JP2009544754A - ジヌクレオチドｍｒｎａキャップアナログ - Google Patents

Abstract

容易に合成され、高レベルのキャップ効率および転写効率および改善された翻訳効率をもたらす新規なキャップアナログが提供される。このようなキャップは、ジヌクレオチドキャップの一方または両方のグアノシンのＮ７位ならびにリボース環上の３’位でメチル化される。リボース環上の置換基はまた、正方向の配向で取り込まれるキャップをもたらす。キャップされたアナログを調製するのに有用な方法もまた提供され、このようなアナログを含むｍＲＮＡ種を使用することおよび新規なキャップアナログを含むキットもまた本明細書で想定される。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００６年７月２８日に出願された米国特許出願第６０／８２０，７７１号（これは、参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。

連邦政府の基金によって後援された研究または開発についての陳述
本明細書に記載される研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＳＢＩＲ助成金（ＳＢＩＲ Ｐｈａｓｅ ＩＩ、Ｎｏ．Ｒ４４ＧＭ０７０１５６−０２）によって少なくとも一部で基金提供を受けた。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。

本明細書に使用されるセクションの見出しは、単に組織化の目的のためであり、いかなる場合においても本明細書に記載される内容を限定するものとしてみなされるべきではない。

導入
真核生物のｍＲＮＡは、その５’−末端に「キャップ」構造を有し、これは、翻訳において重要な役割を果たすことが良く知られている。天然に存在するキャップ構造は、三リン酸架橋（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｒｉｄｇｅ）を介して最初に転写されたヌクレオチドの５’−末端に連結し、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドである）をもたらす７−メチルグアノシンからなる。ｍＲＮＡは、遺伝子発現において重要な役割を果たし得る。これは、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護し、核から細胞質へのＲＮＡの輸送を可能にし、そして翻訳開始複合体の組立てに加わる。ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ）は、５’−末端にキャップ構造を有するＲＮＡを得るために、インビトロでのＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによる転写においてプライマーとして使用されてきた。インビボでは、キャップは、酵素によって付加される。しかしながら、過去２０年以上にわたり、多くの研究が、インビトロで合成されたｍＲＮＡを補充したインビトロ翻訳抽出物におけるタンパク質の合成を必要としていた。キャップされたｍＲＮＡのインビトロ合成のための一般的な方法は、転写の開始因子としての形態ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの予め形成されたジヌクレオチドを使用する。ｍＣＡＰ（擬対照的な（ｐｓｅｕｄｏｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ）ジヌクレオチド）を使用することの欠点は、Ｇ部分またはｍ^７Ｇ（ｍ^７Ｇｕｏ）部分の３’−ＯＨが転写の伸長のための開始求核試薬（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）として働く傾向が常にあることである。このことは、転写反応のイオン条件に依存して、ほぼ等しい割合で、形態ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ（ｐＮ）_ｎおよびＧ（５’）ｐｐｐ７Ｇ（ｐＮ）_ｎの２つの異性体のＲＮＡの合成をもたらす。このことは、種々の下流のプロセス（例えば、インビトロ翻訳または結晶化研究）に問題となり得る。

メチル化されていないキャップアナログは、グアノシン上のメチル基が除去された改変キャップアナログである。Ｎ７でのグアノシンのメチル化および３’Ｏ−メチル化および５’二リン酸合成のための選択的手順は、確立されている（非特許文献１および非特許文献２）。アンチリバースキャップアナログ（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）は、３’ＯＨ基がＯＣＨ３で置換された改変キャップアナログである。ＡＲＣＡおよび三重メチル化キャップアナログは、正方向の配向で取り込まれる。

細胞において、キャップは、核において付加され、酵素グアニリルトランスフェラーゼによって触媒される。ＲＮＡの５’末端へのキャップの付加は、転写後に生じるが、それをほとんど検出できないように転写開始の直後に生じる。末端のヌクレオチドは、常にグアニンであり、それは、全ての他のヌクレオチドに対して逆方向の配向（すなわち、５’Ｇｐｐｐ５’ＧｐＮｐＮｐ…）であり、キャップは、５’−５’三リン酸結合によって接続された２つのヌクレオチドを含む。

ＲＮＡの転写は、通常、ヌクレオシド三リン酸（通常、プリン、ＡまたはＧ）で開始する。転写がインビトロで生じる場合、それは、代表的に、ファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６）、ファージポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型、ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ）およびマグネシウム塩を含む緩衝液を含む。キャップされたＲＮＡの合成は、転写反応においてキャップアナログ（例えば、Ｎ７メチルＧｐｐｐＧまたはｍ７ＧｐｐｐＧ）の取り込みを含む。過剰なｍ７ＧｐｐｐＧ対ＧＴＰ（４：１）は、各転写物が５’キャップを有する機会を増大させるのに有利に働く。Ａｍｂｉｏｎ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ａ ｂｕｓｉｎｅｓｓ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からのｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＭＮＥ（登録商標）キットは、この比率を推奨し、代表的に、８０％のキャップされたＲＮＡ対２０％のキャップされていないＲＮＡを得るが、ＧＴＰが転写物の伸長に必要とされるので、ＧＴＰ濃度が律速になるにつれて、総ＲＮＡの総収量はより低くなる。

５’キャップ構造は、真核生物のリボソームを結合するのを助け、適切なＡＵＧ開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｃｏｄｏｎ）の認識を確実にすることによってｍＲＮＡの翻訳を増強する。この作用は、翻訳系および合成されている特定のｍＲＮＡによって変動し得る。コンセンサス配列５’−ＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ−３’（「Ｋｏｚａｋ」配列としても公知である）は、真核生物ｍＲＮＡの中で最も強力なリボソーム結合シグナルであると考えられている。効率的な翻訳の開始のために、重要なエレメントは、＋１位のＧ残基および−３位のＡ残基である。

翻訳の間、キャップは、翻訳開始因子ｅＩＦ−４Ｅに結合し、ＣＢＣは追加の開始因子を補充する。脱キャップ化（ｄｅｃａｐｐｉｎｇ）は、キャップへ結合するｅＩＦ−４Ｅと競合するタンパク質ｄｃｐ１およびｄｃｐ２によって触媒される。翻訳は、ｍＲＮＡによってコードされ、一緒になってペプチドを形成するアミノ酸をもたらし、そして翻訳は、３つのプロセス（開始、伸長および終止）として生じる。真核生物における開始は、リボソームの結合を含み、リボソームは、最初のメチオニンコドンについてｍＲＮＡをスキャンする。伸長は、終止コドン（翻訳を終止させる）に達するまで、アミノ酸の連続的な付加とともに進行する。

特定の遺伝子をコードするキャップされたＲＮＡは、真核生物細胞にトランスフェクトされ得るか、細胞または胚において翻訳された産物の影響を研究するために細胞または胚へ微量注入され得る。キャップされていないＲＮＡを使用した場合、これらの実験におけるＲＮＡは迅速に分解され、翻訳されたタンパク質の収量は大いに減少する。

患者から単離された樹状細胞は、免疫原をコードするキャップされたＲＮＡでトランスフェクトすることができる。樹状細胞は、キャップされたＲＮＡをタンパク質へ翻訳し、このタンパク質は、このタンパク質に対する免疫応答を惹起する。小規模なヒト研究において、ＣＥＡキャップされたＲＮＡを入れた樹状細胞での免疫療法は、膵患者（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔ）に対して安全かつ実行可能であることが示されている（非特許文献３）。未熟な樹状細胞へ単一キャップされたＲＮＡ種を導入することが、特異的なＴ−細胞応答を惹起したことも留意されている（非特許文献４）。

最近の文献は、２’ＯＨ基または３’ＯＨ基のいずれかでのｍ７Ｇｕｏの化学的な改変が、たとえ２’ＯＨ基がホスホジエステル結合に関与しなくとも、もっぱら正方向の配向で取り込まれたキャップをもたらすことを明らかにする。この観察が、ｍ７Ｇｕｏの２’ＯＨおよび３’ＯＨの改変ならびに二重メチル化されたキャップアナログおよび三重メチル化されたキャップアナログを生成するためのｍ７Ｇｕｏの改変についての調査を促進した。

Ｋｏｒｅ，Ａ．およびＰａｒｍａｒ，Ｇ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２００６）２５：３３７〜３４０ Ｋｏｒｅ Ａ．Ｒ．ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２００６）２５（３）：３０７〜１４ Ｍｏｒｓｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｓｔｅｓｔ．Ｃａｎｃｅｒ（２００２）３２：１〜６ Ｈｅｉｓｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２００２）１０９：４０９〜４１７

