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JP5537034B2 - ナノレポーターならびにその作製方法および使用方法 - Google Patents

ナノレポーターならびにその作製方法および使用方法 Download PDF

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Description

本出願は、２００５年１２月２３日出願の米国仮出願第６０／７５３，７５８号および２００６年９月８日出願の米国仮出願第８４３，５２８号（それらの各開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）に基づく利益を主張する。
１．発明の分野
本発明は、生体分子サンプル中の個別標的分子の検出および定量のための組成物および方法に関する。特定的には、本発明は、個別標的分子に結合可能なコード化標識化レポーター分子（本明細書中では標識化「ナノレポーター」と記す）に関する。ナノレポーターの標識コードを介して、標的分子へのナノレポーターの結合により標的分子の同定を行う。そのようなナノレポーターの作製方法および使用方法をも提供する。ナノレポーターは、診断、予後判定、品質管理、およびスクリーニングの用途で使用可能である。
２．発明の背景
本発明は、一般的には、混合物中の標的分子の検出、同定、および定量の分野に関する。
人体中の細胞はすべて同一の遺伝物質を含有しているが、同一の遺伝子がその全細胞で活性であるとはかぎらない。遺伝子発現パターンの改変は、生物学的機能に大きな影響を及ぼしうる。遺伝子発現のこうした変化は、生理学的過程および病理学的過程の改変の中核をなす。したがって、疾患細胞と対比される正常細胞における遺伝子発現の同定および定量は、新しい薬剤および診断標的の発見に役立ちうる。
核酸は、その特異的ポリヌクレオチド配列に基づいて検出および定量が可能である。既存の検出法および定量法の根底をなす基本原理は、サンプル中の対象の標的配列への標識化相補的プローブ配列のハイブリダイゼーションである。二本鎖の形成は、サンプル中の標的配列の存在の指標となり、組み込まれた標識の量により測定される二本鎖形成度は、標的配列の量に比例する。
分子ハイブリダイゼーションを呼ばれるこの技術は、複合混合物中の特定の核酸配列の同定および分析に有用なツールになっている。この技術は、たとえば、生物学的サンプル中の種々の微生物の核酸配列を検出するために、診断に使用されてきた。そのほかに、ハイブリダイゼーション技術は、個体間で遺伝的な差異または多型をマッピングするために使用されてきた。さらに、この技術は、異なる細胞集団または異なる薬剤で処理された細胞における遺伝子発現の変化をモニターするために使用されてきた。
以前は、複合サンプル中のごく少数の遺伝子を一度に検出できるにすぎなかった。過去十年以内で、いくつかの技術により、細胞内の多数の転写産物の発現レベルを任意の時点で一度にモニターできるようになった（たとえば、非特許文献１; 非特許文献２; 非特許文献３を参照されたい）。ゲノムのほとんどまたはすべてがわかっている生物では、細胞内の遺伝子の多数の転写産物を分析することが可能である。これらの技術のほとんどは、このプロセスをより効率的なものにした小型化表面上に存在する何千という固定化ＤＮＡ配列で構成されるデバイスであるＤＮＡマイクロアレイを利用する。マイクロアレイを用いて、生物学的サンプル中の何千という遺伝子の存在または不在を単一実験で検出することが可能である。このおかげで、研究者は、１つのサンプルでいくつかの診断試験を同時に行ったり、１回の実験で何千という遺伝子の発現レベルの変化を観察したりすることが可能である。一般的には、マイクロアレイは、グリッド上の正確に規定された位置でナイロン膜やガラススライドのような表面にＤＮＡ配列を結合させることにより作製される。次に、生物学的サンプル中の核酸が標識され、アレイにハイブリダイズされる。標識化サンプルＤＮＡは、ハイブリダイゼーションを起こしているアレイ上の正確な位置を標示し、自動検出を可能にする。
残念なことに、アレイ方式の小型化にもかかわらず、この方法は、依然としてかなりの量の生物学的サンプルを必要とする。しかしながら、罹患組織の生検試料や個別細胞タイプのサンプルのようないくつかの場合には、生物学的サンプルは、供給量に限りがある。そのほかに、マイクロアレイの表面上でのハイブリダイゼーションの速度論的挙動は、少量の水溶液中でのハイブリダイゼーションほど効率的ではない。さらに、マイクロアレイハイブリダイゼーションの結果に基づいてサンプル中に存在する核酸の量を推定する方法は存在するが、マイクロアレイ技術では、これまでのところ、個別レベルで標的分子の検出を行うことができず、所与のサンプル中の標的分子の量を直接定量するためのマイクロアレイに基づく方法も存在しない。
Schena ら、 1995, Science 270:467-470 Lockhartら、 1996, Nature Biotechnology 14:1675-1680 Blanchard ら、 1996, Nature Biotechnology 14:1649
したがって、複合混合物中の標的分子の正確かつ高感度の検出、同定、および定量の必要性が存在する。
本明細書中で参考文献が検討または引用されても、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを承認するものと解釈してはならない。
３．発明の概要
本発明は、多種多様な標的分子の検出、同定、および直接定量に使用しうるユニークに標識された分子、好ましくは合成分子（本明細書中ではナノレポーターと記す）のさまざまな集団を生成させる方法に関する。本方法は、ごく少数の異なるタイプの標識モノマーから出発して識別可能に標識された多数のレポーター分子（それぞれ単一標的分子の検出が可能である）を生成させるという点で有利である。
特定の実施形態では、本発明は、デュアルナノレポーター、すなわち、２つの成分：第１のプローブおよび第２のプローブを含む「プローブペア」を提供する。特定の実施形態では、第１のプローブは、（ａ）（ｉ）第１のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第１の標識結合領域；（ｉｉ）第２のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第２の標識結合領域（第１の標識結合領域とオーバーラップしない）；を含む第１の分子すなわちスカフォールドと、（ｂ）第１の分子に結合された第１の標的特異的配列と、を含む複合体である。第２のプローブは、第２の分子または第２の分子を含む複合体であり、該第２の分子は、（ｉ）第２の標的特異的配列；（ｉｉ）場合により、第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第３の標識結合領域；および（ｉｉｉ）場合により、該第２の分子に結合されたアフィニティータグ；を含む。ただし、第１の標的特異的配列および第２の標的特異的配列は、同一の標的分子の異なる領域に結合し、該プローブペアがその標的分子に結合された時、第１および第２のシグナルの同一性ならびにそれらの互いの相対位置は、標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する。
他の選択肢の実施形態では、本発明は、デュアルナノレポーター、すなわち、２つの成分：第１のプローブおよび第２のプローブを含む「プローブペア」を提供する。特定の実施形態では、第１のプローブは、（ａ）（ｉ）第１のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第１の標識結合領域；（ｉｉ）第２のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第２の標識結合領域；を含む第１の分子すなわちスカフォールドと、（ｂ）第１の分子に結合された第１の標的特異的配列と、を含む複合体である。第２のプローブは、第２の分子または第２の分子を含む複合体であり、該第２の分子は、（ｉ）第２の標的特異的配列；（ｉｉ）場合により、第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第３の標識結合領域；および（ｉｉｉ）場合により、該第２の分子に結合されたアフィニティータグ；を含む。ただし、第１のシグナルおよび第２のシグナルは、空間的もしくは分光的に識別可能であり；第１の標的特異的配列および第２の標的特異的配列は、同一の標的分子の異なる領域に結合し、該プローブペアがその標的分子に結合された時、第１および第２のシグナルの同一性ならびにそれらの互いの相対位置は、標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する。
コードは、第１および第２のシグナルとそれらの互いの相対位置とで構成されうるか、または第１および第２のシグナルならびに追加の標識結合領域（第１または第２の分子上）から同様に生成される追加のシグナルとシグナルの互いの相対位置とで構成されうる。
一般的には、標的分子は、天然に存在する分子または天然に存在する分子のｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡの相補体である。他の実施形態では、標的分子は、天然に存在する分子の変異体、たとえば、その活性、安定性、および／もしくは生体内分布が改良または最適化されたタンパク質またはそのようなタンパク質をコードする核酸である。
標的結合領域がヌクレオチド配列である本発明に係るデュアルナノレポーターの第１の態様では、第１のＤＮＡ分子が第１の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第１のＤＮＡ分子に、前記第１のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合され；かつ第２のＤＮＡ分子が第２の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第２のＤＮＡ分子に、前記第２のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される。
標的結合領域がヌクレオチド配列である本発明に係るデュアルナノレポーターの第２の態様では、第１のＲＮＡ分子が第１の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第１のＲＮＡ分子に、前記第１のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合され；かつ第２のＤＮＡ分子が第２の標識結合領域にハイブリダイズされ、この第２のＤＮＡ分子に、前記第２のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される。
標的結合領域がヌクレオチド配列である本発明に係るデュアルナノレポーターの第３の態様では、複数の第１のＤＮＡ分子が第１の標識結合領域にハイブリダイズされ、これらの第１のＤＮＡ分子に、前記第１のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合され；かつ複数の第２のＤＮＡ分子が第２の標識結合領域にハイブリダイズされ、これらの第２のＤＮＡ分子に、前記第２のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される。
標的結合領域がヌクレオチド配列である本発明に係るデュアルナノレポーターの第４の態様では、複数の第１のＲＮＡ分子が第１の標識結合領域にハイブリダイズされ、これらの第１のＲＮＡ分子に、前記第１のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合され；かつ複数の第２のＲＮＡ分子が第２の標識結合領域にハイブリダイズされ、これらの第２のＲＮＡ分子に、前記第２のシグナルを構成する光を放出する前記１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される。
本発明に係るデュアルナノレポーターの特定の実施形態では、第２のプローブは、（ａ）第２の核酸（スカフォールド）分子と、ただし、この第２の核酸分子は、第３のＲＮＡ分子がハイブリダイズされる第３の標識結合領域を含み、この第３のＲＮＡ分子に、第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される；（ｂ）第２の核酸分子に共有結合された第２の標的特異的配列と；を含む核酸複合体であり、コードは、第１、第２、および第３のシグナルの同一性とそれらの互いの相対位置とを含む。特定の実施形態では、第１の標識結合領域に結合された標識モノマーは同一の波長の光を放出し、この光は前記第１のシグナルを構成し、かつ第２の標識結合領域に結合された標識モノマーは同一の波長の光を放出し、この光は第２のシグナルを構成し、かつ第３の標識結合領域に結合された標識モノマーは同一の波長の光を放出し、この光は第３のシグナルを構成する。他の実施形態では、第１のシグナル、第２のシグナル、および第３のシグナルのうちの少なくとも１つは、複数の異なる波長の光を含む。第１、第２、および第３のシグナルは、分光的に識別可能でありうる。他の選択肢として、第１および第３のシグナルは、１つもしくは複数の同一の波長で発光する。
特定の実施形態では、第１のプローブおよび／または第２のプローブは、アフィニティータグを含む。また、特定の実施形態では、第２のプローブは、第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第３の標識結合領域を含む。好ましくは、第１および第２の分子は核酸分子であり；より好ましくは、標識結合領域および標的特異的配列は、所定のヌクレオチド配列である。本発明に係るデュアルナノレポーターの特定の実施形態では、一方もしくは両方の標識結合領域に結合される１つ以上の標識モノマーは、それらのそれぞれの結合領域にハイブリダイズされる核酸に共有結合されるか、またはそれぞれの標識結合領域に結合される核酸に１つ以上の架橋核酸を介して間接的に共有結合される。
本発明に係るデュアルナノレポーターの特定の実施形態では、第１および第２の標的特異的配列は、１つ以上の前記標識モノマーのいずれによっても標識されないが；ナノレポーター中の少なくとも１つの標的特異的配列は、１つ以上の標識モノマーに直接的もしくは間接的に結合されるスカフォールドに結合される。
本発明に係るデュアルナノレポーターの他の実施形態では、第２の分子は、第４のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第４の標識結合領域をさらに含む。好ましくは、そのようなデュアルナノレポーターがその標的分子に結合された時、コードは、第１のシグナル、第２のシグナル、第３のシグナル、および第４のシグナルの同一性とそれらの互いの相対位置とを含む。
しかしながら、第２の核酸は、第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第３の標識結合領域を含む必要はない。本明細書中では、そのようなプローブを「ゴーストプローブ」と呼ぶ。ゴーストプローブは、標的分子へのナノレポーターのハイブリダイゼーションの速度論的挙動を改良する標的特異的配列と、場合により、デュアルナノレポーターの固定および伸長に使用しうるアフィニティータグと、を含有する。ゴーストプローブを利用するナノレポーターの実施形態では、第１の分子（標識モノマーが結合され、本明細書中では「レポータープローブ」と記されることもある）は、好ましくは約２，０００〜約１０，０００塩基の長さ、より好ましくは約５，０００〜約８，０００塩基の長さの核酸分子であり、第２の分子（「ゴーストプローブ」）は、好ましくは約４０〜約２５０塩基の長さ、より好ましくは約５０〜１００塩基の長さの核酸分子である。特定の実施形態では、第１の分子および第２の分子は両方ともＤＮＡ分子である。本明細書中で使用する場合、数または範囲の前の「約」および「ほぼ」という用語の使用は、その数または範囲プラスまたはマイナス５％を意味する。
アフィニティータグは、第１のプローブまたは第２のプローブに間接的に結合させうる。たとえば、アフィニティータグは、第１または第２のプローブにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドに共有結合させうるか、または第１および／または第２のプローブのスカフォールドにハイブリダイズされる「パッチ」にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドに共有結合させうる。他の選択肢として、アフィニティータグは、第１および第２のプローブの第１の核酸分子および／または第２の核酸分子に共有結合される。
所与の標識結合領域に結合される標識モノマーにより放出されるシグナルは、同一でありうるかまたは異なりうる。したがって、一実施形態では、特定の（たとえば、第１または第２の）標識結合領域に結合される標識モノマーは同一の波長の光を放出し、この光はその標識結合領域に対応するシグナルを構成する。他の選択肢として、他の実施形態では、第１のシグナルおよび第２のシグナルの少なくとも一方は、複数の異なる波長の光を含む。
好ましくは、特定の実施形態では、隣接する標識結合領域に結合される標識モノマーにより放出されるシグナルは、分光的に識別可能である。したがって、特定の実施形態では、第１および第２のシグナルは、分光的に識別可能である。
本発明はさらに、シングルナノレポーターでありうるかまたはデュアルナノレポーターの２つの成分の一方もしくは両方でありうるプローブを提供する。該プローブは、（ａ）（ｉ）第１のＲＮＡ分子がハイブリダイズされる第１の標識結合領域、ただし、この第１のＲＮＡ分子に、第１のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される；（ｉｉ）第２のＲＮＡ分子がハイブリダイズされる第２の標識結合領域、ただし、この第２のＲＮＡ分子に、第２のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される；を含む核酸分子と、（ｂ）核酸分子に共有結合された標的特異的配列と、を含む核酸複合体であり、第１および第２のＲＮＡ分子は、好ましくは、それぞれ少なくとも２０ヌクレオチドであり、標的特異的配列は、標的分子に結合し、この標的分子は、天然に存在する分子または天然に存在する分子のｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡの相補体であり、該プローブがその標的分子に結合された時、第１および第２のシグナルの同一性ならびにそれらの互いの相対位置は、標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する。特定の実施形態では、第１および第２のＲＮＡ分子は、それぞれ、好ましくは少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００ヌクレオチドである。
他の態様では、本発明はプローブを提供し、該プローブは、（ａ）（ｉ）第１のＲＮＡ分子がハイブリダイズされる第１の標識結合領域、ただし、この第１のＲＮＡ分子に、第１のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される；（ｉｉ）第２のＲＮＡ分子がハイブリダイズされる第２の標識結合領域、ただし、この第２のＲＮＡ分子に、第２のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される；を含む合成核酸分子と、（ｂ）合成核酸分子に共有結合された標的特異的配列と、を含む核酸複合体であり、第１および第２のＲＮＡ分子は、それぞれ、少なくとも５０ヌクレオチドであり、標的特異的配列は、標的分子に結合し、この標的分子は、天然に存在する分子または天然に存在する分子のｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡの相補体であり、該プローブがその標的分子に結合された時、第１および第２のシグナルの同一性ならびにそれらの互いの相対位置は、標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する。
さらに他の態様では、本発明はプローブを提供し、該プローブは、（ａ）（ｉ）第１のＲＮＡ分子がハイブリダイズされる第１の標識結合領域、ただし、この第１のＲＮＡ分子に、第１のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが共有結合される；（ｉｉ）第２のＲＮＡ分子がハイブリダイズされる第２の標識結合領域、ただし、この第２のＲＮＡ分子に、第２のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが共有結合される；を含む核酸分子と、（ｂ）核酸分子に共有結合された標的特異的配列と、を含む核酸複合体であり、第１および第２のＲＮＡ分子は、それぞれ、少なくとも５０ヌクレオチドであり、標的特異的配列は、標的分子に結合し、この標的分子は、天然に存在する分子または天然に存在する分子のｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡの相補体であり、該プローブがその標的分子に結合された時、第１および第２のシグナルの同一性ならびにそれらの互いの相対位置は、標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する。
本発明の特定の態様では、標識モノマーは、１つ以上のＲＮＡパッチすなわちＲＮＡ分子を介して本発明に係るナノレポーターの標識結合領域に結合される。そのようなＲＮＡパッチは、好ましくはそれぞれ約（±５％）１００〜約３，０００ヌクレオチド、より好ましくはそれぞれ５００〜約１，５００ヌクレオチドである。
ナノレポーターがアフィニティータグを含む場合、アフィニティータグは、パッチに結合されてデュアルナノレポーター中に存在可能であり、アフィニティータグは、プローブペアの一方または両方の成分上の１つ以上のパッチに結合可能である。
アフィニティータグは、ナノレポーター上の１つ以上のパッチにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドに共有結合させることにより結合可能である。他の選択肢として、アフィニティータグは、ナノレポーターのスカフォールドである核酸分子に結合可能である。
本発明の特定の態様では、ナノレポーター−標的分子複合体が提供される。場合により、ナノレポーター複合体の１つ以上の成分は、精製および／または固定のためにアフィニティータグに共有結合される（以下の第５．１２節に記載されるように伸長前または伸長後のいずれかで）。特定の実施形態では、標的分子自体がアフィニティータグに結合される。たとえば、標的分子が核酸である場合、アフィニティータグは、ビオチン修飾ヌクレオチドとして核酸中に組み込まれるビオチンでありうる。標的分子は、ナノレポーター−標的分子複合体の形成前または形成後にアフィニティータグを介して固定可能である。アフィニティータグがビオチン部分である実施形態では、標的分子は、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆された固体表面上に固定可能である。
ナノレポーターの成分（たとえば、スカフォールド、標的特異的配列）の１つまたは全部は、天然に存在する分子でありうる（またはその配列を有しうる）。しかしながら、完全に集合および標識されたナノレポーターは、一般的には、合成分子、たとえば、天然に存在する配列および／または人工の配列を連結させることにより作製されるキメラ分子（たとえば、ウイルス型もしくはプラスミド型のスカフォールドと哺乳動物の標的特異的配列）である。
本発明に係るナノレポーターは、その標的分子に複合体化された時、好ましくは固定および伸長された時、画像化される。ナノレポーターおよびナノレポーターと標的分子とを含む複合体は、当技術分野で公知の任意の方法により固定可能である。好ましくは、ナノレポーターは、アフィニティータグ用のリガンド（たとえば、それぞれストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体）を含有する表面にナノレポーターをつなぐために使用可能なアフィニティータグ（たとえば、ビオチンまたはジゴキシゲニン）に結合される。固定されたナノレポーターは、当技術分野で公知の任意の方法により、たとえば、流動伸長、後退メニスカス技術、電気伸長、振動電場と組み合わせたナノレポーター含有液の流動狭窄により（ただし、これらに限定されるものではない）、伸長させることが可能である。
本発明はさらに、１０種以上のナノレポーターすなわちプローブの集団を提供する。ただし、各プローブは、合成分子を含み、該合成分子は、次の順序で逐次的に、（ａ）第１のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第１の標識結合領域；（ｂ）第２のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第２の標識結合領域；（ｃ）第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第３の標識結合領域；および（ｄ）標的分子に結合する標的特異的配列；を含み、第１および第２のシグナルは、分光的に識別可能であり；第２および第３のシグナルは、分光的に識別可能であり；第１および第２のシグナルは、前記第１、第２、および第３のシグナルの検出に使用可能な条件下で空間的に解像可能でなく；第２および第３のシグナルは、前記第１、第２、および第３のシグナルの検出に使用可能な条件下で空間的に解像可能でなく；第１および第３のシグナルは、前記第１、第２、および第３のシグナルの検出に使用可能な条件下で空間的に解像可能であり；各プローブは、異なる標的分子に結合する標的特異的配列を含み；第１、第２、および第３のシグナルの同一性ならびに第１および第３のシグナルの互いの相対位置は、各標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する。
好ましくは、標的分子は、天然に存在する分子または天然に存在する分子のｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡの相補体である。
また、好ましくは、標識結合領域および標的特異的配列は、所定のヌクレオチド配列である。
本発明の特定の態様では、本発明に係るプローブ、プローブペア、および／または合成核酸分子は精製される。
特定の実施形態では、第１の標識結合領域に結合される標識モノマーは同一の波長の光を放出し、この光は前記第１のシグナルを構成し；第２の標識結合領域に結合される標識モノマーは同一の波長の光を放出し、この光は第２のシグナルを構成し；第３の標識結合領域に結合される標識モノマーは同一の波長の光を放出し、この光は第３のシグナルを構成する。したがって、そのような実施形態では、特定の標識結合領域に結合される標識モノマーは、同一の波長の光を放出する。
他の特定の実施形態では、第１のシグナル、第２のシグナル、および第３のシグナルの少なくとも１つは、複数の異なる波長の光を含む。そのような実施形態では、少なくとも１つの標識結合領域に結合される２つ以上のモノマーは、異なる波長の光を放出する。
本発明はさらに、１０種以上のナノレポーター−標的分子複合体の集団を提供する。ただし、各複合体は、標的分子に結合された合成分子を含み、該合成分子は、次の順序で逐次的に、（ａ）第１のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第１の標識結合領域；（ｂ）第２のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第２の標識結合領域；（ｃ）第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第３の標識結合領域；および（ｄ）該標的分子に結合する標的特異的配列；を含み、第１および第２のシグナルは、分光的に識別可能であり；第２および第３のシグナルは、分光的に識別可能であり；第１および第２のシグナルは、前記第１、第２、および第３のシグナルの検出に使用可能な条件下で空間的に解像可能でなく；第２および第３のシグナルは、前記第１、第２、および第３のシグナルの検出に使用可能な条件下で空間的に解像可能でなく；第１および第３のシグナルは、前記第１、第２、および第３のシグナルの検出に使用可能な条件下で空間的に解像可能であり；各標的特異的配列（またはデュアルナノレポーター中の標的特異的配列のペア）は、異なる該標的分子に結合し；第１、第２、および第３のシグナルの同一性ならびに第１および第３のシグナルの互いの相対位置は、各標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する。
特定の実施形態では、集団は、固体表面に固定され、好ましくは伸長される。たとえば、集団は、流動伸長、後退メニスカス技術、電気伸長、または振動電場と組み合わせた該複合体を含有する液体の流動狭窄に付すことが可能である。
本発明はこのほかにさらに、標的分子の検出方法を提供する。該方法は、（ａ）標的分子へのプローブの結合を可能にする条件下で生体分子サンプルをプローブに接触させることと、ただし、該プローブは、次の順序で逐次的に、（ｉ）第１のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第１の標識結合領域、（ｉｉ）第２のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第２の標識結合領域、（ｉｉｉ）第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第３の標識結合領域、および（ｉｖ）標的分子に結合する標的特異的配列、を含む合成分子であり、標的特異的配列は、該サンプル中に存在しうる標的分子に結合し、第１および第２のシグナルは、分光的に識別可能であり、第２および第３のシグナルは、分光的に識別可能である；（ｂ）次の条件：第１および第２のシグナルが空間的に解像可能でなく、第２および第３のシグナルが空間的に解像可能でなく、第１および第３のシグナルが該条件下で空間的に解像可能であり、第１、第２、および第３のシグナルの同一性ならびに第１および第３のシグナルの互いの相対位置が、標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する条件の下で、該第１、第２、および第３のシグナルを検出することと；（ｃ）該コードが生成されるかを調べることにより該標的分子を検出することと；を含む。
好ましくは、プローブおよび標的分子は核酸である。
ある特定の実施形態では、第１の標識結合領域に結合される標識モノマーは、同一の波長の光を放出し、第２の標識結合領域に結合される標識モノマーは、同一の波長の光を放出し、第３の標識結合領域に結合される標識モノマーは、同一の波長の光を放出する。そのような実施形態では、第１のシグナル、第２のシグナル、および第３のシグナルはそれぞれ、単一の波長の光で構成される。
他の実施形態では、第１のシグナル、第２のシグナル、および第３のシグナルの少なくとも１つは、複数の異なる波長の光を含む。
本発明はさらに、１つ以上の合成領域（これ以降は「当該領域（Region）」）を含む人工の核酸分子を提供する。ただし、当該領域はそれぞれ、少なくとも５０ヌクレオチドでありかつ規則的反復塩基を含み、該規則的反復塩基は、この領域において該タイプの塩基が周期的間隔で４番目〜２５番目ごとの位置に存在するように４〜２５の周期性を有する。特定の実施形態では、この当該領域内の該塩基の５％以下は、該周期的間隔以外で現れる。人工の核酸は、一本鎖の核酸（たとえば、ナノレポータースカフォールドとして有用な核酸）または少なくとも部分的に（もしくは完全に）二本鎖の核酸（たとえば、パッチがハイブリダイズされるナノレポータースカフォールド）でありうる。人工の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドでありうる。好ましくは、規則的反復塩基は、チミジンまたはウラシルである。特定の実施形態では、この１つ以上の当該領域の規則的反復塩基の周期性は、約６〜約１５であり；他の実施形態では、この１つ以上の当該領域の規則的反復塩基の周期性は、約８〜約１２である。
好ましくは、人工の核酸は、複数の当該領域、たとえば、約２〜約５０個の当該領域または約３〜約１０個の当該領域を含む。
複数の当該領域は、互いにすぐ隣りでありうるかまたは１つ以上のスペーサー領域により分離されうる。スペーサー領域は、たとえば、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（またはその相補体）および／または１つ以上のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（またはその相補体）を含みうる。
特定の実施形態では、複数の当該領域は、配列が互いに異なる。
人工の核酸は、複製起点をさらに含みうる。
好ましくは、１つ以上の当該領域のＧＣ含有率は、約２５％〜約７５％、より好ましくは約４０％〜約６０％、最も好ましくは約５０％（±５％）である。
本発明に係る人工の核酸中のこの１つ以上の当該領域はそれぞれ、好ましくは約５０〜約５０，０００塩基の長さ、より好ましくは約２００〜約２，０００塩基の長さである。
本発明に係る人工の核酸は、好ましくは約５０〜約１００，０００塩基の長さ、より好ましくは約２００〜約１０，０００塩基または約５００〜約２０，０００塩基の長さである。
本発明に係る人工の核酸は、標識結合領域として有用な１つもしくは複数の当該領域を含みうる。人工の核酸が複数の当該領域を含む場合、規則的反復塩基のタイプは、複数の当該領域で同一でありうるかもしくは異なりうる。同様に、規則的反復塩基の周期性は、複数の当該領域で同一でありうるかもしくは異なりうる。特定の実施形態では、本発明は、規則的反復塩基のタイプおよび周期性の両方が複数の当該領域で同一である複数の当該領域を含む人工の核酸を提供する。
本発明に係る人工の核酸は、標的特異的配列をさらに含みうる。
好ましくは、当該領域は、少なくとも１種の六塩基対カッター制限エンドヌクレオチド、たとえば、次の制限エンドヌクレアーゼ：ＢａｍＨ１、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＣｌａＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＡｐａＩ、またはＫｐｎＩのうちの１つに対する認識部位を含まない。特定の実施形態では、当該領域は、六塩基対カッター酵素、または少なくとも人工の核酸内へのクローニングに使用される六塩基対カッター酵素、たとえば、プラスミドのポリリンカー中または当該領域にフランキングする領域中に存在する六塩基対カッター酵素に対するいかなる認識部位をも含まない。
本発明に係る人工の核酸または少なくともその中の当該領域は、好ましくは、ヘアピンループを含有することをＭＦＯＬＤプログラムにより予測されない。
本発明に係る人工の核酸または少なくともその中の当該領域は、好ましくは、１２塩基を超える長さの直接反復および逆方向反復のいずれをも有していない。他の実施形態では、人工の核酸および／または当該領域は、約１１、約１０、または約９塩基を超える長さの直接反復および逆方向反復のいずれをも有していない。
本発明に係る人工の核酸は、好ましくは、プロモーター配列（たとえば、Ｔ７、Ｔ３、もしくはＳＰ６）またはその相補体を含む。
本発明に係る人工の核酸は、ファージキャプシド形成配列をさらに含みうる。
本発明に係る人工の核酸中の当該領域は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位によりフランキングされていてもよい。
人工の核酸は、当該領域が標識結合領域として有用であるナノレポータースカフォールドとして使用可能である。したがって、本発明は、１つ以上の当該領域を含む人工の核酸を提供する。ただし、この１つ以上の当該領域の規則的反復塩基は、少なくとも１つの発光標識モノマーに結合される。少なくとも１つの規則的反復塩基は、標識モノマーに共有結合可能であるか、または標識モノマーが共有結合される他の核酸へのハイブリダイゼーションを介して標識モノマーに結合可能である。特定の実施形態では、少なくとも２つの異なる当該領域は、異なる発光標識モノマーに結合される。
本発明に係る人工の核酸は、アフィニティータグおよび／または複製起点をさらに含みうる。
本発明の一態様では、人工の核酸は、部分的にまたは完全に二本鎖の分子であり、その一方の鎖は、複数のＲＮＡがハイブリダイズされるＤＮＡであり、各ＲＮＡは、規則的反復塩基がアミノアリル修飾ウラシルである単一領域を含む。特定の実施形態では、存在する該アミノアリル修飾ウラシルの少なくとも５０％は、少なくとも１つの発光標識モノマーに共有結合され；他の実施形態では、存在パーセントは、少なくとも６０％の、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％である。この存在パーセントは、当技術分野で公知の任意の手段により測定可能である。
他のところで考察されているように、本発明に係るナノレポーターは、パッチおよび場合によりフラップに結合される核酸スカフォールドを含みうる。そのような構造体の詳細については、後掲の第５．３節で考察され、代表的なパッチ構造体およびフラップ構造体は、図７に示されている。
本発明はさらに、標的分子の検出方法を提供する。該方法は、（ａ）標的分子への合成分子の結合を可能にする条件下で、標的分子を含有する可能性のある生体分子サンプルを本明細書に記載のナノレポーター構造体のいずれかに接触させることと、（ｂ）ナノレポーターコードの生成および／または検出を可能にする条件に付すことと、（ｃ）ナノレポーターコードが生成されるか否かまたは存在するか否かを調べることにより該標的分子を検出することと、を含む。
本発明の特定の態様では、本方法のナノレポーターは、（ｉ）第１のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第１の標識結合領域、ただし、該第１のシグナルはすべて同一である；（ｉｉ）第２のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第２の標識結合領域、ただし、該第２のシグナルはすべて同一である；（ｉｉｉ）第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第３の標識結合領域、ただし、該第３のシグナルはすべて同一である；を含む合成分子であり、各結合領域は、複数のパッチペアを含み；第１および第２のシグナルは、分光的に識別可能であり；第２および第３のシグナルは、分光的に識別可能であり；ナノレポーターコードが存在するか否かおよび／または生成されるか否かを調べることは、（ｂ）次の条件：第１および第２のシグナルが空間的に解像可能でなく、第２および第３のシグナルが空間的に解像可能でなく、第１および第３のシグナルが該条件下で空間的に解像可能であり、第１、第２、および第３のシグナルの同一性ならびに第１および第３のシグナルの互いの相対位置が、標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する条件の下で、該第１、第２、および第３のシグナルを検出することを含む。それにより、標的分子が検出される。
４．図の簡単な説明
（以下の「図面の簡単な説明」に記載）
５．発明の詳細な説明
本発明は、ナノレポーターならびにその作製および使用に関する。完全に集合および標識されたナノレポーターは、２つの主要部分、すなわち、標的分子に結合可能な標的特異的配列と、標的特異的配列に関連付けられる「コード」（「ナノレポーターコード」）のシグナルを放出する標識化領域と、を含む。標的分子へのナノレポーターの結合時、ナノレポーターコードは、ナノレポーターが結合される標的分子を同定する。
ナノレポーターはモジュール構造体である。一般的には、ナノレポーターは、３つの基本エレメント：２つ以上の標識結合領域を含有するスカフォールド、スカフォールドに結合された１つ以上のパッチ、および同様にスカフォールドに結合された標的特異的配列を含有する分子状物質である。ナノレポーターのエレメントは、単一の分子状物質（「シングル」ナノレポーター）または２つの異なる分子状物質（「デュアル」ナノレポーター）の形態で見いだされうる。各分子状物質は、１つの分子または共有結合手段もしくは非共有結合手段により互いに結合された２つ以上の分子で構成されうる。一般的には、デュアルナノレポーターの各成分は、同一の標的分子上の異なる部位に結合する標的特異的配列を有する。これにより、標的分子へのナノレポーターの結合の速度論的挙動がより効率的でありかつより良好なシグナル：ノイズ比がより大きい結合特異性により生成されるより小さいナノレポーター成分を得ることが可能になる。
ナノレポータースカフォールドに結合されるパッチは、標識モノマーをナノレポータースカフォールドに結合させる機能を有する。パッチは、たとえば、１つ以上の標識モノマーを核酸パッチ中に共有結合で組み込むことにより、直接的に標識可能である。他の選択肢として、パッチは、フラップに結合させることが可能であり、このフラップは、たとえば、１つ以上の標識モノマーを核酸フラップ中に共有結合で組み込むことにより、直接的に標識可能であるか、または、たとえば、１つ以上の標識モノマーに共有結合されるオリゴヌクレオチドに核酸フラップをハイブリダイズさせることにより、間接的に標識可能である。標識結合領域に結合される標識モノマーをパッチ中またはフラップ中に直接的に組み込まない場合、パッチまたはフラップは、標識モノマーと標識結合領域との間の「架橋」として機能するので、「架橋分子」たとえば架橋核酸と呼びうる。
このほか、ナノレポーターは、精製および／または固定（たとえば固体表面に）のためにアフィニティータグを有しうる。ナノレポーターまたはナノレポーター−標的分子複合体は、好ましくは、２回以上の親和性選択工程で精製される。たとえば、デュアルナノレポーターの場合、一方のプローブは、第１のアフィニティータグを含みうる。また、他方のプローブは、第２の（異なる）アフィニティータグを含みうる。プローブは、標的分子と混合され、デュアルナノレポーターの２つのプローブを含む複合体は、一方または両方の個別アフィニティータグに対するアフィニティー精製により、未結合物質（たとえば、標的またはナノレポーターの個別プローブ）から分離される。第１の工程では、第１のアフィニティータグを含むプローブおよび所望の複合体のみが精製されるように、混合物を第１のアフィニティータグ用の親和性試薬に結合させることが可能である。結合された物質を第１の親和性試薬から遊離させ、場合により、第２のアフィニティータグ用の親和性試薬に結合させることにより、第１のアフィニティータグを含むプローブから複合体を分離することが可能である。この時点では、完全な複合体だけが結合されるであろう。最後に、複合体を第２のアフィニティータグ用の親和性試薬から遊離させ、次に、好ましくは伸長させて画像化に付す。親和性試薬は、アフィニティータグ用の結合パートナーで被覆された任意の固体表面、たとえば、結合パートナーで被覆されたカラム、ビーズ（たとえばラテックスビーズもしくは磁気ビーズ）、またはスライドでありうる。親和性試薬を用いるナノレポーターの固定および伸長については、「配向させて固定された巨大分子を含む組成物およびその調製方法」という名称で代理人整理番号１１６１６−０１４−８８８で２００５年１２月２３日にＳｅａｎ Ｍ．ＦｅｒｒｅｅおよびＤｗａｙｎｅ Ｌ．Ｄｕｎａｗａｙにより出願された米国仮出願第６０／７５３，８１６号（参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）に十分に記載されている。
