JP4986547B2 - 新規なアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、それをコードするＤＮＡ配列、当該酵素の製造方法および当該酵素を利用したメバロン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、新規なアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、それをコードするDNA配列、当該酵素の製造方法および当該酵素を利用したメバロン酸の製造方法に関する。
アセトアセチルＣｏＡ(アセトアセチル・コエンザイムA)は、生理活性物質群であるテルペノイドの重要な生合成中間体である。また、生理的なエネルギー源であるケトン体（アセト酢酸、D-３-ヒドロキシ酪酸等）の中間体でもある。
テルペノイドの生合成は、メバロン酸を経由するメバロン酸経路と、メバロン酸を経由しないMEP経路（２-C-methyl-D-erythritol ４-phosphate経路）の全く異なる二つの生合成経路が知られているが、アセトアセチルＣｏＡを経由するのは、メバロン酸経路だけである。
メバロン酸経路では、生理的にはエネルギー代謝、脂肪酸合成、テルペノイド合成の３大代謝経路で重要な役割を演じるアセチルＣｏＡを出発物質として、〔図１〕に記載のスキーム１の反応によりイソペンテニル二リン酸(IPP)が生成することが知られている。
テルペノイドの生合成は、メバロン酸を経由するメバロン酸経路と、メバロン酸を経由しないMEP経路（２-C-methyl-D-erythritol ４-phosphate経路）の全く異なる二つの生合成経路が知られているが、アセトアセチルＣｏＡを経由するのは、メバロン酸経路だけである。
メバロン酸経路では、生理的にはエネルギー代謝、脂肪酸合成、テルペノイド合成の３大代謝経路で重要な役割を演じるアセチルＣｏＡを出発物質として、〔図１〕に記載のスキーム１の反応によりイソペンテニル二リン酸(IPP)が生成することが知られている。
これらの反応はそれぞれ、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素、HMG ＣｏＡ合成酵素、HMG ＣｏＡ還元酵素、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが触媒する。なお、個々の酵素反応は(→)で示しているが脱炭酸反応以外は基本的に可逆反応であり、順次反応が進んで基質が消費されていくため反応が進行する。
即ち、これまで知られているアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(以下タイプ１)は、本発明者らによるアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(たとえば特許文献１参照)を含めてアセチルＣｏＡ二分子からアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素であるが、当該発明の酵素、即ちアセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡを基質としてアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素(以下タイプ２)は全く知られていなかった。
即ち、これまで知られているアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(以下タイプ１)は、本発明者らによるアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(たとえば特許文献１参照)を含めてアセチルＣｏＡ二分子からアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素であるが、当該発明の酵素、即ちアセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡを基質としてアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素(以下タイプ２)は全く知られていなかった。
一方、大腸菌等の細菌中の脂肪酸合成では、当該発明と類似の〔図２〕に記載のスキーム２の反応経路で進行することが知られている。このスキーム２のうち、反応３を触媒する酵素が脂肪酸合成酵素（KAS III）である。
しかしこの反応経路ではアセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡは、一旦アセチル-ACP、マロニル-ACPとなり、ACP上で反応が進行するため、遊離型のアセトアセチルＣｏＡは中間体として存在しせず、当該発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)とは全く異なる。また、ヒト等の真核生物では上記ACPが関与する部分が多機能酵素複合体となっていることが知られている。
テルペノイドは、炭素数５のイソプレン単位を基本骨格に持つ一群の有機化合物の総称であり、イソペンテニルピロリン酸（IPP）の重合によって生合成される。（C５H８）nの不飽和炭化水素以外に、それらの酸化還元生成物(アルコール、ケトン、酸等）、炭素の脱離した化合物などが多くの植物及び動物体内に見いだされている。テルペノイドは、炭素数によりヘミテルペン（C５）、モノテルペン（C１０）、セスキテルペン（C１５）、ジテルペン（C２０）、セスタテルペン（C２５）、トリテルペン（C３０）、テトラテルペン（C４０、カロチノイド）及びその他のポリテルペンに分類することができる。
また、テルペノイドの中には、アブシジン酸、幼若ホルモン、ジベレリン、フォルスコリン、ホルボールなど生理活性を示す化合物も多い。また、構造の一部にイソプレン構造を有する複合テルペンとしてクロロフィル、ビタミンK、ユビキノン、tRNA等があり、これらも有用な生理活性を示す。
また、テルペノイドの中には、アブシジン酸、幼若ホルモン、ジベレリン、フォルスコリン、ホルボールなど生理活性を示す化合物も多い。また、構造の一部にイソプレン構造を有する複合テルペンとしてクロロフィル、ビタミンK、ユビキノン、tRNA等があり、これらも有用な生理活性を示す。
例えば、テルペノイド化合物の一種であるユビキノンは、電子伝達系の必須成分として、生体内で重要な機能を果たしており、心疾患に効果のある医薬品として使用されているほか、欧米および日本で健康食品としての需要が増大している。また、ビタミンＫは血液凝固系に関与する重要なビタミンであり、止血剤として利用されているほか、最近では骨代謝への関与が示唆され、骨粗鬆症治療への応用が期待されており、フィロキノンとメナキノンは医薬品として許可されている。
また、ユビキノンやビタミンＫ類には船体や橋脚等の建造物への貝類の付着阻害作用が在り、貝類付着防止塗料への応用が期待される。さらに、カロチノイドには抗酸化作用があり、β−カロチン、アスタキサンチン、クリプトキサンチン等、がん予防や免疫賦活活性を有するものとして期待されているものもある。このように、テルペノイドには生体にとって有用な物質が含まれているが、これらの化合物は全て基本骨格単位であるイソペンテニルピロリン酸(IPP)を経由して生合成されることが知られている。
また、ユビキノンやビタミンＫ類には船体や橋脚等の建造物への貝類の付着阻害作用が在り、貝類付着防止塗料への応用が期待される。さらに、カロチノイドには抗酸化作用があり、β−カロチン、アスタキサンチン、クリプトキサンチン等、がん予防や免疫賦活活性を有するものとして期待されているものもある。このように、テルペノイドには生体にとって有用な物質が含まれているが、これらの化合物は全て基本骨格単位であるイソペンテニルピロリン酸(IPP)を経由して生合成されることが知られている。
大腸菌などの原核生物では、従来技術で述べたようにMEP経路、即ち、ピルビン酸とグリセルアルデヒド-３-リン酸が縮合して生じる１-デオキシ-D-キシルロース ５-リン酸を経由してIPPが生合成される経路が発見されており（非特許文献１参照）、13Cラベル化基質を使った実験から１-デオキシ-D-エリスリトール ４-リン酸を経由してIPPへと転換されることが証明されている。（非特許文献２、３参照）。特に大腸菌ではIPPは非メバロン酸経路でのみ合成されることが実証されている（非特許文献４参照）。
一方、放線菌Streptomyces sp. CL１９０株（非特許文献５参照）は、MEP経路に加えてメバロン酸経由でIPPを合成していることが分っており（非特許文献６，７参照）、本発明者等はこれまでに放線菌Streptomyces sp. CL１９０株からメバロン酸経路上の一つの反応を触媒する酵素であるHMG ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子 (hmgr) （非特許文献８参照）、およびメバロン酸経路に関与する６種の酵素、即ち、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、メバロン酸キナーゼ、イソペンテニル ２-リン酸イソメラーゼ、HMG ＣｏＡ還元酵素、HMG ＣｏＡ合成酵素、を含むメバロン酸経路遺伝子クラスターを既にクローニングした（特許文献２、及び、非特許文献９、１０参照）。
本発明者等は先に述べた放線菌Streptomyces sp. CL１９０株のメバロン酸経路遺伝子クラスターのすぐ下流に、機能未知のORF (オープン・リーディング・フレーム) が存在することを見いだし、このORFがアセトアセチルＣｏＡ合成酵素活性を持つのではないかと検討を重ねた。その結果、驚くべきことに、当該酵素は二分子のアセチルＣｏＡを基質とする既知のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素活性(タイプ１)は全く示さないが、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡの両方を基質とする場合にアセトアセチルＣｏＡを生成する(タイプ２)ことを見いだし本発明に至った。
従って本発明の目的は、新規なアセトアセチルＣｏＡ合成酵素（タイプ２）を提供し、さらに当該酵素を利用したメバロン酸の製造方法を提供することにある。
本発明者等は、これまで機能未知のタンパク質をコードするDNA配列(オープン・リーディング・フレーム=ORF)が全く新しいタイプの反応(新規機能)を触媒する酵素遺伝子であることを見いだし本発明に至った。
即ち、本願の第1の発明は、新規アセトアセチルＣｏＡ合成酵素である。また、本願の第２の発明は、該新規アセトアセチルＣｏＡ合成酵素活性を有するアミノ酸配列である。さらに、本願の第３の発明は、該酵素を機能させるのに必要な配列をすべてコートする塩基配列である。そして、本願の第４の発明は、該塩基配列を含むベクターである。また、本願の第５の発明は、該ベクターを含有する形質転換体である。さらに、本願の第６の発明は該形質転換体を培養することを特徴とする新規アセトアセチルＣｏＡ合成酵素の製造方法である。最後に、本願の第７の発明は、該新規アセトアセチルＣｏＡ合成酵素を利用したメバロン酸の製造方法である。
本発明によれば、新規なアセトアセチルＣｏＡ合成酵素を提供することが出来る。さらに、本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素を利用して天然型のメバロン酸を提供することが出来る。
以下、本発明の新規なアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、それをコードするDNA配列、当該酵素の製造方法および当該酵素を利用したメバロン酸の製造方法を具体的に示す。
本明細書において「１から数個の塩基が欠失、置換、付加及び/または挿入されている」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換、付加及び/または挿入されていることを意味する。本明細書においては、「１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び/または挿入されている］とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の下図のアミノ酸が欠失、置換、付加及び/または挿入されていることを意味する。
