DE4335273A1 - Peptide zur Tumortherapie - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, die zur Behandlung von Tumorerkrankungen eingesetzt werden können.

Es ist bekannt, daß die Interaktion zwischen Leukozyten und ihren Zielzellen durch spezielle Adhäsionsmoleküle vermittelt wird. Das sogenannte interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1 ist ein Immunoglobulin-ähnliches einkettiges Transmembranmolekül, das funktionell definiert ist, durch seine Fähigkeit als Rezeptor von LFA-1 zu dienen. Das Lymphozytenfunktions-Antigen-1 (LFA-1) findet sich auf der Oberfläche von Leukozyten, insbesondere auf der Oberfläche von Lymphokin-aktivierten Killerzellen. Die durch LFA-1/ICAM-1 vermittelte Adhäsion spielt bei einer Vielzahl von immunologischen Prozessen eine Rolle, z. B. bei der Antigenpräsentation oder der Ausbildung eines entzündlichen Infiltrats in menschlichen Geweben. Weiterhin fungiert ICAM- 1 als ein Rezeptor für bestimmte humanpathogene Viren, z. B. Rhinoviren. Bei in vitro-Versuchen wurde festgestellt, daß die zytotoxische Zerstörung von Tumorzellen, insbesondere Melanomzellen, durch das Binden von LFA-1-Molekülen auf der Oberfläche von Lymphokin-aktivierten Killerzellen an Melanomzellen vermittelt wird, die das ICAM-1-Molekül tragen. Wenn aktivierte Killerzellen an Melanomzellen binden, wird hierdurch die Lyse und somit die Vernichtung der Tumorzellen bewirkt.

Staunton et al. haben in dem Artikel "Primary Structure of ICAM-1 Demonstrates Interaction between Members of the Immunoglobulin and Integrin Supergene Families" (Cell, Vol. 82 [1988], S. 925-933) eine Aminosäuresequenz eines ICAM-1-Moleküls offenbart.

Das ICAM-1-Molekül ist normalerweise bei den Zellen membrangebunden. Diese Form wird als mICAM-1 bezeichnet. Daneben gibt es aber auch noch eine lösliche Form dieses Moleküls, die als sICAM-1 bezeichnet wird. Das lösliche Molekül sICAM-1 ist funktionell aktiv, da es an LFA-1 binden kann und es konnte bei in vitro-Versuchen gezeigt werden, daß die durch Lymphokin-aktivierte Killerzellen bewirkte Zytotoxizität gegen Melanomzellen durch sICAM-1 gehemmt werden kann (Becker et al. "Shedding of ICAM-1 from Human Melanoma Cell Lines Induced by IFN-γ and Tumor Necrosis Factor-α", Journal of Immunology, [1991], Vol. 147, S. 4398- 4401).

Von Budnik et al. (Exp. Dermatol. 1992, Vol. 1, S. 27-30 "Human Epidermal Keratinocytes are a Source of Soluble ICAM- 1 Molecules") wurde offenbart, daß sowohl maligne wie auch nichtmaligne Keratinozyten (verhornende Zellen der Oberhaut) nach Stimulation mit dem Cytokin-Interferon-γ in der Lage sind, sowohl das membrangebundene mICAM-1 wie auch das lösliche sICAM-1 zu produzieren. Das lösliche sICAM-1 hat ein geringeres Molekulargewicht als das membrangebundene mICAM-1 und entsteht durch proteolytische Abspaltung von mICAM-1. Diese löslichen Moleküle sICAM-1 sind funktionell aktiv, d. h. sie können an LFA-1 binden. Wenn aber die löslichen Moleküle sICAM-1 vorhanden sind und diese an das LFA-1 der Lymphozyten binden, dann ist zu befürchten, daß die Leukozyten durch die lösliche Molekülform blockiert werden und ihre Funktion, nämlich die Zerstörung von Tumorzellen, nicht mehr wahrnehmen können.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel bereitzustellen, die bei der Therapie von Tumorerkrankungen erfolgreich eingesetzt werden können.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Peptide bei der Tumortherapie vorteilhafterweise eingesetzt werden können, da durch diese Peptide überraschenderweise die Bildung von sICAM-1 gehemmt wird, ohne daß die Expression von membrangebundenem mICAM-1 reduziert wird.