核酸であるかまたは核酸を含むナノレポーターおよびナノレポーター−標的複合体は、ナノレポーターまたは標的の少なくとも一部に相補的な核酸たとえばオリゴヌクレオチドを用いて、アフィニティー精製または固定が可能である。標的がポリＡストレッチまたはポリｄＡストレッチを含む特定用途では、ナノレポーター−標的複合体は、ポリｄＴオリゴヌクレオチドで被覆された親和性試薬により精製または固定が可能である。
所与のナノレポーターのスカフォールドの種々の標識結合領域に関連付けられる標識モノマーにより放出されるシグナルの配列は、ナノレポーターのユニークな同定を可能にする。ユニークな同一性またはユニークな分光的識別特性を有するナノレポーターは、特異的標的分子またはその一部を認識する標的特異的配列に関連付けられる。標的分子へのナノレポーターの標的特異的配列の結合を可能にする条件下で標的分子を含有する混合物にナノレポーターを暴露した場合、標的特異的配列は、標的分子に優先的に結合する。ナノレポーターに関連付けられる分光コードの検出は、混合物中の標的分子の存在の検出を可能にする（定性分析）。所与の分光コードまたは分光的識別特性に関連付けられるすべての標識モノマーの計数は、ナノレポーターに結合された標的特異的配列に関連付けられる混合物中のすべての分子の計数を可能にする（定量分析）。したがって、ナノレポーターは、既知の生物学的マーカーの定量分析による異なる生物学的状態（たとえば、疾患状態ｖｓ健常状態）の診断または予後判定に有用である。さらに、本発明に係るナノレポーターにより単一分子の検出および定量の卓抜した感度が提供されるので、新しい診断マーカーおよび予後判定マーカー（異なる生物学的状態間の変動が小さすぎて伝統的分子法を用いて特定の生物学的状態との相関を検出できないマーカーを包含する）の同定が可能になる。ナノレポーターに基づく分子検出の感度は、少量の生物学的サンプルにおける治療剤および診断剤の詳細な薬動学的分析を可能にする。
シングルナノレポーターと呼ばれる多くのナノレポーターは、図１Ｄに示されるように１つの分子状物質で構成される。しかしながら、ナノレポーターの特異性の増大および／または標的分子への結合の速度論的挙動の改良のために、好ましいナノレポーターは、同一の標的分子の異なる領域に結合する異なる標的特異的配列をそれぞれ含有する２つの分子状物質で構成されるデュアルナノレポーターである。デュアルナノレポーターの種々の実施形態は、図１Ａ〜１Ｃに描かれている。デュアルナノレポーターの場合、２つの分子状物質の少なくとも一方が標識される。他方の分子状物質は、必ずしも標識されるとは限らない。デュアルナノレポーターのそのような非標識化成分は、本明細書中では「ゴーストプローブ」（図１Ｃ参照）と記され、多くの場合、結合されたアフィニティータグを有し、このタグは、複合体の可視化および／または画像化を可能にするために、デュアルナノレポーターと標的分子とを含有する複合体の固定および／または伸長を行うのに有用である。
モジュール構造体であるので、ナノレポーターは、多種多様な形で集合および標識が可能である。たとえば、ナノレポータースカフォールドを標的特異的配列に結合させ（たとえば、ハイブリダイゼーションおよび場合によりライゲーションにより）、スカフォールドと標的特異的配列とを含む構造体を１つ以上のパッチおよび所望によりフラップに結合させることが可能である。他の選択肢として、最初にナノレポータースカフォールドを１つ以上のパッチ（および場合によりフラップ）に結合させ、次に、スカフォールド／パッチ構造体を標的特異的配列に結合させることが可能である。したがって、とくに指定がないかぎり、ナノレポーター集合の工程に関する考察または列挙がなされていても、特定の集合経路に従わなければならないことを示唆するものではない。
ナノレポーターの集合および使用については、本明細書中では主に、さまざまな核酸型ナノレポーターの説明を介して例示されるが；当業者であれば、本明細書に記載の方法がアミノ酸型（または核酸／アミノ酸ハイブリッド型）ナノレポーターに適用可能であることはわかるであろう。部分的におよび完全に集合させたナノレポーターの例示的な実施形態を以下に列挙する。
最も単純な場合、本発明は、標識および解像が可能な少なくとも２つの標識結合領域を有するスカフォールドを提供する。スカフォールドは、個別に標識および解像が可能な標識結合領域をスカフォールド上に形成しうる任意の分子状物質でありうる。スカフォールド上に形成される標識結合領域の数は、スカフォールドの長さおよび性質、ナノレポーターを標識する手段、ならびにスカフォールドの標識結合領域に結合されてシグナルを放出する標識モノマーのタイプに基づく。本発明に係るナノレポーターは、２つ以上の標識結合領域を含むスカフォールドを有しうる。好適なスカフォールド構造体としては、ＤＮＡ型スカフォールドが挙げられる。
本発明はまた、１つ以上の標識結合領域が対応する標識モノマー（各標識モノマーはシグナルを放出する）に結合される標識化ナノレポーターを提供する。たとえば、少なくとも２つの標識モノマーがスカフォールドの２つの対応する標識結合領域に結合されて、これらの標識された標識結合領域または「スポット」が識別可能になる場合、本発明に係る標識化ナノレポーターが得られる。スカフォールドの異なる標識結合領域に関連付けられるシグナルを放出する標識モノマーは、検出条件下で分光的に識別不可能なシグナル（「同じ」シグナル）を放出しうるか、または少なくとも検出条件下で（たとえば、ナノレポーターの固定、伸長、および顕微鏡下での観察を行う時に）、分光的に識別可能なシグナルを放出しうる。
本発明はまた、２つ以上の標識モノマーが標識結合領域に結合されるナノレポーターを提供する。該標識結合領域に関連付けられる標識モノマーにより放出されるシグナルは、検出される総和シグナルを生成する。生成される総和シグナルは、同じシグナルで構成されうるか、または少なくとも２つの分光的に識別可能なシグナルで構成されうる。
一実施形態では、本発明は、同じシグナルを放出する少なくとも２つの標識モノマーがスカフォールドの２つの対応する標識結合領域に結合されかつ該２つの標識モノマーが空間的に識別可能であるナノレポーターを提供する。他の実施形態では、本発明は、２つの識別可能なシグナルを放出する少なくとも２つの標識モノマーが２つの近接する標識結合領域（たとえば、２つの隣接する標識結合領域）に結合されて該少なくとも２つの標識モノマーが分光的に識別可能であるナノレポーターを提供する。
本発明は、同じシグナルを放出する２つのスポットがスペーサー領域により分離されてスペーサー領域の介在が該２つのスポットに結合された標識モノマーにより放出される該同じシグナルの解像またはより良好な解像を可能にするナノレポーターを提供する。一実施形態では、スペーサー領域は、ナノレポーターの検出に利用される機器の解像度により決定される長さを有する。
本発明は、１つ以上の「ダブルスポット」を有するナノレポーターを提供する。各ダブルスポットは、スペーサー領域により分離されることなく同じシグナルを放出する２つ以上（たとえば、３つ、４つ、または５つ）の隣接するスポットを含有する。ダブルスポットは、それらのサイズにより同定可能である。
本発明に係るシグナルを放出する標識モノマーは、標識結合領域に結合されたパッチに共有結合または非共有結合で（たとえばハイブリダイゼーションを介して）結合させることが可能である。標識モノマーはまた、パッチに結合されたフラップに共有結合または非共有結合で（たとえばハイブリダイゼーションを介して）結合させることが可能であり、続いてパッチをスカフォールドに結合させることが可能である。フラップは、１つの分子またはスプリットフラップを形成する２つ以上の分子（「フラップ片」）により形成可能である。
本発明はまた、ナノレポーターのスカフォールド上の標識結合領域に（たとえばパッチを介して間接的に）結合された標識モノマーにより放出される一連のシグナルにより測定される分光コードに関連付けられるナノレポーターを提供する。ただし、分光コードの検出によりナノレポーターの同定が可能である。
一実施形態では、本発明は、担体へのアフィニティータグの結合によりスカフォールドの伸長とスカフォールド上の異なる標識結合領域に対応する標識モノマーにより放出されるシグナルの解像とが可能になるようにナノレポータースカフォールドに結合されたアフィニティータグをさらに含むナノレポーターを提供する。ナノレポーターの伸長は、当技術分野で公知のいずれかの伸長手段、たとえば、物理的、流体力学的、または電気的な手段などの手段（ただし、これらに限定されるものではない）を必要としうる。
さらに他の実施形態では、本発明は、スカフォールドの標識結合領域に結合されたフラップをさらに含むナノレポーターを提供する。ただし、スカフォールドの標識結合領域に結合されたフラップは、該標識結合領域に対応する標識モノマーを結合させることにより、該スカフォールド上の対応する標識結合領域に標識モノマーを間接的に結合させる。さらなる実施形態では、各標識モノマーは、シグナル放出部分と所定の配列のオリゴヌクレオチド部分とを含み、フラップは、対応する標識のオリゴヌクレオチド部分に相補的なフラップ配列の反復を含み、それにより、１つ以上の標識モノマーは、該フラップ配列の該反復への該標識モノマーの該オリゴヌクレオチド部分のハイブリダイゼーションを介して対応する標識結合領域に結合して、標識化ナノレポーターを生成させる。
本発明に係るナノレポーターは、スカフォールドに結合された標的特異的配列をさらに含みうる。標的特異的配列は、ナノレポーターが標的分子を認識して標的分子に結合しうるように選択される。本発明に係るナノレポーターは、あらゆるタイプの標的分子の同定に好適である。たとえば、標的分子の検出を可能にするように、適切な標的特異的配列をナノレポーターのスカフォールドに結合させることが可能である。好ましくは、標的分子は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを包含する）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡを包含する）、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。
本発明の一実施形態は、本発明に係る標識モノマーを用いた標的分子の検出の柔軟性の増大を提供する。この実施形態は、個別の標的特異的領域をそれぞれ有する２つの異なる分子状物質を含むデュアルナノレポーターであり、これらの分子状物質は、少なくとも一方が標識され、同一の標的分子に結合する。したがって、デュアルナノレポーターの２つの成分の標的特異的配列は、選択された標的分子の異なる部分に結合し、それにより、デュアルナノレポーターに関連付けられる分光コードの検出は、該デュアルナノレポーターに接触した生体分子サンプル中の選択された標的分子の検出を提供する。
本発明はまた、生体分子サンプル中の特定の標的分子の存在を検出する方法を提供する。この方法は、（ｉ）標的分子へのデュアルナノレポーター中の標的特異的配列の結合を可能にする条件下で該サンプルをデュアルナノレポーターに接触させることと、（ｉｉ）デュアルナノレポーターに関連付けられる分光コードを検出することと、を含む。ナノレポーター構成に依存して、デュアルナノレポーターは、標的分子への結合前または結合後に標識可能である。
特定の実施形態では、検出方法は、複数の標的分子が同一のアッセイ（単一の反応混合物）で検出される多重アッセイで実施される。好ましい実施形態では、アッセイは、複数の標的分子が同時に検出されるハイブリダイゼーションアッセイである。特定の実施形態では、同一のアッセイで検出される複数の標的分子は、少なくとも５種の異なる標的分子、少なくとも１０種の異なる標的分子、少なくとも２０種の異なる標的分子、少なくとも５０種の異なる標的分子、少なくとも７５種の異なる標的分子、少なくとも１００種の異なる標的分子、少なくとも２００種の異なる標的分子、少なくとも５００種の異なる標的分子、もしくは少なくとも７５０種の異なる標的分子、または少なくとも１０００種の異なる標的分子である。他の実施形態では、同一のアッセイで検出される複数の標的分子は、５０種までの標的分子、１００種までの異なる標的分子、１５０種までの異なる標的分子、２００種までの異なる標的分子、３００種までの異なる標的分子、５００種までの異なる標的分子、７５０種までの異なる標的分子、１０００種までの異なる標的分子、２０００種までの異なる標的分子、または５０００種までの異なる標的分子である。さらに他の実施形態では、検出される複数の標的分子は、以上の数の間の任意の範囲内の異なる標的分子、たとえば、２０〜５０種の異なる標的分子、５０〜２００種の異なる標的分子、１００〜１０００種の異なる標的分子、５００〜５０００種の異なる標的分子であるが、これらに限定されるものではない。
特定の実施形態では、本発明は、同一のＲＮＡの異なるスプライス形態の検出に関する。異なるスプライス形態は、同一の遺伝子の異なるエキソンに相補的な異なる標的特異的配列をそれぞれ有する複数のナノレポータープローブを用いて検出可能である。
ナノレポーターの構造安定性は、パッチのライゲーション、場合により、スプリットフラップおよび／またはスプリットフラップにハイブリダイズされた標識化オリゴヌクレオチドのライゲーションを介して、増大可能である。
本発明に係るナノレポーターおよびそれに基づく分析方法により提供される定性分析能力のほかに、本発明に係るナノレポーターは、定量分析の実施に比類なく好適である。本発明に係るナノレポーター（シングルナノレポーターまたはデュアルナノレポーターを問わず）と生体分子サンプル中のその標的分子との一対一の結合を提供することにより、サンプル中に存在する標的分子の全部または代表的な一部の同定および計数が可能である。種々の分子種のこの個別計数は、生体分子サンプル中の標的分子の絶対濃度または相対濃度を測定するための正確かつ直接的な方法を提供する。さらに、混合物中の各分子を個別に取り扱うことができるので、高感度、最小限のサンプル量要件、少量での溶液相速度論的挙動により提供される高反応速度、および最終的に非常に低い試薬コストをはじめとする小型化の利点が得られる。
以下に提供される説明および実施例からわかるであろうが、本発明は、多数の利点を提供する。たとえば、本発明に係るナノレポーターの形成における複合体のモジュール性は、非常に高い多様度（たとえば、何百万ものユニークに認識しうるナノレポーター）を有するユニークなナノレポーターのライブラリーの系統的作製を可能にする。このモジュール性は、ナノレポーター集団を特定用途にカスタマイズする柔軟性をもたらし、さらには有意な作製効率を提供する。以下の説明からわかるであろう他の利点は、本発明に係るナノレポーターの集合の柔軟性から生じる。すなわち、モジュール構造のおかげで、本発明に係るナノレポーターは、使用場所に輸送する前に集合させたり、使用場所で集合させたりすることが可能である。
５．１ ナノレポーター関連用語
ナノレポーター：「ナノレポーター」という用語は、（ｉ）少なくとも２つの標識結合領域を含有する分子（「スカフォールド」）；（ｉｉ）少なくとも１つの標識結合領域に結合される少なくとも１つのパッチ；および（ｉｉｉ）標的特異的配列；を有する分子状物質を意味する。以下で詳細に説明するように、ナノレポーターは、シングルナノレポーター（すべての成分が単一の分子状物質中に存在する）またはデュアルナノレポーター（すべての成分が２つの個別の分子状物質中に存在する）でありうる。ナノレポーターは、好ましくは合成分子、すなわち天然に存在しない分子、たとえば、通常は２つ以上の分子（たとえば、プラスミド、染色体、ウイルスゲノム、タンパク質など）上に存在する２つ以上の人工の配列および／または天然に存在する配列を連結させることにより作製されるキメラ分子である。
標識化ナノレポーター：標識化ナノレポーターとは、ナノレポーターコードの少なくとも一部を形成するシグナルを生成する１つ以上の標識モノマーにナノレポーターの少なくとも１つのパッチが結合されているナノレポーターのことである。
標識ユニット：「標識ユニット」という用語は、標識化ナノレポーターの非標的特異的部分を意味する。
プローブ：これは、標的特異的配列を有する分子を意味する。シングルナノレポーターとの関連では、「プローブ」という用語は、ナノレポーター自体を意味し；デュアルナノレポーターとの関連では、「プローブ」という用語は、ナノレポーターの２つの成分の一方もしくは両方を意味する。
プローブペア：これはデュアルナノレポーターを意味する。
パッチ：「パッチ」という用語は、一般的にはナノレポーターを標識する目的で、ナノレポータースカフォールドの標識結合領域に結合される分子状物質を意味する。パッチは、スカフォールドへの結合前または結合後のいずれかで、直接的に（共有結合もしくは非共有結合で）または間接的に結合される１つ以上の標識モノマーを有しうる。
フラップ：本明細書中で使用される「フラップ」という用語は、標識結合領域に結合されるパッチまたはパッチペアに結合される分子状物質を意味する。フラップは、標識モノマーを含有するかまたは標識モノマーを含有する１つ以上の分子に結合可能である１つ以上の分子である。領域の間接的標識を行うことにより、フラップは、領域に関連付けられるシグナル放出モノマーの数およびそのモノマーの性質を制御するうえでより高い柔軟性を提供する。フラップは、「スプリットフラップ」を形成する単一の分子片または複数の分子片（たとえば２つの片）により形成可能である（たとえば図７参照）。
標的特異的配列：「標的特異的配列」という用語は、標的分子に結合可能な分子状物質を意味する。ナノレポーターとの関連では、標的特異的配列は、ナノレポータースカフォールドに結合される。標的分子は、好ましくは、天然に存在する分子または天然に存在する分子のｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡの相補体である（ただし、必ずしもそうである必要はない）。
ゴーストプローブ：標的特異的配列を含むがナノレポーターコードに寄与するシグナルを放出する標識モノマーで標識されない分子。
レポータープローブ：ナノレポーターコードに寄与するシグナルを放出する少なくとも１つの標識モノマーで標識される標的特異的配列を含む分子。シングルナノレポーターは、デュアルナノレポーターの標識化成分と同様にレポータープローブである。
ＦフックおよびＧフック：デュアルナノレポーターとの関連では、ＦフックおよびＧフックとは、それぞれ、プローブの１つに選択的に結合可能なアフィニティータグのことである。好ましい実施形態では、ＦフックおよびＧフックは、デュアルナノレポーターのそれぞれのナノレポータープローブ中に（たとえばライゲーションを介して）存在するかまたはそれぞれのナノレポータープローブに（たとえばハイブリダイゼーションを介して）結合されるそれぞれの相補的配列にハイブリダイズ可能なビオチン化オリゴヌクレオチドである。したがって、ＦフックおよびＧフックは、ナノレポーターの精製、固定、および伸長のために使用可能である。一般的には、デュアルナノレポーターが１つのレポータープローブと１つのゴーストプローブと含有する場合、Ｇフックは、レポータープローブに結合された状態になり、Ｆフックは、ゴーストプローブに結合された状態になる。ＦフックおよびＧフックは、いずれかの末端または内部にビオチン化可能である。それらはまた、アフィニティー精製用の固体基材に結合できるようにアミン修飾可能である。
ＦタグおよびＧタグ：それぞれ、ＦフックおよびＧフックに相補的な約１０〜約２５ヌクレオチドのタンデム反復配列。ＧタグおよびＦタグは、ナノレポータープローブに結合される。一般的には、Ｆタグは、ライゲーター配列を介してゴーストプローブ中に存在するかまたはゴーストプローブに結合され、Ｇタグは、ライゲーター配列を介してレポータープローブスカフォールド中に存在するまたはレポータープローブスカフォールドに結合される。
スポット：スポットとは、ナノレポーターの検出との関連では、ナノレポーター上の単一の標識結合部位に結合される標識モノマーから検出される総和シグナルのことであり、標識結合領域のサイズおよび標識モノマーの性質（たとえば主発光波長）に依存して、顕微鏡下で視覚化した時に単一の点光源として現れうる。ナノレポーターに由来するスポットは、オーバーラップしていることもあればオーバーラップしていないこともある。標的分子を同定するナノレポーターコードは、スポットの長さ、他のスポットに対するその相対位置、および／またはそのシグナルの性質（たとえば主発光波長（複数可））の任意の入替え形態を含みうる。一般的には、本発明に係る各プローブまたは各プローブペアでは、隣接する標識結合領域は、オーバーラップせず、かつ／または隣接する標識結合領域に由来するスポットは、少なくとも検出条件下で（たとえば、本明細書に記載されるようにナノレポーターの固定、伸長、および顕微鏡下での観察を行う時）、空間的および／もしくは分光的に識別可能である。
折にふれて、特定数の塩基またはヌクレオチドとしてスポット「サイズ」が参照される。当業者であれば容易にわかるであろうが、これは、対応する標識結合領域中の塩基またはヌクレオチドの数を意味する。
ナノレポーターコード：ナノレポーターに由来するスポットの順序および性質（たとえば主発光波長（複数可）、場合によりさらに長さ）は、ナノレポーターの標的特異的配列（複数可）を介してナノレポーターにより結合可能な標的分子を同定するナノレポーターコードとして機能する。また、ナノレポーターが標的分子に結合された時、ナノレポーターコードは、標的分子を同定する。場合により、スポットの長さは、ナノレポーターコードの成分でありうる。
ダークスポット：「ダークスポット」という用語は、ナノレポーター上の標識結合部位に由来するシグナルや「スポット」の欠如を意味する。ダークスポットをナノレポーターコード中に組み込むことにより、より多くのコード入替え形態を追加し、ナノレポーター集団におけるより大きなナノレポーター多様性を生成することが可能である。
レジスター：「レジスター」という用語は、一連の交互標識結合領域を意味する。
５．２ ナノレポータースカフォールド
ナノレポータースカフォールドは、標識モノマーが直接的もしくは間接的に結合されうる標識結合領域を含有する任意の分子状物質、より好ましくは核酸分子でありうる。一実施形態では、ナノレポータースカフォールドは、タンパク質スカフォールドであり；好ましい実施形態では、ナノレポータースカフォールドは、核酸スカフォールドであり、その標識結合領域は、オリゴヌクレオチドパッチ、ＲＮＡパッチ、またはＤＮＡパッチのような他の核酸がハイブリダイゼーションにより結合されうる一本鎖領域である。特定の実施形態では、ナノレポータースカフォールドは、核酸分子である。
本発明に係るナノレポーターの形成に好適なスカフォールドのタイプに関しては、これといった特別な制限があるわけではない。本発明に係るスカフォールドは、本質的には、たとえば、一本鎖線状スカフォールド、二本鎖線状スカフォールド、一本鎖環状スカフォールド、または二本鎖環状スカフォールドをはじめとする任意の構造体を有しうる。スカフォールド構造体の例としては、たとえば、ポリペプチド、核酸、または炭水化物のような１つの分子状物質で作製されるスカフォールドが挙げられる。スカフォールドはまた、構造体の組合せを含みうる。たとえば、１つ以上の炭水化物ストレッチに結合される１つ以上のポリペプチドストレッチでスカフォールドを作製することが可能である。
本発明に係るスカフォールドに好適な分子状物質としては、高分子構造体、特定的にはＤＮＡのような核酸型高分子構造体が挙げられる。ＤＮＡ型構造体は、本発明との関連では、少なくとも部分的な理由としてＤＮＡ構築物の操作を可能にする既存の技術および方法の範囲がきわめて広いので、多くの利点を提供する。
以上に述べたように、スカフォールドは、一本鎖または二本鎖でありうる。二本鎖スカフォールドは、従来の二本鎖ＤＮＡであるかまたは結合されたパッチユニットもしくはフラットパッチを有する線状一本鎖ストレッチの核酸で構成される二本鎖であるかのいずれかでありうる。
スカフォールドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜１００個もしくはそれ以上の標識結合領域を有しうる。
ナノレポータースカフォールドの標識結合領域は、標識方法に依存してサイズがさまざまであろう。種々の実施形態では、標識結合領域は、１０ｎｍ〜１０，０００ｎｍの間の任意の長さを有しうるが、より好ましくは５０ｎｍ〜５，０００ｎｍであり、より好ましくは１００ｎｍ〜１，０００ｎｍである。種々の実施形態では、標識結合領域は、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、約２００ｎｍ〜約４００ｎｍ、または２５０〜約３５０ｎｍである。好ましい実施形態では、標識結合領域は、回折限界スポットのサイズ、すなわち、標準的な光学素子で検出可能な最小スポット（約３００ｎｍである）にほとんど一致する。
スカフォールドが核酸である場合、１ｎｍは、約３ヌクレオチドに対応し；したがって、約３００ｎｍの標識結合領域は、約９００塩基に対応する。他の好ましい実施形態では、標識結合領域は、約３００ヌクレオチド〜約１．５ｋｂ、約４５０ヌクレオチド〜約１．３５ｋｂ、約０．６ｋｂ〜約１．２ｋｂ、または０．７５ｋｂ〜約１．０５ｋｂである。
本発明に係るナノレポータースカフォールド用の分子状物質の具体例は、一本鎖Ｍ１３ ＤＮＡである。一実施形態では、ナノレポータースカフォールドは、環状の少なくとも部分的に一本鎖のＤＮＡ、たとえば、環状Ｍ１３である。より好ましい実施形態では、ナノレポータースカフォールドは、線状の少なくとも部分的に一本鎖のＤＮＡ、たとえば、線状Ｍ１３である。特定の実施形態では、環状Ｍ１３ ＤＮＡのＢａｍＨ１部位で切断を行うことにより得られるＭ１３一本鎖ＤＮＡである。
本発明に関連する範囲内では、線状ＤＮＡが環状ＤＮＡと比較してさらなる利点を提供することに留意されたい。本発明に係るスカフォールドを形成する際に線状ＤＮＡを使用する利点の１つは、線状ＤＮＡに関連付けられる有意に低減される捩り応力が関係する。環状ＤＮＡに関連付けられる追加される捩り応力は、パッチユニットのようなナノレポーターの他の成分をスカフォールドに付加する際にスカフォールドの構造的完全性を阻害する可能性がある。極度の捩り応力は、スカフォールドの構造体の破壊を引き起こす可能性がある。しかしながら、ごく少数の短い標識結合部位が標識化環状ＤＮＡであるナノレポーターが好適なこともあることに留意されたい。
５．２．１ 新規な合成ナノレポータースカフォールド配列
本発明は、ナノレポーターの標識および検出を最適化する特性を有するようにデザインされる人工の核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）であるナノレポータースカフォールドを提供する。本発明のこれらの態様では、ナノレポータースカフォールドは、５０〜５０，０００塩基長の１つ以上の合成配列を含む人工の核酸である。したがって、好ましくはＤＮＡであるナノレポータースカフォールドは、特定の塩基の規則的パターン（「規則的反復塩基」）を含む標識結合領域として有用な１つ以上の当該領域を有するようにデザインされる。そのような領域では、規則的反復塩基は、ｎ番目ごとの塩基の周期性を有して存在する。ただし、ｎは、任意の数、好ましくは４〜２５である。
好ましくは、当該領域中の規則的反復塩基の２５％以下は、該周期的間隔以外で現れる。たとえば、１００ヌクレオチドの当該領域中に１２個のチミジン塩基が存在しかつチミジンが規則的反復塩基である場合、本発明のこの態様では、これらの２５％以下、すなわち、３個以下のチミジン塩基は、チミジンの規則的パターンの範囲外に現れる。特定の実施形態では、該塩基の２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、もしくは１％以下は、該領域の該周期的間隔以外で現れる。
ナノレポータースカフォールドの当該領域中の規則的反復塩基またはアニールされるパッチ（もしくはセグメント）中のその相補的な規則的反復塩基は、ナノレポーターシグナルのより良好な分布が得られるように規則的な等間隔のパターンで、標識モノマー、好ましくは発光標識モノマーをナノレポーターに結合させるために使用可能である。好ましくは、当該領域を標識する場合、存在する規則的反復塩基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％は、塩基に標識モノマーを共有結合させることによりまたは規則的反復塩基の相補体がそのように標識される核酸にハイブリダイズさせることにより、少なくとも１つの発光標識モノマーに結合される。
当該分野で公知の任意の方法によって、この存在のパーセントを測定することができる。一方法では、標識反応で生じる量の核酸を精製し（たとえば、ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを用いて精製し）、ＵＶ分光測光に付す。核酸（２６０ｎｍ）および存在が測定される標識モノマー（たとえば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８では４９５ｎｍ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４では５９０ｎｍ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７では６５０ｎｍ；およびＣｙ３では５５０ｎｍ）のそれぞれに対して、適切な波長で吸光度（「Ａ」）を測定する。標識モノマーのピーク波長における吸光度（ＡＬＭ）マイナスその標識モノマーの補正因子の引き算を行うことにより標識モノマーからの「ノイズ」寄与が除去されるように２６０ｎｍにおける吸光度（「Ａ２６０」）の値を調整することにより、核酸の吸光度を補正する。核酸がＲＮＡである場合、１０００ヌクレオチドあたりの標識モノマーの数は、式：
標識モノマーの数／1000ヌクレオチド＝（A260/ALM）×（9010／ECLM）×1000
に従って計算される。式中、ＥＣＬＭは、標識モノマーの吸光係数である。この式から、発光標識モノマーに結合される規則的反復塩基の存在パーセントを計算することが可能である。
一般的には、標識結合領域中の好ましい規則的反復塩基はチミジンであり、そのようにすれば、規則的反復塩基がウリジンである１つ以上の相補的パッチ（たとえばＲＮＡセグメント）にハイブリダイズさせることにより、領域を標識することが可能になる。これにより、市販品として容易に入手可能なアミノアリル修飾ＵＴＰを他のランダム配列中で標識モノマー結合部位として使用することが可能になる。好ましくは、当該領域の規則的周期性のほかに、領域（およびそれを含む核酸）は、最小限の二次構造を含有する。全ＧＣ含有率は、好ましくは５０％近傍に保持され、好ましくは局所Ｔｍが同じようになるように比較的短いストレッチにわたり一貫性がある。
本発明に係る人工の核酸または少なくともその中の当該領域は、好ましくは、１２塩基を超える長さの直接反復および逆方向反復のいずれをも有していない。他の実施形態では、人工の核酸および／または当該領域は、約１１、約１０、または約９塩基を超える長さの直接反復および逆方向反復のいずれをも有していない。
規則的反復ヌクレオチドがチミジンでありかつ約５０％のＧＣ含有率である代表的な当該領域では、過剰のアデニンによりＴの存在量が低減されることになろう。選択配列を生成するために、４番目ごとの塩基〜２５番目ごとの塩基の範囲内でＴの一定のパターンを有するランダム配列を作製し、逆方向反復および直接反復の存在が最小なるようにスクリーニングする。
好ましくは、一般的な六塩基カッター制限酵素認識部位を回避するように配列をスクリーニングする。選択配列をさらに予測二次構造解析に付し、最小の二次構造を有するものを選択してさらなる評価に付す。当技術分野で公知の任意のプログラム、たとえば、ＭＦＯＬＤプログラム（Zuker, 2003, Nucleic Acids Res. 31 (13):3406-15; Mathews et al., 1999, J. Mol. Biol. 288:911-940）を用いて、二次構造を予測することが可能である。
適切な配列を５０塩基〜２キロ塩基（より長くすることも可能である）の長さの範囲内の標識結合領域に分割する。各標識結合領域はユニークな配列であるが、所与のレポーター配列中の他方の標識結合領域に対して一貫した数および間隔のＴを含有する。これらの標識結合領域は、配列が問題とならない他の領域を散在させうる。ナノレポータースカフォールド中の合成標識結合領域は、異なる長さおよび／または異なる規則的反復塩基を有しうる。ＲＮＡポリメラーゼＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６による転写に対して最適化された開始配列（転写産物の位置＋１で開始する）を各標識結合領域の５’末端に付加することが可能である。場合により、従来のクローニング技術を用いて配列への個別標識結合領域の特異的な付加または欠失を行えるようにするために、制限部位を各標識結合領域の境界に付加する。ナノレポーター中の合成標識結合領域の数は、好ましくは１〜５０の範囲内である。さらに他の実施形態では、ナノレポーター中の合成標識結合領域の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の合成標識結合領域から１５、２０、３０、４０、もしくは５０個の合成標識結合領域までの範囲内またはその間の任意の範囲内である。
そのような新規な合成標識結合領域の一例を以下に与える。５’→３’方向に示されたこの配列では、Ｔは、８番目ごとの位置に配置され、領域は、５’Ｓａｃ Ｉ制限部位および３’Ｋｐｎ Ｉ制限部位により境界付けられる。Ｔ７ポリメラーゼに対して最適化された転写産物開始部位（ＧＧＧＡＧＡ）は、領域の５’末端の５’制限部位の下流に含まれる。この配列の相補体は、一本鎖分子として生成される場合、この標識結合領域から転写されるＲＮＡ分子に対するスカフォールドを形成する。
GAGCTCGGGAGATGGCGAGCTGGAAGCATCAGAAAGTAGGAAGATGACAAAAT
AGGGCCATAGAAGCATGAAGAACTGAACGCATGAGACAATAGGAAGCTACGCC
ACTAGGGACCTGAGAAGCTGAGCGGCTCAGCGGGTCCGAGCGTCAAAAAATAA
AAGAGTGAAACAATAGACGAATGACGCGGTAAAACCATCCAGAAGTAAACGGG
TACAAACATACAGAGATAGCCACCTGGACCAATAGGCACGTACAAACGTACAA
GCCTGGCGCGATGAGGCAATCCACACGTGCAGAGCTGGAACAATGGAAAGATG
CAAGAATAAACCGATACCGGGATCGAGGGCTCAGCGAATAAAGCAGTCAACAA
CTGGAAAGATCCACACATACCGGCGTAACCGAGTCCAAACATACAGACCTGCA
AGACTCGCGACATGGGACGGTAAAACCATCCGACCGTAAACCGGTAACCAGGT
AGCCGGGTAAAAACATAGCAGGGTGGAGACCTCAGAACGTAAAGACGTCCAAG
GGTCGCCGGATAGCGAACTACGCGCATCGCCCAATGGGCCAATCAACAGATAA
ACGAGTAGAAAAGTCAGAAAATAAGAAACTAACGAAATACGAGGGTCCAAGG
ATGCAAGACTGAGGCCCTAAGGAGATAAGGAAATAGGCCGATGCAGACCTGAA
ACGATGCACCGATCCGACGGTAAAAGACTAGACACGTAGCCGGATCAGGGCCT
GGGAGGCTGGAACCGTGAGCACATAGCAAAGTCGCAGCGTCGGCAGATGCGCC
GGTAAAAAAGTAGAGGCATGACCGGATGGGCAAATAGCGACGTACAGCAGTGA
AGCACTAAAAGCATCCAAGGGTAGGAGACTAGGCGCCTCGACGGGTAGGTACC
本発明に係る合成核酸は、天然に存在するヌクレオチドを用いて、または分子の生物学的安定性を増大させるようにもしくは標識結合領域とアニールされるパッチまたはセグメントとから形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるようにデザインされた種々の修飾ヌクレオチドを用いて、化学合成可能である。たとえば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換型ヌクレオチドを使用することが可能である。合成核酸を生成するために使用しうる修飾ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。
他の選択肢として、核酸がサブクローニングされたベクターを用いて、生物学的に合成核酸を生成することが可能である。
種々の実施形態では、たとえば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改良するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸バックボーンで、本発明に係る合成核酸分子を修飾することが可能である。たとえば、ペプチド核酸を生成するために、核酸のデオキシリボースリン酸バックボーンを修飾することが可能である（Hyrup et al., 1996, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1):5-23を参照されたい）。本明細書中で使用する場合、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語は、デオキシリボースリン酸バックボーンがプソイドペプチドバックボーンにより置き換えられかつ４種の天然の核酸塩基のみが保持される核酸模倣体、たとえば、ＤＮＡ模倣体を意味する。ＰＮＡの中性バックボーンは、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションが可能であることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrup et al., 1996, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1):5-23; Perry-O’Keefe et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675に記載される標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて実施可能である。
代表的な実施形態では、選択される新規な合成配列は、商業的遺伝子合成会社により二本鎖ＤＮＡとして合成により構築することが可能であり、ＤＮＡ複製やファージキャプシド形成に必要なシス作用性配列を含有するＭ１３またはｆｌファージ遺伝子間（ＩＧ）領域を含有する「ファージミド」中、プラスミドベクター中、たとえばｐＵＣ１１９中に配向させてクローニングすることが可能である。ファージ複製起点に対してクローン化インサートの適切な配向を行えば、各標識結合領域のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により生成されるＲＮＡ分子のリバース相補体である一本鎖ＤＮＡスカフォールドの生成が可能である。
新規なレポーターの一本鎖ＤＮＡスカフォールドを生成するために、ファージミドは、Ｆ’エピソームを含有するE. coli菌株中にトランスフォームされる。トランスフォームされた細菌にＭ１３変異体Ｋ０７のようなヘルパーファージを続いて感染させると、標準的プロトコルを用いて環状一本鎖ＤＮＡを調製するための出発原料となる一本鎖パッケージ化ファージとして新規なレポーター配列を担持するファージミドの分泌が引き起こされる。このＤＮＡを線状化し、そして新規なレポーター配列の両末端に短い相補的オリゴヌクレオチドをアニールして二本鎖制限部位を生成し、続いて適切な制限酵素で処理することにより、ベクター部分を切除する。
各標識結合領域に対するＲＮＡ分子（パッチまたは「セグメント」）を作製するために、転写開始部位のすぐ上流（５’）のＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）から開始して３’制限酵素部位の後で終了する二本鎖鋳型を生成するように、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）プライマーをデザインする。この鋳型を用いて、ＲＮＡ（たとえば、ＵＴＰ）および未修飾の他の塩基（たとえば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、およびＧＴＰ）中、アミノアリル修飾規則的反復塩基の存在下で、ＲＮＡ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行う。これにより、ＲＮＡ分子中のその位置で標識モノマーの共有結合が可能になるようにすべての規則的反復塩基（たとえば、Ｕ）が修飾されているＲＮＡ産物が得られる。
ＲＮＡ分子への発光標識モノマーの結合およびスカフォールドへの標識化ＲＮＡ分子のアニーリングは、以下に記載されるように行われる。
ｄｅ ｎｏｖｏ配列に対するいくつかのデザイン要件を以下の表１に列挙する。
Figure 0005537034
５．３ パッチ
ナノレポーターコードの全部もしくは一部を構成するシグナルを放出する標識モノマーは、本明細書中では「パッチ」と記される構造体を介してナノレポータースカフォールドの標識結合領域に結合される。標識モノマーは、パッチに直接的に（たとえば共有結合もしくは非共有結合で）結合されうるか、またはパッチに間接的に（たとえばハイブリダイゼーションを介して）結合されうる。
核酸パッチは、２５ヌクレオチド〜数キロ塩基（たとえば５ｋｂ）の任意の長さでありうるが、好ましくは５０ヌクレオチド〜２ｋｂの長さである。特定の実施形態では、核酸パッチは、約２５〜２５０、５０〜２００、５０〜１５０、または５０〜１００ヌクレオチドの長さである。他の実施形態では、核酸パッチは、約５００〜２，０００、５００〜１，５００、５００〜１，０００、７５０〜１，２５０、または７５０〜１，０００ヌクレオチドの長さである。核酸パッチは、ＲＮＡパッチまたはＤＮＡパッチでありうる。
標識モノマーは、パッチがナノレポータースカフォールドの標識結合領域に結合される前または結合された後、パッチに共有結合されうる。たとえば、パッチが核酸分子である場合、その合成時、ただし、スカフォールドの標識結合領域に、たとえばハイブリダイゼーションを介して、結合させる前、標識モノマーを含有するヌクレオチドを核酸中に組み込むことにより標識を共有結合させうる。他の選択肢として、核酸パッチの合成時、標識モノマーアクセプター基を含有するヌクレオチドを組み込んで、その合成後、スカフォールドの標識結合領域に結合させる前または結合させた後のいずれかで、標識モノマーを核酸パッチに付加しうる。他の選択肢として、たとえば、ナノレポーターへの標識モノマーの結合の基点として機能する「フラップ」にパッチをハイブリダイズさせることにより、標識モノマーをパッチに間接的に結合させることが可能である。