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング 第二版等に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、相同性は、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、もっとも好ましくは９８％以上である。
本発明は、A) 放線菌Streptomyces sp. CL１９０株のメバロン酸経路の遺伝子クラスターのすぐ下流にあるアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)をコードするDNAの取得、B） アセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)タンパク質をコードするDNAを有する形質転換体の作製と、C） 該酵素蛋白質をコードするDNAを有する形質転換体での該酵素蛋白質の発現、D) 該酵素蛋白質の機能の確認、即ちアセトアセチルＣｏＡ合成酵素（タイプ２）の基質および反応生成物の同定、E) 該酵素蛋白質をコードするDNA、HMG ＣｏＡ 合成酵素蛋白質をコードするDNA、HMG ＣｏＡ 還元酵素蛋白質をコードするDNAの三種をクローニングした放線菌の形質転換体によるメバロン酸生産、よりなる。
まず、上記A) 放線菌Streptomyces sp. CL１９０株のメバロン酸経路の遺伝子クラスターのすぐ下流にある本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)をコードするDNAの取得について詳述する。
放線菌Streptomyces sp. CL１９０株を適当な培地、例えばグルコース２％、可溶性でんぷん２．５％、大豆粉１．５％、ドライイースト０．２％、炭酸カルシウム０．４％、pH ６.２より成るKG培地で適当な温度(例えば３０℃)で数日間培養する。培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得し、菌体より常法(モレキュラー・クローニング 第二版)に従い染色体DNAを単離精製する。
放線菌Streptomyces sp. CL１９０株を適当な培地、例えばグルコース２％、可溶性でんぷん２．５％、大豆粉１．５％、ドライイースト０．２％、炭酸カルシウム０．４％、pH ６.２より成るKG培地で適当な温度(例えば３０℃)で数日間培養する。培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得し、菌体より常法(モレキュラー・クローニング 第二版)に従い染色体DNAを単離精製する。
PCR法により配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡを取得するためには、放線菌Streptomyces sp. CL１９０株の染色体DNAを鋳型として使用し、配列番号３と配列番号４からなる１対のプライマーＤＮＡを使用して、TaKaRa LA-PCRTM Kit Ver.２(宝酒造社製)またはExpandTM High-Fidelity PCR System(ベーリンガー・マンハイム社製)等を用い、ＤＮＡThermal Cycler(パーキンエルマージャパン社製)でPCRを行う。なお、後のクローニング操作を容易にするために、プライマーには適当な制限酵素部位を付加させておくことが好ましい。
ＰＣＲの条件として、９５℃で３０秒間(変性)、５５℃で３０秒〜１分間(アニーリング)、７２℃で１分間〜２分間(伸長)からなる反応工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件をあげることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。クローニングは、常法、例えば、モレキュラー・クローニング 第二版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement １〜３８, John Wiley & Sons (１９８７-１９９７)(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、DNA Cloning １: Core Techniques, A PracticalApproach, Second Edition, Oxford University Press (１９９５)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Plasmid System for cDNASynthesis and Plasmid Cloning（ライフ・テクノロジーズ社製）やZAP-cDNA Synthesis Kit〔ストラタジーン（Staratagene)社製〕を用いて行うことが出来る。
クローニングベクターとしては、大腸菌K１２株中で自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる、大腸菌の発現用ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, ５, ５８ (１９９２)〕、pBluescript II SK(+)〔Nucleic Acids Research,１７, ９４９４ (１９８９)〕、Lambda ZAP II（ストラタジーン社製）、λgt１０、λgt１１〔DNA Cloning, A Practical Approach, １, ４９ (１９８５)〕、λTriplEx（クローンテック社製）、λExCell（ファルマシア社製）、pT７T３１８U（ファルマシア社製）、pcD２〔H.Okayama and P.Berg；Mol. Cell. Biol., ３, ２８０ (１９８３)〕、pMW２１８（和光純薬社製）、pUC１１８（宝酒造社製）、pEG４００〔J. Bac.,１７２, ２３９２ (１９９０)〕、pQE-３０（QIAGEN社製）等をあげることができる。
得られた形質転換株より、目的とするＤＮＡを含有したプラスミドを常法、例えば、モレキュラー・クローニング 第二版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement １〜３８, John Wiley & Sons (１９８７-１９９７)、DNA Cloning １: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (１９９５)等に記載された方法により取得することができる。上記方法により、配列番号２を有するＤＮＡを取得することができる。
また、配列番号２において、１から数個の塩基が欠失、置換、付加及び/または挿入されている塩基配列であって、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)をコードする塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、アセトアセチル合成酵素活性(タイプ２)を有する酵素蛋白質をコードする塩基配列も本発明の範囲内である。
例えば、配列番号２の塩基配列を有する放線菌由来のＤＮＡ断片の塩基配列を利用し、他の微生物等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。あるいは、上記したように変異ＤＮＡは化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者が既知の任意の方法で作製することもできる。具体的には配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。
例えば、配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異源となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法を用いて行う方法がある。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発方法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research,１０,６４８７(１９８２) 、Nucleic Acids Research,１２,９４４１(１９８４) 、Nucleic Acids Research,１３,４４３１(１９８５) 、Nucleic Acids Research,１３,８７４９(１９８５) 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,７９,６４０９(１９８２) 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,８２,４８８(１９８５) 、Gene,１０２,６７(１９９１)等に記載の方法に準じて行うことができる。
以上により得られた、本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)遺伝子の塩基配列はアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ１)の塩基配列(特開平２００４-２３６６１８)と全く相同性が無い。また、本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)遺伝子の塩基配列がコードするアミノ酸配列はアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ１)の塩基配列(特開平２００４-２３６６１８)がコードするアミノ酸配列と全く相同性が無い。
次に、上記B）本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)タンパク質をコードするDNAを有する形質転換体の作製について詳述する。
以下では、放線菌を例に示しながら説明するが、本発明は該菌株由来の酵素遺伝子以外でも、放線菌や微生物、動物細胞、植物細胞由来等メバロン酸経路を持つ生物由来の酵素遺伝子を形質転換してよい。
以下では、放線菌を例に示しながら説明するが、本発明は該菌株由来の酵素遺伝子以外でも、放線菌や微生物、動物細胞、植物細胞由来等メバロン酸経路を持つ生物由来の酵素遺伝子を形質転換してよい。
本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)遺伝子は、実質的にアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)、即ち、１）配列番号２の塩基配列、あるいは、２）配列番号２において１〜数個の塩基配列が欠失、置換、付加及び/または挿入されている塩基配列であって、本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素を機能させるために必要な配列をすべてコードする塩基配列、あるいは、３）配列番号２の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)を機能させるのに必要な配列をすべてコードする塩基配列である。
本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)遺伝子は、いかなる生物由来であっても構わないが、宿主細胞中で酵素遺伝子から産生される酵素蛋白質の発現効率が高いことが好ましい。また発現した酵素蛋白質が高い触媒機能を発現できる細胞との組合せが好ましい。この点から、細胞としてメバロン酸経路を持たない宿主細胞を用いる場合はこの宿主細胞のメバロン酸経路クラスター近傍にある酵素遺伝子が好ましく、さらに宿主細胞は、放線菌が好ましい。宿主細胞として放線菌を用いる場合は、放線菌由来のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)遺伝子が好ましい。アセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)遺伝子の好ましい１例として配列番号２が挙げられる。
