JP5297817B2 - オキシントモジュリン誘導体 - Google Patents

Description

本発明は、オキシントモジュリン誘導体、それらの合成、及び糖尿病及び肥満症のような代謝障害の治療のためのそれらの使用に関する。

ホルモンであるオキシントモジュリン（ＯＸＭ、グルカゴン−３７）は、腸及び中枢神経系（ＣＮＳ）におけるプレプログルカゴンプロセシングの翻訳後産物であり、摂食に応じて腸管のＬ−細胞から分泌される。１９８３年に発見されたＯＸＭは、摂食及びエネルギー消費の調節と関係づけられてきた。ラットにおけるＯＸＭの中枢又は末梢投与は、短期間の摂食の減少を、胃内容排出に対する最小の影響と共に引き起す（デイキン（Ｄａｉｋｉｎ）ら著、「エンドクリノロジー」、２００１年、第１４２巻、ｐ４２４４−４２５０、デイキンら著、「エンドクリノロジー」、２００４年、第１４５巻、ｐ．２６８７−２６９５）。ラットにおけるＯＸＭの反復の脳血管内投与は、結果として、ペアフェッドの動物に比較して、核心温度の上昇及び体重増加の減少を生じ、このことはカロリー摂取及びエネルギー消費の双方に対する影響を示唆している（デイキンら著、「アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー、エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム」、２００２年、第２８３巻、Ｅ１１７３−Ｅ１１７７）。

ＯＸＭは、３７アミノ酸のペプチドである。胃酸分泌阻害におけるＯＸＭの効果は、ＳＰ−１として知られる８残基のＣ−末端フラグメントＯＸＭ（３０−３７）により、模倣可能であることが報告されている（カルレス−ボネ（Ｃａｒｌｅｓ−Ｂｏｎｎｅｔ）ら著、「ペプタイズ」、１９９６年、第１７巻、ｐ．５５７−５６１）。ヒトでは、健康な正常体重の被験者におけるＯＸＭの単回の９０分間の静脈内注入が、ハンガースコア及び立食における摂食を〜１９％まで低減した。累積１２時間のカロリー摂取は、何らの嘔気又は食物嗜好性の変化の報告なしに、〜１１％まで低減された（コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．）」、２００３年、第８８巻、ｐ．４６９６−４７０１）。より最近では、肥満の健康なボランティア（ＢＭＩ〜３３）における４週間にわたるＯＸＭの食事前注射は、処置の第１日目に有意なカロリー摂取の低減（〜２５％）をもたらし、それは研究の期間にわたって維持された（４週間後、３５％減少）（ワイン（Ｗｙｎｎｅ）ら著、「ダイアベーツ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）」、２００５年、第５４巻、ｐ．２３９０−２３９５）。処置された被験者では、研究の最後に強い体重減少が観察された（１．９％、プラセボ補正）。ＯＸＭの血漿レベルは、注入研究において観察されたものと同様であった（ピーク濃度〜９５０ｐＭ）。インビボでのＯＸＭの不十分な安定性（血漿ｔ_１／２＜１２分間）により必要とされる比較的高い用量にもかかわらず、何らタキフィラキシーがないこと、及び、軽度で一過性の嘔気の発生率が低いこと（〜３％）は、このホルモンを、ヒューマンバリデーション及び魅力的な耐性プロフィールの双方を備えた数少ない肥満症ターゲットの１つにしている。

ＯＸＭは、非常に短い半減期をもち、細胞表面ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（以降ＤＰ−ＩＶ）により迅速に不活性化される。しかしながら、ＤＰ−ＩＶ阻害剤は、臨床ではウェイトニュートラル（体重に対し中立）であり、生理的なレベルを超えたＯＸＭ（９００−１０００ｐＭ）が、ヒトの体重減少を達成するために必要かもしれないことを示唆している。

オキシントモジュリンは、それ故、糖尿病及び肥満症のような代謝障害の治療剤としての可能性を示す。しかしながら、インビボでのＯＸＭの不十分な安定性の故に、糖尿病及び肥満症のような代謝性疾患の治療に対して、安全かつ有効に投与されうるＯＸＭ誘導体を開発することが必要である。もし、安定性及び薬物動態を改善する部位への結合により修飾された、又はより具体的にはＤＰ−ＩＶ切断に対し耐性を与える修飾により修飾された類似体又は誘導体が開発されるならさらに望ましいであろう。本発明は、ＯＸＭポリペプチド誘導体、及び本明細書に記述された誘導体を投与することによる、肥満症及び糖尿病のような代謝障害の治療又は予防の方法を提供する。

（発明の要旨）
本発明は、式：
Ｈ_ｘＸ_１Ｘ_２ＧＴＦＴＳＤＹＸ_３Ｘ_４ＹＬＤＸ_５Ｘ_６Ｘ_６ＡＸ_７Ｘ_８ＦＶＸ_７ＷＬＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＫＲＮＲＮＮＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４
［式中、Ｈ_ｘは、Ｈｉｓ；イミダゾール−乳酸（ＩｍｉＨ）；デスアミノ−Ｈｉｓ（ΔＮＨ_２−Ｈ）；アセチルＨｉｓ；ピログルタミルＨｉｓ（ＰｙｒＨ）；Ｎ−メチル−Ｈｉｓ（Ｍｅ−Ｈ）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈｉｓ（Ｍｅ_２−Ｈ）；ベンゾイルＨｉｓ（Ｂｚ−Ｈ）；ベンジルＨｉｓ（Ｂｚｌ−Ｈ）；及びＰｈｅからなる群より選択され；
Ｘ_１は、Ｓｅｒ；Ｇｌｙ；Ａｌａ；Ａｒｇ；Ａｓｎ；Ａｓｐ；Ｇｌｕ；Ｇｌｎ；Ｈｉｓ；Ｉｌｅ；Ｌｙｓ；Ｍｅｔ；Ｐｈｅ；Ｐｒｏ；Ｔｈｒ；Ｔｒｐ；Ｔｙｒ；Ｖａｌ；Ｄ−Ａｌａ；Ｄ−Ｓｅｒ；及びα−アミノイソ酪酸からなる群より選択され；
Ｘ_２は、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ又はＬ−ノルロイシンであり；
Ｘ_３は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_４は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ，Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_５は、Ｓｅｒ又はＡｌａであり；
Ｘ_６は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ_７は、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_８は、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_９は、Ｍｅｔ、Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｖａｌ、ノルロイシン、アラニン、α−アミノイソ酪酸又はＯ−メチル−ホモセリンであり；
Ｘ_１０は、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１１は、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１２は、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１３は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；そして
Ｘ_１４は、アミド、カルボキシレート、第二級アミド、Ａｌａ、Ｋ（パルミトイル）、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）、Ｃｙｓ（コレステリル）、又は、ｍＰＥＧ又はコレステロールが化学結合により結合した任意のリンカーである］
を包含するポリペプチドを提供する。医薬的に許容されるそれらの塩は、同様に考えられる。

さらに、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_６−Ｘ_８、及びＸ_１０−Ｘ_１４のいずれか１又は２個は、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）、Ｃｙｓ（コレステリル）でよく；Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）ｔｅｉｎｅはまたＣ_１；Ｃ_２；Ｃ_３又はＣ_６でもよく、ここで、Ｃ_１＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）５ｋＤａ、Ｃ_２＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）２０ｋＤａ、Ｃ_３＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ、Ｃ_６＝Ｃｙｓ（ＭＰＥＧ）_２６０ｋＤａであり、かつ各々は、側鎖チオールを介し、示された分子量の直鎖メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）又は分枝鎖ｍＰＥＧ_２によりＰＥＧ化されたシステイン残基に相当する。

本発明は、式：
ＨαＤＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬｍＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡＣ_３
［式中、Ｃ_３＝Ｃｙｓ［（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ］であり、各々は、側鎖チオールを介し、示されたＭＷの分枝したｍＰＥＧ［（ｍＰＥＧ）_２］によりＰＥＧ化されたアミド化システイン残基に相当し；αは、α−アミノイソ酪酸（ａｉｂ）であり；そして、ｍ＝メチオニンスルホキシド（Ｍｅｔ（Ｏ））である］のＯＸＭポリペプチド誘導体に関する。

本発明のもう１つの実施態様においては、
Ｈ_ｘＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ
［式中、Ｈ_ｘは、Ｈｉｓ；Ｈ_Ｉ＝イミダゾール−乳酸（ＩｍｉＨ）；デスアミノ−Ｈｉｓ（ΔＮＨ_２−Ｈ）；アセチルＨｉｓ；ピログルタミルＨｉｓ；Ｎ−メチル−Ｈｉｓ（Ｍｅ−Ｈ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈｉｓ（Ｍｅ_２−Ｈ）；ベンゾイルＨｉｓ（Ｂｚ−Ｈ）、ベンジルＨｉｓ（Ｂｚｌ−Ｈ）及びＰｈｅからなる群より選択される］を包含するポリペプチドが提供される。

本発明のなおもう１つの実施態様においては、
ＨＸ_１ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ
［式中、Ｘ_１は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｓｅｒ及びα−アミノイソ酪酸からなる群より選択される］を包含するポリペプチドが提供される。

本発明はさらに、
ＨＳＸ_２ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ
［式中、Ｘ_２は、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ及びＬ−ノルロイシンからなる群より選択される］を包含するポリペプチドを提供する。

本発明のもう１つの実施態様においては、
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＸ_３Ｘ_４ＹＬＤＳＸ_６Ｘ_６ＡＸ_７Ｘ_８ＦＶＸ_７ＷＬＭＸ_１０Ｘ_１１ＫＲＮＲＮＮＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４
［式中、Ｘ_３は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_４は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_６は、Ａｒｇ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）の任意の１つであり；
Ｘ_７は、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）の任意の１つであり；
Ｘ_８は、Ａｓｐ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１０は、Ａｓｎ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１１は、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１２は、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１３は、Ａｌａ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；そして
Ｘ_１４は、アミド、カルボキシレート、第二級アミド、Ａｌａ、Ｋ（パルミトイル）、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）、Ｃｙｓ（コレステリル）、又は、ｍＰＥＧ又はコレステロールが化学結合により結合した任意のリンカーであり、
ここで、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_６−Ｘ_８、及びＸ_１０−Ｘ_１４の１又は２個は、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）である］を包含するポリペプチドが提供される。

本発明のもう１つの実施態様においては、
ＨαＸ_１５ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＺＺＡＸ_１６ＤＦＶＱＷＬＸ_１７ＮＴＸ_１８
［式中、Ｘ_１５は、Ｄ又はＱであり；
Ｚは、任意のアミノ酸であり；
Ｘ_１６は、Ｃ_８、Ｃｙｓ（Ｎ−エチルマレイミジル）、Ｑ又はＣであり；
Ｘ_１７は、ｍ又はＭであり；
Ｘ_１８は、アミド化されたｋ又はＫである］を包含するポリペプチドが提供される。

本発明のもう１つの実施態様においては、
ＨαＤＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＤＳＺＺＡＱＤＦＶＱＷＬｍＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡＸ_１９
［式中、Ｘ_１９は、Ｃ又はＣ_８、Ｃｙｓ（Ｎ−エチルマレイミジル）である］を包含するポリペプチドが提供される。

本発明のなおもう１つの実施態様においては、式：
ＨαＤＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳ−ＴｔｄｓＥＣ−ＣＯＮＨ_２
のポリペプチドが提供される。

本発明のもう１つの実施態様においては、式：
ＨａＤＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬｍＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ−Ｔｔｄｓ−ＥＥＥＥＥＣ−ＣＯＯＨ
［式中、Ｔｔｄｓは、１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカンアミン−スクシンイミン酸（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｃ ａｃｉｄ）である］のポリペプチドが提供される。

本発明のもう１つの実施態様においては、患者における代謝性疾患の治療のための方法であって、上記記載のポリペプチドを該患者へ投与することを包含する方法が提供される。該代謝性疾患は、糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖症及び肥満症からなる群より選択されてよく、脳までの末梢経路、例えば経口、経粘膜、バッカル、舌下、経鼻 直腸、皮下、経皮 静脈内、筋肉内又は腹腔内経路により投与されてよい。

本発明のなおもう１つの実施態様においては、上記記載のポリペプチドと、医薬的に好適な担体とを包含する医薬組成物が提供される。

本発明はさらに、必要とする患者に本発明のポリペプチド及び医薬組成物を投与することによる、糖尿病又は肥満症のような代謝障害の治療又は予防に有用な医薬品の調製における、本発明のポリペプチドの使用に関する。

（発明の詳細な記載）
本発明は、修飾されたＯＸＭ誘導体に関する。ＯＸＭ誘導体は、安定性及び薬物動態を改善するためのＰＥＧ化又は他の部位又は担体タンパク質への結合により、及び／又は、ＤＰ−ＩＶ切断に対しペプチドを抵抗性にするためのアミノ酸残基の置換基の組み込みにより開発される。さらに、安定化されたＯＸＭ誘導体は、グルカゴン受容体アゴニスト活性を示さず、それにより、糖尿病又は前糖尿病患者における高血糖症及び肥満症の治療において一定の利点を提供しうる。これらの患者については、グルカゴン受容体シグナリングの上方制御は、そのことが結果として血中グルコースレベルの上昇を生じ得るので、回避されねばならない。

他に特定されない限り、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」は、当業者により、種々の修飾及び／又は安定化された型も包含することが理解される。かかる修飾された型は、ＰＥＧ化型、パルミトイル化型、コレステロール修飾型、その他を含む化学修飾型であってよく、それに限定されない。修飾はまた、分子内架橋、及び脂質、フラビン、ビオチン、ポリエチレングリコール誘導体、その他のような種々の部位への共有結合も包含する。加えて、修飾はまた、環化、分枝及び架橋を包含してもよい。さらに、遺伝子によってコードされた通常の２０アミノ酸以外のアミノ酸もまた、ポリペプチド中に包含されうる。

