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JP4760951B2 - ブタノール生産能を有する組換え微生物及びブタノールの製造方法 - Google Patents

ブタノール生産能を有する組換え微生物及びブタノールの製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、ブタノール生合成に関連する遺伝子群が組み込まれたブタノール生産能を有する組換え微生物及び当該組換え微生物を用いたブタノール製造方法に関する。
近年、石油資源の枯渇、地球レベルの炭酸ガス発生量の削減が叫ばれており、今後、石油価格の高騰が予想され、石油代替材料の開発が求められている。例えば、太陽エネルギーにより水と炭酸ガスから植物が作り出したバイオマス、糖、澱粉、油脂、タンパク等をバイオコンバージョンし、石油代替材料として利用する試みが実用化されている。一例として、石油を使用するプラスチックの代替物質として、植物由来のポリ乳酸やポリブチレンサクシネートを生産する技術開発が取り組まれている。また、米国・ブラジル等では糖、澱粉などからエタノールを発酵生産し、石油から精製される自動車燃料にブレンドして用いることも行われている。
また、燃料と樹脂原料のどちらにも使える重要な化合物として1-ブタノールがある。特許文献１には、Clostridium acetobutylicumやClostridium beijerinckii等の細菌を使用して、アセトン、1-ブタノール及びエタノールを生産すること（ABE発酵）が開示されている。
ところが、純度の高い1-ブタノールを発酵生産することは難しく、現在、1-ブタノールは石油から化学合成し生産されているのが一般的である。近年、遺伝子組換え技術を用い、1-ブタノールを大腸菌や酵母で効率的に生産させる試みが行われ始めた。1-ブタノール合成には以下に示す変換工程を微生物内で行う必要がある。すなわち、(I)アセチルCoAをアセトアセチルCoAに変換する工程、(II)アセトアセチルCoAを3-ヒドロキシブチルCoAに変換する工程、(III)3-ヒドロキシブチルCoAをクロトニルCoAに変換する工程、(IV)クロトニルCoAをブチリルCoAに変換する工程、(V)ブチリルCoAをブチルアルデヒドに変換する工程、及び(VI)ブチルアルデヒドをブタノールに変換する工程である。
これら変換工程に関与する遺伝子はClostridium acetobutylicumで知られており、これらを大腸菌で発現させ1-ブタノールを60ｍｇ/L程度生産させた例がある（非特許文献１及び２参照）。また、ミドリムシ由来のTER遺伝子とClostridium beijerinckii由来のALD遺伝子を使い1-ブタノールを75mg/L程度大腸菌で、2ｍｇ/L程度Saccharomyces cerevisiaeで生産した例もある（特許文献２）。この他にも1例Saccharomyces cerevisiaeで1-ブタノールを生産した例もあるが、生産量は20ｍｇ/L程度であった（特許文献３）。
このように、Clostridium acetobutylicum由来の遺伝子を用いることにより組換え大腸菌又は酵母を用いて１-ブタノール生産を行う技術開発が行われている。ところが、2.5g/L程度の1-ブタノールを生産するClostridium acetobutylicumと比較して（非特許文献３）その生産は低く、さらなる組換え体の生産量の向上が望まれている。
US 6,358,717号公報 WO2008-137402 WO2008-080124
Metabolic Engineering, 10. 6. 305-311(2008) Appl. Microbiol. Biotechnol., 77, 1305-1316, 2008 Biotechnol. Lett., 4, 29-32, 1982
そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、ブタノール生産能に優れた組換え微生物を提供し、これを用いて効率良くブタノールを製造することができるブタノール製造方法を提供することを目的とする。
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、上述したアセチルCoAからアセトアセチルCoAを経てブタノールを合成することができる微生物において、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成するチオラーゼの代わりに若しくはチオラーゼに加えて、マロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成できる酵素を機能させることで、ブタノールの生産性が向上することを見いだし本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
（１）マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する酵素をコードするアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、及びアセトアセチルCoAからブタノールを合成するブタノール生合成関連遺伝子群が宿主微生物に導入された、組換え微生物。
（２）上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、Streptomyces属の微生物由来の遺伝子であることを特徴とする（１）記載の組換え微生物。
（３）上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上の一致度を有するアミノ酸配列を有し、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とする（１）記載の組換え微生物。
（４） 上記ブタノール生合成関連遺伝子群は、β-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ遺伝子、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ遺伝子、ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ遺伝子、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びブタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子であることを特徴とする（１）記載の組換え微生物。
