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WO2025183075A1 - 抗ｃｄｈ３ヒト化抗体及びそれらの使用 - Google Patents

抗ｃｄｈ３ヒト化抗体及びそれらの使用

Info

Publication number
WO2025183075A1
WO2025183075A1 PCT/JP2025/006850 JP2025006850W WO2025183075A1 WO 2025183075 A1 WO2025183075 A1 WO 2025183075A1 JP 2025006850 W JP2025006850 W JP 2025006850W WO 2025183075 A1 WO2025183075 A1 WO 2025183075A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cdh3
antibody
seq
amino acid
humanized antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/006850
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
裕子 秋吉
さゆり 金子
敬介 石井
真二 萩原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Perseus Proteomics Inc
Original Assignee
Perseus Proteomics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Perseus Proteomics Inc filed Critical Perseus Proteomics Inc
Publication of WO2025183075A1 publication Critical patent/WO2025183075A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5365—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Definitions

  • the present invention relates to an anti-CDH3 humanized antibody, an immunoconjugate thereof, and a pharmaceutical.
  • Cancer is a serious disease that ranks among the leading causes of death, yet there is still an unmet need for treatment.
  • molecular targeted drugs which are designed to target specific molecules that are specifically expressed in cancer cells, in order to solve the problem of conventional chemotherapy, which also damages normal cells.
  • CDH3 P-cadherin
  • CDH3 is a membrane protein discovered as a molecule involved in calcium-dependent homophilic cell adhesion. Proteins with cadherin repeats consisting of approximately 110 amino acid residues that are highly homologous to each other are called the cadherin superfamily, and CDH3 is a major member of this family.
  • ADCs antibody-drug conjugates
  • the drug does not exhibit any toxicity when bound to the antibody.
  • certain antibodies bind to cells expressing the target antigen, they are taken up into those cells and degraded in the lysosomes. Therefore, after a drug-bound antibody is taken up into a cell, it is degraded within the cell, releasing the drug, which exerts its toxicity only within that specific cell, killing the cell as a result.
  • Patent Documents 1 and 2 describe anti-CDH3 antibodies and their drug conjugates.
  • the objective of the present invention is to create new anti-CDH3 antibodies and further to provide anti-CDH3 humanized antibodies suitable for creating antibody-drug conjugates that more efficiently kill cancer cells that express CDH3.
  • the inventors have succeeded in creating a less immunogenic anti-CDH3 humanized antibody by combining a complementarity-determining region (CDR) sequence defined by an antibody that specifically recognizes CDH3 with various human-derived framework region (FR) sequences and by introducing appropriate amino acid mutations to improve affinity. They have also used this antibody to create an anti-CDH3 humanized antibody-drug conjugate, an immune complex that more efficiently kills cancer cells that express CDH3, thereby completing the present invention. According to the present invention, the following inventions are provided.
  • CDR complementarity-determining region
  • Any of the following antibodies (1) An anti-CDH3 humanized antibody having a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; or (2) an anti-CDH3 humanized antibody having a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the antibody according to ⁇ 1> which is any one of the following antibodies: (1) An anti-CDH3 humanized antibody having a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. (2) An anti-CDH3 humanized antibody having a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. ⁇ 3> A fragment of the anti-CDH3 humanized antibody according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, which has the ability to bind to CDH3.
  • ⁇ 4> The fragment of the anti-CDH3 humanized antibody according to ⁇ 3>, which is Fab, F(ab') 2 or scFv.
  • ⁇ 5> A partial sequence of the antibody according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, which has the ability to bind to CDH3.
  • ⁇ 6> An immune complex comprising the anti-CDH3 humanized antibody, fragment thereof, or partial sequence thereof according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5> linked to a chemotherapeutic agent or a radioactive substance.
  • chemotherapeutic agent is a cytotoxic substance.
  • ⁇ 8> The immune complex according to ⁇ 6> or ⁇ 7>, in which the anti-CDH3 humanized antibody, or a fragment or partial sequence thereof, and the chemotherapeutic agent are linked via a linker.
  • the present invention further provides a method for treating a disease characterized by overexpression of CDH3, which comprises administering the above-described immunoconjugate to a patient.
  • the present invention further provides use of the above-described immunoconjugate for the manufacture of a medicament for treating a disease characterized by overexpression of CDH3.
  • the present invention further provides the above-described immunoconjugate for use in treating a disease characterized by overexpression of CDH3.
  • Anti-CDH3 humanized antibodies are expected to have reduced immunogenicity compared to their parent antibodies.
  • Humanized antibodies are constructed by appropriately combining the CDR sequences of the parent antibody with human-derived FR sequences. If these antibodies do not exhibit affinity for the antigen, attempts can be made to restore affinity by introducing amino acid mutations into the antibody variable region. By combining CDR sequences with appropriate FR sequences and introducing amino acid mutations as necessary, anti-CDH3 humanized antibodies that specifically bind to CDH3 can be obtained.
  • the immune complexes thus obtained which are formed by linking the anti-CDH3 humanized antibodies of the present invention with chemotherapeutic agents, exhibit potent cytotoxic activity against CDH3-expressing cancer cells compared to antibodies that do not bind to chemotherapeutic agents.
  • the immunoconjugate of the present invention is useful as an anticancer agent.
  • Figure 1 shows the results of imaging capillary isoelectric focusing: A: ch2012, B: hu2012c, C: hu2012d.
  • Figure 2 shows the results of thermal stability measurements using the Thermal Shift Assay.
  • Figure 3 shows the results of flow cytometry in which the humanized anti-CDH3 antibody was reacted with the lung cancer-derived cell line NCI-H358. The peak on the left represents the negative control.
  • FIG. 4 shows a graph of the results of measuring the internalization ability shown in Table 1.
  • FIG. 5 shows the results of animal studies (HCC1954 breast cancer model) using CDH3 chimeric and humanized antibody-drug conjugates.
  • the antibody of the present invention is any one of the following antibodies: (1) An anti-CDH3 humanized antibody having a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; or (2) an anti-CDH3 humanized antibody having a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the antibody of the present invention is preferably any one of the following antibodies: (1) An anti-CDH3 humanized antibody having a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. (2) An anti-CDH3 humanized antibody having a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • the anti-CDH3 humanized antibodies of the present invention are provided by combining CDR sequences defined from antibodies that specifically recognize CDH3 (preferably human CDH3) with various appropriate human-derived FR sequences, and further by introducing appropriate amino acid mutations to improve affinity.
  • the antibody of the present invention binds to CDH3 expressed on a cell surface. In one embodiment, the antibody of the present invention binds to an epitope within a CDH3 region. Preferably, the antibody of the present invention binds to CDH3 expressed on the surface of human cells, and particularly preferably binds to CDH3 expressed on the surface of cancer cells.
  • CDH3 (preferably human CDH3) or a partial peptide thereof can be used as an antigen for producing antibodies of the present invention.
  • a soluble CDH3 protein corresponding to the extracellular domain of CDH3 (corresponding to amino acids 108 to 654 of SEQ ID NO: 2 in International Publication WO 2014/126198), but is not limited to this.
  • the antibody of the present invention is a humanized monoclonal antibody.
  • hybridomas are obtained by immunizing mice as a material for obtaining humanized monoclonal antibodies.
  • Such materials can be obtained by various methods well known in the art. For example, they can be obtained by the method described below, but are not limited to these.
  • CDH3 To establish hybridomas that produce antibodies that specifically bind to CDH3, CDH3 or a partial peptide thereof is first administered to mice as an antigen.
  • the dose per mouse is 0.1 to 100 mg when no adjuvant is used, and 1 to 100 ⁇ g when an adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Immunization is typically carried out by intravenous, subcutaneous, or intraperitoneal injection.
  • the interval between immunizations is not particularly limited; immunizations are performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times, at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks.
  • Antibody-producing cells are then collected 1 to 60 days, preferably 1 to 14 days, after the final immunization.
  • Antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood cells, with spleen cells or local lymph node cells being preferred.
  • antibody-producing cells are fused with myeloma cells.
  • Myeloma cells can be commonly available mouse-derived cell lines that are drug-selective to HAT medium, etc. Examples include P3X63-Ag. 8. U1 (P3U1) and NS-1.
  • Cell fusion can be carried out in an animal cell culture medium such as serum-free DMEM or RPMI-1640 medium by mixing antibody-producing cells at 1 x 10 to 1 x 10 cells/mL with myeloma cells at 2 x 10 to 2 x 10 cells/mL in the presence of a cell fusion promoter.
  • cell fusion promoters include polyethylene glycol with an average molecular weight of 1,000 to 6,000 daltons.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device that utilizes electrical stimulation.
  • Hybridomas can be obtained by culturing in a selective medium.
  • the cell suspension is appropriately diluted with, for example, RPMI-1640 medium containing fetal bovine serum, and then plated onto a microtiter plate at approximately 3 x 10 cells/well.
  • Selective medium is added to each well, and the selective medium is then replaced as appropriate for culturing.
