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JP2019068849A - ヒト胚性幹細胞の分化 - Google Patents

ヒト胚性幹細胞の分化 Download PDF

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Abstract

【課題】β細胞に類似する機能性インスリン発現細胞を生成するために、ヒト胚性幹細胞からの、インスリンを発現する細胞への分化効率を改善した細胞集団の提供。【解決手段】膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団であって、プロテインキナーゼＣ活性化因子、及びＢＭＰ阻害能を有する因子、若しくはＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤を追加した培地中で細胞集団を培養することにより５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する細胞集団を生成する方法。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年５月１２日に出願された、米国特許仮出願シリアル番号６１／３
３３，８３１号の利益を主張するものであり、当該出願を本明細書にその全容において、
かつあらゆる目的について援用するものである。
（発明の分野）
本発明は、多能性幹細胞からのインスリン産生細胞への分化を促進させるための方法を
提供する。特に、本発明は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団であっ
て、その集団の５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、細胞集団を産
生する方法に関する。
Ｉ型糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着
に適したインスリン産生細胞即ちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手
法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成すること
がある。
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにおいて、
３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲
状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間段階を経て発達する。この
プロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉（definitive endoderm）の形成である。胚体
内胚葉細胞は、ＨＮＦ−３ β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４、及びＳＯＸ１７
などの多くのマーカーを発現する。
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。膵臓内胚葉細胞は膵臓
−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵
臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵
臓器官形成において重要な工程に格付けされる。成熟した膵臓は、他の細胞型の中でも、
外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によ
って生じる。
島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。
例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１３８９、２００１年）は、マ
ウスの胚幹細胞の、膵島と同様のインスリン分泌構造への分化を報告している。Ｓｏｒｉ
ａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１５７，２０００）は、ストレプトゾトシン誘発糖尿病
のマウスにおいて、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正
常化することを報告している。
一例において、Ｈｏｒｉら（ＰＮＡＳ ９９：１６１０５，２００２）は、ホスホイノ
シチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することに
より、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。
他の例では、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら（ＰＮＡＳ １００：９９８、２００３年）が、Ｐ
ａｘ４を構成的に発現するマウス胚幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告してい
る。
Ｍｉｃａｌｌｅｆらは、レチノイン酸が、胚幹細胞のＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉の形成に
対する関与を調整することができることを報告している。レチノイン酸は、胚における原
腸形成の終了時に対応する期間中の、胚性幹細胞分化の４日目に培養液に添加すると、Ｐ
ｄｘ１発現の誘発に最も効果的である（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４：３０１、２００５年）
。
Ｍｉｙａｚａｋｉらは、Ｐｄｘ１を過剰発現するマウス胚幹細胞株を報告している。こ
の結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン
、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨｎｆ６遺伝子の発現を
明らかに増加させたことを示している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３：１０３０，２００４）
。
Ｓｋｏｕｄｙらは、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦ−βスーパーファミ
リーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子
（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。最
大作用は１ｎＭアクチビンＡを使用して観察された。Ｓｋｏｕｄｙらは、インスリン及び
Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡの発現レベルはレチノイン酸の影響を受けないが、３ｎＭ ＦＧＦ７
で処理することによりＰｄｘ１の転写レベルが増加したことも観察している（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４）。
Ｓｈｉｒａｋｉらは、胚幹細胞のＰＤＸ１陽性細胞への分化を特異的に高める増殖因子
の効果を研究した。シラキらは、ＴＧＦ−β２によってＰＤＸ１陽性細胞が高い割合で再
現可能に得られたことを観察している（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００５ Ｊｕｎ；１
０（６）：５０３〜１６．）。
Ｇｏｒｄｏｎらは、血清の非存在下、かつアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存
在下での、マウス胚性幹細胞からの短尾奇形［陽性］／ＨＮＦ−３ β［陽性］内胚葉細
胞の誘導を示した（米国特許出願公開第２００６／０００３４４６（Ａ１）号）。
Ｇｏｒｄｏｎら（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ １０３，ｐａｇｅ １６８０６，２００６）は、
「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンの同時シグナル伝達が前原始線条の形
成には必要であった」と述べている。
しかしながら、胚幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒト等のより高等な哺乳動物
内の発達プログラムを正確に模倣しない恐れがある。
Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ヒト胚盤胞から胚幹細胞を単離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：
１１４、１９９８年）。これと同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者は、胎児生殖腺
組織から、ヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８）。単
に白血病抑制因子（ＬＩＦ）と共に培養すれば分化が阻止され得るマウス胚幹細胞とは異
なり、ヒト胚性幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（米国特許第６，２
００，８０６号、国際公開ＷＯ ９９／２０７４１号；同ＷＯ ０１／５１６１６号）。
ダムールら（Ｄ’Ａｍｏｕｒ）は、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下で、ヒト胚
性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている（Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５）。これらの細胞を、マウスの腎臓皮膜
下で移植することにより、いくつかの内胚葉性器官の特徴を有する、より成熟した細胞へ
の分化が見られた。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、Ｐ
ＤＸ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許出願公開２００５／０２６６５５
４（Ａ１）号）。
Ｄ’Ａｍｏｕｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１
４０１（２００６））は、「我々はヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、膵臓ホルモンインスリ
ン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンを合成できる内分泌細
胞へと変換する分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵
臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した
段階を通して細胞を指向させることにより、インビボでの膵臓器官形成を模倣する。」と
述べている。
別の例において、Ｆｉｓｋらは、ヒト胚幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告
している（米国特許出願公開２００６／００４０３８７（Ａ１）号）。この場合、分化経
路は３つの段階に分割された。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンＡ
の組み合わせを用いて内胚葉に分化した。次に、細胞をノギンなどのＴＧＦ−βアンタゴ
ニストとＥＧＦ又はベータセルリンとの組み合わせと培養して、ＰＤＸ１陽性細胞を生成
する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。
一例において、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙらは、「我々は、ＰＤＸ１の過剰発現が、膵臓
に豊富に存在する遺伝子の発現を上昇させたことを結論付ける。インスリン発現の誘導に
は、インビボでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている
（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００６；２４：１９２３〜１９
３０）。
他の例では、Ｇｒａｐｉｎ−Ｂｏｔｔｏｎらは次のように記載している：「Ｎｇｎ３を
初期活性化させると、ほぼ例外なくグルカゴン＋細胞を誘導し、膵臓前駆細胞プールを枯
渇させた。Ｅｌ１．５からＰＤＸ１前駆細胞は形質転換受容性になり、インスリン［陽性
］でＰＰ［陽性］の細胞へと分化した」（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ＫＡ ｅｔ ａｌ．、Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ １２，４５７〜４６５，Ｍａｒｃｈ ２００７）
。
例えば、Ｄｉｅｚらは、「９〜１０週齢において、グルカゴン陽性細胞のほとんどはイ
ンスリンを共発現するが、個別のインスリンのみの細胞はこの段階で明らかに検出可能で
あったと述べている。インスリン及びグルカゴンを共発現する細胞は、全試験期間中（９
〜２１週）に観察されたが、全インスリン及びグルカゴン発現細胞のごく一部に相当する
にすぎなかった」（Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２００９ Ｓｅｐ；５
７（９）：８１１〜２４．２００９ Ａｐｒ １３）。
一例として、Ｃｈｅｎらは、「（−）−インドラクタムＶ［（ＩＬＶ）］は、プロテイ
ンキナーゼＣシグナル伝達を活性化し、内胚葉系に既に拘束（commit）されたｈＥＳＣの
膵臓特殊化に向かわせる．．．ＩＬＶ及びレチノイン酸は、関連メカニズムを介して機能
する．．．ＩＬＶは、レチノイン酸よりも、高いＰＤＸ−１発現細胞誘導（ＰＤＸ−１を
発現する細胞の割合）を示す」（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５
，１９５〜１９６（Ａｐｒｉｌ ２００９）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ
０４０９〜１９５）と述べている。
Ｌｙｔｔｌｅらは、「ＮＫＸ６−１がインスリン細胞のみと共局在したことは、ＮＫＸ
６−１がヒトβ細胞発生に独占的に関与することを示す」（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ
２００８ Ｊｕｌ：５１（７）：１１６９〜８０，２００８）と述べている。
したがって、β細胞に更によく類似する機能性インスリン発現細胞を生成するための、
インビトロ法開発の必要性が今も大いに求められているままである。本発明は、細胞集団
の５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマ
ーカーを発現する細胞集団を生成することにより、ヒト胚性幹細胞からの、インスリンを
発現する細胞への分化効率を改善させるという代替アプローチを用いた。
一実施形態において、本発明は、細胞集団の５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．
１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。
一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞集団を、膵臓内分泌系に特徴的なマーカ
ーを発現する細胞集団へと分化させる方法を提供し、この方法は以下の工程、
ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的な
マーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団をプロテインキナーゼＣ活性
化因子を追加した培地で処理することにより、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現す
る細胞集団を膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と
、を含む。
一実施形態において、本発明の方法によって産生された膵臓内胚葉系に特徴的なマーカ
ーを発現する細胞集団の中の５０％を超える細胞は、ＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発
現する。
実施例１に概説される分化プロトコルのステージ４の４日目におけるＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現を示す。 実施例１に概説される分化プロトコルのステージ４の４日目におけるＮＫＸ６．１及びＩＳＬ−１の発現を示す。 ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００で分析した、ＰＫＣ活性化因子処理が、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＣＤＸ２を発現する細胞の割合に与える影響を示す。 ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒによる様々なＰＫＣ活性化因子とそれらがＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１発現細胞の割合に与える影響の比較を示す。 本発明の細胞を、腎臓皮膜の下に受けた場合のＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスにおける循環Ｃペプチドを示す。Ｃペプチドレベルは記載の時点で検出した。 本発明の細胞を、皮下に移植されたＴｈｅｒａｃｙｔｅ社製デバイスの中で受けた場合のＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスにおける循環Ｃペプチドを示す。Ｃペプチドレベルは記載の時点で検出した。 細胞を腎臓皮膜の下に受けた群と、Ｔｈｅｒａｃｙｔｅ社製デバイスの中で細胞を皮下に受けた群との間の、移植後１２週間後に観察されたＣペプチドレベルの比較を示す。 実施例３に記載の方法に従って処理された細胞における、ＰＫＣ活性化因子処理がＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ１ α発現の発現に与える影響を示す。 実施例３に記載の方法に従って処理された細胞における、ＰＫＣ活性化因子処理がＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ１ α発現の発現に与える影響を示す。 実施例３に記載の方法に従って処理された細胞における、ＰＫＣ活性化因子処理がＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ１ α発現の発現に与える影響を示す。 実施例３に記載の方法に従って処理された細胞における、ＰＫＣ活性化因子処理がＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ１ α発現の発現に与える影響を示す。 実施例４に記載の方法に従って処理された細胞における、ＦＧＦ７がＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ α、及びＣＤＸ２の発現に与える影響を示す。 実施例４に記載の方法に従って処理された細胞における、ＦＧＦ７がＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ α、及びＣＤＸ２の発現に与える影響を示す。 実施例４に記載の方法に従って処理された細胞における、ＦＧＦ７がＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ α、及びＣＤＸ２の発現に与える影響を示す。 実施例４に記載の方法に従って処理された細胞における、ＦＧＦ７がＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ α、及びＣＤＸ２の発現に与える影響を示す。