したがって、パッチが核酸である場合、それは、ナノレポーターの集合方法に依存して、２０ヌクレオチド〜５ｋｂ超の範囲内の任意の長さでありうる。
たとえば、標識化ナノレポーターとの関連ではナノレポーターコードの一部であるシグナルを放出する１つ以上の標識モノマーがパッチに共有結合で組み込まれている場合、パッチは、好ましくは約１００〜約１０，０００塩基、より好ましくは２００〜約２０００塩基、さらにより好ましくは７００〜約１２００ヌクレオチドの長さであり、本明細書中では一般的に「セグメント」と記され、「ダーク」セグメントは、標識モノマーの組込み前のパッチであり（ただし、好ましい実施形態では、アミノアリルヌクレオチドのような標識モノマーアクセプター部位を含有する）、「着色」セグメントは、１つもしくは複数の所望の標識モノマーを含有するパッチである。標識結合領域にハイブリダイズされた時のセグメントのＴｍは、８２５ｍＭ Ｎａ＋（５×ＳＳＣ）中で、好ましくは＞８０℃、より好ましくは＞９０℃である。
パッチが単にナノレポーターへのフラップ結合のテンプレートとして機能する場合、それは、好ましくはより小さいサイズ、たとえば約２５〜２５０ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは約５０〜１００ヌクレオチドの長さである。本明細書中では、そのようなパッチを「オリゴヌクレオチドパッチ」と記す。以下の節で詳述されるように、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、スカフォールドにアニールされた時にフラップの全部もしくは一部に相補的なオーバーハングが生成されるように、スカフォールドに対して配列が部分的に相補的である。
「セグメント」および「オリゴヌクレオチドパッチ」という用語は、本明細書中では、単に説明の便宜上使用されているが；「セグメント」と「オリゴヌクレオチドパッチ」とを識別するサイズのカットオフは存在しない。両タイプの構造体の目的は、ナノレポーターの標識化（ひいてはシグナル強度）を最大化することによりナノレポーターによる単一標的分子検出を可能にすることである。
特定の態様では、本発明は、図７Ａを参照して例示される形態の合成分子を提供する。この合成分子は、核酸の鎖（スカフォールド）と該鎖にハイブリダイズされた複数のパッチペアとを含み、各パッチペアは、「Ａ」パッチと「Ｂ」パッチとを含み、各パッチペアに関して、（ａ）各「Ａ」パッチは、第１の領域（１Ｐ）と第２の領域（２Ｐ）とを含むオリゴヌクレオチドであり、該第１の領域は、（ｉ）該「Ａ」パッチのα末端にあり、かつ（ｉｉ）該鎖の第１の部分にハイブリダイズされ、該第２の領域は、（ｉｉ）該「Ａ」パッチのβ末端にあり；（ｂ）各「Ｂ」パッチは、第３の領域（３Ｐ）と第４の領域（４Ｐ）とを含むオリゴヌクレオチドであり、該第３の領域は、（ｉ）該「Ｂ」パッチのα末端にあり、かつ（ｉｉ）該「Ａ」パッチの該第２の領域にハイブリダイズされ、該第４の領域は、（ｉ）該「Ｂ」パッチのβ末端にあり、かつ（ｉｉ）該鎖の第２の部分にハイブリダイズされ、該鎖の該第２の部分は、該鎖の該第１の部分のβ末端にあり、該第２の領域または該第３の領域は、それぞれ該「Ｂ」パッチまたは「Ａ」パッチにハイブリダイズされていないハイブリダイズ可能な領域をそれぞれそのβ末端またはα末端にさらに含む。
図７Ａに示される合成分子では、第２の領域は、図７Ｂに示されるように、該「Ｂ」パッチにハイブリダイズされていないハイブリダイズ可能な領域をそのβ末端にさらに含みうるか、または第３の領域は、図７Ｃに示されるように、該「Ａ」パッチにハイブリダイズされていないハイブリダイズ可能な領域をそのα末端にさらに含みうる。
本発明はさらに、図７Ｄを参照して例示される形態の合成分子を提供する。この合成分子は、核酸の鎖（スカフォールド）と該鎖にハイブリダイズされた複数のパッチペアとを含み、各パッチペアは、「Ａ」パッチと「Ｂ」パッチとを含み、各パッチペアに関して、（ａ）各「Ａ」パッチは、第１の領域（１Ｐ）と第２の領域（２Ｐ）とを含むオリゴヌクレオチドであり、該第１の領域は、（ｉ）該「Ａ」パッチのα末端にあり、かつ（ｉｉ）
該鎖の第１の部分にハイブリダイズされ、該第２の領域は、（ｉｉ）該「Ａ」パッチのβ末端にあり；（ｂ）各「Ｂ」パッチは、第３の領域（３Ｐ）と第４の領域（４Ｐ）とを含むオリゴヌクレオチドであり、該第３の領域は、（ｉ）該「Ｂ」パッチのα末端にあり、かつ（ｉｉ）該「Ａ」パッチの該第２の領域にハイブリダイズされ、該第４の領域は、（ｉ）該「Ｂ」パッチのβ末端にあり、かつ（ｉｉ）該鎖の第２の部分にハイブリダイズされ、該鎖の該第２の部分は、該鎖の該第１の部分の最初のところにあり、該第２の領域は、該「Ｂ」パッチにハイブリダイズされていない第１のハイブリダイズ可能な領域をそのβ末端にさらに含み、該第３の領域は、該「Ａ」パッチにハイブリダイズされていない第２のハイブリダイズ可能な領域をそのα末端にさらに含む。
図７Ｂに示される合成分子では、各パッチペアは、図７Ｆに示されるようにフラップペアに結合させることが可能であり、各フラップペアは、「Ａ」フラップと「Ｂ」フラップとを含み、各フラップペアに関して、（ａ）各「Ａ」フラップは、第１のフラップ領域（１Ｆ）と第２のフラップ領域（２Ｆ）とを含むオリゴヌクレオチドであり；該第１のフラップ領域は、該「Ａ」フラップのα末端にあり；該第２のフラップ領域は、（ｉ）該「Ａ」フラップのβ末端にあり、かつ（ｉｉ）該「Ａ」パッチ、該「Ｂ」パッチ、および該「Ｂ」フラップのいずれにもハイブリダイズされていないハイブリダイズ可能な領域をそのβ末端に含み；そして（ｂ）各「Ｂ」フラップは、第３のフラップ領域（３Ｆ）と第４のフラップ領域（４Ｆ）と第５のフラップ領域（５Ｆ）とを含むオリゴヌクレオチドであり、該第３のフラップ領域は、（ｉ）該「Ｂ」フラップのα末端にあり、かつ（ｉｉ）該「Ａ」パッチ、該「Ｂ」パッチ、および該「Ａ」フラップのいずれにもにハイブリダイズされていないハイブリダイズ可能な領域をそのα末端に含み；該第４のフラップ領域は、（ｉ）第３のフラップ領域と第５のフラップ領域との間に存在し、かつ（ｉｉ）該「Ａ」フラップの該第１のフラップ領域にハイブリダイズされ；該第５のフラップ領域は、（ｉ）該「Ｂ」フラップのβ末端に存在し、かつ（ｉｉ）該「Ａ」パッチの該第２の領域の該ハイブリダイズ可能な領域にハイブリダイズされる。
図７Ｃに示される合成分子では、各パッチペアは、図７Ｅに示されるようにフラップペアに結合させることが可能であり、各フラップペアは、「Ａ」フラップと「Ｂ」フラップとを含み、各フラップペアに関して、（ａ）各「Ａ」フラップは、第１のフラップ領域（１Ｆ）と第２のフラップ領域（２Ｆ）と第３のフラップ領域（３Ｆ）とを含むオリゴヌクレオチドであり、該「Ａ」フラップ領域は、（ｉ）該「Ａ」フラップのα末端に存在し、かつ（ｉｉ）該「Ｂ」パッチの該第３の領域の該ハイブリダイズ可能な領域にハイブリダイズされ；該第２のフラップ領域は、第１のフラップ領域と第３のフラップ領域との間に存在し；該第３のフラップ領域は、（ｉ）該「Ａ」フラップのβ末端にあり、かつ（ｉｉ）該「Ａ」パッチ、該「Ｂ」パッチ、および該「Ｂ」フラップのいずれにもハイブリダイズされていないハイブリダイズ可能な領域をそのβ末端に含み；そして（ｂ）各「Ｂ」フラップは、第４のフラップ領域（４Ｆ）と第５のフラップ領域（５Ｆ）とを含むオリゴヌクレオチドであり；該第４のフラップ領域は、（ｉ）該「Ｂ」フラップのα末端にあり、かつ（ｉｉ）該「Ａ」パッチ、該「Ｂ」パッチ、および該「Ａ」フラップのいずれにもにハイブリダイズされていないハイブリダイズ可能な領域をそのα末端に含み；該第５のフラップ領域は、（ｉ）該「Ｂ」フラップのβ末端に存在し、かつ（ｉｉ）該「Ａ」フラップの該第２のフラップ領域にハイブリダイズされる。
図７Ｄおよび７Ｅに示される合成分子では、スプリットフラップは、図７Ｇに示されるように、１つ（たとえば（１Ｏ））もしくはそれ以上（たとえば（２Ｏ）および（３Ｏ））のオリゴヌクレオチドに結合させることが可能である。したがって、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、個別に「Ａ」フラップの全部もしくは一部に（たとえば（１Ｏ））、個別に「Ｂ」フラップの全部もしくは一部に（たとえば（３Ｏ））結合させうるか、または「Ａ」フラップおよび「Ｂ」フラップのそれぞれの全部もしくは一部にまたがりうる（たとえば（２Ｏ））。そのようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、１つ以上の標識モノマーに共有結合される。
該合成分子のハイブリダイズ可能な領域は、複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることが可能である。ただし、各オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識モノマー、より好ましくは少なくとも５つの標識モノマーに結合、好ましくは共有結合される。特定の実施形態では、単一のパッチペアに結合されるオリゴヌクレオチドはすべて、同一の標識モノマーを含み、たとえば、同一の波長（複数可）の光を放出する標識モノマーを含み；特定の実施形態では、少なくとも２つもしくは少なくとも４つの隣接するパッチペアに結合されるオリゴヌクレオチドはすべて、好ましくは、同一の標識モノマーを含む。１つ以上のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのアフィニティータグに結合されうる。
特定の好ましい実施形態では、標識モノマーは、発蛍光団または量子ドットである。
以上に記載の合成分子では、αは、５’もしくは３’のいずれか、対応するβは、それぞれ、３’もしくは５’のいずれを表しうる。
各パッチペア内または所与のパッチと対応するフラップとの間の相補性を有する領域は、好ましくは、約２０〜５，０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、相補性を有する領域は、約２０〜１００ヌクレオチドまたは約５〜５０ヌクレオチドである。
以上に記載の合成分子では、各フラップは、好ましくは、約５０〜５，０００ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、各フラップは約５０〜１５０ヌクレオチドである。以上に記載の合成分子は、標的分子に結合する標的特異的領域をさらに含みうる。標的特異的領域は、該鎖のβ末端またはα末端に結合させることが可能である。
特定の実施形態では、以上に記載の合成分子は、少なくとも１０個のパッチペアまたは少なくとも５０個のパッチペアを含む。
以上に記載の合成分子では、鎖またはスカフォールドは、線状化ベクター、たとえば、線状化Ｍ１３でありうる。
以上に記載の合成分子は、（ａ）第１のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが（直接的もしくは間接的に）結合される第１の標識結合領域；（ｂ）第２のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第２の標識結合領域（第１の標識結合領域とオーバーラップしない）；（ｃ）第３のシグナルを構成する光を放出する１つ以上の標識モノマーが結合される第３の標識結合領域（第１および第２の標識結合領域とオーバーラップしない）；をさらに含みうる。ただし、各結合領域は、複数のパッチペアを含み；第１および第２のシグナルは、分光的に識別可能であり；第２および第３のシグナルは、分光的に識別可能であり；第１および第２のシグナルは、前記第１、第２、および第３のシグナルの検出に使用可能な条件下で空間的に解像可能でなく；第２および第３のシグナルは、前記第１、第２、および第３のシグナルの検出に使用可能な条件下で空間的に解像可能でなく；第１および第３のシグナルは、前記第１、第２、および第３のシグナルの検出に使用可能な条件下で空間的に解像可能であり；第１、第２、および第３のシグナルの同一性ならびに第１および第３のシグナルの互いの相対位置は、標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する。
５．４ 標識モノマー
本発明に係るナノレポーターは、さまざまな標識モノマーのいずれか、たとえば、放射性同位体、蛍光色素、色素、酵素ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、または直接的（たとえば発光により）もしくは間接的（たとえば蛍光標識化抗体の結合により）に検出可能な当技術分野で公知の他のモノマーで標識可能である。一般的には、ナノレポーター中の標識結合領域の１つ以上は、１つ以上の標識モノマーで標識され、ナノレポーターの標識結合領域に結合された標識モノマーにより放出されるシグナルは、ナノレポーターの標的特異的領域が結合する標的を同定するコードを構成する。特定の実施形態では、標識結合領域に由来する所与のシグナルの欠如（すなわち「ダーク」スポット）もまた、ナノレポーターコードの一部を構成しうる。ダークスポットの例は、図１Ａ中のナノレポーターの位置１２に示される。
放射性同位体は、本発明により利用可能な標識モノマーの例である。ヌクレオチドまたはタンパク質を標識するための標識モノマーとして、たとえば、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、および１２５Ｉをはじめとするいくつかの放射性同位体を使用することが可能である。これらの放射性同位体は、特定の実験のニーズに合うように調整可能なさまざまな半減期、崩壊タイプ、およびエネルギーレベルを有する。たとえば、３Ｈは、低バックグラウンドレベルを生じる低エネルギー発光体であるが、この低エネルギーはまた、長時間のオートラジオグラフィーをもたらす。放射性標識されたリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、およびアミノ酸は、市販品として入手可能である。第１すなわちα位のリン酸基または第３すなわちγ位のリン酸基が放射性標識されているヌクレオチドが入手可能である。たとえば、［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰおよび［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰの両方が市販品として入手可能である。そのほかに、放射性標識化ヌクレオチドに対してさまざまな比活性が市販品として入手可能であり、さまざまな実験に合うように調整可能である。
本発明により利用可能な標識モノマーの他の例は、発蛍光団である。ヌクレオチドを標識するための標識モノマーとして、たとえば、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、およびテキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）をはじめとするいくつかの発蛍光団を使用することが可能である。全スペクトル領域にわたるいくつかの異なる発蛍光団が公知であり、しかも継続して製造されている。また、同一の発蛍光団のさまざまな製品が、さまざまな用途向けに製造されている。たとえば、フルオレセインは、そのイソチオシアネート（isothiocynanate）形（ＦＩＴＣ）で、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＦＡＭ）の混合異性体形もしくは単一異性体形として、またはフルオレセインの異性体ジクロロトリアジン形（ＤＴＡＦ）として使用可能である。これらのモノマーはすべて、化学的に識別可能であるが、５１５〜５２０ｎｍにピークを有する光を放出するので、類似のシグナルを生成する。フルオレセインの化学修飾体のほかに、フルオレセインと同一のもしくは非常によく似た発光ピークを有する完全に異なる発蛍光団が合成されている。たとえば、オレゴン・グリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）色素は、フルオレセインと比較して実質的に重ね合わせることのできる励起スペクトルおよび発光スペクトルを有する。ロードル・グリーン（Ｒｈｏｄｏｌ Ｇｒｅｅｎ）やローダミン・グリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ）のような他の発蛍光団は、それらの発光ピークがわずかにシフトしているにすぎないので、機能的にフルオレセインの代用品としての役割を果たす。そのほかに、スペクトル領域の他の部分の光を放出する他の発蛍光団に基づくさまざまな製品または関連色素が開発されている。
また、非放射性および非蛍光性の標識モノマーも入手可能である。たとえば、ビオチンをヌクレオチドに直接結合し、比色反応を触媒する酵素（たとえば、ホスファターゼ、ルシフェラーゼ、またはペルオキシダーゼ）に化学結合されたアビジンまたはストレプトアビジンに対する特異的かつ高親和性の結合により検出することが可能である。ジゴキシゲニン標識化ヌクレオチドもまた、同様に核酸の非同位体検出に使用することが可能である。ビオチン化ヌクレオチドおよびジゴキシゲニン標識化ヌクレオチドは、市販品として入手可能である。
ナノ粒子と称される微小粒子もまた、核酸を標識するための標識モノマーとして使用可能である。この粒子は、サイズが１〜１０００ｎｍの範囲内にあり、さまざまな化学構造体、たとえば、金粒子および銀粒子ならびに量子ドットを含む。
斜め入射白色光を照射した場合、４０〜１２０ｎｍの範囲内の銀または金のナノ粒子は、高強度の単色光を散乱するであろう。散乱光の波長は、粒子のサイズに依存する。ごく近接する４〜５個の異なる粒子は、それぞれ、単色光を散乱するであろう。これらを重ね合わせた場合、特定のユニークな色を与えるであろう。粒子は、Genicon Sciencesなどの会社により製造されている。誘導体化された銀粒子または金粒子は、タンパク質、抗体、小分子、レセプターリガンド、および核酸をはじめとする広範にわたる分子に結合させることが可能である。たとえば、ヌクレオチドに結合できるように、粒子の表面を化学的に誘導体化することが可能である。
標識モノマーとして使用可能な他のタイプのナノ粒子は、量子ドットである。量子ドットは、広範にわたる波長の光により励起可能な直径１〜５ｎｍの蛍光性結晶である。この結晶は、その化学組成およびサイズに依存する波長を有する光たとえば単色光を放出する。ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＩｎＰ、またはＩｎＡｓのような量子ドットは、ユニークな光学的性質を有する。
量子ドット結晶のサイズクラスの数に応じて、何十ものクラスの粒子を生成することが可能である。これらのサイズクラスの結晶は、１）それぞれの所望のサイズクラスの粒子を形成するように結晶形成パラメーターを厳密に制御するかまたは２）それほど厳密に制御されない結晶形成パラメーターで結晶のバッチを生成してから所望のサイズおよび／もしくは発光波長に基づいて選別するかのいずれかにより、生成可能である。粒子を標識するための量子ドットの使用は、本発明との関連では新しいことであるが、半導体の技術分野では古くから行われていることである。量子ドットが半導体発光／検出デバイスの真性シリコンエピタキシャル層内に埋め込まれる先行文献の２つの例は、Ｃｈａｐｐｌｅ Ｓｏｋｏｌらに付与された米国特許第５，２９３，０５０号および同第５，３５４，７０７号である。
特定の実施形態では、ナノレポーター中の１つ以上の標識結合領域は、１つ以上の発光色素で標識され、各標識結合領域は、１つ以上の標識モノマーを直接的もしくは間接的に含有する。色素により放出される光は、可視光または不可視光線、たとえば、紫外光または赤外光でありうる。代表的な実施形態では、色素は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）色素；キサンテン色素、たとえば、フルオレセインおよびローダミン；α位またはβ位にアミノ基を有する色素（たとえば、ナフチルアミン色素、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（1-anilino-8-naphthalende sulfonate）、および２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネート）（2-p-touidinyl-6-naphthalene sulfonate）；３−フェニル−７−イソシアナトクマリンを有する色素；アクリジン化合物、たとえば、９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ；ピレン化合物、ベンゾオキサジアゾール（bensoxadiazole）化合物、およびスチルベン化合物；３−（ε−カルボキシペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニンを有する色素；６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）；５＆６−カルボキシローダミン−１１０（Ｒ１１０）；６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）；６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；アレキサ・フルオル（ＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ）ＴＭ；Ｃｙ２；テキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）およびローダミン・レッド（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ）；６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）；６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）；５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）；ＮＡＮ；ＮＥＤ；Ｃｙ３；Ｃｙ３．５；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；およびＣｙ７．５；アレキサ・フルオル３５０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０）；アレキサ・フルオル４８８（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）；アレキサ・フルオル５３２（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２）；アレキサ・フルオル５４６（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）；アレキサ・フルオル５６８（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８）；アレキサ・フルオル５９４（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４）；またはアレキサ・フルオル６４７（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）である。
標識モノマーは、ナノレポーター中にその集合のさまざまな段階で組込み可能であるか、またはナノレポーターの成分（たとえば「フラップ」）中にナノレポーター中へのその集合前に組込み可能である。
標識モノマーは、当技術分野で周知の方法を用いてヌクレオチドに直接的に結合させることが可能である。ヌクレオチドはまた、標識モノマーを結合させるために、化学修飾または誘導体化が可能である。たとえば、四原子アミノアルキニル基を用いてフルオレセイン分子のような蛍光性モノマーをｄＵＴＰ（デオキシウリジン三リン酸）に結合させることが可能である。各標識モノマーをヌクレオチドに結合させて標識モノマー：ヌクレオチド複合体を作製する。
この標識モノマー：ヌクレオチド複合体は、さまざまな方法で核酸（たとえば、ＤＮＡパッチまたは検出オリゴヌクレオチド）中に組み込むことが可能である。たとえば、標識モノマー：ヌクレオチド複合体は、核酸内のただ１つの位置または核酸内の２つ以上の位置に組み込むことが可能である。
アミン反応性およびチオール反応性の発蛍光団が入手可能であり、ヌクレオチドおよび生体分子を標識するために使用される。一般的には、ヌクレオチドは、化学合成時に蛍光標識される。たとえば、ヌクレオチド合成時にアミンまたはチオールを組み込むことにより、発蛍光団を付加することが可能である。蛍光標識化ヌクレオチドは入手可能である。たとえば、スペクトル領域をカバーする１０種の異なる発蛍光団にコンジュゲートされたウリジンおよびデオキシウリジン三リン酸が入手可能である。
最初に、ヌクレオチドを標識モノマーに結合させ、次に、核酸中に組み込むことが可能である。他の選択肢として、核酸内のヌクレオチドに標識モノマーを結合させることにより、既存の核酸を標識することが可能である。たとえば、アミノアリル−（「ＡＡ−」）修飾ＵＴＰヌクレオチドを転写時にＲＮＡ産物中に組み込むことが可能である。種々の実施形態では、ＲＮＡパッチを生成する転写反応時、ＵＴＰヌクレオチドの２０％以上がＡＡ修飾される。種々の実施形態では、転写反応時、ＵＴＰの約２０％〜１００％、２０％〜８０％、３０％〜８０％、４０％〜６０％、もしくは５０％〜７５％がＡＡ修飾され、好ましい実施形態では、転写反応時、ＵＴＰの約５０％がＡＡ修飾される。
そのほかに、たとえば、異なるタイプの標識モノマー：ヌクレオチド複合体を単一酸の核酸中に組み込むことが可能であり、この場合、ナノレポーターコードの１つの成分は、２つ以上のタイプのシグナルを含む。
また、ヌクレオチドに直接的に結合可能な蛍光色素を標識モノマーとして利用することも可能である。たとえば、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、およびＲＯＸは、ヌクレオチドに結合されているアミン反応性蛍光色素であり、自動ＤＮＡ配列決定に使用される。これらの蛍光標識化ヌクレオチド、たとえば、ＲＯＸ−ｄｄＡＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＧＴＰ、およびＲＯＸ−ｄｄＵＴＰは、市販品として入手可能である。
ナノレポーターを標識するために使用可能な他のタイプの標識モノマーは、量子ドットである。サイズが非常に小さいので、量子ドットは、オリゴヌクレオチドの溶解性または使用に影響を及ぼすことなくオリゴヌクレオチド中に直接的に結合させることが可能である。好ましい実施形態では、ただ１つのオリゴヌクレオチド分子が各ナノ粒子に結合される。従来のバッチ化学方式で１：１の比のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子複合体を合成するために、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子はいずれも、互いに反応可能な異なる種類の単一の反応基を必要とする。たとえば、オリゴヌクレオチドがアミノ基を有しかつナノ粒子がアルデヒド基を有する場合、これらの基は反応してシッフ塩基を形成しうる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知の化学を用いて単一のアミノ基または他の官能基を結合させるように誘導体化可能である。しかしながら、ナノ粒子を誘導体化する場合、化学試薬で覆われて、結果的にナノ粒子の全表面がいくつかの官能基で被覆される。
本発明は、オリゴヌクレオチド合成に用いられるガラス担体のような固体表面上にオリゴヌクレオチドを化学結合させることにより、１つのオリゴヌクレオチドを１つのナノ粒子に結合させる方法を提供する。
たとえば、市販品として入手可能なオリゴヌクレオチド合成用の樹脂、たとえば、長鎖アルキルアミノ制御細孔ガラス（ｌｃａａ ＣＰＧ）を使用することが可能である。
他の選択肢として、誘導体化顕微鏡スライドのようなフラット表面を使用することが可能である。新生オリゴヌクレオチド鎖の表面密度は、ナノ粒子の直径よりも小さくなければならない。これは、反応基の表面密度が低いガラス担体を選択するかまたは表面が飽和されないようにオリゴヌクレオチド合成の第１の工程で希薄な試薬を用いるかのいずれかにより達成可能である。オリゴヌクレオチド合成用の標準的ガラスマトリックスを使用するときの他の要件は、試薬の流動が確保されるようにナノ粒子直径よりも大きい細孔直径を使用することである。たとえば、ガラス担体上でオリゴヌクレオチドの良好な間隔が確保されるように、固体担体と比較して希薄であることを条件として、たとえば、通常の合成の１／１０で、オリゴヌクレオチドを合成することが可能である。反応性官能基、たとえば、アミノ基を有するオリゴヌクレオチドを合成した後、誘導体化ナノ粒子をガラス担体上に通してオリゴヌクレオチドと反応させる。ナノ粒子による閉塞を防止するために、十分に大きい細孔サイズのガラス担体を選択することが可能である。たとえば、約２００ｎｍの細孔サイズを使用することが可能である。反応が終了した後、ナノ粒子上の未反応基をブロックし、複合体をガラス担体から切り離すことが可能である。
５．５ ナノレポーターコード
５．５．１ デュアルナノレポーター
成分が２つの分子状物質の形態で存在するナノレポーターは、デュアルナノレポーターと呼ばれる。デュアルナノレポーターでは、一般的には、各成分は、標的へのナノレポーターの結合速度論的挙動の特異性を改良する標的特異的配列を含有する。２つの異なる標的特異的配列は、標的分子の異なる部分を認識するように、デザインまたは選択される。
図１Ａ〜１Ｃは、デュアルナノレポーターが関与する本発明の実施形態を示している。図１Ａおよび１Ｂでは、デュアルナノレポーターがその標的分子に結合してナノレポーターの２つの成分が一体化された場合のみナノレポーターの分光コードが生成されるように、ナノレポーターの２つの成分のそれぞれが標識される。しかしながら、デュアルナノレポーターでは、両方の成分を標識する必要はない。たとえば、図１Ｃに示されように、デュアルナノレポーターの一方の成分は、ナノレポーターコードで標識され；他方の成分は、伸長および可視化のためにナノレポーターを固定するのに有用なアフィニティータグ（矢印）に結合される。
５．５．２ レジスター
「レジスター」という用語は、一連の交互（１つおき）の標識結合領域を意味する。スペーサー領域を用いることなく隣接する標識結合領域を標識することが望ましい場合および所望の検出方法を用いて隣接する標識結合領域から放出されるシグナルを空間的に解像することができない場合、レジスターは有用である。したがって、レジスターを用いて検出されるシグナルは、隣接する標識結合領域ではなく交互の標識結合領域により形成されるものである。複数のレジスター（たとえば、合わせると全標識結合領域になるレジスター）から検出されるシグナルは、組み合わされてナノレジスターコードを形成しうる。一般的には、レジスターを使用する場合、隣接する標識結合領域が、分光的に識別可能な標識モノマーで標識される。
レジスターの例は、図３および５に描かれている。たとえば、図３Ａ〜３Ｂでは、８つの標識結合領域１〜８が存在する。交互標識結合領域１、３、５、および７は１つのレジスターを形成し、標識結合領域２、４、６、および８は他のレジスターを形成する。図３Ａでは、一方のレジスター（１、３、５、および７）だけが標識され；図３Ｂでは、両方のレジスターが標識される。
５．６ アフィニティータグ
当技術分野で公知のさまざまなアフィニティータグを用いて、ナノレポーターの精製および／または固定を行うことが可能である。
検出または画像化を目的としてアフィニティータグを用いてナノレポーターを固定する場合、本明細書中ではそれを「アンカー」と記すこともある。好ましい実施形態では、ビオチンアンカーをナノレポーターに結合させて、ストレプトアビジン被覆スライド上にナノレポーターを固定できるようにする。
アフィニティータグは、さまざまな有用な用途、たとえば、精製（ただし、これらに限定されるものではない）のために、ビーズまたは他のマトリックスに結合させるべく使用可能である。
好適なアフィニティータグの例を以下に挙げるが、これらに限定されるものではないは。当然のことながら、ほとんどのアフィニティータグは、二重の目的で、すなわち、ナノレポーターを固定するためのアンカーとしても、ナノレポーター（完全に集合されているか部分的にのみ集合されているかを問わず）またはその成分を精製するためのタグとしても、使用可能である。
特定の実施形態では、アフィニティータグはタンパク質モノマーである。タンパク質モノマーの例としては、免疫グロブリン定常領域（Ｐetty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography, in Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscienceを参照されたい）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST; Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229）、Ｅ．コリ（E. coli）マルトース結合タンパク質（Guan et al., 1987, Gene 67:21-30）、および種々のセルロース結合ドメイン（U.S. Pat. Nos. 5,496,934; 5,202,247; 5,137,819; Tomme et al., 1994, Protein Eng. 7:117-123）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他のアフィニティータグは、特異的結合パートナーにより認識され、したがって、固体担体上に固定可能な結合パートナーへのアフィニティー結合により単離および固定を容易にする。たとえば、アフィニティータグはエピトープであり、結合パートナーは抗体でありうる。そのようなエピトープの例としては、ＦＬＡＧエピトープ、ｍｙｃエピトープのアミノ酸４０８〜４３９、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープ、またはジゴキシゲニン（「ＤＩＧ」）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の実施形態では、アフィニティータグは、他のタンパク質またはアミノ酸により認識されるタンパク質またはアミノ酸配列である（たとえば、アビジン／ストレプトアビジンとビオチン）。
本発明の特定の態様では、アフィニティータグはヌクレオチド配列である。約８〜約３０塩基、より好ましくは約１０〜約２０塩基の多種多様な配列をナノレポーターの精製および固定のために使用することが可能であり、配列をタンデムに反復することが可能である（たとえば、１〜１０タンデム反復）。そのような配列は、好ましくは、アッセイされるサンプル中で多くを占めることはなく（すなわち、遺伝子の５％未満で存在し、より好ましくは遺伝子の３％未満で存在し、最も好ましくは遺伝子の１％未満で存在する）（たとえば、ヒト細胞ＲＮＡを検出するためにナノレポーターを使用する場合、配列は、好ましくは、ヒトゲノム中で多くを占めない）;多量体化された時に二次構造をほとんどもしくはまったく有しておらず、内部でもそれ自体のコピーとの間でも自己相補性をほとんどもしくはまったく有しておらず（すなわち、多量体化タグの二次構造体はすべて、好ましくは、１Ｍ ＮａＣｌで２５℃未満のＴｍを有する）;スカフォールド配列やセグメント配列との有意な同一性や相補性を有しておらず（すなわち、相補的配列のＴｍは、好ましくは、０．２Ｍ ＮａＣｌで２５℃未満である）;かつ５０ｍＭ Ｎａ＋中で約３５〜６５℃、より好ましくは約４０〜５０℃のＴｍを有する。
特定の実施形態では、精製用タグおよび固定用タグとして異なる配列を使用する。この場合、たとえば、精製用タグは、以上に記載したとおりでありうるが、固定用タグは、５０ｍＭ Ｎａ＋中で９５℃までのＴｍを有し、１０〜１００塩基の範囲内でありうる。他の選択肢の実施形態は、固定用タグ内に組み込まれた精製用タグを有するであろう（たとえば、アフィニティータグは、２５塩基の配列を含むであろう。そのうちの１５塩基は、精製用タグとして使用され、全２５塩基は、固定用タグとして使用される）。
特定の場合には、ナノレポーターの精製または固定のほかに、ナノレポーターを標識するためにアフィニティータグを使用することが可能である。
当業者であればわかるであろうが、アフィニティータグのコード領域を得るために、多くの方法、たとえば、ＤＮＡクローニング法、ＤＮＡ増幅法、および合成法（ただし、これらに限定されるものではない）を使用することが可能である。アフィニティータグならびにその検出用および単離用の試薬のいくつかは、市販品として入手可能である。
５．７ 標的特異的配列
「標的特異的配列」という用語は、標的分子に結合可能な分子状物質を意味する。ナノレポーターとの関連では、標的特異的配列は、ナノレポータースカフォールドに結合される。
標的特異的配列は、一般的には、アミノ酸配列（すなわちポリペプチド配列もしくはペプチド配列）または核酸配列である。
特定の実施形態では、標的特異的配列がアミノ酸配列である場合、標的特異的配列は、抗体フラグメント、たとえば、抗体Ｆａｂ’フラグメント、一本鎖Ｆｖ抗体である。
標的特異的配列は、好ましくは、核酸配列であり、最も好ましくは、ナノレポータースカフォールドに共有結合（たとえばライゲーションにより）または非共有結合（たとえばハイブリダイゼーションにより）により結合されるオリゴヌクレオチドの範囲内にある。標的特異的核酸配列は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、標的特異的配列は、約１０〜５００、２０〜４００、３０〜３００、４０〜２００、もしくは５０〜１００ヌクレオチドの長さである。他の実施形態では、標的特異的配列は、約３０〜７０、４０〜８０、５０〜９０、もしくは６０〜１００、３０〜１２０、４０〜１４０、もしくは５０〜１５０ヌクレオチドの長さである。
標的特異的ヌクレオチド配列は、８２５ｍＭ Ｎａ＋（５×ＳＳＣ）中で各プローブについて好ましくは約６５〜９０℃、最も好ましくは約７８〜８３℃のＴｍを有する。
特定の好ましい実施形態では、デュアルナノレポーターの各プローブの標的特異的配列は、約３５〜１００ヌクレオチド（２つのプローブの対象となる約７０〜２００ヌクレオチドの全標的配列に対して）、最も好ましくは各プローブについて約４０〜５０ヌクレオチド（約８０〜１００ヌクレオチドの全体に対して）である。
５．８ 標的分子
「標的分子」という用語は、標識化ナノレポーターの結合により検出または測定される分子のことであり、標識化ナノレポーターの標的特異的配列（複数可）は、それを認識する（それに対する特異的結合パートナーである）。好ましくは、標的分子は、次の化合物：ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド／タンパク質（たとえば、細菌もしくはウイルスのタンパク質または抗体）、脂質、炭水化物、糖タンパク質、糖脂質、小分子、有機モノマー、あるいは薬剤のいずれかでありうるが、これらに限定されるものではない。一般的には、標的分子は、天然に存在する分子または天然に存在する分子のｃＤＮＡまたは該ｃＤＮＡの相補体である。
標的分子は、他の成分を含有する生体分子サンプルの一部でありうるか、またはサンプルの唯一の成分もしくは主成分でありうる。標的分子は、全細胞もしくは組織、細胞もしくは組織の抽出物、それらの分画溶解物の成分、または実質的に精製された分子でありうる。標的分子は、たとえば、チップ、マイクロアレイ、またはビーズのような固体表面などに、溶液中または固相中で結合させうる。また、標的分子は、既知もしくは未知の構造または配列を有しうる。
ある特定の実施形態では、その標的分子は染色体ではない。他の特定の実施形態では、標的分子は、１，０００ｋｂ（すなわち１ｍｂ）以下のサイズ、５００ｋｂ以下のサイズ、２５０ｋｂ以下のサイズ、１７５ｋｂ以下のサイズ、１００ｋｂ以下のサイズ、５０ｋｂ以下のサイズ、２０ｋｂ以下のサイズ、または１０ｋｂ以下のサイズである。さらに他の特定の実施形態では、標的分子は、その細胞環境から単離される。
限定されるものではないが、特定の実施形態では、標的分子は、次の抗体のうちの１つまたは次の抗体のうちの１つにより認識される抗原である：抗エストロゲンレセプター抗体、抗プロゲステロンレセプター抗体、抗ｐ５３抗体、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ−２抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５−３抗体、抗ＣＡ１９−９抗体、抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体、抗Ｐ−糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク質抗体、抗ｒａｓオンコプロテイン抗体、抗ルイスＸ抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ユビキチン抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ｃ−ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ビメンチン抗体、抗ＨＰＶタンパク質抗体、抗κ軽鎖抗体、抗λ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異的抗原抗体、抗Ｓ−１００抗体、抗τ抗原抗体、抗フィブリン抗体、抗ケラチン抗体、抗Ｔｎ−抗原抗体レセプタータンパク質、リンホカイン、酵素、ホルモン、増殖因子、または核酸結合タンパク質、細胞接着レセプターのリガンド；シグナル伝達レセプターのリガンド；ホルモン；デスドメインファミリー分子に結合する分子；抗原；ウイルス粒子、ウイルス被膜タンパク質もしくはその断片、次のものよりなる群から選択される毒性ポリペプチド：（ａ）リシン、（ｂ）シュードモナスエキソトキシン（ＰＥ）、（ｃ）ブリオジン、（ｄ）ゲロニン、（ｅ）α−サルシン、（ｆ）アスペルギリン、（ｇ）レストリクトシン、（ｈ）アンギオゲニン、（ｉ）サポリン、（ｊ）アブリン、（ｋ）アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、および（ｌ）（ａ）〜（ｋ）のいずれかの機能性断片；サイトカイン、または次のものよりなる群から選択される可溶性サイトカイン：エリトロポイエチン、インターロイキン、インターフェロン、繊維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子および表皮増殖因子、ＭＨＣクラスＩ抗原、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、インターナライズ性細胞表面レセプター、および／またはウイルスレセプター。