  • hybridomas can be obtained from cells that grow from about 14 days after the start of culturing in the selective medium.
  • Hybridoma screening can be performed according to conventional methods and is not particularly limited. For example, a portion of the culture supernatant contained in the well in which the hybridomas have grown can be collected and screened for hybridomas that produce antibodies that bind to CDH3 using enzyme immunoassay, radioimmunoassay, or the like. The fused cells can be cloned using limiting dilution or the like, ultimately establishing hybridomas that produce monoclonal antibodies.
  • antibodies derived from them can be humanized using known methods. Specifically, a DNA sequence designed to link the CDR sequence of a mouse antibody with the FR sequence of a human antibody is synthesized by PCR from several oligonucleotides engineered to have overlapping ends. The resulting DNA is ligated to DNA encoding the constant region of a human antibody, then incorporated into an expression vector, which is then introduced into a host for production (see, e.g., EP 239400 and WO 96/02576).
  • CDR sequences are particularly divergent in the variable regions of antibodies and represent sequence regions that play an extremely important role in determining the specificity of the antibody.
  • the amino acid residues in these regions are thought to contain many residues directly involved in antigen binding and specificity, and there are three CDR regions in each of the light and heavy chain variable regions.
  • CDRs have been defined by sequence comparison by Kabat et al. (Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) and by three-dimensional structure by Chothia et al. (J. Mol. Biol.; 196, p901 (1987)).
  • the CDR sequences defined by Kabat are generally located around residues 24-34, 50-56, and 89-97 in the light chain variable region, and around residues 31-35, 50-65, and 95-102 in the heavy chain variable region. However, not all residues in these regions are necessarily directly involved in antigen binding, and they do not necessarily match the CDR sequences defined from the three-dimensional structure.
  • the FR sequences used were derived from human germline sequences selected for optimal alignment.
  • variable region sequence of a mouse antibody is screened against a known, publicly available library of human variable region sequences.
  • the human variable region sequence that is most similar in sequence can be used as the human FR sequence derived from the germline of the humanized antibody (Sims et al., J. Immunol.; 151, p. 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol.; 196, p. 901 (1987); Tempest et al., Biotechnology; 9, p. 266 (1991)).
  • Whether a selected FR sequence is suitable for humanization can be determined by whether it is appropriately combined with each antibody clone CDR sequence and maintains an appropriate three-dimensional structure for the antigen to which it is intended to bind.
  • a humanized antibody is expressed by grafting CDR sequences and human-derived FR sequences between them, the affinity can often decrease if the sequence selection is inappropriate. This means that some residues in the FR sequence also play an important role in maintaining the structure. Amino acid residue substitutions can be made to address this issue. For example, as a result of alignment, it is possible to replace (reshape) an amino acid from a mouse antibody that is present in a position homologous to the human sequence with the same residue. This can sometimes improve the decrease in affinity that occurs with humanization.
  • the positions of the amino acid residues to be substituted vary depending on the antibody of interest, and in many cases are not identified until the antibody is actually expressed.
  • the intention is to improve affinity by substituting amino acid residues at one or more positions selected from position 55 in the light chain variable region and positions 49, 71, and 78 in the heavy chain variable region, which are positions where substitutions are performed in a relatively large number of publications (e.g., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 89, p. 4285 (1992)), but the substitution positions, combinations, and types of amino acid residues after substitution are arbitrary and are not limited to these.
  • While many hosts for antibody production are of mammalian origin, those skilled in the art can select the specific host cell line most suited to the gene product desired to be expressed.
  • Common host cell lines include, but are not limited to, CHO-derived cell lines (Chinese hamster ovary cell lines), CV1 (monkey kidney cell lines), COS (CV1 derivatives expressing SV40 T antigen), SP2/0 (mouse myeloma), P3x63-Ag3.653 (mouse myeloma), 293 (human kidney), and 293T (293 derivatives expressing SV40 T antigen).
  • Host cell lines can be obtained from various manufacturers, the American Tissue Culture Collection (ATCC), or from sources listed in the literature.
  • ATCC American Tissue Culture Collection
  • a CHO-derived cell line or SP2/0 deficient in the expression of the dgfr gene can preferably be used (Urland, G. et al., Somat. Cell. Mol. Genet.; 12, p. 5555 (1986) (Non-Patent Document 4), and Schulman, M. et al., Nature; 276, p. 269 (1978) (Non-Patent Document 5)).
  • the host cell line is DHFR-deficient CHO.
  • Plasmid transfection into host cells can be carried out using any technique. Specific methods include, but are not limited to, transfection (including the calcium phosphate method, DEAE method, lipofection, and electroporation), methods of introducing DNA using envelopes such as Sendai virus, microinjection, and infection with viral vectors such as retroviruses and adenoviruses (Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 9, Introduction of DNA into Mammalian Cells, John Wiley and Sons, Inc.). Plasmid introduction into host cells by electroporation is most preferred.
  • antibodies may be monovalent, divalent, or multivalent antibodies, as long as they have the ability to bind to CDH3.
  • these antibodies may be minibodies such as antibody fragments, modified antibodies, or partial antibody sequences, as long as they have the ability to bind to CDH3.
  • minibodies such as antibody fragments include Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv, ScFv (single chain Fv), and diabodies.
  • antibody fragments and minibodies, such as Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv, ScFv (single chain Fv), and diabodies may also be fused to an Fc portion.
  • genes encoding these antibodies are constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in appropriate host cells.
  • an immunoconjugate in which an anti-CDH3 humanized antibody of the present invention, a fragment thereof, or a partial sequence thereof is linked to a chemotherapeutic agent or a radioactive substance.
  • a preferred embodiment of the antibody of the present invention is an immunoconjugate in which a chemotherapeutic agent such as a cytotoxic substance or a radioactive substance is bound to the antibody, i.e., an antibody-drug conjugate (ADC).
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the immunoconjugate of the present invention can damage cancer cells, for example, by contacting the cancer cells with CDH3.
  • the chemotherapeutic agent is preferably a cytotoxic substance.
  • the chemotherapeutic agent include duocarmycin, duocarmycin analogs and derivatives, CC-1065, CBI-based duocarmycin analogs, MCBI-based duocarmycin analogs, CCBI-based duocarmycin analogs, doxorubicin, doxorubicin conjugates, morpholino-doxorubicin, cyanomorpholino-doxorubicin, dolastatin, dorestatin-10, combretastatin, calicheamicin, maytansinoids or derivatives thereof (e.g., maytansine, maytansine analogs, DM1, DM4, etc.), auristatin or derivatives thereof (e.g., auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), monomethylauristatin E (MMAE), monomethylauristatin F (MMAF), 5- Benzoy
  • the number of chemotherapeutic agent molecules bound to one molecule of an anti-CDH3 humanized antibody, fragment thereof, or partial sequence thereof is not particularly limited, but preferably an average of 1 to 10 molecules, and more preferably an average of 3 to 5 molecules, of the chemotherapeutic agent are bound.
  • an average of 1 to 10 DM1 molecules may be bound to one molecule of an anti-CDH3 humanized antibody, fragment thereof, or partial sequence thereof.
  • the immune complex of the present invention can be prepared by conjugating the above-mentioned chemotherapeutic agent and antibody using known methods.
  • the antibody and chemotherapeutic agent may be directly conjugated via a linking group possessed by the antibody and chemotherapeutic agent, or may be indirectly conjugated via a linker or other substance.
  • linking groups include a disulfide bond using an SH group or a bond via a maleimide.
  • the intramolecular disulfide bond in the Fc region of the antibody and the disulfide bond in the drug are reduced to link the two via a disulfide bond.
  • Another method is to use a maleimide.
  • Another method is to introduce the drug by genetically modifying the Fc region of the antibody. For example, one method is to genetically introduce cysteine into the antibody.
  • Antibodies and chemotherapeutic agents can also be indirectly linked via another substance (linker).
  • the linker preferably has one or more functional groups that react with the antibody, the agent, or both. Examples of functional groups include amino groups, carboxyl groups, mercapto groups, maleimide groups, and pyridinyl groups.
  • the linker is preferably a bifunctional reactive cross-linking reagent.
  • linkers include N-succinimidyl 4-(maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylate (SMCC), sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC), N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate) (LC-SMCC), ⁇ -maleimidoundecanoic acid N-succinimidyl ester (KMUA), ⁇ -maleimidobutyric acid N-succinimidyl ester (GMBS), ⁇ -maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), N-( ⁇ -maleimido N-succinimidyl 4-(p-male
  • This linker may be, for example, a combination of para-aminobenzoic acid (PABA) and a peptide linker such as valine-citrulline (Val-Cit) or alanine-phenylalanine (ala-phe), or the linkers listed above may be used in appropriate combinations.
  • PABA para-aminobenzoic acid
  • a peptide linker such as valine-citrulline (Val-Cit) or alanine-phenylalanine (ala-phe)
  • the linkers listed above may be used in appropriate combinations.
  • the linker may be cleavable by a protease. Additionally, the linker may include at least one of valine-citrulline (Val-Cit), alanine-phenylalanine (ala-phe), and para-aminobenzoic acid (PABA).
