JP2000189171A

JP2000189171A - 新規なグアノシン三リン酸（ｇｔｐ）結合タンパク質共役型のレセプタ―タンパク質

Info

Publication number: JP2000189171A
Application number: JP11145661A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Itaya; 啓板谷; Tetsuo Takimura; 哲雄滝村; Takao Nakamura; 隆男中村; Masahiko Kobayashi; 正彦小林; Kenichi Tanaka; 健一田中; Yusuke Hidaka; 裕介日高; Masaki Ota; 雅貴太田
Original assignee: Banyu Phamaceutical Co Ltd
Current assignee: MSD KK
Priority date: 1998-12-25
Filing date: 1999-05-25
Publication date: 2000-07-11
Also published as: US20050048522A1; WO2000039164A1; EP1142909A4; AU772932B2; US20020086359A1; US6750322B2; US7074594B2; US20070015220A1; US7374895B2; AU1800300A; CA2356243A1; EP1142909A1

Abstract

(57)【要約】【課題】脳に発現する新規なヒト由来Gタンパク質共
役型レセプタータンパク質を提供する。【解決手段】ヒト海馬ライブラリーのスクリーニング
によりヒト由来Gタンパク質共役型レセプタータンパク
質をコードする全長cDNAを単離した。該タンパク質は、
ヒスタミン刺激により細胞内cAMP濃度を低下させる活性
を有していた。このGタンパク質共役型レセプタータン
パク質は、そのリガンドのスクリーニングや該タンパク
質からのシグナル伝達を調節しうる医薬品候補化合物の
スクリーニングのためのツールとして利用しうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なヒト由来グ
アノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレセプタータ
ンパク質、該タンパク質をコードするDNA、並びにこれ
らを利用した医薬品候補化合物のスクリーニング方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜
に存在する特異的なレセプタータンパク質を通じて生体
の機能を調節している。これらのレセプタータンパク質
の多くは共役しているグアノシン三リン酸結合タンパク
質(以下、「Gタンパク質」と略称する場合がある)の活
性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行なっている。こ
のため、このレセプタータンパク質はGタンパク質共役
型レセプタータンパク質と総称されている。あるいは7
個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていること
から、7回膜貫通型レセプタータンパク質とも総称され
ている。

【０００３】Gタンパク質共役型レセプタータンパク質
は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら
生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、例えばホルモ
ン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として非
常に重要な役割を担っている。このため、Gタンパク質
共役型レセプタータンパク質は医薬品開発の標的として
非常に注目されている。

【０００４】Gタンパク質共役型レセプタータンパク質
としては、これまでにムスカリン性アセチルコリン・レ
セプターM1、M2、M3、M4（Peralta, E. G. et al., EMB
O J.6, 3923-3929 (1987)）、ムスカリン性アセチルコ
リン・レセプターM5（Bonner, T. I. et al., Neuron
1, 403-410 (1988)）、アデノシン・レセプターA1（Lib
ert, F. et al., Science 244, 569-572 (1989)）、α1
Aアドレノレセプター（Bruno, J. F. et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 179, 1485-1490 (1991)）、β
1アドレノセプター（Frielle, T. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA84, 7920-7924 (1987)）、アンジオテ
ンシン・レセプターAT_１（Takayanagi, R., et al., Bi
ochem. Biophys. Res. Commun. 183, 910-916 (199
2)）、エンドセリン・レセプターET_Ａ（Adachi, M. et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 180, 1265-1272
(1991)）、ゴナドトロピン放出因子レセプター（Kake
r, S. S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 18
9, 289-295 (1992)）、ヒスタミン・レセプターH_２（Ru
at, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1658
-1672 (1992)）、神経ペプチドYレセプターY1（Larhamm
ar, D. et al., J. Biol.Chem. 267, 10935-10938(199
2)）、インターロイキン8・レセプターIL8R_Ａ（Holmes,
W. E. et al., Science 2563, 1278-1280 (1991)）、
ドーパミン・レセプターD_１（Mahan, L. C. et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2196-2200 (1990)）、
代謝型グルタミン酸レセプターmGluR1（Masu M. et a
l., Nature 349,760-765 (1991)）、ソマトスタチン・
レセプターSS_１（Yamada Y. et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 89, 251-255）などが報告されている（参
考文献：Watson, S. and Arkinstall, S., The G-Prote
in Linked Receptor FactsBook, Academic Press (199
4)）。また、Gタンパク質共役型レセプタータンパク質
を標的とした医薬品としては、塩酸テラゾシン（血圧降
下剤、α１アドレノセプター・アンタゴニスト）、アテ
ノロール（不整脈用剤、β１アドレノセプター・アンタ
ゴニスト）、塩酸ジサイクロミン（鎮痙剤、アセチルコ
リン・レセプター・アンタゴニスト）、塩酸ラニチジン
（消化性潰瘍治療剤、ヒスタミン・レセプターH2・アン
タゴニスト）、塩酸トラゾドン（抗うつ剤、セロトニン
・レセプター5-HT1B・アンタゴニスト）、塩酸ブプレノ
ルフィン（鎮痛剤、オピオイド・レセプターκ・アゴニ
スト）などが開発されている（参考文献：Stadel. J.
M. et al.,Trends Pharm. Sci. 18, 430-437 (1997)；
医薬品要覧第５版、薬業時報社）。

【０００５】ところで、脳の一部である視床下部は、自
律神経系の中枢として特定の反応を引き起こす種々のプ
ログラムを有しており、様々な出力系を介して内部環境
の恒常性に寄与している。例えば、甲状腺刺激ホルモン
放出ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホ
ルモン放出ホルモンなどのホルモンを放出し、標的細胞
に発現している特異的な受容体に対するこれらホルモン
の作用を介して、全身の内分泌系を調節している。この
ような視床下部における出力系には、視床下部における
受容体とそれに作用する物質が関与していると考えられ
ている。このため、視床下部の出力系を調節している物
質と視床下部におけるその特異的レセプターとの関係を
明らかにすることは、内分泌異常などに起因する疾患の
治療などための医薬品開発において非常に重要な手段で
あるといえる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、脳（特に、
視床や視床下部など）に発現する新規なヒト由来Gタン
パク質共役型レセプタータンパク質を提供することを課
題とする。さらに、本発明は、該レセプタータンパク質
を利用したリガンドおよび医薬品の候補化合物のスクリ
ーニング方法を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、まず、既知のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質において高度に保存されている領域
を独自に抽出し、これに対応するプライマーを設計して
ラット視床及び視床下部由来のmRNAに対し逆転写−ポリ
メラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を行った。次いで、これに
より増幅された多くのクローンの中から無作為にクロー
ンを選択し、その部分的な塩基配列の決定を行った。そ
して、塩基配列の決定を行ったクローンの中から公知の
クローンを消去するために、類似性検索により公知のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質をコードすると
判断されたクローンのcDNAをプローブとして、コロニー
ハイブリダイゼーションを行ない、いずれのプローブに
もハイブリダイズしない陰性クローンを選択した。そし
て、この陰性クローンの塩基配列に基づきプローブを調
製し、ラット視床及び視床下部由来のcDNAライブラリー
のスクリーニングを行うことにより、ラットGタンパク
質共役型レセプタータンパク質をコードする全長cDNAを
単離した。

【０００８】さらに本発明者等は、特異的プローブを用
いたヒト海馬ライブラリーのスクリーニングを行い、該
ラットcDNAに対応するヒトcDNAを単離することに成功し
た。

【０００９】単離したヒトcDNAがコードするGタンパク
質共役型レセプタータンパク質のリガンドを同定するた
めに、本発明者等は、該タンパク質を発現する細胞を調
製し、該タンパク質を刺激することにより該細胞内のcA
MP濃度を変化させる化合物のスクリーニングを行なっ
た。その結果、本発明者等は、ヒスタミンが細胞表面に
発現したヒトGタンパク質共役型レセプタータンパク質
を刺激して細胞内のcAMP濃度を低下させる活性を有する
ことを見出した。さらに、ヒスタミンが実際に該タンパ
ク質に結合する活性を有することを見出した。

【００１０】本発明者等により見出されたGタンパク質
共役型レセプタータンパク質は、そのアゴニストやアン
タゴニストのスクリーニングにおいて非常に有用なツー
ルとなり、また、該スクリーニングにより単離されたア
ゴニストやアンタゴニストは医薬品としての利用が期待
される。

【００１１】従って、本発明は、脳に発現する新規なヒ
ト由来Gタンパク質共役型のレセプタータンパク質、該
タンパク質をコードするDNA、および該タンパク質を利
用したリガンドや医薬品候補化合物のスクリーニングに
関する。

【００１２】より具体的には、（１）下記（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列
からなるグアノシン三リン酸結合タンパク質共役型のレ
セプタータンパク質：（ａ）配列番号：２０に記載のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において１
もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加した
アミノ酸配列、（２）ヒスタミンとの結合活性を有す
る、（１）に記載のタンパク質、（３）ヒスタミン刺
激に応答して細胞内のcAMP濃度またはカルシウム濃度を
変化させる活性を有する、（１）に記載のタンパク質、
（４）（１）から（３）のいずれかに記載のレセプタ
ータンパク質の部分ペプチド、（５）（１）から
（３）のいずれかに記載のレセプタータンパク質または
（４）に記載の部分ペプチドをコードするDNA、（６）
配列番号：２１に記載の塩基配列のコード領域を含む
（５）に記載のDNA、（７）（５）または（６）に記
載のDNAを含有することを特徴とするベクター、（８）
（７）に記載のベクターを保持する形質転換体、
（９）（８）に記載の形質転換体を培養する工程を含
む、（１）から（３）のいずれかに記載のレセプタータ
ンパク質または（４）に記載の部分ペプチドの製造方
法、（１０）（１）から（３）のいずれかに記載のレ
セプタータンパク質に結合するリガンドまたはそのアナ
ログのスクリーニング方法であって、（ａ）（１）から
（３）のいずれかに記載のレセプタータンパク質または
（４）に記載の部分ペプチドに被検化合物を接触させる
工程、（ｂ）該タンパク質または部分ペプチドに結合す
る化合物を選択する工程、を含む方法、（１１）
（１）から（３）のいずれかに記載のレセプタータンパ
ク質とそのリガンドまたは該リガンドのアナログとの結
合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法
であって、（ａ）被検化合物の存在下で（１）から
（３）のいずれかに記載のレセプタータンパク質または
（５に記載の部分ペプチドにリガンドまたはそのアナロ
グを接触させ、該タンパク質またはその部分ペプチドと
リガンドまたはそのアナログとの結合活性を検出する工
程、（ｂ）被検化合物非存在下での結合活性と比較し
て、工程（ａ）で検出された結合活性を低下させる化合
物を選択する工程、を含む方法、（１２）リガンドが
ヒスタミンである、（１１）に記載の方法、（１３）
（１）から（３）のいずれかに記載のレセプタータンパ
ク質の活性を阻害または促進する化合物をスクリーニン
グする方法であって、（ａ）被検化合物の存在下で該タ
ンパク質を発現する細胞に該タンパク質のリガンドまた
はそのアナログを接触させる工程、（ｂ）該リガンドま
たはそのアナログの該タンパク質への結合による細胞に
おける変化を検出する工程、（ｃ）被検化合物非存在下
での細胞における変化と比較して、工程（ｂ）で検出さ
れた細胞における変化を抑制または増強させる化合物を
選択する工程、を含む方法、（１４）リガンドがヒス
タミンである、（１３）に記載の方法、（１５）検出
する細胞における変化が、cAMP濃度の変化、カルシウム
濃度の変化、Ｇタンパク質の活性化、ホスホリパーゼＣ
の活性化、およびｐＨの変化からなる群より選択され
る、（１３）または（１４）に記載の方法、（１６）
（１）から（３）のいずれかに記載のレセプタータンパ
ク質または（４）に記載の部分ペプチドを含有すること
を特徴とする、（１０）から（１５）のいずれかのスク
リーニングのためのキット、（１７）（１）から
（４）のいずれかに記載のレセプタータンパク質に結合
する抗体、（１８）（１１）から（１５）のいずれか
に記載のスクリーニングにより単離される化合物、（１
９）（１８）に記載の化合物を有効成分とする医薬組
成物、に関する。

【００１３】なお、本発明において「Gタンパク質共役
型のレセプタータンパク質」とは、Gタンパク質の活性
化を通じて細胞内のシグナル伝達を行なっているレセプ
タータンパク質を指す。

【００１４】本発明において「リガンド」とは、Gタン
パク質共役型のレセプタータンパク質に結合して、シグ
ナル伝達を誘導する能力を有する天然の化合物を指す。
「リガンドのアナログ」とは、Gタンパク質共役型のレ
セプタータンパク質に結合するリガンドと同様の生理活
性を有するか、もしくはリガンドの生理活性を抑制する
リガンドの誘導体を指し、天然の化合物および人工的に
合成された化合物の双方が含まれる。例えば、ヒスタミ
ンとR(-)-α-メチルヒスタミンは、リガンドとそのアナ
ログの関係にある。

【００１５】本発明において「アゴニスト」とは、Gタ
ンパク質共役型のレセプタータンパク質のリガンドと同
様の生理活性を有する化合物を指し、天然の化合物およ
び人工的に合成された化合物の双方が含まれる。

【００１６】本発明において「アンタゴニスト」とは、
Gタンパク質共役型のレセプタータンパク質のリガンド
の生理活性を抑制する能力を有する化合物を指し、天然
の化合物および人工的に合成された化合物の双方が含ま
れる。

【００１７】本発明における「タンパク質」および「ペ
プチド」にはその塩も含まれる。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明は、新規なヒトGタンパク
質共役型レセプタータンパク質に関する。本発明等によ
り単離されたヒト由来Gタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質「BG2」のcDNAの塩基配列を配列番号：２１
に、「BG2」タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２
０に示す。