（５）上記ブタノール生合成関連遺伝子群は、ブタノール生合成能を有するClostridium属の微生物由来の遺伝子であることを特徴とする（１）記載の組換え微生物。
（６）上記Clostridium属の微生物は、Clostridium acetobutylicumであることを特徴とする（５）記載の組換え微生物。
（７）上記宿主微生物は、大腸菌であることを特徴とする（１）記載の組換え微生物。
（８）上記（１）乃至（７）いずれか一項記載の組換え微生物を培養し、培地からブタノールを回収することを特徴とするブタノールの製造方法。
本発明によれば、ブタノール生産能を有する組換え微生物におけるブタノール生産効率を大幅に向上させることができる。すなわち、本発明に係る組換え微生物は、従来のブタノール生産能を有する組換え微生物と比較して優れたブタノール生産能を有する。このため、本発明に係る組換え微生物を使用することで、燃料や樹脂原料として使用されるブタノールを製造する際の生産性を向上させることができ、ブタノール生産コストを低減させることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る組換え微生物は、宿主微生物に対して、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する酵素をコードするアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、及びアセトアセチルCoAからブタノールを合成するブタノール生合成関連遺伝子群を導入し、ブタノール生産能を獲得した組換え微生物である。
アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子
アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子とは、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性を有し、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有しない酵素をコードする遺伝子である。このアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、例えば、Streptomyces属の放線菌において見いだされており（特開2008-61506号公報）、例えばStreptomyces属の放線菌由来の遺伝子を使用することができる。
アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子としては、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質は、放線菌Streptomyces sp. CL190株において見いだされたマロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性を有し、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有しないアセトアセチルCoA合成酵素である（特開2008-61506号公報）。
配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、特開2008-61506号公報を参照して設計した一対のプライマーを用い、放線菌Streptomyces sp. CL190株から得たゲノムDNAを鋳型とした核酸増幅法（例えばPCR）により取得することができる。
また、本発明において、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子としては、放線菌Streptomyces sp. CL190株由来の配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子に限定されず、配列番号１のアミノ酸配列に対して高い類似性を有するアミノ酸配列を有し、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、高い類似性とは、例えば８０％以上の一致度を意味し、好ましくは９０％以上の一致度、より好ましくは９５％以上の一致度、最も好ましくは９７％以上の一致度を意味する。なお、一致度の値は、配列類似性を検索するプログラム（相同性検索プログラムと称される場合もある）を用いて、配列番号１のアミノ酸配列と他のアミノ酸配列とをアライメントした際に、当該他のアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列に対して一致したアミノ酸残基の割合として算出される値である。
また、本発明において、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子としては、配列番号１のアミノ酸配列における１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、複数個のアミノ酸とは、例えば２〜３０個のアミノ酸を意味し、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個のアミノ酸を意味する。
さらに、本発明において、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子としては、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドの一部又は全部に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合を維持することを意味する。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
上述したような、配列番号１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルCoA合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、Streptomyces sp. CL190株以外の放線菌から単離することができる。また、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA社製）を用いて変異が導入される。
