JP2008538901A - 癌胎児性抗原未熟型ラミニンレセプタータンパク質から誘導されるｈｌａ−２提示ｔ細胞エピトープの同定およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は免疫療法、ならびに免疫療法で使用する分子と細胞に関する。特に、本発明は、癌、特に血液の悪性腫瘍を含むいくつかの腫瘍の免疫療法に関する。本発明はさらに、単独またはその他腫瘍関連ペプチドと組み合わせた、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性薬理成分として機能する腫瘍関連Tヘルパー細胞ペプチドエピトープに関する。特に、本発明は、抗腫瘍免疫応答を誘引するためのワクチン組成物に使用可能な、ヒト胎児性抗原未熟型ラミニンレセプター（OFA/iLR）のHLAクラスIまたはII分子由来の２つの新規なペプチド配列に関する。
【選択図】 図３Ａ

Description

本発明は、免疫療法および免疫療法に用いられる分子と細胞に関する。より詳細には、本発明は、癌、特に血液の悪性腫瘍を含むいくつかの腫瘍の免疫療法に関する。本発明はさらに、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬成分として機能する、単独または他の腫瘍関連ペプチドと組み合わせた、腫瘍関連Tヘルパー細胞ペプチドエピトープに関する。特に、本発明は、ヒト癌胎児性抗原未熟型ラミニンレセプター（OFA/iLR）のクラスIまたはIIのHLA分子から誘導された、抗腫瘍免疫応答を誘発するためのワクチンや他の医薬組成物に使用可能な、２つの新規なペプチド配列に関する。

本発明の目的のために、ここで引用する全ての参考文献はその全体を参照として組み入れる。

免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外的要素として認識される抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見により、腫瘍の成長に干渉するために宿主の免疫系を用いる可能性が現在高まってきている。体液性および細胞性の両方の免疫系を利用する様々な機構が、癌免疫療法のために現在調査されている。

細胞の免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を明確に認識して破壊する能力を有する。細胞毒性T細胞（CTL）の腫瘍浸潤細胞集団から、あるいは周辺血液からの単離は、そのような細胞が、癌に対する自然な免疫防御において重要な役割を果たすことを示唆している（Cheeverら、Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112; Rosenberg SA. Shedding light on immunotherapy for cancer. N Engl J Med. 2004 Apr 1;350(14):1461-3）。特に、核または細胞質ゾル内に存在するタンパク質、あるいは欠陥リボソームタンパク質（DRIP）に由来する通常8〜10残基の主要組織適合性抗原複合体（MHC）クラスI分子拘束性ペプチドを認識するCD8陽性T細胞（TCD8⁺）は、この応答において重要な役割を果たす。DRIPは、ペプチドの必須源であり、リボソームにおける不完全な翻訳生成物を構築するが、これはJ. Yedellのグループによって初めて説明された（Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR. Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes. Nature. 2000 Apr 13;404(6779):770-4）。ヒトのMHC分子はまた、ヒト白血球抗原（HLA）としても定義される。

MHC分子の主要な分類は２つあり、これらはT細胞レセプター担持T細胞により認識されうる：内因性タンパク質および大型ペプチドのタンパク分解によって生じるペプチドを与える核を有する多くの細胞上に見られるMHC I分子。MHC II分子は、マクロファージ、樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞（APC）上、B細胞上、内皮細胞上、ならびに、腫瘍および腫瘍間質の変質細胞上に見られ、これらは通常の環境下ではMHCクラスII分子をその細胞表面上に発現することはなく、エンドサイトーシスの過程でAPCによって取り込まれるか、さもなければ、MHCクラスII区画（MIIC）に入る外因性タンパク質を抑えるいずれかのペプチドを提示し、続いて加工されてMHCクラスII複合体上に載せられる。ペプチドとMHC Iの複合体は、CD8陽性細胞毒性Tリンパ球によって認識され、ペプチドとMHC IIの複合体は、CD4陽性ヘルパーT細胞によって認識される（概して、Charles A., Jr. Janeway, Paul Travers, Mark Walport, Mark J. ShlomchikによるImmunobiology中で説明されている）。

ペプチドが細胞免疫応答を引き出すためには、MHC分子に結合させなければならない。この工程は、MHC分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多形現象に依存する。MHCクラスI結合ペプチドは、通常8〜10残基の長さであり、配列中に対応するMHC分子の結合溝と相互反応する２つの保存残基（「アンカー」）を含む（Immunogeneticsで発表されたような第２のリスト（Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI：MHCリガンドおよびペプチドモチーフのためのデータベース、Immunogenetics. 1999 Nov、50(3-4): 213-9）参照）。

腫瘍細胞を特異的に認識し、かつ養子免疫後に治療活性を有するマウスとヒトの両方のTCD8⁺の多数の例が現在あるが、いくつかのケースでは完全な寛解が誘導される。しかしながら、T細胞の腫瘍を根絶する潜在能力にも関わらず、多くの腫瘍がin vivoでのTCD8⁺による認識を逃れることは多くの癌の進行的成長から明らかである。様々な腫瘍が免疫原性であることが発見されたが、有効な抗腫瘍免疫応答の刺激は実証することが難しい：最新の証拠では、免疫法により腫瘍関連ペプチドに対する強力なT細胞の応答を導くことができることが示されている（Speiser DE, Lienard D, Rufer N, Rubio-Godoy V, Rimoldi D, Lejeune F, Krieg AM, Cerottini JC, Romero P. ペプチドを有するワクチン、IFA、CpGオリゴデオキシヌクレオチド7909に対する急速かつ強力なヒトCD8陽性T細胞応答、J Clin Invest. 2005 Mar、115(3):739-46. Schag K, Schmidt SM, Muller MR, Weinschenk T, Appel S, Weck MM, Grunebach F, Stevanovic S, Rammensee HG, Brossart P 細胞毒性Ｔリンパ球によって認識される広範に発現された腫瘍関連抗原としてのC-met腫瘍誘発遺伝子の同定、Clin Cancer Res. 2004 Jun 1;10(11):3658-66）。

腫瘍特異的な細胞毒性Tリンパ球によって認識される抗原、すなわちエピトープは、酵素、レセプター、転写因子などの全てのタンパク質類に由来する分子であり得る。MHCクラスIまたはクラスII分子に結合する、あるいはそれらから溶出したペプチドの包括的リストは、www.syfpeithi.org.に見られる。さらに、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞中にのみ、、例えば変異遺伝子の生成物として存在することができる。良い例としては、K-ras、BCR-ablおよび変異p53由来のT細胞エピトープとして作用するMHCクラスIリガンドである。腫瘍関連抗原のもう１つの重要な分類は、異なる種類の腫瘍ならびに健常精巣組織中で発現するCT（「精巣癌」）抗原などの組織特異的な構造である。MHC分子ステムに結合する他の腫瘍関連ペプチドは遺伝子由来であり、同じ臓器や組織の健常細胞、さらには、その他の組織由来の健常細胞と比べて癌細胞でコピー数が多く発現する。例えばC-metについては、Schag K, Schmidt SM, Muller MR, Weinschenk T, Appel S, Weck MM, Grunebach F, Stevanovic S, Rammensee HG, Brossart P.細胞毒性Ｔリンパ球によって認識される広範に発現された腫瘍関連抗原としてのC-met腫瘍誘発遺伝子の同定、Clin Cancer Res.2004 Jun 1;10(11):3658-66を参照のこと。他の腫瘍関連ペプチドは保持されており分泌されない腫瘍細胞中の抗原に由来する（例えば、ムチン遺伝子ファミリー由来のタンパク質）。その他の源は、異常な転写物（フレームシフト）、後転写タンパク質−タンパク質融合の結合部位由来のペプチドであり得る。科学文献に記載されている腫瘍関連抗原の包括的リストは、www.cancerimmunity.orgにて見られる。

様々な腫瘍関連抗原が同定されている。また、さらなる腫瘍関連抗原を同定するべく、多大な研究が鋭意行われてきた。腫瘍関連抗原、当技術分野では腫瘍特異的抗原とも称すが、これらのいくつかのグループは組織特異性である。例としては、これらに限定されるものではないが、メラノーマに関するチロシナーゼ、前立腺癌に関するPSAおよびPSMA、ならびにリンパ腫内のbcr/ablなどの染色体クロスオーバーなどが包含される。しかしながら、同定された多くの腫瘍関連抗原は複数の種類の腫瘍中で生じ、そのいくつか、例えば発癌タンパク質および／または腫瘍抑制遺伝子（腫瘍抑制遺伝子は、例えば、Linehan WM, Walther MM, Zbar B 腎臓の癌の遺伝学的基礎、J Urol. 2003 Dec；170(6 Pt 1):2163-72中の腎癌に書かれている）は、実際には形質転換の事象を引き起こし、ほぼ全ての種類の腫瘍で生じる。ヒトの癌の遺伝学的発生のさらなる一般的総説は、Bert Vogelstein, Kenneth W. Kinzler ヒトの癌の遺伝学的基礎、2002、に見られる。例えば、p53（腫瘍抑制遺伝子の一例である）、ras、c-met、myc、pRB、VHLおよびHER-2/neuなどの細胞成長と分化を制御する正常な細胞タンパク質は変異を蓄積し、その結果これら遺伝子生成物の発現を調整して増加させ、これによりそれらを腫瘍にする（McCarteyら、癌研究、1998、15:58 2601-5; Disisら、Ciba Found、Symp、1994、187:198-211）。これらの変異タンパク質は、様々な種類の癌における腫瘍特異的な免疫応答の標的となり得る。

癌胎児抗原−未熟型ラミニンレセプタータンパク質（OFA/iLRP）は、造血器悪性腫瘍を含む多くの種類のヒト腫瘍で広範に発現する（Rohrer JW, Barsoum AL, Coggin JH Jr、ヒトおよびげっ歯類の癌で発現したワクチン接種、癌の予防、ならびに抗腫瘍治療のための新たな普遍的腫瘍拒絶抗原、Mod Asp Immunobiol. 2001、5: 191-195（非特許文献１）. Barsoum AL, Rohrer JW, Coggin JH. 37kDa腫瘍胎児抗原は、37kDaラミニンレセプター前駆体の自己免疫遺伝学的同族である、Cell Mol Biol Lett. 2000、19: 5535-5542（非特許文献２）. Castronovo V.、腫瘍が侵襲かつ転移中のラミニンレセプターとラミニン結合タンパク質、Invasion Metas. 1993、13: 1-30.（非特許文献３） Coggin JH Jr, Barsoum, AL, Rohrer JW.、腫瘍は固有TSTAおよび交差保護44 kDa腫瘍胎児抗原両方を発現する、Immunol Today.1998 19, 405-408（非特許文献４）. Coggin JH Jr, Barsoum AL, Rohrer JW. 37キロダルトン腫瘍胎児抗原タンパク質と未熟型ラミニンレセプタータンパク質とが同一であり、原生げっ歯類とヒトの癌のおける免疫原を含む普遍T細胞、Anticancer Res. 1999 19, 5535-5542（非特許文献５））が、正常な成人分化組織中には存在しない。OFA-iLRPは、いくつかの癌本体におけるワクチンによるアプローチのためにそれを魅力的な標的分子にするTおよびBリンパ球の両方によって特異的に認識され得る。OFA-iLRコードRNAを導入された樹状細胞（DC）を利用することにより、造血器標的細胞に対する腫瘍特異的T細胞応答を、in vitroとin vivoの両方で生じさせることができた（Siegel S, Wagner A, Kabelitz Dら、Coggin, J.Jr., Barsoum, A., Rohrer, J., Schmitz, N., Zeis, M.、造血組織悪性腫瘍の治療のための腫瘍胎児抗原−未熟型ラミニンレセプターに対する細胞毒性T細胞応答の誘導、Blood、2003、02, 4416-4423（非特許文献６））。

米国特許第6,753,314号明細書（特許文献１）には、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む精製されたタンパク質複合体であって、該複合体がProPair 267a-267bと表示される第１のポリペプチド（SMI1、配列番号359）と、第２のポリペプチド（BAS1, 配列番号518）のアミノ酸配列を有することが開示されている。

米国特許第4,861,710号明細書（特許文献２）は、ラミニンならびにそれぞれのプローブの、細胞表面レセプターをコードする組み換えcDNAクローンを含むクローンを開示している。

タンパク質を腫瘍特異的な抗原として細胞毒性Tリンパ球により認識させるため、かつ、治療で用いるためには、特定の必須条件を満たさなくてはならない。抗原は、主として腫瘍細胞によって発現されなくてはならず、通常の健常組織によって発現されてはならず、、そうであっても少量でなくてはならない。さらに、それぞれの抗原が、１種類の腫瘍に存在することのみならず、高濃度（例えば、細胞あたりのコピー数）で存在することが望ましい。腫瘍関連抗原由来のそのようなペプチド（「免疫原性ペプチド」）が、in vitroまたはin vivoでT細胞応答を導かなくてはならないので、抗原のアミノ酸配列におけるエピトープの存在は必須である。

これまでに、クラスII処理経路中への抗原の標的化の多数の戦略が開示されている。取り出して処理するために、抗原存在細胞（APC）を対象の抗原で培養することが可能である（Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778（非特許文献７））。他の戦略は、リソソームの標的配列を含む融合タンパク質を用いるものである。APCで発現させることにより、そのような融合タンパク質は、抗原をクラスII処理区画内へ送り込む（Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J. Cell Biol. 131, 351-369（非特許文献８）, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430（非特許文献９））。また、ペプチドと他の活性医薬成分をpAPCに送達する特定のリポソーム製剤が開発されている（Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. 最前線：較正されたMHC/抗CD28被覆ミクロスフィア上に発現したヒトCD8T細胞の所定の親和性、J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8（非特許文献１０））。他の選択方法は、in vitroまたはin vivoでpAPCのMHC分子の外部からの搭載である。この設定において、APCは、細胞培養媒体中で過剰のペプチドにより培養され、APCの表面上でMHC分子に結合させるための競合作用を導くことができる。

Tヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫においてCTLのエフェクター作用を調整する際に重要な役割を果たす。Th1型のTヘルパー細胞応答を誘引するTヘルパー細胞エピトープは、CD8陽性キラーT細胞のエフェクター作用を補助し、このキラーT細胞は、それら細胞表面上で腫瘍関連ペプチド／MHC複合体を示す腫瘍細胞に対する細胞毒性作用を有する。このように、腫瘍関連Tヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独または他の腫瘍関連ペプチドと組み合わせて、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬成分として機能することができる。
米国特許第6,753,314号 米国特許第4,861,710号 Rohrer JW, Barsoum AL, Coggin JH Jr、Mod Asp Immunobiol. 2001、5: 191-195. Barsoum AL, Rohrer JW, Coggin JH. Cell Mol Biol Lett. 2000、19: 5535-5542. Castronovo V. Invasion Metas. 1993、13: 1-30. Coggin JH Jr, Barsoum, AL, Rohrer JW. Immunol Today.1998 19, 405-408. Coggin JH Jr, Barsoum AL, Rohrer JW. Anticancer Res. 1999 19, 5535-5542 Siegel S, Wagner A, Kabelitz Dら、Coggin, J.Jr., Barsoum, A., Rohrer, J., Schmitz, N., Zeis, M.Blood、2003、02, 4416-4423 Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778 Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J. Cell Biol. 131, 351-369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430 Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8

従って、腫瘍ワクチンの開発における主な課題は、新規な腫瘍関連抗原と、それら由来でCD4陽性CTLによって認識され得る免疫原性Tヘルパーエピトープの同定と特徴付けである。そのため本発明の目的は、ヒト主要組織適合抗原複合体（MHC）クラスIの分子に結合し、ペプチド担持する細胞に対するT細胞応答を該MHC分子と協働してそれらの細胞表面上に誘発する能力を有するペプチドについて新規なアミノ酸配列を提供することである。

本発明によれば、この目的は、添付の配列表の配列番号1および配列番号2のいずれかによる配列を少なくとも含むペプチドの群から選択される腫瘍関連ペプチドを提供することによって解決され、該ペプチドはヒト主要組織適合抗原複合体（MHC）クラスIの分子に結合する能力を有し、これらに限定されるものではないが、白色人種にもっとも多く発現するHLA対立遺伝子、HLA-A2（HLA-A*0201などのHLA-A2の亜型（サブタイプ）を含む）を含む。

本発明はさらに、癌胎児抗原未熟型ラミニンレセプタータンパク質のHLAクラスI分子由来の２つの新規なペプチド配列に関し、これらは抗腫瘍免疫応答を誘引するためのワクチン組成物に用いることができる。新規なペプチド配列は、−例えば腫瘍に関連する−画定された抗原の天然に処理された未知のHLAクラスIリガンドの同定のための、新しいかつ一般的に適用可能な組み合わされたアプローチによって同定された。したがって、本発明者らは、これらに限定されるものではないが、種々の血液悪性腫瘍を含むヒト腫瘍細胞に対する特異的なT細胞反応性を誘導可能なOFA/iLRタンパク質由来の２つの異なるHLA-A*0201特異的T細胞エピトープを同定した。

本発明の第一の態様により、配列番号1または配列番号2のいずれかによるアミノ酸配列あるいはそれらの変異体を含むペプチドが提供されるが、ただし該ペプチドは、当該アミノ酸配列が由来するヒトポリペプチドの完全なものではない（すなわち、癌胎児抗原−未熟型ラミニンレセプタータンパク質（OFA/iLRP）；登録番号については以下に添付の表１を参照）。

以下に説明するように、本発明の基礎を形成するペプチドは、MHCクラスI拘束性細胞によって提示されるようにいずれも同定された。そのため、これら特定のペプチドならびに当該配列を有する他のペプチド（すなわち誘導ペプチド）は、いずれも特異的T細胞応答を誘引するであろうが、そのような応答が誘引される範囲は、ペプチドごとに異なるであろう。差異は、例えば、上記ペプチドにおける突然変異に起因して生じ得るであろう（以下を参照）。当業者であれば、応答が個々のペプチドによって誘引される範囲を確認するために適用可能な方法を、特に、本明細書における実施例および個々の文献を参照することにより十分承知しているだろう。

好ましくは、本発明によるペプチドは、配列番号1または配列番号2のいずれかに記載の配列、あるいはそれらの変異体から本質的になる。

「〜から本質的になる」とは、本発明によるペプチドが、配列番号1または配列番号2のいずれかに記載の配列、あるいはそれらの変異体に加えて、結合モチーフを含むペプチドのコア配列として、かつ、免疫性Tヘルパーエピトープとして機能するペプチド部分を形成する必要のないNおよび／またはC末端に位置するアミノ酸の伸張部をさらに含むことを意味する。それにもかかわらず、これら伸張部は、本発明のペプチドの細胞内への効率的な誘導を提供するために重要である場合がある。

所与のアミノ酸配列の「変異体」により、本発明者らは、例えば、アミノ酸残基の１つまたは２つの側鎖を、所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同じようにペプチドがHLA分子への結合能をなおも有するよう変更する（例えば、別の天然に発生したアミノ酸残基またはいくつかの他の側鎖と置換することなどによる）ことを意図するものである。例えば、ペプチドは、改良しない場合に、HLA-Aなどの好適なMHC分子との相互作用能および結合能を少なくとも維持するように、かつ、改良しない場合に、本発明の態様において定義されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞を認識して死滅させることが可能な活性化されたCTLの生成能を少なくとも維持するよう、改変することができる。以下の開示するようなデータベースから誘導可能なため、HLA-A結合性ペプチドの特定の位置は、通常、HLA結合溝の結合モチーフに適合するコア配列を形成する残基を固定する。

T細胞レセプターと相互作用する必要のないそれらのアミノ酸残基は、導入が実質的にT細胞反応性に影響を与えず、関連MHCへの結合を排除しない、別のアミノ酸と置換することによって改変することができる。そのため、所与の条件とは別に、本発明のペプチドは、所与のアミノ酸配列またはそれらの部分もしくは変異体を含むいずれのペプチドであってもよい（本発明者らは該用語によりオリゴペプチドまたはポリペプチドを包含する）。

MHCクラスII提示ペプチドに関して知られているように、これらペプチドは、ある特定のHLA特異的アミノ酸モチーフと、任意に、コア配列の機能とは干渉しない（すなわち、ペプチドとT細胞の相互作用に関係ないと思われる）Nおよび／またはC末端伸張部を有する「コア配列」から構成される。Nおよび／またはC末端伸張部は、それぞれが1〜10アミノ酸長であり得る。したがって、本発明の好ましいペプチドをin vivoで提示するMHCクラスIIは、全長9〜30アミノ酸を示す。これらペプチドはMHCクラスII分子を載せるために直接用いられるか、あるいは、該配列が以下で説明のベクター中にクローン可能であることができるかのいずれかである。これらのペプチドが、細胞内で大型ペプチドの処理の最終生成物を形成するため、より長いペプチドを用いることもできる。本発明のペプチドは、いずれのサイズのものであってよいが、通常は分子量で100,000未満、好ましくは50,000未満、さらに好ましくは10,000未満であり、典型的には約5,000である。アミノ酸残基の数について、本発明のペプチドは、1,000残基より少なく、好ましくは500残基より少なく、より好ましくは100残基より少ない。

本発明の別の態様において、MHCクラスII分子に関して上記で説明したような状況と同様、本発明のペプチド（MHCクラスIに主として関連するが）は、MHCクラスII特異的応答を誘引するのに用いることができ、同時にILR1とILR2がHLAクラスII分子のコアまたは部分的な配列（以下の表で示す特定のHLAクラスII対立遺伝子に整合する）を同時に示すことができる。上述のように、Nおよび／またはC末端伸張部は、それぞれ1〜10のアミノ酸の長さであり得る。そのため、本発明の好ましいペプチドは、9〜30のアミノ酸の全長を示す。これらのペプチドは、MHCクラスII分子を載せるために直接用いることができるか、あるいは、配列が以下の説明によるベクター中にクローン可能であるかのいずれかである。これらのペプチドが、細胞内で大型ペプチドの処理の最終生成物を形成するため、より長いペプチドを用いることもできる。本発明のこの実施態様のペプチドは、いずれのサイズのものであってよいが、通常は分子量で100,000未満、好ましくは50,000未満、さらに好ましくは10,000未満であり、典型的には約5,000である。アミノ酸残基の数について、本発明のペプチドは、1,000残基より少なく、好ましくは500残基より少なく、より好ましくは100残基より少ない。

表Ａ：HLAクラスII分子のための特定のHLA特異的アミノ酸モチーフを有するILR1-「コア配列」。符号するアミノ酸はイタリック体で書かれている。予測は、コンピュータプログラムPAProC（http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/）およびSYFPEITHY （http://www.syfpeithi.de）で行った。

表Ｂ：HLAクラスII分子のための特定のHLA特異的アミノ酸モチーフを有するILR2-「コア配列」。符合するアミノ酸はイタリック体で書かれている。予測は、コンピュータプログラムPAProC（http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/）およびSYFPEITHY （http://www.syfpeithi.de）で行った。

約12アミノ酸残基より大きいペプチドがMHC分子に結合させるのに直接用いられる場合、コアHLA結合領域に隣接する残基が、ペプチドの、MHC分子の結合溝に特異的に結合する能力またはペプチドをCTLに提示する能力に実質的に影響を与えないものであることが好ましい。しかしながら、上記ですでに示したように、特にポリヌクレオチドによってコードされる場合、より大きいペプチドが好適な抗原提示細胞によって断片化され得るため、大きいペプチドを用いることができることは理解されるであろう。

「ペプチド」という語により、本発明者らは、アミノ酸残基がペプチド（-CO-NH-）結合により結合される分子だけでなく、ペプチド結合が逆転した分子をも含むことを意図するものである。そのようなretro-inverso型ペプチド擬態は、当技術分野で既知の方法、例えば、参照としてここに組み入れるMeziereら（1997年）のJ. Immunol. 159, 3230-3237に開示されるような方法を用いて作製することができる。このアプローチは、側鎖の配向ではなく、主鎖に関連する変化を含む偽ペプチドを作製することを包含する。Meziereら（1997年）は、少なくともMHCクラスIIとTヘルパー細胞の応答のために、これら偽ペプチドが有用であることを示している。Retro-inverse型ペプチドは、CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を有し、タンパク質加水分解に対してより抵抗性を有する。

通常、本発明のペプチドは、抗原提示細胞中で発現した場合、断片が生成されるように処理することができるものであり、適切なMHC分子への結合能を有し、かつ、好適な細胞により提示することができ、好適なT細胞応答を誘引することができる。ペプチドから生成された断片もまた、本発明のペプチドであることは理解されるであろう。好都合なことに、本発明のペプチドは、所与のアミノ酸配列またはそれらの部分もしくは変異体を含む部分、さらには、何らかの望ましい特性を与えるさらなる部分を含む。例えば、そのさらなる部分は、さらなるT細胞エピトープ（第１のT細胞エピトープ含有部分として同じポリペプチドから誘導されたかまたはそうでないかのいずれか）を含むか、あるいは、キャリアタンパク質またはペプチドを含み得る。そのため、一実施態様において、本発明のペプチドは、切断型ヒトタンパク質あるいはタンパク質断片と別のポリペプチド部分の融合タンパク質であるが、ただしヒトの部分は１つまたはより多くの本発明のアミノ酸配列を有する。

特に好ましい実施態様において、本発明のペプチドは、本発明のアミノ酸配列と、少なくとも１つのさらなるT細胞エピトープとを含み、該さらなるT細胞エピトープは、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍の種類に向かうT細胞応答の発生を容易にすることができる。したがって、本発明のペプチドは、ワクチンとしても使用可能な、いわゆる「ストリング上のビーズ」ポリペプチドを含む。

ある用途において、本発明のペプチドは直接用いる（すなわち、患者の細胞または患者に与えられた細胞においてポリヌクレオチドの発現によって生成されるものではない）ことができ；そのような用途において、ペプチドは100または50未満の残基を有することが好ましいことが以下から理解されるであろう。本発明の好ましいペプチドは、全長で9〜30アミノ酸を示す。

本発明のペプチドはHLA-A2への結合能を有することが好ましい。ペプチドはHLA-A*0201に選択的に結合することが特に好ましい。

「異常に発現した」という語により、本発明者らは、ポリペプチドが正常なレベルの発現と比較して過剰に発現しているか、あるいは、遺伝子が腫瘍が誘導される組織内では沈黙しているが腫瘍内では発現する、という意味を含ませている。「過剰に発現した」という語により、本発明者らは、ポリペプチドが正常な組織に存在する場合よりも少なくとも1.2倍、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは正常な組織に存在するレベルの少なくとも5倍または10倍のレベルで存在することを意図するものである。