限定されるものではないが、特定の実施形態では、標的分子は、次のような抗原である：αフェトプロテイン、α−１アンチトリプシン、α−２マクログロブリン、アディポネクチン、アポリプロテイン−Ａ−１、アポリプロテイン−ＣＩＩＩ、アポリプロテイン−Ｈ、ＢＤＮＦ、β−２ミクログロブリン、Ｃ反応性タンパク質、カルシトニン、癌抗原１９−９、癌抗原１２５、ＣＥＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、補体第３成分、ＣＫ−ＭＢ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、エンドセリン−１、ｅｎｒａｇｅ、エオタキシン、エリトロポイエチン、第ＶＩＩ因子、ＦＡＢＰ、フェリチン、塩基性ＦＧＦ、フィブリノーゲン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＳＴ、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン、ハプトグロビン、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮ−γ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩＧＦ−１、ＩｇＭ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ ｐ４０、ＩＬ−１２ ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、インスリン、レプチン、リポプロテイン（ａ）、リンフォタクチン、ＭＣＰ−１、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、ミエロペルオキシダーゼ、ミオグロビン、ＰＡＩ−１、ＰＡＰ、ＰＡＰＰ−Ａ、ＳＧＯＴ、ＳＨＢＧ、ＰＳＡ（遊離型）、ＲＡＮＴＥＳ、血清アミロイドＰ、幹細胞因子、ＴＢＧ、トロンボポエチン、ＴＩＭＰ−１、組織因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ ＲＩＩ、ＴＳＨ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、またはｖＷＦ。
いくつかの実施形態では、標的分子は、自己免疫関連分子、たとえば、ＡＳＣＡ、β−２グリコプロテイン、Ｃ１ｑ、セントロメアプロテインＢ、１型コラーゲン、２型コラーゲン、４型コラーゲン、６型コラーゲン、シトクロムＰ４５０、ｄｓＤＮＡ、ヒストン、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ＨＳＣ−７０、ＨＳＰ−３２、ＨＳＰ−６５、ＨＳＰ−７１、ＨＳＰ−９０α、ＨＳＰ−９０β、インスリン、ＪＯ−１、ミトコンドリア分子、ミエロペルオキシダーゼ、膵島細胞分子、ＰＣＮＡ、ＰＭ−１、ＰＲ３、リボソームＰ、ＲＮＰ−Ａ、ＲＮＰ−Ｃ、ＲＮＰ、Ｓｅｌ−７０、Ｓｍｉｔｈ、ＳＳＡ、ＳＳＢ、Ｔ３、Ｔ４、チログロブリン、ｔＴＧ（セリアック病）、または甲状腺ミクロソーム分子である。
いくつかの実施形態では、標的分子は、感染因子、たとえば、コレラトキシン、コレラトキシンβ、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、サイトメガロウイルス、ジフテリアトキシン、エプスタイン−バーＮＡ、エプスタイン−バーＥＡ、エプスタイン−バーＶＣＡ、ヘリオバクター・ピロリ（Heliobacter pylori）、ＨＢＶコア、ＨＢＶエンベロープ、ＨＢＶ表面（Ａｄ）、ＨＢＶ表面（Ａｙ）、ＨＣＶコア、ＨＣＶ ＮＳ３、ＨＣＶ ＮＳ４、ＨＣＶ ＮＳ５、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、ＨＥＶ ｏｒｆ２ ３ＫＤ、ＨＥＶ ｏｒｆ２ ６ＫＤ、ＨＥＶ ｏｒｆ ３ＫＤ、ＨＩＶ−１ ｐ２４、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０、ＨＰＶ、ＨＳＶ−１／２、ＨＳＶ−１ ｇＤ、ＨＳＶ−２ ｇＤ、ＨＴＬＶ−１／２、Ａ型インフルエンザウイルス、Ａ型インフルエンザＨ３Ｎ２ウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、リーシュマニア・ドノバニ（Leishmania donorani）、ライム病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、Ｍ．ニューモニア（M. pneumonia）、Ｍ．ツベルクロシス（M. tuberculosis）、１型パラインフルエンザウイルス、２型パラインフルエンザウイルス、３型パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ＲＳＶ、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、ストレプトリジンＯ、テタヌストキシン、Ｔ．パリデュム（T. pallidum）１５ｋＤ、Ｔ．パリデュム（T. pallidum）ｐ４７、Ｔ．クルジ（T. cruzi）、トキソプラズマ、水痘帯状疱疹ウイルスから単離される成分である。
５．９ ナノレポーター集団
本発明は、ナノレポーター集団またはナノレポーター標識ユニット集団、たとえば、それぞれ、少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも７５種、少なくとも１００種、少なくとも２００種、少なくとも３００種、少なくとも４００種、少なくとも５００種、少なくとも７５０種、もしくは少なくとも１，０００種のユニークなナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニットを含有するナノレポーターライブラリーまたはナノレポーター標識ユニットライブラリーを提供する。本明細書中で使用する場合、集団内のナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニットに関連して使用するときの「ユニーク」とは、同一の集団において他のナノレポーターまたは標識ユニットから区別するコードを有するナノレポーターまたは標識ユニットを意味するものとする。
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも５，０００種、少なくとも１０，０００種、少なくとも２０，０００種、もしくは少なくとも５０，０００種のユニークなナノレポーターまたはナノレポーター標識ユニットを有するナノレポーター集団を提供する。
ナノレポーター集団中のナノレポーターは、シングルナノレポーター、デュアルナノレポーター、またはそれらの組合せでありうる。ナノレポーターは、標識化されていることもあれば標識化されていないこともある。
ナノレポーター集団のサイズおよびその中のナノレポーターの標的特異的配列の性質は、ナノレポーターの使用目的に依存するであろう。標的特異的配列が疾患細胞タイプなどの所与の細胞タイプのマーカーに対応するナノレポーター集団を作製することが可能である。特定の実施形態では、標的特異的配列が細胞内の異なるタイプの転写産物の少なくとも０．１％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％を占めるナノレポーター集団が生成される。特定の実施形態では、標的特異的配列が細胞内の異なる遺伝子の少なくとも０．１％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％を占めるナノレポーター集団が生成される。さらに他の実施形態では、少なくとも一部の標的特異的配列が細胞内もしくは組織内の希少な転写産物に対応するナノレポーター集団が生成される。そのようなナノレポーター集団は、好ましくは少なくとも５種の希少な転写産物に対応する。特定の実施形態では、そのようなナノレポーター集団は、少なくとも１０種、少なくとも２０種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、もしくは少なくとも５０種の希少な転写産物に対応する。
特定の実施形態では、細胞または組織は、哺乳動物の細胞または組織であり、より好ましくはヒトの細胞または組織である。
特定の実施形態では、ナノレポーター集団は、診断用もしくは予後判定用のナノレポーター集団である。たとえば、血液製剤のスクリーニングに有用な診断用ナノレポーター集団の生成が可能であり、この場合、標的特異的配列は、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルスのような混入ウイルスの核酸に結合する。他の選択肢として、診断用ナノレポーター集団は、腫瘍抗原のような細胞疾患マーカーに対応する標的特異的配列を含有しうる。予後判定用ナノレポーター集団は、一般的には、癌のような所与の疾患の異なる段階に対応する標的特異的マーカーを含む。適切な標的特異的配列を選択することにより、ナノレポーター集団を疾患の診断および予後判定の両方に使用することが可能である。
５．１０ 生体分子サンプル
本発明に係るナノレポーターシステムを使用することにより、任意の生体分子サンプル中の標的分子を検出することが可能である。当業者であればわかるであろうが、サンプルは、任意の数の次のもの（ただし、これらに限定されるものではない）を含みうる：細胞（プライマリー細胞および培養細胞系の両方を包含する）、細胞の溶解物または抽出物（ＲＮＡ抽出物、精製ｍＲＮＡを包含するが、これらに限定されるものではない）、組織および組織抽出物（ＲＮＡ抽出物、精製ｍＲＮＡを包含するが、これらに限定されるものではない）；体液（血液、尿、血清、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、房水もしくは硝子体液、初乳、喀痰、羊水、唾液、肛門および膣の分泌液、発汗、ならびに精液を包含するが、これらに限定されるものではない）、漏出液、滲出液（たとえば、膿瘍または任意の他の感染部位もしくは炎症部位から得られる液）、あるいは関節（たとえば、正常関節、またはリウマチ様関節炎、骨関節炎、痛風、もしくは敗血症性関節炎のような疾患に罹患した関節）から得られる液、これらは、事実上任意の生物のものであるが、哺乳動物サンプルが好ましく、ヒトサンプルがとくに好ましい；環境サンプル（空気、農業用の水および土壌のサンプルを包含するが、これらに限定されるものではない）；生物兵器サンプル；研究サンプル、たとえば、細胞外液、細胞培養物に由来する細胞外上清、細菌中の封入体、細胞内コンパートメント、細胞ペリプラズム、ミトコンドリアコンパートメントなど。
生体分子サンプルは、生体学的サンプルから間接的に得ることが可能である。たとえば、対象の標的分子が細胞転写産物たとえばメッセンジャーＲＮＡである場合、本発明に係る生体分子サンプルは、メッセンジャーＲＮＡの逆転写により生成されるｃＤＮＡを含有するサンプルでありうる。他の例では、本発明に係る生体分子サンプルは、生体学的サンプルを分画たとえばサイズ分画または膜分画に付することにより作製される。
本発明に係る生体分子サンプルは、「天然の状態」すなわち操作や処理に付されていない状態であってもよいし、「処理された状態」であってもよく、処理は、候補作用剤たとえば薬剤、遺伝子工学的処理（たとえば、遺伝子の付加または欠失）などをはじめとする任意の数の処理を含みうる。
５．１１ 標識モノマーの分離
標識化ナノレポーターから生成される全シグナルの検出のほかに、本発明は、ナノレポーター上の標識モノマーから放出されるシグナルの空間的位置（すなわちスポット）の測定法を提供する。この場合、各スポットは、所与の標識結合領域に結合された標識モノマーに由来する総和シグナルに対応する。スポットは、同一の波長または異なる波長のシグナルを含有しうる。したがって、ナノレポーター上のスポットの性質およびその位置は、ナノレポーターコードを構成する。
さまざまな手段のいずれか用いることにより、ナノレポーターを「伸長」させて個別スポットを分離することが可能である。たとえば、ナノレポーターは、流動伸長技術（Henegariu et al., 2001, Biotechniques 31:246-250)、後退メニスカス技術（receding meniscus technique）(Yokota et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:1064-1070）または電気伸長技術（Matsuura et al., 2001, Nuc. Acids Res. 29:E79）を用いて伸長させることが可能である。
流動伸長、後退メニスカス、または電気伸長の技術を用いれば、特定のシグナルがナノレポーター中のどこに位置するかを空間的に測定できるように、ナノレポーター内の標識結合領域を分離することが可能である。したがって、標識モノマーの同一の組合せおよび同一の全シグナルを有するユニークなナノレポーターをナノレポーター内のそれらの標識モノマーの位置に基づいて互いに鑑別することが可能である。
ナノレポーター内の標識結合領域またはスポットの位置をこのように決定できるので、各標識結合領域中の標識モノマーによる放出されるシグナルの位置を一連のユニークなナノレポーターの生成時の識別特性として使用することが可能である。したがって、ナノレポーター内の標識モノマーの位置を変化させることにより、出発標識モノマーの同一の組合せを用いて複合型の一連のナノレポーターを作製することが可能である。
ナノレポーターの伸長前、以上の第５．６節に記載されるアフィニティータグを用いてナノレポーターを固体表面に固定することが好ましい。
本発明に係る特定の態様では、固体表面への特異的結合または非特異的結合のいずれかを介してナノレポーターの一端を固定し、ナノレポーターを伸長させ、次に、同様に固体表面への特異的結合または非特異的結合のいずれかを介してレポーターの他端を固定する。したがって、ナノレポーターは、ナノレポーターに結合された標識モノマーにより放出されるシグナルおよびそれらの互いの相対位置の検出および／または画像化によるナノレポーターコードの解像が容易になるように、その伸長状態で「凍結」される。本発明のこれらの態様について以下の第５．１２節で説明する。
５．１２ 伸長型ナノレポーターの固定
本発明は、さまざまなナノレポーターの一次構造の同定を容易にする方法および組成物を提供する。特定の態様では、本発明は、伸長状態のナノレポーターを選択的に固定する方法を提供する。本発明によれば、伸長のためにいかなる力を使用した場合でも完全に伸長された状態でナノレポーターを選択的に固定することが可能である。そのほかに、本発明に係る方法は、互いに配向された伸長型ナノレポーターの選択的固定を容易にする。言い換えれば、本発明に係る方法によれば、複数のナノレポーターを互いに同一の配向状態で容易に固定することが可能である。
一態様では、本発明は、伸長状態のナノレポーターを選択的に固定する方法を提供する。本発明のこの態様に係る方法では、一般的には、ナノレポーターの第１の部分は、当業者に公知のいずれかの技術により固定される。実際には、ナノレポーターの第１の部分を固定する技術は、本発明の多くの実施形態に重要ではない。特定の実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、選択的もしくは非選択的に固定可能である。特定の実施形態では第１の部分は、１つ以上の共有結合により固定される。特定の実施形態では、第１の部分は、１つ以上の非共有結合により固定される。代表的な固定された第１の部分について以下の節で説明する。
固定された第１の部分を用いて、当業者に自明なナノレポーターの任意の伸長技術により、ナノレポーターを伸長させることが可能である。特定の実施形態では、ナノレポーターを伸長させる技術は、本発明に係る方法に重要ではない。特定の実施形態では、当業者の判断に基づいたクラスのナノレポーターに適合するナノレポーターを伸長させる技術である。特定の実施形態では、ナノレポーターは、ナノレポーターを伸長させうる力を加えることにより伸長される。力は、ナノレポーターの伸長技術に関連する当業者に自明な任意の力でありうる。代表的な力としては、重力、流体力、電磁力、およびそれらの組合せが挙げられる。ナノレポーターの伸長に特有な技術について以下の節で説明する。
ナノレポーターは、伸長されたことが当業者により確認されれば、伸長状態である。特定の実施形態では、ナノレポーターは、ナノレポーターを伸長させうる力の場の中に存在する場合、伸長状態である。当業者であればわかることであるが、特定の実施形態では、ナノレポーターは、その平均流体力学的半径がその天然の状態のナノレポーターの平均流体力学的半径の２倍超である場合、伸長状態である。
本発明のこの態様では、本方法は、一般的には、伸長状態にあるときにナノレポーターの第２の部分を選択的に固定する工程を含む。これにより、第１および第２の部分の間で伸長された固定化ナノレポーターを得ることが可能である。注目すべき点として、ナノレポーターが伸長時に選択的に固定されるので、その伸長は、固定化ナノレポーターの形態で保持可能である。一般的には、ナノレポーターの第１の部分および第２の部分は同一でない。
選択的固定は、ナノレポーターの一部を選択的に固定するための当業者に自明な任意の技術に基づくものでありうる。選択的固定は、たとえば、１つ以上の共有結合もしくは１つ以上の非共有結合またはその両方の形成を介するものでありうる。選択的固定技術の特定例を以下の節で説明する。特定の実施形態では、１つ以上の結合ペアを用いてナノレポーターの第２の部分を固定する。
第２の部分は、当業者に自明な任意の基材上に固定可能である。基材は、固定に役立つと判断される当業者に公知の任意の基材でありうる。特定の実施形態では、第２の部分は、他の分子に固定可能である。さらなる有用な基材としては、表面、膜、ビーズ、多孔性材料、電極、アレイ、および当業者に自明な任意の他の基材が挙げられる。
他の態様では、本発明は、選択的に固定された伸長型ナノレポーターを含む組成物を提供する。組成物は、一般的には、基材と基材上に選択的に固定された伸長型ナノレポーターとを含む。基材は、当業者に公知の任意の基材でありうる。代表的な基材としては、以下の節に記載のものが挙げられる。ナノレポーターの少なくとも２つの部分は、基材上に固定され、ナノレポーターは、２つの部分の間で伸長された状態である。特定の実施形態では、ナノレポーターの少なくとも１つの部分は、基材上に選択的に固定される。特定の実施形態では、ナノレポーターの２つ以上の部分は、基材上に選択的に固定される。ナノレポーターは、当業者に自明な任意の技術、たとえば、特定的には本発明に係る方法により、伸長および／または固定が可能である。
他の態様では、本発明は、配向状態のナノレポーターを選択的に固定する方法を提供する。ナノレポーターは、以上に記載の任意のナノレポーターでありうる。特定の実施形態では、ナノレポーターは可撓性でありうるか、または特定の実施形態では、ナノレポーターは剛性もしくは半剛性でありうる。本発明のこの態様に係る方法では、一般的には、ナノレポーターの第１の部分は、以上に記載されるように固定される。固定された第１の部分を用いて、当業者に自明なナノレポーターの任意の伸長技術により、ナノレポーターを配向させることが可能である。特定の実施形態では、ナノレポーターを配向させる技術は、本発明に係る方法に重要ではない。特定の実施形態では、当業者の判断に基づいたクラスのナノレポーターに適合するナノレポーターを配向させる技術である。特定の実施形態では、ナノレポーターは、ナノレポーターを配向させうる力を加えることにより配向される。力は、ナノレポーターの配向技術に関連する当業者に自明な任意の力でありうる。代表的な力としては、重力、流体力、電磁力、およびそれらの組合せが挙げられる。ナノレポーターの伸長に特有な技術について以下の項で説明する。
ナノレポーターは、配向されたことが当業者により確認されれば、配向状態である。特定の実施形態では、ナノレポーターは、ナノレポーターを配向させうる力の場の中に存在する場合、配向状態である。当業者であればわかることであるが、特定の実施形態では、ナノレポーターは、ナノレポーターを配向させうる力の場と平行にその末端が配置された場合、配向状態である。当業者であればわかることであるが、特定の実施形態では、複数のナノレポーターは、ナノレポーターの末端が平行に配置された場合、配向状態である。
本発明のこの態様では、本方法は、一般的には、配向状態にあるときにナノレポーターの第２の部分を選択的に固定する工程を含む。これにより、第１および第２の部分の間で配向された固定化ナノレポーターを得ることが可能である。注目すべき点として、ナノレポーターが伸長時に選択的に固定されるので、その配向は、固定化ナノレポーターの形態で保持可能である。選択的固定は、以上に記載の方法に基づくものでありうる。
他の態様では、本発明は、選択的に固定された配向型ナノレポーターを含む組成物を提供する。組成物は、一般的には、基材と基材上に選択的に固定された配向型ナノレポーターとを含む。基材は、当業者に公知の任意の基材でありうる。代表的な基材としては、以下の節に記載のものが挙げられる。ナノレポーターの少なくとも２つの部分は、基材上に固定され、ナノレポーターは、２つの部分の間で配向された状態である。特定の実施形態では、ナノレポーターの少なくとも１つの部分は、基材上に選択的に固定される。特定の実施形態では、ナノレポーターの両方の部分は、基材上に選択的に固定される。ナノレポーターは、当業者に自明な任意の技術、たとえば、特定的には本発明に係る方法により、配向および／または固定が可能である。
本発明に係る方法および組成物は、当業者に自明な任意の目的に使用可能である。たとえば、固定されかつ伸長および／または配向されたナノレポーターは、ナノレポーターが固定された基材に対する標識として使用可能である。固定されかつ伸長および／または配向されたナノレポーターの一次配列は、当業者に自明な任意の技術により同定可能である。有利には、伸長および／または配向されたナノレポーターの固定は、そのような技術を容易にしうる。特定の実施形態では、固定されかつ伸長および／または配向されたナノレポーターは、ナノ経路の作製を制御するために、たとえば、ナノワイヤーまたはナノ回路を形成するために、使用可能である。固定されかつ伸長および／または配向されたナノレポーターのさらなる使用について以下の節で説明する。
本明細書中で使用される用語はすべて、とくに指示がないかぎり、当業者の知るその通常の意味を有する。以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
本明細書中で使用する場合、「結合ペア」という用語は、互いに選択的に結合可能な、すなわち、組成物中の他の成分に対するよりも大きい親和性で互いに結合可能な、第１および第２の分子または部分を意味する。結合ペアのメンバー間の結合は、共有結合または非共有結合でありうる。特定の実施形態では、結合は非共有結合である。代表的な結合ペアとしては、免疫学的結合ペア（たとえば、対応する抗体またはその結合部分もしくはフラグメントと組み合わされた任意のハプテン性もしくは抗原性の化合物、たとえば、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン、フルオレセインと抗フルオレセイン、ジニトロフェノールと抗ジニトロフェノール、ブロモデオキシウリジンと抗ブロモデオキシウリジン、マウス免疫グロブリンとヤギ抗マウス免疫グロブリン）および非免疫学的結合ペア（たとえば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ホルモン−ホルモン結合タンパク質、レセプター−レセプターリガンド（たとえば、アセチルコリンレセプター−アセチルコリンまたはその類似体）、ＩｇＧ−プロテインＡ、レクチン−炭水化物、酵素−酵素補因子、酵素−酵素阻害剤、核酸二本鎖を形成しうる相補的ポリヌクレオチドペアなど）が挙げられる。たとえば、免疫反応性結合メンバーとしては、抗原、ハプテン、アプタマー、抗体（一次もしくは二次）、およびそれらの複合体が挙げられうる（組換えＤＮＡ法またはペプチド合成により生成されるものを包含する）。抗体は、モノクロナール抗体もしくはポリクロナール抗体、組換えタンパク質、またはそれらの混合物（複数可）もしくはフラグメント（複数可）、さらには抗体と他の結合性メンバーとの混合物でありうる。他の一般的な結合ペアとしては、ビオチンとアビジン（またはその誘導体）、ビオチンとストレプトアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列（たとえば、プローブ核酸配列とキャプチャー核酸配列）、相補的ペプチド配列、たとえば、組換え法により生成されるもの、エフェクター分子とレセプター分子、ホルモンとホルモン結合タンパク質、酵素補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
「選択的結合」とは、組成物中の他の分子または部分に対する分子または部分のペアの互いの任意の優先的結合を意味するが、これについては、当業者であればわかるであろう。特定の実施形態では、分子または部分のペアは、他の分子または部分と比較して互いに優先的に結合する場合、選択的に結合する。選択的結合は、他の分子または部分に対する１つの分子または部分の親和性もしくは結合活性またはその両方を含みうる。特定の実施形態では、選択的結合は、約１×１０−５Ｍ未満、または約１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、１×１０−９Ｍ未満、もしくは１×１０−１０Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）を必要とする。これとは対照的に、特定の実施形態では、非選択的結合は、有意により低い親和性、たとえば、１×１０−３Ｍ超のＫＤを有する。
「伸長状態」とは、当業者であれば伸長させたときにわかるであろう状態のナノレポーターを意味する。特定の実施形態では、ナノレポーターは、溶液中においてその天然のコンフォメーションを基準にして伸長されている場合、伸長状態である。特定の実施形態では、ナノレポーターは、ナノレポーターを伸長させうる力の場の中に存在する場合、伸長状態である。特定の実施形態では、ナノレポーターの伸長状態は、定量的に測定可能である。そのような実施形態では、当業者は、ナノレポーターの末端間ベクトルすなわちナノレポーターの２つの末端間の距離としてＲを認識し、当業者に適切であるとみなされる溶液中においてＲの９５％が２＜Ｒ＞以内に入るような平均末端間ベクトルとして＜Ｒ＞を認識するであろう。代表的な溶液としては、たとえば、水中またはｐＨ緩衝液中のナノレポーターの希薄溶液が挙げられる。特定の実施形態では、ナノレポーターは、Ｒが２．０＜Ｒ＞超である場合、伸長状態である。
「配向状態」とは、当業者であれば配向させたときにわかるであろう状態のナノレポーターを意味する。特定の実施形態では、ナノレポーターは、溶液中においてその天然のコンフォメーションを基準にして配向されている場合、配向状態である。特定の実施形態では、ナノレポーターは、ナノレポーターを配向させうる力の場と平行に配置された場合、配向されている。当業者であればわかることであるが、特定の実施形態では、ナノレポーターは、複数のナノレポーターのうちの１つが平行に配置された場合、配向されている。
５．１２．１ 選択的固定方法
以上に記載したように、本発明は、伸長状態のナノレポーターの選択的固定方法を提供する。ナノレポーターは、選択的固定の後、当業者に自明な任意の目的に使用可能である。
特定の実施形態では、ナノレポーターは、当業者に公知の任意のポリマーである。たとえば、ナノレポーターは、ポリサッカリド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドでありうる。有用なポリヌクレオチドとしては、リボ核酸、デオキシリボ核酸、および当業者に公知の他のポリヌクレオチドが挙げられる。
ナノレポーターは、本発明に係る方法に基づくナノレポーターの伸長および固定を可能にするのに十分な任意のサイズでありうる。ナノレポーターがポリヌクレオチドである特定の実施形態では、ナノレポーターは、５００ｂｐ超、７５０ｂｐ超、１ｋｂ超、１．５ｋｂ超、２．０ｋｂ超、２．５ｋｂ超、３．０ｋｂ超、４．０ｋｂ超、または５．０ｋｂ超の長さを有しうる。ナノレポーターがポリペプチドである特定の実施形態では、ナノレポーターは、５０アミノ酸超、１００アミノ酸超、２００アミノ酸超、３００アミノ酸超、４００アミノ酸超、５００アミノ酸超、７５０アミノ酸超、１０００アミノ酸超、１５００アミノ酸超、２０００アミノ酸超、２５００アミノ酸超、３０００アミノ酸超、４０００アミノ酸超、または５０００アミノ酸超のサイズを有しうる。ナノレポーターがポリサッカリドである特定の実施形態では、ナノレポーターは、５０サッカリド超、１００サッカリド超、２００サッカリド超、３００サッカリド超、４００サッカリド超、５００サッカリド超、７５０サッカリド超、１０００サッカリド超、１５００サッカリド超、２０００サッカリド超、２５００サッカリド超、３０００サッカリド超、４０００サッカリド超、または５０００サッカリド超のサイズを有しうる。
ナノレポーターは、当業者により理解される天然のナノレポーターでありうるか、またはナノレポーターは、非天然のナノレポーターでありうる。ナノレポーターがポリペプチドである特定の実施形態では、ナノレポーターは、天然に存在するアミノ酸だけを含みうるか、またはナノレポーターは、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含みうる。他方のアミノ酸は、当業者に公知の任意のアミノ酸またはその誘導体もしくは類似体でありうる。ナノレポーターがポリヌクレオチドである特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドだけを含みうるか、またはポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドを含みうる。ナノレポーターがポリサッカリドである特定の実施形態では、ポリサッカリドは、天然に存在するサッカリドだけを含みうるか、またはポリサッカリドは、天然に存在するサッカリドおよび天然に存在しないサッカリドを含みうる。特定の実施形態では、ポリマーは、非天然モノマーだけを含みうる。さらなる実施形態では、ナノレポーターは、複数のクラスのモノマー、たとえば、アミノ酸、ヌクレオチド、および／またはサッカリドを含みうる。
特定の実施形態では、ナノレポーターは、モノマーの共有結合主鎖を１本だけ含む。たとえば、ナノレポーターがポリペプチドである特定の実施形態では、ナノレポーターは、アミノ酸主鎖を１本だけ含む。ナノレポーターがポリヌクレオチドである場合、特定の実施形態では、ナノレポーターは一本鎖である。さらなる実施形態では、ナノレポーターは、モノマーの共有結合主鎖を２本含む。たとえば、ナノレポーターがポリペプチドである場合、特定の実施形態では、ナノレポーターは２本のアミノ酸主鎖を含む。ナノレポーターがポリヌクレオチドである場合、特定の実施形態では、ナノレポーターは２本のポリヌクレオチド鎖を含み、特定の実施形態では、ナノレポーターは一部もしくは全部が二本鎖でありうる。さらなる実施形態では、ナノレポーターは、モノマーの共有結合主鎖を３本以上含む。たとえば、ナノレポーターがポリペプチドである場合、特定の実施形態では、ナノレポーターは３本のアミノ酸主鎖を含む。ナノレポーターがポリヌクレオチドである場合、特定の実施形態では、ナノレポーターは３本のポリヌクレオチド鎖を含む。たとえば、ナノレポーターは、３本の鎖Ｆ１、Ｘ、およびＦ２を含みうる。ただし、鎖Ｘの一部は鎖Ｆ１に相補的であり、かつ鎖Ｘの一部は鎖Ｆ２に相補的である。例を図１３Ａに示す。特定の実施形態では、ナノレポーターは、モノマーの共有結合主鎖を３本超含む。
有利には、本発明に係るナノレポーターは、当業者に公知の技術によるナノレポーターの検出、画像化、または同定を容易にする１つ以上の標識を含みうる。標識は、当業者に公知の任意の検出可能な部分でありうる。ナノレポーター用の代表的な標識としては、検出可能な同位体、放射性同位体、発蛍光団、色素、酵素、リガンド、レセプター、抗原、抗体、レクチン、炭水化物、ヌクレオチド配列、および当業者に自明な任意の他の検出可能な標識が挙げられる。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然の核酸塩基（たとえば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）もしくは合成の核酸塩基または両方の組合せのポリマーである。ポリヌクレオチドのバックボーンは、完全に「天然」のホスホジエステル結合で構成されうるか、または１つ以上の修飾された結合、たとえば、１つ以上のホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホルアミデート結合、または他の修飾された結合を含有しうる。特定例として、ポリヌクレオチドは、アミド結合を含有するペプチド核酸（ＰＮＡ）でありうる。本発明と組み合わせて使用可能な合成の塩基およびバックボーンの追加の例ならびにそれらの合成方法は、たとえば、U.S. Patent No. 6,001,983; Uhlman & Peyman, 1990, Chemical Review 90(4):544 584; Goodchild, 1990, Bioconjugate Chem. 1(3):165 186; Egholm et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 1897; Gryaznov et al., J. Am. Chem. Soc. 116:3143 3144および以上全体に引用されている参考文献に見いだしうる。ポリヌクレオチドを構成しうる一般的な合成核酸塩基としては、３−メチルウラシル、５，６−ジヒドロウラシル、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−フルオロウラシル（5 thorouracil）、５−ヨードウラシル、６−ジメチルアミノプリン、６−メチルアミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、６−アミノ−８−ブロモプリン、イノシン、５−メチルシトシン、７−デアザアデニン、および７−デアザグアノシンが挙げられる。標的核酸を構成しうる合成核酸塩基の追加の例は、Fasman, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 1985, pp. 385-392; Beilstein’s Handbuch der Organischen Chemie, Springer Verlag, Berlin and Chemical Abstracts（それらはすべて、そのような核酸塩基の構造、性質、および調製が記載されている出版物への参照を提供する）に見いだしうるが、これらに限定されるものではない。
ナノレポーターは、当業者に自明な任意の技術に従って調製可能である。有利には、本発明に係るナノレポーターは、以下の節に記載されるように、標識ならびに／またはナノレポーターの調製および／もしくは精製を容易にするために使用可能な結合ペアのメンバーを含みうる。そのほかに、本発明に係る特定のナノレポーターは、以下に記載されるように、結合ペアのメンバーを含む分子と複合体を形成しうる。この複合体を用いることにより、ナノレポーターまたは複合体の調製および／または精製を容易にしうる。
５．１２．２ 第１の部分の固定
本発明に係る方法では、ナノレポーターの第１の部分は固定される。一般的には、第１の部分は、固定されたことが当業者により確認されれば、固定されている。第１の部分は、当業者に自明な任意の技術により固定可能である。特定の実施形態では、ナノレポーターの第１の部分を固定する技術は、本発明に係る方法に重要ではない。
ナノレポーターの第１の部分は、ナノレポーター中の任意の位置に存在しうる。特定の実施形態では、第１の部分はナノレポーターの末端に存在する。本発明の目的では、ナノレポーターの末端から５モノマー未満、４、３、２、１、もしくは０モノマーである場合、ナノレポーターの一部は「末端」に存在しうる。もちろん、多くのナノレポーターは２つの末端を有するが、本発明に係る方法は、２個超の末端を有するナノレポーターおよび１もしくは０個の末端を有するナノレポーター、たとえば、環状ナノレポーターに適用可能である。特定の実施形態では、第１の部分はナノレポーターの末端に存在しない。
ナノレポーターは、当業者に自明な任意の基材上に固定可能である。基材は、限定されるものではなく、ナノレポーターを固定しうる任意の部分でありうる。特定の実施形態では、基材は、表面、膜、ビーズ、多孔性材料、電極、またはアレイである。
特定の実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、非選択的に固定可能である。さらなる実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、選択的に固定可能である。有利な実施形態では、ナノレポーターの第１の部分を固定した後、ナノレポーターの一部分は、本方法の後続の工程でナノレポーターを伸長させることができるように十分な程度に自由移動できなければならない。特定的には、ナノレポーターの第１の部分が非選択的に固定される特定の実施形態では、ナノレポーターのいずれの部分の伸長も防止される程度まで全ナノレポーターが非選択的に固定されることがないようにすることが重要である。
固定は、当業者に自明な基材との任意の相互作用によるものでありうる。固定は、静電的相互作用もしくはイオン性相互作用を介するか、１つ以上の共有結合を介するか、１つ以上の非共有結合を介するか、またはそれらの組合せを介するものでありうる。特定の実施形態では、固定は、電極との静電的相互作用を介するものでありうる。さらなる実施形態では、固定は、電極以外の基材との静電的相互作用を介するものである。
特定の実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、結合ペアの第１のメンバーを含む。結合ペアの第１のメンバーは、ナノレポーターの第１の部分に共有結合で結合されうるか、または非共有結合で結合されうる。有用な共有結合および非共有結合は、当業者に自明であろう。有用な実施形態では、ナノレポーターの第１の部分が結合される基材は、結合ペアの第２のメンバーを含むであろう。基材は、第２のメンバーに共有結合で結合されうるか、または非共有結合で結合されうる。図１２Ａは、基材の部分に選択的に結合しうるＦ１部分を含むナノレポーターを示している。Ｆ１部分は、たとえば、アビジンで被覆された基材などに結合可能なビオチンでありうる。
特定の実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、基材上の結合ペアのメンバーと結合して１つ以上の非共有結合を形成しうる結合ペアのメンバーを含みうる。代表的な有用な基材としては、リガンド、抗原、炭水化物、核酸、レセプター、レクチン、および抗体よりなる群から選択される結合部分を含むものが挙げられる。ナノレポーターの第１の部分は、基材の結合部分と結合しうる結合部分を含むであろう。反応部分を含む代表的な有用な基材としては、エポキシ、アルデヒド、金、ヒドラジド、スルフヒドリル、ＮＨＳ−エステル、アミン、チオール、カルボキシレート、マレイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、ヒドロキシル、ペンタフルオロフェニル−エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、もしくはビニルスルホン、またはそれらの混合物を含む表面が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような表面は、供給業者から入手可能であるかまたは標準的方法に従って調製可能である。
有利な実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、アビジン−ビオチン結合ペアを介して基材に固定可能である。特定の実施形態では、ナノレポーターは、その第１の部分にビオチン部分を含みうる。たとえば、ポリヌクレオチドナノレポーターは、ビオチン化ヌクレオチド残基を含みうる。同様に、ポリペプチドナノレポーターは、ビオチン化アミノ酸残基を含みうる。アビジンを含む基材は、当業者に公知のアビジンを含む任意の基材でありうる。アビジンを含む有用な基材は、ＴＢ０２００（Accelr8）、ＳＡＤ６、ＳＡＤ２０、ＳＡＤ１００、ＳＡＤ５００、ＳＡＤ２０００（Xantec）、ＳｕｐｅｒＡｖｉｄｉｎ（Array-It）、ストレプトアビジンスライド（カタログ＃MPC 000、Xenopore）、およびＳＴＲＥＰＴＡＶＩＤＩＮｎｓｌｉｄｅ（カタログ＃439003、Greiner Bio-one）をはじめとする市販品として入手可能である。
特定の実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、基材上のヌクレオチド配列に選択的に結合しうるヌクレオチド配列を含みうる。
さらなる実施形態では、ナノレポーターの第１の部分はアビジンを含みうる。そして基材はビオチンを含みうる。ビオチンを含む有用な基材は、Ｏｐｔｉａｒｒａｙ−ｂｉｏｔｉｎ（Accelr8）、ＢＤ６、ＢＤ２０、ＢＤ１００、ＢＤ５００、およびＢＤ２０００（Xantec）をはじめとする市販品として入手可能である。
さらなる実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、１つ以上の他の分子との複合体を形成可能であり、さらに、該分子は、基材の結合部分に共有結合または非共有結合で結合可能である。たとえば、ナノレポーターの第１の部分は、基材のアビジン部分などに選択的に結合しうるビオチン部分などを含む他の分子に選択的に結合しる能力を有しうる。図１３Ａは、Ｆ１を含む第３の分子に選択的に結合しうる第２の分子Ｘに選択的に結合しうるナノレポーターを示している。Ｆ１は、基材上の部分に選択的に結合しうる。図１３Ｂは、Ｆ１を含む第２の分子に選択的に結合しうるナノレポーターを示している。また、Ｆ１は基材上の部分に選択的に結合しうる。
さらなる実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、基材上の結合ペアのメンバーと反応して１つ以上の共有結合を形成しうる結合ペアのメンバーを含みうる。反応基を含む代表的な有用な基材としては、スクシンアミド、アミン、アルデヒド、エポキシ、およびチオールよりなる群から選択される反応部分を含むものが挙げられる。ナノレポーターの第１の部分は、基材の反応部分と反応しうる反応部分を含むであろう。反応部分を含む代表的な有用な基材としては、ＯｐｔＡｒｒａｙ−ＤＮＡ ＮＨＳ ｇｒｏｕｐ（Accelr8）、Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ Ｓｌｉｄｅ ＡＬ（Schott）、およびＮｅｘｔｅｒｉｏｎ Ｓｌｉｄｅ Ｅ（Schott）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
特定の実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、光活性化により基材に結合されうる反応部分を含みうる。基材は光反応部分を含みうるか、またはナノレポーターの第１の部分は光反応部分を含みうる。光反応部分のいくつかの例としては、アリールアジド、たとえば、Ｎ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリチルアミド；フッ素化アリールアジド、たとえば、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸；ベンゾフェノン系試薬、たとえば、４−ベンゾイル安息香酸のスクシンイミジルエステル；および５−ブロモ−デオキシウリジンが挙げられる。