【００１９】ヒト「BG2」タンパク質は、公知のG蛋白質
共役型レセプター蛋白質であるヒト由来α-2C-1アドレ
ノセプター（Regan, J. W. et al., Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.85, 6301-6305(1988)）、マウス由来β-1アド
レノセプター（Jasper J. R. et al., Biochem. Biophy
s. Acta 1178, 307-309(1993)）、ヒト由来ムスカリン
性アセチルコリンレセプターM3（Peralta, E. G. et a
l., EMBO J. 6, 3923-3929(1987)）とそれぞれ32 %、28
%、27%のホモロジーを有する。この事実は、「BG2」タ
ンパク質が、Gタンパク質共役型レセプタータンパク質
ファミリーに属することを示している。そして、「BG
2」タンパク質がGタンパク質共役型レセプタータンパク
質であることは、そのリガンドの作用によりG蛋白質の
活性化を通じてシグナル伝達を行っていることを示して
いる。実際に、ヒト「BG2」タンパク質はヒスタミンに
結合する活性を有し、また、ヒスタミンの刺激に応答し
て細胞内のcAMP濃度を低下させる活性を有していた。本
発明のヒト「BG2」タンパク質は、脳（海馬など）に発
現していた。脳において海馬は記憶や学習に重要な役割
を担い、小脳は体性運動の制御を行い、視床下部は自律
神経系の中枢である。「BG2」蛋白質はこれら機能の調
節に関与していると考えられる。従って、本発明のヒト
「BG2」タンパク質やその遺伝子、該タンパク質の機能
を調節し得るアゴニストやアンタゴニストは、記憶・学
習障害の改善や、血圧、消化、体温、摂食等の自律神経
系の調節への応用が考えられる。

【００２０】ヒト「BG2」タンパク質は、天然のタンパ
ク質の他、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパ
ク質として調製することができる。天然のタンパク質
は、例えば、ヒト「BG2」タンパク質が発現していると
考えられる脳組織の抽出液に対し、後述する「BG2」抗
体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行う方
法により調製することが可能である。一方、組換えタン
パク質は、後述するようにヒト「BG2」タンパク質をコ
ードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより
調製することが可能である。また、当業者であれば、公
知の方法を用いて天然型のヒト「BG2」タンパク質（配
列番号：２０）中のアミノ酸の置換などの修飾を行い、
天然型のタンパク質と同等の機能または活性（グアノシ
ン三リン酸結合タンパク質の活性化を通じて細胞内のシ
グナル伝達を行なう機能、ヒスタミンとの結合活性、ヒ
スタミン刺激に応答して細胞内のcAMP濃度もしくはカル
シウム濃度を変化させる活性）を有する改変タンパク質
を調製することが可能である。また、タンパク質のアミ
ノ酸の変異は天然においても生じうる。このようにアミ
ノ酸の置換、欠失、付加などにより天然型のタンパク質
に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、天然
型のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質も本発
明のGタンパク質共役型レセプタータンパク質に含まれ
る。当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、
例えば、Kunkel法（Kunkel, T. A. et al., Methods En
zymol. 154, 367-382 (1987)）、ダブルプライマー法
（Zoller, M.J. and Smith, M., Methods Enzymol. 15
4, 329-350 (1987)）、カセット変異法（Wells, et a
l., Gene 34, 315-23 (1985)）、メガプライマー法（Sa
rkar, G. and Sommer, S. S., Biotechniques 8, 404-4
07 (1990)）が挙げられる。機能的に同等なタンパク質
におけるアミノ酸の変異数は、通常、全アミノ酸の10%
以内、好ましくは10アミノ酸以内、さらに好ましくは3
アミノ酸以内（例えば、1アミノ酸）である。

【００２１】また、本発明は、上記本発明のGタンパク
質共役型レセプタータンパク質の部分ペプチドを包含す
る。本発明の部分ペプチドとしては、例えば、本発明の
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質のN末端領域の
部分ペプチドが挙げられ、該ペプチドは抗体の調製に利
用することができる。また、ヒスタミンとの結合活性を
有するペプチドや細胞表面に発現させた場合にヒスタミ
ン刺激に応答して細胞内cAMP濃度もしくはカルシウム濃
度を変化させる活性を有するペプチドが挙げられ、これ
らペプチドは後述する医薬品候補化合物のスクリーニン
グに利用することができる。また、ヒスタミンとの結合
活性を有するが細胞内へのシグナル伝達を行なう活性を
有しない部分ペプチドは、本発明の「BG2」タンパク質
の競合阻害剤になり得る。このような本発明の部分ポリ
ペプチドは、少なくとも15アミノ酸、好ましくは20アミ
ノ酸以上の鎖長を有すると考えられる。

【００２２】また、本発明は、上記本発明のヒト由来G
タンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分
ペプチドをコードするDNAに関する。本発明のGタンパク
質共役型レセプタータンパク質やその部分ペプチドをコ
ードするDNAとしては、これらタンパク質や部分ペプチ
ドをコードしうるものであれば特に制限はなく、cDNA、
ゲノムDNA、および合成DNAが含まれる。本発明のヒト由
来Gタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードす
るcDNAは、例えば、配列番号：２１に記載のcDNAあるい
はその断片、それらに相補的なRNA、または該cDNAの配
列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを^３２Pなどで
標識し、本発明のGタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質が発現している組織（例えば、脳組織）由来のcDNA
ライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリ
ーニングすることができる。あるいは、これらcDNAの塩
基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、適当な
組織（例えば、脳組織）由来のcDNAを鋳型にポリメラー
ゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもでき
る。ゲノムDNAは、例えば、配列番号：２１に記載のcDN
Aあるいはその断片、それらに相補的なRNA、または該cD
NAの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを^３２P
などで標識し、ゲノムDNAライブラリーにハイブリダイ
ズさせることによりスクリーニングすることができる。
あるいは、これらcDNAの塩基配列に対応するオリゴヌク
レオチドを合成し、ゲノムDNAを鋳型にポリメラーゼ連
鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。
一方、合成DNAは、例えば、配列番号：２１に記載のcDN
Aの部分配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、
アニーリングさせて二本鎖にし、DNAリガーゼで結合さ
せることにより調製することができる（Khorana, H. G.
et al., J. Biol. Chem. 251, 565-570 (1976)；Goedd
el D. V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,106
-10 (1979)）。

【００２３】これらDNAは、組換えタンパク質の生産に
有用である。即ち、上記本発明のヒト由来Gタンパク質
共役型レセプタータンパク質をコードするDNA（例え
ば、配列番号：２１に記載のDNA）を適当な発現ベクタ
ーに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形
質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製するこ
とにより本発明のヒト由来Gタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質を組換えタンパク質として調製することが
可能である。本発明のヒト由来Gタンパク質共役型レセ
プタータンパク質はレセプタータンパク質であるため、
細胞膜に発現させて調製することが可能である。

【００２４】具体的には、宿主が大腸菌エシェリシア・
コリ（Escherichia coli）の場合、プラスミドベクター
pET-3（Rosenberg, A. H. et al., Gene 56, 125-35 (1
987)）、pGEX-1（Smith, D. B. and Johnson, K. S., G
ene 67, 31-40 (1988)）などが用いられる。大腸菌の形
質転換は、Hanahan法（Hanahan, D., J. Mol. Biol.16
6, 557-580 (1983)）、電気穿孔法（Dower, W. J. et a
l., Nucl. Acids Res.16, 6127-6145 (1988)）などで行
う。宿主が分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベ（Sc
hizosaccharomyces pombe）の場合には、プラスミドベ
クターpESP-1（Lu, Q. et al., Gene 200, 135-144 (19
97)）などが用いられる。酵母の形質転換は、例えば、
スフェロプラスト法（Beach, D. and Nurse, P., Natur
e 290,140 (1981)）、酢酸リチウム法（Okazaki, K. et
al., Nucleic Acids Res. 18, 6485-6489 (1990)）な
どにより行なわれる。

【００２５】一方、宿主がほ乳動物細胞、例えば、チャ
イニーズハムスター卵巣由来細胞CHO、ヒトHeLa細胞な
どの場合、pMSG（クロンテク社）などのベクターが用い
られる。ほ乳動物細胞への組換えDNAの導入は、リン酸
カルシウム法（Graham, F. L.and van derEb, A. J., V
irology 52, 456-467 (1973)）、DEAE-デキストラン法
（Sussman, D. J. and Milman, G., Mol. Cell. Biol.
4, 1641-1643 (1984)）、リポフェクション法（Felgne
r, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A 84, 7
413-7417 (1987)）、電気穿孔法（Neumann, E. et al.,
EMBO J. 1, 841-845 (1982)）などで行われる。宿主が
昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスベクターpBacPA
K8/9（クロンテク社）などが用いられる。昆虫細胞の形
質転換は、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Techno
logy）,6, 47-55(1980)）などに記載の方法に従って行
なうことができる。

【００２６】宿主細胞において発現させた組換えタンパ
ク質は、公知の方法により精製することができる。ま
た、例えば、N末端にヒスチジン残基のタグ、グルタチ
オンSトランスフェラーゼ（GST）などを結合した融合タ
ンパク質の形で合成し、金属キレート樹脂、GST親和性
レジンに結合させることにより精製することができる
（Smith, M. C. et al., J. Biol. Chem. 263, 7211-72
15 (1988)）。例えば、ベクターとしてpESP-1を用いた
場合、目的のタンパク質は、グルタチオンSトランスフ
ェラーゼ（GST）との融合タンパク質として合成される
ため、GST親和性レジンに結合させることより組換えタ
ンパク質を精製できる。融合タンパク質から目的タンパ
ク質を分離するには、例えば、トロンビン、血液凝固因
子Xaなどで切断する。

【００２７】本発明のヒト由来Gタンパク質共役型レセ
プタータンパク質をコードするDNAは、その変異に起因
する疾患の遺伝子治療に応用することも可能である。遺
伝子治療に用いる場合には、ヒト細胞への遺伝子導入に
は、レトロウイルスベクター（Danos, O. and Mulliga
n, R. C., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 85, 6460-64
64 (1988)；Dranoff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U S A 90, 3539-3543 (1993)）、アデノウイルスベク
ター（Wickham, T. J. et al., Cell 73, 309-319(199
3)）などを用いる方法が用いられている。患者への投与
法としては、骨髄移植、皮下注射、静脈注射などが用い
られる（Asano, S., 蛋白質核酸酵素, 40, 2491-2495
(1995)）。

【００２８】また、本発明は、本発明のヒト由来Gタン
パク質共役型レセプタータンパク質に結合する抗体に関
する。本発明のヒト由来Gタンパク質共役型レセプター
タンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法（例
えば、「新生化学実験講座１,タンパク質Ｉ,389-406,東
京化学同人」参照）により調製することが可能である。
ポリクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行
う。ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの免疫
動物に適量の上記タンパク質またはペプチドを投与す
る。投与は、抗体産生を促進するアジュバント（FIAやF
CA）と共に行ってもよい。投与は、通常、数週間ごとに
行う。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させ
ることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行う
ことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例え
ば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィ
ーによる分画、プロテインAや固定化抗原を用いたアフ
ィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体
を調製することができる。一方、モノクローナル抗体の
調製は、例えば、以下の如く行う。本発明のGタンパク
質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチ
ドを、上記と同様に免疫動物に免疫し、最終免疫後、こ
の免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾
臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ
細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、
ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをス
クリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノ
クローナル抗体を調製することができる。モノクローナ
ル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イ
オンクロマトグラフィーによる分画、プロテインAや固
定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことが
できる。これにより調製された抗体は、本発明のヒト由
来Gタンパク質共役型レセプタータンパク質のアフィニ
ティー精製のために用いられる他、本発明のヒト由来G
タンパク質共役型レセプタータンパク質の発現異常に起
因する疾患の検査や抗体治療、本発明のヒト由来Gタン
パク質共役型レセプタータンパク質の発現量の検出など
に利用することが可能である。

【００２９】抗体治療に用いる場合、ヒト型抗体もしく
はヒト抗体であることが好ましい。ヒト型抗体は、例え
ば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、本発明のGタン
パク質共役型レセプタータンパク質に対する抗体を産生
するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのH鎖定常
部をヒトIgE H鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫
細胞J558Lに導入することにより調製できる（Neuberge
r, M. S. et al., Nature314, 268-270 (1985)）。ま
た、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスに本
発明のGタンパク質共役型レセプタータンパク質を免疫
することにより調製することが可能である。

