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JP2976381B2 - 細胞間粘着分子およびその結合性リガンド - Google Patents

細胞間粘着分子およびその結合性リガンド

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JP2976381B2
JP2976381B2 JP1510885A JP51088589A JP2976381B2 JP 2976381 B2 JP2976381 B2 JP 2976381B2 JP 1510885 A JP1510885 A JP 1510885A JP 51088589 A JP51088589 A JP 51088589A JP 2976381 B2 JP2976381 B2 JP 2976381B2
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cell
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Dana Farber Cancer Institute Inc
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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願に関する記述 本出願は米国特許出願第07/045,963号（1987年５月４
日出願）、第07/115,798号（1987年11月２日出願）、第
07/155,943号（1988年２月16日出願）、第07/189,815号
（1988年５月３日出願）、第07/250,446号（1988年９月
28日出願）および第07/324,481号（1989年３月16日出
願）の一部継続出願である。本出願は米国政府の支持下
に一部なされた。米国政府は本発明においてある種の権
利を有する。
産業上の利用分野 本発明はリンパ球の群が細胞基質を認識しそれに付着
して炎症反応中に炎症部位に浸透し細胞と反応する過程
で含まれる。ICAM−１のような細胞間粘着分子に関す
る。本発明はさらにそのような細胞間粘着分子に結合し
得るリガンド分子、これらリガンドのスクリーニングア
ッセイ、および該細胞間粘着分子、該リガンド分子およ
び該スクリーニングアッセイの使用に関する。
従来技術 白血球はホストをバクテリアまたはウイルスのような
外敵に対して適切に防御するために細胞基質に付着し得
なければならない。防御システムの優れた見解はEisen,
H.W.により“Micro−biology,第３版、ペンシルバニア
州フィラデルフィア、Harpe ＆ Rows社刊、（1980）、2
90−295および381−418"において提示されている。白血
球は内皮細胞に結合できて循環系から進行中の炎症部位
に浸透できなければならない。さらにまた、白血球は抗
原提供細胞に付着して正常な特異的免疫応答が起り得ね
ばならず、さらに、リンパ球は、適当なターゲット細胞
に付着してウイルス感染または腫瘍細胞の分解が起り得
ねばならない。
最近、そのような付着の仲介において含まれる白血球
表面分子がハイブリドーマ技術を用いて同定された。要
するに、ヒトＴ−細胞（Davignon.D.等、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 78:4535−4538（1981）〕とマウスひ臓細胞
〔Springer,T.等、Eur.J.Immunol. ９:301−306（197
9）〕対して向けられた各モノクローナル抗体は白血球
表面に結合し、上述の付着関連機能を抑制しているもの
と同定された〔Springer.T.等、Fed.Proc. 44:2660−2
663（1985）〕。これらの抗体により同定された分子はM
ac−１およびリンパ球機能会合抗原１（LFA−１）と称
される。Mac−１はマクロファージ、顆粒球および顆粒
状リンパ球上に見い出されたヘテロダイマーである。LF
A−１は大部分のリンパ球に見い出されるヘテロダイマ
ーである〔Springer.T.A.等、Immunol.Rev．68:111−13
5（1982）〕。これらの２つの分子、および第３分子p15
0、95（これらはMac−１と同様な組織分布を有する）は
細胞粘着においてある役割を発揮する〔Keizer,G.等、E
ur.J.Immunol. 15:1142−1147（1985）〕。
上記の白血球分子は糖たん白質の関連群の１員である
ことを見い出された〔Sanchez−Madrid,F.等、J.Exper.
Med. 158:1785−1803（1983）;Keizer,G.D.等、Eur.J.
Immunol. 15:1142−1147（1985）〕。この糖たん白質
群は１つのアルファー鎖と１つのベータ鎖を有するヘテ
ロダイマーからなっている。抗原の各々のアルファー鎖
は互いに異なるけれども、ベータ鎖は高度に保護されて
いることが判明している〔Sanchez−Madrid,F.等、J.Ex
per.Med. 158:1785−1803（1983）〕。糖たん白質群の
ベータ鎖（ある場合には“CD18"と称す）は95KDの分子
量を有することが見い出され、一方アルファー鎖は150K
D−180KDで変化することが見い出された〔Springer,T.
等、Fed.Proc. 44:2660−2663（1985）〕。膜たん白質
のアルファーサブユニットはベータサブユニットの有す
る広い相同性を有していないけれども、糖たん白質のア
ルファーサブユニットの近似分析は両者の間に実質的な
類似性があることを示している。LFA−１関連糖たん白
質のアルファーおよびベータサブユニット間の類似性の
検討はSanchez−Madrid,F.等によりなされている。〔J.
Exper.Med. 158:586−602（1983）；J.Exper.Med.185:
1785−1803（1983）〕。
白血球表面上に上記粘着たん白質群のいずれかの１員
の正常量を発現することができない１群の人々が同定さ
れている〔Anderson,D.C.等、Fed.Proc. 44:2671−267
7（1985）;Anderson,D.C.等、J.Infect.Dis.,152:668−
689（1985）〕。これらの患者のリンパ球は分子のLFA−
１群が抗体により中和されている健常者に類似するイン
ビボ欠陥を示していた。さらにまた、上記の患者等は、
彼らの細胞が細胞基質へ粘着できないために、正常な免
疫応答を測定することができない〔Anderson,D.C.等、F
ed.Proc. 44:2671−2677（1985）;Anderson,D.C.等、
J.Infect.Dis.,152−668−689（1985）〕。これらのデ
ータはリンパ球がLFA−１群の機能的粘着分子の欠如に
より正常な形で粘着できない場合に免疫反応が緩和され
ることを示している。
即ち、要約すれば、動物の健康および生命力を維持す
るリンパ球の能力はリンパ球が他の細胞（内皮細胞のよ
うな）に粘着できることを必要とする。この粘着はリン
パ球の細胞表面上に存在する特異的レセプター分子を含
む細胞−細胞接触を必要とすることが判明している。こ
れらのレセプターはリンパ球が他のリンパ球または内皮
および他の非血管細胞に粘着することを可能とする。細
胞表面レセプター分子は相互に高度に関連することが判
明している。リンパ球が上記の細胞表面レセプター分子
を欠損しているヒトは慢性で再発性の感染症、および欠
陥抗体応答を含む他の臨床的症状を示す。
リンパ球粘着は外来組織が認識され拒絶される過程で
起るので、この過程の理解が臓器移植、組織移植、アレ
ルギーおよび腫瘍学の分野において著しく価値がある。
発明の内容 本発明は細胞間粘着分子−１（ICAM−１）およびその
官能性誘導体に関する。本発明はさらにICAM−１の機能
を抑制し得る抗体および抗体フラグメント、およびICAM
−１機能に対する他のインヒビター、並びにそのような
インヒビターを同定し得るアッセイに関する。本発明は
さらに上記分子すべての診断および治療上の用途に関す
る。
さらに詳細には、本発明は実質的に天然不純物を含ま
ない細胞間粘着分子ICAM−１またはその官能性誘導体を
包含する。本発明はさらにリンパ球表面に存在する分子
に結合し得るそのような分子に関する。
本発明はさらに検出可能に標識した細胞間粘着分子IC
AM−１およびその誘導体に関する。
本発明はさらにICAM−１またはその官能性誘導体を発
現し得る組換えDNA分子を包含する。
本発明はまた次の各工程を含む実質的に純粋な形でIC
AM−１を回収する方法を包含する： （ａ） ICAM−１を発現する細胞膜からICAM−１を可溶
化して、可溶化ICAM−１調製物を調製すること、 （ｂ） 上記可溶化ICAM−１調製物をICAM−１に結合し
得る抗体を含有するアフィニティマトリックスに導入す
ること、 （ｃ） ICAM−１を上記アフィニティマトリックスの抗
体に結合させること、 （ｄ） 上記マトリックスから抗体に結合し得ないすべ
ての化合物を除去すること、および （ｅ） ICAM−１を上記マトリックスから溶出させるこ
とによりICAM−１を実質的に純粋な形で回収すること。
本発明はさらにICAM−１およびICAM−１の官能性誘導
体からなる群から選ばれた分子に結合し得る抗体を包含
する。本発明はまたそのような抗体を産生し得るハイブ
リドーマ細胞を包含する。
本発明はさらにモノクローナル抗体R6−５−D6を産生
し得るハイブリドーマ細胞を包含する。
本発明は、さらに、次の工程を含む、ICAM−１に結合
し得る抗体を産生する所望のハイブリドーマ細胞の産生
方法も包含する。
（ａ） 動物をICAM−１を発現する細胞で免疫するこ
と、 （ｂ） 上記動物のひ臓細胞をミエローマ細胞系と融合
させること、 （ｃ） 融合させたひ臓およびミエローマ細胞から抗体
分泌性ハイブリドーマ細胞を調製すること、および （ｄ） ハイブリドーマ細胞を所望のICAM−１結合性抗
体を産生し得るハイブリドーマ細胞にスクリーニングす
ること。
本発明はまた上記方法で取得したハイブリドーマ細胞
およびそのハイブリドーマ細胞から産生させた抗体も包
含する。
本発明はまた細胞間粘着の非免疫グロブリンアンタゴ
ニストの同定方法にも関し、その方法は次の工程よりな
る： （ａ） 細胞間粘着のアンタゴニストであり得る非免疫
グロブリン剤を凝集可能な複数の細胞を含有するリンパ
球調製物とインキュベートすること；および （ｂ） 上記リンパ球調製物を検査して上記非免疫グロ
ブリン剤の存在がリンパ球調製物の細胞凝集を抑制する
かどうかを測定すること；凝集抑制が上記非免疫グロブ
リン剤を細胞間粘着のアンタゴニストとして同定するこ
と。
本発明はまた哺乳動物の特異的防御システムの応答に
由来する炎症を治療する方法にも関し、その方法はその
ような治療の必要な対象物に上記炎症を抑制するのに十
分な量の抗炎症剤を与えることを含み、かつこの抗炎症
剤はICAM−１に結合し得る抗体、ICAM−１に結合し得る
抗体のフラグメント、ICAM−１、ICAM−１の官能性誘導
体、およびICAM−１の非免疫グロブリンアンタゴニスト
からなる群より選ばれる。
本発明はさらにICAM−１の非免疫グロブリンアンタゴ
ニストがLFA−１以外のICAM−１の非免疫グロブリンア
ンタゴニストである上述の炎症治療方法を包含する。
本発明はまた浸透にLFA−１群の官能性一員を必要と
する造血腫瘍細胞の転移を抑制する方法にも関し、この
方法はそのような治療を必要とする患者に上記の転移を
抑制するのに十分な量の抗炎症剤を与えることを含み、
かつこの抗炎症剤はICAM−１に結合し得る抗体、ICAM−
１に結合し得る抗体のフラグメント、ICAM−１、ICAM−
１の官能性誘導体、およびICAM−１の非免疫グロブリン
アンタゴニストからなる群より選ばれる。
本発明はさらにICAM−１の非免疫グロブリンアンタゴ
ニストがLFA−１以外のICAM−１の非免疫グロブリンア
ンタゴニストである上記の造血腫瘍細胞の転移を抑制す
る方法も包含する。
本発明はまたICAM−１発現腫瘍細胞の成長を抑制する
方法も包含し、その方法はそのような治療を必要とする
患者に上記成長を抑制するのに十分な量の毒素を与える
ことを含み、この毒素はICAM−１に結合し得る毒素由来
抗体、ICAM−１に結合に得る毒素由来抗体フラグメン
ト、LFA−１群分子の毒素由来１員、およびLFA−１群分
子の１員の毒素由来官能性誘導体からなる群から選ばれ
る。
本発明はまたLFA−１発現性腫瘍細胞の成長を抑制す
る方法にも関し、その方法はそのような治療を必要とす
る患者にかかる成長を抑制するのに十分な量の毒素を与
えることを含み、この毒素は毒素由来ICAM−１およびIC
AM−１の毒素由来官能性誘導体からなる群から選ばれ
る。
本発明はさらに炎症を有する懸念のある哺乳動物対象
体の特異的防御系の応答に由来する炎症の存在および位
置を診断する方法に関し、その方法は、 （ａ） 上記の対象体にICAM−１を発現する細胞を同定
し得る検出可能に標識した結合性リガンドを含有する組
成物を投与すること、および （ｂ） 上記結合性リガンドを検出すること、 を含む。
本発明はさらに炎症を有する懸念のある哺乳動物対象
体の特異的防御系の応答に由来する炎症の存在および位
置を診断する方法に関し、その方法は、 （ａ） 上記対象体の組織のサンプルをICAM−１を発現
する細胞を同定し得る検出可能に標識した結合性リガン
ドを含有する組成物とインキュベートすること、および （ｂ） 上記結合性リガンドを検出すること、 を含む。
本発明はまたICAM−１発現性腫瘍細胞を有する懸念の
ある哺乳動物対象体のそのような細胞の存在および位置
を診断する方法にも関し、その方法は、 （ａ） 上記対象体にICAM−１に結合し得る検出可能に
標識した結合性リガンドを含有する組成物を投与するこ
と、このリガンは抗体およびICAM−１に結合し得る抗体
フラグメントからなる群より選ばれること、および （ｂ） 上記結合性リガンドを検出すること、 を含む。
本発明はまたICAM−１発現性腫瘍細胞を有する懸念の
ある哺乳動物対象体のそのような細胞の存在および位置
を診断する方法にも関し、その方法は、 （ａ） 上記対象体の標識のサンブルをICAM−１に結合
し得る検出可能に標識した結合性リガンドを含有する組
成物とインキュベートすること、このリガンドが抗体お
よびICAM−１に結合し得る抗体フラグメントからなる群
より選ばれること、および、 （ｂ） 上記結合性リガンドを検出すること、 を含む。
本発明はまたLFA−１群分子の１員を発現する腫瘍細
胞を有する懸念のある対象体のそのような細胞の存在お
よび位置を診断する方法にも関し、その方法は、 （ａ） 上記対象体にLFA−１群分子の１員に結合し得
る検出可能に標識した結合性リガンドを含有する組成物
を投与すること、このリガンドはICAM−１およびICAM−
１の官能性誘導体からなる群より選ばれること、および （ｂ） 上記結合性リガンドを検出すること、 を含む。
本発明はまたLFA−１群分子の１員を発現する腫瘍細
胞を有する懸念のある対象体のそのような細胞の存在お
よび位置を診断する方法にも関し、その方法は、 （ａ） 上記対象体の組織のサンプルを分子のLFA−１
群の１員に結合し得る検出可能に標識した結合性リガン
ドに存在下にインキュベートすること、このリガンドは
ICAM−１およびICAM−１の官能性誘導体からなる群より
選ばれること、および （ｂ） 上記組織サンプル中に存在する分子のLFA−１
群の１員に結合している上記結合性リガンドを検出する
こと、 を含む。
本発明は、さらに、 （ａ） ICAM−１に結合し得る抗体、ICAM−１に結合し
得る抗体のフラグメント、ICAM−１、ICAM−１の官能性
フラグメント、およびICAM−１の非免疫グロブリンアン
タゴニストからなる群より選ばれた抗炎症剤、および （ｂ） デクサメゾン、アザチオピリンおよびシクロス
ポリンＡから選ばれた少なくとも１つの免疫抑制剤。
を含む製薬組成物も包含する。
図面の簡単な説明 第１図は正常細胞とLFA−１欠損細胞間の粘着を図式
的に示す。
第２図は正常細胞／正常細胞粘着過程を図式的に示
す。
第３図は50ng/mのPMAの不存在（×）または存在
（○）下の細胞凝集の動力学を示す。
第４図はLFA−1-細胞とLFA−1+細胞間の凝集を示す。
図中に示すようにカルボキシフルオレスセインジアセテ
ート標識EBV−形質転換細胞（104）を105未標識同元細
胞（黒枠）またはJY細胞（白枠）とPMAの存在下に混合
した。1.5時間後、凝集物中または遊離の標識細胞を実
施例２の定量アッセイを用いて計数した。凝集物中の標
識細胞の％を示す。２つの内の１つの代表的な試験を示
している。
第５図はJY細胞からのICAM−１とLFA−１の免疫沈降
を示す。JY細胞のトリトンＸ−100溶解物（レーン１お
よび２）または対照溶解バッファー（レーン３および
４）をICAM−１に結合し得る抗体（レーン１および３）
またはLFA−１に結合し得る抗体（レーン２および４）
で免疫沈降させた。パネルＡは還元条件下での結果を示
し、パネルＢは非還元条件下で得られた結果を示す。分
子量標準物はレーンＳに示した。
第６図はヒト皮ふ繊維芽細胞上のICAM−１発現に対し
てのLFA−１とガンマーインターフェロンの効果の動力
学を示す。ヒト皮ふ繊維芽細胞は８×104細胞/0.32cm2
ウェルの密度に増殖させた。IL−１（10μ/m、黒丸）
または組換えガンマーインターフェロン（10μ/m、白
四角）を加え、図中に示した時間で、４℃に冷却し間接
結合アッセイを実施した。標準偏差は10％を越えなかっ
た。
第７図はICAM−１へのIL−１とガンマーインターフェ
ロン効果の濃度依存性を示す。ヒト皮ふ繊維芽細胞は８
×104細胞/0.32cm2ウェルの密度に増殖させた。IL−２
（白丸）、組換えヒトIL−１（白四角）、組換マウスIL
−１（黒四角）および組換えベータインターフェロン
（白三角）を図中に示した希釈率で４時間（IL−１）ま
たは16時間（ベータおよびガンマーインターフェロン）
インキュベートした。示した結果は４回測定の平均を示
し、標準偏差は10％を越えなかった。
第８図はICAM−1cDNAのヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を示す。第1ATGは位置58にある。ICAM−１トリプシ
ンペプチドに相当する翻訳配列はアンダーラインを施し
てある。疎水性推定シグナルペプチドおよびトランスメ
ンブラン配列は肉太アンダーラインを施している。Ｎ−
結合グリコシル化部位は囲っている。位置2976のポリア
デニル化シグナルAATAAAはオーバーラインを施してい
る。図示した配列はHL−60cDNAクローン用である。内皮
細胞cDNAはその長さの大部分に亘ってシーケンシングし
小さな差異のみを示した。
第９図はICAM−１相同ドメインおよび免疫グロブリン
超遺伝子群への相関を示す。（Ａ）５つの相同ドメイン
の配列（D1-5）：列んだ２以上の同じ残基は囲ってい
る。NCAMドメインに２回以上含まれる残基、およびセッ
トC2およびC1のドメイン中に含まれる残基はICAM−１内
部繰返しによって配列している。ICAM−１のドメイン中
の予想βストライドの位置は棒線および配列上の小文字
でマークしており、また免疫グロブリンｃドメイン中の
β−ストランドの公知の位置は棒線および配列下の大文
字でマークしている。ICAM−１ドメイン内の推定ジスル
フィド架橋の位置はＳ−Ｓによって記している。ICAM−
１に相同性のたん白質ドメインの（Ｂ−Ｄ）配列：各た
ん白質はFASTPプログラムを用いてNBRFデータベースを
調査することによって先ず配列する。各たん白質配列は
MAG、NCAN、Ｔ細胞レセプターαサブユニットＶドメイ
ン、IgMμ鎖およびα−１−Ｂ糖たん白質である。
第10図はICAM−１とMAGの二次構造の比較図である。
第11図は平坦膜中でICAM−１に結合しているLFA−１
陽性EBV−形質転換Ｂ−リンパ芽球腫（lymphoblastoi
d）細胞を示す。
第12図はプラスチック結合ベシクル中のICAM−１に結
合しているLFA−１陽性Ｔ−リンパ芽球およびＴ−リン
パ球を示す。
第13図はプラスチック結合ベシクル中のICAM−１に結
合しているJY Ｂ−リンパ芽球腫の細胞またはベシクル
のモノクローナル抗体による前処理による結合抑制を示
す。
第14図はプラスチック結合ベシクル中のICAM−１への
Ｔ−リンパ芽球の結合に対しての温度の効果を示す。
第15図はプラスチック結合ベシクル中のICAM−１への
Ｔ−リンパ芽球の結合における二価のカチオンの必要性
を示す。
第16図は末梢血液単核細胞がＴ−細胞会合抗原OKT3の
認識に応答して増殖する能力に及ぼす抗粘着性抗体の効
果を示す。“OKT3"は抗原の添加を示す。
第17図は、末梢血液単核細胞が、非特異的Ｔ−細胞分
裂促進物質である、コンカナバリンＡの認識に応答して
増殖する能力に及ぼす抗粘着性抗体の効果を示す。“CO
NA"はコンカナバリンＡの添加を示す。
第18図は、末梢血液単核細胞が、鍵穴カサガイヘモシ
アニン（keyhole limpet hemocyanin）抗原の認識に応
答して増殖する能力に及ぼす抗粘着性抗体の効果を示
す。“KLH"は、鍵穴カサガイヘモシアニンの、細胞への
添加を示している。
第19図は末梢血液単核細胞が、破傷風菌トキソイド抗
原の認識に応答して増殖する能力に及ぼす抗粘着性抗体
の効果を示す。“AGN"は破傷風菌トキソイド抗原の、細
胞への添加を示す。
第20図はICAM−１欠落変異体へのモノクローナル抗体
RR1/1、R6.5、LB2、およびCL203の結合を示す。
第21図はICAM−１欠落変異体のLFA−１への結合を示
す。
第22図は抗ICAM−１モノクローナル抗体RR1/1、R6.
