PT644768E - Metodos e composicoes para inibir a inflamacao mediada por celulas endoteliais e fibrinogenio - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA INIBIR A INFLAMAÇÃO MEDIADA POR CÉLULAS ENDOTELIAIS E FIBRINOGÉNIO"

Campo da Invenção A presente invenção contempla a utilização de composições para inibir a ligação de fibrinogénio a células endoteliais com o objectivo de inibir a inflamação mediada por células endoteliais e fibrinogénio.

An teceden tes A adesão de leucócitos ao endotélio vascular é um dos acontecimentos mais precoces numa variedade de reacções imunoinflamatórias. 0 processo participa em oclusões vasculares e contribui para lesões aterotrombóticas. Ao nivel molecular, a adesão de leucócitos a células endoteliais é um mecanismo redundante, apoiado pelo reconhecimento regulado de um conjunto discrepante de receptores membranares, incluindo integrinas, expressas tanto em leucócitos e células endoteliais em repouso ou activadas por citoquinas.

As integrinas são um grupo funcionalmente e estruturalmente relacionado que interage com uma vasta variedade de ligandos incluindo glicoproteínas da matriz extracelular, complemento e outras células. As integrinas participam na adesão célula-matriz e célula em muitos processos fisiologicamente importantes incluindo o desenvolvimento embrionário, hemostase, trombose, mecanismos de defesa imunitária e não imunitária na cicatrização de feridas e transformação oncogénica. Ver Hynes, Cell, 48: 549-554 (1987). A maioria das integrinas que participam na adesão dinâmica de células, ligam um tripéptido, arginina-gllcina-ácido aspartático (RGD), presente nos seus ligandos, causando a adesão celular. Ver Ruoslathi et al.f Science, 238: 401-497 (1987).

Mac-1 (CDllb-CD18) é um receptor de integrina encontrado predominantemente em macrófagns e granu 1 ócit.os. Como todos os 1 receptores de integrina, Mac-1 é uma glicoproteína membranar heterodimérica, constituída por subunidades alfa e beta associadas de uma forma não covalente. 0 Mac-1 medeia a adesão de neutrófilos/monócitos ao endotélio vascular e a fagocitose de partículas opsonisadas pelo complemento. Oo anticorpos contra o receptor Mac-1 alteram a função neutrófila in vivo, incluindo a migração de neutrófilos para locais infamatórios. Ver Price et al., J. Immunol., 139: 4174-4177 (1987). 0 Mac-1 funciona também como um receptor de fibrinogénio numa reacção ligada à deposição de fibrina na superfície de monócitos. Ver Altieri et al.r J. Cell Biol., 107: 1893-1900 (1988); Wright et al., proc. Natl. Acad. Sei USA, 85: 7734-7738 (1988); Trezinni et al., Biochem. Biophys. Res.

Commun., 156: 477-484 (1988) e Gustafson et al., J. Cell Biol., 109: 377-387 (1989). 0 fibrinogénio é uma molécula complexa de aproximadamente 340 000 daltons e consiste em três pares de subunidades polipeptídicas, denominadas cadeias α, β e gama. Estas cadeias individuais são mantidas juntas por várias ligações dissulfureto. A digestão proteolítica de fibrinogénio por plasmina produz fragmentos a, B, C, D e E, possuindo todos um peso molecular inferior a 85 daltons. Ver Pizzo et al., J. Cell Biol., 247: 636-645 (1972). A digestão proteolítica adicional de fibrinogénio produz um fragmento D30 com um peso molecular de cerca de 30 000 daltons contendo porções das cadeias do fibrinogénio α, β e gama. Ver Furlan et al., Biochem. Biophys. Acta, 400: 95-111 (1975). A deposição de fibrinogénio na superfície de leucócitos ocorre numa variedade de respostas inflamatórias tais como hipersensibilidade do tipo retardado, rejeição de transplante incompatível, e a fisiopatologia da obstrução vascular e aterogénese. Ver Geczy et al., J. Immunol., 130: 2743-2749 (1983); Hooper et al., J. Immunol., 126: 1052-1058 (1981); 2

Colvin et al., J. Immunol., 114: 377-387 (1975); Hattler et al., Cell Immunol., 9: 289-295 (1973); Gerrity, R.G., Am. J. Pathol., 103: 181-190 (1981); e Am. J. Pathol., 103: 191-200 (1981); e Shelley et al., Nature, 270: 343-344 (1977). Têm sido descritas interacções do fibrinogénio com receptores da superfície celular de células endoteliais. Languino et al., Blood, 73: 734 (1989) descreve a ligação do fibrinogénio a células endoteliais por um mecanismo dependente de RGD. Acredita-se geralmente que o receptor da vitronectina é o principal receptor endotelial para o fibrinogénio. Cheresh et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84: 6471-6475 (1987). Outros receptores das células endoteliais relatados como ligando fibrinogénio, incluem transglutaminase ligada à superfície celular, e um receptor de 130 quilodalton que se liga a péptidos de fibrina. Erbam et al., J. Biol. Chem., 267: 2451 (1992).

Também na superfície das células endoteliais está uma molécula 1 de adesão intercelular (ICAM-1) que foi descrita por Springer et al., Nature, 346: 425-433 (1990), e foi mostrado que ligava a integrina de leucócito LFA-1.

Recentemente, foi mostrado que a interaeção do fibrinogénio com o receptor Mac-1 de leucócitos era uma reacção dinâmica de adesão celular envolvendo o reconhecimento do tripéptido RGD no fibrinogénio pelo receptor Mac-1 semelhante à interaeção do fibrinogénio com os receptores de integrina em plaquetas e células endoteliais. Ver Altieri et al., J. Clinic Invest., 78: 968-976 (1986) e Ruoslathi et al., Science, 238: 491-497 (1987) e Cell, 44: 517-518 (1986). O pedido Internacional PCT N°. PCT/US91/05096 revela composições compreendendo D30 e variantes deste.

Breve Descrição da Invenção

Foi agora descoberto que o fibrinogénio se liga a receptores Mac-1 em leucócitos e a um receptor das células endoteliais (ECR), fazendo deste modo a ponte entre o leucócito 3 .? \ \ e a célula endotelial durante o processo de inflamação. A inflamação proveniente desta ponte é referida como uma inflamação mediada por célula endotelial/fibrinogénio. O ECR é ICAM-1, que é um receptor especifico de fibrinogénio independente de RGD.

Ne3ta especificação, o termo "ECR" refere -se a ICAM-1. A invenção descreve novas composições definindo os locais de ligação para a interacção entre ECR e fibrinogénio.

Assim, é contemplada uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um homólogo de fibrinogénio substancialmente puro e farmaceuticamente aceitável, capaz de se ligar a ECR e inibir a ligação de Fg a células endoteliais. Nas composições que são aqui reivindicadas o homólogo não é D30 nem nenhuma variante deste.

Também está contemplada uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um homólogo de ICAM-1 substancialmente puro e farmaceuticamente aceitável, capaz de se ligar ao fibrinogénio e inibir a ligação do fibrinogénio às células endoteliais. A invenção descreve também um anticorpo monoclonal que reage imunologicamente com o receptor de vitronectina, de modo que o anticorpo monoclonal inibe preferencialmente a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas. É também descrito um anticorpo monoclonal que reage imunologicamente com o fibrinogénio e que inibe preferencialmente a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas. É também descrito um método para inibir a ligação do fibrinogénio (Fg) às células endoteliais compreendendo o contacto das células endoteliais com uma quantidade eficaz de uma composição farmaceuticamente aceitável que se liga a Fg, compreendendo um homólogo substancialmente puro seleccionado do grupo consistindo de um homólogo de Fg e um homólogo de ICAM-1. 0 método é útil para inibir a inflamação mediada pelo 4 fibrinogénio/células endoteliais num doente e compreende a administração a um doente de uma quantidade eficaz de uma composição farmaceuticamente aceitável que se liga a Fg, compreendendo um homólogo substancialmente puro seleccionado do grupo consistindo de um homólogo de Fg e um homólogo de ICAM-1. A invenção descreve tambcm um mótodo para detectar a quantidade de um homólogo do fibrinogénio (Fg) numa amostra líquida compreendendo: (a) misturar uma amostra de células endoteliais estimuladas com uma quantidade pré-determinada de uma amostra liquida contendo um homólogo de Fg e uma quantidade pré-determinada de homólogo de Fg marcado para formar uma mistura de reacção de competição; (b) manter a mistura de reacção durante um período de tempo pré-determinado suficiente para qualquer homólogo de Fg presente na referida composição se ligar a células endoteliais e formar um complexo células endoteliais .-homólogo de Fg e permitir que o homólogo de Fg marcado forme um complexo células endoteliais:homólogo de Fg; e (c) ensaiar a quantidade de complexo células endoteliais:homólogo de Fg marcado formado no passo (b) detectando assim a quantidade de homólogo de Fg na composição. É também descrito um método de selecção para composições eficazes na inibição da ligação de fibrinogénio a ICAM-1 compreendendo os passos de: (a) misturar numa mistura de reacção de inibição quantidades pré-seleccionadas de uma composição inibidora putativa, um homólogo de fibrinogénio, e um homólogo de ICAM-1; (b) manter a mistura sob condições suficientes para o homólogo de ICAM-1 se ligar ao homólogo de Fg e formar um complexo homólogo de ICAM-1:homólogo de Fg; e (c) medir a quantidade de complexo homólogo de ICAM-l:homólogo de Fg formado no passo (b) , e assim a eficácia da composição inibidora. 5 É também descrito um método para preparar ICAM-1 substancialmente puro compreendendo os passos de: (a) proporcionar uma composição detergente aquosa contendo pelo menos ICAM-1; (b) por em contacto a composição contendo ICAM-1 com uma matriz com fibrinogénio imobilizado compreendendo fibrinogénio afixado a um suporte sólido, em que o contacto é conduzido em condições suficientes para o ICAM-1 se ligar ao fibrinogénio e formar uma fase sólida complexo ICAM-1:fibrinogénio; (c) lavar o suporte sólido e o complexo com um tampão de lavagem aquoso compreendendo Mg++, Mn++ e um polipéptido contendo RGD em condições suficientes para eluir quaisquer proteínas ligadas ao fibrinogénio numa forma dependente de RGD, em que o tampão de lavagem é substancialmente isento de Ca++; e (d) eluir o ICAM-1 do suporte sólido utilizando um tampão aquoso compreendendo Mg++, Mn++ e EDTA, para formar o ICAM-1 substancialmente puro.

Breve Descrição das Figuras

Nas figuras fazendo parte desta descrição: A Figura 1 ilustra os resultados autorradiográficos da electroforese de aliquotas de fracções dos picos das eluições com RGD e EDTA dos sobrenadantes de lisados de células preparados a partir de células não tratadas, à esquerda, ou tratadas com TNF como descrito no Exemplo 2A. As faixas 1 e 3 mostram os receptores eluídos com RGD isolados de lisados celulares respectivamente preparados a partir de células não tratadas ou cclulas tratadas com TNF. O padrão caractcrístico dc VNR está presente na faixa 3. as faixas 2 e 4 mostram respectivamente o ECR eluído com EDTA isolado de células não tratadas e tratadas com TNF possuindo uma banda com um peso molecular de aproximadamente 90-95 kD, cuja intensidade é 6 / aumentada cerca de 3-5 vezes como resultado da indução da expressão de ECR por exposição ao TNF. A Figura 2 ilustra os resultados da exposição auto-radiográfica dos receptores marcados com 125I sujeitos a electroforese isolados por cromatografia de afinidade sequencial de sobrenadantes de células HUVEC marcados com 12SI em Sepharose™ com RGD seguida por uma coluna de Sepharose™ com fibrinogénio. As faixas estão marcadas de 1-8. As faixas 1 a 4 mostram a migração de proteínas em condições redutoras enquanto as faixas 5 a 8 mostram a migração de fracções idênticas sujeitas a migração em condições não redutoras. Os padrões de peso molecular de 210, 107, 71 e 41 kD marcados com 125I, respectivamente, miosina, beta-galactosidase, albumina de soro bovino e ovalbumina migraram nas faixas 4 e 8.

Nas faixas 3 e 7, o receptor de vitronectina eluído com EDTA da coluna de RGD-Sepharose™ exibia um perfil característico de alfa v/beta sob condições redutoras e não redutoras como descrito no Exemplo 2C. Outra subunidade beta de integrina, beta 1, também apresentado nas faixas 3 e 7, foi eluída a partir de coluna de RGD-Sepharose™ com EDTA.

As faixas 1 e 5 mostram a eluição de RGD do fluxo da primeira coluna de RGD aplicado na segunda coluna de fibrinogénio. A faixa 6 mostra os resultados da eluição com EDTA a seguir à eluição com RGD em que uma banda foi recuperada uma única banda de aproximadamente 90-95 kD em condições não redutoras. Em condições redutoras, o peso molecular do receptor de fibrinogénio eluído com EDTA aumentou apenas ligeiramente como apresentado na faixa 2. A Figura 3 ilustra a curva de resposta à dose da ligação de fibrinogénio marcado com 1,ftl a monocamadas de HUVEC como descrito o Exemplo 3A2. O fibrinogénio marcado com 125I ligado é colocado no eixo do Y em contagens por minuto (cpm) por poço (X IO'3) em função do incremento de concentrações de fibrinogénio marcado com 125I (X 10'7 M) no eixo do X. Os resultados mostram 7 que o fibrinogénio marcado com 125I ligam de forma saturante a uma concentração de aproximadamente 0,36 μΜ a monocamadas de HUVEC não estimuladas. Δ Figura 4 ilustra a curva de resposta à dose da ligação de fibrinogénio marcado com 125I a HUVEC não estimuladas e estimuladas com TNF ou LPS, como descrito o Exemplo 3A3. O fibrinogénio marcado com 125I ligado é colocado no eixo do Y em moléculas por célula (X 10~6) em função do aumento de concentrações de fibrinogénio marcado com 125I (X 10-7 M) no eixo do X. Sob a estimulação de TNF ou LPS, o número de moléculas de fibrinogénio marcado ligadas por célula duplicou em comparação com as ligadas a células não estimuladas. A Figura 5 ilustra os efeitos dependentes da dose e do tempo na capacidade do fibrinogénio mediar a ligação a HUVEC de células THP-1 marcadas com 51Cr. Os resultados destas experiências estão apresentadas na Figura 5A e Figura 5B em que os dados são expressos como o número de células THP-1 marcadas com 51Cr (X 10'3) no eixo do Y em função do tempo de ensaio no eixo do X. A Figura 5A mostra o efeito de diferentes concentrações de fibrinogénio purificado misturado com células THP-1 comparadas com a ausência de fibrinogénio (marcado como Fg“) na mediação da ligação a culturas HUVEC depois de um período de 60 minutos como descrito no Exemplo 3B1). A Figura 5B apresenta os resultados de ensaios semelhantes efectuados na presença de diluições de plasma humano normal (NHP). A Figura 6 ilustra os resultados da transferência de Western como descrito no Exemplo 4E. Os marcadores de peso molecular marcados radioactivamente de 97, 66, 45, 30 e 21 kD apresentam na faixa da esquerda do primeiro conjunto de 8 faixas Daudi e à esquerda no segundo conjunto de faixas HUVEC. As faixas designadas 1-5 no fundo dos transferidos Daudi e HUVEC foram feitas imunorreagir respectivamente com 2E1, PMI-I, 14E11 purificado por afinidade, sobrenadante de culturas de 14E11 e com os anticorpos monoclonais anti-ICAM-1 BD. As três faixas 8 *Λ-·: K-áir-p extra no lado HUVEC do transferido mostram o ruído de fundo quando não é utilizado nenhum anticorpo primário. A Figura 7 ilustra num gráfico de barras a inibição da ligação de fibrinogénio marcado com 125I a culturas HUVEC na presença de um excesso de 50 vezes de fibrinogénio não marcado (Fg) ao longo do tempo como descrito no Exemplo 5A1. a quantidade de radioactividade associada com as células após colheita é expressa no eixo dos Y como cpm/poço (X IO-3) . Os efeitos não inibitórios da exposição aos anticorpos monoclonais dirigidos contra VNR, designados mAb 609 e mAb 7E3, são também mostrados. A ligação total de fibrinogénio marcado com 125I na ausência de inibidores na mistura é também, mostrada. A Figura 8 ilustra os efeitos da exposição a péptidos contendo RGD e RGE na ligação de fibrinogénio marcado com 125I a HUVEC como descrito no Exemplo 5A1. A quantidade de fibrinogénio marcado com 125I ligada a HUVEC em com/poço (X 10-3) é apresentada no eixo dos Y em função do tempo em que o fibrinogénio marcado se mantinha com HUVEC. A Figura 9 ilustra a inibição do fibrinogénio marcado com 125I em culturas HUVEC não estimuladas e estimuladas por TNF, respectivamente Figura 9A e 9B, por tratamento das HUVEC com anticorpos monoclonais, 14E11, BD (anti-ICAM-1, Becton

Dickinson) e um anticorpo controlo, PMI-I. O protocolo experimental é descrito no Exemplo 5. Os resultados são expressos num gráfico de barras como a ligação específica de fibrinogénio marcado com 125I em cpm/poço (X IO-3) no eixo do Y em função dos tratamentos específicos no eixo do X.

Descrição Detalhada da Invenção Λ. Descrição geral A presente invenção descreve a identificação de um papel novo e específico para o fibrinogénio (Fg) na mediação de processos inflamatórios nos tecidos endoteliais. O papel parece ser o estabelecer de uma ponte entre o receptor Mac-1 em 9 / leucócitos e outras células contendo o receptor Mac-1 e uma classe de moléculas das células endoteliais aqui referidas como um receptor de célula endotelial (ECR). A interacção de Fg com o ECR é apresentado como sendo uma interacção de ligação única independente de RGD, diferente da conhecida ligação de Fg ao receptor vitronectina, e a outros receptores de superfície da célula endotelial tais como a transglutaminase ou o receptor de 130 quilodalton que se liga a péptidos derivados de fibras.

Até agora, como o evento de ponte aqui descrito para o Fg faz aderir células contendo Mac-1 a células endoteliais, o mecanismo descoberto e aqui descrito é distinto do mecanismo de adesão de leucócitos dependente de ICAM-1:Mac-1, devido ao papel desempenhado pelo fibrinogénio no actual estabelecimento da ponte para a interacção. A via de inflamação dependente de Fg aqui descrita é referida como inflamação mediada por célula endotelial/fibrinogénio para enfatizar a necessidade de fibrinogénio no processo. B. Homólogos

Um homólogo, como aqui utilizado é uma macromolécula, tipicamente uma proteína ou polipéptido que mima a estrutura e a função de um domínio de uma proteína que é depois modelada. No local onde uma proteína nativa contém domínios estruturais múltiplos e assim medeia múltiplas funções distintas, como o fibrinogénio, um homólogo mima um domínio particular e é capaz de interagir e competir com a proteína nativa para a participação com os mediadores dessa função da proteína na qual o domínio participa. 1. Homólogos do Fibrinogénio

Assim, de acordo com a presente invenção, um homólogo do fibrinogénio, ou homólogo de Fg, é uma macromolécula que mima a região do fibrinogénio que se liga ao receptor da célula endotelial (ECR, ICAM-1) de uma forma independente de RGD 10

de acordo com esta invenção. 0 local de ECR a que se liga o fibrinogénio de uma forma independente de RGD é referido como o "local do ECR de ligação ao Fg independente de RGD" ou "local da célula endotelial de ligação ao Fg independente de RGD", que é, um local nas células endoteliais, e no ECR aqui identificado, que se liga ao fibrinogénio de uma forma independente de RGD. 0 local de ligação é caracterizado como independente de RGD por as células endoteliais conterem outros receptores para a ligação de fibrinogénio que medeiam a ligação através da região do fibrinogénio contendo RGD.

Um homólogo de Fg é qualquer macromolécula que é capaz de se ligar ao local de ligação do Fg independente de RGD do ECR, e deste modo inibir a ligação de Fg independente de RGD às células endoteliais. Estão descritos no Exemplo 3A ensaios para medir a ligação de um homólogo de Fg ao local de ligação do Fg independente de RGD do ECR. Os ensaios para medir a inibição da ligação de Fg ao local de ligação do Fg independente de RGD do ECR estão descritos no Exemplo 5.

Um homólogo de Fg preferido é um fragmento de fibrinogénio que contém a região de Fg que se liga a ECR no local de ligação do Fg independente de RGD. Mais preferencialmente, o homólogo de Fg não se liga ao receptor Mac-1. Estes fragmentos de Fg podem ser fragmentos proteolíticos de Fg, polipéptidos derivados do fibrinogénio, porções do fibrinogénio, D30, polipéptidos ou proteínas homólogas a D30 ou fibrinogénio contendo derivados de aminoácidos não naturais ou cadeias laterais não proteicas, análogos ou derivados químicos de D30, ou fibrinogénio, ou fragmentos ou polipéptidos deste, e conjugados contendo um homólogo Fg. Um homólogo Fg preferido é o fibrinogénio, um fragmento proteolítico do fibrinogénio, e particularmente o fragmento D30 de Fg, também referido como D30.