さらなる実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、当業者に自明な他の結合ペアを介して基材に固定可能である。
５．１２．３ ナノレポーターの伸長
本発明に係る特定の方法では、ナノレポーターは伸長状態である。一般的には、いずれのナノレポーターも、そうであることが当業者により確認されれば、伸長状態である。
特定の実施形態では、ナノレポーターは、ナノレポーターの伸長に好適な条件下でナノレポーターを伸長させうる力の場の中に存在する場合、伸長状態である。そのような力および条件は、当業者には自明であろう。たとえば、多くのナノレポーターは、流体力によりまたは重力により伸長可能であり、多くの荷電ナノレポーターは、電磁力により伸長可能である。特定の実施形態では、力は、ナノレポーターに間接的に加えることが可能である。たとえば、ナノレポーターは、力により移動されうる部分を含みうるか、または共有結合もしくは非共有結合で該部分に結合されうる。特定の実施形態では、ナノレポーターは、部分に結合可能である。
特定の実施形態では、力は電磁力である。たとえば、ナノレポーターがポリヌクレオチドのように荷電されている場合、ナノレポーターは、電場または磁場の中で伸長可能である。場は、当業者の判断に基づいてナノレポーターを伸長させるのに十分な程度に強力であることが望ましい。電場または磁場の中でナノレポーターを伸長させる代表的な技術は、Matsuura et al., 2002, J Biomol Struct Dyn. 20(3):429-36; Ferree & Blanch, 2003, Biophys J. 85(4):2539-46; Stigter & Bustamante, 1998, Biophys J. 1998 75(3):1197-210; Matsuura et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29(16); Ferree & Blanch, 2004, Biophys J. 87(1):468-75（それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）に記載されている。
特定の実施形態では、力は流体力である。たとえば、ポリサッカリド、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドを含む多くのナノレポーターは、移動流体場の中で伸長可能である。流体力は、当業者の判断に基づいてナノレポーターを伸長させるのに十分な程度に強力であることが望ましい。流体力場の中でナノレポーターを伸長させる代表的な技術は、Bensimon et al., 1994, Science 265:2096-2098; Henegariu et al., 2001, BioTechniques 31:246-250; Kraus et al., 1997, Human Genetics 99:374-380; Michalet et al., 1997, Science 277:1518-1523; Yokota et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(5):1064-70; Otobe et al., 2001, Nucleic Acids Research 29:109; Zimmerman & Cox, 1994, Nucleic Acids Res. 22(3):492-7, and U.S. Patent Nos. 6,548,255; 6,344,319; 6,303,296; 6,265,153; 6,225,055; 6,054,327; and 5,840,862（それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）に記載されている。
特定の実施形態では、力は重力である。有利な実施形態では、重力をたとえば流体力と組み合わせてナノレポーターを伸長させることが可能である。特定の実施形態では、力は、当業者の判断に基づいてナノレポーターを伸長させるのに十分な程度に強力であることが望ましい。重力を用いてナノレポーターを伸長させる代表的な技術は、Michalet et al., 1997, Science 277:1518-1523; Yokota et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(5):1064-70; Kraus et al., 1997, Human Genetics 99:374-380（それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）に記載されている。
特定の実施形態では、力は移動メニスカスを介して加えられる。種々の力、たとえば、流体力、界面張力、および当業者であればわかる任意の他の力を移動メニスカスによりナノレポーターに加えうることは当業者であればわかるであろう。メニスカスは、蒸発および重力をはじめとする当業者に自明な任意の技術により移動可能である。移動メニスカスを用いてナノレポーターを伸長させる代表的な技術は、たとえば、U.S. Patent Nos. 6,548,255; 6,344,319; 6,303,296; 6,265,153; 6,225,055; 6,054,327; and 5,840,862（それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）に記載されている。
特定の実施形態では、ナノレポーターは、光学的トラップまたは光ピンセットにより伸長可能である。たとえば、ナノレポーターは、光力の適切な供給源によりトラップもしくは移動されうる粒子を含みうるか、または共有結合もしくは非共有結合で該粒子に結合されうる。光学的トラップまたは光ピンセットを用いて粒子を移動させる有用な技術は、Ashkin et al., 1986, Optics Letters 11:288-290; Ashkin et al., 1987, Science 235:1517-1520; Ashkin et al., Nature 330:769-771; Perkins et al., 1994, Science 264:822-826; Simmons et al., 1996, Biophysical Journal 70:1813-1822; Block et al., 1990, Nature 348:348-352; and Grier, 2003, Nature 424:810-816（それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）に記載されている。
特定の実施形態では、ナノレポーターは、当業者に自明な以上の力の組合せにより伸長可能である。以下の例では、ナノレポーターは、電場と流体力との組合せにより伸長される。
ナノレポーターは、ナノレポーターの伸長の標準的基準に従って伸長されたことが当業者により確認された場合、伸長状態である。当業者であればわかることであるが、特定の実施形態では、ナノレポーターは、その三次構造上の特徴のほとんどが失われた場合、伸長されている。当業者であればわかることであるが、特定の実施形態では、ナノレポーターは、その二次構造上の特徴のほとんどが失われた場合、伸長されている。特定の実施形態では、ナノレポーターは、標準的技術に従って画像化されたときにその一次構造上の特徴が配列中に検出可能な場合、伸長されている。代表的な画像化技術は、以下の例に記載されている。
特定の実施形態では、ナノレポーターの伸長状態は、その流体力学的半径を希薄溶液中における遊離状態でのその平均流体力学的半径と比較することにより確認可能である。たとえば、特定の実施形態では、ナノレポーターまたはその一部分は、その流体力学的半径が希薄溶液中におけるその平均流体力学的半径の約２倍超である場合、伸長されている。より定量的には、Ｒは、ナノレポーターまたはその一部分の平均流体力学的半径を表し、＜Ｒ＞は、希薄溶液中におけるナノレポーターまたはその一部分の流体力学的半径を表す。平均＜Ｒ＞は、希薄溶液中における非結合状態でのナノレポーターまたはその一部分のＲが時間の９５％で２＜Ｒ＞未満であるように計算されるはずである。特定の実施形態では、ナノレポーターまたはその一部分は、Ｒが１．５＜Ｒ＞超、１．６＜Ｒ＞超、１．７＜Ｒ＞超、１．８＜Ｒ＞超、１．９＜Ｒ＞超、２．０＜Ｒ＞超、２．１＜Ｒ＞超、２．２＜Ｒ＞超、２．３＜Ｒ＞超、２．４＜Ｒ＞超、２．５＜Ｒ＞超、または３．０＜Ｒ＞超である場合、伸長状態である。特定の実施形態では、ナノレポーターまたはその一部分は、Ｒが２．０＜Ｒ＞超である場合、伸長状態である。
５．１２．４ ナノレポーターの配向
本発明に係る特定の方法では、ナノレポーターは配向状態である。一般的には、いずれのナノレポーターも、そうであることが当業者により確認されれば、配向状態である。
特定の実施形態では、ナノレポーターは、ナノレポーターの配向に好適な条件下でナノレポーターを配向させうる力の場の中に存在する場合、配向状態である。そのような力および条件は、当業者には自明であろう。
特定の実施形態において、力は電磁力である。たとえば、ナノレポーターがポリヌクレオチドのように荷電されている場合、ナノレポーターは、電場または磁場の中で配向可能である。場は、当業者の判断に基づいてナノレポーターを配向させるのに十分な程度に強力であることが望ましい。電場または磁場の中でナノレポーターを配向させる代表的な技術は、以上に記載されている。
特定の実施形態では、力は流体力である。たとえば、ポリサッカリド、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドを含む多くのナノレポーターは、移動流体場の中で配向可能である。流体力は、当業者の判断に基づいてナノレポーターを配向させるのに十分な程度に強力であることが望ましい。流体力場の中でナノレポーターを配向させる代表的な技術は、以上に記載されている。
特定の実施形態では、力は重力である。有利な実施形態では、重力をたとえば流体力と組み合わせてナノレポーターを配向させることが可能である。特定の実施形態では、力は、当業者の判断に基づいてナノレポーターを配向させるのに十分な程度に強力であることが望ましい。重力を用いてナノレポーターを配向させる代表的な技術は、以上に記載されている。
特定の実施形態では、ナノレポーターは、当業者に自明な以上の力の組合せにより配向可能である。以下の例では、ナノレポーターは、電場と流体力との組合せにより配向される。
ナノレポーターは、ナノレポーターの配向の標準的基準に従って配向されたことが当業者により確認された場合、配向されている。当業者であればわかることであるが、特定の実施形態では、ナノレポーターは、ナノレポーターを配向させうる力の場と平行に配置された場合、配向されている。当業者であればわかることであるが、特定の実施形態では、ナノレポーターは、複数のナノレポーターのうちの１つが平行に配置された場合、配向されている。当業者であればわかることであるが、たとえば、複数のナノレポーターは、ナノレポーターの第１の末端から第２の末端へのベクトルがその複数の中の他のナノレポーターの対応する末端間のベクトルと平行である場合、配向されているといえる。
５．１２．５ ナノレポーターの第２の部分の選択的固定
以上で述べたように、本発明に係る方法では、ナノレポーターの第２の部分は選択的に固定される。ナノレポーターの第２の部分は、ナノレポーターの第１の部分と同一でないナノレポーターの任意の部分でありうる。いくつかの実施形態では、ナノレポーターの第２の部分は、ナノレポーターの第１の部分のいかなる一部分ともオーバーラップしない。
特定の実施形態では、本発明は、ナノレポーターが伸長状態または配向状態にあるときにかつナノレポーターの第１の部分が固定されているときに、ナノレポーターの第２の部分を選択的に固定する一工程を含む方法を提供する。ナノレポーターの第１の部分の固定およびナノレポーターの伸長または配向を行う代表的な方法は、以上の節に詳細に記載されている。
特定の実施形態では、本発明は、ナノレポーターの第１の部分が固定されているときにナノレポーターを伸長させる工程と、ナノレポーターが伸長状態であるときにナノレポーターの第２の部分を選択的に固定する工程と、を含む方法を提供する。ナノレポーターの第１の部分の固定およびナノレポーターの伸長を行う代表的な方法は、以上の節に詳細に記載されている。
特定の実施形態では、本発明は、ナノレポーターの第１の部分を固定する工程と、第１の部分が固定されているときにナノレポーターを伸長させる工程と、ナノレポーターが伸長状態であるときにナノレポーターの第２の部分を選択的に固定する工程と、を含む方法を提供する。ナノレポーターの第１の部分の固定およびナノレポーターの伸長を行う代表的な方法は、以上に詳細に記載されている。
特定の実施形態では、本発明は、ナノレポーターの第１の部分が固定されているときにナノレポーターを配向させる工程と、ナノレポーターが配向状態であるときにナノレポーターの第２の部分を選択的に固定する工程と、を含む方法を提供する。ナノレポーターの第１の部分の固定およびナノレポーターの配向を行う代表的な方法は、以上の節に詳細に記載されている。
特定の実施形態では、本発明は、ナノレポーターの第１の部分を固定する工程と、第１の部分が固定されているときにナノレポーターを配向させる工程と、ナノレポーターが配向状態であるときにナノレポーターの第２の部分を選択的に固定する工程と、を含む方法を提供する。ナノレポーターの第１の部分の固定およびナノレポーターの配向を行う代表的な方法は、以上に詳細に記載されている。
ナノレポーターの第２の部分の選択的固定は、ナノレポーターを選択的に固定するための当業者に自明な任意の技術に従いうる。注目すべき点として、本発明に係る有利な実施形態では、ナノレポーターの第２の部分は、非選択的に固定されない。選択的固定では、完全に伸長した状態またはほぼ完全に伸長した状態であるときにナノレポーターを固定することが可能である。また、選択的固定では、ナノレポーターを配向させて固定することが可能である。言い換えれば、ナノレポーターの伸長に用いられる１つもしくは複数の場の方向に沿って場の中で第１の部分が第２の部分に先行するように、ナノレポーターの第１の部分および第２の部分を固定することが可能である。複数のナノレポーターを固定する場合、場に沿って均一に配向させることが可能である。
ナノレポーターの第２の部分は、ナノレポーター中の任意の位置に存在しうる。特定の実施形態では、第２の部分はナノレポーターの末端に存在する。特定の実施形態では、第２の部分はナノレポーターの末端に存在しない。特定の実施形態では、以上の節に記載の第１の部分は、ナノレポーターの一方の末端に存在し、第２の部分は、ナノレポーターの他方の末端に存在する。
以上で述べたように、ナノレポーターの第２の部分は、選択的に固定される。固定は、当業者に自明な基材との任意の選択的相互作用によるものでありうる。固定は、静電的相互作用もしくはイオン性相互作用を介するか、１つ以上の共有結合を介するか、１つ以上の非共有結合を介するか、またはそれらの組合せを介するものでありうる。特定の実施形態では、固定は、電極との静電的相互作用を介するものでありうる。さらなる実施形態では、固定は、電極以外の基材との静電的相互作用を介するものである。
ナノレポーターの第１の部分および第２の部分を同一の基材に選択的に固定する場合、選択的固定の技術は、もちろん、基材に適合するものでなければならない。特定の実施形態では、固定の技術は同一である。たとえば、アビジンで被覆された基材上で、ビオチン−アビジン相互作用を介してナノレポーターの第１および第２の部分の両方を選択的に固定することが可能である。しかしながら、当業者には自明であろうが、同一の基材上に固定する場合、第１および第２の部分の両方に同一の相互作用を使用する必要はない。たとえば、基材は、選択的結合の可能な複数の部分を含みうるか、または第１の部分は、非選択的にもしくは当業者に自明な他の技術で固定されうる。
特定の実施形態では、ナノレポーターの第２の部分は、結合ペアの第１のメンバーを含む。結合ペアの第２のメンバーは、ナノレポーターの第２の部分に共有結合で結合されうるか、または非共有結合で結合されうる。有用な共有結合および非共有結合は、当業者に自明であろう。有用な実施形態では、ナノレポーターの第２の部分が結合される基材は、結合ペアの第２のメンバーを含むであろう。基材は、第２のメンバーに共有結合で結合されうるか、または非共有結合で結合されうる。
特定の実施形態では、ナノレポーターの第２の部分は、基材上の結合ペアのメンバーと結合して１つ以上の非共有結合を形成しうる結合ペアのメンバーを含みうる。代表的な有用な基材としては、リガンド、抗原、炭水化物、核酸、レセプター、レクチン、および抗体、たとえば、以上の節に記載のものよりなる群から選択される結合部分を含むものが挙げられる。
有利な実施形態では、ナノレポーターの第２の部分は、アビジン−ビオチン結合ペアを介して基材に固定可能である。特定の実施形態では、ナノレポーターは、その第１の部分にビオチン部分を含みうる。たとえば、ポリヌクレオチドナノレポーターは、ビオチン化ヌクレオチド残基を含みうる。同様に、ポリペプチドナノレポーターは、ビオチン化アミノ酸残基を含みうる。アビジンを含む有用な基材は、以上の節に記載されている。
さらなる実施形態では、ナノレポーターの第２の部分はアビジンを含みうる。そして基材はビオチンを含みうる。ビオチンを含む有用な基材は、以上の節に記載されている。
さらなる実施形態では、ナノレポーターの第２の部分は、基材上の結合ペアのメンバーと反応して１つ以上の共有結合を形成しうる結合ペアのメンバーを含みうる。反応基を含む代表的な有用な基材は、以上の節に記載されている。
特定の実施形態では、ナノレポーターの第２の部分は、光活性化により基材に結合されうる反応部分を含みうる。基材は光反応部分を含みうるか、またはナノレポーターの第２の部分は光反応部分を含みうる。光反応部分のいくつかの例としては、アリールアジド、たとえば、Ｎ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリチルアミド；フッ素化アリールアジド、たとえば、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸；ベンゾフェノン系試薬、たとえば、４−ベンゾイル安息香酸のスクシンイミジルエステル；および５−ブロモ−デオキシウリジンが挙げられる。
さらなる実施形態では、ナノレポーターの第２の部分は、以上の節に記載の他の結合ペアを介して基材に固定可能である。
さらなる実施形態では、ナノレポーターの第２の部分は、１つ以上の他の分子との複合体を形成可能であり、さらに、該分子は、基材の結合部分を共有結合または非共有結合で結合可能である。たとえば、ナノレポーターの第２の部分は、基材のアビジン部分などに選択的に結合しうるビオチン部分などを含む他の分子に選択的に結合しる能力を有しうる。図１２Ｂは、Ｆ３を含む第２の分子に選択的に結合しうるナノレポーターを示している。さらに、Ｆ３は基材上の部分に選択的に結合しうる。ナノレポーターの第２の部分とＦ３を含む分子との相互作用は、たとえば、抗原−抗体相互作用により媒介されるものでありうる。
図１４Ａおよび１４Ｂは、本発明に係る方法に基づくナノレポーターの選択的固定を示している。図１４Ａでは、ナノレポーターの第１の部分は、示される基材Ｓ上の部分に選択的に結合しうる結合部分Ｆ１を含む。結合部分Ｆ１は、たとえば、ビオチンでありうる。そして基材Ｓは、たとえば、アビジンで被覆されうる。図１４Ａのナノレポーターは、以上の節に記載の力により伸長される。図１４Ｂでは、力は電位である。伸長時、ナノレポーターは、示される基材Ｓ上の部分に選択的に結合しうる結合部分Ｆ２を含む分子に接触される。結合部分Ｆ２は、たとえば、ビオチンでありうる。そして基材Ｓは、たとえば、アビジンで被覆されうる。注目すべき点として、Ｆ２を含む３個までの分子は、ナノレポーターの第２の部分に選択的に結合してそれをその伸長状態で選択的に固定しうる。示されるように、分子は、ナノレポーターの反復結合部分に選択的に結合する第２の結合部分を含む。結合部分は、たとえば、図１４Ｂに示されるように相補的核酸配列でありうる。得られるナノレポーターは、伸長状態で選択的に固定され、力が除去されたときでさえも伸長状態を保持するはずである。選択的に固定された伸長型ナノレポーターは、当業者に自明な任意の目的に使用可能である。
５．１２．６ 伸長または配向されたナノレポーターの２つの部分の固定
特定の実施形態では、本発明は、伸長状態または配向状態のナノレポーターの第１の部分および第２の部分を選択的に固定する方法を提供する。注目すべき点として、本発明に係る方法によれば、ナノレポーターは、ナノレポーターを伸長または配向させうる力の適用前に固定する必要はない。
こうした方法では、ナノレポーターは、ナノレポーターを伸長または配向させうる力により伸長もしくは配向またはその両方が行われる。そのような力は、以上の節に詳細に記載されている。特定の実施形態では、力は、ある位置にナノレポーターを保持しながらナノレポーターを伸長または配向させうる力、すなわち、ナノレポーターを実質的に移動させることなく伸長または配向させうる力である。代表的な力としては、振動電磁場および振動流体力場が挙げられる。特定の実施形態では、力は振動電場である。振動電場の中でナノレポーターを伸長または配向させる代表的な技術は、Asbury et al., 2002, Electrophoresis 23(16):2658-66; Kabata et al., 1993, Science 262(5139):1561-3; and Asbury and van den Engh, 1998, Biophys J. 74:1024-30（それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）に記載されている。
本方法では、ナノレポーターは、伸長時または配向時に第１の部分および第２の部分で固定される。第１の部分および第２の部分は、両方とも非選択的に固定されうるか、両方とも選択的に固定されうるか、または一方は選択的に他方は非選択的に固定されうる。第１の部分および第２の部分を固定する技術は、以上の節に詳細に記載されている。
５．１２．７ 固定用基材
本発明に係る方法では、固定用基材は、ナノレポーターに選択的に結合しうる当業者に自明な任意の基材でありうる。さらに、特定の態様では、本発明は、伸長状態で選択的に固定されたナノレポーターを含む組成物を提供する。組成物は、本明細書に記載されるように伸長状態でナノレポーターを固定してなる基材を含む。ナノレポーターは、もちろん、本発明に係る方法に従って固定可能である。
基材に課される唯一の要件は、以上に記載のナノレポーターの第２の部分に選択的に結合しうることである。したがって、基材は、フィルターもしくは膜、たとえば、ニトロセルロースもしくはナイロン、ガラス、ポリマー、たとえば、ポリアクリルアミド、ゲル、たとえば、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリスチレン、ラテックス、またはキャプチャー化合物を固定しうる当業者に公知の任意の他の物質でありうる。基材は、多孔性材料、たとえば、アクリル、スチレンメチルメタクリレートコポリマー、およびエチレン／アクリル酸で構成されうる。
基材は、任意の形態をとりうるが、ただし、その形態は、ナノレポーターの第２の部分の選択的固定を妨害しないものでなければならない。たとえば、基材は、ディスク、スラブ、ストリップ、ビーズ、サブミクロン粒子、被覆磁気ビーズ、ゲルパッド、マイクロタイターウェル、スライド、膜、フリットの形態、または当業者に公知の他の形態を有しうる。基材は、場合により、基材上におけるまたはそれを貫通する液体の流動に役立つハウジング、たとえば、クロマトグラフィーカラム、スピンカラム、シリンジバレル、ピペット、ピペットチップ、９６もしくは３８４ウェルプレート、またはミクロチャネル、キャピラリーなどの中に配設される。
ナノレポーターは、単一の基材上または複数の基材上に固定可能である。たとえば、当業者であればわかることであるが、特定の実施形態では、ナノレポーターの第１および第２の部分は同一の基材上に固定される。特定の実施形態では、ナノレポーターの第１の部分は、第１の基材上に固定可能であり、一方、ナノレポーターの第２の部分は、第１のものとは異なる第２の基材上に固定可能である。
基材は、当業者に自明な任意の方法に従って作製可能である。十分な密度の反応基で本発明に係る代表的な基材を活性化するのに使用しうる膨大な数の技術のレビューに関しては、the Wiley Encyclopedia of Packaging Technology, 2d Ed., Brody & Marsh, Ed., ”Surface Treatment,” pp. 867 874, John Wiley & Sons (1997)およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。酸化ケイ素基材上にアミノ基を生成するのに好適な化学的方法は、Atkinson & Smith, ”Solid Phase Synthesis of Oligodeoxyribonucleotides by the Phosphite Triester Method,” In: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, M J Gait, Ed., 1984, IRL Press, Oxford, particularly at pp. 45 49（およびそこに引用されている参考文献）に記載されており；酸化ケイ素基材上にヒドロキシル基を生成するのに好適な化学的方法は、Pease et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022 5026（およびそこに引用されている参考文献）に記載されており；ポリマー、たとえば、ポリスチレン、ポリアミド、およびグラフト型ポリスチレン上に官能基を生成する化学的方法は、Lloyd Williams et al., 1997, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Chapter 2, CRC Press, Boca Raton, FL（およびそこに引用されている参考文献）に記載されている。
代表的な有用な基材としては、ストレプトアビジン、たとえば、Ａｃｃｅｌｒ８ ＴＢ０２００で被覆された表面が挙げられる。さらなる有用な基材としては、アミンを含むナノレポーターの部分と反応しうるＮ−ヒドロキシスクシンアミドで被覆された表面が挙げられる。そのような表面の１つは、ＯｐｔＡｒｒａｙ−ＤＮＡ（Accelr8）である。そのほかの有用な表面は、アルデヒドで被覆されたもの（たとえば、Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ Ｓｌｉｄｅ ＡＬ， Schott）およびエポキシで被覆された表面（たとえば、Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ Ｓｌｉｄｅ Ｅ， Schott）である。他の有用な表面は、アビジンまたはストレプトアビジンを含むナノレポーターの部分を選択的に固定するのに有用なビオチン化ＢＳＡ被覆表面である。
５．１２．８ 選択的に固定された伸長型もしくは配向型のナノレポーターの使用方法
特定の実施形態では、選択的に固定された引き伸ばされたナノレポーターは、分離および標識の逐次的検出を目的として巨大分子バーコードを生成すべく使用可能である。分子に沿って離間して配置されたこれらの標識は、ナノレポーターが伸長および固定されたときに読取り可能なユニークなコードを提供する。伸長および選択的固定は、巨大分子バーコードの解読を容易にしうる。
選択的に固定された引き伸ばされたナノレポーターはさらに、ナノレポーターの検出または画像化が有用でありうる任意の状況で使用可能である。それは、診断、予後判定、治療、およびスクリーニングの目的に使用可能である。たとえば、それは、疾患細胞タイプがサンプル中に存在するかを調べるためにおよび／または疾患の病期を判定するために、患者から取得されるかまたは患者に由来する生体分子サンプルの分析に適用可能である。それは、サンプル中の細菌またはウイルスのマーカーの存在および／または量をそれぞれ測定することにより、病原体の感染、たとえば、細胞内細菌およびウイルスによる感染を診断するために使用可能である。本発明に係る組成物および方法は、存在量が生物学的状態または疾患症状の指標となる標的分子、たとえば、疾患状態の結果としてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる血液マーカーを定量するために使用可能である。そのほかに、本発明に係る組成物および方法は、患者の治療コースの決定に役立つ予後情報を提供するために使用可能である。
５．１２．９ 選択的に固定された伸長型または配向型のナノレポーターを含むキット
本発明はさらに、本発明に係る１つ以上の成分を含むキットを提供する。キットは、たとえば、本発明に係る基材と、基材上に選択的に固定された１つ以上の伸長型もしくは配向型またはその両方のナノレポーターと、を含みうる。キットは、以上に記載のものをはじめとする当業者に自明な任意の目的に使用可能である。
特定の実施形態では、本発明はまた、ナノレポーターの伸長および選択的固定に有用なキットを提供する。キットは、固定用基材と、ナノレポーターの伸長または固定を容易にする１つ以上の結合パートナーと、を含みうる。結合パートナーは、特定の実施形態では、適切な力でナノレポーターを伸長させるのに有用な部分を含む。特定の実施形態では、結合パートナーは、表面へのナノレポーターの固定または選択的固定を容易にしうる。さらなる実施形態では、キットは、伸長および固定に供されるナノレポーターを含みうる。さらなる実施形態では、キットは、ナノレポーターを伸長させうるデバイスを含みうる。
５．１３ ナノレポーターの検出
ナノレポーターは、所与のナノレポーター上の特定のシグナルを検出しうる当技術分野で利用可能な任意の手段により検出される。ナノレポーターが蛍光標識される場合、適切な励起光源の好適な要件が検討されうる。可能な光源としては、アークランプ、キセノンランプ、レーザー、発光ダイオード、またはいくつかのそれらの組合せが挙げられうるが、これらに限定されるものではない。適切な励起光源は、適切な光学検出システム、たとえば、倒立型蛍光顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、または共焦点顕微鏡と組み合わせて使用される。好ましくは、ナノレポーター上の一連のスポットを測定するのに十分な空間解像度で検出を行いうる顕微鏡が使用される。
５．１３．１ 顕微鏡および対物レンズの選択
顕微鏡の対物レンズに関する主要な要件は、光学解像度を有することであり、この光学解像度は、その開口数（ＮＡ）によって決まる。一般的には、ＮＡが大きいほど、光学解像度は良好である。所要のＮＡは、好ましくは、δ＝０．６１λ／ＮＡ（δ＝光学解像度およびλ＝波長）の関係式に基づいて少なくとも１．０７である。対象レンズにより集光される光量は、ＮＡ４／Ｍａｇ２（Ｍａｇ＝対象レンズの倍率）により決定される。したがって、できるかぎり多くの光を集光するために、高いＮＡおよび低い倍率を有する対物レンズを選択すべきである。
５．１３．２ ＣＣＤカメラの選択および画像キャプチャー技術
ＣＣＤカメラを選択する場合、第１の要件は、画像化システムの最終解像度を部分的に決定するピクセルサイズである。最適には、光学解像度は、ＣＣＤカメラにより損なわれないようにすべきである。たとえば、光学解像度が２１０〜３００ｎｍ（６０倍にした後のＣＣＤチップ上の１２．６〜１８μｍに対応する）である場合、解像および光学解像度の保持のために、サンプルの各スポットに対して少なくとも２つのピクセルが存在するようにすべきである。すなわち、ＣＣＤチップのピクセルサイズは、多くとも６．３〜９μｍにすべきである。
第２の要件は、ピクセルサイズ、量子効率、読取りノイズ、およびダークノイズ（ただし、これらに限定されるものではない）をはじめとする多くの因子により決定されうる検出感度である。高感度を達成するために、大きいピクセルサイズ（これは大きい集光面積を与えうる）、高い量子効率、および低いノイズを有する品質のカメラを選択する。これらの基準を満たす代表的なカメラはHamamatsu Inc.製のＯｒｃａ−Ａｇカメラである。チップサイズは、１３４４×１０２４ピクセルであり、６０倍の対物レンズを用いた場合、視野は１４４×１１０ｕｍ２である。
５．１４ コンピューターシステム
本発明は、ナノレポーター画像の収集、ナノレポーターの同定、および／またはナノレポーターコードの解読をコンピューター化するために使用可能なコンピューターシステムを提供する。特定的には、本発明は、プロセッサーと、プロセッサーに結合されかつ１つ以上のプログラムをコード化するメモリーと、を含む種々のコンピューターシステムを提供する。ナノレポーターの画像化に利用される顕微鏡にコンピューターシステムを接続することにより、ナノレポーターの画像化、同定、および解読、ならびにナノレポーター画像および関連情報の記憶を単一の装置で行うことが可能である。メモリーによりコード化された１つ以上のプログラムにより、プロセッサーは本発明に係る方法を実行する。
さらに他の実施形態では、本発明は、プロセッサーとプロセッサーに接続されたメモリーとを有するコンピューターシステム（たとえば、以上に記載の本発明に係るコンピューターシステムの１つ）と組み合わせて使用されるコンピュータープログラム製品を提供する。本発明に係るコンピュータープログラム製品は、コンピュータープログラム機構をコード化してまたは埋め込んで有するコンピューター可読記憶媒体を含む。コンピュータープログラム機構をコンピューターのメモリーにロードして、プロセッサーにより本発明に係る方法の工程を実行することが可能である。
以上の項に記載の方法は、好ましくは、以下のコンピューターシステムを用いてかつ以下の方法に従って実行可能である。本発明に係る方法の実行に好適な代表的なコンピューターシステムは、外部コンポーネントに接続された内部コンポーネントを含む。このコンピューターシステムの内部コンポーネントは、メインメモリーに相互接続されたプロセッサー素子を含む。たとえば、コンピューターシステムは、２００ＭＨｚ以上のクロック速度を有しかつ３２ＭＢ以上のメインメモリーを備えたＩｎｔｅｌ Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）搭載プロセッサーでありうる。
外部コンポーネントとしては、大容量記憶装置が挙げられる。この大容量記憶装置は、典型的にはプロセッサーおよびメモリーと一緒にパッケージ化された１つ以上のハードディスクでありうる。そのようなハードディスクは、典型的には１ＧＢ以上の記憶容量である。他の外部コンポーネントとしては、「マウス」または他の図形入力デバイスでありうるポインティングデバイスと一緒になったモニターおよびキーボードでありうるユーザーインターフェースデバイスが挙げられる（図示されていない）。典型的には、コンピューターシステムはまた、他のローカルコンピューターシステム、リモートコンピュータシステムへのイーサーネット接続の一部でありうるネットワーク接続、またはインターネットのような広域通信ネットワークに接続される。このネットワーク接続により、コンピューターシステムは、他のコンピューターシステムとデータおよび処理タスクを共有することが可能である。
このシステムの動作時にメモリーにロードされるのは、当技術分野で標準的なものおよび本発明に特有なものの両方のいくつかのソフトウェアコンポーネントである。これらのソフトウェアコンポーネントは全体として、コンピューターシステムを本発明に係る方法に従って機能させる。ソフトウェアコンポーネントは、典型的には大容量記憶装置に記憶される。第１のソフトウェアコンポーネントは、コンピューターシステムおよびそのネットワーク相互接続の管理の役割を担うオペレーティングシステムである。このオペレーティングシステムは、たとえば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９５、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００、もしくはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＸＰのようなＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ファミリーのオペレーティングシステム、または他の選択肢としてＭａｃｉｎｔｏｓｈオペレーティングシステム、Ｌｉｎｕｘオペレーティングシステム、もしくはＵｎｉｘ（登録商標）オペレーティングシステムでありうる。第２のソフトウェアコンポーネントとしては、本発明に特有な方法を実行するプログラムを支援するためにシステム中に便宜上存在する共通の言語および機能が挙げられうる。本発明に係る分析方法をプログラムするのに使用可能な言語としては、たとえば、Ｃ、Ｃ＋＋、ＪＡＶＡ（登録商標）、およびそれほど好ましくないがＦＯＲＴＲＡＮ、ＰＡＳＣＡＬ、およびＢＡＳＩＣが挙げられる。本発明に係る他のソフトウェアコンポーネントは、手続き型言語または記号パッケージでプログラムされている本発明に係る分析方法を含む。
代表的な実行形態では、本発明に係る方法を実施するために、ナノレポーターコード（すなわち、ナノレポーター上のスポットの順序および性質とそのようなナノレポーターが結合する標的分子の同一性との相関）が最初にコンピューターシステムにロードされる。次に、使用者は、所与のナノレポーターコードを有するナノレポーターの存在および場合により量を決定する工程を実施する分析ソフトウェアの実行を行う。
本発明に係る分析システムはまた、ソフトウェアコンポーネントがコンピューターシステムのメモリーにロードされるように、１つ以上の以上に記載のソフトウェアコンポーネントを内蔵するコンピュータープログラム製品を含む。特定的には、本発明に係るコンピュータープログラム製品は、１つ以上のコンピュータープログラム機構をコンピューター可読形式でコード化してまたは埋め込んで有するコンピューター可読記憶媒体を含む。コード化されたコンピュータープログラム機構、たとえば、以上に記載の分析ソフトウェアコンポーネントのうちの１つ以上をコンピューターシステムのメモリーにロードして、コンピューターシステムのプロセッサーにより本発明に係る分析方法を実行することが可能である。
コンピュータープログラム機構または機構は、好ましくは、コンピューター可読記憶媒体上に記憶またはコード化される。代表的なコンピューター可読記憶媒体は、以上に論述されており、次のものを包含するが、これらに限定されるものではない：ハードドライブ（これは、たとえば、本発明に係るコンピューターシステムの外部もしくは内部ハードドライブまたはリムーバブルハードドライブでありうる）；フロッピー（登録商標）ディスク；ＣＤ−ＲＯＭ；またはテープ、たとえば、ＤＡＴテープ。本発明に係るコンピュータープログラム機構に使用しうる他のコンピューター可読記憶媒体もまた、当業者に自明であろう。
本発明はまた、本発明に係る方法を実施するのに有用なデータベースを提供する。データベースは、多種多様な標的分子に対する参照ナノレポーターコードを含みうる。好ましくは、そのようなデータベースは、コンピューターシステムにロード可能な電子形式であろう。そのような電子形式としては、本発明に係る方法を実行するために使用されるコンピューターシステムのメインメモリーにロードされたデータベース、またはネットワーク接続により接続された他のコンピューターのメインメモリー中のデータベース、または大容量記憶媒体上に埋め込まれたもしくはコード化されたデータベース、またはＣＤ−ＲＯＭやフロッピー（登録商標）ディスクのようなリムーバブル記憶媒体上のデータベースが挙げられる。
本発明に係る方法を実行するための他の選択肢のシステムおよび方法は、特許請求の範囲内に包含されるものとする。特定的には、特許請求の範囲は、本発明に係る方法を実行するための他の選択肢のプログラム構造を包含するものとする。こうしたプログラム構造は、当業者には自明であろう。
５．１５ ナノレポーター技術の適用
本発明に係る組成物および方法は、診断、予後判定、治療、およびスクリーニングの目的に使用可能である。本発明は、本発明に係る方法を用いて単一の生体分子サンプルから多くの異なる標的分子を一度に分析できるという利点を提供する。これにより、たとえば、いくつかの診断試験を１つのサンプルで実施することが可能である。
５．１５．１ 診断方法／予後判定方法
本方法は、疾患細胞タイプがサンプル中に存在するかを調べるためにおよび／または疾患の病期を判定するために、患者から取得されるかまたは患者に由来する生体分子サンプルの分析に適用可能である。
たとえば、本明細書に記載の方法のいずれかに従って血液サンプルをアッセイすることにより、サンプル中の癌細胞タイプのマーカーの存在および／または量を決定して、癌の診断または病期判定を行うことが可能である。
他の選択肢として、本明細書に記載の方法は、サンプル中の細菌またはウイルスのマーカーの存在および／または量をそれぞれ測定することにより、病原体の感染、たとえば、細胞内細菌およびウイルスによる感染を診断するために使用可能である。
したがって、本発明に係る組成物および方法を使用して検出される標的分子は、患者マーカー（たとえば癌マーカー）または外来因子による感染のマーカー、たとえば、細菌マーカーもしくはウイルスマーカーでありうる。
ナノレポーターに定量的性質があるので、本発明に係る組成物および方法は、存在量が生物学的状態または疾患症状の指標となる標的分子、たとえば、疾患状態の結果としてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる血液マーカーを定量するために使用可能である。
そのほかに、本発明に係る組成物および方法は、患者の治療コースの決定に役立つ予後情報を提供するために使用可能である。たとえば、患者に由来する少量サンプルからでも腫瘍の特定のマーカーの量を正確に定量することが可能である。乳癌のような特定の疾患の場合、Ｈｅｒ２−ｎｅｕのような特定の遺伝子の過剰発現は、より積極的な治療コースが必要とされることを示唆する。
５．１５．２ 病理サンプルの分析
ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドで固定されたパラフィン包埋組織サンプルから抽出されるＲＮＡは、典型的には、質が悪く（断片化）、収量が少ない。このため、組織学的サンプルまたは長期保存病理組織で低発現遺伝子の遺伝子発現解析を行うことはきわめて困難であり、多くの場合、完全に実行不可能である。ナノレポーター技術は、ごく少量の低品質の全ＲＮＡの分析を可能にすることにより、この満たされないニーズを満たすことが可能である。
そのような用途でナノレポーター技術を使用するために、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ambion）のような市販品として入手可能なキットを用いて製造業者のプロトコルに従って、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドで固定されたパラフィン包埋組織サンプル（または類似物）から全ＲＮＡを抽出することが可能である。そのようなサンプル中のＲＮＡは、多くの場合、小さい断片（２００〜５００ヌクレオチドの長さ）に分解され、多くのパラフィン包埋組織学的サンプルでは、数十ナノグラムの全ＲＮＡが得られるにすぎない。少量（５〜１００ｎｇ）のこの断片化全ＲＮＡは、本明細書に記載のアッセイ条件に基づいてナノレポーターハイブリダイゼーションにおける標的物質として直接的に使用可能である。以下の第１１節の実施例６に記載されるように、約３．３ｎｇの細胞ＲＮＡのナノレポーター分析により、約０．５コピー／細胞で存在する転写産物の検出が可能である。