5、LB2、およびCL203により認識したエピトープを示
す。
第23図はLFA−１へのICAM−１ドメイン２変異体の結
合能力を示す。
第24図はLFA−１へのICAM−１ドメイン３変異体の結
合能力を示す。
第25図はLFA−１へのICAM−１ドメイン１変異体の結
合能力を示す。
第26図はICAMアミノ末端ドメインの配列を示す。
好ましい実施態様 本発明の１つの局面はLFA−１に対しての天然結合性
リガンドの発見に関する。LFA−１群分子のような分子
は、細胞間粘着の過程に含まれており、“粘着分子”と
称されている。
本発明の天然結合性リガンドは“細胞間粘着分子−１
（Intercellular Adhesion Molecule−１）”または“I
CAM−1"と表示される。ICAM−１は76−97kdの糖たん白
質である。ICAM−１はヘテロダイマーではない。本発明
はICAM−１およびその“官能性誘導体”に関する。ICAM
−１の“官能性誘導体”はICAM−１の生物学的活性に実
質的に同様な生物学的活性（機能的または構造的に）を
有する化合物である。“官能性誘導体”なる用語は分子
の“フラグメント”、“変異体”、“同族体”または
“化学誘導体”を包含するものとする。ICAM−１のよう
な分子の“フラグメント”は分子の任意のポリペプチド
サブセットを意味する。ICAM−１活性を有しかつ可溶性
（即ち、膜結合していない）であるICAM−１のフラグメ
ントは特に好ましい。ICAM−１のような分子の“変異
体”とは全分子またはそのフラグメントと構造上または
機能上実質的に同様である分子を称する。分子は他の分
子と両分子が実質的に同様な構造を有するかあるいは両
分子が同様に生物学的活性を有する場合に“実質的に同
様”と称される。即ち、２つの分子が同様な活性を有す
る場合、これらの分子は変異体であるとみなされ、該用
語は本明細書において分子の１つの構造が他の分子中に
見い出されない場合あるいはアミノ酸残基配列が同じで
ない場合でも使用される。ICAM−１のような分子の“ア
ナログ”、つまり“同族体”とは分子全体またはそのフ
ラグメントに対し機能上実質的に同様である分子を称す
る。本明細書で使用するとき、分子が通常分子の１部で
ない追加の化学的成分を含む場合、その分子は他の分子
の“化学的誘導体”であると称する。そのような成分は
分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期等を改善し得
る。これらの成分はまた分子の毒性を低減させ、分子の
望ましくない副作用等を消去または減衰させる。そのよ
うな作用を緩和させ得る成分は“Remington's Pharmace
utical Sciences（1980）”に記載されている。“毒素
由来”分子は“化学誘導体”の特別のクラスを構成して
いる。“毒素由来”分子は毒素成分を有する分子（ICAM
−１または抗体のような）である。そのような分子の細
胞への結合は細胞の極く近くに毒素成分を運びそれによ
って細胞死を促進する。任意の適当な毒素成分を使用で
きるが、例えば、リシン毒素、ジフテリア毒素、ラジオ
イソトープ毒素、膜−チャンネル形成性毒素等の毒素を
用いることが好ましい。そのような成分を分子に結合さ
せる方法は当該技術において周知である。
ICAM−１またはLFA−１群分子の１員のような抗原性
分子はリンパ球表面に天然に発現している。即ち、その
ような細胞の適当な動物への腹腔内注射等によるような
導入はICAM−１またはLFA−１群分子の１員に結合し得
る抗体の産生をもたらすであろう。場合によっては、そ
のような動物の血清を取り出しこれら分子に結合し得る
ポリクローナル抗体の原料として使用することもでき
る。しかしながら、好ましいのはそのような動物からひ
臓球（spleno cytes）を取り出し、かかるひ臓細胞をミ
エローマ細胞系と融合させ、得られた融合細胞からICAM
−１またはLFA−１群分子の１員に結合し得るモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を確立するこ
とである。
上記の方法で得たハイブリドーマ細胞はICAM−１また
はLFA−１群分子の一員のいずれかに結合し得る抗体を
産生する所望のハイブリドーマ細胞を同定する種々の方
法によってスクリーニングできる。１つの好ましいスク
リーニングアッセイにおいては、そのような分子はその
エプスティン−バールウイルス形質転換細胞の凝集を抑
制する能力によって同定される。そのような凝集を抑制
し得る抗体をさらにスクリーニングしてこれらの抗体が
そのような凝集をICAM−１またはLFA−１群分子の一員
への結合によって抑制したかどうかを決定する。ICAM−
１をLFA−１群分子から区別できる任意の手段をそのよ
うなスクリーニングに用いることができる。例えば、抗
体と結合した抗原は免疫沈降およびポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によるようにして分析できる。結合抗原が
LFA−１群の分子の一員である場合には、免疫沈降した
抗原がダイマーとして見い出されるであろうし、一方、
結合抗原がICAM−１である場合には、単一分子量種が免
疫沈降して来るであろう。また、LFA−１群分子の１員
に結合する抗体はICAM−１に結合する抗体からLFA−１
を発現するのがICAM−１は発現しない顆粒球のような細
胞に結合する抗体の能力をスクリーニングすることによ
っても区別できる。顆粒球に結合する抗体（細胞凝集を
抑制することが知られている）の能力はその抗体がLFA
−１に結合し得ることを示す。そのような結合のない場
合はICAM−１を認識し得る抗体を示唆し得る。顆粒球の
ような細胞に結合する抗体の能力は通常の熟練者により
普通に用いられる方法によっても検出し得る。そのよう
な方法にはイムノアッセイ、細胞凝集、フィルター結合
試験、抗体沈降等がある。
本発明の抗凝集抗体はまたそのICAM−１を発現する細
胞（活性化内皮細胞のような）に特異的に結合する能力
およびそのICAM−１を発現しない細胞に結合し得ない能
力を測定することによっても同定し得る。当業者によっ
て容易に理解されるように、上記の各アッセイは修正し
て即ち、異なる順序で行って種々の可能性あるスクリー
ニングアッセイを提供でき、これらアッセイの各々はIC
AM−１に結合し得る抗体とLFA−１群分子の１員との間
で同定および区別化を行い得るものである。
本発明の抗炎症剤は、天然方法（例えば、動物、植
物、真菌、ドクテリア等をICAM−１の非免疫グロブリン
アンタゴニストを産生するよう誘導することによってあ
るいは動物をICAM−１に結合し得るポリクローナル抗体
を産生するよう誘導することによるような）により、合
成方法〔例えば、ポリペプチド合成用のメリフィールド
法を用いてICAM−１、ICAM−１の官能性誘導体またはIC
AM−１のたん白質アンタゴニスト（免疫グロブリンまた
は非免疫グロブリンのいずれか）を合成することによる
ような）により、ハイブリドーマ技術（例えば、ICAM−
１に結合し得るモノクローナル抗体を産生させるよう
な）により、また組換え技術（例えば、本発明の抗炎症
剤を種々の宿主（例えば、酵母、バクテリア、真菌、培
養動物細胞等）中で、あるいは組換えベクターまたはウ
ィルスベクターから産生させるような〕により得ること
ができる。用いる方法の選択は便宜さ、所望の収率等の
ファクターによる。上記の方法、手法または技術の１つ
のみを用いて特定の抗炎症剤を産生させる必要はなく、
上記の方法、手法および技術は組合せて特定の抗炎症剤
を得てもよい。
A. LFA−１結合性パートナー（ICAM−１）の同定 1. LFA−１依存凝集のアッセイ 多くのエプスタイン−バーウイルス形質転換細胞は凝
集を示す。この凝集はホルボールエステルの存在下で促
進できる。そのような同型（homotypic）の凝集（即
ち、１種のみの細胞種を含む凝集）は抗LFA−１抗体に
よってブロックされることが見い出された〔“Rothlei
n,R.等、J.Exper.Med.163:1132−1149（1986）”、該文
献は参考として本明細書に引用する〕。即ち、LFA−１
依存性結合の度合は自発性またはホルボールエステル依
存性凝集形成の度合を評価することによって決定でき
る。
LFA−１依存性凝集を干渉する試剤は該試剤がエプス
タイン−バールウイルス形質転換細胞の自発またはホル
ボールエステル依存のいずれの凝集を抑制するかどうか
を測定し得るアッセイを用いることによって同定でき
る。殆んどのエプスタイン−バールウイルス形質転換細
胞はこれら細胞がLFA−１レセプター分子を発現し得る
限りそのようなアッセイに用い得る。そのような細胞は
“Springer,T.A.等、J.Exper.Med.160:1901−1918（198
4）”の方法によって調製できる。該文献は参考として
本明細書に引用する。任意のそのような細胞を本発明の
LFA−１依存性結合アッセイにおいて使用できるけれど
も、好ましいのはJY細胞系の細胞を使用することである
〔Terhost,C.T.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,73:910（1
976）〕。これらの細胞は任意の適当な培養培地で培養
できるが、最も好ましいのは10％ウシ胎児血清および50
μg/mのゲンタマイシン（ギブコラボラトリーズ社、
ニューヨーク）を加えたRMP11640培地中で細胞を培養す
ることである。これらの細胞は動物細胞増殖に適する条
件（即ち、一般に37℃の温度で、５％CO2の雰囲気中
で、95％の相対湿度にてなど）下で培養すべきである。
2. ICAM−１へのLFA−１の結合 リンパ球がLFA−１レセプター分子の群を欠損するヒ
ト個人は同定されている〔Anderson,D.C.等、Fed.Proc.
44:2671−2677（1985）;Anderson,D.C.等、J.Infect.Di
s.152:668−689（1985）〕。そのような人は白血球粘着
欠損症（LAD）をこうむると云われている。そのような
人のEBV形質転換細胞は上述の凝集アッセイにおいて自
発またはホルボールエステル存在下のいずれにおいても
凝集しない。そのような細胞をLFA−１発現性細胞と混
合したときは、凝集が観察される〔Rothlein,R.等、J.E
xper.Med.163:1132−1149（1986）〕（第１図）。重要
なことは、これら凝集はこれらの細胞を抗LFA−１抗体
の存在下でインキュベートした場合には形成されなかっ
たことである。即ち、凝集はLFA−１を必要としたが、L
FA−１欠損細胞のLFA−１含有細胞による凝集形成能力
はLFA−１結合パートナーはLFA−１ではなくむしろ従来
未発見の細胞間粘着分子であったことを示唆していた。
第１図は細胞間粘着のメカニズムを示す。
B. 細胞間粘着分子−１（ICAM−１） 新規な細胞間粘着分子ICAM−１は“Rothlein,R.等の
手順〔J.Immunol.137:1270−1274（1986）、該文献は参
考として本明細書に引用する〕によって最初同定された
部分的に特徴付けされた。ICAM−１分子を検出するため
に、モノクローナル抗体をLFA−１発現が遺伝的に欠損
しているヒトの細胞で免疫したマウスのひ臓細胞から調
製した。得られた抗体をそのLFA−１発現細胞の凝集を
抑制する能力についてスクリーニングした（第２図）。
詳細には、ICAM−１分子マウスをLFA−１抗原を発現し
ないLAD患者からのEBV形質転換Ｂ細胞で免疫した。これ
ら動物からのひ臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融
合させてモノクローナル抗体産生性ハイブリドーマ細胞
になるようにした。次に、LFA−１を発現する正常人か
らのEBV形質転換Ｂ細胞を上記ハイブリドーマ細胞のモ
ノクローナル抗体の存在下でインキュベートしてEBV形
質転換Ｂ細胞のホルボールエステル媒介、LFA−１依
存、自発性凝集を抑制し得る任意のモノクローナル抗体
を同定した。上記のハイブリドーマ細胞はLFA−１抗原
を全く含まない細胞から誘導したので、LFA−１に対す
るモノクローナル抗体は産生されなかった。従って、凝
集を抑制することが判った抗体はいずれも、LFA−１で
はないけれどもLFA−１粘着過程にかかわっていた抗原
に結合し得るものでなければならない。そのようなモノ
クローナル抗体を取得する方法は任意の方法を使用でき
るけれども、好ましいのはBALB/CマウスをRothlein,R.
等（J.Immunol.137:1270−1274（1986））により開示さ
れた経路およびスケジュールを用いてLFA−１欠損者か
らのエプスタイン−バールウイルス形質転換末梢血単核
細胞でもって免疫することによってICAM−１結合性モノ
クローナル抗体を得ることである。そのような細胞はSp
ringer,T.A.等により開示されている〔J.Exper.Med.16
0:1901−1918（1984）〕。
ICAM−１に結合し得る抗体の産生および検出のための
好ましい方法においては、マウスはICAM−１およびLFA
−１の両方を発現するEBV形質転換Ｂ細胞によりあるい
はより好ましくはICAM−１を発現するのがLFA−１を発
現しないTNF活性化内皮細胞により免疫する。抗ICAM−
１抗体を産生するハイブリドーマ細胞を調製する最も好
ましい方法においては、Balb/CマウスをJY細胞および特
異化U937細胞（ATCC CRL−1593）により順次免疫す
る。そのような動物からのひ臓細胞を取り出しミエロー
ル細胞と融合させ抗体を産生性ハイブリドーマ細胞に発
展させる。得られた抗体をそのLFA−１およびICAM−１
の両方を発現するJY細胞のようなEBV形質転換細胞系のL
FA−１依存、ホルボールエステル誘起凝集を抑制する能
力についてスクリーニングする。Rothlein,R.等（J.Imm
unol.137:1270−1274（1987）〕により開示されている
ように、そのような凝集を制御し得る抗体をSKW3〔Dust
in,M.等、J.Exper.Med.165:672−692（1987）、そのホ
ルボールエステルの存在下で自発的に凝集する能力はLF
A−１に結合し得る抗体によっては抑制されるが抗ICAM
−１抗体によっては抑制されない〕のような細胞系のホ
ルボールエステル誘起凝集を抑制する能力について試験
する。JY細胞のような細胞のホルボールエステル誘起凝
集を抑制し得るがSKW3のような細胞のホルボールエステ
ル誘起凝集を抑制し得ない抗体は恐らく抗ICAM−１抗体
である。また、ICAM−１に結合し得る抗体は、LFA発現
性細胞（JY細胞のような）のLFA−１依存性凝集を抑制
し得るがLFA−１を発現するのがICAM−１を殆んどまた
は全く発現しない細胞（正常顆粒球のような）に結合し
得ない抗体あるいはICAM−１を発現するのがLFA−１を
発現しない細胞（TNF活性化内皮細胞のような）に結合
し得る抗体のスクリーニングによっても同定し得る。別
の方法は、ICAM−１、LFA−１または両方を発現する細
胞から、JY細胞のような細胞のLFA−１依存性凝集を抑
制する抗体を用いて免疫沈降させ、SDS−PAGEあるいは
等価の方法により抗体により沈降した分子のいくつかの
分子特性を測定することである。その特性がICAM−１の
特性と同じであるならば、その抗体は抗ICAM−１−抗体
であるとみなし得る。
上述の方法で調製したモノクローナル抗体を用いて、
ICAM−１細胞表面分子を精製し特性付した。ICAM−１は
ヒト細胞または組織からモノクローナル抗体アフィニテ
ィークロマトグラフィーを用いて精製した。そのような
方法においては、ICAM−１と反応性のモノクローナル抗
体を不活性カラムマトリックスに結合させる。そのよう
な結合を行う任意の方法を使用できるが、好ましいのは
“Oetthen,H.C.等、J.Biol.Chem.259:12034（1984）”
の方法を用いることである。細胞溶解物を上記マトリッ
クスに通したとき、存在するICAM−１分子はマトリック
スに吸着され保持される。カラムのpHまたはイオン濃度
を変えることにより、結合したICAM−１分子はカラムか
ら溶出し得る。任意の適当なマトリックスを使用できる
けれども、好ましいのはマトリックス材料としてセファ
ローズ（ファルマシア）を用いることである。カラムマ
トリックスの作製およびそのたん白質精製での使用は当
該技術において周知である。
当業者によって理解された方法において、上述のアッ
セイ法を用いて細胞粘着の速度または程度を減衰しある
いは抑制し得る化合物を同定することができる。
ICAM−１は血管内皮細胞、胸腺上皮細胞、ある種の他
の上皮細胞、および繊維芽球のような非造血細胞上並び
に組織マクロファージ、マイトジェン刺激Ｔリンパ芽
球、へん桃腺内の胚中心Ｂ細胞および樹枝状細胞、リン
パ節、およびパイエル板のような造血細胞上に発現した
細胞表面糖たん白質である。ICAM−１はリンパ節および
反応性増殖を示すへん桃腺内のＴ細胞領域の血管内皮細
胞状に高度に発現される。ICAM−１は末梢血リンパ球上
に少量発現される。ある骨ずい単球細胞系のホルボール
エステル刺激特異化はICAM−１発現を大きく増大させ
る。即ち、ICAM−１は炎症部位に優先的に発現され静止
状態の細胞には一般に発現されない、皮ふ繊維芽球上の
ICAM−１発現は10μ/mのレベルのインターロイキン１
またはガンマーインターフェロンによりそれぞれ４時間
または10時間以上で３倍〜５倍増大する。その誘発はた
ん白質およびmRNA合成に依存し可逆的である。
ICAM−１は繊維芽球上での97Kd、骨ずい単球細胞系上
での114Kd、およびＢリンパ芽球細胞JY上での90Kdの分
子量を有する異なる細胞腫での分子量異種抗原性を示
す。ICAM−１生合成は約73Kdの細胞間プレカーサーを含
むことが判っている。ツニカマイシン処理（グリコシル
化を抑制）から得られる非−Ｎ−グリコシル化形は分子
量55Kdを有する。
ホルボールエステル刺激U937細胞からあるいは繊維芽
球細胞から単離したICAM−１は化学脱グリコシル化後60
Kdの分子量を有する同一の主要生成物を与える。ICAM−
１モノクローナル抗体はフィトヘマグルチニン芽球のLF
A−１欠損細胞系への粘着を干渉する。繊維芽球（リン
パ球でない）のICAM−１に結合したモノクローナル抗体
による前処理はリンパ球−繊維芽球粘着を抑制する。リ
ンパ球のLFA−１に対する抗体による前処理（繊維芽球
は行なわない）もリンパ球−繊維芽球粘着を抑制するこ
とが見い出されている。
従って、ICAM−１は白血球上のCD18複合体の結合性リ
ガンドである。ICAM−１はIL−１、ガンマーインターフ
ェロンおよび腫瘍壊死因子のような炎症メディーターに
よりインビトロで繊維芽球および内皮細胞上にインビボ
での炎症領域中へのリンパ球の浸潤と時間枠的に一致し
て誘起可能である（Dustin,M.L.等、J.Immunol.137:245
−254、（1986）:Prober,J.S.等、J.Immunol.137:1893
−1896、（1986）〕。さらに、ICAM−１は血管内皮細
胞、胸腺上皮細胞、他の上皮細胞および繊維芽球のよう
な非造血細胞上にまた組織マクロファージ、マイトジェ
ン刺激Ｔリンパ芽球、へん桃腺内の胚中心Ｂ細胞および
樹枝状細胞、リンパ節およびパイエル板のような造血細
胞上にも発現される（Dustin,M.L.等、J.Immunol.137:2
45−254、（1986）〕。ICAM−１−はアレルギー性湿
疹、偏平苔癬、発疹、じんま疹および水庖性疾患のよう
な良性炎症のケラチノサイト上にも発現される。アレル
ギー性である患者の皮ふへのハプテンの適用により誘発
させたアレルギー性皮ふ反応もケラチノサイト上に多量
のICAM−１発現を生じた。これに対して、皮ふ上の有毒
パッチはケラチノサイト上にICAM−１発現を生じなかっ
た。ICAM−１は種々の皮ふ学上の不整からの皮ふ障害の
生検からのケラチノサイト上に存在し、ICAM−１発現は
アレルギーパッチ試験からの障害において誘発された
が、毒性パッチ試験障害からのケラチノサイトはICAM−
１を発現しなかった。
ICAM−１は、従って、リンパ球が付着できる細胞基質
であり、その結果、リンパ球は炎症部位に浸透し得およ
び／またはこの炎症に貢献する各種のエフェクター機能
を伝達し得る。そのような機能には抗体の産生、ウイル
ス感染ターゲット細胞の溶解等がある。本明細書で使用
する“炎症”なる用語は特異的または非特異的防御系の
反応を含むことを意味する。“特異的防御系”なる用語
は特徴的抗原の存在と反応する免疫系の成分を称するも
のとする。炎症は、特異的防御系の反応によって引き起
され、媒介されあるいはそれに伴う場合には、特異的防
御系の応答に由来するものといわれている。特異的防御
系の応答に由来する炎症の例には風疹ウイルス、自己免
疫疾患、Ｔ細胞によって仲介された遅延型過敏症（例え
ば、Mantaux試験で“陽性”となる患者におけるよう
な）、乾癬等がある。
“非特異的防御系反応”は免疫記憶のできない白血球
により媒介される応答である。そのような細胞には顆粒
球およびマクロファージがある。本明細書で使用すると
き、炎症は、その炎症が非特異的防御系の反応によって
引き起され、仲介されあるいはその反応に伴う場合に
は、非特異的防御系の応答に由来するものといわれる。
少なくとも１部が非特異的防御系に由来する炎症の例に
は、喘息、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）または敗血症も
しくは外傷の副次的な重複器官損症群、心筋または他の
組織の再潅流（reperfusion）損傷、急性糸球体腎炎、
反応性関節炎、急性炎症成分による皮ふ炎、急性化膿性
髄膜炎または他の中枢神経系炎症疾患、熱傷、血液透
析、ロイカフェレシス（leukapheresis）、潰瘍性大腸
炎、クローン病、壊死性全腸炎、顆粒球輸血関連症候
群、およびサイトカイン誘起毒性のような状態に伴う炎
症がある。
本発明によれば、ICAM−１官能性誘導体、特に、ドメ
イン１、２および３を有するICAM−１のフラグメントま
たは突然変異体を含むような誘導体を上記のような非特
異的防御系反応の処置または治療において使用できる。
そのような処置または治療においてより好ましいのはIC
AM−１のドメイン２を含有するICAM−１フラグメントま
たは突然変異体である。そのような処置または治療にお
いて最も好ましいのはICAM−１のドメイン１を含有する
ICAM−１フラグメントまたは突然変異体である。さら
に、本発明は喘息の治療におけるICAM−１およびその官
能性誘導体の使用も意図する。
C. ICAM−１遺伝子のクローニング 任意の多くの方法を用いてICAM−１遺伝子をクローニ
ングできる。そのような方法の１つはICAM−１遺伝子を
含有する挿入物の存在についてcDNA挿入物のシャトルベ
クターライブラリー（ICAM発現性細胞由来の）を分析す
ることである。そのような分析は細胞を上記ベクターで
移入し次いでICAM−１発現についてアッセイすることに
よって実施できる。この遺伝子をクローニングする好ま
しい方法はICAM−１分子のアミノ酸配列を決定すること
が含まれる。これを行うには、ICAM−１たん白質を精製
して自動化シークエネーターにより分析できる。また、
分子は臭化シアンによりあるいはパパイン、キモトリプ
シンまたはトリプシンのようなプロテアーゼによるよう
にして分解できる〔Oike,Y.等、J.Biol.Chem.257:9751
−9758（1982）:Liu,C.等、Int,J.Pept.Protein Res.2
1:209−215（1983）〕。ICAM−１の全アミノ酸配列を決
定できるけれども、好ましいのは分子のペプチドフラグ
メントの配列を決定することである。ペプチドが10ケの
アミノ酸より長い場合、その配列情報は一般にICAM−１
の遺伝子のような遺伝子をクローニングするのに十分で
ある。
ペプチド中のアミノ酸残基の配列は、普通用いられて
いる３文字表示または１文字表示を用いて本明細書にお
いても表示する。これら３文字および１文字表示の目録
は“Biochemistry,Lehninger,A.,Worth Publishers刊、
ニューヨーク、（1970）”のような教科書において見い
出される。そのような配列を縦に書くときには、アミノ
末端基は列の頂部にあるようにし、カルボキシ末端基は
列の底部にあるようにする。同様に、横方向に書くとき
には、アミノ末端は左にあるようにし、カルボキシ末端
は右末端にあるようにする。ペプチド中のアミノ酸残基
はハイホンによって分離できる。そのようなハイホンは
単に配列の存在を容易にすることを意図しているだけで
ある。単なる例示としては、 と表示したアミノ酸配列はＡａ残基がGlyのカルボキ
シ基に結合していることおよびSer残基はＡａ残基の
カルボキシ基およびPhe残基のアミノ基に結合している
ことを示している。この表示はさらにアミノ酸配列がテ
トラペプチドＧｙ−Ａａ−Ser−Pheを含有している
ことも示している。この表示はミノ酸配列をこの１つの
テトラペプチドに限定するものではなく、（１）アミノ
またはカルボキシに結合した１種以上のアミノ酸残基を
有するテトラペプチド、（２）アミノおよびカルボキシ
末端の両方に結合した１種以上のアミノ酸残基を有する
テトラペプチド、（３）追加のアミノ酸残基を有してい
ないテトラペプチドを包含するものとする。
１種以上の適当なペプチドフラグメントがシーケンシ
ングされると、これらをコードし得るDNA配列を検査す
る。遺伝子コードは縮重するので、１種以上のコドンを
用いて特定のアミノ酸をコードできる〔Watsno,J.D.,Mo
lecular Biology of the Gene,第３版、W.A.Benjamin
社、カルホルニア メンローパーク、（1977）、pp356
−357〕。ペプチドフラグメントを分析して最低度の縮
重性を有するオリゴヌクレオチドによってコードされ得
るアミノ酸配列を同定する。これは好ましくは単一コド
ンのみによってコードされているアミノ酸を含有する配
列を同定することによって行う。場合によっては、その
ようなアミノ酸配列は単一オリゴヌクレオチドのみによ
ってコードされ得るけれども、多くの場合、そのアミノ
酸配列は任意の１セット（組）の同様なオリゴヌクレオ
チドによってコードされ得る。重要なのは、上記セット
のすべてのメンバーがそのペプチドフラグメントをコー
ドし得るオリゴヌクレオチドを含有し、かくしてそのペ
プチドフラグメントをコードする遺伝子として同じヌク
レオチド配列を潜在的に含むのに対し、上記のセットの
１メンバーのみはこの遺伝子のヌクレオチド配列と同一
のヌクレオチド配列を含むことである。このメンバーは
上記のセット内に存在し、上記セットの他のメンバーの
存在においてさえもDNAにハイブリッドし得るので、単
一オリゴヌクレオチドを用いて上記ペプチドをコードす
る遺伝子をクローニングするのと同じ方法で分解してい
ないオリゴヌクレオチドセットを用いることができる。
上述の方法と正確に同じ方法において、ペプチドフラ
グメントをコードし得るオリゴヌクレオチド配列または
配列セットに相補的であるヌクレオチド配列を有するオ
リゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドのセッ
ト）を用い得る。
ICAM−１遺伝子のフラグメントをコードし得る適当な
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセット
（またはそのようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチドに相補性であるもの）を同定し（上述の手順
を用いて）、DNAについて当該技術で周知の手段を用い
て、好ましくはICAM−１遺伝子配列を発現し得るヒト細
胞由来のcDNA調製物により合成しハイブリッド化する。
核酸ハイブリッド化技術はManiatis,T.等、により“Mol
ecular Cloning,a Laboratory Manual,Coldspring Harb
or,NY（1982）”において、またHaymes,B.D.等により
“Nucleic acid Hybrization,a Practical approach,IR
L Press社、ワシントンD.C.（1985）”において開示さ
れており、これら文献は参考として本明細書に引用す
る。使用するDNAまたはcDNA源は好ましくはICAM−１配
列に富む。そのような濃厚化はICAM−１合成を誘起する
条件下で培養された細胞（ホルボールエステルの存在下
で増殖させたU937等のような）からRNAを抽出すること
によって得たcDNAから最も容易になし得る。
上述した方法のようなあるいは同様な方法はヒト ア
ルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子〔Hsu,L.C.等、Pro
c,Natl,Acad,Sci, USA82:3771−3775（1985）〕、フィ
ブロネクチン〔Suzuki,S.等、Eur,Mol,Biol,Organ,J.4:
2519−2524（1985）〕ヒト エストロゲン レセプス−
遺伝子〔Walter,P.等、Proc,Natl,Acad,Sci,USA82:7889
−7993（1985）〕、組織型プラスミノーゲン アクチベ
ータ〔Pennica,D.等、Nature301:214−221（1983）〕お
よびヒト胎盤アルカリ ホスファターゼ相補DNA〔Kam,
W.等、Proc,Natl,Acad,Sci,USA82:8715−8719（198
5）〕のクローニングを成功裏に可能にしている。
ICAM−１遺伝子をクローニングする別の好ましい方法
においては、発現ベクターのライブラリーをICAM−１を
発現ベクター中に発現できる細胞からDNAまたは好まし
くはcDNAをクローニングすることによって調製する。こ
のライブラリーを次いで抗ICAM−１抗体に結合しICAM−
１またはICAM−１フラグメントと同じアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードし得るヌクレオチド配列を有
するたん白質を発現し得るメンバーについてスクリーニ
ングする。
上記方法により得られたクローニングICAM−１遺伝子
は操作によって発現ベクターに結合させバクテリアまた
は真核生物細胞に組み込んでICAM−１たん白質を産生さ
せる。そのような操作技術はManiatis,T.等（前出）に
より開示さ、当該技術において周知である。
D. LFA−１依存性凝集のアッセイの使用 LFA−１依存性凝集を測定し得る前述のアッセイを用
いてLFA−１依存性凝集の度合を抑制するアンタゴニス
トとして作用する試剤を同定できる。そのようなアンタ
ゴニストは凝集に関係するLFA−１またはICAM−１の能
力を付与することによって作用し得る。即ち、そのよう
な試剤はLFA−１またはICAM−１に結合し得る抗体のよ
うな免疫グロブリンを包含する。さらに、非免疫グロブ
リン（即ち、化学）剤も、上記アッセイを用いてこれら
がLFA−１凝集のアンタゴニストであるかどうかを決定
し得る。
E. ICAM−１レセプターたん白質に結合し得る抗体の使
用 1. 抗炎症剤 CD18複合体の各１員に対するモノクローナル抗体は内
皮への結合〔Haskard,D.等、J.Immunol.137:2901−2906
（1986）〕、ホモタイプ粘着〔Rothlein,R.等、J.Exp.M
ed.163:1132−1149（1986）〕リンパ球の抗原およびマ
イトジァン誘起増殖〔Davigon,D.等、Proc,Natl,Acad,S
ci,USA78:4535−4539（1981）〕、抗体形成〔Fisher,A.