ＯＸＭ誘導体の構造
本発明は、修飾されたＯＸＭ誘導体を提供する。特に、本発明は、式：
Ｈ_ｘＸ_１Ｘ_２ＧＴＦＴＳＤＹＸ_３Ｘ_４ＹＬＤＸ_５Ｘ_６Ｘ_６ＡＸ_７Ｘ_８ＦＶＸ_７ＷＬＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＫＲＮＲＮＮＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４
［式中、Ｈ_ｘは、Ｈｉｓ；イミダゾール−乳酸（ＩｍｉＨ）；デスアミノ−Ｈｉｓ（ΔＮＨ_２−Ｈ）；アセチルＨｉｓ；ピログルタミルＨｉｓ（ＰｙｒＨ）；Ｎ−メチル−Ｈｉｓ（Ｍｅ−Ｈ）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈｉｓ（Ｍｅ_２−Ｈ）；ベンゾイルＨｉｓ（Ｂｚ−Ｈ）；ベンジルＨｉｓ（Ｂｚｌ−Ｈ）；及びＰｈｅからなる群より選択され；
Ｘ_１は、Ｓｅｒ；Ｇｌｙ；Ａｌａ；Ａｒｇ；Ａｓｎ；Ａｓｐ；Ｇｌｕ；Ｇｌｎ；Ｈｉｓ；Ｉｌｅ；Ｌｙｓ；Ｍｅｔ；Ｐｈｅ；Ｐｒｏ；Ｔｈｒ；Ｔｒｐ；Ｔｙｒ；Ｖａｌ；Ｄ−Ａｌａ；Ｄ−Ｓｅｒ；及びα−アミノイソ酪酸からなる群より選択され；
Ｘ_２は、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ又はＬ−ノルロイシンであり；
Ｘ_３は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_４は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ，Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_５は、Ｓｅｒ又はＡｌａであり；
Ｘ_６は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ_７は、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_８は、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_９は、Ｍｅｔ、Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｖａｌ、ノルロイシン、アラニン、α−アミノイソ酪酸又はＯ−メチル−ホモセリンであり；
Ｘ_１０は、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１１は、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１２は、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１３は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；そして
Ｘ_１４は、アミド、カルボキシレート、第二級アミド、Ａｌａ、Ｋ（パルミトイル）、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）、Ｃｙｓ（コレステリル）、又は、ｍＰＥＧ又はコレステロールが化学結合により結合した任意のリンカーである］の、新規な安定化された修飾されＯＸＭポリペプチド誘導体に関する。

さらに、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_６−Ｘ_８、及びＸ_１０−Ｘ_１４の１又は２個は、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）でよく；Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）ｔｅｉｎｅはまたＣ_１；Ｃ_２；Ｃ_３又はＣ_６でもよく、ここで、Ｃ_１＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）５ｋＤａ、Ｃ_２＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）２０ｋＤａ、Ｃ_３＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ、Ｃ_６＝Ｃｙｓ（ＭＰＥＧ）_２６０ｋＤａであり、そして各々が、側鎖チオールを介し、示されたＭＷの直鎖メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）又は分枝鎖ｍＰＥＧ_２によりＰＥＧ化されたシステイン残基に相当する。

本発明はさらに、式：
ＨαＤＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬｍＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡＣ_３
［式中、Ｃ_３＝Ｃｙｓ［（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ］であり、各々が、側鎖チオールを介し、示されたＭＷの分枝したｍＰＥＧ［（ｍＰＥＧ）_２］によりＰＥＧ化されたアミド化システイン残基に相当し；αはα−アミノイソ酪酸（ａｉｂ）であり；そして、ｍ＝メチオニンスルホキシド［Ｍｅｔ（Ｏ）である］の、ＯＸＭポリペプチド誘導体を提供する。

本発明のもう１つの実施態様においては、
ＨＸ_１ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ
［式中、Ｘ_１は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ；Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｓｅｒ及びα−アミノイソ酪酸からなる群より選択される］を包含するポリペプチドが提供される。

本発明はさらに、
ＨＳＸ_２ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ
［式中、Ｘ_２は、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ及びＬ−ノルロイシンからなる群より選択される］を包含するポリペプチドを提供する。

本発明のもう１つの実施態様においては、
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＸ_３Ｘ_４ＹＬＤＳＸ_６Ｘ_６ＡＸ_７Ｘ_８ＦＶＸ_７ＷＬＭＸ_１０Ｘ_１１ＫＲＮＲＮＮＸ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４
［式中、Ｘ_３は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_４は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_６は、Ａｒｇ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_７は、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_８は、Ａｓｐ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１０は、Ａｓｎ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１１は、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１２は、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；
Ｘ_１３は、Ａｌａ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；そして
Ｘ_１４は、アミド、カルボキシレート、第二級アミド、Ａｌａ、Ｋ（パルミトイル）、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）、Ｃｙｓ（コレステリル）、又は、ｍＰＥＧ又はコレステロールが化学結合により結合した任意のリンカーであり、
ここで、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_６−Ｘ_８、及びＸ_１０−Ｘ_１４の１又は２個は、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）である］を包含するポリペプチドが提供される。

本発明のもう１つの実施態様においては、
ＨαＸ_１５ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＺＺＡＸ_１６ＤＦＶＱＷＬＸ_１７ＮＴＸ_１８
［式中、Ｘ_１５は、Ｄ又はＱであり；
Ｚは、任意のアミノ酸であり；
Ｘ_１６は、Ｃ８、Ｑ又はＣであり；
Ｘ_１７は、ｍ又はＭであり；
Ｘ_１８はアミド化されたｋ又はＫである］を包含するポリペプチドが提供される。

本発明のもう１つの実施態様においては、
ＨαＤＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＤＳＺＺＡＱＤＦＶＱＷＬｍＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡＸ_１９
［式中、Ｘ_１９は、Ｃ又はＣ_８である］を包含するポリペプチドが提供される。

本発明のなおもう１つの実施態様においては、式：
ＨαＤＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳ−ＴｔｄｓＥＣ−ＣＯＮＨ_２
のポリペプチドが提供される。

本発明のもう１つの実施態様においては、式：
ＨαＤＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬｍＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ−Ｔｔｄｓ−ＥＥＥＥＥＣ−ＣＯＯＨ
のポリペプチドが提供される。

本明細書で用いる場合、アミノ酸残基の略語は、以下のように示される：

他に具体的に指定しない限り、全てのアミノ酸残基はＬ−型である。

野生型ＯＸＭに比較して、本発明のＯＸＭ誘導体は、いくつかのアミノ酸置換基を含有し、及び／又は、ＰＥＧ化されるか又は別の方法で修飾可能（例えばコレステロール部位）である。類似体は、例えばコレステロール及びＰＥＧの双方により、二重に結合されてもよい。かかるＯＸＭ誘導体は、切断に抵抗性であり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰ−ＩＶ）に不活性である。

「受容体アゴニスト」とは、受容体、例えばＧＬＰ−１Ｒ又はグルカゴン受容体と相互作用し、それにより受容体活性化の薬理学的又は生化学的応答特性を開始し得る、任意の内在又は外来性（薬剤）物質又は化合物が意味される。典型的には、本発明のＯＸＭ誘導体は、ヒトＧＬＰ−１Ｒに対する親和性により特徴づけられ、この受容体に対し０．１ｐＭ−１μＭの範囲のＥＣ５０を示す。本発明のＯＸＭ誘導体はまた、ＧｃｇＲに対するその親和性によっても特徴づけられ、ＥＣ５０＞１μＭを示す。

本発明のＯＸＭ誘導体は、摂食及び体重増加の低減において有用であり、また膵島からのグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を仲介し得、それにより例えば肥満症、糖尿病、メタボリックシンドロームＸ，高血糖症、空腹時グルコース障害、及び他の前糖尿病状態のような代謝障害にかかっている個体のための、治療オプションを提供する。

α＝α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ａ＝Ｄ−Ａｌａ；Ｓ＝Ｄ−Ｓｅｒ；ｎ＝Ｌ−ノルロイシン（Ｎｌｅ）， Ｘ＝Ｏ−メチル−ホモセリン；Ｃ_１＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）５ｋＤａ， Ｃ_２＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）２０ｋＤａ， Ｃ_３＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ，各々、側鎖チオールを介し、示されたＭＷの直鎖メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）又は分枝鎖ｍＰＥＧ［（ｍＰＥＧ）_２］によりＰＥＧ化されたシステイン残基に相当する；Ｃ₄＝Ｃｙｓ（コレステリル），側鎖チオールを介しコレステロールへ結合されたシステイン残基に相当する；Ｃ_５＝Ｃｙｓ（ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２），側鎖チオールがヨードアセトアミドと反応したシステイン残基に相当する；Ｃ_６＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）_２６０ｋＤａ、各々、側鎖チオールを介し、示されたＭＷの直鎖メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）又は分枝鎖ｍＰＥＧ_２ｍＰＥＧ［（ｍＰＥＧ）_２］によりＰＥＧ化されたシステイン残基に相当する；Ｈ_１＝イミダゾール−乳酸（ＩｍｉＨ）；Ｈ_２＝デスアミノ−Ｈｉｓ（ΔＮＨ_２−Ｈ） ^１Ａｃ＝アセチル；Ｐｙｒ＝ピログルタミル；Ｍｅ−Ｈ＝Ｎ−メチル−Ｈｉｓ；Ｍｅ_２−Ｈ＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈｉｓ；Ｂｚ＝ベンゾイル（Ｃ７Ｈ５Ｏ）；Ｂｚｌ＝ベンジル（Ｃ７Ｈ７）；ｍ＝メチオニンスルホキシド， Ｃ_７＝（Ｃｙｓ）_２（ｍＰＥＧ）２−４０ｋＤａ，各々、側鎖チオールを介し、同じ１つの直鎖メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）又は１つの分枝鎖ｍＰＥＧ［（ｍＰＥＧ）_２］によりＰＥＧ化された２つのシステイン残基に相当する， Ｃ_８＝Ｃｙｓ（Ｎ−エチルマレイミジル）；Ｔｔｄｓ，１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカンアミン スクシンイミン酸；ｋ，Ｄ−リジン。

１．１．アミノ酸置換及び修飾
Ｘ_１（ＯＸＭの２位）における置換は、ＯＸＭ及びＧＬＰ−１を含む多くのペプチドの分解において重要な役割を果たすＤＰ−ＩＶによるタンパク質分解に対し、ＯＸＭ誘導体の抵抗性を改善するためにデザインされている。ＧＬＰ−１における２位のＳｅｒのＧｌｙによる置換が、ＤＰ−ＩＶ切断に対する抵抗性を改善することが報告されてきた（ロッテ（Ｌｏｔｔｅ，Ｂ．Ｋ．）著、「ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー」、２００４年、第４７巻、ｐ．４１２８−４１３４）。ＯＸＭとＧＬＰ−１との間の、高度の配列相同性にもかかわらず、２位におけるＳｅｒ→Ｇｌｙ置換が、修飾されたＯＸＭに対し同様の効果を与えることは見出されなかった。しかしながら、２位のＳｅｒの、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｓｅｒ又はα−アミノイソ酪酸による置換は、実施例において以下に議論されたように、対応するＯＸＭ誘導体を、ＤＰ−ＩＶに対し野生型ＯＸＭよりもさらに抵抗性にした。Ｘ_１（ＯＸＭの２位）における置換をもつペプチド類には、ＯＸＭ４−７、１２、２３、２８−５９、及びＯＸＭ３３−３６及びＯＸＭ５５−５９の前駆体を包含する。

Ｘ_２（ＯＸＭの３位）おける置換は、ＧｃｇＲの活性が最少か又は全くないＧＬＰ−１Ｒの選択的アゴニストであるＯＸＭ誘導体を創成するためにデザインされている。かかるＯＸＭ誘導体は、肥満性糖尿病患者の治療時に有利であろう。Ｘ_２（ＯＸＭの３位）に置換のあるペプチド類には、ＯＸＭ８−１２、１５、２３、５３、９５、９６及び９７を包含する。

同様に、Ｘ_３及びＸ_５（１１位及び１６位）におけるＡｌａに対する置換は、ＧＬＰ−１Ｒに対し選択的であって、かつＧｃｇＲに対し何ら活性をもたないＯＸＭ誘導体を創成するためにデザインされている。Ｘ_３及びＸ_５（１１位及び１６位）におけるＡｌａに対するかかる置換の一例は、ＯＸＭ２４である。

Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_６−Ｘ_８及びＸ_１０−Ｘ_１４の任意の１個以上におけるシステインに対する置換は、ＯＸＭ誘導体の特定の位置におけるＰＥＧ化又はコレステリル化を可能にする。他の置換又は修飾は、当該技術分野において公知であり、活性薬剤の表面には物理的に付着するが、活性薬剤と化学結合もしくは相互作用しないものを包含する。２個以上のかかる修飾が使用可能であって、種々のポリマー、低分子量オリゴマー、天然産物及び界面活性剤を含む公知の有機及び無機の医薬用賦形剤から選択されてよい。

１．２．ＰＥＧ化及び／又はコレステリル化
本発明は、二官能性及びマルチアーム型Ｎ−マレイミジルＰＥＧ誘導体により例示される、多官能性ポリマー誘導体の使用を意図する。広く多様なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）種が、本発明の新規なＯＸＭ誘導体のＰＥＧ化のために使用されうる。実質的に任意の好適な反応性ＰＥＧ試薬が使用可能であり、好適な化学種は、ＮＯＦコーポレーション（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（〒１５０−６０１９ 東京都渋谷区恵比寿４丁目２０−３恵比寿ガーデンタワー）のドラッグデリバリーシステム）カタログにおいて市販されているもの、及び、例として、ネクター・セラピューティクス（アラバマ州３５８０６、ハンツビル、４９０ディスカバリー・ドライブ）のモレキュラーエンジニアリングカタログのものを包含するが、これに限定されない。例として、そして制限されることなく、以下のＰＥＧ試薬が種々の実施態様においてしばしば好ましい：マルチ−アーム型ＰＥＧ（ｍｕｌｔｉ−ＡｒｍＰＥＧ）、ｍＰＥＧ（ＭＡＬ）２、ｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）、任意のサンブライト（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ）活性化ＰＥＧ（カルボキシル−ＰＥＧ類、ｐ−ＮＰ−ＰＥＧ類、トレシル−ＰＥＧ類，アルデヒドＰＥＧ類、アセタール−ＰＥＧ類、アミノ−ＰＥＧ類、チオール−ＰＥＧ類、マレイミド−ＰＥＧ類、ヒドロキシ−ＰＥＧアミン、アミノ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ヒドロキシ−ＰＥＧ−アルデヒド、カルボン酸無水物型ＰＥＧ、官能化ＰＥＧ−リン脂質を包含するが、これに限定されない）、及び、その特定の適用及び使用のために当業者により選択される他の類似の及び／又は好適な反応性ＰＥＧ。

本発明の新規なＯＸＭ誘導体ペプチドはまた、スペーサー部位に対し、カルバメート又はアミド結合を介し共有結合される、２つのＰＥＧ部位を含有することも可能であり、ここでスペーサー部位は、該ペプチドの第三級アミドリンカーへ共有結合される。本発明のかかる実施態様において使用される２つのＰＥＧ部位の各々は、直鎖であってよく、一の結合点において一緒に結合されてもよい。本発明の１つの実施態様においては、各ＰＥＧ部位は、約１０キロダルトン（１０Ｋ）−約６０Ｋの分子量を有する（用語「約」は、ＰＥＧの標品において、ある分子は標準的な分子量よりもさらに重く、あるものはさらに軽いことを示している）。２つのＰＥＧ部位の各々は、約２０Ｋ−約４０Ｋの分子量を有してもよい。当業者は、所望の用量；循環時間；タンパク質分解に対する抵抗性；もしあれば、生物活性に対する影響；取り扱いの容易さ；抗原性の程度又は欠如；及び治療用ペプチドに対する他の公知のＰＥＧの影響のような考慮に基づき、所望のポリマーサイズを選択することができるであろう。