５．１５．３ スクリーニング方法
本発明に係る方法を用いて、とくに、種々の標的分子に及ぼす攪乱因子（たとえば、化学化合物、突然変異、温度変化、成長ホルモン、増殖因子、疾患、または培養条件変化）の影響を調べることが可能であり、これにより、存在、不在、またはレベルが特定の生物学的状態の指標となる標的分子を同定することが可能である。好ましい実施形態では、本発明は、疾患状態の要素および経路の解明および探索のために使用される。たとえば、疾患組織中に存在する標的分子の量を「正常」組織のものと比較することにより、疾患に関与する重要な標的分子を解明することが可能であり、それにより、疾患の治療に使用可能な新しい薬剤候補物質の探索／スクリーニングのための標的を同定することが可能である。
５．１６ キット
本発明はさらに、本発明に係る１つ以上の成分を含むキットを提供する。キットは、標識済みナノレポーターを含みうるか、またはナノレポーターを標識するための１つ以上の成分と共に非標識化ナノレポーターを含みうる。さらに、キット中に提供されるナノレポーターは、あらかじめ結合された標的特異的配列を有していてもよいし有していなくてもよい。一実施形態では、ナノレポータースカフォールドに結合されていない状態で標的配列がキット中に提供される。
キットは、同様に、他の試薬、たとえば、ハイブリダイゼーション反応を実施するための緩衝液、リンカー、制限エンドヌクレアーゼ、およびＤＮＡリガーゼを含みうる。
キットはまた、キットの要素を使用するためのならびに／または標識化ナノレポーターを作製および／もしくは使用するための使用説明書を含むであろう。
６． 実施例１：ナノレポーターの作製およびプロトコル
ここでは、種々の成分からナノレポーターを構築する方法の工程別の例を示す。
当然のことながら、他の成分と同時に、その前に、またはその後に、種々の成分を構築または添加することが可能である。たとえば、スカフォールドへのパッチユニットまたはフラップのアニーリングは、同時にまたは逐次的に実施可能である。
この実施例では、出発原料は、環状Ｍ１３ｍｐ１８ウイルスベクターである。線状一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８を用いて、パッチユニットをそれにアニールし、二本鎖スカフォールドを形成する。次に、フラップを付加し、その後、標的特異的配列をライゲートする。一方、精製工程は、過剰の未結合のパッチユニットおよびフラップを除去するのに役立つ。ナノレポーターに結合する標識化核酸（パッチおよび／またはフラップおよび／または他の標識化オリゴヌクレオチド）の構築についても記述する。
標的分子への結合（たとえば、ハイブリダイゼーションを介して）の後、ナノレポーターを表面に結合させ、伸長させる。最後に、ナノレポーターをカメラにより画像化する。
ナノレポーターを作製し、実質的にこの実施例に記載の方法を用いて標的分子を検出するために利用し、好結果を得た。そのようなこの方法を用いて標的を検出する例を図４に示す。
６．１ スカフォールドの構築
選択されたオリゴヌクレオチドスカフォールド配列をＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）ソフトウェアを用いて分析した。第１に、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから商品として購入した環状Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを線状化することにより、一本鎖核酸を作製した。環状Ｍ１３ｍｐ１８をＢａｍＨ１酵素で消化し、それを線状化した。使用した材料は、Ｍ１３ｍｐ１８ベクター（２５０ｎｇ／μｌ）、パッチ＿１Ｌ＿ＢａｍＨ１．０２（１００μＭストック液の１０μＭ希釈液）、１０×ＢａｍＨ１緩衝液、ＢａｍＨ１酵素で構成された。全量０．８ｐｍｏｌの線状Ｍ１３ｍｐ１８を作製するためのプロトコルは、次の工程を含む。１）加熱ブロックを３７℃に予備加熱する；２）０．６５ｍｌエッペンドルフチューブ中で、４０μｌの２５０ｎｇ／μｌ Ｍ１３ｍｐ１８ベクター、２μｌの１０μＭ パッチ＿１Ｌ＿ＢａｍＨ１．０２、および５μｌの１０×ＢａｍＨ１緩衝液を混合する；３）上端をフォイルで覆ってエッペンドルフチューブを３７℃の加熱ブロック中に配置する。チューブを３７℃で１５分間インキュベートしてパッチユニットをＭ１３ｍｐ１８スカフォールドにハイブリダイズさせる；４）１５分後、２μｌのＢａｍＨ１酵素を添加し、反応系を３７℃で３０分間消化させ、その後、追加の２μｌのＢａｍＨ１酵素を添加して反応を継続させ、３７℃でさらに３０分間消化させる（ＢａｍＨ１酵素の最終量は８％である）；および５）１０μｌのアリコートに分けて０．６５ｍｌエッペンドルフチューブ中に導入し、フリーザー内に貯蔵する（線状Ｍ１３ｍｐ１８の最終濃度は２００ｎｇ／μｌである）。
６．２ ベースパッチプール（ＢＰＰ）のパッチユニット調製
第２に、パッチユニットをプールの形態で調製する。Ｍ１３ｍｐ１８鎖およびヒトゲノム配列に対して最適な長さおよび所望の相同性／非相同性になるように、パッチオリゴヌクレオチド配列を選択した。パッチは、６０または６５ヌクレオチド塩基のいずれかの長さの市販のオリゴヌクレオチド（Integrated DNA technologiesから購入）であった。各パッチオリゴヌクレオチドの５０ヌクレオチド塩基は、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡに相補的であり、１０ヌクレオチド塩基は、隣接するパッチに相補的であり、かつ５ヌクレオチド塩基対は、対応するフラップに相補的である。パッチ間の１０ヌクレオチド塩基マッチは、ステム構造を形成し、これにより、構造を安定化させるとともに、被覆されたスカフォールドからフラップを持ち上げるのを支援して標識化オリゴヌクレオチドの結合に一層役立つようにする。フラップに結合させるためのパッチ上の５ヌクレオチド塩基の合成結合部位は、モジュールシステムの能力の強化を可能にする。
ベースパッチプールは、９種のパッチユニットを含有し、パッチユニットはすべて、特定の文字のグループとナノレポーター上の位置とに対応する。この実施例では、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤにグループ分けされた４つの異なる蛍光色素（色）と、標識化核酸が結合しうるナノレポーター上の８つの異なる位置または領域と、が存在する。たとえば、ＢＰＰ Ａ３は、ナノレポーター上の位置３のＡパッチユニットすべて（パッチユニット１９〜２７）に対応する。
ナノレポーター位置は、以下のとおりである：
位置１：パッチユニット１〜９（ＡまたはＣ）
位置２：パッチユニット１０〜１８（ＢまたはＤ）
位置３：パッチユニット１９〜２７（ＡまたはＣ）
位置４：パッチユニット２８〜３６（ＢまたはＤ）
位置５：パッチユニット３７〜４５（ＡまたはＣ）
位置６：パッチユニット４６〜５４（ＢまたはＤ）
位置７：パッチユニット５５〜６３（ＡまたはＣ）
位置８：パッチユニット６４〜７２（ＢまたはＤ）
材料：互いにあらかじめアニールされた右パッチおよび左パッチ（各オリゴヌクレオチドは１０μＭの濃度である）。１００ｐｍｏｌのＢＰＰ １を作製するための材料：（位置１でパッチ座標１ＬがＢａｍＨ１消化のために使用されるが、このパッチはＢＰＰ １に含まれない）：１０μｌのそれぞれあらかじめアニールされたパッチユニット（各１０μＭ）（座標２〜９）、５μｌの［２０μＭ］パッチ＿１Ｒ（ＡまたはＣ）。各パッチの最終濃度は１．１８ｐｍｏｌ／μｌである。１００ｐｍｏｌのＢＰＰ ２〜８を作製するための材料：１０μｌのそれぞれあらかじめアニールされた適切なパッチユニット（各１０μＭ）。それぞれに９種のパッチユニットが添加される。すなわち、全体で９０μｌである。各パッチの最終濃度は１．１１ｐｍｏｌ／μｌである。
以下に、色素標識化核酸が結合するナノレポーター上の８つの位置または領域と共に、この実施例のために作製されたすべてのパッチユニットプールの表を示す。位置１、３、５、および７は、色素Ａまたは色素Ｃで標識された核酸に結合可能であり、位置２、４、６、および８は、色素Ｂまたは色素Ｄで標識された核酸に結合可能である。
Figure 0005537034
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６．３ 一本鎖オリゴヌクレオチドをパッチユニットとアニールして二本鎖スカフォールドを得るための材料および調製
第３に、二本鎖オリゴヌクレオチドスカフォールドを作製するために、パッチユニットを調製して一本鎖線状Ｍ１３ｍｐ１８にアニールし、鎖を被覆する。結合が非常に特異的でありかつパッチがＭ１３ｍｐ１８鎖上の不適切な座標にアニールしないように、６０および６５ヌクレオチド塩基のパッチをＭ１３ｍｐ１８にアニールするための条件は、高い塩濃度になるようにする必要がある。アニーリング工程では、各パッチユニットに全量０．５ｐｍｏｌの一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８配列を２：１〜４：１の比で添加する。フラップをアニールする前に過剰のパッチを除去する。
使用した材料は、２０×ＳＳＣ、線状Ｍ１３ｍｐ１８（０．０８ｐｍｏｌ／μｌまたは２００ｎｇ／μｌでＢａｍＨ１にて消化された）、適切なベースパッチプール（ＢＰＰ）（１．１１ｐｍｏｌ／μｌで合計８種が必要である（上記参照））、および４５℃に設定されたディジタルヒートブロックで構成された。アニーリング反応構成は次のとおりある。一般的ガイドライン：Ｍ１３ｍｐ１８分子に対して２倍の各パッチユニット、後続の精製のために追加されたあらかじめライゲートされたフラップ／パッチ（位置１または８で）、および５×ＳＳＣ。実施例（Ｆ８フックフラップを有する０．５ｐｍｏｌのスカフォールド）の反応は、次のように構成される：７．１μｌ ＢａｍＨ１で消化したＭ１３ｍｐ１８鎖（０．０７１μＭ）、最初の７つの位置：Ａ１、Ｂ２、Ａ３、Ｂ４、Ｃ５、Ｂ６、およびＡ７に対する０．９μｌのそれぞれ新しいベースパッチプール（１．１１μＭ）：
１．７μｌ Ａ１ ＢＰＰ（アニール済み、１２／１５；１．１８μＭ／各パッチ）
１．８μｌ Ｂ２ ＢＰＰ（アニール済み、１２／１５；１．１１μＭ／各パッチ）
１．８μｌ Ａ３ ＢＰＰ（アニール済み、１２／１５；１．１１μＭ／各パッチ）
１．８μｌ Ｂ４ ＢＰＰ（アニール済み、１２／１５；１．１１μＭ／各パッチ）
１．８μｌ Ｃ５ ＢＰＰ（アニール済み、１２／１５；１．１１μＭ／各パッチ）
１．８μｌ Ｂ６ ＢＰＰ（アニール済み、１２／１５；１．１１μＭ／各パッチ）
１．８μｌ Ａ７ ＢＰＰ（アニール済み、１２／１５；１．１１μＭ／各パッチ）、
２．４μｌ ＢＰＰ−Ｄ８（位置８の座標６４、６５、６６、６７、６８、６９、および７０の最初の７つのパッチユニットのプール、「Ｄ」特異性）［ただし、Ｆ８に０．８３μＭの精製用タグ（ＦＨＦ、これは、パッチ座標７１Ｌ、７１Ｒ、７２Ｌ、７２Ｒ、７３Ｌにアニールして、ビオチンリンカーとして使用するための「Ｆ」特異性を有するフルスプリットフラップ／パッチユニットを位置Ｆ８に形成する）を有する］、ならびに７．３μｌ ２０×ＳＳＣ。最終反応量は、０．０２７ｐｍｏｌ／μｌで２９．３μｌになるであろう。
また、（欠失した）１Ｌパッチユニットに相補的なＭ１３中の領域にアニールさせてライゲーション時のＭ１３スカフォールドの再環状化を防止するために、抗Ｂａｍオリゴヌクレオチドを添加する。
６．４ 一本鎖Ｍ１３ＭＰ１８へのパッチユニットのアニーリングによる二本鎖スカフォールドの形成
第４の工程は、二本鎖オリゴヌクレオチドスカフォールドを作製するためにパッチユニットを一本鎖線状Ｍ１３ｍｐ１８にアニールして鎖を被覆するためのプロトコルを含み、次に工程で実施される：１）加熱ブロックを４２℃にあらかじめ加熱し、上端をフォイルで覆った小さいＰＣＲ（またはストリップ）チューブ中で以上の反応溶液を４５℃に１５分間加熱し、ヒートブロックを６５℃に変更してさらに１時間４５分間インキュベートし、そしてチューブを取り出して氷上に配置するかまたは凍結する。
６．５ ビオチンとストレプトアビジンを有する磁気ビーズとを用いるナノレポータースカフォールドの精製
第５の工程は、フラップの結合前に行われ、ここでは、Ｍ１３ｍｐ１８鎖にアニールされなかった過剰のパッチユニットを二本鎖オリゴヌクレオチドスカフォールドから分離する。スカフォールドを「フック」で固定するために、パッチユニットの相補的５ヌクレオチド塩基オーバーハングに対する５ヌクレオチド塩基相同領域を有する精製用タグをアニールする。ビオチン化オリゴヌクレオチドを「精製用タグ」にアニールし、ビオチン化オリゴヌクレオチドを用いたスカフォールドをキャプチャーするためにストレプトアビジンを有する磁気ビーズを使用する。過剰のパッチユニットを上清と共に除去する。回収のためにスカフォールドを溶融して磁気ビーズから溶液内に遊離させる。
６．６ 精製用タグへのＤ−ビオチンキャッチャーのアニーリング
Ｄ−ビオチンキャッチャーをナノレポーター上の精製用タグにアニールする（溶液中の利用可能なＤ８−フラップ位置の量に対して２倍（これはＭ１３に対して２倍）または４倍の最終量にする）：０．５ｐｍｏｌ×２５フックオリゴヌクレオチド位置（５×５）、４倍では５０ｐｍｏｌが０．５０μｌの１００ｐｍｏｌ／μｌ Ｄ−ビオチンを意味する、０．５μｌの（Ｄ、Ｅ、Ｆ）−ビオチン（１００μＭ）をサンプルに添加し、混合し、そして室温で３０分間インキュベートする。
６．７ 二本鎖スカフォールドから未結合パッチユニットを洗浄除去するための精製プロトコル
５×ＳＳＣ中、室温で、２５倍過剰のＦ−フックオリゴヌクレオチドをナノレポーターに３０分間アニールする。２００μｌのＤｙｎａＢｅａｄ ＭｙＯｎｅ ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＴＭビーズ溶液を１．５ｍｌチューブ中にピペットで添加し、マグネット上に配置し、そして上清を除去する。以上の工程のときと同様に再懸濁およびマグネットによる清澄化を行うことにより、５×ＳＳＣを用いて２回洗浄する。５×ＳＳＣ中の８０μｌのサンプル（この実施例では８０ｆモルのサンプル）を添加する。ボルテックス上に１５分間配置することにより、十分に再懸濁させる。マグネットを用いて溶液を清澄化し、後続のゲル分析のために上清を新しいチューブに移す。マグネット上にある状態で、最初に添加したのと同一の８０μｌの量でペレット上にピペットで３回添加することにより、８０μｌのＴＥでペレットを洗浄する（再懸濁させない）。洗液を除去し、分析のために新しい「洗浄」チューブ中に配置する。ＴＥ緩衝液を４５℃に昇温し、８０μｌを各ペレットに添加し、そして再懸濁させる。４５℃のヒートブロック上にチューブを１５分間配置し、ビーズが懸濁状態を保持していることを保証するためにピペッティングで一度上下に操作する。ただちに、マグネットを用いて温かいうちに生成物を清澄化し、貯蔵する。精製ナノレポーターの大部分は、４５℃で溶出されたこの生成物中に存在するはずである。
６．８ スカフォールドへのフラップのアニーリングおよびライゲーション
第６の工程は、「被覆されたスカフォールド」を作製するためにスカフォールドにアニールされるスプリットフラップオリゴヌクレオチドを含む。過剰のスプリットフラップを除去するために、後続的に磁気ビーズによる精製を行う。構造の安定性を増大させるために、Ｔ４リガーゼを用いて、被覆されたスカフォールドのライゲーションを行う。１つの蛍光色素あたりただ１つのタイプのフラップが必要とされる。フラップは、９５もしくは１００塩基のいずれかの長さであり、パッチに対して、標識化オリゴヌクレオチドに対して、および互いに、相補的な領域を有する。各フラップは、標識化オリゴヌクレオチドに結合させるための１５塩基の反復配列を有する。反復配列は、いかなるパリンドロームおよびヘアピン構造体をも除去すべく分析されたλ配列に基づく。
フラップをアニールするための条件は、次のとおりである。パッチに対応するフラップ上の配列は、５ヌクレオチド塩基対の長さであり、したがって、フラップは、高い塩濃度でさえもパッチに特異的にアニールする。フラップ対パッチの比は２：１である。高温における安定性を増大させるために、パッチの相互のライゲーションおよびパッチへのフラップのライゲーションを同一の反応で行うことが可能である。
１）スペクトロメーターを用いてＡ２６０ｎｍで精製スカフォールドを定量する。適正量のナノレポーターを調製するのに必要な量を計算する。この実施例では、１１０ｎｇまたは０．０２３ｐｍｏｌを使用した。Ａ２６０ｎｍの読取り値は７．７ｎｇ／μｌを示す。すなわち、１１０ｎｇの場合、１４．３μｌである。２）次のようにライゲーション反応を構成する（量は、精製およびスケールに依存して異なるであろう）。一般的には、パッチに対して１．５倍のフラップを使用し、それに従って計算する。この実施例では、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤにグループ分けされた４つの異なる蛍光色素（色）と、色素標識化核酸が結合しうるナノレポーター上の８つの異なる位置または領域と、が存在する。各色に対する位置の数（この場合は１〜４）×９×１．５モル（スカフォールド）＝使用するフラップのモル数。
配列／位置［ＡＢＡＢＣＢＡＤ］の蛍光色素を有するナノレポーターの場合：
ＡＢＡＢＣＢＡＤ＝
Ａ：４０．５×０．０２３＝０．９３ｐｍｏｌ；量：１μＭで０．９３μｌのＳＦ（スプリットフラップ）−ＡＬ、１μＭで０．９３μｌのＳＦ−ＡＲ
Ｂ：４０．５×０．０２３＝０．９３ｐｍｏｌ；量：１μＭで０．９３μｌのＳＦ−ＢＬ、１μＭで０．９３μｌのＳＦ−ＢＲ
Ｃ：１３．５×０．０２３＝０．３１ｐｍｏｌ；量：１μＭで０．３１μｌのＳＦ−ＣＬ、１μＭで０．３１μｌのＳＦ−ＣＲ
Ｄ：１３．５×０．０２３＝０．３１ｐｍｏｌ；量：１μＭで０．３１μｌのＳＦ−ＤＬ、１μＭで０．３１μｌのＳＦ−ＤＲ
ライゲーション反応（全量２５μｌ）は次のもので構成される：スプリットフラップ（以上参照；全量４．９６μｌまたは約５μｌ）、０．００１６ｐｍｏｌ／μｌで１４．３μｌのＭＯＤＢ−スカフォールド、２．５μｌ １０×Ｔ４ライゲーション緩衝液、２．２μｌ ＮａｎｏＰｕｒｅ Ｈ２Ｏ、および１μｌ Ｔ４リガーゼ。チューブを４５℃で５分間インキュベートする。３７℃水浴に移して５分間インキュベートする。１μｌ Ｔ４リガーゼをサンプルに添加する。３７℃でさらに１時間インキュベートする。ただちに凍結するかまたは７５℃で５分間加熱してＴ４リガーゼを失活させる。
６．９ ナノレポーターへの標的特異的配列のライゲーション
第７の工程は、ナノレポーターへの標的特異的配列のライゲーションを含む。ＤＮＡ標的特異的配列は、ＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）またはＤＮＡ（たとえばｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）でありうる標的分子に相補的になるようにデザインされる。標的特異的配列は、３５〜６０もしくは７０ヌクレオチド塩基の長さでありうる。被覆されたスカフォールド上の一本鎖オーバーハング領域を用いて標的特異的配列をスカフォールドにライゲートすることが可能である。単一タイプの標的特異的配列を有するスカフォールドを個別に作製し、次に、混合してライブラリーを形成することが可能である。
６．１０ ナノレポーターの構築
ナノレポーターへのオリゴヌクレオチドの付加は、ナノレポーター構築時の任意の時点で実施可能である。本発明の特定の態様では、標識化オリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチド塩基の長さである。５’末端に単一の蛍光色素が結合される。特定の蛍光色素を有するオリゴヌクレオチドは、一般的には、同一の配列を有するであろう。これらの標識化オリゴヌクレオチドは、スプリットフラップの反復配列に結合する。この実施例に最適な蛍光物質としては、Ａｌｅｘａ ４８８、ｃｙ３、Ａｌｅｘａ ５９４、およびＡｌｅｘａ ６４７が挙げられるが、これらに限定されるものではない。１５ヌクレオチド塩基の長さがあれば、互いに消光できないようにかつ可視化プロセスの条件で標識化核酸が安定であること（溶融して相補鎖から遊離されないこと）が保証されるように、蛍光物質は十分に離間して保持される。標識化オリゴヌクレオチドは、４０℃で安定である。この短い長さはまた、フラップ上への多数の蛍光色素の充填を可能にする。本発明の特定の態様では、標識化オリゴヌクレオチドは、標的サンプルの処理時に導入される。
６．１１ 標的分子へのナノレポーターの結合
当業者に公知の任意の手段を用いて、ナノレポーターを標的分子に結合させることが可能である。代表的な実施形態では、それぞれ２５０ｐｍｏｌの第１のプローブおよび第２プローブの両方を１２５ｐｍｏｌの標的と混合することにより、デュアルナノレポーターを標的分子にハイブリダイズさせる。４μｌおよび最終濃度の５×ＳＳＣ緩衝液になるように全量を調整する。カバーをかけたＰＣＲチューブ中、４２度で、この混合物を一晩インキュベートすることにより、ハイブリダイゼーションを行う。
６．１２ 表面結合
標的分子と、対応する標識化核酸、すなわち、標識モノマーに結合された核酸との両方にナノレポーターを結合させた後、標識モノマーにより放出されたシグナルの順序の解像ひいては標的分子の同定を行うために、それらを表面に結合させて伸長させる。この実施例では、特定の標的分子に対応する蛍光色素コードを空間的に解像するために、ナノレポーターを伸長させる。一端を表面（この実施例では、カバースリップ、以下の調製を参照されたい）に結合させることにより、ナノレポーターを伸長させる。２つの表面結合方法を使用しうる：Ａ）Accelr8 Corporation製のストレプトアビジン被覆スライドとビオチン化されたナノレポーターおよびＢ）ビオチン被覆スライドとストレプトアビジンを有するナノレポーター。緩衝液中でナノレポーターを活性表面に接触させ、ある時間にわたりインキュベートする。チャネルを形成するようにエッチングされたシリコンウェーハ中に成形されたＰＤＭＳ製のフローセル中で、反応を行う。緩衝液およびサンプルを挿入するために、チャネルの端でコアウェルへの金属チューブを使用する。チャネルの寸法は、幅０．５ｍｍもしくは１ｍｍおよび高さ５４μｍである。サンプルをフローセルレーンに充填してインキュベートした後、ナノレポーターは結合されているはずである。電圧を印加することによりまたは後退メニスカスで液体を除去することによりナノレポーターを伸長させ、鎖を伸長状態に保持して乾燥させることが可能である。
６．１３ 表面の調製およびデバイスの集成
結合表面（Ａｃｃｅｌｒ８ブランドのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＯｐｔｉＣｈｅｍ、被覆カバースリップ）は、スライド容器１つあたり５つの表面が含まれるユニットとして輸送され、各容器は、フォイルパウチ内でシリカ乾燥剤のパッケージに包囲されている。使用時までパウチを−２０℃で貯蔵する。
結合用の表面を調製するために、最初に、パウチをフリーザーから取り出し、数分間かけて室温に戻す。まだ開封されていない場合、次に、一方の縁に沿ってパウチをスライスしてスリットを形成し、表面の容器を取り出す。所要の表面を取り出した後、容器をその乾燥剤と共にパウチ内に戻し、一片の梱包用テープを用いてスリットを密封状態にシールし、パウチをフリーザー内に戻す。
次に、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｎａｎｏｐｕｒｅ Ｄｉａｍｏｎｄ）の流水で表面を軽く濯ぎ、清浄なスロット付きＣｏｐｌｉｎジャー内の０．２μｍ濾過済み１×ＰＢＳ中に１０分間浸漬する。浸漬後、表面をＮａｎｏｐｕｒｅ水中に浸漬し、表面の縁を横切って濾過済み窒素を吹き付けることにより乾燥させる。
使用の直前に、ＰＤＭＳ表面にセロファンテープを適用し、次に、貯蔵時に付着された可能性のある塵埃または他の粒子を剥離除去することにより、表面に嵌合させかつサンプルの位置特定を行うために使用されるＰＤＭＳデバイスを清浄化する。Ａｃｃｅｌｒ８表面の結合面を上向きにして置き、表面上の中央にチャネル面を下向きにして清浄なＰＤＭＳ構造体を置く。ＰＤＭＳは、被覆ガラスに容易に接着し、それ以上の結合機構を必要としない。
６．１４ サンプルの結合および洗浄
最初に、選択されたレーンの１つのウェル中に５μＬのサンプル液滴（一般的には、ｐＨ９．８の１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液中に希釈される）を適用することにより、サンプルを表面に結合させる。液滴は、チャネルがウェルに連結する点にちょうど接触する状態が望ましい（この時点で、いくらかのサンプルがチャネル中に滲み込む可能性がある）。チャネルを通って対向するウェルに達するように非常に弱い真空（＜２ｋＰａ）を用いてドロップレットを吸引することにより、チャネルを満たし、チャネル全体にわたり結合を均等化させる。他のサンプルについてそれらのそれぞれのレーン中でこのプロセスを反復する。次に、過剰の液をウェルから除去し、ウェルをテープで留めて蒸発を低減させ、そして暗所中、室温でデバイスを２０分間インキュベートする。
結合後、テープを除去し、以上に記載のホウ酸緩衝液１００μＬで各レーンの上端ウェルを満たす。チャネルを通って他のウェルに達するように真空を用いて約２０μＬのその緩衝液を吸引し、このプロセスを１回反復する。次に、すべてのホウ酸緩衝液をすべてのウェルから除去し、上端ウェルをｐＨ８．３の１×ＴＡＥで満たす。チャネルを通るように約５０μＬのＴＡＥを吸引し、次に、すべてのＴＡＥを除去し、そしてウェルを再び満たす。全量約１５０μＬのＴＡＥリンスで、このプロセスを３回反復する。最後に、すべてのウェルを１００μＬの１×ＴＡＥで満たす。
６．１５ 電気伸長
カバースリップ／ＰＤＭＳデバイスの下端に液浸油をスポットし、顕微鏡上に配置する。第１のＰＤＭＳチャネルの両端のウェルに電極を挿入する（負極を上端ウェルに、正極を下端ウェルに）。チャネルの第１の画像は、下端ウェルの近傍で取得されるであろう。その際、対象の領域の焦点が合うように、顕微鏡ステージを調整する。
次に、チャネルを横切って電圧（２００Ｖ）を印加する。ＤＣ電源（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅ３６３０Ａ）により電圧を供給し、自家製の増幅器を介して１００倍に増幅する。電流を印加した後、焦点を再調整し、画像化プロセスを開始する。
次に、残りのチャネルで電気伸長および画像化プロセスを反復する。結合を画像化する。
６．１６ ナノレポーター上の蛍光色素に対する光源
アークランプを光源として使用する場合、最良の蛍光物質の選択は、蛍光の重なりを生じない最高輝度のタイプ、たとえば、Ａｌｅｘａ ４８８、Ｃｙ３、およびＡｌｅｘａ ５９４である。Ａｌｅｘａ ６４７やＣｙ５．５のようなより弱い蛍光色素を使用することも可能である。
６．１７ ナノレポーター上の蛍光色素を画像化するためのフィルター
選択される蛍光物質Ａｌｅｘａ ４８８、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ ５９４、およびＡｌｅｘａ ６４７では、Ｃｙ３とＡｌｅｘａ ５９４との間に重なりが存在しうる。しかしながら、５７２〜６００ｎｍの帯域幅を有する発光フィルターを特注すれば、重なりは最小限に抑えられる。
６．１８ ナノレポーターを画像化するための顕微鏡および対物レンズ
使用した顕微鏡モデルは、複数の蛍光色素候補物質からの蛍光発光の選択を可能にする６つのフィルターカセットを有する倒立型蛍光画像化ステーションを用いたNikon Incorporation製のＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００Ｅであった。選択された色素では、所要の光学解像度は、すべての波長（５００〜７００ｎｍ）に対して約４００ｎｍである。選択された対物レンズは、１．４５のＮＡおよび６０倍の倍率を有するＮｉｋｏｎ Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＴＩＲＦレンズである。光学解像度は、さまざまな波長に対して約２１０〜３００ｎｍである。
７． 実施例２：パッチ／フラップナノレポーター作製プロトコル
この実施例では、一本鎖線状Ｍ１３ｍｐ１８ウイルスＤＮＡとオリゴヌクレオチドパッチユニットと長いフラップとよりなるナノレポーターを作製する他の方法を示す。
実質的にこの実施例に記載の方法を用いて、ナノレポーター標識ユニットを作製し、好結果を得た。
リン酸化済みのパッチユニットおよびフラップをＭ１３ｍｐ１８ ＤＮＡベクターと共に添加し、ライゲートして一体化させる。Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡにライゲートされたパッチユニットにフラップをライゲートした後、ベクターを線状化するためにＢａｍＨ１酵素を導入する。
スカフォールドとしての５μｇのＭ１３ｍｐ１８から開始して、ナノレポーターのバッチを調製する。所望の量に応じてハイブリダイゼーションをスケールアップすることが可能である。このプロセスは、完了までに約１〜２日間を要するであろう。
Figure 0005537034
プロトコルを開始する前に水浴を３７℃および５５℃に予備加熱する。使用前、緩衝液がすべて良好に混合され解凍されていることを確認する。ワークプレートを入手してラベルを貼っておくことが望ましく、ＩＤＴ製の注文品オリゴは、プレート＃５２９９１６および＃６１０５９１に入っている。これらの２つのプレートを取り出して室温で０．５〜１時間解凍し、ウェルを覆っているテープを除去する前に内容物を遠心沈降させる。これらのプレートの特定のオリゴヌクレオチドを用いて、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で４つの個別の反応を構成する。開始にあたり、これらの４つの個別のチューブのキャップにローマ数字のラベルを貼る。列５および６のＡ〜Ｈは、反応Ｉ用であり、列７および８のＡ〜Ｈは、反応ｉｉ用であり、すべてプレート＃５２９９１６中に存在する。列１および２は反応ｉｖ用であり、列３および４は反応ｉｉｉ用である。
フラップライゲーション（工程Ａ）：４つの個別の１．５ｍｌチューブにローマ数字ｉ〜ｉｖ（以上に記載）のラベルを貼る。次のものを含有するそれぞれの５０μｌ反応液に応じて以下の試薬を添加する：５μｌ １０×リガーゼ緩衝液、０．５μｌ／プレート＃５２９９１６および＃６１０５９１の指定のウェルのオリゴヌクレオチド、４μｌの長いフラップオリゴ／反応（ＡまたはＢ）（反応Ｉ、ｉｉ、およびｉｖ用）、３μｌのＬＦ（区域ｉｉｉ用）、２９μｌＨ２Ｏ（反応Ｉ、ｉｉ、およびｉｖ用）、３２μｌ Ｈ２Ｏ（反応ｉｉｉ用）、ならびに４μｌ Ｔ４リガーゼ。リガーゼを用いることなく３７℃で１時間半にわたりこの混合物中のオリゴをあらかじめアニールする。最後の試薬としてリガーゼを添加し、室温で少なくとも４時間ライゲートする。生成物濃度は１ｐｍｏｌ／フラップ／μｌである。
フラップライゲーションリン酸化（工程Ｂ） 再び４つの個別の１．５ｍｌチューブにローマ数字のラベルを貼り、生成物がリン酸化されていることを示すために丸印の中にＰの文字を入れて１〜４に付記する。対応するチューブに次の試薬を添加する：１０μｌ／フラップライゲーション反応（１０μｌ／上記フラップライゲーション反応を利用）、２．５μｌ Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ緩衝液、０．５μｌ １００ｍＭ ＡＴＰ、１１．５μｌ Ｈ２Ｏ、および０．５μｌ Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ酵素。３７℃で１時間インキュベートする。生成物濃度０．４ｐｍｏｌ／フラップ／μｌ。
オリゴヌクレオチドパッチユニットリン酸化（工程Ｃ） ２７μｌオリゴヌクレオチドパッチユニットミックス（０．７４ｐｍｏｌ／μｌ）、５μｌ １０×緩衝液、１μｌ １００ｍＭ ＡＴＰ、３μｌ Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ酵素、および１４μｌ Ｈ２Ｏ。試薬をすべて合わせた後、チューブを軽く数回叩くことにより溶液を穏やかに混合し、そして遠心沈降させる。３７℃で１時間インキュベートする。
Ｍ１３ｍｐ１８スカフォールドへのハイブリダイゼーション（工程Ｄ） 新しい１．５ｍｌチューブ中に次の試薬：２０μｌ Ｍ１３ｍｐ１８（２５０ｎｇ／μｌ）、２７μｌリン酸化オリゴヌクレオチドパッチユニット（０．４ｐｍｏｌ／μｌ）（工程Ｃ）、１２．５μｌ／リン酸化フラップライゲーション（工程Ｂ）（５５℃で５分間予備加熱し、氷上に置く）、１１μｌ １０×リガーゼ緩衝液を添加し、全混合物を５５℃で１分間加熱する。３７℃で少なくとも４時間にわたり混合物をハイブリダイズする。
ライゲーション（工程Ｅ） エッペンドルフ内容物を遠心沈降させる。１．２μｌ １００ｍＭ ＡＴＰおよび３μｌ Ｔ４リガーゼを添加する。チューブを軽く叩くことにより穏やかに内容物を混合し、次に、遠心沈降させる。
ＢａｍＨ１消化（工程Ｆ） １μｌの１０ｐｍｏｌ ＢａｍＨ１オリゴ、２０μｌ １０×ＢａｍＨ１緩衝液、３７℃で約１時間ハイブリダイズする。量を２００μｌに調整する。３μｌ ＢａｍＨ１酵素を添加する。３７℃で１時間インキュベートする。
第１の工程：清浄な１．７ｍｌエッペンドルフチューブに２０μｌのＭ１３ｍｐ１８（ＮＥＢ ２５０μｇ／ｍｌ）を添加することにより開始する。５μｌのリン酸化フラップライゲーション反応系を利用し、それを７０℃で２分間予備加熱し、ただちに氷上に置く。５μｌの各リン酸化フラップライゲーション反応系（１ｐｍｏｌ／フラップ／μｌ）をチューブに添加し、ピペッティングを数回行うことにより穏やかに混合する。エッペンドルフチューブを３７℃で１時間インキュベートする。
第２の工程：新しいエッペンドルフ１．７ｍｌエッペンドルフチューブ中に１３．５μｌオリゴヌクレオチドパッチユニットミックス（０．７４ｐｍｏｌ／μｌ）および１μｌのＡｃｒｙｄｉｔｅミックス（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を入れる。５μｌ １０×Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ緩衝液、１μｌ １００ｍＭ ＡＴＰ、および２７．５μｌ Ｈ２Ｏを添加する。溶液をピペッティングにより穏やかに混合する。２μｌ Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ酵素を添加し、ピペッティングにより穏やかに混合し、３７℃で１時間インキュベートする。
第３の工程：リン酸化オリゴ反応系を利用し、Ｍ１３ｍｐ１８＋フラップハイブリダイゼーションの内容物にそれを全部添加する。反応系をピペッティングにより穏やかに混合し、３０℃で１時間インキュベートする。ハイブリダイゼーションの終了後、反応系に１μｌ（１００ ＡＴＰ）を添加することによりＡＴＰを調整する。
第４の工程：エッペンドルフチューブ中の内容物を遠心沈降させ、４μｌ Ｔ４リガーゼ酵素（５単位／μｌ）添加し、ピペッティングにより穏やかに混合する。室温で少なくとも４時間インキュベートする。ライゲーションが行われている間、室温で１μｌ ＢａｍＨ１オリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を添加し、ハイブリダイズさせる。
第５の工程：４μｌ ＢａｍＨ１酵素（５単位／μｌ）を添加することによりライゲーション反応系を消化し、ピペッティングにより穏やかに混合し、そして３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーション時間が終了したら、ＱＣのために５００ｎｇのアリコートを採取する。
第６の工程：ソラレン、ＵＶまたはＤＭＰＡ光で１５分間処理する。
計算には次のものが含まれる：
５μｇのＭ１３＝２０μｌストック液（New England Biolabs製）＝２ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドミックス：１８０−３４フラップ領域−１０ Ａｃｒｙｄｉｔｅ修飾オリゴ＝０．７４ｐｍｏｌ／オリゴ
１０ｐｍｏｌ／オリゴヌクレオチド＝１３．５μｌ＝１３５０ｐｍｏｌ
１単位のＯｐｔｉｋｉｎａｓｅは、最終的に１ｎｍｏｌのリン酸を変換する。過剰量を使用する。４μｌのＯｐｔｉｋｉｎａｓｅを使用した。
配列番号１＝Ｍ１３ｍｐ１８。
８． 実施例３：ＲＮＡナノレポーターを作製するためのプロトコル
ナノレポーターを作製し、実質的にこの実施例に記載の方法を用いて標的分子を検出するために利用し、好結果を得た。そのようなこの方法を用いて標的を検出する例を図６に示す。
８．１ スカフォールドの作製
一本鎖環状Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡ（USB Corporation）をＢａｍ ＨＩ認識部位に相補的な１０倍モル過剰のオリゴヌクレオチド（Ｂａｍカッターオリゴ）にアニールし、Ｂａｍ ＨＩ制限酵素で切断して線状一本鎖ＤＮＡバックボーンを得る。続いて、Ｂａｍカッターオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（抗Ｂａｍオリゴヌクレオチド）をＢａｍカッターオリゴヌクレオチドに対して５０倍過剰で添加して遊離のＢａｍカッターオリゴヌクレオチドを封鎖することにより、後続の工程時におけるＭ１３の再環状化を防止する。
線状Ｍ１３分子は、組み込まれた蛍光物質を有するＲＮＡパッチまたはＲＮＡセグメントをアニールさせうるスカフォールドとして機能する。
８．２ Ｍ１３スカフォールド上に二本鎖部位を形成するためのＰＣＲ
Ｍ１３スカフォールドに沿って１０個の異なる領域を形成ために、１０セットのオリゴヌクレオチドプライマーペアをデザインした。各ペアは、５’末端にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する１つのプライマーを含有する。領域２〜７は、９００塩基（約３００ｎｍ）の長さになるようにデザインされる。なぜなら、これは、回折限界スポット（標準的光学素子で達成可能な最小スポット）の近似サイズであるからである。領域１および８は、長体および短体の両方を有し、長体は、全９００塩基領域をカバーし、一方、短体は、標的特異的配列をライゲートできるように９００塩基領域の一部だけをカバーする。したがって、標的特異的配列は、いずれかの末端に結合可能である。アンカーまたはタグの結合のために、末端を使用することも可能である。
Ｔａｑポリメラーゼおよび鋳型としての０．５ｎｇの二本鎖Ｍ１３ｍｐ１８（USB Corporation）を用いてＰＣＲを行う。Qiagen製のＱｉａｑｕｉｃｋ精製キットを用いて反応系を清浄化する。各ＰＣＲ反応により、以下に示される特定のセグメントの１つに対応する二本鎖断片が得られる。これらの断片をＲＮＡセグメントのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型として使用する。
８．３ ダークＲＮＡセグメントを作製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
以上に記載のＰＣＲ産物を二本鎖鋳型として用いて、Ambion製のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キット（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット）によりＲＮＡセグメントを作製する。Qiagen製のＲＮｅａｓｙキットを用いて、転写反応産物を精製する（鋳型を除去するためのＤＮＡｓｅ Ｉによる処理を含む）。
８．４ アミノアリル基で修飾されたＲＮＡセグメントを作製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
以上に記載のＰＣＲ産物を二本鎖鋳型として用いて、Ａｍｂｉｏｎ製のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キット（ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡキット）により、後続の色素結合のためのＲＮＡセグメントを作製する。転写時にアミノアリル修飾ＵＴＰヌクレオチドをＲＮＡセグメント中に組み込む。Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙキットを用いて、転写反応産物を精製する（鋳型を除去するためのＤＮＡｓｅ Ｉによる処理を含む）。
８．５ 着色ＲＮＡセグメントを作製するためのアミノアリルＲＮＡセグメントへの色素結合
Ａｍｂｉｏｎ Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ Ｌａｂｅｌｉｎｇキットを用いて、２０〜１００μｇのアミノアリル修飾ＲＮＡセグメントをＮＨＳ−エステル色素に結合させる。使用した色素としては、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５９４、およびＡｌｅｘａ ６４７（Invitrogen／Molecular Probes）、ならびにＣｙ３（Amersham）が挙げられる。
スカフォールド上の各位置が４色のいずれかのセグメントで満たされるように、各セグメントを４つの色で個別に作製する。したがって、異なる位置で異なる色を付加することにより、多くのユニークな色の組合せを生成することが可能である。
この特定の実施形態では、各セグメントが個別の「スポット」として検出されるように、隣接するセグメントは、異なる色でなければならないか、または介在するダークセグメントでありうる。ナノレポーターコードの一部としてダークセグメントを使用することが可能である。
８．６ 標識分子の集合
１×ＳＳＰＥ緩衝液中７０℃で、２：１のセグメント対Ｍ１３スカフォールド比で、各位置に対するセグメントを２時間アニールする。
標識化ＲＮＡセグメントを有する集合ナノレポーターを図３Ａ〜３Ｂに示す。図３Ａは、交互の「スポット」（１、３、５、および７）だけが標識されているナノレポーターを示し、図３Ｂは、すべてのスポットが標識されているナノレポーターを示している。
９． 実施例４：ＲＮＡナノレポーター／ゴーストプローブの組合せを用いる標的（Ｓ２）ＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子の検出
９．１ プローブおよび標的オリゴヌクレオチドの合成