以下：

を含む組成物が提供され、ここで、Ａは、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、Ｈ、ｔ−ブチルジメチルシリルおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され、Ｂは、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＮＨ_２、Ｎ_３、ＮＯ_２、ＣＦ_３、ＣＨＯ、Ｓ、ｔ−ブチルジメチルシリル、ＬＮＡおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され；Ｒ_１はＣＨ_３であるかまたは存在せず、Ｒ_２がＯＨ、ＯＣＨ_３およびハロゲンから選択され、ｎが１、２または３であり、ＢがＯＨまたはＯＣＨ_３であり、Ｒ_１が存在せず、Ｒ_２がＯＨである場合、ＡはＯＨでもＯＣＨ_３でもなく、Ａ、ＢおよびＲ_２がＯＨである場合、Ｒ_１はＣＨ_３ではない。

式：

によって表されるアンチリバースキャップアナログ組成物もまた提供され、ここで、Ａは、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、Ｈ、ｔ−ブチルジメチルシリルおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され、Ｂは、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＮＨ_２、Ｎ_３、ＮＯ_２、ＣＨＯ、Ｓ、ｔ−ブチルジメチルシリル、ＬＮＡおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され、Ｒ_１は存在せず、Ｒ_２はＯＨ、ＯＣＨ_３およびハロゲンから選択され、ｎが１、２または３であり；ＡがＯＨまたはＯＣＨ_３のいずれかである場合、Ｒ_２はＯＨではない。

式：

によって表される二重メチル化されたキャップアナログ組成物もまた提供され、ここで、Ａは、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、Ｈおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され、Ｂは、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＮＨ_２、Ｎ_３、ＮＯ_２、ＣＨＯ、ＬＮＡおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され、Ｒ_１がＣＨ_３であり、Ｒ_２がＯＨ、ＯＣＨ_３およびハロゲンから選択され、ｎが１、２または３であり、ＡがＯＨである場合、Ｒ_２はＯＨではない。

式：

によって表される三重メチル化されたキャップアナログが提供され、ここで、Ａは、ＯＨおよびＯＣＨ_３から選択され、ＢはＯＨおよびＯＣＨ_３から選択され、そしてｎは１、２または３である。

ＡまたはＢがハロゲンである場合、このハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり得る。グアノシン分子間のホスホジエステル結合は、三リン酸結合、四リン酸結合または五リン酸結合であり得る。

５’末端に先に記載される構造のうちの一つが取り込まれたＲＮＡ分子もまた提供される。

ＲＮＡ転写物をキャップするためのキットもまた提供され、このキットは、処方物：ａ）請求項１に記載の構造：

を有するキャップアナログであって、ここで、ａは、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、Ｈ、ＴＢＤＭＳおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され、Ｂは、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＮＨ_２、Ｎ_３、ＮＯ_２、ＣＦ_３、ＣＨＯ、ハロゲン、Ｓ、ＴＢＤＭＳ、ＬＮＡおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され；Ｒ_１はＣＨ_３であるかまたは存在せず；Ｒ_２はＯＨ、ＯＣＨ_３およびハロゲンから選択され；ｎが１、２または３であり；ＢがＯＨまたはＯＣＨ_３であり、Ｒ_１が存在せず、Ｒ_２がＯＨである場合、ＡがＯＨでもＯＣＨ_３でもない、キャップアナログ、ならびに処方物：ｂ）ＲＮＡポリメラーゼを含む。このキットはまた、ヌクレオチド、リボヌクレアーゼインヒビター、酵素緩衝液およびヌクレオチド緩衝液を含み得る。

ジヌクレオチドキャップアナログを合成する方法もまた提供され、この方法は、ａ）リボース環上に２’置換基および３’置換基のうちの少なくとも１つを含む第一のヌクレオシドを提供する工程、ｂ）この第一のヌクレオシドをリン酸化して、第一のヌクレオチドを形成する工程、ｃ）この第一のヌクレオチドをメチル化する工程、ｄ）２’リボース環置換基を必要に応じて含むリン酸化された第二のヌクレオチドを添加する工程、ならびにｅ）この第一のヌクレオチドとこの第二のヌクレオチドを連結して、ジヌクレオチドキャップアナログを形成する工程、を包含する。

本教示のこれらおよび他の特徴が本明細書に示される。

当業者は、以下に記載される図面が、単に説明目的のためであることを理解する。これらの図面は、いかなる場合においても本教示の範囲を限定するとは意図されない。

図１は、新規の二重メチル化されたキャップアナログのための合成スキームを示す。 図２は、新規なＡＲＣＡの合成を示す。 図３は、Ｐ１−グアノシン−５’−イルＰ３−７−メチルグアノシン−５’−イル三リン酸（ｍ^７Ｇ５’ｐｐｐ５’Ｇ）からなる基本的なＲＮＡキャップ構造（ｍＣＡＰ）を示す。 図４は、例示的な改変キャップアナログを示す。改変は、ｍ^７Ｇｕｏの、Ｇ７位のいずれかもしくはそれらの両方および／または３’リボース位置においてである。 図５は、Ｂｌｐ １でのＡｍｂＬｕｃポリＡ ＲＮＡの消化の結果を示す。 図６は、ＡｍｂＬｕｃ ポリＡベクターにおいて二重メチル化されたキャップアナログおよび三重メチル化されたキャップアナログを使用することによる、転写反応からの収量をグラフ表示する。 図７は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分析される、キャップされた場合の高レベルのＲＮＡの完全性を示す。 図８は、ゲルシフトアッセイによる、転写反応でのＲＮＡのキャップ効率を示す。 図９は、トランスフェクション後の種々の時点での、ポリ（Ａ）テイルを有する、標準的なキャップされたルシフェラーゼＲＮＡおよびＡＲＣＡキャップされたルシフェラーゼＲＮＡ、二重メチル化キャップされたルシフェラーゼＲＮＡおよび三重メチル化キャップされたルシフェラーゼＲＮＡの間のタンパク質発現の比較を示す。 図１０は、改変キャップアナログおよび通常のキャップアナログを使用することによる転写物収量を示す。 図１１は、フッ素−改変キャップアナログでのキャップ効率を示す。 図１２は、ルシフェラーゼアッセイにおけるフッ素−改変キャップアナログのトランスフェクション効率を示す。

種々の実施形態の説明
本明細書を解釈する目的のため、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語はまた複数形を含み、またその逆も同様である。以下に示される任意の定義が任意の他の書類（参考として本明細書に援用されるあらゆる書類を含む）における単語の使用法と対立する場合、例えば、その用語が元来使用される書類を解釈することにおいて反対の意味が明確に意図されない限り、本明細書および付随する特許請求の範囲を解釈する目的のために、以下に示される定義が常に支配する。本明細書における「または」の使用は、別様に記載されるか、「および／または」の使用が明らかに不適切である場合でない限り、「および／または」を意味する。本明細書における「１つの（ａ）」の使用は、別様に記載されるか、「１つ以上」の使用が明らかに不適切である場合でない限り、「１つ以上」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は交換可能であり、限定するとは意図されない。

全体に亘って使用される場合、「Ｍｅ」は「ＣＨ_３」と同等であり、「ＯＣＨ_３」または「ＯＭｅ」はメチル基に結合した酸素原子を示し、「ＣＨＯ」は水素原子（Ｈ）に結合した炭素原子（Ｃ）および酸素原子（Ｏ）への二重結合（Ｏ＝ＣＨ−）を意味し、「Ｅｔ」はＣ_２Ｈ_５を意味する。

本明細書で使用される場合、用語「ＡＲＣＡ」またはアンチリバースキャップアナログとは、その３’ＯＨ基がＯＣＨ_３で置換される改変キャップアナログをいう。その構造はｍ_２ ^{７，３’０}（５’）Ｇｐｐｐ（５’）Ｇと表される。

本明細書で使用される場合、用語「キャップ」とは、翻訳または局在化を促進するか、および／またはＲＮＡ転写物の５’末端に取り込まれた場合、そのＲＮＡ転写物の分解を防止する、伸長不能なジヌクレオチドをいい、代表的にｍ７ＧｐｐｐＧ構造またはｍ７ＧｐｐｐＡ構造を有する。それは、実際には、５’〜３’ではなく反対の配向（５’〜５’）で３つのリン酸基を介して分子の残りに結合されている改変塩基７−メチルグアノシンからなる（すなわち、Ｐ１−グアノシン−５’−イルＰ３−７−メチルグアノシン−５’−イル三リン酸（ｍ^７Ｇ５’ｐｐｐ５’Ｇ））。

本明細書で使用される場合、用語「キャップアナログ」とは、単一のエレメントのみしか異なっていない可能性があるＲＮＡキャップの構造上の誘導体をいう。

本明細書で使用される場合、用語「二重メチル化」キャップ（ｄｍ−ＣＡＰ）とは、各Ｎ７位が−ＣＨ_３基を含むジヌクレオチドキャップの各々のグアノシン分子をいう。これは、ｍ^７（５’）Ｇｐｐｐ（５’）ｍ^７Ｇと示される。