ペプチド（少なくともアミノ酸残基間にペプチド結合を有するペプチド）は、Luら（1981年）、J. Org. Chem. 46,3433および本明細書における参考文献に開示されるような、固相ペプチド合成のFmoc-ポリアミド法によって合成することができる。一時的なNアミノ基の保護は、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基によって与えられる。この高度に塩基不安定な保護基の反復開裂は、N,N-ジメチルフォルムアルデヒド中の20%ピペリジンを用いることで影響を受ける。側鎖の官能性は、それらのブチルエーテルとして（セリン、トレオニンおよびチロシンの場合）、ブチルエステルとして（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体として（リシンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体として（システインの場合）、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルフォニル誘導体として（アルギニンの場合）保護することができる。グルタミンまたはアスパラギンがC末端残基である場合、側鎖アミド官能性の保護のため、4,4'-ジメトキシベンズヒドリル基の作製を利用する。固相支持体は、３つのモノマー、ジメチルアクリルアミド（主鎖-モノマー）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（クロスリンカー）、およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能化剤）から構成されるポリジメチル-アクリルアミドポリマーに基づく。用いられたペプチド-樹脂の開裂可能に結合された試薬は、酸不安定な4-ヒドロキシメチル-フェノキシ酢酸誘導体である。全てのアミノ酸誘導体は、アスパラギンとグルタミンを除いて、それらの予め形成された対称無水物誘導体として添加され、逆転N,N-ジシクロヘキシル-カルボジイミド／1-ヒドロキシベンゾトリアゾール介在カップリング手法を用いて添加される。全てのカップリングと脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸、すなわち、イソチン（isotin）試験法を用いて監視する。合成が完了すると、ペプチドは50%スカベンジャー混合物を含む95％トリフルオロ酢酸で処理することにより、側鎖保護基の除去に伴って樹脂支持体から開裂される。共通して用いられるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水であり、正確な選択は合成されたペプチドのアミノ酸の構成に依存する。また、ペプチド合成のための固相と液相方法論の組み合わせも可能である（例えば、Bruckdorfer T, Marder O, Albericio F、研究のためのミリグラム単位から未来の薬剤のための数トン単位のでのペプチドの生成、Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb、5(1):29-43ならびにここで引用の参考文献を参照）。

トリフルオロ酢酸は、真空中での蒸発によって除去し、その後ジエチルエーテルで粉砕することにより粗ペプチドを得ることができる。あるいは、凍結乾燥前に塩交換を用いることができる（TFA−＞酢酸）。存在する全てのスカベンジャーが簡単な抽出法で除去され、水性相の凍結乾燥によりスカベンジャーのない粗ペプチドを与える。ペプチド合成の試薬は通常、英国ノッティンガムNG7 2QJのCalbiochem-Novabiochem社（英国）から入手可能である。

サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィおよび、アセトニトリル／水勾配分離を用いる（通常の）逆相高速液体クロマトグラフィなどの技術のうちの１つまたはそれらの組み合わせによって、精製を行うことができる。

ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィ、逆相高速液体クロマトグラフィ、酸分解後のアミノ酸分析、Edmanシーケンス法および高速原子衝突（FAB）質量スペクトル分析ならびにMALDIおよびESI-Q-TOF質量スペクトル分析を用いて実行することができる。

本発明のさらなる態様によれば、本発明のペプチドをコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）が提供される。ポリヌクレオチドは、DNA、cDNA、PNA、CNA、RNAまたはそれらの組み合わせであってもよく、本発明のペプチドをコードする限りイントロンを含んでも含まなくてもよい。当然のことながら、ポリヌクレオチドによってコード可能な天然に生じるペプチド結合によって結合される天然に生じるアミノ酸残基を含む単なるペプチドである。本発明のさらに別の態様によれば、本発明のポリペプチドを発現可能な発現ベクターが提供される。

例えば、相補的な付着末端を介して、ポリヌクレオチド特にDNAをベクターに操作可能に結合させる様々な方法が開発されている。例えば、相補的なホモポリマートラクトは、ベクターDNAに挿入されるDNAセグメントに加えることができる。ベクターとDNAセグメントは、次いで、相補的なホモポリマーテール間の水素結合によって接合され、組み換えDNA分子を形成する。

１つまたはより多くの制限酵素切断部位を含む合成リンカーは、DNAセグメントをベクターに結合する別の方法を提供する。上述のように制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるDNAセグメントは、バクテリオファージT4DNAポリメラーゼまたは大腸菌DNAポリメラーゼI、それらの3'-5'-エクソヌクレアーゼ活性を有する突出3'-単鎖末端を排除し、重合活性を有する陥凹3'-末端を満たす酵素で処理される。

そのため、これら活性の組み合わせは、平滑末端化DNAセグメントを生成する。平滑末端化セグメントは、次いで、バクテリオファージT4DNAリガーゼなどの、平滑化末端DNA分子の連結を触媒可能な酵素の存在下で大過剰モルのリンカー分子で培養される。そのため、反応生成物は高分子リンカー配列をそれらの末端に担持するDNAセグメントである。これらDNAセグメントは、次いで、好適な制限酵素によって開裂され、これらDNAセグメントと適合する末端を生成する酵素によってすでに開裂された発現ベクターに連結される。

様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、米国コネチカット州ニューヘブンのInternational Biotechnologies社を含む多数の源から入手可能である。

本発明のポリペプチドをコードするDNAを改変する望ましい方法は、Saikiら（1988）Science 239,487-491に開示されるようなポリメラーゼ鎖反応の使用である。この方法は、例えば好適な制限部位での操作によって、好適なベクター中にDNAを導入するのに用いることができ、あるいは、DNAを当技術分野で既知の他の有用な方法で改変するのに用いることができる。この方法において、酵素によって増幅されるDNAは、それ自体が増幅DNA中に導入される２つの特異的プライマーにより隣接される。該特異的プライマーは、当技術分野で既知の方法を用いて発現ベクター中にクローン化するのに使用可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み得る。

DNA（または、レトロウィルスベクターの場合にはRNA）は、次いで、本発明の化合物を含むポリペプチドを生成するよう好適な宿主中で発現される。そのため、本発明の化合物を構成するペプチドをコードするDNAは、既知の技術に従って使用することができ、発現ベクターを構築するよう、ここに包含される教示に鑑みて適切に改変され、次いで本発明のポリペプチドを発現して生成するために適切な宿主細胞を形質転換するのに用いられる。そのような技術には、1984年4月3日発効のRutterらの米国特許第4,440,859号明細書、1985年7月23日発効のWeissmanの第4,530,901号明細書、1986年4月15日発効のCrowlの第4,582,800号明細書、1987年6月30日発効のMarkらの第4,677,063号明細書、1987年7月7日発効のGoeddelの第4,678,751号明細書、1987年11月3日発効のItakuraらの第4,704,362号明細書、1987年12月1日発効のMurrayの第4,710,463号明細書、1988年7月12日発効のToole, Jr.らの第4,757,006号明細書、1988年8月23日発効のGoeddelらの第4,766,075号明細書および1989年3月7日発効のStalkerの第4,810,648号明細書に開示されるような技術が包含され、これらは全て参照としてここに組み入れられる。

本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするDNA（レトロウィルスベクターの場合はRNA）は、適切な宿主に導入するために、広範なその他のDNA配列に接合することができる。随伴DNAは、宿主の性質、DNAの宿主への導入法に依存し、およびエピソームの維持または共適応のいずれかが望ましい。

概して、DNAはプラスミドなどの発現ベクター中に、発現用の好適な配向で正しい読み枠で挿入される。必要に応じて、所望の宿主で認識される適切な転写および翻訳調整制御ヌクレオチド配列に連結することができるが、そのような制御は、概して発現ベクター中で利用可能である。ベクターは次いで、標準的な技術によって宿主中に導入される。概して、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。そのため、形質転換された宿主細胞を選択する必要がある。１つの選択技術として、必要な制御因子とともに、抗生物質抵抗性などの形質転換した細胞中で選択可能な形質をコードするDNA配列を、発現ベクター中に導入することが包含される。

あるいは、そのような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞に共に形質転換するのに用いられる、もう１つのベクター上にあることもできる。

本発明の組み換えDNAによって形質転換された宿主細胞は、次いで、ポリペプチドの発現を可能にする十分な時間、ここで開示される技術を考慮して当業者らに既知の好適な条件下で培養され、その後回収することができる。

細菌（例えば、E. coliおよびBacillus subtilis）、酵母菌（例えば、Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌（例えば、Aspergillu）、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞を含む多くの発現系が知られている。好ましくは、そのような系はAwells細胞であってよい。

プロモータは、RNAポリメラーゼの結合を可能にするDNA配列により形成される発現制御因子であり、転写を引き起こす。代表的な細菌宿主との適合性を有するプロモータ配列は、通常本発明のDNAセグメントの導入のための好都合な制限部位を有するプラスミドベクター中に提供される。典型的な原核細胞ベクタープラスミドは、Biorad laboratories社（米国カリフォルニア州リッチモンド）から入手可能なpUC18、pUC19、pBR322、pBR329および米国ニュージャージー州ピスカタウェイのPharmacia社から入手可能なpTrc99AおよびpKK223-3である。

典型的なほ乳類の細胞ベクタープラスミドは、米国ニュージャージー州ピスカタウェイのPharmacia社から入手可能なpSVLである。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を促進するのにSV40後期プロモータを用い、発現の最高レベルはCOS-1細胞などのT抗原産生細胞中で見られる。誘導可能なほ乳類発現ベクターの例はpMSGであり、Pharmaciaから入手可能である。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を促進するためにマウスの乳癌ウィルスの長い末端反復のグルココルチコイド誘導プロモータを用いる。有用な酵母菌プラスミドベクターは、pRS403-406とpRS413-416であり、概して、米国カリフォルニア州92037ラ・ホーヤのStratagene Cloning Systemsから入手可能である。プラスミドpRS403、pRS404、pRS404、pRS405およびpRS406は酵母インテグレイティングプラスミド（YIps）であり、酵母の選択可能なマーカーHIS3、TRP1、LEU2およびURA3を組み込んでいる。プラスミドpRS413-416は、酵母セントロメアプラスミド（Ycps）である。様々な宿主細胞とともに用いる他のベクターと発現系が当技術分野で周知である。

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物で形質転換した宿主細胞に関する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかであってよい。細菌細胞は、ある環境においては好ましい原核宿主細胞であり、通常例えば、米国メリーランド州ベセスダのBethesda Research Laboratories Inc.から入手可能な大腸菌株DH5および米国メリーランド州ロックヴィルのAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手可能なRR1（No ATCC 31343）などの大腸菌株である。好ましい真核宿主細胞は、酵母菌、昆虫およびほ乳類の細胞を含み、マウス、ラット、サルあるいはヒトの線維芽細胞ラインおよび腎臓細胞ライン由来などの脊椎動物の細胞が好ましい。酵母菌宿主細胞には、米国カリフォルニア州92037ラ・ホーヤのStratagene Cloning Systemsから入手可能なYPH499、YPH500およびYPH501が包含される。好ましいほ乳類宿主細胞には、CCL61としてATCCから入手可能なチャイニーズハムスターの卵巣（CHO）細胞、CRL 1658として入手可能なNIHスイスマウス胎芽細胞NIH/3T3、CL 1650としてATCCから入手可能なサルの腎臓由来COS-1細胞、およびヒト胎児腎臓細胞である293細胞が包含される。好ましい昆虫細胞は、Sf9細胞であり、バキュロウィルス発現ベクターでトランスフェクトすることができる。

本発明のDNA構築物を有する好適な細胞宿主の形質転換は、通常使用するベクターの種類に応じた周知の方法で達成される。原核宿主細胞の形質転換については、例えば、Cohenら（1972）、Proc. Natl. Acad. Sci.米国69,2110および、Sambrookら（1989）分子のクローニング、A Laboratory Manual、米国ニューヨーク州コールドスプリング、Cold Spring Harbor Laboratoryを参照されたい。酵母細胞の形質転換については、Shermanら（1986）、研究所の手引き、酵母菌遺伝子学における方法、米国ニューヨーク州 Cold Spring Harborに開示されている。Beggsの方法（1978）、Nature 275,104-109もまた有用である。脊椎動物の細胞については、そのような細胞をトランスフェクトするのに有用な試薬は、例えばStratagene Cloning Systemsまたは米国メリーランド州20877ガイザーブルクのLife Technologies Incから入手可能な、リン酸カルシウムとDEAEデキストランまたはリポソーム形成因子である。細胞を形質転換および／またはトランスフェクトするのに電気穿孔法もまた有用であり、酵母菌細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞を形質転換する技術において周知である。

うまく形質転換された細胞、すなわち本発明のDNA構築物を含む細胞は、周知の技術によって同定することができる。例えば本発明の発現構築物を導入して得られた細胞は、本発明のポリペプチドを産生するよう増殖させることができる。細胞は採取して溶解することができ、Southern（1975）、J. Mol. Biol. 98,503またはBerentら（1985）、Biotech. 3,208に開示されるような方法を用いて、DNAの有無についてDNA含有量を検査することができる。あるいは、以下で説明する抗体を用いて上清中のタンパク質の有無を検出することができる。

組み換えDNAの有無を直接分析することに加えて、組み換えDNAがタンパク質の発現を誘導可能であるとき、形質転換の成功は周知の免疫学的方法によって確認することができる。例えば、発現ベクターで形質転換が成功した細胞により、適切な抗原性を示すタンパク質が生成される。形質転換されたと推測される細胞の試料を採取し、好適な抗体を用いてタンパク質について分析する。したがって、形質転換した宿主細胞自体に加えて、本発明は、それら細胞の培養物、好ましくは、栄養培地におけるモノクローナルな（クローン的に均質な）培養物あるいはモノクローナルな培養物から得られた培養物もまた、意図するものである。

本発明の特定の宿主細胞、例えば、細菌、酵母菌および昆虫細胞が本発明のペプチドを作製するのに有用であることは理解されるであろう。しかしながら、他の宿主細胞は特定の治療法においては有用であろう。例えば、本発明のペプチドが好適なMHC分子中に載せられるように、樹状細胞などの抗原提示細胞が当該ペプチドを発現させるのに有効に用いることができる。