配列番号１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルCoA合成酵素の活性は以下のように評価することができる。すなわち、先ず、評価対象のタンパク質をコードする遺伝子を発現可能なように宿主細胞に導入し、クロマトグラフィー等の手法によってタンパク質を精製する。得られた評価対象のタンパク質を含む緩衝液中に、基質としてマロニルCoAとアセチルCoAとを添加する。その後、例えば所望の温度（例えば10〜60℃）でインキュベートする。そして、反応終了後、基質の減少量及び/又は生成物（アセトアセチルCoA）の生成量を測定することで、評価対象のタンパク質について、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能の有無及びその程度を評価することができる。このとき、得られた評価対象のタンパク質を含む緩衝液中に、基質としてアセチルCoAのみを添加し、同様に、基質の減少量及び/又は生成物生成量を測定することで、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性の有無について検討することができる。
ブタノール生合成関連遺伝子群
ブタノール生合成関連遺伝子群とは、アセトアセチルCoAを出発化合物として最終生産物であるブタノールを生合成する代謝経路に関与する酵素をコードする複数の遺伝子からなる群を意味する。代謝経路に関与する酵素としては、アセトアセチルCoAを基質として3-ヒドロキシブチルCoAを合成するβ-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、3-ヒドロキシブチルCoAを基質としてクロトニルCoAを合成する3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトニルCoAを基質としてブチリルCoAを合成するブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、ブチリルCoAを基質としてブチルアルデヒドを合成するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及びブチルアルデヒドを基質としてブタノールを合成するブタノールデヒドロゲナーゼを挙げることができる。
これらブタノール生合成関連遺伝子群は、ブタノール生合成能を有する微生物から単離することができる。ブタノール生合成能を有する微生物としては、いわゆるアセトン/ブタノール/エタノール発酵（ABE発酵）能を有する微生物、特に細菌を挙げることができる。ABE発酵能を有する微生物としては、Clostridium属の微生物、特に限定されないが、Clostridium acetobutylicum、Clostridium beijerinckii、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、Clostridium saccharoacetobutylicum、Clostridium aurantibutyricum、Clostridium pasteurianum、Clostridium sporogenes、Clostridium cadaveris及びClostridium tetanomorphumを挙げることができる。なかでも、ABE発酵能を有する微生物として、全ゲノム配列が解析されているClostridium acetobutylicum及びClostridium beijerinckii由来のブタノール生合成関連遺伝子群を使用することが好ましい。
特に、Clostridium acetobutylicumにおけるブタノール生合成関連遺伝子群については、Appl. Microbiol. Biotechnol., 77, 1305-1316, 2008に詳細に開示されている。本発明においても、当該論文に開示されたブタノール生合成関連遺伝子群を使用することができる。すなわち、Clostridium acetobutylicumにおけるhbd遺伝子（β-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ遺伝子）、crt遺伝子（3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ遺伝子）、bcd遺伝子（ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ遺伝子）、及びadhe遺伝子又はadhe1遺伝子（ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びブタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子）を使用することができる。なお、bcd遺伝子は、Clostridium acetobutylicumにおけるetfA遺伝子及びetfB遺伝子とともに共発現することで、ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を示すため、これらetfA遺伝子及びetfB遺伝子もまた、ブタノール生合成関連遺伝子群に含まれる。またadhe遺伝子及びadhe1遺伝子は、それぞれブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する、いわゆるバイファンクショナルな酵素をコードしている。したがって、Clostridium acetobutylicum由来のhbd遺伝子、crt遺伝子、bcd遺伝子、及びadhe遺伝子（又はadhe1遺伝子）を宿主微生物に導入することによって、当該微生物がアセトアセチルCoAからブタノールを合成する代謝能を獲得することができる。
なお、上記論文には、ブタノール生合成関連遺伝子群として、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する反応を触媒するチオラーゼ（thiL遺伝子）が開示されている。本発明におけるブタノール生合成関連遺伝子群としては、このチオラーゼ遺伝子が含まれていても良いが、チオラーゼ遺伝子は必須ではない。
