JP4003069B2 - 新規なグアノシン三リン酸（ｇｔｐ）結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質、ｂｇ３７ - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、新規なグアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、並びにこれらを利用した医薬品候補化合物のスクリーニング方法に関する。
背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜に存在する特異的なレセプタータンパク質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプタータンパク質の多くは共役しているグアノシン三リン酸結合タンパク質（以下、「Ｇタンパク質」と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行っている。このため、このレセプタータンパク質はＧタンパク質共役型レセプタータンパク質と総称されている。あるいは７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、７回膜貫通型レセプタータンパク質とも総称されている。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、例えばホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として非常に重要な役割を担っている。
例えば、ホルモンや神経伝達物質とＧタンパク質共役型レセプターによる生体の機能を調節する一つの経路として、視床下部−下垂体系がある。この系においては、視床下部ホルモンの働きにより、下垂体からの下垂体ホルモンの分泌が調節され、血中に放出された下垂体ホルモンを介して標的細胞・器官の機能調節が行われる。例えば、この経路を介して、ホメオスタシスの維持や生殖系、個体の発達・成長の調節などの生体にとって重要な機能調節が行われている。
代表的な視床下部ホルモンとして、ＴＲＨ、ＣＲＦ、ＧＲＦ、ソマトスタチン、また下垂体ホルモンとして、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、プロラクチン、成長ホルモン、オキシトシン、バソプレッシンなどがある。特に、下垂体ホルモンは視床下部ホルモンと標的内分泌腺より分泌される末梢ホルモンによるポジティブあるいは、ネガティブなフィードバック機構によって分泌調節されている。
これらのホルモンおよびそのレセプターは単に、視床下部−下垂体系だけに局在しているのではなく、脳内にも広く分布することが知られている。また、末梢組織においても同様に分布し、それぞれ重要な機能を担っていると考えられている。
例えば、膵臓は消化液を分泌する他にグルカゴンやインスリンを分泌することにより糖代謝に重要な役割を果たしている。インスリンは膵臓のβ細胞から分泌されるが、主としてグルコースにより促進される。しかしβ細胞には様々なレセプターが存在し、グルコース以外の様々な因子、ペプチドホルモン（ガラニン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、ガストリック・インヒビトリー・ポリペプチド、グルカゴンなど）、糖（マンノースなど）、アミノ酸、神経伝達物質などにより、インスリンの分泌が制御されていることが知られている。
胃や小腸などの消化器官では、ガストリン、セクレチン、グルカゴン、ガストリン放出ペプチド、血管作動性小腸ペプチド、アセチルコリン、ノルアドレナリン、およびセロトニン等といった、多くのホルモン・ホルモン様物質・神経伝達物質あるいは生理活性物質などによる調節のもとで、種々の消化液が分泌され、食物の消化・吸収が行われている。これらの物質は、胃や小腸などに存在する、それぞれに対応するレセプターによってその分泌が制御されていると考えられている。
心臓、肺をはじめとする、心臓血管系、呼吸器系においても、神経伝達物質、ホルモンあるいは生理活性物質などによる調節のもとで、心筋、血管平滑筋の収縮、及び弛緩、血圧の調節などが厳密に行われている。
以上のように脳、下垂体をはじめ、末梢組織においても、様々なホルモンや神経伝達物質に対するレセプタータンパク質が存在し、その機能調節に重要な役割を果たしていると考えられる。このため、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質は医薬品開発の標的として非常に注目されている。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質としては、これまでにムスカリン性アセチルコリン・レセプターＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４（Ｐｅｒａｌｔａ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．６，３９２３−３９２９（１９８７））、ムスカリン性アセチルコリン・レセプターＭ５（Ｂｏｎｎｅｒ，Ｔ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １，４０３−４１０（１９８８））、アデノシン・レセプターＡ１（Ｌｉｂｅｒｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，５６９−５７２（１９８９））、α１Ａアドレノレセプター（Ｂｒｕｎｏ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９，１４８５−１４９０（１９９１））、β１アドレノセプター（Ｆｒｉｅｌｌｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，７９２０−７９２４（１９８７））、アンジオテンシン・レセプターＡＴ１（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８３，９１０−９１６（１９９２））、エンドセリン・レセプターＥＴＡ（Ａｄａｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８０，１２６５−１２７２（１９９１））、ゴナドトロピン放出因子レセプター（Ｋａｋｅｒ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８９，２８９−２９５（１９９２））、ヒスタミン・レセプターＨ２（Ｒｕａｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１６５８−１６７２（１９９２））、神経ペプチドＹレセプターＹ１（Ｌａｒｈａｍｍａｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１０９３５−１０９３８（１９９２））、インターロイキン８・レセプターＩＬ８ＲＡ（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６３，１２７８−１２８０（１９９１））、ドーパミン・レセプターＤ１（Ｍａｈａｎ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，２１９６−２２００（１９９０））、代謝型グルタミン酸レセプターｍＧｌｕＲ１（Ｍａｓｕ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４９，７６０−７６５（１９９１））、ソマトスタチン・レセプターＳＳ１（Ｙａｍａｄａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，２５１−２５５）などが報告されている（参考文献：Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．ａｎｄ Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ，Ｓ．，Ｔｈｅ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））。また、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を標的とした医薬品としては、塩酸テラゾシン（血圧降下剤、α１アドレノセプター・アンタゴニスト）、アテノロール（不整脈用剤、β１アドレノセプター・アンタゴニスト）、塩酸ジサイクロミン（鎮痙剤、アセチルコリン・レセプター・アンタゴニスト）、塩酸ラニチジン（消化性潰瘍治療剤、ヒスタミン・レセプターＨ２・アンタゴニスト）、塩酸トラゾドン（抗うつ剤、セロトニン・レセプター５−ＨＴ１Ｂ・アンタゴニスト）、塩酸ブプレノルフィン（鎮痛剤、オピオイド・レセプターκ・アゴニスト）などが開発されている（参考文献：Ｓｔａｄｅｌ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１８，４３０−４３７（１９９７）；医薬品要覧第５版、薬業時報社）。
発明の開示
本発明は、新規なＧタンパク質共役型のレセプタータンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の製造方法、および該タンパク質ならびにＤＮＡの用途を提供することを課題とする。
本発明者らは上記の課題を解決するために、鋭意研究を行った。まず、本発明者らは新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質（ＧＰＣＲ）候補遺伝子の探索を目的に、既知のＧＰＣＲアミノ酸配列約４００個について、ＧｅｎＢａｎｋのｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｐｕｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｉｓｉｏｎに対する類似性検索を行った。検索の結果得られた、既知ＧＰＣＲと類似性を示した配列をリストアップし、これらの塩基配列の既知ＧＰＣＲデータベースに対する類似性検索を行った。これら塩基配列が既知ＧＰＣＲと同一か否か、および同一でない場合にどの程度類似性があるかを確認し、新規ＧＰＣＲ候補配列を得た。その候補の一つとしてＡＣ０２１０１６を見出し、該新規ＧＰＣＲ候補遺伝子をヒト「ＢＧ３７」と命名した。
次に本発明者らは、このＡＣ０２１０１６の断片４１４ｂｐを増幅し、３’−ＲＡＣＥ法を行うことにより、該断片のＣ末端の遺伝子情報を取得した。この新たに得られた塩基配列と既に得られているヒト「ＢＧ３７」の断片を組み合わせ、ＧｅｎＢａｎｋのｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｉｓｉｏｎに対する類似性検索を行った。その結果、既に得られた塩基配列と同一の配列ＡＣ０５５８８４を見出した。このＡＣ０５５８８４はＡＣ０２１０１６と１塩基のギャップ以外は全て同一の配列であった。ＡＣ０５５８８４およびＡＣ０２１０１６からの塩基配列情報により、ヒト「ＢＧ３７」の開始コドンが見出され、ヒト「ＢＧ３７」のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が９９３ｂｐであることが推定された。
次いで本発明者らは、ヒト「ＢＧ３７」のＯＲＦを含むｃＤＮＡのクローニングを行い、塩基配列を決定した。その結果、ヒト「ＢＧ３７」遺伝子によりコードされるタンパク質の推定アミノ酸配列は３３０アミノ酸残基からなることが判明し、モチーフ解析から、該タンパク質は７回膜貫通型の受容体であることが推定された。
さらに本発明者らは、ヒト組織由来のＲＮＡを用いたノーザンハイブリダイゼーションにより、これらの遺伝子の発現を解析したところ、ヒト「ＢＧ３７」は、心臓、骨格筋、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球において発現が見られた。このようにさまざまな組織において、発現がみられたことから、ヒト「ＢＧ３７」は、ヒトにとって重要な機能を有する遺伝子であることが示唆された。
続いて本発明者らは、ヒト「ＢＧ３７」遺伝子によってコードされる受容体蛋白質のリガンドの探索を行った。まず、ヒト「ＢＧ３７」蛋白質を強く発現する細胞を作製し、該細胞に被検化合物を作用させ、細胞内のｃＡＭＰの量の測定を行った。その結果、プロゲステロン、デヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロン、５α−ジヒドロテストステロン等を含む生体内ステロイドホルモンにおいて、濃度依存的に細胞内ｃＡＭＰ量の増加が確認された。このことからプロゲステロン等を含むステロイドホルモンが、「ＢＧ３７」受容体蛋白質を介して、細胞内ｃＡＭＰを特異的に上昇させることが判明した。
また、本発明者らは、マウス「ＢＧ３７」遺伝子の単離に成功した。該遺伝子のＯＲＦは、９９０ｂｐであり、３２９アミノ酸からなる蛋白質をコードすることが推定された。このマウス「ＢＧ３７」はヒト「ＢＧ３７」に対して、塩基配列で８３％、アミノ酸配列では８４％の相同性が確認された。そしてマウス「ＢＧ３７」の発現解析の結果、心臓、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、および７、１１、１５、１７日目のマウス胎児において発現していることが確認された。
さらに、本発明者らは、ラット「ＢＧ３７」遺伝子の単離に成功した。該遺伝子のＯＲＦは、９９０ｂｐであり、３２９アミノ酸からなる蛋白質をコードすることが推定された。このラット「ＢＧ３７」はヒト「ＢＧ３７」に対して、塩基配列で８４％、アミノ酸配列では８２％の相同性が確認された。そしてラット「ＢＧ３７」の発現解析の結果、肺、肝臓、および腎臓において発現していることが確認された。
上記の如く本発明者らは、Ｇタンパク質レセプタータンパク質をコードすると考えられる新規遺伝子「ＢＧ３７」を見出し、本発明を完成させた。本発明の「ＢＧ３７」タンパク質は、例えば、その結合活性を指標として、そのリガンドのスクリーニング、およびリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニング、さらには「ＢＧ３７」タンパク質からのシグナル伝達を調節しうる医薬品候補化合物のスクリーニングに好適に用いることができる。
従って、本発明は新規なＧタンパク質共役型のレセプタータンパク質、これらタンパク質をコードするＤＮＡ、およびこれらタンパク質を利用したリガンドおよび医薬品候補化合物のスクリーニングに関し、より具体的には、
〔１〕 下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のグアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２、２０または３８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１、１９または３７に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：２、２０または３８に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：１、１９または３７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
〔２〕 配列番号：２、２０または３８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、
〔３〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチド、
〔４〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡを含有することを特徴とするベクター、
〔５〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡまたは〔４〕に記載のベクターを保持する形質転換体、
〔６〕 〔５〕に記載の形質転換体を培養し、発現させたタンパク質またはペプチドを回収する工程を含む、〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法、
〔７〕 〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドに結合する抗体、
〔８〕 配列番号：１、１９または３７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するポリヌクレオチド、
〔９〕 〔３〕に記載のタンパク質に結合するリガンドまたはそのアナログのスクリーニング方法であって、
（ａ）〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドに被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質またはペプチドに結合する化合物を選択する工程、を含む方法、
〔１０〕 〔３〕に記載のタンパク質とそのリガンドまたは該リガンドのアナログとの結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検化合物の存在下で〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドにリガンドまたはそのアナログを接触させ、該タンパク質またはペプチドとリガンドまたはそのアナログとの結合活性を検出する工程、
（ｂ）被検化合物非存在下での結合活性と比較して、工程（ａ）で検出された結合活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法、
〔１１〕 〔３〕に記載のタンパク質の活性を阻害または促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物の存在下で該タンパク質を発現する細胞に該タンパク質のリガンドまたはそのアナログを接触させる工程、
（ｂ）該リガンドまたはそのアナログの該タンパク質への結合による細胞における変化を検出する工程、
（ｃ）被検化合物非存在下での細胞における変化と比較して、工程（ｂ）で検出された細胞における変化を抑制または増強させる化合物を選択する工程、を含む方法、
〔１２〕 リガンドがステロイド骨格を有する生体内物質である〔１０〕または〔１１〕に記載のスクリーニング方法、
〔１３〕 ステロイド骨格を有する生体内物質が、プロゲステロン、デヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロン、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、および５α−ジヒドロテストステロンからなる群より選択される〔１２〕に記載のスクリーニング方法、
〔１４〕 〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドを含有することを特徴とする、〔９〕から〔１３〕のいずれかに記載のスクリーニングのためのキット、
〔１５〕 〔９〕から〔１３〕のいずれかに記載のスクリーニングにより単離される化合物、
〔１６〕 〔１５〕に記載の化合物を有効成分とする医薬組成物、を提供するものである。
なお、本発明において「Ｇタンパク質共役型のレセプタータンパク質」とは、Ｇタンパク質の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行っているレセプタータンパク質を指す。また、本発明において「リガンド」とは、Ｇタンパク質共役型のレセプタータンパク質に結合して、シグナル伝達を誘導する能力を有する天然の化合物を指す。また、本発明において「アゴニスト」とは、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のリガンドと同様の生理活性を有する化合物を指し、天然の化合物および人工的に合成された化合物の双方が含まれる。また、本発明において「アンタゴニスト」とは、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のリガンドの生理活性を抑制する能力を有する化合物を指し、天然の化合物および人工的に合成された化合物の双方が含まれる。また、本発明における「タンパク質」および「ペプチド」にはその塩も含まれる。
本発明は、新規なＧタンパク質共役型のレセプタータンパク質（ＧＰＣＲ）に関する。本発明者らにより単離されたヒト由来のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質「ＢＧ３７」（ヒト「ＢＧ３７」）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ｃＤＮＡによりコードされる「ＢＧ３７」タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、マウス由来のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質「ＢＧ３７」（マウス「ＢＧ３７」）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１９に、該ｃＤＮＡによりコードされる「ＢＧ３７」タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２０に示す。さらに、ラット由来のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質「ＢＧ３７」（ラット「ＢＧ３７」）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：３７に、該ｃＤＮＡによりコードされる「ＢＧ３７」タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３８に示す。なお本明細書において「ＢＧ３７」とは、特に断りがない限り、ヒト「ＢＧ３７」、マウス「ＢＧ３７」およびラット「ＢＧ３７」の全てを指す。
本発明のヒト、マウス、およびラット「ＢＧ３７」タンパク質はそれぞれ３３０アミノ酸残基、３２９アミノ酸残基、３２９アミノ酸残基数のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する。親水性プロット解析の結果、ヒト「ＢＧ３７」タンパク質はＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に特徴的な７つの疎水性ドメインを有していた（図１）。従って、「ＢＧ３７」タンパク質は７回膜貫通型の受容体であることが推定された。また、ヒト組織においてヒト「ＢＧ３７」タンパク質によりコードされるレセプターｍＲＮＡの発現は、心臓、骨格筋、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、末梢血白血球においてシグナルが検出された。マウス組織においてマウス「ＢＧ３７」タンパク質の発現は、心臓、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、および、７、１１、１５、１７日目の胎児において発現が確認された。ラット組織においてラット「ＢＧ３７」タンパク質の発現は、肺、肝臓、および腎臓において発現が確認された。さらにヒト「ＢＧ３７」のリガンドが、生体内のプロゲステロン、デヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロン、５α−ジヒドロテストステロン等を含む生体内ステロイドホルモンであることが判明した。
これらの事実は、「ＢＧ３７」タンパク質が、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ファミリーに属し、かつヒト、マウス、およびラットにとって重要なタンパク質であることを示している。そして、「ＢＧ３７」タンパク質がＧタンパク質共役型レセプタータンパク質であることは、そのリガンドの作用によりＧタンパク質の活性化を通じてシグナル伝達を行っていることを示唆している。
本発明のタンパク質は、医薬品として有用なリガンドのスクリーニングや、該リガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニングに利用することが可能である。
本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドとしては、ステロイド骨格を有する生体内物質を好適に用いることができる。このような生体内物質としては、本発明者らによって同定されたプロゲステロン、デヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロン、５α−ジヒドロテストステロン等を含む生体内ステロイドホルモンを挙げることができる。また、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、およびウルソデオキシコール酸などの胆汁酸を挙げることができる。これら胆汁酸は、グリシン包合体やタウリン包合体などの包合体の形態であってもよい。また、潜在的リガンドとしては、ＰＴＨ（上皮小体ホルモン）、カルシトニン、ＣＧＲＰ（カルシトニン遺伝子関連タンパク質）、グルカゴン、セクレチン、アドレノメジュリン、セロトニン、アドレナリンおよびノルアドレナリン、ガラニン、ソマトスタチン、ケモカイン、およびヒスタミン等を例示できるが、本発明のリガンドはこれらに限定されない。