本発明のさらなる態様によれば、静脈内（i.v.）注射、皮下（s.c.）注射、皮内（i.d.）注射、腹腔内（i.p）注射、筋肉内（i.m.）注射のためのペプチドを作製する方法が提供される。ペプチド注射の好ましい方法は、s.c.、i.d.、i.p.、i.m.、およびi.v.である。DNA注射の好ましい方法は、i.d.、i.m.、s.c.、i.p.、およびi.v.である。ペプチドまたはDNAの投与量は、1〜500 mgであってよい。

本発明のさらに別の態様によれば、患者の標的細胞を死滅させる方法が提供され、該標的細胞は、本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し、該方法は患者に有効量の本発明のペプチドまたは有効量のポリヌクレオチド、あるいは前記ペプチドをコードする発現ベクターを投与することを含み、前記ペプチドの量もしくは前記ポリヌクレオチドの量もしくは発現ベクターは、該患者内で抗標的細胞免疫応答を引き起こすのに効果的なものである。標的細胞は通常は腫瘍または癌細胞であり、特に白血病またはリンパ腫細胞である。

ペプチドまたはペプチドをコードする核酸は、腫瘍または癌のワクチンを構成する。患者に、病気に冒された臓器に、または全身に直接投与すること、または、患者またはヒトセルライン由来の細胞にex vivoで適用するができ、続いて該細胞は患者に投与されるか、または患者由来の免疫細胞から副次集団を選択するようin vitroで用いられ、次いでそれらは再び患者に投与されるかである。核酸をin vitroで細胞に投与した場合、インターロイキン-2などの免疫刺激サイトカインを共に発現させるよう、細胞をトランスフェクトすることが有用であろう。ペプチドは実質的に純粋であるか、あるいは、Detoxなどの免疫刺激アジュバントと組み合わせたものであるか、あるいは、免疫刺激サイトカインと組み合わせて用いるか、または好適な送達システム、例えばリポソームとともに投与される。ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）またはマンナンなどの好適な担体に結合させることもできる（WO 95/18145号公報およびLongeneckerら（1993）、Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291を参照）。ペプチドは標識化することもでき、あるいは融合タンパク質であるか、ハイブリッド分子であり得る。配列が本発明で与えられるペプチドは、CD8陽性CTLを刺激することが期待される。しかしながら、CD4陽性T細胞により与えられる補助の存在下で、刺激はより効率的になる。そのため、ハイブリッド分子の融合相手または部分は、CD4陽性T細胞を刺激するエピトープを好適に提供する。CD4陽性刺激性エピトープは当技術分野で既知であり、破傷風トキソイドにおいて同定されたものを含む。ポリヌクレオチドは実質的に純粋であるか、好適なベクターまたは送達システムに含まれ得る。

好適なベクターおよび送達システムには、アデノウィルス、ワクチンウィルス、レトロウィルス、ヘルペスウィルス、アデノ随伴ウィルスまたは１つ以上のウィルス成分を含むハイブリッドなどをベースとするシステムなどのウイルスが包含される。非ウィルス性送達システムは、DNA送達の技術において周知のカチオン性脂質およびカチオン性ポリマーを包含する。「遺伝子銃（gene-gun）」などを介した物理的送達もまた用いることができる。ペプチドまたは核酸によってコードされたペプチドは、例えばCD8陽性T細胞を刺激するエピトープを有する融合タンパク質であってよい。

癌ワクチンに用いるペプチドは、好適なペプチドのいずれかであってよい。特に、好適な9量体ペプチドまたは、好適な7量体か、8量体か、10量体か、11量体のペプチド、または12量体であり得る。より長いペプチドもまた適しているが、添付の表１に開示するように9量体か10量体のペプチドが好ましい。

好適には、患者に投与した核酸は滅菌しパイロジェンフリーにする。むき出しのDNAは、筋肉内、皮内または皮下的に与えることができる。ペプチドは、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内あるいは皮下的に与えることができる（ペプチド作製法に関連する上記も参照）。好ましくは、活性医薬成分としてのペプチドは、例えばIL-2、IL-12、GM-CSF、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、あるいはリポソーム調製物などのアジュバントと組み合わせて与えることができる。最も好ましいアジュバントは、例えば、Brinkman JA, Fausch SC, Weber JS, Kast WMのExpert Opin Biol Ther.、2004 Feb、4(2):181-98において見出すことができる。

ワクチン接種は、専門的な抗原提示細胞により刺激されたCTL応答をひきおこす；CTLをいったん刺激した後は、腫瘍細胞中でのMHC発現の強化に有利である。

注入する部位、標的ベクターと送達システムの使用、または患者由来の細胞集団の選択的精製とペプチドもしくは核酸のex vivo投与のいずれかにより、例えば抗原提示細胞などの特異的な細胞集団をワクチンの標的にすることも有用であろう（例えば、樹状細胞は、Zhouら（1995）、Blood 86,3295-3301; Rothら（1996）、Scand. J. Immunology 43,646-651に開示されるように分類することができる）。例えば標的ベクターは、好適な場所で抗原を発現させる組織または腫瘍特異的プロモータを含んでもよい。

本発明のさらなる態様により、有効量の本発明のペプチドを含む、あるいはそのようなペプチドをコードする核酸を含む、癌、癌細胞または腫瘍細胞に有効なワクチンが提供される。ワクチンが核酸ワクチンであることも好ましい。DNAワクチンなどのポリペプチドをコードする核酸ワクチンの接種がT細胞応答を導くことが知られている。最も好ましいのは、一種または複数種の（合成）ペプチド（すなわち、単体かあるいは1,2,3,4,5または6あるいはさらに多くのペプチドの組み合わせ、以下をさらに参照）を含むワクチンである。

好都合なことに、核酸ワクチンは好適な核酸送達手段を含み得る。核酸、好ましくはDNAは、むき出し（すなわち、実質的に他の成分は投与されない）であるか、またはリポソーム中で、またはウィルス性ベクター送達システムの部分として送達することができる。

核酸の取り込みおよび樹状細胞によってコードされたポリペプチドの発現が、免疫応答刺激の機構であると考えられている：しかしながら、樹状細胞はトランスフェクトされることはないが、組織中でトランスフェクトされた細胞から発現したペプチドを採取するため、さらに重要である。

DNAワクチンなどのワクチンを筋肉中に投与することが好ましい。ワクチンを皮膚に投与することもまた好ましい。核酸ワクチンはアジュバントを用いず投与することができる。核酸ワクチンはまた、BCGまたはミョウバンなどのアジュバントとともに投与することができる。他の好適なアジュバントには、サポニン、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣体に由来するAquila's QS21 stimulon（Aquila Biotech, 米国メリーランド州ウースター）、およびRibi's Detox. Quil A、他のサポニン由来アジュバント（デンマーク、Superfos）などのメーカー開発のアジュバントも用いることができる。核酸ワクチンをアジュバントを用いずに投与することが好ましい。フロイントなどの他のアジュバントもまた有用である。ペプチドを、好ましくはアジュバントとともにキーホールリンペットヘモシアニンに接合して提供することもまた有用である。

癌のポリヌクレオチド介在免疫治療は、Conryら（1996）、腫瘍学セミナー、23,135-147；Condonら（1996）、Nature Medicine 2,1122-1127；Gongら（1997）、Nature Medicine 3,558-561；Zhaiら（1996）、J. Immunol. 156,700-710；Grahamら（1996）、Int J. Cancer 65,664-670およびBurchellの（1996）pp 309-313 In: 乳ガン、生物学における進歩および治療、Calvoら(eds), John Libbey Eurotextに開示されており、これらは全て参照としてここに組み入れられる。

本発明のさらに別の態様は、標的細胞が本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する患者において標的細胞を死滅させるための薬物の製造における、本発明によるペプチド、ポリヌクレオチドまたはそのようなペプチドをコードする発現ベクターの使用を提供する。

本発明のさらなる態様によれば、活性化細胞毒性Tリンパ球（CTL）をin vitroで作製する方法が提供され、該方法は、該CTLを活性化させるのに十分な時間、抗原に特異的な方法で、好適な抗原提示細胞の表面上で発現した抗原提示ヒトクラスI MHC分子にin vitroでCTLを接触させることを含み、該抗原は本発明のペプチドである。

好ましくは、CTLはCD8陽性ヘルパー細胞である。MHCクラスI分子は、いずれかの好適な細胞の表面上で発現させることができ、細胞は天然にMHCクラスI分子を発現しないものである（この場合、細胞はそのような分子を発現するようトランスフェクトされる）、あるいは、発現する場合は、抗原処理または抗原提示過程で機能しないものであることが好ましい。このように、MHCクラスI分子を発現する細胞は、CTLを活性化させる前に選択したペプチド抗原によって実質的に完全に刺激されることが可能である。

抗原提示細胞（または刺激細胞）は、通常MHCクラスI分子をその表面上に有し、好ましくは、実質的にそれ自体は前記MHCクラスI分子に選択した抗原を載せることはできない。以下でより詳細に説明するように、MHCクラスI分子はin vitroで、選択した抗原を容易に載せることができる。

好ましくは、ほ乳類の細胞は、TAPペプチドトランスポーターの機能を有さないか、低減したレベルで有するか、低減した機能を有する。TAPペプチドトランスポーター欠損の好適な細胞には、T2、RMA-S、およびショウジョウバエ細胞が包含される。TAPとはTransporter Associated with antigen Processingである。

ヒトペプチドを載せている欠損細胞ラインT2は、米国メリーランド州20852ロックヴィルパークローンドライブのAmerican Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USAから、カタログNo. CRL1992で入手可能であり、ここに参照として組み入れる。

好都合なことに、トランスフェクトされる前の該宿主細胞は実質的にMHCクラスI分子を発現しない。刺激細胞はT細胞を共に刺激するのに重要な分子、B7.1、B7.2、ICAM-1およびLFA 3のいずれかなどを発現することが好ましい。

多数のMHCクラスI分子と共刺激分子の核酸配列は、GenBankとEMBLのデータベースから公的に入手可能である。

さらなる実施態様において、ここで表Ａおよび表Ｂに開示するMHCクラスII分子など、HLA分子の組み合わせも用いることができる。組み換えポリペプチドワクチンの、複数のCD8陽性CTLエピトープの送達のための使用は、Thomsonら（1996）、J. Immunol. 157, 822-826およびWO 96/03144号公報に開示されており、いずれも参照としてここに組み入れられる。本発明に関連して、単一ワクチン中に、いかなる順番でも、本発明のアミノ酸配列と他のCD8陽性T細胞刺激エピトープとを含むペプチド（またはペプチドをコードする核酸）を含むことが望ましい。そのようなワクチンは、癌を治療するのに特に有用である。そのような「ストリング上のビーズ」ワクチンは、通常DNAワクチンである。MHCクラスI依存免疫応答とともに、MHCクラスII依存免疫応答の同時の誘発は、これにより、CD4陽性T細胞の局部的なTH₁-様T細胞反応を誘導するという利点を有するため、MHCクラスI依存CD8陽性T細胞が支持される。

CTLをin vitroで生成するのに他の多数の方法を用いることができる。例えば、Peoplesら（1995）Proc. Natl. Acad. Sci.USA 92,432-436およびKawakamiら（1992）J. Immunol. 148,638643に開示の方法は、自己腫瘍浸潤リンパ球をCTL作製に用いる。Plebanskiら（1995）Eur. J. Immunol. 25,1783-1787は、自己末梢血リンパ球（PLB）をCTLの作製に利用する。Jochmusら（1997）J. Gen. Virol. 78,1689-1695は、ペプチドまたはポリペプチドとともにパルス樹状細胞を用いることによる、または組み換えウィルスの感染による自己CTLの作製を開示している。Hillら（1995）J. Exp. Med. 181,2221-2228とJeromeら（1993）J. Immunol. 151,1654-1662は、自己CTLの生成にB細胞を利用している。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでパルス標識した、または組み換えウィルスで感染したマクロファージを、自己CTLの作製に用いることができる。S. Walterら（Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge:較正MHC/抗CD28被覆ミクロスフィアで拡張されたヒトCD8T細胞の所定の親和性、J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8）は、人工抗原提示細胞を用いることによるT細胞のin vitro刺激を開示しており、これは選択したペプチドに対抗するT細胞を生成する好適な方法でもある。

同種の細胞もまたCTLの作製に用いることができ、この方法はWO 97/26328号公報で詳細に開示されており、ここに参照として組み入れられる。例えば、ショウジョウバエ細胞とT2細胞に加えて、CHO細胞、バキュロウィルス感染昆虫細胞、細菌、酵母菌、ワクチン感染標的細胞などの他の細胞も抗原を提示するのに用いることができる。さらに植物ウィルスも使用可能である（例えば、外部ペプチドの提示のための高効率システムとしてのササゲモザイクウィルスの開発を開示する、Portaら（1994年）Virology 202, 449-955を参照）。

本発明のペプチドに対抗する活性化CTLは治療に有用である。そのため、本発明のさらなる態様によれば本発明の前述の方法で得られうる活性化CTLが提供される。

本発明のさらなる態様によれば、本発明のアミノ酸を含むポリペプチドを発現する細胞を選択的に認識する活性化CTLが提供される。好ましくはCTLは、該細胞をHLA/ペプチド複合体と相互作用することによって認識する（例えば結合）。CTLは、標的細胞が本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する患者において当該標的細胞を死滅させる方法において有用であり、該患者は有効数の活性化CTLを投与される。患者に投与されるCTLは患者由来のものであってよく、かつ上述したように活性化することができる（すなわち、自己CTLである）。あるいは、CTLは患者由来ではなく別の個体由来のものである。当然のことながら、該個体は健常個体であることが好ましい。「健常個体」という語により、本発明者らはおおむね健康であり、好ましくは有能な免疫系を有し、より好ましくは容易に試験でき、検出できるような疾患を全く持たないことを意図する。