得られた酵素遺伝子を含むDNA断片を宿主細胞中で発現させるためにはまず目的とする該DNA断片を制限酵素あるいはDNA分解酵素で該遺伝子を含む適当な長さのDNA断片とした後、発現ベクター中においてプロモーターの下流に挿入し、次いで上記DNAを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
本発明で使用する宿主細胞としては、非メバロン酸経路を利用している（メバロン酸経路を有しない）宿主細胞として、グラム陽性菌であるAlicyclobacillus属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Mycobacterium属、Bacillus属、Clostridium属、Deinococcus属、多くのStreptomyces属、グラム陰性菌であるEscherichia属、Salmonella属、Agrobacterium属、Azotobacter属、Methylobacterium属、Pseudomonas属、Rhodopseudomonas属、Zymomonas属、光合成グラム陰性細菌であるChromatium属、Rhodospirillum属、藍藻であるAnabaena属、Anacystis属、Phormidium属、Synnecoccus属、緑藻であるChlorella属、Scenedesmun属、等に属する生物をあげることが出来る。
ちなみに、メバロン酸経路を利用している（メバロン酸経路を有している）宿主細胞では、動物細胞、真菌、酵母、グラム陽性菌であるActinoplanes属、 Lactobacillus属、 Mycoplasma属、Staphylococcu属、Enterococcus属、Streptococcus属、一部のStreptomyces属、グラム陰性菌であるChloropseudomonas属、Flavobacterium属、Myxococcus属、Nannocystis属、Borrelia属、古細菌であるArchaeoglobus属、Methanobacterium属、Methanococcus属、Pyrococcus属、 Cardarella属、 Halobacterium属、 Sulfolobus属、などが知られている。
また、一部のStreptomyces属はメバロン酸経路と非メバロン酸の両方を利用していることが知られている。
ちなみに、メバロン酸経路を利用している（メバロン酸経路を有している）宿主細胞では、動物細胞、真菌、酵母、グラム陽性菌であるActinoplanes属、 Lactobacillus属、 Mycoplasma属、Staphylococcu属、Enterococcus属、Streptococcus属、一部のStreptomyces属、グラム陰性菌であるChloropseudomonas属、Flavobacterium属、Myxococcus属、Nannocystis属、Borrelia属、古細菌であるArchaeoglobus属、Methanobacterium属、Methanococcus属、Pyrococcus属、 Cardarella属、 Halobacterium属、 Sulfolobus属、などが知られている。
また、一部のStreptomyces属はメバロン酸経路と非メバロン酸の両方を利用していることが知られている。
本発明で使用する宿主細胞は、メバロン酸経路を有しない微生物であり、特に好ましくはメバロン酸経路を有しない放線菌、例えばStreptomyces lividans、Streptomyces chromofuscus、Streptomyces exfoliatus、Streptomyces argenteorus、等が好ましい。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。細菌等を宿主細胞として用いる場合は、上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp２、pBTac１、pBTac２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK２３３-２（Pharmacia社製）、pSE２８０（Invitrogen社製）、pGEMEX-１（Promega社製）、pQE-８（QIAGEN社製）、pQE-３０（QIAGEN社製）、pKYP１０（特開昭５８-１１０６００）、pKYP２００〔Agricultural Biological Chemistry, ４８, ６６９ (１９８４)〕、pLSA１〔Agric. Biol. Chem., ５３, ２７７ (１９８９)〕、pGEL１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８２, ４３０６ (１９８５)〕、pBluescriptII SK+、pBluescriptII SK(-)（Stratagene社製）、pTrS３０(FERMBP-５４０７)、pTrS３２(FERM BP-５４０８)、pGEX（Pharmacia社製）、pET-３（Novagen社製）、pTerm２(US４６８６１９１、US４９３９０９４、US５１６０７３５)、pSupex、pUB１１０、pTP５、pC１９４、pUC１８〔gene, ３３, １０３ (１９８５)〕、pUC１９〔Gene, ３３, １０３ (１９８５)〕、pSTV２８(宝酒造社製)、pSTV２９（宝酒造社製）、pUC１１８（宝酒造社製）、pPA１（特開昭６３-２３３７９８号公報）、pEG４００〔J. Bacteriol., １７２, ２３９２(１９９０)〕等を例示することができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO１プロモーター、SPO２プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、letIプロモーター、lacT７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好ましい。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ６９, ２１１０ (１９７２)〕、プロトプラスト法（特開昭６３-２４８３９４２号公報）、またはGene, １７, １０７ (１９８２)やMolecular & General Genetics, １６８, １１１ (１９７９)に記載の方法等をあげることができる。
３番目に、上記C）該酵素蛋白質をコードするDNAを有する形質転換体での該酵素蛋白質の発現について詳述する。
上記ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)タンパク質を生成させることができる。
上記ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)タンパク質を生成させることができる。
発明の形質転換体が大腸菌、放線菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
本発明の形質転換体は、酵素タンパク質を効率的に発現できる能力を有する宿主細胞であればどのような細胞でも構わないが、大腸菌、パン酵母、放線菌(Streptomyces属)が好ましく、大腸菌がもっとも好ましい。また、得られた酵素タンパク質の精製・活性発現供に容易であるため得られた酵素タンパク質は水溶性であることが好ましいが、水不溶性であっても何らかの方法、例えば界面活性剤添加等、で可溶化しても良い。
本発明の形質転換体により調製した酵素タンパク質は他のタンパク質との融合タンパク質であっても良いが、融合部分がない構造が好ましい。
本発明の形質転換体は、酵素タンパク質を効率的に発現できる能力を有する宿主細胞であればどのような細胞でも構わないが、大腸菌、パン酵母、放線菌(Streptomyces属)が好ましく、大腸菌がもっとも好ましい。また、得られた酵素タンパク質の精製・活性発現供に容易であるため得られた酵素タンパク質は水溶性であることが好ましいが、水不溶性であっても何らかの方法、例えば界面活性剤添加等、で可溶化しても良い。
本発明の形質転換体により調製した酵素タンパク質は他のタンパク質との融合タンパク質であっても良いが、融合部分がない構造が好ましい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン、チオストレプトン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン、チオストレプトン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
以上により得られた酵素タンパク質は菌体内生産の場合は宿主細胞を破壊し塩析、透析、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、有機溶剤処理、加熱処理等公知のタンパク質精製方法の組み合わせにより、必要な精製度まで精製する。また、反応や反応産物に支障がなければ菌体そのものや菌体を破壊した溶液、破壊溶液の可溶性画分でも良い。
以上により得られた酵素タンパク質は菌体内生産の場合は宿主細胞を破壊し塩析、透析、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、有機溶剤処理、加熱処理等公知のタンパク質精製方法の組み合わせにより、必要な精製度まで精製する。また、反応や反応産物に支障がなければ菌体そのものや菌体を破壊した溶液、破壊溶液の可溶性画分でも良い。
次に、上記D）該酵素蛋白質の機能の確認、即ち本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素の基質および反応生成物の同定について詳述する。
（１） アセトアセチルＣｏＡ合成酵素の酵素活性の測定
アセトアセチルＣｏＡ合成酵素の酵素活性の測定は、通常の酵素の活性測定法に準じて行うことができる。
即ち、活性測定の反応液に用いる緩衝液のpHは、目的とする酵素の活性を阻害しないpH範囲であればよく、最適pHを含む範囲のpHが好ましい。
（１） アセトアセチルＣｏＡ合成酵素の酵素活性の測定
アセトアセチルＣｏＡ合成酵素の酵素活性の測定は、通常の酵素の活性測定法に準じて行うことができる。
即ち、活性測定の反応液に用いる緩衝液のpHは、目的とする酵素の活性を阻害しないpH範囲であればよく、最適pHを含む範囲のpHが好ましい。
例えば、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素においては、ｐＨ５〜１０、好ましくは６〜９である。
緩衝液としては、酵素活性を阻害せず、上記ｐＨを達成できるものであればいずれの緩衝液も用いることができる。該緩衝液として、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液、硼酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、炭酸水素緩衝液などを用いることができる。アセトアセチルＣｏＡ合成酵素においては、例えば、トリス塩酸緩衝液が好適に用いられる。
緩衝液の濃度は酵素活性に阻害を及ぼさない限りどのような濃度でも用いることができるが、好適には１ｍＭから１Ｍである。
緩衝液としては、酵素活性を阻害せず、上記ｐＨを達成できるものであればいずれの緩衝液も用いることができる。該緩衝液として、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液、硼酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、炭酸水素緩衝液などを用いることができる。アセトアセチルＣｏＡ合成酵素においては、例えば、トリス塩酸緩衝液が好適に用いられる。
緩衝液の濃度は酵素活性に阻害を及ぼさない限りどのような濃度でも用いることができるが、好適には１ｍＭから１Ｍである。
反応液には、目的とする酵素の基質を添加する。例えば、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素（タイプ２）においては、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡを添加する。
基質の濃度は反応に支障のない限りどのような濃度でも用いることができるが、好適には反応液中の濃度は０．０１ｍＭ〜０．２Ｍである。
反応に用いる酵素濃度に特に制限はないが、通常０．００１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で反応を行う。