本明細書で使用される場合、用語「三重メチル化」キャップ（ｔｍ−ＣＡＰ）とは、ジヌクレオチドキャップのグアノシン分子の各Ｎ７位における−ＣＨ_３基およびグアノシン分子のうちの１つのリボース環の２’位または３’位におけるさらなるＯＣＨ_３基の存在をいう。ｔｍＣＡＰは、ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}（５’）Ｇｐｐｐ（５’）ｍ^７Ｇ、ｍ_２ ^{７，３’Ｏ}（５’）Ｇｐｐｐ（５’）ｍ^７Ｇ、ｍ^７（５’）Ｇｐｐｐ（５’）ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇまたはｍ^７（５’）Ｇｐｐｐ（５’）ｍ_２ ^{７，３’Ｏ−}Ｇと示される。

本明細書で使用される場合、用語「酵素的に取り込み可能な」とは、、鋳型依存性または鋳型非依存性のポリメラーゼ酵素の作用を介して、ポリヌクレオチド鎖の末端（例えば、３’末端）に、またはポリヌクレオチド鎖のニックトランスレーションによって内部に、ヌクレオチドが酵素的に取り込まれ得ることを意味する。ヌクレオチド−５’−三リン酸は、酵素的に取り込み可能なヌクレオチドの一例である。

本明細書で使用される場合、用語「酵素的に伸長可能な」または「３’伸長可能な」とは、酵素作用によってヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに付加され得るヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味する。３’ヒドロキシル基を含むポリヌクレオチドは、酵素的に伸長可能なポリヌクレオチドの一例である。

本明細書で使用される場合、用語「ハロゲン」とは、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）およびアスタチン（Ａｔ）を含む元素の周期表の第７Ａ属の非金属元素をいう。ハロゲンは、一価であり、容易に陰イオンを形成し、化合物またはイオンとして生じる。

本明細書で使用される場合、用語「ロックト核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」（ＬＮＡ）とは、２’Ｏメチレンビシクロヌクレオチドモノマーと４’Ｃメチレンビシクロヌクレオチドモノマーとの間の架橋をいう。

本明細書で使用される場合、用語「核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）」とは、窒素を含む複素環式部分核酸塩基をいう。適切な核酸塩基の非限定的な例としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（８−アザ−７−デアザアデニン）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」とは、リボース糖またはそのアナログのＣ−１’炭素に連結された核酸塩基から構成される化合物をいう。このリボース糖またはアナログは、置換されていても置換されていなくてもいい。置換リボース糖としては、１つ以上の炭素原子（好ましくは、３’−炭素原子）が、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲＲ（ここで、各Ｒ基は独立して−Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルまたはＣ_３−Ｃ_１４アリールである）またはハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）のような１つ以上の同一または異なる置換基で置換されているリボースが挙げられるが、これらに限定されない。特に、リボースは、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、３’−ハロリボース（例えば、３’−フルオロリボースまたは３’−クロロリボース）および３’−アルキルリボースである。代表的に、核酸塩基がＡまたはＧである場合、リボース糖は、この核酸塩基のＮ^９位に結合している。核酸塩基がＣ、ＴまたはＵである場合、ペントース糖は、この核酸塩基のＮ^１位に結合している（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，（１９９２））。リボースアナログの例としては、例えば、アラビノース、２’−Ｏ−メチルリボースおよびロックトヌクレオシドアナログ（例えば、ＷＯ９９／１４２２６）が挙げられるが、多くの他のアナログもまた当該分野において知られている。

本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」とは、モノマー単位としての、またはポリヌクレオチド内のヌクレオシドのリン酸エステルをいう。

本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド三リン酸」とは、５’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいう。

本明細書で使用される場合、本教示のヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドは、「天然糖（ｎａｔｕｒａｌ ｓｕｇａｒ）」（すなわち、−リボースおよび２’−デオキシリボースなど）または糖アナログを含み得る。

本明細書で使用される場合、用語「糖アナログ」とは、糖リボースのアナログをいう。例示的なリボース糖アナログとしては、５個より多いかもしくは５個より少ない環原子を有する置換または非置換のフラノース（例えば、エリトロースおよびヘキソース）および置換または非置換の３−６個の炭素の非環式糖が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な置換フラノースおよび置換非環式糖は、１つ以上の炭素原子が、１つ以上の同一または異なる−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲＲ（ここで、各Ｒは、独立して−Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルまたは（Ｃ_３−Ｃ_１４）アリールである）またはハロゲン基で置換されているものである。５個の環原子を有する置換フラノースの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２’−デオキシリボース、２’−（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルリボース、２’−（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ_５−Ｃ_１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ_５−Ｃ_１４）アリールオキシリボース、３’−（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ_５−Ｃ_１４）アリールオキシリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−ハロリボース−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−アミノリボース−５’−三リン酸、２’，３’−ジデオキシリボース−５’−三リン酸または２’，３’−ジデヒドロリボース−５’−三リン酸。さらなる糖アナログはまた、構造：

を有する、いわゆるロックト核酸（ＬＮＡ）およびＷｅｎｇｅｌら、ＷＯ９９／１４２２６（これは、参考として本明細書に援用される）に記載される糖アナログが挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、交換可能に使用され、これらは、ヌクレオチドモノマーの一本鎖のポリマーおよび二本鎖のポリマーをいう。これらとしては、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合連鎖（ｂｏｎｄ ｌｉｎｋａｇｅ）によって連結されたリボヌクレオチド（ＲＮＡ）および２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、もっぱらデオキシリボヌクレオチドから構成され得るか、もっぱらリボヌクレオチドから構成され得るか、またはこれらのキメラな（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）混合物から構成され得る。

本明細書で使用される場合、用語「ターミネーター」とは、生じるポリヌクレオチド鎖への引き続くヌクレオチドの取り込みを妨害し、それによってポリメラーゼ媒介性の伸長を停止させる、酵素的に取り込み可能なヌクレオチドを意味する。代表的なターミネーターは、３’−ヒドロキシル置換基を欠き、例えば、２’，３’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボースおよび２’，３’−ジデオキシ−３’−ハロリボース（例えば、３’−デオキシ−３’−フルオロ−リボースまたは２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロリボースを含む。あるいは、２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−デオキシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシルおよび２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシルのようなリボフラノースアナログが使用され得る（例えば、Ｃｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：１６７１−１６８６（１９８４）、およびＣｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅら、ＦＥＢ．Ｌｅｔｔ．，１８３：２７５−２７８（１９８５）を参照のこと）。ヌクレオチドターミネーターはまた、可逆性のヌクレオチドターミネーターも含む（Ｍｅｔｚｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２０）：４２５９（１９９４））。

本明細書で使用される場合、用語「伸長不能な」または「３’伸長不能な」とは、ターミネーターを、鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによって３’方向に伸長できないか、または実質的に伸長できない事実をいう。

本明細書で使用される場合、用語「ＴＢＤＭＳ」とは、ｔ−ブチルジメチルシリルをいう。

本明細書で使用される場合、用語「ない（ｖｏｉｄ）」とは、キャップアナログのＲ_１位に置換基が存在しないことをいう。置換基の欠如は、イミダゾール環上に陽電荷がないことをもたらす。一実施形態において、この置換基は、ＣＨ_３基であり得る。このＣＨ_３基が存在する場合、イミダゾール環上に陽電荷が存在する。

キャップアナログは、転写反応において５’キャップされたＲＮＡ分子を合成するために使用される。転写反応における、ＧＴＰの部分のキャップアナログとの置き換えは、転写物の対応する画分へのキャップ構造の取り込みをもたらす。一般的に、キャップされたｍＲＮＡは、インビトロ翻訳系内の網状赤血球溶解物およびコムギ胚芽においてより効率的に翻訳される。キャップされていないｍＲＮＡは迅速に分解されるので、微量注入実験のためにインビトロ転写物がキャップされることが重要である。キャップアナログは、タンパク質合成の開始工程の高度に特異的なインヒビターとしても使用される。

一実施形態において、新規なＡＲＣＡ、二重メチル化されたキャップアナログおよび三重メチル化されたキャップアナログが開示される。これらのキャップ構造は、正方向の配向で結合するように（すなわち、５’Ｇｐｐｐ５’ＧｐＮｐＮｐ．．．．）合成および設計されている。生じた新規なキャップアナログは、図６、８および１０に示されるように、標準的なキャップアナログと比較して、転写の収量および効率を改善することが実証されている。

これらのアナログはまた、リボース環の２’位および／または３’位に新規な置換基（これは、正方向の配向でのキャップの結合ももたらす）を有する。一実施形態において、リボース環の２’位または３’位に結合したフッ素が、図１１および図１２に示されるように、キャップ効率および翻訳効率の両方を改善することが示されている。