開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形
態」を本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を、説明又は例示する下記の小節に分割
する。
定義
幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製し分化して子孫細胞を生成するという、これら
の両方の能力で定義される未分化細胞であり、子孫細胞には、自己複製前駆細胞、非再生
前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚
葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また
移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞への注入後、全てではないとしても殆どの
組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
幹細胞は、発生能によって、（１）全ての胚種及び胚体外細胞型を生じさせ得る能力を
意味する全能性、（２）全ての胚細胞型を生じさせ得る能力を意味する多能性、（３）細
胞系の小集合を生じさせ得るが、全て特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じ
させ得る能力を意味する複能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）
、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及
び要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生できる）、（４）複能性幹細胞と比較して、
より限定された細胞系の小集合を生じさせる能力を意味する少能性、並びに（５）１つの
細胞系（例えば、精子形成幹細胞）を生じさせる能力を意味する単能性に分類される。
分化は、特殊化されていない（unspecialized）（「未拘束の（uncommitted）」）又は
比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞
の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化を誘導された細胞は、細胞系内でよ
り特殊化された（「拘束された」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用し
た際の用語「拘束された」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し
続ける分化経路の地点に進行しており、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化し又はよ
り分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内
で比較的特殊化されて（又は拘束されて）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で
使用される場合、細胞系は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞から由来したか、また
どの細胞を生じさせることができるかを規定する。細胞系は、発生及び分化の遺伝スキー
ム内にその細胞を位置付けるものである。系特異的マーカーとは、対象とする系の細胞の
表現型と特異的に関連した特徴を指し、拘束されていない細胞の対象とする系への分化を
評価するために使用することができる。
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」又は「
ステージ１細胞」又は「ステージ１」とは、以下のマーカー、即ち、ＳＯＸ１７、ＧＡＴ
Ａ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ−様
ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥ
Ｓ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、又はＯ
ＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカー
を発現する細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内
胚葉細胞が挙げられる。
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、
以下のマーカー、即ち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１ β、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ
６、ＨＮＦ４ α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１のうちの少なくとも１つを発現す
る細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細
胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸
管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下
のマーカーを発現する：ＨＮＦ３ β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｏ
ＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１。
本明細書で使用するとき、「マーカー」は、対象とする細胞で差異的に発現される核酸
又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベ
ルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの
検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低い
ことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞
を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
本明細書で使用するとき、「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」又は「膵
臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のホルモン、即ち、インスリ
ン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現
することが可能な細胞を指す。
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６
０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体を使用して検出可能なマーカーのうちの１つ以上
を発現することができる（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１
１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ
−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が減少し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発
現が上昇する結果になる。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を４％パラホルム
アルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒ
ｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．））によって記載されるようにＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを基
質として現像することによって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有
する。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣ
Ｔ４及びＴＥＲＴも発現する。
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、３つの胚葉の全て、即ち、内胚葉、
中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化し得るものである。多能性幹細胞の多能性は、例え
ば細胞を重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、４％パラホルムアルデヒド
を使用して形成した奇形腫を固定した後、それらを３つの胚葉からの細胞型の痕跡に関し
て組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を
形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより
決定することができる。
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表
されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は「正常な核型」
を有する細胞を獲得することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、
ヒト染色体が全て揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。
多能性幹細胞の供給源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではな
いが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）
、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株
が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９（ＷｉＣｅｌ
ｌ）などのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株である。更に、こうした細胞の初
期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、
供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される１次多能性細胞であろう。フィーダ
ー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例え
ば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）等の変異ヒト胚性幹細胞株も
好適である。
一実施形態において、ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第
５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏ
ｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）に記載の通りに調製される。
多能性幹細胞の培養
一実施形態において、多能性幹細胞は、フィーダー細胞の層上で培養され、このフィー
ダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。代替的に、多能性幹細胞は、本質的
にフィーダー細胞が存在しないにも関わらず、実質的な分化を受けないで多能性幹細胞の
増殖を支持する培養液システム中で培養される。無フィーダー培養液中での分化なしでの
多能性幹細胞の増殖は、以前に他の細胞型で培養することによって馴化された培地を使用
して支持される。代替的に、無フィーダー培養液中での分化なしでの多能性幹細胞の増殖
は、合成培地を使用して支持される。
一実施形態において、多能性幹細胞は、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００））に開示されている方法に従
って、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性
幹細胞は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８：Ｖ
ｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１，ｐｐ．１１４５〜１１４７）に開示されている方法に従
って、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性
幹細胞は、Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜５５６，２００
３）に開示されているフィーダー細胞層の任意の１つの上で培養されてもよい。
一実施形態において、多能性幹細胞は、Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１
２２１〜１２２７，２００５）に開示されている方法に従って、ヒトフィーダー細胞層の
上で培養されてもよい。代替実施形態において、多能性幹細胞は、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら
（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４，２００５）に開示されてい
るヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｍｉｙａ
ｍｏｔｏら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０，２００４）に開示されてい
るヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ａｍｉｔ
ら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６，２００３）に開示されている
ヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｉｎｚｕｎ
ｚａら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：５４４〜５４９，２００５）に開示されているヒ
トフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。
一実施形態において、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００２／００７２１１７号
に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能
性幹細胞は、米国特許第６６４２０４８号に開示されている方法に従って誘導された培地
の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開特許ＷＯ２００５０１４
７９９号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるい
は、多能性幹細胞は、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４
）に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多
能性幹細胞は、米国特許出願公開２００７／００１００１１号に開示されている方法に従
って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願
公開２００５／０２３３４４６号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培
養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第６８００４８０号に開示されて
いる方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、
国際公開特許ＷＯ２００５０６５３５４号に開示されている方法に従って誘導された培地
の中で培養されてもよい。
一実施形態において、多能性幹細胞は、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：
１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９
，２００５）に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あ
るいは、多能性幹細胞は、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６
８〜５７４，２００６）に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されて
もよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００５／０１４８０７０号に開
示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹
細胞は、米国特許出願公開２００５／０２４４９６２号に開示されている方法に従って誘
導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開ＷＯ０２０
０５０８６８４５号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよ
い。