本発明の１つの実施態様においては、Ｎ−マレイミジルポリマー誘導体のポリマー主鎖は、ポリ（アルキレングリコール）、そのコポリマー、そのターポリマー、又はそれらの混合物である。例としては、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、及びエチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマーを包含する。以下に、より詳細に説明されるように、本発明のさらに好ましい実施態様は、例えば、二官能性ＰＥＧ、マルチアーム型ＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分枝状ＰＥＧ、ペンダント状ＰＥＧ、及びその中に分解可能な結合をもつＰＥＧのようなＰＥＧポリマーを利用する。しかしながら、他の関連ポリマーもまた本発明の実施において好適であること、及び、用語ＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）の使用が、この点について包括的であって排他的でないことを意図したものであることが理解されるべきである。用語ＰＥＧは、二官能性ＰＥＧ、マルチアーム型ＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分枝状ＰＥＧ、ペンダント状ＰＥＧ（すなわち、ポリマー主鎖に対して垂れ下った１個以上の官能基を有するＰＥＧ又は関連ポリマー）、又はその中に分解可能な結合をもつＰＥＧを含む、そのどのような形状のポリ（エチレングリコール）をも包含する。

ポリマー主鎖は、直鎖又は分枝鎖でよい。ＰＥＧは一般に、分枝型で使用され、それは、例えばグリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール及びソルビトールのような種々のポリオールに対するエチレンオキシドの添加により調製可能である。中心の枝分かれ部位はまた、例えばリジンのようないくつかのアミノ酸から誘導可能である。分枝したポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ
［式中、Ｒは例えばグリセロール、グリセロールオリゴマー又はペンタエリスリトールのようなコア部位であり、ｍはアームの数を表わす］のような一般式で表わし得る。マルチアーム型ＰＥＧ分子、例えば、米国特許第５，９３２，４６２号に記載されたものもまた、ポリマー主鎖として使用可能であり、ここに参考することによりその全てが本明細書に含まれる。

当業者は、実質的に水溶性かつ非ペプチド性のポリマー主鎖に関する上記のリストが、決して完全なものではなく、例示的なものにすぎないこと、及び上記の特性を有する全てのポリマー素材が意図されていることを認識するであろう。

本発明のＯＸＭ誘導体上のＰＥＧ化位置は、ＯＸＭの構造及びそのグルカゴン及びＧＬＰ−１受容体との相互作用を考慮して選択される。それ故、ＰＥＧ化は好ましくは位置特異的である。システインのチオール側鎖におけるＰＥＧ化は、広く報告されてきた（例えば、カリケティ及びベロネーゼ（Ｃａｌｉｃｅｔｉ＆Ｖｅｒｏｎｅｓｅ）、２００３年参照）。ペプチド中にＣｙｓ残基がない場合、置換により導入可能である。本発明のＯＸＭ誘導体は、システインの側鎖によりＰＥＧ化されてもよい。ＯＸＭ誘導体は、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）ｔｅｉｎｅを含有してもよい。Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）ｔｅｉｎｅ中のｍＰＥＧは、種々の分子量を有し得る。分子量の範囲は、好ましくは５ｋＤａ−２００ｋＤａ、さらには５ｋＤａ−１００ｋＤａ、さらに好ましくは２０ｋＤａ−６０ｋＤａである。ｍＰＥＧは、直鎖又は分枝鎖でよい。例えば、本発明のＣｙｓ（ｍＰＥＧ）ｔｅｉｎｅは、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３又はＣ_６でよい。本明細書で例示される場合、Ｃ_１は、分子量５ｋＤａの直鎖ｍＰＥＧをもつＣｙｓ（ｍＰＥＧ）ｔｅｉｎｅ（Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）５ｋＤａ）（例えば、ＭＰＥＧ−ＭＡＬ−５０００、ＮＥＫＴＡＲ ２Ｆ２ＭＯＨ０１）であり；Ｃ_２は、分子量２０ｋＤａの直鎖ｍＰＥＧをもつＣｙｓ（ｍＰＥＧ）ｔｅｉｎｅ（Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）２０ｋＤａ）（例えば、ＭＰＥＧ−ＭＡＬ−２０Ｋ、ＮＥＫＴＡＲ ２Ｆ２Ｍ０Ｐ０１）であり；Ｃ_３は、分子量４０ｋＤａの分枝鎖ｍＰＥＧをもつＣｙｓ（ｍＰＥＧ）ｔｅｉｎｅ（Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ）（例えば、ＭＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋ、ＮＥＫＴＡＲ ２Ｄ３Ｙ０Ｔ０１、又は、Ｙ型ＰＥＧマレイミド、ＭＷ４０Ｋ（ジェンケム・テクノロジー（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、商品番号Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋ、又はサンブライト（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ）ＧＨＴ ＧＬ２−４００ＭＡマレイミド（ＮＯＦコーポレーション）であり、そしてＣ_６は分子量６０ｋＤａの分枝鎖ｍＰＥＧをもつＣｙｓ（ｍＰＥＧ）ｔｅｉｎｅ（Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）_２６０ｋＤａ）（例えば、ＭＰＥＧ２−ＭＡＬ−６０Ｋ、ＮＥＫＴＡＲ ２Ｄ３Ｙ０Ｖ０１）である。

別法として、ＯＸＭ誘導体のシステイン残基はまた、側鎖チオールを介し、コレステロールにより誘導体化されてもよい。コレステリルＯＸＭ誘導体の例は、ＯＸＭ３６、ＯＸＭ５９、ＯＸＭ６５、ＯＸＭ７０、ＯＸＭ７６、ＯＸＭ８２、ＯＸＭ８８及びＯＸＭ１０１を包含する。

１．３．他の修飾
Ｎ−末端ヒスチジンＨ_ｘは、Ｈｉｓ、Ｈ１＝イミダゾール−乳酸（ＩｍｉＨ）；デスアミノ−Ｈｉｓ（ΔＮＨ_２−Ｈ）；アセチルＨｉｓ；ピログルタミルＨｉｓ（ＰｙｒＨ）；Ｎ−メチル−Ｈｉｓ（Ｍｅ−Ｈ）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈｉｓ（Ｍｅ_２−Ｈ）；ベンゾイルＨｉｓ（Ｂｚ−Ｈ）；ベンジルＨｉｓ（Ｂｚｌ−Ｈ）、及びＰｈｅからなる群より選択される誘導体により変異可能である。Ｎ−末端におけるアセチル化及び他の修飾、及び、Ｎ−末端キャッピング基は、ＤＰ−ＩＶ切断に対しＯＸＭを安定化させ、一方Ｃ−末端のアミド化は、カルボキシペプチダーゼによるインビボの潜在的な分解を防止しうる。Ｎ−末端修飾をもつＯＸＭ誘導体には、ＯＸＭ１４及びＯＸＭ１６−２２を包含する。

実施例において示されたように、単一用量のＯＸＭ２及びＯＸＭ３は、自由（ａｄ ｌｉｂｉｔｕｍ）に摂食したマウスにおける一晩の体重増加の低減に有効であったのに対し、単一用量のＯＸＭ１及び野生型又は天然の（ｗｔ）ＯＸＭは、このモデルでは有効ではなかった。ＯＸＭ３は、一晩の体重増加の用量依存性の低減において最も高いインビボ有効性を有しており、受容体結合を妨害しそうなよりかさのあるＰＥＧ基を有するＯＸＭ２に比較して、ＧＬＰ−１Ｒに対するその高い効力を反映しているようであった。ＯＸＭ２及びＯＸＭ３の双方が、インビトロではＧＬＰ−１Ｒに対し、天然のＯＸＭよりも有意に効力が低いことから、ＰＥＧ化されたＯＸＭ誘導体については、ｗｔＯＸＭに比較して増大されたインビボ有効性は、タンパク質分解、及び／又は腎クリアランスに対する何らかの安定化がＰＥＧ化のみによって誘導されることを示唆している。

さらに、血液成分は、当該ペプチドを安定化するために利用されてよい。好ましい血液成分は、例えば免疫グロブリン、血清アルブミン、フェリチン、ステロイド結合タンパク質、トランスフェリン、チロキシン結合タンパク質、α−２−マクログロブリン等のようなタンパク質を含む。

２．ＯＸＭ誘導体の合成
２．１．ペプチド類の合成
以下の一般的な方法が、いくつかのＯＸＭ誘導体を合成するために使用された。固相ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ化学を用いて、バッチ又は連続フロー条件下に（例えば、ペニントン及びダン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ＆Ｄｕｎｎ）著、「ペプチド・シンセシス・プロトコールズ」、１９９４年、第３５巻参照）、ＰＥＧ−ポリスチレン樹脂を用いて行なった。ペプチド類を樹脂から切断し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、及びフェノールトリイソプロピルシランのようなカチオンスカベンジャー、及び水を用いて脱保護した。ペプチド類を、冷メチル−ｔ−ブチルエーテルを用いて沈澱させ、沈澱したペプチドを、凍結乾燥に先立ち冷エーテルで２回洗浄した。ペプチドは、０．１％ＴＦＡを加えた水／アセトニトリルを典型的な移動相として使用したＣ４カラム上での逆相ＨＰＬＣ、及びエレクトロスプレー質量分析により確認した。ペプチド類は逆相ＨＰＬＣにより≧９５％まで精製した。

２．２．ペプチド類のＰＥＧ化
ペプチド類をまず合成し、次にシステインのチオール側鎖をＰＥＧ化した。以下の一般的な方法を、ペプチド類のＰＥＧ化に使用した。

ＰＥＧ化反応は、チオール化されたペプチド前駆体と、マレイミド−ｍＰＥＧとの間で行ない、チオエーテル結合を形成した。反応はｐＨ７．３で行い、マレイミド−ｍＰＥＧ量は、チオール化されたペプチドに対し、０．５から１０倍モル過剰までの範囲であった。ＰＥＧ化されたＯＸＭペプチドを、次に、逆相ＨＰＬＣ又はイオン交換クロマトグラフィー、及びそれに続いてサイズ排除クロマトグラフィーを用いて単離した。最後に、ＰＥＧ化ペプチド類を、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＡＩ（マルディ）ｔｏｆ質量分析によりキャラクタライズした。

３．ＯＸＭをベースとする療法の影響
ＯＸＭをベースとする療法は、肥満症及び糖尿病の双方に都合よく影響を及ぼす可能性を有する。ＯＸＭの末梢投与時の体重減少及び摂食低減は、ヒトにおいて充分に実証されてきた。本発明者らによる研究は、末梢投与されたブタＯＸＭが、マウスにおいて短期間の摂食及び一晩の体重増加を低減するに充分であることを示してきた。ＯＸＭのインクレチン（抗血糖上昇）活性は今日まで十分に研究されてきていないが、マウスの腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）において、ＯＸＭのグルコース低下活性がＧＬＰ−１のそれに匹敵することが、初めて証明されている。ＧＬＰ−１と同様、ＯＸＭは、静的な単離ネズミ膵島及び灌流ラット膵臓から、大量のグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を誘導し（ジャルーセ（Ｊａｒｒｏｕｓｓｅ）ら著、「エンドクリノロジー」、１９８４年、第１１５巻、ｐ．１０２−１０５）、通常のインスリン分泌促進薬に比較して、ローリスクの低血糖を示唆している。ラットでは、ＯＸＭの、胃内容排出に対する無視できるほど小さい影響が報告されている（デイキン（Ｄａｋｉｎ）ら著、「エンドクリノロジー」、２００４年、第１４５巻、ｐ．２６８７−２６９５）。マウスでは、ＯＸＭは、グルコース低下に最大有効用量において、胃内容排出を〜２５％まで低減し、これは、ＧＬＰ−１受容体アゴニストであるエキセンジン４の最大有効用量によってもたらされるもの（４７％低減）よりも少ない。それ故、ヒトにおける胃内容排出に対するＯＸＭの潜在的な良性の作用が、現在のＧＬＰ−１模倣薬に比較してこのペプチドホルモンの増強された忍容性に役割を果たしているのかもしれない。

本発明のポリペプチドは、肥満症及び／又は糖尿病の治療に有用でありうることが示唆される。第２の適応は、メタボリックシンドローム、高血糖症、空腹時グルコース障害、及び他の前糖尿病状態である。本発明のポリペプチドに関する別の適応は、例えば過敏性腸症候群及び他の腸の吸収疾患、虚血、卒中、及び不安、認知障害及びアルツハイマー病を含む神経障害のような任意の及び全てのＧＬＰ−１の適応を包含する。

ＯＸＭのペプチド性の性質は、天然のホルモンを用いた経口療法を排除する。対照的に、本明細書に提示されたＯＸＭ誘導体は、本発明のポリペプチドの１つを、制限されることなく、経口、鼻腔内、舌下、十二指腸内、皮下、バッカル、結腸内、直腸、経膣、経粘膜、経肺、経皮、皮内、非経口、静脈内、筋肉内及び眼内を含む、種々の経路による投与に好適な、医薬的に許容される担体と組合せて含んでなる医薬組成物として、０．００１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ−２００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で、１日２回から１週間以上に１回の投与頻度で投与されてよい。当該ペプチド医薬組成物は、投与方法に依存して、多様な単位用量で投与可能である。好適な単位剤形は、粉末、タブレット、ピル、カプセル、ロゼンジ、坐剤、パッチ、鼻スプレー、注射可能薬物、移植可能な徐放性製剤、脂質複合体、その他を包含し、これに制限されない。ペプチドは、典型的には、医薬的に許容される担体又は賦形剤と組合され、これは、組成物を安定化するため、又は活性薬剤の吸収を増減するために作用する１以上の生理的に許容される化合物を含有し得る。生理的に許容される化合物には、例えばグルコース、スクロース又はデキストランのような炭水化物、例えばアスコルビン酸又はグルタチオンのような酸化防止剤、キレート剤、低分子タンパク質、例えば脂質のような保護及び取込みのエンハンサー、活性薬剤のクリアランス又は加水分解を低減する組成物、又は賦形剤、又は他の安定化剤及び／又は緩衝剤を包含し得る。他の生理的に許容される化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤又は微生物の増殖又は活動を防止するために特に有用な保存料を包含する。種々の保存料が周知であり、例えば、フェノール及びアスコルビン酸を包含する。当業者は、生理的に許容される化合物を含め、医薬的に許容される担体の選択が、例えば活性薬剤の投与経路及び活性薬剤の特定の物理化学的性質に依存することを理解するであろう。

ペプチド類は、天然の形態で、又は所望であれば、該塩が医薬的に許容されるという条件付きで塩の形態で、投与可能である。活性薬剤の塩は、合成有機化学の当業者に周知の標準法を用いて調製されうる。本発明のポリペプチド類は、実施例において詳述されるように、酢酸塩として調製された。