Embora D3o e homólogos deste possam ser utilizados nos métodos da invenção, estes não são utilizados nas composições da reivindicação 1. 11 CV, '^7 0 fragmento D30 do fibrinogénio é produzido por digestão proteolitica de fibrinogénio. A preparação de D30 tem sido descrita por Fair et al., J. Biol. Chem. 256: 8018-8023 (1981), Furlow et al., Biochem. Biophys. Acta, 400:95-119 (1975) e no Exemplo 1. D30 contém cadeias β e gama parcialmente degradadas e cadeias α extensivamente degradadas combinadas por ligações dissulfureto inter-cadeia como descrito por Pizzo et al., J. Biol. Chem., 247:636-645 (1972). A extremidade N da cadeia Aa de D30 que permanece inicia-se com os resíduos de aminoacidos Leu , Gin , Lys e Asn utilizando a sequência de aminoácidos da cadeia alfa descrita por Doolittle et al., Nature, 280:464-469 (1979). A cadeia Aa de D3o que permanece não contém os resíduos de aminoácidos Arg95, Gly96, e Asp97 (RGD) ou os resíduos de aminoácidos Arg572, Gly573 e Asp574 (RGD) e possui um PM de cerca de 11 a 13 quilodaltons (kDa). A extremidade N da cadeia β de D3o contém os resíduos de aminoácidos Asp134, Asn135, Glu136 e Asn137. a extremidade N da cadeia gama de D30 contém os resíduos de aminoácidos Met89, Leu90, Glu91 e Glu92.

Um dado homólogo de Fg inclui qualquer análogo, fragmento ou derivado químico de um polipéptido de fibrinogénio activo como aqui definido, desde que o polipéptido seja capaz de inibir a ligação de Fg ao local de ligação de Fg de ECR independente de RGD. Deste modo, um polipéptido homólogo de Fg pode ser sujeito a várias alterações, substituições, inserções e delecções em que tais variações proporcionam certas vantagens na sua utilização. Neste aspecto, um homólogo de Fg desta invenção pode conter uma ou mais alterações no polipéptido desde que o homólogo retenha a sua função em um ou mais dos ensaios de inibição e ligação como aqui definido. O termo "análogo" inclui qualquer polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácidos substancialmente idêntica a uma sequência de um homólogo de Fg ou domínio de fibrinogénio cujo um ou mais resíduos foram conservativamente substituídos 12 com um resíduo funcionalmente semelhante e que apresenta as capacidades aqui descritas. Os exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico) tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, a substituição de um resíduo polar (hidrofílico) por outro tal como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagina, entre glicina e serina, a substituição de um resíduo básico tal como lisina, arginina ou histidina por outro, ou a substituição de um resíduo acídico, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico por outro. A frase "substituição conservativa" inclui também a utilização de um resíduo derivado quimicamente no lugar de um resíduo não derivado desde este polipéptido apresente a actividade de ligação necessária. "Derivado químico" refere-se a um polipéptido possuindo um ou mais resíduos quimicamente derivados por reacção de um grupo funcional lateral. Estas moléculas derivadas incluem por exemplo, as moléculas em que os grupos amina livres foram derivados para formar cloridratos de amina, grupos p-toluenossulfonilo, grupos carbobenzoxilo, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo ou grupos formilo. Os grupos carboxilo livres podem derivados para formar sais, ésteres de metilo e etilo ou outros tipos de ésteres ou hidrazidas. Os grupos hidroxilo livres podem ser derivados para formar derivados O-acilo ou O-alquilo. 0 azoto do imidazole da histidina pode ser derivado para formar N-im-benzilhistidina. Também incluídos como derivados químicos estão os péptidos que contêm um ou mais aminoácidos derivados que ocorrem naturalmente entre os vinte e dois aminoácidos convencionais. Por exemplo: 4-hidroxiprolina pode ser substituído por prolina; 5-hidroxilioina pode ser substituído por lisina; 3-metilhistidina pode ser substituída por homoserina ou serina; e ornitina pode ser substituída por lisina. Os polipéptidos da presente invenção incluem também qualquer polipéptido possuindo uma ou mais 13 Γ' adições e/ou delecções ou resíduos relativos à sequência de um polipéptido cuja sequência é aqui apresentada, desde que seja mantido o requisito da actividade de ligação. 0 termo "fragmento" refere-se a qualquer polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácidos mais curta do que a proteína nativa.

Quando um polipéptido que define uma porção de um homólogo de Fg da presente invenção possui uma sequência que não é idêntica à sequência de uma porção de fibrinogénio, é porque foram feitas tipicamente porque uma ou mais substituições conservativas ou não conservativas, normalmente não substituem mais do que cerca de 30 porcento em número, mais normalmente não mais do que 20 porcento em número, e preferencialmente não mais do que 10 porcento em número de resíduos de aminoácidos. Adicionalmente, os resíduos podem também ser adicionados a qualquer das extremidades com o objectivo de proporcionar um "ligante" através do qual os polipéptidos desta invenção possam ser convenientemente ligados a um marcador ou a uma matriz sólida, ou veículo. Preferencialmente os resíduos ligantes não formam epitopos de homólogos de Fg, isto é, não são semelhantes em estrutura a um homólogo de Fg.

Marcadores, matrizes sólidas e veículos que podem ser utilizados com os homólogos de Fg desta invenção são descritos daqui em diante.

Os ligantes de resíduos de aminoácidos são pelo menos um resíduo e podem ser 40 ou mais resíduos, mais frequentemente 1 a 10 resíduos, mas não formam epitopos de Fg. Os resíduos de aminoácidos típicos utilizados para ligação são tirosina, cisteína, lisina, ácido glutâmico e aspártico, ou afins. Adicionalmente, um determinado polipéptido pode diferir, a menos que especificado o contrário, da sequência natural da cadeia gama de fibrinogénio por a sequência ser modificada por acilação do NH2 terminal, por exemplo, acetilação, ou amidação com ácido tioglicólico, por carboxilamidação terminal, por exemplo, com 14

/" :;Ί amónia, metilamina, e afins.

Um polipéptido formando um homólogo de Fg da presente invenção pode ser preparado utilizando a técnica sintética de fase sólida inicialmente descrita por Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963). Outras técnicas de síntese de polipéptidos podem ser encontradas, por exemplo, em M. Bodansky et al.f Peptide synthesis, John Wiley & Sons, 2a Ed. (1976) assim como noutros trabalhos de referência conhecidos dos especialistas da técnica. Um resumo das técnicas de síntese de péptidos pode ser encontrado em J. Stuart e J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 3a Ed., Neurath, H. et ai., Eds., pag. 104-327, Academic Press, New York, NY, (1976). Os grupos protectores apropriados para utilização nestas sínteses serão encontrados nos textos acima assim como em J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY (1973).

Em geral, estes métodos sintéticos compreendem a adição sequencial de um ou mais resíduos de aminoácidos ou resíduos de aminoácidos adequadamente protegidos a uma cadeia polipeptídica em crescimento. Normalmente, o grupo amina ou carboxílico do primeiro resíduo de aminoácido está protegido por um grupo protector adequado, selectivamente removível, é utilizado para aminoácidos contendo um grupo lateral reactivo tal como a lisina.

Utilizando uma síntese de fase sólida como um exemplo, o aminoácido protegido ou derivado é ligado a um suporte sólido inerte através do seu grupo amina ou carboxílico não protegido. O grupo de protecção do grupo amina ou carboxílico é então selectivamente removido e o próximo aminoácido na sequência possuindo o grupo complementar (amina ou carboxílico) adequadamente protegido é misturado e feito reagir em condições adequadas para formar a ligação amida com o resíduo já ligado ao suporte sólido grupo de protecção do grupo amina ou carboxílico é então removido deste novo resíduo de aminoácido adicionado, e 15 o próximo aminoácido (adequadamente protegido) é então adicionado, e assim sucessivamente. Após todos os aminoácidos desejados terem sido ligados na sequência adequada qualquer grupo terminal e grupos laterais de protecção (e suporte sólido) são sequencialmente ou simultaneamente removidos, para proporcionar o polipéptido final.

Os métodos e procedimentos para determinar a inibição são bem conhecidos na técnica e incluem a utilização dos ensaios de competição semelhantes aos ensaios de competição do antigénio em Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor, NY (1988). Por exemplo, um composto não marcado suspeito de ser um homólogo Fg pode ser utilizado para inibir a ligação de Fg marcado ou um homólogo de Fg marcado ao sítio de ligação de Fg independente de RGD de ECR em células endoteliais. A quantidade de Fg marcado que se liga ao sítio de ligação na presença ou ausência do composto não marcado será comparada e se a presença do composto não marcado inibir a quantidade de Fg marcado ligado ao sítio de ligação, então o composto não marcado é um homólogo de Fg. Um método preferido para medir a inibição da ligação de Fg a ECR é descrito no exemplo 5.

Outros homólogos de Fg contemplado pela presente invenção são moléculas de anticorpo que imunorreagem com o sítio de ligação a Fg independente de RGD de ECR. Moléculas de anticorpo exemplificativas são anticorpos anti-ECR e anti-ICAM-1, aqui definidos posteriormente. 2. Homólogos de Receptores de Células Endoteliais

Um receptor de célula endotelial (ECR) homólogo, de acordo com a presente invenção, é uma macromolécula que mima a região de ECR que liga o fibrinogénio de uma forma independente de RGD. 0 sítio do fibrinogénio que se liga a ECR de uma forma independente de RGD é referido como "o sítio de Fg de ligação a ECR independente de RGD", que é, um sítio no Fg que se liga a ECR de uma forma independente de RGD. 16 r- 7

Um homólogo de ECR é qualquer macromolécula que é capaz de se ligar ao sítio de Fg de ligação a ECR independente de RGD, e deste modo inibir a ligação de ECR ao sítio de Fg de ligação a ECR independente de RGD, e assim inibir a ligação de Fg independente de RGD a células endoteliais. Os ensaios para medir a ligação de um homólogo de ECR ao sítio de Fg de ligação a ECR independente de RGD estão descritos no Exemplo 3a. Os ensaios para medir a inibição da ligação de ECR ao sítio de Fg de ligação a ECR independente de RGD estão descritos no Exemplo 5. 0 homólogo de ECR da presente invenção é um homólogo de ICAM-1 substancialmente purificado. Um homólogo de ECR particularmente preferido é o próprio ICAM-1. Também contemplados, os homólogos de ECR são moléculas associadas com ICAM-1 ou relacionadas com ICAM-1.

Um homólogo de ECR da presente invenção pode ser modificado, fragmentado, acoplado ou manipulado de outra forma como aqui descrito para um homólogo de Fg desde que sejam mantidas as propriedades de inibição e ligação desejáveis.

Particularmente preferidos são polipéptidos e seus análogos derivados da região de ICAM-1 que se liga ao f ibrinogénio, particularmente um ICAM-1 solúvel e derivados funcionais deste. Um ICAM-1 solúvel para utilização numa composição ou método aqui descrito não possuem tipicamente o domínio transmembranar que serve como uma âncora na membrana. As composições de ICAM-1 e ICAM-1 solúvel adequadas para utilização como um homólogo de ECR podem ser preparadas por uma variedade de métodos, incluindo os métodos de purificação descritos no Exemplo 2. Métodos preparativos adicionais para ICAM-1 e ICAM-1 solúvel estão descritos no Pedido EPO Publicado N° EP 365837 e Pedido Canadiano Publicado N° 2008368.

Outro homólogo de ECR contemplado pela presente invenção é uma molécula de anticorpo que imunorreage com o sítio de Fg de ligação a ECR independente de RGD. Moléculas de anticorpo exemplificativas são os anticorpos anti-Fg, aqui posteriormente 17 (-~ΪΊ definidos .

Um homólogo de Fg ou ECR pode ser acoplado a ou conjugado com outra proteína ou polipéptido para produzir um conjugado homólogo. Um conjugado homólogo tem vantagens sobre um homólogo utilizado por si. Por exemplo, o acoplamento do homólogo a uma proteína ou polipéptido conhecido por conter uma segunda função biológica permite o direccionamento dessa segunda função biológica para o local ou próximo de um ECR.

Quando acoplado a um veículo para formar o que é conhecido na técnica como um conjugado veículo-hapteno, um homólogo da presente invenção é capaz de induzir anticorpos que imunorreagem com o homólogo. Com base no princípio bem estabelecido da reactividade imunológica cruzada, a presente invenção contempla então variantes antigenicamente relacionadas de um homólogo de Fg ou ECR. Uma "variante antigenicamente relacionada" é um dado polipéptido que é capaz de induzir moléculas de anticorpo que imunorreagem com um homólogo de Fg desta invenção e com Fg, ou com um homólogo de ECR desta invenção e com ECR.

Qualquer péptido da presente invenção pode ser utilizado na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Os ácidos adequados que são capazes de formar sais com os péptidos da presente invenção incluem ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociânico, ácido sulfúrico, ácido acético fosfórico, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido cinâmico, ácido naftalenossulfónico, ácido sulfanílico, ou afins.

As bases adequadas capazes de formar sais com os péptidos da presente invenção incluem ba3cs inorgânicas tais como hidróxido de sódio, hidróxido de amónio, hidróxido de potássio e afins; e bases orgânicas tais como aminas mono-, di- e tri-alquilo e arilo (por exemplo, trietilamina, diisopropilamina, metilamina, dimetilamina e afins) e etanolaminas opcionalmente 18

substituídas (por exemplo, etanolamina, dietanolamina e afins).

Em outras realizações preferidas é conjugado um homólogo com uma molécula veículo para formar um conjugado homólogo contendo pelo menos uma molécula veículo. Veículos típicos incluem Sepharose™, proteínas, polipéptidos e afins.

Um homólogo pode também ser conjugado consigo mesmo ou agregado de modo a produzir um grande complexo contendo um homólogo. Um grande complexo contendo um homólogo é vantajoso porque possui novas propriedades biológicas tais como maior tempo de vida em circulação ou maior actividade. C. Composições Contendo Homólogos

Numa realização preferida, a invenção contempla uma composição compreendendo um veículo e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um homólogo de fibrinogénio (Fg) de acordo com esta invenção substancialmente puro e farmaceuticamente aceitável, capaz de ligação ao sítio de ECR de ligação a Fg independente de RGD. Os homólogos de Fg preferidos para utilização numa composição foram descritos antes.

Numa realização relacionada, a invenção contempla uma composição compreendendo um veículo e uma quantidade terapeuticamente eficaz de homólogo de receptor de célula endotelial substancialmente puro e farmaceuticamente aceitável de acordo com esta invenção, capaz de se ligar ao sítio de ligação a ECR independente de RGD e inibir a ligação a ECR ao sítio de ligação de ECR independente de RGD. Foram descritos anteriormente homólogos de ECR preferidos, particularmente homólogos de ICAM-1, para utilização numa composição.

Estas composições são ambas úteis para inibir a ligação de Fg à3 célulao cndotcliaia, inibindo asoim a inflamação mediada por célula endotelial/fibrinogénio, e os processos de doença associados aqui descritos em mais detalhe noutra secção.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um homólogo de Fg ou de ECR é uma quantidade que, quando administrada a um doente, 19 é capaz de inibir a ligação do fibrinogénio às células endoteliais. Ensaios para a detecção de inibição da ligação de Fg a células endoteliais e desta forma a medida das quantidades de inibição eficazes do homólogo incluem, mas não estão limitados aos ensaios competitivos e outros ensaios de ligação descritos no Exemplo 5 desta especificação.

Preferencialmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um homólogo de Fg ou ECR é uma quantidade que reduz (inibe) a ligação do fibrinogénio às células endoteliais em pelo menos 10%, preferencialmente 10%, preferencialmente em pelo menos 50 por cento, e mais preferencialmente em pelo menos 99 por cento quando a medição se realiza num ensaio in vitro para a ligação do fibrinogénio às células endoteliais. Um ensaio exemplificativo in vitro para quantificar quantidades inibitórias eficazes de um homólogo de Fg é descrito no Exemplo 5.

Numa realização, uma composição terapêutica é útil para inibir a inflamação mediada por célula endotelial/fibrinogénio num doente exibindo uma ou mais das condições associadas com inflamação como aqui descrito adiante. Nesta realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que quando administrada a um doente é suficiente para inibir a ligação do fibrinogénio a células endoteliais, inibindo assim a inflamação mediada por célula endotelial/fibrinogénio.

Os ensaios para a detecção directa da inibição de inflamação mediada por célula endotelial/fibrinogénio incluem, mas não estão limitados a, inspecção clinica de sintomas encontrados num doente que se apresenta com inflamação.

Substancialmente puro, quando utilizado no contexto de um homólogo dc Fg ou ECR, rcfcrc-ae a composições que são enriquecidas no homólogo de Fg ou de ECR, e estão preferencialmente isentas de quantidades detectáveis de células sanguíneas, proteínas imunoglobulina e albumina, e lipoproteínas, e mais preferencialmente contêm mais do que 99 20 por cento de homólogo em peso por massa total na composição.

Numa realização, a presente invenção contempla composições, e seus métodos de utilização, compreendendo tanto um homólogo de Fg como de ECR desta invenção numa gama de proporções de homólogo de Fg para homólogo de ECR. A proporção pode situar-se algures entre um vasto excesso de homólogo de Fg em relação a homólogo de ECR até um vasto excesso de homólogo de ECR em relação a homólogo de Fg, ie, cerca de 0,01:99,00 porcento em peso. As proporções preferidas variam entre 10:1 e 1:1. a única combinação não permitida de homólogos de Fg e homólogos de ECR numa composição contemplada é a mistura de um anticorpo anti-ECR (homólogo de Fg) com um homólogo de ECR, ou a mistura de um anticorpo anti-Fg (homólogo de ECR) com um homólogo de Fg, porque estas combinações particulares irão realizar reacções imunológicas cruzadas e neutralizar a eficiência.

Por farmaceuticamente aceitável entende-se que um homólogo de Fg ou de ECR, quando utilizado numa composição terapêutica, não provoca nenhuns efeitos fisiológicos indesejáveis devidos à presença de contaminantes. Assim, um homólogo de Fg ou de ECR farmaceuticamente aceitável está isento de contaminantes farmaceuticamente não aceitáveis tais como pirogénios (lipopolissacáridos) e outros contaminantes tais como químicos venenosos (i.e., azida de sódio) e detergentes, nomeadamente dodecilssulfato de sódio. A preparação de composições terapêuticas que contêm polipéptidos ou proteínas como ingredientes activos é bem conhecida na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas como injectáveis, quer como soluções líquidas ou suspensões, contudo, também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, líquido ante3 da injecção. A preparação também pode ser emulsionada. O ingrediente terapeuticamente activo é misturado com veículos inorgânicos e/ou orgânicos que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. Os veículos são 21

Λ». - rr:p _ V'-*a·.* "“7 excipientes (veículos) farmaceuticamente aceitáveis compreendendo mais ou menos substâncias inertes quando adicionados a uma composição terapêutica para conferir consistência adequada ou forma da composição. Os veículos adequados são, por exemplo, água, salino, dextrose, glicerol, etanol, ou afin3 e combinações dc3tco. Adicionalmcntc, oc desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes de humidificação ou emulsificação e agentes de tamponamento de pH, que aumentam a eficiência do ingrediente activo.

Uma composição terapêutica útil na prática da presente invenção contém tipicamente um homólogo de Fg ou de ECR formulado na composição terapêutica sob uma forma de sal farmaceuticamente aceitável neutralizado. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres do polipéptido ou da molécula de anticorpo) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e afins. Os sais formados com os grupos carboxilo livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo hidróxidos de sódio, potássio, amónia, cálcio, ou de ferro e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína e afins. A composição terapêutica contendo homólogo de Fg ou de ECR é convencionalmente administrada parentericamente, como através de injecção de uma dose unitária, por exemplo. Deste modo, a composição terapêutica pode ser distribuída por uma variedade de meios incluindo intravenoso,. intramuscular, infusão, oral, intranasal, intraporitoneal, subcutâneo, rectal tópico, ou noutras regiões, tais como em fluidos sinoviais. No entanto, a distribuição de uma composição contendo um homólogo de Fg ou ECR transdermicamente também é contemplada, por difusão através de via transdérmica. 22 Γ\

Ο termo "unidade de dose" quando utilizado em referência a uma composição terapêutica utilizada na presente invenção refere-se a unidades discretas adequadas para dosagens unitárias para humanos, contendo cada unidade uma quantidade pré-determinada de material activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente, veiculo ou excipiente necessário.

