JP2005110693A - ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製方法、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤、および上記方法の使用 - Google Patents

Abstract

【課題】 菌糸体バイオバスからのＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製に好適な精製方法、上記方法により得られたＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤、および上記方法の使用を提供する。
【解決手段】 ロバスタチン等のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を、複合化された結晶化の各工程に供して、９９．６％より高い純度を得るステップを有する精製方法およびその使用。上記複合化された結晶化の各工程は、水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒または上記有機溶媒と水との混合液から、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を結晶化する工程と、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を、上記水混和性もしくは水溶性より小さい水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機エステル溶媒から結晶化する工程とを含む。
【選択図】 なし

Description

本発明は、抗高コレステロール血症剤として使用されるＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製方法、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤、および上記方法の使用に関するものである。

ロバスタチン（lovastatin) 、プラバスタチン(pravastatin) 、メバスタチン(mevastatin)、シンバスタチン(simvastatin) およびこれらの誘導体および類似体は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤として知られており、抗高コレステロール血症剤として使用されている。これらＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、アスペルギルス属(Aspergillus) 、モナスカス属(Monascus)、ノカルディア属(Nocardia)、アミコラトプシス属(Amycolatopsis) 、ムコア属(Mucor) またはペニシリウム属(Penicillium) に属する種として識別される、それぞれの種の微生物を用いた培養により製造されている。

安全で効能を有する製薬の製造のためには、主成分の純度は重要な要素となっている。プラズマでの高コレステロールの治療もしくは予防の場合のように、製薬品が長期間にわたり服用される場合、製薬品の可能最大純度は、特に重要なものとなる。低純度の製薬品からの不純物の蓄積は、医療治療中、多くの副作用を引き起こす原因となる。

過去の各特許出願に開示された、抗高コレステロール血症剤の各単離精製方法は、抽出、クロマトグラフィー、ラクトン化、および結晶化方法を互いに異なる組み合わせによって行うものとなっている。これらの処理で得られる最終生成物の純度は９９．６％より低いものとなっている。これらの方法を用いて、より高純度の生成物を得ることは可能ではあるが、これらの方法を大規模工業的に利用した場合、所望の生成物の収量は許容できないほど低いものとなる。

特許文献１に開示される単離方法は、９９．５％を超える純度を有するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を得るための溶液を調製する方法を示しているが、高性能な工業的な高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置の使用が必要となっている。

特許文献１では、約８５％またはそれ以上の純度を有する粗ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を、有機溶媒、もしくは有機溶媒と水との溶液で溶解する。その後、該混合液は、ｐＨ２〜９となるように緩衝され、ＨＰＬＣカラムに供される。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の所望のピークを収集した後、溶媒の一部が除去され、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を結晶化するために、水が添加されるか、または、溶媒混合液の２／３が除去される。最終的には、この処理により得られる生成物の純度は、実際に少なくとも９９．５％であり、収量は約９０％である。
ＷＯ９２／１６２７６号公報（公開日：１９９２年１０月１日）

本発明の要約
本発明は、９９．６％を超える、好ましくは９９．７％を超える純度を有するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の、培養後の培養液からの単離および精製のための新規の工業的な処理方法に関するものである。この目的を達成するために、アスペルギルス属、モナスカス属、ノカルディア属、アミコラトプシス属、ムコア属またはペニシリウム属に属する、それぞれの微生物を用いた培養により生成された化学化合物、およびこれら化合物の異なる溶媒およびｐＨでの化学的特性および性質に対する鋭意研究がなされた。

その結果、上記目的は、以下の各工程を有する本発明の方法により達成された。

本発明に係るＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製方法は、上記課題を解決するために、ロバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、シンバスタチン、これらの誘導体および類似体から選択されるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を精製するための方法であって、複合化された結晶化の各工程に上記ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を供して、９９．６％より高い純度を有しているＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を得るステップを有し、上記複合化された結晶化の各工程は、水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒または上記有機溶媒と水との混合液から、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を結晶化する工程と、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を、上記水混和性もしくは水溶性より小さい水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機エステル溶媒から結晶化する工程とを含む。

