ITMI20011364A1 - Robozima hammerhead specifico per la stearoyl-acp desaturesi di piante oleaginose differenti - Google Patents

Description

"Ribozima Hammerhead specifico per la Stearoyl-ACP desaturasi di piante oleaginose differenti"

Descrizione

La presente invenzione riguarda un ribozima Hammerhead capace di modulare l'espressione del gene che codifica per l'enzima stearoyl-ACP desaturasi (anche detta Δ9 desaturasi) di piante oleaginose differenti, un vettore contenente la sequenza che codifica per detto ribozima ed il suo impiego per la produzione di piante transgeniche con un contenuto di acido stearico migliorato.

In natura i lipidi sono costituiti da acidi grassi saturi, quali il paimitico e lo stearico, e da acidi grassi mono e poli-insaturi, quali l'oleico, il linoleico e il linolenico. La loro caratterizzazione è legata alla percentuale con cui ognuno di questi acidi grassi è presente.

Generalmente i lipidi solidi a temperatura ambiente vengono detti grassi e sono caratterizzati da un'elevata percentuale di acidi grassi saturi.

Detti acidi sono costituiti da molecole lineari che tendono a formare una struttura "impilata" responsabile del loro elevato punto di fusione. La ridotta presenza di doppi legami conferisce, inoltre, a questi acidi una maggiore resistenza alle alte temperature ed ai processi fotoossidativi . I grassi animali sono la principale fonte naturale di acidi grassi saturi.

I lipidi con un'elevata percentuale di acidi grassi mono- e poli-insaturi sono, invece, caratterizzati da un più basso punto di fusione direttamente correlato con il grado d'insaturazione degli acidi grassi che lo compongono. Sono liquidi a temperatura ambiente e vengono comunemente detti oli. La principale fonte naturale di acidi grassi mono- e poli-insaturi è costituita dagli oli vegetali .

Sia i grassi che gli oli risultano importanti per l'industria di trasformazione, anche se la loro destinazione d'uso è differente perché legata alle diverse caratteristiche chimico-fisiche sopra descritte.

Più precisamente, l'impiego di grassi è particolarmente richiesto nell'industria dolciaria ed in tutti quei processi di preparazione alimentare che sottopongono il grasso ad alte temperature.

Gli oli vengono utilizzati principalmente nell'alimentazione e, quelli con un elevato contenuto di acidi grassi poli-insaturi, soprattutto, nelle industrie di cosmetici, saponi, detergenti, lubrificanti, vernici, plastiche, etc.

Nel corso degli anni, i grassi derivati dagli animali sono stati gradualmente sostituiti dagli oli vegetali in quanto questi ultimi non contengono colesterolo che è, invece, presente nelle membrane delle cellule animali.

Attualmente gli oli di origine vegetale costituiscono circa l'85% della produzione degli oli e dei grassi alimentari e rappresentano un elemento essenziale nell'alimentazione umana in quanto forniscono fino al 25% dell'apporto calorico (Broun P. et al., 1999, Genetic engineering of plant lipids. Annu. Rev. Nutr. 19:197-216).

Poiché questi oli sono ricchi di acidi grassi poliinsaturi, è stato necessario sottoporli ad un processo di idrogenazione catalitica per ridurre i doppi legami.

Tale processo consente di aumentare il punto di fusione dell'olio e di conferire un migliore aroma ed una maggiore resistenza alle reazioni ossidative, cui sono suscettibili gli acidi grassi insaturi e particolarmente l'acido linolenico.

L'olio così modificato viene utilizzato per la produzione di margarine che vengono spesso impiegate come surrogati del burro nell'industria dolciaria ed alimentare.

Tuttavia, il processo di idrogenazione catalitica, oltre ad incidere economicamente, provoca la formazione di trans -isomeri degli acidi grassi che, ingeriti, determinano un aumento del livello di colesterolo nel sangue.