本発明のタンパク質を介するシグナル伝達の異常は、種々の疾患の原因となり得ると考えられる。従って、本発明のＧタンパク質共役型レセプターを活性化する化合物や、該Ｇタンパク質共役型レセプターの機能を抑制できる化合物は、医薬品としての応用が期待される。本発明のＧタンパク質共役型レセプターを活性化、または抑制する化合物を疾患の治療や予防目的に用いる場合に対象となる疾患としては、例えば、以下の疾患を挙げることができる。
・心疾患： 不整脈、心不全、心筋症、心臓弁疾患、心臓腫瘍、心内膜炎、心膜疾患、低血圧、低血圧性ショック、高血圧、アテローム動脈硬化、冠状動脈疾患、末梢動脈疾患等。
・肺疾患： 急性呼吸促迫症候群、肺塞栓症、気管支炎、閉塞性気道疾患、アレルギー性肺疾患、浸潤性肺疾患、肺炎、肺腫瘍、嚢胞性繊維症、胸膜疾患、肺癌等。
・筋肉疾患： 痙性斜頸、繊維筋痛症候群、滑液包炎等。
・脾臓疾患： 脾腫等。
・腸疾患： 炎症性腸疾患等。
・肝臓疾患： 脂肪肝、肝硬変、肝炎、肝臓血液障害（静脈閉塞性疾患、バッド−キアリ症候群、門脈血栓症など）、肝腫瘍、胆石症、総胆管結石症、胆嚢炎、胆管腫瘍等。
・腎臓疾患： 腎不全、腎炎、腎梗塞、アテローム塞栓性腎疾患、皮質壊死、悪性腎硬化、腎静脈血栓症等。
・血液疾患： エーレルス−ダンロー症候群、ランデュ・オースラー・ウェーバー病、アレルギー性紫斑病、血小板減少症、突発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血尿毒性症候群、血小板機能不全、白血球疾患、白血病、リンパ腫、形質細胞疾患、骨髄増殖性疾患等。
本発明はまた、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を提供する。このようなタンパク質は、当業者に公知のアミノ酸を改変する方法、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２（１９８７））、ダブルプライマー法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３２９−３５０（１９８７））、カセット変異法（Ｗｅｌｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３４，３１５−２３（１９８５））、メガプライマー法（Ｓａｒｋａｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８，４０４−４０７（１９９０））などを利用して調製することが可能である。即ち、当業者であれば、公知の方法を用いて天然型のヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質（配列番号：２、２０または３８）中のアミノ酸の置換などの修飾を行い、天然型のタンパク質と同等の機能または活性（グアノシン三リン酸結合タンパク質の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行う機能）を有する改変タンパク質を調製することが可能である。また、タンパク質のアミノ酸の変異は天然においても生じうる。このようにアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入などにより天然型のタンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、天然型のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質も本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に含まれる。機能的に同等なタンパク質におけるアミノ酸の変異数は、通常、全アミノ酸の１０％以内、好ましくは１０アミノ酸以内、さらに好ましくは３アミノ酸以内（例えば、１アミノ酸）であると考えられるが、その機能が保持される限り、特に制限はない。
ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、また、当業者に公知のハイブリダイゼーション技術（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ａｎｄ Ｍｅｓｅｌｓｏｎ，Ｍ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，３３３−３４２（１９８３）、Ｂｅｎｔｏｎ，Ｗ．Ｄ．ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６，１８０−１８２（１９７７））を利用して調製することができる。即ち、当業者であれば、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」ｃＤＮＡ配列（配列番号：１、１９または３７）、あるいはその一部を利用してハイブリダイゼーションを行い、種々の他の生物からこれと相同性の高いＤＮＡを単離し、さらに単離したＤＮＡから「ＢＧ３７」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることができる。本発明には、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」ｃＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に含まれる。
ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」ｃＤＮＡと相同性の高いＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションを「６ ｘ ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、２５度」、洗浄を「１ ｘ ＳＳＣ、５５度」で行う条件を用いることができる。より好ましい条件としては、ハイブリダイゼーションを「６ ｘ ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、３７度」、洗浄を「０．２ ｘ ＳＳＣ、５５度」で行う条件、さらに好ましい条件としては、ハイブリダイゼーションを「６ ｘ ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、３７度」、洗浄を「０．１ ｘ ＳＳＣ、６２度」で行う条件を用いることができる。なお、当業者であれば、ＳＳＣの希釈率、ホルムアミド濃度、温度などの諸条件を適宜選択することで、上記の条件と同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を実現することができる。
ハイブリダイゼーション技術を利用して機能的に同等なタンパク質を単離する他の生物としては、例えば、ウサギ、ウシ、イヌ、サルなどが挙げられるが、これらに制限されない。
ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、通常、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：１、１９または３７）と高い相同性を有する。高い相同性とは、塩基レベルで少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＡｌｔｓｃｈｕｌらによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，３３８９−３４０２（１９９７））によって決定することができる。パラメータは例えば、Ｅ ｖａｌｕｅ＝０．０１とし、その他はデフォルト値を用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
同様に、ポリメラーゼ連鎖反応などの遺伝子増幅技術を利用して、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することも可能である。
本発明のタンパク質は、天然のタンパク質の他、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えば、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質が発現していると考えられる心臓組織の抽出液に対し、後述する「ＢＧ３７」抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行う方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、後述するように本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。
また、本発明は、上記本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の部分ペプチドを包含する。本発明の部分ペプチドとしては、例えば、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のＮ末端領域の部分ペプチドが挙げられ、該ペプチドは抗体の調製に利用することができる。該ペプチドは、後述する医薬品候補化合物のスクリーニングに利用することができる。このような本発明の部分ポリペプチドは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、さらに好ましくは２０アミノ酸以上の鎖長を有するポリペプチドである。
また、本発明は、上記本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡに関する。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、これらタンパク質や部分ペプチドをコードしうるものであれば特に制限はなく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡは、例えば、配列番号：１、１９または３７に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質が発現している組織由来のｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、適当な組織由来のｃＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号：１、１９または３７に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、ゲノムＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、ゲノムＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。一方、合成ＤＮＡは、例えば、配列番号：１、１９または３７に記載のｃＤＮＡの部分配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、アニーリングさせて二本鎖にし、ＤＮＡリガーゼで結合させることにより調製することができる（Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，５６５−５７０（１９７６）；Ｇｏｅｄｄｅｌ Ｄ．Ｖ．ｅｔ ａｌ，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，１０６−１１０（１９７９））。
これらＤＮＡは、組換えタンパク質の生産に有用である。即ち、上記本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１、１９または３７に記載のＤＮＡ）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製することにより本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を組換えタンパク質として調製することが可能である。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質はレセプタータンパク質であるため、細胞膜に発現させて調製することが可能である。
具体的には、宿主が大腸菌エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合、プラスミドベクターｐＥＴ−３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５６，１２５−３５（１９８７））、ｐＧＥＸ−１（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｇｅｎｅ ６７，３１−４０（１９８８））などが用いられる。大腸菌の形質転換は、Ｈａｎａｈａｎ法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０（１９８３））、電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，６１２７−６１４５（１９８８））などで行う。宿主が分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の場合には、プラスミドベクターｐＥＳＰ−１（Ｌｕ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２００，１３５−１４４（１９９７））などが用いられる。酵母の形質転換は、例えば、スフェロプラスト法（Ｂｅａｃｈ，Ｄ．ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ，Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９０，１４０（１９８１））、酢酸リチウム法（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，６４８５−６４８９（１９９０））などにより行われる。
一方、宿主がほ乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ、ヒトＨｅＬａ細胞などの場合、ｐＭＳＧ（クロンテク社）などのベクターが用いられる。ほ乳動物細胞への組換えＤＮＡの導入は、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒＥｂ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４１−１６４３（１９８４））、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，７４１３−７４１７（１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１，８４１−８４５（１９８２））などで行われる。宿主が昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスベクターｐＢａｃＰＡＫ８／９（クロンテク社）などが用いられる。昆虫細胞の形質転換は、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８０））などに記載の方法に従って行うことができる。
宿主細胞において発現させた組換えタンパク質は、公知の方法により精製することができる。また、例えば、Ｎ末端にヒスチジン残基のタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを結合した融合タンパク質の形で合成し、金属キレート樹脂、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることにより精製することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，７２１１−７２１５（１９８８））。例えば、ベクターとしてｐＥＳＰ−１を用いた場合、目的のタンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として合成されるため、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることより組換えタンパク質を精製できる。融合タンパク質から目的タンパク質を分離するには、例えば、トロンビン、血液凝固因子Ｘａなどで切断する。
本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡは、その変異に起因する疾患の遺伝子治療に応用することも考えられる。遺伝子治療に用いる場合には、ヒト細胞への遺伝子導入には、レトロウイルスベクター（Ｄａｎｏｓ，Ｏ．ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，６４６０−６４６４（１９８８）；Ｄｒａｎｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，３５３９−３５４３（１９９３））、アデノウイルスベクター（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７３，３０９−３１９（１９９３））などを用いる方法が用いられている。患者への投与法としては、骨髄移植、皮下注射、静脈注射などが用いられる（Ａｓａｎｏ，Ｓ．，蛋白質核酸酵素，４０，２４９１−２４９５（１９９５））。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に結合する抗体に関する。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法（例えば、「新生化学実験講座１，タンパク質Ｉ，３８９−４０６，東京化学同人」参照）により調製することが可能である。ポリクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの免疫動物に適量の上記タンパク質またはペプチドを投与する。投与は、抗体産生を促進するアジュバント（ＦＩＡやＦＣＡ）と共に行ってもよい。投与は、通常、数週間ごとに行う。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体を調製することができる。一方、モノクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを、上記と同様に免疫動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。これにより調製された抗体は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のアフィニティー精製のために用いられる他、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現異常に起因する疾患の検査や抗体治療、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現量の検出などに利用することが可能である。
抗体治療に用いる場合、ヒト型抗体もしくはヒト抗体であることが好ましい。ヒト型抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのＨ鎖定常部をヒトＩｇＥ Ｈ鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌに導入することにより調製できる（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４，２６８−２７０（１９８５））。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスに本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を免疫することにより調製することが可能である。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドまたはそのアナログのスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法においては、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドに被検化合物を接触させ、これらタンパク質もしくはペプチドに結合する化合物を選択する工程を含む。被検化合物としては、例えば、アセチルコリン、アデノシン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンジオテンシン、ボムベシン、ブラジキニン、Ｃ５ａアナフィラトキシン、カルシトニン、カナビノイド、ケモカイン、コレシストキニン、ドーパミン、エンドセリン、フォルミルメチオニルペプチド、ＧＡＢＡ、ガラニン、グルカゴン、グルタミン酸、グリコペプチドホルモン、ヒスタミン、５−ヒドロキシトリプトファン、ロイコトリエン、メラノコルチン、神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、オドラント、オピオイドペプチド、オプシン、パラサイロイドホルモン、血小板活性化因子、プロスタノイド、ソマトスタチン、タキキニン、トロンビン、サイロトロピン放出ホルモン、バソプレシン、オキシトシン（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．ａｎｄ Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ，Ｓ．，Ｔｈｅ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））などの公知の化合物またはそのアナログ、その他の精製タンパク質、遺伝子（ライブラリーも含む）の発現産物、リガンドが存在していることが予想される組織もしくは細胞の抽出液、細胞培養上清などが用いられる。スクリーニングに用いる本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質は、例えば、所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）内または細胞表面に発現した形態、該細胞の細胞膜画分としての形態、アフィニティーカラムに結合した形態であってもよい。スクリーニングに用いる被検化合物は、必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質と被検化合物との結合は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に結合した化合物に付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度により検出する）のほか、被検化合物の細胞表面上の本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質への結合による細胞内へのシグナル伝達（例えば、Ｇタンパク質の活性化、Ｃａ２＋またはｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化）を指標に検出することもできる。具体的な方法については、例えば、文献（Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １４，６６３−６７１（１９９３）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２６，３４９−３５４（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，５９５７−５９６４（１９９３）、Ｃｅｌｌ ９２，５７３−５８５（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ ３９３，２７２−２７３（１９９８））や公報（特開平９−２６８号公報）の記載に準じて行うことができる。その他、ＴＷＯハイブリッドシステム（Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７２，２２３−２３２（１９９４）、Ｆｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７６，５３０−５３３（１９９５））を利用したレポーター遺伝子の活性の検出によっても結合を検出することができる。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質とそのリガンドまたはリガンドのアナログとの結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、（ａ）被検化合物の存在下で本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドにリガンドまたはそのアナログを接触させ、該タンパク質またはその部分ペプチドとリガンドまたはそのアナログとの結合活性を検出する工程、および（ｂ）工程（ａ）で検出された結合活性を、被検化合物非存在下での結合活性と比較し、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドとリガンドまたはそのアナログとの結合活性を低下させる化合物を選択する工程を含む。