  • Val-Cit valine-citrulline
  • ala-phe alanine-phenylalanine
  • PABA para-aminobenzoic acid
  • Methods for binding drugs to antibodies can be carried out in accordance with the methods described, for example, in Cancer Res.; 52, p. 127 (1992), Cancer Res.; 68 (22), p. 9280 (2008), Nature Biotechnology; 26 (8), p. 925 (2008), Bio Conjugate Chemistry; 19, p. 1673 (2008), Cancer Res.; 68 (15), p. 6300 (2008), or JP 2008-516896 A.
  • Another embodiment of the present invention is a so-called immunotoxin, in which a drug is chemically or genetically bound to an antibody.
  • examples of drugs that can be used include, but are not limited to, diphtheria toxin A chain, pseudomonas endotoxin, ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain, gelonin, and saporin.
  • a radioactive substance can be bound to the antibody.
  • the radioactive substance is preferably a cytotoxic radioactive metal, and when used as a cancer diagnostic drug, it is preferably a non-cytotoxic radioactive metal.
  • cytotoxic radioactive metals include yttrium-90 (90Y), rhenium-186 (186Re), rhenium-188 (188Re), copper-67 (67Cu), iron-59 (59Fe), strontium-89 (89Sr), gold-198 (198Au), mercury-203 (203Hg), lead-212 (212Pb), dysprosium-165 (165Dy), ruthenium-103 (103Ru), bismuth-212 (212Bi), bismuth-213 (213Bi), holmium-166 (166Ho), samarium-153 (153Sm), lutetium-177 (177Lu), astatine-211 (211At), and actinium-225 (225Ac).
  • 90Y, 153Sm, and 177Lu are preferred in terms of half-life, radiation energy, ease of labeling reaction, labeling rate, and stability of the complex, but are not limited to these.
  • suitable non-cytotoxic radioactive metals for use in diagnostic agents include, but are not limited to, technetium-99m (99mTc), indium-111 (111In), indium-113m (113mIn), gallium-67 (67Ga), gallium-68 (68Ga), thallium-201 (201Tl), chromium-51 (51Cr), cobalt-57 (57Co), cobalt-58 (58Co), cobalt-60 (60Co), strontium-85 (85Sr), mercury-197 (197Hg), and copper-64 (64Cu).
  • radioactive metal elements to an anti-CDH3 antibody
  • the modified antibody obtained in this way has the radioactive metal element bound via the metal chelating reagent.
  • metal chelating agents used in forming such complexes include (1) quinoline derivatives such as 8-hydroxyquinoline, 8-acetoxyquinoline, 8-hydroxyquinaldine, oxyquinoline sulfate, O-acetyloxine, O-benzoyloxine, O-p-nitrobenzoyloxine, and quinolone compounds having a quinoline skeleton, such as norfloxacin, ofloxacin, enoxacin, ciprofloxacin, lomefloxacin, tosufloxacin, fleroxacin, and sparfloxacin; (2) chloranilic acid, aluminone, thiourea, pyrogallol, cupferron, and bismuthiol ( II), compounds such as galloyl gallic acid, thiolide, 2-mercaptobenzothiazole, and tetraphenylarsonium chloride; (3) ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminep
  • isothiocyanobenzyl DOTA, methylisothiocyanobenzyl DTPA, and cyclohexylisothiocyanobenzyl DTPA are preferred in terms of ease of introduction of the metal chelate into the antibody, labeling rate, and stability of the complex.
  • Radioactive metal elements can be bound to antibodies using standard methods. For example, this can be achieved by reacting the antibody with a metal chelating agent, preparing a labeled precursor in advance, and then reacting it with the radioactive metal element.
  • a medicament for treating a disease characterized by overexpression of CDH3, comprising the immunoconjugate of the present invention.
  • the immune complexes provided by the present invention may contain, as appropriate, pharmaceutically acceptable carriers, excipients, diluents, etc. to maintain the stability of the drug.
  • the immune complexes of the present invention can be formulated, for example, as injections.
  • the dosage of the immune complexes of the present invention depends on the severity of the patient's symptoms, age, and body weight, the method of administration, etc., and is usually in the range of about 10 ng to about 100 mg/kg body weight in terms of the weight of the antibody, which is the active ingredient.
  • cancers that can be treated by the immunoconjugate of the present invention are not particularly limited as long as CDH3 is expressed in the cells, and examples include cancer.
  • cancer include, but are not limited to, colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, head and neck cancer, ovarian cancer, lung cancer, invasive bladder cancer, pancreatic cancer, metastatic brain cancer, thyroid cancer, head and neck squamous cell carcinoma, esophageal squamous cell carcinoma, lung squamous cell carcinoma, skin squamous cell carcinoma, melanoma, breast adenocarcinoma, lung adenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma, pancreatic squamous cell carcinoma, colon squamous cell carcinoma, gastric squamous cell carcinoma, prostate cancer, osteosarcoma, and soft tissue sarcoma.
  • the pharmaceutical agent of the present invention can be used as an antitumor agent.
  • Example 1 Method for producing humanized antibody (1) Production of anti-CDH3 mouse antibody Anti-CDH3 mouse antibodies were produced as described in Examples 1 to 9 of Japanese Patent No. 6,377,601, and the sequences of the variable regions of the anti-CDH3 mouse antibodies were obtained by sequence analysis.
  • ApE and GENETYX were used for sequence analysis.
  • CLUSTALW was used for gene alignment.
  • HPRD, NCBI BLAST, UCSF (University of California, Santa Cruz)-Blat, and UniProt were used to obtain and confirm gene and protein information.
  • GYSFTAYN SEQ ID NO: 9 (CDR-H1) IDPYSGII: SEQ ID NO: 10 (CDR-H2) ARRGYYDGGFDY: SEQ ID NO: 11 (CDR-H3)
  • QDITNY SEQ ID NO: 12 (CDR-L1) YTS: SEQ ID NO: 13 (CDR-L2)
  • QQDSKHPRT SEQ ID NO: 14 (CDR-L3)
  • CDR-H1, H2, and H3 represent the CDR sequences constituting the heavy chain
  • CDR-L1, L2, and L3 represent the CDR sequences constituting the light chain.
  • transient expression vector for anti-CDH3 antibody For chimerization, a gene for the light chain variable region of the CDH3 mouse antibody was designed to be linked to a chimeric light chain expression vector encoding human Ck.
  • a gene for the heavy chain variable region of the CDH3 mouse antibody was designed to be linked to a vector encoding the human Cg1 region.
  • mouse-derived CDR sequences were combined with human-derived FR sequences, and a human Fc region was then linked to construct a stable-producing strain using a humanized antibody expression vector. More specifically, the process is as follows:
  • the region corresponding to the mouse FR sequence was replaced with a human-derived FR sequence, and the full length was artificially synthesized by GenScript.
  • the amino acid sequence of the region corresponding to the FR sequence was a human germline frame sequence.
  • amino acid sequence substitutions were also performed to reduce affinity.
  • Antibody number hu2012c-VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYSFTAYNMHWVQQAPGKGLEWMGFIDPYSGIIT YAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGYYDGGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1)
  • Antibody number hu2012c-VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLETGVPSRFSGSGSGTDFTFISSLQPEDIATYYCQQDSKHPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 2)
  • Antibody number hu2012d-VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYSFTAYNMHWVQQAPGKGLEWMGFIDPYSGIIT YAEKFQGRVTITVDKSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGYYDGGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 3) (A72V and T74K substitutions compared to hu2012c-VH)
  • Antibody number hu2012d-VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFISSLQPEDIATYYCQQDSKHPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 4) (E55H substitution compared to hu2012c-VL)
  • the artificial synthetic sequence genes designed to have these sequences were inserted into a pCXN vector containing a human IgG1-derived constant region gene for the heavy chain variable region, and into a pCXN vector containing a human ⁇ chain-derived constant region gene for the light chain variable region.
  • the full-length amino acid sequences of the anti-CDH3 humanized antibodies obtained by expression are shown below.
  • the anti-CDH3 humanized antibody hu2012c is composed of a hu2012c-H heavy chain and a hu2012c-L light chain
  • the anti-CDH3 humanized antibody hu2012d is composed of a hu2012d-H heavy chain and a hu2012d-L light chain, but the heavy and light chains may be interchanged when expressed.
  • Antibody number hu2012c-H EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYSFTAYNMHWVQQAPGKGLEWMGFIDPYSGIITYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGYYDGGFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
  • Antibody number hu2012c-L DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDSKHPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 6)
  • Antibody number hu2012d-H EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYSFTAYNMHWVQQAPGKGLEWMGFIDPYSGIITYAEKFQGRVTITVDKSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGYYDGGFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
  • Antibody number hu2012d-L DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDSKHPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 8)
  • Example 2 Imaging capillary isoelectric focusing (icIEF) of ch2012 and hu2012 was performed using an iCE280 analyzer (Protein Simple).