Tale processo alcune volte risulta insufficiente e diventa necessaria anche l'aggiunta di altri oli ad elevato contenuto di acidi grassi saturi, come l'olio di palma, ed altre sostanze chimiche aventi la funzione di prevenire la formazione di cristalli a basse temperature.

Per superare tali inconvenienti sono stati proposti nuovi approcci di ingegneria genetica per modificare la composizione degli oli vegetali in modo da ottimizzarli rispetto ai fabbisogni della dieta umana.

Tali sistemi si basano sull'inibizione, parziale o totale, dell'espressione dei geni che codificano per le desaturasi coinvolte nella via metabolica degli acidi grassi attraverso la tecnica dell'antisenso (U.S. Pat. No.

5,850,026), della cosoppressione (Knutzon DS., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1992, 89:2624-28), oppure dell'impiego di ribozimi multimerici (Merlo A.O., et al., The Plant Celi., 1998, 10:603-21).

Per quanto riguarda le strategie di inibizione sopra citate, l'uso dei ribozimi presenta dei vantaggi dovuti al loro meccanismo catalitico che richiede poche molecole per poter essere efficace.

Infatti, la modulazione dell'espressione di un gene endogeno, nel caso della strategia antisenso o della cosoppressione, necessita di un'interazione di tipo stechiometrico tra transgene e la sequenza bersaglio (target).

Questa condizione non è più necessaria nel caso in cui vengano impiegati i ribozimi, in quanto un RNA catalitico è teoricamente capace di tagliare più molecole dell'RNA target. L'utilizzazione dei ribozimi come transgeni, inoltre, riduce la probabilità d'insorgenza di fenomeni di soppressione spesso associati alla trasformazione con costrutti senso o antisenso. Ciò è probabilmente dovuto alla ridotta dimensione del transgene ed alla minore omologia di sequenza con geni endogeni.

I ribozimi sono RNA circolari in grado di catalizzare la propria frammentazione in assenza di proteine ed in corrispondenza di particolari sequenze nucleotidiche.

In particolare, i ribozimi Hammerhead (Haseloff et al., U.S. Patent N°6,127,114) rappresentano una specifica classe di ribozimi e presentano la struttura del dominio catalitico caratterizzata dalla presenza di 3 eliche (I, II, III) di lunghezza variabile (Figura 1).

Tali ribozimi consistono di:

- una sequenza di 22 nucleotidi che costituisce il dominio catalitico; e

- due regioni fiancheggianti tale dominio catalitico che sono complementari all'RNA target. Tali sequenze consentono l'allineamento dell'RNA target con il dominio catalitico e conferiscono specificità alla reazione.

Tutti i ribozimi fino ad ora progettati sono caratterizzati dall'avere un'elevata specificità nei confronti dell'RNA bersaglio. Tale specificità è conferita al ribozima dalla perfetta complementarietà delle due eliche fiancheg-gianti il dominio catalitico con l'RNA target.

E' stato ora trovato che, utilizzando un unico ribozima di tipo Hammerhead opportunamente disegnato, è possibile modulare l'espressione del gene che codifica per l'enzima stearoyl-ACP desaturasi di piante oleaginose differenti .

In accordo con ciò costituisce uno scopo della presente invenzione un ribozima Hammerhead capace di modulare l'espressione del gene che codifica per l'enzima stearoyl-ACP desaturasi di piante oleaginose differenti caratterizzato dal fatto di avere le due regioni fiancheggianti il sito catalitico non perfettamente complementari con nessuna delle sequenze bersaglio.

Costituisce un ulteriore scopo della presente invenzione una sequenza di DNA che codifica per detto ribozima.

Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione un vettore ad espressione in piante contenente la sequenza di DNA che codifica per detto ribozima.

Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione un metodo per incrementare il contenuto di acido stearico in differenti piante oleaginose che utilizza detto ribozima .

Costituiscono inoltre uno scopo della presente invenzione piante transgeniche trasformate con detto ribozima.