被検化合物としては、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物、組織や細胞の抽出液、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。スクリーニングに用いる本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質は、例えば、所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）内または細胞表面に発現した形態、該細胞の細胞膜画分としての形態、アフィニティーカラムに結合した形態であってもよい。スクリーニングに利用するリガンドは必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。
本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドと、リガンドまたはそのアナログとの結合活性は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質やその部分ペプチドに結合したリガンドまたはそのアナログに付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度により検出する）のほか、被検化合物の細胞表面上の本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質への結合による細胞の変化（例えば、Ｇタンパク質の活性化、Ｃａ２＋またはｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化）を指標に検出することもできる。具体的な方法については、例えば、実施例に記載のＺｌｏｋａｒｍｉｋらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，ｖｏｌ．２７９，ｐ．８４）を利用することが可能である。また、文献（Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １４，６６３−６７１（１９９３）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２６，３４９−３５４（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，５９５７−５９６４（１９９３）、Ｃｅｌｌ ９２，５７３−５８５（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ ３９３，２７２−２７３（１９９８））や公報（特開平９−２６８号公報）の記載に準じて行うことができる。検出の結果、被検化合物の存在下における結合活性が、被検化合物の非存在下における結合活性（対照）４より低い値を示した場合には、該被検化合物は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドとリガンドまたはそのアナログとの結合を阻害する活性を有すると判定される。このような化合物は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物（アゴニスト）および該活性を有しない化合物（アンタゴニスト）などが含まれる。アゴニストは、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドと同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニストは、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドが有する生理活性を抑制する。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を阻害または促進する化合物をスクリーニングする方法に関する。このスクリーニング方法は、（ａ）被検化合物の存在下で本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を発現する細胞に該タンパク質のリガンドまたはそのアナログを接触させる工程、（ｂ）該リガンドまたはそのアナログの該タンパク質への結合による細胞における変化を検出する工程、および（ｃ）被検化合物非存在下での細胞における変化と比較して、工程（ｂ）で検出された細胞における変化を抑制または増強させる化合物を選択する工程、を含む方法である。
被検化合物としては、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物、組織や細胞の抽出液、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。上記の結合活性の阻害を指標としたスクリーニングにより単離された化合物を被検化合物として用いることも考えられる。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を発現する細胞は、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な動物細胞に導入することにより調製することができる。該発現ベクターには、形質転換体を選別するためのマーカー遺伝子が挿入されていてもよい。
リガンドやそのアナログが本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質へ結合することによる細胞における変化は、例えば、Ｇタンパク質の活性化、Ｃａ２＋またはｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化を指標に検出することもできる。具体的な方法については、例えば、Ｚｌｏｋａｒｍｉｋらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，ｖｏｌ．２７９，ｐ．８４）を利用することが可能である。また、文献（Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １４，６６３−６７１（１９９３）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２６，３４９−３５４（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，５９５７−５９６４（１９９３）、Ｃｅｌｌ ９２，５７３−５８５（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ ３９３，２７２−２７３（１９９８））や公報（特開平９−２６８号公報）の記載に準じて行うことができる。
この検出の結果、被検化合物非存在下においてリガンドやそのアナログを作用させた場合の細胞における変化と比較して、細胞における変化が抑制されれば、用いた被検化合物は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が該細胞における変化を増強させれば、該化合物は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を促進する化合物であると判定される。
本発明のスクリーニング方法により単離される化合物（本発明のタンパク質のアゴニストやアンタゴニスト）は、例えば、関節リュウマチ、変形性関節症、胃潰瘍、炎症性腸疾患、虚血性心疾患、不整脈、高及び低血圧症、肥満、喘息、疼痛、アレルギー疾患、自己免疫疾患（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ １９、１９９８，１７７−１８３、Ｓｔａｒｋ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ２１，５０７−５２０（１９９６）、Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｋ．ａｎｄ Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５，８７−１０２（１９９５））への応用が考えられる。これら化合物を薬剤として用いる場合には、単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、香料、および着色剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを含有することを特徴とする、上記本発明のスクリーニングのためのキットに関する。本発明のキットにおける本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドは、例えば、所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）内または細胞表面に発現した形態、該細胞の細胞膜画分としての形態、アフィニティーカラムに結合した形態であってもよい。本発明のキットの他の要素としては、上記レセプタータンパク質標品以外に、例えば、リガンド標品（標識されたもの、および標識されていないもの）、リガンドとレセプタータンパク質の反応のための緩衝液、洗浄液などが含まれていてもよい。リガンドに付される標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられる。本発明のキットの利用は、公報（特開平９−２６８号公報）の記載に準じて行うことができる。また、例えば、ｃＡＭＰ量の変化の検出系や結合活性の検出系を利用したスクリーニングにおいて本発明のキットを利用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］新規ＧＰＣＲ候補遺伝子の探索
既知のＧＰＣＲアミノ酸配列約４００個の、ＧｅｎＢａｎｋのｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｉｓｉｏｎに対する類似性検索を行った。検索のアルゴリズムはｂｌａｓｔを用いた。検索の結果得られた既知のＧＰＣＲと類似性を示した配列をリストアップした。次に、これらの塩基配列について、既知ＧＰＣＲデータベースに対する類似性検索を行い、これら塩基配列が既知ＧＰＣＲと同一か否か、同一でないのであればどの程度類似性があるかを確認し、新規ＧＰＣＲ候補配列を得た。その候補の一つとして、ＡＣ０２１０１６を見出した。この新規ＧＰＣＲ候補遺伝子をヒト「ＢＧ３７」と命名した。
［実施例２］ヒトＢＧ３７ ｃＤＮＡのクローニング
既知のＧＰＣＲの塩基配列と類似性が認められたＡＣ０２１０１６の断片４１４ｂｐを増幅させるために、ＢＧ３７−０１Ｆ（５’−ＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＴＣＣＴＧＡＧＧＣ−３’／配列番号：３）、およびＢＧ３７−０２Ｒ（５’−ＡＣＴＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＧＣ−３’／配列番号：４）の２つのプライマーを合成しプライマーとして用いて、ヒトゲノム遺伝子（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）からＰＣＲにより目的の断片を増幅した。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄのプロトコールに従い、９５度９分の後、９４度３０秒、５５度１５秒、７２度１分を３９サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。次いで、増幅産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした。ダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳ（ＰＥバイオシステムズ社）でダイオキシシーケンシング反応を行い、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＰＥバイオシステムズ社）で電気泳動して塩基配列を決定した。
このヒトＢＧ３７断片のＣ末側の遺伝子情報を得るために３’−Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（３’−ＲＡＣＥ）法をＣｌｏｎｔｅｃｈ社の方法に従って行った。プライマーＢＧ３７−１０Ｆ（５’−ＣＧＴＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＣ−３’／配列番号：５）を合成し、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｆｅｔｕｓ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ＰＣＲにより断片約５００ｂｐを増幅した。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、６８度３分を３５サイクル、最後に９４度３０秒、６２度８分を行った。次いで、この増幅産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした。ダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）でダイオキシシーケンシング反応を行い、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）で電気泳動して塩基配列を決定した。
３’−ＲＡＣＥにより新たに得られた塩基配列と既に得られていたヒトＢＧ３７の断片配列を組み合わせ、ＧｅｎＢａｎｋのｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｉｓｉｏｎに対する類似性検索を行った。検索のアルゴリズムはｂｌａｓｔを用いた。検索の結果、ＡＣ０５５８８４において今まで得られた塩基配列と同一の塩基配列を見出し、ＡＣ０２１０１６において１塩基のギャップ以外は全て同一の塩基配列を見出した。ＡＣ０５５８８４およびＡＣ０２１０１６からの塩基配列情報により、ヒトＢＧ３７の開始コドンを見出し、ヒトＢＧ３７のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が９９３ｂｐであることが予測された。
ヒトＢＧ３７のＯＲＦを含むｃＤＮＡをクローニングするために、プライマーＢＧ３７−１２Ｆ（５’−ＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧ−３’／配列番号：６）とＢＧ３７−１５Ｒ（５’−ＴＴＡＧＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＣＡＣＴＧＣＴＴＴ−３’／配列番号：７）を合成し、ヒトゲノム遺伝子（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）からＢＧ３７−１２Ｆ、およびＢＧ３７−１５Ｒをプライマーとして用いて、ＰＣＲにより目的の断片を増幅した。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、６８度３分を２６サイクル、最後に９４度３０秒、６２度８分を行った。次いで、増幅産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした（ｐＣＲ２．１−ＢＧ３７ＯＲＦ）。ダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳ（ＰＥバイオシステムズ社）でダイオキシシーケンシング反応を行い、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＰＥバイオシステムズ社）で電気泳動して塩基配列を決定した。アミノ酸配列の推定には、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（ＤＮＡスター社）を用いた。
その結果、タンパク質の推定アミノ酸配列は３３０残基から成ることを見出し、かつ７回膜貫通型の受容体であることが推定された。
なお、ＢＧ３７ ｃＤＮＡをクローニングした大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ｈＢＧ３７−２）を下記の通り寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）：平成１２年１１月２日
（ハ）寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−７７３９
［実験例３］ヒトＢＧ３７の発現解析
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ（ｈｕｍａｎ １２−ｌａｎｅ ＭＴＮ Ｂｌｏｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ヒトＢＧ３７のノーザンハイブリダイゼーションを行った。プライマーＢＧ３７−１２ＦとＢＧ３７−１５Ｒを用いて、ｐＣＲ２．１−ＢＧ３７ＯＲＦを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した断片、即ちヒトＢＧ３７のＯＲＦをＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製した後にノーザンハイブリダイゼーションのプローブとして使用した。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、６８度３分を２６サイクル、最後に９４度３０秒、６２度８分を行った。プローブはＢｃａＢＥＳＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）と［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いてラベル化されたものを使用した。ハイブリダイゼーションバッファーにはＲａｐｉｄ Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用し、ＭＴＮ Ｂｌｏｔを１時間Ｒａｐｉｄ Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒにプレハイブリダイゼーションした後、ラベル化されたプローブを加えて、２時間のハイブリダイゼーションを行った。非特異的なプローブの結合を除去するために、２ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで２回室温で洗浄後、０．１ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで２０分２回６５度で洗浄した。その後、イメージングプレート（富士フィルム社）に一晩感光させ、ＢＡＳ２０００（富士フィルム社）にて解析した。
ノーザンハイブリダイゼーションの結果を図２に示す。ヒトＢＧ３７のｍＲＮＡは心臓、骨格筋、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、末梢血白血球において約１．５ｋｂの長さで発現が見られた。脳、結腸、胸腺については、発現は確認できなかった。
［実施例４］ヒトＢＧ３７発現細胞（ｈｕｍａｎ ＢＧ３７ ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）の作製
ヒトＢＧ３７発現ベクターは、ｐＩＲＥＳｎｅｏおよびｐＩＲＥＳｈｙｇ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を利用して作製した。ヒトＢＧ３７遺伝子をクローン化しやすいように、ｐＩＲＥＳｎｅｏのネオマイシン耐性遺伝子を、ｐＩＲＥＳｈｙｇのハイグロマイシン耐性遺伝子と置換したプラスミド（ｐＫＴ５２）を作製した。ｐＣＲ２．１−ＢＧ３７ＯＲＦからＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶサイトを用いて切り出されたヒトＢＧ３７遺伝子を、同じくＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶサイトで消化切断されたｐＫＴ５２ベクターにサブクローニングし、発現ベクターとした（ｐＫＴ５２−ｈＢＧ３７−２）。
ＨＥＫ２９３細胞は、１０％牛胎児血清、ネオマイシンを含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）混合培地（旭テクノグラス社）を用い、３７度、５％ＣＯ２存在下で培養した。
遺伝子導入には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いた。トランスフェクション前日に１ｘ１０６の細胞を６ｃｍ ｄｉｓｈ（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏａｔｅｄ）（旭テクノグラス社）にまき、１２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔと８μｌのｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、２μｇのｐＫＴ５２−ｈＢＧ３７−２を添付のマニュアルに従い、トランスフェクションし、３７度、５％ＣＯ２存在下で４８時間培養した。
目的の遺伝子が導入された単一の細胞を単離する為に、トランスフェクションした細胞をトリプシンで処理後、遠心操作により回収し、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）混合培地（旭テクノグラス社）に再懸濁し、ハイグロマイシンを含む選択培地にてさらに３７度、５％ＣＯ２存在下、１１日間培養した。単一のコロニーからなる細胞を選び、順次継代培養しｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅを作製した。
この様にして作製したヒトＢＧ３７発現細胞からトータルＲＮＡを調製し、ノーザンハイブリダイゼイション法を用いて導入されたヒトＢＧ３７の発現量を調べ、強く発現している細胞（ＨＥＫ／ｈＢＧ３７）を選択して以下の実験に用いた。
［実施例５］細胞内ｃＡＭＰ量の測定（ＥＬＩＳＡ法）
細胞内ｃＡＭＰ量の測定は、Ｚｌｏｋａｒｍｉｋらの方法を用いた（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，ｖｏｌ．２７９，ｐ．８４）。７回膜貫通型レセプターにおける結合Ｇタンパク質を介した細胞内ｃＡＭＰ量の増加を測定するため、リガンドが作用した際の細胞内ｃＡＭＰ量を測定した。
細胞内ｃＡＭＰ量の測定の前日に、ポリ−Ｄ−リジンコートされた９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に４ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように蒔き直し、さらに３７度、２４時間インキュベーションした。ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅは、最終濃度０．１％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）及び最終濃度１ｍＭ ３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−Ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）（ナカライテスク社）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ溶液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−ＢＳＡ−ＩＢＭＸ溶液）で２回リンスした後、３７度で２０分インキュベーションした。上清をのぞいた後、各濃度のプロゲステロンなどのステロイドホルモンを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ−ＢＳＡ−ＩＢＭＸ溶液を添加し、３７度で１５分インキュベーションした後、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで細胞を溶解し細胞内ｃＡＭＰ量の測定を行った。