  • sample Preparation If the sample contained 20 mM or more of salt, it was replaced with 20 mM phosphate buffer (pH 6.0). Urea was dissolved in 20 mM phosphate buffer (pH 6.0) to prepare 10 M urea immediately after use. Samples were prepared in the following proportions: the sample concentration was 140-200 ⁇ g/mL for antibodies and 400 ⁇ g/mL for drug-labeled antibodies.
  • n 1 measurement: 10 M urea 10 uL Antibody (140-200ug/mL) 20uL loading mixture 20uL Total 50uL
  • Markers were prepared in the following proportions. 10M urea 20uL 20 mM phosphate buffer (pH 6.0) 40 uL loading mixture 40uL Total 100uL
  • the prepared sample and marker were mixed thoroughly in a Vortex mixer and centrifuged for 3 to 5 minutes in a tabletop centrifuge.
  • the sample and marker were dispensed into dedicated glass vials and briefly centrifuged in a tabletop centrifuge to remove any air bubbles from the vials.
  • the vials were then placed in the vial holder of the iCE280 analyzer and measurements were performed.
  • TSA Thermal Shift Assay
  • the prepared samples were measured using real-time PCR StepOnePlus (Thermofisher Scientific, StepOnePlus-01 registered trademark).
  • Example 4 Binding activity of antibodies Antibodies having the sequences shown in Example 1 were prepared, and their binding activity was evaluated by flow cytometry.
  • Each cell line to be tested (NCI-H358 cell line, which has been confirmed to express high levels of CDH3) was detached from the culture plate by treatment with 2 mM EDTA-PBS and then suspended in FACS solution at 1 x 10 cells/mL. This cell suspension was seeded into a 96-well plate at 50 ⁇ L/well, and purified hu2012c and hu2012d antibodies were added at 0.3 ⁇ g/mL. The cells were incubated at 4°C for 60 minutes.
  • Example 5 Measurement of internalization activity This was performed using a saporin-labeled anti-human IgG antibody (Hum ZAP, Advanced Targeting Systems). Because cell killing requires internalization by saporin, internalization activity can be evaluated by measuring the degree of killing. Activity was expressed relative to the cell viability when no saporin-labeled anti-human IgG antibody was added, which was set at 100%. More specifically, the procedure is as follows.
  • Human CDH3-expressing cells were the human breast cancer-derived cell line HCC1954 and the human lung cancer-derived cell line NCIH358. Each well was adjusted to contain 5,000 cells, 100 ng (or 0 ng) of HumZAP, and 100 ng of anti-human CDH3 chimeric antibody or anti-human CDH3 humanized antibody. The cells were added to a 96-well microplate and incubated at 37°C in a 5% CO2 incubator for 3 days.
  • Example 6 In vivo (1) Preparation of DM1-labeled antibody
  • DM1SMe CAS 138148-68-2
  • DM1SH was obtained by reduction treatment with TCEP and HPLC purification using a C18 column.
  • a maleimide group was introduced into the antibody using sulfo-SMCC, and then the antibody was reacted with DM1SH to prepare a DM1-labeled antibody.
  • DM1SMe structural formula

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Abstract

本発明の課題は、新たな抗ＣＤＨ３ヒト化抗体を作出し、これを用いてＣＤＨ３を発現するがん細胞をより効率的に殺傷する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体薬剤コンジュゲートを提供することである。本発明によれば、以下の何れかの抗体が提供される。 （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体；または （２）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。

Description

抗ＣＤＨ３ヒト化抗体及びそれらの使用
　本発明は、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その免疫複合体、及び医薬に関する。
　がんは、死亡原因の上位を占める重要な疾患であるが、その治療ニーズはいまだ満たされていない。近年、従来の化学療法の正常細胞にもダメージを与えるという問題点を解決するために、がん細胞に特異的に発現する特定の分子を標的として薬剤を設計し治療を行う分子標的薬によるがん治療が盛んに研究されている。
　その標的のひとつとして細胞膜表面抗原であるＰ－カドヘリン（ＣＤＨ３）が同定された。ＣＤＨ３はカルシウム依存的に同種親和性の細胞接着に関与する分子として発見された膜タンパク質である。相互にホモロジーが高い約１１０アミノ酸残基からなるカドヘリンリピートを持つタンパク質はカドヘリンスーパーファミリーと呼ばれ、ＣＤＨ３はその主要メンバーに属する。
　ある種のがん細胞においてはＣＤＨ３の発現上昇例が報告されており、正常組織と比較してがん組織でのＣＤＨ３の発現が高いがん細胞に対して抗体を用いたがん治療が検討されている。
　抗体の抗がん作用を増強する有効な手段の一つとして、抗体と強力な毒性を有する物質（薬物）との連結があげられる。強力な毒性を有する物質はそれ単独で患者に投与すると正常組織にも傷害を及ぼし、有効な治療手段とはなり得ない。しかしながら、がん細胞特異的な抗原と結合する抗体と薬物を連結することにより、正常な組織に悪影響を及ぼさず、がん細胞のみ殺傷しえる能力を持つに至る。こうした薬剤は抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ、　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と呼ばれる。即ち、薬物は抗体と結合した状態では何ら毒性を示さない。しかし、ある種の抗体は標的とする抗原を発現する細胞に結合するとその細胞内に取り込まれ、リソソームにて分解される。したがって、薬物を結合したその種の抗体が細胞内に取り込まれた後、細胞内で分解される事で薬物が放出され、特定の細胞内部においてのみ毒性が発現し、その効果により細胞は殺傷される。
　特許文献１および特許文献２には、抗ＣＤＨ３抗体、およびその薬剤コンジュゲートが記載されている。
国際公開ＷＯ２０１３／１５０６２３号公報 国際公開ＷＯ２０１４／１２６１９８号公報
　本発明は、新たな抗ＣＤＨ３抗体を作出し、更にはＣＤＨ３を発現するがん細胞をより効率的に殺傷する抗体薬剤コンジュゲートを作出するのに適した抗ＣＤＨ３ヒト化抗体を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＣＤＨ３を特異的に認識する抗体から規定される相補性決定領域（ＣＤＲ）配列と、種々のヒト由来フレームワーク領域（ＦＲ）配列とを組み合わせることによって、そして親和性を改善するために適切なアミノ酸変異を導入することによって、免疫原性の少ない抗ＣＤＨ３ヒト化抗体を作出し、これを用いてＣＤＨ３を発現するがん細胞をより効率的に殺傷する免疫複合体である抗ＣＤＨ３ヒト化抗体薬剤コンジュゲートを作出することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　以下の何れかの抗体。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体；または
（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
＜２＞　以下の何れかの抗体である、＜１＞に記載の抗体。
（１）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体
（２）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
＜３＞　ＣＤＨ３との結合能を有する、＜１＞又は＜２＞に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体の断片。
＜４＞　Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）２、又はｓｃＦｖである、＜３＞に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体の断片。
＜５＞　ＣＤＨ３との結合能を有する、＜１＞又は＜２＞に記載した抗体の部分配列。
＜６＞　＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列と、化学療法剤又は放射性物質とが連結している、免疫複合体。
＜７＞　化学療法剤が、細胞障害性物質である、＜６＞に記載の免疫複合体。
＜８＞　抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列と、化学療法剤とがリンカーを介して連結している、＜６＞又は＜７＞に記載の免疫複合体。
＜９＞　＜６＞から＜８＞の何れか一に記載の免疫複合体を含む、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患を治療するための医薬。
＜１０＞　ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患が、がんである、＜９＞に記載の医薬。