効率的にキャップされるだけではなく高レベルの転写されたＲＮＡを得る、キャップされたＲＮＡの合成は、満たされていない必要性の領域にある。Ａｍｂｉｏｎによって使用される一つのアプローチは、米国特許出願公開第２００５／０２８７５３９号（これは、参考として本明細書に援用される）に開示される。正方向の配向でのみ取り込まれるキャップアナログの合成は、転写および翻訳の効率を改善する。

米国特許第７，０７４，５９６号におけるＤａｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚらの教示は、アンチリバースキャップアナログのための合成方法およびメチル化方法を提示することを試みている。教示されるメチル化の方法は、本発明者らの手では再現性がなく、リンカーの合成もヌクレオチドを連結するための方法も再現性がなかった。

したがって、当該分野において、効率的にＲＮＡを合成する高収量の転写反応に対する満たされていない必要性が存在する。生じたＲＮＡは、リボザイム研究、アンチセンス研究および生物物理学研究ならびに遺伝子アレイ分析を含む種々の適用に用途が見出される。さらに、キャップされたＲＮＡ転写物を、インビボ発現（例えば、微量注入実験、トランスフェクション実験および感染実験）およびインビトロ翻訳のようなタンパク質合成を必要とする適用のために使用する。

合成ｍＣＡＰが１回（ｔｉｍｅ）あたり約５０％でＲＮＡに逆方向の配向で結合する課題を克服するために、ＮＴＰとキャップＲＮＡとが匹敵する濃度で存在する場合、本発明の適用は、改変キャップアナログ、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）ならびに二重メチル化キャップアナログおよび三重メチル化キャップアナログの合成のための化学的に便利でありかつ再現性のある方法を教示する（図１および図２）。

リボース環上の２’位および３’位における種々の部分が置換されているｍ７，２’ＦＧ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇおよびｍ７，２’ＦＧ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ７Ｇ、二重メチル化キャップのような新規なキャップアナログの設計および合成が示される（図２）。

三重メチル化キャップもまた発見され、かつ合成される。このようなキャップとしては、ｍ２７，２’ＯＧ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ７Ｇ、ｍ２７，２’ＯＧ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ２’ＯＧ５、ｍ２７，３’ＯＧ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ７Ｇおよびｍ２７，２’ＯＧ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ２７，２’ＯＧが挙げられる。さらに、標準的かつ従来のＡＲＣＡ キャップアナログと比較した、ＨｅＬａ細胞を使用することによる転写効率、キャップ化効率および翻訳効率についての新規な改変キャップアナログの適合性の詳細が示される。

^１Ｈ ＮＭＲおよび^３１Ｐ ＮＭＲによって構造を確認した。「アンチリバース」キャップアナログ（ＡＲＣＡ）を使用してＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって生成した転写物は、予測された長さであり、サイズおよび均質性においてｍ^７ＧｐｐｐＧで生成された転写物と見分けがつかなかった。ＨｅＬａ細胞によってインビトロ転写されたＲＮＡにおいて標準的なキャップアナログでキャップされたルシフェラーゼおよびＡＲＣＡキャップされたルシフェラーゼを使用することによって、トランスフェクションアッセイを実行した。最後に、ルシフェラーゼ活性を測定し、ＡＲＣＡキャップされた転写物が、ｍ^７ＧｐｐｐＧキャップされた転写物のルシフェラーゼ活性の２．２〜２．５倍であることを明らかにした。この知見はまた、従来のインビトロ合成されたｍＲＮＡにおけるリバースキャップの存在がそれらの翻訳効率を低下させることも示唆する。

当業者は、多くの改変、代替物および等価物が可能であることを理解する。

全てのこのような改変、代替物および等価物は、本明細書に包含されることが意図される。

材料および方法
試薬
全ての試薬および溶媒は、他に述べられない限り、さらに精製することなく使用する。グアノシン５’−二リン酸、硫酸ジメチル、無水ジメチルホルムアミド、２，２’−ジチオジピリジン（Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ）、トリフェニルホスフィン、トリメチルホスフェート（（ＯＭｅ）_３Ｐ）、オキシ塩化リン、五酸化リン、オルトリン酸、無水塩化メチレン、ジクロロメタン、トリブチルアミン、無水ピリジンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から購入した。３’−Ｏ−Ｍｅ−グアノシンは、Ｃｈｅｍｇｅｎｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡから利用可能である。イミダゾリドＧＭＰ、イミダゾリドＧＤＰ、イミダゾリド２’Ｆ−ＧＭＰ、イミダゾリド３’ＣＦ_３−ＧＤＰ、イミダゾリドｍ^７ＧＭＰ、１Ｍ トリス（トリエチルアンモニウム）ホスフェートおよびトリブチルアンモニウムオルトホスフェートは、本明細書またはＡ．ＫｏｒｅおよびＧ．Ｐａｒｍａｒ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍ．，３６：３３９３−３３９９，２００６（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）に教示されるように作製した。

キャップアナログを、^１Ｈ ＮＭＲおよび^３１Ｐ ＮＭＲ（Ｂｒuｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ），４００ＭＨｚによって分析した．^１Ｈを、４００．１４４６００６ＭＨｚで収集し、^３１Ｐを、１６１．９９６８５３１で収集し、両方ともＱＮＰプローブを使用した。質量分析法（すなわち、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｓｃｉｅｘ ＭＤＸ ＡＰＩ １５０モデル）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯモデル）ならびに分析用ＨＰＬＣ（Ａｌｉａｎｃｅ，Ｗａｔｅｒ’ｓ）を、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＳＡＸカラム、５μｍ、２５０×４．６ｍｍ（Ａｌｔｅｃｈ）を使用して実行した。

本教示の局面は、以下の実施例を鑑みてさらに理解され得る。この実施例は、いかなる場合においても本教示の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。

本教示は、種々の実施形態と組み合わせて記載されているが、本教示がこのような実施形態に限定されることを意図していない。それどころか、本教示は、当業者によって認識される種々の代替物、改変および等価物を包含する。

実施例１
７−メチルグアノシン５’−二リン酸の合成。攪拌棒を装着し、きれいでかつ乾燥した２０００ｍＬ丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、氷酢酸でｐＨを４．０に調整した２００ｍＬの水に、遊離酸または対イオン形態としてのナトリウムのいずれかで、乾燥し、微細に粉末化されたグアノシン５’−二リン酸（１）、（１０．０ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）をゆっくり溶解させる。次に、硫酸ジメチル（２０ｍＬ、１１９．０４ｍｍｏｌ）を、室温で一定に攪拌しながら、１時間にわたって添加し、そして反応を、さらに１時間続けさせた。この時間の間、ｐＨの低下が観察されたが、１０ ｍＭ ＮａＯＨを滴下して加えることによって、ｐＨをｐＨ３．８〜４．０の間に維持した。メチル化を、進行について分析用ＨＰＬＣによってモニタリングした。メチル化は、２時間以内に９８％完了したと測定された。２時間後、反応混合物を、ＣＨＣｌ_３（３×２００ｍＬ）で抽出し、反応しなかった過剰の硫酸ジメチルを除去した。

生じた水層を、さらにロータリーエバポレータによって蒸発させ、あらゆるクロロホルムの痕跡を除去し、さらに、次に水で１．５Ｌに希釈し、陰イオン交換樹脂（すなわち、ＢＰＧ １００カラムに充填されたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓａ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＧＥ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ））にロードした。ＢＰＧ（生物学的処理ガラス（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｇｌａｓｓ））１００の仕様：４００ｍｍの総容積（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）までＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓａ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ樹脂で充填した、１００／５００カラム（直径１００ｍｍおよび高さ５０ｃｍ）。ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ １００ ＦＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＧＥ）を使用し、１００ｍＬ／分の流量で、４総容積の０％〜８０％の勾配の１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液（重炭酸トリエチルアンモニウム）（ｐＨ７．５）を使用することによって所望の化合物を溶出した。４５％ ＴＥＡＢ緩衝液において、７−メチルグアノシン５’−二リン酸（ｍ^７ＧＤＰ）を、２５４ｎｍでの強力な紫外の吸光度を伴う大きなブロードなピークとして溶出した。残留する重炭酸塩を、メタノール（３×６００ｍＬ）と共に蒸発させることによって除去した。生じた残渣を、遠心分離管に移し、１．１Ｌ アセトンに溶解させた８．９ｇ 過塩素酸ナトリウムを添加し、２時間、４℃で冷却した。生じた混合物を遠心分離し、上清の液体を捨てた。沈殿物を、新規な部（ｐｏｒｔｉｏｎ）のアセトンで粉砕し、冷却し、遠心分離し、これを一回反復した。沈殿物を、減圧デシケーター内でＰ_２Ｏ_５によって乾燥させた。生じた非晶質の白色粉末は７メチル−グアノシン５’−二リン酸であった。Ｋｏｒｅ，Ａ．およびＰａｒｍａｒ，Ｇ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２５：３３７−３４０，２００６（この全体が、参考として援用される）から採用。