細胞内ｃＡＭＰ量の測定には、ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ（ＥＩＡ）ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム ファルマシア バイオテク社）を用い、添付のマニュアルに従って行った。
その結果、ヒトＢＧ３７を発現した細胞（ＨＥＫ／ｈＢＧ３７）では、プロゲステロンやデヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロンなどを含むステロイドホルモンに濃度依存的に細胞内ｃＡＭＰ量の増加が確認された。代表的な例として、プロゲステロンによる濃度依存的な細胞内ｃＡＭＰ量増加のデータを示す。また、ベクターのみを発現させたｍｏｃｋ細胞ではプロゲステロンによる濃度依存的な細胞内ｃＡＭＰ量増加は認められなかった（図３）。
このことから少なくともプロゲステロンやデヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロンなどを含むステロイドホルモンがＢＧ３７を介して細胞内ｃＡＭＰ量を特異的に上昇させることが判明した。
［実施例６］マウスＢＧ３７ ｃＤＮＡのクローニング
マウスＢＧ３７のｃＤＮＡをクローニングする目的で、ヒトＢＧ３７配列を基にした２つのプライマー、ＢＧ３７−１３Ｆ（５’−ＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＴＡＣＴＴＧＧＣＴＣＣＣ−３’／配列番号：８）とＢＧ３７−１４Ｒ（５’−ＴＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＧＴＡＧＧＧＣ−３’／配列番号：９）を利用して、マウスゲノム遺伝子（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型にして約４９０ｂｐの断片をＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄのプロトコールに従い、９５度９分の後、９４度３０秒、５２度３０秒、７２度１分を３０サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。次いで、増幅産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号：１０）。マウスＢＧ３７ｆｒａｇｍｅｎｔとヒトＢＧ３７の配列との相同性を調べたところ、８４．４％の相同性を示すことが分かり、得られた塩基配列は目的のマウスＢＧ３７の配列であることが強く示唆された。なお、塩基配列決定はダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳ（ＰＥバイオシステムズ社）でダイオキシシーケンシング反応を行い、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＰＥバイオシステムズ社）で電気泳動して行った。
このマウスＢＧ３７の断片のＣ末側の遺伝子情報を得るために３’−ＲＡＣＥ法及びｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法をＣｌｏｎｔｅｃｈ社の方法に従って行った。３’−ＲＡＣＥにはプライマーｍＢＧ３７−０４Ｆ（５’−ＣＣＣＴＣＡＡＣＣＣＴＧＧＣＴＡＧＧＧＣＴＣＴＣＡＣＣ−３’／配列番号：１１）を利用し、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｍｏｕｓｅ ｈｅａｒｔ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＰＣＲを行った。そのＰＣＲ産物を鋳型とし、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲをプライマーｍＢＧ３７−０３Ｆ（５’−ＧＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧＧＧＧ−３’／配列番号：１２）を利用して行った。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号：１３）。
同様にこのマウスＢＧ３７の断片のＮ末側の遺伝子情報を得るために５’−ＲＡＣＥ法及びｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法をＣｌｏｎｔｅｃｈ社の方法に従って行った。５’−ＲＡＣＥにはプライマーｍＢＧ３７−０９Ｒ（５’−ＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＧＣＴＡＧＣＣＧＣ−３’／配列番号：１４）を利用し、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｍｏｕｓｅ ｈｅａｒｔ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ＰＣＲを行った。そのＰＣＲ産物を鋳型とし、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲをｍＢＧ３７−０７Ｒ（５’−ＧＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＧ−３’／配列番号：１５）を利用して行った。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号：１６）。
マウスＢＧ３７のＯＲＦを含むｃＤＮＡをクローニングするために、プライマーｍＢＧ３７−１２Ｆ（５’−ＧＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＴＧＡＴＧＡＣＡＣＣＣ−３’／配列番号：１７）とｍＢＧ３７−１３Ｒ（５’−ＣＴＡＡＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＧＣＴＧＣ−３’／配列番号：１８）を合成し、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｍｏｕｓｅ ｈｅａｒｔ ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）からｍＢＧ３７−１２Ｆ、ｍＢＧ３７−１３Ｒを用いて、ＰＣＲにより目的の断片を増幅した。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、５８度３０秒、７２度２分を３５サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。次いで、ＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし（ｐＣＲ２．１−ｍＢＧ３７−９）、マウスＢＧ３７のＯＲＦの塩基配列を決定した（配列番号：１９）。
予想されるＯＲＦは９９０ｂｐ、３２９アミノ酸からなると推定され、マウスＢＧ３７のヒトＢＧ３７に対する相同性を調べたところ、ＤＮＡでは８３％、アミノ酸では８４％の相同性が確認された。
なお、マウスＢＧ３７ ｃＤＮＡをクローニングした大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ｍＢＧ３７−９）を下記の通り寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）：平成１３年２月１日
（ハ）寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−７７４０
［実験例７］マウスＢＧ３７の発現解析
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ ｐａｎｅｌ（ｍｏｕｓｅ ＭＴＣ ｐａｎｅｌ Ｉ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、マウスＢＧ３７の発現部位を調べるためにＰＣＲを行った。プライマーはｍＢＧ３７−１Ｆ（５’−ＴＴＣＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’／配列番号：２１）とｍＢＧ３７−２Ｒ（５’−ＣＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣ−３’／配列番号：２２）を用い、ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、５５度３０秒、７２度２分を４０サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で電気泳動した結果を示す（図４）。ＰＣＲ産物の長さは約４２０ｂｐであった。その結果、マウスＢＧ３７は心臓、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、７日目の胎児、１１日目の胎児、１５日目の胎児、１７日目の胎児において発現が確認でき、脳では発現を確認できなかった。
［実験例８］ラットＢＧ３７ ｃＤＮＡのクローニング
ラットＢＧ３７のｃＤＮＡをクローニングする目的で、ヒトＢＧ３７配列を基にした２つのプライマー、ＢＧ３７−１３ＦとＢＧ３７−１４Ｒを利用して、ラットゲノム遺伝子（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型にして約４９０ｂｐの断片をＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄのプロトコールに従い、９５度９分の後、９４度３０秒、５２度３０秒、７２度１分を３０サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。次いで、増幅産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号：２３）。ラットＢＧ３７フラグメントとヒトＢＧ３７の配列との相同性を調べたところ、８４．２％の相同性を示すことが分かり、得られた塩基配列は目的のラットＢＧ３７の配列であることが強く示唆された。なお、塩基配列決定はダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳ（ＰＥバイオシステムズ社）でダイオキシシーケンシング反応を行い、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＰＥバイオシステムズ社）で電気泳動して行った。
ヒトＢＧ３７ｃＤＮＡの全長をクエリーにして、ＧｅｎＢａｎｋにおいてｂｌａｓｔのアルゴリズムで類似性検索を行ったところ、ラットＥＳＴクローン（ＡＩ５４８１４１）がラットＢＧ３７のＣ末をコードしていることが分かった。このＡＩ５４８１４１に記載されている配列を基にプライマーｒＢＧ３７−１２Ｒ（５’−ＣＣＣＴＡＡＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧ−３’／配列番号：２４）を作製し、また既に得られているラットＢＧ３７断片配列からプライマーｒＢＧ３７−３Ｆ（５’−ＧＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧＧＧＧ−３’／配列番号：２５）を作製し、ラットゲノム遺伝子とラットｍａｒａｔｈｏｎ ｒｅａｄｙ ｋｉｄｎｅｙ ｃＤＮＡ（共にＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型にしてＰＣＲを行ったところ、どちらからも３１１ｂｐの断片が増幅された。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄのプロトコールに従い、９５度９分の後、９４度３０秒、５８度３０秒、７２度１分を４０サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定したところ、２つのＰＣＲ産物は同じ配列であった（配列番号：２６）。
ラットＢＧ３７の断片のＮ末側の遺伝子情報を得るために５’−ＲＡＣＥ法及びｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を行った。まず最初に、プライマーｒＢＧ３７−１０Ｒ（５’−ＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＧ−３’／配列番号：２７）とｍａｒａｔｈｏｎ ｒｅａｄｙ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて５’−ＲＡＣＥを行い、そのＰＣＲ産物を鋳型として、プライマーｒＢＧ３７−８Ｒ（５’−ＧＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＣＣＣＡＴＧＣＡＣＣ−３’／配列番号：２８）を用いてｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄのプロトコールに従い、９５度９分の後、９４度３０秒、５８度３０秒、７２度１分を３０サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号：２９）。さらに上流部分をクローニングする目的で、プライマーｒＢＧ３７−１４Ｒ（５’−ＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴＡＴＴＣＣＡＴＡＧＣＣＣ−３’／配列番号：３０）、プラスミドベクターの配列Ｍ１３ Ｒｅｖ．（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’／配列番号：３１）を利用し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）より、プラスミドＤＮＡを精製したものを鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、５０度１５秒、７２度６０秒を３９サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。そのＰＣＲ産物を鋳型とし、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲをｒＢＧ３７−１３Ｒ（５’−ＴＧＴＧＡＧＴＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＧＴＡＧＴＡＧＧＣ−３’／配列番号：３２）を利用して行った。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号：３３）。
ラットＢＧ３７のＯＲＦを含むｃＤＮＡをクローニングするために、プライマーｒＢＧ３７−１６Ｆ（５’−ＧＧＡＴＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＣＴＧ−３’／配列番号：３４）とｒＢＧ３７−１１Ｒ（５’−ＧＧＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧＡＧＣ−３’／配列番号：３５）を用いて、ラット視床および視床下部由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲにより目的の断片を増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし（ｐＣＲ２．１−ｒＢＧ３７−Ｇ０７０３）、ラットＢＧ３７のＯＲＦの塩基配列を決定した（配列番号：３６）。
予想されるＯＲＦは９９０ｂｐ（配列番号：３７）、３２９アミノ酸（配列番号：３８）からなると推定され、ラットＢＧ３７のヒトＢＧ３７に対する相同性を調べたところ、ＤＮＡでは８４％、アミノ酸では８２％の相同性が確認された。
なお、ラットＢＧ３７ ｃＤＮＡをクローニングした大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ｒＢＧ３７−Ｇ０７０３）を下記の通り寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）：平成１３年２月２０日
（ハ）寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−７７４１
［実験例９］ラットＢＧ３７の発現解析
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ ｐａｎｅｌ（ｒａｔ ＭＴＣ ｐａｎｅｌ Ｉ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ラットＢＧ３７の発現部位を調べるためにＰＣＲを行った。プライマーはｒＢＧ３７−３ＦとｒＢＧ３７−１２Ｒを用い、ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、５０度１５秒、７２度１分を４０サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で電気泳動した結果を示す（図５）。ＰＣＲ産物の長さは３１２ｂｐであった。その結果、ラットＢＧ３７は肺、肝臓、腎臓において発現が確認でき、心臓、脳、脾臓、骨格筋、精巣では発現を確認できなかった。
［実施例１０］胆汁酸による細胞内ｃＡＭＰ量増加反応
細胞内ｃＡＭＰ量の測定は、Ｚｌｏｋａｒｍｉｋらの方法を用いた（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，ｖｏｌ．２７９，ｐ．８４）。７回膜貫通型レセプターにおける結合Ｇタンパク質を介した細胞内ｃＡＭＰ量の増加を測定するため、リガンドが作用した際の細胞内ｃＡＭＰ量を測定した。
細胞内ｃＡＭＰ量の測定の前日に、ポリ−Ｄ−リジンコートされた９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ ｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に４ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように蒔き直し、さらに３７度、２４時間インキュベーションした。ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅは、最終濃度１ｍＭ ３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−Ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）（ナカライテスク社）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ溶液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−ＩＢＭＸ溶液）で２回リンスした後、３７度で２０分インキュベーションした。上清をのぞいた後、各濃度の試薬を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ−ＩＢＭＸ溶液を添加し、３７度で２０分インキュベーションした後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００で細胞を溶解し細胞内ｃＡＭＰ量の測定を行った。
細胞内ｃＡＭＰ量の測定には、ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｋｉｔ（ＨＴＲＦ）（日本シェーリング社）を用い、添付のマニュアルに従って行った。
プロゲステロンなどのステロイドホルモンと同様にステロイド骨格を保持する胆汁酸がＢＧ３７を活性化させるかどうかを調べたところ、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸やそれぞれのグリシン包合体、タウリン包合体などがヒトＢＧ３７が発現した細胞において細胞内ｃＡＭＰ量を上昇させた。上記の化合物はベクターのみを発現させたｍｏｃｋ細胞では細胞内ｃＡＭＰ量を上昇させなかった。このことから、コール酸などの胆汁酸もＢＧ３７を介して細胞内ｃＡＭＰ量を特異的に上昇させることが判明した。図６に示すデータは化合物の濃度が１０μＭの時のＨＥＫ／ｈＢＧ３７細胞における細胞内ｃＡＭＰ量を示している。
産業上の利用の可能性
本発明により、複数の組織で発現する新規なＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、および該タンパク質をコードする遺伝子が提供された。これにより、該レセプタータンパク質を利用したリガンドや医薬品の候補化合物のスクリーニングが可能となった。これらリガンドや医薬品の候補化合物は、例えば、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を介したシグナル伝達系の異常等に起因する疾患の診断や治療等への利用が期待される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト「ＢＧ３７」タンパク質の親水性プロットを示す図である。図上の番号は、ヒト「ＢＧ３７」タンパク質のアミノ酸の番号を示す。７つの疎水性領域をＩ〜ＶＩＩで示す。
図２は、上の図は、ノーザンブロットハイブリダイゼーション法により各種組織におけるヒト「ＢＧ３７」の発現を検出した結果を示す写真である。下の図はノーザンプロットハイブリダイゼーション法により各種組織におけるベータアクチンの発現を検出した結果を示す写真である。図中のレーン１から１２はそれぞれ、脳、心臓、骨格筋、大腸（粘膜を除く）、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、末梢血白血球を示す。
図３は、プロゲステロン添加による細胞内ｃＡＭＰの増加の結果を示すグラフである。左はＨＥＫ／ｈＢＧ３７細胞、右はベクターのみを発現させたｍｏｃｋ細胞（対照細胞）を表す。横軸はプロゲステロン濃度（Ｍ）の対数、縦軸はｃＡＭＰレベルを表す。
図４は、上の図はマウスＭＴＣ ｐａｎｅｌ Ｉを利用してマウス「ＢＧ３７」の発現部位を調べた結果を示す写真である。下の図は各種組織におけるＧ３ＰＤＨの発現を検出した結果を示す写真である。図中のレーン１から１３は心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、７日目の胎児、１１日目の胎児、１５日目の胎児、１７日目の胎児、ネガティヴコントロール（テンプレートなし）を示す。レーンＭはサイズマーカーを示す。
図５は、上の図はラットＭＴＣ ｐａｎｅｌ Ｉを利用してラットＢＧ３７の発現部位を調べた結果を示す写真である。下の図は各種組織におけるＧ３ＰＤＨの発現を検出した結果を示す写真である。図中のレーン１から１１は心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、ネガティヴコントロール（テンプレートなし）、コントロールｃＤＮＡ（キットに添付されていた物）、ラットゲノム遺伝子を示す。レーンＭはサイズマーカーを示す。
図６は、胆汁酸による細胞内ｃＡＭＰ量増加反応を示すグラフである。各化合物の濃度が１０μＭの時のＨＥＫ／ｈＢＧ３７細胞における細胞内ｃＡＭＰ量を示す。
本発明は、新規なグアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、並びにこれらを利用した医薬品候補化合物のスクリーニング方法に関する。
背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜に存在する特異的なレセプタータンパク質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプタータンパク質の多くは共役しているグアノシン三リン酸結合タンパク質（以下、「Ｇタンパク質」と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行っている。このため、このレセプタータンパク質はＧタンパク質共役型レセプタータンパク質と総称されている。あるいは７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、７回膜貫通型レセプタータンパク質とも総称されている。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、例えばホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として非常に重要な役割を担っている。
例えば、ホルモンや神経伝達物質とＧタンパク質共役型レセプターによる生体の機能を調節する一つの経路として、視床下部−下垂体系がある。この系においては、視床下部ホルモンの働きにより、下垂体からの下垂体ホルモンの分泌が調節され、血中に放出された下垂体ホルモンを介して標的細胞・器官の機能調節が行われる。例えば、この経路を介して、ホメオスタシスの維持や生殖系、個体の発達・成長の調節などの生体にとって重要な機能調節が行われている。