上記精製方法では、上記複合化された結晶化は、上記ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤をアセトンにて溶解する工程と、その後、その溶解液に水を加える工程とを水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒または上記有機溶媒と水との混合液から結晶化する工程として含む結晶化と、上記水混和性もしくは水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機エステル溶媒からの結晶化としてのエチルアセテートからの結晶化とを含んでよい。

本発明に係るＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤は、ロバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、シンバスタチン、これらの誘導体および類似体から選択され、上記記載の各精製方法の何れかにより、９９．７％より高い純度を有して得られたものである。

上記記載の各精製方法の何れかの使用は、ロバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、シンバスタチン、これらの誘導体および類似体の単離および／または精製のためのものである。

本発明に係るＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製方法は、以上のように、複合化された結晶化の各工程に上記ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を供して、９９．６％より高い純度を有しているＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を得るステップを有しているので、簡便なステップにより９９．６％より高い純度を得ることができる。それゆえ、上記方法は、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製を簡便化できて、上記の高純度のＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の製造を容易化できるという効果を奏する。

図面を参照しながら、本発明を説明すると、通常、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、細胞内生成物であると共に、細胞外生成物でもあることから、該阻害剤は、菌糸体から培養液へと効果的に溶解されることが、必ずしもそうする必要はないが、好ましい。

特許出願ＷＯ９７／２０８３４号公報に開示されている溶解方法では、培養後の培養液は、アルカリ塩基によりｐＨが１１．５となるように処理され、３時間攪拌される。ＷＯ９７／０６１２８号公報には、培養する培養液をｐＨ１０〜ｐＨ１３の間にアルカリ化することによって溶解を行ってもよいことが記載されている。また、そのような溶解工程においては、６０℃〜９５℃の間の温度が加えられる。

ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、ｐＨが９より高ければ非常に効率的に菌糸体から溶解させることができるが、そのような厳しい条件下に長時間曝されると、ナフタレン骨格の水酸基とカルボン酸との間のエステル結合の解離反応が生じる。さらに厳しい条件下では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤と、脱アシルＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤との平衝は、脱アシル生成物へとシフトする。

本願発明の発明者は、１０℃〜４０℃の温度、好ましくは室温などの１８℃〜２５℃の温度で、１時間未満、好ましくは３０分未満で、例えば約１０分間、ｐＨ９．５〜１３、最も好ましくはｐＨ９．５〜１１．５で行われた溶解の効率は、今までの各特許出願に記載されている、高温で行われ、非経済的で、時間のかかる方法により得られる効率と同等であることを予期せずに見出した。溶解は、ｐＨ９．５未満、特にｐＨ６未満で行うこともできるが、この場合、多量の有機溶媒を使用することが必要になる。

この好ましい実施形態に係るＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の溶解が行われる場合、その後、培養後の培養液は、ｐＨ値を７．５〜８．５にするために、酸性化剤により、好ましくは鉱酸と共に処理される。好ましい鉱酸としては、リン酸、硫酸、および塩酸が挙げられる。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、このｐＨの範囲で安定しており、培養後の培養液も、この工程の後、必要もしくは所望するのであれば、しばらくの間保管することができる。

菌糸体は、ろ過および／または遠心分離などの、適切な分離工程手段によって培養後の培養液から除去される。ろ過が好ましく、ろ過方法としては、標準的なろ過の他に、マイクロフィルトレーション、ウルトラフィルトレーション、ダイアフィルトレーションが好適に使用される。浄化された培養液は、逆浸透、もしくはその他の、低量にするための方法により、低量に、好ましくは５〜１０倍に濃縮される。