活性化CTLは、ポリペプチドを発現する細胞の認識に関連するT細胞レセプター（TCR）を発現する。TCRをコードするcDNAが活性化CTLからクローン化されたものであり、かつ、発現のために別のCTL中に転移させることが有用である。

本発明によるCD8陽性CTLの標的細胞はin vivoで、腫瘍、白血病、もしくはリンパ腫（MHCクラスIを発現する）細胞、および／または腫瘍（腫瘍細胞）を取り巻く間質細胞（MHCクラスII分子クラスIを発現する場合もある）である。

本発明のペプチドに特異的な本発明のCTLクローンのTCRは、クローン化される。CTLクローン中でのTCRの使用量は、(i)TCR可変領域に特異的なモノクローナル抗体と、(ii)VaとVp遺伝子ファミリーに特異的なプライマーを用いたRT PCRを用いて決定される。cDNAライブラリは、CTLクローンから抽出されたポリA mRNAから作製される。TCR aのC末端部分とP鎖および同定されたVaセグメントとPセグメントのN末端部分に特異的なプライマーが用いられる。TCR aとb鎖の完全なcDNAは、高度に忠実なDNAポリメラーゼで増幅され、増幅された生成物は好適なクローニングベクター中にクローン化される。クローン化されたaとP鎖遺伝子は、Chungら（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,12654-12658に開示される方法によって、単鎖TCRに組み入れられることができる。この単鎖構築物において、VaJセグメントの後にV DJセグメントが続き、Cpセグメントが続き、膜透過とCD3鎖の細胞質セグメントが後に続く。この単鎖TCRは、次いでレトロウィルス発現ベクター中に挿入される（ベクターのパネルは、成熟型ヒトCD8陽性Tリンパ球に感染し、遺伝子発現を媒介する能力に基づいて使用される：レトロウィルスベクターシステムKatは好ましい一例である（Finerら（1994）Blood 83,43を参照））。高力価の広宿主性レトロウィルスは、腫瘍患者の末梢血から単離した、精製CD8陽性またはCD4陽性Tリンパ球に感染させるのに用いられる（Robertsら(1994) Blood 84,2878-2889によって公開されたプロトコルに従う、参照としてここに組み入れる）。精製されたCD8陽性T細胞の増殖を引き起こすのに抗CD3抗体が用いられ、これによりレトロウィルスの集積と単鎖TCRの安定な発現を促進する。レトロウィルス形質導入の効率は、単鎖TCRに特異的な抗体による感染CD8陽性T細胞の染色によって決定される。形質導入されたCD8陽性T細胞のin vitro解析は、それらからTCR鎖が最初にクローン化される同種異系制限CTLクローンで見られるように、同じ腫瘍特異的致死性を示すことを確立する。期待された特異性を有する形質導入CD8陽性T細胞の集団は、腫瘍患者の養子免疫療法に用いることができる。患者は10⁸〜10¹¹の自己、形質導入CTLで治療することができる。

CTLに遺伝子を導入するための他の好適な系は、Moritzら(1994)、Proc. Natl. Acad. Sci.米国、91,4318-4322に開示されており、参照としてここに組み入れられる。Eshharら(1993)、Proc. Natl. Acad. Sci.米国、90,720-724およびHwuら(1993)J. Exp. Med. 178, 361-366もまた、CTLのトランスフェクションを開示している。したがって、本発明のさらなる態様によれば、本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞を認識するTCRが提供され、該TCRは活性化CTLから得られうる。

本発明にはTCRに加えて、機能的にTCRと等価な分子が包含される。これらはTCRと同じ役割を果たすことが可能なTCRと機能的に等価である分子を含む。特にそのような分子は、Chungら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 91, 12654-12658（ここに参照と組み入れられる）に開示されるような方法、および上で参照した方法によって作製される、遺伝子操作された3ドメインの単鎖TCRを含む。本発明はまた、TCRまたは機能的に等価な分子をコードするポリヌクレオチドと、TCRまたはそれらに機能的に等価な分子をコードする発現ベクターも含む。本発明のTCRを発現するのに適した発現ベクターには、上記で本発明のペプチドの発現に関して説明したものが包含される。

しかしながら発現ベクターは、トランスフェクト後にCRT中でTCRを発現可能なものであることが好ましい。

本発明のさらに別の態様によれば、患者において標的細胞を死滅させる方法が提供され、該標的細胞は本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し、該方法は(1)患者からCTLを得るステップと、(2)該細胞にTCRまたは上記で定義したような機能的に等価な分子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップと、(3)ステップ(2)で作製された細胞を患者に導入するステップとを含む。

本発明のさらなる態様によれば、患者において標的細胞を死滅させる方法が提供され、該標的細胞は本発明の第１、第２または第３の態様で定義したアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドを発現し、該方法は(1)該患者から樹状細胞などの抗原提示細胞を得るステップと、(2)該抗原提示細胞を、本発明の第１、第２または第３の態様で定義したペプチド、またはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドに、ex vivoで接触させるステップと、(3)そのように処理した抗原提示細胞を再び患者に導入するステップ、とからなる。

好ましくは、抗原提示細胞は樹状細胞である。好適には樹状細胞は、抗原性ペプチドでパルスされる自己樹状細胞である。抗原性ペプチドは、適切なT細胞応答を生じる好適な抗原性ペプチドであってよい。腫瘍関連抗原由来のペプチドでパルスされた自己樹状細胞を用いるT細胞治療は、Murphyら(1996)、The Prostate 29,371-380とTjuaら(1997)The Prostate 32, 272-278に開示されている。

さらなる実施態様において、樹状細胞などの抗原提示細胞は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させられる。ポリヌクレオチドはいかなる好適なポリヌクレオチドであってもよく、樹状細胞を形質導入可能であることにより、ペプチドを提示して免疫性を誘導する結果となることが好ましい。

好都合なことに、ポリヌクレオチドは、ウィルス性ポリヌクレオチドまたはウィルス中に構成することができる。例えば、アデノウィルス形質導入樹状細胞は、MUCIに関連した抗原特異的抗腫瘍免疫を誘引することが示されている（Gongeら(1997)、Gene Ther. 4,1023-1028参照）。同様に、アデノウィルスベースの系を用いることができ（例えば、Wanら(1997)、Hum. Gene Ther. 8,1355-1363参照）、レトロウィルス系を用いることができ（Spechtら(1997)、J. Exp. Med. 186,1213-1221、およびSzabolcsら(1997)、血液粒子媒介転移樹状細胞もまた用いることができ（Tutingら(1997)、Eur. J. Immunol. 27,2702-2707)、さらにはRNAも用いることができる（Ashleyら(1997)、J. Exp. Med. 186,1177 1182）。

患者において標的細胞を死滅させる方法に関連して、標的細胞が癌細胞であることが特に好ましく、より好ましくは白血病細胞またはリンパ腫細胞であることは理解されるであろう。

本発明の方法で治療される患者は、HLA-A2型を有することが特に好ましい。そのため、好ましい実施態様において、患者のHLAハプロタイプは治療前に確認される。HLAのハプロタイプ決定はいかなる好適な方法でも行うことができ、そのような方法は当技術分野で周知である。

本発明は、in vivoで活性のあるワクチン接種の目的と、in vitroで自己樹状細胞を操作し、その後そのように操作された樹状細胞をin vivoで導入しCTL応答を活性化する目的と、自己CTLをin vitroで活性化し、その後に養子免疫治療する目的と（すなわち、そのように操作したCTLは患者に導入される）、（MHCが適合する、もしくは適合しない）健常ドナー由来CTLをin vitroで活性化して養子免疫療法する目的で、特に本発明のペプチド（またはそれらをコードするポリヌクレオチド）を使用することを包含する。

好ましい実施態様において、本発明のワクチンは腫瘍の形成を阻害または抑制するために、単独または別の癌治療と組み合わせて宿主に投与される。

ペプチドワクチンは、アジュバントなしで投与することができる。ペプチドワクチンは、BCGまたはミョウバンなどのアジュバントとともに投与することもできる。他の好適なアジュバントには、サポニン、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣体から誘導されるAquila's QS21 stimulon（Aquila Biotech, 米国メリーランド州ウースター）、およびRibi's Detox. Quil A、他のサポニン誘導アジュバント（デンマークSuperfos）などのメーカー開発のアジュバントもまた用いることができる。他のCpGオリゴヌクレオチドなどのアジュバント、安定化RNA、Imiquimod（商品名Aldara（商標）、3M Pharma、米国から市販）、不完全フロイントアジュバント（フランス国パリ、Seppic S.A.から市販のMontanide ISA-51）、リポソーム調製物またはGM-CSFも有用である。ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン、好ましくはアジュバントに結合させることもまた有用である。

本発明によるペプチドは、診断試薬としても用いることができる。ペプチドを用いることにより、ペプチドに対して特異性を有するか、治療によって誘導されるCTLが、CTL集団中に存在するか否かを分析することができる。さらに、前駆体T細胞の増大は、定義されたペプチドに対抗した反応性を有するそれらのペプチドで試験することができる。また、ペプチドは、ペプチドが誘導される抗原を発現する腫瘍疾患の進行を監視するのにマーカーとして使用することができる。

添付の表１において、使用されかつ同定されるペプチドが挙げられている。さらに、この表では、それぞれのタンパク質中のペプチドのそれぞれの部分が与えられている。国立健康研究所（National Institute of Health (http: www.ncbi.nlm.nih.gov参照)）の「バイオテクノロジーインフォメーションナショナルセンター（National Centre for Biotechnology Information）」のGenbankにおけるマウスOFA/iLRの登録番号はAAD26866である。国立健康研究所(http: www.ncbi.nlm.nih.gov参照)の「バイオテクノロジーインフォメーションナショナルセンター」のGenbankにおけるヒトOFA/iLRの登録番号は、例えば、AAC50652またはAAP35883である。

他の好ましい実施態様において、ペプチドは、白血球、特にTリンパ球を染色するのに用いられる。CTL集団にペプチドに対して特異的なCTLが存在するか否かが証明されれば、この使用は特に利点を有するものである。さらには、ペプチドは、腫瘍の疾患または障害における治療の進行を確認するマーカーとして使用可能である。

本発明のさらに好ましい実施態様において、ペプチドは抗体の作製に用いられる。ペプチドを注射し、続いて免疫グロブリンを精製することによる動物免疫法によって、ポリクローナル抗体を標準的方法で得ることができる。モノクローナル抗体は、例えば、Methods Enzymol、(1986)、121、ハイブリドーマ技術とモノクローナル抗体に開示されるような方法などの標準的なプロトコルによって作製できる。

さらなる態様において本発明は医薬組成物に関し、該組成物は１つまたはより多くの本発明の上記ペプチドを含む。この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与や経口投与に用いることができる。このためペプチドは、薬理学的に許容可能な好ましい水性担体中に溶解または懸濁される。さらに組成物は、緩衝剤、結合剤、爆破剤、希釈剤、香料、潤滑剤などの賦形剤を含んでもよい。ペプチドはまた、サイトカインなどの免疫刺激物質と一緒に投与することができる。そのような組成物に使用可能な賦形剤の多数のリストは、例えば、A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版、2000（American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press）から得ることができる。組成物は、腫瘍疾患の防止、予防および／または治療に用いることができる。

配列番号1〜配列番号2のいずれかを含む本発明のペプチドを少なくとも１つ含む医薬調合物は、それぞれのペプチドまたは抗原に関連する腫瘍疾患を患う患者に投与される。治療される特定の疾患は、白血病（例えばAMLもしくはCLL）、または骨髄腫（例えばMM）などのOFA/iLRPを発現する悪性腫瘍である。これにより、CTL特異的免疫応答を誘引することができる。

本発明の別の態様において、本発明による２つまたはいくつかのペプチドの組み合わせが、直接組み合わせて、もしくは該治療の投薬計画内で、ワクチンとして用いることができる。さらには、他のペプチド、例えばMHCクラスII特異的ペプチドとの組み合わせが使用可能である。例えばT細胞のin vitro産生ならびにそれらの有効率および全体的な有無、特定のペプチドに対する特定のT細胞の増殖、親和性および拡大、およびT細胞の機能などを試験することにより、例えばIFN-γ（以下の例も参照）、IL-12またはパーフォリンの生成を解析することにより、当業者は免疫原性ペプチドの好ましい組み合わせを選択することができるであろう。通常、最も効果的なペプチドは上述の目的でワクチンとして組み合わせたものである。

好適なワクチンは、2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14または15の異なるペプチド、好ましくは、4,5,6または7の異なるペプチド、より好ましくは6の異なるペプチドを含む。

最終的にワクチンは、治療される患者が冒されている癌の具体的な種類、ならびに疾患の状態、初期治療の投薬計画、患者の免疫状態、そしてもちろん患者のHLAハプロタイプに依存しうる。

腫瘍関連抗原のTヘルパー細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫療法において依然として重要な業務である。OFA-iLRタンパク質由来のT細胞結合性エピトープを同定するために、コンピュータプログラムPAProC（http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/）と、SYFPEITHY（http://www.syfpeithi.de）によって推定された、HLA-A*0201分子に結合する14のペプチドが合成された（以下を参照）。TAP（transporter associated with antigen processing）欠損T2セルラインを用いるin vitro再構築分析法において、Flu核タンパク質_58-66と比較した場合に、２つのペプチド（iLR1、iLR2）のみが、HLA-A*0201に対する強力な結合親和性を示した（図１１Ａと図１１Ｂ）。、iLR1またはiLR2ペプチドでパルスした完全に成熟したDC存在下で、健常HLA-A*0201陽性ドナー由来のCTLラインを生成することができた。