【００３０】また、本発明は、本発明のヒト由来Gタン
パク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドま
たはそのアナログのスクリーニング方法に関する。この
スクリーニング方法においては、本発明のGタンパク質
共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチド
に被検化合物を接触させ、これらタンパク質もしくはペ
プチドに結合する化合物を選択する工程を含む。被検化
合物としては、例えば、アセチルコリン、アデノシン、
アドレナリン、ノルアドレナリン、アンジオテンシン、
ボムベシン、ブラジキニン、C5aアナフィラトキシン、
カルシトニン、カナビノイド、ケモカイン、コレシスト
キニン、ドーパミン、エンドセリン、フォルミルメチオ
ニルペプチド、GABA、ガラニン、グルカゴン、グルタミ
ン酸、グリコペプチドホルモン、ヒスタミン、5ーヒド
ロキシトリプトファン、ロイコトリエン、メラノコルチ
ン、神経ペプチドY、ニューロテンシン、オドラント、
オピオイドペプチド、オプシン、パラサイロイドホルモ
ン、血小板活性化因子、プロスタノイド、ソマトスタチ
ン、タキキニン、トロンビン、サイロトロピン放出ホル
モン、バソプレシン、オキシトシン（Watson, S. and A
rkinstall, S., TheG-Protein Linked Receptor FactsB
ook, Academic Press (1994)）などの公知の化合物また
はそのアナログ、その他の精製タンパク質、遺伝子（ラ
イブラリーも含む）の発現産物、リガンドが存在してい
ることが予想される組織もしくは細胞（例えば、脳、視
床、視床下部）の抽出液、細胞培養上清などが用いられ
る。スクリーニングに用いる本発明のGタンパク質共役
型レセプタータンパク質は、例えば、所望の細胞（該タ
ンパク質を発現するように処理した形質転換体を含む）
内または細胞表面に発現した形態、該細胞の細胞膜画分
としての形態、アフィニティーカラムに結合した形態で
あってもよい。スクリーニングに用いる被検化合物は、
必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、
例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これ
らに制限されない。本発明のヒト由来Gタンパク質共役
型レセプタータンパク質と被検化合物との結合は、本発
明のヒト由来Gタンパク質共役型レセプタータンパク質
に結合した化合物に付された標識による検出（例えば、
結合量を放射活性や蛍光強度により検出する）のほか、
被検化合物の細胞表面上の本発明のヒト由来Gタンパク
質共役型レセプタータンパク質への結合による細胞内へ
のシグナル伝達（例えば、Gタンパク質の活性化、Ca
^２＋またはcAMPの濃度変化、ホスホリパーゼCの活性
化、pHの変化）を指標に検出することもできる。具体的
な方法については、例えば、文献（Cell Calcium 14,66
3-671(1993)、Analytical Biochemistry 226,349-354(1
995)、J.Biol.Chem.268,5957-5964(1993)、Cell 92,573
-585(1998)、Nature 393,272-273(1998)）や公報（特開
平9-268号公報）の記載に準じて行うことができる。そ
の他、TWOハイブリッドシステム（Zervos et al.,Cell
72,223-232(1994)、Fritz et al.,Nature 376,530-533
(1995)）を利用したレポーター遺伝子の活性の検出によ
っても結合を検出することができる。

【００３１】また、本発明は、本発明のヒト由来Gタン
パク質共役型レセプタータンパク質とそのリガンドまた
はリガンドのアナログとの結合を阻害する活性を有する
化合物のスクリーニング方法に関する。このスクリーニ
ング方法は、（ａ）被検化合物の存在下で本発明のGタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペ
プチドにリガンドまたはそのアナログを接触させ、該タ
ンパク質またはその部分ペプチドとリガンドまたはその
アナログとの結合活性を検出する工程、および（ｂ）工
程（ａ）で検出された結合活性を、被検化合物非存在下
での結合活性と比較し、本発明のGタンパク質共役型レ
セプタータンパク質もしくはその部分ペプチドとリガン
ドまたはそのアナログとの結合活性を低下させる化合物
を選択する工程を含む。被検化合物としては、タンパク
質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成され
た化合物、組織や細胞の抽出液、血清などが挙げられる
が、これらに制限されない。スクリーニングに用いる本
発明のGタンパク質共役型レセプタータンパク質は、例
えば、所望の細胞（該タンパク質を発現するように処理
した形質転換体を含む）内または細胞表面に発現した形
態、該細胞の細胞膜画分としての形態、アフィニティー
カラムに結合した形態であってもよい。スクリーニング
に利用するリガンドは必要に応じて適宜標識して用いら
れる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識など
が挙げられるが、これらに制限されない。また、リガン
ドとしては、例えば、ヒスタミンを好適に用いることが
できる。また、ヒスタミンのアナログ、例えば、R(-)-
α-メチルヒスタミンを用いることも可能である。

【００３２】本発明のヒト由来Gタンパク質共役型レセ
プタータンパク質またはその部分ペプチドとリガンドま
たはそのアナログとの結合活性は、本発明のGタンパク
質共役型レセプタータンパク質やその部分ペプチドに結
合したリガンドまたはそのアナログに付された標識によ
る検出（例えば、結合量を放射活性や蛍光強度により検
出する）のほか、被検化合物の細胞表面上の本発明のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質への結合による
細胞の変化（例えば、Gタンパク質の活性化、Ca^２＋ま
たはcAMPの濃度変化、ホスホリパーゼCの活性化、pHの
変化）を指標に検出することもできる。具体的な方法に
ついては、例えば、実施例に記載のZlokarmikらの方法
（Science 1998, vol.279, p.84）を利用することが可
能である。また、文献（Cell Calcium 14,663-671(199
3)、Analytical Biochemistry 226,349-354(1995)、J.B
iol.Chem.268,5957-5964(1993)、Cell 92,573-585(199
8)、Nature 393,272-273(1998)）や公報（特開平9-268
号公報）の記載に準じて行うことができる。検出の結
果、被検化合物の存在下における結合活性が、被検化合
物の非存在下における結合活性（対照）より低い値を示
した場合には、該被検化合物は、本発明のGタンパク質
共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドと
リガンドまたはそのアナログとの結合を阻害する活性を
有すると判定される。このような化合物は、本発明のG
タンパク質共役型レセプタータンパク質に結合して細胞
内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する化合物（ア
ゴニスト）および該活性を有しない化合物（アンタゴニ
スト）などが含まれる。アゴニストは、本発明のGタン
パク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドと
同様の生理活性を有しており、一方、アンタゴニスト
は、本発明のヒト由来Gタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質に対するリガンドが有する生理活性を抑制す
る。このため、これらアゴニストやアンタゴニストは、
本発明のヒト由来Gタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患
の治療などのための医薬組成物として有用である。

【００３３】また、本発明は、本発明のヒト由来Gタン
パク質共役型レセプタータンパク質の活性を阻害または
促進する化合物をスクリーニングする方法に関する。こ
のスクリーニング方法は、（ａ）被検化合物の存在下で
本発明のヒト由来Gタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質を発現する細胞に該タンパク質のリガンドまたはそ
のアナログを接触させる工程、（ｂ）該リガンドまたは
そのアナログの該タンパク質への結合による細胞におけ
る変化を検出する工程、および（ｃ）被検化合物非存在
下での細胞における変化と比較して、工程（ｂ）で検出
された細胞における変化を抑制または増強させる化合物
を選択する工程、を含む方法である。被検化合物として
は、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工
的に合成された化合物、組織や細胞の抽出液、血清など
が挙げられるが、これらに制限されない。上記の結合活
性の阻害を指標としたスクリーニングにより単離された
化合物を被検化合物として用いることも考えられる。本
発明のヒト由来Gタンパク質共役型レセプタータンパク
質を発現する細胞は、例えば、実施例５に記載されたよ
うに、該タンパク質をコードするDNAを適当な発現ベク
ターに挿入し、該ベクターを適当な動物細胞に導入する
ことにより調製することができる。該発現ベクターに
は、形質転換体を選別するためのマーカー遺伝子が挿入
されていてもよい。本発明のヒト由来Gタンパク質共役
型レセプタータンパク質を刺激するためのリガンドとし
ては、例えば、ヒスタミンを好適に用いることができ
る。また、ヒスタミンのアナログ、例えば、R(-)-α-メ
チルヒスタミンを用いることも可能である。

【００３４】リガンドやそのアナログが本発明のヒト由
来Gタンパク質共役型レセプタータンパク質へ結合する
ことによる細胞における変化は、例えば、Gタンパク質
の活性化、Ca^２＋またはcAMPの濃度変化、ホスホリパー
ゼCの活性化、pHの変化を指標に検出することもでき
る。具体的な方法については、例えば、実施例６に記載
のZlokarmikらの方法（Science 1998, vol.279, p.84）
を利用することが可能である。また、文献（Cell Calci
um 14,663-671(1993)、Analytical Biochemistry226,34
9-354(1995)、J.Biol.Chem.268,5957-5964(1993)、Cell
92,573-585(1998)、Nature 393,272-273(1998)）や公
報（特開平9-268号公報）の記載に準じて行うことがで
きる。

【００３５】この検出の結果、被検化合物非存在下にお
いてリガンドやそのアナログを作用させた場合の細胞に
おける変化と比較して、細胞における変化が抑制されれ
ば、用いた被検化合物は、本発明のヒト由来Gタンパク
質共役型レセプタータンパク質の活性を阻害する化合物
であると判定される。逆に、被検化合物が該細胞におけ
る変化を増強させれば、該化合物は、本発明のヒト由来
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の活性を促進
する化合物であると判定される。

【００３６】本発明のスクリーニング方法により単離さ
れる化合物（本発明のタンパク質のアゴニストやアンタ
ゴニスト）は、例えば、注意欠如行動多加疾患、アルツ
ハイマー病、記憶障害、認識障害、精神分裂病、睡眠障
害、不眠症、睡眠性無呼吸症候群、睡眠発作、関節リュ
ウマチ、変形性関節症、胃潰瘍、炎症性腸疾患、虚血性
心疾患、不整脈、高及び低血圧症、てんかん、肥満、拒
食症、鬱病、不安、偏頭痛、喘息、ハンチントン舞踏
病、疼痛、ニコチン禁断症状（Trends in Pharmacologi
cal Science, vol 19、1998, 177-183、Stark, H. et a
l.,Drugs of theFuture 21, 507-520(1996)、Onodera,
K. and Watanabe, T., Jpn. J. Psychopharmacol. 15,
87-102(1995)）への応用が考えられる。これら化合物を
薬剤として用いる場合には、単離された化合物自体を直
接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製
剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能であ
る。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具
体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁
剤、界面活性剤、安定剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、香
料、および着色剤などと適宜組み合わせて製剤化して投
与することが考えられる。患者への投与は、例えば、動
脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内
的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知
の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、
投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な
投与量を適宜選択することが可能である。

【００３７】また、本発明は、本発明のヒト由来Gタン
パク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペ
プチドを含有することを特徴とする、上記本発明のスク
リーニングのためのキットに関する。本発明のキットに
おける本発明のヒト由来Gタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくはその部分ペプチドは、例えば、所望
の細胞（該タンパク質を発現するように処理した形質転
換体を含む）内または細胞表面に発現した形態、該細胞
の細胞膜画分としての形態、アフィニティーカラムに結
合した形態であってもよい。本発明のキットの他の要素
としては、上記レセプタータンパク質標品以外に、例え
ば、リガンド標品（標識されたもの、および標識されて
いないもの）、リガンドとレセプタータンパク質の反応
のための緩衝液、洗浄液などが含まれていてもよい。リ
ガンドに付される標識としては、例えば、放射標識、蛍
光標識などが挙げられる。本発明のキットの利用は、公
報（特開平9-268号公報）の記載に準じて行うことがで
きる。また、例えば、実施例６に記載のcAMP濃度の変化
の検出系や実施例７に記載の結合活性の検出系を利用し
たスクリーニングにおいて本発明のキットを利用するこ
とができる。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。

【００３９】[実施例１] ラットGタンパク質共役型受
容体遺伝子の単離 Gタンパク質共役型受容体は、細胞膜を7回貫通するとい
う構造上の特徴を有し、膜貫通領域およびその近傍のア
ミノ酸配列はしばしばよく保存されている。本発明者ら
は、まず、既知のGタンパク質共役型受容体であるマウ
ス神経ペプチドY受容体Y1(GenBank Acession Number Z1
8280),ラットY1(同Z11504)、ヒトY1(同M84755)、マウス
神経ペプチドY受容体Y4(同U40189)、ラットY4(同Z6818
0)、ヒトY4(同Z66526)、マウス神経ペプチドY受容体Y6
(同U58367)において高度に保存されている第2膜貫通領
域および第7膜貫通領域のDNA配列の比較から、それぞれ
配列番号:3で表される新規センスプライマー、配列番
号:4で表される新規アンチセンスプライマーを合成し
た。

【００４０】次いで、ラット(Rattus norvegicus)視床
および視床下部由来ポリ(A)^＋RNAから、RNA-PCRキット
(宝酒造社)を用いて一本鎖cDNAを合成し、これら2本の
プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をお
こなった。具体的には、ラット視床および視床下部か
ら、ファストトラック2.0キット（インビトロジェン
社）を用いてポリ（A）^＋RNAを精製した。RNA−PCRキッ
ト（宝酒造社）のプロトコルにしたがって、精製したポ
リ（A）^＋RNA 75ngから相補鎖DNAを合成した。cDNA全量
を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅を
おこなった。反応液の組成は、各0.15mM dNTPs、1.5mM
MgCl_２、0.025U／μl rTaqポリメラーゼ（宝酒造
社）、各0.5μM ディジェネレートプライマーFg（配列
番号：3）およびRb（配列番号：4）、10×酵素付属PCR
バッファーで、総反応液量130μlとした後、20μlずつ6
本に分注した。ペルティエサーマルサイクラーPTC200(M
Jリサーチ社)で、94℃2分、「94℃30秒、48℃1分、72℃
1分30秒」を35サイクル、72℃8分の条件でPCRをおこな
った。PCR反応後、6本の反応液を1本に集め、ウィザー
ドPCR精製キット（プロメガ社）を用いて増幅産物を精
製し、30μlのTEで溶出した。このうち2μlを、TOPO TA
クローニングキット（インビトロジェン社）のpCR2.1ベ
クターにクローニングした。宿主にはXL1−Blueを用
い、E.coliパルサー（バイオラッド社）で形質転換し
た。得られた形質転換体のうち、白色または薄青色のコ
ロニーを、遺伝子ライブラリー作製装置バイオピック
（バイオロボティックス社）を用いて、5,760個を無作
為に選択し、384ウェルプレート15枚に分注した、100μ
g／mlアンピシリン入りLB培地に植菌した。クローンを3
7℃で一晩培養し、遺伝子ライブラリー複製装置バイオ
グリッド（バイオロボティックス社）を用いて、グリセ
ロールストック用に100μg／mlアンピシリン、25％グリ
セロール入りLB寒天培地に載せたフィルター上、および
コロニーハイブリダイゼーション用に100μg／mlアンピ
シリン入りLB寒天培地に載せたフィルター上に、それぞ
れ1枚ずつレプリカを作成した。