以下に説明される、酸性化およびエチルアセテート抽出工程は、精製処理において非常に重要なものである。

上記濃縮液は、酸性化剤により、好適には鉱酸と共に、ｐＨ値が４．５〜７．５となるように酸性化される。鉱酸としては、上記例示したものが使用可能である。その後、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、エチルアセテートを用いて、ｐＨ調整された該濃縮液から抽出される。上記抽出は、向流抽出カラムを用いることによって好適に行うことができる。

ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の分布係数と、エチルアセテート可溶不純物の分布係数との比率は、ｐＨ値５．５〜７．５の範囲、特に６．０〜７．０の範囲で最大となり、この工程では、極性不純物の一部はすでに除去されている。ｐＨ値５未満、特にｐＨ値４未満で行われる抽出は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の分布係数が高くなるため、より効率的であるが、極性不純物のレベルが高くなる。

図１に示すように、このｐＨ値では、エチルアセテート可溶不純物の分布係数も高くなる。ｐＨ４．５〜７．５、特にｐＨ５より高く、さらにはｐＨ５．５より高いｐＨ値で行われたエチルアセテートへの抽出では、極性不純物の分布係数が低いため、極性不純物のレベルは低くなる。濃縮液からエチルアセテートへの、このｐＨ値におけるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の悪化した分布は、長い向流抽出カラムを使用することによって補償することができる。

所望ならば、得られたエチルアセテート抽出物は、その後、濃縮され、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、この処理段階で任意にラクトン化される。ｐＨ５．５〜７．５では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の大部分は遊離酸の状態である。したがって、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤が、製薬品上、ラクトンとして使用されない場合、濃縮およびラクトン化は省略することができる。 ラクトン化は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を、鉱酸もしくは有機酸、最も好ましくはトリフルオロ酢酸（trifluoracetic acid 、ＴＦＡ）と接触させることによって好適に行うことができる。

任意にラクトン化されたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、その後、以下に説明するように、エチルアセテートから直接結晶化されてもよい。もしくは、エチルアセテートは蒸発により好適に除去され、任意にラクトン化される粗ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤が得られる。

このようにして得られた粗ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、その後、吸着クロマトグラフィー、好ましくは逆相クロマトグラフィーに供することができる。吸着クロマトグラフィーの移動相としては、アセトニトリル、もしくはメタノール、エタノール、プロパノールなどの低級アルコール、もしくはこれら溶媒と水との混合物を好適に使用することができる。

好ましくは、粗ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、純品のアセトニトリル、もしくはアセトニトリルが少なくとも３０％容量／容量（ｖ／ｖ）である、アセトニトリルと水との混合液で溶解され、得られる溶液は、吸着クロマトグラフィーカラムに供される。

カラム充填剤としては、オクチルシラン、ジメチルシラン、オクタデシルシラン、シアノシアン、ポリスチレンジビニルベンゼン共重合体、もしくはアクリルポリマーに基づく固定相が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、シリカ、アルミナなどの、他の一般的な固定相材料も使用することができる。

吸着化合物は、アセトニトリル／水勾配などの、適切な移動相により溶出される。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の所望のピークが収集され、移動相溶媒が除去され、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤が結晶化される。結晶化された粗ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の純度は８０％〜９２％であり、純度は培養後の培養液の不純物プロフィルに依存する。任意の吸着クロマトグラフィーは、順相クロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、工業用ＨＰＬＣ、もしくは抽出または結晶化方法により置換されてもよい。

以下に、本発明に特徴である、複合化された結晶化処理について、さらに詳しく説明する。

より具体的には、複合結晶化処理は、水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒からのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の第一結晶化、および、上記水混和性もしくは水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機溶媒からのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の第二結晶化を含むものである。これら結晶化の順序は逆であってもよい。水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒、あるいは、上記水混和性もしくは水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機溶媒の特性は、当業者にとって公知のものであり、ここで参照する、例えば、ウルマンの工業化学事典（"Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry", Vol. A24, 5th edition (1993), pp. 437-505 ）に述べられている。