Ulteriori scopi della presente invenzione appariranno evidenti dalla lettura della descrizione e degli esempi che seguono .

Breve descrizione delle figure

Figura 1: si riporta la struttura secondaria di un ribozima di tipo Hammerhead.

La scatola centrale racchiude il dominio catalitico del ribozima (elica II); le due scatole laterali costituiscono, procedendo da sinistra verso destra, l'elica III e l'elica I del ribozima. Le X indicano i nucleotidi della sequenza target che si appaiano con le due eliche I e III del ribozima. La Y presente sulla sequenza target può essere una G o una A a seconda della sequenza target su cui è stato disegnato il ribozima (vedi Figura 2). Questa base nucleotidica associata alla U ed alla C costituisce la tripletta di cleavage indicata in grassetto.

Figura 2 : Si riporta un confronto tra la sequenza target definita nella presente invenzione e le sequenze target di alcune piante oleaginose.

Le ATC centrali in grassetto e sottolineate rappresentano la tripletta di cleavage; le basi in grassetto, indicate nelle sequenze delle diverse specie, sono le basi differenti dalla sequenza target.

Figura 3:

Si riporta la foto del gel relativo al saggio catalitico sul trascritto delle stearoyl-ACP desaturasi di alcune specie.

Linea 1: Lino; Linea 2: Lino ribozima; Linea 3: Colza; Linea 4: Colza ribozima; Linea 5: Sad 6 (Girasole); Linea 6: Sad 6 (Girasole); ribozima; Linea 7: Sad 17 (Girasole); Linea 8: Sad 17 (Girasole) ribozima; Linea 9:Olivo; Linea 10: Olivo ribozima; Linea 11: Ricino; Linea 12: Ricino ribozima.

Nelle Linee 1, 3, 5, 7, 9 e 11 compare un'unica banda che è quella relativa al trascritto marcato del gene; mentre nelle Linee 2, 4, 6, 8, 10 e 12 sono evidenti le due bande prodotte dal taglio del gene target ad opera del ribozima .

Figura 4:

Si riporta la foto del gel relativo al saggio catalitico sul trascritto delle stearoyl-ACP desaturasi di alcune specie.

Linea 1: Sad 17 (Girasole) ribozima; Linea 2: Sad 17 (Girasole); Linea 3: Sad 6 (Girasole) ribozima; Linea 4: Sad 6 (Girasole); Linea 5: Colza ribozima; Linea 6: Colza; Linea 7: Lino ribozima; Linea 8: Lino.

Figura 5 :

Si riporta la foto del gel relativo al saggio catalitico sul trascritto delle stearoyl-ACP desaturasi di alcune specie.

Linea 1: Olivo ribozima; Linea 2: Olivo; Linea 3: Ricino ribozima; Linea 4: Ricino; Linea 5: Colza ribozima; Linea 6: Colza; Linea 7: Lino ribozima; Linea 8: Lino; Linea 9: Sad 17 (Girasole) ribozima; Linea 10: Sad 17 (Girasole) ;

Descrizione dettaliata dell'invenzione

Nei semi delle piante oleaginose, la sintesi degli acidi grassi sembra che avvenga nei plastidi e successivamente tali acidi vengano trasportati nel reticolo endoplasmatico, dove sono impiegati per la formazione dei trigliceridi .

Il primo prodotto nel processo di sintesi di tali acidi è il palmitato (16:0), la cui catena di atomi di carbonio viene allungata a stearato (18:0) su cui agisce, quando è ancora all'interno del plastidio, la stearoyl-ACP desaturasi (comunemente detta Δ9 desaturasi).

Questo enzima aggiunge un doppio legame cis nella posizione 9/10 della catena, convertendo la stearoyl-ACP in oleoyl-ACP (stearato in oleato).

Allo scopo di costruire un ribozima in grado di interagire con una più ampia gamma di RNA target aventi tra di loro una regione ad alta omologia, sono state prese in considerazione le sequenze delle Δ9 desaturasi del Linum usitatissimum, Brassica napus, Ricinus communis, Helianthus annuus, Carthamus tinctorius, Simmondsia chinensis, Olea europaea e Sesamum indicum.