多能性幹細胞は、好適な培養基質上で平板培養することができる。一実施形態において
、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド
結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、
好適な培養培地は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ
）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ Ｓｗａ
ｒｍ腫瘍細胞からの可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細
胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン
、ヘパラン硫酸塩等を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、
基質上に好適な分布で平板培養されてもよい。これら全ての特徴は、播種分布に細心の注
意を払うことから利益が得られ、かつ当業者により容易に決定可能である。
好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉ
ｂｃｏ Ｎｏ．１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ
ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基
礎培地、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１５０３９−０２７；非−必
須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、
Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、
Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１３２５６−０２９などから調製することができる。
多能性幹細胞からの、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発
現する細胞集団を産生するための方法を提供し、この方法は、
ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分
化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、プロテインキナーゼＣ活
性化因子を追加した培地で処理することにより、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現
する細胞集団を膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程
と、を含む。
本発明の一態様において、本発明は、集団の５０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６
．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代
替実施形態において、本発明は、集団の６０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を
共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施
形態において、本発明は、集団の７０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現
する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態に
おいて、本発明は、集団の８０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において
、本発明は、集団の９０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内
胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。
本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、膵
内臓分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を形成するために更に処理されてもよ
い。
分化の効率は、所望の細胞型に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタ
ンパク質マーカーを特異的に認識する作用剤（例えば、抗体など）に、処理した細胞集団
を暴露することにより測定することができる。
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当
技術分野にて標準的である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅ
ｌら、ｅｄｓ．２００１年付録）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定
法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイト
メトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）参照）が
含まれる。
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同
定されている。例えば多能性幹細胞マーカーとしては、以下のもののうちの１つ以上の発
現が挙げられる：ＡＢＣＧ２、ＣＲＩＰＴＯ、ＦＯＸＤ３、コネキシン（CONNEXIN）４３
、コネキシン４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ナノグ（NANOG）、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、Ｚ
ＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０、又はＴｒａ １−８１。
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴
的なマーカーを発現する細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４等のタンパク質マーカ
ーを特異的に認識する作用剤（例えば、抗体等）に暴露することにより、分化した細胞を
精製することができる。
本発明における使用に好適な多能性幹細胞は、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨ
ｃｏｄｅ：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈｌ（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０１）、ヒト胚
幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅ
ｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）を含む。多能性細胞に特徴的な以下のマ−カー、即ち、
ＡＢＣＧ２、ＣＲＩＰＴＯ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏ
ＣＴ４、ＳＯＸ２、ナノグ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦＩ、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥ
Ａ−４、Ｔｒａ １−６０及びＴｒａ １−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞
も本発明での使用に適している。
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ
、ＣＥＲ１、ノーダル（Nodal）、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパ
ク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、
ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択され
る。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞は本発明で
の使用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する
細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発
現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを
発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１ β、ＰＴＦ
１ α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４ α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、及びＰＲＯＸ１からなる群から選
択される。膵内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細
胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵内胚葉系に特徴的なマー
カーを発現する細胞は、膵内胚葉細胞である。
膵臓内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ニューロＤ（NeuroD）、ＮＫＸ２．２
、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６からなる群から選択される。一実施
形態では、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチ
ン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる。膵臓内分泌
系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞は、本発明での使用に好適である
。本発明の一態様において、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内
分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵臓内
分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細
胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、以下の、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３
、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ニューロＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３ β、ＭＡＦＡ、ＰＡ
Ｘ４、及びＰＡＸ６の転写因子の少なくとも１つとを発現する。本発明の一態様では、β
細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
多能性幹細胞の、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの
前後に、マーカーの存在に関して試験することにより判定することができる。多能性幹細
胞は、典型的にはそのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、
細胞がそれらの発現を開始した際に検出されることになる。
多能性幹細胞は、当技術分野における任意の方法により、又は本発明で提案される任意
の方法により、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒらの、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ２３、１５３４〜１５４１（２００５年）に開示されている方法に従って、胚体
内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。
例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉらの、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１
、１６５１〜１６６２（２００４年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特
徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎらの、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５、２９〜３
８（２００７年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発
現する細胞に分化され得る。
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒらの、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、胚体
内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号１１／７３６，９０８号に開示さ
れる方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマー
カーを発現する細胞へと分化させることができる。
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号１１／７７９，３１１号に開示さ
れる方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマー
カーを発現する細胞へと分化させることができる。
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号６０／９９０，５２９号に開示さ
れる方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマー
カーを発現する細胞へと分化させることができる。
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号６１／０７６，８８９号に開示さ
れる方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマー
カーを発現する細胞へと分化させることができる。
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号６１／０７６，９００号に開示さ
れる方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマー
カーを発現する細胞へと分化させることができる。
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号６１／０７６，９０８号に開示さ
れる方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマー
カーを発現する細胞へと分化させることができる。
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号６１／０７６，９１５号に開示さ
れる方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマー
カーを発現する細胞へと分化させることができる。
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカー
を発現する細胞への分化
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発
現する細胞集団を産生するための方法を提供し、この方法は、
ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分
化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、プロテインキナーゼＣ活
性化因子を追加した培地で処理することにより、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現
する細胞集団を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工
程と、を包む。
本発明の一態様において、本発明は、集団の５０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６
．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代
替実施形態において、本発明は、集団の６０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を
共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施
形態において、本発明は、集団の７０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現
する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態に
おいて、本発明は、集団の８０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態におい
て、本発明は、集団の９０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓
内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。
一実施形態では、プロテインキナーゼＣ活性化因子は、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−
８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ
（pentadiemoylamino））ベンゾラクタム、インドラクタムＶ（ＩＬＶ）、ホルボール−
１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）、及びホルボール−１２，１３−ジブ
チレート（ＰＤＢｕ）からなる群から選択される。一実施形態では、プロテインキナーゼ
Ｃ活性化因子は、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル
）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタ
ムである。（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェ
ニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタムは、
約２０ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度で使用することができる。（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）
−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミ
ノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタムは、本明細書で「ＴＰＢ」と称される。
一実施形態において、プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地は、ＢＭＰ阻害
能を有する因子、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子からなる
群から選択される少なくとも１つの因子が追加される。
一実施形態では、ＢＭＰ阻害能を有する因子はノギンである。ノギンは、約５０ｎｇ／
ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは１
００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
一実施形態では、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤は、ＡＬＫ５の阻害剤である。一
実施形態では、ＡＬＫ５の阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。ＡＬＫ５阻害剤ＩＩは
、約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用されてもよい。一実施形態では、ＡＬＫ５阻害
剤ＩＩは１μＭの濃度で使用される。
一実施形態において、線維芽細胞増殖因子はＦＧＦ７である。代替実施形態では、線維
芽細胞（fibpoblast）増殖因子はＦＧＦ１０である。
一実施形態において、線維芽細胞増殖因子は、約５０ｐｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの
濃度で使用されてもよい。一実施形態では、線維芽細胞増殖因子は５０ｎｇ／ｍＬの濃度
で使用される。
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵臓内分泌系のマーカーを発現す
る細胞への分化
一実施形態において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、当技術
分野における任意の方法により、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団に
更に分化される。
例えば、Ｄ’ Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，２００６に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する
細胞集団を処理することによって、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団
を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団に更に分化してもよい。
例えば、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
２００６に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細
胞集団を処理することによって、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を
膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団に更に分化してもよい。
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル
番号１１／７３６，９０８号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に
特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞
集団へと更に分化させてもよい。
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル
番号１１／７７９，３１１号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に
特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞
集団へと更に分化させてもよい。
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル
番号６０／９５３，１７８号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に
特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞
集団へと更に分化させてもよい。
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル
番号６０／９９０，５２９号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に
特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞
集団へと更に分化させてもよい。
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル
番号６１／２８９，６７１号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に
特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞
集団へと更に分化させてもよい。
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定さ
れるものではない。
（実施例１）
本発明の細胞集団の形成
ヒト胚性幹細胞株Ｈｌ細胞を、０．２％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（
ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；カタログ＃１２０−１４）＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（Ｒ＆
Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ＃ １３２４−ＷＮ／ＣＦ）を追加したＲＰＭＩ培地（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃：２２４００）を有する、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標
）（１：３０希釈）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ＃ ３５６２３１）をコ
ーティングしたディッシュ上で１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ
のアクチビンＡを追加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、
次いで、
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間
にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７＋０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭのレチノイン酸（
ＲＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわた
って処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．処理１：１％のＢ２７を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処
理する（ステージ４−基本培地−ＢＭ）、若しくは
ｄ．処理２：１％のＢ２７＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ
を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する（ステージ４）、又は
ｅ．処理３：１％のＢ２７＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ
＋２０ｎＭのホルボール−１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢｕ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ、カタログ＃５２４３９０）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって
処理した（ステージ４）。
ステージ４の４日目に培養液を２回サンプリングし、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅ
ｒ １０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像した。ウェルあたり１００視
野の撮像を得て、バイオアッセイ及び続く染色手順の間の任意の細胞ロスを補正した。Ｉ
Ｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌｂｏｘ １．７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａ
ｒｅ）ソフトウェアを用いて、各ウェルから総細胞数、総ＰＤＸ１発現細胞、総ＮＫＸ６
．１発現細胞及び総ＣＤＸ−２発現細胞の測定値を得た。各複製データセットについて平
均及び標準偏差を算出した。総ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＣＤＸ−２の発現細胞を、全
細胞集団中の割合として報告した。
図２Ａに示されるように、ステージ４（４日目）、の終了時の全ての実験集団において
、細胞集団のおよそ９２％±４％がＰＤＸ１を発現した。しかしながら、ＰＤＢｕ（プロ
テインキナーゼＣ活性化因子）による処理は、基本培地（処理１）、又はＡＬＫ５阻害剤
ＩＩ＋ノギン（処理２）のいずれかで処理された細胞集団と比較して、ＰＤＸ１発現集団
におけるＮＫＸ６．１発現細胞の割合に顕著な増加を引き起こした（図２Ａ）。ＰＤＢｕ
で処理された群では、全集団の８８％±４．２％がＮＫＸ６．１を発現し、処理２を受け
た細胞の６２％±８％はＮＫＸ６．１を発現し、処理１を受けた細胞の４６．７±０．２
％はＮＫＸ６．１を発現した。ステージ４のＮＫＸ６．１発現細胞のほとんどは、ＰＤＸ
１も発現した。これらの観察結果は、所与の細胞集団から得たＰＤＸ１発現とＮＫＸ６．
１発現との画像をオーバーレイすることによって確認された（図１Ａ）。これらのデータ
は、プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地で細胞を処理することによって、膵
臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団においてＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を
共発現する細胞の割合が増加したことを示している。
処理１を受けた細胞集団では、細胞の１０％がＣＤＸ２（腸マーカー）を発現した（図
２Ａ）。処理２又は３のいずれかを受けた細胞集団では、細胞の５％未満がＣＤＸ２を発
現した。いずれの場合にも、ＣＤＸ２発現細胞のほとんどは、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１
を共発現しなかった。
ステージ３の細胞の並列集団を、上記処理３におけるＰＤＢｕの代わりに、次のプロテ
インキナーゼＣ活性化因子、２０ｎＭの濃度のホルボール−１２−ミリステート−１３−
アセテート（ＰＭＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ＃５２４４００）、又は５０ｎＭの濃度
の［（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル（
pheny））−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム］（ＴＰＢ）（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ ＃５６５７４０）で同様に処理した。
ステージ４の終了時に（４日目）、ＰＭＡで処理された細胞集団の９１％が、及びＴＰ
Ｂで処理された細胞集団の９０％が、ＮＫＸ６．１を発現した。これら処理の全てにおけ
る総ＰＤＸ１発現細胞に有意差は観察されなかった。図２Ｂを参照。
この例は、プロテインキナーゼＣ活性化因子を比較的低濃度で使用して、ＮＫＸ６．１
発現の上方調節を容易にし、かつ膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団内
におけるＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する細胞の割合を増加させることができるこ
とを示している。
（実施例２）
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）−ｂｅｉｇｅ（Ｂｇ）マウスへの、本発明の細胞の移植
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、０．２％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ＋
２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａを添加したＲＰＭＩ培地を有する、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登
録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュ上で１日培養し、次いで０．５
％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわ
たって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間に
わたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７＋０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭのレチノイン酸（
ＲＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわた
って処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．１％のＢ２７＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ＋５０ｎ
ＭのＴＰＢを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理した（ステージ
４）。
５〜６週齢のオスのＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウス（Ｃ．Ｂ−Ｉｇｈ−１ｂ／ＧｂｍｓＴ
ａｃ−Ｐｒｋｄｃscid−ＬｙｓｔbgＮ７）をＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓより購入した。
滅菌した餌と水を自由に利用できるような状態で、マウスをｍｉｃｒｏｉｓｏｌａｔｏｒ
ケージ内に収容した。外科手術を準備するため、マウスをイヤータグで同定し、体重を測
定し、手持ち式ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ；ＯｎｅＴｏｕｃｈ）を用いて
血糖を測定した。
マウスにイソフルラン（isolflurane）と酸素の混合物で麻酔をかけ、手術部位を小動
物用はさみで剪毛した。マウスには手術前に皮下に０．１ｍｇ．ｋｇ Ｂｕｐｒｅｎｅｘ
を投与した。７０％のイソプロピルアルコール及び１０％のポビドンヨウ素で連続的に洗
浄することで手術部位を準備した。
ステージ４の終了時に、１ｍＬのガラス製ピペットを用いて細胞を機械的に回収し、続
いて非接着性プレートに移し一晩培養した。マウスの手術前準備の間に、細胞を１．５ｍ
Ｌ遠心管で遠心し、次いで細胞ペレットを回収するのに必要最低限を残しつつほとんどの
上清を除去した。細胞をＲａｉｎｉｎ製Ｐｏｓ−Ｄポジティブディスプレイスメント式ピ
ペットに回収し、ピペットを反転させて重力により細胞を沈降させた。移植用に充填した
細胞調製物を残して過剰な培地を除去した。
移植用に２４Ｇ×１．９ｃｍ（３／４”）のＩ．Ｖ．カテーテルを用い、腎臓皮膜を貫
通させ、針を除去した。次いで腎臓被膜下でカテーテルを腎臓の遠位極まで前進させた。
Ｐｏｓ−Ｄピペットチップをカテーテルのハブにしっかりと取り付け、腎臓皮膜下でカテ
ーテルを通してピペットから５百万個の細胞を分配し、腎臓の遠位極に供給した。腎臓皮
膜を低温焼灼でシールし、腎臓を解剖学的な元の位置に戻した。並行して、Ｐｏｓｔ−Ｄ
ピペットチップを用い、５百万個の細胞を含有している細胞凝集物を５０μＬデバイスに
充填した。５０μＬデバイスはＴｈｅｒａＣｙｔｅ，Ｉｎｃ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から
購入した。細胞充填後にデバイスを医療用接着剤ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｔｙｐｅ Ａ（Ｄｏ
ｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ＃１２９１０９）によりシールし、ＳＩＣＤ／Ｂｇマウス
（動物番号３及び４）の皮下に移植した。５〜０ ｖｉｃｒｙｌを用いて連続縫合するこ
とで筋を縫合し、皮膚を創傷クリップにより閉じた。マウスには手術後に１．０ｍｇ．ｋ
ｇ Ｍｅｔａｃａｍを皮下投与した。マウスを麻酔から覚めさせ、完全に回復させた。
移植後に、マウスを週に１回計量し、週に２回血糖を測定した。移植に続き、マウスに
は様々な間隔で３ｇ／ｋｇグルコースを腹腔内投与し、グルコース注入の６０分後に、ヘ
パリンを少量含有している遠心管に後眼窩静脈洞から血液を吸引した。血液を遠心分離し
、２本目の遠心管中に血漿を配置し、ドライアイス上で凍結させ、その後、ヒトＣ−ペプ