また、ブタノール生合成関連遺伝子群としては、上記論文に開示されたい遺伝子に限定されず、Clostridium acetobutylicum由来のhbd遺伝子、crt遺伝子、bcd遺伝子、及びadhe遺伝子（又はadhe1遺伝子）に対する相同遺伝子であってもよい。相同遺伝子は、遺伝子の塩基配列やタンパク質のアミノ酸配列が格納されたデータベースに対して、BlastやFasta等の公知のアルゴリズムを用いた相同性検索によって特定することができる。データベースを用いて特定した相同遺伝子は、公知の手法によって微生物から単離して使用することができる。すなわち、微生物から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、特定した相同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いた核酸増幅法によって相同遺伝子を含む核酸断片を得ることができる。
また、上述したようなブタノール生合成能を有するClostridium属微生物について公知の手法によってcDNAライブラリーを作製し、Clostridium acetobutylicum由来のhbd遺伝子、crt遺伝子、bcd遺伝子、adhe遺伝子及びadhe1遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプローブと特異的にハイブリダイズするcDNAを特定することで、上述したようなブタノール生合成能を有するClostridium属微生物由来の相同遺伝子を得ることもできる。
なお、Clostridium acetobutylicum由来のhbd遺伝子、crt遺伝子、bcd遺伝子、及びadhe遺伝子（又はadhe1遺伝子）に対する相同遺伝子の取得方法は、上述した手法に限定されず、如何なる手法を適用しても良い。
宿主微生物への形質転換
上述した「アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子」及び「ブタノール生合成関連遺伝子群」は、適当な発現ベクターに組み込まれ、宿主微生物に導入される。ここで、宿主微生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli）などのエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などのバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などのシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などのリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母が挙げられる。
大腸菌などの細菌を宿主とする場合、発現ベクターは、該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、上述した遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、発現ベクターには、プロモーター活性を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリBL21(DE3)株、K12株、DH1株、JM109株など従来公知の如何なる菌株を使用することができる。また、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス168株などが挙げられる。
プロモーターとしては、大腸菌などの宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの大腸菌由来のものやT7プロモーターなどのファージ由来のものが用いられる。さらに、tacプロモーターなどのように人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
発現ベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N.,et al.:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69:2110-2114 (1972)]、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ピキア・パストリスなどが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーターなどが挙げられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M.,et al.: Methods. Enzymol., 194:182-187 (1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75:1929-1933(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol.,153:163-168 (1983)]などが挙げられる。
特に、宿主微生物としては、マロニルCoAの含有量が比較的に多い微生物を使用することが好ましい。マロニルCoAは、脂肪酸の生合成に利用される物質であり、あらゆる微生物に存在する。上述したアセトアセチルCoA合成酵素がマロニルCoA及びアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成するため、宿主微生物としてマロニルCoA含量が高いものを使用することにって、ブタノールの生産性をより向上させることができる。
ブタノールの製造
上述した「アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子」及び「ブタノール生合成関連遺伝子群」が導入された微生物を、グルコース等の炭素源を含む培地で培養することによってブタノールの生合成が進行する。すなわち、先ず、グルコース等の炭素源から解糖系により生合成されたピルビン酸が生成され、ピルビン酸からアセチルCoA更にはマロニルCoAが生成する。そして、上述したアセトアセチルCoA合成酵素によりアセチルCoAとマロニルCoAからアセトアセチルCoAが合成される。そして、上述したブタノール生合成関連遺伝子群により、アセトアセチルCoAからブタノールが合成される。