等、J.Immunol.136:3198−3203（1986）〕、および細胞
毒性Ｔ細胞〔Krensky,A.M.等、J.Immunol.132:2180−21
82（1984）〕、マクロファージ〔Strassman,G.等、J.Im
munol.136:4328−4333（1986）〕、および抗体依存性細
胞毒反応に含まれるすべての細胞〔Kohi,S.等、J.Immun
ol.133:2972−2978（1984）〕の溶解活性のようなすべ
ての白血球のエフェクター機能を包含する白血球の多く
の粘着依存性機能を抑制する。これらの機能のすべてに
おいて、上記抗体は白血球の適当な細胞基質への粘着能
力（この能力は最終結果を抑制する）を抑制する。
前述したように、ICAM−１分子のLFA−１群分子の１
員への結合は細胞粘着において極めて重要である。粘着
の過程において、リンパ球は外来抗原の存在について動
物を連続的にモニターし得るものである。これらの過程
は通常は望ましいものであるけれども、これらの過程は
また臓器移植拒絶、組織移植拒絶、および多くの自己免
疫患者の原因でもある。従って、細胞粘着を減衰または
抑制できる何らかの手段が臓器移植、組織移植を受け入
れ者または自己免疫患者に大いに望まれている。
ICAM−１に結合し得るモノクローナル抗体は哺乳動物
の抗炎症剤として極めて適している。明らかに、そのよ
うな薬剤は粘着を選択的に抑制でき通常の薬剤で見い出
し得るネフロ毒性のような他の副作用を示さない点で一
般の抗炎症剤と異なっている。従って、ICAM−１に結合
し得るモノクローナル抗体を用いて哺乳動物においてそ
のような副作用の恐れなしに臓器または組織の拒絶反応
を防止しあるいは自己免疫応答を修正できる。
重要なことは、ICAM−１を認識し得るモノクローナル
抗体の使用はHIA不均衡を有する個々人においてさえも
臓器移植を行うことができるということである。
2. 遅延型過敏反応のサプレッサー ICAM−１分子は殆んど遅延型過敏反応に含まれる部位
のような炎症部位に発現するので、ICAM−１分子に結合
し得る抗体（特にモノクローナル抗体）はそのような反
応の減衰または排除において治療的潜在力を有する。こ
の潜在的治療用途は２つの方法のいずれかで活用でき
る。第１は、ICAM−１に対するモノクローナル抗体を含
有する組成物を遅延型過敏反応に呈する患者に投与でき
る。例えば、そのような組成物は毒キツダ、毒オーク等
の抗原と接触した人に投与できるであろう。第２の態様
においては、ICAM−１に結合し得るモノクローナル抗体
を抗原と共に患者に投与してその後の炎症反応を防止す
る。即ち、抗原とICAM−１結合性モノクローナル抗体と
の共投与は上記抗原の投与後に人に一時的に許容し得
る。
3. 慢性炎症疾患の治療 LFA−１を欠損するLAD患者は炎症応答を示さないの
で、LFA−１の天然リガンド、ICAM−１の拮抗作用もま
た炎症応答を抑制するものと信じでいる。ICAM−１に対
する抗体の炎症を抑制する能力は円板状エリスマトーデ
ス、自己免疫甲状腺炎、実験的アレルギー性脳脊ずい炎
（EAE）、多発性硬化症、糖尿病レイナード症候群のあ
る態様、リウマチ様関節炎等の慢性炎症および自己免疫
疾患の治療における治療用途の基体を与える。一般に、
ICAM−１に結合し得るモノクローナル抗体はステロイド
療法により現在治療可能な疾患の治療に用い得る。
4. 診断および判定的用途 ICAM−１は殆んど炎症部分に発現するので、ICAM−１
に結合し得るモノクローナル抗体は患者の感染および炎
症部位を画像化または可視化する手段として使用でき
る。そのような用途においては、モノクローナル抗体は
ラジオアイソトープ、アフィニティラベル（ビオチン、
アビジン等のような）、蛍光ラベル、常磁性原子等の使
用により検出可能に標識化する。そのような標識化を行
う手順は当該技術において周知である。画像診断におけ
る抗体の臨床的応用は“Grossman,H.B.,Urol,Clin,Nort
h Amer.13:465−474（1986）”、“Unger,E.C.等、Inve
st,Radiol,20:693−700（1985）”および“Khaw,B.A.
等、Science209:295−297（1980）”により検討されて
いる。
炎症の存在はまたICAM−１を発現する細胞のICAM−１
遺伝子配列にまたはICAM−1mRNA配列に結合するmRNA、c
DNAまたはDNAのような結合性リガンドの使用によっても
検出できる。そのようなハイブリッド化アッセイを行う
技術はManiatais,T.（前出）によって開示されている。
そのような検出可能に標識した抗体の病巣の検出は炎
症または腫瘍発現部位を示し得る。１つの実施態様にお
いては、この炎症検査は組織または血液のサンプルを取
り出しそのようなサンプルを上記検出可能に標識した抗
体の存在下にインキュベートすることによって行う。好
ましい実施態様においては、この方法を磁性画像診断、
フルオログラフィ等を用いて非侵略的方法で行う。その
ような診断試験は臓器移植受け入れ者を潜在的な組織拒
絶の早期発見のためにモニターするのに用い得る。その
ようなアッセイはまたリウマチ様関節炎または他の慢性
炎症疾患に対する個々人の対応を決定するにも実施し得
る。
5. 治療または診断目的で投与する抗原物質の導入の補
佐 例えば、ウシインシュリン、インターフェロン、組織
型プラズミノーゲンアクチベーターまたはマウスモノク
ローナル抗体のような治療または診断剤への免疫応答は
そのような薬剤の治療または診断価値を実質的に減少さ
せ、実際に、血清病のような疾患を生じ得る。そのよう
な事情は本発明の抗体を用いて改善できる。この実施態
様においては、そのような抗体を治療剤または診断剤と
組合せて投与する。抗体の添加は受け入れ者を上記薬剤
の認識から防止し、従って、受け入れ者が薬剤に対する
免疫応答を開始するのを防止する。そのような免疫応答
がないことは患者の治療剤または診断剤の追加の投与を
受け入れる能力をもたらす。
F. 細胞間粘着分子−１（ICAM−１）の使用 ICAM−１はLFA−１の結合パートナーである。かくし
て、ICAM−１またはその官能性誘導体は疾患の治療にお
いてLFA−１に結合し得る抗体と相互変化的に使用でき
る。即ち、可溶化形において、そのような分子は炎症、
臓器拒絶、移植拒絶等を抑制するのに用い得る。ICAM−
１またはその官能性誘導体は抗ICAM抗体と同じ方法で用
いて治療剤または診断剤の免疫原性を減少させ得る。
ICAM−１、その官能性誘導体、およびそのアンタゴニ
ストを用いて表面上にICAM−１またはLFA−１を発現す
る腫瘍細胞の転移または増殖をブロックし得る。種々の
方法がそのような目的を達成するのに用い得る。例え
ば、造血細胞の浸透はLFA−１−ICAM−１結合を必要と
する。従って、そのような結合のアンタゴニストは上記
の浸透を抑制し白血球由来の腫瘍細胞の転移をブロック
する。また、ICAM−１またはLFA−１群分子の１員に結
合し得る毒素由来分子も患者に投与し得る。そのような
毒素由来分子がICAM−１またはLFA−１群分子の１員と
結合する場合、毒素の存在が腫瘍細胞を殺しそれによっ
て腫瘍の増殖を抑制する。
G. ICAM−１依存性粘着の非免疫グロブリンアンタゴニ
ストの使用 ICAM−１依存性粘着はICAM−１またはLFA−１に結合
し得る非免疫グロブリンアンタゴニストにより抑制し得
る。ICAM−１の非免疫グロブリンアンタゴニストの１つ
の例はLFA−１である。LFA−１に結合する非免疫グロブ
リンアンタゴニストの例はICAM−１である。前述のアッ
セイを使用することによって、追加の非免疫グロブリン
アンタゴニストを同定し精製できる。ICAM−１依存粘着
の非免疫グロブリンアンタゴニストはLFA−１に対する
抗体またはICAM−１に対する抗体と同じ目的で使用でき
る。
H. 本発明の組成物の投与 ICAM−１の治療効果は患者に全ICAM−１またはその任
意の治療上活性なペプチドフラグメントを投与すること
によって得られる。
ICAM−１およびその官能性誘導体は組換えDNAを用い
て合成的にあるいはたん白質分解により取得できる。IC
AM−１の治療上の利点は追加のアミノ酸残基を有してキ
ャリヤーに対する結合性を改善しあるいはICAM−１の活
性を改善したICAM−１の官能性誘導体の使用により増強
され得る。本発明の範囲はさらにある種のアミノ酸残基
を欠損しあるいは別のアミノ酸残基を含むICAM−１の官
能性誘導体もそのような誘導体が細胞粘着に作用する能
力を示す限り包含するものとする。
本発明の抗体およびICAM−１分子は、これらを含有す
る調製物がこれらの生成物と共に通常天然に見出される
物質を実質的に含まない場合、“天然不純物を実質的に
含まない”といえる。
本発明はICAM−１に結合し得る抗体およびその生物学
的活性を有するフラグメント（ポリクローナルまたはモ
ノクローナル）にも及ぶ。そのような抗体は動物、組織
培養または組換えDNA手段により調製できる。
患者にICAM−１に結合し得る抗体またはそのフラグメ
ントを投与するには、あるいは、ICAM−１（またはフラ
グメント、変異体または誘導体）を受け入れ患者に投与
するには、その投与量は患者の年令、体重、身長、性
別、一般的医療条件、病歴等のファクターによる。一般
には、患者に約1Pg/kg〜10mg/kg（患者体重）の範囲の
抗体投与量で投与することが望ましいが、それにより低
量または高量の投与量も投与できる。ICAM−１分子また
はその官能性誘導体を患者に投与するときは、同じく約
1Pg/kg〜10mg/kg（患者の体重基準）の範囲の投与量で
そのような分子を投与することが好ましいが、それより
低量または高量の投与量も使用できる。後述するよう
に、上記の有効投与量は抗ICAM−１抗体を抗LFA−１投
与と共投与する場合は少なくすることができる。本発明
においては、１つの化合物は第２の化合物と、その２つ
の化合物の投与がこれら両化合物を患者血清中で同時に
検出できるような条件になる場合において患者に共投与
できると云える。
ICAM−１に結合し得る抗体及びICAM−１自体の両者は
患者に静注、筋注、皮下、腸内または非経口的に投与で
きる。抗体またはICAM−１を注射により投与するとき
は、投与は連続注入によりあるいは１回または多数回ボ
ーラスにより行い得る。
本発明の抗炎症剤は炎症を抑制するのに十分な量で受
け入れ対象体に投与するものである。その量は、薬剤の
投与量、投与経路等が炎症を減衰させあるいは防止する
に十分である場合において炎症を“抑制”するに十分で
あると云える。
本発明の抗炎症剤は炎症の発症前（予想される炎症を
抑制するために）または炎症発症後のいずれにおいても
投与できる。
抗ICAM−１抗体またはそのフラグメントは単独または
１種以上の追加の免疫抑制剤と組合せて投与できる（特
に、臓器または組織移植の受け入れ者に対して）。その
ような化合物の投与は“予防”または“治療”目的のい
ずれかであり得る。予防的に投与する場合には、これら
の免疫抑制剤は炎症応答または症候の前に投与する（例
えば、臓器または組織の移植前、移植中または移植直後
の臓器拒絶症候の前）。これらの化合物の予防的投与は
後の何らかの炎症応答（例えば、移植臓器または組織の
拒絶等）を防止または低減するのに役立つ。治療的に投
与する場合には、これらの免疫抑制化合物は実際の炎症
の症候（例えば、臓器または組織拒絶のような）の発症
時（またはその直後）に投与する。これら化合物の治療
的投与は何らかの実際の炎症（例えば、移植臓器または
組織の拒絶のような）を低減するのに役立つ。かくし
て、本発明の抗炎症剤は炎症の発症前（予想される炎症
を抑制するように）または炎症の開始後のいずれかで投
与できる。
組成物はその投与が受け入れ患者に許容される場合に
“薬学上受け入れ可能である”と云える。そのような薬
剤はその投与量が生理学上有意である場合に、“治療上
有効な量”で投与されると云える。薬剤はその存在が受
け入れ患者の生理に検知可能な変化をもたらす場合に経
理学上有意である。
本発明の抗体及びICAM−１分子は薬学上有用な組成物
を調製する公知の方法によって処方でき、それによって
これらの物質またはその官能性誘導体を薬学上許容でき
るキャリヤーベヒクルと混合物として組合せ得る。適当
なベヒクルおよびその調製物（例えば、他のヒトたん白
質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む）は、例えば
“Remington's Pharmaceutical Sciences（第16版、Dso
l,A.編、マーク・イーストン（PA）、（1980）”に記載
されている。有効な投与に適する薬学上許容し得る組成
物を調製するためには、そのような組成物は適当量のキ
ャリヤーベヒクルと共に有効量の抗ICAM−１抗体または
ICAM−１分子、またはその官能性誘導体を含有する。
追加の薬学的方法を用いて活性の持続を制御すること
ができる。制御放出性製剤は抗ICAM−１抗体またはICAM
−１、またはこれらの官能性誘導体を複合体化しあるい
は吸収するポリマーを使用することによって得ることが
できる。制御された伝達は適当なマクロ分子（例えば、
ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、
エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシ
メチルセルロース、またはプロタミン硫酸塩）および該
マクロ分子の濃度並びに放出を制御するための混入方法
を選択することによって達成できる。制御放出製剤によ
り活性持続を制御するもう１つの可能性ある方法は抗IC
AM−１抗体またはICAM−１分子、またはこれらの官能性
誘導体をポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポ
リラクトン酸またはエチレン−酢酸ビニルコポリマーの
ような高分子物質の粒子に混入させることである。ま
た、これら薬剤を高分子粒子に混入させる代りに、これ
らの薬剤を例えばコアセルベーション法によりあるいは
界面重合法により調製したマクイロカプセル例えばヒド
ロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセ
ルおよび（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中
に、あるいはコロイド状薬物伝達系例えばリポソーム、
アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、
ナノパーティクル、ナノカプセルまたはマクロエマルジ
ョン中に内包させることも可能である。そのような方法
も“Remington's Pharmaceutical Sciences（1980）”
中に記載されている。
実施例 これまで本発明を一般的に説明して来たが、以下の実
施例は本発明をより容易に理解できるであろう。これら
の実施例は例示を目的とするものであり本発明を限定す
るものではない。
実施例１ 動物細胞の培養 一般に、本発明のEBV形質転換およびハイブリドーマ
各細胞は20mMのＬ−グルタミン、50μg/mのジェンタ
マイシン、および10％のウシ胎児血清を加えたRMP11640
培地中に保存した。細胞は37℃で、５％ CO2、95％湿
度雰囲気下で培養した。
エプスタイン−バールウイルス（EBV）形質転換体を
確立するために、20％ウシ胎児血清（FCS）および50μg
/mのジェンタマイシンを加えたRPM11640培地中の106
個のＴ細胞放血末梢単核細胞/mを16時間B95−８細胞
のEBV含有上清でインキュベートした〔Thorles−Lawso
n、D.A.等、J.Exper.Med.146:495（1977）〕。0.2m細
胞アリコートを10マイクロタイターウェルに入れた。培
地をRPMI 1640培地（20％ウシ胎児血清および50μm/
ジンタマイシンを加えた）で細胞増殖が見られるまで置
換えた。細胞は殆んどのウェルで増殖し同じ培地中に拡
った。フィトヘマグルチニン（PHA）芽球を1:800希釈PH
A−Ｐ（Difco Laboratories社、デトライト、MI）を含
有するRPMI 1640培地（20％ウシ胎児血清加）中106細胞
/mで確立した。PHA系はインターロイキン２（IL−
２）調整培地で拡がりPHAにより弱く脈動した〔Cantrel
l,D.A.等、J.Exper.Med.158:1895（1983）〕。上記手順
は“Springer、T.等、J.Exper.Med.160:1901−1918（19
84）”により開示されており、その記載は参考として本
明細書に引用する。上記手順で得た細胞を次いで抗LFA
−１抗体でスクリーニングしてこれらがLFA−１抗原を
発現するかどうかを決定した。そのような抗体は“Sanc
hey Madrid、F.等、J.Exper.Med.158:1785（1983）”に
開示されている。
実施例２ 細胞凝集および粘着のアッセイ 細胞粘着の度合を評価するために、凝集アッセイを用
いた。かかるアッセイに用いた細胞系は5mMのHepesバッ
ファー（Sigma Chemical社、セントルイス）を含有する
PRMI1640培地で２回洗浄し２×106細胞/mの濃度に再
懸濁させた。平底96ウェルマイクロタイタープレート
（No.3596;Coastar社、ケンブリッジ、MA）に50μの
適当なモノクローナル抗体上清、50μの精製モノクロ
ーナル抗体を含むまたは含まない完全培地、50μの20
0ng/mホルボールエステルホルボールミリステートア
セテート（PMA）含有完全培地および100μの完全培地
中２×106細胞/m濃度の細胞を加えた。これは50ng/m
PMAと２×105細胞／ウェルの最終濃度を与えた。細
胞を自然に沈降させ、凝集度を各時点で計数した。度数
は０〜5+の範囲にあった。ここで０は密集中に本質的に
細胞がないことを示し;1+は10％以下の細胞が凝集物中
にあり;2+は50％以下の細胞が凝集していることを示し:
3+は100％までの細胞が小さいゆるやかな密集中にあっ
たことを示し;4+は100％までの細胞が大密集中に凝集し
たことを示し;5+は100％の細胞が大きい極めて密な凝集
物中にあったことを示す。細胞粘着のより定量的な評価
を得るために、試剤および細胞を上記と同じ順序で5m
ポリスチレンチューブに加えた。チューブを37℃でグリ
ラトリーシェーカー上の台中に置いた。約200rpmで１時
間後に、10μの細胞懸濁液をヘモサイトメーター中に
入れ遊離細胞の数を定量した。％凝集を次の等式によっ
て決定した。
上記等式中の入れた細胞の数はインキュベートしてい
ない細胞と完全培地のみを含有するコントロールチュー
ブ中のｍ当りの細胞数である。上記等式中の遊離細胞
の数は試験チューブからのｍ当りの非凝集細胞の数に
等しい。上記の手順は“Rothlein,R.等、J.Exper.Med.1
63:1132−1149（1986）”によって開示されている。
実施例３ LFA−１依存性細胞凝集 実施例２で記載した定量的凝集アッセイをエプスタイ
ン−バールウイルス形質転換細胞系JYを用いて行った。
マイクロタイタープレート中の培地にPMAを加えて、細
胞凝集を観察した。時間経過ビデオ記録計はマイクロタ
イターウェル底部のJY細胞が動いており活性な膜波動お
よび仮足運動を示していた。隣接細胞の仮足間の接触は
しばしば細胞−細胞粘着をもたらした。粘着が持続した
場合、細胞接触領域は尾脚（uropod）に移動した。接触
は激しい細胞運動および反対方向への細胞の引っ張り合
いにも依らず維持できた。PMA処理および未処理細胞間
の主な違いは１度形成された上記接触の安定性において
現われていた。PMAにおいては、細胞密集が出現し、そ
の周りに粘着した追加の細胞として粒度の成長があっ
た。
粘着を測定する第２の手段としては、実施例２で記載
した定量的アッセイを用いた。細胞懸濁液を２時間、20
0rpmで振り、ヘモサイトメーターに移し、凝集物中に含
まれない細胞を計数した。PMAの不存在では、42％（SD
＝20％、Ｎ＝６）のJY細胞が２時間後、凝集物中にあっ
たが、50μg/mのPHAと共に同じ条件下でインキュベー
トしたJY細胞は凝集物中に87％（SD＝８％、Ｎ＝６）の
細胞を有していた。凝集の動力学的検討はPMAがすべて
の試験時間で凝集速度および強度を促進していることを
示した（第３図）。
実施例４ 抗LFA−１モノクローナル抗体を用いての細胞の凝集抑
制 PMA誘起細胞凝集への抗LFA−１モノクローナル抗体の
効果を試験するために、そのような抗体を実施例２の定
量凝集アッセイに従ってインキュベートした細胞を加え
た。このモノクローナル抗体はPMAの存在または不存在
下のいずれにおいても細胞凝集の形成を抑制しているこ
とが判った。LFA−１のアルファー鎖に対するモノクロ
ーナル抗体のＦ（ab′）２およびFab′フラグメントは
双方とも細胞凝集を抑制できた。一方、本質的に100％
の細胞が抗LFA−１抗体の不存在下では凝集を形成し、
抗体を加えたときは20％以下の細胞が凝集物中に見い出
された。この実験の結果はRothlein,R.等により開示さ
れた（J.Exper.Med.163:1132−1149（1986）〕。
実施例５ 細胞凝集はLFA−１レセプターを必要とする： EBV形質転換リンパ芽球細胞を実施例１で記載した方
法により患者から調製した。この細胞をLFA−１を認識
し得るモノクローナル抗体に対してスクリーニングし、
細胞がLFA−１欠損であることを見い出した。
実施例２で記載した定量凝集アッセイを上記LFA−１
欠損細胞を用いて行った。この細胞はPMAの存在におい
ても自発的に凝集しなかった。
実施例６ ICAM−１の発見 実施例５のLFA−１欠損細胞をカルボキシルフオレス
セインジアセテートで標識した〔Patarroyo,M.等、Cel
l.Immunol.63:237−248（1981）〕。標識細胞を同原ま
たはJY細胞と1:10の比で混合し凝集物中のフルオレスセ
イン標識細胞の割合を“Rothlein,R.等 J.Exper.Med.1
63:1132−1149（1986）”の方法に従って測定した。LFA
−１欠損細胞はLFA−１発現性細胞と共凝集し得ること
を見い出した（第４図）。
LFA−１が凝集形成またはその維持にのみに重要であ
るかどうかを決定するために、LFA−１に結合し得る抗
体を上記の前以って形成させた凝集に加えた。抗体の添
加は上記の前以って形成させた凝集を強く分裂させるこ
とが判った。時間経過ビデオ記録計は前以って形成させ
た凝集へのモノクローナル抗体の添加が２時間以内で分
裂を生じ始めることを示した（第１表）。LFA−１に対
するモノクローナル抗体の添加後、凝集中の個々の細胞
の仮足運動および形状塩化は変らないまま続いた。個々
の細胞は凝集物の周囲から次第に解離し、８時間までに
細胞は殆んど分散した。ビデオ時間経過によれば、LFA
−１モノクローナル抗体による前以って形成させた凝集
の分裂は時間を逆のぼって行ったLFA−１モノクローナ
ル抗体の不存在下での凝集経過と等価であった。
定量マイクロタイタープレート中の凝集を観察的に計
数した。アッセイ時間全体を通じた存在した抗LFA−１
においては、凝集は1+以下であった。ａ モノクローナル抗体添加２時間直前の凝集量b TS1/18＋TS1/22c TS1/18d TS1/22 実施例７ LFA−１依存性凝集における２価イオンの必要性 細胞毒性Ｔ細胞とターゲット間のLFA−１依存性粘着
はマグネシウムの存在を必要とする〔Martz,E.,J.Cell.