チドアッセイを実施するまでの間−８０℃で保管した。製造者による取扱説明書に従い、
Ｍｅｒｃｏｄｉａ／ＡＬＰＣＯ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ＥＬＩＳＡ（Ｃａｔ Ｎｏ．８０−ＣＰＴＨＵ−Ｅ０１，Ａｌｐ
ｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮＨ）を用いてヒトＣペプチドレベルを測定した。
移植後４〜６週で早くも、腎臓皮膜群及びＴｈｅｒａｃｙｔｅ社製デバイスを受けた群
の両方の動物血清中でヒトＣペプチドが検出され、時間経過に伴って増加した（図３Ａ及
び図３Ｂ）。３ヵ月の終わりに、腎臓皮膜及びＴｈｅｒａｃｙｔｅ社製デバイスを移植さ
れた群の両方の動物の１００％において、グルコース投与に応答して顕著な量の循環ヒト
Ｃペプチドを検出することができた。３ヵ月後の腎臓皮膜群におけるグルコース刺激され
たヒトＣペプチドの血中濃度は１．７±０．５ｎｇ／ｍＬであり（ｎ＝４）、Ｔｈｅｒａ
ｃｙｔｅ社製デバイス移植群では１±０．５ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝２）であった（図３Ｃ）。
この実施例は、プロテインキナーゼＣ活性化因子によって生成されるＰＤＸ１及びＮＫ
Ｘ６．１共発現細胞集団が、インビボでインスリン分泌細胞に更に分化する能力を有する
ことを示している。インスリン分泌細胞への更なる分化の可能性は、局所環境に依存しな
い。本発明者らは、腎臓皮膜及び皮下部位の中の免疫保護デバイス内の両方において、Ｐ
ＤＸ１及びＮＫＸ６．１共発現細胞がインスリン分泌細胞へと更に分化し得ることを示し
ている。
（実施例３）
本発明の細胞集団を形成するための代替方法
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、０．２％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（
ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；カタログ＃１２０−１４）＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（Ｒ＆
Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ＃ １３２４−ＷＮ／ＣＦ）を添加したＲＰＭＩ培地（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃：２２４００）を有する、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標
）（１：３０希釈）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ＃ ３５６２３１）をコ
ーティングしたディッシュ上で１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ
のアクチビンＡを追加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、
次いで、
ａ．２％のＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間に
わたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７＋０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭのレチノイン酸（
ＲＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわた
って処理し（ステージ３）、続いて又は
ｃ．処理４：１％のＢ２７＋２０ｎＭのＰＤＢｕ＋１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加し
たＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する（ステージ４）、又は
ｄ．処理５：１％のＢ２７＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ
＋２０ｎＭのＰＤＢｕを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する
（ステージ４）、又は
ｅ．処理６：１％のＢ２７＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０＋２０ｎＭのＰＤＢｕを添加
したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間処理する（ステージ４）。
プロテインキナーゼＣ活性化因子によって媒介されるＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発
現する細胞の割合の増加に与える追加因子の影響を調べた。ステージ４の４日目に培養液
を２回サンプリングし、上の実施例１に記載の通りに画像解析を行った。ＩＳＬ１及びＮ
ＥＵＲＯＤ１の発現も記録した。
この研究では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の大部分は、ＰＤ
Ｘ１の発現に陽性であった。ＰＤＸ１発現細胞のほとんどもまたＮＫＸ６．１に共陽性で
あった。表１に示されるように、ＰＫＣ活性化因子のみの追加は、膵臓内胚葉系に特徴的
なマーカーを発現する細胞集団におけるＮＫＸ６．１発現細胞の形成を促進した。ステー
ジ４の４日目までに、全集団の９３％はＮＫＸ６．１陽性であり、ＮＫＸ６．１発現細胞
のほとんど全てはＰＤＸ１の発現に陽性であった。
プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地へのＡＬＫ５阻害剤ＩＩの添加（処理
５）は、観察されたＮＫＸ６．１発現の増加に影響を与えなかった。細胞集団の５７．１
％はニューロＤ１を発現し、細胞集団の５２．４％はＩＳＬ１を発現し、この処理の後に
内分泌前駆体細胞集団の割合が増加したことを示唆している。表１を参照されたい。
この実施例から得たサンプルのＰＣＲ分析は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＰＴＦ１
αの発現が、処理５を受けた細胞と比べて、処理４を受けた細胞集団で増加したことを
明らかにした。図４Ａ〜図４Ｄ参照。その一方で、ＮＧＮ３の発現の顕著な増加が、ＡＬ
Ｋ５阻害剤２及びＰＤＢｕを与えられた（処理５）細胞で観察された。図４Ａ〜図４Ｄ参
照。
プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した（処理６）培地に対するＦＧＦ１０の添加
の影響もまた調べた。ＰＤＢｕと組み合わせた５０ｎｇ／ｍＬの濃度でのＦＧＦ１０の添
加（処理６）は、細胞集団の９０％がＮＫＸ６．１を発現する膵臓内胚葉系に特徴的なマ
ーカーを発現する細胞集団を生成したが、ＮＫＸ６．１発現細胞の多くはＣＤＸ２陽性で
もあった。表１参照。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＰＴＦ１ αのｍＲＮＡレベルは、Ｐ
ＤＢｕ及びノギンで処理された細胞で観察されるレベルよりも増加しなかった。図４Ａ〜
図４Ｄされたい。
この実施例は、比較的低濃度（約２０ｎＭ）のプロテインキナーゼＣ活性化因子とＢＭ
Ｐ阻害剤の組み合わせを使用して、細胞の９０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を
共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成することができ
ることを示している。
Figure 2019068849
（実施例４）
本発明の細胞集団を形成するための代替方法
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、０．２％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（
ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；カタログ＃１２０−１４）＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（Ｒ＆
Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ＃ １３２４−ＷＮ／ＣＦ）を添加したＲＰＭＩ培地を（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃：２２４００）有する、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標
）（１：３０希釈）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ＃ ３５６２３１）をコ
ーティングしたディッシュ上で１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ
のアクチビンＡを追加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、
次いで、
ａ．２％のＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間に
わたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．処理７（Ｔ７）：１％のＢ２７＋０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭ
のレチノイン酸（ＲＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース
）で４日間にわたって処理する（ステージ３）、又は
ｃ．処理８（Ｔ８）：１％のＢ２７＋０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭ
のレチノイン酸（ＲＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加
したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する（ステージ３）、次いで
ｄ．処理９（Ｔ９）：１％のＢ２７＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン＋１μＭのＡＬＫ５阻
害剤ＩＩ＋２０ｎＭのＰＤＢｕを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって
処理する（ステージ４）、又は
ｅ．処理１０（Ｔ１０）：１％のＢ２７＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０＋２０ｎＭのＰ
ＤＢｕを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する（ステージ４）
、又は
ｆ．処理１１（Ｔ１１）：１％のＢ２７＋２０ｎＭのＰＤＢｕ＋１００ｎｇ／ｍＬのノ
ギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理した（ステージ４）。
ステージ４の４日目に培養液を２回サンプリングし、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅ
ｒ １０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像した。ウェルあたり１００視
野の撮像を得て、バイオアッセイ及び続く染色手順の間の任意の細胞ロスを補正した。Ｉ
Ｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌｂｏｘ １．７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａ
ｒｅ）ソフトウェアを用いて、各ウェルから総細胞数、総ＰＤＸ１発現細胞、総ＮＫＸ６
．１発現細胞、及び総ＣＤＸ２発現細胞の測定値を得た。各複製データセットについて平
均及び標準偏差を算出した。総ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＣＤＸ−２の発現細胞は、全
細胞集団の割合として報告された。
Ｔ７培地及びその後のＴ９培地で処理された細胞集団では、細胞集団の約８０％がＮＫ
Ｘ６．１を発現した。これについては、表２を参照されたい。Ｔ７培地及びその後のＴ１
０培地で処理された細胞集団では、細胞の９０％がＮＫＸ６．１を発現したが、この処理
ではより多くのＣＤＸ２発現細胞が観察された。表２を参照されたい。Ｔ７培地及びその
後のＴ１１培地で処理された細胞集団は、細胞集団の９３％がＮＫＸ６．１を発現する、
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成した。その集団におけるほと
んどのＮＫＸ６．１発現細胞は、ＰＤＸ１も発現した。
Ｔ８培地及びその後のＴ９培地で処理された培養液は、細胞集団の５６．７％がＮＫＸ
６．１を発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成した。表
２を参照されたい。Ｔ８培地及びその後のＴ１０培地で処理された培養液は、細胞集団の
６３．５％がＮＫＸ６．１を発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞
集団を生成し、本発明者らはこの処理の後により多くのＣＤＸ２発現細胞を観察した。表
２を参照されたい。Ｔ８培地及びその後のＴ１１培地で処理された培養液は、細胞集団の
７４％がＮＫＸ６．１を発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団
を生成した。表２を参照されたい。ＮＫＸ６．１発現細胞のほとんどはＰＤＸ１も発現し
た。
ステージ３でレチノイン酸、シクロパミン、及びノギンで処理した後、ステージ４でＰ
ＫＣ活性化因子を加えることにより、ステージ４の４日目までにＮＫＸ６．１及びＰＴＦ
１ αのｍＲＮＡレベルの上昇がもたらされた（図５Ａ〜図５Ｄ）という点で、ＰＣＲ分
析はＩＮ Ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓも支持した。
Figure 2019068849
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込む
ものとする。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明し
たが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈さ
れる以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。
本発明は次の実施態様を含む。
（１）膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団であって、前記集団の５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、細胞集団。
（２）前記集団の６０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、上記（１）に記載の細胞集団。
（３）前記集団の７０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、上記（１）に記載の細胞集団。
（４）前記集団の８０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、上記（１）に記載の細胞集団。
（５）前記集団の９０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、上記（１）に記載の細胞集団。
（６）細胞集団の５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する前記細胞集団を生成する方法であって、該方法は、
ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する前記細胞集団を、プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地の中で、前記膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を含む方法。
（７）前記プロテインキナーゼＣ活性化因子が、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム、インドラクタムＶ、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート、及びホルボール−１２，１３−ジブチレートからなる群から選択される、上記（６）に記載の方法。
（８）前記プロテインキナーゼＣ活性化因子が、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタムである、上記（６）に記載の方法。
（９）前記（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタムが、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度で使用される、上記（８）に記載の方法。
（１０）プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した前記培地が、ＢＭＰ阻害能を有する因子、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子からなる群からの少なくとも１つの因子を更に追加される、上記（６）に記載の方法。
（１１）ＢＭＰ阻害能を有する前記因子がノギンである、上記（１０）に記載の方法。
（１２）ノギンが、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの濃度で使用される、上記（１１）に記載の方法。
（１３）ノギンが約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される、上記（１１）に記載の方法。
（１４）前記ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤がＡＬＫ５阻害剤である、上記（１０）に記載の方法。
（１５）前記ＡＬＫ５阻害剤がＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、上記（１４）に記載の方法。
（１６）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが、約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用される、上記（１５）に記載の方法。
（１７）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが約１μＭの濃度で使用される、上記（１６）に記載の方法。