特に、本発明のアセトアセチルCoA合成酵素によれば、マロニルCoAとアセチルCoAからアセトアセチルCoAが不可逆反応として合成される。これに対して、チオラーゼは二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する反応に寄与するが、当該反応は、アセトアセチルCoAの合成に二分子のアセチルCoAが必要であるうえ、アセトアセチルCoA分解反応の方に大きく偏る可逆反応である。したがって、チオラーゼとブタノール生合成関連遺伝子群とを用いてブタノール生合成を行う場合と比較して、マロニルCoAとアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成するアセトアセチルCoA合成酵素を使用する場合には、ブタノールの生産性が大幅に向上することとなる。
なお、上述した「アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子」及び「ブタノール生合成関連遺伝子群」が導入された微生物を培養する際の培養条件としては、特に限定されず、宿主微生物の栄養要求性や薬剤耐性に合致した培地を使用し、嫌気条件とする以外は通常の条件で培養すればよい。
また、合成されたブタノールは培地中に存在するため、遠心分離等の手段によって培地から菌体を分離した後の上清画分からブタノールを取得することができる。上清画分からブタノールを単離するには、例えば、上清画分に酢酸エチル及びメタノール等の有機溶媒を添加し、十分に撹拌する。水層と溶媒層とに分離し、溶媒層からブタノールを抽出することができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
＜Clostridium acetobutylicum のゲノムDNAの調製＞
Clostridium acetobutylicum ATCC(824)株を常法に従い３mlのDifco社製クロストリジウム強化培地で30℃、２日間嫌気培養した。QIAGEN社製ゲノムDNA調製キット（Gentra Puregene Yeast/Bact.kit）を用いて培養液１.５mlからゲノムDNAを調製した。
＜pT7Blue-CAC2873の作製＞
Clostridium acetobutylicum ATCC(824)株のチオラーゼ遺伝子であるthiA遺伝子を以下のようにクローニングした。先ず、以下のプライマーを用いてPCRを行った。
CAC2873-F：5’-ATG AAA GAA GTT GTA ATA GCT AGT GCA G-3’（配列番号２）
CAC2873-R：5’-CTA GCA CTT TTC TAG CAA TAT TGC TG-3’（配列番号３）
PCRにおいて鋳型としては上記で調製したClostridium acetobutylicum ATCC(824)株のゲノムDNAを0.1μg使用した。また、上記一対のプライマーは50pmolとした。反応液組成は1x Pfu Ultra II reaction buffer(Stratagene)中に10 nmolのdNTP及び1μlのPfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)を含む50μl溶液とした。PCRのサーマルサイクルは、95℃で5分の後、95℃で30秒、60℃で30秒及び72℃で3分を1サイクルとして30サイクル行い、その後72℃で3分とした。また反応終了後は4℃でストックした。
PCRで増幅した約1.2kbの断片をNovagen社製Perfectly Blunt Cloning Kitを用いてpT7-Blueベクターにブラントエンドクローニングした。クローニングした配列をシークエンスし、Clostridium acetobutylicum ATCC(824)株のthiA遺伝子であることを確認した。こうして得られたプラスミドをpT7Blue-CAC2873と命名した。
＜pCDFDuet-thiAの作製＞
大腸菌において上記thiA遺伝子を発現するための発現ベクターを以下のように構築した。先ず、以下のプライマーを用いてPCRを行った。
acat-NdeI-F：5’-AAA CAT ATG AAA GAA GTT GTA ATA GC-3’（配列番号４）
acat-XhoI-R：5’-AAA CTC GAG CTA GCA CTT TTC TAG CAA T-3’（配列番号５）
PCRにおいて鋳型としては上記で調製したpT7Blue-CAC2873を使用した。また、上記一対のプライマーは10pmolとした。反応液組成は1xPfu UltraTMII reaction buffer (Stratagene)中に12.5 nmolのdNTP及び1μlのPfu UltraTMII fusion HS DNA polymerase (Stratagene)を含む50μl溶液とした。PCRのサーマルサイクルは、95℃で2分の後、95℃で20秒、43℃で20秒及び72℃で40秒を1サイクルといして5サイクル行い、その後、95℃で20秒、50℃で20秒及び72℃で40秒を1サイクルとして30サイクル行い、その後72℃で3分とした。また反応終了後は4℃でストックした。
PCRで増幅した約1.2bpのDNA断片をMinElute PCR Purification Kitで精製し、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kitキットを用い、pCR-Blunt II-Topoベクターにクローニングした。得られたベクターをpCR-Blunt II-TOPO-thiAと命名した。pCR-Blunt II-TOPO-thiAをNdeIとXhoIで切断し、アガロースゲル電気泳動で約1.2KbpのDNA断片を精製し、pCDF-Duet（Novagen社製）のNdeI-XhoI部位に挿入した。得られたプラスミドをpCDFDuet-thiAとした。
＜pCDFDuet-orfNの作製＞
マロニルCoAとアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成するアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を以下のようにクローニングした。先ず、以下のプライマーを用いてPCRを行った。
OrfN-NdeI-F：5’-AAA CAT ATG ACC GAC GTC CGA TTC CGC AT 3’（配列番号６）
OrfN-XhoI-R：5’-AAA CTC GAG TTA CCA CTC GAT CAG GGC GA 3’（配列番号７）