Em realizações preferidas, a composição terapêutica da presente invenção contém uma quantidade eficaz de um homólogo de Fg ou ECR e é uma composição estéril. Uma composição estéril é bem compreendida nas técnicas farmacêuticas e é substancialmente isenta de bactérias e fungos. Tipicamente, uma composição é tornada estéril por passagem da composição por um filtro tal como um filtro de 0,2 micra concebido para este fim.

Em outras realizações preferidas, a composição da presente invenção é optimizada para permitir que o homólogo de Fg ou ECR que contém seja distribuído transdermicamente.

Em outras realizações preferidas, uma composição da presente invenção contém uma quantidade imunologicamente eficaz do homólogo de Fg ou ECR. Uma quantidade imunologicamente eficaz do homólogo de Fg ou ECR é uma quantidade suficiente para produzir anticorpos que imunorreagem com o homólogo imunizante. D. Anticorpos e Anticorpos Monoclonais O termo "anticorpo" nas suas várias formas gramaticais é aqui utilizado como substantivo colectivo que se refere a uma população de moléculas de imunoglobulina e/ou porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulinas, isto é, moléculas que contêm um sítio de combinação do anticorpo ou paratopo.

Um "sítio de combinação do anticorpo" é a porção estrutural de uma molécula de anticorpo compreendida pelas regiões variáveis e hipervariáveis das cadeias pesada e leve que se ligam especificamente ao antigénio. O sítio pode ser reduzido a 23

uma quantidade mínima das regiões que determinam a complementaridade (CDRs) das regiões variáveis desde que a propriedade de ligação ao antigénio seja preservada. Δ frase "molécula de anticorpo" nas suas várias formas gramaticais como aqui utilizada contempla por isso tanto uma molécula de imunoglobulina intacta como uma porção imunologicamente activa de uma molécula de imunoglobulina.

Moléculas de anticorpo exemplificativas para utilização nos métodos e sistemas da presente invenção são moléculas de imunoglobulina intactas, moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e as porções de uma molécula de imunoglobulina que contêm o paratopo, incluindo as porções conhecidas na técnica como Fab, Fab', F(ab'>2/ F(v), e porções destas.

As porções Fab e F(ab')2 dos anticorpos podem ser preparadas através da reacção proteolítica da papaína e pepsina, respectivamente, em anticorpos substancialmente intactos através de métodos que são bem conhecidos. Ver por exemplo, Patente U.S. No. 4 342 566, Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69:2659-62 (1972), e Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, P118-124 (1983).

As porções de anticorpo Fab' também são bem conhecidas e são produzidas a partir de porções F(ab')2 seguidas por redução das ligações dissulfito ligando as porções das duas cadeias pesadas tal como com mercaptoetanol, e seguido por alquilação da proteína mercaptano resultante com um reagente tal como iodoacetamida. Um anticorpo contendo moléculas de anticorpo intactas são preferidas e são aqui utilizadas como ilustrativas. 1. AnLicurpus AnLi-Humóloqo de ECR Numa realização, a presente invenção contempla um anticorpo anti-homólogo de ECR, ie, uma composição compreendendo moléculas de anticorpo, que imunorreagem com um homólogo de ECR desta invenção no sítio de ligação a Fg independente de RGD de ECR ou 24 próximo deste. Dito de modo diferente, e o anticorpo homólogo anti-ECR imunorreage com ECR, é especificamente para o sitio de ligação a Fg em ECR como aqui definido, e preferencialmente inibe a ligação do fibrinogénio às células endoteliais estimuladas.

Um anticorpo anti-ECR preferido não imunorreage com o receptor da vitronectina (VnR), ie, é substancialmente livre de moléculas de anticorpo que imunorreagem com VnR. Mais preferencialmente, o anticorpo não imunorreage com qualquer receptor de superfície de célula endotelial dependente de RGD, ou com transglutaminase ou o receptor de 130 quilodalton que se liga a péptidos de fibrina.

Por "inibe preferencialmente" entende-se que o anticorpo exibe mais inibição da ligação de Fg a células endoteliais que são estimuladas do que a células endoteliais que não são estimuladas quando ensaiada em células endoteliais em monocamada, tal como é descrito no Exemplo 5. Por outras palavras, um anticorpo preferido inibe a ligação de Fg a endoteliais estimuladas a doses de anticorpo mais baixas ou resultam em ligação a Fg mais baixa do que o mesmo anticorpo quando testado em células endoteliais não estimuladas. As células endoteliais podem ser estimuladas através de uma variedade de meios, incluindo através de exposição a citoquinas tais como TNF e péptidos quimioatractivos tais como N-FMLP.

Por "substancialmente livre" entende-se que as moléculas de anticorpo não imunorreagem com o referido antigénio a níveis dentro de uma ordem de magnitude, e preferencialmente dentro de duas ordens de magnitude, do nível de imunorreacção com a espécie de antigénio referida como imunorreagindo com a molécula de anticorpo quando a imunorreacção é expressa como uma constante de equilíbrio entre o antigénio ligado (que imunorreagiu) e não ligado (que não imunorreagiu). A reactividade do anticorpo com um antigénio declarado pode ser medida através de uma variedade de ensaios imunológicos 25 ensaios de conhecidos na técnica. São aqui descritos imunorreacção exemplificativos. A preparação de anticorpos é bem conhecida na técnica. Ver, Staudt et al., J. Exp. Med., 157:687-704 (1983), Exemplos 4 e 6 da especificação ou Antibodies: A Laboratory Manual, Harlowe e Lane, Eds. Culd Spring Harbor, NY (1988). Resumidamente, para produzir uma composição de anticorpo desta invenção, um mamífero de laboratório é inoculado com uma quantidade imunologicamente eficaz de um homólogo de ECR, tipicamente como presente numa vacina ou inoculo da presente invenção, induzindo assim no mamífero moléculas de anticorpo possuindo imunoespecificidade contra o imunogénio. As moléculas de anticorpo induzidas são então recolhidas do mamífero e são isoladas até ao ponto desejado através de técnicas bem conhecidas tais como, por exemplo, através de cromatografia de imunoafinidade, ou utilizando DEAE Sephadex™ para obter a fracção de IgG.

Para aumentar a especificidade do anticorpo, as moléculas de anticorpo são purificadas preferencialmente através de cromatografia de imunoafinidade utilizando imunogénio afixado em fase sólida. O anticorpo é colocado em contacto com o imunogénio afixado de fase sólida durante um período de tempo suficiente para o imunogénio imunorreagir com as moléculas de anticorpo para formar um imunocomplexo afixado em fase sólida. Os anticorpos ligados são separados do complexo através de técnicas convencionais.

Uma vacina útil para preparar anticorpos da presente invenção compreende quantidades imunologicamente eficazes tanto de um imunogénio como de um imunopotenciador adequado para utilização em mamíferos.

Um imunopotenciador é uma entidade molecular que estimula a maturação, diferenciação e função de linfócitos B e/ou T. Os imunopotenciadores são bem conhecidos na técnica e incluem polipéptidos de estimulação de células T tais como os descritos na Patente U.S. No. 4 426 324 e os nucleósidos de guanina 26 ί—!-? substituídos em C8 descritos por Goodman et al., J. Immunol., 135:3284-88 (1985) e Patente U.S. No. 4 643 992. A palavra "inoculo" nas suas várias formas gramaticais é aqui utilizada para descrever uma composição contendo um homólogo de ECR desta invenção como um ingrediente activo utilizado para a preparação de anticorpos desta invenção.

Quando uma molécula pequena tal como um polipéptido é utilizada num inoculo para induzir anticorpos deve ser entendido que o polipéptido pode ser utilizado em várias realizações, p. ex., isoladamente ou ligado a um veículo como um conjugado, ou como um polímero polipeptídico. Contudo, para facilidade de expressão e no contexto de um inoculo de polipéptido, as várias realizações dos polipéptidos desta invenção são aqui referidos colectivamente pelo termo "polipéptido" e as suas várias formas gramaticais.

Para um polipéptido que contém menos do que cerca de 35 resíduos de aminoácidos, é preferível utilizar o péptido ligado a um veículo com o objectivo de induzir a produção de anticorpos.

Pode ser adicionado um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais ao terminal arnino- ou carboxilo- do péptido para auxiliar na ligação do polipéptido a um veículo. Verificou-se que os resíduos de cisteína adicionados ao terminal amino- ou carboxilo- do polipéptido são particularmente úteis para a formação de conjugados através de pontes dissulfito. Contudo, também podem ser utilizados outros métodos bem conhecidos na técnica para a preparação de conjugados.

As técnicas de conjugação ou acoplamento de polipéptidos através de grupos funcionais activados presentemente conhecidos na técnica são particularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Aurameas, et al-, Scand. J. Immunol., Vol. 8, Supl. 7:7-23 (1978) e Patente U.S. N° 4 493 795, N° 3 791 932 e N° 3 839 153. Adicionalmente, pode ser realizada uma reacção de acoplamento dirigida a um sítio de modo a que qualquer perda de actividade 27

Μ -η devida à orientação de polipéptido através de acoplamento possa ser minimizada. Ver, por exemplo, Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1985), e Patente U.S. N°. 4 671 958.

Procedimentos de ligação exemplificativos adicionais incluem a utilização de produtos de reacção de adição de Michael, dialdeidos tais como glutaraldeido, Klipstein, et al. , J. Infect. Dis., 147:318-326 (1983) e afins, ou a utilização de tecnologia de carbodiimida como na utilização de uma carbodiimida solúvel em água para formar ligações de amida ao veiculo. Alternativamente, o ligante cruzado heterobifuncional SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato)) pode ser utilizado para conjugar péptidos, nos quais foi introduzida uma cisteina no terminal carboxilo. São bem conhecidos na técnica veículos úteis e são eles próprios geralmente proteínas. São exemplos desses veículos a hemocianina de lapa (KLH), edestina, tiroglobulina, albuminas tais como a albumina do soro bovino (BSA) ou a albumina do soro humano (HSA), glóbulos vermelhos sanguíneos tais como eritrócitos de carneiro (SRBC), toxóide do tétano, toxóide da cólera bem como ácidos de poliamino tais como poli (D-lisina: ácido D-glutâmico), e afins. A escolha do veículo está mais dependente da utilização final do inoculo e baseia-se nos critérios que não estão particularmente envolvidos na presente invenção. Por exemplo, deve ser seleccionado um veículo que não cria uma reacção desagradável no animal particular a ser inoculado. 0 presente inóculo contém uma quantidade imunogénica eficaz de um homólogo desta invenção, tipicamente como um conjugado ligado a um veículo. A quantidade eficaz de homólogo por unidade de dose sufiuienLe para induzir uma resposta imunitária ao imunogénio depende, entre outras coisas, da espécie do animal inoculado, do peso corporal do animal e do regime de inoculação escolhido, como é bem conhecido na técnica. Os inóculos contêm tipicamente concentrações de homólogo de cerca de 10 microgramas 28 \ ; \ . /_ X)·.. JoOLv'“'’v' até cerca de 500 miligramas por inoculação (dose), preferencialmente cerca de 50 microgramas até cerca de 50 miligramas por dose. O termo "dose unitária" na sua aplicação aos inóculos refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dooageno unitárias para animai3, contendo cada unidade uma quantidade pré-determinada de material activo calculada para produzir o efeito imunogénico desejado; i.e., transportador ou veiculo. As especificações para a nova dose unitária de um inoculo da invenção são ditadas por e são directamente dependentes de (a) as caracteristicas únicas do material activo e o efeito imunológico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes à técnica de composição de material activo para utilização imunológica em animais, como aqui revelado em detalhe, sendo estas caracteristicas da presente invenção.

Os inóculos são preparados tipicamente a partir do homólogo-conjugado sólido através da dispersão do conjugado num diluente fisiologicamente tolerável (aceitável) tal como água, salino ou salino tamponado com fosfato para formar uma composição aquosa.

Os inóculos também podem incluir um adjuvante como parte do diluente. Os adjuvantes tais como o adjuvante completo de Freund (CFA), adjuvante incompleto de Freund (IFA) e alum são materiais bem conhecidos na técnica, e estão disponíveis comercialmente a partir de várias fontes. O anticorpo anti-homólogo especifico assim produzido pode ser utilizado, inter alia, em métodos e sistemas terapêuticos e de diagnóstico da presente invenção, para inibir a ligação de fibrinogénio a células endoteliais, e para detectar homólogos presentes numa amostra tal como uma amostra de fluido corporal.

Um anticorpo desta invenção é preferencialmente um anticorpo monoclonal devido à especificidade controlada oferecida por um anticorpo monoclonal. A frase "anticorpo monoclonal" nas suas várias formas 29

gramaticais refere-se a uma população de moléculas de anticorpo que contêm apenas uma espécie de sitio de combinação de anticorpo capaz de imunorreagir com um epitopo particular. Um anticorpo monoclonal apresenta assim tipicamente uma afinidade de ligação única para qualquer epitopo com o qual imunorreage. Um anticorpo monoclonal pode por isso conter uma molécula de anticorpo possuindo uma pluralidade de sítios de combinação de anticorpo, cada um imunoespecífico para um epitopo diferente, p. ex., um anticorpo monoclonal biespecífico.

Um anticorpo monoclonal é composto tipicamente de anticorpos produzidos por clones de uma célula única denominada hibridoma que segrega (produz) apenas um tipo de molécula de anticorpo. A célula de hibridoma é formada através da fusão de uma célula produtora de anticorpo e um mieloma ou outra linha celular de auto-perpetuação. A preparação de tais anticorpos foi primeiro descrita por Kohler e Milstein, Nature 256:495-497 (1975). Uma tecnologia de hibridoma exemplar é descrita por Niman et al.r Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 80:4949-4953 (1983). Também são conhecidos outros métodos de produção de um anticorpo monoclonal, uma célula hibridoma, ou uma cultura de células de hibridoma. Ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; ou o método de isolamento de anticorpos monoclonais de um reportório imunológico como descrito por Sastry, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:5728-5732 (1989); e Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1981). As referências citadas são aqui incorporadas por referência. O hibridoma assim preparado produz um sobrenadante que pode ser pesquisado em relação à presença de moléculas de anticorpo que imunorreagem com um homólogo desta invenção, ou para inibição de ligação de fibrinogénio a células endoteliais como aqui também descrito.

Em resumo, para formar o hibridoma a partir do qual a 30 composição de anticorpo monoclonal é produzida, um mieloma ou outra linha celular de auto-perpetuação é fundida com linfócitos obtidos a partir do baço de um animal hiperimunizado com um análogo desta invenção como um imunogénio. É preferido que uma linha celular de mieloma utilizada para preparar um hibridoma 3eja da mesma espécie que os linfócitos. Tipicamente, um murganho da estirpe 129 GLX+ é o mamífero preferido. Mielomas de murganho adequados para utilização na presente invenção incluem as linhas celulares sensíveis a hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) P3X63-Ag8.653, e Sp2/0-Agl4 que estão disponíveis na American Type Culture Collection, Rockville, MD, sob as designações de CRL 1580 e CRL 1581, respectivamente.

Os esplenócitos são fundidos tipicamente com células de mieloma utilizando polietilenoglicol (PEG) 1500. os híbridos fundidos são seleccionados pela sua sensibilidade ao HAT. Os hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal desta invenção são identificados utilizando o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) descrito no Exemplo 4.

Um anticorpo monoclonal da presente invenção também pode ser produzido iniciando uma cultura de hibridoma monoclonal compreendendo um meio nutriente contendo um hibridoma que produza e segregue moléculas de anticorpo da especificidade polipeptídica apropriada. A cultura é mantida em condições e durante um período de tempo suficiente para o hibridoma segregar as moléculas de anticorpo para o meio. O meio contendo anticorpo é então recolhido. As moléculas de anticorpo podem então ser posteriormente isoladas através de técnicas bem conhecidas.

Os meios úteis para a preparação destas composições são bem conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis e incluem meios de cultura sintéticos, murganhos consanguíneos e afins. Um meio sintético exemplificativo é o meio mínimo essencial de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959)) suplementado com glucose a 4,5 gm/L, glutamina a 20 mM e 31

soro de vitela fetal a 20%. Uma estirpe de murganhos consanguíneos exemplificativa é a Balb/c.

Os anticorpos monoclonais desta invenção podem ser utilizados do mesmo modo que o revelado para os anticorpos da presente invenção.

Dor exemplo, o anticorpo monoclonal pode ser utilizado em métodos terapêuticos, de diagnóstico ou ín vitro aqui revelados nos quais a inibição da ligação do fibrinogénio a células endoteliais é desejada.

Um anticorpo monoclonal preferido imunorreage com o protótipo de ECR aqui descrito, nomeadamente ICAM-1. O anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 foi produzido através de imunização com células endoteliais, seguido por pesquisa em relação à capacidade de inibir a ligação de Fg a células endoteliais, como descrito no Exemplo 4.

Um anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 particularmente preferido é o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma 14E11, 16G8, 2E12, e 2B12 que imunorreage com ICAM-1, e inibe a ligação de Fg a células endoteliais.

Estão também contemplados anticorpos monoclonais possuindo uma especificidade de ligação para os mesmos epitopos ou de reacção cruzada, ie, imunoespecíficos para o mesmo epitopo, em ICAM-1 como os anticorpos anti-ICAM-1 acima preferidos, ou derivados dos anticorpos acima. Assim, a presente invenção contempla um anticorpo monoclonal, e fragmentos imunorreactivos deste, que possui a imunoespecificidade de um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma seleccionado de um grupo consistindo em 14E11, 16G8, 2E12, e 2B12.

As técnicas imunológicas para determinar a imunoespecificidade de um anticorpo monoclonal são bem conhecidas na técnica, e podem incluir estudos de ligação de competição e outros ensaios de reacção cruzada. Ver, por exemplo os imunoensaios descritos em Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. 32

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Está também contemplada por esta invenção a célula hibridoma e as culturas contendo uma célula hibridoma que produz um anticorpo monoclonal desta invenção.

Os hibridomas 14E11, 16G8, 2E12, e 2B12 foram depositados de acordo com as especificações do Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection (ATCC) , Rockville, MD, em 10 de Junho, 1992 e foi-lhes atribuído os números de acesso HB 11064, 11063, 11061 e 11062, respectivamente.

Os hibridomas 14E11, 16G8, 2E12, e 2B12 foram depositados num depositário permitindo a permanência do depósito e a pronta acessibilidade a estes pelo público após concessão de uma patente, sob as condições que asseguram que o acesso aos hibridomas estará disponível, durante o tempo em que o pedido de patente está pendente, aos acreditados pelo Comissariado como tendo direito a esse acesso, e que todas as restrições à disponibilidade dos hibridomas ao público tal como depositados serão irrevogavelmente retiradas após a concessão da patente. Os hibridomas depositados serão mantidos pela ATCC até ao fim da patente ou durante 30 anos a partir da data do depósito, qualquer que ocorra mais tarde, e em todos os casos durante pelo menos cinco anos após a data do último pedido de acesso. E. Métodos de Inibição de Ligação de Fibrinoqénio a Células Endoteliais e Inibição de Inflamação Mediada por Fibrinogénio/Células Endoteliais A presente invenção contempla um método de inibição de fibrinogénio (Fg) a células endoteliais com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição contendo um homólogo de Fg ou de ECR, ou ambos, desta invenção dispersa num excipiente farmaceuticamente aceitável.

Como aqui descrito, a utilização de um homólogo de Fg ou de um homólogo de ECR, ou ambos, exibe(m) inibição terapeuticamente eficaz de ligação de Fg a células endoteliais porque estes dois reagentes terapêuticos mima, como homólogos, os seus parceiros 33 naturais bloqueando assim a interacção fibrinogénio-ECR como identificado pela presente invenção.

Nos exemplos aqui apresentados, o anticorpo monoclonal homólogo de ECR anti-ICAM-1 é utilizado como um reagente terapêutico exemplificativo para utilização numa composição para o presente método. Noutro exemplo, o homólogo de Fg, fibrinogénio intacto, é utilizado como um reagente terapêutico exemplificativo. Contudo, deve ser entendido que a invenção contempla a utilização de qualquer um dos homólogos de Fg ou de ECR e não está limitada a estes reagentes específicos.

Na medida em que a ligação de Fg a células endoteliais medeia a inflamação mediada por fibrinogénio e célula endotelial, a inibição da ligação de Fg in vivo proporciona um método para a inibição de inflamação num doente que sofre de, ou que está em risco de inflamação mediada por fibrinogénio e célula endotelial.