代表的な視床下部ホルモンとして、ＴＲＨ、ＣＲＦ、ＧＲＦ、ソマトスタチン、また下垂体ホルモンとして、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、プロラクチン、成長ホルモン、オキシトシン、バソプレッシンなどがある。特に、下垂体ホルモンは視床下部ホルモンと標的内分泌腺より分泌される末梢ホルモンによるポジティブあるいは、ネガティブなフィードバック機構によって分泌調節されている。
これらのホルモンおよびそのレセプターは単に、視床下部−下垂体系だけに局在しているのではなく、脳内にも広く分布することが知られている。また、末梢組織においても同様に分布し、それぞれ重要な機能を担っていると考えられている。
例えば、膵臓は消化液を分泌する他にグルカゴンやインスリンを分泌することにより糖代謝に重要な役割を果たしている。インスリンは膵臓のβ細胞から分泌されるが、主としてグルコースにより促進される。しかしβ細胞には様々なレセプターが存在し、グルコース以外の様々な因子、ペプチドホルモン（ガラニン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、ガストリック・インヒビトリー・ポリペプチド、グルカゴンなど）、糖（マンノースなど）、アミノ酸、神経伝達物質などにより、インスリンの分泌が制御されていることが知られている。
胃や小腸などの消化器官では、ガストリン、セクレチン、グルカゴン、ガストリン放出ペプチド、血管作動性小腸ペプチド、アセチルコリン、ノルアドレナリン、およびセロトニン等といった、多くのホルモン・ホルモン様物質・神経伝達物質あるいは生理活性物質などによる調節のもとで、種々の消化液が分泌され、食物の消化・吸収が行われている。これらの物質は、胃や小腸などに存在する、それぞれに対応するレセプターによってその分泌が制御されていると考えられている。
心臓、肺をはじめとする、心臓血管系、呼吸器系においても、神経伝達物質、ホルモンあるいは生理活性物質などによる調節のもとで、心筋、血管平滑筋の収縮、及び弛緩、血圧の調節などが厳密に行われている。
以上のように脳、下垂体をはじめ、末梢組織においても、様々なホルモンや神経伝達物質に対するレセプタータンパク質が存在し、その機能調節に重要な役割を果たしていると考えられる。このため、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質は医薬品開発の標的として非常に注目されている。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質としては、これまでにムスカリン性アセチルコリン・レセプターＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４（Ｐｅｒａｌｔａ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．６，３９２３−３９２９（１９８７））、ムスカリン性アセチルコリン・レセプターＭ５（Ｂｏｎｎｅｒ，Ｔ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １，４０３−４１０（１９８８））、アデノシン・レセプターＡ１（Ｌｉｂｅｒｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，５６９−５７２（１９８９））、α１Ａアドレノレセプター（Ｂｒｕｎｏ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９，１４８５−１４９０（１９９１））、β１アドレノセプター（Ｆｒｉｅｌｌｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，７９２０−７９２４（１９８７））、アンジオテンシン・レセプターＡＴ１（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８３，９１０−９１６（１９９２））、エンドセリン・レセプターＥＴＡ（Ａｄａｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８０，１２６５−１２７２（１９９１））、ゴナドトロピン放出因子レセプター（Ｋａｋｅｒ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８９，２８９−２９５（１９９２））、ヒスタミン・レセプターＨ２（Ｒｕａｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１６５８−１６７２（１９９２））、神経ペプチドＹレセプターＹ１（Ｌａｒｈａｍｍａｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１０９３５−１０９３８（１９９２））、インターロイキン８・レセプターＩＬ８ＲＡ（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６３，１２７８−１２８０（１９９１））、ドーパミン・レセプターＤ１（Ｍａｈａｎ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，２１９６−２２００（１９９０））、代謝型グルタミン酸レセプターｍＧｌｕＲ１（Ｍａｓｕ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４９，７６０−７６５（１９９１））、ソマトスタチン・レセプターＳＳ１（Ｙａｍａｄａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，２５１−２５５）などが報告されている（参考文献：Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．ａｎｄ Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ，Ｓ．，Ｔｈｅ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））。また、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を標的とした医薬品としては、塩酸テラゾシン（血圧降下剤、α１アドレノセプター・アンタゴニスト）、アテノロール（不整脈用剤、β１アドレノセプター・アンタゴニスト）、塩酸ジサイクロミン（鎮痙剤、アセチルコリン・レセプター・アンタゴニスト）、塩酸ラニチジン（消化性潰瘍治療剤、ヒスタミン・レセプターＨ２・アンタゴニスト）、塩酸トラゾドン（抗うつ剤、セロトニン・レセプター５−ＨＴ１Ｂ・アンタゴニスト）、塩酸ブプレノルフィン（鎮痛剤、オピオイド・レセプターκ・アゴニスト）などが開発されている（参考文献：Ｓｔａｄｅｌ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１８，４３０−４３７（１９９７）；医薬品要覧第５版、薬業時報社）。
発明の開示
本発明は、新規なＧタンパク質共役型のレセプタータンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の製造方法、および該タンパク質ならびにＤＮＡの用途を提供することを課題とする。
本発明者らは上記の課題を解決するために、鋭意研究を行った。まず、本発明者らは新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質（ＧＰＣＲ）候補遺伝子の探索を目的に、既知のＧＰＣＲアミノ酸配列約４００個について、ＧｅｎＢａｎｋのｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｐｕｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｉｓｉｏｎに対する類似性検索を行った。検索の結果得られた、既知ＧＰＣＲと類似性を示した配列をリストアップし、これらの塩基配列の既知ＧＰＣＲデータベースに対する類似性検索を行った。これら塩基配列が既知ＧＰＣＲと同一か否か、および同一でない場合にどの程度類似性があるかを確認し、新規ＧＰＣＲ候補配列を得た。その候補の一つとしてＡＣ０２１０１６を見出し、該新規ＧＰＣＲ候補遺伝子をヒト「ＢＧ３７」と命名した。
次に本発明者らは、このＡＣ０２１０１６の断片４１４ｂｐを増幅し、３’−ＲＡＣＥ法を行うことにより、該断片のＣ末端の遺伝子情報を取得した。この新たに得られた塩基配列と既に得られているヒト「ＢＧ３７」の断片を組み合わせ、ＧｅｎＢａｎｋのｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｉｓｉｏｎに対する類似性検索を行った。その結果、既に得られた塩基配列と同一の配列ＡＣ０５５８８４を見出した。このＡＣ０５５８８４はＡＣ０２１０１６と１塩基のギャップ以外は全て同一の配列であった。ＡＣ０５５８８４およびＡＣ０２１０１６からの塩基配列情報により、ヒト「ＢＧ３７」の開始コドンが見出され、ヒト「ＢＧ３７」のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が９９３ｂｐであることが推定された。
次いで本発明者らは、ヒト「ＢＧ３７」のＯＲＦを含むｃＤＮＡのクローニングを行い、塩基配列を決定した。その結果、ヒト「ＢＧ３７」遺伝子によりコードされるタンパク質の推定アミノ酸配列は３３０アミノ酸残基からなることが判明し、モチーフ解析から、該タンパク質は７回膜貫通型の受容体であることが推定された。
さらに本発明者らは、ヒト組織由来のＲＮＡを用いたノーザンハイブリダイゼーションにより、これらの遺伝子の発現を解析したところ、ヒト「ＢＧ３７」は、心臓、骨格筋、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球において発現が見られた。このようにさまざまな組織において、発現がみられたことから、ヒト「ＢＧ３７」は、ヒトにとって重要な機能を有する遺伝子であることが示唆された。
続いて本発明者らは、ヒト「ＢＧ３７」遺伝子によってコードされる受容体蛋白質のリガンドの探索を行った。まず、ヒト「ＢＧ３７」蛋白質を強く発現する細胞を作製し、該細胞に被検化合物を作用させ、細胞内のｃＡＭＰの量の測定を行った。その結果、プロゲステロン、デヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロン、５α−ジヒドロテストステロン等を含む生体内ステロイドホルモンにおいて、濃度依存的に細胞内ｃＡＭＰ量の増加が確認された。このことからプロゲステロン等を含むステロイドホルモンが、「ＢＧ３７」受容体蛋白質を介して、細胞内ｃＡＭＰを特異的に上昇させることが判明した。
また、本発明者らは、マウス「ＢＧ３７」遺伝子の単離に成功した。該遺伝子のＯＲＦは、９９０ｂｐであり、３２９アミノ酸からなる蛋白質をコードすることが推定された。このマウス「ＢＧ３７」はヒト「ＢＧ３７」に対して、塩基配列で８３％、アミノ酸配列では８４％の相同性が確認された。そしてマウス「ＢＧ３７」の発現解析の結果、心臓、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、および７、１１、１５、１７日目のマウス胎児において発現していることが確認された。
さらに、本発明者らは、ラット「ＢＧ３７」遺伝子の単離に成功した。該遺伝子のＯＲＦは、９９０ｂｐであり、３２９アミノ酸からなる蛋白質をコードすることが推定された。このラット「ＢＧ３７」はヒト「ＢＧ３７」に対して、塩基配列で８４％、アミノ酸配列では８２％の相同性が確認された。そしてラット「ＢＧ３７」の発現解析の結果、肺、肝臓、および腎臓において発現していることが確認された。
上記の如く本発明者らは、Ｇタンパク質レセプタータンパク質をコードすると考えられる新規遺伝子「ＢＧ３７」を見出し、本発明を完成させた。本発明の「ＢＧ３７」タンパク質は、例えば、その結合活性を指標として、そのリガンドのスクリーニング、およびリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニング、さらには「ＢＧ３７」タンパク質からのシグナル伝達を調節しうる医薬品候補化合物のスクリーニングに好適に用いることができる。
従って、本発明は新規なＧタンパク質共役型のレセプタータンパク質、これらタンパク質をコードするＤＮＡ、およびこれらタンパク質を利用したリガンドおよび医薬品候補化合物のスクリーニングに関し、より具体的には、
〔１〕 下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のグアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２、２０または３８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１、１９または３７に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：２、２０または３８に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：１、１９または３７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
〔２〕 配列番号：２、２０または３８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、
〔３〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチド、
〔４〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡを含有することを特徴とするベクター、
〔５〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡまたは〔４〕に記載のベクターを保持する形質転換体、
〔６〕 〔５〕に記載の形質転換体を培養し、発現させたタンパク質またはペプチドを回収する工程を含む、〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法、
〔７〕 〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドに結合する抗体、
〔８〕 配列番号：１、１９または３７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するポリヌクレオチド、
〔９〕 〔３〕に記載のタンパク質に結合するリガンドまたはそのアナログのスクリーニング方法であって、
（ａ）〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドに被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質またはペプチドに結合する化合物を選択する工程、を含む方法、
〔１０〕 〔３〕に記載のタンパク質とそのリガンドまたは該リガンドのアナログとの結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検化合物の存在下で〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドにリガンドまたはそのアナログを接触させ、該タンパク質またはペプチドとリガンドまたはそのアナログとの結合活性を検出する工程、
（ｂ）被検化合物非存在下での結合活性と比較して、工程（ａ）で検出された結合活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法、
〔１１〕 〔３〕に記載のタンパク質の活性を阻害または促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物の存在下で該タンパク質を発現する細胞に該タンパク質のリガンドまたはそのアナログを接触させる工程、
（ｂ）該リガンドまたはそのアナログの該タンパク質への結合による細胞における変化を検出する工程、
（ｃ）被検化合物非存在下での細胞における変化と比較して、工程（ｂ）で検出された細胞における変化を抑制または増強させる化合物を選択する工程、を含む方法、
〔１２〕 リガンドがステロイド骨格を有する生体内物質である〔１０〕または〔１１〕に記載のスクリーニング方法、
〔１３〕 ステロイド骨格を有する生体内物質が、プロゲステロン、デヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロン、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、および５α−ジヒドロテストステロンからなる群より選択される〔１２〕に記載のスクリーニング方法、
〔１４〕 〔３〕に記載のタンパク質またはペプチドを含有することを特徴とする、〔９〕から〔１３〕のいずれかに記載のスクリーニングのためのキット、
〔１５〕 〔９〕から〔１３〕のいずれかに記載のスクリーニングにより単離される化合物、
〔１６〕 〔１５〕に記載の化合物を有効成分とする医薬組成物、を提供するものである。
なお、本発明において「Ｇタンパク質共役型のレセプタータンパク質」とは、Ｇタンパク質の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行っているレセプタータンパク質を指す。また、本発明において「リガンド」とは、Ｇタンパク質共役型のレセプタータンパク質に結合して、シグナル伝達を誘導する能力を有する天然の化合物を指す。また、本発明において「アゴニスト」とは、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のリガンドと同様の生理活性を有する化合物を指し、天然の化合物および人工的に合成された化合物の双方が含まれる。また、本発明において「アンタゴニスト」とは、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のリガンドの生理活性を抑制する能力を有する化合物を指し、天然の化合物および人工的に合成された化合物の双方が含まれる。また、本発明における「タンパク質」および「ペプチド」にはその塩も含まれる。
本発明は、新規なＧタンパク質共役型のレセプタータンパク質（ＧＰＣＲ）に関する。本発明者らにより単離されたヒト由来のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質「ＢＧ３７」（ヒト「ＢＧ３７」）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ｃＤＮＡによりコードされる「ＢＧ３７」タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、マウス由来のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質「ＢＧ３７」（マウス「ＢＧ３７」）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１９に、該ｃＤＮＡによりコードされる「ＢＧ３７」タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２０に示す。さらに、ラット由来のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質「ＢＧ３７」（ラット「ＢＧ３７」）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：３７に、該ｃＤＮＡによりコードされる「ＢＧ３７」タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３８に示す。なお本明細書において「ＢＧ３７」とは、特に断りがない限り、ヒト「ＢＧ３７」、マウス「ＢＧ３７」およびラット「ＢＧ３７」の全てを指す。
本発明のヒト、マウス、およびラット「ＢＧ３７」タンパク質はそれぞれ３３０アミノ酸残基、３２９アミノ酸残基、３２９アミノ酸残基数のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する。親水性プロット解析の結果、ヒト「ＢＧ３７」タンパク質はＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に特徴的な７つの疎水性ドメインを有していた（図１）。従って、「ＢＧ３７」タンパク質は７回膜貫通型の受容体であることが推定された。また、ヒト組織においてヒト「ＢＧ３７」タンパク質によりコードされるレセプターｍＲＮＡの発現は、心臓、骨格筋、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、末梢血白血球においてシグナルが検出された。マウス組織においてマウス「ＢＧ３７」タンパク質の発現は、心臓、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、および、７、１１、１５、１７日目の胎児において発現が確認された。ラット組織においてラット「ＢＧ３７」タンパク質の発現は、肺、肝臓、および腎臓において発現が確認された。さらにヒト「ＢＧ３７」のリガンドが、生体内のプロゲステロン、デヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロン、５α−ジヒドロテストステロン等を含む生体内ステロイドホルモンであることが判明した。
これらの事実は、「ＢＧ３７」タンパク質が、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ファミリーに属し、かつヒト、マウス、およびラットにとって重要なタンパク質であることを示している。そして、「ＢＧ３７」タンパク質がＧタンパク質共役型レセプタータンパク質であることは、そのリガンドの作用によりＧタンパク質の活性化を通じてシグナル伝達を行っていることを示唆している。
本発明のタンパク質は、医薬品として有用なリガンドのスクリーニングや、該リガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニングに利用することが可能である。
本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドとしては、ステロイド骨格を有する生体内物質を好適に用いることができる。このような生体内物質としては、本発明者らによって同定されたプロゲステロン、デヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロン、５α−ジヒドロテストステロン等を含む生体内ステロイドホルモンを挙げることができる。また、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、およびウルソデオキシコール酸などの胆汁酸を挙げることができる。これら胆汁酸は、グリシン包合体やタウリン包合体などの包合体の形態であってもよい。また、潜在的リガンドとしては、ＰＴＨ（上皮小体ホルモン）、カルシトニン、ＣＧＲＰ（カルシトニン遺伝子関連タンパク質）、グルカゴン、セクレチン、アドレノメジュリン、セロトニン、アドレナリンおよびノルアドレナリン、ガラニン、ソマトスタチン、ケモカイン、およびヒスタミン等を例示できるが、本発明のリガンドはこれらに限定されない。
本発明のタンパク質を介するシグナル伝達の異常は、種々の疾患の原因となり得ると考えられる。従って、本発明のＧタンパク質共役型レセプターを活性化する化合物や、該Ｇタンパク質共役型レセプターの機能を抑制できる化合物は、医薬品としての応用が期待される。本発明のＧタンパク質共役型レセプターを活性化、または抑制する化合物を疾患の治療や予防目的に用いる場合に対象となる疾患としては、例えば、以下の疾患を挙げることができる。
・心疾患： 不整脈、心不全、心筋症、心臓弁疾患、心臓腫瘍、心内膜炎、心膜疾患、低血圧、低血圧性ショック、高血圧、アテローム動脈硬化、冠状動脈疾患、末梢動脈疾患等。
・肺疾患： 急性呼吸促迫症候群、肺塞栓症、気管支炎、閉塞性気道疾患、アレルギー性肺疾患、浸潤性肺疾患、肺炎、肺腫瘍、嚢胞性繊維症、胸膜疾患、肺癌等。
・筋肉疾患： 痙性斜頸、繊維筋痛症候群、滑液包炎等。
・脾臓疾患： 脾腫等。
・腸疾患： 炎症性腸疾患等。
・肝臓疾患： 脂肪肝、肝硬変、肝炎、肝臓血液障害（静脈閉塞性疾患、バッド−キアリ症候群、門脈血栓症など）、肝腫瘍、胆石症、総胆管結石症、胆嚢炎、胆管腫瘍等。
・腎臓疾患： 腎不全、腎炎、腎梗塞、アテローム塞栓性腎疾患、皮質壊死、悪性腎硬化、腎静脈血栓症等。
・血液疾患： エーレルス−ダンロー症候群、ランデュ・オースラー・ウェーバー病、アレルギー性紫斑病、血小板減少症、突発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血尿毒性症候群、血小板機能不全、白血球疾患、白血病、リンパ腫、形質細胞疾患、骨髄増殖性疾患等。