Bioll. 84:584、598（1980）〕。PMA誘起JY細胞凝集を
２価カチオン依存性について試験した。JY細胞はカルシ
ウムまたはマグネシウムイオンを含まない培地中では凝
集しなかった（実施例２のアッセイを用いて）。２価マ
グネシウムの添加は0.3mM程の低い濃度で凝集を行っ
た。カルシウムイオン単独の添加は殆んど効果がなかっ
た。しかしながら、カウシウムイオンはマグネシウムイ
オンのPMA誘起凝集を補佐する能力を増強することが判
った。1.25mMのカルシウムイオンを培地に加えたとき
は、0.02mM程の低いマグネシウムイオン濃度で凝集を補
佐することが判った。これらのデータは細胞のLFA−１
依存性凝集がマグネシウムイオンを必要とすること、お
よびカルシウムイオンがそれ自体は不十分であるけれど
もマグネシウムイオンと共に凝集を増大させることを示
している。
実施例８ 抗ICAM−１モノクローナル抗体を発現し得るハイブリド
ーマ細胞の単離 ICAM−１に結合し得るモノクローナル抗体を“Rothle
in,R.等、J.Immunol．137:1270−1274（1986）”の方法
に従って単離した。該文献は参考として本明細書に引用
する。即ち、３匹のBALB/CマウスをLFA−１欠損患者か
らのEBV形質転換末梢血単核細胞で腹腔内免疫した（Spr
inger,T.A.等、J.Exper.Med.160:1901（1984）。1m R
PML1640培地中約107個の細胞を各免疫に用いた。免疫は
ひ臓細胞をマウスから取り出す前の45日、29日および４
日で行い所望のハイブリドーマ細胞系を産生させた。ひ
臓細胞の取り出し前３日に、マウスに追加の0.15m培
地中107細胞を投与した（静注）。
上記の動物からの単離ひ臓細胞をP3×73Ag8.653ミエ
ローマ細胞と4:1の比率で“Galfre,G.等、Nature266:55
0（1977）”のプロトコールに従って融合させた。得ら
れたハイブリドーマ細胞の各アリコートを96ウェルマイ
クロタイタープレートに入れた。各ハイブリドーマ上清
を凝集抑制についてスクリーニングし、１つの抑制ハイ
ブリドーマ（600以上のすべてのウェル試験のうちか
ら）をクローニングし限定希釈によりサブクローニング
した。このサブクローンはRP1/1.1.1.と表示した（以後
“PR1/1"と表示する）。
モノクローナル抵抗RP1/1はLFA−１は発現性細胞系JY
のPMA刺激凝集を一貫して抑制することを見い出した。R
P1/1モノクローナル抗体はいくつかのLFA−１αまたは
βサブユニットに対するモノクローナル抗体よりも等価
かわずかに小さく凝集を抑制した。これに対し、コント
ロールのHLAに対するモノクローナル抗体（これはJY細
胞上に多量に発現する）は凝集を抑制しなかった。モノ
クローナル抗体RP1/1と結合した抗原は細胞間粘着分子
−１（ICAM−１）と定義する。
実施例９ ICAM−１を特性決定するための抗ICAM−１モノクローナ
ル抗体の使用 ICAM−１の性質を限定するために、特にICAM−１がLF
A−１と異なるかどうかを決定するために、細胞たん白
質をモノクローナル抗体RP1/1を用いて免疫沈降させ
た。免疫沈降は“Rothlein,R.等の方法に従って行った
〔J.Immunol.137:1270−1274（1986）〕。JY細胞を新た
に1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド、0.2単位
/mのトリプシンインヒビターアプロチニンを加えた１
％トリトンＸ−100、0.14mのNaCl、10mMのトリス、pH8.
0（溶解バッファー）中で５×107細胞/mで20分間、４
℃で溶解させた。溶解物を10,000xgで10分間遠心しCNBr
活性化グリシン抑制セファローズCl−4Bの50％懸濁液50
mで１時間、４℃で前処理した。1mの溶解物をセフ
ァローズCl−4Bに結合させたモノクローナル抗体（1mg/
m）の50％懸濁液の20μで４℃で一夜免疫沈降させ
た〔Springer,T.A.等、J.Exper.Med.160:1901（198
4）〕。セファローズ結合モノクローナル抗体は“Marc
h,S.等、の方法に従って炭酸塩バッファー中のセファロ
ーズCl−4BのCNBr活性化法を用いて調製した〔Anal.Bio
chem.60:149（1974）〕。洗浄した免疫沈降物をSDS−PA
GEおよび銀染色に“Morrissey,J.H.Anal.Biochem.117:3
07）1981）”の手順に従って供した。
SDSサンプルバッファー〔HD、M.K.等、J.Biol.Chem.2
58:636（1983）〕による100℃でのたん白質溶出後、各
サンプルを半分に分けて還元（第5A図）または非還元
（第5B図）の各条件下で電気泳動（SDS−８％PAGE）に
供した。分子量50Kdおよび25Kdを有するバンドはモノク
ローナル抗体セファローズからの免疫グロブリンの長鎖
および短鎖に相当した（第5A図、レーン３）。25〜50Kd
分子量範囲の可変量の他のバンドも観察したが、ヘアリ
ー白血病細胞からの沈降物中では見られず、この白血病
細胞は90Kd分子量バンドのみを与えた。LFA−１の177Kd
αサブユニットおよび95Kdβサブユニットは還元（第5A
図、レーン２）および非還元（第5B図、レーン２）の両
条件下でICAM−１とは異なって浸透した。
PHA−リンパ芽球凝集に対してのモノクローナル抗体R
P1/1の効果を測定するために、実施例２で記載した定量
凝集アッセイを用いた。即ちＴ細胞芽球細胞をPHAで４
日間刺激し、十分に洗浄し、次いでIL−２状態調節培地
の存在下に６日間培養した。PHAはこの６日間培養で取
り込まれ凝集アッセイに寄与しなかった。異なるＴ細胞
芽球調製物による３種のアッセイにおいて、ICAM−１モ
ノクローナル抗体は一貫して凝集を抑制した（第２
表）。
ａ 50ng/mのPHAで刺激したPHA誘起リンパ芽球の凝集
は実施例２に記載したようにして非凝集細胞の数を顕微
鏡により計数することによって間接的に定量した。ｂ PMAおよびX63モノクローナル抗体で処理した細胞に
対する％抑制ｃ 凝集はモノクローナル抗体およびPMAの刺激的添加
後１時間で測定した。ｄ 負の数は凝集の％促進を示す。ｅ 凝集はモノクローナル抗体およびPMAの刺激的添加
後１時間で測定した。細胞は200XGで１分間でペレット
化し、37℃で15分間インキュベートし、ゆるやかに再懸
濁し、100rpmで45分間振とうした。ｆ 細胞はPHAで37℃、４時間前処理した。モノクロー
ナル抗体添加後、各チューブを37℃で20分間静置インキ
ュベートし、75rpmで100分間振とうさせた。
LFA−１モノクローナル抗体はICAM−１モノクローナ
ル抗体よりも一貫して抑制的であり、一方、HLA−Ａ、
ＢおよびLFA−３モノクローナル抗体は効果なしであっ
た。これらの結果は試験したモノクローナル抗体のう
ち、LFA−１またはICAM−１に結合し得るモノクローナ
ル抗体のみが細胞粘着を抑制し得ることを示している。
実施例10 ICAM−１に対するモノクローナル抗体の調製 免疫 Balb/cマウスをRPMI培地中の２×107JY細胞0.5mで
融合前の103日および24日腹腔内（i.p.）免疫した。融
合前４日および３日に、マウスを0.5mのRPMI培地中の
PMA分化U937細胞でi.p.免疫した。
U937細胞の分化 U937細胞（ATCC CRL−1593）を10％のウシ胎児血
清、１％グルタミンおよび50mの2ng/mホルボール−
12−ミリステートアセテート（PMA）含有ジエタマイシ
ン（完全培地）を含むRPMI中５×105/mで滅菌ポリプ
ロピレン容器中でインキュベートすることによって分化
した。このインキュベーションの第３日で、1/2容量の
培地を除去し新しいPMH含有完全培地で置き換えた。４
日目で、細胞を取り出し、洗浄して免疫用に調製した。
融合 免疫マウスからのひ臓細胞をGalfre等に従ってP3×63
Ag8.653ミエローマ細胞と4:1の比で融合させた〔Nature
266:550（1977）〕。融合後、細胞を96ウェル平底マイ
クロタイタープレートに105ひ臓細胞／ウェルで入れ
た。
抗ICAM−１陽性細胞の選択 １週間後、50μの上清を凝集用細胞系としてJYおよ
びSKW−３の両方を用いて実施例２の定量凝集アッセイ
でスクリーニングした。JY細胞凝集を抑制するがSKW−
３凝集は抑制しない上清からの細胞を選択し限定希釈を
用いて２回クローニングした。
この実験により、抗ICAM−１モノクローナル抗体を産
生する３種のハイブリドーマ系の同定およびクローニン
グができた。これらのハイブリドーマ系により産生した
抗体は、それぞれ、IgG2a、IgG2bおよびIgMであった。I
gG2a抗ICAM−１抗体は産生するハイブリドーマ細胞系は
表示R6′５′D6′E9′B2とした。この好ましいハイブリ
ドーマ細胞系により産生した抗体はR6′５′D6′E9′B2
と表示した（以下、“R6−５−D6"と称する）。
実施例11 ICAM−１の発現と規格化 ICAM−１発現を測定するために、ラジオイムノアッセ
イを行った。このアッセイにおいては、精製RP1/1をイ
オドゲンを用いて10μCi/μｇの特定の活性にヨー素化
した。内皮細胞を96ウェルプレート中で増殖させ各実験
で述べたようにして処理した。各プレートを直接氷上で
はなく冷室に0.5〜１時間置くことによって４℃に冷却
した。各単一層を冷完全培地で３回洗浄し次いで４℃で
30分間125I RP1/1でインキュベートした。次いで、単
一層を完全培地で３回洗浄した。結合125Iを0.1N NaOH
を用いて放出し計数した。125I RP1/1の特異活性を未
認識RP1/1を用いて調整して本試験において用いる抗原
密度範囲に亘って直線状シグナルを得た。非特異結合を
1,000倍過剰の未標識RP1/1の存在下で測定し総結合から
差引き特異性結合を得た。
上述のラジオイムノアッセイを用いて測定したICAM発
現はヒトヘソ帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト伏状
静脈内皮細胞（HSVEC）上でIL−１、TNF−、LPSおよびI
NFガンマーにより増大する（第３表）。伏状静脈内皮細
胞は本試験においては成人組織由来の培養大静脈内皮細
胞中のヘソ帯静脈内皮細胞からの結果を確認するために
用いた。ICAM−１の基礎的発現はヘソ帯静脈内皮細胞よ
りも伏状静脈内皮細胞上で２倍高い。ヘソ帯静脈内皮細
胞の組換えIL−１アルファ、IL−１ベータ、およびTNF
への露出はICAM発現を10〜20倍増大させる。IL−１アル
ファ、TNFおよびLPSは最大効力インデューサーであり、
IL−１は重量基準および応答の飽和濃度では効力はそれ
より小さい（第３表）。100ng/mでのIL−１ベータはI
CAM−１発現をHUVEC上で９倍、HSVEC上で7.3倍増大さ
せ、半−最高増加は15ng/mで起った。50ng/mのrTNF
はICAM−１発現をHUVEC上で16倍、HSVEC上で11倍増大さ
せ、半−最高効果は0.5ng/mであった。インターフェ
ロンガンマーはICAM−１発現において10,000U/mでHUV
EC上で5.2倍またはHSVEC上で3.5倍の有意の増大を示し
た。10μg/mでのLPSの効果はrTNFの効果と強さにおい
て同じようであった。これら媒介物の対の組合せはICAM
−１発現において追加の効果または追加の効果よりもわ
ずかに小さい効果をもたらした（第３表）。rTMFとrIL
−１ベータまたはrIFNガンマーとの交差滴定は次善また
は最善の濃度での効果において共働作用を示さなかっ
た。
LPSは培地中でときどき見い出される基準で内皮細胞
上でのICAM−１発現を増大させたので、基礎的ICAM−１
発現がLPSに基づき得る可能性を試験した。いくつかの
血清バッチを試験したとき、低エンドトキシン血清が25
％までの低ICAM−１基礎発現を与えることを見い出し
た。ここで示した結果はすべて低エンドトキシン血清中
で増殖させた内皮細胞のものであった。しかしながら、
LPS中和性抗生物質ポリミキシンＢの10μg/mでの添加
はICAM−１発現をわずかに追加の25％に減少させた（第
３表）、IL−１またはTNFによる処理時のICAM−１発現
の増大はこれらの調製物中の低エンドトキシン値と一致
させた10μg/mポリミキシンＢの存在によっては効果
はなかった（第３表）。
HVECおよびHSVEC−HUVECまたはHSVEC上のICAM−１発
現の上方規格化（upregulation）は96ウェプレートに1:
3で融合性単一層から種付し融合状に増殖させた。次い
で細胞を各物質または倍地で16時間処理しRIAを方法的
に行った。すべての数値は４回繰返しで行った。
実施例12 ICAM−１のインターロイキン１およびガンマーインター
フェロン誘起の動力学 皮ふ繊維芽細胞上でのICAM−１発現へのインターロイ
キン−１およびガンマーインターフェロン効果の動力学
をDustin,M.L.等の125Iヤギ抗マウスIgG結合アッセイを
用いて測定した。〔J.Immunol，137:245−254（198
6）；該文献は参考として本明細書に引用する。〕この
結合アッセイを行うために、ヒト皮ふ繊維芽球を96ウェ
ルマイクロタイタープレート中で２〜８×104細胞／ウ
ェル（0.32cm2）に増殖させた。細胞を実施例１で記載
したようにして補充したRPMI1640培地で２回洗浄した。
細胞をさらにハンクス平衡塩溶液（HBSS）、10mMのHEPE
S、0.05％NaN3および10％の熱不活性ウシ胎児血清で１
回洗浄した。この結合用バッファーでの洗浄は４℃で行
った。各ウェルに上記の結合用バッファー50μおよび
X63およびW6/32による適当なハイブリドーマ上清50m
を、それぞれ陰性および陽性コントロールとして加え
た。30分間、４℃でのインキュベーション後、ウェルを
２回結合用バッファーで洗浄し、第２の抗体125I−ヤギ
抗マウスIgGを100μ中50nCiで加えた。125I−ヤギ抗
マウス抗体はイオドゲン（Pierce社）を用いてFraker,
P.J.等の方法に従って調製した（Biochem.Biophys.Res.
Commun.80:849（1978）〕。４℃で30分後、ウェルを２
回200μの結合用バッファーで洗浄し、細胞層を100μ
の0.1N NaOHを加えることによって可溶化した。この
処理および100μ洗浄はベックマン5500ガンマーカウ
ンター中で計数した。分当り結合の特異的カウントを
〔モノクローナル抗体によるcpm〕−〔X63によるcpm〕
として計算した。特異的試剤による誘起を含むすべての
工程は４回繰返しで行った。
ICAM−１誘起における半減期２時間を有するインター
ロイキン１の効果は半減期3.75時間を有するガンマーイ
ンターフェロンの効果よりも急速であった（第６図）。
ICAMの静止レベルに戻る時間は細胞サイクルまたは細胞
増殖によっているようであった。静止状態細胞において
は、インターロイキン１およびガンマーインターフェロ
ン効果は２〜３日安定であり、一方対数期培養において
は、ICAM−１発現はこれら誘起剤の除去後２日で基本線
に近い。
組換えマウスおよびヒトインターロイキン１によるIC
AM−１誘起および組換えガンマーインターフェロンによ
るICAM−１誘起のドーズレスポンス曲線を第７図に示
す。ガンマーインターフェロンおよびインターロイキン
１は1ng/mで殆んど同一の効果を有する同じような濃
度依存性を有することが判った。ヒトおよびマウス組換
えインターロイキン１も同様な曲線を有するが、ICAM−
１発現の誘起においてヒトインターロイキン１製剤より
もかなり低い効果を示している。
シクロヘキシミド（たん白質合成のインビビター）お
よびアクチノマイシンＤ（mRNA合成のインビビター）は
繊維芽球上でのICAM−１発現におけるインターロイキン
１およびガンマーインターフェロンの効果を壊滅させる
（第４表）。さらにまた、ツニカマイシン（Ｎ結合グリ
コシル化のインヒビター）のみはインターロイキン１効
果を43％まで抑制した。これらの結果はたん白質および
mRNA合成がICAM−１発現におけるインターロイキン１お
よびガンマーインターフェロン誘起増大において必要で
あるがＮ−結合グリコシル化の方はそれを必要としない
ことを示している。
ａヒト繊維芽球を８×104細胞/0.32cm2ウェルの密度
に増殖させた。処理は各試剤を含有する50μ最終濃度
で行った。シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤおよ
びツニカマイシンは、それぞれ、サイトカインと同じ時
間で20μg/m、10μＭおよび２μg/mで加えた。すべ
ての数値は４回重複ウェルの平均±SDである。
実施例13 ICAM−１の組織分布 組織化学試験をヒト器官の凍結組織上で行い胸線、リ
ンパ節、腸、皮ふ、じん臓および肝臓中のICAM−１の分
布を測定した。そのような分析を行うために、正常ヒト
組織の凍結組織切片（４μｍ厚さ）をアセトン中で10分
間固定したモノクローナル抗体、RR1/1でCerf−Bensuss
an、N.等により開示されたアジピン−ビオチンコンプレ
ックス法（Vector Laboratories社、バーリンゲーム、C
A）を用いたイムノパーオキシダーゼ法により染色した
〔J.Immunol. 130:2615（1983）〕。抗体とのインキュ
ベーション後、切片をビオチン化ウマ抗マウスIgGおよ
びアビチン−ビオチン化パーオキシダーゼ複合体で順次
インキュベートした。各切片は最終的には３−アミノ−
９−エチル−カルバゾール（アルドリッチケミカル社、
ミルウォーキー、WI）を含有する溶液に浸して呈色反応
を行った。次いで、各切片を４％ホルムアルデヒド中で
５分間固定させてヘマトキシリンで対向染色（counters
tain）させた。コントロール（対照）はRRI/1抗体の代
りに無関係のモノクローナル抗体でインキュベートした
切片を含んでいた。
ICAM−１は主要組織親和性コンプレックス（MHC）ク
ラスII抗原の分布と殆んど同じ分布を有していることが
判った。すべての組織中の血管（大および小共に）の殆
んどはICAM−１抗体による内皮細胞染色を示した。管内
皮染色はじん臓、肝臓および正常皮ふ中の血管に較べて
リンパ節、へん桃腺およびパイヤー班中の小胞間（パラ
コーチカル）領域でより強い。肝臓においては、染色は
殆んど洞様毛細血管ライニング細胞に限定され、門静脈
および動脈の殆んどライニングしているヘパトサイトお
よび内皮細胞は染色されなかった。
胸線ずい質においては、大細胞の拡散染色および樹木
染色模様がみられた。皮質においては、染色像は巣状で
あり主として樹木状であった。胸腺細胞は染色されてな
かった。末梢リンパ球組織においては、２次リンパ濾胞
の胚中心細胞は強く染色していた。あるリンパ濾胞にお
いては、染色像は殆んど樹木状であり、リンパ球の認識
し得る染色はしなかった。マントル領域の細胞のかすか
な染色も観察された。さらに、細胞質拡大（指間小網細
胞）を有する樹木状細胞および小胞内またはパラコーチ
カル領域のリンパ球の小数はICAM−１結合性モノクロー
ナル抗体で染色していた。
細胞様マクロファージはリンパ節および小腸の薄膜プ
ロプリア内で染色されていた。試験した器官の殆んどの
ストローマ内に拡散している繊維芽球様細胞（スピンド
ル形細胞）はICAM−１結合性抗体により染色していた。
外皮中のランゲルハンス／不定細胞中では染色は認めら
れなかった。平滑筋組織中でも染色は観察されなかっ
た。
外皮細胞の染色はへん桃腺の粘膜中で一貫して見られ
た。肝細胞、肝管外皮、腸外皮細胞、およびじん臓中の
管状外皮細胞は殆んどの情況において染色されなかった
が、じん細胞がん腫を有するじん摘出片からの正常じん
臓組織の切片はICAM−１の多くの隣接管状細胞の染色を
示した。これらの管状外皮細胞はまた抗HLA−DR結合性
抗体によっても染色していた。
要するに、ICAM−１は管状外皮細胞のような非造血細
胞上、および組織マクロファージおよびマイトジエン刺
激Ｔリンパ芽球のような造血細胞上に発現する。ICAM−
１は末梢血リンパ球に少量発現することが判った。
実施例14 モノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィーに
よるICAM−１の精製 一般的精製手順 ICAM−１をヒト細胞または組織からモノクローナル抗
体アフィニティクロマトグラフィーを用いて精製した。
ICAM−１と反応性のモノクローナル抗体RP1/1を最初に
精製して不活性カラムマトリックスに結合させた。この
抗体は“Rothlein,R.等、J.Immunol. 137:1270−1274
（1986）”および“Dustin,M.L.等、J.Immunol. 137:2
45（1986）”に記載されている。ICAM−１を細胞膜から
細胞を非イオン性清浄剤トリトンＸ−100中で近中性pH
で溶解することによって可溶化した。可溶化ICAM−１を
含有する細胞溶解物をカラムマトリックス材料に非特異
的に結合する物質を除去するように設計されたプレカラ
ムに通し、次いでモノクローナル抗体カラムマトリック
スに通してICAM−１を抗体に結合させた。抗体カラムを
pHをpH11.0まで上昇させた一連の洗浄剤洗浄バッファー
で洗浄した。これらの洗浄中、ICAM−１は抗体マトリッ
クスに結合したままであり、結合してないまた弱く結合
している不純物は除去された。次いで、結合ICAM−１を
pH12.5の洗浄剤バッファーを適用することによってカラ
ムから特異的に溶出させた。
モノクローナル抗体RR1/1の精製およびセファローズCL
−4Bへの共有結合 抗ICAM−１モノクローナル抗体RP1/1をハイブリドー
マ含有マウスの腹水またはハイブリドーマ培養上清から
標準の硫酸アンモニウム沈降法およびプロティンＡアフ
ィニティークロマトグラフィーにより精製した〔Ey等、
Immunochem. 15:429（1978）〕。精製IgGまたはラットI
gG（シグマケミカル社、セントルイス、MO）をセファロ
ーズCL−4B（ファルマシア社、スウェーデン）にMarch
等の方法〔Anal.Biochem.60:149（1974）〕の修正法を
用いて共有結合させた。要するに、セファローズCL−4B
を蒸留水で洗浄し、5MのK2HPO4（pH約12）中の40mg/m
CNBrで５分間活性化し、次いで0.1mM HClで４℃にて長
く洗浄した。濾過し活性化したセファローズを等容量の
精製抗体（0.1M NaHCP3、0.1M NaCl中２〜10mg/m）で
再懸濁させた。懸濁液を４℃で18時間ゆるやかな端から
端までの回転によりインキュベートした。次いで、上清
を末結合抗体について280nmの吸収によりモニターし、
活性化セファローズの残りの反応部位をグリシンを0.05
Mに加えることによって飽和させた。結合効率は通常90
％以上であった。
ヒトひ臓から調製した膜の洗浄剤可溶化 すべての手順を４℃で行った。ヘアリー細胞白血病の
患者からの凍結ヒトひ臓（200gフラグメント）を氷上で
1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMS
F）、0.2U/mのアプロチニンおよび5mMのイオドアセタ
ミドを含有する200mトリス−塩水（50mMのTris:0.14M
のNaCl、４℃でpH7.4）中に溶解させた。組織を小片に
切断し４℃でテクマー強力ホモジナイザーで均質化し
た。容量をトリス−塩水で300mとし、トリス−塩水中
10％トウィーン40（ポリオキシエチレンソルビタンモノ
パルミテート）100mを加え最終濃度2.5％トウィーン4
0を得た。
膜を調製するため、均質化物を３ストロークのドンス
（Dounce）またはより好ましくはテフロンポッターエル
ブジャムホモジナイザーを用いて抽出し、次いで1000xg
で15分間遠心した。上清を残し、ペレットをトリス−塩
水中の2.5％トウィーン40の250mで再抽出した。1000x
gで15分間の遠心後、両抽出物からの上清を一緒にし15
0,000xgで１時間遠心して膜をペレット化した。膜を200
mのトリス−塩水中に再懸濁させることによって洗浄
し、150,000xgで１時間遠心した。膜ペレットを200m
のトリス−塩水中に再懸濁させ、モーター駆動ホモジナ
イザーおよびテフロンペストルで懸濁液が濃密になるま
で均質化した。容量を次いでトリス−塩水で900mまで
にし、Ｎ−ラウロイルサルコシンを最終濃度１％になる
よう加えた。４℃で30分の攪拌後、洗浄剤溶解物中の不
溶性物質を150,000xg、１時間での遠心により除去し
た。トリトンＸ−100を上清に最終濃度２％に加え、溶
解物を４℃で１時間攪拌した。
JYB−リンパ芽球細胞の洗浄剤可溶化 EBV形質転換Ｂ−リンパ芽球細胞系JYを10％ウシ胎児
血清（FCS）および10mM HEPESを含有するRPMI 1640中
で0.8〜1.0×1.06細胞/mの密度に増殖させた。ICAM−
１の細胞表面発現を増大させるため、ホルボール12−ミ
リステート13−アセテート（PMA）を細胞を収穫する前
に25ng/mで８〜12時間で加えた。バナジン酸ナトリウ
ム（50μＭ）もこの時間中に培養物に加えた。細胞を50
0xgで10分間遠心することによってペレット化しハンス
平衡塩溶液（HBSS）中で再懸濁および遠心することによ
って２回洗浄した。細胞（５の培養物当り約5g）を50
mの溶解バッファー（0.14M NaCl、50mM Tris、pH8.