ペプチドの滴定曲線は、iLR1とiLR2特異的CTLが、ペプチド／MHC複合体に対して高い親和性を有するものであったことを示している（図５および図１０）。iLR1（図１）またはiLR2（図６）に対して特異的なCTLラインのいずれも、HLA-A*0201陽性の血液腫瘍ライン、原発性悪性腫瘍AML芽細胞（図４Ａ、Ｂおよび８Ａ、Ｂのそれぞれ）、およびCLL細胞（図３Ａ、Ｂおよび９Ａ、Ｂのそれぞれ）に対する強力な細胞溶解活性を示したが、HLA-A2陰性標的および正常な造血細胞（ibid.）は残存した。抗体阻止検査（図２と７）は、ペプチド特異的CD8陽性Tリンパ球によって誘発されたMHCクラスI拘束性死滅を明らかにした。HLA-A*0201陽性AML、CLLおよび多発性骨髄腫の患者においてiLR1およびiLR2特異的T細胞の発生頻度を測定するために、ELISPOT IFN-γ分泌分析（表３〜５）を行った。血液悪性腫瘍を有する、HLA-A*0201陽性患者の25/50（50％）および20/50（40％）において、顕著なレベルのiLR1またはiLR2ペプチド特異的T細胞が検出され、健常個体の末梢血試料では、ILR1またはILR2のいずれかに対する自発性T細胞応答は生じなかった（表２）。CLLを有する１人の患者と、AMLを有する別の患者では、iLR1とiLR2のペプチドエピトープの両方に特異的な自己CTLラインが産生され、自己および同種のHLA-A2適合標的細胞に対する効果的な細胞毒性を誘引することができた。

インターロイキン10を分泌するOFA/iLR特異的な調節性CD8陽性T細胞クローンが、OFA/iLR陽性腫瘍担持マウス（Rohrer JW, Rohrer SD, Barsoum A, Coggin JH Jr.、同質遺伝子的クローン化Balb/cおよびRFMマウスT細胞によるネズミ腫瘍関連胎児性移植抗原と個体特異性腫瘍移植抗原との差認識、J Immunol.、1994; 152: 745-764）および、進行した乳房腫瘍の患者（Rohrer JW, Barsoum AL, Dyess DL et al. Human breast carcinoma patients develop clonable oncofoetal antigen-specific effector and regulatory T lymphocytes. J Immunol.、1999、162: 6880-6892. 11. Rohrer JW, Coggin JH Jr.、IL-10分泌によるCD8T細胞クローン阻害抗腫瘍T細胞機能、J. Immunol.1995、155: 5719.）のいずれもで同定可能であることを、本発明者らは以前に示した。Suら（Su Zら、腫瘍RNAトランスフェクト樹状細胞をワクチン接種した転移性腎細胞癌患者における免疫学的および臨床的応答、Cancer Res. 2003; 63: 2127-2133）は、転移性腎癌を有する患者のOFA/iLR由来のMHCクラスI拘束性エピトープに対するT細胞の反応性を報告した。この研究では、著者らはまた、OFA/iLRをコードするRNAと他の推定腫瘍抗原とをトランスフェクトした自己樹状細胞による治療ワクチン接種を受けた患者の予想外に低い死亡率を報告している。しかしながらSuらには、OFA/iLR由来エピトープの数、HLA拘束性、および化学的同定は開示されていない。Hoeltlら（Hoeltl Lら、腫瘍溶菌パルス化自己樹状細胞による転移性腎細胞癌の免疫療法、Clin. Cancer Res.、2002; 8: 3369-3376）は、OFA/iLRが特異的な細胞性免疫応答を刺激する治療ワクチンに基づく癌の免疫療法に非常に有用であるさらなる証拠を述べた。該著者らは、自己のまたは同種の腫瘍細胞溶解物を提示した自己樹状細胞をワクチン接種された転移性腎細胞癌（RCC）の5/6の患者が、OFA/iLRに対する増強された免疫応答の特徴をもったことを発見した。また、Hoeltlらは、OFA/iLR由来のエピトープは開示しなかった。興味のあることに、OFA/iLRに対して最も強い免疫応答を有する患者は、完全かつ部分的な臨床的応答を有した。

本発明者らの少量の一連の初期疾患（Binet A）を有するCLL患者において、関連するiRL1またはiLR2ペプチドに特異的なIL-10分泌T細胞は検出できなかった（データは示されていない）。本発明者らは、現時点でIFN-γまたはIL-10分泌抗OFA/iLRP特異的T細胞の発生と、CLLと多発性骨髄腫を有する患者における疾患の段階との間のあり得る関係をより正確に解明するための実験に携わっている。

概略的には本発明者らは、最初にOFA/iLRタンパク質から誘導された２つの異なるHLA-A*0201特異的ペプチドエピトープを同定した。これらのペプチドは、腫瘍の免疫学的研究を実施すること、およびOFA/iLR発現悪性腫瘍におけるワクチン接種ストラテジーの両方に有用な手段を提供する。

本発明はさらなる態様において、標的細胞がここで与えられるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法に関し、該方法は患者に有効量の本発明のペプチドまたは本発明の核酸、あるいは本発明の発現ベクターを投与することを含み、該ペプチドの量、該核酸の量、あるいは該発現ベクターの量は、該患者に抗標的細胞免疫応答を引き起こすのに効果的なものである。

本発明はさらなる態様において、標的細胞が本発明によって与えられるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法に関し、該方法は本発明で定義される有効数の細胞毒性Tリンパ球（CTL）を患者に投与することを含む。

本発明はさらなる態様において、標的細胞が本発明によって与えられるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法に関し、該方法は(1)患者からCTLを得るステップと、(2)該細胞中にT細胞レセプター（TCR）または本発明により定義したような機能的に等価な分子をコードする核酸を導入するステップと、(3)ステップ(2)で作製された細胞を患者に導入するステップとを含む。

好ましくは、標的細胞は癌細胞である。さらに好ましくは、該癌は白血病またはリンパ腫であり、これは本発明によって与えられるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する。

本明細書で開示かつ説明する本発明の特徴が、示したようなそれぞれの組み合わせのみならず、本発明の意図する範囲から逸脱することなく、特異な方法で用いられることは理解されるべきである。

本発明を図面、配列表および実施例を参照しながら以下でより詳細に説明する。以下の実施例は例示目的でのみ与えられるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。

配列番号1から配列番号2は、本発明によるMHCクラスIによって提示されるペプチドを含むT細胞エピトープのペプチド配列を示している。

配列番号6から配列番号17は、実施例で用いられるペプチド配列を示している。

図１は、ILR1に特異的なCTLによる様々なセルラインの認識を示している。
図２は、ILR1について、CD8、MHCクラスIまたはTCRを認識する抗体による標的細胞溶解の阻止を示している。
図３は、（Ａ）１回目の実験、（Ｂ）２回目の実験で、HLA-A*02/ILR1に特異的なCTLがCLL患者の腫瘍細胞を死滅させることが示されている。
図４は、（Ａ）１回目の実験、（Ｂ）２回目の実験で、HLA-A*02/ILR1に特異的なCTLがAML患者の腫瘍細胞を死滅させることが示されている。
図５Ａは、ILR1特異的CTLによる、ペプチドパルスT2標的細胞の溶解の投与量依存性を示している。図５Ａは、非放射性標的によるILR1特異的CTLの阻害を示している（非放射性標的阻害分析）。
図６は、ILR2に特異的なCTLによる種々のセルラインの認識を示している。
図７は、ILR2について、CD8、MHCクラスIまたはTCRを認識する抗体による標的細胞溶解の阻止を示している。
図８は、（Ａ）１回目の実験、（Ｂ）２回目の実験で、HLA-A*02/ILR2に特異的なCTLがAML患者の腫瘍細胞を死滅させることを示している。
図９は、（Ａ）１回目の実験、（Ｂ）２回目の実験で、HLA-A*02/ILR2に特異的なCTLがCLL患者の腫瘍細胞を死滅させることを示している。
図１０Ａは、ILR2特異的CTLによる、ペプチドパルスT2標的細胞の溶解の投与量依存性を示している。図１０Ｂは、非放射性標的によるILR2特異的CTLの阻害を示している（非放射性標的阻害分析）。
図１１は、TAP（transporter associated with antigen processing）欠損Tセルラインを用いるin vitro再構築分析を示しており、２つのペプチド（iLR1、iLR2）のみが、Flu 核タンパク質_58-66と比較した場合、HLA-A*0201に対する強力な結合親和性を示している（図１１ＡおよびＢ）。ILR3〜ILR14とインフルエンザウィルス（Flum1）由来の対照ペプチドとを比較すると、ILR1ペプチドとILR2ペプチドはHLA-A*02に対する良好な結合親和性を示している。
図１２は、末梢血由来のA2/RPS-001およびA2/RPS-002特異的なCD8陽性リンパ球の増大を引き起こす微粒子（microsphere）の代表的な四量体分析を示している。健常HLA-A2陽性ドナーHBC-065のウェルあたり1×10⁶CD8陽性濃縮PBMCを、若干の変更しながら前述のように、１ウェルで、抗CD28パルス高密度腫瘍抗原A*0201/RPS-001（上方パネル）また高密度腫瘍抗原A*0201/PRS-002（下方パネル）に結合した微粒子により、週に１度刺激した（Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S.、最前線：較正されたMHC/抗CD28被覆ミクロスフィア上に発現したヒトCD8T細胞の所定の親和性、J Immunol. 2003年11月15;171(10):4974-8）。３度のin vitro刺激後、両方のウェルの細胞は、抗体CD8FITCパルス四量体A*0201/RPS-001APCとA*0201/RPS-002PEで染色した。細胞は、リンパ球集団上（左と中央のパネル）、またはCD8陽性リンパ球集団上（右のパネル）にゲート（gate）される。数はCD8陽性リンパ球内における四量体陽性のパーセンテージを示している。RPS-001＝LLAARAIVAI (配列番号1); RPS-002 = ALCNTDSPL (配列番号2)

実施例
本発明を通して使用する略語は以下の通りである。
Ab: 抗体（Antibody）
Ag: 抗原（Antigen）
APC: 抗原提示細胞（antigen presenting cell）
CD: 分化クラスタ（Cluster of Differentiation）
cpm: 数／分（counts per minute）
DC: 樹状細胞（Dendritic Cell）
EBV:エプステイン-バーウィルス（Epstein-Barr Virus）
ESI: エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization）
HLA:ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen）
HPLC: 高速液体クロマトグラフィ（High Performance Liquid Chromatography）
IFN: インターフェロン（Interferon）
Ii: 不変鎖（invariant chain）(CD74)
IL: インターロイキン（Interleukin）
MALDI: マトリックス支援レーザ脱離／イオン化（matrix assisted laser desorption/ionization）
MHC: 主要組織適合抗原複合体（Major Histocompatibility Complex）
MS: 質量分析法（mass spectrometry）
OD₄₅₀: 波長450 nmでの光学濃度（Optical Density at a wavelength of 450 nm）
PBMC: 末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells）
PCR: ポリメラーゼ鎖反応（Polymerase Chain Reaction）
PHA: フィトヘマグルチニン（Phytohemagglutinin）
SDS-PAGE: ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）
S.I.: 刺激インデックス（stimulation index）
TOF: 飛行時間（time of flight）

セルライン、腫瘍試料、および末梢血単核細胞（PBMC）
この研究で用いる全てのセルラインは、American Type Culture Collection（米国ヴァージニア州マナッサス）から得た。PBMC、CD34⁺前駆細胞、骨髄細胞および腫瘍試料は、インフォームドコンセントを行い、治験承認委員会の承認を得た後、健常ドナー、急性骨髄性白血病（AML）患者、慢性リンパ球性白血病（CLL）患者、および多発性骨髄腫（MM）患者からそれぞれ採取した。

抗体
MAM-6に対する抗体：スイス国Alexis Corp.、D-35305グリュンベルク、グラウスストラーセ10のAXXORA DEUTSCHLAND GmbHを通じて得た製品No. SIG-614、
BD HLA-A*02に対する抗体：PharmingenからのクローンBB7.2、カタログNo. 551230、
CD8に対する抗体：Beckman Coulterからのclone SFCI21Thy2D3 (T8)、Part. No. 6602139、
TCRに対する抗体：Beckman CoulterからのクローンBMA031、Part. No. IM1466、
CD4に対する抗体：Beckman CoulterからのクローンSFCI12T4D11 (T4)、Part. No. 6602138、
HMFG-1に対する抗体：Beckman Coulterからのクローン1.10F3、Part. No. IM0271

ペプチド
ペプチドFluM1_58-66 (GILGFVFTL)、HIV-Pol_476-484 (ILKEPVHGV、ELISPOT分析における陰性コントロール)、msurv33 (LYLKNYRIA、T2結合分析における陰性コントロール、H2^d、に特異的なネズミサバイビンペプチドエピトープ)、iLR1_59-68 (LLAARAIVAI)、iLR21_46-154 (ALCNTDSPL)、iLR3_60-68 (LAARAIVAI)、iLR4_58-66 (LLLAARAIV)、iLR5_7-15 (VLQMKEEDV)、iLR6_50-58 (NLKRTWEKL)、iLR7_66-74 (VAIENPADV)、iLR8_139-147 (YVNLPTIAL)、iLR9_177-185 (MLAREVLRM)、iLR10_249-257 (SEGVQVPSV)、iLR11_18-26 (FLAAGTHLG)、iLR12_57-66 (KLLLAARAIV)、iLR13_67-76 (AIENPADVSV)、iLR14_173-182 (LMWWMLAREV)は、Biosynthan（独国ベルリン）から購入した、純度90％以上のものであり、高速液体クロマトグラフィと質量分析法によって解析した。