Ｓ２ ＤＮＡ標的オリゴヌクレオチドを合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Integrated DNA Technologies）により精製した。Ａｍｂｉｏｎ ＭｅｇａｓｃｒｉｐｔＴＭキットを用いて製造業者の使用説明書に従って、クローン化ＳＡＲＳコロナウイルス遺伝子（Invitrogen）の領域に対応するＰＣＲ産物のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により、Ｓ２ ＲＮＡ標的分子を作製した。Ｓ２ゴーストプローブ（図６Ａ（ｉ））は、Ｓ２標的配列の特定の５０塩基領域（Ｓ２−ａ）に相補的であり、５’末端にビオチン−ＴＥＧモノマーを有するように合成され、高速液体クロマトグラフィー（Integrated DNA Technologies）により精製された。Ｓ２標的（Ｓ２−ｂ）に相補的な５０ｂｐとＭ１３スカフォールドへのライゲーションに用いられる追加の配列の９ｂｐとを有する第２のオリゴヌクレオチド（全５９ｂｐ）を合成し、ＨＰＬＣ（Integrated DNA Technologies）により精製した。Ｓ２−ａおよびＳ２−ｂ標的領域がオーバーラップしていなかったことに留意されたい。
９．２ ナノレポーターの合成
オリゴヌクレオチドＳ２−ｂを線状化Ｍ１３［図６Ａ（ｉｉｉ）］の５’末端にライゲートし、得られた生成物を、製造業者の使用説明書に従ってＹＭ１００フィルター（Millipore）に通してサイズ排除濾過により精製し、ライゲートされていない残留オリゴヌクレオチドから分離した。製造業者の使用説明書に従ってＡｍｂｉｏｎ ＭｅｇａｓｃｒｉｐｔＴＭキットを利用して、Ｍ１３の位置２、４、６、および８に相補的なアミノアリル修飾ＲＮＡセグメント（配列番号）（図１Ｃ）をＤＮＡ鋳型（ＰＣＲ産物）のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写から作製した。次に、Ambionの使用説明書（アミノアリルＭｅｓｓａｇｅＡｍｐＴＭ ＩＩ ａＲＮＡキット）に従ってセグメントをＮＨＳ−エステル修飾Ａｌｅｘａ ６４７色素（Invitrogen）に結合した。Ｍ１３スカフォールドの位置１、３、５、および７に対応するＲＮＡセグメント（図１Ｃ）を以上に記載のＤＮＡ鋳型から未修飾ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡとして作製した。１×ＳＳＰＥ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中、７０℃で、１０ｆｍｏｌ／μｌの８つの各セグメントを５ｆｍｏｌ／μｌのＭ１３−Ｓ１−ｂスカフォールドに２時間アニールすることにより、ナノレポーターの集合を行った。最終生成物は、ダークセグメントを介在させてＡ６４７（赤色）で標識された４つのセグメントを有するナノレポーターであった。
９．３ ハイブリダイゼーション条件
標的へのナノレポーターおよびゴーストプローブのハイブリダイゼーションを次の条件下で行った：５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭジナトリウムＥＤＴＡ）、４０ｐＭゴーストプローブ（結合オリゴヌクレオチドＳ２−ａ）、４０ｐＭナノレポーターＳ２−ｂ、１００ｎｇ／μｌ剪断サケ精子ＤＮＡ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、および０．１％Ｔｗｅｅｎ。最終標的濃度は、２０ｐＭ Ｓ２ ＤＮＡ標的（図６Ｂ）および１ｐＭ Ｓ２ ＲＮＡ標的（図６Ｃ）であった。陰性対照（図６Ｄ）には標的を添加しなかった。
ハイブリダイゼーション反応系を６５℃で少なくとも１６時間インキュベートした。
ハイブリダイゼーション反応系を１００ｍＭホウ酸緩衝液溶液（ｐＨ９．８）で１：２に希釈し、フローセルチャネル中に導入し、チャネルの底部を形成するストレプトアビジン被覆カバースリップ（Accelr8製のストレプトアビジン−ＯｐｔｉＣｈｅｍカバースリップ）に結合させた。ビオチン化ゴーストプローブとストレプトアビジン表面との相互作用により、ナノレポーター／標的／ゴーストプローブ複合体の一端によるスライドへの結合を達成した。表面に結合されていない過剰のレポーターを除去するために追加のホウ酸緩衝液でチャネルを濯いだ後、緩衝液を１×ＴＡＥ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−アセテート、１ｍＭ ＥＤＴＡ）と交換し、画像キャプチャー時にナノレポーター／標的複合体を伸長させるように２００Ｖの電流を印加する。
倍率６３倍の油浸対物レンズ（１．４ ＮＡ）を備えたＬｅｉｃａ ＤＭＩ ６０００Ｂ顕微鏡、Ｘｃｉｔｅ−１２０光源（Exfo）、特注品のフィルターセット（Chroma Technologies）、Ｏｒｃａ−ＥＲ ＣＣＤカメラ（Hamamatsu）、およびＭｅｔａｍｏｒｐｈデータ取得ソフトウェア（Molecular Devices）を用いて、画像を取得した。
予想どおり、適切な標的分子Ｓ２がゴーストプローブ［図６Ａ（ｉ）、Ｓ２−ａ］とＳ２−ｂ標的特異的ナノレポーター［図６Ａ（ｉｉｉ）］との両方にハイブリダイズしたときに［図６Ａ（ｉｉ）］、ゴーストプローブ／標的／ナノレポーター複合体は、スライドに結合する単一種を生成し、６４７ｎｍの波長の光を照射したときに４つのスポットとして視覚化された（図６Ｂ、６Ｃ、および６Ｅ）。結合の量は、標的濃度に依存した。Ｓ２標的配列の不在下では有意な結合は存在しなかった（図６Ｄ）。
１０． 実施例５：一価もしくは二価抗体フラグメントを含むナノレポーター
標的分子がタンパク質またはポリペプチドである場合、ナノレポータースカフォールドが核酸でありかつ標的特異的配列が一価もしくは二価抗体フラグメントであるナノレポーターを作製することが可能である。
場合により、常法を用いて、対象の標的分子を認識する抗体をペプシンで消化し、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを作製する。温和な還元により、たとえば、２−メルカプトエチルアミンを用いて、ペプシン消化により作製された抗体の２つの部分すなわち２つのＦ（ａｂ’）２フラグメントを分離する。この還元により、両方の抗体フラグメントすなわち２つのＦ（ａｂ’）２フラグメントは、官能化可能な２つのスルフヒドリル基を有する２つの一価フラグメントに分離される。
ヘテロ二官能性架橋試薬（たとえば、Pierce Biotechnology Inc.製のｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を用いて、アミン修飾を有するオリゴヌクレオチド（これは、Integrated DNA Technologiesから注文品として入手可能）にマレイミドを結合する。架橋試薬上のＮＨＳをオリゴヌクレオチド上のアミンと反応させて、マレイミドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドを生成する。
次に、このマレイミドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドを抗体フラグメント上のスルフヒドリル基の１つと反応させる。立体的制約があるので、ただ１つのオリゴヌクレオチドを各フラグメントに結合させることが好ましい。
次に、オリゴヌクレオチドに結合されたこの一価もしくは二価抗体フラグメントをナノレポータースカフォールド上の相補的配列にハイブリダイズすることにより、標的特異的配列が抗体配列であるレポータープローブを作製することが可能である。そのようなレポータープローブは、標的分子を検出するために単独で使用可能であるか、あるいはゴーストプローブまたは他のレポータープローブ（その標的特異的配列は、同一の標的分子の異なる部分に結合する一価もしくは二価抗体または抗体フラグメントである）と組み合わせて使用可能である。
１１． 実施例６：ナノ鎖レポーターシステムを用いる１００ｎｇの胎盤全ＲＮＡへの２５種の細胞遺伝子のハイブリダイゼーション
２５種の内在性細胞遺伝子の検出および定量を単一の多重化ハイブリダイゼーション反応で行った。そのほかに、約１０、１００、および３００コピー／細胞にそれぞれ対応する３種の非ヒト対照配列を各反応系にスパイクした。また、細胞ＲＮＡの不在下で陰性対照ハイブリダイゼーションを行った。
１１．１ ハイブリダイゼーション反応
各サンプルを三重反復試験方式でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション試薬の最終濃度は、次のとおりであった：１．１２ｎＭ全ナノレポーター（それぞれ４０ｐＭで２８種の個別ナノレポーター）、１．１２ｎＭ全ゴーストプローブ（２８種の個別ゴーストプローブ）、５×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．５）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、１００ｎｇ／μｌ剪断サケ精子ＤＮＡ、０．１％トゥイーン２０、１５０ｆＭ Ｓ３スパイクＤＮＡ、５０ｆＭ Ｓ４スパイク、および５ｆＭ Ｓ６スパイク。全胎盤ＲＮＡの最終濃度は、３３ｎｇ／μｌであった。陰性対照ハイブリダイゼーションには全胎盤ＲＮＡを添加しなかった。反応の最終量は、３０μｌであった。試薬を混合し、加熱蓋を備えたサーモサイクラーブロック中６５℃で２０時間インキュベートした。
Figure 0005537034
Figure 0005537034
１１．２ ポストハイブリダイゼーション精製
磁気ビーズ（Ｆ−ビーズ）に結合されたゴーストプローブに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーション反応系を精製し、ハイブリダイズされていないレポーターを除去した。最終塩濃度が１×ＳＳＰＥになるようにハイブリダイゼーション反応系を０．１％トゥイーン２０中に５倍希釈し、溶液を３０μｌのＦ−ビーズ（１５０μｌの１×ＳＳＰＥ／０．１％トゥイーン２０中で２回予備洗浄した）に添加した。連続回転させながら、ハイブリダイズされた複合体をビーズに室温で１５分間結合させ、１５０μｌの０．５×ＳＳＰＥ中で１回洗浄し、そして２５μｌの０．１×ＳＳＰＥ中、４５℃で１５分間溶出させた。
１１．３ 結合、伸長、および固定
０．１μＭ ＴｅｔｒａｓｐｅｃＴＭ蛍光マイクロスフェア（製品番号T7279、Molecular Probes）の１／１０００希釈液１μｌおよび３μｌの１Ｍビス−トリスプロパン（ｐＨ９．０）を添加することにより、結合用としてサンプルを調製した。ストレプトアビジンで被覆されたＡｃｃｅｒｌ８ Ｏｐｔｉｃｈｅｍ（登録商標）スライド（製品番号TB0200）に結合させるために、サンプルをナノ鎖流体デバイスに充填した。充填後、各ウェルに４０μｌのＴＡＥを添加することにより、スライド表面を１×ＴＡＥで１回洗浄して電気伸長用として調製した。流体チャネルを横切って２００Ｖを印加することにより、結合された複合体を伸長させた。１分後、電圧の印加を５分間継続しながら、負荷電電極の入ったウェルに６０μｌの５００ｍＭのＧ−フックオリゴ溶液を添加することにより、サンプルを伸長位置で固定した。固定後、ＴＡＥ溶液を除去し、画像化のために光漂白防止試薬で置き換えた。
１１．４ 画像化
メタルハライド光源（Ｘ−ｃｉｔｅ １２０、Exfo Corporation）と倍率６０倍の油浸レンズ（１．４ ＮＡ Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＶＣ、Nikon）とを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００Ｅを用いて、スライドを画像化した。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Universal Imaging Corporation）の制御下でＯｒｃａ Ａｇ ＣＣＤカメラ（Hamamatsu）を用いて、各視野ごとに異なる励起波長（４８０、５４５、５８０、および６２２）で４つの画像を取得した。特注品の画像処理ソフトウェアを用いて画像を処理した。
１１．５ データ解析
特注品のソフトウェアを用いて処理画像から生データを抽出した。各サンプル中の対照スパイクの平均カウント数を基準にしてデータを規格化した。システムにより遺伝子が「検出」されたかを判定するために、スチューデントのｔ検定を用いて、各遺伝子ごとにＲＮＡを含有するハイブリダイゼーションから得られたカウント数をＲＮＡなしのハイブリダイゼーションで得られたカウント数と比較した。ｐ値＜０．０５を有する遺伝子を検出されたと判定した。バックグラウンドを除去した後、スパイク対照の線形回帰から細胞ｍＲＮＡの濃度を推定した。次の仮定を用いてこれらの濃度をコピー／細胞に変換した：１個の細胞は１０ｐｇの全ＲＮＡを含有し；各細胞は３００，０００個のｍＲＮＡ分子を含有し；反応の最終量は３０μｌである。
１１．６ 結果および結論
以下の表３は、以上に記載のデータ解析の結果を示している。この結果に示されるように、本明細書に記載のナノレポーター技術を用いて、１転写産物／細胞未満の濃度で存在する転写産物（たとえばＣＡＳＰ３）を検出することが可能である。したがって、ナノレポーター技術は、遺伝子発現の検出および定量を行うきわめて高感度の手段を提供する。
Figure 0005537034
１２０種までの異なるレポーターを含む単一の多重化反応で本明細書に記載のハイブリダイゼーション法を行ったところ、類似のハイブリダイゼーション効率および結果が得られた。
１２． 実施例７：ナノレポーターハイブリダイゼーションの速度論に関する考察
１２．１ 背景
標的に対して大過剰のプローブを用いる溶液ハイブリダイゼーションは、擬一次速度式に従う。このレジームでは、反応速度は、プローブ濃度だけに依存し、標的濃度には依存しない。溶液中の標的の濃度に関する正確な情報を提供する二プローブ一標的ストラテジーでは、プローブは両方とも、標的よりも過剰に存在するはずである。したがって、可能な濃度範囲は、好ましくは、標的の濃度によりその下限が制限される。しかしながら、本明細書に記載のナノレポーター技術の有用な濃度範囲は、実用上、ハイブリダイゼーションを行うのに必要な時間量によりその下限が制限される。
１２．２ ハイブリダイゼーションの速度論
好ましい実施形態では、検出のために標的（Ｔ）がレポータープローブ（Ｒ）およびゴーストプローブ（Ｇ）の両方にハイブリダイズしなければならない標的検出および定量アッセイが行われる（たとえば、結果的に（Ｔ）の存在下でのみ複合体を形成する（Ｒ）および（Ｇ）だけを含む複合体のアフィニティー選択および検出により）。この反応が不可逆であると仮定すると、起こる可能性のある素反応は４つである。
Figure 0005537034
ＲＴおよびＴＧは３種のうちの２種の中間複合体であるので、これらの４つの反応は、次のように単純化することが可能である。
Ｒ＋Ｔ＋Ｇ→ＲＴＧ
しかしながら、ＲＴＧ（レポーター−標的−ゴーストプローブ複合体）の生成速度を定量的に計算するためには、４つの反応をすべて考慮に入れなければならない。系を記述する微分方程式は、以下のとおりである：
Figure 0005537034
式中、ＣＲ、ＣＴ、ＣＧ、ＣＲＴ、ＣＴＧ、およびＣＲＴＧは、種々の種の濃度であり、ｋ１〜ｋ４は、４つの素反応の速度定数である。プローブおよび標的が相補的一本鎖分子である場合（すなわち、ゴーストプローブ上に精製用タグが存在せずかつレポーターが存在しない場合）のこれらの速度定数の値は、文献（Wetmur, J. Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 1976.5:337-361）中の利用可能なデータから計算可能である。
Figure 0005537034
上記式中、ｋＮは核生成速度定数であり、Ｌは核酸長さ（塩基対単位）であり、Ｎは核酸複雑度（非反復配列ではＬに等しい）であり、ａｓａｌｔおよびａｒｅｆは塩濃度に対する補正である（Britten et al., 1974, Methods in Enzymology 29E:363-406）。本明細書に記載のナノレポーターシステムでは、速度定数は、結合されるゴーストプローブタグおよびレポータープローブのサイズに依存する。いかなる理論によっても拘束されるものではないが、本発明者らの考えるところによれば、長さへの速度定数の依存性は、反応物の拡散定数への素反応の依存性と同一であろう。
Figure 0005537034
上記式中、Ｄ１およびＤ２は、２つの反応種（上記反応参照）の拡散定数であり、Ｄ５０は、５０ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ分子の拡散定数である。１００塩基の一本鎖標的、１００塩基の一本鎖ゴーストプローブ、および７２００塩基の二本鎖レポーターを仮定すると、関連する速度定数は、次のようになる。
ｋ１＝２．６４×１０５Ｌ／ｍｏｌ／ｓ
ｋ２＝６．５５×１０５Ｌ／ｍｏｌ／ｓ
ｋ３＝３．９９×１０５Ｌ／ｍｏｌ／ｓ
ｋ４＝１．９１×１０５Ｌ／ｍｏｌ／ｓ
これらの速度定数を用いて微分方程式の系を数値的に解くと（プローブが標的に対して少なくとも１０倍過剰であると仮定する）、５ｐＭレポーターおよび５ｐＭゴーストプローブは、終夜反応（１６〜１８時間）で最終到達点の１０％までハイブリダイゼーションを起こすであろうという予測結果が得られる。５ｐＭ未満の濃度では、完全にハイブリダイズされた分子の量は、おそらく実際上測定不可能であろう。したがって、好ましい実施形態では、ナノレポーター成分（ゴーストプローブおよび／またはレポータープローブ）の下限濃度は、５ｐＭである。
１２．３ レポーターの絡合い
理論によれば、プローブ濃度が増加するにつれて、ハイブリダイゼーション速度は際限がなく上昇し、プローブの溶解度だけが制約になると予測される。しかしながら、レポータープローブは、本発明に係るナノレポーターシステム中の標的特異的配列と比較して非常に大きい可能性がある。いかなる理論によっても拘束されるものではないが、レポータープローブへの結合により、標的特異的配列の速度論は、古典的溶液ハイブリダイゼーションの速度論とは異なったものになると本発明者らは考えている。レポータープローブは大きい高分子であるので、他のナノレポーターに接触したときに互いに長時間の相互作用（絡合い）をする可能性がある。低濃度では、２つのポリマーが絡み合った状態になる可能性は低いが、溶液中のポリマーの濃度および／またはサイズが増加するにつれて、この相互作用はより一般的に見受けられるようになる。非常に高い濃度の非常に長い分子という極端な場合、ポリマーは、溶液中で永久的網状構造またはゲルを形成する。溶液ハイブリダイゼーションが起こるようにするには、プローブ（たとえば、ナノレポータープローブ）／標的ペアは、互いに接触してハイブリダイゼーション核が生成されるまで溶液中を拡散しなければならない。古典的には、分子の並進拡散はハイブリダイゼーションの核生成よりも速いので、ハイブリダイゼーション反応は拡散律速ではない（すなわち、プローブおよび標的は、一緒に拡散して、核生成が行われる前に何回も相互作用する）。希薄溶液中では、その大きいサイズは、レポータープローブの並進拡散を遅くするであろうが、速度論には有意な影響を及ぼさない可能性がある。ある中間濃度では、レポータープローブは、溶液中の空間のほとんどすべてを占めて効果的に永久的絡合いゲルを生成し、もはや溶液中を拡散できない。しかしながら、ゴーストプローブおよび標的は、絡み合ったレポータープローブを通って依然として拡散しハイブリダイゼーションを起こしうるより小さい分子であると考えられる（おそらくより遅い速度であろうが）。同様に本発明者らの考えるところによれば、あるより高い濃度では、溶液中のレポータープローブは、反応が拡散律速になる点までゴーストプローブおよび標的の運動を妨害するであろう。この濃度（これは、定量的にはわかっておらず、レポータープローブ構造、ゴーストプローブ構造、および標的サイズに依存する）は、ナノレポーターシステムにおける有用な濃度範囲の上限であり、当業者であれば本明細書に記載の原理に基づいて経験的に決定可能である。
１２．４ 速度論の長さ依存性
ハイブリダイゼーションの上限濃度はレポーター構造およびゴーストプローブ構造（それらには多くの可能な形態が存在する）の両方に依存するので、有用な濃度範囲の変化を予測する理論的枠組みは、本発明を実施するのに有用である。古典的理論によれば、ハイブリダイゼーションの速度論は、より小さいプローブのサイズにのみ依存すると予測される。したがって、理論的には、標的分子およびゴーストプローブの両方が有意により小さいかぎり、レポーターのサイズは、ハイブリダイゼーションの速度論に関与しないであろうと予測されよう。その場合、理論によれば、ハイブリダイゼーションの速度（一定の標的長さに対して）は、ハイブリダイゼーションの立体阻害に基づいて、１／Ｌ１／２〔ただし、Ｌはゴーストプローブの長さである〕に依存すると予測される。結果的に、ハイブリダイゼーションの速度は、ゴーストプローブが小さいほど速いであろう。ゴーストプローブの長さが増加するにつれて、ハイブリダイゼーションの速度は、１／Ｌ１／２に応じて減少するはずである。一定のゴーストプローブ長さを仮定すれば、ハイブリダイゼーション事象の測定可能な量を生じるレポーターの長さおよび濃度の範囲を規定することが可能である。レポーターサイズを規定した後、ゴーストプローブサイズの近似的範囲を決定することが可能である。これは反復プロセスであるが、本発明者らの論拠の基礎になる理論が、レポータープローブを利用しないシステムでのハイブリダイゼーションデータから導かれたものであることを考慮すれば、詳細な経験的ガイドラインを作成するためのデータを収集する良好な出発点を与えうる。
１２．５ 絡合いの閾値
レポータープローブは、本質的には、自由溶液中のポリマーであり、ランダムコイルの挙動を示す。単一のレポーターにより占有される体積Ｖｐは、自由連結鎖モデル（ＦＪＣ、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡのような可撓性ポリマー用）またはみみず鎖モデル（ＷＬＣ、二本鎖ＤＮＡもしくはレポーターのような剛性ポリマー用）に基づく高分子物理学理論から計算可能である。いずれのモデルの場合にも、
Figure 0005537034
である。式中、Ｒｇは慣性半径である。ＦＪＣの場合、
Figure 0005537034
である。式中、ｂはセグメントの長さであり、Ｎは鎖中のセグメントの数である。ＷＬＣの場合、
Figure 0005537034
である。絡合いの閾値濃度は、溶液の全体積がレポーターにより占有されるときの濃度として定義される。
Figure 0005537034
式中、ＮＡはアボガドロ数である。この濃度を超えると、レポーターの並進拡散は著しく制限されると推定される。絡合いの閾値濃度は、レポーター構造によって異なる。レポーターの長さが増加するにつれて、絡合いの閾値は減少する（１／Ｌ１／５に応じて）。上記の式から、さまざまなスポットサイズおよびさまざまな長さを有するレポータープローブに対する理論上の絡合いの閾値を計算することが可能である。そのような計算の結果を図１７に示す。この図は、約９００ｂｐの８つの標識結合領域を有する７２００ｂｐのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドレポータープローブの場合、絡合いの閾値が約７０ｎＭであることを示している。
標的およびゴーストプローブの両方がレポーターよりもかなり小さい場合、それらは、こうした高濃度のレポーターのときでさえも、溶液中を自由に拡散できる可能性がかなり高いであろう。７２００ｂｐのレポータープローブ、１００塩基の標的、および１００塩基のゴーストプローブを用いた場合、ハイブリダイゼーション速度は、８０ｎＭの濃度まで認めうるほど遅くはならないことが初期データから示唆される。
１２．６ 多重化に及ぼす絡合いの閾値の効果
ハイブリダイゼーション反応におけるレポーターの最大濃度がＣ＊であると仮定すると、各レポーター（特定の標的に特異的）の濃度は、Ｃ＊／Ｍに等しい。ただし、Ｍは、反応の多重度（同時に取り扱われる異なる標的の数）である。逆に、特定のレポーター構造体の可能な多重レベルは、プローブ濃度の下限（速度論に由来するＣｐ、約１０ｎＭ未満）および絡合いの閾値から次のように計算可能である。
Ｍ＝Ｃ＊／Ｃｐ
利用可能なナノレポーターコードの数がレポータープローブのサイズに依存しない場合、ナノレポーターの多重化は、主に、レポータープローブのサイズおよび濃度（この濃度がゴーストプローブよりもかなり高いため）に依存する。ゴーストプローブはハイブリダイゼーション時に絡合いに対して有意な寄与を示さないので、本発明者らの考えるところによれば、ゴーストプローブの濃度は、レポータープローブの濃度よりもかなり増大させることが可能である。以下の表４中、最大全ゴーストプローブ濃度（［Ｇ］）は、すべてのレポーター濃度に対して１０００ｎＭに設定されている。ゴーストプローブおよびレポータープローブのこの濃度差は、調整可能なパラメーターである。予備試験では、７２００ｂｐレポーターと１００ｂゴーストとを用いた多重ハイブリダイゼーション反応において、４０ｐＭの各レポータープローブおよび２００ｐＭの各ゴーストプローブは、終夜反応でほぼ完全なハイブリダイゼーションを生じることが示される。
１２．７ サイズおよび濃度の最適範囲
以下の表４には、以上の理論により近似したときのさまざまな多重化におけるゴーストプローブおよびレポータープローブの最適の有用なサイズおよび濃度の範囲がまとめられている。本発明者らの考えるところによれば、約２００塩基までのゴーストプローブは、ほとんどの用途に実用可能であろう。
Figure 0005537034
１３． 実施例８：デュアルナノレポーター集合の代表的な実施形態
この節では、デュアルナノレポーターの集合の実施形態について記述する。ここでは、一方のプローブは、ゴーストプローブであり、他方のプローブは、Ｍ１３バックボーン上に集合された色ＲＮＡセグメントを含むレポータープローブである。ゴーストプローブは、ビオチン化Ｆ−フックに結合され、レポータープローブは、ビオチン化Ｇ−フックに結合される。標的分子の検出および定量のために、デュアルナノレポーターを生体分子サンプルにハイブリダイズさせる。以下の工程は、示された順序で行わなければならないわけではない。さらに、それぞれの特定の工程は、以下に示される以外の実施形態と組み合わせうる特定の実施形態を示している。
１３．１ Ｍ１３スカフォールドの調製
一本鎖環状Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡ（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をＢａｍ ＨＩ認識部位に相補的な５倍モル過剰のオリゴヌクレオチド（Ｂａｍカッターオリゴ）にアニールし、Ｂａｍ ＨＩ制限酵素で切断して線状一本鎖ＤＮＡバックボーンを得る。続いて、Ｂａｍカッターオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（抗Ｂａｍオリゴヌクレオチド）を５０倍過剰で添加して遊離のＢａｍカッターオリゴヌクレオチドを封鎖することにより、後続の工程時におけるＭ１３の再環状化を防止する。
線状Ｍ１３分子は、組み込まれた蛍光物質を有するＲＮＡパッチまたはＲＮＡセグメントをアニールさせうるスカフォールドとして機能する。
１３．２ スカフォールドへの標的特異的配列の結合
対象の標的核酸に相補的な配列（たとえば、３０〜７０ヌクレオチドの配列）と、Ｍ１３スカフォールドへのライゲーションに使用される追加の９ｂｐの配列と、を含むオリゴヌクレオチドを作製し、線状化Ｍ１３スカフォールドの３’末端にライゲートする。
１３．３ スカフォールドへのＧ−タグの結合
Ｇ−タグ（たとえば、Ｇ−フック5'-GGTCTGTGTGATGTT-3'の相補体４コピーと続いて９塩基のライゲーター配列とを含みかつＧ−フックに相補的な配列5'-AACATCACACAGACC AACATCACACAGACC AACATCACACAGACC AACATCACACAGACC AGCCCTTTG-3'を有するオリゴヌクレオチド）を線状化一本鎖Ｍ１３バックボーンの５’末端に結合させ、（１）レポーターの精製ならびに続いてセグメントのライゲーションおよび／またはアニーリングと；（２）固体表面上で「伸長」させた後のレポーターの固定と；を可能にする。Ｇ−タグをＢａｍＨＩ部位で線状化された一本鎖Ｍ１３の５’末端に結合させるためのライゲーターの配列は、5'-CTCTAGAGGATCCAAAGGGCT-3'でありうる。ライゲーション反応は、約８０ｐｍｏｌのＧ−タグ／Ｍ１３ライゲーション産物を生成するための以下のプロトコルに従って実施可能である：
材料：
［１００μＭ］ 抗Ｇ４タグオリゴ
［１００μＭ］ 抗Ｇ４タグライゲーターオリゴ
［８０ｎＭ］ 線状一本鎖Ｍ１３
１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Fermentas）
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Fermentas）
２０×ＳＳＣ（Ambion）
ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ（Ambion）
方法：
１．Ｇ−タグとライゲーターとをあらかじめアニールする：
２５μＭ ２：１ Ｇ／Ｇｌｉｇ １×ＳＳＣ中
２０μｌ ［１００μＭ］ Ｇ−タグライゲーター
４０μｌ ［１００μＭ］ Ｇ−タグ
４μｌ ２０×ＳＳＣ
１６μｌ ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ
＊ ＭＪサーモサイクラー上でアニールする
９５℃、３分間；７２℃、３０秒間、−１℃／サイクル、×６８サイクル；４℃に保持する
２．Ｇ−タグを線状Ｍ１３にライゲートする：
６４ｎＭ Ｍ１３−Ｇ４ １×Ｌｉｇ緩衝液中
１０００μｌ ［８０ｎＭ］ 線状Ｍ１３
８０μｌ ［２５μＭ］ ２：１ Ｇ／Ｇｌｉｇ １×ＳＳＣ中
１２４μｌ １０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液
４０μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
＊ フォイルで覆われたアルミニウムヒートブロック中、３７℃で２時間ライゲートし、次に、酵素を６５℃で１５分間不活性化させる。
１３．４ ＲＮＡセグメントの調製
Ｍ１３スカフォールドに沿って１０個の異なる領域を形成するために、１０セットのオリゴヌクレオチドプライマーペアをデザインする。各ペアは、５’末端にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する１つのプライマーを含有する。領域２〜７は、９００塩基（約３００ｎｍ）の長さになるようにデザインされる。なぜなら、これは、回折限界スポット（標準的光学素子で達成可能な最小スポット）の近似サイズであるからである。領域１および８は、長体および短体の両方を有し、長体は、全９００塩基領域をカバーし、一方、短体は、標的特異的配列をライゲートできるように９００塩基領域の一部だけをカバーする。したがって、標的特異的配列は、いずれかの末端に結合可能である。アンカーまたはタグの結合のために、末端を使用することも可能である。
Ｔａｑポリメラーゼおよび鋳型としての０．５ｎｇの二本鎖Ｍ１３ｍｐ１８（USB Corporation）を用いてＰＣＲを行う。Qiagen製のＱｉａｑｕｉｃｋ精製キットを用いて反応系を清浄化する。各ＰＣＲ反応により、以下に示される特定のセグメントの１つに対応する二本鎖断片が得られる。これらの断片をＲＮＡセグメントのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型として使用する。
以上に記載のＰＣＲ産物を二本鎖鋳型として用いて、Ambion製のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キット（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット）によりＲＮＡセグメントを作製する。Qiagen製のＲＮｅａｓｙキットを用いて、転写反応産物を精製する（鋳型を除去するためのＤＮＡｓｅ Ｉによる処理を含む）。
１３．５ ＲＮＡセグメントの標識化
以上に記載のＰＣＲ産物を二本鎖鋳型として用いて、Ambion製のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キット（ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡキット）により、後続の色素結合のためのＲＮＡセグメントを作製する。転写時にアミノアリル修飾ＵＴＰヌクレオチドをＲＮＡセグメント中に組み込む。Qiagen製のＲＮｅａｓｙキットを用いて、転写反応産物を精製する（鋳型を除去するためのＤＮＡｓｅ Ｉによる処理を含む）。
Ａｍｂｉｏｎ Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ Ｌａｂｅｌｉｎｇキットを用いて、２０〜１００μｇのアミノアリル修飾ＲＮＡセグメントをＮＨＳ−エステル色素に結合させる。使用した色素としては、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５９４、およびＡｌｅｘａ ６４７（Invitrogen／Molecular Probes）、ならびにＣｙ３（Amersham）が挙げられる。
スカフォールド上の各位置が４色のいずれかのセグメントで満たされるように、各セグメントを４つの色で個別に作製する。したがって、異なる位置で異なる色を付加することにより、多くのユニークな色の組合せを生成することが可能である。
この特定の実施形態では、各セグメントが個別の「スポット」として検出されるように、隣接するセグメントは、異なる色であるか、または介在するダークセグメントである。ナノレポーターコードの一部としてダークセグメントを使用することが可能である。
１３．６ スカフォールドへのＲＮＡセグメントのアニーリング
１×ＳＳＰＥ緩衝液中７０℃で、２：１のセグメント対Ｍ１３スカフォールド比で、各位置に対するセグメントを２時間アニールする。標識化ＲＮＡセグメントを有する集合ナノレポーターを図３Ａ〜３Ｂに示す。図３Ａは、交互の「スポット」（１、３、５、および７）だけが標識されているナノレポーターを示し、図３Ｂは、すべてのスポットが標識されているナノレポーターを示している。
１３．７ ゴーストプローブの調製
レポータープローブの標的特異的配列が相補的である領域とは異なる対象の標的核酸の領域に相補的な配列（たとえば、３０〜７０ヌクレオチドの配列）を含む１つ以上のオリゴヌクレオチドを作製する。場合により、Ｆ−フックの３’末端上の短い配列とゴーストプローブの５’末端上の短い配列とに相補的なライゲーターオリゴヌクレオチドを用いて、Ｆ−フック結合用のＦ−タグをゴーストプローブの５’末端にライゲートする。ライゲーターオリゴヌクレオチドに相補的な配列は、Ｆ−フック配列の一部でもなければプローブ配列の一部でもなく、ライゲーションを容易にするためにそれらオリゴに付加された追加のヌクレオチドである。
１３．８ ゴーストプローブへのＦ−タグの結合
Ｆ−タグ（たとえば、Ｆ−フック5'-GCTGTGATGATAGAC-3'の相補体２コピーと続いて９塩基のライゲーター配列とを含みかつＦ−フックに相補的である配列5'-GATGGAGAC GTCTATCATCACAGC GTCTATCATCACAGC-ビオチン-3'を有するオリゴヌクレオチド）をゴーストプローブの３’末端に結合させ、（１）ゴーストプローブ−標的−レポーターハイブリダイゼーション複合体の精製と；（２）ビオチン部分を介するスライド上へのハイブリダイゼーション複合体の結合と；を可能にする。Ｆ−タグをゴーストプローブの３’末端に結合させるためのライゲーターの配列は、5'-GTCTCCATCTTCCGACAG-3'でありうる。
材料：
１００μＭ Ｆ−ビオチンタグ
１００μＭ Ｆゴーストプローブライゲーター
Fermentas １０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液
１μＭゴーストプローブ
Fermentas Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
方法：
１．フックとライゲーターとをあらかじめアニールする：
５μＭ Ｆ−ビオチンタグ／ライゲーターミックス
５μｌ ［１００μＭ］ Ｆ−ビオチンタグ
５μｌ ［１００μＭ］ Ｆ−ゴーストプローブライゲーター
１０μｌ １０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液
８０μｌ ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ
ＭＪサーモサイクラー上でアニールする（９５℃、３分間；７２℃、３０秒間、−１℃／サイクル ×６８サイクル；４℃に保持する）。
２．以下のゴーストプローブライゲーションを構成する：
３００ｎＭ 抗Ｆ２−ビオチン−ＧＰ
６．０μｌ ［１μＭ］ ゴーストプローブ
４．８μｌ ［５μＭ］ 抗Ｆ２−ビオチンタグ／ライゲーターミックス
１．５２μｌ １０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液
３．６８μｌ ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ
４．０μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
ＭＪサーモサイクラー上でライゲートする（３７℃、１８時間；６５℃、１５分間；４℃に保持する）。
３．１５％ Ｎｏｖｅｘ ＴＢＥ−Ｕｒｅａゲル上でライゲーションのＱＣを行う：
以下の充填溶液を調製する：
ライゲーション
３．３３μｌ ［３００ｎＭ］ ライゲーション
１．６７μｌ ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ
５μｌ ２×充填緩衝液
陰性対照−ゴーストプローブ
１μｌ ［１μＭ］ ゴーストプローブ
０．３３μｌ １０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液
３．６７μｌ ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ
５μｌ ２×充填緩衝液
陰性対照−Ｆ−ビオチンタグ／ライゲーターミックス
２μｌ ［０．５μＭ］ Ｆ−ビオチンタグ／ライゲーターミックス
０．３３μｌ １０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液
２．６７μｌ ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ
５μｌ ２×充填緩衝液
５０ｂｐオリゴラダー
４μｌラダー
６μｌ ２×充填緩衝液
１８０Ｖで１５％ Ｎｏｖｅｘ ＴＢＥ−Ｕｒｅａゲルにて５０分間泳動させる。
ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで３０分間染色する。
１３．８．１ 他の選択肢の実施形態
ビオチンを一本鎖Ｆ−タグに共有結合させるのではなく、ゴーストプローブの共通部分に相補的な配列を有するビオチン化オリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をアニールすることにより、ゴーストプローブのビオチン化を達成することも可能である。そのような配列は、Ｆ配列自体でありうるかまたはＦ配列に加えてゴーストプローブに付加される他の配列でありうる。そのような追加の配列を付加する場合、それは、１０〜１００塩基の長さの１〜１０コピーでありうるが、好ましい構成は、５０〜１００塩基の長さの単一コピーである。
１３．９ 標的ｍＲＮＡのビオチン化
ｍＲＮＡサンプルを直接標識するのに利用可能ないくつかの市販のキットが存在する。たとえば、Ｌａｂｅｌ ＩＴ（登録商標）μＡｒｒａｙＴＭ Ｂｉｏｔｉｎ Mirus #MIR 8010）およびＢｉｏｔｉｎ−Ｃｈｅｍ−Ｌｉｎｋ（Roche (1 812 149）が挙げられる。製造業者の手順に従って、ただし、次の変更を加えて、ビオチン標識化ｍＲＮＡを第３ｄ節に記載のハイブリダイゼーション反応系（以下参照）に追加する：ほとんどのプロトコルはポリＡ＋ｍＲＮＡの使用を推奨するので、ＲＮＡの使用量を典型的なハイブリダイゼーションでの全ＲＮＡ１００ｎｇよりも少ない１０ｎｇまで、場合により１ｎｇまで減少させることが可能である。この反応系にはゴーストプローブを添加してはならない。Ｆビーズポストハイブリダイゼーション精製は、もはや必要とされない。スライドへの結合に競合する可能性のあるハイブリダイズされていないビオチン化ｍＲＮＡを除去するために、Ｇビーズポストハイブリダイゼーション精製を使用すべきである。ＲＮＡの使用量に依存して、これは必要なこともあれば必要でないこともある。他の選択肢として、ポリＡ＋画分の精製を必要とすることなく、全ＲＮＡをビオチン化することが可能である。この場合、元の量の全ＲＮＡを使用すべきである（１００ｎｇ）。全ＲＮＡを使用する際、標識化効率を増大させるために、製造業者のプロトコルに変更を加えることが必要になることもある。
他の選択肢の方法は、市販品として入手可能なキットを用いてビオチン化第一鎖ｃＤＮＡまたはビオチン化増幅ＲＮＡ（ａＲＮＡ）を酵素的に生成し、これらを全ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの代わりに使用することであろう。この方法では、センス配向になるようにレポータープローブを再デザインする必要があろう。ゴーストプローブおよびＦ−ビーズポストハイブリダイゼーション反応は、いずれも省略されるであろうが、Ｇビーズ精製は、ハイブリダイズされていないＲＮＡを除去するために残るであろう。
１３．１０ 標的へのデュアルナノレポーターのハイブリダイゼーション
多くのハイブリダイゼーション条件は、遺伝子発現データを得るのに十分である。妥当なハイブリダイゼーション効率を保持しながらハイブリダイゼーション時間を短くするために、いくつかのパラメーターに変更を加えた：ｉ）ゴーストプローブおよびレポーターの濃度を増大させる、ｉｉ）全ＲＮＡを２００〜５００ｂｐの平均サイズ範囲に断片化し、一方、ハイブリダイゼーションのｐＨを６．５に低下させる、ｉｉｉ）同一のハイブリダイゼーション体積でより多くの全ＲＮＡを使用する、ｉｖ）ハイブリダイゼーション体積を約１０μｌまで減少させる。さまざまな種に由来するｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション効率やクロスハイブリダイゼーションに有害作用を及ぼすことなく、Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬やｓｓＤＮＡのようなブロッキング試薬を省略することが可能である。
ゴーストプローブと共に１〜＞５００種のナノレポーターの多重化を行って以下のプロトコルを実施し、好結果を得た（２５種のナノレポーターを利用するナノレポーターアッセイを示す例は、以上の実施例６に記載されており、５０９種のナノレポーターを利用するナノレポーターアッセイを示す他の例は、以下の実施例９に記載されている）。全ナノレポーターの最終濃度は、１）各レポーターの濃度および２）多重化される遺伝子の数に依存して変化する。