0、１％トリトンＸ−100、0.2μ/mアプロチニン、1mM
のPMSF、50μＭバナジン酸ナトリウム）中に４℃で30分
間攪拌することによって溶解させた。未溶解核および不
溶性片を10,000xgで15分間の遠心、次いで、150,000xg
での１時間の上清の遠心および上清のワットマン3mmフ
ィルター紙による濾過により除去した。
構造検討のためのICAM−１のアフィニティクロマトグラ
フィー 構造検討に使用するICAM−１の大規模精製として、10
mのRP1/1−セファローズCL−4Bのカラム（2.5mgの抗
体／ゲルのｍで結合）、およびCNBr−活性化、グリシ
ン安定化セファローズCL−4BおよびラットIgG結合セフ
ァローズCL−4B（2mg/m）の２種のプレカラムを用い
た。各カラムを直列につなぎ、10カラム容量の溶解バッ
ファー、10カラム容量のpH12.5バッファー（50mMトリエ
チルアミン、0.1％トリトンＸ−100、４℃でpH12.5）で
予備洗浄し次いで10カラム容量の溶解バッファーで平衡
させた。１のヒトひ臓の洗浄剤溶解物を0.5〜1.0ml/
分の流速で負荷させた。２つのプレカラムはRR1/1−セ
ファローズカラムに通す前の溶解物から非特異結合物質
を除去するのに用いた。
負荷後、RP1/1−セファローズのカラムおよび結合ICA
M−１を（１）溶解バッファー、（２）20mM Tris pH8.0
/0.14M NaCl/0.1％トリトンＸ−100、（３）20mMグリシ
ンpH10.0/0.1％トリトンＸ−100、および（４）50mMト
リエチルアミンpH11.0/0.1％トリトンＸ−100の各々最
低５カラム容量で1m／分の流速で順次洗浄した。すべ
ての洗浄バッファーは1mMのPMSFと0.2μ/mのアプロチ
ニンを含んでいた。洗浄後、残留結合ICAM−１を５カラ
ム容量の溶出バッファー（50mMトリエチルアミン/0.1％
トリトンＸ−100/4℃でpH12.5）により1m/3分の流速
で溶出させた。溶出ICAM−１を1mフラクションに集め
直ちに0.1mの1Mトリス、pH6.7を加えて中和させた。I
CAM−１を含有するフラクションを10μのアリコート
のSDS−ポリアクリルアミド電気泳動〔Springer等、J.E
xp.Med.160:1901（1984）〕により次いで銀染色〔Morri
ssey,J.H.,Anal.Biochem.117:307（1981）〕によって同
定した。これらの条件下で、ICAM−１のバルクが約１カ
ラム容量に溶出し、銀染色電気泳動から判断して90％以
上の純度であった（アフィニティーマトリックスから漏
出した少量のIgGが主要不純物であった）。ICAM−１を
含有するフラクションをプールしセントリコン−30マイ
クロコンセントレーター（アミコン社、デンバース、M
A）を用いて約20倍に濃縮した。精製ICAM−１をプール
のエタノール沈降アリコートのローリー（Lowry）たん
白質アッセイにより定量した。約500μｇの純ICAM−１
を200gのヒトひ臓から調製できた。
約200μｇの精製ICAM−１を分離用SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により第２段階の精製に供した。IC
AM−１を示すバンドはゲルを1M KCl中にソーキングする
ことによって可視化させた。ICAM−１を含むゲル領域を
検査して“Hunkapiller等、Meth.Enzymol.91:227−236
（1983）”の方法によって電気溶出させた。精製たん白
質はSDS−PAGEおよび銀染色で判断したとき98％以上の
純度であった。
官能試験のためのICAM−１のアフィニティ精製 官能性試験用のICAM−１を前述したようなJY細胞から
の洗浄剤溶解物から精製したが、小スケール（1mのRR
1/1セファロースカラム）で次の修正を加えて行った。
すべての溶液は50μＭバナジン酸ナトリウムを含んでい
た。カラムを0.1％トリトンＸ−100含有pH11.0バッファ
ーで洗浄後、カラムを0.1％トリトンＸ−100に代えて１
％のｎ−オクチル−ベーダー−Ｄ−グルコピラノサイド
（オクチルグルコシド）含有の同じバッファー５カラム
容量で再洗浄した。オクチルグルコシド洗浄剤はICAM−
１に結合したトリトンＸ−100を除去し、トリトンＸ−1
00と異なりその後透析により除去できる。次いで、ICAM
−１を0.1％トリトンＸ−100の代りに１％オクチルグル
コシドを含むpH12.5バッファーで溶出させ、分析し、上
述のようにして濃縮した。
実施例15 精製ICAM−１の特性 ヒトひ臓から精製したICAM−１はSDS−ポリアクリル
アミドゲル中でMr72,000〜91,000の広いバンドとして浸
透する。JY細胞から精製したICAM−１もMr76,500〜97,0
00の広いバンドとして浸透する。これらMrは種々の細胞
源から免疫沈降させたICAM−１の報告された範囲にあ
る:JY細胞からのMr＝90,000、骨ずい単球細胞系U937上
の114,000、および繊維芽球上の97,000〔Dustin等、J.I
mmunol.137:245（1986）〕。Mrのこの広い範囲は広汎で
あるが変化し得る度合のグリコシル化に貢献する。非グ
リコシル化プレカーサーはMr55,000を有する（Dustin
等）。JY細胞またはヒトひ臓から精製したたん白質は、
その元のアフィニティカラムへの再結合能力によりまた
RR1/1セファローズによる免疫沈降およびSDS−ポリアク
リルアミド電気泳動により明らかなように、その抗原活
性を保持している。
ICAM−１のペプチドフラグメントを調製するために
は、約200μｇを2mMジチオスレイトール/2％SDSで還元
し、次いで5mMの沃化酢酸でアルキル化した。たん白質
をエタノールで沈降させ、0.1M NH4C03/0.1mM CaCl2/0.
1％双性イオン剤（Zwittergent）３−14（カルビオケミ
社）中に再溶解させ、１％ w/wトリプシンで37℃、４
時間消化し、次いで１％トリプシンで37℃、12時間の追
加の消化を行った。トリプシンヘプチドを逆相HPLCによ
り0.4×15cm C4カラム（Vydac社）を用いて精製した。
ペプチドは0.1％トリフルオロ酢酸中で０％〜60％アセ
トニトリルの直線勾配によって溶出した。選択したペプ
チドをガス相マイクロシーケネーター（アプライドバイ
オシステムズ社）での配列分析に供した。この試験から
得られた配列情報を第５表に示す。
実施例16 ICAM−１遺伝子のクローニング ICAM−１の遺伝子は任意の種々の手順を用いてクロー
ニングできる。例えば、ICAM−１のトリプシンフラグメ
ントのシーケンシング（第５表）から得られたアミノ酸
配列情報を用いてICAM−１遺伝子に相当するオリゴヌク
レオチド配列を同定し得る。また、ICAM−１遺伝子は抗
ICAM−１抗体を用いてICAM−１を産生するクローンを検
出することによってもクローニングできる。
オリゴヌクレオチドプローブを用いることによるICAM−
１遺伝子のクローニング 遺伝子コード〔Watson,J.D.,Molecular Biology of t
he Gene,第３版、W.A.ベンジャミン社、メロノパーク、
CA（1977）〕を用いて、１種以上の異なるオリゴヌクレ
オチドを同定でき、その各々はICAM−１トリプシンペプ
チドをコードし得るものである。特定のオリゴヌクレオ
チドが実際に現実のICAM−１コード配列を構成する可能
性は異常な塩基対関係および特定のコドンを現実に真核
細胞を用いて（特定のアミノ酸をコードする）頻度を考
慮することによって評価できる。そのような“コドン利
用法則”は“Lathe,R.等、J.Melec.Biol.183:1〜12（19
85）”により開示されている。Latheの“コドン利用法
則”を用いて、理論的に“最も可能性のある"ICAM−１
トリプシンペプチド配列をコードし得るヌクレオチド配
列（即ち、最低の不要物を有するヌクレオチド配列）を
含有する単一オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ
チドのセットを同定する。
ICAM−１フラグメントをコードし得る理論的に“最も
可能性のある”配列を含むオリゴヌクレオチドはオリゴ
ヌクレオチドのセットを用いて“最も可能性ある”配列
または配列のセットにハイブリッド化し得る相補オリゴ
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットの配列
を同定する。そのような相補配列を含むオリゴヌクレオ
チドはICAM−１遺伝子を同定し単離するプローブとして
使用できる〔Maniatis,T.等、Moleculer Cloning A Lab
oratory Manual,コールド スプリング ハーバー プ
レス社、コールド スプリング、NY（1982）〕。
上記文献のセクションＣに記載されているように、IC
AM−１遺伝子を含有する可能性ある真核DNA調製物からI
CAM−１遺伝子をクローニングすることは可能である。I
CAM−１たん白質をコードする遺伝子を同定しクローニ
ングするためには、DNAライブラリーをその上記のオリ
ゴヌクレオチドプローブとハイブリッド化する能力につ
いてスクリーニングする。正常な二倍体細胞中にはICAM
−１の遺伝子のほんの２つのコピーしか存在しないよう
であるので、またICAM−１遺伝子はクローニングが望ま
れない大きな非転写介在配列（イントロン）を有し得る
可能性があるので、好ましいのはゲノムDNAよりはむし
ろICAM−１産生性細胞のmRNAから調製したcDNAライブラ
リーからICAM−１コード配列を単離することである。適
当なDNAまたはcDNA調製物は酵素的に開裂させ、ランダ
ムにせん断し、連結反応させて組換えベクターとする。
次いで、これら組換えベクターの上述のオリゴヌクレオ
チドプローブとハイブリッド化する能力を測定する。ハ
イブリッド化の手順は、例えば、“Maniatis,T.,Molecu
lar Cloning A Laboratory Manual,コールド スプリン
グ ハーバー プレス社、コールド スプリング ハー
バー、NY（1982）”または“Haymes,B.T.等、Nucleic A
cid Hybridization a Practical Approach,IRLプレス
社、オックスフォード、英国（1985）”において開示さ
れている。そのようなハイブリッド化ができることが判
っているベクターを分析してベクターが含有するICAM−
１配列の程度および性質を分析する。純粋に仮説的な考
察によれば、ICAM−１分子をコードするような遺伝子は
ほんの18ケのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド
を用いて明確に同定できるであろう（ハイブリッド化ス
クリーニングにより）。
即ち、要約すれば、ICAM−１ペプチド配列の現実の同
定により、そのようなペプチドをコードし得る理論的に
“最も可能性ある"DNA配列またはそのような配列のセッ
トの同定ができる。この理論的配列に相補性のオリゴヌ
クレオチドを構築することにより（あるいは“最も可能
性ある”オリゴヌクレオチドのセットに相補的なオリゴ
ヌクレオチドのセットを構築することにより）、ICAM−
１遺伝子を同定し単離するプローブとして機能し得るDN
A分子（またはDNA分子のセット）が得られる。
第５表のICAM−１ペプチド配列を用いて、AAおよびＪ
ペプチドをコードし得るオリゴヌクレオチドの“最も可
能性ある”配列の配列を決定した（それぞれ、第６表お
よび第７表）。これら配列に相補性のオリゴヌクレオチ
ドを合成し精製してICAM−１遺伝子配列を単離するプロ
ーブとした。適当なサイズ選定cDNAライブラリーをPMA
誘起HL−60細胞からおよびps刺激へそ帯静脈内皮細胞か
らのポリ（Ａ）+RNAから調製した。サイズ選定cDNAライ
ブラリーは“Gubler,U.等〔Gene 25:263−269（198
3）〕およびCorbi,A.等〔EMBO J.6:4023−4028（198
7）〕の方法に従ってPMA誘起HL−60細胞からのポリ
（Ａ）+RNAを用いて調製した。これらの文献は参考とし
て本明細書に引用する。
サイズ選定cDNAライブラリーはPS5μg/mで４時間刺
激したへそ帯静脈内皮細胞からのポリ（Ａ）＋を用いて
調製した。RNAは上記細胞を4Mグアニジニウムイソシア
ネート中で均質化し上清をCsCl勾配により超遠心に供す
ることによって抽出した〔Chirgwin,J.M.等、Biochem.1
8:5294−5299（1979）〕。ポリ（Ａ）+RNAは全RNAスペ
イシスの混合物からオリゴ（dT）−セルロースクロマト
グラフィー（タイプ３、コラボラティブ リサーチ社）
を用いて単離した〔Aviv,H.等、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）69:1408−1412（1972）〕。
第１のストランドcDNAを８μｇのポリ（Ａ）+RNA、ト
リ骨ずい芽球症ウイルス逆転写酵素（ライフサイエンス
社）およびオリゴ（dT）プライマーと用いて合成した。
DNA−RNAハイブリッドはラナーゼＨ（BRL社）で消化、
第２ストランドはDNAポリメラーゼＩ（ニューイングラ
ンド バイオラブス社）を用いて合成した。生成物をEc
oR Iリンカー（ニューイングランド バイオラブス社）
でメチル化し、EcoR Iリンカー（ニューイングランド
バイオラブス社）にブラントエンド連結反応させ、EcoR
Iで消化し低融点アガロースゲル上でサイズ選定した。
500bpより大きいcDNAを前以てEcoR I消化させ脱リン酸
化させているλgt10に連結反応させた（ストラタジー
ン）。連結反応生成物を次いでパッケージングした（ス
トラクタジーンゴールド）。
次に、へそ帯静脈内皮細胞およびHL−60cDNAライブラ
リーを20,000PFμ/150mmプレートに塗布した。組換えDN
Aを複製中でニトロセルロースフィルターに移し、0.5M
NaOH/1.5M NaCl中で変性し1Mトリス、pH7.5/1.5M NaC
l中で中和し、80℃で２時間ベーキングした〔Benton,W.
D.等、Science196:180−182（1977）〕。フィルターを
プレハイブリッド化し、５×Denhardt溶液、50mM NaPO4
および１μg/mのサケ精子DNAを含む５×SSC中でハイ
ブリッド化した。プレハイブリッド化は45℃で１時間行
なった。
ハイブリッド化は32bp（′５−TTGGGCTGGTCACAGGAGGT
GGAGCAGGTGAC）または47bp（５′−GAGGTGTTCTCAAACAGC
TCCAGGCCCTGGGGCCGCAGGTCCAGCTC）抗感覚オリゴヌクレ
オチドを上述の方法で、それぞれ、ICAM−１トリプシン
ペプチドＪおよびAA（第６表および第７表）上で用いて
行なった〔Lathe,R.J.Melec.Biol.183:1−12（198
5）〕。オリゴヌクレオチドはｒ−（32P）ATPでT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼおよび製造者（ニューイングラン
ド バイオラブス社）に推奨される条件を用いて末端標
識した。オーバーナイトハイブリッド化に続いて、フィ
ルター２×SSC/0.1％SDSで30分間、45℃で２回洗浄し
た。ファージをハイブリッド化を示すプラーグから単離
し、連続再塗布および再スクリーニングにより精製し
た。
抗ICAM−１抗体の使用によるICAM−１の遺伝子のクロー
ニング ICAM−１の遺伝子を別法として抗ICAM−１抗体の使用
によりクローニングできる。DNAまたはより好ましくはc
DNAをICAM−１を発現し得る細胞から抽出し精製する。
精製cDNAをフラグメント化し（せん断化、エンドヌクレ
アーゼ消化等により）DNAまたはcDNAフラグメントのプ
ールを調製する。このプールからのDNAまたはcDNAフラ
グメントを発現ベクターにクローニングして各々のメン
バーが特異的クローン化DNAまたはcDNAフラグメントを
含有する発現ベクターの遺伝子ライブラリーを調製す
る。
実施例17 cDNAクローンの分析 陽性クローンからのファージDNAをEcoR Iで消化し、
１つのクローンからのcDNAをプローブとして用いてサウ
サーン分析により試験した。交差ハイブリッド化した最
大サイズcDNA挿入物をプラスミドベクターpGEM4Z（プロ
メガ社）のEcoR Iサイトにサブクローニングした。両配
向でcDNAを含むHL−60サブクローンをエンドヌクレアー
ゼIII消化〔Henikoff,S.,Gene 28:351−359（1984）〕
により製造者の推奨（エラスーアーベース、ブロメガ
社）に従って欠落させた。漸次的に欠落させたcDNAを次
いでクローニングしてジデオキシヌクレオチド鎖終端シ
ーケンシングに製造者の推奨（シーケナーゼ、U.S.バイ
オケミカル社）に従って供した〔Sanger,F.等、Proc．N
atl．Acad．Sci（USA）74:5463−5467（1977）〕。HL−
60cDNA5′およびコード領域を両ストランド上で完全に
シーケンシングし、３′領域を両ストランド上で約70％
シーケンシングした。代表的な内皮cDNAをその長さの殆
んどに亘って4bp認識制限酵素フラグメントのショット
ガンクローニングによりシーケンシングした。
１種のHL−60および１種の内皮細胞cDNAのcDNA配列を
確立した（第８図）、3023bp配列は短い５′未ほん訳領
域と位置2966に共通ポリアデヒル化シグナルを有する1.
3kb3′未ほん訳領域を含む。最長開放読み枠は位置58の
第1ATGで始まり位置1653のTGA終端トリプレットで終
る。ほん訳アミノ酸配列と合計91個のアミノ酸の８種の
異なるトリプシンペプチドから決定した配列（第８図中
でアンダーラインを施している）との間の同一性は信頼
できるICAM−1cDNAクローンが単離されたことを認識し
た。ICAM−１トリプシンペプチドのアミノ酸配列を第８
表に示す。
疎水性分析〔Kyte,J.等、J.Melec.Biol.157:105−132
（1982）〕は27残基シグナル配列の存在を示唆してい
る。＋１グルタミンの役目は３種のICAM−１たん白質調
製物上にＮ−末端配列を本発明で得ることができないこ
とと一致しており；グルタミンはフイログルタミン酸に
環状化しブロックしたＮ−末端をもたらす。１〜453の
ほん訳配列は主として親水性であり24残基の疎水性の推
定トランスメンブランドメインが続く。トランスメブラ
ンドメインはその後すぐに27残基の推定細胞質ドメイン
内に含まれた数個の荷電残基が続く。
成熟ポリペプチド鎖の予示サイズは55,219ダルトンで
あり、脱グリコシル化ICAM−１の観察されたサイズ55,0
00と良好に一致している〔Dustin,M.L.等、J.Immunol.
137:245−254（1986）〕。８個のＮ−結合グリコシル
化部位が予示される。これらの部位の２つのトリプシン
ペプチド配列中のアスパラギンの不存在はそれらのグリ
コシル化とそれらの細胞外配向を確認している。高マン
ノースＮ−結合カルボハイドレート当り2,500ダルトン
を想定すると、75,000ダルトンのサイズがICAM−１プレ
カーサーについて予示され、観察されたサイズ73,000ダ
ルトン（Dustion,M.L.等、J.Immunol.137:245−254（19
86）〕に匹敵する。高マンノースのコンプレックスカル
ボハイドレートへの転換後、成熟ICAM−１糖たん白質は
細胞の種類により76〜114kdである〔Dustin,M.L.等、J.
Immunol.137:245−254（1986）〕。即ち、ICAM−１は高
度にグリコシル化されているが典型的な完全膜たん白質
である。
実施例18 ICAM−１は免疫グロブリン超遺伝子群のインテグリン結
合性１員である： ICAM−１内部繰返し配列をミクロジーニ（Microgeni
e）たん白質配列プログラム〔Queen,C.等、Nucl.Acid R
es.12:581−599（1984）〕を用い次いで検査することに
よって行なった。ICAM−１のIgM、Ｎ−CAMおよびMAGへ
の配列をミクロジーニおよびALIGNプログラム〔Daypof
f,M.O.等、Meth.Enzmol.91:524−545（1983）〕を用い
て行なった。ナショナル バイオメデカル リサーチ
ファンデーション（National Biomedical Research Fou
ndation）に保管されている４種のたん白質配列データ
ベースをWilliamsとPearsonのFASTPプログラムを用いて
たん白質配列の類似性について調査した〔Lipman,D.J.
等、Science227:1435−1439（1985）〕。
ICAM−１はインテグリンのリガンドであるので、免疫
グロブリン超遺伝子群の１員であることは予期されなか
った。しかしながら、ICAM−１配列の調査はその配列が
免疫グロブリン超遺伝子群中の身内関係に提唱されたす
べての規準を満たすことを示している。これらの基準を
以下に説明する。
ICAM−１の全細胞外ドメインを第9A図に配列して示し
た５つの相同性免疫グロブリン様ドメインから構築す
る。ドメイン１−４はそれぞれ88、97、98および102の
残基長であり、かくして典型的なIgドメインサイズを有
しており；ドメイン５は68個の残基中で切り取られてい
る。FASTPプログラムを用いてのNBRFデータベースの調
査はIgMとIgG Ｃドメインを包含する免疫グロブリン超
遺伝子群の１員、Ｔ細胞レセプターαサブユニット可変
ドメイン、およびアルファ１ベータ糖たん白質と有意の
相同性を示していた（第9B−Ｄ図）。
上記の情報を用いて、ICAM−１のアミノ酸配列を免疫
グロブリン超遺伝子群の他の１員のアミノ酸配列と比較
した。
Ig超遺伝子群ドメインの３つのタイプであるＶ、C1お
よびC2は分化されている。ＶとＣの両ドメインは内部ド
メインジスルフィド結合により一緒に結合している２β
−シートから構築されており;Vドメインは９つの抗平行
β−ストランドを有しＣドメインは７つ有している。定
常ドメインを第9A図に示した特徴的残基に基づいてC1お
よびC2−セットに分割した。C1−セットは抗原認識中に
含まれるたん白質を含んでいる。C2−セットは数個のFC
レセプターとCD2、LFA−３、MAGおよびNCAMを包含する
細胞粘着中に含まれるたん白質とを含んでいる。ICAM−
１ドメインはこのセット中でICAM−１と置き変っている
C2−セットのドメインと最も強い相同性を有することが
判った；このことは第９図のβ−ストランドＢ−Ｆにつ
いて示されているようにC1ドメインよりもC2中の保持残
基により強く類似している点にも反映されている。ま
た、ICAM−１ドメインはＶおよびC1ドメイン中の上記ス
トランドとよりもC2ドメインのβストランドＡおよびＧ
とより一層良好に列んでおり、全C2ドメイン強度を横切
って良好な配列を可能としている。NCAM、MAGおよびア
ルファ１−β糖たん白質からのC2ドメインとの配列は第
9B図および第9C図に示されており；同一性は28〜33％の
範囲であった。Ｔ細胞レセプターＶα27％同一性および
IgM Ｃドメイン３ 34％同一性との配列も示されてい
る（第9B、9D図）。
免疫グロブリンドメインの最も重要な特徴の１つはβ
シートサンドイッチを安定化するＢおよびＦβストラン
ドを架橋するジスルフィド結合システィンであり;ICAM
−１においてはシスティンはすべての場合に保持されて
いるが、ドメイン４のストランドｆにおいては、上記サ
ンドイッチに面しかついくつかの他のＶ−およびＣ−２
セットドメインにおいて提案されたような接触を安定化
しているロイシンが見い出される。システィン（43、5
0、52および37残基）間の距離はC2セットについて述べ
たとおりである。
ICAM−１中の鎖間ジスルフィド結合の存在について試
験するために、内皮細胞ICAM−１を還元および非還元条
件下でSDS−PAGEに供した。内皮細胞ICAM−１はこれがJ
Yまたは毛状ひ臓細胞ICAM−１よりも小さいグリコシル
化異種原性を示しMr中のシフトにより大きな感応性を示
すことから使用した。従って、ICAM−１を16時間LPS
（５μg/m）刺激ヘソ帯静脈内皮細胞培養物から前述
したようなイムノアフィニティークロマトグラフィーに
より精製した。アセトン沈降ICAM−１を0.25％２−メル
カプトエタノールまたは25mMイオドアセタミド含有のサ
ンプルバッファー〔Lacemmli,U.K.,Nature227:680−685
（1970）〕中に再懸濁させ100℃に５分間もたらした。
サンプルをSDS−PAGE4760および銀染色4613に供した。
内皮細胞ICAM−１は還元条件下で100kdの見掛けのMrを
また非還元条件下で96kdを示し天然ICAM−１中の鎖間ジ
スルフィドの存在を強く示唆していた。
二次構造を予想するための一次配列の使用 〔Chon,P.Y.等、Biochem.13:211−245（1974）〕は、第
9A図上方にａ−ｇと表示され、免疫グロブリンドメイン
についての予想を正確に満たしたまま免疫グロブリン中
のストランドＡ−Ｈの各位置（第9A図下方）に相応する
各ICAM−１ドメイン中の７つの予期されたβ−ストラン
ドを示していた。ドメイン５はＡおよびＣストランドを
欠損しているが、これらはシートの端部を形成している
ので、各シートは依然として恐らくはストランドＤによ
って形成しておりいくつかの他のC2ドメインで提案され
たようにストランドＣの代理をしており；またＢおよび
Ｆストランド間の特徴的ジスルフィド結合は影響を受け
ないであろう。即ち、ドメインサイズ、配列相同性、推
定ドメイン間ジスルフィド結合を形成する保持システィ
ン、ジスルフィド結合の存在、および予想βシート構造
の基準はすべて免疫グロブリン超遺伝子群中でのICAM−
１の内在を満たしている。
ICAM−１はC2セットのNCAMおよびMAG糖たん白質と最
も強く相同性であることが判明した。このことはNCAMと
MAGが共に細胞−細胞粘着を媒介するので特に興味深
い。NCAMはニューロン−ニューロンおよび神経−筋相互
作用において重要であり〔Cunningham,B.A.等、Science
236:799−806（1987）〕、またMAGはミエリン化（myeli
nation）中のニューロン−オリゴデントロサイトおよび
オリゴデントロサイト−オリゴデントロサイト相互作用
において重要である〔Poltorak,M.等、J.Cell.Biol.10
5:1893−1899（1987）〕。NCAMとMAGの細胞表面発現は
神経系形成およびミリエン化中に、それぞれ、炎症にお
けるICAM−１の調整された誘起と類似して発展的に調整
される〔Springer,T.A.等、Ann.Rev.Immunol.5:223−25
2（1987）〕。ICAM−１、NCAM〔Cunningham,B.A.等、Sc
ience236:799−806（1987）〕、およびMAG〔Salzer,J.