Le stearoyl-ACP desaturasi di tali piante sono state allineate e confrontate ed è stato individuato un sito di cleavage (ATC) in una regione altamente conservata.

Si è proceduto, quindi, alla definizione della "sequenza target" che non è uguale a nessuna delle desaturasi riportate (figura 2). Con il termine "sequenza target" si definisce la sequenza su cui vengono disegnate le eliche I e III che fiancheggiano il dominio catalitico del ribozima e che sono complementari alla sequenza target stessa.

Le regioni fiancheggianti la tripletta di cleavage non sono perfettamente complementari con nessuno degli RNA bersaglio e le X possono essere sostituite da uno qualsiasi dei quattro nucleotidi. E' proprio questa caratteristica che consente al ribozima di esplicare la sua azione catalitica su un maggior numero di RNA.

A scopo esemplificativo è stata definita una sequenza bersaglio su cui sono state sintetizzate le eliche I e III che fiancheggiano il dominio catalitico del ribozima Luna 9. Più precisamente le differenze tra l'elica I del ribozima e la sequenza del gene bersaglio sono: 0 per il Linum usitatissimum, 1 per Brassica napus e Olea europaea, 2 per Helianthus annuus, Ricinus communis e Simmondsia chinensis, 3 per Carthamus tinctorius e Sesamum indicum.

Le differenze tra l'elica III e la sequenza del gene bersaglio sono: 1 per Linum usitatissimum e Brassica napus, 2 basi per Carthamus tinctorius, Helianthus annuus Ricinus communis e Simmondsia chinensis e 3 basi per Olea europea e Sesamum indicum.

Quindi sulla base della sequenza così individuata sono stati sintetizzati gli oligonucleotidi complementari alle eliche I e III che, dopo appaiamento sono stati clonati in un vettore per la trascrizione in vitro.

Il clonaggio è stato effettuato seguendo le procedure standard (Sambrook J. et al. (1989) Molecular cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Dopo ogni subclonaggio il DNA codificante per il ribozima è stato sequenziato per verificare che non ci fossero mutazioni puntiformi.

Il ribozima trascritto è stato impiegato nei saggi catalitici ( "cleavage") in vitro per determinare l'efficienza di taglio sulle stearoyl-acyl-carrier protein desaturase provenienti da varie specie (lino, colza, ricino, girasole, olivo).

La sequenza codificante il ribozima può essere posta sotto il controllo di regioni regolatrici che ne consentono l'espressione in cellule eucariotiche.

Esempi di tali regioni regolatrici includono promotori di tipo costitutivo o di origine virale (CaMV 35S, TMV) od i cosiddetti "housekeeping genes" (ubiquitina, actina, tubulina) associati alla loro sequenza di terminazione o ad una eterologa.

Tali regioni includono, inoltre, promotori tessuto specifici, quali ad esempio quelli dei geni coinvolti nella biosintesi degli acidi grassi (ACPs, acyltransferasi, desaturasi, lipid transfer protein genes) oppure quelli dei geni delle proteine di riserva dei semi (zeina, napina, cruciferina, conglicina) associati con la propria sequenza di terminazione o con una differente.

Possono inoltre essere utilizzati promotori inducibili associati alle proprie sequenze di terminazione.

Infine la cassetta d'espressione per pianta, descritta sopra, può essere trasferita in un vettore che contiene anche un gene marker per la selezione di cellule vegetali trasformate (ad esempio geni per la resistenza ad igromicina, kanamicina, metotrexate, fosfinotricina).

Il marker per la selezione è sotto il controllo di un promotore costitutivo. Il vettore è costruito in modo tale che sia il transgene che il gene marker vengano trasferiti entrambi nel genoma della pianta.