Por isso, a presente invenção também contempla um método de inibição de inflamação mediada por fibrinogénio/célula endotelial num doente compreendendo a administração ao doente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo um homólogo substancialmente puro seleccionado do grupo consistindo num homólogo de Fg e um homólogo de ICAM-1 dispersos em conjunto com um excipiente farmaceuticamente aceitável (veículo).

Os doentes para os quais a inibição de ligação de Fg a células endoteliais, e a inibição da inflamação seriam clinicamente úteis incluem doentes com vários tipos de inflamação, ou em risco de inflamação, incluindo, mas não estando limitado a doentes com enfartes de miocárdio muito recentes (dentro de 40 h apÓ3 o acontecimento agudo) cm que o homólogo de Fg ou de ECR previnem a acumulação de neutrófilos nos tecidos expostos devido a lesão desses tecidos, doentes com respostas autoimunes, inflamações gerais ou reacções inflamatórias localizadas, nefrite glomerular, 34

hipersensibilidade do tipo atrasado, psoríase, tiroidite autoimune, esclerose múltipla, artrite reumatóide, eritematose de lúpus, transplantes de tecidos, rejeição de enxertias, lesão de reperfusão do tecido, e as desordens inflamatórias afins. A inibição de inflamação mediada por fibrinogénio/célula endotelial pode ser detectada através da medição de alterações na quantidade de acumulação de neutrófilos no sitio da inflamação produzindo lesão ou ferida. Por exemplo, o número de neutrófilos que se acumulam no sítio de uma esponja colocada sob a pele pode ser determinada tanto antes como após um homólogo de Fg ou de ECR ser administrado ao doente. Ver, por exemplo, Price et al., J. Immunol., 139:4174-4177 (1987). A inflamação mediada por fibrinogénio/célula endotelial inclui qualquer um dos linfócitos mediados por vários processos biológicos, possuindo um receptor de Mac-1 na sua superfície celular. Os processos biológicos típicos incluem a adesão de células possuindo Mac-1 a endotélio vascular e interacções específicas com proteínas de matriz extracelular.

Um homólogo é tipicamente administrado como uma composição farmaceuticamente aceitável na forma de uma solução ou suspensão. Contudo, como é bem conhecido, podem também ser formulados péptidos e proteínas tais como um homólogo de Fg ou de ECR para administração terapêutica como comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação sustentada ou pós. Tipicamente, o intervalo de dosagem adequado para uma composição terapêutica encontra-se na ordem de um a centenas de nanomoles de homólogo de Fg ou de ECR por quilograma de peso corporal, por minuto, e depende da via de administração. Em qualquer dos casos, a composição de administração contém pelo menos cerca de 0,10% a cerca de 99% em peso de um homólogo de Fg ou de ECR por peso de composição, preferencialmente 10%-90% e mais preferencialmente 25-75%. A composição é administrada de um modo compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade terapeuticamente 35 eficaz. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado, da capacidade do sistema hemostático do sangue do sujeito para utilizar o ingrediente activo, e do grau de inibição de inflamação ou de inibição de ligação ao fibrinogénio desejada. As quantidades precisas de ingrediente activo necessário para a administração dependem do julgamento do médico assistente e são peculiares para cada indivíduo.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de homólogo pode ser expressa como uma quantidade suficiente para produzir uma concentração final de homólogo no sangue de um doente. Essa concentração sanguínea pode ser determinada através de um ensaio in vitro para o homólogo numa amostra de líquido corporal (p. ex., sangue), tal como é aqui descrito, ou pode ser calculada com base no peso corporal do doente e no volume sanguíneo, como é bem conhecido.

Os intervalos de dosagem adequados de um homólogo para os métodos terapêuticos aqui descritos são da ordem de cerca de 0,1 a cerca de 20 miligramas, preferencialmente de um a dez miligramas de homólogo por quilograma de peso corporal de um doente, e dependendo a via de administração. Dito de forma diferente, uma dosagem terapeuticamente eficaz é uma quantidade suficiente para produzir uma concentração intravascular no sangue do doente no intervalo de cerca de 0,1 a cerca de 100 microgramas/mililitro (pg/mL), preferencialmente cerca de 10 a cerca de 20 pg/mL, preferencialmente cerca de 10 a cerca de 20 pg/mL do ingrediente activo. F. Métodos de Detecção do Homólogo A presente invenção contempla qualquer método que resulta na detecção de um homólogo atravéo da produção de um produto de reacção utilizando um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, ou reagente de ligação homólogo.

Devido à interacção de ligação de um homólogo de Fg e de um homólogo de ECR, um reagente de ligação a Fg homólogo pode ser 36 qualquer homólogo de ECR, e um reagente de ligação de ECR pode ser qualquer homólogo de Fg.

Os especialistas da técnica entenderão que existem numerosos procedimentos químicos de diagnóstico clínico bem conhecidos que podem ser utilizados para formar e detectar estes produtos de reacção. Assim, embora sejam aqui descritoo método3 de ensaio exemplificativos, a invenção não é tão limitada.

Podem ser empregues vários protocolos de ensaio heterogéneos e homogéneos, competitivos ou não competitivos para detectar a presença e preferencialmente a quantidade de um homólogo de Fg ou ECR num tecido ou composição líquida.

Um homólogo de Fg ou ECR pode ser detectado em qualquer amostra tal como uma amostra sólida, líquida ou de fluido corporal. Em realizações preferidas é detectado um homólogo em amostras de fluidos corporais incluindo sangue, plasma, soro, mucos, expectoração e afins.

Um homólogo pode também ser detectado in vitro ou in vivo em vários tecidos e órgãos. Em realizações preferidas podem ser ensaiados pedaços de tecido ou secções de tecido para a presença e localização de um homólogo. Em outras realizações preferidas podem ser ensaiados órgãos in vivo para detectar a presença e para determinar a localização de um homólogo. A detecção da quantidade de homólogo presente in vitro ou in vivo é útil porque a quantidade de homólogo presente correlaciona-se com o progresso de homólogo administrado terapeuticamente presente no doente a ser analisado. Assim, a determinação de homólogo presente no doente a ser analisado permite a administração terapêutica de um homólogo a um doente a ser monitorizado para determinar o estado clínico do doente.

Numa realização a presente invenção contempla um método para detectar a presença e preferencialmente a quantidade, de um homólogo de Fg numa composição líquida. Os passos deste método incluem: (1) misturar uma amostra de células endoteliais com 37

Λ η + ί'-·Ί uma quantidade pré-determinada de uma amostra liquida contendo um homólogo de Fg e uma quantidade pré-determinada de um homólogo de Fg marcado para formar uma mistura de reacção de competição; (2) manter a mistura de reacção formada no passo (1) durante um período de tempo pré-determinado suficiente para o homólogo de Fg presente na composição líquida se ligar às células endoteliais e formar um complexo célula endotelial:homólogo de Fg e para permitir que o homólogo de Fg marcado se ligue às células endoteliais e forme um complexo marcado células endoteliais:homólogo de Fg; (3) ensaiar a presença e/ou a quantidade de complexo marcado células endoteliais:homólogo de Fg formado no passo (2) detectando assim a presença e/ou a quantidade de um homólogo de Fg na composição.

Uma quantidade pré-determinada de uma composição líquida contendo um homólogo de Fg é uma quantidade conhecida de uma composição liquida contendo Fg que é útil e facilmente ensaiada. Esta quantidade pré-determinada de composição líquida contendo um homólogo de Fg mostrou ser útil efectuando uma série de ensaios teste com uma quantidade de composição contendo uma concentração conhecida de homólogo de Fg e é suficiente para permitir que o ensaio se efectue. As quantidades de composição líquida preferidas são de 1 microlitro (pL) a cerca de 100 pL. A composição líquida também contém um homólogo de Fg marcado. Um marcador é um átomo ou molécula que ou directamente ou indirectamente está envolvido na produção de um sinal detectável para indicar a presença do complexo. Qualquer marcador ou meio indicador pode ser ligado a ou incorporado numa composição do proteína expressa, polipóptido, ou anticorpo ou anticorpo monoclonal da presente invenção, ou utilizado separadamente, e esses átomos ou moléculas podem ser utilizados isoladamente ou em conjunto com reagentes adicionais. Os marcadores incluem vários marcadores in vivo úteis no corpo de 38

Γ V’ ;y\ um doente tais como 1UI, 99Tc, 67Ga, 186Re, e 132I. 0 marcador pode ser um agente de marcação fluorescente que se liga quimicamente a anticorpos ou antigénios sem os desnaturar para formar um fluorescente (corante) que é um imunofluorescente detectável útil. Os agentes de marcação fluorescente adequados o3o fluorooromoa tais como isocianato de fluoresceina (FIC), isotiocianato de fluoresceina (FITC), cloreto de 5-dimentilamin-l-naftalenossulfonilo (DANSC), isotiocianato de tetrametilrrodamina (TRITC), lissamina, cloreto de sulfunilo e rodamina 8200 (RB 200 SC) e afins. Uma descrição de técnicas de análise por imunofluorescência é encontrada em Deluca, "Immunofluorescence Analysis", in Antibody As A Tool, Marchalonis et ai., eds., John Wiley & Sons, Ltd, pag. 189-231 (1982), que é aqui incorporado por referência.

Em realizações preferidas o marcador é uma enzima, tal como a peroxidase de rábano (HRP), glucose oxidase, ou afins. Nos casos em que o grupo indicador principal é uma enzima como a HRP ou glucose oxidase, são necessários reagentes adicionais para visualizar o facto de que se formou um complexo receptor-ligando (imunorreagido). Estes reagentes adicionais para HRP incluem peróxido de hidrogénio e um corante de oxidação precursor tal como diaminobenzidina. Um reagente adicional útil com a glucose oxidase é o ácido 2,2'-azino-di(3-etil-4-2-benzotiazolin-G-sulfónico (ABTS).

Os elementos radioactivos são também úteis como marcadores. Um marcador radioactivo exemplificativo é um elemento que produza emissão de raios gama. Os elementos que por si só emitem raios gama, tais como 124I, 125I, 128I, 131I, 132I e 51Cr representam uma classe de grupos indicadores de elementos radioactivos que produzem-emitem raio3 gama. Particularmente preferido é ο I. Outro grupo de grupos indicadores úteis é o dos elementos UC, 18F, 150 e 13N que por si só emitem positrões. Os positrões assim emitidos produzem raios gama após encontrarem electrões que estão presentes no corpo do animal. Também útil é um emissor 39 rs. rs.

i-— Λ -· : \ / {] j ;"Λ -.:V . beta tal como o índio. A ligação de marcadores, isto é, a marcação de polipéptidos e proteínas tais como um homólogo de Fg é bem conhecida na técnica. Por exemplo, as moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma podem ser marcadas por incorporação metabólica de aminoácidos contendo radioisótopos fornecidos como componentes do meio de cultura. Ver, por exemplo, Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). As técnicas de conjugação ou acoplamento de proteínas através de grupos funcionais activados são particularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Vol.8, 7:7-23 (1978), Rodwell et al.,

Biotech. 3: 889-894 (1985), e Patente E.U.A. n° 4 493 795. adicionalmente, as reacções de acoplamento dirigidas a um local podem ser efectuadas que modo que o marcador não interfira substancialmente com a capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem ao seu antigénio específico. Ver, por exemplo, Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1985). A mistura de reacção é mantida durante um período de tempo pré-determinado suficiente para o homólogo de Fg e o homólogo de Fg marcado presentes na composição líquida se ligarem às células endoteliais e formarem um complexo célula endotelial:homólogo de Fg e um complexo célula endotelial:homólogo de Fg marcado. A quantidade de tempo suficiente para o homólogo de Fg se ligar ás células endoteliais depende de vários parâmetros físicos incluindo temperatura e a concentração dos vários reagentes. Em realizações preferidas, o período de tempo pré-determinado é de cerca 1 minuto a 24 horas. Em realizações mais preferidas o período de tempo pré-determinado é de cerca de 15 minutos a cerca de 1 hora. Nas realizações mais preferidas, o período de tempo pré-determinado è de cerca de lb minutos a cerca de 30 minutos. Tipicamente este período de tempo é pré-determinado para optimizar o ensaio.

Tipicamente a mistura de reacção é mantida sob condições de ensaio biológico que mantêm a actividade das moléculas de 40 Γ\ \ \ ΰ · >-"Τ —η 7 polipéptido e proteínas incluindo do homólogo de Fg e as células endoteliais que se pensa ensaiar, e incluem o intervalo de temperatura de cerca de 4 graus C (4°C) a cerca de 45°C, um valor de pH no intervalo de 5 a cerca de 9 e uma força iónica variando desde a da água destilada à da cloreto de sódio a um molar. Os métodos para optimizar estas condições são bem conhecidos na técnica. A presença de complexo célula endotelial:homólogo de Fg marcado formado por manter a mistura de reacção no passo (2) é ensaiada.

Os métodos directos ou indirectos utilizados para ensaiar a presença de e preferencialmente a quantidade de complexo célula endotelial:homólogo de Fg marcado formado dependem em particular do marcador utilizado e são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a quantidade de radioactividade no complexo célula endotelial:homólogo de Fg marcado pode ser determinado como descrito no Exemplo 5. Alternativamente, os métodos de ensaio métodos de ensaio homogéneos como os descritos nas patentes E.U.A. N° 4 536 479; N° 4 233 401; N° 4 233 402 e N° 3 996 345.

Em outras realizações preferidas, a presente invenção contempla outro método de detecção da quantidade de um homólogo de Fg numa amostra líquida utilizando um reagente de ligação do homólogo de Fg, isto é, um homólogo de ECR. Os passos deste método incluem: (1) misturar um homólogo de ECR com uma quantidade pré-determinada de uma amostra líquida contendo um homólogo de Fg para formar uma mistura de reacção de ligação; (2) manter a mistura de reacção de ligação formada no passo (1) durante um período de tempo pré-seleccionado suficiente para o homólogo de Fg presente na amostra líquida se ligar ao homólogo de ECR e formar um complexo contendo um homólogo de Fg e um homólogo de ECR; e (3) determinar a quantidade de complexo formado no passo (2), detectando assim a quantidade de um homólogo de Fg na 41 Γ\

amostra líquida.

Um homólogo de ECR preferido é um anticorpo monoclonal anti-Fg, e o complexo formado é um complexo de imunorreacção.

Numa realização relacionada, a invenção contempla um método para a detecção da quantidade de um homólogo de ECR numa amostra líquida utilizando um reagente de ligação de um homólogo de ECR, isto é, um homólogo de Fg.

Preferencialmente, a amostra líquida contendo um homólogo é uma amostra de fluido biológico tal como sangue, plasma, soro, expectoração, saliva, e afins. Preferencialmente, é conhecida a quantidade de amostra líquida misturada.

Para o passo determinante, é preferido que o homólogo adicionado (homólogo de Fg para detectar homólogo de ECR, e homólogo de ECR para detectar homólogo de Fg) seja marcado, isto é, operacionalmente ligado a um meio indicador tal como uma enzima, radionuclídeo e afins como descrito anteriormente. Nesta realização, a determinação é realizada pela detecção da presença/quantidade do marcador no complexo, determinando assim a presença/quantidade do homólogo na amostra.

Numa realização, o homólogo adicionado está presente como parte do suporte sólido, isto é, operacionalmente ligado a uma matriz sólida, de modo que a mistura de reacçâo formada é uma fase líquida ou sólida, com o objectivo de "capturar" a amostra a ser determinada. A mistura de reacção é mantida durante um período de tempo pré-determinado suficiente para o homólogo presente na amostra líquida se ligar ao anticorpo e formar um complexo contendo um homólogo a ser detectado pelo homólogo adicionado.

As condições de ensaio biológico são as condições que mantêm a actividade biológica dos reagentes e do homólogo a ser ensaiado como discutido anteriormente.

Numa realização preferida, a quantidade de homólogo no complexo pode ser determinada, seja directamente ou indirectomente, utilizando técnicas de ensaio bem conhecidas na 42

técnica, e dependem tipicamente do tipo de meios indicadores utilizados G. Detecção de Receptores ECR In Vivo

Está contemplado um método para detectar a presença e preferencialmente a quantidade e localização de células possuindo receptores ECR num mamífero. Uma quantidade eficaz de uma composição contendo um diluente fisiologicamente tolerável e uma quantidade de homólogo de Fg ligada a um meio indicador in vivo é administrado parentericamente a um sujeito humano. A administração parentérica inclui a administração intramuscular, administração intravenosa, e administração em outros sítios do corpo, tais como o fluido sinovial. A quantidade de composição administrada é suficiente para ligar uma quantidade detectável de receptores ECR. Em realizações preferidas os homólogos de Fg são moléculas de anticorpo anti-ICAM-1, ou o fragmento D30.

Como aqui utilizado, os termos "marcador" e "meios indicadores" nas suas várias formas gramaticais referem-se a átomos simples e moléculas que estão directamente ou indirectamente envolvidos na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um complexo. Os marcadores ou meios indicadores in vivo são os que são úteis no corpo de um sujeito humano. Qualquer marcador ou meio indicador pode ser ligado a ou incorporado numa composição de proteína expressa, polipéptido, ou molécula de anticorpo que é parte de um anticorpo ou anticorpo monoclonal da presente invenção, ou utilizados separadamente, e estes átomos ou moléculas podem ser utilizadas isoladamente ou em conjunto com reagentes adicionais. Estes marcadores são eles próprios bem conhecidos na química de diagnóstico clínico e constituem parte desta invenção apenas na medida em que são utilizados com outros novos métodos e/ou sistemas de proteínas.

Os marcadores de ligação, isto é, a marcação de polipéptidos e proteínas é bem conhecida na técnica. Por 43 exemplo, as moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma podem ser marcadas por incorporação metabólica de aminoácidos contendo radioisótopos fornecidos como componentes do meio de cultura. Ver, por exemplo, Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981) . As técnicas de conjugação ou acoplamento de proteínas através de grupos funcionais activados são particularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Vol.8, 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech. 3: 889-894 (1985), e Patente E.U.A. n° 4 493 795. O sujeito é então mantido durante um período de tempo pré-determinado suficiente para o homólogo de Fg se ligar aos receptores de ECR presentes nas células do sujeito humano e formarem um complexo ECR:homólogo de Fg. Preferencialmente, este período de tempo foi pré-determinado para optimizar a formação de um complexo ECR: homólogo de Fg. 0 sujeito é então ensaiado para a presença da e preferencialmente localização de quaisquer complexos ECR:homólogo de Fg formados. H. Método para Identificar Inibidores A presente invenção contempla também métodos para identificar a composição que inibe a interacção de ligação do fibrinogénio com as células endoteliais quando a interacção é mediada pelo sitio de ECR de ligação ao fibrinogénio como aqui descrito. 0 método é geralmente útil para a concepção de novos terapêuticos utilizados na inibição da inflamação mediada por célula endotelial/fibrinogénio, e é particularmente útil como um procedimento de pesquisa de massa para identificar compostos inibidores activos e formulação. A invenção contempla assim um método para identificar uma composição que inibe a ligação do fibrinogénio a ECR nas células endoteliais, que compreende: (a) incubar oo componentes compreendendo a composição a 44 7 7

\~ρ

' ·- t.*T ser testada em conjunto com um homólogo de ECR e um homólogo de Fg sob condições que permitem ao homólogo de ECR interagir e ligar-se com o homólogo de Fg; e (b) medir a interacção do homólogo de CR com o homólogo de Fg, medindo assim a capacidade da composição inibir a interacção.

Um homólogo de ECR preferido é ICAM-1, e um homólogo preferido de Fg é fg, como aqui definido. A medição pode ser dirigida para detectar o homólogo de Fg, o homólogo de ECR livre, ou a composição livre. Alternativamente, a medição pode detectar a interacção da ligação da composição seja com o homólogo de ECR ou com o homólogo de Fg. Tipicamente, a interacção de ligação é medida pela detecção de um complexo formado após a ligação.

As condições suficientes para uma interacção de ligação são geralmente fisiológicas, e são condições de tempo, temperatura e tampão compatíveis com a ligação de fibrinogénio a células endoteliais, como apresentado nos Exemplos.

Mais preferencialmente, a interacção de ligação é detectada em ensaios em que um ou outro do homólogo de Fg ou do homólogo de ECR está na fase sólida, e outro está marcado. A medição compreendeu detectar a presença, e preferencialmente a quantidade de marcador na fase sólida, indicando directamente a quantidade de inibição pela composição.

Numa realização relacionada, a invenção descreve um método de pesquisa para composições eficazes em inibir a ligação de fibrinogénio a ECR compreendendo os passos de: (a) misturar numa mistura de reacção de inibição quantidades pré-seleccionadas de uma composição de um inibidor putativo, um homólogo de Fg, e um homólogo de ECR como aqui definido; (b) manter a referida mistura sob condições suficientes para o referido homólogo de ECR se ligar ao referido homólogo de Fg e formar um complexo homólogo de ECR: homólogo de 45

Fg; e (c) medir a quantidade de complexo homólogo de ECR: homólogo de Fg formado no passo (b) , e assim a eficácia da referida composição inibidora.