L.等、J.Cell.Biol.104:957−965（1987）〕は全体構造
において類似しまた相同性である。何故ならば、各々は
Ｎ末端細胞外領域を形成する５つのC2ドメインから構成
された完全膜糖たん白質であるからである。ただし、NC
AMにおいては、ある追加の非Ig様配列が最後のC2ドメイ
ンとトランスメブランドメイン間に存在する。ICAM−１
はトランスメンブランと細胞質ドメインを含むその全体
長に亘ってMAGと21％の同一性を有して列んでおり；同
一％の同一性がICAM−１とNCAM−１の５つのドメインを
比較したとき見出される。ICAM−１とMAGの二次構造の
図式的比較は第10図に示している。ドメイン対ドメイン
の比較はICAM−１とNCAM分子内のドメイン間の相同性の
レベル（それぞれ、×±s.d.21±2.8％および18.6±3.8
％）はICAM−１ドメインをNCAMおよびMAGドメインと比
較したときの相同性のレベル（それぞれ、20.4±3.7お
よび21.9±2.7）と同じであることを示している。NCAM
〔Cunningham,B.A.等、Science236:799−806（198
7）〕;Barthels,D.等、EMBO J.6:907−914（1987）〕
およびMAG〔Lai,C.等、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）84:
4377−4341（1987）〕のＣ−末端領域における別の接合
の証拠は存在するけれども、これが内皮またはHL−601C
AM−１クローンのシーケンシングにおいてあるいは種々
のタイプのICAM−１たん白質バックボーンおよびプレカ
ーサーの研究〔Dustin,M.L.等、J.Immunol.137:245−25
4（1986）〕において見出されたという証拠はない。
ICAM−１は多くの種々の細胞種とのリンパ球相互作用
におけるLFA−１用のリガンドとして機能する。リンパ
球は人工膜２重層に含まれたICAM−１と結合し、これは
リンパ球上にLFA−１を必要としICAM−１とLFA−１の相
互作用を直接示唆している（Marlin,S.D.等、Cell 51:8
13−819（1987）〕。LFA−１は白血球インテグリンであ
り免疫グロブリン様特徴を有しない。白血球インテグリ
ンは１種のインテグリン亜族を含む。他の２つの亜族は
細胞マトリックス相互作用を媒介し、フイブロネクチ
ン、ビトロネクチン、コラーゲンおよびフィブリノーゲ
ンを包含するそのリガンド内の配列REGを認識する〔Hyn
es,R.O.,Cell48:549−554（1987）〕;Ruoslahti,E.等、
Science238:491−497（1987）〕。白血球インテグリン
は白血球上のみに発現し、細胞−細胞相互作用に含ま
れ、わずかに公知のリガンドはICAM−１とiC3b（即ち免
疫グロブリン様特徴を示さない補体成分C3のフラグメン
ト）であり、Mac−１によって認識される〔Kishimoto,
T.K.等、Leukocyte Typing III,McMi Chael,M.編、スプ
リンガー ベルラーグ ニューヨーク（1987）;Springe
r,T.A.等、Ann.Rev.Immunol.5:223−252（1987）;Ander
son,D.C.等、Ann.Rev.Med.38:175−194（1987）〕。配
列分析により、LFA−１により認識されるICAM−１配列
内の潜在的ペプチドは第９表に示す。
ICAM−１はインテグリンに結合する免疫グロブリン超
遺伝子群の１員の最初の例である。これらの群の両方は
細胞粘着において重要な役割を発揮するけれども、両者
間の相互作用は以前には予期されてなかった。これに対
し、免疫グロブリン超遺伝子群内の相互作用は全く一般
的である。インテグリンと免疫グロブリン群との間の相
互作用のさらなる例が発見されるであろうことは全く可
能である。LFA−１はICAM−１とは異なるリガンドを認
識し〔Springer,T.A.等、Ann.Rev.Immunol. ５:223−2
52（1987）〕、白血球インテグリンMac−１は好中球−
好中球粘着のC3biと異なるリガンドを認識する〔Anders
on,D.C.等、Ann.Rev.Med. 38:175−195（1987）〕。さ
らにまた、精製したMAG含有ベシクル（小胞）はMAGであ
るニューリット（neurites）に結合し、かくしてMAGは
異種レセプターと異好性相互作用可能でなければならな
い〔Poltorak,M.等、J.Cell.Biol. 105:1893−1899（1
987）〕。
神経−神経および神経−筋肉細胞相互作用におけるNC
AMの役割は同種親和性NCAM−NCAM相互作用に基づくこと
は示唆されている〔Cunningham,B.A.等、Science 236:
799−806（1987）〕。ミエリン鞘形成中に軸索を取り込
むシュヴアン細胞の隣近回転ループ間の相互作用におけ
るMAGの重要な役割は異種レセプターとの相互作用また
は同種親和性MAG−MAG相互作用に基づき得る。NCAMとの
相同性および免疫グロブリン超遺伝子群内でのドメイン
−ドメイン相互作用の頻繁な出現はICAM−１が同種親和
性相互作用並びにICAM−１−LFA−１異好性相互作用に
係わり得る可能性を引き起こす。しかしながら、同様な
密度のLFA−１とICAM−１を共発現するＢリンパ芽球細
胞の人工または細胞単一層中のICAM−１への結合はＢ−
リンパ芽球のLFA−１ MAbによる前処理によって完全に
抑制され得るが、粘着はICAM−１ MAbによるＢ−リン
パ芽球前処理によって影響されない。ICAM−１ Mabに
よる単一層の前処理は結合を完全に壊滅させている〔Du
stin,M.L.等、J.Immunol.137:245−254（1986）;Marli
n,S.D.等、Cell，51:813−819（1987）〕。これらの知
見は、ICAM−１同種親和性相互作用が全く起った場合、
その作用がLFA−１との異好性相互作用よりもかなり弱
くなければならないことを示している。
白血球インテグリンが基本的に異なる方法でリガンド
を認識する可能性はリガンド結合において重要でありRG
D認識性インテグリン中には存在しないそれらのαサブ
ユニット中の180残基配列の存在と一致する〔Corbi,A.
等、EMBO J.6:4023−4028（1987）〕。Mac−１はiC3b50
86中に存在するRGD配列を認識することが提示されてい
るけれども、ICAM−１中にはRGD配列はない（第８
図）。これはフイブロネクチンペプチドGRGDSPとコント
ロールペプチドGRGESPがICAM−１−LFA−１粘着を抑制
できないことと一致している〔Marlin,S.D.等、Cell．5
1:813−819（1987）〕。しかしながら、PRGGSおよびRGE
KEのような関連配列はICAM−１中に、それぞれ、ドメイ
ン２のβ−ストランドａとｂおよびドメイン２のｃとｄ
間のループに予示される領域において存在しており（第
９図）、従って、認識について受け入れられ得る。興味
あることは相同性MAG分子がドメイン１と２の間にRGD配
列を含むことである〔Poltorak,M.等、J.Cell.Biol.10
5:1893−1899（1987）;Salzer,J.L.等、J.Cell.Biol.
104:957−965（1987）〕。
実施例19 サウサーンおよびノウサーンブロット サウサーンブロットを３種の細胞系から抽出した５μ
ｇの遺伝子DNAを用いて行なった:BL2、バーキットリン
パ腫細胞系（Dr.Gilbert Lenoirから供与）;JYおよびEr
−LCLのEBV形質転換Ｂ−リンパ腫様細胞系。
各DNAを５×製造者が推奨する量のBamH 1とEcoR Iエ
ンドヌクレアーゼ（ニューイングランド バイオラブス
社）で消化した。0.8％アガロースゲルによる電気泳動
に続いて、DNAをナイロン膜（ゼータプローブ、バイオ
ラド社）に移した。フィルターをプレハイブリッド化お
よびα−（32P）d XTP′ｓで標識したHL−60からのICAM
cDNAを用いての標準手法に従ってランダムプライミン
グによりハイブリッド化した。ノウサーンブロット20μ
ｇの全DNAまたは６μｇのポリ（Ａ）+RNAを用いて行な
った。DNAは変性し１％アガローズ−ホルムアルデヒド
ゲルにより電気泳動し、ゼータプローブに電気移動させ
た。各フィルターをプレハイブリッド化し32P標識オリ
ゴヌクレオチドプローブ（前述の）HL−60cDNAプローブ
を用いて前述したようにしてハイブリッド化した（Stau
ton,D.E.等、Embo J.6:3695−3701（1987）〕。
3kb cDNAプローブおよびBamH IとEcoR 1で消化した
遺伝子DNAを用いたサウサーンブロットはそれぞれが単
一遺伝子を示しまたコード化情報の殆どが8kb内に存在
することを示す20および8kbの単一主要ハイブリッド化
性フラグメントを示した。３種の細胞系のブロットにお
いては、制限フラグメント多形性の証拠はなかった。
実施例20 ICAM−１遺伝子の発現 “発現ベクター”は、（適当な転写性および／または
ほん訳性コントロール配列の存在に基づき）ベクターに
クローニングされるDNA（またはcDNA）を発現し得、そ
れによってポリペプチドまたはたん白質を産生し得るベ
クターである。クローニングした配列の発現は発現ベク
ターを適当なホスト細胞に組み込んだときに起る。原核
細胞発現ベクターを用いる場合は、適切なホスト細胞は
クローニングした配列を発現し得る任意の原核細胞であ
ろう。同様に、真核発現ベクターを用いる場合、適切な
ホスト細胞はクローニングした配列を発現し得る任意の
真核細胞である。重要なことは、真核DNAは介在配列を
含み得るので、またそのような配列は原核細胞中では正
確に加工できないので、原核ゲノム発現ベクターライブ
ラリーを産生するためには、ICAM−１を発現し得る細胞
からのcDNAを用いることが好ましい。
cDNAを調製する方法およびゲノムライブラリーを産生
する方法はManiatis,J.等により開示されている〔Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual,コールド スプリ
ング ハーバー プレス社、コールド スプリング ハ
ーバー、NY（1982）〕。
上述の発現ベクター遺伝子ライブラリーを用いてホス
ト細胞のバンクを作る（その各々はライブラリーの１員
を含む）。発現ベクターはホスト細胞に任意の種々の手
段（即ち、形質転換、トランスフェクション、原形質体
融合、エレクトロポーレーション等）によって組み込み
得る。発現ベクター含有細胞のバンクはクローン的に増
殖させ、その各員は個々にアッセイして（イムノアッセ
イを用いて）これらが抗ICAM−１抗体に結合し得るたん
白質を産生するかどうかを測定する。
抗ICAM−１抗体に結合し得るたん白質を産生する細胞
の発現ベクターはさらに分析してこれらのベクターが全
ICAM−１遺伝子を発現（または含有）するかどうか、IC
AM−１遺伝子のフラグメントのみを発現（または含有）
するかどうかあるいは生成物が免疫学的にICAM−１に関
係したとしてもICAM−１ではない遺伝子を発現（または
含有）するかどうかを決定する。そのような分析は任意
の都合の良い方法で行なってよいけれども、好ましいの
は発現ベクターにクローニングされるDNAまたはcDNAの
ヌクレオチド配列を決定することである。そのようなヌ
クレオチド配列を検査してICAM−１のトリプシン消化フ
ラグメント（第５表）と同じアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードし得るかどうかを決定する。
ICAM−１遺伝子をコードするDNAまたはcDNA分子を含
む発現ベクターは、かくして、（ｉ）抗ICAM−１抗体に
結合し得るたん白質の発現を行なう能力；および（ii）
ICAM−１のトリプシンフラグメントの各々をコードし得
るヌクレオチド配列の存在によって認識し得る。そのよ
うな発現ベクターのクローニングDNA分子は発現ベクタ
ーから取り出して純粋な形で単離できる。
実施例21 精製ICAM−１の機能活性 細胞中では、ICAM−１は細胞膜と会合した表面たん白
質として通常は機能する。従って、精製ICAM−１の機能
は分子を人工脂質膜（リポソームまたはベシクル）中に
たん白質を洗浄剤可溶化脂質中に溶解し次いで洗浄剤を
透析により除去することによって再構成させたのち試験
した。JY細胞から精製し洗浄剤オクチルグリコシド中に
上述したようにして溶出したICAM−１をベシクル中に再
構成し、ICAM−１含有ベシクルをガラスカバースリップ
またはプラスチック培養ウェルに融合させてたん白質に
結合する細胞の検出をできるようにした。
平坦膜およびプラスチック結合ベシクルの調製 ベシクルはGay等の方法により調製した〔J.Immunol.
136:2026（1986）〕。即ち、たまごホスファチジルク
ロリンとコレステロールをクロロホルム中に溶解し7:2
のモル比で混合した。脂質混合物をチッ素ガス流下に回
転させながら薄膜に乾燥させ、次いで１時間で凍結乾燥
させすべての痕跡量のクロロホルムを除去した。脂質膜
を１％オクチルグリコシド/0.14M NaCl/20mMトリス（pH
7.2）中にホスファチジルクロリン最終濃度0.1mMに溶解
した。約10μｇの精製ICAM−１またはコントロール膜糖
たん白質としてのヒトグリコホリン（シグマケミカル
社、セントルイス、MO）を溶解脂質の各ｍに加えた。
たん白質−脂質−洗浄剤溶液を200容量の20mMトリス/0.
14M NaCl、pH7.2の３回交換およびHBSSの１回交換に対
して４℃で透析した。
平坦膜はBrian等の方法により調製した〔Proc.Natl.A
cad.Sci.81:6159（1984）〕。ガラスカバースリップ
（直径11mm）を17×洗浄剤（Linbro）の1:6希釈液中で1
5分間煮沸し、一夜蒸留水中で洗浄し、70％エタノール
中に浸し、風乾させた。ICAM−１またはクリコホリンの
いずれかを含有するベシクル懸濁液の80μ小滴を24ウ
ェルクルスタープレートのウェル底部に入れ、上記で調
製したガラスカバースリップを静かに頂部に浮かした。
室温での20〜30分のインキュベーション後、各ウェルを
HBSSで満し、カバースリップをひっくり返して平坦面を
上向きにした。次いでウェルをHBSSで十分洗浄して未結
合ベシクルを除去した。平坦膜表面は全く空気にさらさ
なかった。
ガラス表面に融合させた平坦膜による実験途中で、IC
AM−１を含むベシクルはマルチウェル組織培養プレート
のプラスチック表面に直接結合し、特異的細胞結合によ
り明らかなような機能活性を保持していることが判明し
た。そのようなベシクルは以後“プラスチック結合ベシ
クル（PBV）と称する。というのは、プラスチックに結
合した脂質ベシクルの性質を測定するのではないからで
ある。プラスチック結合ベシクルは30μのベシクル懸
濁液を直接96ウェル組織培養トレイ（ファルコン社）中
のウェル底部に加え次いで平坦膜について述べたように
してインキュベーションおよび洗浄を行うことによって
調製した。
細胞粘着アッセイ 平坦膜またはプラスチック結合ベシクルを用いた細胞
粘着アッセイの両方を本質的に同じ方法で行ったが、PB
Vアッセイの細胞数および容量は平坦膜アッセイで用い
たものの1/5に減じた。
正常コントロールおよびLFA−１を発現できない白血
球粘着欠損（LAD）患者〔Anderson,D.C.等、J.Infect.D
is．152:668（1985）〕からのＴリンパ球を、１μg/m
のコンカナバリン−Ａ（Con−Ａ）を含む末梢血単核細
胞RPMI−1640＋20％FCS中で５×105細胞/mで３日間培
養することによって調製した。次いで、細胞をRPMIで２
回;5mMメチル−アルファ−ｂ−マノフィラノシドで１回
洗浄して残留レクチンを細胞表面から除去した。細胞を
1ng/mの組換えIL−２を含むRPMI/20％FCS中で増殖さ
せ、培養開始後10および22日の間で使用した。
平坦膜またはPBVに結合する細胞を検出するため、Con
A芽球、Ｔ−リンパ腫SKW−３、EBV形質転換Ｂ−リンパ
腫様細胞系JY（LFA−１陽性）およびLFA−１欠損リンパ
腫様細胞系（BBN）〔患者１由来、Springer,T.A.等、J.