Il tessuto vegetale impiegato nella trasformazione può essere ottenuto da qualsiasi pianta oleaginosa.

Tali piante possono essere, ad esempio del genere Brassica, Helianthus, Carthamus, Sesamum, Glycine, Arachis, Gossypium, Ricinus, Linum, Cuphea, Euphorbia, Limnanthes, Crambe, Lesquerella, Vernonia, Simmondsia, Olea, Papaver, Elaeis, Cocos e Zea.

Esempi di tessuti idonei alla trasformazione includono foglie, ipocotili, cotiledoni, steli, calli, singole cellule e protoplasti.

Le tecniche di trasformazione impiegabili sono quelle ben note dalla letteratura sulla trasformazione di piante ed includono la trasformazione mediata da Agrobatterio, l 'elettroporazione, il polyethylene glicole (PEG) e l'impiego del Particle Gun. Tutti questi sistemi consentono l 'inserimento nel genoma della pianta del transgene e del marker di selezione.

I calli trasformati possono essere selezionati facendoli sviluppare su substrato selettivo, quale ad esempio un mezzo che contiene la sostanza chimica tossica il cui gene di resistenza è stato trasferito nella pianta come gene marker.

Dalle piante rigenerate vengono prelevati campioni di tessuti su cui vengono effettuate analisi molecolari (Southern o PCR) per determinare i cloni nei quali il transgene si è integrato nel genoma.

Le piante positive per il transgene possono essere portate a seme ed i semi sono analizzati per la determinazione della composizione in acidi grassi dell'olio estratto. Le caratteristiche di nuovi acidi grassi vengono determinate confrontando la composizione dei semi transgenici con quelli delle piante parentali.

I genotipi i cui semi hanno mostrato un'alterata composizione degli acidi grassi rispetto al wild type vengono moltiplicati e sottoposti allo studio della stabilità del carattere e dell'ereditarietà attraverso appropriati incroci. Le caratteristiche conferite dal ribozima possono essere trasferite in varietà agronomicamente valide attraverso l'incrocio tradizionale.

Gli esempi seguenti sono riportati per una migliore comprensione dell'invenzione e non devono considerarsi limitanti della stessa.

Esempio 1

Le sequenze delle stearoyl-ACP desaturasi prese in considerazione sono quelle del Linum usitatissimum, Brassica napus, Ricinus communis, Helianthus annuus, Carthamus tinctorius, Simmondsia chinensis, Olea europaea e Sesamum indicum.

Con il software di allineamento multiplo ClustalWR, sono state confrontate le stearoyl-ACP Δ9 desaturasi ed è stato individuato un sito di cleavage (ATC) in una regione altamente conservata.

Si è proceduto, quindi, a definire la sequenza target che non è uguale a nessuna delle desaturasi riportate. Sulla base di tale sequenza sono state quindi determinate le sequenze delle due eliche (I e III) che fiancheggiano il dominio catalitico del ribozima e che sono complementari alla sequenza target (Figura 2).

Più precisamente le differenze tra l'elica I del ribozima (SEQ.ID N°2) e la sequenza del gene bersaglio sono: 0 per il Linum usitatissimum, 1 per Brassica napus e Olea europaea, 2 per Helianthus annuus, Ricinus communis e Simmondsia chinensis, e 3 per Carthamus tinctorius e Sesamum indicum.

L'elica III presenta la differenza di 1 base per Linum usitatissimum e Brassica napus, 2 basi per Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Ricinus communis e Simmondsia chinensis e 3 basi per Olea europaea e Sesamum indicum.

La lunghezza del ribozima, denominato Luna9, è di 48 bp (SEQ.ID N°2) cui vanno aggiunte, ad entrambe le estremità, i siti di restrizione BamHI per il successivo clonaggio in pGEM3Zf (Promega). La lunghezza delle eliche I e III è di 12 basi.

Le due eliche di DNA complementari sono state sintetizzate come oligonucleotidi dalla Roche Diagnostics SpA.