（１８）前記線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ７である、上記（１０）に記載の方法。
（１９）前記線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ１０である、上記（１０）に記載の方法。
（２０）前記線維芽細胞増殖因子が、約５０ｐｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で使用できる、上記（１０）に記載の方法。

Claims (20)

  1. 膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団であって、前記集団の５０％超の
    細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、細胞集団。
  2. 前記集団の６０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、請求項１に記載
    の細胞集団。
  3. 前記集団の７０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、請求項１に記載
    の細胞集団。
  4. 前記集団の８０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、請求項１に記載
    の細胞集団。
  5. 前記集団の９０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、請求項１に記載
    の細胞集団。
  6. 細胞集団の５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に
    特徴的なマーカーを発現する前記細胞集団を生成する方法であって、該方法は、
    ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程と、
    ｂ．前記多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴
    的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、
    ｃ．前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する前記細胞集団を、プロテインキナ
    ーゼＣ活性化因子を追加した培地の中で、前記膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現す
    る細胞集団へと分化させる工程と、を含む方法。
  7. 前記プロテインキナーゼＣ活性化因子が、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（
    ４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラク
    タム、インドラクタムＶ、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート、及びホ
    ルボール−１２，１３−ジブチレートからなる群から選択される、請求項６に記載の方法
    。
  8. 前記プロテインキナーゼＣ活性化因子が、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（
    ４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラク
    タムである、請求項６に記載の方法。
  9. 前記（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル
    ）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタムが、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭの
    濃度で使用される、請求項８に記載の方法。
  10. プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した前記培地が、ＢＭＰ阻害能を有する因子、
    ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子からなる群からの少なくと
    も１つの因子を更に追加される、請求項６に記載の方法。
  11. ＢＭＰ阻害能を有する前記因子がノギンである、請求項１０に記載の方法。
  12. ノギンが、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの濃度で使用される、請求項１１に
    記載の方法。
  13. ノギンが約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤がＡＬＫ５阻害剤である、請求項１０に記載の
    方法。
  15. 前記ＡＬＫ５阻害剤がＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項１４に記載の方法。
  16. ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが、約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用される、請求項１５に
    記載の方法。
  17. ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが約１μＭの濃度で使用される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ７である、請求項１０に記載の方法。
  19. 前記線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ１０である、請求項１０に記載の方法。
  20. 前記線維芽細胞増殖因子が、約５０ｐｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で使用できる
    、請求項１０に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023537327A (ja) * 2020-07-31 2023-08-31 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 膵内分泌細胞の分化

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
CA3207103A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic endocrine
ATE523585T1 (de) 2007-11-27 2011-09-15 Lifescan Inc Differenzierung menschlicher embryonaler stammzellen
RU2551772C2 (ru) 2008-02-21 2015-05-27 Сентокор Орто Байотек Инк. Способы, поверхностно-модифицированные носители и композиции для иммобилизации, культивирования и открепления клеток
BRPI0914116A2 (pt) 2008-06-30 2019-09-17 Centocor Ortho Biotech Inc diferenciação de células-tronco pluripotentes
CN107435038B (zh) 2008-10-31 2021-07-09 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
RU2522001C2 (ru) 2008-10-31 2014-07-10 Сентокор Орто Байотек Инк. Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток
CA2743641C (en) 2008-11-14 2024-03-26 Viacyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
CA2744227C (en) 2008-11-20 2018-10-02 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates
JP2012509085A (ja) 2008-11-20 2012-04-19 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド マイクロキャリア上での多能性幹細胞の培養
SG177481A1 (en) 2009-07-20 2012-02-28 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
CA2784415C (en) 2009-12-23 2019-06-18 Jean Xu Differentiation of human embryonic stem cells
SG183535A1 (en) 2010-03-01 2012-10-30 Janssen Biotech Inc Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
MX351515B (es) 2010-05-12 2017-10-17 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
ES2658146T3 (es) 2010-08-31 2018-03-08 Janssen Biotech, Inc. Diferenciación de células madre embrionarias humanas
CN103221536B (zh) 2010-08-31 2016-08-31 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
CN108220224A (zh) 2011-06-21 2018-06-29 诺沃—诺迪斯克有限公司 自多潜能干细胞有效诱导定形内胚层
AU2012355698B2 (en) 2011-12-22 2018-11-29 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells
US9434920B2 (en) 2012-03-07 2016-09-06 Janssen Biotech, Inc. Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells
MX358590B (es) 2012-06-08 2018-08-24 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas.
KR102058259B1 (ko) 2012-06-26 2019-12-23 세라시스, 인코포레이티드 인슐린 의존성 당뇨병의 치료에 유용한 줄기 세포 및 췌장 세포
JP6470687B2 (ja) * 2012-09-03 2019-02-13 ノヴォ ノルディスク アー／エス 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製
GB201216796D0 (en) * 2012-09-20 2012-11-07 Cambridge Entpr Ltd In vitro pancreatic differentiation
US10344264B2 (en) * 2012-12-31 2019-07-09 Janssen Biotech, Inc. Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells
AU2013370228B2 (en) 2012-12-31 2018-10-18 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
SG10201707811XA (en) * 2012-12-31 2017-11-29 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using hb9 regulators
EP3008170A4 (en) * 2013-06-11 2016-11-09 Harvard College SC-CELLS AND COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
EP2896688A1 (en) * 2014-01-20 2015-07-22 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) A method of producing beta pancreatic cells from progenitor cells through the use of hydrogen peroxide
SG10201810739VA (en) 2014-05-16 2019-01-30 Janssen Biotech Inc Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells
EP3191583A1 (en) * 2014-09-08 2017-07-19 Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud Method for obtaining pancreatic beta cell surrogates by increasing pancreatic and duodenal homeobox 1 (pdx-1) expression
ES2985135T3 (es) 2014-12-18 2024-11-04 Harvard College Procedimientos para generar células ß derivadas de células madre y usos de las mismas
US20160175363A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College Methods for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
US10443042B2 (en) 2014-12-18 2019-10-15 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
CN107614678B (zh) 2014-12-18 2021-04-30 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
US10392598B2 (en) 2015-06-19 2019-08-27 Emory University Methods of measuring cell purity for making quality control determinations and related compositions
MA45747A (fr) 2016-02-24 2019-01-02 Novo Nordisk As Génération de cellules bêta fonctionnelles à partir de progéniteurs endocrines dérivés de cellules souhes pluripotentes humaines
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
EP3591040A4 (en) * 2017-03-03 2020-11-11 Kyoto University METHOD OF PRODUCTION OF PANCREATIC PROGENITOR CELLS
CA3081762A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Semma Therapeutics, Inc. Islet cell manufacturing compositions and methods of use
CA3108275A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
US20220177849A1 (en) * 2019-04-08 2022-06-09 Novo Nordisk A/S Generation of pancreatic endoderm from stem cell derived definitive endoderm
CN114096557B (zh) 2019-05-22 2024-12-13 克利夫兰诊所基金会 产生背侧前肠和前部结构域内胚层细胞
US20220234006A1 (en) 2019-05-31 2022-07-28 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
US20220233298A1 (en) 2019-05-31 2022-07-28 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
AU2020283056B2 (en) 2019-05-31 2023-06-08 Viacyte, Inc. A biocompatible membrane composite
AU2020283150B2 (en) 2019-05-31 2023-08-17 Viacyte, Inc. Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008212150A (ja) * 2001-12-07 2008-09-18 Geron Corp ヒト胚幹細胞由来の膵島細胞
US20090170198A1 (en) * 2007-11-27 2009-07-02 Alireza Rezania Differentiation of human embryonic stem cells
US20090263896A1 (en) * 2008-04-21 2009-10-22 Olivia Kelly Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
WO2009132083A2 (en) * 2008-04-22 2009-10-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells
JP6469047B2 (ja) * 2010-05-12 2019-02-13 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の分化

Family Cites Families (237)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US709392A (en) 1902-05-06 1902-09-16 Haydn Brown Suture-clamp.