　本発明によればさらに、上記した免疫複合体を患者に投与することを含む、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患を治療する方法が提供される。
　本発明によればさらに、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患を治療するための医薬の製造のための、上記した免疫複合体の使用が提供される。
　本発明によればさらに、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患の治療において使用するための、上記した免疫複合体が提供される。
　抗ＣＤＨ３ヒト化抗体は、その元となる抗体と比較して免疫原性の低減が期待される。ヒト化抗体は、元となった抗体のＣＤＲ配列とヒト由来ＦＲ配列の適切な組み合わせにより構成される。もしこれが抗原との親和性を示さない時は、更に抗体可変領域へのアミノ酸変異を導入することで親和性回復の試みもなされる。ＣＤＲ配列と適切なＦＲ配列との組み合わせ、及び必要に応じたアミノ酸変異導入により、ＣＤＨ３と特異的に結合する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体が得られる。このようにして得られた本発明の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体は、化学療法剤を結合しない抗体と比較して、ＣＤＨ３を発現するがん細胞に対して強力な細胞傷害活性を示す。
　ＣＤＨ３を発現するがん細胞を有する患者に本発明による免疫複合体を投与することによって、高い抗がん作用を発揮できるとともに、それ自身の免疫原性の低減も達成できる。本発明の免疫複合体は、抗がん剤として有用である。
図１は、画像化キャピラリー等電点電気泳動の結果を示す。Ａ：ｃｈ２０１２、Ｂ：ｈｕ２０１２ｃ、Ｃ：ｈｕ２０１２ｄ。 図２は熱安定性をＴｈｅｍａｌ　Ｓｈｉｆｔ　Ａｓｓａｙで測定した結果を示す。Ａ：ｃｈ２０１２、Ｂ：ｈｕ２０１２ｃ、Ｃ：ｈｕ２０１２ｄ。 図３はヒト化抗ＣＤＨ３抗体を肺がん由来細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８に反応させたフローサイトメトリの結果を示す。左側のピークが陰性対象を示す。 図４は内在化能を測定した表１の結果のグラフを示す。 図５はＣＤＨ３キメラ化及びヒト化抗体薬剤コンジュゲートを用いた動物試験結果（ＨＣＣ１９５４乳がんモデル）を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
　本発明の抗体は、以下の何れかの抗体である。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体；または
（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
　本発明の抗体は、好ましくは、以下の何れかの抗体である。
（１）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体
（２）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
　本発明の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体は、ＣＤＨ３（好ましくはヒトＣＤＨ３）を特異的に認識する抗体から規定されるＣＤＲ配列と種々の適切なヒト由来ＦＲ配列を組み合わせることにより提供され、更には親和性を改善するために適切なアミノ酸変異を導入することにより提供される。
　一態様では、本発明の抗体は細胞表面に発現されるＣＤＨ３に結合する。一態様では、本発明の抗体はＣＤＨ３領域内のエピトープに結合する。好ましくは、本発明の抗体は、ヒト細胞表面に発現されるＣＤＨ３に結合し、特に好ましくはがん細胞表面に発現されるＣＤＨ３に結合する。
　本発明の抗体を作成するための抗原としては、ＣＤＨ３（好ましくはヒトＣＤＨ３）又はその部分ペプチドを用いることができる。一例としては、ＣＤＨ３細胞外領域（国際公開ＷＯ２０１４／１２６１９８号公報の配列番号２の１０８から６５４アミノ酸に相当する）に相当する可溶型ＣＤＨ３タンパク質などを用いることができるが、これに限定されるものではない。
　本発明の抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。ヒト化モノクローナル抗体を取得するための材料として、本発明ではマウスへの免疫を経てハイブリドーマを取得する。このような材料は当該分野で周知な種々の方法で取得することができる。例えば以下に記載する方法でも得ることが出来るが、これに限定されるものではない。
　ＣＤＨ３特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ樹立のためには、先ずＣＤＨ３又はその部分ペプチドを抗原としてマウスに投与する。１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１～１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１～１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２～５週間間隔で、１～１０回、好ましくは２～５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１～６０日後、好ましくは１～１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
　ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。ミエローマ細胞は、ＨＡＴ培地等への薬剤選択性を有し一般に入手可能なマウス由来の株化細胞を使用することができる。例えば　Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ－１などが挙げられる。
　細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０６～１×１０７個／ｍＬの抗体産生細胞と２×１０５～２×１０６個／ｍＬのミエローマ細胞とを混合し、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行うことができる。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００～６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
　ハイブリドーマは、選択培地の培養操作により得ることができる。細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０５個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
　次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、ＣＤＨ３と結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
　樹立したハイブリドーマを材料とすれば、これに由来した抗体のヒト化は既知の方法で達成することができる。具体的には、マウス抗体のＣＤＲ配列とヒト抗体のＦＲ配列を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込み、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（ＥＰ２３９４００号公報、国際公開ＷＯ９６／０２５７６号公報など）。
　ＣＤＲ配列は、抗体間の可変領域で特に相違が激しく、その抗体の特異性決定に極めて重要な役割を果たす配列領域を示す。この領域に属するアミノ酸残基は、抗原に対する結合性および特異性に直接的に関わる残基を多く含んでいると考えられ、軽鎖及び重鎖可変領域に各々３領域が存在する。
ＣＤＲはＫａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈ　Ｅｄ．，　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，　ＭＤ　（１９９１）によって配列比較により規定され、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；１９６，ｐ９０１（１９８７））により三次元構造によっても規定される。
　Ｋａｂａｔが規定したＣＤＲ配列は、一般的に軽鎖可変領域は残基２４－３４付近、残基５０－５６付近、残基８９－９７付近に位置し、重鎖可変領域では残基３１－３５付近、残基５０－６５付近、残基９５－１０２付近に位置するとされるが、この領域の全ての残基が抗原結合に直接関与するとは必ずしも限らず、三次元構造から規定されたＣＤＲ配列と完全に一致するという訳では無い。
　ＦＲ配列は本発明においては最適なアライメントのもとで選択されたヒトの生殖系列に由来するものを使用した。
　即ち、マウス抗体の可変領域配列を既知の公開されたヒト可変領域配列ライブラリーに対してスクリーニングする。その中で最も配列的に近似したヒト可変領域配列をヒト化抗体の生殖系列に由来したヒトＦＲ配列として用いることができる（Ｓｉｍｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１５１，ｐ２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；１９６，ｐ９０１（１９８７）、Ｔｅｍｐｅｓｔら．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；９，ｐ２６６（１９９１））。
　最も配列的に近似した生殖系列配列は、そのようなライブラリーを多数登録したデータベースにおいて元抗体の配列に対するアライメント（例えば、ＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｈｕｍａｎＩｇ））を実施することで確かめることができる。
　選ばれたＦＲ配列がヒト化に適当であるかどうかは、各抗体クローンＣＤＲ配列との組み合わせが適切であり、結合を目指す抗原に対して適切な立体構造を維持しえたか否かによって判断することができる。
　もしＣＤＲ配列とヒトに由来したＦＲ配列を挟んで移植することで発現したヒト化抗体が、その配列選択が適切でない場合には親和性が低下することもしばしば起こりえる。これはＦＲ配列中に存在する残基も、その構造維持において重要な役割を果たすものが存在することを意味する。この事象に対応したアミノ酸残基置換を行うことができる。例えば、アライメントの結果、ヒト由来の配列と位置的に相同な場所に存在するマウス抗体由来のアミノ酸と同じ残基へと置換（ｒｅｓｈａｐｅ）することができる。これによりヒト化によって生じた親和性の低下を改善することができる場合がある。
　置換されるべきアミノ酸残基の位置は、対象とする抗体によって異なり、多くの場合、実際に発現させるまで特定されない。以下の実施例においては、比較的多くの文献（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；８９，ｐ４２８５（１９９２））において置換が実施される軽鎖可変領域の５５位、重鎖可変領域の４９位、７１位、及び７８位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基を置換することによって、親和性低下に対する向上を図ることが意図されたが、その置換位置、組み合わせ及び置換後のアミノ酸残基の種類は任意であり、これに限定されるものではない。
　抗体を生産するための宿主は哺乳動物起源のものが多いが、当業者であれば、発現したい遺伝子産物に最も適する特定の宿主細胞系を適宜選択することができる。一般的な宿主細胞系としては、ＣＨＯ由来細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）、ＣＶ１（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原をするＣＶ１の誘導体）、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）、Ｐ３ｘ６３－Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、２９３（ヒト腎臓）、及び２９３Ｔ（ＳＶ４０Ｔ抗原をする２９３の誘導体）などが挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞系は、各種メーカー、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、または文献に記載の論文発表機関から入手することができる。