I due oligonucleotidi (10 μg) sono stati appaiati in un 60 μl di tampone avente la seguente composizione: 10 mM TrisHCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 0,25 mM EDTA, pH 8.

La soluzione è stata mantenuta a 68°C per 5 minuti e quindi lasciata raffreddare lentamente. I due oligonucleotidi così appaiati sono stati precipitati con 2 volumi di etanolo al 100 % e 1/10 di sodioacetato 3M pH 5.3, risospesi in 20 μΐ di acqua e successivamente ne sono stati digeriti 5 μg con BamHI.

Il prodotto della digestione, dopo essere stato caricato su gel d'agarosio al 2% è stato purificato da gel con il kit GeneCleanTM (BIO 101 Ine, USA).

Circa 10 ng del DNA così isolato sono stati ligati a 50 ng di plasmide pGem3Zf (Promega) previamente digerito con l'enzima BamHI in 10 μl di miscela di reazione, in presenza di 2 unità di T4 DNA ligasi, a 16°C per una notte.

5 μΐ di detta miscela sono stati utilizzati per trasformare cellule competenti di E.coli DH5a (BRL). I trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB (NaCl 10 g/1, Yeast extract 5 g/1, Bacto-triptone 10 g/1 e agar 20 g/1) contenente 50 μg/ml di ampicillina.

Il DNA plasmidico estratto da 5 cloni positivi è stato sottoposto ad analisi di sequenza per verificare la corrispondenza nucleotidica con il ribozima indicato nella Seq.ID N.2.

Le reazioni e le analisi di sequenza sono state condotte utilizzando il "Dye Terminator Cycle Sequencing Kit" secondo le istruzioni del produttore PEBiosystems impiegando il sequenziatore automatico "373 DNA Sequencer della Applied Biosystems.

Uno dei cloni analizzati, contenente un frammento di DNA avente la SEQ:ID No 2, è stato denominato MA399.

Esempio 2

Dimostrazione dell'attività del ribozima in vitro.

Il ribozima sintetizzato come nell'esempio 1, è stato fatto reagire con i trascritti marcati con fosforo radioattivo di alcuni geni target (stearoyl-ACP desaturasi di colza, lino, girasole, olivo e ricino). Il ribozima è stato ottenuto trascrivendo con la SP6 polimerase la SEQ ID No: 2 clonata nel pGem3Zf linearizzato con l'enzima Smal.

I trascritti senso dei geni delle desaturasi sono stati ottenuti linearizzando i differenti plasmidi in cui erano clonati con un enzima situato al 3' del gene e ad almeno 100 bp dopo il sito di cleavage (tabella 1).

Tabella 1: Elenco delle Δ9 desaturasi impiegate nei saggi in vitro, degli enzimi utilizzati per la linearizzazione, delle polimerasi usate per la trascrizione. Nelle ultime due colonne vengono riportate le dimensioni del trascritto integro e quelle dei frammenti generati dall'azione catalitica del ribozima.

Tabella 1

Per la trascrizione è stato impiegato il Kit della Ambion denominato MEGAscript™. La miscela di reazione, preparata come descritto dal produttore, è costituita da: • 2 μl di tampone di reazione;

• 2 μl di ATP (75mM per T7 e 50 mM per SP6);

• 2 μl di GTP (75mM per T7 e 50 mM per SP6);

• 2 μl di CTP (75mM per T7 e 50 mM per SP6);

• 2 μl di UTP (75mM per T7 e 50 mM per SP6);

• 1 μl di [a-32P]CTP;

• 1 μg di DNA plasmidico linearizzato,

• 2 μl di T7 polimerase o SP6 polimerase in funzione del plasmide utilizzato e

• H2O in modo da portare il volume a 20 μl totali;

La miscela è stata incubata per 2 ore a 37°C e, successivamente il DNA plasmidico è stato degradato aggiungendo 1 μl di DNase I Rnase-free ed incubando per altri 15 minuti a 37°C.