実施例２
ヌクレオシド−５’−二リン酸の合成
以下の手順はグアノシン−５’−二リン酸の合成を示すが、当業者は、アデノシン−５’−二リン酸、ウリジン−５’−二リン酸およびシチジン−５’−二リン酸ならびにそれらのアナログを合成するための手順を使用し得る。攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した５００ｍＬ 丸底フラスコにおいて、無水ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）中のグアノシン５’−一リン酸（１０．０ｇ、２１．５ｍｍｏｌ）のトリエチルアンモニウム塩を一緒に攪拌し、トリエチルアミン（２．４ｍＬ、１４２．８ｍｍｏｌ）を添加し、５分間攪拌し、その後、イミダゾール（５．８６ｇ、８６．１ｍｍｏｌ）、２，２’−ジチオジピリジン（７．４ｇ、３３．５８ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（８．９ｇ、３３．９ｍｍｏｌ）を添加した。攪拌を、２時間、室温で続けた。ＨＰＬＣによって測定されるように反応を完了させ、次に、アセトン（１５００ｍＬ）中の過塩素酸ナトリウム（７ｇ）の混合物にゆっくり注ぎ、その後、４℃で３０分間冷却した。反応混合物を遠心分離し、上清を捨てた。イミダゾールおよびトリフェニルホスフィンの痕跡を、固体を新規な部のアセトン（４００ｍＬ）で粉砕することによって除去し、冷却し、再度遠心分離し、そしてこれを一回反復した。沈殿物を、２４℃、真空オーブン内でＰ_２Ｏ_５によって乾燥させた（３０ｍｂａｒの圧力）。このようにして得たリボヌクレオシド−５’−ホスホロイミダゾリドを、ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒａｍｉｄｅ）（２００ｍＬ）に溶解させ、そしてジメチルホルムアミド（８０ｍＬ）中のトリブチルアンモニウムオルトホスフェートの１Ｍ溶液を、３０分間にわたって、激しく攪拌した混合物に滴下して加えた。塩化亜鉛（２ｇ、１４．６７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を、室温で３時間攪拌した。反応の完了を、ＨＰＬＣによってモニタリングした。反応混合物を、水（５０ｍＬ）でクエンチし、クロロホルムで抽出し（３×２００ｍＬ）、ロータリーエバポレータ内で濃縮し、次に陰イオン交換樹脂へ加えることによって精製した。

カラムクロマトグラフィによる精製を、ＸＫ ５０／６０カラム（直径５０ｍｍおよび長さ６０ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＧＥ）に充填したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ樹脂によって達成した。ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ １００ ＦＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＧＥ）を使用し、２０ｍＬ／分の流量で、４総容積の０％〜８０％の勾配の１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液（重炭酸トリエチルアンモニウム）（ｐＨ７．５）を使用することによって所望の化合物を溶出した。５５％のＴＥＡＢ緩衝液において、所望の産物（ヌクレオシド−５’−二リン酸）を、２５４ｎｍでの強力な紫外の吸光度を伴う大きなブロードなピークとして溶出した。ヌクレオシド−５’−二リン酸を含む画分をプールし、ロータリーエバポレータを使用して蒸発させ、所望の二リン酸化合物のトリエチルアミン塩を得た。Ａ．ＫｏｒｅおよびＧ．Ｐａｒｍａｒ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍ．（２００６）上記、から採用。

実施例３
３’−Ｏ−メチルグアノシン一リン酸（３’−Ｏ−Ｍｅ−ＧＭＰ）のＴＥＡ塩（化合物２）の合成
攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した５００ｍＬ 丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、トリメチルホスフェート(（ＯＭｅ）_３Ｐ）（５０ｍＬ）およびオキシ塩化リン（ＰＯＣｌ_３）（６ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴン下で攪拌を続けながら、０℃、少量で、乾燥し、かつ微細に粉末化された３’−Ｏ−Ｍｅ−グアノシン（１）（６ｇ、２０ｍｍｏｌ）をゆっくり添加する。混合物を０℃〜４℃に保ち、少なくとも１９時間攪拌した。ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を添加し、過剰なオキシ塩化リンを抽出し、同時に３’−Ｏ−メチルグアノシン−５’−ホスホロジクロリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｃｈｌｏｒｉｄａｔｅ）を沈殿させた。次に、これを、遠心分離によってペレットにし、水中の１００ｍＬ 氷冷５％ ＮａＨＣＯ_３に溶解させた。生じた水溶液を、１Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨ約１．５に調整した。さらに２０時間、０℃〜４℃で攪拌した後、ｐＨを７．０に調整し、生じた混合物を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５のカラムに加えた。カラムを、５ｍＭ ＴＥＡＢ緩衝液、ｐＨ７．５で洗浄し、次に、新規に調製した１Ｍ 重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。３’−Ｏ−Ｍｅ ＧＭＰ ＴＥＡ塩（２）を含む画分をプールし、乾燥するまで濃縮した。

実施例４
３’−Ｏ−Ｍｅ−ＧＭＰイミダゾリド（化合物３）の合成
攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した１Ｌ 丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、無水ＤＭＦ（１４４ｍＬ）をゆっくり添加し、トリエチルアミン（０．９３３ｍＬ、９．２３ｍｍｏｌ）を少なくとも５分間にわたって攪拌する。これに、アルゴン下で攪拌を続けながら、少量で、乾燥し、かつ微細に粉末化された３’−Ｏ−Ｍｅ−ＧＭＰ ＴＥＡ塩（２）（３．５ｇ、７．３４ｍｍｏｌ）を添加した。その後、イミダゾール（２．０５ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）、アルドリチオール（２．６５ｇ、１２．０２ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（３．１３ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応を、少なくとも２〜３時間、室温で攪拌した。この時間の間、反応物は可溶性になり、反応が透明な黄色を呈した。完了時に、攪拌を続けながら、過塩素酸ナトリウム（３．０ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）をアセトンに溶解させ、反応混合物にゆっくり加えた。次に、この混合物を２つの１Ｌ ｎａｌｇｅｎｅボトルに注ぎ、冷蔵庫内で−８０℃、３０分間冷却した。その後、この混合物を３０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離に供し、上清を捨てた。沈殿物を新規な部のアセトンで粉砕し、遠心分離した。この処理をさらに一回繰り返し、沈殿物を五酸化リンによって真空デシケーター内で乾燥させ、３’−Ｏ−Ｍｅ−ＧＭＰイミダゾリドを得た。

実施例５
３’Ｏ−Ｍｅ−ＧＤＰ ＴＥＡ塩（化合物４）の合成
トリス（トリエチルアンモニウム）ホスフェートリンカーの合成：
無水オルトリン酸（２２．５ｇ、２２９．５９ｍｍｏｌ）を、攪拌棒を装着した、きれいでかつオーブン乾燥させた２５０ｍＬフラスコ内の５０ｍＬの無水塩化メチレンに加えた。次に、トリブチルアミン（５４．６ｍＬ、２２９．６ｍｍｏｌ）を、３０分間にわたり、添加漏斗を介してこの溶液に滴下して加えた。この混合物を１時間攪拌させた。次に、ＣＨ_２Ｃｌ_２を蒸発させ、反応残渣を３×３０ｍＬの無水ピリジン、そして次に２×３０ｍＬの無水ＤＭＦとともに同時に蒸発させた。トリス（トリエチルアンモニウム）ホスフェートリンカー産物を１ Ｍの最終濃度になるように１００ｍＬ 無水ＤＭＦに溶解させ、４℃、４Å モレキュラーシーブ上で保存した。

攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した１Ｌ 丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）をゆっくり加え、少なくとも５分間攪拌した。これに、アルゴン下で攪拌を続けながら、少量で、微細に粉末化された３’−Ｏ−Ｍｅ−ＧＭＰ イミダゾリド（３）（３．０ｇ、７．０４ｍｍｏｌ）を添加した。内容物が溶解するまで塩化亜鉛（２．０ｇ、１４．６７ｍｍｏｌ）を少量で加えた。その後、トリス（トリエチルアンモニウム）ホスフェートリンカーおよび１Ｍ トリブチルアンモニウムオルトホスフェート（４０ｍＬ）を、アルゴン下で反応混合物にゆっくり加え、反応を室温で５時間攪拌した。次に、反応を、ＨＰＬＣに供し、このＨＰＬＣは、出発材料、３’−Ｏ−Ｍｅ−ＧＭＰ イミダゾリド（３）のその対応する二リン酸塩への完全な変換を示した。完了時に、反応に水（１００ｍＬ）を補充し、反応物混合物をクロロホルム（３×２５０ｍＬ）で溶出し、蒸発による容積低減（ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）（約１００ｍＬ）に供し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５カラムに加え、新規に調製した１Ｍ ＴＥＡＢ、ｐＨ７．５の直線勾配で溶出した。純粋な３’Ｏ−Ｍｅ−ＧＤＰ ＴＥＡ塩（化合物４）を含む画分を溶出し、合わせて、乾燥するまで蒸発させた。