本発明においては、「水混和性もしくは水溶性」とは、実質的に無制限の、好ましくは１００％の水混和性もしくは水溶性を示し、「水に対する混和性もしくは溶解性」とは、上記の水混和性もしくは水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を示し、水と混和しない、または水と不溶な有機溶媒も含むものとする。さらに、本発明における結晶化の概念は、特に沈澱も含むものとする。

実質的に水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、およびイソプロピルアルコールなどの低級アルキルアルコール類；アセトン、メチルエチルケトンなどの低級アルキルケトン類；メチルグリコール、エチルグリコール、プロピルグリコール、およびエチルジグリコールなどの低級アルキルグリコールエーテル類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの双極子非プロトン性溶媒；およびこれら溶媒の混合物が挙げられる。水混和性を有する有機溶媒の特に好ましい例としては、アセトンおよび低級アルキルアルコール類が挙げられる。

上記水混和性もしくは水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機溶媒の例としては、ブタノール、イソブタノールアミルアルコール、ヘキサノール、２−エチルヘキサノール、ベンジルアルコール、およびシクロヘキサノールなどの高級アルキルアルコール類；メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン、およびシクロヘキサノンなどの高級アルキルケトン類；メチルアセテート、エチルアセテート、ｎ−プロピル（およびイソプロピル）アセテート、ｎ−ブチル（およびイソブチルまたはｓｅｃ−ブチル）アセテート、およびアミルアセテートなどのエステル類；ジエチルエーテルおよびジイソプロピルエーテルなどのエーテル類；塩化メチレンおよびクロロホルムなどの塩素化炭化水素類；アセトニトリル；およびこれら溶媒の混合物が挙げられる。上記水混和性もしくは水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機溶媒の特に好ましい例としては、エチルアセテート（酢酸エチル）が挙げられる。

本願発明の発明者は、アセトンもしくは低級アルキルアルコールなどの水混和性を有する有機溶媒からのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の結晶化、およびその後の、同一の溶媒を用いたさらなる結晶化では、非極性不純物の一部のみと極性不純物の大部分が除去されること、およびエチルアセテートなどの、より小さな水に対する混和性を有する有機溶媒からの結晶化、およびその後の、同一の溶媒を用いたさらなる結晶化では、非極性不純物の大部分のみが除去されることを予期せずに見出した。

この後者の事実は、粗ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（図２）、アセトンから結晶化されたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（図３）、およびアセトンからの結晶化およびエチルアセテートからのさらなる結晶化により得られたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（図４）のＨＰＬＣのクロマトグラフから明らかである。この予期されなかった認識により、本発明の最終の工程である、水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒からと、上記水混和性もしくは水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機溶媒からとの複合結晶化は、高純度ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を得るための方法から省略できないものである。

本発明に係る複合結晶化処理は、以下のように行うことができる。まず、粗ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の結晶を、特にアセトンや低級アルコールなどの、実質的に（好ましくは１００％の）水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒で溶解した後、水を加えることによりＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を結晶化または沈澱させる。もしくは、実質的に水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒で溶解したＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を、水に加えることにより結晶化または沈澱させる。これらの工程は、必要に応じて、同一もしくは他の水混和性または水溶性を有する有機溶媒を用いて、出発粗原料の純度により、例えば１〜４回繰り返し行われてもよい。

このようにして得られた結晶は、エチルアセテートなどの、上記の水混和性または水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機溶媒で、好ましくは１０ｇ／ｌ〜３５ｇ／ｌ、最も好ましくは１５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌの範囲の適切な濃度となるように溶解される。溶媒の１／３〜３／４を除去すると、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤が結晶化する。

同一もしくは他の、上記の水混和性または水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機溶媒からの結晶化は、上記有機溶媒から結晶化されたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の純度により、必要に応じて、例えば１〜３回繰り返し行われてもよい。結晶化されたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤をろ過および乾燥すると、少なくとも９９．６％の純度を有する生成物が得られる。