I nucleotidi non incorporati sono stati allontanati mediante precipitazione con Liei 2,5 M (concentrazione finale). Una stima del quantitativo di trascritto marcato ottenuto è stata effettuata leggendo allo scintillatone 1 μl della miscela di trascrizione immediatamente prima della precipitazione con LiCl (A) ed 1 μl del trascritto risospeso in un uguale volume dopo precipitazione (B).

Il rapporto tra B/A moltiplicato per 100 esprime la percentuale d'incorporazione del nucleotide marcato. La percentuale d'incorporazione moltiplicata per il quantitativo teorico massimo di RNA sintetizzabile (calcolato supponendo che tutti i nucleotidi inclusi nella miscela siano stati utilizzati per la formazione di RNA) esprime il quantitativo di trascritto ottenuto.

Nel caso in cui sia stata impiegata la T7 polimerase il massimo quantitativo di RNA sintetizzabile è di 198 μg, nel caso della SP6 polimerase è di 132 μg.

Nel caso della trascrizione con T7 polimerase la concentrazione di ognuno dei quattro ribonucleotidi è pari a 7,5 mM (nel caso della SP6 polimerase è pari a 5 mM) in una reazione di 20 μl, ciò significa che se tutti i nucleotidi presenti nella miscela fossero impiegati per la formazione di RNA il quantitativo massimo ottenibile sarebbe pari a 198 μg, cioè al prodotto di:

(peso di 1 M di ribonucleotide x 4)/1000 mM x 7.5 mM/106 x 20 μl=198 μg

cioè sostituendo:

(330x4)g/1000 mM x 7.5m M/106 μl x 20ul=198 μg

10 nanogrammi del trascritto così quantizzato, dopo denaturazione a 65°C per 5 minuti, sono stati incubati a 37°C per 15 minuti con un eccesso del trascritto del ribozima in un tampone avente come concentrazione finale 100 mM TrisHCl pH 7,6 e 50 mM MgCl2. I prodotti della reazione di cleavage sono stati separati su poliacrilamide al 5%, 8 M Urea.

Alla fine della corsa elettroforetica, il gel è stato essiccato ed esposto utilizzando il "phosphor screen" della Molecular Dynamics che ha la capacità di catturare le immagini provenienti da campioni radioattivi. Lo screen è stato poi letto utilizzando lo scanner Storm<R >860 della Molecular Dynamics.

La percentuale di cleavage è stata stimata come intensità relativa del segnale autoradiografico determinata mediante l'uso dello Storm 860 e l'ausilio del software Image-Quant .

Utilizzando il Phosphorimager<R >ed il software annesso è stato possibile attribuire ad ogni banda presente sul gel un valore direttamente correlato con 1'intensità del segnale. Tale valore può essere indicato in percentuale considerando pari a 100 la sommatoria di tutti i segnali autoradiografici all'interno di ogni linea. Poiché le bande all'interno di ogni linea sono da attribuire alla presenza del trascritto del gene target e dei suoi eventuali prodotti di cleavage, è possibile in questo modo esprimere in percentuale quanta parte del target è stato tagliato.

Incubando i trascritti di colza, lino, girasole, ricino e olivo con il ribozima è stato ottenuto un taglio efficiente ed altamente specifico con la produzione, per ogni trascritto, di due frammenti aventi le dimensioni attese .

Più precisamente nel caso della stearoyl-ACP del lino si ottengono due frammenti derivanti dall'azione catalitica del ribozima pari a 767 e 558 basi; in colza pari a 748 e 559 basi; in ricino 707 basi e 961 basi; in girasole per la Sad6 675 basi e 439 basi, mentre per la Sadl7681 basi e 614 basi; nell'olivo 694 e 107 basi (Figure 3-4-5).

L'efficienza catalitica del ribozima ottenuto trascrivendo la sequenza della presente invenzione è riportata nelle tabelle 2, 3 e 4 ed è stata determinata come descritto precedentemente.