Exper.Med.160:1901−1918（1986）〕を1mのRPMI−16
40/10％FCS中の１×107細胞を100μCiのNa51CrO4で37
℃、１時間インキュベートし、次いでRPMI−1640で４回
洗浄し未結合標識を除去することによって放射性標識さ
せた。モノクローナル抗体ブロッキング試験において
は、細胞またはプラスチック結合ベシクルはRPMI−1640
/10％FCS中の20μg/mの精製抗体で４℃にて30分間前
処理し、次いで４回洗浄して未結合抗体を除去した。細
胞結合に関しての２価イオンの効果の実験においては、
細胞をCa2+、Mg2+を含まないHBSS＋10％透析FCSで１回
洗浄し、CaClとMgClを決められた濃度に加えた。すべて
の実験において、細胞および平坦膜またはPBVは適当な
温度（４℃、22℃または37℃）で適当なアッセイバッフ
ァー中で予備平衡させた。
精製ICAM−１に結合する細胞を測定するために、51Cr
標識細胞（平坦膜アッセイでの５×105EBV形質転換体;P
BVアッセイでの１×105EBV形質転換体またはSKW−３細
胞、２×105Con−Ａ芽球）を平坦膜またはPBV上で25Xg
で２分間遠心し、次いで４℃、22℃または37℃で１時間
インキュベーションした。インキュベーション後、未結
合細胞を適当な温度での予備平衡させたバッファーによ
る充填、吸引の８回のサイクルによって除去した。結合
細胞はウェル内容物の0.1N NaOH/1％トリトンＸ−100に
よる可溶化およびガンマーカウンターでの計数によって
定量した。％細胞結合は結合細胞からのcpmを入力細胞
のcpmで割ることによって決定した。平坦膜アッセイに
おいては、入力cpmはカバースリップの表面積を培養ウ
ェルの表面積と比較した比に対して集めた。
これらのアッセイにおいて、EBV形質転換Ｂ−リンパ
腫細胞、SKW−3T−リンパ腫細胞、およびCon−A Tリン
パ芽球は甲膜中のICAM−１に特異的に結合した（第11図
および第12図）。結合は、細胞が等価の量の他のヒト細
胞表面糖たん白質グリコホリンを含んだコントロールの
平坦膜またはベシクルに極めて貧弱にしか結合しなかっ
たことから特異的であった。さらにまた、LFA−１陽性E
BV形質転換体およびCon Ａ芽球も結合したが、それら
のLFA−１陰性等価物は何ら有意の程度に結合せず、結
合が細胞上のLFA−１の存在に依存していることを示し
た。
細胞結合の特異性および細胞LFA−１への依存性の両
方はモノクローナル抗体のブロッキング試験において確
認した（第13図）。JY細胞の結合はICAM−１含有PBVを
抗ICAM−１モノクローナル抗体RR1/1前処理したとき97
％まで抑制できた。同じ抗体による細胞の前処理は殆ん
ど効果がなかった。逆に、抗LFA−モノクローナル抗体R
S1/18は96％まで結合を抑制したがPBVでなく細胞を前処
理したときはわずかであった。LFA−３と反応性のコン
トロール抗体TS2/9（異なるリンパ球表面抗原）は細胞
またはPBVのいずれを前処理したときも有意の抑制効果
はなかった。この実験は人工膜の若干量の不純物のない
ICAM−１自体が観察された細胞粘着を媒介していること
および粘着は結合性細胞上のLFA−１に依存しているこ
とを示している。
人工膜中のICAM−１への細胞の結合はまたLFA−１依
存性粘着系の２つの他の特性：温度依存性と２価カチオ
ンの必要性を示した。第14図に示すように、Con−Ａ芽
球はPBV中のICAM−１に37℃で最も効果的に、22℃で部
分的に、４℃で極めて貧弱に結合した。第15図に示すよ
うに、結合は完全に２価カチオンの存在に依存してい
る。生理学上の濃度においては、Mg2+は単独で最高の細
胞結合を示したが、Ca2+の単独は極めて低レベルの結合
を示した。しかしながら、Ca2+と組合せた通常濃度の1/
10のMg2+は相乗効果を有し最高の結合を示した。
要約すれば、人工膜中に含有させた精製ICAM−１に対
する細胞結合の特異性、モノクローナル抗体による特異
的抑制、および温度および２価カチオンの必要性はICAM
−１がLFA−１依存性の粘着系の特異的リガンドである
ことを示している。
実施例22 アレルギーおよび毒性パッチ試験反応におけるICAM−１
とHLA−DRの発現 ５人の正常人の皮ふ生検をそのICAM−１およびHLA−D
R発現について行った。ある血管中の内皮細胞は通常ICA
M−１を発現するけれども、正常皮ふからのケラチン細
胞にはICAM−１は発現しないことが判った。正常皮ふ生
検からの任意ケラチン細胞上のHLA−DRの染色は観察さ
れなかった。ICAM−１とクラスII抗原の発現動力学をア
レルギー性および毒性皮ふ障害の生検の細胞において検
討した。検討した６人の対象者の半分がハプテンの適用
後４時間でICAM−１を発現したケラチン細胞を有してい
ることが判った（第10表）。ハプテンへの露出時間によ
りケラチン細胞上にICAM−１を発現する人の割合が増大
し、また48時間までにケラチン細胞当りより多くのICAM
−１発現を示す染色強度も増大した。事実、この時点
で、すべての生検のケラチン細胞の部分がICAM−１に対
して陽性に染色した。72時間（ハプテン除去後24時間）
で、８人の対象者の７人がケラチン細胞にICAM−１を発
現しており、１人の対象者のICAM−１発現は48〜72時間
の間に弱くなった。
ａサンプルは少なくとも小群のケラチン細胞が染色し
た場合に陽性とみなした。
ｂすべてのパッチはこの時点で除去した。
組織学上、ハプテンの適用後４時間で採取した生検か
らのケラチン細胞上のICAM−１の染色像は通常小群生状
であった。48時間後、ICAM−１はケラチン細胞の大部分
の表面上に発現し、障害の中心および周辺間に差異はな
かった。染色強度はケラチン細胞が爪角質層に近づいた
とき減少した。これは障害の中心および周辺から採られ
た生検において見い出された。また、この時間でも、パ
ッチ試験は陽性であった（湿潤、紅斑、小胞）。異なる
ハプテンを感受性個々人に適用してもICAM−１発現にお
ける差異は見られなかった。ケラチン細胞以外にも、IC
AM−１は障害部位でいくつかの単核細胞および内皮細胞
上にも発現した。
アレルギー皮ふ障害のケラチン細胞上でのHLA−DRの
発現はICAM−１の発現よりも頻度は小さかった。検討し
た対象者のうち、ハプテン適用後24時間までにHLA−DR
に陽性に染色したケラチン細胞による障害を有するもの
はなかった。事実、わずかに４人の生検サンプルがHLA
−DRを発現したケラチン細胞を有するに過ぎず、HLA−D
Rに陽性でICAM−１に陽性でないケラチン細胞を有する
生検はなかった（第10表）。
アレルギーパッチ試験障害と対照的に、まず油または
ラウリル硫酸ナトリウムで誘発させた毒性パッチ試験障
害は試験のすべての時点でその表面にICAM−１を殆んど
示さないケラチン細胞を有していた（第11表）。実際
に、パッチ適用後48時間で、これはアレルギー性パッチ
試験対象者における最適の時点であるが、14人の毒性パ
ッチ試験対象者のうちの１人が障害中にICAM−１を発現
するケラチン細胞を有していた。また、アレルギー性パ
ッチ試験生検と対照的に、毒性パッチ試験障害のケラチ
ン細胞上にHLA−DRは発現しなかった。
これらのデータはICAM−１が免疫系炎症中で発現し毒
性系炎症では発現しないことを示しており、かくして、
ICAM−１の発現は、疾患が免疫抑制治療剤の拒絶または
尿毒性によるのかどうかの判断が難しい腎移植患者にお
ける急性腎疾患のような免疫系および毒性系炎症を区別
するのに使用できる。腎生検およびICAM−１発現の向上
の評価が免疫系拒絶と非免疫系毒性反応の区別を可能に
するであろう。
ａサンプルは少なくともケラチン細胞の小群が染色さ
れた場合陽性とみなした。
ｂすべてのパッチはこの時点で除去した。
実施例23 良性皮ふ病中のICAM−１とHLA−DRの発現 種々のタイプの炎症性皮ふ病を有する患者からの傷害
の皮ふ生検からの細胞をそのICAM−１とHLA−DRの発現
について検討した。アレルギー性接触湿疹、天疱瘡、お
よび扁平苔癬の生検中のケラチン細胞の１部はICAM−１
を発現した。扁平苔癬は48時間アレルギー性パッチ試験
生検で見られた結果と同等か幾分強い像により最も強く
染色を示した（第12表）。アレルギー性パッチ試験の結
果と同様に、最も強いICAM−１染色は高単核細胞浸潤部
位で見られた。さらにまた、試験した11の扁平苔癬生検
のうちの８つはケラチン細胞上でHLA−DR発現について
陽性であった。
発疹とじんま疹を有する患者の皮ふ生検からのケラチ
ン細胞上のICAM−１の発現は少なかった。これらの疾患
を有する試験した７人の患者のうち４人のみが障害部位
でICAM−１を発現したケラチン細胞を有していた。HLA
−DR発現は１人の患者においてのみであり、これはICAM
−１と関連していた。
試験した良性炎症皮ふ病のすべてからの内皮細胞およ
び単核細胞浸潤の部分は変化度合でICAM−１を発現して
いた。
ａサンプルは少なくともケラチン細胞の小群が染色さ
れた場合陽性とみなした。
実施例24 乾癬皮ふ病のケラチン細胞上でのICAM−１発現 乾癬を有する５例の患者からの皮ふ生検中のICAM−１
発現をPUVA治療の開始前および治療途中で周期的に検討
した。生検は組織学によって認識した古典的乾癬を有す
る５例の患者から得た。生検はPUVA治療の前および指示
された時間中に連続的に採取した。PUVAは週に３〜４回
投与した。生検は５例の患者の乾癬斑の周辺から採取
し、生検以外に、これら患者の４人の臨床的に正常な皮
ふからも採取した。
各新鮮皮ふ生検試料を凍結し、液体チッ素中に保存し
た。６ミクロンの保存切片を一夜室温で風乾し、アセト
ン中で10分間固定し、直ちに染色しまたはアルミニウム
ホイルで包み染色するまで−80℃で保存した。
染色は次の方法で作った。切片をモノクローナル抗体
でインキュベートし、ジアミノベンジンH2O2、基質を用
いて３段階のイムノパーオキシダーゼ法により染色した
〔Stein,H.等、Adv.Cencer Res．42:67−147、（198
4）〕。へん桃腺およびリンパ節を抗ICAM−１およびHLA
−DR染色用の陽性コントロールとして用いた。一次抗体
の不存在下で染色した組織は陰性コントロールであっ
た。
HLA−DRに対するモノクローナル抗体をBecton Dickin
son社（カリホルニア州マウンテンビュー）から購入し
た。抗ICAM−１モノクローナル抗体はR6−５−D6であっ
た。パーオキシダーゼ接合ウサギ抗マウスIgおよびパー
オキシダーゼ接合ブタ抗ウサギIgはスウェーデン、コペ
ンハーゲンのDAKAPATTSより購入した。ジアミノベンジ
ジン−テトラヒドロクロリドはシグマ社（セントルイ
ス）より得た。
試験の結果は数種の血管の内皮細胞が疾患および正常
皮ふの両方でICAM−１を発現していることを示したが、
染色強度およびICAM−１を発現する血管の数は乾癬皮ふ
病変内で増大した。さらに、５例の患者からの未治療乾
癬皮ふ病変のケラチン細胞中のICAM−１の発現像はわず
かに小群の細胞染色から多数のケラチン細胞が染色され
ているまでに変化した。PUVA治療の途中では、２例の患
者（患者２と３）のICAM−１発現は臨床的軽快に先行し
てあるいは同時に著しい低減を示した。患者１、４およ
び５は、それぞれ、臨床的軽快あるいは悪化に相関して
PUVA治療中にICAM−１発現を減少あるいは増大させた。
PUVA治療前後の正常皮ふからのケラチン細胞上ではICAM
−１発現はなかった。このことはPUVAは正常皮ふからの
ケラチン細胞上にICAM−１を誘起しないことを示してい
る。
注目すべきことは単核細胞浸潤密度はケラチン細胞上
のICAM−１発現量と相関していることであった、このこ
とはICAM−１発現も弱まったときPUVA治療中の障害中の
単核細胞の数も減少することおよびケラチン細胞上のIC
AM−１発現がより顕著になったときPUVA治療中の単核細
胞の数が増大することの両方に関係している。内皮細胞
および皮ふ単核細胞もまたICAM−１陽性である。臨床的
に正常な皮ふにおいては、ICAM−１発現はケラチン細胞
の標識化なしで内皮細胞に確認された。
ケラチン細胞上のHLA−DRの発現は可変的であった。I
CAM−１陽性でないHLA−DR陽性生検は存在しなかった。
要約すれば、これらの結果は、治療前では、ICAM−１
発現はケラチン細胞上で高く、単核細胞浸潤密度と相関
していることを示している。PUVA治療中は、ICAM−１染
色の著しい減少が臨床的改善と平行して見られる。組織
学的には、皮ふ浸潤は消失していた。臨床的悪化が治療
中に見られる場合には、ケラチン細胞上のICAM−１の発
現並びに皮ふ浸潤密度も増大した。臨床的軽快が治療中
に見られたときは、ケラチン細胞上のICAM−１染色の同
時の減少並びに皮ふ浸潤の減少があった。即ち、ケラチ
ン細胞上のICAM−１の発現は皮ふの単核細胞浸潤密度に
相応していた。これらのデータはPUVA治療に対する臨床
的応答は単核細胞のよりおだやかな下降と平行してケラ
チン細胞上のICAM−１発現の促進された減少をもたらす
ことを示している。このことはケラチン細胞上のICAM−
１発現が皮ふ浸潤の開始および持続に応答性であるこ
と、およびPUVA治療がICAM−１を下方調整し皮ふ浸潤お
よび炎症応答を緩和していることを示している。データ
はまたPUVA治療中のケラチン細胞上のHLA−DRが発現が
変化性であったことも示している。
乾癬障害のケラチン細胞上のICAM−１発現は障害臨床
上の厳正さおよび皮ふ浸潤の大きさと相関している。即
ち、ICAM−１は乾癬において中心的役割を発揮し、その
発現の抑制および／またはその単核細胞上でのCD18コン
プレックスとの相互作用の抑制は本病変の有効な治療と
なるであろう。さらにまた、ケラチン細胞上のICAM−１
発現をモニターすることは乾癬の診断、予防、および治
療経過を評価するための有効な手段となるであろう。
実施例25 悪性皮ふ病中のICAM−１とHLA−DRの発現 良性皮ふ状態の病変とは異なり、悪性皮ふ傷害からの
ケラチン細胞上のICAM−１の発現は変化に富んでいた
（第14表）。試験した皮ふＴ−細胞リンパ腫23例のう
ち、ICAM−１陽性ケラチン細胞は14例のみにおいて同定
された。菌状息肉腫病変の生検からのケラチン細胞で
は、病気の進行がより前の段階に進むにつれてそのICAM
−１発現を消化する傾向にあった。しかしながら、ICAM
−１発現は皮ふＴ細胞リンパ腫病変の殆んどからの変化
割合の単核細胞浸潤上に見られた。試験した残りのリン
パ腫のうちでは、８つのうち４つがICAM−１を発現した
ケラチン細胞を有していた。試験した悪性皮ふ病を有す
る29人の患者のうち、５例はICAM−１を発現することな
しにHLA−DRを発現したケラチン細胞を有していた（第1
4表）。
ａ各サンプルは少なくともケラチン細胞の小群が染色
された場合陽性とみなした。
実施例26 ヒト末梢血単核細胞の増殖上の抗ICAM−１抗体の効果 ヒト末梢血単核細胞を抗原またはマイトジェンの存在
および認識より誘起させ増殖させる。マイトジェン、コ
ンカナバリンＡまたはＴ細胞結合性抗体OKT3のようなあ
る種の分子は末梢血単核細胞の非特異的増殖を引き起こ
す。
ヒト末梢血単核細胞はこれらが特異的抗原を認識し得
る細胞の細個体群（subpopulation）からなる点で不均
質である。特定の特異抗原を認識し得る末梢血単核細胞
がその抗原に出会った場合、単核細胞の上記細個体群の
増殖は誘起される。破傷風トキソイドおよびキーホール
リンペットヘモシアニンは末梢単核細胞の細個体群によ
り認識される抗原の例であるが感応化した個体中のすべ
ての末梢単核細胞によって認識されるものではない。
細胞−細胞粘着を必要とすることが知られている系中
でのヒト末梢血単核細胞の増殖的応答を抑制する抗ICAM
−１モノクローナル抗体R6−５−D6の能力を試験した。
末梢血単核細胞をフィコール−ペーグ（Ficoll−Paqu
a、ファルマシア社）勾配で製造者が推奨するようにし
て精製した。界面を集めたのち、細胞をRPMI1640培地で
３回洗浄し平底96ウェルマイクロタイタープレート中で
10％ウシ胎児血清、2mMグルタミンおよびジェンタマイ
シン（50μg/m）を加えたRPMI1640培地中で106細胞/m
の濃度で培養した。
抗原、Ｔ−細胞マイトジェン、コンカナバリンＡのい
ずれか（0.25μg/m）;T−細胞結合性抗体OKT3（0.001
μg/m）；キーホールリンペットヘモシアニン（10g/m
）または破傷風トキソイド（供給源からの1:100希釈
物）を上記のようにして培養した細胞中に抗ICAM−１抗
体（R6−５−D6;最終濃度5g/m）の存在または不存在
下に加えた。細胞はアッセイが終了する前の3.5日（コ
ンカナバリンＡ試験）、2.5日（OKT3試験）、または5.5
日（キーホールリンペットヘモシアニンおよび破傷風ト
キソイド試験）で培養した。アッセイ終了前18時間で、
2.5μCiの3H−チミジンを培養物に加えた。細胞増殖を
末梢血単核細胞によるDNAへのチミジンの取り込みを測
定することによってアッセイした。取り込まれたチミジ
ンを集め液体シンチレーションカウンター中で計数した
〔Merluzzi等、J.Immunol.139:166−168（1987）〕。こ
れらの実験の結果は第16図（コンカナバリンＡ試験）、
第17図（OKT3試験）、第18図（キーホールリンペットヘ
モシアニン試験）、および第19図（破傷風トキソイド試
験）に示す。
抗ICAM−１抗体は単核細胞中の非特異Ｔ−細胞マイト
ジェン、ConA;非特異的Ｔ−細胞会合抗原、OKT−3;およ
び特異抗原、キーホールリンペットヘモシアニンおよび
破傷風トキソイドに対する増殖的応答を抑制することが
判明した。抗ICAM−１抗体による抑制は抗LFA−１抗体
の抑制効果と匹敵し、ICAM−１はLFA−１の官能性リガ
ンドであることおよびICAM−１のアンタゴニストは特異
的防御系応答を抑制するであろうことを示唆している。
実施例27 混合リンパ球反応についての抗ICAM−１の効果 前述したように、ICAM−１はLFA−１依存性細胞粘着
より媒介された免疫応答中の有効な細胞相互作用のため
に必要である。免疫応答または炎症疾患中のICAM−１の
誘起は白血球の相互または内皮細胞との相互作用を可能
にする。
２例の無関係の個人からのリンパ球を各互いの存在下
で培養したときには、芽球形質転換およびリンパ球の細
胞増殖が観察される。１つの集団の白血球を第２集団の
白血球の存在へのこの応答は混合リンパ球反応（MLR）
として公知であり、リンパ球のマイトジェンの添加に対
する応答と同類である〔Immunology the Science of Se
lf−Nonself Discrimination,Klein,J.John Wiley ＆ S
one社、NY（1982）、pp453−458〕。
抗ICAMモノクローナル抗体のヒトMLRに対する効果に
ついて試験した。これらの実験は次のようにして行っ
た。末梢血を正常な健康ドナーから静脈穿刺により採取
した。血液をヘパリン化チューブに集め、室温でPunk's
G（GIBCO社）平衡塩溶液（BSS）で1:1に希釈した。血
液混合物（20m）を15mのFicoll/Hypaque密度勾配
（ファルマシア社、密度1.078、室温）上に層化し、100
0Xgで20分間遠心した。次いで界面を集め、Punk's G中
で３回洗浄した。細胞をヘマシトメーター上で計数し、
0.5％のジェンタマイシン、1mM L−グルタミン（GIBCO
社）および５％加熱不活化（56℃、30分）ヒトAB血清
（フローラボラトリーズ社）とを含むRPMI−1640培地
（GIBCO社）（以下、RPMI培地と呼ぶ）中に再懸濁させ
た。
マウス抗−ICAM−１（R6−５−D6）をこの実験で用い
た。すべてのモノクローナル抗体（ジャックソンイムノ
リサーチラボラトリーズ社、ボストン、MAにより腹水か
ら調製された）を精製IgG調製物として用いた。末梢血
単各細胞（PBMC）はリンブロ（Linbro）丸底マイクロタ
イタープレート（＃76−013−06）中で6.25×105細胞/m
で培地中で培養した。別々のドナーからのスチミュレ
ーター細胞を1000Rで照射し、レスポンダー細胞と同じ
濃度で培養した。培養当りの総容量は0.2mであった。
コントロールはレスポンダー細胞単独およびスチミュレ
ーター細胞単独を含んでいた。培養プレートを37℃で５
％CO2−湿潤空気雰囲気中で５日間インキュベートとし
た。各ウェルを0.5μCiのトリチウム化チミジン（3HT）
（ニューイングランドニュクレア社）で培養の最後の18
時間脈動させた。ある場合には、２経路（two−way）ML
Rを行った。そのプロトコールは第２ドナー細胞を照射
により不活化しなかった以外は同じであった。
細胞をガラス繊維フィルター上で自動化マルチプルサ
ンプルハーベスタ（Skatron社、ノルウェー）を用いて
採取し、水およびメタノールですすいだ。フィルターを
オーブン乾燥させ、アクアゾル中でベッグマン（LS−38
01）液体シンチレーションカウンターで計数した。結果
は６例の個々の培養物について平均CPM±標準誤差とし
て示している。
第15表は精製抗ICAM−１モノクローナル抗体が20ng/m
で明らかな有意の抑制でもって投与量依存の形でMLR
を抑制していた。精製マウスIgGは殆んどあるいは全く
抑制効果を示さなかった。抗ICAM−１モノクローナル抗
体によるMLRの抑制は抗体を培養の最初の24時間以内で
加えたとき生じる（第16表） ａレスポンダー細胞（6.25×105/m） ｂスチミュレーター細胞（6.25×105/m、1000Rでの
照射） ｃ最終濃度（μg/m）でのICAM−１に対する精製モ
ノクローナル抗体（R6−５−D6）または精製マウスIgG
（mIgG） d5〜６個の培養物の平均±標準誤差、（ ）内の数は
MLRの％抑制を示す。
ａレスポンダー細胞（6.25×105/m） ｂスチミュレーター細胞（6.25×105/m） ｃ培養培地またはICAM−１に対する精製モノクローナ
ル抗体（R6−５−D6）、10μg/mで日０で24時間間隔
で加えた。
d4〜６個の培養物の平均値±標準誤差 end＝測定せず ｆ％抑制 要約すれば、ICAM−１に対する抗体のMLRを抑制する
能力はICAM−１モノクローナル抗体が急性移植拒絶に治
療的利用性を有していることを示している。ICAM−１モ
ノクローナル抗体はまたLFA−1/ICAM−１調整細胞−細
胞相互作用に依存する関連免疫媒介不整における治療的
利用性を有している。
上記の実験はICAM−１に対するモノクローナル抗体の
添加が反応の最初24時間中に加えたときに混合リンパ球
反応（MLR）を抑制することを示している。さらにま
た、ICAM−１はインビトロ培養中のヒト末梢血単核細胞
について状態向上なる。
さらにまた、ICAM−１は静止ヒト末梢血リンパ球また
は単核細胞上には発現しないことが見い出された。ICAM
−１は単独培養細胞または混合リンパ球反応での無関係
ドナー細胞との共培養細胞の単核細胞上で、通常のフロ
ーサイトメトリック分析を用いることにより状態向上さ
れる。単核細胞上でのこのICAM−１の状態向上は炎症の
指示剤として、特に、ICAM−１が急性または慢性炎症を
有するヒトの新鮮単核細胞上で発現する場合に使用でき
る。
活性化単核細胞に対するICAM−１の特異性およびICAM
−１に対する抗体のMLRを抑制する能力はICAM−１モノ
クローナル抗体が急性移植拒絶および細胞−細胞相互作
用を必要とする関連免疫媒介不整における診断上および
治療上の潜在力を有し得ることを示している。
実施例28 抗ICAM−１および抗LFA−１抗体の混合投与の相乗効果 実施例27で示したように、MLRは抗ICAM−１抗体によ
って抑制される。MLRはまた抗LFA−１抗体によっても抑
制できる。抗ICAM−１および抗LFA−１抗体の組合せ投
与が促進されたあるいは相乗的効果を有するかどうかを
決定するために、MLRアッセイ（実施例27に記載したよ
うにして行った）を２つの抗体の種々の濃度の存在下で
行った。
このMLRアッセイは抗ICAM−１＋抗LFA−１の組合せ
が、抗体単独では劇的にMLRを抑制しない濃度におい
て、MLR応答を抑制するのに著しい効力があることを示
した（第17表）。この結果は抗ICAM−１抗体（またはそ
のフラグメント）と抗LFA−１抗体（またはそのフラグ
メント）を共投与することを含む治療が改善された抗炎
症治療を与える能力を有することを示している。そのよ
うな改善された治療は治療上有効である他の方法よりも
より低い抗体投与量の投与を可能にし、また高濃度の個
々の抗体が抗イデオタイプ応答を誘起するような場合に
重要性を示す。
実施例29 MLRにおける抗ICAM−１と他の免疫抑制剤との次善投与
量での混合投与の付加的効果 実施例28で示すように、MLRは抗ICAM−１抗体と抗LFA
−１抗体の組合せによって抑制される。抗ICAM−１と他
の免疫抑制剤〔デキサメタソン、アゼチオピリン、シク
ロスポリンＡまたはステロイド（例えば、プレドニソン
等の）のような〕との混合投与も改善された効果を有す
るかどうかを見るために、MLRアッセイを、実施例27の
プロトコールによるようにして、他の免疫抑制剤と組合
せたR6−５−D6の次善濃度（即ち、薬剤を単独で対象物
に対して投与する最適濃度よりも低いであろう濃度）を
用いて行った。
データはR6−５−D6の抑制効果が次善投与量のデキサ
メタソン（第18表）、アゼチオピリン（第19表）および
シクロスポリンＡ（第20表）の抑制効果を少なくとも付
加されていることを示している。このことは抗ICAM−１
が公知の免疫抑制剤の必要投与量の低減、即ち、その有
毒副作用の低減において有効であり得ることを意味す
る。抗ICAM−１抗体（またはそのフラグメント）を用い
てそのような免疫抑制を得るのに、この抗体（またはそ
のフラグメント）と単一の追加の免疫抑制剤または２種
以上の追加の免疫抑制剤の組合せとの投与を行うことが
可能である。
実施例30 移植した同種異系臓器の拒絶を抑制するのにおける抗IC
AM−１抗体の効果 同種異系移植臓器の拒絶を抑制するのにおける抗ICAM
−１抗体の効果を示すために、カニクイザルにCosimi等
の方法〔Transplant.Proc.13:499−503（1981）〕に従
って同種異系の腎臓を移植した、ただし、麻酔薬として
バリウム（valium）とケタミンを用いる修正を加えた。
即ち、腎臓移植を本質的に次のようにして行った。異
型腎アログラフトを３〜5kgのカニクイザルに、バリウ
ムとケタミンによる麻酔の誘起後、本質的にMarquetに
より開示されたようにして行った〔Marquet等、Medical
Primatology,Part II、Basel,Karger,p.125（197
2）〕。大動脈または大静脈のパッチ上のドナー腎臓の
末端−側面アナストモーシス（anastpmoses）を７−０
プロレン（Prolene）縫合線を用いて構築した。ドナー
尿管をスパチュラ処理し外のう的方法によってブラッダ
ー中に埋め込んだ〔Taguchi,Y.等、Dausset等編、Advan
ces in Transplantation、バルチモア、ウィリアムス
アンド ウィルキンス、p393（1968）〕。腎機能を１週
間毎にまたは２週間毎の血清クリアチニン測定によって
評価した。さらに、頻ぱんなアログラフト生検を組織病
理学検査用に採取し、完全解剖をすべての死んだ受容体
で行った。殆んどの受容体において、両側性腎摘出を移
植時に行い、その後の尿毒症死をアログラフト生存の終
点とみなした。いくつかの受容体においては、片側の生
腎摘出と対側尿管ライゲーションを移植時点で行った。
アログラフト拒絶が生じたとき、同原尿管上のライゲー
チュアを除去し、正常腎機能の再生と受容動物の免疫学
的モニターを続ける機械を得た。
モノクローナル抗体R6−５−D6を12日間毎日投与した
が、移出前２日から１〜2mg/kg/日の投与量で開始し
た。クレアチニンの血清量を同期的に試験して拒絶をモ
ニターした。同種異系腎の免疫系拒絶に対する抗ICAM−
１抗体の効果は第21表に示す。
ａサルは移植前２日から12日間毎日R6−５−D6が投与
された。
ｂ死因はわからなかった。潜在的マラリヤの証拠があ
った。
ｃ腎梗塞死 d1988年８月15日でまだ生存中 上記の結果はR6−５−D6で同種異系移植を受け入れた
サルの寿命延長に有効であることを示している。
実施例31 移植臓器の急性拒絶を抑制するのにおける抗ICAM−１抗
体の効果 抗ICAM−１抗体が移植拒絶の急性モデルにおいて有効
であることを示すために、R6−５−D6の治療中のまたは
急性腎拒絶モデルにおいても試験した。このモデルにお
いて、サル腎臓を移植し（実施例30のプロトコールを用
いて）、15mg/kgのシクロスポリンＡ（CyA）を筋注で組
織周辺的に安定な腎機能が得られるまで投与した。次
に、CyA投与量を血液クレアチニン値の上昇で示される
ような拒絶が生じるまで2.5mg/kg増分量で２週間毎に低
減した。この時点で、R6−５−D6は10日投与し、生存時
間をモニターした。重要なことは、このプロトコールに
おいては、CyAの投与量が急性拒絶状態が生ずると同時
に変化しないので次善のままであるということに留意す
ることである。このモデルにおいては、抗体援助を有し
ない組織学的対照（Ｎ＝５）は拒絶状態の開始から５〜
14日間生存する。これまで、６匹の動物をこのプロトコ
ールにおいてR6−５−D6を用いて試験した（第22表）。
これら動物の２匹はまだ生存している（R6−５−D6の投
与後にM12:31日間、およびM5:47日間）。２匹の動物はR
6−５−D6治療開始後38日および55日間生き、２匹の動
物は急性拒絶以外の原因で死亡した（一匹はCyA毒性で
死亡し、一匹は麻酔下でR6−５−D6を投与している間に
死亡した）。このモデルはR6−５−D6を最初から用いた
臨床状態とより密接に近似している。
ａサルは拒絶開始後10日間毎日１〜2mg/kgのR6−５−
D6を投与された。
ｂクレアチニン値がCyA投与量の低減の結果として増
大しR6−５−D6治療を開始した日 c5匹の動物は援助治療を用いなかった以外は前述の治
療プロトコールを用いて試験した。生存／後治療の日数
はクレアチニン値が上昇し始めたすぐからの日数を示
す。
ｄ麻酔中に死亡、クレアチニン値は低かった。
eCyA毒性による死亡。クレアチニン値は低かった。
f1988年８月15日でまだ生存している。
実施例32 ICAM−１の末端切取り誘導体の遺伝子構築および発現 天然状態において、ICAM−１は５つの免疫グロブリン
様ドメインの細胞外領域トランスメンブランドメインお
よび細胞質ドメインを含有する細胞膜結合たん白質であ
る。望ましいのはICAM−１から分泌した可溶物を発現で
きる点でトランスメンブランドメインおよび／または細
胞質ドメインを欠落するICAM−１の官能性誘導体を構築
することであった。これらの官能性誘導体はICAM−１遺
伝子のオリゴヌクレオチド関連変異誘発およびその後の
変異遺伝子による投入後のサル細胞中での発現により構
築した。
アミノ酸置換および／または末端切取り（Truncate
d）誘導体を与えるICAM−１遺伝子の突然変異はKunkel,
T.の方法により発生させた〔Proc.Natl.Acad.Sci.（U.