　宿主細胞系としては、好ましくはｄｇｆｒ遺伝子の発現欠損であるＣＨＯ由来細胞株又はＳＰ２／０を使用することができる（Ｕｒｌａｎｄ，　Ｇ．ら、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．；１２，ｐ５５５５（１９８６）（非特許文献４）、およびＳｃｈｕｌｍａｎ，　Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ；２７６，ｐ２６９（１９７８）（非特許文献５））。最も好ましくは、宿主細胞系はＤＨＦＲ欠失ＣＨＯである。
　宿主細胞中へのプラスミドのトランスフェクションは、任意の技術を使って実施できる。具体的な方法としては、トランスフェクション（リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ法、リポフェクション、およびエレクトロポレーションを含む）、センダイウイルス等のエンベロープを利用してＤＮＡを導入する方法、マイクロインジェクション、およびレトロウイルスウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターを用いた感染が挙げられるが、これらに限定されるものではない（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　９　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｉｎｔｏ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．）。最も好ましいのは、エレクトロポレーションによる宿主中へのプラスミド導入である。
　これらの抗体は、ＣＤＨ３との結合能を有する限り、一価抗体、二価抗体、多価抗体のいずれでもよい。また、これらの抗体は、ＣＤＨ３との結合能を有する限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体、抗体の修飾物、または抗体の部分配列などであってもよい。抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙなどが挙げられる。さらに、抗体断片や低分子化抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ）、ＤｉａｂｏｄｙなどにＦｃ部分を融合したものでもよい。このような抗体を得るには、これら抗体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。
＜免疫複合体＞
　本発明によれば、本発明の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列と、化学療法剤又は放射性物質とが連結している、免疫複合体が提供される。即ち、本発明の抗体の好ましい使用態様としては、抗体に細胞傷害性物質等の化学療法剤又は放射性物質を結合させた免疫複合体、即ち、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を挙げることができる。本発明の免疫複合体は、例えばＣＤＨ３を発現しているがん細胞と接触させることによりがん細胞を傷害することができる。
　化学療法剤は、好ましくは細胞傷害性物質である。化学療法剤の例としては、デュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、ＣＣ－１０６５、ＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＭＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＣＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ－ドキソルビシン、シアノモルフォリノ－ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン－１０、コンブレタスタチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、メイタンシノイド又はその誘導体（例えば、メイタンシン、メイタンシンアナログ、ＤＭ１，ＤＭ４など）、アウリスタチン又はその誘導体（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、５－ベンゾイルバレリン酸ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）など）、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ－３８、トポテカン、エキサテカン、デルクステカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、アマニチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ８－アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
　抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列１分子あたりに結合している化学療法剤の分子数は特に限定されないが、好ましくは平均１～１０分子、より好ましくは平均３～５分子の化学療法剤が結合している。一例としては、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列１分子あたり平均１～１０個のＤＭ１が結合していてもよい。
　本発明における免疫複合体は、前記の化学療法剤と抗体とを公知の方法により結合することにより作製できる。抗体と化学療法剤は、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーや他の物質を介して間接的に結合されてもよい。
　薬剤が直接結合される場合の連結基は、例えばＳＨ基を用いたジスルフィド結合やマレイミドを介する結合が挙げられる。例えば、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合と、薬剤のジスルフィド結合を還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。また、マレイミドを介する方法もある。また別の方法として、抗体のＦｃ領域を遺伝子工学的に改変して導入することもできる。例えば、抗体内にシステインを遺伝子工学的に導入する方法がある。
　抗体と化学療法剤を、他の物質（リンカー）を介して間接的に結合することも可能である。リンカーには、抗体または薬剤または両方と反応する官能基を１または２種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、，マレイミド基、ピリジニル基等をあげることができる。リンカーは、好ましくは２価反応性架橋試薬である。
　リンカーの例としては、Ｎ－スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）　（ＬＣ－ＳＭＣＣ）、κ－マレイミドウンデカン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ－マレイミド酪酸Ｎ－スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）－スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル－６－（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）－ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ－（ｐ－マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、Ｎ－スクシンイミジル４（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－イオド－アセチル）アミノ安息香酸エステル（ＳＩＡＢ）、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボンイル（ＰＡＢ）、及びＮ－スクシンイミジル４（２－ピリジルチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）等があげられるが、これらに限定されるものではない。このリンカーは例えば、パラアミノベンゾイック酸（ＰＡＢＡ）に、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｌａ－ｐｈｅ）のようなペプチドリンカーが組み合わさってもよいし、上記にあげたリンカーをそれぞれ適時組み合わせて使用しても良い。
　一例においては、リンカーは、プロテアーゼによって切断されるものでもよい。
　さらに、リンカーは、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン-フェニルアラニン（ａｌａ-ｐｈｅ）、及びパラアミノベンゾイック酸（ＰＡＢＡ）の少なくとも１つ以上を含むものでもよい。
　薬剤と抗体との結合方法に関しては、例えば、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．；５２，ｐ１２７（１９９２）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．；６８（２２），ｐ９２８０（２００８）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２６（８），ｐ９２５（２００８）、Ｂｉｏ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；１９，ｐ１６７３（２００８）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．；６８（１５），ｐ６３００（２００８）、又は特表２００８－５１６８９６号公報などに記載の方法に準じて行うことができる。
　本発明の別の実施形態としては、抗体に薬物を化学的または遺伝子工学的に結合した、いわゆるイムノトキシンをあげることができる。用いられる薬物としては、例えば、ジフテリアトキシンＡ鎖、シュードモナスエンドトキシン、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、ゲロニン、サポリン等をあげることができるが、これに限定されるものではない。
　更に本発明の別の実施形態として、抗体に放射性物質を結合させることもできる。放射性物質としては、がん治療薬として用いる場合、細胞傷害性放射性金属が好ましく、がん診断薬として用いる場合には細胞非傷害性放射性金属であることが好ましい。
　このような細胞傷害性放射性金属としては、例えばイットリウム９０（９０Ｙ）、レニウム１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム１８８（１８８Ｒｅ）、銅６７（６７Ｃｕ）、鉄５９（５９Ｆｅ）、ストロンチウム８９（８９Ｓｒ）、金１９８（１９８Ａｕ）、水銀２０３（２０３Ｈｇ）、鉛２１２（２１２Ｐｂ）、ジスプロシウム１６５（１６５Ｄｙ）、ルテニウム１０３（１０３Ｒｕ）、ビスマス２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス２１３（２１３Ｂｉ）、ホルミウム１６６（１６６Ｈｏ）、サマリウム１５３（１５３Ｓｍ）、ルテチウム１７７（１７７Ｌｕ）、アスタチン２１１（２１１Ａｔ）、アクチニウム２２５（２２５Ａｃ）などを挙げることができる。これらの放射性金属の中でも、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕが、半減期、放射線エネルギー、容易な標識反応、標識率、錯体の安定性等の点から好ましいが、これらに限定されるものではない。
　一方、診断薬に用いる細胞非傷害性放射性金属としては、テクネシウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、インジウム１１３ｍ（１１３ｍＩｎ）、ガリウム６７（６７Ｇａ）、ガリウム６８（６８Ｇａ）、タリウム２０１（２０１Ｔｌ）、クロム５１（５１Ｃｒ）、コバルト５７（５７Ｃｏ）、コバルト５８（５８Ｃｏ）、コバルト６０（６０Ｃｏ）、ストロンチウム８５（８５Ｓｒ）、水銀１９７（１９７Ｈｇ）、銅６４（６４Ｃｕ）が好適に用いられるが、これらに限定されるものではない。
　これらの放射性金属元素を抗ＣＤＨ３抗体に結合させるには、該抗体に金属キレート試薬を反応させ、これに放射性金属元素を反応させて錯体とするのが好ましい。このようにして得られた修飾抗体は、放射性金属元素が金属キレート試薬を介して結合している。