本発明はまた、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を提供する。このようなタンパク質は、当業者に公知のアミノ酸を改変する方法、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２（１９８７））、ダブルプライマー法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３２９−３５０（１９８７））、カセット変異法（Ｗｅｌｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３４，３１５−２３（１９８５））、メガプライマー法（Ｓａｒｋａｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８，４０４−４０７（１９９０））などを利用して調製することが可能である。即ち、当業者であれば、公知の方法を用いて天然型のヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質（配列番号：２、２０または３８）中のアミノ酸の置換などの修飾を行い、天然型のタンパク質と同等の機能または活性（グアノシン三リン酸結合タンパク質の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行う機能）を有する改変タンパク質を調製することが可能である。また、タンパク質のアミノ酸の変異は天然においても生じうる。このようにアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入などにより天然型のタンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、天然型のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質も本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に含まれる。機能的に同等なタンパク質におけるアミノ酸の変異数は、通常、全アミノ酸の１０％以内、好ましくは１０アミノ酸以内、さらに好ましくは３アミノ酸以内（例えば、１アミノ酸）であると考えられるが、その機能が保持される限り、特に制限はない。
ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、また、当業者に公知のハイブリダイゼーション技術（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ａｎｄ Ｍｅｓｅｌｓｏｎ，Ｍ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，３３３−３４２（１９８３）、Ｂｅｎｔｏｎ，Ｗ．Ｄ．ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６，１８０−１８２（１９７７））を利用して調製することができる。即ち、当業者であれば、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」ｃＤＮＡ配列（配列番号：１、１９または３７）、あるいはその一部を利用してハイブリダイゼーションを行い、種々の他の生物からこれと相同性の高いＤＮＡを単離し、さらに単離したＤＮＡから「ＢＧ３７」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることができる。本発明には、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」ｃＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に含まれる。
ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」ｃＤＮＡと相同性の高いＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションを「６ ｘ ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、２５度」、洗浄を「１ ｘ ＳＳＣ、５５度」で行う条件を用いることができる。より好ましい条件としては、ハイブリダイゼーションを「６ ｘ ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、３７度」、洗浄を「０．２ ｘ ＳＳＣ、５５度」で行う条件、さらに好ましい条件としては、ハイブリダイゼーションを「６ ｘ ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、３７度」、洗浄を「０．１ ｘ ＳＳＣ、６２度」で行う条件を用いることができる。なお、当業者であれば、ＳＳＣの希釈率、ホルムアミド濃度、温度などの諸条件を適宜選択することで、上記の条件と同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を実現することができる。
ハイブリダイゼーション技術を利用して機能的に同等なタンパク質を単離する他の生物としては、例えば、ウサギ、ウシ、イヌ、サルなどが挙げられるが、これらに制限されない。
ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、通常、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：１、１９または３７）と高い相同性を有する。高い相同性とは、塩基レベルで少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＡｌｔｓｃｈｕｌらによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，３３８９−３４０２（１９９７））によって決定することができる。パラメータは例えば、Ｅ ｖａｌｕｅ＝０．０１とし、その他はデフォルト値を用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
同様に、ポリメラーゼ連鎖反応などの遺伝子増幅技術を利用して、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することも可能である。
本発明のタンパク質は、天然のタンパク質の他、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えば、ヒト、マウス、またはラット「ＢＧ３７」タンパク質が発現していると考えられる心臓組織の抽出液に対し、後述する「ＢＧ３７」抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行う方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、後述するように本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。
また、本発明は、上記本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の部分ペプチドを包含する。本発明の部分ペプチドとしては、例えば、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のＮ末端領域の部分ペプチドが挙げられ、該ペプチドは抗体の調製に利用することができる。該ペプチドは、後述する医薬品候補化合物のスクリーニングに利用することができる。このような本発明の部分ポリペプチドは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、さらに好ましくは２０アミノ酸以上の鎖長を有するポリペプチドである。
また、本発明は、上記本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡに関する。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、これらタンパク質や部分ペプチドをコードしうるものであれば特に制限はなく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡは、例えば、配列番号：１、１９または３７に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質が発現している組織由来のｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、適当な組織由来のｃＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号：１、１９または３７に記載のｃＤＮＡあるいはその断片、それらに相補的なＲＮＡ、または該ｃＤＮＡの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを３２Ｐなどで標識し、ゲノムＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらｃＤＮＡの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、ゲノムＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。一方、合成ＤＮＡは、例えば、配列番号：１、１９または３７に記載のｃＤＮＡの部分配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、アニーリングさせて二本鎖にし、ＤＮＡリガーゼで結合させることにより調製することができる（Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，５６５−５７０（１９７６）；Ｇｏｅｄｄｅｌ Ｄ．Ｖ．ｅｔ ａｌ，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，１０６−１１０（１９７９））。
これらＤＮＡは、組換えタンパク質の生産に有用である。即ち、上記本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１、１９または３７に記載のＤＮＡ）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製することにより本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を組換えタンパク質として調製することが可能である。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質はレセプタータンパク質であるため、細胞膜に発現させて調製することが可能である。
具体的には、宿主が大腸菌エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合、プラスミドベクターｐＥＴ−３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５６，１２５−３５（１９８７））、ｐＧＥＸ−１（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｇｅｎｅ ６７，３１−４０（１９８８））などが用いられる。大腸菌の形質転換は、Ｈａｎａｈａｎ法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０（１９８３））、電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，６１２７−６１４５（１９８８））などで行う。宿主が分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の場合には、プラスミドベクターｐＥＳＰ−１（Ｌｕ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２００，１３５−１４４（１９９７））などが用いられる。酵母の形質転換は、例えば、スフェロプラスト法（Ｂｅａｃｈ，Ｄ．ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ，Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９０，１４０（１９８１））、酢酸リチウム法（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，６４８５−６４８９（１９９０））などにより行われる。
一方、宿主がほ乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ、ヒトＨｅＬａ細胞などの場合、ｐＭＳＧ（クロンテク社）などのベクターが用いられる。ほ乳動物細胞への組換えＤＮＡの導入は、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒＥｂ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４１−１６４３（１９８４））、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，７４１３−７４１７（１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１，８４１−８４５（１９８２））などで行われる。宿主が昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスベクターｐＢａｃＰＡＫ８／９（クロンテク社）などが用いられる。昆虫細胞の形質転換は、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８０））などに記載の方法に従って行うことができる。
宿主細胞において発現させた組換えタンパク質は、公知の方法により精製することができる。また、例えば、Ｎ末端にヒスチジン残基のタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを結合した融合タンパク質の形で合成し、金属キレート樹脂、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることにより精製することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，７２１１−７２１５（１９８８））。例えば、ベクターとしてｐＥＳＰ−１を用いた場合、目的のタンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として合成されるため、ＧＳＴ親和性レジンに結合させることより組換えタンパク質を精製できる。融合タンパク質から目的タンパク質を分離するには、例えば、トロンビン、血液凝固因子Ｘａなどで切断する。
本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡは、その変異に起因する疾患の遺伝子治療に応用することも考えられる。遺伝子治療に用いる場合には、ヒト細胞への遺伝子導入には、レトロウイルスベクター（Ｄａｎｏｓ，Ｏ．ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，６４６０−６４６４（１９８８）；Ｄｒａｎｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，３５３９−３５４３（１９９３））、アデノウイルスベクター（Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７３，３０９−３１９（１９９３））などを用いる方法が用いられている。患者への投与法としては、骨髄移植、皮下注射、静脈注射などが用いられる（Ａｓａｎｏ，Ｓ．，蛋白質核酸酵素，４０，２４９１−２４９５（１９９５））。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に結合する抗体に関する。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法（例えば、「新生化学実験講座１，タンパク質Ｉ，３８９−４０６，東京化学同人」参照）により調製することが可能である。ポリクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの免疫動物に適量の上記タンパク質またはペプチドを投与する。投与は、抗体産生を促進するアジュバント（ＦＩＡやＦＣＡ）と共に行ってもよい。投与は、通常、数週間ごとに行う。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体を調製することができる。一方、モノクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを、上記と同様に免疫動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。これにより調製された抗体は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のアフィニティー精製のために用いられる他、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現異常に起因する疾患の検査や抗体治療、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現量の検出などに利用することが可能である。
抗体治療に用いる場合、ヒト型抗体もしくはヒト抗体であることが好ましい。ヒト型抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのＨ鎖定常部をヒトＩｇＥ Ｈ鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌに導入することにより調製できる（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４，２６８−２７０（１９８５））。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスに本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を免疫することにより調製することが可能である。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドまたはそのアナログのスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法においては、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドに被検化合物を接触させ、これらタンパク質もしくはペプチドに結合する化合物を選択する工程を含む。被検化合物としては、例えば、アセチルコリン、アデノシン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンジオテンシン、ボムベシン、ブラジキニン、Ｃ５ａアナフィラトキシン、カルシトニン、カナビノイド、ケモカイン、コレシストキニン、ドーパミン、エンドセリン、フォルミルメチオニルペプチド、ＧＡＢＡ、ガラニン、グルカゴン、グルタミン酸、グリコペプチドホルモン、ヒスタミン、５−ヒドロキシトリプトファン、ロイコトリエン、メラノコルチン、神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、オドラント、オピオイドペプチド、オプシン、パラサイロイドホルモン、血小板活性化因子、プロスタノイド、ソマトスタチン、タキキニン、トロンビン、サイロトロピン放出ホルモン、バソプレシン、オキシトシン（Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．ａｎｄ Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ，Ｓ．，Ｔｈｅ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））などの公知の化合物またはそのアナログ、その他の精製タンパク質、遺伝子（ライブラリーも含む）の発現産物、リガンドが存在していることが予想される組織もしくは細胞の抽出液、細胞培養上清などが用いられる。スクリーニングに用いる本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質は、例えば、所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）内または細胞表面に発現した形態、該細胞の細胞膜画分としての形態、アフィニティーカラムに結合した形態であってもよい。スクリーニングに用いる被検化合物は、必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質と被検化合物との結合は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に結合した化合物に付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度により検出する）のほか、被検化合物の細胞表面上の本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質への結合による細胞内へのシグナル伝達（例えば、Ｇタンパク質の活性化、Ｃａ２＋またはｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化）を指標に検出することもできる。具体的な方法については、例えば、文献（Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １４，６６３−６７１（１９９３）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２６，３４９−３５４（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，５９５７−５９６４（１９９３）、Ｃｅｌｌ ９２，５７３−５８５（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ ３９３，２７２−２７３（１９９８））や公報（特開平９−２６８号公報）の記載に準じて行うことができる。その他、ＴＷＯハイブリッドシステム（Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７２，２２３−２３２（１９９４）、Ｆｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７６，５３０−５３３（１９９５））を利用したレポーター遺伝子の活性の検出によっても結合を検出することができる。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質とそのリガンドまたはリガンドのアナログとの結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、（ａ）被検化合物の存在下で本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドにリガンドまたはそのアナログを接触させ、該タンパク質またはその部分ペプチドとリガンドまたはそのアナログとの結合活性を検出する工程、および（ｂ）工程（ａ）で検出された結合活性を、被検化合物非存在下での結合活性と比較し、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドとリガンドまたはそのアナログとの結合活性を低下させる化合物を選択する工程を含む。
被検化合物としては、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物、組織や細胞の抽出液、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。スクリーニングに用いる本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質は、例えば、所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）内または細胞表面に発現した形態、該細胞の細胞膜画分としての形態、アフィニティーカラムに結合した形態であってもよい。スクリーニングに利用するリガンドは必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。