実施例６
ｍ_２ ^{７，３’Ｏ}ＧＤＰ（化合物５）の合成
１００ｍＬのヌクレアーゼを含まない水中の３’−Ｏ−Ｍｅ−ＧＤＰ ＴＥＡ塩（４）（４．０ｇ、６．１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、濃縮した氷酢酸をゆっくり加え、溶液のｐＨを４．０に調整した； ５０ｍＭ ＮａＯＨを用いてｐＨ約４．０〜４．５を維持しながら、硫酸ジメチル（（Ｍｅ）_２ＳＯ_４）（２０ｍＬ、２１０ｍｍｏｌ）を、６０分間にわたってゆっくり滴下して加えた。反応を、室温で２時間攪拌し、メチル化をＨＰＬＣによってモニタリングした。２時間後、反応混合物をＣＨＣｌ_３（３×２５０ｍＬ）で抽出して、未反応の硫酸ジメチルを除去した。水層をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに加え、産物を含む画分をプールし、蒸発させて、五酸化リンにより真空デシケーター内で乾燥させ、３’−Ｏ−Ｍｅ（Ｎ^７−Ｍｅ）ＧＤＰ（化合物５）を微細な粉末として得た。

実施例７
ｍ_２ ^{７，３’Ｏ}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ（化合物７）の合成
攪拌棒を装着した、きれいでかつ乾燥した１Ｌ 丸底フラスコにおいて、アルゴン流の下で、無水ＤＭＦ（１６５ｍＬ）をゆっくり添加し、攪拌した。これに、アルゴン下で攪拌を続けながら、少量で、微細に粉末化された３’−Ｏ−Ｍｅ−ＧＤＰ ＴＥＡ塩（５）（４．０ｇ、５．８４ｍｍｏｌ）を添加した。内容物が溶解するまで、塩化亜鉛（２．０ｇ、１４．６７ｍｍｏｌ）を少量で加えた。その後、イミダゾリドＧＭＰ（化合物６）（６．００ｇ、１４．０８ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で反応混合物にゆっくり加えた。反応を室温で攪拌し、メチル化をＨＰＬＣによってモニタリングした。出発材料（３’−Ｏ−Ｍｅ−ＧＤＰ ＴＥＡ塩）の完全な消失時に、反応を水（２００ｍＬ）中のＥＤＴＡ（３．０ｇ）の溶液に注ぎ、ｐＨを飽和ＮａＨＣＯ_３によって７．０に調整した。次に、これをＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに加え、新規に調製した１Ｍ ＴＥＡＢ、ｐＨ７．５の直線勾配によって溶出した。産物を含む画分をプールし、蒸発および乾燥させて、純粋な３’−Ｏ−Ｍｅ−Ｎ７−Ｍｅ−Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇ（化合物７）を得、−２０℃で保存した。

実施例８ ｍ_２ ^{７，３’Ｏ}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ^７Ｇ（化合物８）の合成
５．０ｍＬの水中の化合物７（５００ｍｇ、０．６１２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、濃縮した氷酢酸をゆっくり加え、溶液のｐＨを４．０に調整し、そして、５０ｍＭ ＮａＯＨでｐＨ約４．０〜４．５に維持しながら、この混合物に、硫酸ジメチル（２．０ｍＬ、２１．１ｍｍｏｌ）を、６０分間にわたってゆっくりと滴下して加えた。反応を、２時間、室温で攪拌し、メチル化をＨＰＬＣによってモニタリングした。２時間後、反応混合物をＣＨＣｌ_３（３×５０ｍＬ）で抽出して、未反応の硫酸ジメチルを除去した。水層を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに加え、産物を含む画分をプールし、蒸発および乾燥させて、純粋なトリメチル化ＣＡＰ（ｍ２７，３’ＯＧ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ７Ｇ）（化合物８）を得た。その後、これを、Ｓｔｒａｔａ ＡＷカラムを通過させて、その塩を除去し、遊離酸形態にした。

実施例９
２’Ｆ ＧＭＰ（化合物１４）の合成：
窒素雰囲気下、０℃で、ＰＯＣｌ_３（３．９７ｇ、２６．３ｍｍｏｌ）および（ＯＭｅ）_３Ｐ（２０．０ｍＬ）の攪拌溶液に、２’−フルオログアノシン（２．５ｇ、８．７７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２時間、０℃で攪拌した。２時間後、５０．０ｍＬの水を反応混合物に添加した。生じた反応混合物を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄し、リン酸化剤を除去した。集めた水溶液を、１Ｎ ＮａＯＨによって滴下してｐＨ１．５に調整し、４℃で１２時間攪拌した。１２時間後、この水溶液を、ローターエバポレータの下で約２０ｍＬまで濃縮した。０℃で、遠心分離管内で、１００ｍＬのアセトン中の過塩素酸ナトリウム（３．０ｇ）へ、この濃縮溶液（２０．０ｍＬ）を２分間にわたりゆっくり添加した。生じた混合物を遠心分離し、上清の液体を除去した。この沈殿物を５００ｍＬの水に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ_３によってｐＨを５．５に調整し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにロードした。所望の産物を、０Ｍ〜１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液、ｐＨ７．５の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、五酸化リン（Ｐ_２Ｏ_５）によって真空デシケーター内で乾燥させ、微細な白色粉末として２’Ｆ ＧＭＰ（化合物１４）（収量：３．５４ｇ、８７％）を得た。

実施例１０
イミダゾリド２’Ｆ ＧＭＰ（Ｉｍ２’Ｆ ＧＭＰ）（化合物１５）の合成：
５０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の２’Ｆ ＧＭＰ ＴＥＡ塩１４（２．０ｇ、４．３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液へ、イミダゾール（１．５０ｇ、２１．５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ_３）（２．２６ｇ、８．６ｍｍｏｌ）、アルドリチオール（１．９０ｇ、８．６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．４３ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、窒素雰囲気下、室温で５時間攪拌した。０℃、遠心分離管内で、１００ｍＬアセトン中の過塩素酸ナトリウム（２．０ｇ）の溶液へ、上記の反応混合物を５分間にわたりゆっくり添加した。生じた混合物を遠心分離し、上清の液体を除去した。固体を、新規な部のアセトン（１００ｍＬ）によって粉砕し、冷却し、再度遠心分離した。この処理を二回繰り返し、生じた固体をＰ_２Ｏ_５によって真空デシケーター内で乾燥させ、白色の粉末としてイミダゾリド２’Ｆ ＧＭＰ（化合物１５）（収量：１．４４ｇ、８１％）を得た。

実施例１１
２’Ｆ ＧＤＰ（化合物１６）の合成：
１０．０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中のイミダゾリド２’Ｆ ＧＭＰ １５（１．２ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）および塩化亜鉛（０．３８ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液へ、ＤＭＦ中の１８ｍＬの１Ｍ トリス（トリエチルアンモニウム）ホスフェート（トリス（Ｅｔ_３ＮＨ）_３ＰＯ_４）を、窒素雰囲気下で加えた。反応混合物を、室温で３時間攪拌した。３時間後、反応混合物を５０．０ｍＬの水で希釈した。生じた反応混合物を酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄し、リン酸化剤を除去した。収集した水溶液を、飽和ＮａＨＣＯ_３によってｐＨ５．５に調整し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにロードした。所望の産物を、０Ｍ〜１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液、ｐＨ７．５の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、五酸化リンによって真空デシケーター内で乾燥させ、微細な白色粉末として２’Ｆ ＧＤＰ（化合物１６）（収量 １．３４ｇ、７２％）を得た。

実施例１２
ｍ^{７，２’Ｆ}ＧＤＰ（化合物１７）の合成：
２０．０ｍＬの水中の２’Ｆ ＧＤＰ １６（０．７５ｇ、１．１６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液へ、酢酸をゆっくり添加し、溶液のｐＨを４．０に調整した。この混合物へ、硫酸ジメチル（３．０ｍＬ）を、３０分間にわたって滴下して加え、反応混合物を、室温で、４時間攪拌した。メチル化が進行するにつれて、ｐＨが、約ｐＨ２．０に低下し、１Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨ４．０へ再び調整した。４時間後、反応混合物をＣＨＣl３（３×５０ｍＬ）で抽出し、未反応の過剰な硫酸ジメチルを除去した。収集した水溶液を、飽和ＮａＨＣＯ_３によってｐＨ５．５に調整し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに加えた。最終産物を、ＨＰＬＣ？？によってメチル化についてモニタリングし、０Ｍ〜１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液、ｐＨ７．５の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、五酸化リンによって真空デシケーター内で乾燥させ、微細な白色粉末としてｍ^{７，２’Ｆ}ＧＤＰ（化合物１７）（収量 ０．６４ｇ、８３％）を得た。