【００４１】得られたPCRクローンの中には、NPY受容体
cDNAが多数重複して存在すると予想されたため、得られ
た5，760クローンから80クローンを無作為に選び、部分
塩基配列を決定した。塩基配列決定のための鋳型にはプ
ラスミド自動単離装置PI100Σ（倉敷紡績社）で精製し
たプラスミドDNAを、酵素反応にはダイプライマーサイ
クルシーケンシングキットFS（パーキンエルマー社）
を、反応産物の電気泳動にはDNAシーケンサー377（パー
キンエルマー社）を用いた。ウィスコンシン・パッケー
ジ（ジェネティック・コンピュータ・グループ社）のbl
astプログラムで、得られた配列を類似性検索にかけた
結果、80個のうち29個はコイルドコイル様タンパク質1
（GenBank Accession Number U79024）の、17個は神経
ペプチドY受容体Y1 同Z11504）のcDNAであった。そこ
で、これら2種類のcDNA断片をプローブに用いて、それ
ぞれディジェネレートPCR増幅断片ライブラリーフィル
ターにハイブリダイズした。プローブは、それぞれのク
ローンの挿入断片をPCRで増幅し、ウィザードPCR精製キ
ット（プロメガ社）で精製し、プライム−イットIIラン
ダムプライマーラベリングキット（ストラタジーン社）
を用いて、［α-^３２P］dCTPで標識したものを用いた。
コロニーハイブリダイゼーションは常法にしたがって行
った（Sambrook et al., Molecular Cloning: A labora
tory mannual 2ndedn., (1989)）。コイルドコイル様タ
ンパク質1に対しても神経ペプチドY受容体Y1に対しても
陰性のクローンについて部分塩基配列を決定した。塩基
配列決定のための鋳型には、各クローンの培養液からPC
Rで挿入断片を増幅し、PCR産物精製用キット（アマシャ
ム社）で精製したDNAを用いた。酵素反応にはダイプラ
イマーサイクルシーケンシングキットFSを、反応産物の
電気泳動にはDNAシーケンサー377を用いた。ウィスコン
シン・パッケージのblastプログラムで、得られた配列
を類似性検索にかけた結果、ムスカリン性アセチルコリ
ン・レセプターM5（GenBank Accession Number M2292
6）と有意の類似性を示すクローンが見出された。この
クローンを工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し
た。

【００４２】（イ）寄託機関の名称・あて名名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便
番号３０５−８５６６）（ロ）寄託日（原寄託日）：平成９年１２月２５日（ハ）寄託番号生命研条寄第6575号（FERM BP-6575）

【００４３】次いで、この遺伝子の全長cDNAを単離する
ために、まず、ラット視床および視床下部由来のcDNAラ
イブラリーを構築した。cDNAの合成は、cDNA合成キット
（ストラタジーン社）のプロトコルに従い、ベクターに
はpEF1x、宿主にはXL1-blueMRF'（ストラタジーン社）
を使用した。なお、pEF1xは、pcDNA3（インビトロジェ
ン社）を以下のように改良したものである。

【００４４】(1)ヒトEF1αプロモーター（GenBank Acce
ssion number J04617）の調製ヒトゲノミックDNAから、プライマー（配列番号：6／CG
AGGATCCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTC、配列番号：7／CGGGTAAG
CTTCACGACACCTGAAATGGAAGA）を用いてPCRを行い、BamHI
（宝酒造社）およびHindIII（宝酒造社）で消化し、プ
ラスミドベクターpUC19（宝酒造社）にクローニングし
た。得られたプラスミドDNAをXhoIで消化、クレノウ酵
素（宝酒造社）で末端を平滑化した後、DNAライゲーシ
ョンキット（宝酒造社）でセルフ・ライゲーションし、
クローニングした。得られたプラスミドDNAをBamHIおよ
びHindIIIで消化し、インサート部分を回収した。

【００４５】(2)pcDNA3の改変プラスミドpcDNA3DNAをMluI（宝酒造社）で消化、クレ
ノウ酵素（宝酒造社）で末端を平滑化した後、DNAライ
ゲーションキットでセルフ・ライゲーションし、クロー
ニングした。得られたプラスミドDNAをAflIII（ニュー
イングランドバイオラボ社）およびSmaI（宝酒造社）で
消化、クレノウ酵素（宝酒造社）で末端を平滑化した
後、DNAライゲーションキットでセルフ・ライゲーショ
ンし、クローニングした。得られたプラスミドDNAをBgl
II（宝酒造社）およびHindIIIで消化し、CMVプロモータ
ー部分を除いた断片を回収し、DNAライゲーションキッ
トを用いて(1)で回収したインサート断片と連結し、ク
ローニングした。これによりpEF1xを構築した。

【００４６】次いで、cDNA断片の塩基配列からオリゴヌ
クレオチドプローブ（配列番号：8／CCTTCTGCATCCCATTG
TACGTACC）を合成し、ジーントラッパーcDNAポジティブ
セレクションシステム（ギブコBRL社）のプロトコルに
したがって、上記のように調製されたラット視床及び視
床下部由来のcDNAライブラリーから、複数個のクローン
を得た。次に、先に単離したクローン（FERM P-16572）
に挿入されたcDNA断片をプローブにしてコロニーハイブ
リダイゼーションを行い、陽性のクローンを得た。この
クローンを工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し
た。

【００４７】（イ）寄託機関の名称・あて名名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便
番号３０５−８５６６）（ロ）寄託日（原寄託日）：平成９年１２月２５日（ハ）寄託番号生命研条寄第6574号（FERM BP-6574）

【００４８】このクローンの挿入断片長は2.7kbpであっ
た。キアプレップミディキット（キアゲン社）でプラス
ミドDNAを調製し、ショットガン法（Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A laboratory mannual 2nd edn.,
(1989)）で全塩基配列を決定した。cDNAの断片化には、
密閉式超音波生物材料処理装置バイオラプター（東湘電
機社）を用い、断片化したDNAを2％アガロース低融解ゲ
ル電気泳動で分画し、0.6kbp付近の断片を、gene clean
spin kit(bio101社）で精製、T4 DNAポリメラーゼ
（宝酒造社）で末端を平滑化して、HincII／BAP処理pUC
118ベクターにクローニングした。宿主にはXL1−Blueを
用い、E.coliパルサー（バイオラッド社）で形質転換し
た。得られたショットガンクローンを、ダイプライマー
サイクルシーケンシングキットFS（パーキンエルマー
社）あるいはダイターミネーターサイクルシーケンシン
グキットFS（パーキンエルマー社）でシーケンシングし
た。得られた配列を、DNAシーケンシングソフト・シー
ケンチャー（日立ソフト社）で結合・編集し、全塩基配
列をした。全塩基配列は、2700bpで、413アミノ酸から
なるタンパク質をコードしていることが明らかになった
（配列番号：5）。オープン・リーディング・フレーム
の5'側に停止コドンが存在するため、このcDNAは、コー
ド領域全長を含むと考えられる(配列番号:2)。この配列
をアミノ酸配列に翻訳したところ、第1、第2、第3、第
4、第5、第6および第7膜貫通領域が疎水性プロット上で
確認された（図1）。

【００４９】また、オープン・リーディング・フレーム
のサイズも、公知のGタンパク質共役型レセプタータン
パク質と比較して同程度の約1.2kbであった。Gタンパク
質共役型レセプタータンパク質はそのアミノ酸配列にあ
る程度の共通性を示し、一つのタンパク質ファミリーを
形成している。そこで、単離したcDNAによってコードさ
れるアミノ酸配列を用いてホモロジー検索を行なったと
ころ、公知のGタンパク質共役型レセプタータンパク質
であるウシ由来ムスカリン性アセチルコリンレセプター
M3タンパク質（Lee, P. H. et al., Biochim. Biophys.
Acta 1223, 151-154 (1994)）、ヒト由来ムスカリン性
アセチルコリンレセプターM5タンパク質（Bonner, T.
I. et al., Neuron 1, 403-410 (1988)）、マウス由来
α2Aアドレノセプター（Link, R. et al., Mol. Pharma
col. 42, 16-27 (1992)）とそれぞれ26 %、25 %、29 %
のホモロジーを有する全く新規なレセプタータンパク質
であることが判明した。

【００５０】[実施例２] ヒトGタンパク質共役型受容
体遺伝子の単離得られたラットの配列をEST検索にかけたところ、ヒト
ホモログの断片が見出された（ジーンバンクNID：94603
0およびNID：901756）。ヒト胎児脳cDNAを特異的プライ
マーIF01（配列番号：9／CTTCCGCCGGGCCTTCACCAA）およ
びIR02（配列番号：10／ACAGACACGGCGGGGCTCAC）（プロ
ーブ1）を用いてPCRにより増幅した。プラークハイブリ
ダイゼーションの標準的な方法により、プローブ1を用
いて1.2x10^６のサイズを有するhuman λ EMBL3 SP6/T7
genomic library（クロンテック社）をスクリーニング
した。これにより2つの陽性クローンを単離した。得ら
れたファージクローンをSacIで消化し、一つのクローン
の3つのバンドをサブクローニングした。これをそれぞ
れI1（配列番号：11）、I3（配列番号：12）、およびI5
（配列番号：13）と命名した。これらの断片の配列を決
定し、仮想的な配列をラットのホモログとの比較により
検討した。I1およびI3は、それぞれ特異的プライマーYS
03（配列番号：14／TGAACGCTTCGGGGGCGCTG）およびYS05
（配列番号：15／GAGATGGCGAGGTTGAGCAGG）、YS12（配
列番号：16／GGCTCCAAGCCATCGGCGTC）およびYS14（配列
番号：17／CTCACTTCCAGCAGTGCTCC）を用いてPCR増幅
し、そのPCR産物をそれぞれプローブ2およびプローブ3
と命名した。ヒト視床下部cDNA（1.3x10^６ファージ）を
150mmプレート当たり5.6x10^４の濃度でプレートに播い
た。得られたサブプールをプライマーYS03およびYS05を
用いたPCRによりチェックした。プローブ2を用いて、ゲ
ノムライブラリーのスクリーニングと同様の方法で、一
つの陽性サブプールをスクリーニングした。これにより
TM5から5’UTRを含む一つのcDNAクローンを得て、cDNA
クローン1と命名した。

【００５１】プライマーYS07（配列番号：18／GCCTCCGC
ACCCAGAACAAC）およびYS10（配列番号：19／TGCGCCTCTG
GATGTTCAG）を用いたPCRにより、cDNAクローン1からプ
ローブ4を増幅した。プローブ3およびプローブ4を用い
て、ゲノムライブラリーのスクリーニングと同様の方法
で、ヒト海馬ライブラリー（3x10^６pfu）のスクリー
ニングを行った。いくつかのクローンを得て、その中で
最も長いものをcDNAクローン2と命名して、その配列の
決定を行った。このクローンはTM2から3’UTRの領域を
有していた。cDNAクローン1をSacIIで消化し、ベクター
と5’端領域を含む3.3kbバンドをシュリンプアルカリフ
ォスファターゼで処理した。cDNAクローン2もまたSacII
で消化し、その1.7kbの断片をcDNAクローン1由来の3.3k
b断片に結合させた。この結合された断片が挿入された
クローンを工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し
た。

【００５２】（イ）寄託機関の名称・あて名名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便
番号３０５−８５６６）（ロ）寄託日（原寄託日）：平成１０年１２月１７日（ハ）寄託番号生命研条寄第6609号（FERM BP-6609）

【００５３】決定されたヒト「BG2」cDNAの塩基配列を
配列番号：21に、該cDNAがコードするタンパク質のアミ
ノ酸配列を配列番号：20に示す。

【００５４】ヒト「BG2」タンパク質は、公知のG蛋白質
共役型レセプター蛋白質であるヒト由来α-2C-1アドレ
ノセプター（Regan, J. W. et al., Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.85, 6301-6305(1988)）、マウス由来β-1アド
レノセプター（Jasper J. R. et al., Biochem. Biophy
s. Acta 1178, 307-309(1993)）、ヒト由来ムスカリン
性アセチルコリンレセプターM3（Peralta, E. G. et a
l., EMBO J. 6, 3923-3929(1987)）とそれぞれ32 %、28
%、27%のホモロジーを有していた。

【００５５】[実施例３] ノーザンブロット解析ヒト「BG2」の検出においては、プローブ4を^３２Pγ-dC
TP（Amersham,Prime It II）で標識し、cDNAプローブと
して用いた。また、ブロット膜としては、MTN（Human M
ultiple Tissue Northern）ブロット（クロンテック
社）を用いた。ExpressHyb solution（クロンテック
社）中で68℃で30分のプレハイブリダイゼーション後、
68℃で1時間プローブを膜にハイブリダイズさせた（最
終プローブ濃度は1.5x10^６cpm/ml）。0.1％SDSを含む2x
SSCで42℃で30分、そのブロットを洗浄し、最終的な洗
浄を0.1％SDSを含む0.1xSSCで50℃で30分行った。次い
で、そのブロットを-80℃で2.5日間、コダックのオート
ラジオグラフィックフィルムに暴露した。

【００５６】一方、マウスBG2の検出においては、プロ
ーブの調製は、ラット「BG2」cDNAを鋳型に、センスプ
ライマーMF2（配列番号：22／TGCATCCCATTGTACGTNCC）
およびアンチセンスプライマーMR1（配列番号：24／TGC
TCTGGGACACCATCTTC）を用いてPCRで増幅後、増幅産物を
アガロース電気泳動で精製し、上記ヒトと同様に標識す
ることにより調製した。

【００５７】また、ブロット膜としては、Rat MTN（Mul
tiple Tissue Northern）ブロット（クロンテック社）
を用いた。ハイブリダイゼーション緩衝液（50% ホルム
アミド, 4xSSPE, 1% SDS, 0.5% BLOTTO, 100μg/ml サ
ケ精子DNA）中で、42℃にて一晩のハイブリダイゼーシ
ョンを行った。洗浄は、0.1％SDSを含む0.1xSSCで65℃
で行った。次いで、そのブロットを-80℃で一晩、コダ
ックのオートラジオグラフィックフィルムに暴露した。
その結果、ヒトおよびラット由来の「BG2」遺伝子の発
現は、特に脳において強く検出された（図２）。