Na prática do método, um dos homólogos está marcado e na fase liquida, e outro homólogo está na fase sólida, em que a medida envolve a detecção da quantidade de marcador na fase sólida. Outros formatos são imediatamente óbvios.

Preferencialmente, o homólogo de ECR é ICAM-1 purificado. Mais preferencialmente, o homólogo de ECR está na fase sólida. Ainda mais preferencialmente, a fase sólida é uma célula em que ECR está localizado como numa célula endotelial, célula linfóide, ou uma célula recombinante capaz de expressar ICAM-1 recombinante. São descritos métodos exemplificativos de pesquisa no Exemplo 5, em que foram identificados anticorpos que exibem ligação de Fg a células endoteliais. Também podem ser desenvolvidos e/ou identificados homólogos de Fg e homólogos de ECR através dos métodos acima.

Exemplos mas não limitar,

Os seguintes exemplos pretendem ilustrar, a presente invenção. 1. Preparação de Análogos de Fibrinigénio A. Purificação de Plasma de Fibrinoqénio 0 fibrinogénio foi isolado a partir de plasma fresco através de procedimentos de fraccionamento com etanol frio. A um volume de plasma foi misturado 0,22 volumes de etanol frio a bU%, pH 7,0 que baixou a temperaLura para -3 graus Celsius (-3°C). A mistura foi centrifugada e o precipitado resultante foi lavado com 0,5 volumes originais (OV) de etanol a 7%, pH 6,5 a -3°C. 0 precipitado foi recolhido e dissolvido em 0,25 OV de tampão citrato de sódio a 0,55 M, pH 6,5 a 30°C. A solução 46 resultante foi arrefecida a 0°C e o fibrinogénio foi precipitado através da adição de etanol frio a 20% para uma concentração final de 8% para formar fibrinogénio purificado.

Para remover qualquer contaminação possível do fibrinogénio purificado com fibronectina, a preparação de fibrinogénio purificado foi passado por uma coluna de gelatina de Sepharose™ 4B (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) de acordo com as instruções do fabricante resultando em fibrinogénio livre de fibronectina. B. Preparação de D30 a partir de Fibrinogénio Purificado 1) Digestão Proteolítica de Fibrinogénio Purificado

Cinquenta miligramas (mg) de fibrinogénio purificado preparado no Exemplo IA foi dissolvido em 1 mililitro (mL) de uma solução de tampão TBS contendo Tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl) a 0,01 M, cloreto de sódio (NaCl) a 0,14 M, pH 7,4, e foi digerido proteoliticamente por plasminogénio activado por Estreptoquinase (plasmina) de acordo com o seguinte procedimento. O plasminogénio activado com Estreptoquinase foi preparado misturando plasminogénio (KABI, 20 unidades (U) ) a 2 mL de tampão fosfato de sódio a 0,1 M, pH 7,4 e pré-mantendo durante 10 minutos a 37°C com 500 U de estreptoquinase (Streptase, Behring). Esta solução foi então misturada a uma concentração final de 18 microgramas por mL (pg/mL) à solução de fibrinogénio purificado em ureia a 2 M. A mistura foi mantida durante 2 horas a 37°C. A reacçâo proteolítica na mistura foi terminada através da adição de 50 000 U/mL de trasilol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). A solução resultante de fragmentos de fibrinogénio foi dialisada extensivamente contra uma solução de TBS durante 24 horas a 4°C. O tampão de diálise foi mudado a cada 8 horas. A solução dialisada foi então recuperada e aplicada numa coluna de Sephadex™ G-100 (Pharmacia LKB). A cromatografia em coluna foi realizada para separar os fragmentos resultantes da digestão 47 h \i proteolitica do fibrinogénio. A coluna foi pré-lavada com um tampão corrente de TBS seguido por aplicação dos fragmentos de fibrinogénio dialisados. Foram colhidas fracções de 3 mL e os pesos moleculares dos fragmentos separados nas fracções foram determinados por electroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilsulfato de sódio a 10% (SDS-PAGE) com e sem redução por mercaptoetanol a 3%.

Foram visualizados três fragmentos de diferentes pesos moleculares através de coloração do gel com Coomassie Blue. Os fragmentos X, D, e E possuíam respectivamente pesos moleculares de aproximadamente 240 000, 85 000, e 50 000 em condições de não redução. As fracções correspondentes aos três picos separados foram recolhidas separadamente, dialisadas contra água destilada, e concentradas por liofilização. 2) Digestão Proteolitica do Fragmento D para Produzir um Homólogo de D30 O fragmento de fibrinogénio D com um peso molecular de 80 000 (80 quilodaltons (kD)), purificado e concentrado, foi digerido proteoliticamente com plasmina em ureia a 2 M durante 24 horas a 37°C como descrito no Exemplo 1B. A digestão foi terminada e a solução resultante foi dialisada como descrito no Exemplo 1B. A solução dialisada foi recuperada e os produtos da digestão foram isolados por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC) numa coluna Mono-Q (Pharmacia LKB) equilibrada em fosfato de sódio a 0,01 M, pH 7,0. Os fragmentos foram eluídos com uma solução de fosfatos de sódio a 0,01 M e cloreto de sódio a 1 M, pH 7,0. A pureza das proteínas eluídas nas fracções recolhidas foi ensaiada em SDS-PAGE a 15% em condições de não redução. A coloração do gel com Coomassie Blue revelou um fragmento de 30 kD de homogeneidade superior a 90%. O produto de digestão proteolitica purificado do fragmento D possuindo um kD de 30 foi designado D30. As fracções de pico contendo D30 foram recolhidas e concentradas por liofilização. 48 2. Purificação da Célula Endotelial

Receptor de Fibrinogénio Independente de RGD A. Preparação de Lisado de Células Endoteliais de Veia Umbilical Humana Células endoteliais de veia umbilical humana, (HUVEC) comercialmente disponíveis em Clonetics, San Diego, CA, foram passadas para 40 frascos de cultura de tecidos com cobertura de gelatina T75 (Falcon, Thousand Oaks, CA) e mantidas em RPMI 1640 sem endotoxina (Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, MD) suplementado com soro de feto bovino (FBS) (Hyclone, Sterile Systems, Logan, UT), Hepes a 25 mH [ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperidinaetanossulfónico] (Calbiochem Boehring, La Jolla, CA), penicilina-estreptomicina-fungizona a 100 pg/mL (Whittaker), factor de crescimento de células endoteliais a 0,5% (Biomedical Technologies, Stoughtom, MA) e glutamina a 1 mM (Whittaker) . De modo a aumentar o rendimento do receptor de células endoteliais purificado (ECR), as células endoteliais cultivadas, a uma densidade de aproximadamente 5 x 106 células/frasco, foram estimuladas 6 horas antes da recolha através de exposição a factor alfa da necrose tumoral (TNF, Genzyme Corp., Cambridge, MA) a uma concentração de 20 ng/mL. A resposta celular a TNF foi inicialmente revelada em experiências descritas no Exemplo 3a. após o meio de cultura ter sido removido, as células foram retiradas dos frascos com ácido etilenodiaminotetracético a 4 mM (EDTA, Sigma Chemical Co.) a 37°C durante 30 minutos. As suspensões das células removidas de todos os frascos foram recolhidas e sedimentadas por centrifugação a 1200 rpm durante 10 minutos. As células sedimentadas foram lavadas duas vezes com salino tamponado com fosfato frio (PBS).

Após a lavagem final, as células foram ressuspendidas em PBS contendo cloreto de cálcio (CaCl2) a 1 milimolar (mM) e cloreto de magnésio (MgCl2) a 1 mM na preparação da marcação de proteínas de superfície celular com 125iodeto de sódio a 4 mCi 49 '7 Γ\ \ Ί f <··· 'Jí ( (125Ι) (NEN Du Pont de Nemours, Wilmington, DE) através do método da iodinação por lactoperoxidose, conhecido dos especialistas na técnica e como descrito em "Antibodies: A Laboratory Method", Eds. Harlow et ai., Cold Spring Harbor Laboratory, pp 434-435 (1988). Após o procedimento de marcação, as células foram lavadas três vezes com PBS na ausência de todos os catiões. Após a lavagem por centrifugação final, o sedimento foi congelado, descongelado e depois ressuspendido num volume de três partes de tampão de extracção salino tamponado com Tris (tampão de extracção TBS) para uma parte de sedimento. 0 tampão de extracção TBS consistiu em Tris-HCl a 25 mM, NaCl a 136 mM e cloreto de potássio a 2 mM (KC1) que também continha MgCl2 a 1-2 mM, cloreto de manganês a 1-2 mM (MnCl2) , octilbetaglucopiranósido a 50 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a 1 mM, aprotinina a 1 pg/mL, leupeptina a 1 pg/mL, pepstatina a 1 pg/mL e macroglobulina alfa 2 a 1 pg/mL. As concentrações preferidas de MgCl2 e de MnCl2 foram de 1 mM. O cloreto de cálcio estava ausente do tampão de extracção e todos os tampões subsequentes utilizados no isolamento e na purificação da ECR. O lisado de células resultante em 3 mL foi centrifugado a 3000 x g para precipitar os resíduos celulares insolúveis. O sobrenadante contendo o ECR isolado foi removido e a eficiência de marcação foi determinada por detecção gama. Foi obtida aproximadamente uma actividade específica de 200 000 contagens por minuto (cpm) por 10 microlitros (pl) pelo procedimento de marcação. B. Purificação de ECR Marcado por Cromatografia de Afinidade numa Coluna de Fibrinoqénio Sepharose™ 1) Eluições Sequenciais da Coluna de Afinidade para o Fibrinoqénio o sobrenadante de células marcado preparado acima foi pré-clarificado antes da purificação por cromatografia numa 50

r.

Ca-í coluna plana Sepharose™ CL4B (Pharmacia) previamente equilibrada com o tampão de extracção TBS. Para a purificação de ECR por cromatografia de afinidade, o fluxo contendo ECR marcado foi colhido da coluna plana de Sepharose™ e aplicado numa coluna de fibrinogénio Sepharose™ pré-lavada com 10 volumes de coluna de tampão de extracção TBS. A coluna foi previamente preparada por acoplamento de 8 mg de fibrinogénio purificado preparado no Exemplo IA com um mL (aproximadamente 0,333 gramas de resina) de Sepharose™ 4B activada com brometo de cianogénio (CNBr) de acordo com as instruções do fabricante (Pharmacia LKB). A solução contendo ECR marcado foi mantida na coluna de fibrinogénio durante a noite a 4°C e foi misturada ocasionalmente para imobilizar o ECR no ligando fibrinogénio. Após o periodo de manutenção, o fluxo foi colhido e armazenado separadamente a 4°C. A coluna foi então lavada com 10 volumes da coluna de tampão de extracção TBS. Antes da eluição com o EDTA do ECR imobilizado na coluna de fibrinogénio, a coluna foi primeiro mantida com 300 pL de uma solução de péptido Arg-Gly-Glu (RGE) a 1 mg/mL dissolvido em tampão de extracção TBS para eluir proteínas marcadas imobilizadas de forma não específica. A colheita do eluato foi seguida por um período de espera de 10 minutos antes da aplicação seguinte de 300 pL da solução de RGE à coluna. A eluição com RGE foi repetida 10 vezes durante um total de 10 fracções colhidas. Para o segundo conjunto de eluições para remover o receptor de vitronectina marcado contaminante ligado ao fibrinogénio, um membro da superfamília das integrinas, a coluna foi mantida com 300 pL de uma solução de péptido Arg-Gly-Asp (RGD) a 1 mg/mL dissolvido em tampão de extracção TBS. O eluato de KG D foi colhido e o protocolo de eluição foi repetido separadamente 10 vezes como descrito para a eluição de RGE resultando na colheita do receptor de vitronectina marcado ao longo de 10 fracções. As fracções dos picos foram determinadas por detecção gama. Os péptidos 51

\ί !] utilizados para as eluições acima descritas foram sintetizados utilizando a técnica de fase sólida clássica descrita por Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-296 (1969) como adaptado para utilização com um sintetizador de péptidos automático modelo 430 (Applied Biosystems, Foster Cito, CA) . As resinas de polipéptido preparadas foram clivadas por fluoreto de hidrogénio, extraídas e analisadas quanto à pureza por cromatografia liquida de elevado desempenho (HPLC) utilizando uma coluna de fase reversa C18 fabricada por Waters Associates, Milford, MA. O ECR marcado ligado à então coluna de fibrinogénio isenta de receptor de vitronectina foi então eluído com EDTA a 10-20 mM dissolvido em tampão de extracção TBS. É preferida a eluição com EDTA a 20 mM. O protocolo de eluição foi efectuado como descrito acima resultando na colheita de ECR purificado em 10 fracções separadas. As fracções do pico contendo o ECR marcado com 125I eluido foram determinadas por detecção gama. A coluna foi então lavada com 10 volumes de coluna de tampão de extracção TBS seguido por 3 volumes de NaCl a 1 M em TBS. A coluna foi armazenada a 4°C após uma lavagem final com pelo menos 20 volumes de coluna de PBS contendo 0,02% de azida de sódio. 2) Caracterização do ECR Purificado Específico para

Fibrinogénio O peso molecular do ECR marcado com 125I purificado com fibrinogénio Sepharose™ foi determinado por SDS-PAGE a 7,5% com e sem redução com beta-mercaptoetanol a 3%. A Figura 1 mostra os resultados autorradiográficos da electroforese de aliquotas de fracções de picos das eluições com RGD e EDTA dos lisados celulares preparados a partir de células não tratadas à esquerda ou tratadas com TNF como descrito no Exemplo 2A . as faixas 1 e 3 mostram os receptores eluidos com RGD isolados a partir de lisados de células preparados respectivamente a partir de células não tratadas e tratadas com TNF. Não são detectáveis bandas na faixa 1. contudo, na faixa 3, estão presentes duas bandas correspondentes aos pesos moleculares aproximados de 125 52

rx e 110 kD. Estas bandas correspondem respectivamente às subunidades alfa v e beta 3 do receptor da vitronectina como descrito por Cheresh et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 84:6471-6475 (1987), aqui incorporado por referência. As faixas 2 e 4, respectivamente ECR eluido com EDTA isolado de células não tratadas e tratadas com TNF, revela a presença de uma banda de baixo peso molecular de aproximadamente 90-95 kD, cuja intensidade é aumentada cerca de 3-5 vezes como resultado da indução da expressão de ECR por exposição a TNF. Assim, as fraeções eluidas com EDTA continham um ECR não dependente de RGD possuindo um peso molecular de 90-95 kD distinto do receptor de vitronectina que se liga ao fibrinogénio através da sequência tripeptidica de RGD (Cheresh et al., supra). B. Purificação de ECR Marcado por Cromatoqrafia de Afinidade numa Coluna de RGD Sepharose™ 1) Cromatografia Sequencial em Coluna

Foi confirmado que o ECR de ligação de fibrinogénio eluido com EDTA era um receptor distinto do receptor da vitronectina, utilizando uma abordagem alternativa de purificação de ECR a partir dos lisados de células marcadas, através de cromatografia de afinidade em duas colunas diferentes. O lisado celular preparado no Exemplo 2A foi primeiro aplicado numa coluna de RGD Sepharose™ previamente equilibrada com tampão de extraeção TBS para imobilizar os receptores específicos para RGD a RGD ligado a Sepharose™. O acoplamento de RGD a CNBr-Sepharose™ foi realizado como descrito no Exemplo 2A para a preparação de uma coluna de Sepharose™ fibrinogénio. Após o período de manutenção durante a noite para maximizar a interaeção do lisado celular marcado com 120I contendo receptores dependentes de RGD com a RGD ligada a Sepharose™, o líquido de passagem foi recolhido e aplicado numa coluna de Sepharose™ fibrinogénio como descrito no Exemplo 2B. A coluna de RGD foi então lavada como anteriormente descrito. O tampão de eluição de EDTA foi subsequentemente 53

aplicado à coluna de RGD lavada e as fracções contendo os receptores eluídos com EDTA marcados com 125I foram recolhidos como descrito para o protocolo de eluição no Exemplo 2B. A caracterização dos receptores diluídos com EDTA da coluna de Sepharose de RGD está descrita no Exemplo 2C2, abaixo.

0 caudal da coluna de RGD foi mantido durante a noite com a coluna de fibrinogénio para permitir a máxima interacção entre o lisado celular com RGD extraído contendo receptores de fibrinogénio independentes de RGD e o fibrinogénio ligado a Sepharose™. Após o período de manutenção, os receptores marcados com 125I ligados ao fibrinogénio foram eluídos seguindo o mesmo procedimento descrito para a eluição da coluna de fibrinogénio no Exemplo 2B. Foram colhidas dez fracções de cada de RGE sequencial, e eluições de RGE e EDTA. A caracterização do material eluído com RGD e EDTA da coluna de fibrinogénio Sepharose™ é descrita no Exemplo 2C2) abaixo. 2) Caracterização dos Receptores Dependentes de Fibrinogénio Versus os Dependentes de RGD Alíquotas das fracções colhidas da eluição com EDTA a partir da coluna fibrinogénio Sepharose™ em condições de não redução e de redução para proporcionar uma comparação óptima e caracterização dos receptores eluídos. As alíquotas das fracções colhidas foram sujeitas a electroforese como descrito no Exemplo 2B2). Os resultados da exposição dos receptores marcados com 125I sujeitos a electroforese estão apresentados na Figura 2 em 8 faixas. As faixas 1 a 4 mostram a migração de proteínas sob condições de redução enquanto as faixas 5 a 8 mostram a migração de alíquotas idênticas separadas em condições não redutoras. As determinações Uo peso molecular do3 receptores eluídos sujeitos a electroforese são feitas por comparação com os padrões de peso molecular marcados com 125I de 210, 107, 71 e 41 kD, respectivamente, miosina, beta-galactosidase, albumina de soro bovino e ovalbumina. Estes marcadores são apresentados nas 54 (-)7

faixas 4 e 8.

Nas faixas 3 e 7, o receptor de vitronectina eluido com EDTA da coluna de RGD-SepharoseTM exibia o perfil característico de alfa v/beta 3 em condições de redução e de não redução. A alfa v não reduzida possui um peso molecular de 150 kD (faixa 7, banda superior) que foi clivada em dois polipéptidos de 125 e 25 kD em condições de redução (faixa 3, banda do meio - o fragmento de 25 kD migrou para fora do gel). A beta 3 não reduzida possui um peso molecular de 90 kD (faixa 7, banda inferior) que aumentou para 110 kD sob condições de redução (faixa 3, banda inferior).

Adicionalmente ao receptor de integrina vitronectina possuindo as subunidades alfa v e beta 3, foi eluída outra subunidade beta de integrina, beta 1, da coluna de RGD-Sepharose™ com EDTA. Foi mostrado que alfa v se associava separadamente com beta 3 e beta 1 como descrito por Vogel et al., J. Biol. Chem., 265:5934-5937 (1990). A beta 1 migra como uma proteína de 120 kD em condições de não redução (faixa 7, banda do meio) que aumenta para 140 kD em condições de não redução (faixa 3, banda superior). Assim, o receptor de vitronectina dependente de RGD consistindo das subunidades alfa v/beta 3 foi eluido de uma coluna fibrinogénio Sepharose™ com RGD e de uma coluna de RGD com EDTA.