本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドと、リガンドまたはそのアナログとの結合活性は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質やその部分ペプチドに結合したリガンドまたはそのアナログに付された標識による検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度により検出する）のほか、被検化合物の細胞表面上の本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質への結合による細胞の変化（例えば、Ｇタンパク質の活性化、Ｃａ２＋またはｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化）を指標に検出することもできる。具体的な方法については、例えば、実施例に記載のＺｌｏｋａｒｍｉｋらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，ｖｏｌ．２７９，ｐ．８４）を利用することが可能である。また、文献（Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １４，６６３−６７１（１９９３）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２６，３４９−３５４（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，５９５７−５９６４（１９９３）、Ｃｅｌｌ ９２，５７３−５８５（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ ３９３，２７２−２７３（１９９８））や公報（特開平９−２６８号公報）の記載に準じて行うことができる。検出の結果、被検化合物の存在下における結合活性が、被検化合物の非存在下における結合活性（対照）４より低い値を示した場合には、該被検化合物は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドとリガンドまたはそのアナログとの結合を阻害する活性を有すると判定される。このような化合物は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物（アゴニスト）および該活性を有しない化合物（アンタゴニスト）などが含まれる。アゴニストは、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドと同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニストは、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドが有する生理活性を抑制する。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治療などのための医薬組成物として有用である。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を阻害または促進する化合物をスクリーニングする方法に関する。このスクリーニング方法は、（ａ）被検化合物の存在下で本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を発現する細胞に該タンパク質のリガンドまたはそのアナログを接触させる工程、（ｂ）該リガンドまたはそのアナログの該タンパク質への結合による細胞における変化を検出する工程、および（ｃ）被検化合物非存在下での細胞における変化と比較して、工程（ｂ）で検出された細胞における変化を抑制または増強させる化合物を選択する工程、を含む方法である。
被検化合物としては、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物、組織や細胞の抽出液、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。上記の結合活性の阻害を指標としたスクリーニングにより単離された化合物を被検化合物として用いることも考えられる。本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を発現する細胞は、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な動物細胞に導入することにより調製することができる。該発現ベクターには、形質転換体を選別するためのマーカー遺伝子が挿入されていてもよい。
リガンドやそのアナログが本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質へ結合することによる細胞における変化は、例えば、Ｇタンパク質の活性化、Ｃａ２＋またはｃＡＭＰの濃度変化、ホスホリパーゼＣの活性化、ｐＨの変化を指標に検出することもできる。具体的な方法については、例えば、Ｚｌｏｋａｒｍｉｋらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，ｖｏｌ．２７９，ｐ．８４）を利用することが可能である。また、文献（Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １４，６６３−６７１（１９９３）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２６，３４９−３５４（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，５９５７−５９６４（１９９３）、Ｃｅｌｌ ９２，５７３−５８５（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ ３９３，２７２−２７３（１９９８））や公報（特開平９−２６８号公報）の記載に準じて行うことができる。
この検出の結果、被検化合物非存在下においてリガンドやそのアナログを作用させた場合の細胞における変化と比較して、細胞における変化が抑制されれば、用いた被検化合物は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を阻害する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が該細胞における変化を増強させれば、該化合物は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を促進する化合物であると判定される。
本発明のスクリーニング方法により単離される化合物（本発明のタンパク質のアゴニストやアンタゴニスト）は、例えば、関節リュウマチ、変形性関節症、胃潰瘍、炎症性腸疾患、虚血性心疾患、不整脈、高及び低血圧症、肥満、喘息、疼痛、アレルギー疾患、自己免疫疾患（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ １９、１９９８，１７７−１８３、Ｓｔａｒｋ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ２１，５０７−５２０（１９９６）、Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｋ．ａｎｄ Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５，８７−１０２（１９９５））への応用が考えられる。これら化合物を薬剤として用いる場合には、単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、香料、および着色剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
また、本発明は、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを含有することを特徴とする、上記本発明のスクリーニングのためのキットに関する。本発明のキットにおける本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドは、例えば、所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）内または細胞表面に発現した形態、該細胞の細胞膜画分としての形態、アフィニティーカラムに結合した形態であってもよい。本発明のキットの他の要素としては、上記レセプタータンパク質標品以外に、例えば、リガンド標品（標識されたもの、および標識されていないもの）、リガンドとレセプタータンパク質の反応のための緩衝液、洗浄液などが含まれていてもよい。リガンドに付される標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられる。本発明のキットの利用は、公報（特開平９−２６８号公報）の記載に準じて行うことができる。また、例えば、ｃＡＭＰ量の変化の検出系や結合活性の検出系を利用したスクリーニングにおいて本発明のキットを利用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］新規ＧＰＣＲ候補遺伝子の探索
既知のＧＰＣＲアミノ酸配列約４００個の、ＧｅｎＢａｎｋのｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｉｓｉｏｎに対する類似性検索を行った。検索のアルゴリズムはｂｌａｓｔを用いた。検索の結果得られた既知のＧＰＣＲと類似性を示した配列をリストアップした。次に、これらの塩基配列について、既知ＧＰＣＲデータベースに対する類似性検索を行い、これら塩基配列が既知ＧＰＣＲと同一か否か、同一でないのであればどの程度類似性があるかを確認し、新規ＧＰＣＲ候補配列を得た。その候補の一つとして、ＡＣ０２１０１６を見出した。この新規ＧＰＣＲ候補遺伝子をヒト「ＢＧ３７」と命名した。
［実施例２］ヒトＢＧ３７ ｃＤＮＡのクローニング
既知のＧＰＣＲの塩基配列と類似性が認められたＡＣ０２１０１６の断片４１４ｂｐを増幅させるために、ＢＧ３７−０１Ｆ（５’−ＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＴＣＣＴＧＡＧＧＣ−３’／配列番号：３）、およびＢＧ３７−０２Ｒ（５’−ＡＣＴＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＧＣ−３’／配列番号：４）の２つのプライマーを合成しプライマーとして用いて、ヒトゲノム遺伝子（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）からＰＣＲにより目的の断片を増幅した。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄのプロトコールに従い、９５度９分の後、９４度３０秒、５５度１５秒、７２度１分を３９サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。次いで、増幅産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした。ダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳ（ＰＥバイオシステムズ社）でダイオキシシーケンシング反応を行い、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＰＥバイオシステムズ社）で電気泳動して塩基配列を決定した。
このヒトＢＧ３７断片のＣ末側の遺伝子情報を得るために３’−Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（３’−ＲＡＣＥ）法をＣｌｏｎｔｅｃｈ社の方法に従って行った。プライマーＢＧ３７−１０Ｆ（５’−ＣＧＴＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＣ−３’／配列番号：５）を合成し、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｆｅｔｕｓ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ＰＣＲにより断片約５００ｂｐを増幅した。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、６８度３分を３５サイクル、最後に９４度３０秒、６２度８分を行った。次いで、この増幅産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした。ダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）でダイオキシシーケンシング反応を行い、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）で電気泳動して塩基配列を決定した。
３’−ＲＡＣＥにより新たに得られた塩基配列と既に得られていたヒトＢＧ３７の断片配列を組み合わせ、ＧｅｎＢａｎｋのｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｉｓｉｏｎに対する類似性検索を行った。検索のアルゴリズムはｂｌａｓｔを用いた。検索の結果、ＡＣ０５５８８４において今まで得られた塩基配列と同一の塩基配列を見出し、ＡＣ０２１０１６において１塩基のギャップ以外は全て同一の塩基配列を見出した。ＡＣ０５５８８４およびＡＣ０２１０１６からの塩基配列情報により、ヒトＢＧ３７の開始コドンを見出し、ヒトＢＧ３７のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が９９３ｂｐであることが予測された。
ヒトＢＧ３７のＯＲＦを含むｃＤＮＡをクローニングするために、プライマーＢＧ３７−１２Ｆ（５’−ＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧ−３’／配列番号：６）とＢＧ３７−１５Ｒ（５’−ＴＴＡＧＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＣＡＣＴＧＣＴＴＴ−３’／配列番号：７）を合成し、ヒトゲノム遺伝子（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）からＢＧ３７−１２Ｆ、およびＢＧ３７−１５Ｒをプライマーとして用いて、ＰＣＲにより目的の断片を増幅した。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、６８度３分を２６サイクル、最後に９４度３０秒、６２度８分を行った。次いで、増幅産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした（ｐＣＲ２．１−ＢＧ３７ＯＲＦ）。ダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳ（ＰＥバイオシステムズ社）でダイオキシシーケンシング反応を行い、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＰＥバイオシステムズ社）で電気泳動して塩基配列を決定した。アミノ酸配列の推定には、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（ＤＮＡスター社）を用いた。
その結果、タンパク質の推定アミノ酸配列は３３０残基から成ることを見出し、かつ７回膜貫通型の受容体であることが推定された。
なお、ＢＧ３７ ｃＤＮＡをクローニングした大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ｈＢＧ３７−２）を下記の通り寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）：平成１２年１１月２日
（ハ）寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−７７３９
［実験例３］ヒトＢＧ３７の発現解析
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ（ｈｕｍａｎ １２−ｌａｎｅ ＭＴＮ Ｂｌｏｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ヒトＢＧ３７のノーザンハイブリダイゼーションを行った。プライマーＢＧ３７−１２ＦとＢＧ３７−１５Ｒを用いて、ｐＣＲ２．１−ＢＧ３７ＯＲＦを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した断片、即ちヒトＢＧ３７のＯＲＦをＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製した後にノーザンハイブリダイゼーションのプローブとして使用した。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、６８度３分を２６サイクル、最後に９４度３０秒、６２度８分を行った。プローブはＢｃａＢＥＳＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）と［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いてラベル化されたものを使用した。ハイブリダイゼーションバッファーにはＲａｐｉｄ Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用し、ＭＴＮ Ｂｌｏｔを１時間Ｒａｐｉｄ Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒにプレハイブリダイゼーションした後、ラベル化されたプローブを加えて、２時間のハイブリダイゼーションを行った。非特異的なプローブの結合を除去するために、２ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで２回室温で洗浄後、０．１ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで２０分２回６５度で洗浄した。その後、イメージングプレート（富士フィルム社）に一晩感光させ、ＢＡＳ２０００（富士フィルム社）にて解析した。
ノーザンハイブリダイゼーションの結果を図２に示す。ヒトＢＧ３７のｍＲＮＡは心臓、骨格筋、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、末梢血白血球において約１．５ｋｂの長さで発現が見られた。脳、結腸、胸腺については、発現は確認できなかった。
［実施例４］ヒトＢＧ３７発現細胞（ｈｕｍａｎ ＢＧ３７ ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）の作製
ヒトＢＧ３７発現ベクターは、ｐＩＲＥＳｎｅｏおよびｐＩＲＥＳｈｙｇ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を利用して作製した。ヒトＢＧ３７遺伝子をクローン化しやすいように、ｐＩＲＥＳｎｅｏのネオマイシン耐性遺伝子を、ｐＩＲＥＳｈｙｇのハイグロマイシン耐性遺伝子と置換したプラスミド（ｐＫＴ５２）を作製した。ｐＣＲ２．１−ＢＧ３７ＯＲＦからＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶサイトを用いて切り出されたヒトＢＧ３７遺伝子を、同じくＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶサイトで消化切断されたｐＫＴ５２ベクターにサブクローニングし、発現ベクターとした（ｐＫＴ５２−ｈＢＧ３７−２）。
ＨＥＫ２９３細胞は、１０％牛胎児血清、ネオマイシンを含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）混合培地（旭テクノグラス社）を用い、３７度、５％ＣＯ２存在下で培養した。
遺伝子導入には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いた。トランスフェクション前日に１ｘ１０６の細胞を６ｃｍ ｄｉｓｈ（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏａｔｅｄ）（旭テクノグラス社）にまき、１２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔと８μｌのｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、２μｇのｐＫＴ５２−ｈＢＧ３７−２を添付のマニュアルに従い、トランスフェクションし、３７度、５％ＣＯ２存在下で４８時間培養した。
目的の遺伝子が導入された単一の細胞を単離する為に、トランスフェクションした細胞をトリプシンで処理後、遠心操作により回収し、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）混合培地（旭テクノグラス社）に再懸濁し、ハイグロマイシンを含む選択培地にてさらに３７度、５％ＣＯ２存在下、１１日間培養した。単一のコロニーからなる細胞を選び、順次継代培養しｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅを作製した。
この様にして作製したヒトＢＧ３７発現細胞からトータルＲＮＡを調製し、ノーザンハイブリダイゼイション法を用いて導入されたヒトＢＧ３７の発現量を調べ、強く発現している細胞（ＨＥＫ／ｈＢＧ３７）を選択して以下の実験に用いた。
［実施例５］細胞内ｃＡＭＰ量の測定（ＥＬＩＳＡ法）
細胞内ｃＡＭＰ量の測定は、Ｚｌｏｋａｒｍｉｋらの方法を用いた（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，ｖｏｌ．２７９，ｐ．８４）。７回膜貫通型レセプターにおける結合Ｇタンパク質を介した細胞内ｃＡＭＰ量の増加を測定するため、リガンドが作用した際の細胞内ｃＡＭＰ量を測定した。
細胞内ｃＡＭＰ量の測定の前日に、ポリ−Ｄ−リジンコートされた９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に４ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように蒔き直し、さらに３７度、２４時間インキュベーションした。ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅは、最終濃度０．１％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）及び最終濃度１ｍＭ ３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−Ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）（ナカライテスク社）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ溶液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−ＢＳＡ−ＩＢＭＸ溶液）で２回リンスした後、３７度で２０分インキュベーションした。上清をのぞいた後、各濃度のプロゲステロンなどのステロイドホルモンを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ−ＢＳＡ−ＩＢＭＸ溶液を添加し、３７度で１５分インキュベーションした後、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで細胞を溶解し細胞内ｃＡＭＰ量の測定を行った。
細胞内ｃＡＭＰ量の測定には、ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ（ＥＩＡ）ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム ファルマシア バイオテク社）を用い、添付のマニュアルに従って行った。
その結果、ヒトＢＧ３７を発現した細胞（ＨＥＫ／ｈＢＧ３７）では、プロゲステロンやデヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロンなどを含むステロイドホルモンに濃度依存的に細胞内ｃＡＭＰ量の増加が確認された。代表的な例として、プロゲステロンによる濃度依存的な細胞内ｃＡＭＰ量増加のデータを示す。また、ベクターのみを発現させたｍｏｃｋ細胞ではプロゲステロンによる濃度依存的な細胞内ｃＡＭＰ量増加は認められなかった（図３）。
このことから少なくともプロゲステロンやデヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロンなどを含むステロイドホルモンがＢＧ３７を介して細胞内ｃＡＭＰ量を特異的に上昇させることが判明した。
［実施例６］マウスＢＧ３７ ｃＤＮＡのクローニング