【００５８】[実施例４] In situハイブリダイゼーシ
ョン 13から18齢の成体雄Sprague-Dawley rats（Charles Riv
er Japan社）をエーテルの吸入により麻酔し、ロータリ
ーポンプに接続し、左心室に挿入したカニューレを通じ
て、冷却した4％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液
（pH7.2）中を注入した。灌流後、脳、脳下垂体、およ
び脊髄を取り出し、矢状方向にまたは冠状に切断した。
組織標本を4℃で夜通し、同様の固定剤で固定した。次
の過程はRNaseの混入を避けるため、注意して行った。
組織試料を常法にてパラフィンワックスで包埋し、回転
ミクロトーム（Model HM 355；MICROM Laborgerate Gmb
H）を用いて6μmの厚さのパラフィン切片を作製した。
切片はIn situハイブリダイゼーションを実施するまで-
20℃で無湿状態で保存した。

【００５９】ラットBG2センスおよびアンチセンスRNAプ
ローブの調製のために、センスプライマーMF2（配列番
号：22／TGCATCCCATTGTACGTNCC）およびアンチセンスプ
ライマーMR3（配列番号：23／ATCATTAGGAGCGTGTANGG）
を用いてMP21プラスミドDNAからPCR増幅したcDNA断片を
pZErO-2ベクター（インビトロジェン社）にクローニン
グした。RNAプローブは、DIG RNA Labeling Kit（ベー
リンガーマンハイム社）を用いてジギトキシゲニンで標
識した。パラフィン切片をキシレンで脱パラフィンし、
段階的エタノール系列で洗浄し、蒸留水に移した。ジギ
トキシゲニンで標識したRNAプローブを含まないIn situ
ハイブリダイゼーション試薬としては、Insitu Hybridi
zation Reagents（ISHR,Code No.316-01951;ニッポンジ
ーン社）を用いた。切片は緩衝液（PBS;ISHR1）を用い
て1分間と10分間の２回インキュベートした。切片を37
℃で10分間、プロティナーゼK（ISHR6）で処理した。氷
酢酸（ISHR4）を含むアセチル化緩衝液（ISHR3）を用い
てアセチル化を15分行い、次いで、PBS／グリシン緩衝
液（ISHR2）を用いて室温で20分のクエンチング後、4xS
SC（ISHR5）で10分間、２回洗浄し、次いで、PBS緩衝液
で10分間洗浄した。50％ホルムアミド／2xSSCを用いて
室温で30分のプレハイブリダイゼーション後、ジギトキ
シゲニンで標識したRNAプローブ（1μg/ml）を用いて42
℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。

【００６０】ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ホル
ムルムアミド／2xSSCを用いて42℃で10分間を２回行っ
た。それから切片を37℃で5分間、NET緩衝液（ISHR9）
で洗浄後、RNaseA（ISHR10）/NET緩衝液（ISHR9）を用
いて37℃で30分間、RNase処理を行った。0.1xSSC緩衝液
（ISHR11）で20分間、２回洗浄後、切片を移し、標識し
たジゴキシゲニンを、Digoxigenin Detection Kit（ベ
ーリンガーマンハイム社）を用いて検出した。切片を10
0mM Tris-HCl，150mM NaClを含む緩衝液（緩衝液1）で
室温で1分間洗浄し、室温下、ブロッキング試薬（緩衝
液2）で30分間インキュベートした。切片は、アルカリ
フォスファターゼ標識された抗ジゴキシゲニン抗体を用
いて室温で60分間インキュベートした。緩衝液1を用い
て15分間、緩衝液3を用いて2分間、室温で洗浄後、切片
を緩衝液3で希釈したNBT/Ｘリン酸溶液と室温で12から1
4時間インキュベートした。緩衝液4で洗浄後、切片はグ
リセロールまたはパーマウント（Permount）で封入し
た。

【００６１】その結果、図３および図４に示すように、
BG2 cDNAプローブは、海馬および脊髄で強くハイブリダ
イズした。ハイブリダイゼーションはまた、視床下部、
視床および小脳においても中程度のハイブリダイゼーシ
ョンシグナルが検出された。

【００６２】[実施例５] BG2発現細胞作製 BG2発現ベクターは、pIRESneoおよびpIREShyg（CLONTEC
H社）を利用して作製した。BG2遺伝子をクローン化しや
すいように、pIRESneoのネオマイシン耐性遺伝子を、pI
REShygのハイグロマイシン耐性遺伝子と置換したプラス
ミドを作製し、これにヒトBG2遺伝子をクローン化し、
発現ベクターとした。

【００６３】このヒトBG2発現ベクターを、CRE配列の下
流にベータラクタマーゼの遺伝子がつながった遺伝子を
持つHEK293細胞（Aurora社より購入）にリポフェクショ
ン法により遺伝子導入した。遺伝子導入にはLipofectam
ine PLUS reagent（GIBCO-BRL社）を用い、実験操作は
添付のマニュアルに従った。

【００６４】BG2発現細胞をハイグロマイシン添加培地
中に放置することにより選択し、ハイグロマイシン添加
培地で生育してきた細胞をBG2発現細胞としてファンク
ショナルアッセイに用いた。なお、BG2遺伝子の発現はR
T-PCR法により確認した。

【００６５】[実施例６] 細胞内cAMP濃度の測定細胞内cAMP濃度の測定は、Zlokarmikらの方法（Science
1998, vol.279, p.84）を用いた。Zlokarmikらの方法
は細胞内のcAMP濃度上昇に依存して下流遺伝子の転写活
性を上昇させる配列（CRE：cAMP responcible elemen
t）の下流にベータラクタマーゼ遺伝子をつないだ遺伝
子を導入し、この細胞内のcAMP濃度の変化により転写翻
訳されたベータラクタマーゼの活性を添加した蛍光基質
の蛍光変化を測定することにより細胞内cAMP濃度を測定
するものである。

【００６６】さらに７回膜貫通型レセプターにおける結
合Gタンパク質を介した細胞内cAMP濃度の減少を測定す
るため、フォルスコリンを添加して細胞内cAMP濃度に依
存したベータラクタマーゼ活性を上昇させ、リガンドが
作用した際のベータラクタマーゼ活性の減少から細胞内
cAMP濃度の減少を測定した。

【００６７】上記レポーター遺伝子とBG2レセプターを
発現させた細胞をPBS(-)緩衝液（GIBCO-BRL社）で2回洗
浄した後、Cell-dissociation buffer（GIBCO-BRL社）
を添加し、CO₂インキュベーター内で37度で3分間保温
し、培養フラスコを軽くたたいて細胞をフラスコから遊
離させた。遠心操作により細胞を回収後、0.1％BSA（シ
グマ社）を含むOpti-MEM培地（GIBCO-BRL社）に懸濁し
細胞数を測定し、8ｘ10⁴細胞/mlに調整した。

【００６８】あらかじめ、各種薬剤100μg/mlを含むDMS
O溶液1μlに、最終濃度0.5μＭになるようにフォルスコ
リン（シグマ社）を加えた0.1％BSA（シグマ社）を含む
Opti-MEM培地（GIBCO-BRL社）50μlを添加し反応溶液と
した。この反応溶液に上記の細胞数に調整した細胞を50
μl添加し反応を開始し、CO₂インキュベーター内で37度
で3時間保温した。

【００６９】つぎにAurora社から購入したキットを用い
てA液[1mM CCF2-AM / dry DMSO溶液]：12μl、Ｂ液[100
mg/ml Pluronic 127, 0.1% acetic acid in DMSO]：120
μｌ、Ｃ液[24% w/w PEG-400, 18% TR40, water])2mlの
割合で混ぜ色素導入緩衝液を調整し、上記反応液に色素
導入緩衝液20μlを添加・室温に１時間放置してベータ
ラクタマーゼの基質となる蛍光色素（CCF2-AM）を細胞
内に導入し、励起波長409nm、蛍光波長460nm(CCF分解
物)および530nm(CCF)を測定し、（EM460/EM530）を求め
ることにより細胞内cAMP濃度変化を測定した。

【００７０】各種薬剤を1μg/mlの濃度で被験したとこ
ろ、BG2発現細胞はヒスタミンによりコントロールの35
％（コントロールの比の値を100，フォルスコリン無し
の比の値を0とした場合）まで、EM460/EM530の比の値が
低下した。同様な現象はヒスタミンアナログアゴニスト
であるR(-)-α-メチルヒスタミン、イメティット（imet
it）及びN-α-メチルヒスタミンでも観察された（図
５）。すなわちBG2発現細胞ではヒスタミンにより細胞
内cAMP濃度が低下した。このヒスタミンによる細胞内cA
MP濃度低下現象はBG2発現細胞特異的な現象で、何も発
現させていないコントロールの細胞では観察されなかっ
た。

【００７１】また他の被験薬剤（ムスカリン性アセチル
コリンレセプターのアゴニストであるカルバコール、セ
ロトニンレセプターのアゴニストであるセロトニン、ド
ーパミンレセプターのアゴニストであるドーパミンな
ど）は、1μg/mlの薬剤濃度を用いても、細胞内cAMP濃
度の低下は観察されなかった。このことからBG2レセプ
ターはヒスタミンレセプターであることが示された。な
お、実験に用いた化合物を下記表１に示す。

【００７２】

【表１】

【００７３】[実施例７] ヒスタミン結合実験ヒスタミンアナログアゴニストである、R(-)-α-メチル
ヒスタミンを用いて、結合実験を行った。BG2レセプタ
ーを発現させた細胞をPBS(-)緩衝液（GIBCO-BRL社）で2
回洗浄した後、Cell-dissociation buffer（GIBCO-BRL
社）を添加し、CO ₂インキュベーター内で37度で3分間保
温し、培養フラスコを軽くたたいて細胞をフラスコから
遊離させた。遠心操作により細胞を回収後、アッセイバ
ッファー（Hanks' Balanced Salt Solution [GIBCO-BRL
社], 10mM Hepes [ナカライ社], 0.1% BSA [シグマ社],
pH7.4 [NaOHにより調整]）に懸濁し細胞数を測定し、
最終濃度0.6x10⁶細胞／ｍｌになるように調整した。細
胞を上記アッセイバッファー中で0.2nM R(-)-α-メチル
[イミダゾール-2,5(n)-3H]ヒスタミン（アマシャム社）
と37度で30分間保温し、あらかじめ0.5% ポリエチレン
イミン（和光社）で処理したUnifilter plate GF/B（パ
ッカード）で細胞を収集した。非特異的な細胞へのヒス
タミンアナログの結合は、２μＭ R(-)-α-メチルヒス
タミン（RBI社）共存下で測定した。その結果、BG2発現
細胞では、全結合:非特異的結合が4.4:1、BG2を発現し
ていないコントロールの細胞では、1.2:1で、非特異的
結合量は発現細胞でも、非発現細胞でもほとんど変わら
なかった。このことから、BG2レセプターは特異的に、
ヒスタミンアナログと結合することが示された。

【００７４】

【発明の効果】本発明により、脳に発現する新規なGタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質およびその遺伝子
が提供された。これにより該レセプタータンパク質を利
用したリガンドや医薬品の候補化合物のスクリーニング
が可能となった。これらリガンドや医薬品の候補化合物
は、例えば、本発明のGタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質を介したシグナル伝達系の異常などに起因する
疾患の診断や治療などへの利用が期待される。