本発明のＯＸＭポリペプチドは、ＧＬＰ１−Ｒに関与する疾病の治療又は予防において使用される他の薬剤と組合せて使用可能である。本発明のポリペプチドとの組合せにおいて役立つ具体的な化合物には、シンバスタチン、メバスタチン、エゼチミブ、アトロバスタチン、シタグリプチン、メトホルミン、シブトラミン、オルリスタット、Ｑｎｅｘａ、トピラマート、ナルトレキソン、ブプリオピオン、フェンテルミン及びロサルタン、ヒドロクロロチアジドとロサルタンの組み合わせを包含する。本発明のポリペプチドとの組合せにおいて役立つ具体的なＣＢ１アンタゴニスト／インバースアゴニストには、Ｎ−［３−（４−クロロフェニル）−２（Ｓ）−フェニル−１（Ｓ）−メチルプロピル］−２−（４−トリフルオロメチル−２−ピリミジルオキシ）−２−メチルプロパンアミド、Ｎ−［３−（４−クロロフェニル）−２−（３−シアノフェニル）−１−メチルプロピル］−２−（５−トリフルオロメチル−２−ピリジルオキシ）−２−メチルプロパンアミド、Ｎ−［３−（４−クロロフェニル）−２−（５−クロロ−３−ピリジル）−１−メチルプロピル］−２−（５−トリフルオロメチル−２−ピリジルオキシ）−２−メチルプロパンアミド、及び医薬的に許容されるそれらの塩を含む、ＷＯ０３／０７７８４７に記載されたもの；並びに以下：３−｛１−［ビス（４−クロロフェニル）メチル］アゼチジン−３−イリデン｝−３−（３，５−ジフルオロフェニル）−２，２−ジメチルプロパンニトリル、１−｛１−［１−（４−クロロフェニル）ペンチル］アゼチジン−３−イル｝−１−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−メチルプロパン−２−オール、３−（（Ｓ）−（４−クロロフェニル）｛３−［（１Ｓ）−１−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル］アゼチジン−１−イル｝メチル）ベンゾニトリル、３−（（Ｓ）−（４−クロロフェニル）｛３−［（１Ｓ）−１−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−２−メチルプロピル］アゼチジン−１−イル｝メチル）ベンゾニトリル、３−（（４−クロロフェニル）｛３−［１−（３，５−ジフルオロフェニル）−２、２−ジメチルプロピル］アゼチジン−１−イル｝メチル）ベンゾニトリル、３−（（１Ｓ）−１−｛１−［（Ｓ）−（３−シアノフェニル）（４−シアノフェニル）メチル］アゼチジン−３−イル｝−２−フルオロ−２−メチルプロピル）−５−フルオロベンゾニトリル、３−［（Ｓ）−（４−クロロフェニル）（３−｛（１Ｓ）−２−フルオロ−１−［３−フルオロ−５−（４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−４−イル）フェニル］−２−メチルプロピル｝アゼチジン−１−イル）メチル］ベンゾニトリル、及び５−（（４−クロロフェニル）｛３−［（１Ｓ）−１−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−２−メチルプロピル］アゼチジン−１−イル｝メチル）チオフェン−３−カルボニトリル、及び医薬的に許容されるそれらの塩を含む、ＷＯ０５／０００８０９に記載されたもの；並びに３−［（Ｓ）−（４−クロロフェニル）（３−｛（１Ｓ）−２−フルオロ−１−［３−フルオロ−５−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）フェニル］−２−メチルプロピル｝アゼチジン−１−イル）メチル］ベンゾニトリル、３−［（Ｓ）−（４−クロロフェニル）（３−｛（１Ｓ）−２−フルオロ−１−［３−フルオロ−５−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）フェニル］−２−メチルプロピル｝アゼチジン−１−イル）メチル］ベンゾニトリル、３−［（Ｓ）−（３−｛（１Ｓ）−１−［３−（５−アミノ−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−５−フルオロフェニル］−２−フルオロ−２−メチルプロピル｝アゼチジン−１−イル）（４−クロロフェニル）メチル］ベンゾニトリル、３−［（Ｓ）−（４−シアノフェニル）（３−｛（１Ｓ）−２−フルオロ−１−［３−フルオロ−５−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）フェニル］−２−メチルプロピル｝アゼチジン−１−イル）メチル］ベンゾニトリル、３−［（Ｓ）−（３−｛（１Ｓ）−１−［３−（５−アミノ−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−５−フルオロフェニル］−２−フルオロ−２−メチルプロピル｝アゼチジン−１−イル）（４−シアノフェニル）メチル］ベンゾニトリル、３−［（Ｓ）−（４−シアノフェニル）（３−｛（１Ｓ）−２−フルオロ−１−［３−フルオロ−５−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）フェニル］−２−メチルプロピル｝アゼチジン−１−イル）メチル］ベンゾニトリル、３−［（Ｓ）−（４−クロロフェニル）（３−｛（１Ｓ）−２−フルオロ−１−［３−フルオロ−５−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］−２−メチルプロピル｝アゼチジン−１−イル）メチル］ベンゾニトリル、３−［（１Ｓ）−１−（１−｛（Ｓ）−（４−シアノフェニル）［３−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］−メチル｝アゼチジン−３−イル）−２−フルオロ−２−メチルプロピル］−５−フルオロベンゾニトリル、５−（３−｛１−［１−（ジフェニルメチル）アゼチジン−３−イル］−２−フルオロ−２−メチルプロピル｝−５−フルオロフェニル）−１Ｈ−テトラゾール、５−（３−｛１−［１−（ジフェニルメチル）アゼチジン−３−イル］−２−フルオロ−２−メチルプロピル｝−５−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−テトラゾール、５−（３−｛１−［１−（ジフェニルメチル）アゼチジン−３−イル］−２−フルオロ−２−メチルプロピル｝−５−フルオロフェニル）−２−メチル−２Ｈ−テトラゾール、３−［（４−クロロフェニル）（３−｛２−フルオロ−１−［３−フルオロ−５−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル］−２−メチルプロピル｝アゼチジン−１−イル）メチル］ベンゾニトリル、３−［（４−クロロフェニル）（３−｛２−フルオロ−１−［３−フルオロ−５−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル］−２−メチルプロピル｝アゼチジン−１−イル）メチル］ベンゾニトリル、３−［（４−シアノフェニル）（３−｛２−フルオロ−１−［３−フルオロ−５−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル］−２−メチルプロピル｝アゼチジン−１−イル）メチル］ベンゾニトリル、３−［（４−シアノフェニル）（３−｛２−フルオロ−１−［３−フルオロ−５−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル］−２−メチルプロピル｝アゼチジン−１−イル）メチル］ベンゾニトリル、５−｛３−［（Ｓ）−｛３−［（１Ｓ）−１−（３−ブロモ−５−フルオロフェニル］−２−フルオロ−２−メチルプロピル］アゼチジン−１−イル｝（４−クロロフェニル）メチル］フェニル｝−１，３，４−オキサジアゾール−２（３Ｈ）−オン、３−［（１Ｓ）−１−（１−｛（Ｓ）−（４−クロロフェニル）［３−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）フェニル］メチル｝アゼチジン−３−イル）−２−フルオロ−２−メチルプロピル］−５−フルオロベンゾニトリル、３−［（１Ｓ）−１−（１−｛（Ｓ）−（４−シアノフェニル）［３−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）フェニル］メチル｝アゼチジン−３−イル）−２−フルオロ−２−メチルプロピル］−５−フルオロベンゾニトリル、３−［（１Ｓ）−１−（１−｛（Ｓ）−（４−シアノフェニル）［３−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）フェニル］メチル｝アゼチジン−３−イル）−２−フルオロ−２−メチルプロピル］−５−フルオロベンゾニトリル、３−［（１Ｓ）−１−（１−｛（Ｓ）−（４−クロロフェニル）［３−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）フェニル］メチル｝アゼチジン−３−イル）−２−フルオロ−２−メチルプロピル］−５−フルオロベンゾニトリル、３−［（１Ｓ）−１−｛１−［（Ｓ）−［３−（５−アミノ−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）フェニル］（４−クロロフェニル）メチル］アゼチジン−３−イル｝−２−フルオロ−２−メチルプロピル］−５−フルオロベンゾニトリル、３−［（１Ｓ）−１−｛１−［（Ｓ）−［３−（５−アミノ−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）フェニル］（４−シアノフェニル）メチル］アゼチジン−３−イル｝−２−フルオロ−２−メチルプロピル］−５−フルオロベンゾニトリル、３−［（１Ｓ）−１−（１−｛（Ｓ）−（４−シアノフェニル）［３−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル｝アゼチジン−３−イル）−２−フルオロ−２−メチルプロピル］−５−フルオロベンゾニトリル、３−［（１Ｓ）−１−（１−｛（Ｓ）−（４−クロロフェニル）［３−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）フェニル］メチル｝アゼチジン−３−イル）−２−フルオロ−２−メチルプロピル］−５−フルオロベンゾニトリル、５−［３−（（Ｓ）−（４−クロロフェニル）｛３−［（１Ｓ）−１−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−２−メチルプロピル］アゼチジン−１−イル｝メチル）フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２（３Ｈ）−オン、５−［３−（（Ｓ）−（４−クロロフェニル）｛３−［（１Ｓ）−１−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−２−メチルプロピル］アゼチジン−１−イル｝メチル）フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２（３Ｈ）−オン、４−｛（Ｓ）−｛３−［（１Ｓ）−１−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−フルオロ−２−メチルプロピル］アゼチジン−１−イル｝［３−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）フェニル］メチル｝−ベンゾニトリル、及び医薬的に許容されるそれらの塩を包含する。

本発明のポリペプチドとの組合せにおいて役立つ具体的なＮＰＹ５アンタゴニストには、３−オキソ−Ｎ−（５−フェニル−２−ピラジニル）−スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］−１’−カルボキサミド、３−オキソ−Ｎ−（７−トリフルオロメチルピリド［３，２−ｂ］ピリジン−２−イル）スピロ−［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］−１’−カルボキサミド、Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）−２−ピリミジニル］−３−オキソスピロ−［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］−１’−カルボキサミド、トランス−３’−オキソ−Ｎ−（５−フェニル−２−ピリミジニル）スピロ［シクロヘキサン−１，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−４−カルボキサミド、トランス−３−オキソ−Ｎ−［１−（３−キノリル）−４−イミダゾリル］スピロ［シクロヘキサン−１，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−４−カルボキサミド、トランス−３−オキソ−Ｎ−（５−フェニル−２−ピラジニル）スピロ［４−アザイソ−ベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド、トランス−Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）−２−ピリミジニル］−３−オキソスピロ−［５−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド、トランス−Ｎ−［５−（２−フルオロフェニル）−２−ピリミジニル］−３−オキソスピロ［５−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド、トランス−Ｎ−［１−（３，５−ジフルオロフェニル）−４−イミダゾリル］−３−オキソスピロ［７−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド、トランス−３−オキソ−Ｎ−（１−フェニル−４−ピラゾリル）スピロ［４−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド、トランス−Ｎ−［１−（２−フルオロフェニル）−３−ピラゾリル］−３−オキソスピロ［６−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド、トランス−３−オキソ−Ｎ−（１−フェニル−３−ピラゾリル）スピロ［６−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド、トランス−３−オキソ−Ｎ−（２−フェニル−１，２，３−トリアゾール−４−イル］スピロ［６−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド、及び医薬的に許容されるそれらの塩及びエステルを包含する。

本発明のポリペプチドとの組合せにおいて役立つ具体的なＡＣＣ−１／２阻害剤には、１’−［（４，８−ジメトキシキノリン−２−イル）カルボニル］−６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）スピロ［クロマン−２，４’−ピペリジン］−４−オン、（５−｛１’−［（４，８−ジメトキシキノリン−２−イル）カルボニル］−４−オキソスピロ［クロマン−２，４’−ピペリジン］−６−イル｝−２Ｈ−テトラゾール−２−イル）メチルピバレート、（５−｛１’−［（８−シクロプロピル−４−メトキシキノリン−２−イル）カルボニル］−４−オキソスピロ［クロマン−２，４’−ピペリジン］−６−イル｝−ニコチン酸、１’−（８−メトキシ−４−モルホリン−４−イル−２−ナフトイル）−６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）スピロ［クロマン−２，４’−ピペリジン］−４−オン、及び１’−［（４−エトキシ−８−エチルキノリン−２−イル）カルボニル］−６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）スピロ［クロマン−２，４’−ピペリジン］−４−オン、及び医薬的に許容されるそれらの塩を包含する。

本発明のポリペプチドとの組合せにおいて役立つ具体的なＭＣＨ１Ｒアンタゴニストには、１−｛４−［（１−エチルアゼチジン−３−イル）オキシ］フェニル｝−４−［（４−フルオロベンジル）オキシ］ピリジン−２（１Ｈ）−オン、４−［（４−フルオロベンジル）オキシ］−１−｛４−［（１−イソプロピルアゼチジン−３−イル）オキシ］フェニル｝ピリジン−２（１Ｈ）−オン、１−［４−（アゼチジン−３−イルオキシ）フェニル］−４−［（５−クロロピリジン−２−イル）メトキシ］ピリジン−２（１Ｈ）−オン、４−［（５−クロロピリジン−２−イル）メトキシ］−１−｛４−［（１−エチルアゼチジン−３−イル）オキシ］フェニル｝ピリジン−２（１Ｈ）−オン、４−［（５−クロロピリジン−２−イル）メトキシ］−１−｛４−［（１−プロピルアゼチジン−３−イル）オキシ］フェニル｝ピリジン−２（１Ｈ）−オン、及び４−［（５−クロロピリジン−２−イル）メトキシ］−１−（４−｛［（（２Ｓ）−１−エチルアゼチジン−２−イル）メトキシ］フェニル｝ピリジン−２（１Ｈ）−オン、又は医薬的に許容されるそれらの塩を包含する。

本発明のポリペプチドとの組合せにおいて役立つ具体的なＤＰ−ＩＶ阻害剤には、７−［（３Ｒ）−３−アミノ−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ブタノイル］−３−（トリフルオロメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジンから選択される。特に、式Ｉの化合物は、７−［（３Ｒ）−３−アミノ−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ブタノイル］−３−（トリフルオロメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン、及び医薬的に許容されるそれらの塩を包含する。

さらに、他のペプチド類似体及びインクレチンホルモングルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）の模倣薬もまた、本発明のポリペプチドとの組合せにおいて役立つ。

本発明の他の特徴及び利点は、異なる実施例を含む本明細書に提供された追加的な記載から明らかである。提供された実施例は、本発明の実施において有用な、種々の成分及び方法論を示している。実施例は、クレームされた本発明を制限するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施において有用な他の成分及び方法論を特定しかつ用いることができる。