ペプチドの合成と解析
ペプチドは、Fmoc/tBu法に従い、自動ペプチド合成装置EPS221（独国ランゲンフェルドのAbimed）で合成した。TFA/フェノール/エタンジチオール/チオアニソール/水（容量で、90/3.75/1.25/2.5/2.5）で1〜3時間処理することによって樹脂から除去した後（アルギニン含有ペプチド）、ペプチドをメチル-t-ブチルエーテルから沈殿させ、メチル-t-ブチルエーテルで１回洗浄し、ジメチルエーテルで２回洗浄後、凍結乾燥前に水に懸濁した。合成生成物は、HPLC（Varian star、独国ミュンヘンのZinsser analytics）、およびMALDI-TOF質量分析計（future、GSG；独国ブルフザール）で分析した。80％未満の純度のペプチドを調製用HPLCで精製した。

T2結合分析
Casatiら（Casati C, Dalerba P, Rivoltini Lら）から採用したプロトコルを用いて、T2全細胞結合分析を実施した。アポトーシス阻害タンパク質サバイビンは、結腸癌患者において腫瘍特異的なCD8陽性とCD4陽性T細胞を誘導する（Cancer Res. 2003; 63, 4507-4515）。

ヒトCTLの産生
健康なHLA-A*0201陽性の個体由来CTLを、いずれか（Zeis M, Siegel S, Schmitz Mら、サバイビンRNAトランスフェクト樹状細胞による血液腫瘍に対する細胞毒性Tリンパ球の誘導、J Immunol. 2003年; 170, 5391-5397）に開示のプロトコルを用いて産生した。AMLとCLLの患者から得た自己OFA/iLRペプチド特異的CTLの誘導のため、免疫磁気ビーズ（MACS（登録商標）、独国ベルギッシュ-グラッドバッハのMiltenyi）を用いてCD8陽性T細胞をPBMCから分離し、自己OFA/iLRペプチドパルス完全成熟DCで培養し、IL-2（1 ng/ml、独国ヴァイスキルシュのCellConcepts）の存在下で、自己ペプチドパルスPBMCで再刺激した。少なくとも再刺激の4週間後、CTL反応性を通常の4時間⁵¹クロム放出分析で測定した。非放射性標的阻害分析および抗体阻害試験は、前述したように実施した（Zeis M, Siegel S, Schmitz Mら、サバイビンRNAトランスフェクト樹状細胞による血液腫瘍に対する細胞毒性Tリンパ球の誘導、J Immunol. 2003年; 170, 5391-5397）。

ELISPOT分析
患者におけるOFA/iLRペプチド特異的T細胞の発現頻度を測定するため、製造元の手引きに従ってインターフェロン-γ-ELISPOTキット（独国ハイデルベルクのBecton Dickinson）を用いてELISPOT分析を実施した。

表１：本発明で同定されるペプチドと腫瘍関連Tヘルパー細胞ペプチドエピトープ

結果
ペプチド：ILR1 (LLAARAIVAI, 配列番号1)およびILR2 (ALCNTDSPL, 配列番号2)
全てのELISPOT解析において、IFN-γ-陽性スポットに与えられる数は、10⁵PBMC当たりである。解析の前に、患者由来のT細胞と健常ドナー由来のT細胞とを7日間インターロイキン-2（IL-2）（10単位／ml）とペプチド（10 μg／10⁶PBMC／ml）の存在下で保持した。

プローブした健常ドナーの全試料は、IFN-γ-ELISPOT解析においてILR1またはILR2に応答する少量のCTLを有する（表２）。

IFN-γELISPOT解析において、プローブしたCLL患者の腫瘍試料のうち、12/20（60％）はILR1ペプチドに対して顕著な（>20）CTL応答を有し、9/16（56％）はILR2ペプチドに対して応答を有する。２つのILR誘導ペプチドについて陽性に染色されたCTLの中央値数を、インフルエンザマトリックスタンパク質（ほぼ全ての成人が事前にそれに対して細胞性免疫応答を有する）由来の共通のHLA-A*02拘束性リコール抗原で得られる応答の数の55％（ILR2）と76％（ILR1）とを比較した（表３）。

IFN-γELISPOT解析において、プローブしたAML患者の腫瘍試料のうち、6/15（40％）はILR1ペプチドに対して顕著な（>20）CTL応答を有し、7/15（47％）はILR2ペプチドに対して応答を有する（表４）。

IFN-γELISPOT解析において、プローブした骨髄腫患者の腫瘍試料のうち、8/14（57％）はILR1ペプチドに対して顕著な（>20）CTL応答を有し、6/14（43％）はILR2ペプチドに対して応答を有する（表５）。

要するに、OFA/ILRP由来のペプチドILR1とILR2が、癌細胞、特に白血病およびリンパ腫由来の細胞に対する細胞免疫応答を誘引する潜在能力が、明確に現れるようになる。該ペプチドに特異的なT細胞は、エフェクター作用（IFNγの分泌）を示す。

表６：末梢血由来のA2/RPS-001およびA2/RPS-002特異的CD8陽性リンパ球の増大を引き起こす微粒子の四量体解析の概要。ウェル当たり1×10^6のCD8陽性濃縮PBMCを、抗CD28パルス高密度腫瘍抗原A*0201/RPS-001または高密度腫瘍抗原A*0201/RPS-002に結合した微粒子により、図１２におけるように刺激した。示されているのは、少なくとも１つの明確な陽性応答を有する評価可能なHLA-A2陽性ドナーの数、評価可能な全ドナーにおける評価可能な刺激の数、および明確な陽性応答を有する評価可能な刺激の数である。PS-001＝LLAARAIVAI (配列番号1)、RPS-002=ALCNTDSPL (配列番号2)

ILR1(LLAARAIVAI)に関連した他の試験
ILR1ペプチドを認識するT細胞を、K562（ヒト前赤芽球白血病セルライン、慢性骨髄性白血病（CML）セルラインとしても知られ、HLAレベルが非常に低いことから、エフェクター細胞としてのNK細胞を排除するためのコントロールとして作用する）、IM9（ヒトBリンパ芽球様セルライン）、Karpas-422（ヒトB細胞リンパ腫）、Balm-3（ヒト非バーキットBリンパ腫セルライン）、U266（ヒト多発性骨髄腫）、REH（ヒトB細胞前駆体白血病）、MEC-1（ヒト慢性B細胞白血病）で試験した。同じT細胞は、コントロールとして健常ドナー由来の自己および同種のPBMCを試験した。MEC-1を除く全てのセルラインは、HLA-A*02対立遺伝子を発現せず、一般にHLAクラスI遺伝子発現欠損のK562はILR1特異的T細胞により認識された（図１参照）。健常ドナー由来の同種かつ自己細胞は認識されず、これは以下であることを示している。
１．ILR1は、腫瘍細胞中でのみ、ペプチドレベルで顕著に発現されるが、HLA適合健常ドナー由来の血液単核細胞では発現されない。
２．応答は、同種主要または副組織適合抗原に対するものではない。
３．ILR1ペプチドは、HLA拘束性様式で認識される。
４．拘束性は、対立遺伝子特異的である（A*02に特異的）。

標的: AML
HLA-A*02拘束性ILR1に特異的なT細胞を、AML患者由来の腫瘍細胞（4人の患者、試料AML-01、-02、-03、-06）について試験した（図４Ａ）。A*02陽性患者（3/4）由来の細胞は、25.9％〜39.8％の範囲の40:1であるE:T比における最大溶解により認識した。A*02陰性患者AML-06由来のAML細胞は認識されなかった。

HLA-A*02拘束性ILR1に特異的なT細胞を、１回目の試験で得られた結果を確認するために、AML患者由来の腫瘍細胞について２回目として試験した（9人の患者、試料AML-01、-02、-04、-05、-06、-07、-09、-10、-12）。A*02陽性患者（5/9、AML-02、-04、-05、-09、-10）由来の細胞は全ての場合に認識した。A*02陰性患者（4/9、AML-01、-06、-07、-12）由来の細胞は認識されなかった（4/4）（図４Ｂ）。

図４Ｂはまた、A*02陽性ドナー由来CD34陽性骨髄誘発前駆細胞（CD34-01、-02）におけるデータを示しており、これらは活性化ILR1特異的T細胞によっては認識されず、IL-2の存在下で、IRL1により7日間in vitroで再刺激した。また、A*02陽性ドナー由来骨髄細胞（BM-01、-02）はこれらT細胞クローンによっては認識されなかった。

図２は、T細胞応答の特異性をさらに特徴付けるための抗体阻害検査を示している。40:1の一定であるE:T比における51Cr放出試験の前に、阻害するmAbを、ヒトBリンパ芽球様セルラインIM-9で、製造元によって提示されたmAb濃度において培養した。阻害試験により、ILR1の認識には以下が介在することが示されている。
１．T細胞レセプター（TCR）担持細胞が、
２．MHCクラスI（HLAクラスI）の構成において、それらの標的を認識し、
３．それはCD4ではなくコレセプターCD8に依存した相互作用の機構によるものである。

関連性のない、ムチン様細胞表面タンパク質MAM-6（別名CA15-3、DF3）とHMFG-1に特異的なコントロールmAbは、IM-9細胞のエフェクターT細胞による認識に対しては効果を有さない。PBSは陰性のコントロールとしてこれら阻害試験に用いられた。

要約すると、これら２セットの実験は以下を確認する。
１．ILR1は、試験したA*02陽性AML患者（8/13）の100％（8/8）で腫瘍関連抗原であること。
２．ILR1はHLA-A*02によって拘束されること。
３．ILR1特異的T細胞は、腫瘍細胞上で天然に処理されたILR2を認識し、一方、同時にはILR1ペプチドが骨髄およびCD34陽性前駆細胞には存在しないようであること。
４．標的とエフェクター細胞との間の相互作用が、MHCクラスI、TCR又はCD8に対するmAbで特に阻害されるうること。

標的：CLL
HLA-A*02拘束性ILR1に特異的なT細胞を、CLL患者（5人の患者、試料CLL-01、-02、-03、-05、-06）由来の腫瘍細胞で試験した。A*02陽性患者（3/5）由来の細胞は、全ての場合（3/3）で認識された。A*02陰性患者由来の細胞は、いずれの場合でも（0/2）認識されなかった（図３Ｂ）。8人のさらなるCLL患者で実験を繰り返したところ（図３Ａ）、それらの4/8はA*02陽性であった。4/4のA*02陽性患者由来のCLL細胞が認識され、一方、0/4のA*02陰性標的細胞が認識されたため、これらの追加実験により前述の結果が確認された。要約すると以下の通りである。
１．ILR1は、試験したA*02陽性CLL患者の100％（7/7）において腫瘍関連抗原である。
２．ILR1は、HLA-A*02で拘束される。

標的：T2
TAP（"Transporter associated with Antigen Processing"）の発現のためT2細胞を欠損しており、これは細胞質から小胞体（ER）まで短いペプチドを往復させる働きを担い、ペプチドを空のMHCクラスI分子上に載せる。その結果、ペプチドを添加しない場合（外部からの取り込み）、T2細胞のMHCクラスI分子は空のままである。そのため、細胞表面上の空のHLA-A*02分子を発現するT2細胞は、HLA-A*02拘束性T細胞によるペプチド特異的な死滅について適定曲線を確立するための最適な標的である。

この実験において（図５Ａ）、ILR1に特異的なT細胞をHIV由来の前述のT細胞エピトープまたはILR1ペプチドLLAARAIVAIのいずれかでパルスしたT2細胞について試験した。
結果：T細胞は、ILR1ペプチドでパルスしたT2細胞のみを認識した。HIVペプチドでパルスしたT2細胞は認識されなかった。ILR1ペプチドパルスT2標的は投与量に依存する様式で溶解した。溶解は試験した濃度範囲内では飽和に達しなかった。

標的：T2 + ILR1
非放射性標的阻害分析(cold target inhibition assay)を実施した。ILR1特異的T細胞がILR1ペプチドパルスT2細胞を特異的にかつHLA-A*02の構成中で溶解するか否かを試験するために、非放射性標的阻害分析を以下のように行った：⁵¹Cr標識を付したT2細胞を、10μgペプチド/10⁶T2細胞/mlの濃度でペプチドで負荷した。同じまたはコントロールのペプチドで同等に負荷された全部で2×10⁵の標識を付していないT2細胞を、次いで10⁴ペプチドパルス⁵¹Crラベルを付したT2細胞に、容量で50μlのAIMV中に添加した。ILR1に特異的なエフェクターT細胞を添加し、⁵¹Cr放出分析を上述のように行った。解析の結果は、ILR1特異的CTLに関連しないペプチド（サバイビンとILR2）も、それら細胞表面上で空のHLA-A*02分子を示す負荷されていないT2細胞のいずれも、ILR1特異的CTLによるILR1ペプチドで負荷された標的の溶解に対抗しないことを示す。対照的に、合成ILR1ペプチドまたは、HLA-A*02の構成中でILR1を天然に示すAML腫瘍細胞でパルスした標的は２回目の（非放射性）標的としていったん用いられ、次いでILR1特異的CTLによる溶解に対して、主要標的細胞（放射性、ILR1ペプチドパルスT2）に対抗する（図５Ｂ）。