【００７５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> BANYU PHARMACEUTICAL CO., LTD. 萬有製薬株式会社 <120> G PROTEIN-COUPLED RECEPTORS 新規なグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合タンパク質共役型のレセプタータンパク質 <130> B1-103 <140> <141> <150> World Intellectual Property Organization <151> PCT/JP98/05967 <160> 24 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 413 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 1 Met Glu Arg Ala Pro Pro Asp Gly Leu Met Asn Ala Ser Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Arg Gly Phe Ser Ala Ala 20 25 30 Trp Thr Ala Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Leu Leu Ile Val Ala Thr 35 40 45 Val Leu Gly Asn Ala Leu Val Met Leu Ala Phe Val Ala Asp Ser Ser 50 55 60 Leu Arg Thr Gln Asn Asn Phe Phe Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp 65 70 75 80 Phe Leu Val Gly Ala Phe Cys Ile Pro Leu Tyr Val Pro Tyr Val Leu 85 90 95 Thr Gly Arg Trp Thr Phe Gly Arg Gly Leu Cys Lys Leu Trp Leu Val 100 105 110 Val Asp Tyr Leu Leu Cys Ala Ser Ser Val Phe Asn Ile Val Leu Ile 115 120 125 Ser Tyr Asp Arg Phe Leu Ser Val Thr Arg Ala Val Ser Tyr Arg Ala 130 135 140 Gln Gln Gly Asp Thr Arg Arg Ala Val Arg Lys Met Ala Leu Val Trp 145 150 155 160 Val Leu Ala Phe Leu Leu Tyr Gly Pro Ala Ile Leu Ser Trp Glu Tyr 165 170 175 Leu Ser Gly Gly Ser Ser Ile Pro Glu Gly His Cys Tyr Ala Glu Phe 180 185 190 Phe Tyr Asn Trp Tyr Phe Leu Ile Thr Ala Ser Thr Leu Glu Phe Phe 195 200 205 Thr Pro Phe Leu Ser Val Thr Phe Phe Asn Leu Ser Ile Tyr Leu Asn 210 215 220 Ile Gln Arg Arg Thr Arg Leu Arg Leu Asp Gly Gly Arg Glu Ala Gly 225 230 235 240 Pro Glu Pro Pro Pro Asp Ala Gln Pro Ser Pro Pro Pro Ala Pro Pro 245 250 255 Ser Cys Trp Gly Cys Trp Pro Lys Gly His Gly Glu Ala Met Pro Leu 260 265 270 His Ser Ser Gly Ser Ser Ser Arg Gly Thr Glu Arg Pro Arg Ser Leu 275 280 285 Lys Arg Gly Ser Lys Pro Ser Ala Ser Ser Ala Ser Leu Glu Lys Arg 290 295 300 Met Lys Met Val Ser Gln Ser Ile Thr Gln Arg Phe Arg Leu Ser Arg 305 310 315 320 Asp Lys Lys Val Ala Lys Ser Leu Ala Ile Ile Val Ser Ile Phe Gly 325 330 335 Leu Cys Trp Ala Pro Tyr Thr Leu Leu Met Ile Ile Arg Ala Ala Cys 340 345 350 His Gly Arg Cys Ile Pro Asp Tyr Trp Tyr Glu Thr Ser Phe Trp Leu 355 360 365 Leu Trp Ala Asn Ser Ala Val Asn Pro Val Leu Tyr Pro Leu Cys His 370 375 380 Tyr Ser Phe Arg Arg Ala Phe Thr Lys Leu Leu Cys Pro Gln Lys Leu 385 390 395 400 Lys Val Gln Pro His Gly Ser Leu Glu Gln Cys Trp Lys 405 410 <210> 2 <211> 1239 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(1239) <400> 2 atg gag cgc gcg ccg ccc gac ggg ctg atg aac gcg tcg ggc act ctg 48 Met Glu Arg Ala Pro Pro Asp Gly Leu Met Asn Ala Ser Gly Thr Leu 1 5 10 15 gcc gga gag gcg gcg gct gca ggc ggg gcg cgc ggc ttc tcg gct gcc 96 Ala Gly Glu Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Arg Gly Phe Ser Ala Ala 20 25 30 tgg acc gct gtc ctg gct gcg ctc atg gcg ctg ctc atc gtg gcc aca 144 Trp Thr Ala Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Leu Leu Ile Val Ala Thr 35 40 45 gta ctg ggc aac gcg ctg gtc atg ctc gcc ttc gtg gcg gat tcg agc 192 Val Leu Gly Asn Ala Leu Val Met Leu Ala Phe Val Ala Asp Ser Ser 50 55 60 ctc cgc acc cag aac aac ttc ttt ctg ctc aac ctc gcc atc tcc gac 240 Leu Arg Thr Gln Asn Asn Phe Phe Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp 65 70 75 80 ttc ctc gtg ggt gcc ttc tgc atc cca ttg tac gta ccc tat gtg ctg 288 Phe Leu Val Gly Ala Phe Cys Ile Pro Leu Tyr Val Pro Tyr Val Leu 85 90 95 acc ggc cgt tgg acc ttc ggc cgg ggc ctc tgc aag ctg tgg ctg gtg 336 Thr Gly Arg Trp Thr Phe Gly Arg Gly Leu Cys Lys Leu Trp Leu Val 100 105 110 gta gac tac cta ctg tgt gcc tcc tcg gtc ttc aac atc gta ctc atc 384 Val Asp Tyr Leu Leu Cys Ala Ser Ser Val Phe Asn Ile Val Leu Ile 115 120 125 agc tat gac cga ttc ctg tca gtc act cga gct gtc tcc tac agg gcc 432 Ser Tyr Asp Arg Phe Leu Ser Val Thr Arg Ala Val Ser Tyr Arg Ala 130 135 140 cag cag ggg gac acg aga cgg gcc gtt cgg aag atg gca ctg gtg tgg 480 Gln Gln Gly Asp Thr Arg Arg Ala Val Arg Lys Met Ala Leu Val Trp 145 150 155 160 gtg ctg gcc ttc ctg ctg tat ggg cct gcc atc ctg agt tgg gag tac 528 Val Leu Ala Phe Leu Leu Tyr Gly Pro Ala Ile Leu Ser Trp Glu Tyr 165 170 175 ctg tct ggt ggc agt tcc atc ccc gag ggc cac tgc tat gct gag ttc 576 Leu Ser Gly Gly Ser Ser Ile Pro Glu Gly His Cys Tyr Ala Glu Phe 180 185 190 ttc tac aac tgg tac ttt ctc atc acg gcc tcc acc ctc gag ttc ttc 624 Phe Tyr Asn Trp Tyr Phe Leu Ile Thr Ala Ser Thr Leu Glu Phe Phe 195 200 205 acg ccc ttc ctc agc gtt acc ttc ttc aac ctc agc atc tac ctg aac 672 Thr Pro Phe Leu Ser Val Thr Phe Phe Asn Leu Ser Ile Tyr Leu Asn 210 215 220 atc cag agg cgc acc cgc ctt cgg ctt gat ggg ggc cgt gag gct ggc 720 Ile Gln Arg Arg Thr Arg Leu Arg Leu Asp Gly Gly Arg Glu Ala Gly 225 230 235 240 cca gaa ccc cca cca gat gcc cag ccc tcg cca cct cca gct ccc ccc 768 Pro Glu Pro Pro Pro Asp Ala Gln Pro Ser Pro Pro Pro Ala Pro Pro 245 250 255 agc tgc tgg ggc tgc tgg cca aaa ggg cat ggc gag gcc atg ccg ttg 816 Ser Cys Trp Gly Cys Trp Pro Lys Gly His Gly Glu Ala Met Pro Leu 260 265 270 cac agc tct ggc agc tcc tca agg ggc act gag agg cca cgc tca ctc 864 His Ser Ser Gly Ser Ser Ser Arg Gly Thr Glu Arg Pro Arg Ser Leu 275 280 285 aaa agg ggc tcc aag cca tca gca tct tca gca tcc ctg gag aag cgc 912 Lys Arg Gly Ser Lys Pro Ser Ala Ser Ser Ala Ser Leu Glu Lys Arg 290 295 300 atg aag atg gtg tcc cag agc atc acc cag cgc ttc cgg ctg tcg cgg 960 Met Lys Met Val Ser Gln Ser Ile Thr Gln Arg Phe Arg Leu Ser Arg 305 310 315 320 gac aag aag gtg gcc aag tcg ctg gcc atc atc gtg agc atc ttt ggg 1008 Asp Lys Lys Val Ala Lys Ser Leu Ala Ile Ile Val Ser Ile Phe Gly 325 330 335 ctc tgc tgg gcg ccg tac acg ctc cta atg atc atc cga gct gct tgc 1056 Leu Cys Trp Ala Pro Tyr Thr Leu Leu Met Ile Ile Arg Ala Ala Cys 340 345 350 cat ggc cgc tgc atc ccc gat tac tgg tac gag acg tcc ttc tgg ctt 1104 His Gly Arg Cys Ile Pro Asp Tyr Trp Tyr Glu Thr Ser Phe Trp Leu 355 360 365 ctg tgg gcc aac tcg gcc gtc aac ccc gtc ctc tac cca ctg tgc cac 1152 Leu Trp Ala Asn Ser Ala Val Asn Pro Val Leu Tyr Pro Leu Cys His 370 375 380 tac agc ttc cgc aga gcc ttc acc aag ctc ctc tgc ccc cag aag ctc 1200 Tyr Ser Phe Arg Arg Ala Phe Thr Lys Leu Leu Cys Pro Gln Lys Leu 385 390 395 400 aag gtc cag ccc cac ggc tcc ctg gag cag tgc tgg aag 1239 Lys Val Gln Pro His Gly Ser Leu Glu Gln Cys Trp Lys 405 410 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 3 batngccaac ctbkccttct c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 4 ccataaaagn nggggttgac 20 <210> 5 <211> 2700 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (351)..(1589) <400> 5 aattcggcac gagcgggcag atcgcggggc gcactcggtt gcgcgctgag ctaggggtgc 60 accgacgcac cgcgggcggc tggagctcgg ctttgctctc gctgcagcag ccgcgccgcc 120 cgccccactc cgctcagatt ccgacaccag ccccctctgg atcgccctcc tggactctag 180 cccgggctct tgctccgacc ccgcggacca tgctccgggc gccccccgga aaaccgggct 240 gggcgaagag ccggcaaaga ttaggctcac gagcgggggc cccacccggc cacccagctc 300 tccgcccgtg ccctgcccgg tgtccccgag ccgtgtgagc ctgctgggcc atg gag 356 Met Glu 1 cgc gcg ccg ccc gac ggg ctg atg aac gcg tcg ggc act ctg gcc gga 404 Arg Ala Pro Pro Asp Gly Leu Met Asn Ala Ser Gly Thr Leu Ala Gly 5 10 15 gag gcg gcg gct gca ggc ggg gcg cgc ggc ttc tcg gct gcc tgg acc 452 Glu Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Arg Gly Phe Ser Ala Ala Trp Thr 20 25 30 gct gtc ctg gct gcg ctc atg gcg ctg ctc atc gtg gcc aca gta ctg 500 Ala Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Leu Leu Ile Val Ala Thr Val Leu 35 40 45 50 ggc aac gcg ctg gtc atg ctc gcc ttc gtg gcg gat tcg agc ctc cgc 548 Gly Asn Ala Leu Val Met Leu Ala Phe Val Ala Asp Ser Ser Leu Arg 55 60 65 acc cag aac aac ttc ttt ctg ctc aac ctc gcc atc tcc gac ttc ctc 596 Thr Gln Asn Asn Phe Phe Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Phe Leu 70 75 80 gtg ggt gcc ttc tgc atc cca ttg tac gta ccc tat gtg ctg acc ggc 644 Val Gly Ala Phe Cys Ile Pro Leu Tyr Val Pro Tyr Val Leu Thr Gly 85 90 95 cgt tgg acc ttc ggc cgg ggc ctc tgc aag ctg tgg ctg gtg gta gac 692 Arg Trp Thr Phe Gly Arg Gly Leu Cys Lys Leu Trp Leu Val Val Asp 100 105 110 tac cta ctg tgt gcc tcc tcg gtc ttc aac atc gta ctc atc agc tat 740 Tyr Leu Leu Cys Ala Ser Ser Val Phe Asn Ile Val Leu Ile Ser Tyr 115 120 125 130 gac cga ttc ctg tca gtc act cga gct gtc tcc tac agg gcc cag cag 788 Asp Arg Phe Leu Ser Val Thr Arg Ala Val Ser Tyr Arg Ala Gln Gln 135 140 145 ggg gac acg aga cgg gcc gtt cgg aag atg gca ctg gtg tgg gtg ctg 836 Gly Asp Thr Arg Arg Ala Val Arg Lys Met Ala Leu Val Trp Val Leu 150 155 160 gcc ttc ctg ctg tat ggg cct gcc atc ctg agt tgg gag tac ctg tct 884 Ala Phe Leu Leu Tyr Gly Pro Ala Ile Leu Ser Trp Glu Tyr Leu Ser 165 170 175 ggt ggc agt tcc atc ccc gag ggc cac tgc tat gct gag ttc ttc tac 932 Gly Gly Ser Ser Ile Pro Glu Gly His Cys Tyr Ala Glu Phe Phe Tyr 180 185 190 aac tgg tac ttt ctc atc acg gcc tcc acc ctc gag ttc ttc acg ccc 980 Asn Trp Tyr Phe Leu Ile Thr Ala Ser Thr Leu Glu Phe Phe Thr Pro 195 200 205 210 ttc ctc agc gtt acc ttc ttc aac ctc agc atc tac ctg aac atc cag 1028 Phe Leu Ser Val Thr Phe Phe Asn Leu Ser Ile Tyr Leu Asn Ile Gln 215 220 225 agg cgc acc cgc ctt cgg ctt gat ggg ggc cgt gag gct ggc cca gaa 1076 Arg Arg Thr Arg Leu Arg Leu Asp Gly Gly Arg Glu Ala Gly Pro Glu 230 235 240 ccc cca cca gat gcc cag ccc tcg cca cct cca gct ccc ccc agc tgc 1124 Pro Pro Pro Asp Ala Gln Pro Ser Pro Pro Pro Ala Pro Pro Ser Cys 245 250 255 tgg ggc tgc tgg cca aaa ggg cat ggc gag gcc atg ccg ttg cac agc 1172 Trp Gly Cys Trp Pro Lys Gly His Gly Glu Ala Met Pro Leu His Ser 260 265 270 tct ggc agc tcc tca agg ggc act gag agg cca cgc tca ctc aaa agg 1220 Ser Gly Ser Ser Ser Arg Gly Thr Glu Arg Pro Arg Ser Leu Lys Arg 275 280 285 290 ggc tcc aag cca tca gca tct tca gca tcc ctg gag aag cgc atg aag 1268 Gly Ser Lys Pro Ser Ala Ser Ser Ala Ser Leu Glu Lys Arg Met Lys 295 300 305 atg gtg tcc cag agc atc acc cag cgc ttc cgg ctg tcg cgg gac aag 1316 Met Val Ser Gln Ser Ile Thr Gln Arg Phe Arg Leu Ser Arg Asp Lys 310 315 320 aag gtg gcc aag tcg ctg gcc atc atc gtg agc atc ttt ggg ctc tgc 1364 Lys Val Ala Lys Ser Leu Ala Ile Ile Val Ser Ile Phe Gly Leu Cys 325 330 335 tgg gcg ccg tac acg ctc cta atg atc atc cga gct gct tgc cat ggc 1412 Trp Ala Pro Tyr Thr Leu Leu Met Ile Ile Arg Ala Ala Cys His Gly 340 345 350 cgc tgc atc ccc gat tac tgg tac gag acg tcc ttc tgg ctt ctg tgg 1460 Arg Cys Ile Pro Asp Tyr Trp TyrGlu Thr Ser Phe Trp Leu Leu Trp 355 360 365 370 gcc aac tcg gcc gtc aac ccc gtc ctc tac cca ctg tgc cac tac agc 1508 Ala Asn Ser Ala Val Asn Pro Val Leu Tyr Pro Leu Cys His Tyr Ser 375 380 385 ttc cgc aga gcc ttc acc aag ctc ctc tgc ccc cag aag ctc aag gtc 1556 Phe Arg Arg Ala Phe Thr Lys Leu Leu Cys Pro Gln Lys Leu Lys Val 390 395 400 cag ccc cac ggc tcc ctg gag cag tgc tgg aag tgagcagctg ccccaccctt 1609 Gln Pro His Gly Ser Leu Glu Gln Cys Trp Lys 405 410 ctgaggccag gcccttgtac ttgtttgagt gggcagccgg agcgtgggcg gggccctggt 1669 ccatgctccg ctccaaatgc catggcggcc tcttagatca tcaaccccgc agtggggtag 1729 catggcaggt gggccaagag ccctagttgg tggagctaga gtgtgctggt tagctctgcc 1789 gccacattct ccttcaccac acagaagaga caatccagga gtcccaggca tgccttccac 1849 ctacacacac acacacacac acacacacac acacaccaca gtgcagtgcc agtgatgtcc 1909 ccttttgcat atttagtggt tggtgtcctc cctaatgcaa acctcggtgt gtgctcccgg 1969 ctccggccct ggcaatgcgt gcgtgcgccc tgcatgtgct cacacccgcc acacacccgc 2029 ccgccacaca cttgcaacac ctcctctctc ccagaagagc tggggacgat gccctttgct 2089 gccactgtct cttgcttaat cccagagcct ggctccttat cccccactct cccttcaact 2149 ctgccccaca aagtgtcgag cgcctcggga aacttgaagc ttctctgctc cttccactct 2209 ggatgttttc aggaagatgg aggagaagaa aacacgtctg tgaacttgat gttccttgga 2269 tgtttaatca agagagacaa aattgccgag gagctcgggg ctggattggc aggtgtgggc 2329 tcccacgccc tcctccctca gtgctgcagc ttccggctga gccgcgccag ctgcttctgc 2389 ctgccccgcc cccaggcttg ggacgatggc cctgccctgc ttgccccgtc tgtacaatca 2449 gaatttgggg gtgggtggtt atggggtaga gcggctcttc actgtgccct aaaggtcctg 2509 aggctcacag gacagtcagc aggagagcag gcaggcccgc gacacctggg aggaatgctt 2569 tgcctcgtcc tgtgtactca cctcaggctt ctgcatgctc tgctgccctt gtgccctggt 2629 gtgctgcctc tgccaatgtg aaaacacaat aaagtgtatt tttttacgga aaaaaaaana 2689 aaaaaaaaaa a 2700 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 6 cgaggatccg tgaggctccg gtgcccgtc 29 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 7 cgggtaagct tcacgacacc tgaaatggaa ga 32 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 8 ccttctgcat cccattgtac gtacc 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 9 cttccgccgg gccttcacca a 21 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 10 acagacacgg cggggctcac 20 <210> 11 <211> 1350 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> exon <222> (280)..