PCRにおいて鋳型としてはpHISORFnを20ng使用した。pHISORFnは、特開2008-61506号公報に記載のものを使用した。また、上記一対のプライマーは15 pmolとした。反応液組成は1x PrimeSTAR GC Buffer(Mg2+plus) (タカラバイオ社製)中に10nmolのdNTP及び0.5μlのPrimeSTAR HS DNA Polymerase (タカラバイオ社製)を含む50μl溶液とした。PCRのサーマルサイクルは、94℃で1分の後、98℃で10秒、53℃で5秒及び72℃で1分を1サイクルとして5サイクル行い、その後、98℃で10秒、60℃で5秒、72℃で1分を1サイクルとして30サイクル行い、その後72℃で5分とした。また反応終了後は4℃でストックした。
PCRで増幅した約1KbpのDNA断片をMinElute PCR Purification Kitで精製し、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kitキットを用い、pCR-Blunt II-Topoベクターにクローニングした。得られたベクターをpCR-Blunt II-TOPO-orfNと命名した。pCR-Blunt II-TOPO-orfNをNdeIとXhoIで切断し、アガロースゲル電気泳動で約1KbpのDNA断片を精製し、pCDF-Duet（Novagen社製）のNdeI-XhoI部位に挿入した。得られたプラスミドをpCDFDuet-orfNとした。
＜pETDuet-crt-bcd-etfB-etfA-hbdの作製＞
Clostridium acetobutylicum ATCC(824)株のブタノール生合成関連遺伝子群であるcrt遺伝子、bcd遺伝子、etfB遺伝子、etfA遺伝子及びhbd遺伝子からなるオペロンを以下のようにクローニングした。以下のプライマーを用いてPCRを行った。
crt-NcoI-F：5’-CTC CCA TGG AAC TAA ACA ATG TCA TCC TTG-3’（配列番号８）
crt-BamHI-R：5’-AAC GGA TCC TTA TTT TGA ATA ATC GTA GAA ACC TTT TC-3’（配列番号９）
PCRにおいて鋳型としては上記で調製したClostridium acetobutylicum ATCC(824)株のゲノムDNAを0.02μg使用した。反応液組成は50μl反応液中に12.5nmolのdNTP及び1μlのPfu UltraII（Stratagene）を含む組成とした。PCRのサーマルサイクルは、95℃で20秒間の変性反応工程、53℃で20秒間のアニーリング工程及び72℃で120秒間の伸長反応工程を1サイクルとして28サイクル行った。また反応終了後は4℃でストックした。
PCRで増幅したDNAをNcoIとBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動に供し、4500bpのDNA断片を精製した。この断片をpET-Duet（Merk社製）のNcoI/BamHI部位に挿入した。クローニングした配列をシークエンスしClostridium acetobutylicum ATCC(824)株のcrt-bcd-etfA-etfB-hbdオペロン配列であることを確認した。得られたプラスミドをpETDuet-crt-bcd-etfB-etfA-hbdとした。
＜pETDuet-crt-bcd-etfB-etfA-hbd-adheの作製＞
Clostridium acetobutylicum ATCC(824)株のブタノール生合成関連遺伝子群であるadhe遺伝子を以下のようにクローニングした。先ず、以下なプライマーを用いてPCRを行った。
adhe-SalI-F：5’-CAC GTC GAC AAG GAG ATA TAA TGA AAG TTA CAA ATC AAA AAG AAC TA-3’（配列番号１０）
adhe-NotI-R：5’-CAC GCG GCC GCT TAA AAT GAT TTT ATA TAG ATA TCC TTA AGT TCA C-3’（配列番号１１）
PCRにおいて鋳型としては上記で調製したClostridium acetobutylicum ATCC(824)株のゲノムDNAを0.1μg使用した。反応液組成は、50μl反応液中に15pmolのプライマー、12.5nmolのdNTP及び1μlのPrime STAR HS（TakaraBio）を含む組成とした。PCRのサーマルサイクルは、95℃で20秒間の変性反応工程、53℃で20秒間のアニーリング工程及び72℃で120秒間の伸長反応工程を1サイクルとして28サイクル行った。また反応終了後は4℃でストックした。
PCRで増幅したDNAをSalIとNotIで切断後、アガロースゲル電気泳動に供し、2500bpのDNA断片を精製した。このDNA断片を上記で調製したpETDuet-crt-bcd-etfB-etfA-hbdのマルチクローニングサイト（SalI/NotI部位）に挿入した。クローニングした配列をシークエンスしClostridium acetobutylicum ATCC(824)株のadhe配列であることを確認した。得られたプラスミドをpETDuet-crt-bcd-etfB-etfA-hbd-adheと命名した。
＜組換え大腸菌作製＞
作製したプラスミドpETDuet-crt-bcd-etfB-etfA-hbd-adheとpCDFDuet-thiA又はpCDFDuet-orfNとを大腸菌Tuner株(タカラバイオ社製)に導入した。得られた組換え大腸菌をそれぞれpCDFDuet-thiA/pETDuet-crt-bcd-etfB-etfA-hbd-adhe/Tuner及びpCDFDuet-orfN/pETDuet-crt-bcd-etfB-etfA-hbd-adhe/Tunerと命名した。
＜組換え大腸菌の培養＞
上記で得られた組換え大腸菌pCDFDuet-thiA/pETDuet-crt-bcd-etfB-etfA-hbd-adhe/Tuner及びpCDFDuet-orfN/pETDuet-crt-bcd-etfB-etfA-hbd-adhe/Tunerを、必要に応じて抗生物質（アンピシリン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン）を添加したLB培地又は終濃度4％グルコース、0.0001％チアミンを含むM9培地を用いて培養した。