典型的な全ナノレポーター濃度は、４０ｐＭ（１遺伝子＠４０ｐＭ）〜２０ｎＭ（５００遺伝子＠４０ｐＭ）の範囲内である。また、ゴーストプローブ濃度は、２００ｐＭ（１遺伝子＠２００ｐＭ）〜１００ｎＭ（５００遺伝子＠２００ｐＭ）のさまざまな値である。以下の例は、陽性対照および陰性対照と共に約５００種の内在性遺伝子を含有する単一の多重化ハイブリダイゼーションを記述する。１１．１μｌの２．７×ハイブリダイゼーションミックス［１３．５×ＳＳＰＥ ｐＨ７．５（USB#75890）、０．２７μｇ／μｌ剪断サケ精子ＤＮＡ（Sigma#D-7656）、０．２７％トゥイーン２０（Sigma#P-1379）、および１３．５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬（Sigma D-2532）］、５μｌの遺伝子ナノレポーターミックス（各０．２４ｎＭまたは全１２３ｎＭは、５０９種の内在性遺伝子および８種のハイブリダイゼーション対照を含む）、４．６μｌの５１３種の遺伝子ゴーストプローブミックス（各１．３ｎＭまたは全６６７ｎＭは、５０９種の内在性遺伝子および８種のハイブリダイゼーション対照を含む）、１μｌの精製対照レポーターミックス（０．５ｐＭ）、１μｌの全細胞ＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）、１μｌの３０×スパイク標的ミックス（１．５ｎＭ〜３ｆＭ）、ならびに６．３μｌのＤＥＰＣ処理水（Ａｍｂｉｏｎ＃９９２２）を０．２ｍｌ薄肉チューブ（最終量３０μｌ）に添加する。
ハイブリダイゼーション試薬の最終濃度は、５×ＳＳＰＥ、０．１％トゥイーン２０、１００ｎｇ／μｌ剪断サケ精子ＤＮＡ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、４０ｐＭの各ナノレポーター（全約２０ｎＭ）、２００ｐＭの各ゴーストプローブ（全約１００ｎＭ）、および３３ｎｇ／μｌの全細胞ＲＮＡであることが望ましい。対照スパイク標的は、典型的には、単一反応において５０ｆＭ〜０．１ｆＭの範囲内でさまざまである。試薬はすべて、最も好ましくは、すべてのヌクレアーゼ活性を含まない。最適結果を得るには、すべての試薬がヌクレアーゼ活性を含まないようにしなければならない。
試薬を十分に混合し、加熱蓋を有する温度ブロック中で２０時間インキュベートする。ハイブリダイゼーションの後、ゴーストプローブおよびレポータープローブの両方に対してアフィニティー試薬を用いてナノレポーターを精製する。
１３．１０．１ 他の選択肢の実施形態：ｓｓＤＮＡおよびＤｅｎｈａｒｄｔ試薬を用いないためのハイブリダイゼーションプロトコル
１〜５００種のナノレポーターおよびゴーストプローブの多重化を用いてこのプロトコルを実施し、好結果を得た。ヒト試薬（ナノレポーターおよびゴーストプローブ）を用いて行われるハイブリダイゼーションからｓｓＤＮＡおよびＤｅｎｈａｒｄｔ試薬を省略しても、ｓｓＤＮＡおよびＤｅｎｈａｒｄｔを含むハイブリダイゼーションと比較した場合、マウス全ＲＮＡとのクロスハイブリダイゼーションにまったく影響を及ぼさなかった。そのほか、ｓｓＤＮＡおよびＤｅｎｈａｒｄｔ試薬を省略しても、バックグラウンドシグナルの増大を生じない（陰性ハイブリダイゼーション対照を基準にして）。最後に、ｓｓＤＮＡおよびＤｅｎｈａｒｄｔ試薬の存在下または不在下でハイブリダイズされた内在性遺伝子のシグナルの有意な損失（または増大）は存在しない（５０９種の遺伝子、Ｒ２値＝０．９９８）。
１３．１０．２ 他の選択肢の実施形態：断片化細胞ｍＲＮＡ用のハイブリダイゼーション条件
熱的プロトコルおよびカチオン触媒プロトコルの両方を用いて細胞ＲＮＡの断片化を達成した。１００〜７００ｂｐ（平均で）の断片長さが得られるようにこれらのプロトコルをデザインした。熱的断片化：ＲＮＡｓｅを含まない水中に全ＲＮＡサンプルを２００ｎｇ／μｌになるように希釈する。加熱蓋を備えた温度ブロック中でサンプルを９５℃に加熱する。サンプルを氷上に配置することにより断片化を停止する。ただちに使用するかまたは使用時まで−８０℃で貯蔵する。製造業者のプロトコル（Ambion）に変更を加えたカチオン触媒反応による断片化。ＲＮＡｓｅを含まない水を用いてＲＮＡサンプルの体積を９μｌにする。全ＲＮＡの最終濃度は、０．２〜２μｇ／ｍｌでなければならない。１μｌの１０×断片化緩衝液（Ambion １０×断片化緩衝液）を添加する。温度ブロック中７０℃で５分間インキュベートする。時間をより長くすれば、平均の断片サイズは小さくなるであろう。１μｌ ２００ｍＭ ＥＤＴＡを添加することにより反応を停止させる。ただちに使用するかまたは使用時まで−８０℃で貯蔵する。
次の変更を加えた以外は本明細書に記載されるように、断片化ＲＮＡサンプルをハイブリダイズさせる：ｉ）ＳＳＰＥのｐＨを６．５に低下させる、およびｉｉ）反応時間を６時間に減少させる（レポータープローブおよびゴーストプローブの濃度が２００ｐＭであるハイブリダイゼーション反応に対して）。
１３．１１ ナノレポーター−標的複合体の精製
全レポータープローブ濃度が１ｎＭ超である場合、ポストハイブリダイゼーション精製が好ましい。精製は、非特異的結合を有意に減少させ、より高いレポーター濃度およびゴーストプローブ濃度でスライドへの特異的結合効率を増大させる。以上に提供される実施例では、単一のＦ−ビーズ精製が記載されている（ハイブリダイズされた複合体をゴーストプローブ末端から精製する）。以下の実施例９に記載されるように、ハイブリダイゼーション複合体をレポーターの５’末端から精製して過剰のハイブリダイズされていないゴーストプローブを効果的に除去する後続のＧビーズ精製を介して、高いゴーストプローブ濃度（＞５ｎＭの全量）で最適結果が得られる。精製の好ましい順序は、Ｆ−ビーズ、次にＧビーズであるが、順序を逆にすることが可能であり、それに従ってプロトコルを最適化することが可能である。これらのアフィニティー精製に使用される正確な配列は、おそらく、変更可能であり、技術の他の選択肢の実施形態で最適化可能である。これらのアフィニティー精製工程および試薬は、一般的には、核酸に基づくものであるが、理論上は、互いに特異的結合を呈し、かつ相互作用が破壊されて開放されるように化学的処理または結合条件の変更を行うことにより放出されうる任意の結合ペアでありうる。たとえば、抗体／抗原ペア、タンパク質／金属相互作用、またはリガンド／レセプター相互作用など。
精製の一例を以下に提供する。
ハイブリダイゼーションの終了後、ハイブリダイゼーションサンプルの塩（３０μｌ、開始時５×ＳＳＰＥ＝８２５ｍＭ Ｎａ＋）を約１×ＳＳＰＥの最終濃度に調整する。希釈サンプルを３０μｌ Ｆ−フックＭｙＯｎｅ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｆ−ＭＯＤＢ）に添加し、回転させながら室温で１５分間に結合させる。ビーズをマグネットで固定し、上清を除去する。回転させながら室温で１５分間にわたり１５０μｌ ０．１ｘＳＳＰＥ＋０．１％Ｔｗｅｅｎを用いてビーズを２回洗浄し、廃棄する。精製されたレポーターを、回転させながら４５℃で３０μｌ ０．１×ＳＳＰＥ中に１５分間溶出させる。この時点では、ハイブリダイズされたレポーターは、汚染性のハイブリダイズされていないレポーターから精製される。溶出液は、依然として、ストレプトアビジン被覆スライド上のビオチン結合部位に対してレポーターと競合する汚染性のハイブリダイズされていないゴーストプローブを含有している。３０μｌを１３０μｌの１×ＳＳＰＥ＋０．１％Ｔｗｅｅｎに添加し、塩濃度を増大させる。次に、サンプル（１５０μｌ）を３０μｌのＧ−ＭＯＤＢに充填し、室温で１５分間結合させる。上清を廃棄し、回転させながら室温で１５０μｌ ０．１×ＳＳＰＥ＋０．１％Ｔｗｅｅｎを用いてビーズを１５分間洗浄する。洗液を廃棄し、完全に精製されたレポーターを、回転させながら４５℃で２５μｌ ０．１×ＳＳＰＥを用いて１５分間溶出させる。この時点では、ゴーストプローブ（抗Ｆ配列を含有する）とレポーター（抗Ｇ配列を含有する）との両方にハイブリダイズされた標的分子だけが溶液中に残存するであろう。
１３．１２ ナノレポーター−標的複合体の固定および伸長および画像化
伸長された複合体のスライドへの結合および固定は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用して達成可能である。他の選択肢の実施形態では、固定および伸長は、他の相互作用ペアを用いて達成される。ただし、２つのうちの一方は、スライド上に固定され、他方は、ゴーストプローブまたはレポーターのいずれかに結合される。電気泳動を利用して伸長を達成する必要はなく、機械的に実施可能である。結合前、サンプルへのビス−トリスプロパンの添加は必要でない。技術は、異なる標識モノマーを画像処理により分離しうるかぎり、本明細書中に例示された特定の標識モノマーの使用に限定されるものではない。
固定および伸長のプロトコルの一例を以下に提供する。
精製後、ハイブリダイゼーション生成物をマイクロ流体デバイスの開放ウェル中に直接充填する。液体は、毛管作用によりマイクロ流体チャネル中に吸引され、ハイブリダイズされた分子は、ビオチン化ゴーストプローブを介してストレプトアビジン被覆スライドに結合する。次に、反応混合物をチャネル中に反復して通して結合効率を増大させるために、チャネルの長手方向に垂直な軸に沿って交互方向で間欠的にマイクロ流体デバイスを傾斜させる。
ハイブリダイゼーション反応系の結合後、ある角度でデバイスを傾斜させることにより、チャネルを１×ＴＡＥで５分間洗浄する。次に、ウェル（我々の現用の形状では３０マイクロリットル）中に挿入された白金電極に接触させるのに十分なレベルまで、新しいＴＡＥを各ウェルに添加する。次に、マイクロ流体チャネルにより連結された２つのウェル間に２００Ｖの電位を印加することにより、レポーターを伸長させる。チャネル内のいかなる残存する汚染性の未結合レポーター分子をも除去するためにあらかじめ１分間電気泳動させた後、１×ＴＡＥ中の０．５μＭ Ｇ−フックの溶液をカソードウェルに添加する（６０マイクロリットルのこの溶液）。電位によりＧ−フックはアノードウェルの方向にチャネルを通って吸引される。チャネルを通過する際、フックは、表面に結合され伸長されたレポーターの自由端上の遊離Ｇ−タグ配列にハイブリダイズする。次に、表面上のストレプトアビジンは、Ｇ−フック上のビオチンに結合し、自由端を固定する。電位を除去した時、レポーターは、画像化に供されるべく伸長状態を保持する。
１４． 実施例９：ナノ鎖レポーターシステムを用いるＡ５４９細胞由来の１００ｎｇ全ＲＮＡへの５０９種の細胞遺伝子のハイブリダイゼーション
１４．１ ハイブリダイゼーション反応
５０９種の内在性細胞遺伝子の検出を単一の多重化ハイブリダイゼーション反応で行った。細胞１個あたり約０．１、０．５、１、５、１０、５０、および１００コピーに対応する８種の非ヒト対照配列を各反応系にスパイクした。同様に、標的を用いずに２種のレポーターをスパイクした（陰性対照）。また、ポストハイブリダイゼーション精製プロセスに対する陽性（３）および陰性（１）の対照として機能する４種のレポーターを添加した。また、全ナノ鎖レポーターライブラリーを含有するが細胞ＲＮＡが欠如した一連の陰性対照ハイブリダイゼーションを行った。
各サンプルを三重反復試験方式でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション試薬の最終濃度は、次のとおりであった：２０．８ｎＭ全ナノレポーター（それぞれ４０ｐＭで５２１種の個別ナノレポーター）、１０３ｎＭ全ゴーストプローブ（５１７種の個別ゴーストプローブ＠各２００ｐＭ）、５×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．５）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、１００ｎｇ／μｌ剪断サケ精子ＤＮＡ、０．１％トゥイーン２０、５０ｆＭ Ｓ１１スパイク標的ＤＮＡ、１０ｆＭ Ｓ１０スパイク標的ＤＮＡ、５ｆＭ Ｓ９スパイク標的ＤＮＡ、１ｆＭ Ｓ８スパイク標的ＤＮＡ、０．５ｆＭ Ｓ７スパイク標的ＤＮＡ、０．１ｆＭ Ｓ６スパイク標的ＤＮＡ。Ｓ３およびＳ４を陰性対照として添加した。２つの異なる条件下でＡ５４９肺上皮細胞からＲＮＡを取得した。１回のハイブリダイゼーションあたりの全ＲＮＡの最終濃度は、３３ｎｇ／μｌであった。陰性対照ハイブリダイゼーションには全ＲＮＡを添加しなかった。反応の最終量は、３０μｌであった。試薬を混合し、加熱蓋を備えたサーモサイクラーブロック中６５℃で２０時間インキュベートした。
Figure 0005537034
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１４．２ ポストハイブリダイゼーション精製
磁気ビーズ（Ｆ−ビーズ）に結合されたゴーストプローブに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーション反応系を精製し、ハイブリダイズされていないレポーターを除去した。ハイブリダイゼーション反応系を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＥ中に５倍希釈して最終塩濃度を１×ＳＳＰＥにした。次に、希釈されたハイブリダイゼーション溶液を１００μｌのＦ−ビーズ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中）に添加し、連続回転させながら室温でビーズに３０分間結合させた。次に、１５０μｌの０．１×ＳＳＰＥ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中でビーズを３回洗浄し、１００μｌの０．１×ＳＳＰＥ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中４５℃で１５分間溶出させた。
Ｆ−ビーズ溶出後、Ｇビーズを用いて、ハイブリダイズされた複合体の反対側末端からサンプルを精製した。５０μｌの３×ＳＳＰＥ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を添加することにより溶出液を１×ＳＳＰＥの最終濃度にし、回転させながら室温で３０μｌのＧビーズ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中）に１５分間結合させた。次に、ビーズを以上のように洗浄し、３０μｌの０．１×ＳＳＰＥ／Ｔｗｅｅｎ−２０中に溶出させ、以下に記載されるように結合用として調製した。
１４．３ 結合、伸長、および固定
０．１μＭ ＴｅｔｒａｓｐｅｃＴＭ蛍光マイクロスフェア（製品番号T7279、Molecular Probes）の１／５０００希釈液１μｌを添加することにより、結合用としてサンプルを調製した。サンプルをナノ鎖流体デバイスに充填し、１５分間にわたりデバイスを４５°傾斜させることにより、ストレプトアビジンで被覆されたＡｃｃｅｌｒ８ Ｏｐｔｉｃｈｅｍ（登録商標）スライド（製品番号TB0200）に結合させ、合計４回反復した。充填後、９０μｌの１×ＴＡＥでスライド表面を１回洗浄した。洗浄緩衝液を除去した後、４０μｌのＴＡＥを各ウェルに添加することにより、電気伸長用としてサンプルを調製する。流体チャネルを横切って２００Ｖを印加することにより、結合された複合体を伸長させた。１分後、電圧の印加を５分間継続しながら、負荷電電極の入ったウェルに６０μｌの５００ｎＭのＧ−フックオリゴ溶液を添加することにより、サンプルを伸長位置で固定した。固定後、ＴＡＥ溶液を除去し、画像化のために光漂白防止試薬で置き換えた。
１４．４ 画像化
メタルハライド光源（Ｘ−ｃｉｔｅ １２０、Exfo Corporation）と倍率６０倍の油浸レンズ（１．４ ＮＡ Ｐｌａｎ Ａｐｏ ＶＣ、Nikon）とを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００Ｅを用いて、スライドを画像化した。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Universal Imaging Corporation）または特注品のソフトウェアのいずれかの制御下でＯｒｃａ Ａｇ ＣＣＤカメラ（Hamamatsu）を用いて、各視野ごとに異なる励起波長（４８０、５４５、５８０、および６２２）で４つの画像を取得した。特注品の画像処理ソフトウェアを用いて画像を処理した。
１４．５ データ解析
特注品のソフトウェアを用いて処理画像から生データを抽出した。各サンプル中の対照スパイクの平均カウント数を基準にしてデータを規格化した。システムにより遺伝子が「検出」されたかを判定するために、スチューデントのｔ検定を用いて、各遺伝子ごとにＲＮＡを含有するハイブリダイゼーションから得られたカウント数を２つの陰性対照の平均カウント数と比較した。検出された遺伝子の数は、サンプル＃１および＃２で、それぞれ、４４１種（８７％）および４４５種（８８％）であった。
散布図（図は、５０９種のすべての遺伝子について各陽性サンプル（ｎ＝３）から得られたｌｏｇ２シグナル値の規格化平均値を示している。サンプル＃１に対してサンプル＃２のシグナル値のｔ検定を行うことにより、２つのサンプルで有意に異なる遺伝子を同定した。以下の図中、実線は、サンプル＃１に対して２倍にアップレギュレートされる閾値（黒色の線）および２倍にダウンレギュレートされる閾値（灰色の線）を示している。有意な変化倍率（ｐ値＜０．０５）を有する遺伝子は、中塗りの黒の菱形で示されている。変化倍率のｐ値がこの閾値を超えた遺伝子は、中抜きの黒の正方形で示されている。
１５． 実施例１０：小さいスポットの検出
以上に述べたように、ナノレポータースカフォールド領域の標識結合領域は、１０ｎｍ〜１０，０００ｎｍの間の任意の長さを有するが、好ましくは、標準的光学素子で検出可能な最小スポット（約３００ｎｍである）にほとんど一致する。異なる色（分光的に識別可能）のスポットは、同一の色のスポットよりも狭い間隔で空間的に解像可能である。同一の色の２つのスポット間に異なる色の１、２、３、もしくは４つのスポットを割り込ませて、しかもすべてのスポットをスペクトル的におよび空間的に解像することが可能である。同一の色の２つのスポット間の距離を有意に減少させることも可能である。
空間的解像の限界、すなわち、同一の色のわずかに離間したスポットを識別する限界は、多くの場合、ハードリミットすなわちレイリー基準であると考えられる（Inoue, S., Spring, Video Microscopy (Plenum Press, 1997), p 30.）。こうした限界を超えて動作させる多くの技術が存在する。これらは、さまざまな画像化技術および／または画像処理技術を含む。画像化の側面では、構造化光照射は、互いにより近接して配置された同一の色のスポットを解像する一方法である。５０ｎｍが実証されているが、理論的には、構造化光照射による解像には限界がない（Gustafsson, 2005, Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 102:13081-13086）。画像処理の側面では、混合モデリングは、一般に認められる限界を突破するのに有効な技術である（Thomann et al., 2002, J. Microsc. 211:230-248）。これらの技術を組み合わせれば、５０ｎｍ未満の標識結合領域に対応するより小さいスポットを有する劇的に小さいナノレポーターが利用可能になる。
こうしたより小さいスポット間隔にすれば、絡合いの閾値（絡合いの閾値の解説については、以上の実施例９（第１４節に記載）を参照されたい）を超える前に、劇的により短くかつより安定なレポーター、より多くのコード、さらにはより高い多重化度が利用可能になる。
スポットをきわめて小さくすることおよびレポーターをきわめて短くすることの代償は、シグナルの減少および走査時間の延長であろう。しかしながら、より高輝度の光源やより高効率のＣＣＤのような他の技術的進歩があれば、走査時間の増大が相殺され、これらの方法が妥当なものになろう。
１６． 引用文献
本明細書に引用されている参考文献はすべて、あたかも個々の刊行物または特許または特許出願が具体的かつ個別的に明示されて参照によりその全体があらゆる目的で組み入れられたのと同一程度まで、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられるものとする。
当業者には自明なことであろうが、本発明に対してその精神および範囲から逸脱することなく多くの修正および変更を加えることが可能である。本明細書に記載の特定の実施形態は、単なる例として提供されたものにすぎず、本発明は、特許請求の範囲（そのような特許請求の範囲の権利の及ぶ等価物の全範囲を包含する）によってのみ限定されるものとする。
図１Ａは、２つの八位置ナノレポーター成分を用いる十六位置ナノレポーターコードを有するデュアルナノレポーターを示している。図１Ｂは、１つの八位置ナノレポーター成分と１つの単一位置ナノレポーター成分とを用いる九位置ナノレポーターコードを有するデュアルナノレポーターを示している。図１Ｃは、１つのゴーストプローブと１つの八位置ナノレポーター成分とを用いる八位置ナノレポーターコードを有するデュアルナノレポーターを示している。図１Ｄは、八位置ナノレポーターコードを有するシングルナノレポーターを示している。図１Ａ〜１Ｄにおいて、星形（矢印で示される）は、画像化を目的として、ナノレポーターの精製またはナノレポーター（もしくはナノレポーター−標的分子複合体）の固定に使用しうるアフィニティータグを描いたものである。図１Ａ〜１Ｄ中の番号付き領域は、個別標識結合領域を意味する。図１Ａの位置１２以外はすべて、灰色、白色、ハッチング付き、またはストライプ入りの「太陽」図として示される４タイプの標識モノマーのうちの１つで標識される。図１Ａの位置１２は、非標識化「ダークスポット」である。図１Ｅおよび１Ｆは、それぞれ、図１Ｂおよび１Ｄのナノレポーターに対する変形形態を表しており、ナノレポーターが結合される標的分子は、ビオチン部分（小さいアステリスクとして示される）、たとえば、標的核酸にランダムに組み込まれたビオチン修飾ヌクレオチドを含む。ナノレポーター自体は、場合により、アフィニティータグを含む（図示せず）。 図１Ａは、２つの八位置ナノレポーター成分を用いる十六位置ナノレポーターコードを有するデュアルナノレポーターを示している。図１Ｂは、１つの八位置ナノレポーター成分と１つの単一位置ナノレポーター成分とを用いる九位置ナノレポーターコードを有するデュアルナノレポーターを示している。図１Ｃは、１つのゴーストプローブと１つの八位置ナノレポーター成分とを用いる八位置ナノレポーターコードを有するデュアルナノレポーターを示している。図１Ｄは、八位置ナノレポーターコードを有するシングルナノレポーターを示している。図１Ａ〜１Ｄにおいて、星形（矢印で示される）は、画像化を目的として、ナノレポーターの精製またはナノレポーター（もしくはナノレポーター−標的分子複合体）の固定に使用しうるアフィニティータグを描いたものである。図１Ａ〜１Ｄ中の番号付き領域は、個別標識結合領域を意味する。図１Ａの位置１２以外はすべて、灰色、白色、ハッチング付き、またはストライプ入りの「太陽」図として示される４タイプの標識モノマーのうちの１つで標識される。図１Ａの位置１２は、非標識化「ダークスポット」である。図１Ｅおよび１Ｆは、それぞれ、図１Ｂおよび１Ｄのナノレポーターに対する変形形態を表しており、ナノレポーターが結合される標的分子は、ビオチン部分（小さいアステリスクとして示される）、たとえば、標的核酸にランダムに組み込まれたビオチン修飾ヌクレオチドを含む。ナノレポーター自体は、場合により、アフィニティータグを含む（図示せず）。 図２Ａは、長手方向に配設されたパッチユニットおよび対応するスプリットフラップを有するスカフォールドを含有するナノレポーターの標識ユニットの説明図を示している。図２Ｂは、単一のパッチペアおよびその対応するフラップの成分を示しており、１：ナノレポータースカフォールド（たとえば、Ｍ１３一本鎖ＤＮＡ）の一部；２：パッチペア；３：スプリットフラップペア；および４：スプリットフラップにハイブリダイズされた標識化オリゴヌクレオチド（それぞれに標識モノマーが組み込まれている）が含まれる。図２Ｃは、４つの「スポット」を有するナノレポーターを示しており、各スポットは、９５〜１００ヌクレオチドのスプリットフラップペアにそれぞれ結合された６０〜６５ヌクレオチドの９つのパッチペアを含有するようにデザインされている。各スプリットフラップペアは、単一の標識モノマーにそれぞれ結合された１２個のオリゴヌクレオチドに対する結合部位を有していた。したがって、各スポットは、１０８個の標識モノマーに対する結合部位を有していた。 パッチがＲＮＡセグメントであるナノレポーターは、レジスターあり（図３Ｂ）およびレジスターなし（図３Ａ）で使用可能である。図３Ａおよび３Ｂはいずれも、（１）ナノレポータースカフォールド（黒色の太線）、（２）それに結合された８個のＲＮＡセグメント（灰色の太線１〜８）、（３）標的特異的配列（点線「Ｔ」）、および（４）ナノレポータースカフォールドに部分的に相補的かつ標的特異的配列に部分的に相補的なオリゴヌクレオチド（チェック柄の線「０」）を示している。このオリゴヌクレオチドは、「ライゲーター」オリゴヌクレオチドと呼ばれる。図３Ａでは、１つのレジスターのみ、すなわち、１つおきのＲＮＡセグメントが標識される。第２のレジスター位置は、コード中の一連の位置が同一の「色」すなわち分光的に識別不可能であるナノレポーターコードの生成を可能にする「スペーサー」として機能する。図３Ｂでは、両方のレジスター、すなわち、介在スペーサーを有していない隣接ＲＮＡセグメントが、同一の「色」の最近接部分をもたないように標識される。 図４は、標的分子にハイブリダイズされたデュアルナノレポーターの画像である。ここでは、両方のレジスターが標識される。ナノレポーターは、３つの異なる色、すなわち、Ａｌｅｘａ４８８、Ｃｙ３、およびＡｌｅｘａ６４７（それぞれ、１、２、および３と記す）で標識される。左側のグループは、デュアルナノレポーターの一方のプローブを示しており、右側のグループは、デュアルナノレポーターの他方のプローブを示している。色１、２、および３は、それぞれ、異なるチャネルで得られたものであり、スポットの並びとして観察される第１および第２のレジスターは、各レジスターを個別に示すことができるように数ピクセルだけ上にずらした。 この図は、図４に示されるデュアルナノレポーターの種々の成分を示している。図５Ａは、Ｃｙ３（縦ストライプ入りの丸として左のカラムに描かれて図５Ｂに示される）およびＡｌｅｘａ６４７（対角ストライプ入りの丸として図５Ｃに示される）から分光的に識別可能な１つの色（ここでは、白丸として左のカラムに描かれるＡｌｅｘａ４８８）を示している。それぞれから得られた画像を重ね合わせて図５Ｄを作成した。 図６Ａは、図６Ｂおよび６Ｃに示される実験の概略図である。この場合、星形は、伸長前に複合体の一端を表面に結合させるために使用したビオチンを表している。図６Ｂおよび６Ｃは、Ｓ２−Ａゴーストプローブ、Ｓ２−Ｂ標識化ナノレポーター、およびＳ２標的ＤＮＡ（図６Ｂ）またはＳ２標的ＲＮＡ（図６Ｃ）をハイブリダイズさせた実験で得られた画像を示している。図６Ｅは、図６Ｂで得られたナノレポーター複合体の拡大図を示しており、各複合体は、Ｓ２−Ａゴーストプローブ、Ｓ２−Ｂ標識化ナノレポーター、およびＳ２標的ＤＮＡを含有する。図６Ｄは、Ｓ２−Ａゴーストプローブ、Ｓ２−Ｂ標識化ナノレポーターはハイブリダイズさせたがＳ２標的ＲＮＡはハイブリダイズさせなかった陰性対照実験の画像を示している。 図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、および７Ｄは、ナノレポータースカフォールド上のパッチの異なる入替え形態を示しており、図７Ｅおよび７Ｆは、ナノレポータースカフォールド上のスプリットフラップの異なる入替え形態を示しており、場合により、図７Ｇのように１つ以上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。図７Ａ〜Ｇ中、αは、５’もしくは３’分子または分子の５’もしくは３’末端を表し、βは、対応する３’もしくは５’分子または分子の３’もしくは５’末端を表す。 図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、および７Ｄは、ナノレポータースカフォールド上のパッチの異なる入替え形態を示しており、図７Ｅおよび７Ｆは、ナノレポータースカフォールド上のスプリットフラップの異なる入替え形態を示しており、場合により、図７Ｇのように１つ以上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。図７Ａ〜Ｇ中、αは、５’もしくは３’分子または分子の５’もしくは３’末端を表し、βは、対応する３’もしくは５’分子または分子の３’もしくは５’末端を表す。 図８は、ナノレポータースカフォールドとして使用するために一本鎖Ｍ１３ファージを線状化するスキームを示している。環状Ｍ１３ファージを５倍過剰のＢａｍＨ１カッターオリゴヌクレオチド（ハッチング付きライン）にアニールし（１）、得られた部分的に二本鎖のＭ１３を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１で消化することにより（２）、ＢａｍＨ１カッターオリゴヌクレオチドが依然として結合されている線状化Ｍ１３を得る（３）。このＭ１３−オリゴヌクレオチド複合体をＢａｍＨ１カッターオリゴヌクレオチドに相補的な過剰のオリゴヌクレオチド（「抗ＢａｍＨ１オリゴヌクレオチド」）（灰色の線）の存在下で加熱する（４）。ＢａｍＨ１カッターオリゴヌクレオチドは、過剰の抗ＢａｍＨ１オリゴヌクレオチドにアニールし、Ｍ１３分子は、たとえばサイズ排除カラムを用いて、オリゴヌクレオチドから精製され、Ｍ１３スカフォールドを生成する。 図９Ａ〜９Ｂは、それぞれの末端にアフィニティータグＡ１およびＡ２を有する標識化ナノレポーターを示している。図９中、標識化ナノレポーターは、固定化親和性パートナーへのＡ１の結合を介して固定される。Ａ２に対するアフィニティー結合パートナーの不在下では、ナノレポーターのＡ２末端は溶液中に残存するが（図９Ａ）、アフィニティー結合パートナー（Ａ２’）の存在下では、ナノレポーターのＡ２末端もまた固定される（図９Ｂ）。固定時、ナノレポーターコードの検出が可能になるように標識結合領域を分離するために、たとえば電気伸長により、図９Ｂに示されようにナノレポーターの伸長すなわち「引伸し」を行うことが可能である。 図１０Ａは、単一のアフィニティータグＡ１を含有する標識化ナノレポーターを示している。図１０Ｂに示されるように、Ａ２を含有する分子にナノレポーターを直接結合させることにより、他のアフィニティータグＡ２をナノレポーターに結合させることが可能である（たとえば、ナノレポーターが核酸であるかまたは核酸を含む場合、Ａ２が結合される他の核酸で直接ハイブリダイズすることが可能である）。他の選択肢として、図１０Ｃに描かれる架橋核酸（「Ｘ」）のような架橋分子を介して、第２のアフィニティータグＡ２を標識化ナノレポーターに結合させることが可能である。 図１１Ａ〜１１Ｂは、一端にアフィニティータグＡ１を有する標識化（核酸型）ナノレポーターを示している。図１１中、標識化ナノレポーターは、固定化親和性パートナーへのＡ１の結合を介して固定される。ナノレポーターの他端は、溶液中に存在するが（図１１Ａ）、ナノレポーターの固定に使用される他のアフィニティータグ（Ａ２）を含有する相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより固定可能である（図１１Ｂ）。Ａ１およびＡ２は、たとえば、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆された表面上に固定するために、同一のビオチンでありうる。Ａ１の固定時、ナノレポーターコードの検出が可能になるように標識結合領域を分離するために、たとえば電気伸長により、図１１に示されようにナノレポーターの伸長すなわち「引伸し」を行うことが可能である。場合により、ナノレポーターが引き伸ばされた状態にある間、Ａ２を導入し、Ａ２に相補的なナノレポーターの末端を表面に結合させる。 図１２Ａは、固定された第１の部分Ｆ１を含むナノレポーターの説明図を提供し；図１２Ｂは、固定された第１の部分Ｆ１と固定された第２の部分Ｆ２とを含む電場中で伸長されたナノレポーターの説明図を提供する（ただし、Ｆ２は、分子Ｆ３を有する複合体を介して固定される）。 図１３Ａは、伸長型ナノレポーターを固定するための三元複合体の説明図を提供し；図１３Ｂは、伸長型ナノレポーターを固定するための二元複合体の説明図を提供し；そして図１３Ｃは、伸長型ナノレポーターを固定するための不完全な複合体の説明図を提供する。 図１４Ａは、固定された第１の部分Ｆ１を含むナノレポーターの説明図を提供し；図１４Ｂは、第１の部分Ｆ１で固定されかつＦ２との複合体を介して第２の部分で固定された伸長型ナノレポーターの説明図を提供し；図１４Ｃは、ビオチンを介してアビジン表面に固定された第１の部分を含むナノレポーターの説明図を提供し；そして図１４Ｄは、第１の部分で固定されかつアビジン表面へのビオチンの選択的結合を介して第２の部分で固定された伸長型ナノレポーターの説明図を提供する。 図１４Ａは、固定された第１の部分Ｆ１を含むナノレポーターの説明図を提供し；図１４Ｂは、第１の部分Ｆ１で固定されかつＦ２との複合体を介して第２の部分で固定された伸長型ナノレポーターの説明図を提供し；図１４Ｃは、ビオチンを介してアビジン表面に固定された第１の部分を含むナノレポーターの説明図を提供し；そして図１４Ｄは、第１の部分で固定されかつアビジン表面へのビオチンの選択的結合を介して第２の部分で固定された伸長型ナノレポーターの説明図を提供する。 図１５Ａは、マイクロ流体デバイス中におけるＤＮＡ分子の一方の末端の固定を示している。 図１５Ｂは、電場中におけるＤＮＡの伸長を示している。 図１５Ｃは、伸長型ＤＮＡ分子の第２の末端の選択的固定を示している。 図１６は、本発明に係る方法により選択的に固定された伸長型ナノレポーターの画像を提供する。 図１７は、９００ｂｐおよび１１００ｂｐの標識結合領域サイズのナノレポーターに関して、標識結合領域の数と絡合い閾値の計算値との関係を示している。 図１８は、以下の実施例９（第１４節）に記載のナノレポーター多重アッセイで発現の測定が行われた５０９種のすべての遺伝子に関して、各陽性サンプル（ｎ＝３）から得られたｌｏｇ２シグナル値の規格化平均値を示す散布図である。

Claims (30)

  1. 第１のプローブ及び第２のプローブを含むプローブペアであって、
    （a）第１のプローブが、
    （i）40％〜60％のG/C含有率を有し、且つ4〜25塩基毎に規則的反復塩基を有する300〜1500ヌクレオチド長の第１のDNA配列を含む第１の標識結合領域であって、第１の標識結合領域にハイブリダイズする4〜25塩基毎に規則的反復塩基を有する第１のRNA分子において、第１のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが前記規則的反復塩基で結合される、前記第１の標識結合領域；
    （ii）40％〜60％のG/C含有率を有し、且つ4〜25塩基毎に規則的反復塩基を有する300〜1500ヌクレオチド長の第２のDNA配列を含む第２の標識結合領域(第１の標識結合領域とオーバーラップしない)であって、第２の標識結合領域にハイブリダイズする4〜25塩基毎に規則的反復塩基を有する第２のRNA分子において、第２のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが前記規則的反復塩基で結合される、前記第２の標識結合領域；及び、
    （iii）第１の標的特異的配列、
    を含み、
    (b)第２のプローブが、
    （i）第２の標的特異的配列、
    を含み、
    第１の標的特異的配列及び第２の標的特異的配列が、同一の標的分子の異なる領域に結合し、
    該標的分子が核酸であり、
    第１のシグナル及び第２のシグナルが分光的に識別可能であり、且つ、
    該プローブペアがその標的分子に結合された時、第１及び第２のシグナルの同一性並びにそれらの互いの相対位置が、該標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する、
    上記プローブペア。
  2. 第１のプローブ及び第２のプローブを含むプローブペアであって、
    （a）第１のプローブが、
    （i）40％〜60％のG/C含有率を有し、且つ4〜25塩基毎に規則的反復塩基を有する300〜1500ヌクレオチド長の第１のDNA配列を含む第１の標識結合領域であって、第１の標識結合領域にハイブリダイズする4〜25塩基毎に規則的反復塩基を有する第１のDNA分子において、第１のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが前記規則的反復塩基で結合される、前記第１の標識結合領域；
    （ii）40％〜60％のG/C含有率を有し、且つ4〜25塩基毎に規則的反復塩基を有する300〜1500ヌクレオチド長の第２のDNA配列を含む第２の標識結合領域(第１の標識結合領域とオーバーラップしない)であって、第２の標識結合領域にハイブリダイズする4〜25塩基毎に規則的反復塩基を有する第２のDNA分子において、第２のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが前記規則的反復塩基で結合される、前記第２の標識結合領域；及び、
    （iii）第１の標的特異的配列、
    を含み、
    (b)第２のプローブが、
    （i）第２の標的特異的配列、
    を含み、
    第１の標的特異的配列及び第２の標的特異的配列が、同一の標的分子の異なる領域に結合し、
    該標的分子が核酸であり、
    第１のシグナル及び第２のシグナルが分光的に識別可能であり、且つ、
    該プローブペアがその標的分子に結合された時、第１及び第２のシグナルの同一性並びにそれらの互いの相対位置が、該標的分子を同定するコードの少なくとも一部を構成する、
    上記プローブペア。
  3. 第１及び第２の標識結合領域が所定のヌクレオチド配列である、請求項１又は２に記載のプローブペア。
  4. 第１のプローブが少なくとも4つの標識結合領域、少なくとも6つの標識結合領域又は少なくとも8つの標識結合領域を含む、請求項１又は２に記載のプローブペア。
  5. 前記DNA配列が6〜15塩基毎に、又は8〜12塩基毎に規則的反復塩基を含む、請求項１又は２に記載のプローブペア。
  6. 前記DNA配列における前記規則的反復塩基がチミンである、請求項１又は２に記載のプローブペア。
  7. 前記コードが、第１及び第２のシグナルの同一性と、それらの互いの相対位置と、前記シグナルの少なくとも1つから生じるスポットのサイズとを含む、請求項１又は２に記載のプローブペア。
  8. 第１のシグナル及び第２のシグナルが空間的に識別可能である、請求項１又は２に記載のプローブペア。
  9. 第１の標識結合領域に結合された各標識モノマーが同一の波長の光を放出し、この光が第１のシグナルを構成し、且つ第２の標識結合領域に結合された各標識モノマーが同一の波長の光を放出し、この光が第２のシグナルを構成する、請求項１又は２に記載のプローブペア。
  10. 第１のシグナル及び第２のシグナルの少なくとも一方が、複数の異なる波長の光を含む、請求項１又は２に記載のプローブペア。
  11. 複数の第１のRNA分子が第１の標識結合領域にハイブリダイズされ、第１のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが該複数の第１のRNA分子に結合され；且つ複数の第２のRNA分子が第２の標識結合領域にハイブリダイズされ、第２のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが該複数の第２のRNA分子に結合される、請求項１に記載のプローブペア。
  12. 前記RNA分子が6〜15塩基毎に、又は8〜12塩基毎に規則的反復塩基を含む、請求項１に記載のプローブペア。
  13. 前記RNA分子における前記規則的反復塩基がウラシルである、請求項１２に記載のプローブペア。
  14. 前記RNA分子における前記規則的反復塩基がアミノアリル修飾ウラシルである、請求項１２に記載のプローブペア。
  15. 前記1つ以上の標識モノマーが前記RNA分子に共有結合される、請求項１に記載のプローブペア。
  16. 前記RNA分子が1つ以上の非共有結合架橋核酸を介してそれぞれの結合領域にハイブリダイズされる、請求項１に記載のプローブペア。
  17. 第１及び第２標的特異的配列が前記標識モノマーのいずれか1つ以上によって標識されない、請求項１又は２に記載のプローブペア。
  18. 第２のプローブが標識結合領域及び光を放出する1つ以上の標識モノマーを含まない、請求項１又は２に記載のプローブペア。
  19. 第２のプローブが、40％〜60％のG/C含有率を有し、且つ4〜25塩基毎に規則的反復塩基を有する300〜1500ヌクレオチド長の第３のDNA配列を含む第３の標識結合領域をさらに含み、第３の標識結合領域にハイブリダイズする4〜25塩基毎に規則的反復塩基を有する第３のRNA分子において、第３のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが前記規則的反復塩基で結合され、且つ第１、第２及び第３のシグナルが空間的に、又は分光的に識別可能である、請求項１に記載のプローブペア。
  20. 第３の標識結合領域が所定のヌクレオチド配列である、請求項１９に記載のプローブペア。
  21. プローブペアがその標的分子に結合された時、前記コードが第１のシグナル、第２のシグナル及び第３のシグナルの同一性並びにそれらの互いの相対位置を含む、請求項１９に記載のプローブペア。
  22. 第２のプローブが、40％〜60％のG/C含有率を有し、且つ4〜25塩基毎に規則的反復塩基を有する300〜1500ヌクレオチド長の第４のDNA配列を含む第４の標識結合領域(第３の標識結合領域とオーバーラップしない)をさらに含み、第４の標識結合領域にハイブリダイズする4〜25塩基毎に規則的反復塩基を有する第４のRNA分子において、第４のシグナルを構成する光を放出する1つ以上の標識モノマーが前記規則的反復塩基で結合され、且つ第１、第２、第３及び第４のシグナルが空間的に、又は分光的に識別可能である、請求項１９に記載のプローブペア。
  23. 第４の標識結合領域が所定のヌクレオチド配列である、請求項２２に記載のプローブペア。
  24. プローブペアがその標的分子に結合された時、前記コードが第１のシグナル、第２のシグナル、第３のシグナル及び第４のシグナルの同一性並びにそれらの互いの相対位置を含む、請求項２２に記載のプローブペア。
  25. 第１のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のプローブペア。
  26. アフィニティータグが第１のプローブに共有結合される、請求項２５に記載のプローブペア。
  27. 第２のプローブがアフィニティータグをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のプローブペア。
  28. アフィニティータグが第２のプローブに共有結合される、請求項２７に記載のプローブペア。
  29. 生体分子サンプル中の1つ又は複数の標的分子を検出する方法であって、（i）該サンプルを、該標的分子への第１の標的特異的配列及び第２の標的特異的配列の結合を可能にする条件下で請求項１〜２８のいずれか１項に記載のプローブペアに接触させることと、（ii）該標的分子を同定するコードを検出することとを含む、上記方法。
  30. 前記生体分子サンプル中の前記標的分子の量を定量することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
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