(557) <400> 11 gcactcggct gcgcgttgcn tccggctgca cggtcgcacc ggcagcggct caggctccgg 60 ctcctctccc gctgcagcag ccgcgctgcc ggccccactg ggctcggatc cggccccggc 120 cccctcggca ccgcctgctc tggccccggc cccggccccg cggaccatgc gctgggcgcc 180 cccaggggaa cccgacccgg ccaagggccc gcaaagacga ggctcccggg ccggggcccc 240 tcccggccgc ccagctctcg gccggcgccc tgccccgcgt cccggagccg cgtgagcctg 300 cggggccatg gagcgcgcgc cgcccgacgg gccgctgaac gcttcggggg cgctggcggg 360 cgaggcggcg gcggcgggcg gggcgcgcgg cttctcggca gcctggaccg cggtgctggc 420 cgcgctcatg gcgctgctca tcgtggccac ggtgctgggc aacgcgctgg tcatgctcgc 480 cttcgtggcc gactcgagcc tccgcaccca gaacaacttc ttcctgctca acctcgccat 540 ctccgacttc ctcgtcggta aatccccagc ccctggccgc tggggaccca ggggcgccca 600 gcgtggccgg gccagcgggg actggaacac ggacctgggt ggctcccgca ggcacacgcc 660 ccaccagggg acccggcctg ggaagggggc gtccggagcc catggggtgg ggggcacagg 720 cgaagttcct tgccactcag gcctcgggac aggggctggg gagagatgtc cccgggaagg 780 gacacgggca ctgggcgagg cgcaaggcgc aaaggcagcg ggtgcagctc tggctcctgc 840 gctgtagcca aacaaaggct gctgcggact taggacgcgc ggagggcgca gtggggcggt 900 ttagagaagg tctgggggag gggacatgga agggggattt ttagagctgt gttgggggaa 960 gggacggtgg ggaaggtggg ggttggggga gacgctcgga ggagcgtgct ctcacgtgtc 1020 caggctctgc tgccggctgg ggggcggggc acgcggaggg ggctggagcg ccagacacct 1080 gttggggctg tgaggtgcgt ctcccagacg ctccaagccc gcttggcagt agtagtagcg 1140 gctggcggct ggcggctgca accaagtgcc ctttcagcca ggagaaaggc tttctccttg 1200 tctaagctga gaccgagggt tgtccagcgc cagggtaggg gctggagtcc agcgggggag 1260 gggagaagga aattgtcttc tttcctcctt tgagggctgg gagggctgga cagaagtcca 1320 gggaatcccg actccaggct ctcgggggtc 1350 <210> 12 <211> 448 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> exon <222> (259)..(425) <400> 12 gagctcccca tgcctggatc atccctcctg cccccaggcc caggggacac agatagtgct 60 gggagctatg tgggggtgaa ggctggcggc agggcagagt ttgtggctga caccaggtgg 120 aggggtggta agatgaggat ggctagttcc agaaaagcag ccaccatgtg accccaggtc 180 ccgccggtgt ctgcgcttag gtccgtctgt cccctggccc ctggctgcat ggtcccactg 240 tggccctact ccccacaggc gccttctgca tcccactgta tgtaccctac gtgctgacag 300 gccgctggac cttcggccgg ggcctctgca agctgtggct ggtagtggac tacctgctgt 360 gcacctcctc tgccttcaac atcgtgctca tcagctacga ccgcttcctg tcggtcaccc 420 gagcggtgag tcctgggctg cggagctc 448 <210> 13 <211> 1893 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> exon <222> (293)..(1209) <400> 13 gagctcacag ctggtagggg gtggtaaaca ggcagcctag cagagagtga gggttcaggt 60 tggtcccagg gagcttctga ggctctcact gagtgtggca gggcaccagt ccgggacccc 120 agtggggagg gttagaggaa gggaggggaa agagggaggg agggaggaca ggaggggaaa 180 ggaggagcat tgctgctgag ggaagggccc acataggggc ccacaggcta cgggggcgca 240 cccagcccaa tattccttcc gccccgcccc tgaccagcct gcccttctgc aggtctcata 300 ccgggcccag cagggtgaca cgcggcgggc agtgcggaag atgctgctgg tgtgggtgct 360 ggccttcctg ctgtacggac cagccatcct gagctgggag tacctgtccg ggggcagctc 420 catccccgag ggccactgct atgccgagtt cttctacaac tggtacttcc tcatcacggc 480 ttccaccctg gagttcttta cgcccttcct cagcgtcacc ttctttaacc tcagcatcta 540 cctgaacatc cagaggcgca cccgcctccg gctggatggg gctcgagagg cagccggccc 600 cgagccccct cccgaggccc agccctcacc acccccaccg cctggctgct ggggctgctg 660 gcagaagggg cacggggagg ccatgccgct gcacaggtat ggggtgggtg aggcggccgt 720 aggcgctgag gccggggagg cgaccctcgg gggtggcggt gggggcggct ccgtggcttc 780 acccacctcc agctccggca gctcctcgag gggcactgag aggccgcgct cactcaagag 840 gggctccaag ccatcggcgt cctcggcctc actggagaag cgcatgaaga tggtgtccca 900 gagcttcacc cagcgctttc ggctgtctcg ggacaggaaa gtggccaagt cgctggccgt 960 catcgtgagc atctttgggc tctgctgggc cccatacacg ctgctgatga tcatccgggc 1020 cgcctgccat ggccactgcg tccctgacta ctggtacgaa acctccttct ggctcctgtg 1080 ggccaactcg gctgtcaacc ctgtcctcta ccctctgtgc caccacagct tccgccgggc 1140 cttcaccaag ctgctctgcc cccagaagct caaaatccag ccccacagct ccctggagca 1200 ctgctggaag tgagtggccc accagagcct ccctcagcca cgcctctctc agcccaggtc 1260 tcctgggcat ctggccctgc tgccccctac ccggctcgtt cccccagggg tgagccccgc 1320 cgtgtctgtg gccctctctt aatgccacgg cagccaccct gccatggagg cgccttcctg 1380 ggttggccag agggcccctc actggctgga ctggaggctg ggtggccggc cctgcccccc 1440 acattctggc tccaccggga gggacagtct ggaggtccca gacatgctgc ccaccccctg 1500 ctggtgccca cccttcgcag ttactggttg gtgttcttcc caaagcaagc acctgggtgt 1560 gctccaggct tcctgcccta gcagtttgcc tctgcacgtg cacacacctg cacacccctg 1620 cacacacctg cacaccgtcc ctctccccgg acaagcccag gacactgcct ttgctgcctt 1680 ctgtctcttg cataagcctc aggcctggcc ctttcacccc tcttcccacc aactctctct 1740 gcccccaaaa gtgtcaaggg gccctaggaa cctcgaagct gttctctgct tttccattct 1800 gggtgttttc agaaagatga agaagaaaac atgtctgtga acttgatgtt cctgggatgt 1860 ttaatcaaga gagacaaaat tgctgaggag ctc 1893 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 14 tgaacgcttc gggggcgctg 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 15 gagatggcga ggttgagcag g 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 16 ggctccaagc catcggcgtc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 17 ctcacttcca gcagtgctcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 18 gcctccgcac ccagaacaac 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 19 tgcgcctctg gatgttcag 19 <210> 20 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Glu Arg Ala Pro Pro Asp Gly Pro Leu Asn Ala Ser Gly Ala Leu 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Arg Gly Phe Ser Ala Ala 20 25 30 Trp Thr Ala Val Leu Ala Ala Leu Met Ala Leu Leu Ile Val Ala Thr 35 40 45 Val Leu Gly Asn Ala Leu Val Met Leu Ala Phe Val Ala Asp Ser Ser 50 55 60 Leu Arg Thr Gln Asn Asn Phe Phe Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp 65 70 75 80 Phe Leu Val Gly Ala Phe Cys Ile Pro Leu Tyr Val Pro Tyr Val Leu 85 90 95 Thr Gly Arg Trp Thr Phe Gly Arg Gly Leu Cys Lys Leu Trp Leu Val 100 105 110 Val Asp Tyr Leu Leu Cys Thr Ser Ser Ala Phe Asn Ile Val Leu Ile 115 120 125 Ser Tyr Asp Arg Phe Leu Ser Val Thr Arg Ala Val Ser Tyr Arg Ala 130 135 140 Gln Gln Gly Asp Thr Arg Arg Ala Val Arg Lys Met Leu Leu Val Trp 145 150 155 160 Val Leu Ala Phe Leu Leu Tyr Gly Pro Ala Ile Leu Ser Trp Glu Tyr 165 170 175 Leu Ser Gly Gly Ser Ser Ile Pro Glu Gly His Cys Tyr Ala Glu Phe 180 185 190 Phe Tyr Asn Trp Tyr Phe Leu Ile Thr Ala Ser Thr Leu Glu Phe Phe 195 200 205 Thr Pro Phe Leu Ser Val Thr Phe Phe Asn Leu Ser Ile Tyr Leu Asn 210 215 220 Ile Gln Arg Arg Thr Arg Leu Arg Leu Asp Gly Ala Arg Glu Ala Ala 225 230 235 240 Gly Pro Glu Pro Pro Pro Glu Ala Gln Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro 245 250 255 Gly Cys Trp Gly Cys Trp Gln Lys Gly His Gly Glu Ala Met Pro Leu 260 265 270 His Arg Tyr Gly Val Gly Glu Ala Ala Val Gly Ala Glu Ala Gly Glu 275 280 285 Ala Thr Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Val Ala Ser Pro Thr 290 295 300 Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Arg Gly Thr Glu Arg Pro Arg Ser Leu 305 310 315 320 Lys Arg Gly Ser Lys Pro Ser Ala Ser Ser Ala Ser Leu Glu Lys Arg 325 330 335 Met Lys Met Val Ser Gln Ser Phe Thr Gln Arg Phe Arg Leu Ser Arg 340 345 350 Asp Arg Lys Val Ala Lys Ser Leu Ala Val Ile Val Ser Ile Phe Gly 355 360 365 Leu Cys Trp Ala Pro Tyr Thr Leu Leu Met Ile Ile Arg Ala Ala Cys 370 375 380 His Gly His Cys Val Pro Asp Tyr Trp Tyr Glu Thr Ser Phe Trp Leu 385 390 395 400 Leu Trp Ala Asn Ser Ala Val Asn Pro Val Leu Tyr Pro Leu Cys His 405 410 415 His Ser Phe Arg Arg Ala Phe Thr Lys Leu Leu Cys Pro Gln Lys Leu 420 425 430 Lys Ile Gln Pro His Ser Ser Leu Glu His Cys Trp Lys Lys Met Lys 435 440 445 Lys Lys Thr Cys Leu 450 <210> 21 <211> 2050 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (271)..(1629) <400> 21 agagatgtag ggcgcccctt ttagctgcgc acagaacgaa agaactcgtt ttttctttaa 60 gtgagtgtgc ttgggtgacg cttagggcgc cctccgcagt gcgcgcagga aagcgcactg 120 aggctgcgga ggcagagctg catgctgggt gcgggaagag gtgggctccg tcgcggagtc 180 gctgagtccg tgccctttta gttagttctg cagtctagta tggtccccat ttgcccttcc 240 actcccggag ccgcgtgagc ctgcggggcc atg gag cgc gcg ccg ccc gac ggg 294 Met Glu Arg Ala Pro Pro Asp Gly 1 5 ccg ctg aac gct tcg ggg gcg ctg gcg ggc gag gcg gcg gcg gcg ggc 342 Pro Leu Asn Ala Ser Gly Ala Leu Ala Gly Glu Ala Ala Ala Ala Gly 10 15 20 ggg gcg cgc ggc ttc tcg gca gcc tgg acc gcg gtg ctg gcc gcg ctc 390 Gly Ala Arg Gly Phe Ser Ala Ala Trp Thr Ala Val Leu Ala Ala Leu 25 30 35 40 atg gcg ctg ctc atc gtg gcc acg gtg ctg ggc aac gcg ctg gtc atg 438 Met Ala Leu Leu Ile Val Ala Thr Val Leu Gly Asn Ala Leu Val Met 45 50 55 ctc gcc ttc gtg gcc gac tcg agc ctc cgc acc cag aac aac ttc ttc 486 Leu Ala Phe Val Ala Asp Ser Ser Leu Arg Thr Gln Asn Asn Phe Phe 60 65 70 ctg ctc aac ctc gcc atc tcc gac ttc ctc gtc ggc gcc ttc tgc atc 534 Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Phe Leu Val Gly Ala Phe Cys Ile 75 80 85 cca ctg tat gta ccc tac gtg ctg aca ggc cgc tgg acc ttc ggc cgg 582 Pro Leu Tyr Val Pro Tyr Val Leu Thr Gly Arg Trp Thr Phe Gly Arg 90 95 100 ggc ctc tgc aag ctg tgg ctg gta gtg gac tac ctg ctg tgc acc tcc 630 Gly Leu Cys Lys Leu Trp Leu Val Val Asp Tyr Leu Leu Cys Thr Ser 105 110 115 120 tct gcc ttc aac atc gtg ctc atc agc tac gac cgc ttc ctg tcg gtc 678 Ser Ala Phe Asn Ile Val Leu Ile Ser Tyr Asp Arg Phe Leu Ser Val 125 130 135 acc cga gcg gtc tca tac cgg gcc cag cag ggt gac acg cgg cgg gca 726 Thr Arg Ala Val Ser Tyr Arg Ala Gln Gln Gly Asp Thr Arg Arg Ala 140 145 150 gtg cgg aag atg ctg ctg gtg tgg gtg ctg gcc ttc ctg ctg tac gga 774 Val Arg Lys Met Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Phe Leu Leu Tyr Gly 155 160 165 cca gcc atc ctg agc tgg gag tac ctg tcc ggg ggc agc tcc atc ccc 822 Pro Ala Ile Leu Ser Trp Glu Tyr Leu Ser Gly Gly Ser Ser Ile Pro 170 175 180 gag ggc cac tgc tat gcc gag ttc ttc tac aac tgg tac ttc ctc atc 870 Glu Gly His Cys Tyr Ala Glu Phe Phe Tyr Asn Trp Tyr Phe Leu Ile 185 190 195 200 acg gct tcc acc ctg gag ttc ttt acg ccc ttc ctc agc gtc acc ttc 918 Thr Ala Ser Thr Leu Glu Phe Phe Thr Pro Phe Leu Ser Val Thr Phe 205 210 215 ttt aac ctc agc atc tac ctg aac atc cag agg cgc acc cgc ctc cgg 966 Phe Asn Leu Ser Ile Tyr Leu Asn Ile Gln Arg Arg Thr Arg Leu Arg 220 225 230 ctg gat ggg gct cga gag gca gcc ggc ccc gag ccc cct ccc gag gcc 1014 Leu Asp Gly Ala Arg Glu Ala Ala Gly Pro Glu Pro Pro Pro Glu Ala 235 240 245 cag ccc tca cca ccc cca ccg cct ggc tgc tgg ggc tgc tgg cag aag 1062 Gln Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Gly Cys Trp Gly Cys Trp Gln Lys 250 255 260 ggg cac ggg gag gcc atg ccg ctg cac agg tat ggg gtg ggt gag gcg 1110 Gly His Gly Glu Ala Met Pro Leu His Arg Tyr Gly Val Gly Glu Ala 265 270 275 280 gcc gta ggc gct gag gcc ggg gag gcg acc ctc ggg ggt ggc ggt ggg 1158 Ala Val Gly Ala Glu Ala Gly Glu Ala Thr Leu Gly Gly Gly Gly Gly 285 290 295 ggc ggc tcc gtg gct tca ccc acc tcc agc tcc ggc agc tcc tcg agg 1206 Gly Gly Ser Val Ala Ser Pro Thr Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Arg 300 305 310 ggc act gag agg ccg cgc tca ctc aag agg ggc tcc aag ccg tcg gcg 1254 Gly Thr Glu Arg Pro Arg Ser Leu Lys Arg Gly Ser Lys Pro Ser Ala 315 320 325 tcc tcg gcc tcg ctg gag aag cgc atg aag atg gtg tcc cag agc ttc 1302 Ser Ser Ala Ser Leu Glu Lys Arg Met Lys Met Val Ser Gln Ser Phe 330 335 340 acc cag cgc ttt cgg ctg tct cgg gac agg aaa gtg gcc aag tcg ctg 1350 Thr Gln Arg Phe Arg Leu Ser Arg Asp Arg Lys Val Ala Lys Ser Leu 345 350 355 360 gcc gtc atc gtg agc atc ttt ggg ctc tgc tgg gcc cca tac acg ctg 1398 Ala Val Ile Val Ser Ile Phe Gly Leu Cys Trp Ala Pro Tyr Thr Leu 365 370 375 ctg atg atc atc cgg gcc gcc tgc cat ggc cac tgc gtc cct gac tac 1446 Leu Met Ile Ile Arg Ala Ala Cys His Gly His Cys Val Pro Asp Tyr 380 385 390 tgg tac gaa acc tcc ttc tgg ctc ctg tgg gcc aac tcg gct gtc aac 1494 Trp Tyr Glu Thr Ser Phe Trp Leu Leu Trp Ala Asn Ser Ala Val Asn 395 400 405 cct gtc ctc tac cct ctg tgc cac cac agc ttc cgc cgg gcc ttc acc 1542 Pro Val Leu Tyr Pro Leu Cys His His Ser Phe Arg Arg Ala Phe Thr 410 415 420 aag ctg ctc tgc ccc cag aag ctc aaa atc cag ccc cac agc tcc ctg 1590 Lys Leu Leu Cys Pro Gln Lys Leu Lys Ile Gln Pro His Ser Ser Leu 425 430 435 440 gag cac tgc tgg aaa aag atg aag aag aaa aca tgt ctg tgaacttgat 1639 Glu His Cys Trp Lys Lys Met Lys Lys Lys Thr Cys Leu 445 450 gttcctggga tgtttaatca agagagacaa aattgctgag gagctcaggg ctggattggc 1699 aggtgtgggc tcccacgccc tcctccctcc gctaaggctt ccggctgagc tgtgccagct 1759 gcttctgccc accccgcctc tgggctcaca ccagccctgg tggccaagcc tgccccggcc 1819 actctgtttg ctcacccagg acctctgggg gttgttggga ggagggggcc cggctgggcc 1879 cgagggtccc aaggcgtgca ggggcggtcc agaggaggtg cccgggcagg ggccgcttcg 1939 ccatgtgctg tgcacccgtg ccacgcgctc tgcatgctcc tctgcctgtg cccgctgcgc 1999 tgccctgcaa accgtgaggt cacaataaag tgtatttttt tattggtgct g 2050 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 22 tgcatcccat tgtacgtncc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 23 atcattagga gcgtgtangg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially synthesized primer sequence <400> 24 tgctctggga caccatcttc 20