実施例１３
ｍ^{７，２’Ｆ}ＧｐｐｐＧ（化合物１８）の合成：
１０．０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中のｍ^{７，２’Ｆ}ＧＤＰ １７（０．２ｇ、０．３ｍｍｏｌ）およびイミダゾリドＧＭＰ（ＩｍＧＭＰ）（０．１９ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液へ、塩化亜鉛（８１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で添加し、反応混合物を、室温で１時間攪拌した。１時間後、反応混合物を、０℃で、１００．０ｍＬの水中のＥＤＴＡ二ナトリウム（０．４５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。生じた水溶液を、飽和ＮａＨＣＯ_３によってｐＨ５．５へ調整し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにロードした。所望の産物を、０Ｍ〜１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液、ｐＨ７．５の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、化合物１８の１０．０ｍＬ ＴＥＡ塩へ濃縮した。生じた１０．０ｍＬをＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに通過させ、１０．０ｍＬの水、次に１０．０ｍＬのＭｅＯＨによって洗浄した。その後、化合物１８を、１５．０ｍＬのＮＨ_４ＯＨ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（２／２５／７３）によって溶出し、収集した溶液を、蒸発および乾燥させ、微細な白色粉末としてｍ^{７，２’Ｆ}ＧｐｐｐＧ（化合物１８）（収量：０．１５ｇ、５８％）を得た。

ＨＰＬＣ分析：出発時のイミダゾリドは３．４９分でのピークを与え、ＧＤＰのピークは５．９５分であった。新規な産物のピークは７．１３分であった。１時間後の粗製の反応混合物は、９７％の産物のピーク（７．１４分）および３％の出発材料のピーク（５．９５分）を与えた。

実施例１４

ｍ^{７，２’−Ｆ}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ^７Ｇ（化合物２０）の合成：
１０．０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中のｍ^{７，２’Ｆ}ＧＤＰ １７（０．２５ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）およびイミダゾリドｍ^７ＧＭＰ（ｍ^７−ＩｍＧＭＰ）（０．２４ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液へ、塩化亜鉛（０．１０ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で添加し、反応混合物を、室温で６時間攪拌した。６時間後、反応混合物を、０℃で、１００．０ｍＬの水中のＥＤＴＡ二ナトリウム（０．５７ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。生じた水溶液を、飽和ＮａＨＣＯ_３によってｐＨ５．５へ調整し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにロードした。所望の産物を、０Ｍ〜１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液、ｐＨ７．５の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、化合物２０の１０．０ｍＬ ＴＥＡ塩へ濃縮した。生じた１０．０ｍＬをＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに通過させ、１０．０ｍＬの水、次に１０．０ｍＬのＭｅＯＨによって洗浄した。その後、化合物２０を、１５．０ｍＬのＮＨ_４ＯＨ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（２／２５／７３）によって溶出し、収集した溶液を、蒸発および乾燥させ、微細な白色粉末としてｍ^{７，２’−Ｆ}Ｇｐｐｐｍ^７Ｇ（化合物２０）（収量：０．２１ｇ、６４％）を得た。

実施例１５

ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ^２’ＯＧ（化合物２３）の合成：
１０．０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中のｍ_２ ^{７，２’Ｏ}ＧＤＰ（Ｎ７Ｍｅ２’Ｏ−ＭｅＧＤＰ） ２１（０．２２ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）およびイミダゾリドｍ^２’Ｏ［ＧＭＰ（Ｉｍ２’Ｏ−ＭｅＧＭＰ） ２２（０．１４ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液へ、塩化亜鉛（０．０９ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で加え、反応混合物を室温で２時間攪拌した。２時間後、反応混合物を、０℃で１００．０ｍＬの水中のＥＤＴＡ二ナトリウム（０．４９ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。生じた水溶液を、飽和ＮａＨＣＯ_３によってｐＨ５．５に調整し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにロードした。所望の産物を、０Ｍ〜１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液、ｐＨ７．５の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、化合物２３の１０．０ｍＬ ＴＥＡ塩へ濃縮した。生じた１０．０ｍＬをＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに通過させ、１０．０ｍＬの水、次に１０．０ｍＬのＭｅＯＨによって洗浄した。その後、化合物２３を、１５．０ｍＬのＮＨ_４ＯＨ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（２／２５／７３）によって溶出し、収集した溶液を、蒸発および乾燥させ、微細な白色粉末としてｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ^２’ＯＧ（化合物２３）（収量：０．１８ｇ、６３％）を得た。

実施例１６

ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ（化合物２５）の合成：
１０．０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中のｍ_２ ^{７，２’Ｏ}ＧＤＰ（Ｎ７Ｍｅ２’−Ｏ−ＭｅＧＤＰ） ２１（０．１８ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）およびイミダゾリドｍ_２ ^{７，２’Ｏ}ＧＭＰ（Ｉｍ Ｎ７Ｍｅ−２’−Ｏ−ＭｅＧＭＰ） ２４（０．１８ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液へ、塩化亜鉛（０．０７ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で添加し、反応混合物を、室温で６時間攪拌した。６時間後、反応混合物を、０℃で１００．０ｍＬの水中のＥＤＴＡ二ナトリウム（０．４０ｇ、１．０８ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。生じた水溶液を、飽和ＮａＨＣＯ_３によってｐＨ５．５に調整し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにロードした。所望の産物を、０Ｍ〜１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液、ｐＨ７．５の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、化合物２５の１０．０ｍＬ ＴＥＡ塩へ濃縮した。生じた１０．０ｍＬをＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに通過させ、１０．０ｍＬの水、次に１０．０ｍＬのＭｅＯＨによって洗浄した。その後、化合物２５を、１５．０ｍＬのＮＨ_４ＯＨ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（２／２５／７３）によって溶出し、収集した溶液を、蒸発および乾燥させ、微細な白色粉末としてｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ（化合物２５）（収量：０．１３ｇ、５４％）を得た。

実施例１７

ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ^７Ｇ（化合物２６）の合成：
１０．０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中のｍ_２ ^{７，２’Ｏ}ＧＤＰ（Ｎ７Ｍｅ２’−Ｏ−ＭｅＧＤＰ） ２１（０．２０ｇ、０．３ｍｍｏｌ）およびイミダゾリドｍ^７ＧＤＰ（ＩｍＮ^７ＭｅＧＭＰ）（０．１９ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液へ、塩化亜鉛（０．０８ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で添加し、反応混合物を、室温で６時間攪拌した。６時間後、反応混合物を、０℃で１００．０ｍＬの水中のＥＤＴＡ二ナトリウム（０．４５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。生じた水溶液を、飽和ＮａＨＣＯ_３によってｐＨ５．５に調整し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにロードした。所望の産物を、０Ｍ〜１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液、ｐＨ７．５の直線勾配を使用して溶出し、産物を含む画分をプールし、蒸発させ、化合物２６の１０．０ｍＬ ＴＥＡ塩へ濃縮した。生じた１０．０ｍＬをＳｔｒａｔａ−Ｘ−ＡＷカラムに通過させ、１０．０ｍＬの水、次に１０．０ｍＬのＭｅＯＨによって洗浄した。その後、化合物２６を、１５．０ｍＬのＮＨ_４ＯＨ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（２／２５／７３）によって溶出し、収集した溶液を、蒸発および乾燥させ、微細な白色粉末（化合物２６）（収量：０．１６ｇ、６２％）を得た。

実施例１８ Ｔ７ ＲＮＡ転写：
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写を、２０μＬの最終容積でｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用することにより実行し、この転写は、示される最終濃度で以下の試薬を含む：１μｇの直線化したＡｍｂＬｕｃポリＡ ＤＮＡ、１×反応緩衝液、７．５ｍＭの各ＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ、１．５ｍＭ ＧＴＰ、６．５ｍＭのｍＣＡＰおよび２’フルオロキャップアナログ、ならびに５０Ｕ／μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。転写反応を、３７℃で２時間インキュベートした。残存するプラスミドＤＮＡを加水分解するために、１μＬのｔｕｒｂｏ ＤＮＡｓｅを反応混合物に添加し、さらに、３７℃で１５分間インキュベートした。転写された、キャップされたｍＲＮＡおよびキャップされていないｍＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ^ＴＭキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用することによって精製した。

ＡｍｂＬｕｃ ポリ（Ａ）（Ａｍｂｉｏｎ）、転写は、改変されたキャップアナログおよび標準的なキャップアナログについて匹敵する収量を生成した（図５および６を参照のこと）。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒアッセイは、全てのｍＲＮＡが分解されず、高い完全性を保持することを示す（図７を参照のこと）。

実施例１９ 翻訳アッセイ：
ＨｅＬａ細胞を用いたトランスフェクション後の種々の時点における、ｍＣＡＰ、二重メチル化、三重メチル化およびＡＲＣＡキャップされたルシフェラーゼＲＮＡからのタンパク質発現は、三重メチル化キャップを含む転写物が、トランスフェクトされた細胞においてより多く翻訳されることを示す。ｍＣＡＰおよび二重メチル化キャップによるタンパク質発現の比較は、ＨｅＬａ細胞によるインビボにおいて二重メチル化キャップ転写物が、１倍のタンパク質を生成するが、ＡＲＣＡは、３倍のタンパク質を生成し、そして三重メチル化キャップは、４倍のタンパク質を生成することを示唆する。図９を参照のこと。