実施例１：オキシントモジュリン（ＯＸＭ）類似体の合成
ペプチドＯＸＮ類似体（表１参照）は、固相により、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を用いて、ペプチドマルチシンセサイザーＡＰＥＸ３９６（アドバンスド・ケムテック）にて、４０ウェル反応ブロックを用いて合成した。各ペプチドを、単一のウェル中で合成した。ペプチドアミド用には、０．１ｇの、１％架橋された樹脂Ｆｍｏｃ−リンカーＡＭ−チャンピオン（バイオサーチ・テクノロジーズ・インク）、及び、修飾されたリンク（Ｒｉｎｋ）リンカー ｐ−［（Ｒ，Ｓ）−α−［９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸で誘導体化された、ＰＥＧ−ＰＳベースの樹脂（リンク（Ｒｉｎｋ、Ｈ）著、「テトラヘドロン・レターズ」、１９８７年、第２８巻、ｐ．３７８７−３７８９；ベルナトビッツ（Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．Ｓ．）ら著、「テトラヘドロン・レターズ」、１９８９年、第３０巻、ｐ．４６４５−４６６７）を使用した。ペプチド酸用には、０．１ｇの１％架橋チャンピオン樹脂（バイオサーチ・テクノロジーズ・インク）を使用し、それは、あらかじめヒドロキシメチルフェノキシメチル処理により誘導体化した。全てのアミノ酸は、０．５Ｍ ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）のＤＭＦ中の溶液中に、０．５Ｍの濃度で溶解した。アシル化反応は、樹脂の遊離アミノ基の６倍過剰の活性化アミノ酸を用いて、６０分間にわたり行なった。アミノ酸は、等モル量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）及び２倍モル過剰のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）により活性化した。

別法として、ペプチドは、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を用いて、パイオニアペプチドシンセサイザー（アプライド・バイオシステムズ）を用いて合成した。この場合、全てのアシル化反応は、樹脂の遊離アミノ基の４倍過剰の活性化アミノ酸を用いて、６０分間にわたり行ない、シンセサイザーでのペプチドアセンブリーの終了に続いた。側鎖保護基は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒにはｔｅｒｔ−ブチル；Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ及びＨｉｓにはトリチル；Ｌｙｓ、Ｔｒｐにはｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル；及び、Ａｒｇには２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルであった。ＯＸＭ２及びＯＸＭ３ペプチド類については、アセチル化反応は、ペプチドアセンブリーの終了時に、ＤＭＦ中の１０倍過剰の無水酢酸を用いた反応により行なった。

ＯＸＭ１４用には、Ｌ−ピログルタミン酸を、等モル量のＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）とＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）との、樹脂遊離アミノ基の４倍過剰の活性化されたアシル作用物（ａｃｙｌａｎｔ）との反応によりアシル化した。

ＯＸＭ１６用には、イミダゾール−乳酸（Ｉｍｉ−Ｈ）を、等モル量のＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＯＢｔ及び２倍モル過剰のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）との、樹脂遊離アミノ基の４倍過剰の活性化されたアシル作用物との反応によりアシル化した。

ＯＸＭ１７用には、Ｎ−メチル−Ｈｉｓ（Ｍｅ−Ｈ）を、等モル量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）と２倍モル過剰のＤＩＥＡとの反応によりアシル化した。アシル化反応は、樹脂遊離アミノ基の３倍過剰の活性化されたアシル作用物を用いて、１８０分間にわたり行った。

ＯＸＭ１８用には、デスアミノ−Ｈｉｓ（ΔＮＨ_２−Ｈ）を、等モル量のＨＢＴＵと２倍モル過剰のＤＩＥＡとの反応によりアシル化した。アシル化反応は、樹脂遊離アミノ基の３倍過剰の活性化されたアシル作用物を用いて、１８０分間にわたり行った。

ＯＸＭ１９用には、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈｉｓ（Ｍｅ_２−Ｈ）を、等モル量のＨＢＴＵと２倍モル過剰のＤＩＥＡとの反応によりアシル化した。アシル化反応は、樹脂遊離アミノ基の３倍過剰の活性化されたアシル作用物を用いて、一晩にわたり行った。

ＯＸＭ２０用には、ベンゾイル−Ｈｉｓ（Ｂｚ−Ｈ）を、等モル量のＨＢＴＵと２倍モル過剰のＤＩＥＡとの反応によりアシル化した。アシル化反応は、樹脂遊離アミノ基の３倍過剰の活性化されたアシル作用物を用いて、２４０分間にわたり行った。

ＯＸＭ２１用には、ベンジル−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ−Ｈ）を、等モル量のＨＢＴＵと２倍モル過剰のＤＩＥＡとの反応によりアシル化した。アシル化反応は、樹脂遊離アミノ基の３倍過剰の活性化されたアシル作用物を用いて、一晩にわたり行った。

合成の終わりに、乾燥ペプチド樹脂は、２０ｍＬの切断混合物、８８％ＴＦＡ、５％フェノール、２％トリイソプロピルシラン、及び５％水（ソール及びバラニー（Ｓｏｌｅ、Ｎ．Ａ．＆Ｇ．Ｂａｒａｎｙ，）著、「ザ・ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）」、１９９２年、第５７巻、ｐ．５３９９−５４０３）を用いて、室温で１．５時間にわたり個別に処理した。各樹脂を濾過し、ペプチドを沈澱するため、溶液を冷メチル−ｔ−ブチルエーテルへ添加した。遠心分離後、沈澱ペレットを、新鮮な冷メチル−ｔ−ブチルエーテルで洗浄して有機スカベンジャーを除去した。このプロセスを２回繰返した。最終ペレットを乾燥し、Ｈ_２Ｏ、２０％アセトニトリル中に再懸濁し、凍結乾燥した。

ペプチドＯＸＭ５４の合成は、チオール含有ＯＸＭペプチド前駆体（配列番号４１）を、ｐＨ８の０．１ＭトリスＨＣｌ、６Ｍ塩化グアニジニウム中に溶解することにより行った。１０倍モル過剰のヨードアセトアミドを添加した。１時間のインキュベーション後、ペプチド溶液をＨＰＬＣにより精製した。

ペプチドＯＸＭ５５の合成は、チオール含有ＯＸＭペプチド前駆体（配列番号６４）を、ｐＨ８の０．１ＭトリスＨＣｌ、６Ｍ塩化グアニジニウム中に溶解することにより行った。この溶液に対し、１０倍モル過剰のヨードアセトアミドを添加した。１時間のインキュベーション後、ペプチド溶液をＨＰＬＣにより精製した。

粗ペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより、セミ分取用ォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ＲＣＭデルタＰａｋ^ＴＭＣ_４カートリッジ（４０ｘ２００ｍｍ、１５μｍ）を用い、溶出液として、（Ａ）水中の０．１％ＴＦＡ、及び（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを用いて精製した。以下の溶出液（Ｂ）の勾配を使用した：５分間にわたり２０％−２０％、さらに２０分間にわたり２０％−３５％、流速８０ｍＬ／分。分析用ＨＰＬＣは、フェノメネックス、ジュピターＣ_４カラム（１５０ｘ４．６ｍｍ、５μｍ）にて、以下の溶出液（Ｂ）の勾配を使用した：２０％−４０％Ｂ（２０分間）−８０％（３分間）、流速１ｍＬ／分。精製したペプチドを、マイクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析によりキャラクタライズした。

実施例２：オキシントモジュリン（ＯＸＭ）類似体のＰＥＧ化
ＰＥＧ化反応は、チオエステル結合形成を可能にする条件下に行なった。次にＰＥＧ化されたＯＸＭペプチドを、逆相ＨＰＬＣ又はイオン交換クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて単離した。ＰＥＧ化されたＯＸＭ類似体は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ及びＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析を用いてキャラクタライズした。

ＯＸＭ３３、３４、３５、３６及び５４ペプチド類は、チオール含有ＯＸＭペプチド前駆体（配列番号４１）から合成し、チオエーテル結合により共有結合したＰＥＧをもつ誘導体を調製した。

ＯＸＭ３３の合成
１０ｍｇのペプチド前駆体（２．２μｍｏｌ）を、０．２ｍＬのｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、６Ｍ塩化グアニジニウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に対し、０．４ｍＬのｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に溶解した２２ｍｇのＭＰＥＧ−ＭＡＬ−５０００（ＮＥＫＴＡＲ ２Ｆ２ＭＯＨ０１）（４．４μｍｏｌ）（１：２ ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比）を添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした。

ＯＸＭ３４の合成
１０ｍｇのペプチド前駆体（２．２μｍｏｌ）を、０．２ｍＬのｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、６Ｍ塩化グアニジニウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に対し、０．５ｍＬのｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に溶解した、８０ｍｇのＭＰＥＧ−ＭＡＬ−２０Ｋ（ＮＥＫＴＡＲ ２Ｆ２Ｍ０Ｐ０１）（４．０μｍｏｌ）（１：１．８ ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比）を添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした。

ＯＸＭ３５の合成
１０ｍｇのペプチド前駆体（０．９２μｍｏｌ）を、０．４ｍＬのｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、６Ｍ塩化グアニジニウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に対し、０．８ｍＬのｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に溶解した、７０ｍｇのＭＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋ（ＮＥＫＴＡＲ ２Ｄ３Ｙ０Ｔ０１）（１．７μｍｏｌ）を、１：１．８ ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比で添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした。

コントロールペプチドＯＸＭ５４は、チオール含有ペプチド前駆体を、ｐＨ７．５の０．１Ｍ トリスＨＣｌ、６Ｍ塩化グアニジニウム中、１０ｅｑのヨードアセトアミドとインキュベートすることにより調製した。３０分間のインキュベーション後、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、そしてエレクトロスプレー質量分析によりキャラクタライズした。

ペプチドＯＸＭ５６、５７、５８は、チオール含有ＯＸＭペプチド前駆体（配列番号６４）から合成し、チオエーテル結合により共有結合したＰＥＧをもつ誘導体を調製した。

ＯＸＭ５６の合成
５ｍｇのペプチド前駆体（１．１μｍｏｌ）を、０．２ｍＬのｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳに溶解した。この溶液に対し、０．４ｍＬのｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳに溶解した、５７ｍｇのＭＰＥＧ−ＭＡＬ−５０００（ＮＥＫＴＡＲ ２Ｆ２ＭＯＨ０１）（１１．４μｍｏｌ）（１：１０ ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比）を添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチド溶液を１％酢酸で酸性化し、フラクトゲルＴＳＫ ＣＭ−６５０Ｓ上での陽イオン交換クロマトグラフィー（ＩＸＣ）により、ｐＨ４．８の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中のＮａＣｌの直線勾配を用いて精製した。ＩＸＣ精製したＰＥＧ化ペプチドを、サイズ排出クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりさらに精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした。

ＯＸＭ５７の合成
１０ｍｇのペプチド前駆体（２．２μｍｏｌ）を、０．２ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。この溶液に対し、０．６ｍＬのｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．３Ｍトリス（２−カルボキシ−エチル）ホスフィン中に溶解した、５０ｍｇのＭＰＥＧ−ＭＡＬ−２０Ｋ（ＮＥＫＴＡＲ ２Ｆ２Ｍ０Ｐ０１）（２．５μｍｏｌ）を、１：１．１３ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比で添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした。

ＯＸＭ５８の合成
１０ｍｇのペプチド前駆体（０．９２μｍｏｌ）を、０．４ｍＬのｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、６Ｍ塩化グアニジニウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に対し、０．８ｍＬのｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に溶解した７０ｍｇのＭＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋ（ＮＥＫＴＡＲ ２Ｄ３Ｙ０Ｔ０１）（１．７μｍｏｌ）（１：１．８ ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比）を添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチドを、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした。

コントロールペプチドＯＸＭ１０２、ＯＸＭ１１２及びＯＸＭ１１６は、チオール含有ペプチド前駆体を、ｐＨ７．５の０．１Ｍ トリスＨＣｌ、６Ｍ塩化グアニジニウム中、１０ｅｑ．のヨードアセトアミドとインキュベートすることにより調製した。３０分間のインキュベーション後、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、そしてエレクトロスプレー質量分析によりキャラクタライズした。

ＯＸＭ１０３、ＯＸＭ１０５、ＯＸＭ１０７、ＯＸＭ１１３の合成
１０ｍｇの対応するペプチド前駆体（２．２６μｍｏｌ）を、２ｍＬの、８Ｍ尿素、ｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に対し、Ｈ_２Ｏに溶解した１０９ｍｇのＭＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋ（ＮＥＫＴＡＲ ２Ｄ３Ｙ０Ｔ０１）（２．７１μｍｏｌ）（１：１．２ ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比）を添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチド溶液を、１％酢酸で酸性化し、ＴＳＫ ＣＭ−６５０Ｓでの陽イオン交換クロマトグラフィー（ＩＸＣ）により、ｐＨ４．８の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中のＮａＣｌの直線勾配を用いて精製した。ＩＸＣ精製したＰＥＧ化ペプチドを、ＳＥＣによりさらに精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした。

ＯＸＭ１０９の合成
１０ｍｇの対応するペプチド前駆体（２．２５μｍｏｌ）を、２ｍＬの、８Ｍ尿素、ｐＨ７．３の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に対し、２ｍＬのＨ_２Ｏ中に溶解した１０８ｍｇのＭＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋ（ＮＥＫＴＡＲ ２Ｄ３Ｙ０Ｔ０１）（２．７μｍｏｌ）（１：１．２ ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比）を添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチド溶液を、１％酢酸で酸性化し、ＴＳＫ ＣＭ−６５０Ｓでの陽イオン交換クロマトグラフィー（ＩＸＣ）により、ｐＨ４．８の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中のＮａＣｌの直線勾配を用いて精製した。ＩＸＣ精製したＰＥＧ化ペプチドを、ＳＥＣによりさらに精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした。

ＯＸＭ１１７の合成
１０ｍｇの対応するペプチド前駆体（２．１９μｍｏｌ）を、２ｍＬの、８Ｍ尿素、ｐＨ６．５の０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に対し、Ｈ_２Ｏ中に溶解した１０５ｍｇのＭＰＥＧ_２−ＭＡＬ−４０Ｋ（ＮＥＫＴＡＲ ２Ｄ３Ｙ０Ｔ０１）（２．６３μｍｏｌ）（１：１．２ ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比）を添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチド溶液を、１％酢酸で酸性化し、ＴＳＫ ＣＭ−６５０Ｓでの陽イオン交換クロマトグラフィー（ＩＸＣ）により、ｐＨ４．８の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中のＮａＣｌの直線勾配を用いて精製した。ＩＸＣ精製したＰＥＧ化ペプチドを、ＳＥＣによりさらに精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした。