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、マウス「BG2」タンパク質の疎水性
プロットを示す。図中の1乃至7の番号はGタンパク質共
役型レセプタータンパク質の特徴的な7つの疎水性領域
（膜貫通領域）を示す。また、図下の番号は「BG2」タ
ンパク質のアミノ酸の番号を示す。

【図２】図２は、ヒトおよびマウス「BG2」遺伝子の
発現の組織特異性をノーザンブロット解析した結果を示
す。

【図３】図３は、脳におけるマウス「BG2」遺伝子の
発現の局在をIn situハイブリダイゼーションにより解
析した結果を示す。

【図４】図４は、脊髄におけるマウス「BG2」遺伝子
の発現の局在をIn situハイブリダイゼーションにより
解析した結果を示す。「センス」はセンスRNAプローブ
（mRNAとハイブリダイズしない；ネガティブコントロー
ル）を用いてハイブリダイゼーションを行った結果、
「アンチセンス」はアンチセンスRNAプローブ（mRNAと
ハイブリダイズする）を用いてハイブリダイゼーション
を行った結果を示す。

【図５】各種薬剤をヒト「BG2」発現細胞に作用さ
せ、その後のcAMP濃度の変化を検出した結果を示す。ア
デニル酸サイクレースの活性化剤であるフォルスコリン
により、細胞内cAMP濃度を上昇させ（レーン：contro
l）、各種被験薬を作用させた場合の細胞内cAMP濃度の
変化をZlokarmikらの方法（Science 1998,vol.279, p.8
4）を用いて測定した（レーン：A1〜H10）。フォルスコ
リンを作用させない場合の細胞内cAMP濃度レベルは、レ
ーン：baseに示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者中村隆男茨城県つくば市大久保３番地萬有製薬株式会社つくば研究所内 (72)発明者小林正彦茨城県つくば市大久保３番地萬有製薬株式会社つくば研究所内 (72)発明者田中健一茨城県つくば市大久保３番地萬有製薬株式会社つくば研究所内 (72)発明者日高裕介茨城県つくば市大久保３番地萬有製薬株式会社つくば研究所内 (72)発明者太田雅貴茨城県つくば市大久保３番地萬有製薬株式会社つくば研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ
酸配列からなるグアノシン三リン酸結合タンパク質共役
型のレセプタータンパク質：（ａ）配列番号：２０に記載のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：２０に記載のアミノ酸配列において１
もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加した
アミノ酸配列。
【請求項２】ヒスタミンとの結合活性を有する、請求
項１に記載のタンパク質。
【請求項３】ヒスタミン刺激に応答して細胞内のcAMP
濃度またはカルシウム濃度を変化させる活性を有する、
請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】請求項１から３のいずれかに記載のレセ
プタータンパク質の部分ペプチド。
【請求項５】請求項１から３のいずれかに記載のレセ
プタータンパク質または請求項４に記載の部分ペプチド
をコードするDNA。
【請求項６】配列番号：２１に記載の塩基配列のコー
ド領域を含む請求項５に記載のDNA。
【請求項７】請求項５または６に記載のDNAを含有す
ることを特徴とするベクター。
【請求項８】請求項７に記載のベクターを保持する形
質転換体。
【請求項９】請求項８記載の形質転換体を培養する工
程を含む、請求項１から３のいずれかに記載のレセプタ
ータンパク質または請求項４に記載の部分ペプチドの製
造方法。
【請求項１０】請求項１から３のいずれかに記載のレ
セプタータンパク質に結合するリガンドまたはそのアナ
ログのスクリーニング方法であって、（ａ）請求項１か
ら３のいずれかに記載のレセプタータンパク質または請
求項４に記載の部分ペプチドに被検化合物を接触させる
工程、（ｂ）該タンパク質または部分ペプチドに結合す
る化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１１】請求項１から３のいずれかに記載のレ
セプタータンパク質とそのリガンドまたは該リガンドの
アナログとの結合を阻害する活性を有する化合物のスク
リーニング方法であって、（ａ）被検化合物の存在下で
請求項１から３のいずれかに記載のレセプタータンパク
質または請求項５に記載の部分ペプチドにリガンドまた
はそのアナログを接触させ、該タンパク質またはその部
分ペプチドとリガンドまたはそのアナログとの結合活性
を検出する工程、（ｂ）被検化合物非存在下での結合活
性と比較して、工程（ａ）で検出された結合活性を低下
させる化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１２】リガンドがヒスタミンである、請求項
１１に記載の方法。
【請求項１３】請求項１から３のいずれかに記載のレ
セプタータンパク質の活性を阻害または促進する化合物
をスクリーニングする方法であって、（ａ）被検化合物
の存在下で該タンパク質を発現する細胞に該タンパク質
のリガンドまたはそのアナログを接触させる工程、
（ｂ）該リガンドまたはそのアナログの該タンパク質へ
の結合による細胞における変化を検出する工程、（ｃ）
被検化合物非存在下での細胞における変化と比較して、
工程（ｂ）で検出された細胞における変化を抑制または
増強させる化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１４】リガンドがヒスタミンである、請求項
１３に記載の方法。
【請求項１５】検出する細胞における変化が、cAMP濃
度の変化、カルシウム濃度の変化、Ｇタンパク質の活性
化、ホスホリパーゼＣの活性化、およびｐＨの変化から
なる群より選択される、請求項１３または１４に記載の
方法。
【請求項１６】請求項１から３のいずれかに記載のレ
セプタータンパク質または請求項４に記載の部分ペプチ
ドを含有することを特徴とする、請求項１０から１５の
いずれかのスクリーニングのためのキット。
【請求項１７】請求項１から４のいずれかに記載のレ
セプタータンパク質に結合する抗体。
【請求項１８】請求項１１から１５のいずれかに記載
のスクリーニングにより単離される化合物。
【請求項１９】請求項１８に記載の化合物を有効成分
とする医薬組成物。