用いる酵素は必ずしも単一にまで精製されている必要はなく、反応を妨害しない限り、他の侠雑蛋白質が混入した標品であってもよい。
基質の濃度は反応に支障のない限りどのような濃度でも用いることができるが、好適には反応液中の濃度は０．０１ｍＭ〜０．２Ｍである。
反応に用いる酵素濃度に特に制限はないが、通常０．００１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で反応を行う。
用いる酵素は必ずしも単一にまで精製されている必要はなく、反応を妨害しない限り、他の侠雑蛋白質が混入した標品であってもよい。
反応温度は、目的とする酵素の活性を阻害しない温度範囲であればよく、最適温度を含む範囲の温度が好ましい。即ち、反応温度は、１０℃から６０℃、より好ましくは３０℃から４０℃である。
活性の検出は、反応に伴う基質の減少、あるいは反応生成物の増加の変化を測定できる方法を用いて行うことができる。
該方法として、例えば、必要に応じて薄相クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）等により目的物質を分離定量する方法をあげることができる。また反応の進行に伴ってMg2+イオンをキレートして複合体を形成する場合には、反応液の３０３ｎｍの吸光度を測定することで活性を直接測定することができる。例えば、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素においては、生成するアセトアセチルＣｏＡとMg2+イオンからなる複合体のもつ３０３ nmの吸光の増加を分光光度計で測定することにより、反応の進行に伴い増加するアセトアセチルＣｏＡを定量し活性を検出することができる。なお、この方法は、アセトアセチルＣｏＡの定量だけではなく、３−オキソペンタノイルＣｏＡのような１,３-ジケトン構造を有する化合物の定量にも利用できる。
活性の検出は、反応に伴う基質の減少、あるいは反応生成物の増加の変化を測定できる方法を用いて行うことができる。
該方法として、例えば、必要に応じて薄相クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）等により目的物質を分離定量する方法をあげることができる。また反応の進行に伴ってMg2+イオンをキレートして複合体を形成する場合には、反応液の３０３ｎｍの吸光度を測定することで活性を直接測定することができる。例えば、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素においては、生成するアセトアセチルＣｏＡとMg2+イオンからなる複合体のもつ３０３ nmの吸光の増加を分光光度計で測定することにより、反応の進行に伴い増加するアセトアセチルＣｏＡを定量し活性を検出することができる。なお、この方法は、アセトアセチルＣｏＡの定量だけではなく、３−オキソペンタノイルＣｏＡのような１,３-ジケトン構造を有する化合物の定量にも利用できる。
反応産物の同定には、薄相クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）等により目的物質を分離した後、標品と保持時間を比較する方法、核磁気共鳴吸収装置や質量分析計を用いる方法を用いることができる。
最後に、上記E) 本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ ＣｏＡ合成酵素及びＨＭＧ ＣｏA還元酵素の３種類の酵素タンパク質を生成させ、本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素（タイプ２）タンパク質、ＨＭＧ ＣｏＡ合成酵素タンパク質およびＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素タンパク質の機能によりメバロン酸を蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法について詳述する。
本発明では、メバロン酸の生合成に関与する酵素蛋白質をコードするＤＮＡとして、本発明のタイプ２のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、HMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子およびHMG ＣｏＡ還元酵素遺伝子の３種類の遺伝子を形質転換することが必須である。
以下では、放線菌を例に示しながら説明するが、本発明は該菌株由来の酵素遺伝子以外でも、放線菌や微生物、動物細胞、植物細胞由来等メバロン酸経路を持つ生物由来の酵素遺伝子を形質転換してよい。
本発明で使用するHMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、実質的にHMG ＣｏＡ合成酵素、すなわちアセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡからHMG ＣｏＡを生成する反応を触媒する活性をもつ酵素蛋白質をコードするDNA配列であればよい。また、酵素反応にNADPH等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
本発明で使用するHMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、実質的にHMG ＣｏＡ合成酵素、すなわちアセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡからHMG ＣｏＡを生成する反応を触媒する活性をもつ酵素蛋白質をコードするDNA配列であればよい。また、酵素反応にNADPH等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
また、本発明で使用するHMG ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、実質的にHMG ＣｏＡ還元酵素、すなわちHMG ＣｏＡからメバロン酸を生成する反応を触媒する活性をもつ酵素蛋白質をコードするDNA配列であればよい。また、酵素反応にNADPH等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、HMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子およびHMG ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、いかなる生物由来であっても構わないが、宿主である放線菌細胞中で酵素遺伝子から産生される酵素蛋白質の発現効率が高いことが好ましい。また発現した酵素蛋白質が高い触媒機能を発現できる細胞との組合せが好ましい。この点から、細胞としてメバロン酸経路を持たない微生物を用いる場合は微生物のメバロン酸経路由来の酵素遺伝子が好ましく、さらに放線菌由来が好ましい。特に放線菌由来の本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子及び、放線菌由来のメバロン酸経路から得たHMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子およびHMG ＣｏＡ還元酵素遺伝子との３種類の組合せが好ましい。
本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、HMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子およびHMG ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、いかなる生物由来であっても構わないが、宿主である放線菌細胞中で酵素遺伝子から産生される酵素蛋白質の発現効率が高いことが好ましい。また発現した酵素蛋白質が高い触媒機能を発現できる細胞との組合せが好ましい。この点から、細胞としてメバロン酸経路を持たない微生物を用いる場合は微生物のメバロン酸経路由来の酵素遺伝子が好ましく、さらに放線菌由来が好ましい。特に放線菌由来の本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子及び、放線菌由来のメバロン酸経路から得たHMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子およびHMG ＣｏＡ還元酵素遺伝子との３種類の組合せが好ましい。
得られた３種類の酵素遺伝子を含むDNA断片を放線菌細胞中で発現させるためにはまず目的とする該DNA断片を制限酵素あるいはDNA分解酵素で該遺伝子を含む適当な長さのDNA断片とした後、発現ベクター中においてプロモーターの下流に挿入し、次いで上記DNAを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した放線菌細胞中に導入する。
本発明で使用する宿主細胞は、メバロン酸経路を有しない放線菌、例えばStreptomyces lividans、Streptomyces chromofuscus、Streptomyces exfoliatus、Streptomyces argenteorus、等が好ましい。
本発明で使用する宿主細胞は、メバロン酸経路を有しない放線菌、例えばStreptomyces lividans、Streptomyces chromofuscus、Streptomyces exfoliatus、Streptomyces argenteorus、等が好ましい。
発現ベクターとしては、上記宿主である放線菌細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp２、pBTac１、pBTac２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK２３３-２（Pharmacia社製）、pSE２８０（Invitrogen社製）、pGEMEX-１（Promega社製）、pQE-８（QIAGEN社製）、pQE-３０（QIAGEN社製）、pKYP１０（特開昭５８-１１０６００）、pKYP２００〔Agricultural Biological Chemistry, ４８, ６６９ (１９８４)〕、pLSA１〔Agric. Biol. Chem., ５３, ２７７ (１９８９)〕、pGEL１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８２, ４３０６ (１９８５)〕、pBluescriptII SK+、pBluescriptII SK(-)（Stratagene社製）、pTrS３０(FERMBP-５４０７)、pTrS３２(FERM BP-５４０８)、pGEX（Pharmacia社製）、pET-３（Novagen社製）、pTerm２(US４６８６１９１、US４９３９０９４、US５１６０７３５)、pSupex、pUB１１０、pTP５、pC１９４、pUC１８〔gene, ３３, １０３ (１９８５)〕、pUC１９〔Gene, ３３, １０３ (１９８５)〕、pSTV２８(宝酒造社製)、pSTV２９（宝酒造社製）、pUC１１８（宝酒造社製）、pPA１（特開昭６３-２３３７９８号公報）、pEG４００〔J. Bacteriol., １７２, ２３９２(１９９０)〕等を例示することができる。
プロモーターとしては、宿主である放線菌細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO１プロモーター、SPO２プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、letIプロモーター、lacT７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、宿主である放線菌細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主である放線菌細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ６９, ２１１０ (１９７２)〕、プロトプラスト法（特開昭６３-２４８３９４２号公報）、またはGene, １７, １０７ (１９８２)やMolecular & General Genetics, １６８, １１１ (１９７９)に記載の方法等をあげることができる。