ILR2 (ALCNTDSPL)に関連する他の実験
ILR2ペプチドを認識するT細胞（図６）を、K562（ヒト前赤芽球白血病セルライン、あるいは、慢性骨髄性白血病（CML）セルラインとしても知られ、HLAレベルが非常に低いことから、エフェクター細胞としてのNK細胞を排除するためのコントロールとして作用する）、IM9（ヒトBリンパ芽球様セルライン）、Karpas-422（ヒトB細胞リンパ腫）、Balm-3（ヒト非バーキットBリンパ腫セルライン）、U266（ヒト多発性骨髄腫）、REH（ヒトB細胞前駆体白血病）、Ramos（別名RA 1、ヒトバーキットリンパ腫Bリンパ芽球）、MEC-1（ヒト慢性B細胞白血病）について試験した。同じT細胞を用いて、健常ドナー由来の自己および同種PBMCをコントロールとして試験した。

HLA-A*02対立遺伝子を発現しないRamosとMEC-1、およびHLAクラスI遺伝子発現を一般に欠損させたK562を除く全てのセルラインは、ILR2特異的T細胞で認識された。健常ドナー由来の同種かつ自己細胞の両方は認識されず、これは以下のことを示している。
１．ILR2は、腫瘍細胞においてペプチドレベルで顕著に発現されるが、HLA適合健常ドナー由来の血液単核細胞では発現されない。
２．応答は、同種の主要または副組織適合複合抗体に対するものではない。
３．ILR2ペプチドはHLA拘束性様式で認識される。
４．拘束性は対立遺伝子特異的である（A*02に対して特異的）。

標的：AML
HLA-A*02拘束性ILR2に特異的なT細胞を、AML患者（8人の患者、試料AML-01、-02、-04、-05、-06、-07、-10、-12）由来腫瘍細胞について試験した。A*02陽性患者由来細胞（4/8、AML-02、-04、-05、-10）は全ての場合（4/4）で認識された。A*02陰性患者由来細胞（4/8、AML-01、-06、-07、-12）は認識されなかった（4/4）（図８Ａ）。実験は、以前に試験されなかった患者由来の試料で２回行った。２回目の実験において、HLA-A*02拘束性ILR2に特異的なT細胞を、AML患者由来腫瘍細胞（4人の患者、試料AML-01、-02、-03、-06）について再度試験した。A*02陽性患者由来細胞（3/4）は全ての場合で認識された。A*02陰性患者由来細胞は認識されなかった（0/1）（図８Ｂ）。

図８Ａは、A*02陽性ドナー由来CD34陽性骨髄誘導の前駆細胞（CD34-01、-02）におけるデータを示しており、in vitroで7日間IL-2の存在下でILR2により再刺激された活性化ILR2特異的T細胞によって認識されなかった。また、A*02陽性ドナー由来骨髄細胞（BM-01、-02）は、これらT細胞クローンでは認識されなかった。

図７は、T細胞応答の特異性をより特徴付けるための抗体阻害実験を示している。40:1の一定であるE:T比における51Cr放出試験の前に、阻害するmAbを、ヒトBリンパ芽球様セルラインIM-9で、製造元によって提示されたmAb濃度において培養した。阻害実験により、ILR2の認識がT細胞レセプター（TCR）担持細胞により媒介され、CD4ではなくコレセプターCD8に依存する相互作用の機構により、MHCクラスI（HLAクラスI）の構成中でそれら標的を認識することを示す。

関連のないムチン様細胞表面タンパク質MAM-6（別名CA15-3、DF3）とHMFG-1に特異的なコントロールmAbは、エフェクターT細胞によるIM-9細胞の認識に対する効果を有さなかった。これら阻害実験でPBSを陰性コントロールとして用いた。要約すると、これら２セットの実験により以下であることを確認した。
１．ILR2は、試験したA*02陽性AML患者の100％（7/7）において腫瘍関連抗原であること。
２．ILR2はHLA-A*02によって拘束されること。
３．ILR2特異的T細胞は、腫瘍細胞上で天然に処理されるILR2を認識し、一方、同時にはILR2ペプチドが骨髄およびCD34陽性前駆細胞には存在しないようであること。
４．標的とエフェクター細胞との間の相互作用が、MHCクラスI、TCR又はCD8に対するmAbで特異的に阻害されること。

標的：CLL
HLA-A*02拘束性ILR2に特異的なT細胞を、CLL患者由来腫瘍細胞（8人の患者、試料CLL-01、-02、-03、-04、-05、-06、-07、-08）について試験した。A*02陽性患者由来細胞（4/8）は全ての場合で認識された（4/4）。A*02陰性患者由来細胞はいずれの場合でも認識されなかった（0/4）（図９Ａ）。実験を5人のさらなるCLL患者で繰り返し（図９Ｂ）、それら患者の3/5はA*02陽性であった。3/3のA*02陽性患者由来CLL細胞が認識され、一方で0/2のA*02陰性標的細胞が認識されたことから、これら追加の実験により前述の結果が確認された。結果と概要：
１．ILR2は、試験したA*02陽性CLL患者の100％（7/7）において腫瘍関連抗原である。
２．ILR2はHLA-A*02によって拘束される。

標的：T2
T2細胞はTAP（Transporter associated with Antigen Processing）の発現を欠損しており、これは細胞質から小胞体(ER)までの短いペプチドの往復の働きを担い、該ペプチドは空のMHCクラスI分子上に載せられる。その結果、ペプチドを加えない場合（外部からの取り込み）、T2細胞のMHCクラスI分子は空のままである。そのため、細胞表面上で空のHLA-A*02分子を発現するT2細胞は、HLA-A*02拘束性T細胞によるペプチド特異的な死滅についての滴定曲線を確立するのに最適な標的である。この実験において、ILR2に特異的なT細胞を、HIV由来の前述のT細胞エピトープまたはILR2ペプチドALCNTDSPLのいずれかでパルスしたT2細胞について試験した。結果：T細胞は、ILR2ペプチドでパルスしたT2細胞のみを認識した。HIVペプチドでパルスしたT2細胞は認識されなかった。ILR2ペプチドパルスT2標的は、投与量に依存する様式で溶解した。溶解は、試験した濃度範囲内では飽和に達しなかった（図１０Ａ）。

標的：T2 + ILR2
非放射性標的阻害分析を上記「T2+ILR1」のように実施した。この実験の結果によりILR2特異的CTLに関連のないペプチド（サバイビンとILR1）も、それら細胞表面上に空のHLA-A*02分子を示す、負荷されなかったT2細胞のいずれも、ILR2特異的CTLによるILR2ペプチドで負荷された標的の溶解に対抗しないことを確認した。対照的に、合成ILR2ペプチド、またはHLA-A*02の構成中でILR2を天然に示すAML腫瘍細胞によりパルスされた標的を、二次（非放射性）標的としていったん用いた後は、ILR2特異的CTLによる溶解について主要標的細胞（放射性、ILR2ペプチドパルスT2）に対抗する（図１０Ｂ）。

要するに、本発明のIRL由来ペプチドのいずれも、一般的に癌患者のペプチドに基づく治療ワクチンを開発するための候補物である。

は、ILR1に特異的なCTLによる様々なセルラインの認識を示している。 は、ILR1について、CD8、MHCクラスIまたはTCRを認識する抗体による標的細胞溶解の阻止を示している。 １回目の実験で、HLA-A*02/ILR1に特異的なCTLがCLL患者の腫瘍細胞を死滅させることが示されている。 ２回目の実験で、HLA-A*02/ILR1に特異的なCTLがCLL患者の腫瘍細胞を死滅させることが示されている。 １回目の実験で、HLA-A*02/ILR1に特異的なCTLがAML患者の腫瘍細胞を死滅させることが示されている。 ２回目の実験で、HLA-A*02/ILR1に特異的なCTLがAML患者の腫瘍細胞を死滅させることが示されている。 ILR1特異的CTLによる、ペプチドパルスT2標的細胞の溶解の投与量依存性を示している。 非放射性標的によるILR1特異的CTLの阻害を示している（非放射性標的阻害分析）。 ILR2に特異的なCTLによる種々のセルラインの認識を示している。 ILR2について、CD8、MHCクラスIまたはTCRを認識する抗体による標的細胞溶解の阻止を示している。 １回目の実験で、HLA-A*02/ILR2に特異的なCTLがAML患者の腫瘍細胞を死滅させることを示している。 ２回目の実験で、HLA-A*02/ILR2に特異的なCTLがAML患者の腫瘍細胞を死滅させることを示している。 １回目の実験で、HLA-A*02/ILR2に特異的なCTLがCLL患者の腫瘍細胞を死滅させることを示している。 ２回目の実験で、HLA-A*02/ILR2に特異的なCTLがCLL患者の腫瘍細胞を死滅させることを示している。 ILR2特異的CTLによる、ペプチドパルスT2標的細胞の溶解の投与量依存性を示している。 非放射性標的によるILR2特異的CTLの阻害を示している（非放射性標的阻害分析）。 TAP（transporter associated with antigen processing）欠損T細胞ラインを用いるin vitro再構築分析を示す。 TAP（transporter associated with antigen processing）欠損T細胞ラインを用いるin vitro再構築分析を示す。 末梢血由来のA2/RPS-001およびA2/RPS-002特異的なCD8陽性リンパ球の増大を引き起こす微粒子（microsphere）の代表的な四量体分析を示している。

Claims (28)

1. 配列番号1もしくは配列番号2のいずれかに記載の配列、またはそれらの変異体の少なくとも１つを含むペプチドの群から選択され、完全なヒト腫瘍関連ポリペプチドではない腫瘍関連ペプチド。
2. 前記ペプチドが、配列番号1もしくは配列番号2のいずれかに記載のアミノ酸配列、またはそれらの変異体から本質的になる、請求項１記載の腫瘍関連ペプチド。
3. 前記ペプチドが9〜30アミノ酸の全長を示す、請求項１または２に記載の腫瘍関連ペプチド。
4. 配列番号1または配列番号2のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、請求項１〜３いずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。
5. ヒト主要組織適合複合体（MHC）クラスI、特にHLA-A*0201の分子に対する結合能を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。
6. HLA-A*0201に結合したとき、該結合ペプチドが所与のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞を認識する細胞毒性Tリンパ球（CTL）の生成を誘発することができる、請求項５に記載の腫瘍関連ペプチド。
7. ヒト主要組織適合複合体（MHC）クラスII、特にHLA-DRB1の分子に対する結合能を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。
8. 前記ペプチドが非ペプチド結合を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。
9. 前記ペプチドが融合タンパク質である、請求項１〜８のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。
10. 請求項１〜９のいずれか１に記載のペプチドをコードする核酸。
11. DNA、cDNA、PNA、CNA、RNAまたはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の核酸。
12. 請求項１０または１１に記載の核酸を発現可能な発現ベクター。
13. 請求項１０または１１に記載の核酸あるいは請求項１２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
14. 請求項１〜９のいずれか１に記載の腫瘍関連ペプチドの作製方法であって、請求項１３に記載の宿主細胞を培養すること、および該宿主細胞またはその培養培地から前記ペプチドを分離することを含む方法。
15. 請求項１〜９のいずれか１に記載の腫瘍関連ペプチド、請求項１０もしくは１１に記載の核酸または請求項１２に記載の発現ベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
16. 請求項１〜９のいずれか１に記載の腫瘍関連ペプチド、請求項１０または１１に記載の核酸、あるいは請求項１２に記載の発現ベクターの、医薬における使用。
17. 請求項１〜９のいずれか１に記載の腫瘍関連ペプチドと、請求項１０もしくは１１のいずれかに記載の核酸または請求項１２に記載の発現ベクターとを含む、癌ワクチン。
18. 標的細胞が請求項１〜９のいずれかに与えられるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する患者において、標的細胞を死滅させるための医薬の製造における、請求項１〜９のいずれか１に記載の腫瘍関連ペプチド、あるいは請求項１０もしくは１１に記載の核酸または請求項１２に記載の発現ベクターの使用。
19. 活性化細胞毒性Tリンパ球（CTL）のin vitro作製方法であって、該方法が、該CTLを活性化させるのに十分な時間、抗原特異的な様式で、好適な抗原提示細胞の表面上で発現したヒトクラスIまたはII MHC分子に載せられた抗原とCTLをin vitroで接触させること含み、該抗原が請求項１〜９のいずれか１に記載のペプチドである方法。
20. 十分量の前記抗原を抗原提示細胞に接触させることにより、前記抗原が、好適な抗原提示細胞の表面上で発現するクラスIまたはII MHC分子上に載せられる、請求項１９に記載の方法。
21. 前記抗原提示細胞が請求項１２に記載の発現ベクターを含む、請求項１９に記載の方法。
22. 前記クラスI MHC分子がHLA-A*0201である、請求項１９〜２１のいずれか１に記載の方法。
23. 前記クラスII MHC分子がHLA-DRB1である、請求項１９〜２１のいずれか１に記載の方法。
24. 請求項１９〜２３のいずれか１に記載の方法により作製された活性化細胞毒性Tリンパ球（CTL）であって、該CTLが請求項１〜９のいずれか１で与えられるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞を選択的に認識する、活性化細胞毒性Tリンパ球。
25. 請求項１〜９のいずれか１で与えられるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞を認識するT細胞レセプター（TCR）であって、該TCRが請求項２４の細胞毒性Tリンパ球（CTL）またはTCRに機能的に等価な分子から得られうる、T細胞レセプター。
26. 請求項２５に記載のT細胞レセプター（TCR）をコードする、核酸。
27. 請求項２６に記載の核酸をコードするT細胞レセプター（TCR）を発現可能な発現ベクター。
28. 標的細胞が請求項１〜９のいずれかで与えられるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する患者において、標的細胞を死滅させるための医薬の製造における、請求項２４に記載の細胞毒性Tリンパ球の使用。