Em contraste, foi obtido um perfil diferente das proteínas eluídas da cromatografia de afinidade com o fibrinogénio de lisados celulares pré-clarificados na coluna de RGD Sepharose™. Como acima descrito no Exemplo 2C1), o fluxo colhido da coluna de RGD Sepharose™ a que falta alfa v/beta 1 e beta 3 foi então sujeito a cromatografia em fibrinogénio Sepharose™. Uma vez que todos os receptores dependentes de RGD foram removidua pela primeira separação em cromatografia de afinidade em coluna, não foram obtidos produtos de eluição marcados com 125I quando a coluna de fibrinogénio foi sujeita a eluição com RGD (faixas 1 e 5, respectivamente, condições de redução e de não redução). 55

Contudo, com a eluição com EDTA que se seguiu à eluição com RGD, foi recuperada uma única banda de aproximadamente 90-95 kD em condições de não redução (faixa 6). Em condições de redução, o peso molecular do receptor de fibrinogénio eluido com EDTA derivado de células da veia umbilical humana (HUVEC) referido como ECR aumentou apenas ligeiramente (faixa 2) . Os pesos moleculares do ECR purificado por qualquer das duas abordagens descritas nos exemplos 2B (eluições sequenciais de uma cromatografia de afinidade em fibrinogénio SepharoseTM) ou 2C (cromatografia de afinidade sequencial em colunas de afinidade separadas) foram os mesmos. Deste modo, o ECR idêntico foi purificado utilizando duas abordagens alternativas como apresentado nas Figuras 1 e 2. Adicionalmente, o ECR foi também purificado por cromatografia de afinidade numa coluna de fibrinogénio SepharoseTM com EDTA sem um passo prévio de eluição com RGD para remover outros receptores que ligam fibrinogénio. D. Identificação do ECR Purificado Especifico para o

Fibrinogénio como ICAM-1 por Imunoprecipitação. 1) Imunoprecipitação de um ECR de 90-95 kD com Anticorpos Monoclonais Anti-ICAM-1 Aliquotas de fracções contendo ECR purificado de 90-95 kD marcado com 125I purificado por qualquer das abordagens descritas no Exemplo 2B ou 2C foram utilizadas em imunoprecipitações para identificar melhor o ECR de ligação ao fibrinogénio. Fracções de 50 a 100 pL de fracções de pico contendo o ECR como determinado por cromatografia de afinidade como descrito acima foram misturadas separadamente com 20 pg de um anticorpo monoclonal de Molécula-1 de Adesão Intercelular (ICAM-1) anti-humano de murganho, comercialmenle disponível de Becton Imunocytochemistry Systems, Mountain View, CA. Foram misturadas aliquotas separadas com anticorpos de controlo. Para o controlo de IgC, foi utilizado como um controlo um anticorpo monoclonal designado comercialmente por 1C10 comercialmente 56

' \.S disponível de Telios, San Diego, CA, que reconheceu uma proteína de superfície de célula endotelial de 130 kD. Para o controlo de IgM foi utilizado um anticorpo monoclonal IgM irrelevante de murganho. As misturas foram mantidas em gelo durante uma hora para formar complexos imunitários. Para imunoprecipitar ou recolher os complexos imunitários formados, 100 pL de IgG anti murganho de cabra acoplado a agarose (Sigma Chemical Co.) a uma proporção de 1:1.

Tipicamente, 50 pL do ECR eluído numa fracção de pico foram misturados com 50 pL do IgG anti murganho de cabra acoplado a agarose e mantido em gelo durante 30 minutos. Os complexos imunitários ligados a agarose anti murganho de cabra foram subsequentemente depositados através de centrifugação a 10 000 X g durante um minuto a 4°C. Os sobrenadantes resultantes foram removidos por aspiração e os sedimentos foram ressuspendidos em tampão de extracção TBS. Os sedimentos foram lavados 3 vezes e finalmente ressuspendidos em tampão de amostra de Laemmli para análise por SDS-PAGE contra os pesos moleculares padrão descritos acima. Após electroforese, o gel foi seco e autorradiografado. Era evidente uma banda única a 90-95 kD nos filmes revelados indicando que o ECR purificado por afinidade de fibrinogénio de 90-95 kD era de facto ICAM-1 como determinado por imunoprecipitação com um anticorpo monoclonal de murganho desenvolvido contra ICAM-1 humano.

2) Imunoprecipitação de um ECR de 90-95 kD com Anticorpos Monoclonais Anti-HUVEC

Os imunoprecipitações como descrito acima foram também realizados com anticorpos monoclonais de murganho desenvolvidos contra HUVEC intacto não estimulado. A preparação e caracterização de quatro desses anticorpos monoclonais são descritas no Exemplo 4. Cinquenta pL do anticorpo monoclonal de IgM designado 2E12 foram misturados com 50 pL da mesma fracção utilizada nas imunoprecipitações com o anticorpo anti-ICAM-1 disponível comerei a1 mente. Após electroforese e exposição do 57 Γ\\.) ,- C- η c filme autorradiográfico, foi evidente uma banda de 90-95 kD. Assim, os anticorpos monoclonais dirigidos contra proteínas de superfície de células HUVEC imunoprecipitaram a mesma proteína de 90-95 kD que a que imunoprecipitou com um anticorpo monoclonal de murganho disponível comercialmente contra ICAM-1. 0 ECR que se liga a fibronogénio através de um sítio de ligação independente de RGD é agora identificado como ICAM-1 como determinado por análise de cromatografia de afinidade (Exemplos 2B e 2C) . A ligação da ECR, de aqui em diante referida como ICAM-1, a um sítio de ligação independente de RGD no fibrinogénio é uma nova descoberta. 3. Confirmação de um Receptor de Fibrinogénio Independente de RGD em Células Endoteliais (HUVEC) A adesão de leucócitos ao endotélio vascular é um dos acontecimentos mais precoces numa variedade de reacções imunoinflamatórias. Ao nível molecular, a adesão de leucócitos a células endoteliais é um mecanismo redundante, apoiado pelo reconhecimento regulado de um conjunto díspar de receptores de membrana expressos tanto em leucócitos como em células endoteliais, podendo as últimas estar num estado de repouso ou de estimulação por citoquina. Foi agora identificado um novo conjunto de interacções moleculares que participam na adesão de leucócitos. O fibrinogénio demonstrou agora interagir leucócitos (monócitos, células mononucleares periféricas e várias linhas celulares) através da integrina CDllb/VD18, também referida como Mac-1, como descrito por Altieri et al., J. Biol. Chem., 265:12119-12122 (1990), aqui incorporado por referência. Estudos sobre a interacção de fibrinogénio com células endoteliais in vitro resultaram agora na descoberta de um receptor de membrana de superfície de célula endotelial que se liga a um sítio independente de RGD no fibrinogénio. São aqui apresentados resultados demonstrando que a interacção entre leucócitos em circulação θ células endoteliais é mediada por um efeito de 58 ponte entre diferentes partes da molécula de fibrinogénio para distinguir os receptores de membrana de superfície celular expressos em cada tipo de célula.

A. Demonstração de Ligação de Fibrinogénio a HUVEC 1) Preparação de Fibrinogénio Iodado 0 fibrinogénio foi iodado utilizando o método de Iodogen™. Resumidamente, foi dissolvido Iodogen™ em diclorometano para uma concentração final de 1 pg/mL e 170 pL de Iodogen™ dissolvido que foi seco no fundo de um tubo de vidro. O fibrinogénio, preparado no Exemplo IA, foi ressuspendido em tampão citrato de sódio a 0,055 M, pH 7,4, para uma concentração final de 5 pg/mL. Foi colocado 200 pL de uma solução de fibrinogénio dissolvido no tubo revestido com Iodogen™ com 700 pCi de iodeto de sódio sem veiculo. A mistura foi mantida no gelo durante 20 minutos com agitação ocasional. Para parar a reacção de iodação a mistura foi removida do tubo e sujeita a filtração em gel numa coluna grosseira de Sepharose™ G-25 (100 x 2,5). As fracções de fibrinogénio iodado foram determinadas por contagem de ácido tricloroacético precipitável. O fibrinogénio marcado produzido foi marcado radioactivamente até uma actividade específica de 0,3 pCi/pg de proteína. O fibrinogénio marcado foi utilizado na ligação e na inibição de ensaios de ligação aqui descritos a uma concentração de 50 pg/mL enquanto que o fibrinogénio não marcado foi geralmente utilizado a uma concentração de 500 pg/mL. 2) Análise de Dependência de Dose

Para determinar se o fibrinogénio se liga a um receptor de HUVEC de superfície celular e nesse caso, a que concentrações, foram misturadas separadamente concentrações crescentes de 0,01 micromolar (pM) até 0,44 pM (0,14 pM é equivalente a 50 pg/mL; 0,29 pM é equivalente a 100 é equivalente a lOOpg/mL e 0,44 pM é equivalente a 150 pg/mL) de fibrinogénio iodado (125I-Fg) 59

preparadas acima, a monocamadas de células HUVEC que foram previamente lavadas duas vezes com RPMI 1640 sem soro. As culturas de células HUVEC foram inicialmente plaqueadas em poços individuais de uma placa de 48 poços revestida para cultura de tecidos (Costar Corp., Cambridge, MA) como descrito no Exemplo 2A para cultivar as células em frascos T/b. o catiâo divalente, apresentado como cloreto de cálcio (CaCl2), a uma concentração de 2,5 mM foi também misturado nas misturas de célula-fibrinogénio. 0 inibidor da polimerização de fibrina, Ppack (clorametilo de D-fenil-l-propil-l-arginina; Calbiochem Boehring), foi misturado às misturas de células a uma concentração de 100 mM. O Ppack esteva presente em todos os ensaios em que foi necessário prevenir a polimerização de fibrinogénio em fibrina.

As misturas resultantes foram mantidas a 22°C durante 45 minutos para permitir que o fibrinogénio se ligasse às HUVEC plaqueadas. Após o período de manutenção, as células foram lavadas duas vezes com RPMI 1640 sem soro para remover o fibrinogénio são ligado. As células foram então solubilizadas em SDS a 10% e a radioactividade associada nas condições de manutenção foi quantificada num contador gama.

Os resultados obtidos estão representados na Figura 3 como o fibrinogénio marcado com 125I ligado em contagens por minutos (cpm) por poço (x 10-3) no eixo dos Y contra concentrações crescentes de fibrinogénio marcado com 125I (X 10~7 M) no eixo dos X. Os resultados demonstram que o fibrinogénio marcado com 125I se liga de forma saturável a uma concentração de aproximadamente 0,36 μΜ a monocamadas de HUVEC não estimuladas. 3) Análise do Efeito de Estimulação de HUVEC por Exposição a TNF ou Lipopollssacáridos na Ligação de Fibrinogénio

Para determinar o efeito que estimuladores conhecidos de HUVEC têm nas características de ligação de fibrinogénio a HUVEC, foram realizadas experiências de dose-resposta como 60 descrito no Exemplo 3A2) em células HUVEC não tratadas e em HUVEC estimuladas com THF ou lipopolissacáridos (LPS, Genzyme). 0 TNF e o LPS foram misturados separadamente com concentrações respectivas de 5 nanogramas (ng)/mL e 1,0 pg/mL a monocamadas de HUVEC e mantidas a 37°C durante 4 horas antes da mistura do fibrinogénio marcado variando em concentração desde 0,01 μΜ a 0,36 μΜ.

Os resultados obtidos estão representados na Figura 4 como fibrinogénio marcado com 125I ligado em moléculas por célula (X 10"6) no eixo dos Y contra concentrações crescentes de fibrinogénio marcado com 125I (X IO-7) no eixo dos X. Sob estimulação quer com TNS ou LPS, o número de moléculas de fibrinogénio marcadas ligadas por células duplicou em comparação com as ligadas a células não estimuladas. Assim, o aumento de fibrinogénio que se liga ao receptor de ICAM-1 em HUVEC é mediado por citoquina ou imunoestimulante.

4) Análise da Ligação de D30 a HUVEC

os ensaios de ligação descritos acima no Exemplo 3A2) também foram realizados com o homólogo do fibrinogénio, D30, para determinar se essa região do fibrinogénio também imunorreagiu com as HUVEC. Dado que se conhece que D30 se liga aos leucócitos através do receptor Mac-1 como descrito por Altieri et al., J. Biol. Chem., 265:12119-12122 (1990), estas experiências foram realizadas para determinar se a região de fibrinogénio que medeia a ligação de leucócitos a HUVEC está contida no fragmento D30. para esta análise, o fragmento D30 do fibrinogénio preparado no Exemplo 1B foi marcado com 1Z5I como descrito para a marcação do fibrinogénio acima. O D30 iodado foi misturado com monocamadas de HUVEC a uma concentração de 10 pg/mL para formar um complexo de ligação. Após lavagem das células para remover o D30 não ligado como descrito no Exemplo 3A2) acima, as células foram solubilizadas e a quantidade de radioactividade ligada foi determinada. A ligação de D30 a HUVEC foi máxima aos 120 minutos do período de manutenção com aproximadamente 60 000 cpm. A 61 ligação de D30 feita competir especificamente com a mistura de um excesso molar de 50 vezes de fibrinogénio frio, confirmando assim que o D30 se liga especif icamente a um sítio de ligação de fibrinogénio em HUVEC. A mioglobina, uma proteína não específica, não inibiu a ligação de D30 a HUVEC. Ά confirmação da especificidade da ligação de D30 a HUVEC foi obtida através da inibição da ligação de D30 a células transfectadas com ICAM-1 preparadas no Exemplo 4 na presença do anticorpo monoclonal IgG 14E11 também preparado no Exemplo 4. Os ensaios de inibição de ligação foram realizados como descrito no Exemplo 5. O anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 BD descrito no Exemplo 4 também foi utilizado no ensaio. Tanto o anticorpo monoclonal 14E11 como o anti-ICAM-1 BD, a uma concentração de 20 pg/mL na presença de MnCl2, inibiu especificamente a ligação de D30 a HUVEC. Foram recuperados aproximadamente cerca de 3000 e 7500 cpm a partir da ligação de D30 na presença de CaCl2 e MnCl2, respectivamente, na ausência de quaisquer inibidores. Com 14E11 e MnCl2, a ligação de D30 aos transfectantes foi completamente inibida. A porção do fibrinogénio contendo D30 liga-se, por isso, ao receptor de fibrinogénio em HUVEC e a ICAM expresso na superfície nos transfectantes. A ponte de fibrinogénio, contudo, não está contida no fragmento D30, como determinado através da inibição de ensaios de ligação na presença de péptidos derivados do sítio de ligação do receptor Mac-1 em D30. Os péptidos derivados de D30 não bloquearam a ligação de fibrinogénio ou D30 às HUVEC. Por isso, o sítio de ligação do fibrinogénio que se liga ao receptor de fibrinogénio endotelial está no D30 mas não é a mesma região de medeia a ligação de D30 ou fibrinogénio a Mac-1 em leucócitos.

B. Demonstração do Fibrinogénio Fazer a Ponte Entre Células Contendo Mac-1 e um Receptor de Fibrinogénio Independente em HUVEC 1) Análise de Dependência da Dose ao Longo 62 < X 1. \ do Tempo

Os leucócitos que circulam in vivo demonstraram que se ligam à superfície apical das células endoteliais. Adicionalmente, foram realizadas experiências in vitro em que a linha celular cultivada de monócitos, THP-1 possuindo o número de acesso ATCC TIB 202, (ATCC, Bethesda, MU), demonstrou ligar-se directamente a HUVEC não perturbado na presença de catiões divalentes com ou sem estimulação com o péptido contráctil N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (N-FMLP) (Sigma Chemical Co.) a 1 mM como descrito por Altieri, J. Immunol., 147:1891-1898 (1991), aqui incorporado por referência. Para determinar se este evento foi o resultado de um fenómeno de ponte mediado pelo fibrinogénio, foram realizados ensaios de ligação em união com as células in vitro.

Para estes ensaios, foram plaqueadas HUVEC no meio descrito no Exemplo 2A a uma densidade de aproximadamente 1-5 X 104 células/poço em poços de microtitulação de fundo liso de uma placa tratada de culturas de tecidos de 96 poços. As células foram então lavadas em RPMI 1640 sem soro e ainda mantidas com suspensões de células THP-1 marcadas com 51Crómio (51Cr) previamente expostas a diferentes concentrações de fibrinogénio não marcado ou deixado não tratado. Para marcar células THP-1, foram marcadas suspensões sem soro das células a uma concentração de 1 X 107 células /mL, com 0,5 mCi de 51Cr (Na2Cr04 possuindo uma actividade específica de 487,4 mCi/mg, NEN Du Pont de Nemours) durante 2 horas a 37°C com incorporação de uma média de 12 a 20 cpm/célula THP-1. As células marcadas foram então lavadas duas vezes à temperatura ambiente com RPMI 1640 sem soro e ressuspendidas da mesma maneira a uma concentração de 5 X 105 células/mL. As células marcadas foram utilizadas nos ensaios dentro de 2 horas a partir do procedimento de marcação. Para os ensaios, as células pré-estimuladas com n-FMLP a 1 μΜ na presença de CaCX a 1 mM e Ppack a 100 mM. As suspensões de células THP-1 resultantes estimulada por N-FMLP foram então 63 - ·κ -'Τ'

? misturadas separadamente com o seguinte: 1) Meio sem qualquer fibrinogénio misturado com um controlo; 2) concentrações de Fibrinogénio a 1,2 mg/mL e 2,5 mg/mL; e 3) Plasma Humano Normal (NHP) diluído 1:2 e 1:50. o fibrinogénio purificado foi preparado como descrito no Exemplo 1. estava presente fibrinogénio em plasma humano normal não diluído a uma concentração de aproximadamente 1-3 mg/mL. As misturas resultantes foram mantidas durante 20 minutos a 22°C para permitira ligação ao fibrinogénio, ou purificado ou presente em NHP, ao receptor Mac-1 na superfície das células THP-1.

As células THP-1 resultantes ligadas a fibrinogénio foram então misturadas às HUVEC imobilizadas lavadas, descritas acima para permitir a ligação de um sítio de ligação do receptor não Mac-1 no fibrinogénio ao receptor de fibrinogénio independente de RGD na superficie das HUVEC, resultando por isso na ligação de células THP-1 a HUVEC através de um ponte de fibrinogénio. As misturas foram mantidas a 37°C para permitir a adesão. A intervalos de tempo seleccionados entre 1 a 60 minutos, as camadas de HUVEC foram lavadas suavemente cinco vezes com RPMI 1640 sem soro para remover células THP-1 não aderentes ou livremente aderentes às quais o fibrinogénio foi inicialmente imobilizado. As células aderentes foram então solubilizados em SDS a 10% e o lisado celular foi quantificado num contador de cintilações beta. A libertação espontânea de 51Cr de células THP-1 foi sempre menor do que 2% durante o ensaio de adesão. O número de células THP-1 especificamente unidas foi determinado dividindo o cpm recolhido pelas cpm/célula. O resultado destas experiências está apresentado na Figura 5A e Figura 5B em que os resultados são expressos como números de células THP-1 marcadas com 51Cr (X 10~3) no eixo dos Y representado contra o tempo do ensaio no eixo X. As células THP-1 não se ligaram significativamente a HUVEC imobilizado na ausência de fibrinogénio ao longo do curdo de tempo. Em contraste, as células THP-1 mantidas na presença de 1,2 mg/mL de 64 fibrinogénio exibiram aumentos significativos de ligação a HUVEC ao longo do percurso de tempo ocorrendo o máximo de união celular a 2,5 mg/mL de fibrinogénio, a união de células TPC-1 não tinha saturado ao fim de 60 minutos em que aproximadamente 18 000 células THP-1 se uniram ao fibrinogénio (Figura 5A) . foram obtidas curvas semelhantes de ligaçáo na presença de NHP apresentado na Figura 5B. O máximo de união de células THP-1 de aproximadamente 23 000 células foi obtido após 40 minutos na presença de NHP diluído 1:2 que continha aproximadamente 0,5-1,5 mg/mL de fibrinogénio. O NHP diluído 1:50 exibia um perfil comparável ao observado com 1,2 mg/mL de fibrinogénio purificado. Assim, a ligação dependente do tempo de células THP-1 a HUVEC é dependente de fibrinogénio confirmando que o fibrinogénio, quer seja purificado ou esteja presente em NHP, serve como uma ponte de proteína entre os dois tipos de células. 2) Análise de Dependência de Temperatura Para determinar os efeitos que a temperatura tem na capacidade do fibrinogénio mediar a ligação de células THP-1 marcadas com 51Cr às monocamadas de HUVEC, foram realizados ensaios de adesão celular como descrito no Exemplo 3B1), a 22°C e a 37 °C durante o período de uma hora. Os ensaios foram realizados de um modo idêntico ao descrito acima com a excepção de ter sido utilizado 500 pg/mL de fibrinogénio em vez de 1,2 ou 2,5 pg/mL. O máximo de ligação de células THP-1 a HUVEC a 22°C foi de 7500 células após 40 minutos. Aos 60 minutos, a ligação diminuiu para 5000 células. Os resultados são significativos em comparação com as aproximadamente 2000 células THP-1 ligadas na ausência de fibrinogénio. Contudo, a 37°C, aproximadamente 20 000 células THP-1 ligadas a HUVEC após 40 minutos contra uma ligação de fundo de aproximadamente 5000 células na ausência de fibrinogénio. A ligação de células THP-1 marcadas com 51Cr a HUVEC é por isso maximizada à temperatura fisiológica de 37°C com as concentrações fisiológicas do fibrinogénio. 65 3) Análise da Especificidade do Tipo de Célula Os ensaios de ligação de adesão celular acima descritos foram realizados em células endoteliais aórticas bovinas (BAE) para determinar se o fibrinogénio pode mediar a ligação de células THP-1 marcadas com 51Cr a células endoteliais de uma fonte diferente. As culturas de células foram preparadas a partir de aorta bovina seguindo procedimentos conhecidos dos especialistas na técnica. As células THP-1 foram deixadas não tratadas ou foram tratadas com 500 pg/mL de fibrinogénio durante mais de 60 minutos. Em pontos de tempo seleccionados, as células foram colhidas como descrito no Exemplo 3B1 e o número de células THP-1 ligadas foi determinado como previamente descrito. Na ausência de fibrinogénio, as células THP-1 não se ligaram significativamente a células BAE (menos do que 5000 células ligadas) após um aumento do pico de ligação inicial de 20 minutos. No entanto, na presença de fibrinogénio, ligaram-se aproximadamente 20000 células a células BAE após um período de manutenção de 40 minutos. Este máximo de ligação caiu ao fim de 60 minutos para aproximadamente 15000 células ligadas. A ligação de células THP-1 a células HUVEC foi efectuada em paralelo como um controlo para a experiência; a ligação não saturável das células THP-1 na presença de fibrinogénio foi máxima aos 60 minutos, com aproximadamente 25000 células ligadas. Deste modo, o fibrinogénio medeia a ligação de células THP-1 não apenas a células endoteliais humanas mas também a células endoteliais derivadas de bovino. 4. Preparação de Anticorpos Monoclonais Contra um Receptor de Fibrinogénio Independente de RGD em HUVEC A. Preparação do imunoqénio HUVEC, cultivadas como descrito no Exemplo 2A mas sem estimulação com TNF ou LPS, foram preparadas para utilização como imunogénio de modo a produzir anticorpos monoclonais contra proteínas de superfície de HUVEC para eventual pesquisa por 66

ensaio da inibição da ligação de fibrinogénio marcado com 125I a culturas HUVEC. Para as imunizações, foram injectadas em murganhos 10 X 106 células colhidas a partir de placas de cultura por tratamento com EDTA a 0,4 mM e ressuspendidas em salino, como abaixo descrito. B. Preparação de Anticorpos Monoclonais Contra um

Receptor de Fibrinogénio Independente de RGD em HUVEC As HUVEC, preparadas como imunogénios de acordo com o Exemplo 4A, foram injectadas intraperitonealmente (i.p.) em murganhos Balb/c ByJ separados (The Scripps Research Institute Vivarium, La Jolla, CA) . Os murganhos receberam injecções de reforço a 1, 3 e 5 semanas. O último reforço foi 4 dias antes da fusão.