Die erfindungsgemäßen Peptide können die Aminosäuresequenz REVTVNVLSPRYEIVIITVVAAAVIM aufweisen. Die Aminosäuresequenz ist in dem 1-Buchstabencode angegeben. Die Bedeutung der jeweiligen Buchstaben ist beispielsweise in Römpps Chemielexikon, 8. Auflage, 1979, Bd. 1, S. 176, wiedergegeben. Im 3-Buchstabencode angegeben lautet die Aminosäuresequenz:
Arg Glu Val Thr Val Asn Val Leu Ser Pro Arg Tyr Glu Ile Val Ile Ile Thr Val Val Ala Ala Ala Val Ile Met.

Die erfindungsgemäßen Peptide können eine Deletion an einem oder beiden Enden der obigen Sequenz aufweisen, wobei jede Deletion bis zu fünf Aminosäuren umfassen kann.

Es ist bei biologischen Systemen häufig so, daß die Moleküle auch dann noch funktionell aktiv sind, wenn einzelne Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt werden. Das Ausmaß der zulässigen Abweichung wird angegeben in Homologiewerten. Unter Homologiewerten versteht man den Anteil der Aminosäuren, die bei beiden Sequenzen vorhanden sind. Wenn sich also beispielsweise eine Sequenz von 10 Aminosäuren in drei Aminosäuren unterscheidet und in sieben Aminosäuren übereinstimmt, dann liegt eine Homologie von 70% vor. Die erfindungsgemäßen Peptide umfassen auch solche Peptide, die eine Homologie von wenigstens 70% zu der Sequenz NVLSPRYEIVIITVVA aufweisen. Dies bedeutet, daß 30% der Aminosäuren ersetzt sein können durch andere Aminosäuren. Diese Derivate weisen aber noch die erforderliche biologische Aktivität auf.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Derivate eine Homologie von wenigstens 80% und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Homologie von wenigstens 90% zu der Sequenz NVLSPRYEIVIITVVA auf.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind verhältnismäßig kurz. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen sie nicht mehr als 26 Aminosäuren auf und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen sie nicht mehr als 16 Aminosäuren auf. Ganz besonders bevorzugt ist das Peptid mit der Aminosäuresequenz: NVLSPRYEIVIITVVA.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Arzneimittel, die wenigstens ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthalten. Diese Arzneimittel sind besonders für die Behandlung von Tumorerkrankungen geeignet. Bei einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Peptide zur Behandlung von Tumorzellen ex vivo eingesetzt werden. Wenn also Patienten, die an einer Tumorerkrankung leiden, Zellen im Rahmen der Therapie entnommen werden, können die erfindungsgemäßen Peptide ex vivo, ggf. zusammen mit IFN-γ zugegeben werden, wodurch die Tumorzellen verstärkt das membrangebundene mICAM exprimieren, aber die Expression von löslichem sICAM reduziert wird. Die aktivierten Lymphocyten können dann die Tumorzellen erkennen und vernichten.

An einem oder beiden Enden können die erfindungsgemäßen Peptide eine Deletion aufweisen, sofern sie länger als 16 Aminosäuren sind. Dies bedeutet, daß die ersten und/oder letzten Aminosäuren deletiert, d. h. entfernt sind. Die Deletion sollte jedoch nicht mehr als fünf Aminosäuren pro Ende betragen.

Unter Peptid im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Molekül verstanden, bei dem eine nicht zu große Anzahl von Aminosäuren miteinander verbunden ist. Die Zahl der Aminosäuren der erfindungsgemäßen Peptide beträgt höchstens 30, bevorzugterweise nicht mehr als 26 und besonders bevorzugterweise nicht mehr als 16.

Hergestellt werden können die erfindungsgemäßen Peptide nach an sich bekannten Methoden entweder auf synthetischem Wege (beispielsweise Festphasensynthese) oder auf gentechnologischem Weg, bei dem eine für die Aminosäuresequenz des Peptids kodierende DNA-Sequenz in einem geeigneten Vektor eingebaut wird und in einem geeignetem Wirtsystem zur Expression gebracht wird.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

Nach an sich bekannten Methoden wurden normale menschliche Keratinozyten, die von Vorhaut abstammen, kultiviert und unter Verwendung eines definierten Keratinozyten- Wachstumsmediums (KGM, Gibco, Berlin) kultiviert. Die Zellen wurden einschichtig bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre enthaltend 5% CO₂ kultiviert. Zur Stimulierung wurde zunächst das Wachstumsmedium ersetzt und menschliches Interferon-γ zugegeben, um die Expression von ICAM-1 zu stimulieren. Zur Inhibierung der Sekretion von sICAM-1 wurden Proteaseinhibitoren nach einer Inkubierungsperiode mit Interferon-γ zugegeben.