前述したように、結晶化の順序は逆であってもよい。即ち、最初に、上記の水混和性または水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機溶媒からの結晶化を行なった後、水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒からの結晶化を行ってもよい。

本発明の好ましい実施形態では、上記の水混和性または水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機溶媒としてのエチルアセテートからの結晶化は、上記したエチルアセテート抽出工程、もしくは任意のラクトン化工程の後、直ちに行ってもよい。

本発明に係る方法によれば、少なくとも９９．６％、さらには少なくとも９９．７％の純度を有する生成物を得ることができる。さらに別の実施形態では、異なる種類の結晶化を、交互に繰り返し行ってもよい。

本発明の別の様態によれば、上述した、水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒からと、上記水混和性もしくは水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機溶媒からとの複合結晶化方法は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の単離および／または精製のための全ての方法における最終の仕上げ工程として適用される。

したがって、このような最終の仕上げ工程は、従来より得られたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の原材料に対しても適用可能なものである。このようにして得られるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の純度は、少なくとも９９．６％、さらには少なくとも９９．７％である。

本発明に係る方法は、ロバスタチンがＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤として選択される場合に、特に好適である。従い、本発明のさらに別の様態では、上述した方法は、ロバスタチンの単離および／または精製に使用される。

本発明に係る方法で得られる、ロバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、およびこれらの誘導体および類似体などの、実質的に純粋なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、疾患の予防および／もしくは治療のための製薬品の作製に有益に使用できる。得られた阻害剤および製薬品は、脳血管破裂の発作、一時的な虚欠性発作、アテローム性動脈硬化症、および心筋梗塞のリスクを軽減するための治療薬または予防薬として特に好適に使用される。

以下の実施例は、本発明の方法を説明するものであるが、添付の請求項に記載の発明を何ら限定するものではない。
実施例
実施例１
アスペルギルス・テルウス（Aspergillus terreus ATCC 20542) を用いた培養により得られた、濃度１ｇ／ｌのロバスタチンを含む培養後の培養液（１６０ｌ）を容器（４００ｌ）に入れ、１Ｍ水溶性水酸化ナトリウム溶液により、ｐＨ１０に調整した。室温にて１０分間激しく攪拌した後、該培養液を、１Ｍ硫酸溶液により、ｐＨ９に調整し、バイオマスをろ過した。

続いて、ろ液を、１Ｍ硫酸溶液により、ｐＨ６．５となるように酸性化した。ろ液に１６０ｌのエチルアセテートを加え、得られた混合液を２０分間攪拌した。水相とエチルアセテート相とを抽出遠心分離により分離した。エチルアセテート抽出液を、回転蒸発器により、１４ｌの量となるまで濃縮した。エチルアセテート濃縮液中の、遊離酸状態にあるロバスタチンの濃度は１０ｇ／ｌであった。 その後、エチルアセテート濃縮液（１４ｌ）を反応器（４０ｌ）に入れラクトン化した。ラクトン化は、触媒量のＴＦＡ（１ｌの濃縮液に対し、０．５ｍｌのＴＦＡ）で開始した。ラクトン化工程を、４０℃で２時間続けた。ラクトン化の後、濃縮液を１４ｌの５％炭酸水素アンモニウム水溶液により２回洗浄した。水相を除去し、回転蒸発器により、有機相をさらに濃縮し乾燥させた。得られた油状の生成物（１．５ｌ）は、１３３ｇのロバスタチンを含んでいた。

得られた油状の生成物（１６１ｍｌ）を、８０ｍｌのアセトニトリルに溶解し、ＸＡＤ−１６（XAD-16は、Rohm & Hass 社による商品名、20-50 メッシュ）が充填されたクロマトグラフィーカラム（８０ｃｍ、３．６ｃｍ）に供した。

カラムを、最初、４０：６０のアセトニトリル／水（ｐＨ３、塩酸により調整）により、７５ｍｌ／ｍｉｎの速度で溶出した。溶出液を、ＵＶ検出器（２３６ｎｍ）でモニターした。溶出液における、吸収を示した最初の滴下後、５５：４５のアセトニトリル／水（ｐＨ３、塩酸により調整）によるカラムの溶出を開始した。