Os animais assim tratados foram sacrificados e o baço de cada murganho foi colhido. Foi então preparada uma suspensão de células do baço. As células do baço foram então extraídas da suspensão de células do baço por centrifugação durante cerca de 10 minutos a 1000 rpm, à temperatura ambiente. A seguir à remoção do sobrenadante resultante, o precipitado de células foi ressuspendido em 5 mL de tampão de lise de cloreto de amónio frio (NH4C1) , e foram mantidas durante cerca de 10 minutos.

Foram misturados dez mL de Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (Whittaker Μ. A. Bioproducts) e tampão Hepes com a suspensão de células lisadas para formar uma mistura, e essa mistura foi centrifugada durante cerca de 10 minutos a 1000 rpm à temperatura ambiente.

Após o sobrenadante ter sido decantado, o precipitado foi ressuspendido em 15 mL de DMEM e Hepes e foi centrifugado durante cerca de 10 minutos a 1000 rpm â temperatura ambiente. O procedimento anterior foi repetido. 0 precipitado foi então ressuspendido em 5 mL de DMEM e Hepes. Uma alíquota da suspensão de células de baço foi então removida para contagem. As fusões foram realizadas da maneira 67

seguinte utilizando a linha de células de mieloma de rato não secretora P3X63Ag8.653.1, um subclone da linha P3X63Ag8.653 (Número de Acesso ATCC CRL 1580) . Com uma proporção de mieloma para células de baço de cerca de 1 a 10 ou cerca de 1 a 5, uma quantidade suficiente de células de mieloma foi centrifugada num precipitado, lavada duas vezes com 15 mL de dmem e Hepes, e então centrifugada durante 10 minutos a 1000 rpm à temperatura ambiente.

As células de baço e as células de mieloma foram combinadas em tubos de 15 mL de fundo redondo. A mistura de células foi centrifugada durante 10 minutos a 1000 rpm à temperatura ambiente e o sobrenadante foi removido por aspiração. A seguir, foram misturados com o precipitado 200 pL de polietilenoglicol (PEG) 4000 aquoso a 50 porcento (peso por volume) a cerca de 37°C utilizando uma pipeta de 1 mL com agitação vigorosa para ressuspender o precipitado. As células foram então gentilmente misturados entre 15 e 30 segundos. A mistura de células resultante foi centrifugada 4 minutos a 700 rpm.

Após cerca de 8 minutos desde a altura da adição do PEG, foram adicionados lentamente ao precipitado 5 mL de DMEM mais tampão Hepes, sem perturbar as células. Após 1 minuto, a mistura resultante foi quebrada com uma pipeta de 1 mL e foi mantida por mais 4 minutos. Esta mistura foi centrifugada durante 7 minutos a 1000 rpm. O sobrenadante resultante foi decantado, foram adicionados lentamente ao precipitado 5 mL de meio HT (hipoxantina/timidina), e a mistura foi mantida sem perturbação durante 5 minutos. O precipitado foi então quebrado em grandes aglomerados e a suspensão final de células foi colocada em frascos T75 (2,5 mL por frasco) em que tinham sido previamente colocados 7,5 mL de meio HT. A suspensão de células resultante foi mantida a 37°C para cultivar as células fundidas. Após 24 horas, foram adicionados 10 mL de meio HT aos frascos seguidos pela mistura de 0,3 mL de aminopterina a 0,04 mM 6 horas depois. Quarenta e oito horas após a fusão, foram misturados aos frascos 68

/)

10 ml de meio HAT (hipoxantina/aminopterina/timidina).

Três dias após a fusão, as células viáveis foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços a cerca de 2 X IO4 células viáveis por poço (7 68 poços na totalidade) em meio de tampão HAT como descrito em Kennett et al.r Curr. Top. Mícrobiol. Immunol.f 81:77 (1978). As células foram alimentadas durante sete dias após a infusão com meio HAT e depois aproximadamente a intervalos de 4-5 dias com meio HT. O crescimento foi seguido microscopicamente e os sobrenadantes da cultura foram colhidos cerca de duas semanas mais tarde. C. Imunosselecção de Anticorpos Monoclonais por Ensaios de Adesão Celular

Os sobrenadantes de cultura de culturas resistentes a HAT preparadas acima foram subsequentemente ensaiados quanto à presença de anticorpos para o receptor de fibrinogénio independentes de RGD de HUVEC através de ensaios de ligação e ensaios de adesão celular respectivamente descritos nos exemplos 3A e 3B, e ainda descritos no Exemplo 5. Os sobrenadantes de culturas foram testados quanto à sua capacidade de inibir a ligação de fibrinogénio marcado com 125I com monocamadas de HUVEC. Para este ensaio, as monocamadas foram mantidas na presença sobrenadantes de cultura de hibridoma e CaCl2 a 2,5 mM durante 30 minutos a 37°C. Após o período de manutenção, as HUVEC tratadas com o sobrenadante foram lavadas uma vez com RPMI 1640. O fibrinogénio marcado foi então misturado com as HUVEC tratadas a uma concentração de 50 pg/mL na presença de CaCl2 a 2,5 mM e Ppack a 100 mM. As misturas resultantes foram mantidas durante 30-60 minutos a 22°C. As HUVEC tratadas com fibrinogénio foram então lavadas, solubilizadas e contadas como descrito no Exemplo 3A.

Os sobrenadantes foram também pesquisados quanto à sua capacidade de bloquear a ligação de células THP-1 marcadas com 51Cr previamente expostas ao fibrinogénio com células HUVEC. O 69

ensaio foi efectuado essencialmente como descrito para o ensaio de adesão celular no Exemplo 3B com a excepção de que as HUVEC foram separadamente mantidas com sobrenadantes de hibridoma durante 30 minutos a 37°C. Após exposição ao anticorpo, as células foram lavadas uma vez com meio de cultura antes de misturar as células THP-1 marcadas e ligadas ao flbrlnogénio nas concentrações desejadas como descrito no exemplo 3B.

Os sobrenadantes de cultura de hibridomas que produziam um anticorpo desta invenção que efectivamente bloqueava a ligação de células THP-1 a monocamadas de HUVEC mediada pelo fibrinogénio foram então seleccionados para subsequente purificação e caracterização. Foram identificadas as culturas de hibridoma produtoras de anticorpos contra receptores de fibrinogénio independentes de RGD (também referidos como um sitio de ligação ao fibrinogénio) em HUVEC. Foram obtidos quatro anticorpos separados, denominados 14E11, 16g8, 2E12 e 2B12. O 14E11 foi determinado ser uma IgG enquanto que os restantes monoclonais foram determinados ser IgM. Os anticorpos monoclonais, específicos para um receptor de fibrinogénio independente de RGD de célula endotelial (também referido como um anti-ECR equivalente ao anti-ICAM-1 com base na análise de cromatografia de afinidade no Exemplo 2), mostraram imunorreagir com HUVEC em adição ao ECR purificado eluído de uma coluna de fibrinogénio Sepharose™ com EDTA como descrito no Exemplo 2D, e não imunorreagir com VNR. D. Purificação dos Anticorpos Monoclonais Seleccionados

Os quatro hibridomas secretores de anticorpos anti-ECR como descrito no Exemplo 4C foram injectados em murganhos Balb/c de 10 semanas de idade como descrito abaixo para produzir fluido ascítico.

Para tal, conjuntos separados de murganhos Balb/c de 10 semanas de idade foram iniciados com 0,3 mL de óleo mineral e depois injectados peritonealmente com 5 X 106 células de 70 7 hibridoma para cada monoclonal. 0 tempo médio para o desenvolvimento de ascites foi de 9 dias. Após clarificação por centrifugação a 15000 g durante 15 minutos à temperatura ambiente, os fluidos asciticos produzidos pelos hibridomas foram misturados e armazenados congelados a -20°C para formar composições de anticorpos monoclonais.

Os anticorpos monoclonais produzidos por ascites foram posteriormente purificados por cromatografia liquida rápida de proteínas (FPLC) utilizando uma coluna Pharmacia de troca iónica Mono Q HR/5 (Pharmacia) utilizando um gradiente de NaCl de 0-0,5 M em Tris-HCl a 10 mM a pH 8,0, seguindo as instruções fornecidas com a coluna. Os anticorpos monoclonais tratados por FPLC foram então concentrados utilizando uma célula de ultrafiltração com agitação Amicon (Danvers, MA; membrana PM 30) até uma concentração de 1 mg/ml, dialisados em PBS e armazenados a -70°C para formar Mab purificado. O anticorpo monoclonal 14E11, foi posteriormente purificado por afinidade utilizando um kit de purificação por afinidade, Affi-prep, de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad, Richmond, CA) . Os anticorpos monoclonais IgM foram posteriormente purificados por filtração em gel de hidroxiapatite numa coluna de hidroxiapatite Bio-Gel HPTP de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad). Estes anticorpos purificados foram utilizados em subsequentes ensaios de ligação, imunotransferências de Western e imunoprecipitações são descritas nos Exemplos. E. Confirmação da Imunoespecificidade dos Anticorpos Monoclonais para um Receptor de Fibrinoqénio

Independente de rgd em HUVEC A imunoespecificidade dos anticorpos monoclonais 14E11, 16G8, 2E12 e 2B12 foi confirmada através de uma variedade de abordagens. Primeiramente, como descrito no Exemplo 2D, a imunoprecipítação do ECR purificado por cromatografia de 71

\Ν- - f.....-)·7 L \ , ' afinidade para o fibrinogénio foi realizada utilizando 2E12 em comparação com a imunoprecipitação com um anticorpo anti-ICAM-1 disponível comercialmente (Benton Dickinson, referido como BD) . O ECR purificado de 90-95 kD foi imunoprecipitado com ambos os anticorpos indicando que o anticorpo 2E12 possui a mesma imunoespecificidade do que o anticorpo anti-ICAM-1 e que o ECR purificado era ICAM-1. Os epitopos exactos do ECR (ICAM-1) reconhecido pelos anticorpos 2E12 e Becton Dickinson anti-ICAM-1 não foram determinados. Com base no perfil de transferência obtido por análise de imunotransferência de Western descrita abaixo e através dos resultados da inibição da ligação apresentados no Exemplo 5, os epitopos são provavelmente únicos. A análise de Cellscan Activada por Fluorescência (FACscan) foi realizada numa linha celular tipo fibroblasto que foi geneticamente manipulada para expressar a forma recombinante de ICAM-1 na superfície das células como descrito por Seed et ai., Nature, 331:624-627 (1988), aqui incorporado por referência. Resumidamente, uma biblioteca de ADNc, construída utilizando ARN preparado a partir de células HL-60 induzidas com 13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol (TPA), foi transfectada em células COS. As células expressando antigénios de superfície foram pesquisadas através de selecção com anticorpos monoclonais anti-ICAM designados 8F5 e 84H10, resultando na selecção de um clone de ADNc numa célula transfectada expressando ICAM-1. Estes transfectantes foram utilizados numa análise de FACscan para confirmar a imunoespecificidade dos anticorpos anti-ECR desta invenção.

Para a análise, 1 X 106 células transfectantes de ICAM-1 em suspensão foram misturadas separadamente com 14E11 purificado por afinidade a 1 μg/mL, uma mistura de hidroxiapatite purificada de todos os três anticorpos monoclonais IgM (16G8, 2E12 e 2B12), com o anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 BD e um anticorpo monoclonal controlo designado PMI-I possuindo o Número de Acesso ATCC HB 9476. Este último reconhece o fragmento hGPIIb 72 do terminal C do receptor GPIIb/IIIa encontrado em plaquetas. As misturas separadas foram mantidas durante 30 minutos a 4°C para formar produtos de imunorreacção. Após 3 lavagens em RPMI 1640 sem soro as células transfectadas imunorreagidas foram misturadas com imunoglobulinas anti-murganho de cabra conjugadas com fluoresceina e mantidas durante 30 minutos a 4°C para formar produtos secundários de imunorreacção. Após lavar e vezes as células foram sujeitas a citometria de fluxo numa peneira celular activada com fluorescência Benton Dickinson IV/40.

Os resultados do FACscan revelaram que os anticorpos monoclonais 16G8, 2E12 e 2B12 imunorreagiram especificamente com os transfectantes que expressam ICAM-1 comparavelmente aos observados com o anticorpo anti-ICAM-1 BD. Contudo, 14E11, não imunorreagiu especificamente com os transfectantes que expressam ICAM-1 e o seu perfil sobrepõe-se ao observado com o anticorpo PMI-I de controlo. Uma vez que o ICAM-1 expresso nos transfectantes é conhecido como sendo não glicosilado, a falta de imunorreactividade de 14E11 com as células é muito provavelmente devida e esta razão. Na pesquisa inicial dos hibridomas, o anticorpo monoclonal 14E11 bloqueou a ligação de fibrinogénio marcado com 125I a HUVEC assim como bloqueou a ligação das células THP-1 através de uma ponte de fibrinogénio a células HUVEC.

Foi confirmado por imunotransferência de Western que o anticorpo monoclonal 14E11 reconheceu especificamente o ECR identificado como ICAM-1. Tanto as células HUVEC como Daudi foram utilizadas para a transferência. Daudi é uma linha celular humana de linfoma de Burkitt que expressa níveis elevados de ICAM-1 e está disponível da ATCC possuindo o Número de Acesso ATCC CCL 213. Os lisados celulares foram preparados a partir de culturas de cada tipo de células como descrito para a preparação de um lisado celular no Exemplo 2A com a excepção de as células terem sido lisadas com Triton-X 100 a 0,5% e NP-40 a 0,5%. Após centrifugação como descrito no Exemplo 2A, aliquotas de cada 73

V ,J

Vt sobrenadante resultante foram sujeitas a electroforese em pistas múltiplas em SDS-PAGE a 10%.

Após a electroforese, as proteínas no gel foram transferidas electroforetícamente para nitrocelulose para subsequentes imunorreacções. Após a transferência de nitrocelulose ter sido mantida durante 2 horas à temperatura ambiente imersa numa solução de leite seco magro (Blotto) para bloquear os sítios de ligação não específica foi cortada em tiras para isolar cada pista individual de proteínas sujeitas a electroforese, 5 para Daudi e 8 para HUVEC. As tiras de nitrocelulose foram então imunorreagidas separadamente com dois anticorpos de controlo 2E1 e PMI-I, IgG 14E11 purificado, sobrenadante de cultura de 14E11 e anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 BD durante 1 hora à temperatura ambiente para formar produtos primários de imunorreacção. A concentração dos anticorpos primários adicionados foi de aproximadamente 10 pg/mL. As transferências que imunorreagiram foram então lavadas 4 vezes com PBS durante 5 minutos cada. As transferências lavadas foram então imersas durante 1 hora a temperatura ambiente numa solução de anticorpos secundários anti-murganho de cabra marcados com 125I (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA) para formar produtos de imunorreacção secundários. As transferências que imunorreagiram foram então lavadas 4 vezes com PBS e expostas a uma película de raios X para a detecção de proteínas sujeitas a electroforese de imunorreagiram a partir dos sobrenadantes do lisado celular. Controlos adicionais incluíram fazer reagir as tiras com um único anticorpo secundário marcado.

Os resultados da transferência de Western são apresentados na Figura 6. Os pesos moleculares relativos das proteínas sujeitas a electroforese nos sobrenadantes do lisado celular foram determinados por comparação com um conjunto de marcadores de peso molecular marcados radioactivamente de 97, 66, 45, 30 e 21 kD apresentados na pista da esquerda do primeiro conjunto de 74 / "" Λ

'Ί / ρ. \ 5 pistas de Daudi e à esquerda do segundo conjunto de 8 pistas de HUVEC. As pistas designadas 1-5 no fundo da transferência tanto para Daudi como para HUVEC foram respectivamente imunorreagidos com 2E1, PMI-I, 14E11 purificado por afinidade, sobrenadantes de cultura de 14E11 e os anticorpos monoclonais anti-ICAM-1 BD. Foi detectada uma banda de 90-95 kD em sobrenadantes de lisado tanto de células Daudi como de HUVEC com o anticorpo monoclonal 14E11 purificado por afinidade apresentado no número 3 das pistas marcadas. Adicionalmente, o 14E11 purificado por afinidade imunorreagiu com uma proteína de aproximadamente 50-55 kD na pista 3 das proteínas sujeitas a electroforese-HUVEC. Embora o anticorpo anti-ICAM-1 BD tenha imunorreagido com as proteínas de Daudi, imunorreagiu fortemente apenas com a banda de 90-95 kD nas proteínas de HUVEC sujeitas a electroforese. A diferença aparente nos padrões de transferência entre os anticorpos monoclonais 14E11 e anti-ICAM-1 BD apoia a posição de que eles reconhecem epitopos separados na molécula de ICAM-1. Os anticorpos primários de controlo 2E1 e PMI-I imunorreagiram com as proteínas de Daudi e de HUVEC sujeitas a electroforese como previsto com base em caracterizações anteriores de especificações de ligação. Assim, o anticorpo monoclonal IgG 14E11 reconhece especificamente a proteína de superfície celular de 90-95 kD isolada tanto de Daudi como de HUVEC em comparação com a observada com o anticorpo anti-ICAM-1 BD através de transferência de Western aqui descrita e por imunoprecipitação descrita no Exemplo 2D.