Für die Versuche wurden chemisch synthetisierte Peptide, die in Wasser auf eine Konzentration von 1 mM verdünnt wurden, zugegeben.

Beispiel 2 Bestimmung von sICAM-1 mittels ELISA

Vor der Stimulierung wurden die Zellen in 25 mm Zellkulturplatten (Falcon, Lincoln Park, NJ, USA) mit einer Dichte von 2,5 × 10⁵ Zellen/Platte ausgesät. Zum Zeitpunkt 0 wurde das Medium ersetzt durch 1,0 ml Medium mit der oder ohne die angegebenen Konzentration von rh IFN-γ (recombinant human interferon-γ) (Genzyme, Boston) und Proteaseinhibitoren. Nach einer Inkubationsperiode von 24 Stunden wurden die Überstände geerntet, für fünf Minuten bei 10.000 × g zentrifugiert, um verbleibende Zellpartikel zu entfernen und bis zur Messung bei -20°C gelagert. Die Menge der sICAM-1-Moleküle innerhalb der zellfreien Überstände wurde bestimmt, indem ein kommerziell erhältliches, hochsensitives (Nachweisgrenze für sICAM-1 : 0,5 ng/ml) Two- Side Capture sICAM-1 ELISA-System verwendet wurde. Die bei diesem sICAM-1 ELISA verwendeten anti-sICAM-1-monoklonalen Antikörper erkennen spezifisch den extrazellulären Bereich.

Die sICAM-1 ELISAs wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Löchern gemäß den Instruktionen des Herstellers (Bender MedSystems, Wien) durchgeführt, wobei jeweils 100 µl unverdünnter Überstand pro Probe verwendet wurde. Die Platten wurden auf einem Titertec Multiscan MCC bei 450 nm ausgewertet. Die Konzentrationen an sICAM-1 wurden mit einer Eichkurve berechnet, die mit Standardverdünnungen von sICAM- 1-Konzentrationen von 0 bis 10 ng/ml erstellt wurde.

Beispiel 3 Analyse der ICAM-1-Expression durch SDS-Gelelektrophorese und Western blot

Für die Western blot-Analyse wurden die Zellen in 10 cm Petrischalen kultiviert. Die Überstände wurden gesammelt und bei 10.000 × g 10 Minuten zentrifugiert, um irgendwelche Zellpartikel zu entfernen. Dann wurden die Überstände 25- fach mit Hilfe eines Centricon-30-Konzentrierers (Amicon, USA) konzentriert.

Um Lysate von den Zellen herzustellen, wurden die Zellen dreimal mit kaltem PBS-Puffer gewaschen, von den Kulturgefäßen abgekratzt und in 1,0 ml kaltem Lysepuffer resuspendiert. Der Lysepuffer enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA; 2 mM EGTA; 1% Triton; 1 µg/ml Aprotinin; 0,5 mM PMSF; 20 mM Jodacetamid; 10 mM Benzamidin und 50 mM ε-Aminocapronsäure. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation bei 10.000 × g für zweimal 10 Minuten bei 4°C entfernt. Der Proteingehalt einer jeden Probe wurde mit der Methode von Bradford bestimmt. SDS-Gelelektrophorese wurde nach der Methode von Laemmli (Laemmli, Nature [1970], 227, 680) durchgeführt. Hierzu wurden 10 µg Protein in Beladungspuffer (80 mM Tri-HCl pH 6,8; 10% Glycerin; 2% SDS und 0,02% Bromphenolblau) suspendiert und anschließend bei 95°C für fünf Minuten erhitzt. Die Elektrophorese wurde auf einem 8% SDS-Polyacrylamidgel unter nichtreduzierenden Bedingungen durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die der Größe nach aufgetrennten Proteine auf eine Polyvinylidendifluoridmembran in einem Transferpuffer (25 mM Tris; 150 mM Glycin und 10% Methanol) elektrotransferiert (Towbin et al. PNAS [1979] Vol. 76, S. 4350).