組換え大腸菌コロニーを４mlのLB培地を含む12mlファルコン社製ディスポーサブルチューブに植菌し30℃で一晩しんとう培養した。培養液0.2mlをさらに20mlのLB培地を含む50ml容量のディスポーサブルチューブ（コーニング社製）に植菌し、30℃でさらに一晩しんとう培養した。培養後、OD660nmを測定した。培養したチューブを４℃、8000ｇ、10秒間の遠心分離に供し、上清をデカンテーションして捨て嫌気ボックス内へ移した。あらかじめ嫌気ボックス内で保存しておいたM9培地をOD660nmが12〜15になるよう添加し、十分に懸濁させた。終濃度10μMになるようIPTGを加え懸濁後、ディスポーサブル試験管に移し、アルミキャップをかぶせて30℃で24時間、嫌気的に静置培養した。
＜ブタノール分析＞
培養終了後、試験管を嫌気ボックス内から取り出し、培養液をエッペンドルフチューブに分注し、トミー精工社製遠心分離機で14000rpmで5分間遠心分離し、菌体と上清とを分離した。上清液1ｍlをディスポーサブル試験管に移し、酢酸エチル1ml及びメタノール0.3mlを加え、ドラフト内で10分間ボルテックスを用いて攪拌した。ベックマン社製遠心分離機を用いて室温、1200rpmで5分遠心分離することで溶媒層と水層とを分離した。溶媒層を10μlの内部標準の1％ウンデカノール溶液（エタノールに溶解）を添加したGC/MSバイアル瓶に移し、その後、GC/MSによりブタノールを定量分析した。
GC/MSには、HP6890/5973 GC/MSシステム(Hewlett-Packard社製)を用いた。使用カラムはJ&W DB-624 (0.32mmx60m、フィルム厚1.8μm)を使用した。GC/MS分析条件は以下の通りである。
インレット温度：260℃
検出器温度：260℃
インジェクションパラメーター：自動インジェクションモード
サンプル容量：2μl
3回のメタノール洗浄及び2回のクロロフォルム洗浄
スプリット比：1/20
キャリヤーガス：ヘリウムガス、1.0ml/分
オーブン加熱条件：70℃で5分の後、10℃/分で130℃まで加熱、その後100℃/分で260℃まで加熱。
内部標準：エタノール中0.01μlの1-ウンデカノール
信頼標準：ブタノール（ナカライテスク社製）
以上の条件でGC/MSによりブタノールを定量した。このとき、内部標準に対する信頼標準のピークエリア比に基づいて、培養液に含まれるブタノール量を算出した。結果を表１に示した。
Figure 0004760951
表１に示すように、Clostridium acetobutylicum ATCC(824)株由来のブタノール生合成関連遺伝子群のみを大腸菌に導入しても、ブタノールは検出されないか微量であった。これに対して、Clostridium acetobutylicum ATCC(824)株由来のブタノール生合成関連遺伝子群と、チオラーゼ遺伝子又はマロニルCoAとアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成するアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子とを導入した組換え大腸菌では、ブタノールを生産することができた。
特に、チオラーゼ遺伝子を導入した組換え大腸菌と比較して、上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌では、ブタノール生産量が有意に高い値を示した。この結果から、ブタノール生合成関連遺伝子群を利用してブタノールを生合成する場合、マロニルCoAとアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成するアセトアセチルCoA合成酵素によりアセトアセチルCoAを合成する方が、チオラーゼにアセトアセチルCoAを合成するよりもブタノールの生産効率に優れるといった新規な知見を得ることができた。

Claims (8)

  1. マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する酵素をコードするアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、及びアセトアセチルCoAからブタノールを合成するブタノール生合成関連遺伝子群が宿主微生物に導入された、組換え微生物。
  2. 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、Streptomyces属の放線菌由来の遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の組換え微生物。
  3. 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上の一致度を有するアミノ酸配列を有し、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項１記載の組換え微生物。
  4. 上記ブタノール生合成関連遺伝子群は、β-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ遺伝子、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ遺伝子、ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ遺伝子、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子及びブタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の組換え微生物。
  5. 上記ブタノール生合成関連遺伝子群は、ブタノール生合成能を有するClostridium属の微生物由来の遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の組換え微生物。
  6. 上記Clostridium属の微生物は、Clostridium acetobutylicumであることを特徴とする請求項５記載の組換え微生物。
  7. 上記宿主微生物は、大腸菌であることを特長とする請求項１記載の組換え微生物。
  8. 請求項１乃至７いずれか一項記載の組換え微生物を培養し、培地からブタノールを回収することを特徴とするブタノールの製造方法。
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