主溶出分を収集し、溶出液の吸収が低下した後、８０：２０のアセトニトリル／水（ｐＨ３、塩酸により調整）によりカラムを洗浄した。アセトニトリルを、回転蒸発器により主溶出分から除去し（５０℃、１５０ｍｂａｒ）、得られた結晶をろ過した。結晶の質量は２４．５ｇであり、ロバスタチンの含有量は５０％（重量／重量）（ｗ／ｗ）であった。ＨＰＬＣ純度は９２．５％であった。

得られた結晶（２４ｇ）を、３５０ｍｌのアセトンで溶解し、連続的に攪拌しながら７００ｍｌの水を加えた。混合液を、４℃で３０分間静置した。得られた結晶を、室温でろ過すると共に真空乾燥した。結晶の質量は１２．７ｇであり、ロバスタチンの含有量は９０％（ｗ／ｗ）であった。ＨＰＬＣ純度は９８．８％であった。

同一条件下で、アセトンからの結晶化を繰り返し、ロバスタチンの含有量が９７％である１１．３ｇの結晶を得た。ＨＰＬＣ純度は９９．４％であった。

アセトンからの２回目の結晶化により得られた結晶（１１．３ｇ）を、７００ｍｌのエチルアセテートに溶解した。エチルアセテート溶液を、ロバスタチンの濃度が７０ｇ／ｌとなるまで減圧下にてエチルアセテートを蒸発させた。濃縮液を、８℃で１時間静置した。得られたロバスタチンの結晶をろ過し、真空乾燥した。結晶の質量は９．４ｇであり、ロバスタチンの含有量は９９．６％（ｗ／ｗ）であった。ＨＰＬＣ純度は９９．７％であった。

実施例２
実施例１で説明したＸＡＤ−吸着クロマトグラフィー後に単離したロバスタチン結晶（３ｇ）を、１７０ｍｌのエチルアセテートに溶解した。エチルアセテート溶液を、減圧下（２００ｍｂａｒ）および５０℃で、３５ｍｌまでエチルアセテートを蒸発させた。濃縮液を、１０℃で１時間静置した。得られたロバスタチンの結晶をろ過し、真空乾燥した。結晶の質量は２．１ｇであり、ロバスタチンの含有量は９６％（ｗ／ｗ）であった。ＨＰＬＣ純度は９９．０％であった。

得られた結晶（２．１ｇ）を、５０ｍｌのアセトンに溶解し、８５ｍｌの水を加えた。その後、混合液を１０℃で３０分間静置し、結晶をろ過して、４０℃で真空乾燥した。得られた結晶の質量は１．９ｇであり、ロバスタチンの含有量は９９％（ｗ／ｗ）であった。ＨＰＬＣ純度は９９．８％であった。

実施例３
プラバスタチン（培養後の培養液１ｋｇ毎に６９０ｇ；プラバスタチンのＨＰＬＣ純度は４８．７％）を含んだ培養後の培養液（５０ｌの培養槽内に３０ｌ）をろ過し、得られた菌糸体を水で洗浄した。ろ液（５１ｌ）を、１０％リン酸水溶液で、ｐＨ５まで酸性化した。その後、抽出カラム内で、活性物質（プラバスタチン）を、ろ液から７０ｌのエチルアセテートに抽出した。

含有プラバスタチンが２ｇ未満であり、不純物の大部分を含む水相（５０ｌ）を除去した。エチルアセテート相を、８００ｍｌまで蒸発により濃縮し、続いて、その濃縮したエチルアセテート相を単離工程にて用いた。エチルアセテート抽出物内のプラバスタチンのＨＰＬＣ純度は７０．３％であった。