ＯＸＭ１２５の合成
１０ｍｇの対応するペプチド前駆体（２．２６μｍｏｌ）を、２ｍＬの、８Ｍ尿素、ｐＨ６．５の０．２５Ｍ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に対し、Ｈ_２Ｏ中に溶解した１０５ｍｇのＭＰＥＧ_２−ＭＡＬ−４０Ｋ（ＮＥＫＴＡＲ ２Ｄ３Ｙ０Ｔ０１）（２．７１μｍｏｌ）（１：１．２ ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比）を添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチド溶液を、０．２％蟻酸でｐＨ２．８まで酸性化し、ＴＳＫ ＳＰ−５ＰＷでの陽イオン交換クロマトグラフィー（ＩＸＣ）により、０．２％蟻酸中のＮａＣｌの直線勾配を用いて精製した。ＩＸＣ精製したＰＥＧ化ペプチドを、ＳＥＣによりさらに精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした。

ＯＸＭ１２９の合成
１０ｍｇの対応するペプチド前駆体（２．２６μｍｏｌ）を、２ｍＬの、８Ｍ尿素、ｐＨ６．５の０．２５Ｍ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に対し、Ｈ_２Ｏ中に溶解した１０９ｍｇのＭＰＥＧ_２−ＭＡＬ−４０Ｋ（ＮＥＫＴＡＲ ２Ｄ３Ｙ０Ｔ０１）（２．７２μｍｏｌ）（１：１．２ ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比）を添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチド溶液を、０．２％蟻酸で酸性化し、ＴＳＫ ＳＰ−５ＰＷでの陽イオン交換クロマトグラフィー（ＩＸＣ）により、０．２％蟻酸中のＮａＣｌの直線勾配を用いて精製した。ＩＸＣ精製したＰＥＧ化ペプチドを、ＳＥＣによりさらに精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした。

実施例３ ペプチド配列のデザイン及び合成
種々のＰＥＧサイズ（ｍＰＥＧ）５ｋＤａ、（ｍＰＥＧ）２０ｋＤａ、（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ及び（ｍＰＥＧ）_２６０ｋＤａの生物活性を、一連の実験において比較し、最大かつ耐久性のある活性をマウスにおいて与えるために最適なＰＥＧサイズが、一般に４０ｋＤａであることを証明した。

ペプチドＯＸＭ１０３（２位Ａｉｂ（α））は、オキシントモジュリン配列内の２０位を、（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａとの結合用の部位として調査するためにデザインした。ＯＸＭ１０２はコントロールペプチド（ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２）であり、ここで側鎖チオール（２０位のシステイン）は、ヨードアセトアミドと反応した。

ペプチドＯＸＭ１０５（２位Ａｉｂ（α））は、オキシントモジュリン配列内の２１位を、（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａとの結合用の部位として調査するためにデザインした。ＯＸＭ１０４はコントロールペプチド（ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２）であり、ここで側鎖チオール（２１位のシステイン）は、ヨードアセトアミドと反応した。

ペプチドＯＸＭ１０７（２位Ａｉｂ（α）、２７位Ｍｅｔ（Ｏ））は、オキシントモジュリン配列内の２４位を、（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａとの結合用の部位として調査するためにデザインした。ＯＸＭ１０６はコントロールペプチド（ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２）であり、ここで側鎖チオール（２４位のシステイン）は、ヨードアセトアミドと反応した。

ペプチドＯＸＭ１０９（２位Ａｉｂ（α））は、オキシントモジュリン配列内の２８位を、（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａとの結合用の部位として調査するためにデザインした。ＯＸＭ１０８はコントロールペプチド（ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２）であり、ここで側鎖チオール（２８位のシステイン）は、ヨードアセトアミドと反応した。

ＯＸＭ１４１と呼ばれるペプチドは、３位においてＧｌｎからＡｓｐへの変異を有し、このことがＧＬＰ−１受容体に対する特異的選択性を与えている。３位にＧｌｎからＡｓｐへの変異を、２７位にＭｅｔ（Ｏ）を、及び、２０位及び３８位に２つの結合部位を有するペプチドＯＸＭ１４１は、Ｃ３８位にコレステロール基及びＣ２０位にＰＥＧの双方に結合されたペプチドを有する可能性を調査するためにデザインした。

ペプチドＯＸＭ１４２（Ａｉｂ（α）、２７位にＭｅｔ（Ｏ）、及び２０位及び３８位に２つの結合部位）は、Ｃ３８位にコレステロール基及びＣ２０位にＰＥＧの双方に結合されたペプチドを有する可能性を調査するためにデザインした。

図１４は、ＧＬＰ１Ｒ及びＧＣＧ受容体に関するインビトロ活性のデータ（ＧＬＰ−１Ｒ及びＧＬＧＲの特異性も示している）を、表形式に要約している。Ｃ２０位における（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ結合は、双方の受容体に対し活性を保持しており、それ故、ＯＸＭ１０３は、＋／＋類似体と呼ばれ、それに対し他の全ての（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ結合は、ＧＣＧ受容体において能力を失っている。特に、３８、２４及び２８位における（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ結合については、Ｇｃｇ受容体に対し２−３オーダーの大きさの選択性が、ＧＬＰ−１受容体に対し存在する。それ故、類似体ＯＸＭ９９、１０７及び１０９は、＋／０類似体と呼ばれる。

図１５は、ＤＩＯマウスでの、摂食及び体重減少に対する、（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ結合のインビボ活性を示す。自由に摂食したＤＩＯ（各〜５１ｇ）の、雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに、暗期開始の〜３０分前に、ビヒクル（水）又はＯｘｍ類似体９９、１０３、１０５、１０７及び１０９を、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。摂食は、１日目で〜２時間及び１８時間（一晩）後に、２日目で２６及び４２時間（一晩）後に測定した。^＊Ｐ＜０．０５ 対ビヒクル、群当たりｎ＝５−６。

ペプチドＯＸＭ１１０（２位Ｄ−Ｓｅｒ）は、オキシントモジュリン配列内の３８位を、パルミトイル基のような脂質との結合用の部位として調査するためにデザインした。パルミトイル基を、オキシントモジュリン配列のＣ−末端に付加されたリジンのε−アミノ基へアシル化した。

ペプチドＯＸＭ１１３（１位デスアミノ−Ｈｉｓ（ΔＮＨ_２−Ｈ）、２位Ａｉｂ（α）、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位３８位）は、ＤＰＰＩＶタンパク質分解から保護するための、１位における野生型（ｗｔ）Ｈｉｓの、デスアミノ−Ｈｉｓによる置換の可能性を調査するためにデザインした。ＯＸＭ１１３は、（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ結合であり、ＯＸＭ１１４は、コレステリル結合であり、そしてＯＸＭ１１２はコントロールペプチド（ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２）であり、ここで側鎖チオール（３８位システイン）は、ヨードアセトアミドと反応した。（ＯＸＭ１１１は、チオール化されたペプチド前駆体である）。

ペプチドＯＸＭ１１７及びＯＸＭ１１８（２位Ａｉｂ（α）、３位ＧｌｎからＡｓｐへの変異、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位３８位）は、３位における野生型Ｇｌｎの、Ａｓｐによる置換の可能性を調査するためにデザインした。上記のように、この変異は、ＧＬＰ−１Ｒに対する特異的選択性を与える。ＯＸＭ１１７は、（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ結合であり、ＯＸＭ１１８は、コレステリル結合である。（ＯＸＭ１１６は、チオール化されたペプチド前駆体である）。

ペプチドＯＸＭ１２１（２位Ａｉｂ（α）、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位１１位）は、オキシントモジュリン配列内の１１位を、結合用の位置として調査するためにデザインした。ＯＸＭ１２１は、（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ結合であり、ＯＸＭ１１９は、チオール化されたペプチド前駆体であり、そしてＯＸＭ１２０は、コントロールペプチド（ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２）であり、ここで側鎖チオール（１１位のシステイン）は、ヨードアセトアミドと反応した。

ペプチドＯＸＭ１２４（２位Ａｉｂ（α）、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位１２位）は、オキシントモジュリン配列内の１２位を、結合用の部位として調査するためにデザインした。ＯＸＭ１２１は、（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ結合であり、ＯＸＭ１２２は、チオール化されたペプチド前駆体であり、かつＯＸＭ１２３は、コントロールペプチド（ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２）であり、ここで側鎖チオール（１２位のシステイン）は、ヨードアセトアミドと反応した。

ペプチドＯＸＭ１２５（２位Ａｉｂ（α）、３位ＧｌｎからＡｓｐへの変異、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位２０位）は、２０位を（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａの結合用の部位として、並びに、ＧＬＰ−１Ｒに対する特異的選択性を与える３位におけるＧｌｎからＡｓｐへの置換を調査するためにデザインした。

ペプチドＯＸＭ１２７（２位Ａｉｂ（α）、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位２２位）は、オキシントモジュリン配列内の２２位をコレステロール用の結合のための部位として調査するためにデザインした。（ＯＸＭ１２６は、チオール化されたペプチド前駆体である）。

ペプチドＯＸＭ１２９（１位デスアミノ−Ｈｉｓ（ΔＮＨ_２−Ｈ）、２位Ａｉｂ（α）、３位ＧｌｎからＡｓｐへの変異、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位２０位）は、以下の組合せの可能性を調査するためにデザインした：ＤＰＰＩＶタンパク質分解からの保護のため１位において野生型Ｈｉｓをデスアミノ−Ｈｉｓで置換すること、ＧＬＰ−１Ｒに対する特異的選択性を与える３位におけるＧｌｎからＡｓｐへの置換、及び、２０位における結合。

ペプチドＯＸＭ１３４（２位Ａｉｂ（α）、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位２０位）は、強力な＋／＋ＯＸＭ１０３類似体に類似の、（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ結合であり、メチオニン置換がメチオニンスルホキシドへの点についてのみ異なっている。このペプチドは、２０位において結合されており、したがって、ＧＬＰ１Ｒ／ＧｃｇＲ選択性については、＋／＋パターンを示す。

実施例４ Ｃ−末端切断類似体又はＧｃｇＫ類似体
Ｃ−末端切断類似体
一連の、ペプチドＯＸＭＣ−末端切断類似体がデザインされた。ＧＬＰ１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）及びＧｃｇ受容体（ＧｃｇＲ）の双方に対するインビトロ活性の分析は、ＯＸＭ配列がＣ−末端において、ｗｔグルカゴンに対し１つだけ余分のリジン残基をもつよう切断可能であり、ＧＬＰ１Ｒ及びＧｃｇＲの双方に対し極めて効力のある、ＯＸＭ９３のようなペプチドを生じることを証明した。ＯＸＭ９３の効力は、ｗｔＯＸＭのそれのよりも、少なくとも１オーダー（及び恐らくは２オーダー）大きい。Ｇｃｇに対し１つだけ余分のリジン残基があることから、この新規なクラスはＧｃｇＫ類似体と呼ばれる。図１６は、ＧＬＰ１及びＧｃｇ受容体において作用する、Ｃ−末端切断類似体に関するインビトロの効力を表形式で例示している。

選択的ＧｃｇＫ類似体であるＣ−末端切断類似体
ペプチドＯＸＭ１３０及びＯＸＭ１３１は、インビトロ分析を確認するため、及び安定性及び好適な特性を与えることが知られている他の変異を導入するためデザインした。ＯＸＭ１３０及びＯＸＭ１３１は、ＯＸＭ９３と同じ長さのＣ−末端切断類似体である。ＯＸＭ１３０は、２位にＡｉｂ（α）を、一方ＯＸＭ１３１は、２位にＡｉｂ（α）を、また３位に、ＧＬＰ１Ｒに対する選択性を与えるためのＧｌｎからＡｓｐへの変異を有する。

以下のＰＥＧ化された類似体を、これらの切断類似体に基づきデザインした：

ペプチドＯＸＭ１３６（２位Ａｉｂ（α）、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位２０位）は、（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａの結合である。先の研究（上記参照）から、２０位におけるＰＥＧ結合の選択は、ＧＬＰ１Ｒ及びＧｃｇＲの双方の受容体に対する活性を与えることが知られており、それ故ＯＸＭ１３６は、プロトタイプＧｃｇ＋／＋類似体として定義されるであろう。（ＯＸＭ１３５は、チオール化されたペプチド前駆体である）。

ペプチドＯＸＭ１３８（２位Ａｉｂ（α）、３位ＧｌｎからＡｓｐへの変異、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位２０位）は、以下の組合せの可能性を調査するためにデザインした：ＧＬＰ−１Ｒに対する特異的選択性を与える３位におけるＧｌｎからＡｓｐへの置換；２０位における結合、及び３位におけるｗｔＧｌｎからＡｓｐへの変異。それ故、ＯＸＭ１３７は、プロトタイプＧｃｇＫ＋／０類似体として定義されるであろう（ＯＸＭ１３７は、チオール化されたペプチド前駆体である）。

図１７は、ＰＥＧ化されたＯＸＭ類似体選択のための、ＧＬＰ１及びＧＣＧ受容体におけるインビトロの効力のデータを提供する。

実施例５：代替のＰＥＧ成分をもつペプチド
ペプチドＯＸＭ１４５（２位Ａｉｂ（α）、３位ＧｌｎからＡｓｐへの変異、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、ジェンケム・セラピューティクス（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）からのＹ型ＰＥＧマレイミドとの結合部位３８位）を、代替の分枝した４０ｋＤａＰＥＧ基を用いる可能性を調査するために調製した。これは、ジェンケム・セラピューティクスからの（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ（Ｙ型ＰＥＧマレイミド、ＭＷ４０Ｋ、商品番号Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋ）を用いて得た結合体であり、その構造は、以下に示される：

ペプチドＯＸＭ１４６は、２位におけるＡｉｂ（α）、３位におけるＧｌｎからＡｓｐへの変異、２７位におけるＭｅｔ（Ｏ）、ＮＯＦコーポレーションからのサンブライトＧＬ２−４００ＭＡマレイミドとの３８位の結合によりキャラクタライズされる。これは、ＮＯＦコーポレーションからの（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ（サンブライト ＧＬ２−４００ＭＡマレイミド）を用いて得た結合体であり、その構造は、以下に示される：

ペプチドＯＸＭ１５１（２位Ａｉｂ（α）、３位ＧｌｎからＡｓｐへの変異、１７位ＡｒｇからＧｌｕへの変異、１８位ＡｒｇからＡｌａへの変異、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位３８位）は、ペプチド配列への、インビボでの増大された安定性を与えるためにデザインした。