Die Western blot-Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung des ECL-Western blot-Analysesystems von Amersham. Nach der Übertragung wurden bei der Membran unspezifische Bindungen in einer Lösung von 0,15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5); 0,05% Tween-20 und 5% entfettete Trockenmilch für 60 Minuten blockiert. Die Membran mit den aufgetrennten Proteinen wurde dann für 60 Minuten bei Raumtemperatur mit dem ersten monoklonalen Antikörper (Klon 15.2, Boehringer Mannheim) in einer Verdünnung von 1 : 500 in der Blockierungslösung inkubiert. Anschließend wurde die Membran viermal für 10 Minuten bei Raumtemperatur in 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 0,05% Tween-20 gewaschen und dann für 60 Minuten mit einer 1 : 300 Lösung eines zweiten Antikörpers (Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Anti-Maus IgG-Antikörper [Schaf, Amersham]) in Blockierungslösung inkubiert, viermal wie oben beschrieben gewaschen und nach den Angaben des Herstellers der Farbentwicklungsreaktion unterzogen.

Beispiel 4 Immunofluoreszenz-Fließzytometrie

Die gesammelten und gewaschenen Zellen wurden mit einer 1 : 40 Verdünnung des monoklonalen Antikörpers 84H10 (Dianova) für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Dann wurden die Zellen dreimal in PBS-Puffer, der 0,05% Natriumazid enthielt, resuspendiert und mit einer 1 : 20 Verdünnung eines Ziegen- Anti-Maus-Antikörpers (FITC-Fab₂) für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen dreimal gewaschen und unmittelbar anschließend mit einem FACScan-Gerät (Becton Dickinson, USA) analysiert. Vor der Analyse wurden die Zellen routinemäßig mit Propidiumiodid angefärbt, um tote Zellen auszuschließen. Üblicherweise wurden 5.000 Zellen pro Probe überprüft. In der graphischen Darstellung ist die Fluoreszenzintensität gegenüber der Zellzahl angegeben.

Die Ergebnisse der Beispiele sind in den Figuren zusammengefaßt.

Fig. 1 stellt eine schematische Darstellung der Anordnung der verschiedenen getesteten Oligopeptide innerhalb des ICAM-Moleküls dar. Obwohl verschiedene Peptide untersucht wurden (Peptide 1-6), stellte sich überraschenderweise nur das Peptid 3 als wirksam bei der Blockierung der Produktion von löslichen sICAM-Molekülen heraus. Das Peptid 3 hat die Aminosäuresequenz NVLSPRYEIVIITVVA. Das erfindungsgemäße Peptid umspannt einen membrannahen extrazellulären Anteil und einen intramembranären Anteil des membranständigen ICAM- 1 Moleküls.

Fig. 2 zeigt, daß das erfindungsgemäße Peptid 3 dosisabhängig und spezifisch die Bildung von löslichem sICAM-1 hemmt. Dies ist auf der linken Hälfte der Fig. 2 dargestellt. Die Expression von membranständigen ICAM-1- Molekülen wird aber durch das erfindungsgemäße Peptid nicht gehemmt. Dies ist in der rechten Hälfte der Fig. 2 dargestellt. Die Produktion der löslichen sICAM-1-Moleküle wurde mittels des ELISA-Tests (Beispiel 2) ermittelt. Die Expression von mICAM-1 wurde mittels der FACS-Analyse (Beispiel 4) bestimmt.

Fig. 3 zeigt, daß nur das erfindungsgemäße Peptid, das in der Darstellung als Peptid 3 bezeichnet wurde, in der Lage ist, die Produktion von löslichen siCAM-1-Molekülen signifikant zu inhibieren. Die anderen Peptide zeigen keine oder nur eine äußerst geringe Inhibierung der Bildung von sICAM-1.

Claims (9)

1. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz REVTVNVLSPRYEIVIITVVAAAVIM aufweist, die an einem oder beiden Enden der Sequenz eine Deletion von bis zu fünf Aminosäuren aufweisen kann sowie Derivate davon, die eine Homologie von wenigstens 70% zu der Sequenz NVLSPRYEIVIITVVA aufweisen.

2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es nicht mehr als 26 Aminosäuren aufweist.

3. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Derivate zu der Sequenz NVLSPRYEIVIITVVA eine Homologie von wenigstens 80% aufweisen.

4. Peptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Derivate zu der Sequenz NVLSPRYEIVIITVVA eine Homologie von wenigstens 90% aufweisen.

5. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Sequenz NVLSPRYEIVIITVVA aufweist.

6. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.

7. Arzneimittel für die Behandlung von Tumorerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.

8. Arzneimittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es bei der Behandlung von Tumorerkrankungen ex vivo eingesetzt wird.

9. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis zur Behandlung von Tumorerkrankungen.