さらなる単離のために、油状の生成物を、実施例１に記載の、吸着クロマトグラフィーおよび複合結晶化工程に供した。

実施例４
ラクトン形態の粗シンバスタチン（２．３ｇ）を、アセトン（７ｍｌ）に溶解し、１５ｍｌの水を加えた。その結果、油状の生成物が得られ、続いて、該生成物を１０分で結晶化させた。その後、結晶をろ過して、水で洗浄し、４０℃で６０分間乾燥させた。その後、ＨＰＬＣ純度が９９．５１％にて得られた結晶（２．２ｇ）を、エチルアセテート（８ｍｌ）に溶解した。得られた溶液を４ｍｌまで濃縮し、８℃で６０分間静置して、上記溶液からシンバスタチンを結晶化させた。得られた生成物をろ過し、水で洗浄した。その後、結晶を４０℃で６０分間乾燥させた。得られたシンバスタチン（１．７ｇ）の純度は、９９．７３％であった。

実施例５
ＨＰＬＣ純度が９８．５％である、ラクトン形態の粗メバスタチン（２．０ｇ）を、アセトン（７ｍｌ）に溶解し、２０ｍｌの水を加えた。その結果、油状の生成物が得られ、該生成物を１０分で結晶化させた。その後、結晶をろ過して、水で洗浄し、４０℃で６０分間乾燥させた。その後、ＨＰＬＣ純度が９９．３３％である、得られた結晶（１．８ｇ）をエチルアセテート（８ｍｌ）に溶解した。得られた溶液を４ｍｌまで濃縮して、８℃で６０分間静置することにより、上記溶液からメバスタチンを結晶化させた。生成物をろ過し、水で洗浄した。その後、結晶を４０℃で６０分間乾燥させた。得られたメバスタチン（１．３ｇ）の純度は、９９．７２％であった。

本発明のＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製方法、上記方法により得られたＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤、および上記方法の使用は、簡便な各工程により上記ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の純度を向上できるので、医薬品の分野に好適に利用できる。

本発明に係るエチルアセテート抽出工程における、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（ロバスタチン) および不純物の分布係数のｐＨに対する依存性を示すグラフである。 本発明のエチルアセテート抽出後の、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を含む、粗生成物としてのサンプルに関するＨＰＬＣのクロマトグラフである。 本発明のエチルアセテート抽出後、水混和性または水溶性の有機溶媒からの結晶化後の、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を含むサンプルのＨＰＬＣのクロマトグラフである。 本発明のエチルアセテート抽出後、水混和性または水溶性の有機溶媒からの結晶化後、上記水混和性または水溶性より小さい、水に対する混和性または溶解性を有する有機溶媒からのさらなる結晶化後の、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を含むサンプルのＨＰＬＣのクロマトグラフである。

Claims (4)

1. ロバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、シンバスタチン、これらの誘導体および類似体から選択されるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を精製するための方法であって、
   複合化された結晶化の各工程に上記ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を供して、９９．６％より高い純度を有しているＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を得るステップを有し、
   上記複合化された結晶化の各工程は、水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒または上記有機溶媒と水との混合液から、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を結晶化する工程と、
   ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を、上記水混和性もしくは水溶性より小さい水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機エステル溶媒から結晶化する工程とを含む、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製方法。
2. 上記複合化された結晶化は、
   上記ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤をアセトンにて溶解する工程と、その後、その溶解液に水を加える工程とを水混和性もしくは水溶性を有する有機溶媒または上記有機溶媒と水との混合液から結晶化する工程として含む結晶化と、
   上記水混和性もしくは水溶性より小さい、水に対する混和性もしくは溶解性を有する有機エステル溶媒からの結晶化としてのエチルアセテートからの結晶化とを含む請求項１記載の方法。
3. ロバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、シンバスタチン、これらの誘導体および類似体から選択され、請求項１または２に記載の方法により、９９．７％より高い純度を有して得られたＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤。
4. ロバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、シンバスタチン、これらの誘導体および類似体の精製のための、請求項１または２記載の方法の使用。

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