試験した全ての改変キャップ化合物は、ゲルシフトアッセイによって決定されるように、Ｔ７ポリメラーゼの基質である。このゲルシフトアッセイは、キャップされていないＲＮＡに比べてより遅い移動に基づいて、キャップされたＲＮＡが形成されたことを明確に明らかにする（図８および１０を参照のこと）。

上記の実施例は、特定のキャップアナログを記載するが、また本発明を実施することにおいて作用する、想定されるさらなるキャップアナログが存在し、これらは、以下に示される：

実施例２０
ｍ^{７，２’Ｆ}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］^２’ＦＧおよびｍ^{７，２’Ｆ}Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］ｍ^{７，２’Ｆ}Ｇを作製するためのスキーム

触媒としてＺｎＣｌ_２の存在下での、ｍ^{７，２’Ｆ}ＧＤＰ（Ｎ７Ｍｅ−２’ＦＧＤＰ）とイミダゾリド^２’ＦＧＭＰ（Ｉｍ２’ＦＧＭＰ）またはイミダゾリドｍ^{７，２’Ｆ}ＧＭＰ（Ｎ７ＭｅＩｍ２’ＦＧＭＰ）とのカップリング反応は、対応するキャップアナログＡおよびＢを得る。

特定の実施形態および実施例に関して本開示が記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変を行うことができる。

Claims (49)

1. を含む組成物であって、ここで、
   Ａは、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、Ｈ、ｔ−ブチルジメチルシリルおよび２’，３ ’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され；
   Ｂは、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＮＨ_２、Ｎ_３、ＮＯ_２、ＣＦ_３、ＣＨＯ、Ｓ、ｔ−ブチルジメチルシリル、ＬＮＡおよび２’，３ ’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され；
   Ｒ_１はＣＨ_３であるかまたは存在せず；
   Ｒ_２はＯＨ、ＯＣＨ_３およびハロゲンから選択され；
   ｎは１、２または３であり；かつ
   ＢがＯＨまたはＯＣＨ_３であり、Ｒ_１が存在せず、Ｒ_２がＯＨである場合、ＡはＯＨでもＯＣＨ_３でもなく、Ａ、ＢおよびＲ_２がＯＨである場合、Ｒ_１はＣＨ_３ではない、
   組成物。
2. Ａがフッ素である、請求項１に記載の組成物。
3. Ｂがフッ素である、請求項１に記載の組成物。
4. Ｒ_２がフッ素である、請求項１に記載の組成物。
5. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項１に記載の組成物。
6. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項２に記載の組成物。
7. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項３に記載の組成物。
8. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項４に記載の組成物。
9. Ａが、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、Ｈ、ｔ−ブチルジメチルシリルおよび２’−３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され；
   Ｂが、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＮＨ_２、Ｎ_３、ＮＯ_２、ＣＨＯ、Ｓ、ｔ−ブチルジメチルシリル、ＬＮＡおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され；
   Ｒ_１が存在せず；
   Ｒ_２がＯＨ、ＯＣＨ_３およびハロゲンから選択され；
   ｎは１、２または３であり；そして
   ＡがＯＨまたはＯＣＨ_３である場合、Ｒ_２はＯＨではない、
   請求項１に記載の組成物。
10. Ａがフッ素である、請求項９に記載の組成物。
11. Ｂがフッ素である、請求項９に記載の組成物。
12. Ｒ_２がフッ素である、請求項９に記載の組成物。
13. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項９に記載の組成物。
14. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項１０に記載の組成物。
15. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項１１に記載の組成物。
16. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項１２に記載の組成物。
17. Ａが、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、Ｈ，−および２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され；
    Ｂが、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＮＨ_２、Ｎ_３、ＮＯ_２、ＣＨＯ、ＬＮＡおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され；
    Ｒ_１がＣＨ_３であり；
    Ｒ_２がＯＨ、ＯＣＨ_３およびハロゲンから選択され；
    ｎが１、２または３であり；そして
    ＡがＯＨである場合、Ｒ_２はＯＨではない、
    請求項１に記載の組成物。
18. Ａがフッ素である、請求項１７に記載の組成物。
19. Ｒ_２がフッ素である、請求項１７に記載の組成物。
20. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項１７に記載の組成物。
21. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項１８に記載の組成物。
22. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項１９に記載の組成物。
23. ＡがＯＨおよびＯＣＨ_３から選択され；
    ＢがＯＨおよびＯＣＨ_３から選択され、；
    Ｒ_１がＣＨ_３であり；
    Ｒ_２がＯＣＨ_３であり；そして
    ｎが１、２または３である、
    請求項１に記載の組成物。
24. ＡがＯＨであり、ＢがＯＣＨ_３である、請求項２３に記載の組成物。
25. ＡがＯＣＨ_３であり、ＢがＯＨである、請求項２３に記載の組成物。
26. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項２３に記載の組成物。
27. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項２４に記載の組成物。
28. ＲＮＡ分子の５’末端に結合した、請求項２５に記載の組成物。
29. ＲＮＡ転写物をキャップするためのキットであって、該キットは：
    ａ）構造：
    を有するキャップアナログであって、ここで、
    Ａは、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、Ｈ、ｔ−ブチルジメチルシリルおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され；
    Ｂは、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＮＨ_２、Ｎ_３、ＮＯ_２，ＣＦ_３、ＣＨＯ、Ｓ、ｔ−ブチルジメチルシリル、ＬＮＡおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択され；
    Ｒ_１はＣＨ_３であるかまたは存在せず；
    Ｒ_２がＯＨ、ＯＣＨ_３およびハロゲンから選択され；
    ｎは１、２または３であり；かつ
    ＢがＯＨまたはＯＣＨ_３であり、Ｒ_１が存在せず、Ｒ_２がＯＨである場合、ＡはＯＨでもＯＣＨ_３でもなく、Ａ、ＢおよびＲ_２がＯＨである場合、Ｒ_１はＣＨ_３ではない、
    キャップアナログ、ならびに
    ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ、
    を含む、キット。
30. ジヌクレオチドキャップアナログを合成する方法であって、該方法は：
    ａ）リボース環上に２’置換基および３’置換基のうちの少なくとも１つを含む第一のヌクレオシドを提供する工程、
    ｂ）該第一のヌクレオシドをリン酸化して、第一のヌクレオチドを形成する工程、
    ｃ）該第一のヌクレオチドをメチル化する工程、
    ｄ）必要に応じて２’リボース環置換基を含む、リン酸化された第二のヌクレオチドを添加する工程、ならびに
    ｅ）該第一のヌクレオチドと該第二のヌクレオチドを連結して、ジヌクレオチドキャップアナログを形成する工程、
    を包含する、方法。
31. 前記リボース環が、その２’位に置換基を含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記２’置換基が、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、Ｈ、ｔ−ブチルジメチルシリルおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択される、請求項３１に記載の方法。
33. 前記ハロゲンがフッ素である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記リボース環が、その３’位に置換基を含む、請求項３０に記載の方法。
35. 前記３’置換基が、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＮＨ_２、Ｎ_３、ＮＯ_２、ＣＦ_３、ＣＨＯ、Ｓ、ｔ−ブチルジメチルシリル、ＬＮＡおよび２’，３’−Ｏ−イソプロピリデンから選択される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記ハロゲンがフッ素である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記工程ｅ）にｆ）前記第二のヌクレオチドをメチル化する工程が続く、請求項３０に記載の方法。
38. 前記第一のヌクレオシドがグアノシンである、請求項３０に記載の方法。
39. 工程ｃ）が、前記ヌクレオチドのＮ７位をメチル化することを含む、請求項３８に記載の方法。
40. 前記第二のヌクレオチドがグアニル酸である、請求項３０に記載の方法。
41. 前記第二のヌクレオチドの前記２’置換基が、ハロゲン、ＯＨまたはＣＨ_３である、請求項３０に記載の方法。
42. 前記ハロゲンがフッ素である、請求項４１に記載の方法。
43. ｆ）前記第二のヌクレオチドをメチル化する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
44. 工程ｆ）が、Ｎ７位をメチル化することを含む、請求項４３に記載の方法。
45. 前記連結する工程が、ＺｎＣｌ_２によって触媒される、請求項３０に記載の方法。
46. ヌクレオチドをさらに含む、請求項２９に記載のキット。
47. リボヌクレアーゼインヒビターをさらに含む、請求項２９に記載のキット。
48. 酵素緩衝液をさらに含む、請求項２９に記載のキット。
49. ヌクレオチド緩衝液をさらに含む、請求項２９に記載のキット。