上記ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に、本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素タンパク質、HMG ＣｏＡ合成酵素タンパク質及びHMG ＣｏＡ還元酵素タンパク質を生成させ、これらの酵素タンパク質の作用により該培養物からメバロン酸を生成蓄積させ、該培養物よりメバロン酸を採取することにより、メバロン酸を製造することができる。
上記ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に、本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素タンパク質、HMG ＣｏＡ合成酵素タンパク質及びHMG ＣｏＡ還元酵素タンパク質を生成させ、これらの酵素タンパク質の作用により該培養物からメバロン酸を生成蓄積させ、該培養物よりメバロン酸を採取することにより、メバロン酸を製造することができる。
本発明の、メバロン酸の生合成能力を付与させた形質転換体を培地に培養する方法は、宿主である放線菌の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体である放線菌を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
本発明の形質転換体である放線菌を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、放線菌が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン、チオストレプトン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン、チオストレプトン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した放線菌を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した放線菌を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した放線菌を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
本発明の形質転換体の培養物からメバロン酸を単離精製するには、通常のメバロン酸ないしメバロン酸の分子内エステルであるメバロノラクトンの単離精製方法、すなわち菌体分離、抽出、蒸留、クロマトグラフィー、再結晶等を適宜組み合わせることにより得ることが出来る。
メバロン酸は分子量(mw:１４８)が小さいことから、多くの場合形質転換体の細胞膜を透過できるため培養ろ液中に蓄積し、菌体中で検出されるメバロン酸は比較的僅かである。このため、培養ろ液を得るために菌体を遠心分離やろ過を用いて除去することが好ましい。ただし、形質転換体の細胞内に蓄積する場合は菌体もしくは菌体を含めた培養ろ液から抽出してもよい。
メバロン酸は分子量(mw:１４８)が小さいことから、多くの場合形質転換体の細胞膜を透過できるため培養ろ液中に蓄積し、菌体中で検出されるメバロン酸は比較的僅かである。このため、培養ろ液を得るために菌体を遠心分離やろ過を用いて除去することが好ましい。ただし、形質転換体の細胞内に蓄積する場合は菌体もしくは菌体を含めた培養ろ液から抽出してもよい。
メバロン酸の抽出方法は、通常の酸性有機物の抽出方法に従って行うことが出来る。すなわち、培養物を有機酸ないし無機酸を用いてpH １.０〜４.０とした後、酢酸エチル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸ブチル、アセトン等の有機溶媒を用いて抽出できる。また、必要に応じて培養物に塩化ナトリウム等の電解質を溶解させてもよい。さらに抽出液中に含有する水分を減らす必要があれば無水硫酸ナトリウム等で脱水してもよい。得られた抽出液は蒸留や減圧下で抽出溶媒を留去し抽出物を得ることが出来る。ただし、メバロン酸は有機溶媒で抽出すると容易に分子内エステル化(ラクトン化、メバロノラクトン）する。メバロノラクトンをメバロン酸として使用したい場合はメバロノラクトンと等モル量の水酸化ナトリウム等のアルカリを用いて中和することが出来る。
抽出物はシリカゲルクロマト等のカラムクロマトグラフィーに吸着させヘキサン/酢酸エチル等の溶媒を用いて溶出することで精製することが可能である。また、蒸留により直接メバロノラクトンを精製することも可能である。また、適当な溶媒を用いることにより結晶化することも可能である。
以上より、形質転換した宿主細胞で発現した本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)は、アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する。当該酵素は脂肪酸合成酵素（KAS III）（Annu. Rev. Biochem. ７４: ７９１ (２００５)）とは、４０％程度と比較的高い相同性があるが、一方KAS IIIはアセチル-ＣｏＡおよびマロニル-ACPからアセトアセチル-ＡＣＰを生成する反応を触媒するため、異なる酵素であることが明らかである。
本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素（タイプ２）は、効率的なアセトアセチルＣｏＡの生産に利用可能である。アセトアセチルＣｏＡの利用としては、研究用試薬があげられる。この場合、溶液中に当該酵素に加えて、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡを添加することで容易に調製可能である。
また、本発明は宿主にアセトアセチルＣｏＡ以降の生合成に関する酵素遺伝子を形質転換することによりさまざまなアセトアセチルＣｏＡから生合成される生理活性物質の生産が可能である。
また、本発明は宿主にアセトアセチルＣｏＡ以降の生合成に関する酵素遺伝子を形質転換することによりさまざまなアセトアセチルＣｏＡから生合成される生理活性物質の生産が可能である。
この方法により生産される生理活性物質群としてはテルペノイドがあげられる。例えばテルペノイドの重要な生合成中間体であり化粧品原料でもあるメバロン酸を生産する(特開平２００４-１８７５３１、特開平２００４-２３６６１８)ためには、メバロン酸経路を持たない宿主に当該酵素をコードするDNA配列に加えて、HMG ＣｏＡ(３-ヒドロキシ-３-メチルグルタリルコエンザイムA)合成酵素をコードするDNA配列、HMG ＣｏＡ還元酵素をコードするDNA配列、の３種類を形質転換することで効率的に生産可能となる。また、メバロン酸以降の生理活性物質、例えば、生合成研究の重要な試薬であるファルネシル二リン酸の生産に使用することも本発明の範疇であり、以下の手順となる。
即ちメバロン酸生産で使用した３種のDNA配列に加えてメバロン酸キナーゼをコードするDNA配列、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするDNA配列、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするDNA配列、イソペンテニル二リン酸異性化酵素をコードするDNA配列、ファルネシル二リン酸合成酵素をコードするDNA配列の計９種を形質転換する。一方、宿主は遺伝子欠損株でない限りイソペンテニル二リン酸以降の生合成遺伝子を自身の生命維持のために持っているため、二系統の反応触媒(酵素)群が並立することとなる。
上記のようにメバロン酸生産は、本発明の応用範囲であり、DNAを含むベクターを宿主に形質転換して作製した形質転換体を培養して培養物中にアセトアセチルＣｏＡを生成させる工程、培養物中のアセトアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡに由来する化合物を生成させる工程、及び該培養物からメバロン酸を採取する工程、により効率的にメバロン酸を製造することができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕 (配列番号５のDNA断片がコードする組換え酵素タンパク質の調製)
ａ）放線菌Streptomyces sp. CL １９０株から、配列番号２の全長を含むN末側にBamHIサイト
（GGATCC）を、C末側にEcoRI（GAATTC）サイトを付加した配列番号５のDNA断片の取得、該DNA断片を含む大腸菌用発現ベクターpHIS８ORFnの調製及びこの発現ベクターを用いた大腸菌の形質転換
アセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)タンパク質をコードする遺伝子（ORFn）を十分発現させるような組換え体プラスミドをＰＣＲ法〔Science，２３０，１３５０ (１９８５)〕を用いて下記方法により構築した。
配列番号３に示した配列を有するセンスプライマーおよび配列番号４に示した配列を有するアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該センスプライマーの５’末端にはBamHI制限酵素サイトを、アンチセンスプライマーの５’末端にはEcoRIの制限酵素サイトを付加させた。
ａ）放線菌Streptomyces sp. CL １９０株から、配列番号２の全長を含むN末側にBamHIサイト
（GGATCC）を、C末側にEcoRI（GAATTC）サイトを付加した配列番号５のDNA断片の取得、該DNA断片を含む大腸菌用発現ベクターpHIS８ORFnの調製及びこの発現ベクターを用いた大腸菌の形質転換
アセトアセチルＣｏＡ合成酵素(タイプ２)タンパク質をコードする遺伝子（ORFn）を十分発現させるような組換え体プラスミドをＰＣＲ法〔Science，２３０，１３５０ (１９８５)〕を用いて下記方法により構築した。
配列番号３に示した配列を有するセンスプライマーおよび配列番号４に示した配列を有するアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該センスプライマーの５’末端にはBamHI制限酵素サイトを、アンチセンスプライマーの５’末端にはEcoRIの制限酵素サイトを付加させた。
放線菌Streptomyces sp. CL １９０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマーおよびTaq DNA polymerase（ベーリンガー社製）を用い、DNA Thermal Cycler（パーキンエルマージャパン社製）でＰＣＲを行うことによりORFnを増幅した。
ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる反応工程を１サイクルと３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。
精製された断片とpT７Blueベクター（Novagen社製）を混合した後エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる反応工程を１サイクルと３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。
精製された断片とpT７Blueベクター（Novagen社製）を混合した後エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli DH５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
該形質転換体より定法に従って組換えDNAを含むプラスミドを単離した。
該組換え体ＤＮＡがORFnであることをＤＮＡ配列を決定することによって確認した。
該組換え体から抽出したプラスミドを、制限酵素制限酵素BamHIとEcoRIとで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行いBamHIとEcoRI処理ORFn含有ＤＮＡ断片を取得した。