US2232142A (en) 1940-09-27 1941-02-18 Schumann Seymour Wound clip
US2814296A (en) 1954-04-15 1957-11-26 S & R J Everett & Co Ltd Surgical needles
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
US5759830A (en) 1986-11-20 1998-06-02 Massachusetts Institute Of Technology Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo
US4898156A (en) 1987-05-18 1990-02-06 Mitek Surgical Products, Inc. Suture anchor
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
TW205553B (ja) 1991-04-25 1993-05-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
US5341922A (en) 1993-02-24 1994-08-30 Ethicon, Inc. Peelable foil suture packaging
WO1994023572A1 (en) 1993-04-08 1994-10-27 Human Cell Cultures, Inc. Cell culturing method and medium
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ja) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
AU704723B2 (en) 1994-12-29 1999-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antitumor agent effect enhancer containing IL-6 antagonist
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
AU7138298A (en) 1997-04-24 1998-11-13 Ortho-Mcneil Corporation, Inc. Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases
DE69837491T2 (de) 1997-07-03 2008-01-17 Osiris Therapeutics, Inc. Menschliche mesenchymale stammzellen aus peripherem blut
DE69830065T2 (de) 1997-09-16 2006-01-19 Egea Biosciences, LLC, San Diego Methoden zur kompletten chemischen synthese und zusammensetzung von genen und genomen
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
WO1999020741A1 (en) 1997-10-23 1999-04-29 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells
ZA9811898B (en) 1997-12-29 2000-06-28 Ortho Mcneil Pharm Inc Anti-Inflammatory Compounds.
WO1999047163A2 (en) 1998-03-18 1999-09-23 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
IL144359A0 (en) 1999-01-21 2002-05-23 Vitro Diagnostics Inc Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
EP1224259A4 (en) 1999-09-27 2005-04-27 Univ Florida INVERSION OF INSULIN DEPENDENT DIABETES BY ISOLATED STEM CELLS, PROGENITOR ISLANDIC CELLS, AND INSULAR TYPE STRUCTURES
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
US6753153B2 (en) 1999-12-13 2004-06-22 The Scripps Research Institute Markers for identification and isolation of pancreatic islet α and β progenitors
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
KR100947577B1 (ko) 2000-06-26 2010-03-15 엔씨 메디컬 리서치 가부시키가이샤 신경계 세포로 분화할 수 있는 세포를 포함하는 세포분획
EP2404603A1 (en) 2000-10-23 2012-01-11 Glaxosmithkline LLC Novel trisubstituted-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-one compounds for the treatment of CSBP/p38 kinase mediated diseases
CZ20031594A3 (cs) 2000-12-08 2004-06-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Pyrrolinové sloučeniny substituované indazolylovou skupinou jako inhibitory kinázy
ATE301661T1 (de) 2000-12-08 2005-08-15 Ortho Mcneil Pharm Inc Makroheterocyclische verbindungen als kinase inhibitoren
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
EP1366148A2 (en) 2001-01-24 2003-12-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
US6699835B2 (en) 2001-01-25 2004-03-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Formulation of boronic acid compounds
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
JP2004527249A (ja) 2001-04-19 2004-09-09 デヴェロゲン アクチエンゲゼルシャフト フュア エントヴィックルングスビオローギッシェ フォルシュング 幹細胞をインスリン産生細胞に分化する方法
JP4296781B2 (ja) 2001-04-24 2009-07-15 味の素株式会社 幹細胞及びその分離方法
EP1393066A4 (en) 2001-05-15 2006-01-25 Rappaport Family Inst For Res INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
CA2456981C (en) 2001-08-06 2012-02-28 Bresagen, Inc. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
JP2005506074A (ja) 2001-10-18 2005-03-03 イクシオン・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド 肝臓の幹細胞および前駆細胞の膵臓機能細胞への転換
CA2468171C (en) 2001-11-15 2015-10-06 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
KR101083454B1 (ko) 2001-12-07 2011-11-16 사이토리 테라퓨틱스, 인크. 처리된 리포애스퍼레이트 세포로 환자를 치료하기 위한 시스템 및 방법
AU2002218893A1 (en) 2001-12-21 2003-07-09 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
JP2005512593A (ja) 2001-12-28 2005-05-12 セルアーティス アーベー 多能性のヒト胚盤胞由来幹細胞株の樹立方法
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
US20050208029A1 (en) 2002-04-17 2005-09-22 Akihiro Umezawa Method of forming pancreatic beta cells from mesenchymal cells
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
JP2005529918A (ja) 2002-05-08 2005-10-06 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 置換されたピロリンキナーゼ阻害剤
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
WO2003102134A2 (en) 2002-05-28 2003-12-11 Becton, Dickinson And Company Pancreatic acinar cells into insulin producing cells
WO2003104222A1 (en) 2002-06-05 2003-12-18 Janssen Pharmaceutica N.V. Bisindolyl-maleimid derivatives as kinase inhibitors
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
WO2004011621A2 (en) 2002-07-29 2004-02-05 Es Cell International Pte Ltd. Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose
AU2003262628A1 (en) 2002-08-14 2004-03-03 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
EP1539928A4 (en) 2002-09-06 2006-09-06 Amcyte Inc POSIOTIVE PANCREATIC ENDOCRINE PROGENITOR CELLS CD56 IN ADULT HUMAN BEINGS
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
US20060252150A1 (en) 2002-11-08 2006-11-09 Linzhao Cheng Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
WO2004050827A2 (en) 2002-12-05 2004-06-17 Technion Research & Development Foundation Ltd. Cultured human pancreatic islets, and uses thereof
ES2705683T3 (es) 2002-12-16 2019-03-26 Technion Res & Dev Foundation Medio de cultivo de células madre pluripotentes
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
AU2004208606B2 (en) 2003-01-29 2009-09-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Process for producing coated preparation
US20070154981A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
US20070155661A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
CA2520861A1 (en) 2003-03-27 2004-10-14 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
US20060194315A1 (en) 2003-03-31 2006-08-31 Condie Brian G Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
EP1641915B1 (en) 2003-06-27 2016-07-27 DePuy Synthes Products, Inc. Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
US20050042595A1 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Martin Haas Banking of multipotent amniotic fetal stem cells
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
AU2004269395A1 (en) 2003-08-27 2005-03-10 Stemcells California, Inc. Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations
US6939633B2 (en) 2003-09-17 2005-09-06 General Motors Corporation Fuel cell shutdown and startup using a cathode recycle loop
WO2005058301A1 (en) 2003-12-17 2005-06-30 Allergan, Inc. Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
CN112813019A (zh) 2003-12-23 2021-05-18 维亚希特公司 定形内胚层
CN103898047B (zh) 2003-12-23 2020-03-03 维亚希特公司 定形内胚层
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
WO2005065354A2 (en) 2003-12-31 2005-07-21 The Burnham Institute Defined media for pluripotent stem cell culture
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
US20080241107A1 (en) 2004-01-23 2008-10-02 Copland Iii John A Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells
GB2441530B (en) 2004-02-12 2009-09-23 Univ Newcastle Stem Cells
JP4901471B2 (ja) 2004-02-19 2012-03-21 国立大学法人京都大学 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
US20060281174A1 (en) 2004-03-09 2006-12-14 Gang Xu Methods for generating insulin-producing cells
EP1730261A4 (en) 2004-03-10 2007-11-28 Univ California COMPOSITIONS AND METHODS FOR GROWING EMBRYONIC STEM CELLS
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
WO2005097977A2 (en) 2004-04-01 2005-10-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
DK2377922T3 (da) 2004-04-27 2020-05-04 Viacyte Inc PDX1-eksprimerende endoderm
GB0410011D0 (en) * 2004-05-05 2004-06-09 Novartis Forschungsstiftung Neural cell differentiation method
CA2573283C (en) 2004-07-09 2023-03-14 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
WO2006020919A2 (en) 2004-08-13 2006-02-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells
US20080268533A1 (en) 2004-08-25 2008-10-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
KR101264940B1 (ko) 2004-09-08 2013-05-15 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물
DK3196296T3 (en) 2004-09-08 2019-02-04 Wisconsin Alumini Res Foundation Cultivation of human embryonic stem cells
AU2006210955A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
EP1860950B1 (en) 2005-03-04 2017-04-19 Lifescan, Inc. Adult pancreatic derived stromal cells
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
CN103361301A (zh) 2005-03-31 2013-10-23 斯丹姆涅恩有限公司 高度纯化来自羊膜的细胞群
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
EP1876893B1 (en) 2005-04-15 2012-04-11 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities
WO2006114097A2 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Aarhus Universitet Biosurface structure array
JP4557797B2 (ja) 2005-05-20 2010-10-06 株式会社日立製作所 光ディスク装置
KR20080024194A (ko) 2005-06-10 2008-03-17 아이알엠 엘엘씨 배아 줄기 세포의 다능성을 유지하는 화합물
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
US20080199959A1 (en) 2005-06-21 2008-08-21 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method For Cell Culture
EP1910516B1 (en) 2005-06-22 2019-06-19 Asterias Biotherapeutics, Inc. Suspension culture of human embryonic stem cells
ES2330789T3 (es) 2005-06-30 2009-12-15 Janssen Pharmaceutica Nv Anilino-piridinotriazinas ciclicas como inhibidores de gsk-3.