Adicionalmente, como observado no Exemplo 5, o anticorpo 14E11 purificado por afinidade foi completamente eficaz na inibição da ligação de células THP-1 através da ponte de fibrinogénio para HUVEC. 5. Inibição de Ligação Mediada por Fibrinogénio de Leucócitos a Células Endoteliais A - Inibição de Ligação Mediada por Fibrinogénio de 75 f\ \

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·'? / Células ΤΗΡ-1 a HUVEC Utilizando Análogos de Fibrinoqénio

1) Excesso de Fibrinoqénio Frio Os ensaios de ligação de fibrinogénio marcado com 125I ligado a HUVEC foram realizados na presença de um excesso molar de 50 de fibrinogénio não marcado de modo a confirmar a especificidade de ligação como apresentado no Exemplo 3A. O ensaio de ligação foi realizado como descrito no Exemplo 3A com a excepção de o fibrinogénio não marcado ser misturado com HUVEC a um excesso molar de 50 (fibrinogénio a aproximadamente 7,5 X 10'3 M) concorrentemente com 50 μς/ταΏ de fibrinogénio marcado com 125I. As misturas proteína-célula foram mantidas a 22°C durante 30 minutos para permitir a ligação de fibrinogénio a HUVEC. Adicionalmente ao fibrinogénio frio, foi misturado como um controlo um excesso molar de 50 vezes de BSA. A quantidade de fibrinogénio ligado nas condições acima foi quantificada como descrito no Exemplo 3A. A ligação total não inibida de fibrinogénio marcado com 125I saturou após 30 minutos a aproximadamente 4000 cpm por poço. A BSA não inibiu a ligação e por isso o fibrinogénio marcado com 125I exibiu um perfil semelhante na presença de BSA. Contudo, o fibrinogénio não marcado competiu para a ligação do fibrinogénio marcado para metade do total de ligação não inibida. A ligação do fibrinogénio ao receptor de fibrinogénio da superfície de HUVEC é por isso específica. A especificidade de ligação a um receptor de fibrinogénio independente de RGD foi confirmada em ensaios de competição realizados como descrito acima na presença de anticorpos monoclonais contra a subunidade beta da VNR dependente de RGD e na presença de péptidos contendo RGD. Para os ensaios nos quais a capacidade de anticorpos monoclonais anti-VNR, designados mAb 609 e mAb 7E3, para inibir a ligação de fibrinogénio marcado com 125 I a HUVEC, os anticorpos foram mantidos separadamente a uma concentração de 25 pg/mL com HUVEC durante 20 minutos a 37°C. 76

'· / \

Após ο período de manutenção, as HUVEC tratadas com anticorpo foram lavadas uma vez com RPMI 1640 sem soro para remover qualquer anticorpo não ligado. 0 fibrinogénio marcado foi então misturado com as HUVEC tratadas a uma concentração de 50 μg/mL na presença de CaCl2 a 2,5 mM e Ppack a 100 mM. As misturas resultante foram mantidas durante 10-30 minutos a 22°c. As HUVEC tratadas com fibrinogénio foram então lavadas, solubilizadas e contadas como descrito no Exemplo 3A.

Os resultados são apresentados no gráfico de barras na Figura 7 em que a quantidade de fibrinogénio marcado com 1Z5I ligado a HUVEC em cpm/poço (X 10”3) são representados no eixo dos X contra o período de tempo durante o qual o fibrinogénio marcado foi mantido com as HUVEC. Cada parte do gráfico de barras é identificado separadamente para cada ponto de tempo como se segue: ligação total (sem inibidores misturados), +Fg (fibrinogénio) misturado, +mAb 609; e +mAb 7E3. O fibrinogénio frio que foi adicionado num excesso molar de 50 como descrito acima inibiu quase completamente a ligação de fibrinogénio marcado com 125I a HUVEC. Os anticorpos VNR, contudo, não tiveram efeito como antecipado através dos resultados com a cromatografia de afinidade no Exemplo 2. Assim, o fibrinogénio liga-se a um receptor em HUVEC que não é VNR.

Para confirmar que o sítio de ligação do fibrinogénio em HUVEC não é dependente de RGD, os ensaios de inibição foram realizados como acima descrito para a inibição com anticorpos excepto que foram realizados na presença de um péptido contendo RGD a 1,0 mM. Foi também incluído no ensaio um péptido de controlo contendo RGD. As HUVEC foram recolhidas como descrito no Exemplo 3A em pontos de tempo seleccionados ao longo do período de tempo de uma hora.

Os resultados obtidos são apresentados na Figura 8 em que a quantidade de fibrinogénio marcado com 125I ligado a HUVEC em cpm/poço (X 10-3) são representados no eixo dos Y contra o período de tempo em que o fibrinogénio marcado foi mantido com 77 Γ"

U-u·*' Π / HUVEC. Nem ο péptido contendo RGD nem o péptido contendo RGE tiveram qualquer efeito inibidor da ligação de fibrinogénio marcado HUVEC em comparação com a ligação total do fibrinogénio marcado na ausência de qualquer inibidor. Os resultados dos péptidos contendo RGD e RGE são apresentados respectivamente como as linhas indicadas pelos quadrados a cheio e abertos. O fibrinogénio frio inibiu completamente a ligação de fibrinogénio marcado como esperado.

Resumidamente, um excesso de fibrinogénio não marcado inibiu completamente a ligação de fibrinogénio marcado a HUVEC e esta ligação é mediada através de um receptor de fibrinogénio independente de RGD que não é VNR. 2) Anticorpos Monoclonais Anti-ECR (ICAM-1)

Os anticorpos monoclonais produzidos por imunização de murganhos com HUVEC não estimuladas intactas como preparado no Exemplo 4 foram testados em relação à sua capacidade para inibir a ligação de 125I-fibrinogénio a HUVEC quer não estimuladas quer estimuladas com TNF. Os ensaios de ligação foram realizados como descrito no Exemplo 3A com as excepções descritas no Exemplo 4, para a pesquisa de sobrenadantes de cultura de hibridomas. As HUVEC foram expostas a TNF a 5 ng/mL durante 4 horas a 37 °C antes da mistura dos anticorpos. Após a estimulação as células foram lavadas uma vez com o meio de cultura de HUVEC preparado no Exemplo 2A. Os anticorpos monoclonais, 14Eqq purificado por afinidade, anti-ICAM-1 BD, e PMI-I (como descrito no Exemplo 4), foram misturados separadamente a uma concentração de 20 pg/mL a culturas de HUVEC ou estimuladas ou não estimuladas e mantidas durante 30 minutos a 37°C. Após as células reagidas com o anticorpo terem sido lavadas uma vez com meio de cultura, foi misturado a cada poço fibrinogénio marcado com 125I a 50 pg/mL preparado no Exemplo 3A e mantido durante 30 minutos a 22°C. As células foram subsequentemente lavadas e solubilizadas como descrito no Exemplo 3A.

Os resultados obtidos são apresentados nas Figuras 9A e 78

•Κ-

Figuras 9B que apresentam respectivamente os efeitos de exposição a anticorpo na ligação de fibrinogénio marcado com 125I a HUVEC não estimuladas e estimuladas com TNF. Os resultados são expressos num gráfico de barras como a ligação especifica de fibrinogénio marcado com 125I em cpm/poço (X IO"3) no eixo dos Y contra os tratamentos específicos no eixo dos X. Como apresentado na Figura 9A, ο 14E11 inibiu parcialmente a ligação de fibrinogénio, enquanto que o anticorpo BD anti-ICAM-1 foi ligeiramente mais eficaz. Contudo, nas culturas de HUVEC estimuladas com TNF apresentadas na Figura 9B, ο 14E11 inibiu completamente a ligação enquanto que o anticorpo BD foi apenas parcialmente eficaz. 0 anticorpo de controlo, PMI-I não foi inibidor em comparação com a quantidade de ligação na ausência de qualquer anticorpo. Por isso, os resultados apoiam a observação de que ο 14E11 reconhece especificamente um receptor de fibrinogénio (ou sitio de ligação) na superfície das HUVEC, cuja ocupação inibe completamente a ligação do fibrinogénio a HUVEC estimuladas com TNF. Este sistema in vitro mima o verificado in vivo e por isso os anticorpos desta invenção são úteis como terapêuticos. 6. Preparação de Anticorpos Monoclonais Anti-Fibrinoqénio que

Bloqueiam a Ligação de Fibrinogénio ao Receptor de

Fibrinogénio Independente de RGD em Células Endoteliais A. Preparação de Imunogénio 0 fibrinogénio e os fragmentos D e E daí preparados como descrito no Exemplo 1 são preparados para utilização como imunogénios de modo a produzir anticorpos monoclonais contra a porção de fibrinogénio que medeia a ligação de fibrinogénio ao sítio de ligação do fibrinogénio independente de RGD em células endoteliais. Para as imunizações, são misturados 50 μρ de imunogénios de fibrinogénio preparado separadamente em adjuvante completo de Freund (CFA). 79

B. Preparação de Anticorpos Monoclonais para o Sitio do Fibrinogénio que Medeia a Ligação de Fibrinoqénio em HUVEC

As HUVEC, preparadas como imunogénios de acordo com o Exemplo 4A, são injectados intraperitonealmente (i.p.) em murganhos Balb/c ByJ separados seguido por uma segunda e uma terceira imunizações utilizando os mesmos fibrinogénios, cada uma com três semanas de intervalo, em adjuvante incompleto de Freund (IFA) . Os murganhos receberam um reforço de 50 Hg de imunogénios de fibrinogénio preparados, intravenosamente (i.v.) em salino normal quatro dias antes da fusão e uma segunda perfusão semelhante de reforço um dia mais tarde.

Os animais assim tratados são sacrificados e o baço de cada murganho é extraído. É então preparada uma suspensão de células do baço e sujeita a um protocolo de fusão como descrito no Exemplo 4. Os clones em crescimento são então pesquisados quanto à expressão de hibridomas possuindo a especificidade seleccionada como abaixo descrito. C. Pesquisa Imunolóqica de Anticorpos Monoclonais através de Ensaios de Ligação

Os sobrenadantes de cultura de culturas resistentes a HAT preparadas acima são subsequentemente ensaiados quanto à presença de anticorpos de fibrinogénio que funcionam como inibidores da ligação de fibrinogénio ao receptor de fibrinogénio independente de RGD em células endoteliais. Os sobrenadantes são pesquisados tanto pelo ensaio de ligação de fibrinogénio marcado com 125I como pelo ensaio de união de células THP-1 ligadas a fibrinogénio e marcadas com 51Cr como descrito no Exemplo 4C, que se baseiam nos ensaios descritos no Exemplos 3A e 3B. A inibição do ensaio de ligação é ainda descrita no Exemplo 5.

Os sobrenadantes da cultura de hibridomas que produzem um anticorpo que se 1 iga ao sítio no fibrinogénio que medeia a 80

ligação do fibrinogénio as receptor de fibrinogénio independente de RGD em células endoteliais {também referido como ICAM-1) com base na análise nos Exemplos 2-5 são então seleccionados para subsequentes purificação e caracterização. São identificadas as culturas de hibridoma que produzem anticorpos contra o fibrinogénio. Os anticorpos monoclonais, específicos para uma região no fibrinogénio que se liga ao receptor de fibrinogénio independente de RGD em células endoteliais (ICAM-1) demonstram imunorreagir com o fibrinogénio para além dos seus análogos, e não imunorreagir com o sítio no fibrinogénio que medeia a ligação a MAC-1, nomeadamente o sítio definido pelos péptidos derivados de D30 descritos no Exemplo 3. D. Purificação dos Anticorpos Monoclonais Seleccionados

Os hibridomas seleccionados que segregam anticorpos anti-fibrinogénio como descritos no Exemplo 6C são injectados em murganhos Balb/c de 10 semanas de idade como descrito no Exemplo 4D para produzir líquido ascítico.

Os anticorpos monoclonais produzidos por ascites são ainda purificados através de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) utilizando uma coluna de permuta aniónica Pharmacia Mono Q HR5/5 (Pharmacia) utilizando um gradiente de NaCl de 0-0,5 M em Tris HC1 a 10 mM a pH 8,0 seguindo as instruções fornecidas com a coluna. Os anticorpos monoclonais tratados por FPLC são então concentrados utilizando uma célula de ultrafiltração com agitação Amicon (Danvers, MA; membrana PM 30) até uma concentração de 1 mg/mL, dialisados contra PBS e armazenados a -70°C para formar anticorpos monoclonais purificados.

Os anticorpos monoclonais são ainda purificados por afinidade utilizando um "kit" de purificação por afinidade, Affi-Prep, de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad, Richmond, CA) . Os anticorpos monoclonais IgM são ainda purificados através de filtração por gel em hidroxiapatite através de uma coluna de hidroxiapatite Bio-Gel HPHT de acordo 81 com as instruções do fabricante (Bio-Rad). Estes anticorpos purificados são utilizados em subsequentes ensaios de ligação, imunotransferências de Western e imunoprecipitações para utilização nesta invenção. A especificação apresentada, incluindo as realizações e exemplos específicos, pretende ser ilustrativa da presente invenção e não deve ser encarada como limitante. Podem ser realizadas numerosas outras variações e modificações sem desviar do verdadeiro âmbito da presente invenção, como definido nas reivindicações anexas.

Lisboa, 17 de Dezembro de 2001

O AGENTE OEIC1AL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES Composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um homólogo de fibrinogénio substancialmente puro e farmaceuticamente aceitável capaz de se ligar a ICAM-1 e inibir a ligação de Fg a células endoteliais, desde que o referido homólogo não seja D30 ou uma variante deste. Composição de acordo com a reivindicação 1 em que a referida quantidade terapeuticamente eficaz é pelo menos cerca de 0,1 porcento em peso de homólogo de fibrinogénio por peso da composição total. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o referido homólogo de fibrinogénio é disperso num excipiente farmaceuticamente aceitável. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que 0 referido homólogo de fibrinogénio é disperso numa solução estéril. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que 0 homólogo de fibrinogénio é seleccionado de um grupo consistindo de um fragmento proteolitico de fibrinogénio e um anticorpo monoclonal que imunorreage com ICAM-1, mas que não imunorreage com o receptor de vitronectina, em que o referido anticorpo monoclonal inibe preferencialmente a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o referido anticorpo monoclonal possui a imunoccpecificidade 83 de um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma seleccionado do grupo consistindo de 14E11, 16G8, 2E12, e 2B12.
2. 7. Composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um homólogo de ICAM-1 substancialmente puro e farmaceuticamente aceitável capaz de se ligar ao fibrinogénio e inibir a ligação de fibrinogénio a células endoteliais.
3. 8. Anticorpo monoclonal que imunorreage com ICAM-1, mas que não imunorreage com o receptor de vitronectina, em que o referido anticorpo monoclonal inibe preferencialmente a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas.
4. 9. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 8, em que o referido anticorpo possui a imunoespecificidade de um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma seleccionado do grupo consistindo de 14E11, 16G8, 2E12, e 2B12.
5. 10. Anticorpo monoclonal que imunorreage com o fibrinogénio e que inibe preferencialmente a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas.
6. 11. Utilização de um homólogo de fibrinogénio (Fg) ou de um homólogo de ICAM-1 no fabrico de um medicamento para inibir a ligação de Fg a células endoteliais num doente, sendo o referido homólogo de Fg capaz de se ligar a ICAM-1 e inibir a ligação de fibrinogénio a células endoteliais, e o referido homólogo de ICAM-1 capaz de se ligar a fibrinogénio e inibir a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas. 2 kjJ

   Γ\ 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11 em que o referido homólogo de Fg é seleccionado do grupo consistindo de um fragmento proteolitico de fibrinogénio, D30, e um anticorpo monoclonal que imunorreage com ICAM-1, mas não imunorreage com o receptor de vitronectina, em que o referido anticorpo monoclonal inibe preferenclalmente a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas.
7. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o referido anticorpo monoclonal possui a imunoespecificidade de um anticorpo monoclonal produzido por um produzido por um hibridoma seleccionado do grupo consistindo de 14E11, 16G8, 2E12, e 2B12.
8. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o referido homólogo de ICAM-1 é seleccionado do grupo consistindo de ICAM-1 e um anticorpo monoclonal compreendendo moléculas de anticorpo monoclonal que imunorreagem com fibrinogénio e que inibem preferencialmente a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas.
9. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o referido medicamento compreende o referido análogo numa quantidade suficiente para produzir uma concentração intravascular de homólogo no sangue do referido doente no intervalo de cerca de 0,1 a 100 μg/mL.
10. 16. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o referido medicamento é para administração numa quantidade que proporciona cerca de 0,1 a cerca de 20 miligramas de homólogo por quilograma de peso corporal do doente.
11. 17. Utilização de um homólogo de Eg ou um homólogo de ICAM-1 no 3 Γ\ Γ' fabrico de um medicamento para inibir a inflamação mediada por fibrinogénio/células endoteliais num doente, sendo o referido homólogo de Fg capaz de se ligar a ICAM-1 e inibir a ligação de Fg a células endoteliais, e sendo o referido homólogo de ICAM-1 capaz de se ligar ao fibrinogénio e inibir a ligaçao de fibrinoyénio a células endoteliais.
12. 18. Utilização de acordo com a reivindicação 17, em que o referido homólogo de Fg é seleccionado do grupo consistindo de um fragmento proteolitico de fibrinogénio, D30, e um anticorpo monoclonal que imunorreage com ICAM-1, mas não imunorreage com o receptor de vitronectina, em que o referido anticorpo monoclonal inibe preferencialmente a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas.
13. 19. Utilização de acordo com a reivindicação 17, em que o referido homólogo de ICAM-1 é seleccionado do grupo consistindo de ICAM-1 e de um anticorpo monoclonal compreendendo moléculas de anticorpo monoclonal que imunorreagem com fibrinogénio e que inibem preferencialmente a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas.
14. 20. Utilização de acordo com a reivindicação 17, em que o referido medicamento compreende o referido homólogo numa quantidade suficiente para produzir uma concentração intravascular de homólogo no sangue do referido doente no intervalo de cerca de 0,1 a 100 μg/mL.
15. 21. Método de detecção de um homólogo de fibrinogénio (Fg) numa amostra liquida compreendendo: (a) misturar uma amostra de células endoteliais estimuladas com uma quantidade pré-determinada de uma 4

    Ju amostra liquida contendo um homólogo de Fg e uma quantidade pré-determinada de homólogo de Fg marcado para formar uma mistura de reacção de competição; (b) manter a referida mistura de reacção durante um período de tempo pré-determinado suficiente para qualquer homólogo de Fg presente na referida composição se ligar às referidas células endoteliais e formar um complexo células endoteliais: homólogo de Fg e permitir que o homólogo de Fg marcado forme um complexo células endoteliais:homólogo de Fg; e (c) determinar a quantidade de complexo células endoteliais:homólogo de Fg marcado formado no passo (b) detectando assim a quantidade de homólogo de Fg na referida composição.
16. 22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o referido homólogo de fibrinogénio marcado é seleccionado do grupo consistindo de fibrinogénio, um fragmento proteolítico de fibrinogénio, D30, e um anticorpo monoclonal que imunorreage com ICAM-1, mas não imunorreage com o receptor de vitronectina, em que o referido anticorpo monoclonal inibe preferencialmente a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas.
17. 23. Método de pesquisa para composições eficazes na inibição da ligação de fibrinogénio a ICAM-1 compreendendo os passos de: (a) misturar numa mistura de reacção de inibição quantidades pré-seleccionadas de uma composição de um inibidor putativo, um homólogo de fibrinogénio, e um homólogo de ICAM-1, em que o referido homólogo de Fg é capaz de se ligar a ICAM-1 e inibir a ligação de Fg a células endoteliais, e o referido homólogo de ICAM-1 é capaz de se ligar ao fibrinogénio e inibir a ligação a 5 células endoteliais; referida condições se ligar ao homólogo de (b) manter a referida mistura sob suficientes para o referido homólogo de ICAM-1 referido homólogo de Fg e formar um complexo ICAM-1:homólogo de Fg; e (c) medir a quantidade de complexo homólogo de ICAM-1: homólogo de Fg formado no passo (b), e assim a eficácia da referida composição inibidora.
18. 24. Método de acordo com a reivindicação 23 em que o referido homólogo de Fg é seleccionado do grupo consistindo de fibrinogénio, fragmento proteolítico de fibrinogénio, D3o, e um anticorpo monoclonal que imunorreage com ICAM-1, mas não imunorreage com o receptor de vitronectina, em que o referido anticorpo monoclonal inibe preferencialmente a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas.
19. 25. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o referido homólogo de ICAM-1 é seleccionado do grupo consistindo de ICAM-1 e um anticorpo monoclonal compreendendo moléculas de anticorpo monoclonal que imunorreagem com fibrinogénio e que inibem preferencialmente a ligação de fibrinogénio a células endoteliais estimuladas.
20. 26. Método para preparar ICAM-1 substancialmente puro compreendendo os passos de: (a) proporcionar uma composição detergente aquosa contendo pelo menos ICAM-1; (b) pôr em contacto a composição contendo ICAM-1 com uma matriz com fibrinogénio imobilizado compreendendo fibrinogénio afixado a um suporte sólido, sendo o referido contacto é conduzido em condições suficientes para o ICAM-1 se ligar ao referido fibrinogénio e formar uma fase sólida complexo ICAM-1:fibrinogénio; 6 k (c) lavar o referido suporte sólido e o referido complexo com um tampão de lavagem aquoso compreendendo Mg++, Mn++ e um polipéptido contendo RGD em condições suficientes para eluir quaisquer proteínas ligadas ao fibrinogénio numa forma dependente de RGD, sendo o referido tampão de lavagem substancialmente isento de Ca**; e (d) eluir o referido ICAM-1 do referido suporte sólido utilizando um tampão aquoso compreendendo Mg++, Mn++ e EDTA, para formar o referido ICAM-1 substancialmente puro. Lisboa, 17 de Dezembro de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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