pHIS８（Biochemistry ３９: ８９０ (２０００)）を制限酵素BamHIとEcoRIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行いBamHIとEcoRI処理pHIS８断片を取得した。
上記で取得されたBamHIとEcoRI処理ORFn遺伝子含有ＤＮＡ断片をBamHIとEcoRI消化pHIS８断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該形質転換体より定法に従って組換えDNAを含むプラスミドを単離した。
該組換え体ＤＮＡがORFnであることをＤＮＡ配列を決定することによって確認した。
該組換え体から抽出したプラスミドを、制限酵素制限酵素BamHIとEcoRIとで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行いBamHIとEcoRI処理ORFn含有ＤＮＡ断片を取得した。
pHIS８（Biochemistry ３９: ８９０ (２０００)）を制限酵素BamHIとEcoRIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行いBamHIとEcoRI処理pHIS８断片を取得した。
上記で取得されたBamHIとEcoRI処理ORFn遺伝子含有ＤＮＡ断片をBamHIとEcoRI消化pHIS８断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli DH５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
上記と同様の方法で、該形質転換体よりプラスミドを単離した。
上記同様、該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。このプラスミドをpHISORFnと命名した。
上記と同様の方法で、該形質転換体よりプラスミドを単離した。
上記同様、該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。このプラスミドをpHISORFnと命名した。
ｂ）大腸菌発現プラスミドpHISORFnを含む大腸菌BL２１(DE３)株からの組換え酵素タンパク質の調製
上記ａ）で作成したpHISORFnを常法によりDE３を有するE. coli BL２１(DE３)株(Novagen社製)に導入し、カナマイシン５０μg/mlに耐性を示すBL２１(DE３)/ pHISORFn株を得た。
BL２１(DE３)/ pHISORFn株をカナマイシン５０μg/mlを含むTB液体培地１００ｍｌ中、３７℃で培養し、６６０ｎｍの濁度が１.５に達した時点で、培養液を１０分間氷冷した後、イソプロピルチオガラクトシドを終濃度０.１ｍＭになるように添加した。さらに１８℃で１８時間培養した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）によって培養上清を除いた。この菌体を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）６ｍｌに懸濁し、超音波破砕機(SONIFIER,BRANSON社製)を用いて氷冷しつつ破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）にかけ、上清を回収した。この細胞抽出液遠心上清をNi-NTAレジンカラム(QIAGEN社製)に通し、２０ｍｌの洗浄緩衝液〔１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ イミダゾール、０．５％ Tween２０〕で洗浄した。
ついで溶出緩衝液〔１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ イミダゾール〕１０ｍｌを通塔し、溶出液を１ｍｌづつ分画した。
各分画について蛋白量を測定（ＢｉｏＲａｄ社の蛋白量定量キット使用)し、蛋白質を含む画分を精製蛋白画分とした。
上記ａ）で作成したpHISORFnを常法によりDE３を有するE. coli BL２１(DE３)株(Novagen社製)に導入し、カナマイシン５０μg/mlに耐性を示すBL２１(DE３)/ pHISORFn株を得た。
BL２１(DE３)/ pHISORFn株をカナマイシン５０μg/mlを含むTB液体培地１００ｍｌ中、３７℃で培養し、６６０ｎｍの濁度が１.５に達した時点で、培養液を１０分間氷冷した後、イソプロピルチオガラクトシドを終濃度０.１ｍＭになるように添加した。さらに１８℃で１８時間培養した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）によって培養上清を除いた。この菌体を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）６ｍｌに懸濁し、超音波破砕機(SONIFIER,BRANSON社製)を用いて氷冷しつつ破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）にかけ、上清を回収した。この細胞抽出液遠心上清をNi-NTAレジンカラム(QIAGEN社製)に通し、２０ｍｌの洗浄緩衝液〔１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ イミダゾール、０．５％ Tween２０〕で洗浄した。
ついで溶出緩衝液〔１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ イミダゾール〕１０ｍｌを通塔し、溶出液を１ｍｌづつ分画した。
各分画について蛋白量を測定（ＢｉｏＲａｄ社の蛋白量定量キット使用)し、蛋白質を含む画分を精製蛋白画分とした。
実験例１ (実施例１で得た組換え酵素タンパク質の性状)
SDS-アクリルアミドゲル電気泳動により、分子量は３４ kDaであった。
HiLoad ２６/６０ Superdex ２００ prep grade （アマシャム社製）カラムを用いたゲル濾過による分子量測定の結果、６３ kDaであったことから、本酵素は、２量体であることが分かった。
SDS-アクリルアミドゲル電気泳動により、分子量は３４ kDaであった。
HiLoad ２６/６０ Superdex ２００ prep grade （アマシャム社製）カラムを用いたゲル濾過による分子量測定の結果、６３ kDaであったことから、本酵素は、２量体であることが分かった。
実験例２ (実施例１で得た組換え酵素タンパク質（ORFn）の、チオラーゼ活性(=逆反応)の測定)
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、１００ μM アセトアセチルＣｏＡ、１００ μM ＣｏＡ、２０ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で保温しながら３０３ nmの吸光度の変化をUV可視測定装置UV-１６００PC（島津社製）で観察した。その結果、３０３ nmの吸光度の変化は観察されなかった（図３、アセトアセチルＣｏＡ分解活性）。このことは、実施例１で得た組換え酵素タンパク質（ORFn）には、アセトアセチルＣｏＡを分解して、アセチルＣｏＡを生成するチオラーゼ活性を有しないことを示している。
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、１００ μM アセトアセチルＣｏＡ、１００ μM ＣｏＡ、２０ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で保温しながら３０３ nmの吸光度の変化をUV可視測定装置UV-１６００PC（島津社製）で観察した。その結果、３０３ nmの吸光度の変化は観察されなかった（図３、アセトアセチルＣｏＡ分解活性）。このことは、実施例１で得た組換え酵素タンパク質（ORFn）には、アセトアセチルＣｏＡを分解して、アセチルＣｏＡを生成するチオラーゼ活性を有しないことを示している。
実験例３ (実施例１で得た組換え酵素の、本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素活性(=正反応)の確認)
次に、まず、本アセトアセチルＣｏＡ合成酵素がアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡが生成するかどうか以下の反応条件で調べた。
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、１ mM アセチルＣｏＡ、２０ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で保温しながら３０３ nmの吸光度の変化をUV可視測定装置UV-１６００PC（島津社製）で観察した。その結果、３０３ nmの吸光度の変化は観察されなかった（図３、アセトアセチルＣｏＡ合成活性）。このことは、実施例１で得た組換え酵素タンパク質（ORFn）には、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する本アセトアセチルＣｏＡ合成酵素活性を有しないことを示している。
次に、まず、本アセトアセチルＣｏＡ合成酵素がアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡが生成するかどうか以下の反応条件で調べた。
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、１ mM アセチルＣｏＡ、２０ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で保温しながら３０３ nmの吸光度の変化をUV可視測定装置UV-１６００PC（島津社製）で観察した。その結果、３０３ nmの吸光度の変化は観察されなかった（図３、アセトアセチルＣｏＡ合成活性）。このことは、実施例１で得た組換え酵素タンパク質（ORFn）には、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する本アセトアセチルＣｏＡ合成酵素活性を有しないことを示している。
そこで次に、本アセトアセチルＣｏＡ合成酵素がアセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとからアセトアセチルＣｏＡが生成するかどうか以下の反応条件で調べた。
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、１００ μM アセチルＣｏＡ、１００ μM マロニルＣｏＡ、１ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で保温しながら３０３ nmの吸光度の変化をUV可視測定装置UV-１６００PC（島津社製）で観察した。その結果、３０３ nmの吸光度の変化が観察された（図４）。このことは、実施例１で得た組換え酵素タンパク質（ORFn）が、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとからアセトアセチルＣｏＡを生成することを示しており、本酵素タンパク質が、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素であることを示している。
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、１００ μM アセチルＣｏＡ、１００ μM マロニルＣｏＡ、１ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で保温しながら３０３ nmの吸光度の変化をUV可視測定装置UV-１６００PC（島津社製）で観察した。その結果、３０３ nmの吸光度の変化が観察された（図４）。このことは、実施例１で得た組換え酵素タンパク質（ORFn）が、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとからアセトアセチルＣｏＡを生成することを示しており、本酵素タンパク質が、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素であることを示している。
次に、本アセトアセチルＣｏＡ合成酵素がマロニルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡが生成するかどうか以下の反応条件で調べた。