詳細な研究を行い、ここではＯＸＭ１３９を１０％のマウス又はヒト血漿を含有するＰＢＳ中、３７℃においてインキュベートした。試料調製は、１μＬの試験溶液と、１μＬのマトリックス（α−シアノ）とを、試料プレート上で直接混合することにより遂行した。結晶化後、Ｔｏｆスペクトルを収集した：３０、６０、１２０及び７２０分の時点で分析し、同じ時点のコントロール試験溶液と比較した。ペプチド配列内では、Ａｒｇ１７とＡｒｇ１８との間の結合は、第１の加水分解部位であると特定された。Ａｒｇ１８とＡｌａ１９との間の結合もまた、第２の加水分解部位であると特定されたため、部位１７及び１８に変異を導入することを決定した。特異的に、Ａｒｇ１７をＧｌｕへ変異させ、Ａｒｇ１８をＡｌａへ変異させた。ペプチドＯＸＭ１５３は、ＯＸＭ１５１のＮ−エチルマレイミド類似体である。ペプチドＯＸＭ１５４は、ＮＯＦコーポレーションからの（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ（サンブライトＧＬ２−４００ＭＡマレイミド）を用いて得られた結合体である。

ペプチドＯＸＭ１５２は、オキシントモジュリン配列の残基１−１６を繋いでおり（２位Ａｉｂ（α）、３位ＧｌｎからＡｓｐへの変異、１７位スペーサーとしてＴｔｄｓ、１８位に結合のためのＣｙｓ）、１−１６配列に対し特異的な抗体を上げるため、担体タンパク質へ結合可能なペプチドである。

ペプチドＯＸＭ１５５（２位Ａｉｂ（α）、３位ＧｌｎからＡｓｐへの変異、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、３８位Ｔｔｄｓ、グルタミン酸残基３９−４３、４４位に結合のためのＣｙｓ）は、抗体を上げるための担体タンパク質へ結合可能なもう１つのペプチドである。Ｃ末端へのグルタミン酸の付加は、２００３年１２月１８日に出願された、仮出願第６０／５３０８６７号（高い免疫原性をもつペプチド−担体結合体の作成法）」（これを参照とすることによりその全を本明細書に組み込む）に記載のように、担体タンパク質への結合を可能にするｐＩ修飾に必要である。

実施例６ 新規な切断類似体又はＧｃｇＫ類似体
ペプチドＯＸＭ１４３（Ａｉｂ（α）、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位２０位）は、ＯＸＭ１３５のＮ−エチルマレイミド類似体である。

ペプチドＯＸＭ１４４（Ａｉｂ（α）、３位ＧｌｎからＡｓｐへの変異、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位２０位）は、ＯＸＭ１３７のＮ−エチルマレイミド類似体である。

ペプチドＯＸＭ１４７（２位Ａｉｂ（α）、結合部位２０位）は、Ｃ２０位に結合部位を有するＧｃｇＫ類似体シリーズ内で、２７位に天然のメチオニン残基をもつようデザインした。このデザインの根拠は、天然メチオニンをもつペプチド類似体がグルカゴン受容体に対しより活性があることであった。

ペプチドＯＸＭ１４８（２位Ａｉｂ（α）、結合部位２０位）は、ＯＸＭ１４７のＮ−エチルマレイミド類似体である。

ペプチドＯＸＭ１４９（２位Ａｉｂ（α）、３位ＧｌｎからＡｓｐへの変異、２７位Ｍｅｔ（Ｏ）、結合部位２０位、及び３０位Ｄ−リジン置換）は、ペプチドＣ−末端の、インビボでの酵素分解からの保護を与えるためデザインした。ペプチドＯＸＭ１５０は、ＯＸＭ１４９のＮ−エチルマレイミド類似体である。

同様の安定性の研究を、ＧｃｇＫシリーズの類似体ＯＸＭ１４４に対し、１０％のマウス又はヒトのいずれかの血漿を含有するＰＢＳとのインキュベーションにより、第１の加水分解部位を決定するために行なった。この例では、Ａｒｇ１７とＡｒｇ１８との間の結合を第１の加水分解部位として特定した。また、Ａｒｇ１８とＡｌａ１９との間の結合も、第２の加水分解部位として特定した。このことから、ＧｃｇＫ類似体シリーズにおいても、部位１７及び１８に変異を導入することが決定された。

ＯＸＭ１４５の合成
５４ｍｇの対応するペプチド前駆体（１１．８μｍｏｌ）を、２ｍＬの８Ｍ尿素、ｐＨ６．５の０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に対し、Ｈ_２Ｏ中に溶解した５６９ｍｇ（１４．２μｍｏｌ）のＹ型ＰＥＧマレイミドＭＷ４０Ｋ（ジェンケム・テクノロジー、商品番号Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋ）（１：１．２ ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比）を添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチド溶液を、０．２％蟻酸でｐＨ２．８に酸性化し、ＴＳＫ ＳＰ−５ＰＷでの陽イオン交換クロマトグラフィー（ＩＸＣ）により、０．２％蟻酸中のＮａＣｌの直線勾配を用いて精製した。ＩＸＣ精製したＰＥＧ化ペプチドを、ＳＥＣによりさらに精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした。

ＯＸＭ１４６の合成
５５ｍｇの対応するペプチド前駆体（１２μｍｏｌ）を、２ｍＬの８Ｍ尿素、ｐＨ６．５の０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に対し、Ｈ_２Ｏ中に溶解した５３１ｍｇ（１３．２μｍｏｌ）のサンブライトＧＬ２−４００ＭＡマレイミド（ＮＯＦコーポレーション）（１：１．１ ｍｏｌ／ｍｏｌのＰＥＧ：ペプチド比）を添加した。１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ化されたペプチド溶液を、０．２％蟻酸でｐＨ２．８に酸性化し、ＴＳＫ ＳＰ−５ＰＷでの陽イオン交換クロマトグラフィー（ＩＸＣ）により、０．２％蟻酸中のＮａＣｌの直線勾配を用いて精製した。ＩＸＣ精製したＰＥＧ化ペプチドを、ＳＥＣによりさらに精製し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆによりキャラクタライズした

実施例７：サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）を用いたＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）シグナリングの測定
ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ及びＤＰ−ＩＶに対する抵抗性の評価
天然の受容体と同様の生物活性をもつヒトＧＬＰ−１Ｒの変異型により安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン−ストレプトマイシン、ヒポキサンチン−チミジン及びＧ４１８を含有する、完全なイスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）培地中に維持した。ＧＬＰ−１受容体活性化に対するホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを使用して、細胞をリガンド、ＸＬ−６６５及び抗−ｃＡＭＰクリプテートと３７℃でインキュベートしたことを除いて製造業者（シスバイオ（ＣｉｓＢｉｏ））の指示に従って、本発明のペプチドとのインキュベーション時のトランスフェクト細胞におけるｃＡＭＰ蓄積を測定した。アッセイは、９６ハーフウェルプレートフォーマット中で、パーキン・エルマーエンビジョンプレートリーダを使用してプレートを読み取った。本発明のポリペプチド及びポリペプチドフラグメント／誘導体については、ｃＡＭＰ ＨＴＲＦアッセイにおけるＧＬＰ−１受容体の「活性化」は、最大活性の誘導であり、それは、天然のヒトＯＸＭ配列により誘導される最大活性の少なくとも約６０％から約２００％までであり、少なくとも０．０４％から約１０００％までの相対効力である。「相対効力」とは、天然のヒトＯＸＭのＥＣ_５０を本発明のポリペプチドのＥＣ_５０で割り、１００倍したものである。「ＥＣ_５０」とは、最大活性の５０％が達成されるポリペプチド濃度である。

ＤＰ−ＩＶ切断に対する抵抗性を測定するため、５μＭのペプチド溶液を、１０ｎＭの組換え可溶性ヒトＤＰ−ＩＶと、１００μｌのアッセイバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．０５％ＢＳＡ）中で、３７℃で２時間プレインキュベートした。続いて、ｈＧＬＰ−１Ｒの活性化を、シスバイオＨＴＲＦｃＡＭＰアッセイを用いて測定し、ＤＰ−ＩＶなしに３７℃で２時間プレインキュベートしたコントロールペプチドと比較した。本発明のポリペプチド類及びそれらのフラグメント／誘導体については、本実験における「ＤＰ−ＩＶに対する抵抗性」は、０．１から３５までの効力比として定義され、ここで「効力比」とは、ＤＰ−ＩＶとプレインキュベートしたペプチドのＥＣ_５０をＤＰ−ＩＶなしでプレインキュベートした本発明の同じポリペプチドのＥＣ_５０で割ったものである（図２）。

実施例８：サイクリックＡＭＰフラッシュプレートアッセイを用いたグルカゴン受容体（ＧｃｇＲ）シグナリングの測定
クローニングされたヒトグルカゴン受容体を発現しているＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｈＧＣＧＲ）（カシエリ（Ｃａｓｃｉｅｒｉ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、１９９９年、第２７４巻、ｐ．８６９４−８６９７）を、１０％ＦＢＳ、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を供えたＩＭＤＭ中に維持した。本発明のペプチドとのインキュベーション時のトランスフェクト細胞におけるｃＡＭＰレベルを、フラッシュプレートアッセイ（ＳＭＰ−００４Ｂ、パーキン・エルマー・ライフ・サイエンス）を利用して、製造業者の指示に従って測定した。細胞刺激を、細胞溶解剤と^１２５Ｉ−標識ｃＡＭＰトレーサーとを含有する等量の検出バッファーの添加により停止した。プレートに結合した^１２５Ｉ−ｃＡＭＰを、液体シンチレーションカウンタを用いて測定し、各試料中に存在するｃＡＭＰ量を定量するために使用した。本発明のポリペプチド類及びポリペプチドフラグメント／誘導体については、ｃＡＭＰフラッシュプレートアッセイにおけるＧｃｇ受容体の「活性化」は、最大活性の誘導であり、それは、天然のグルカゴンペプチドにより誘導される最大活性の少なくとも約６０％から約２００％までであり、少なくとも０．０４％から約１００００％までの相対効力である。「相対効力」は、天然グルカゴンのＥＣ_５０（ＥＣ_５０＝７０ｐＭ）を本発明のポリペプチドのＥＣ_５０で割り、１００倍したものである。「ＥＣ_５０」は、最大活性の５０％が達成されるポリペプチド濃度である。天然のブタＯＸＭは、このアッセイにおいて、２．４ｎＭのＥＣ_５０でグルカゴン受容体を活性化した。

実施例９：やせたマウスにおける腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）の間の血中グルコース変位に対する効果
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを、体重別に処理群へ分配し、実験開始の約５時間前に断食させた。ベースライン（ｔ＝〜３０分）の血中グルコース濃度を、尾部切開の血液からグルコメータにより測定した。次いで動物に、ビヒクル（食塩水）又は本発明のポリペプチド（０．０１−１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。血中グルコース濃度を、処理（ｔ＝０分）の３０分後に測定し、次いでマウスを、デキストロース（２ｇ／ｋｇ、１０ｍＬ／ｋｇ）のｉ．ｐ．により誘発した。ビヒクル処理マウスの１群を、ネガティブコントロールとして通常の食塩水で誘発した。血中グルコースレベルを、デキストロース誘発の２０、４０、６０及び１２０分後に尾部の血から測定した。ｔ＝０からｔ＝１２０分までの血中グルコース変位プロフィールを用いて、各処理について曲線下面積（ＡＵＣ）を積分した。各処理群についてのグルコース変位のパーセント阻害は、式：

［式中、
ＡＵＣ_ｄｅｘ＝ビヒクル処理され、デキストロース誘発された動物の平均ＡＵＣ、
ＡＵＣ_{ｐｅｐｔｉｄｅ}＝ペプチド処理され、デキストロース誘発された動物の平均ＡＵＣ、及び
ＡＵＣ_{ｓａｌｉｎｅ}＝ビヒクル処理され、食塩水誘発された動物の平均ＡＵＣ］に従って、水で誘発したコントロールによりノーマライズしたＡＵＣデータから計算した。

ＩＰＧＴＴにおける本発明のポリペプチドのインクレチン活性は、グルコース変位のパーセント阻害における用量依存性の増加として明示されており、１０ｍｇ／ｋｇの投与において少なくとも３０％に達する（図２）。

実施例１０：やせたマウスにおける摂食及び体重に対する急性効果
約３か月齢の、自由摂食させた雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを秤量し、ビヒクル（水）又はビヒクル中に溶解したＯＸＭ２又はＯＸＭ３のいずれかを、光周期の暗期開始の〜３０分前に、ｉ．ｐ．注射により投与した。光周期の暗期開始の〜５分前に、あらかじめ秤量した量のげっ歯類用固形飼料（テクラド７０１２）を、ワイヤーケージ上のフードホッパーに供給し、光周期の暗期開始の２及び１８時間（一晩）後に秤量した。摂食における絶対変化は、各動物につき、特定の時点においてフードホッパー内に残留する餌の量を対応する元の秤量前の量のそれから引くことにより計算した。体重における絶対変化は、各動物につき、投与前の動物の体重を特定の時点における対応する動物の体重から引くことにより計算した。全ての値は、平均±ＳＥＭとして報告し、ペプチド処理群は、ビヒクル処理動物を基準としてツーテイルド・アンペアード・スチューデント検定（ｔｗｏ ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔｅｓｔ）により分析した。任意の時点における摂食、及び／又は一晩の体重増加における低減は、ｐ値≦０．０５として統計的に有意であって、このモデルにおける対応するＯＸＭポリペプチド（ＯＸＭ２又はＯＸＭ３）の効力を示しているとみなされる（図３）。

実施例１１：マウスにおけるグルコース刺激インスリン分泌の増大
１６ｍｍｏｌ／ｌグルコースでのインスリン分泌の仲介における天然ＯＸＭのインビトロの効力を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの膵島及び、強いＧＳＩＳ活性をもつマウスインスリノーマ細胞系、ＭＩＮ６ｃ４（ミナミ（Ｍｉｎａｍｉ Ｋ）ら著、「アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー、エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．）」、２０００年、第２７９巻、Ｅ７７３−Ｅ７８１）において、天然ＯＸＭペプチドの濃度を増加しながら、１６ｍｍｏｌ／ｌグルコースにおいて、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を測定することにより評価した。膵臓ランゲルハンス島を、正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ジャクソン・ラボラトリー、メイン州）から、レイシー及びコスチアノフスキーの原法（レイシーら著、「ダイアベーツ」、１９６７年、第１６巻、ｐ．３５−３９）の変法である、コラゲナーゼ消化及び不連続フィコール勾配分離により単離した。ＧＳＩＳアッセイに先立ち、膵島を、ＲＰＭＩ１６４０培地（１１ｍＭグルコース）中で一晩培養した。ＧＳＩＳを測定するために、膵島をまず、２ｍＭグルコース入りのクレブス・リンガー重炭酸塩（ＫＲＢ）バッファー中で３０分間プレインキュベートした（ペトリ皿中）。ＫＲＢ培地は、１４３．５ｍＭ Ｎａ^＋、５．８ｍＭ Ｋ^＋、２．５ｍＭ Ｃａ^＋、１．２ｍＭ Ｍｇ^２＋、１２４．１ｍＭ Ｃｌ⁻、１．２ｍＭ ＰＯ_４ ^３−、１．２ｍＭ ＳＯ_４ ^２＋、２５ｍＭ ＣＯ_３ ^２−、２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ｐＨ７．４）を含有する。膵島を、次に９６穴プレートに移し（１膵島／ウェル）、２又は１６ｍＭグルコース入りの２００μｌのＫＲＢバッファー中で、試験されるべき他の薬剤、例えばＧＬＰ−１及びＯＸＭと共に３７℃で６０分間インキュベートした（ゾウ（Ｚｈｏｕ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２００３年、第２７８巻、ｐ．５１３１６−５１３２３）。インスリンを、市販のキット（ＡＬＰＣＯダイアグノスティクス、ニューハンプシャー州ウィンダム）によるＥＬＩＳＡにより、インキュベーションバッファーの少量中で測定した。ＭＩＮ６ｃ４細胞におけるインスリン分泌を、同様の方法で９６穴プレートに播種した細胞において測定した。