マウスＢＧ３７のｃＤＮＡをクローニングする目的で、ヒトＢＧ３７配列を基にした２つのプライマー、ＢＧ３７−１３Ｆ（５’−ＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＴＡＣＴＴＧＧＣＴＣＣＣ−３’／配列番号：８）とＢＧ３７−１４Ｒ（５’−ＴＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＧＴＡＧＧＧＣ−３’／配列番号：９）を利用して、マウスゲノム遺伝子（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型にして約４９０ｂｐの断片をＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄのプロトコールに従い、９５度９分の後、９４度３０秒、５２度３０秒、７２度１分を３０サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。次いで、増幅産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号：１０）。マウスＢＧ３７ｆｒａｇｍｅｎｔとヒトＢＧ３７の配列との相同性を調べたところ、８４．４％の相同性を示すことが分かり、得られた塩基配列は目的のマウスＢＧ３７の配列であることが強く示唆された。なお、塩基配列決定はダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳ（ＰＥバイオシステムズ社）でダイオキシシーケンシング反応を行い、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＰＥバイオシステムズ社）で電気泳動して行った。
このマウスＢＧ３７の断片のＣ末側の遺伝子情報を得るために３’−ＲＡＣＥ法及びｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法をＣｌｏｎｔｅｃｈ社の方法に従って行った。３’−ＲＡＣＥにはプライマーｍＢＧ３７−０４Ｆ（５’−ＣＣＣＴＣＡＡＣＣＣＴＧＧＣＴＡＧＧＧＣＴＣＴＣＡＣＣ−３’／配列番号：１１）を利用し、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｍｏｕｓｅ ｈｅａｒｔ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＰＣＲを行った。そのＰＣＲ産物を鋳型とし、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲをプライマーｍＢＧ３７−０３Ｆ（５’−ＧＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧＧＧＧ−３’／配列番号：１２）を利用して行った。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号：１３）。
同様にこのマウスＢＧ３７の断片のＮ末側の遺伝子情報を得るために５’−ＲＡＣＥ法及びｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法をＣｌｏｎｔｅｃｈ社の方法に従って行った。５’−ＲＡＣＥにはプライマーｍＢＧ３７−０９Ｒ（５’−ＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＧＣＴＡＧＣＣＧＣ−３’／配列番号：１４）を利用し、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｍｏｕｓｅ ｈｅａｒｔ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ＰＣＲを行った。そのＰＣＲ産物を鋳型とし、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲをｍＢＧ３７−０７Ｒ（５’−ＧＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＧ−３’／配列番号：１５）を利用して行った。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号：１６）。
マウスＢＧ３７のＯＲＦを含むｃＤＮＡをクローニングするために、プライマーｍＢＧ３７−１２Ｆ（５’−ＧＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＴＧＡＴＧＡＣＡＣＣＣ−３’／配列番号：１７）とｍＢＧ３７−１３Ｒ（５’−ＣＴＡＡＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＧＣＴＧＣ−３’／配列番号：１８）を合成し、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｍｏｕｓｅ ｈｅａｒｔ ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）からｍＢＧ３７−１２Ｆ、ｍＢＧ３７−１３Ｒを用いて、ＰＣＲにより目的の断片を増幅した。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、５８度３０秒、７２度２分を３５サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。次いで、ＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし（ｐＣＲ２．１−ｍＢＧ３７−９）、マウスＢＧ３７のＯＲＦの塩基配列を決定した（配列番号：１９）。
予想されるＯＲＦは９９０ｂｐ、３２９アミノ酸からなると推定され、マウスＢＧ３７のヒトＢＧ３７に対する相同性を調べたところ、ＤＮＡでは８３％、アミノ酸では８４％の相同性が確認された。
なお、マウスＢＧ３７ ｃＤＮＡをクローニングした大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ｍＢＧ３７−９）を下記の通り寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）：平成１３年２月１日
（ハ）寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−７７４０
［実験例７］マウスＢＧ３７の発現解析
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ ｐａｎｅｌ（ｍｏｕｓｅ ＭＴＣ ｐａｎｅｌ Ｉ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、マウスＢＧ３７の発現部位を調べるためにＰＣＲを行った。プライマーはｍＢＧ３７−１Ｆ（５’−ＴＴＣＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’／配列番号：２１）とｍＢＧ３７−２Ｒ（５’−ＣＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣ−３’／配列番号：２２）を用い、ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、５５度３０秒、７２度２分を４０サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で電気泳動した結果を示す（図４）。ＰＣＲ産物の長さは約４２０ｂｐであった。その結果、マウスＢＧ３７は心臓、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、７日目の胎児、１１日目の胎児、１５日目の胎児、１７日目の胎児において発現が確認でき、脳では発現を確認できなかった。
［実験例８］ラットＢＧ３７ ｃＤＮＡのクローニング
ラットＢＧ３７のｃＤＮＡをクローニングする目的で、ヒトＢＧ３７配列を基にした２つのプライマー、ＢＧ３７−１３ＦとＢＧ３７−１４Ｒを利用して、ラットゲノム遺伝子（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型にして約４９０ｂｐの断片をＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄのプロトコールに従い、９５度９分の後、９４度３０秒、５２度３０秒、７２度１分を３０サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。次いで、増幅産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号：２３）。ラットＢＧ３７フラグメントとヒトＢＧ３７の配列との相同性を調べたところ、８４．２％の相同性を示すことが分かり、得られた塩基配列は目的のラットＢＧ３７の配列であることが強く示唆された。なお、塩基配列決定はダイプライマーサイクルシーケンシングキットＦＳ（ＰＥバイオシステムズ社）でダイオキシシーケンシング反応を行い、ＤＮＡシーケンサー３７７（ＰＥバイオシステムズ社）で電気泳動して行った。
ヒトＢＧ３７ｃＤＮＡの全長をクエリーにして、ＧｅｎＢａｎｋにおいてｂｌａｓｔのアルゴリズムで類似性検索を行ったところ、ラットＥＳＴクローン（ＡＩ５４８１４１）がラットＢＧ３７のＣ末をコードしていることが分かった。このＡＩ５４８１４１に記載されている配列を基にプライマーｒＢＧ３７−１２Ｒ（５’−ＣＣＣＴＡＡＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧ−３’／配列番号：２４）を作製し、また既に得られているラットＢＧ３７断片配列からプライマーｒＢＧ３７−３Ｆ（５’−ＧＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧＧＧＧ−３’／配列番号：２５）を作製し、ラットゲノム遺伝子とラットｍａｒａｔｈｏｎ ｒｅａｄｙ ｋｉｄｎｅｙ ｃＤＮＡ（共にＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型にしてＰＣＲを行ったところ、どちらからも３１１ｂｐの断片が増幅された。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄのプロトコールに従い、９５度９分の後、９４度３０秒、５８度３０秒、７２度１分を４０サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定したところ、２つのＰＣＲ産物は同じ配列であった（配列番号：２６）。
ラットＢＧ３７の断片のＮ末側の遺伝子情報を得るために５’−ＲＡＣＥ法及びｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を行った。まず最初に、プライマーｒＢＧ３７−１０Ｒ（５’−ＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＧ−３’／配列番号：２７）とｍａｒａｔｈｏｎ ｒｅａｄｙ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて５’−ＲＡＣＥを行い、そのＰＣＲ産物を鋳型として、プライマーｒＢＧ３７−８Ｒ（５’−ＧＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＧＣＧＴＴＣＣＣＣＡＴＧＣＡＣＣ−３’／配列番号：２８）を用いてｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄのプロトコールに従い、９５度９分の後、９４度３０秒、５８度３０秒、７２度１分を３０サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号：２９）。さらに上流部分をクローニングする目的で、プライマーｒＢＧ３７−１４Ｒ（５’−ＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴＡＴＴＣＣＡＴＡＧＣＣＣ−３’／配列番号：３０）、プラスミドベクターの配列Ｍ１３ Ｒｅｖ．（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’／配列番号：３１）を利用し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）より、プラスミドＤＮＡを精製したものを鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、５０度１５秒、７２度６０秒を３９サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。そのＰＣＲ産物を鋳型とし、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲをｒＢＧ３７−１３Ｒ（５’−ＴＧＴＧＡＧＴＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＧＴＡＧＴＡＧＧＣ−３’／配列番号：３２）を利用して行った。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、塩基配列を決定した（配列番号：３３）。
ラットＢＧ３７のＯＲＦを含むｃＤＮＡをクローニングするために、プライマーｒＢＧ３７−１６Ｆ（５’−ＧＧＡＴＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＣＴＧ−３’／配列番号：３４）とｒＢＧ３７−１１Ｒ（５’−ＧＧＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧＡＧＣ−３’／配列番号：３５）を用いて、ラット視床および視床下部由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲにより目的の断片を増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし（ｐＣＲ２．１−ｒＢＧ３７−Ｇ０７０３）、ラットＢＧ３７のＯＲＦの塩基配列を決定した（配列番号：３６）。
予想されるＯＲＦは９９０ｂｐ（配列番号：３７）、３２９アミノ酸（配列番号：３８）からなると推定され、ラットＢＧ３７のヒトＢＧ３７に対する相同性を調べたところ、ＤＮＡでは８４％、アミノ酸では８２％の相同性が確認された。
なお、ラットＢＧ３７ ｃＤＮＡをクローニングした大腸菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ｒＢＧ３７−Ｇ０７０３）を下記の通り寄託した。
（イ）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ロ）寄託日（原寄託日）：平成１３年２月２０日
（ハ）寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−７７４１
［実験例９］ラットＢＧ３７の発現解析
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ ｐａｎｅｌ（ｒａｔ ＭＴＣ ｐａｎｅｌ Ｉ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ラットＢＧ３７の発現部位を調べるためにＰＣＲを行った。プライマーはｒＢＧ３７−３ＦとｒＢＧ３７−１２Ｒを用い、ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄを用いて、９４度９分の後、９４度３０秒、５０度１５秒、７２度１分を４０サイクル、最後に９４度３０秒、６２度１０分を行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で電気泳動した結果を示す（図５）。ＰＣＲ産物の長さは３１２ｂｐであった。その結果、ラットＢＧ３７は肺、肝臓、腎臓において発現が確認でき、心臓、脳、脾臓、骨格筋、精巣では発現を確認できなかった。
［実施例１０］胆汁酸による細胞内ｃＡＭＰ量増加反応
細胞内ｃＡＭＰ量の測定は、Ｚｌｏｋａｒｍｉｋらの方法を用いた（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，ｖｏｌ．２７９，ｐ．８４）。７回膜貫通型レセプターにおける結合Ｇタンパク質を介した細胞内ｃＡＭＰ量の増加を測定するため、リガンドが作用した際の細胞内ｃＡＭＰ量を測定した。
細胞内ｃＡＭＰ量の測定の前日に、ポリ−Ｄ−リジンコートされた９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ ｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に４ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように蒔き直し、さらに３７度、２４時間インキュベーションした。ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅは、最終濃度１ｍＭ ３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−Ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）（ナカライテスク社）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ溶液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−ＩＢＭＸ溶液）で２回リンスした後、３７度で２０分インキュベーションした。上清をのぞいた後、各濃度の試薬を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ−ＩＢＭＸ溶液を添加し、３７度で２０分インキュベーションした後、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００で細胞を溶解し細胞内ｃＡＭＰ量の測定を行った。
細胞内ｃＡＭＰ量の測定には、ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｋｉｔ（ＨＴＲＦ）（日本シェーリング社）を用い、添付のマニュアルに従って行った。
プロゲステロンなどのステロイドホルモンと同様にステロイド骨格を保持する胆汁酸がＢＧ３７を活性化させるかどうかを調べたところ、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸やそれぞれのグリシン包合体、タウリン包合体などがヒトＢＧ３７が発現した細胞において細胞内ｃＡＭＰ量を上昇させた。上記の化合物はベクターのみを発現させたｍｏｃｋ細胞では細胞内ｃＡＭＰ量を上昇させなかった。このことから、コール酸などの胆汁酸もＢＧ３７を介して細胞内ｃＡＭＰ量を特異的に上昇させることが判明した。図６に示すデータは化合物の濃度が１０μＭの時のＨＥＫ／ｈＢＧ３７細胞における細胞内ｃＡＭＰ量を示している。
産業上の利用の可能性
本発明により、複数の組織で発現する新規なＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、および該タンパク質をコードする遺伝子が提供された。これにより、該レセプタータンパク質を利用したリガンドや医薬品の候補化合物のスクリーニングが可能となった。これらリガンドや医薬品の候補化合物は、例えば、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を介したシグナル伝達系の異常等に起因する疾患の診断や治療等への利用が期待される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト「ＢＧ３７」タンパク質の親水性プロットを示す図である。図上の番号は、ヒト「ＢＧ３７」タンパク質のアミノ酸の番号を示す。７つの疎水性領域をＩ〜ＶＩＩで示す。
図２は、上の図は、ノーザンブロットハイブリダイゼーション法により各種組織におけるヒト「ＢＧ３７」の発現を検出した結果を示す写真である。下の図はノーザンプロットハイブリダイゼーション法により各種組織におけるベータアクチンの発現を検出した結果を示す写真である。図中のレーン１から１２はそれぞれ、脳、心臓、骨格筋、大腸（粘膜を除く）、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、末梢血白血球を示す。
図３は、プロゲステロン添加による細胞内ｃＡＭＰの増加の結果を示すグラフである。左はＨＥＫ／ｈＢＧ３７細胞、右はベクターのみを発現させたｍｏｃｋ細胞（対照細胞）を表す。横軸はプロゲステロン濃度（Ｍ）の対数、縦軸はｃＡＭＰレベルを表す。
図４は、上の図はマウスＭＴＣ ｐａｎｅｌ Ｉを利用してマウス「ＢＧ３７」の発現部位を調べた結果を示す写真である。下の図は各種組織におけるＧ３ＰＤＨの発現を検出した結果を示す写真である。図中のレーン１から１３は心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、７日目の胎児、１１日目の胎児、１５日目の胎児、１７日目の胎児、ネガティヴコントロール（テンプレートなし）を示す。レーンＭはサイズマーカーを示す。
図５は、上の図はラットＭＴＣ ｐａｎｅｌ Ｉを利用してラットＢＧ３７の発現部位を調べた結果を示す写真である。下の図は各種組織におけるＧ３ＰＤＨの発現を検出した結果を示す写真である。図中のレーン１から１１は心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、ネガティヴコントロール（テンプレートなし）、コントロールｃＤＮＡ（キットに添付されていた物）、ラットゲノム遺伝子を示す。レーンＭはサイズマーカーを示す。
図６は、胆汁酸による細胞内ｃＡＭＰ量増加反応を示すグラフである。各化合物の濃度が１０μＭの時のＨＥＫ／ｈＢＧ３７細胞における細胞内ｃＡＭＰ量を示す。
Claims (4)
- 下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、下記（i）または（ii）に記載のレセプタータンパク質:
（i）配列番号：２、２０若しくは３８に記載のアミノ酸配列からなるグアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質；
（ii）配列番号：２、２０または３８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ステロイド骨格を有する生体内物質と結合する活性を有するグアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質；
とそのリガンドであるステロイド骨格を有する生体内物質との結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法：
（ａ）被検化合物の存在下及び該被検物質の非存在下の各々の条件下で、上記（i）または（ii）のレセプタータンパク質に該リガンドを接触させ、該各々の条件下での該レセプタータンパク質と該リガンドとの結合活性を検出する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）で検出された各々の結合活性を比較して、該レセプタータンパク質と該リガンドとの結合活性を低下させる化合物を選択する工程。 - 下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程を含む、下記（i）または（ii）に記載のレセプタータンパク質：
（i）配列番号：２、２０若しくは３８に記載のアミノ酸配列からなるグアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質；
（ii）配列番号：２、２０または３８に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ステロイド骨格を有する生体内物質と結合する活性を有するグアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質；
の活性を阻害または促進する化合物をスクリーニングする方法：
（ａ）被検化合物の存在下及び該被検物質の非存在下の各々の条件下で、上記（i）または（ii）のレセプタータンパク質を発現する細胞に該レセプタータンパク質のリガンドであるステロイド骨格を有する生体内物質を接触させる工程；
（ｂ）該リガンドの該レセプタータンパク質への結合による該細胞における変化を検出する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で検出された各々の細胞の変化を比較して、該細胞に変化を与える化合物を選択する工程。 - 該細胞の変化が、細胞内cAMP量の変化である請求項２に記載のスクリーニング方法。
- ステロイド骨格を有する生体内物質が、プロゲステロン、デヒドロイソアンドロステロン、テストステロン、アンドロステンジオン、プレグネノロン、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、および５α-ジヒドロテストステロンからなる群より選択される請求項１乃至３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
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