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、１００ μM マロニルＣｏＡ、２０ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で保温しながら３０３ nmの吸光度の変化をUV可視測定装置UV-１６００PC（島津社製）で観察した。その結果、３０３ nmの吸光度の変化は観察されなかった（図６）。このことは、実施例１で得た組換え酵素タンパク質（ORFn）には、マロニルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する本アセトアセチルＣｏＡ合成酵素活性を有しないことを示している。
本アセトアセチルＣｏＡ合成酵素の酵素学的パラメーターは以下のように算出された。
アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡに対するKm値は、それぞれ、７５.２±１.４ μM、１４.８±０.５ μMであり、kcatは１５８±１ s-1であった。
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、１００ μM マロニルＣｏＡ、２０ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で保温しながら３０３ nmの吸光度の変化をUV可視測定装置UV-１６００PC（島津社製）で観察した。その結果、３０３ nmの吸光度の変化は観察されなかった（図６）。このことは、実施例１で得た組換え酵素タンパク質（ORFn）には、マロニルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する本アセトアセチルＣｏＡ合成酵素活性を有しないことを示している。
本アセトアセチルＣｏＡ合成酵素の酵素学的パラメーターは以下のように算出された。
アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡに対するKm値は、それぞれ、７５.２±１.４ μM、１４.８±０.５ μMであり、kcatは１５８±１ s-1であった。
本組換え酵素タンパク質（ORFn）が、プロピオニルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから３−オキソペンタノイルＣｏＡを生成するかどうか以下の反応条件で調べた。
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、５０ μM プロピオニルＣｏＡ、５０ μM マロニルＣｏＡ、５０ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で保温しながら３０３ nmの吸光度の変化をUV可視測定装置UV-１６００PC（島津社製）で観察した。その結果、３０３ nmの吸光度の変化が観察された（図５）。このことは、実施例１で得た組換え酵素タンパク質（ORFn）が、プロピオニルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから３−オキソペンタノイルＣｏＡを生成する酵素活性も持っていることを示している。
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、５０ μM プロピオニルＣｏＡ、５０ μM マロニルＣｏＡ、５０ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で保温しながら３０３ nmの吸光度の変化をUV可視測定装置UV-１６００PC（島津社製）で観察した。その結果、３０３ nmの吸光度の変化が観察された（図５）。このことは、実施例１で得た組換え酵素タンパク質（ORFn）が、プロピオニルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから３−オキソペンタノイルＣｏＡを生成する酵素活性も持っていることを示している。
ORF-nがアセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとからアセトアセチルＣｏＡを生成するならば、それに伴いＣｏＡの放出が起こると考えられる。そこで、ORF-nによる反応に伴い生成するＣｏＡの検出を試みた。ＣｏＡの検出法としては呈色試薬２, ６-dichroloindophenol (DCIP)による検出法を用いた。この方法は反応により生成したＣｏＡのスルフヒドリル基がDCIPを還元することによって、DCIP由来の６００ nmにおける吸光度が減少することを利用した検出法である。
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、１００ μM アセチルＣｏＡ、１００ μM マロニルＣｏＡ、１００ μM DCIP、１ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で保温しながら６００ nmの吸光度の変化をUV可視測定装置UV-１６００PC（島津社製）で観察した。
その結果、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡの両基質が存在する場合のみ６００ nmにおける吸光度が減少した（図６）。すなわちORF-nによるアセトアセチルＣｏＡの生成に伴い、ＣｏＡが生成していることが明らかとなった。
その結果、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡの両基質が存在する場合のみ６００ nmにおける吸光度が減少した（図６）。すなわちORF-nによるアセトアセチルＣｏＡの生成に伴い、ＣｏＡが生成していることが明らかとなった。
HPLCと質量分析計を組み合わせたLC-MSを用いた分析によって、ORFnのアセトアセチルＣｏＡ合成活性を以下のように検出した。
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、１ mM アセチルＣｏＡ、１ mM マロニルＣｏＡ、１０ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で１時間保温した。
この反応液（以下、反応液（酵素有り））のうち１０ μlをLC-MS分析装置TSQ７０００（Finnigan社製）に供した。HPLCの条件は、０分から２０分まで０.１ ％ヘプタフルオロ酪酸水溶液から０.１ ％ヘプタフルオロ酪酸を含む４０ ％アセトニトリル水溶液までアセトニトリル濃度を２％／分の割合で変化させて展開した。HPLCカラムは、Develosil AR-５ (２.０ X １５０ mm)（野村化学社製）を使用した。流速は０.４ ml/minで、検出は２５４ nmで行った。
５０ mM Tris-HCl (pH ８.０)、５ mM MgCl2、１ mM アセチルＣｏＡ、１ mM マロニルＣｏＡ、１０ μg ORF-nを含む反応液１ mlを調製し、３０度で１時間保温した。
この反応液（以下、反応液（酵素有り））のうち１０ μlをLC-MS分析装置TSQ７０００（Finnigan社製）に供した。HPLCの条件は、０分から２０分まで０.１ ％ヘプタフルオロ酪酸水溶液から０.１ ％ヘプタフルオロ酪酸を含む４０ ％アセトニトリル水溶液までアセトニトリル濃度を２％／分の割合で変化させて展開した。HPLCカラムは、Develosil AR-５ (２.０ X １５０ mm)（野村化学社製）を使用した。流速は０.４ ml/minで、検出は２５４ nmで行った。
まず、アセトアセチルＣｏＡの標品（Sigma社製）を上記条件で分析した。その結果７.８分にシグナルAが得られた。反応液（酵素有り）も同様に分析したところ、６.８分にシグナルEと７.８分にシグナルBが得られた。反応液（酵素有り）のORFnの代わりに熱処理を施したORFnを添加した反応液（熱処理酵素）も同様に分析したところ、７.３分にシグナルDと７.７分にシグナルCが得られた（図７）。
シグナルAとシグナルBとは保持時間がともに７.８分であり、さらにそれらの質量分析の結果、ともに、アセトアセチルＣｏＡに由来するm/z=８５２.１のシグナルが得られたことから、シグナルBはアセトアセチルＣｏＡであると同定した。シグナルCは、m/z=８２０.１が観察されることからアセチルＣｏＡであり、シグナルDは、m/z=８５４.１が観察されることからマロニルＣｏＡである。シグナルEは、m/z=７６８.１が観察されることから、ＣｏＡと同定できた（図８）。
以上の測定結果からも、ORF-nは、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡとＣｏＡを生成することが明らかになった。
すなわち、ORFnは以下の反応を触媒する。
アセチルＣｏＡ + マロニルＣｏＡ ( アセトアセチルＣｏＡ + ＣｏＡ + CO2
すなわち、ORFnは以下の反応を触媒する。
アセチルＣｏＡ + マロニルＣｏＡ ( アセトアセチルＣｏＡ + ＣｏＡ + CO2
〔実施例２〕 (CL１９０株由来の配列番号８の本発明のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子とその上流領域、及びHMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子、並びにHMG ＣｏＡ還元酵素遺伝子の３種を組込んだ放線菌Streptomyces lividans TK２３株用発現ベクターpSEMV２５ORFnの調製、及び発現ベクターpSEMV２５ORFnを用いたTK２３株の形質転換)
放線菌用発現プラスミド、pSEMV２５（Biosci. Biotech. Biochem. ６８: ９３１ (２００４)）にはCL１９０株のメバロン酸経路遺伝子クラスターから取得したHMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子、並びにHMG ＣｏＡ還元酵素遺伝子がクローニングされている。
このプラスミドのHMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子の上流にある制限酵素サイトXbaIとEcoRIの間に、以下のように、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子（タイプ２）(ORFn)及びそのプロモーター配列を含むと考えられる上流領域をクローニングした。該上流域は、上記HMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子の終止コドンの直後の塩基からORFnの開始コドンの直前の配列（９６塩基）までとした。
放線菌用発現プラスミド、pSEMV２５（Biosci. Biotech. Biochem. ６８: ９３１ (２００４)）にはCL１９０株のメバロン酸経路遺伝子クラスターから取得したHMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子、並びにHMG ＣｏＡ還元酵素遺伝子がクローニングされている。
このプラスミドのHMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子の上流にある制限酵素サイトXbaIとEcoRIの間に、以下のように、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子（タイプ２）(ORFn)及びそのプロモーター配列を含むと考えられる上流領域をクローニングした。該上流域は、上記HMG ＣｏＡ合成酵素遺伝子の終止コドンの直後の塩基からORFnの開始コドンの直前の配列（９６塩基）までとした。
配列番号６に示した配列を有するセンスプライマーおよび配列番号７に示した配列を有するアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該センスプライマーの５’末端にはXbaI制限酵素サイトを、アンチセンスプライマーの５’末端にはEcoRIの制限酵素サイトを付加させた。
放線菌Streptomyces sp. CL １９０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマーおよびTaq DNA polymerase（ベーリンガー社製）を用い、DNA Thermal Cycler（パーキンエルマージャパン社製）でＰＣＲを行うことによりORFn及びそのプロモーター配列を含むと考えられる上流領域を増幅した。
ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルと３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。
精製された断片とpT７Blueベクター（Novagen社製）を混合した後エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該センスプライマーの５’末端にはXbaI制限酵素サイトを、アンチセンスプライマーの５’末端にはEcoRIの制限酵素サイトを付加させた。
放線菌Streptomyces sp. CL １９０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマーおよびTaq DNA polymerase（ベーリンガー社製）を用い、DNA Thermal Cycler（パーキンエルマージャパン社製）でＰＣＲを行うことによりORFn及びそのプロモーター配列を含むと考えられる上流領域を増幅した。
ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルと３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。
精製された断片とpT７Blueベクター（Novagen社製）を混合した後エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli DH５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
該形質転換体より定法に従って組換えDNAを含むプラスミドを単離した。
該組換え体ＤＮＡがORFn及びそのプロモーター配列を含むと考えられる上流領域であることをＤＮＡ配列を決定することによって確認した。
該組換え体からプラスミドを抽出し、制限酵素制限酵素XbaIとEcoRIとで消化後、アガロースゲル電気泳動を行いXbaIとEcoRI処理ORFn及びそのプロモーター配列を含むと考えられる上流領域含有ＤＮＡ断片を取得した。
pSEMV２５を制限酵素XbaIとEcoRIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行いXbaIとEcoRI処理pSEMV２５断片を取得した。
上記で取得されたXbaIとEcoRI処理ORFn遺伝子及びそのプロモーター配列を含むと考えられる上流含有ＤＮＡ断片をXbaIとEcoRI消化pSEMV２５断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該形質転換体より定法に従って組換えDNAを含むプラスミドを単離した。
該組換え体ＤＮＡがORFn及びそのプロモーター配列を含むと考えられる上流領域であることをＤＮＡ配列を決定することによって確認した。
該組換え体からプラスミドを抽出し、制限酵素制限酵素XbaIとEcoRIとで消化後、アガロースゲル電気泳動を行いXbaIとEcoRI処理ORFn及びそのプロモーター配列を含むと考えられる上流領域含有ＤＮＡ断片を取得した。
pSEMV２５を制限酵素XbaIとEcoRIで消化後、アガロースゲル電気泳動を行いXbaIとEcoRI処理pSEMV２５断片を取得した。
上記で取得されたXbaIとEcoRI処理ORFn遺伝子及びそのプロモーター配列を含むと考えられる上流含有ＤＮＡ断片をXbaIとEcoRI消化pSEMV２５断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli DH５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
上記と同様の方法で、該形質転換体よりプラスミドを単離した。
上記同様、該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。このプラスミドをpSEMV２５ORFnと命名した。
pSEMV２５ORFnを用い、S. lividans TK２３株を常法に従って形質転換体を得た。該形質転換体をS. lividans TK２３ (pSEMV２５ORFn)株と命名した。
上記と同様の方法で、該形質転換体よりプラスミドを単離した。
上記同様、該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。このプラスミドをpSEMV２５ORFnと命名した。
pSEMV２５ORFnを用い、S. lividans TK２３株を常法に従って形質転換体を得た。該形質転換体をS. lividans TK２３ (pSEMV２５ORFn)株と命名した。
〔実施例３〕 (メバロン酸の生産)
S. lividans TK２３ (pSEMV２５ORFn)株を、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む１０ ml のSK-II液体培地（Biosci. Biotech. Biochem. ６８: ９３１ (２００４)）に１白金耳植菌し、振とう培養器で３０℃、１２０ rpmで２日間培養を行った。得られた培養液を各２ mlずつ、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含むKG液体培地１００ mlを入れた坂口フラスコに分注し、さらに１０日間培養を継続した。得られた培養液を３５００ rpmで１０分遠心分離を行い培養ろ液を得た。
S. lividans TK２３ (pSEMV２５ORFn)株を、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む１０ ml のSK-II液体培地（Biosci. Biotech. Biochem. ６８: ９３１ (２００４)）に１白金耳植菌し、振とう培養器で３０℃、１２０ rpmで２日間培養を行った。得られた培養液を各２ mlずつ、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含むKG液体培地１００ mlを入れた坂口フラスコに分注し、さらに１０日間培養を継続した。得られた培養液を３５００ rpmで１０分遠心分離を行い培養ろ液を得た。
この培養ろ液１００ mlに８５％リン酸を滴下してpHを２.０とした後、無水硫酸ナトリウム５０ gを添加し飽和溶液とする。この飽和溶液を、酢酸エチル１００ mlを用いて抽出を行った。抽出は３回行い、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、ロータリーエバポレーターで乾固し油状物質を得た。得られた油状物質をイソプロパノール１ mlに溶解し下記分析例に示す条件で分析を行った。その結果、培養液中のメバロン酸濃度は８ μg/mlであった。
分析例 (メバロノラクトンのHPLCによる分析)
メバロン酸は培養液から抽出の過程で環化してラクトン体となることが公知であることから、メバロノラクトンとして分析を行った。メバロノラクトンの分析は下記のように行った。
カラム：ヌクレオジル５N(CH３)２ (ドイツ、M. ナーゲル社製)、サイズ直径４.６ mm × 長さ２５０ mm、４ ０ ℃
移動層：N-ヘキサン/イソプロパノール=９/１、流速１.０ ml/分
検出：示差屈折計 （（株）日立ハイテクノロジーズ製、L-２４９０型)、注入量 ０.０１ ml
メバロン酸は培養液から抽出の過程で環化してラクトン体となることが公知であることから、メバロノラクトンとして分析を行った。メバロノラクトンの分析は下記のように行った。
カラム：ヌクレオジル５N(CH３)２ (ドイツ、M. ナーゲル社製)、サイズ直径４.６ mm × 長さ２５０ mm、４ ０ ℃
移動層：N-ヘキサン/イソプロパノール=９/１、流速１.０ ml/分
検出：示差屈折計 （（株）日立ハイテクノロジーズ製、L-２４９０型)、注入量 ０.０１ ml
Claims (13)
- 配列番号２の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列がコードするタンパク質であって、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡの両方を基質としてアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する新規なアセトアセチルＣｏＡ合成酵素。
- アセトアセチルＣｏＡ合成酵素が、メバロン酸経路をもつ放線菌のメバロン酸経路遺伝子クラスター中に含まれるアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子がコードするタンパク質である、請求項１記載のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素。
- 配列番号１のアミノ酸配列を持つポリペプチド。
- 配列番号１において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／または挿入されているアミノ酸配列であって、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素活性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチド。
- 配列番号２の塩基配列を持つＤＮＡ。
- 配列番号２において、１〜数個の塩基配列が欠失、置換、付加及び/または挿入されている塩基配列であって、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素を機能させるために必要な配列をすべてコードする塩基配列を持つＤＮＡ。
- 配列番号２の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素を機能させるのに必要な配列をすべてコードする塩基配列を持つＤＮＡ。
- 請求項５〜７の何れか１項に記載の塩基配列を持つＤＮＡを含むベクター。
- 請求項８に記載のベクターを有する形質転換体。
- 大腸菌である、請求項９に記載の形質転換体。
- 請求項９又は１０に記載の形質転換体を培養することを特徴とするアセトアセチルＣｏＡ合成酵素の製造方法。
- 少なくとも、請求項１又は２に記載のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素をコードする塩基配列又は請求項５〜７の何れか１項に記載の塩基配列を持つＤＮＡを含むベクターで宿主を形質転換し、当該形質転換体内に少なくともアセトアセチルＣｏＡ合成酵素タンパク質を生成させ、少なくともアセトアセチルＣｏＡ合成酵素タンパク質の機能により、アセトアセチルＣｏＡから生合成される生理活性物質を蓄積させることを特徴とする生理活性物質の製造方法。
- 請求項１又は２に記載のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素をコードする塩基配列、又は請求項５〜７の何れか１項に記載の塩基配列、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素をコードする塩基配列及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素をコードする塩基配列の３種類の塩基配列を持つＤＮＡを含むベクターで放線菌を形質転換し、該形質転換体の放線菌細胞中にアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素の３種類の酵素タンパク質を生成させ、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素タンパク質、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素タンパク質および３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素タンパク質の機能によりメバロン酸を蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法。
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