図４に示したように、天然のＯＸＭは、マウスの膵島及びＭＩＮ６ｃ４細胞において、ＧＳＩＳを有意に増大した。ＧＳＩＳに対するＯＸＭのＥＣ５０は、各々、ネズミ膵島で約２．９ｎＭ（図４Ａ）、及び１５５ｐＭ（図４Ｂ）であった。天然のＧＬＰ−１を、この実験におけるポジティブコントロールとして使用した。２つのペプチドの最大ＧＳＩＳ効果は、膵島及びＭＩＮ６細胞の双方において類似していた。

ＯＸＭは、実施例７及び８に記載のように、ＣＨＯ細胞において異種発現されたＧＬＰ−１Ｒ及びＧＣＧ−Ｒ双方を活性化し、そして双方の受容体は、膵臓β細胞において機能性であることが知られている。ＯＸＭのインクレチン作用におけるこれら２つのＧ−タンパク質共役受容体の潜在的役割を識別するため、ＧＳＩＳに対するＯＸＭ、ＧＬＰ−１及びＧＣＧの効果を、ＧＬＰ−１Ｒ−／−マウス（スクロッチ（Ｓｃｒｏｃｃｈｉ ＬＡ）ら著、「ネイチャー・メディスン」、１９９６年、第２巻、ｐ．１２５４−１２５８）、及び、齢の合致したＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの膵島において調べた。先の結果と一致して、ＷＴネズミ膵島からの１６ｍｍｏｌ／ｌグルコースにおけるＧＳＩＳの増大においては、３つのペプチドは全て（各１０ｎＭ）等しく有効であった（図５Ａ）。ＧＳＩＳ及びＧＣＧによるＧＳＩＳの相乗作用は、ＧＬＰ−１Ｒ−／−膵島では損なわれなかったのに対し、ＧＬＰ−１及びＯＸＭの双方は、後者においてＧＳＩＳを全く増大することができなかった。ＯＸＭのインクレチン作用におけるＧＬＰ−１Ｒの関与はまた、広く使用されるＧＬＰ−１Ｒのペプチドアンタゴニストであるエキセンジン−９によるこの活性の拮抗作用により示された。ＯＸＭ及びＧＬＰ−１によるＧＳＩＳの相乗作用は、０．５μＭのエキセンジン−９により、ＷＴ膵島において完全に阻止された（図５Ｂ）。

ＯＸＭのインクレチン作用におけるＧＣＧ−Ｒの潜在的な関与を、ペプチド仲介ＧＳＩＳを、ＷＴ及びＧＣＧ−Ｒ−／−マウスからの膵島において１６ｍｍｏｌ／ｌグルコースにより比較することにより試験した（ゲリング（Ｇｅｌｌｉｎｇ ＸＱ）ら著、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ」、２００３年、第１００巻、ｐ．１４３８−１４４３）。先に記載の通り、３つのペプチドの全て（ＧＬＰ−１、ＯＸＭ及びＧＣＧ、各１０ｎＭ）が、等しい効力で、ＷＴ膵島におけるＧＳＩＳを増強した（図６Ａ）。しかしながら、サイズ合致したＷＴ膵島に比較して、２及び１６ｍＭグルコースの双方におけるインスリン分泌は、ＧＣＧ−Ｒ−／−膵島では〜２倍まで低減された。膵島のインスリン含有量もまた、ＧＣＧ−Ｒ−／−膵島ではＷＴに比較して＞３倍まで低減された（図６Ｂ）。ＧＣＧ（１０ｎＭ）は、１６ｍＭグルコースにおいてはＧＣＧ−Ｒ−／−膵島ではＧＳＩＳを増強しなかったのに対し、ＧＬＰ−１及びＯＸＭ（１０ｎＭ）は、ＧＳＩＳを、このアッセイにおいて有意に増大させた。データをフラクショナルＧＳＩＳ（全膵島インスリン含有量に比較した％インスリン放出）として表わすと、ＯＸＭにより仲介されるＧＳＩＳにおける倍数的増加（ｆｏｌｄ−ｉｎｃｒｅａｓｅ）は、ＧＣＧ−Ｒ−／−膵島ではＷＴに比較してわずか３２％（１．７対２．５倍）に低減された（図６Ｃ）のに対し、ＧＬＰ−１によるＧＳＩＳの倍数的刺激は、同じに保持された（２．５倍）。対照的に、ＧＣＧは、ＧＣＧ−Ｒ−／−膵島では、ベースライン（ＤＭＳＯ）を超えてフラクショナルＧＳＩＳを増大することはなかった。これらのデータは、ＧＳＩＳに対するＯＸＭの作用において、ＧＣＧ−Ｒが限定された役割を果たすかもしれないことを示唆している。

ＯＸＭのグルコース低下効果（上記記載のように、また図２に示したように）が、増大されたインビボＧＳＩＳに対し二次的であったかどうかを決定するため、血漿グルコース及びインスリンレベルに対するＯＸＭの効果を、ＷＴ及びＧＬＰ−１Ｒ−／−マウスにおけるＩＰＧＴＴの間に分析した。一晩絶食したマウスに、グルコース誘発に先立ち、０．３ｍｐｋ（ｋｇ体重当たりのｍｇペプチド）の天然ＯＸＭを前投与した（ｉ．ｐ．）。ＧＬＰ−１の模倣薬である、エキセンジン−４（０．０２ｍｐｋでｉ．ｐ．投与）（トレンス（Ｔｈｏｒｅｎｓ，Ｂ）ら著、「ダイアベーツ」、１９９３年、第４２巻、ｐ．１６７８−１６８２）を、この研究における比較対象として用いた。図７Ａに示したように、エキセンジン−４及びＯＸＭの双方は、ＷＴマウスにおいてＩＰＧＴＴの間に、グルコースレベルを有意に低減し、エキセンジン−４は、グルコース変位の抑制においてより強力であった。０．３ｍｐｋのＯＸＭ処理群におけるグルコース変位についての曲線下面積（ＡＵＣ）は、ビヒクル群に比較して約３０％低減された［１３０２５±５２４対１９９２８±８１１ｍｇ／ｄｌ／６０分間］、ｐ＜０．００１、ｎ＝１０（ビヒクル）又は５（ＯＸＭ）］のに対し、エキセンジン−４処理群におけるグルコースＡＵＣの低減は、＞６０％（ＡＵＣ＝６６０１±１７９ｍｇ／ｄｌ／６０分間）であった。対照的に、同じ用量のＯＸＭ及びエキセンジン−４は、ＧＬＰ−１Ｒ−／−マウスにおけるＩＰＧＴＴにおいて、グルコース変位に影響を及ぼさなかった（図７Ｂ）。

インビボのＧＳＩＳでのｉ．ｐ．のＯＸＭ及びエキセンジン−４の効果を、ＩＰＧＴＴ研究において、グルコース誘発の前（０分）及び後（１０分）の血漿インスリンレベルを測定することにより評価した。ＯＸＭは、ＷＴマウスにおいて、ベース（０分）の血漿インスリンレベルを４倍に増大し、ｉ．ｐ．のグルコース誘発に対するインスリン応答を有意に増幅した（図７Ｃ）。同様な結果は、ＷＴマウスにおいて、エキセンジン−４を用いて観察された。対照的に、ＧＬＰ−１Ｒ−／−マウスに対するＯＸＭ又はエキセンジン−４の投与は、ベースのインスリンレベルに影響を及ぼさず、ｉ．ｐ．のグルコース誘発に対するインスリン応答も改善しなかった（図７Ｄ）。

医薬組成物の例
本発明の新規なポリペプチドの経口組成物の１つの具体的な実施態様として、５ｍｇの、式
ＨαＤＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬｍＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡＣ_１０−ＣＯＮＨ_２、
により記載されるポリペプチドを、サイズ０ハードゲルカプセルを満たすように、全量５８０−５９０ｍｇを提供すべく充分な超微粒子状のラクトースと共に製剤する。

本発明の新規なポリペプチドの経口組成物の、もう１つの具体的な実施態様として、２．５ｍｇの、式
ＨαＤＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬｍＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡＣ_１０−ＣＯＮＨ_２、
により記載されるポリペプチドを、サイズ０ハードゲルカプセルを満たすように、全量５８０−５９０ｍｇを提供すべく充分な超微粒子状のラクトースと共に製剤する。

他の実施態様は、以下のクレームの範囲内にある。いくつかの実施態様が示され、記載されてきたが、本発明の精神及び範囲から離れることなく、種々の変更が行われてもよい。

変異型のヒトＧＬＰ−１受容体の、（ａ）天然のブタＯＸＭ、及び（ｂ）ＰＥＧ化されたＯＸＭ２による活性化、及び、ＤＰ−ＩＶとのプレインキュベーションによる、当該ペプチドの効力の減少を描いた説明図である。 やせたマウスの腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）における、ブタオキシントモジュリンのインクレチン活性を示す図である。グルコース変位の％阻害が、各群について示されている。「ｃｔｒｌ」＝ビヒクル処理された食塩水誘発マウス、「ｖｅｈ」＝ビヒクル処理されたデキストロース誘発マウス。 配列ＯＸＭ２及びＯＸＭ３により示されたポリペプチドの、やせたマウスにおける一晩の摂食及び体重増加の低減における効果を例示する図である。^＊ビヒクル群を基準として、ｐ≦０．０５。 膵島及びＭＩＮ６細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）に対する、ＧＬＰ−１及びＯＸＭの効果を描いた図である。 膵島におけるＯＸＭ、ＧＣＧ及びＧＬＰ−１仲介ＧＳＩＳに対する、ＧＬＰ−１Ｒ欠失及び受容体拮抗作用の影響を示す図である。 グルカゴン受容体−／−膵島でのＧＳＩＳに対するＯＸＭの効果を示す図である。 野生型及びＧＬＰ−１Ｒ−／−マウスにおける、ＩＰＧＴＴの間の血中グルコース及びインスリンレベルに対するＯＸＭ及びエキセンジン−４の効果を示す図である。 やせたマウスのＩＰＧＴＴにおける、ＯＸＭ９９の急性のグルコース低下効果を示す図である。 やせたマウスでの、血中グルコースの低減におけるＯＸＭ９９の効果を描いた図である。 やせたマウスのＩＰＧＴＴにおける、ＯＸＭ１１７のグルコース低下効果を示す図である。 エキセンジン−４と比較した、ＯＸＭ類似体であるＯＸＭ１１７及びＯＸＭ９９の、活性の持続時間を示す図である。 ラットにおける皮下投与を用いたＯＸＭ１１７の薬物動態を描いた図である。 ＯＸＭ１１７ペプチドが、インビトロで何らグルカゴン様活性を示さないことを示す研究結果を示す図である。 ＧＬＰ１及びＧＣＧ受容体におけるインビトロ活性のデータを表形式に要約している図である。 ＤＩＯマウスモデルにおける摂食及び体重減少に対する（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ結合体のインビボ活性を示す図である。 ＧＬＰ１及びＧＣＧ受容体において作用するＣ−末端切断類似体についてのインビトロの効力のデータを示す図である。 ＧＬＰ１及びＧＣＧ受容体において作用する選択されたＰＥＧ化ＯＸＭ類似体についてのインビトロの効力のデータを表わす図である。

Claims (8)

1. 式：
   ＨＸ_１Ｘ_２ＧＴＦＴＳＤＹＸ_３ＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡＸ_１４，
   ［式中、
   Ｘ_１は、Ｖａｌ；Ｉｌｅ；Ａｓｐ；Ｇｌｕ；Ｍｅｔ；Ｔｒｐ；Ａｓｎ；Ｄ−Ａｌａ；Ｄ−Ｓｅｒ；及びα−アミノイソ酪酸からなる群より選択され；
   Ｘ_２は、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ又はＬ−ノルロイシンであり；
   Ｘ_３は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）又はＣｙｓ（コレステリル）であり；そして
   Ｘ_１４は、カルボン酸、カルボキサミド、第二級アミド、Ａｌａ、Ｌｙｓ（パルミトイル）、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）、Ｃｙｓ（コレステリル）、又は、ｍＰＥＧ又はコレステロールが化学結合により結合した任意のリンカーであり、ここで、ｍＰＥＧはメトキシＰＥＧを表す］の修飾オキシントモジュリン（ＯＸＭ）配列からなるポリペプチド、又は医薬的に許容されるその塩。
2. Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）がＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３又はＣ_６であり、ここで、Ｃ_１＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）５ｋＤａ、Ｃ_２＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）２０ｋＤａ、Ｃ_３＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）_２４０ｋＤａ、Ｃ_６＝Ｃｙｓ（ｍＰＥＧ）_２６０ｋＤａであり、各々が、側鎖チオールを介し、およそ示されたＭＷの直鎖メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）又は分枝鎖ｍＰＥＧ_２によりＰＥＧ化されたシステイン残基に相当する、請求項１記載のポリペプチド。
3. 式：
   ＨＸ_１ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ
   ［式中、Ｘ_１は、Ｖａｌ；Ｉｌｅ；Ａｓｐ；Ｇｌｕ；Ｍｅｔ；Ｔｒｐ；Ａｓｎ；Ｄ−Ａｌａ；Ｄ−Ｓｅｒ；及びα−アミノイソ酪酸からなる群より選択される］からなる、請求項１記載のポリペプチド。
4. 式：
   ＨＳＸ_２ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ
   ［式中、Ｘ_２は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ及びＬ−ノルロイシンからなる群より選択される］からなる、請求項１記載のポリペプチド。
5. 配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０、３１、３３、３４、３５、３６，３７、３８、３９、１１９、１２０又は１２１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド又は医薬的に許容されるその塩。
6. それを必要とする患者における代謝性疾患の治療に用いるための請求項１〜５のいずれかの請求項に記載のポリペプチド。
7. 請求項１〜５のいずれかの請求項に記載のポリペプチドと、医薬的に好適な担体とを包含する医薬組成物。
8. グルコースレベルの低下に用いるための請求項１〜５のいずれかの請求項に記載のポリペプチド。
   

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