CA2616863A1 (en) 2005-07-29 2007-02-01 Australian Stem Cell Centre Limited Compositions and methods for growth of pluripotent cells
US20080194021A1 (en) 2005-07-29 2008-08-14 Mays Robert W Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
US20080199849A1 (en) 2005-09-02 2008-08-21 Agency For Science, Technology And Research Method of Deriving Progenitor Cell Line
AU2006292021B2 (en) 2005-09-12 2012-05-31 Es Cell International Pte Ltd. Cardiomyocyte production
WO2008048671A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
EP1941032A2 (en) 2005-10-14 2008-07-09 Regents Of The University Of Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
JP5404047B2 (ja) 2005-10-27 2014-01-29 ヴィアサイト，インコーポレイテッド Ｐｄｘ１発現背側及び腹側前腸内胚葉
US8048999B2 (en) 2005-12-13 2011-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
JP5830217B2 (ja) 2006-02-23 2015-12-09 ヴィアサイト インコーポレイテッド 分化可能細胞の培養に有用な組成物及び方法
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
EP1999253B1 (en) 2006-03-02 2019-05-22 Viacyte, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
ES2725601T3 (es) 2006-04-28 2019-09-25 Lifescan Inc Diferenciación de células madre embriónicas humanas
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
US8685730B2 (en) 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
GB2452186B (en) 2006-05-02 2011-01-26 Wisconsin Alumni Res Found Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
US7964402B2 (en) 2006-05-25 2011-06-21 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
US20090298169A1 (en) 2006-06-02 2009-12-03 The University Of Georgia Research Foundation Pancreatic and Liver Endoderm Cells and Tissue by Differentiation of Definitive Endoderm Cells Obtained from Human Embryonic Stems
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
US8415153B2 (en) 2006-06-19 2013-04-09 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
CA2656175C (en) 2006-06-26 2018-08-28 Lifescan, Inc. Conditioned media obtained from amniotic fluid-derived cells for pluripotent stem cell culture
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
US8968994B2 (en) 2006-07-06 2015-03-03 Jeremy Micah Crook Method for stem cell culture and cells derived therefrom
AU2007277364B2 (en) 2006-07-26 2010-08-12 Viacyte, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
US20080091234A1 (en) 2006-09-26 2008-04-17 Kladakis Stephanie M Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
CA2667053C (en) 2006-10-17 2015-04-28 Stiefel Laboratories, Inc. Talarazole metabolites
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
WO2008056779A1 (fr) 2006-11-09 2008-05-15 Japan As Represented By The President Of International Medical Center Of Japan Procédé destiné à la culture et au passage d'une cellule souche embryonnaire de primate, et procédé destiné à induire la différenciation de la cellule souche embryonnaire
AU2007324530A1 (en) * 2006-11-20 2008-05-29 Octagene Gmbh Genetic ablation of the PrP gene cells using a targeted promoter trap strategy for production of serum-free recombinant proteins as therapeuticals
WO2008086005A1 (en) 2007-01-09 2008-07-17 University Of South Florida Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
CN101641436A (zh) 2007-01-30 2010-02-03 佐治亚大学研究基金会 用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞（mmc）的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
US7688908B2 (en) 2007-03-12 2010-03-30 Samsung Electronics Co., Ltd. System and method for processing wireless high definition video data using a shortened last codeword
WO2008148105A1 (en) 2007-05-25 2008-12-04 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
PL2185695T3 (pl) 2007-07-18 2015-08-31 Lifescan Inc Różnicowanie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych
CA3207103A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic endocrine
BRPI0815052A2 (pt) 2007-07-31 2014-10-21 Lifescan Inc Diferenciação de células-tronco pluripotentes por meio de uso de células nutrizes humanas
KR101544498B1 (ko) 2007-08-24 2015-08-17 스티칭 허트 네덜란드 칸커 인스티튜트 종양성 질환의 치료를 위한 조성물
WO2009061442A1 (en) 2007-11-06 2009-05-14 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
US20100330677A1 (en) 2008-02-11 2010-12-30 Cambridge Enterprise Limited Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained
RU2551772C2 (ru) 2008-02-21 2015-05-27 Сентокор Орто Байотек Инк. Способы, поверхностно-модифицированные носители и композиции для иммобилизации, культивирования и открепления клеток
WO2009110215A1 (ja) 2008-03-03 2009-09-11 独立行政法人 科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
US8716018B2 (en) 2008-03-17 2014-05-06 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
WO2009131568A1 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Cythera, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
WO2009154606A1 (en) 2008-06-03 2009-12-23 Cythera, Inc. Growth factors for production of definitive endoderm
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
BRPI0914116A2 (pt) 2008-06-30 2019-09-17 Centocor Ortho Biotech Inc diferenciação de células-tronco pluripotentes
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
RU2522001C2 (ru) 2008-10-31 2014-07-10 Сентокор Орто Байотек Инк. Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток
CN107435038B (zh) 2008-10-31 2021-07-09 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
CA2742583C (en) 2008-11-04 2022-09-27 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
CA2743641C (en) 2008-11-14 2024-03-26 Viacyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
JP2012509085A (ja) 2008-11-20 2012-04-19 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド マイクロキャリア上での多能性幹細胞の培養
DK2356218T3 (en) 2008-12-05 2017-08-21 Inserm (Institut Nat De La Santé Et De La Rech Médicale) METHOD AND MEDIUM FOR NEURAL DIFFERENTIZATION OF PLURIPOTENT CELLS
US8507274B2 (en) * 2009-02-06 2013-08-13 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of definitive endoderm
SG177481A1 (en) 2009-07-20 2012-02-28 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
CA2768720C (en) 2009-07-20 2018-12-18 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
CA2784415C (en) * 2009-12-23 2019-06-18 Jean Xu Differentiation of human embryonic stem cells
US20120322152A1 (en) 2010-03-02 2012-12-20 Michael Raghunath Culture Additives To Boost Stem Cell Proliferation And Differentiation Response
AU2011235212B2 (en) 2010-03-31 2014-07-31 The Scripps Research Institute Reprogramming cells
CN103068970A (zh) 2010-04-25 2013-04-24 西奈山医学院 来自多能细胞的前部前肠内胚层的形成
US9279103B2 (en) 2010-08-05 2016-03-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Simplified basic media for human pluripotent cell culture
AU2011296383B2 (en) 2010-08-31 2016-03-10 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
WO2012117333A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
WO2013055834A2 (en) 2011-10-11 2013-04-18 The New York Stem Cell Foundation Er stress relievers in beta cell protection
AU2012355698B2 (en) 2011-12-22 2018-11-29 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
MX358590B (es) 2012-06-08 2018-08-24 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas.
AU2014239954B2 (en) 2013-03-15 2020-07-16 The Jackson Laboratory Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008212150A (ja) * 2001-12-07 2008-09-18 Geron Corp ヒト胚幹細胞由来の膵島細胞
US20090170198A1 (en) * 2007-11-27 2009-07-02 Alireza Rezania Differentiation of human embryonic stem cells
US20090263896A1 (en) * 2008-04-21 2009-10-22 Olivia Kelly Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
WO2009132083A2 (en) * 2008-04-22 2009-10-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells
JP6469047B2 (ja) * 2010-05-12 2019-02-13 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の分化

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NATURE BIOTECHNOLOGY (2006) VOL.24, NO.11, PP.1392-1401, JPN6015017739, ISSN: 0004216025 *
NATURE BIOTECHNOLOGY (2008) VOL.26, NO.4, PP.443-452, JPN6015017737, ISSN: 0004216024 *
NATURE CHEMICAL BIOLOGY (2009) VOL.5, NO.4, PP.258-265, JPN6015017736, ISSN: 0004471782 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023537327A (ja) * 2020-07-31 2023-08-31 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 膵内分泌細胞の分化
US12173324B2 (en) 2020-07-31 2024-12-24 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Differentiation of pancreatic endocrine cells
JP7705448B2 (ja) 2020-07-31 2025-07-09 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 膵内分泌細胞の分化
US12371665B2 (en) 2020-07-31 2025-07-29 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Differentiation of pancreatic endocrine cells
US12385013B2 (en) 2020-07-31 2025-08-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Differentiation of pancreatic endocrine cells

Also Published As

Publication number Publication date
EP2569419A2 (en) 2013-03-20
KR101986176B1 (ko) 2019-06-05
AU2011250912A1 (en) 2012-11-22
JP7535079B2 (ja) 2024-08-15
JP7149190B2 (ja) 2022-10-06
CN107338217B (zh) 2021-02-09
JP2013526279A (ja) 2013-06-24
SG10201503652WA (en) 2015-08-28
JP2022133411A (ja) 2022-09-13
US20110281355A1 (en) 2011-11-17
JP2017012178A (ja) 2017-01-19
RU2018120334A (ru) 2019-12-02
PH12012502189B1 (en) 2019-02-20
KR101903562B1 (ko) 2018-10-02
US20170327793A1 (en) 2017-11-16
WO2011143299A3 (en) 2012-03-01
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