S.A.）82:488−492（1985）〕。上記のようにして調製
したICAM−1cDNAを制限エンドヌクリアーゼSal1およびK
pm1で消化し、得られた1.8kb DNAフラグメントをプラス
ミドベクターCDM8にサブクローン化した〔Seed,B.等、P
roc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）84:3364−3369（198
7）〕。次にE.Coli（BW313/P3）のdut −、ung −株をpCD
1.8Cと表示する上記構築物で形質転換した。単一ストラ
ンドウラシル含有鋳型を形質転換体からヘルパーファー
ジR408（ストレータジーンＲ）で感染させることによっ
て救援（rescue）した。次いで、変異体ICAM−1cDNAを
不整合ベースを有するオリゴヌクレオチドとの第２スト
ランド合成および引き続くung ＋宿主（MC1061/P3）の得
られたヘテロ二本鎖体による形質転換を開始することに
よって産生させた。変異体を上記変異オリゴヌクレオチ
ドを導入した新たに創生したエンドヌクレアーゼ制限サ
イトについてスクリーニングすることによって単離し
た。変異体ICAM−１たん白質は標準DEAE−デキストラン
法〔Selden,R.F.等、Current Protocols in Molecular
Biology（Ausebel,F.M.等編集）、9.2.1−9.2.6（198
7）〕を用いて真核発現ベクターのCDM8中で上記変異体D
NAによるCos−７細胞の移入によって発現させた。
トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインを
欠落するが５つの免疫グロブリン様ドメインのすべてを
含有するICAM−１の末端切取り官能性誘導体を調製し
た。30bp変異体オリゴヌクレオチド（CTC TCC CCC CGG
TTC TAG ATT GTC ATC ATC）を用いて位置452および453
のアミノ酸チロシン（Ｙ）およびグルタミン酸（Ｅ）の
コドンを、それぞれ、フェニルアラニン（Ｆ）およびほ
ん訳停止コドン（TAG）に形質転換した。変異体はその
特徴的Xba 1制限サイトにより単離し、Y452E/F、TAGと
表示した。
変異体たん白質を発現させるために、COS細胞に３種
の変異体サブクローン（＃２、＃７および＃８）を移入
した。これら３種の変異体サブクローンによる移入の３
日後、培養上清および細胞溶解物を抗ICAM−１モノクロ
ーナル抗体RR1/1による免疫沈降およびSDS−PAGEによっ
て分析した。ICAM−１は変異体サブクローン＃２および
＃８を移入した細胞の培養上清からは沈降したがこれら
細胞の清浄剤溶解物からは沈降しなかった。培養上清中
に見い出されるICAM−１の分子量はICAM−１の膜体に比
し約6Kd低下していたが、これは変異体DNAから予想した
大きさに一致する。即ち、このICAM−１の官能性誘導体
は可溶性たん白質として分泌している。これに対し、IC
AM−１は対照の天然ICAM−１を移入した細胞の培養上清
からは免疫沈降せず、ICAM−１の膜体はCOS細胞からは
発現しなかったことを示していた。さらにまた、ICAM−
１は陰性対照の偽移入細胞からの培養上清または細胞溶
解物からは免疫沈降してこなかった。
移入細胞から分泌した末端切取りICAM−１をICAM−１
特異性抗体（R6−５−D6）によるイムノアフィニティク
ロマトグラフによって精製し、細胞結合アッセイでの官
能活性について試験した。清浄剤オクチルグルコサイド
の存在下での精製後、天然ICAM−１または末端切取り型
分泌体を含有する調製物を0.25オクチルグルコサイドの
最終濃度に希釈した（清浄剤の臨界ミセル濃度以下の濃
度）。ICAM−１のこれら調製物をプラスチック96−ウェ
ルプレート（Nunc社）の表面に結合させて固相に結合し
たICAM−１を調製した。未結合物を洗い出したのち、表
面上にLFA−１を含有するSKW−３細胞の約75〜80％およ
び約83〜85％が、それぞれ、ICAM−１の天然体および末
端切取り体に特異的に結合した。これらのデータは分泌
型の末端切取り可溶性ICAM−１官能性誘導体が免疫学的
反応性および天然ICAM−１の特徴であるICAM−１依存性
粘着を仲介する能力の両方を保持していることを示して
いる。
細胞質ドメインのみを欠落するICAM−１の官能性誘導
体を同様な方法で調製した。25bpオリゴヌクレオチド
（TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA）を用いてアミ
ノ酸476（Ｙ）のコドンをTAGほん訳停止コドンに変え
た。この変異体はY476/TAGと表示した。この変異体を移
入したCos細胞の免疫沈降分析およびSDS−PAGEは陰性IC
AM−１よりも約3Kd小さい分子量を有するICAM−１の膜
結合体を検出した。上記変異体移入Cos細胞の間接免疫
蛍光分析はLPS刺激ヒト内皮細胞上に発現した天然ICAM
−１と同様な点状染色像を示した。また、上記変異体DN
Aを移入した細胞は天然ICAM−1DNAを移入したCos細胞と
同じような形でプラスチック表面上の精製LFA−１に特
異的に結合した（第23表）。
実施例33 ICAM−１官能性ドメインのマッピング ICAM−１の研究はその分子が７つのドメインを有する
ことを見い出した。これらドメインのうちの５つは細胞
外であり（ドメイン５は細胞表面に最も近く、ドメイン
１は細胞表面から最も遠い）、１つのドメインはトラン
スメンブランドメインであり、１つのドメインは細胞質
である（即ち、細胞内に存在する）。どのドメインがIC
AM−１のLFA−１に結合する能力に貢献するかをみるた
めに、エピトープマッピング（地図作製）試験を用い
た。そのような試験を行うためには異なる欠落変異体を
作製し、そのLFA−１を結合する能力について特徴決定
した。別に、ICAM−１のLFA−１に結合する能力を干渉
することが知られている抗ICAM抗体を用いた試験を行っ
た。かかる抗体の適当な例にはRR1/1〔Rothlein,R.等、
J.Immunol.137:1270−1274（1986）〕、R6.5（Springa
r,T.A.等、米国特許出願07/250,446号）、LB−２〔Clar
k,E.A.等、Leukocyte Typing I（A.Bernard等編集）、S
pringer−Verlag、339−346（1984）〕、またはCL203
〔Staunton,D.E.等、Cell.56:849−853（1989）〕があ
る。
ICAM−１の欠落変異体は種々の任意の方法によって調
製できる。しかしながら、そのような変異体は部位特異
的変異誘発によりまたは他の組換え手段（特定のたん白
質領域をコードする配列を欠落させたICAM−１発現性遺
伝子配列を構築することによるような）により産生させ
るのが好ましい。そのような変異体を産生するのに適す
る手順は当該技術において周知である。そのような手順
を用いて、３つのICAM−１欠落変異体を調製した。第１
の変異体はアミノ酸残基F185〜P284を欠落する（即ち、
ドメイン３の欠落）。第２の変異体はアミノ酸残基P284
〜R451を欠落する（即ち、ドメイン４および５の欠
落）。第３の変異体はY476より後のアミノ酸残基を欠落
する（即ち、細胞質ドメインの欠落）。そのような試験
の結果はドメイン１、２および３が抗ICAM−１抗体およ
びLFA−１とのICAM−１相互作用中に主として含まれて
いることを示す。
実施例34 LFA−１結合に対してのICAM−１変異の効果 ICAM−１がLFA−１に反応し結合する能力はICAM−１
分子のドメイン１中に存在するICAM−１アミノ酸残基に
よて仲介される（第８、９および10図）。しかしなが
ら、そのような反応はICAM−１のドメイン２および３中
に存在するアミノ酸の貢献によって促進される。即ち、
本発明の好ましい官能性誘導体の内には、ICAM−１のド
メイン１、２および３を含有するICAM−１分子の可溶性
はフラグメントが存在する。より好ましいのはICAM−１
のドメイン１および２を含有するICAM−１分子の可溶性
フラグメントである。最も好ましいのはICAM−１のドメ
イン１を含有するICAM−１の可溶性フラグメントであ
る。第1ICAM−１ドメイン内の幾つかのアミノ酸残基はI
CAM−１とLFA−１の反応中に含まれている。これらアミ
ノ酸の他のアミノ酸による置換はICAM−１のLFA−１に
結合する能力を変化させる。これらのアミノ酸残基およ
びその置換体を第25図に示す。第25図は得られた変異体
ICAM−１分子のLFA−１に結合する能力についてのその
ような変異の効果を示す。第23〜25図においては、各残
基はアミノ酸の１文字コードについて記載し、次いでIC
AM−１分子中のその残基の位置を示している。即ち、例
えば“E90"はICAM−１の位置90でのグルタミン酸残基を
称す。同様に、“E90V"は位置90のグルタミン酸残基と
位置91のバリン残基とからなるジペプチドを示す。置換
配列はスラッシュ（“/"）マークの右に示されている。
ICAM−１のV4、R13、Q27、Q58およびD60S61残基はLFA−
１結合中に含まれる。
これらアミノ酸の置換はICAM−１のLFA−１への結合
能力を変化させる。例えば、V4のＧによる置換はLFA−
１により少なくしか結合しない変異体ICAM−１分子の形
成をもたらす（第25図）、ICAM−１のR13残基のＥによ
る置換は実質的に小さいLFA−１への結合能力を有する
変異体分子の形成を与える（第25図）。ICAM−１のQ58
残基のＨによる置換は実質的に通常のLFA−１への結合
能力を有する変異体分子を与える（第25図）。ICAM−１
のD60S残基のKLによる置換は実質的に小さいLFA−１へ
の結合能力を有する変異体分子を与える（第25図）。
第２ドメイン中のグリコシル化部位もまたLFA−１結
合中に含まれる（第23図）。N103のＫによるまたはA155
NのSVによる置換はLFA−１を実質的に結合し得ない変異
体ICAM−１分子の形成をもたらす。対照的に、グリコシ
ル化部位N 175のＡによる置換はその変異体ICAM−１のL
FA−１結合能に実質的に影響しないようであった。
第31CAM−１ドメインの変異はICAM−１−LFA−１結合
性を認知し得る程変化させないようであった（第24
図）。
実施例35 増大した生物学的半減アフィニティとクリアランス能力
を有するICAM−１の多量体形 ICAM−１のドメイン１と２をその免疫グロブリン長鎖
のヒンジ領域に結合させたキノラ分子を構築する。好ま
しい構築物はICAM−１ドメイン２のＣ末端をヒンジ領域
対しての丁度Ｎ−末端の免疫グロブリン長鎖のセグメン
トに結合させて、ヒンジ領域により付与されたセグメン
トフレキシビリティを可能にする。ICAM−１ドメイン１
と２はかくして抗体のFabフラグメントを置換するであ
ろう。IgG類の長鎖への結合および動物細胞の生成はキ
メラ分子の産生をもたらすであろう。IgAまたはIgMに由
来する長鎖を含有する分子の生成は２〜12個のICAM−１
分子を含有するより高多量体の分子の産生をもたらすで
あろう。ICAM−１長鎖キメラ分子を産生する動物細胞中
での長鎖遺伝子の共発現は４〜６ケのICAM−１分子を含
有するIgA分子と約10ケのICAM−１分子を含有するIgMの
ケースとを主として与えるIgAとIgM多量体の適当な集合
体を与えるであろう。これらのキメラ分子は幾つかの利
点を有する。第１は、Ig分子を循環系中で長く滞在する
よう設計し、これにより生物学的半減期を改善できる。
さらにまた、これら加工分子の多量体性は、治療情状
のいかんによって、これら分子がより高い結合活性によ
ってライノウイルス並びに細胞表面LFA−１と反応でき
るようにして、かくして有効投与量を与えるべき投与に
必要な組換えたん白質の量を大いに低減させる。IgAお
よびIgMは鼻におけるような粘膜部位の分泌物中に通常
存在する高グリコシル化分子である。その高親水性は粘
膜中で結合する微生物およびウイルスを保持するのを助
長し細胞への結合を防止しまた上皮細胞膜バリヤーの交
差を防止する。即ち、これらの分子は増大した治療効果
を有する。IgMと特にIgAとは粘膜環境で安定でありICAM
−１構築物の安定性を増大させる。そのようなICAM−１
官能性誘導体を血液流中に投与する場合、この誘導体も
生物学的半減期を増大する。IgAは補体を固定せず、従
って、それが有害である用途において理想的であろう。
IgGのＨ鎖キメラを望む場合には、補体への結合並びにF
cレセプターとの反応中に含まれる領域を変異させるこ
とが可能であろう。
実施例36 ICAM−１変異体の発現 オリゴヌクレオチド特異性変異誘発 1.8Kb Sal1−Kpm1フラグメント中のICAM−1cDNAのコ
ード領域を発現ベクターCDMB中にサブクローニングした
〔Seed,B.等、Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）84:3365
〜3369（1987）〕。Kunkel,T.の方法〔Proc.Natl.Acad.
Sci.（U.S.A.）82:488−492（1985）〕およびStaunton
D.等の変法（Staunton D.E.等、Cell 52:925−933（198
8）〕に従って、この構築物（pCD1.8）を用いてオリゴ
ヌクレオチド特異性変異誘発で使用する単一ストランド
ウラシル含有鋳型を調製した。
要するに、E.Coli株XS127をpCD1.8で形質転換した。
単一コロニーを13μg/mのアンピシリンと８μg/mの
テトラサイクリンを含有する1mのルリア ブロス（L
B）培地（Difco社）中で近飽和まで増殖させた。100μ
の培養物をR408ヘルパーファージ（Strategene社）で
10の感染多重度（MOI）で感染させ、アンピシリンとテ
トラサイクリンを含む10mのLB培地を37℃で16時間培
養で加えた。10,000rpmで１分間の遠心および上清の0.2
2μｍ濾過の後、ファージ懸濁疫をE.Coli BW313/P3を感
染し、次いで、これをアンピシリンおよびテトラサイク
リンを加えたLB寒天（Difco社）プレート上に塗布し
た。コロニーを採取し、アンピシリンとテトラサイクリ
ンを含む1mのLB培地中で近飽和に増殖させ、ヘルパー
ファージでMOI10で感染させた。次いで、培養容量を250
mに増大させ、細胞を一夜培養した。単一ストランドD
NAを標準のファージ抽出により単離した。
変異体オリゴヌクレオチドをリン酸化し、第２ストラ
ンド合成反応にpCD1.8鋳型と共に用いた〔Staunton D.
E.等、Cell52:925−933（1988）〕。
移 入 COS細胞を16〜24時間で50％の集密性となるように10c
mの組織培養プレート中にシード付けした。次いで、COS
細胞をTBSで１度洗浄し、10％のNu血清（Collaborative
社）５μg/mのクロロキーネ（chloroquine）、３μｇ
の変異プラスミドおよび200μg/mのDEAE−デキストラ
ン サルフェートを含有する4mのRPMIで４時間培養し
た。細胞をその後10％のDMSO/PBS次いでPBSで洗浄し、
培養培地中で16時間培養した。培養培地を新鮮培地で入
れ替え、48時間で、後移入COS細胞をトリプシン/EDTA
（Gibco社）処理により懸濁し、HRV結合用の２、10cmプ
レート並びに24ウェル組織培養プレート中に細分した。
72時間で、細胞を10cmプレートから、5mM EDTA/HBSSで
採集し、LFA−１コーティングプラスチックへの粘着お
よび免疫蛍光分析用に加工した。
LFA−１およびHRV結合性 LFA−１をSKW−３からTS2/4LFA−1mAbセファローズ上
でイムノアフィニティクロマトグラフにより精製し、2m
MのMgCl2および１％のオクチルグリコシドの存在下にpH
11.5で溶出させた。LFA−１（10μg/200μ/6cmプレー
ト）を微生物学的ペトリ皿に2mMのMgCl2を含むPBS（リ
ン酸塩緩衝塩水）中でオクチルグルコシドを0.1％に希
釈し４℃で一夜インキュベートすることによって結合さ
せた。各プレートを１％BSA（ウシ血清アルブミン）で
ブロックし、2mMのMgCl2、0.2％BSA、0.025％のアザイ
ド、および50μg/mのジェンタマイシンを含有するPBS
中で保存した。
５％FCS（ウシ胎児血清）、2mMのMgCl2、0.025％のア
ザイドを含有するPBS（バッファー）中の51Cr標識COS細
胞をLFA−１コーティングマイクロタイタープレート中
で５μg/mのRRI/1およびR6.5の存在または不存在下に
25℃、１時間でインキュベートした。粘着してない細胞
をバッファーで３回洗浄することにより除去した。粘着
細胞はEDTAの添加により10mMに溶出し、γ−計算した。
結 果 RR1/1、R6.5、LB−２、またはCL203のような抗ICAM−
１抗体は同定されている。これら抗体がICAM−１機能を
抑制し得るならば、これらの抗体はICAM−１分子の特定
の部位（これがまたICAM−１機能に重要である）に結合
し得なければならない。即ち、前述のICAM−１の欠落変
異体を調製し、上記の抗ICAM−１抗体が上記欠落体に結
合し得る程度を測定することによって、欠落ドメインが
機能上重要であるかどうかを見ることができる。
ICAM−１は複合膜たん白質であり、その細胞外ドメイ
ンは５つの1g様Ｃ−ドメインからなるものと予測され
る。LFA−１を結合するのに含まれるドメインを同定す
るには、ドメイン３、およびドメイン４と５（カルボキ
シル未満）をオリゴヌクレオチド特異性変異誘発により
欠落させ、COS細胞中で発現後官能的に試験した。さら
に、全細胞質ドメインを欠落させてICAM−１反応へのそ
の潜在的影響を確認した。期待したように、細胞質ドメ
イン欠落体、Y476/＊はRR1/1、R6.5、LB−２およびCL20
3の反応性の喪失を示さないのに対し、ドメイン３の欠
落体F184−R451はCL203反応性の減少および喪失をもた
らした（第20図）。即ち、CL203エピトープはドメイン
４中に存在するようであるが、RR1/1、R6.5およびLB−
２は２ケのアミノ末端ドメイン中に存在するようであ
る。
３つの欠落変異体はすべてLFA−１に対し野生型レベ
ルの粘着性を示した（第21図）。ドメイン１、２および
３中の予測β−ターンでのアミノ酸置換体も調製しCOS
細胞中での発現後機能性試験した。R6.5エピトープはド
メイン２の配列E111GGAに局在化しまたドメイン１中にE
39を含み得るが、RR1/1とLB−２は共にドメイン１のR13
に依存している（第22図）。さらに、RR1/1結合性は配
列D71GOS中での変異により減少した。N103およびN163の
Ｎ−結合グリコシル化部位を削減する変異はRR1/1、R6.
5とLB−２、LFA−1HRV結合性を減少させた。これらの変
異はICAM−１ダイマーを発生させるような加工を行うよ
うである。
ドメイン２または３の他の変異は変化型LFA−１粘着
をもたらさなかった（第23および24図）。ドメイン１の
アミノ酸、R13とD60の両方はLFA−１と結合することに
よって含まれる（第25図）。
即ち、LFA−１およびHRV結合性はICAM−１のアミノ未
満Ig様ドメインの機能であるようである。第26図はICAM
−１未満ドメインの配列を示す。
本発明をその特定の実施態様について説明して来た
が、異なる修正が可能であることは理解し得ることであ
り、本出願は、一般に、本発明の原理に従いかつ本発明
が関係する技術内での公知または慣用的実施に含まれる
ようなまた特許請求するような本質的な特徴に適用し得
るような本明細書の記載からの回避を包含するすべての
変形、用途または適用を含むものとする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 マーリン スティーヴン ディー アメリカ合衆国 コネティカット州 06810 ダンバリー テラ ホート ロ ード 18 (72)発明者 ダスティン マイケル エル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02215 ボストン 23 パーク ドライ ヴ 231 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/78 C07K 16/18 C12N 15/06

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも天然ICAM−１のアミノ酸残基45
    4番〜477番のトランスメンブレンドメインが欠落してい
    る点でICAM−１とは異なる、ICAM−１の可溶性官能性誘
    導体であって、アミノ酸残基１番〜88番のドメイン１を
    含み、天然のICAM−１の特徴である免疫学的反応性およ
    びICAM−１依存性接着を媒介する能力を保持し、生理学
    的条件下で可溶性である該官能性誘導体。
  2. 【請求項２】少なくとも１つの変更されたアミノ酸残基
    を含み、CD18ファミリーメンバー分子に結合しうる、請
    求項１に記載のICAM−１の可溶性官能性誘導体。
  3. 【請求項３】更にアミノ酸残基478番〜505番のICAM−１
    の細胞質ドメインを欠く、請求項１又は２に記載のICAM
    −１の可溶性官能性誘導体。
  4. 【請求項４】ドメイン１のアミノ酸残基88番の後、また
    はドメイン２のアミノ酸残基185番の後、またはドメイ
    ン３のアミノ酸残基283番の後のアミノ酸残基を欠落し
    ている、請求項１〜３のいずれか１項記載のICAM−１の
    可溶性官能性誘導体。
  5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項記載のICAM−
    １の可溶性官能性誘導体を含有することを特徴とする、
    特異的又は非特異的防御系の応答に由来する炎症を治療
    するための薬剤組成物。
  6. 【請求項６】請求項１〜４のいずれか１項記載のICAM−
    １の可溶性官能性誘導体を含有することを特徴とする、
    移行にLFA−１群の官能性１員を必要とする造血腫瘍細
    胞の移転を抑制するための薬剤組成物。
  7. 【請求項７】請求項１〜４のいずれか１項記載のICAM−
    １毒素由来型可溶性官能性誘導体を含有することを特徴
    とする、LFA−１発現性腫瘍細胞の増殖を抑制するため
    の薬剤組成物。
  8. 【請求項８】デクサメタゾン、アザチオピリン及びシク
    ロスポリンＡから選ばれた免疫抑制剤及び請求項１〜４
    のいずれか１項記載のICAM−１の可溶性官能性誘導体を
    含有することを特徴とする、特異的防御系の応答に由来
    する炎症を治療するための薬剤組成物。
  9. 【請求項９】LFA−１に結合し得る抗体；抗体の官能性
    誘導体であってLFA−１に結合し得る官能性誘導体；及
    びLFA−１の非免疫グロブリンアンタゴニストから選ば
    れた第２の薬剤、及び請求項１〜４のいずれか１項記載
    のICAM−１の可溶性官能性誘導体を含有することを特徴
    とする、特異的防御系の応答に由来する炎症を治療する
    ための薬剤組成物。
  10. 【請求項１０】キャリヤー又は賦形剤を更に含む、請求
    項５〜９のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
  11. 【請求項１１】請求項１〜４のいずれか１項記載のICAM
    −１の可溶性官能性誘導体を発現することが可能な組換
    えDNA分子。
  12. 【請求項１２】請求項１〜４のいずれか１項記載のICAM
    −１の可溶性官能性誘導体をコードしている組換えベク
    ターにより形質転換された宿主微生物を、該誘導体が発
    現され、かつ培地中に分泌される条件下において培養す
    ること、及びその後該誘導体を分離することを含む、IC
    AM−１の可溶性官能性誘導体の製造方法。
  13. 【請求項１３】リンパ球表面上に存在する分子に結合し
    得るICAM−１のフラグメントである請求項１記載のICAM
    −１可溶性官能性誘導体。
  14. 【請求項１４】リンパ球表面上に存在する分子に結合し
    得るICAM−１の変異体である請求項１記載のICAM−１の
    可溶性官能性誘導体。
  15. 【請求項１５】リンパ球表面上に存在する分子に結合し
    得るICAM−１のアナログである請求項１記載のICAM−１
    の可溶性官能性誘導体。
  16. 【請求項１６】リンパ球表面上に存在する分子に結合し
    得るICAM−１の化学誘導体である請求項１記載のICAM−
    １の可溶性官能性誘導体。
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