　このような錯体形成に用いられる金属キレート試薬の例としては、例えば（１）８－ヒドロキシキノリン、８－アセトキシキノリン、８－ヒドロキシキナルジン、硫酸オキシキノリン、Ｏ－アセチルオキシン、Ｏ－ベンゾイルオキシン、Ｏ－ｐ－ニトロベンゾイルオキシン、キノリン骨格を有するキノロン系化合物であるノルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、フレロキサシン、スパルフロキサシン等のキノリン誘導体；（２）クロラニル酸、アルミノン、チオ尿素、ピロガロール、クペロン、ビスムチオール（ＩＩ）、ガロイル没食子酸、チオリド、２－メルカプトベンゾチアゾール、テトラフェニルアルソニウムクロライド等の化合物；（３）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびこれらに類似した骨格を有するジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパノール四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ニトリロトリス（メチレンスルホン酸）三ナトリウム塩、トリエチレンテトラミン六酢酸、メチルＤＴＰＡ、シクロヘキシルＤＴＰＡ、アミノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、マレイミドプロピルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＤＴＰＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＤＴＰＡ；（４）１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、イソチオシアノベンジルＮＯＴＡ等が挙げられる。
　これらの金属キレート試薬のうち、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡが金属キレートの容易な抗体への導入反応、標識率、錯体の安定性等の点で好ましい。
　抗体への放射性金属元素の結合は、常法に従って行うことができる。例えば抗体と金属キレート試薬とを反応させ、予め標識前駆体を調製しておき、次いで放射性金属元素を反応させることにより行うことができる。
＜医薬＞
　本発明によれば、本発明の免疫複合体を含む、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患を治療するための医薬が提供される。
　本発明により提供される免疫複合体は、その薬剤の安定的な状態を保持に対応するため薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを適宜含有させることができる。本発明の免疫複合体は、例えば注射剤として製剤することができる。本発明の免疫複合体の投与量は、患者の症状の程度、年令及び体重、投与方法などに依存し、有効成分である抗体の重量としては通常、約１０ｎｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
　本発明の免疫複合体により治療されうる疾患はＣＤＨ３がその細胞に発現しているものであれば特に限定されないが、例えば、がんを挙げることができる。がんとしては、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、乳がん、頭頚部がん、卵巣がん、肺がん、浸潤性膀胱がん、膵臓がん、脳の転移性がん、甲状腺がん、頭頚部扁平上皮がん、食道扁平上皮がん、肺扁平上皮がん、皮膚扁平上皮がん、メラノーマ、乳腺がん、肺腺がん、子宮頚部扁平上皮がん、膵臓扁平上皮がん、結腸扁平上皮がん、又は胃扁平上皮がん、前立腺がん、骨肉腫又は軟組織肉腫などをあげることが出来るが、これに限定されるものではない。本発明の医薬は、抗腫瘍剤として使用することができる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これの目的は例示的なものであって、本発明の内容が実施例によって限定されるものではない。なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
実施例１：ヒト化抗体作製方法
（１）抗ＣＤＨ３マウス抗体の作製
　抗ＣＤＨ３マウス抗体を特許第６３７７６０１号の実施例１から実施例９に記載の通りに抗ＣＤＨ３マウス抗体を作製し、抗ＣＤＨ３マウス抗体の配列解析から可変領域の配列を得た。
　配列解析はＡｐＥ及びＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス）を使用した。遺伝子のアライメントにはＣＬＵＳＴＡＬＷを使用した。遺伝子、およびタンパク質情報取得・確認にはＨＰＲＤ，　ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ，　ＵＣＳＦ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，　Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ）－　Ｂｌａｔ，　ＵｎｉＰｒｏｔを使用した。
　これにより配列決定されたマウスハイブリドーマに由来する抗ＣＤＨ３マウス抗体の可変領域のうち、ＣＤＲに相当するアミノ酸配列を以下に示す。
ＧＹＳＦＴＡＹＮ：配列番号９（ＣＤＲ－Ｈ１）
ＩＤＰＹＳＧＩＩ：配列番号１０（ＣＤＲ－Ｈ２）
ＡＲＲＧＹＹＤＧＧＦＤＹ：配列番号１１（ＣＤＲ－Ｈ３）
ＱＤＩＴＮＹ：配列番号１２（ＣＤＲ－Ｌ１）
ＹＴＳ：配列番号１３（ＣＤＲ－Ｌ２）
ＱＱＤＳＫＨＰＲＴ：配列番号１４（ＣＤＲ－Ｌ３）
なお、ＣＤＲ－Ｈ１、Ｈ２及びＨ３は重鎖を、ＣＤＲ－Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は軽鎖を構成するＣＤＲ配列を表す。示したＣＤＲのアミノ酸配列は抗ＣＤＨ３マウス抗体可変域の塩基配列をＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｈｕｍａｎＩｇ）で検索することにより得た。
（２）抗ＣＤＨ３抗体の一過性発現ベクターの作製
　キメラ化に際し、軽鎖についてはヒトＣｋをコードするキメラ軽鎖発現ベクターにＣＤＨ３マウス抗体の軽鎖可変領域の遺伝子を接続した遺伝子を設計した。重鎖についてはヒトＣｇ１領域をコードするベクターにＣＤＨ３マウス抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子を接続し設計した。
　ヒト化に際してはマウス由来ＣＤＲ配列とヒト由来ＦＲ配列を組み合わせ、更にヒトＦｃ領域を連結してヒト化抗体発現ベクターを用いて安定生産株を構築した。より具体的には以下の通りである。
　マウスＦＲ配列に相当する領域をヒトに由来したＦＲ配列に入れ替え、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で全長人工合成した。ＦＲ配列に相当する領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列フレーム配列を用いた。生殖系列フレーム配列はクローニングされた抗ＣＤＨ３マウス抗体の塩基配列をＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｈｕｍａｎＩｇ）に入力し、最も類似度の高い配列を選択して設計した。また、親和性低下に対応したアミノ酸配列の置換（ｒｅｓｈａｐｅ）も実施した。
　今回用いた抗ＣＤＨ３ヒト化抗体の重鎖あるいは軽鎖可変領域のアミノ酸配列を以下に示した。
　抗体番号ｈｕ２０１２ｃ及びｈｕ２０１２ｄは同じＣＤＲ配列を持つ。また、ｈｕ２０１２ｄは付記したようなアミノ酸配列の置換を導入している。
抗体番号：ｈｕ２０１２ｃ－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＳＦＴＡＹＮＭＨＷＶＱＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＦＩＤＰＹＳＧＩＩＴＹＡＥＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＹＹＤＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（配列番号１）
抗体番号：ｈｕ２０１２ｃ－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＤＳＫＨＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
（配列番号２）
抗体番号：ｈｕ２０１２ｄ－ＶＨ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＳＦＴＡＹＮＭＨＷＶＱＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＦＩＤＰＹＳＧＩＩＴＹＡＥＫＦＱＧＲＶＴＩＴＶＤＫＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＹＹＤＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（配列番号３）
（ｈｕ２０１２ｃ－ＶＨに対してＡ７２Ｖ、Ｔ７４Ｋが置換されている）
抗体番号：ｈｕ２０１２ｄ－ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＤＳＫＨＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
（配列番号４）
（ｈｕ２０１２ｃ－ＶＬに対してＥ５５Ｈが置換されている）
　これらの配列を持つように設計した人工合成配列遺伝子を、重鎖可変領域の遺伝子についてはヒトＩｇＧ１由来の定常領域の遺伝子が組み込まれたｐＣＸＮベクターに組み込み、軽鎖可変領域の遺伝子についてはヒトκ鎖由来の定常領域の遺伝子が組み込まれたｐＣＸＮベクターに組み込んだ。
　これを発現させて得られた抗ＣＤＨ３ヒト化抗体のアミノ酸の全長配列を以下に示した。ここで抗ＣＤＨ３ヒト化抗体ｈｕ２０１２ｃはＨ鎖がｈｕ２０１２ｃ－Ｈ、Ｌ鎖がｈｕ２０１２ｃ－Ｌからなり、抗ＣＤＨ３ヒト化抗体ｈｕ２０１２ｄはＨ鎖がｈｕ２０１２ｄ－Ｈ、Ｌ鎖がｈｕ２０１２ｄ－Ｌからなるものを言うが、それぞれのＨ鎖とＬ鎖を相互に入れ替えて発現させても良い。
抗体番号：ｈｕ２０１２ｃ－Ｈ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＳＦＴＡＹＮＭＨＷＶＱＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＦＩＤＰＹＳＧＩＩＴＹＡＥＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＹＹＤＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号５）
抗体番号：ｈｕ２０１２ｃ－Ｌ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＤＳＫＨＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号６）
抗体番号：ｈｕ２０１２ｄ－Ｈ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＳＦＴＡＹＮＭＨＷＶＱＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＦＩＤＰＹＳＧＩＩＴＹＡＥＫＦＱＧＲＶＴＩＴＶＤＫＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＹＹＤＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７）
抗体番号：ｈｕ２０１２ｄ－Ｌ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＤＳＫＨＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号８）
実施例２：ｉｃＩＥＦ（画像化キャピラリー等電点電気泳動）
　ｃｈ２０１２とｈｕ２０１２の画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）をｉＣＥ２８０アナライザー（プロテインシンプル社）を用いて行った。
（１）ｌｏａｄｉｎｇ　ｍｉｘｔｕｒｅの調製
　Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（ファルマライト）３－１０、ｐＩマーカーおよび０．５％メチルセルロース溶液を混合し、ｌｏａｄｉｎｇ　ｍｉｘｔｕｒｅを調製した。サンプル数に合わせて調製量は適宜調節した。
Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ　３－１０　　　　２．０　ｕＬ／ｓａｍｐｌｅ
酸性側ｐＩマーカー（４．２２）　　　　０．２５　ｕＬ／ｓａｍｐｌｅ
アルカリ性側ｐＩマーカー（９．４６）０．２５　ｕＬ／ｓａｍｐｌｅ
０．５％メチルセルロース　　 　　　　１７．５　ｕＬ／ｓａｍｐｌｅ
Ｔｏｔａｌ　　　　　　　　　　　　　２０．０　ｕＬ／ｓａｍｐｌｅ
（２）サンプルの調製
　サンプルが２０ｍＭ以上の塩を含む場合は２０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．０）で置換した。尿素は２０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．０）で溶解し１０Ｍ　尿素を用事調製した。
　サンプルを以下の割合で調製した。サンプル濃度は抗体であれば１４０～２００ｕｇ／ｍＬ、薬剤標識抗体であれば４００ｕｇ／ｍＬとした。
ｎ＝１測定の場合
１０Ｍ　尿素　　　　　　　　　　　１０ｕＬ
抗体（１４０～２００ｕｇ／ｍＬ）　２０ｕＬ
ｌｏａｄｉｎｇ　ｍｉｘｔｕｒｅ　　２０ｕＬ
Ｔｏｔａｌ　　　　　　　　　　　　　５０ｕＬ
（３）マーカーの調製
以下の割合でマーカーを調製した。
１０Ｍ　尿素　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｕＬ
２０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ６．０）　　４０ｕＬ
ｌｏａｄｉｎｇ　ｍｉｘｔｕｒｅ　　　　　　　４０ｕＬ
Ｔｏｔａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｕＬ
　調整したサンプルとマーカーはＶｏｒｔｅｘミキサーでよく混和し、卓上用遠心器で３～５分遠心した。専用のグラスバイアルに、サンプルとマーカーを分注し、バイアル内の気泡を除くために卓上用遠心器で軽く遠心した後ｉＣＥ２８０アナライザーのバイアルホルダーにセットし、測定を行った。
（４）結果
　図１はキメラ抗体ｃｈ２０１２、ヒト化抗体ｈｕ２０１２ｃおよびｈｕ２０１２ｄの画像化キャピラリー等電点電気泳動の電気泳動図を示している。ｃｈ２０１２は酸性および塩基性ピークが不均一かつ複数のピークを示した。一方、ヒト化抗体であるｈｕ２０１２ｃ、ｈｕ２０１２ｄのそれぞれの主要ピークの等電点（ｐＩ）はそれぞれ７．９９と８．６０であり主要ピーク以外のピークはほぼ検出されなかった。ｃｈ２０１２をヒト化することにより同等性評価しやすいほぼ単一ピークの抗体を取得した。
実施例３：Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｓｈｉｆｔ　Ａｓｓａｙ（ＴＳＡ）
（１）サンプルの調製
　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｓｈｉｆｔ　Ｄｙｅ　ＫｉｔのＤｙｅ（１０００ｘ）１ｕＬをＭｉｌｌｉ　Ｑ水　１２４ｕＬで希釈してＤｙｅ（８ｘ）とした（１２５ｕＬ、５０サンプル分）。調製量はサンプル数によって適宜変更した。
　サンプルとなる抗体は、ＤＰＢＳに置換し、濃度を０．２５ｍｇ／ｍＬに調製した。
　氷上に指定の８連ＰＣＲチューブもしくは９６ウェルプレートを置き、ｎ＝１測定の場合は以下の割合で反応液を調製した。
Ｄｙｅ（８ｘ）　　　　　　　　　２．５ｕＬ
０．２５　ｍｇ／ｍＬ　Ａｂ　　　　 １７．５ｕＬ
（反応液中抗体濃度：５．０　ｕｇ）
Ｔｏｔａｌ　　　　　　　　　　２０．０ｕＬ
　調整したサンプルはリアルタイムＰＣＲ　ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ　（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社，　ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ－０１登録商標）を用いて測定した。
（２）測定条件
Ｔｅｍｐ．ｒａｎｇｅ　２０－９０℃
Ｈｅａｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　０．２℃
Ｉｎｔｅｒｖａｌ　１０ｓｅｃ
Ｔｉｍｅｓ　３５０　ｔｉｍｅｓ
　解析はＰｒｏｔｅｉｎ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｓｈｉｆｔ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（登録商標）を用いて行った。
（３）結果
　ｃｈ２０１２、ｈｕ２０１２ｃ、ｈｕ２０１２ｄの　サーマルシフトアッセイの結果を図２に示した。
　解析により得られたＴｍ値はｃｈ２０１２は　５９．０℃　、ｈｕ２０１２ｄでは６８．８℃となりヒト化したｈｕ２０１２ｄの方がＴｍ値が高いことが分かった。ｃｈ２０１２をヒト化することにより熱安定性が向上した。
実施例４：抗体の結合活性
　実施例１に示した配列を持つ抗体を作製し、その結合活性をフローサイトメトリで評価した。
　反応対象となる各細胞株（ＣＤＨ３の高発現が確認されているＮＣＩ－Ｈ３５８細胞株）を２ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳで処理することにより培養プレートから剥離後、１×１０６個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、精製したｈｕ２０１２ｃ及びｈｕ２０１２ｄ抗体を０．３ｕｇ／ｍＬになるように添加し、４℃で６０分間反応させた。ＦＡＣＳ溶液（１％ＢＳＡ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．１％ＮａＮ　３入りＰＢＳ、１５０μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ヒトＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ‘）２（インビトロジェン社）４μｇ／ｍｌを加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施した。その結果、ＣＤＨ３発現細胞株への強い反応性が認められた（図３）。ヒト化抗体ｈｕ２０１２ｄはｈｕ２０１２ｃより強い結合活性を示した。
実施例５：内在化能の測定
　サポリン標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｈｕｍ　ＺＡＰ、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して行った。細胞殺傷はサポリンによる内部移行が必須のため、殺傷の程度を測定することにより内在化能の評価が可能である。サポリン標識抗ヒトＩｇＧ抗体を加えなかった時の細胞生存率を１００％とした相対活性で表した。より具体的には以下の通りである。
（１）測定方法
　ヒトＣＤＨ３発現細胞としてヒト乳がん由来細胞株ＨＣＣ１９５４及びヒト肺がん由来細胞株ＮＣＩＨ３５８を用いた。各ウェル当り細胞数５０００個、ＨｕｍＺＡＰ１００ｎｇ（あるいは０ｎｇ）、抗ヒトＣＤＨ３キメラ抗体または抗ヒトＣＤＨ３ヒト化抗体１００ｎｇとなるように調製し、９６穴マイクロプレートに加え、５％ＣＯ２インキュベータ中で３７℃、３日間静置した。
　その後、各ウェルにＣｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（株式会社同仁化学研究所）を１０ｕＬ添加、攪拌後静置し、２時間後にプレートリーダーにてＡ４５０／６２０を測定し生細胞数を計測した。
（２）内在性能の計算
　抗体内在性能の比較は、以下の計算式に従った。
Ｓａｍｐｌｅ（ＺＡＰ＋）：ＨｕｍＺＡＰ存在下でのサンプルのシグナル平均値
Ｓａｍｐｌｅ（ＺＡＰ－）：ＨｕｍＺＡＰ非存在下でのサンプルのシグナル平均値
ＮｏＡｂ（ＺＡＰ＋）：ＨｕｍＺＡＰ存在下での抗体無しウェルのシグナル平均値
ＮｏＡｂ（ＺＡＰ－）：ＨｕｍＺＡＰ非存在下での抗体無しウェルのシグナル平均値
ＢＫ：Ｍｅｄｉｕｍのみウェルのシグナル平均値
（３）結果
　結果を表１及び図４に示す。
　ｈｕ２０１２ｃ及びｈｕ２０１２ｄはＮＣＩ－Ｈ３５８とＨＣＣ１９５４どちらの細胞においてもｃｈ２０１２よりも生細胞率が減少していた。これはサポニン標識抗ヒトＩｇＧ抗体がより内部移行したことを表すためヒト化によって内在化能が高くなることが示された。
実施例６：インビボ
（１）ＤＭ１標識抗体の作製
　結合薬剤の出発物質としてＤＭ１ＳＭｅ（ＣＡＳ　１３８１４８－６８－２）を用いる場合はＴＣＥＰにより還元処理を行いＣ１８カラムを用いたＨＰＬＣ精製する事でＤＭ１ＳＨを得た。一方で抗体にｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣでマレイミド基を導入し、更にＤＭ１ＳＨを反応させる事で、ＤＭ１標識体を調製した。
ＤＭ１ＳＭｅ構造式
（２）ゼノグラフト作製
　ＨＣＣ１９５４細胞を培養し、移植必要量の２倍程度の数が得られるまで拡大した。また、細胞移植前日に、マウス右腹側部の剃毛を行った。
（３）移植
　細胞をＰＢＳ（－）で洗浄した後、ＴｒｙｐｌｅＥｘｐｒｅｓｓ(Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社)で剥離し、１，０００　ｒｐｍ　５分遠心してペレットを回収した。ペレットを抗生物質および血清不含ＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁して５×１０７／ｍｌに調製し、その１００μｌをマウス右側部皮下に移植した。
　インビボ試験は各群５匹とし、ｃｈ２０１２－ＤＭ１とｈｕ２０１２（ｃ／ｄ）－ＤＭ１の５ｍｇ／ｋｇを尾静脈より投与した。投与は平均腫瘍径が１００－１５０ｍｍ３となった時点で１回目の投与し、１週間後に更に同量投与し、計２回投与を行なった。
　結果を図５に示す。ｈｕ２０１２ｃ及びｈｕ２０１２ｄはｃｈ２０１２よりも薬効が高くなることが示された。ヒト化によって熱安定性及び内在化能が向上した結果、薬効が高くなることが示唆された。

Claims (10)

  1. 以下の何れかの抗体。
    （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体；または
    （２）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  2. 以下の何れかの抗体である、請求項１に記載の抗体。
    （１）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体
    （２）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖とを有する抗ＣＤＨ３ヒト化抗体。
  3. ＣＤＨ３との結合能を有する、請求項１又は２に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体の断片。
  4. Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）２、又はｓｃＦｖである、請求項３に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体の断片。
  5. ＣＤＨ３との結合能を有する、請求項１又は２に記載した抗体の部分配列。
  6. 請求項１から５のいずれか１項に記載の抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列と、化学療法剤又は放射性物質とが連結している、免疫複合体。
  7. 化学療法剤が、細胞障害性物質である、請求項６に記載の免疫複合体。
  8. 抗ＣＤＨ３ヒト化抗体、その断片又はその部分配列と、化学療法剤とがリンカーを介して連結している、請求項６又は７に記載の免疫複合体。
  9. 請求項６から８の何れか一項に記載の免疫複合体を含む、ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患を治療するための医薬。
  10. ＣＤＨ３の過剰発現によって特徴づけられる疾患が、がんである、請求項９に記載の医薬。 
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WO2014126198A1 (ja) * 2013-02-15 2014-08-21 株式会社ペルセウスプロテオミクス 抗ｃｄｈ３ヒト化抗体、その薬剤コンジュゲート、及びそれらの使用

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