Nelle tabelle suddette la riga denominata "Linea" si riferisce alla corsa in cui sono stati caricati contemporaneamente il trascritto marcato del gene ed il trascritto del ribozima. Non sono state considerate le linee in cui è stato caricato il solo trascritto del gene, in quanto in tal caso non c'è stato alcun taglio.

I frammenti che si evidenziano in ogni linea sono contrassegnati rispettivamente da: T = trascritto integro residuo; 1 e 2 = prodotti dell'azione catalitica del ribozima. I valori della colonna "% d'intensità" si riferiscono all 'intensità relativa del segnale dei frammenti presenti nelle linee; mentre nella colonna "% di cleavage" è riportata la somma delle percentuali relative all'intensità delle bande prodotte dal cleavage. La somma delle % riferite ai picchi generati dalle bande di cleavage rappresenta una stima dell'efficienza del taglio.

Tabella 2. Efficienza catalitica del ribozima sulle stearoyl-ACP desaturasi di lino, colza, girasole e ricino.

L'elaborazione riportata nella presente tabella si riferisce al saggio di cui in figura 3. In questa tabella non viene riportato il calcolo relativo all'olivo in quanto il secondo frammento di cleavage, di circa 100 basi, non era più visibile nel gel.

Tabella 2

Tabella 3 . Efficienza di taglio sulle stearoyl-ACP desaturasi di girasole, colza e lino.

L'elaborazione riportata nella presente tabella si riferisce al saggio di cui in figura 4. In questa tabella non viene riportato il calcolo relativo alla Sad17 del girasole (linea 3) in quanto l'elevato fondo potrebbe alterarne la determinazione.

Tabella 3.

Tabella 4: Efficienza di taglio sulle stearoyl-ACP desaturasi di ricino, colza, lino e girasole.

L'elaborazione riportata nella presente tabella si riferisce al saggio di cui in figura 5.

In questa tabella non viene riportato il calcolo relativo all'Olivo in quanto il secondo frammento di cleavage, di circa 100 basi, non era più visibile nel gel.

Tabella 4.

Dai tati riportati nelle tabelle si osserva che, nonostante la non perfetta complementarietà delle eliche I e III del ribozima con il gene target, l'efficienza di cleavage è pari al 100% per colza, lino e ricino, e, pur riducendosi, rimane elevata nelle due SAD del girasole. Le prove di cleavage sono state più volte ripetute ed hanno prodotto risultati comparabili.

Claims (9)

1. Rivendicazioni 1. Un ribozima Hanunerhead capace di modulare l'espressione del gene che codifica per l'enzima stearoyl-ACP desaturasi di piante oleaginose differenti caratterizzato dalla SEQ.ID N°3.
2. 2. Un ribozima Hammerhead secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dalla sequenza SEQ.ID N°4.
3. 3 . Una sequenza di DNA che codifica per il ribozima della rivendicazione 1, caratterizzata dalla SEQ ID No. 1.
4. 4. Una sequenza di DNA che codifica per il ribozima della rivendicazione 2, caratterizzata dalla SEQ ID No. 2.
5. 5 . Un vettore scelto tra un plasmide o un fago comprendente la sequenza nucleotidica SEQ ID No. 1 o 2.
6. 6 . Un vettore ricombinante per espressione in pianta comprendente la sequenza nucleotidica SEQ ID No. 1 o 2.
7. 7. Cellule procariotiche o eucariotiche trasformate con il vettore della rivendicazione 6.
8. 8. Un metodo per l'inattivazione dell'enzima stearoyl-ACP desaturasi di piante oleaginose differenti che comprende la reazione tra la sequenza che codifica per la stearoyl-ACP desaturasi ed il ribozima della rivendicazione 1.
9. 9 . Piante transgeniche comprendenti nelle proprie cellule la sequenza nucleotidica SEQ ID No: 1 o SEQ ID No: 2. 0. Semi ottenuti da piante transgeniche della rivendicazione 9.