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FR3153663A1 - Méthode de diagnostic d’une peau exposée à l’ozone - Google Patents

Méthode de diagnostic d’une peau exposée à l’ozone Download PDF

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FR3153663A1
FR3153663A1 FR2310555A FR2310555A FR3153663A1 FR 3153663 A1 FR3153663 A1 FR 3153663A1 FR 2310555 A FR2310555 A FR 2310555A FR 2310555 A FR2310555 A FR 2310555A FR 3153663 A1 FR3153663 A1 FR 3153663A1
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FR
France
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skin
ozone
compound
methionine sulfoxide
sample
Prior art date
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Pending
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FR2310555A
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English (en)
Inventor
Eric Arbey
Laurence DENAT
Fabien Girard
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LOreal SA
Original Assignee
LOreal SA
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Publication date
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Priority to PCT/EP2024/077830 priority patent/WO2025073825A1/fr
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Pending legal-status Critical Current

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Abstract

Méthode de diagnostic d’une peau exposée à l’ozone La présente invention concerne une méthode de diagnostic d’une exposition de la peau à l'ozone comprenant la mesure de la quantité de méthionine sulfoxyde, ainsi qu'une méthode d’identification de composé actif et une méthode d'évaluation de l'efficacité d'un composé, afin de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau. Figure pour l'abrégé : néant

Description

Méthode de diagnostic d’une peau exposée à l’ozone
La présente invention concerne une méthode de diagnostic d’une exposition de la peau à l'ozone comprenant la mesure de la quantité de méthionine sulfoxyde, ainsi qu'une méthode d’identification de composé actif et une méthode d'évaluation de l'efficacité d'un composé, afin de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur peau.
L'ozone ou trioxygène a pour formule chimique O3, c’est une variété allotropique de l'oxygène, bien moins stable que le dioxygène O2, en lequel il tend naturellement à se décomposer. L'ozone est naturellement présent dans l'atmosphère terrestre, formant dans la stratosphère une couche d'ozone qui intercepte les rayons ultraviolets du Soleil. Cependant, dans les basses couches de l'atmosphère (la troposphère) c’est un des polluants de l’air les plus dangereux pour la santé. Cet oxydant très puissant peut être produit par les feux de forêts, les fortes températures, il est aussi produit dans les zones industrielles ou les centres urbains ayant un fort ensoleillement. Ainsi certains milieux sont régulièrement soumis à des pics d’ozone. L’individu dans son environnement quotidien et particulièrement en zone urbaine, peut être soumis à de multiples agressions au niveau des matières kératiniques, et notamment la peau, par ce polluant aérien. En effet l’ozone a des effets délétères liés à l’oxydation des constituants de la peau et à la modulation de l’expression des biomarqueurs qu’il induit.
De ce qui précède, on comprend l'importance de trouver des biomarqueurs permettant de détecter l’exposition à l’ozone de la peau, afin de pouvoir traiter la peau de manière ciblée. La présente invention a pour objet de satisfaire à ce besoin.
La demanderesse a découvert de manière surprenante un nouveau biomarqueur modulé significativement dans les peaux exposées à l'ozone. Ce biomarqueur est une forme oxydée d’un acide aminé de l'épiderme de la peau, la méthionine sulfoxyde.
Les méthodes selon l’invention sont donc basées sur la mesure de ce biomarqueur modulé de façon significative, dans des tissus reconstruits exposés à l’ozone et/ou sur des échantillons de peaux exposés à l’ozone.
Ainsi, selon un premier de ses aspects, l'invention a pour objet une méthode de diagnostic, préférentiellementin vitroouex vivo ,d’une exposition à l’ozone de la peau, chez un sujet, ladite méthode comprenant la mesure de la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau dudit sujet.
Eventuellement cette méthode de diagnostic selon l’invention comprend en outre l’étape suivante : sur la base de la quantité mesurée de méthionine sulfoxyde, déterminer si la peau dudit sujet a été exposée à l’ozone.
L’invention concerne également une méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
  1. mesurer la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau d’un sujet, ledit échantillon étant traité avec ledit composé;
  2. comparer ladite quantité mesurée à l’étape a) à la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau non traité avec ledit composé ;
  3. identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, lorsque la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieure à la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé.
L’invention concerne également une méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
  1. effectuer un traitement d'un échantillon de peau choisi parmi des kératinocytes, un épiderme reconstruit et une peau reconstruite, par la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé;
  2. effectuer une exposition à l’ozone dudit échantillon de peau ;
  3. mesurer la quantité de méthionine sulfoxyde dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé ;
  4. comparer ladite quantité mesurée à l’étape c) à la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau exposé à l’ozone et non traité avec ledit composé ;
  5. identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieure à la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé ;
étant entendu que l’étape b peut être réalisée après l’étape a et inversement, et que les étapes a et b peuvent être répétées au moins 2 fois.
L’invention concerne aussi une méthode d’évaluation de l’efficacité d’un composé permettant de prévenir et/ou traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau d’un sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
  1. mesurer la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau dudit sujet avant le traitement avec ledit composé.
  2. traiter la peau dudit sujet avec ledit composé,
  3. mesurer la quantité de méthionine sulfoxyde, après l’étape b, dans un second échantillon de peau dudit sujet;
  4. comparer lesdites quantités mesurées à l’étape a. et à l’étape c. ;
  5. évaluer l’efficacité dudit composé candidat quant à la prévention et/ou le traitement des effets délétères de l’ozone sur la peau.
L’invention apparaîtra plus clairement à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d’exemple non limitatif.
Définition s générales
Par « sujet » on comprend un être humain, de préférence âgé de 1 mois à 90 ans.
Avantageusement, le sujet est susceptible d’avoir été exposé à l’ozone, en particulier à une exposition chronique ou aigue.
Le stratum corneum est la couche la plus éloignée de l'épiderme, et comprend la surface de la peau. Elle est composée principalement de cellules mortes.
Par « échantillon de stratum corneum », on entend ici un échantillon prélevé dans cette couche. Par exemple un tel échantillon peut être prélevé en frottant la surface de la peau ou en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame® appliquée sur la peau.
Par « exposition à l’ozone » on entend ici une exposition chronique ou aigue à l’ozone.
Par « exposition chronique », on entend ici une exposition régulière, en particulier journalière, pendant une période donnée, de préférence une période de plus d’un an, en particulier une période de douze mois éventuellement interrompue à une ou plusieurs reprises pendant de courtes durées, typiquement des durées de moins d’un mois, de préférence de moins d’une semaine.
Par « exposition aigue », on entend ici une exposition momentanée, en particulier de 12 heures à 5 jours, à au moins un niveau d’ozone supérieur à 0,05 ppm, de préférence supérieur à 0,07 ppm, plus préférentiellement supérieur à 0,09 ppm, encore mieux supérieur à 0,1 ppm.
La méthionine sulfoxyde ou sulfoxyde de méthionine, est un dérivé oxydé de la méthionine ayant pour formule la formule (I) suivante :
Formule (I)
La mesure de la quantité de méthionine sulfoxyde peut être réalisée par toute technique connue de l’homme du métier et en particulier par chromatographie liquide couplée à un détecteur UV (LC-UV) ou par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse par exemple la spectrométrie de masse à haute résolution (LC-HRMS).
Par « effets délétères de l’ozone », on entend des irritations ou des réactions d’inconfort au niveau de la peau (incluant également la peau du cuir chevelu) qui peuvent se traduire en particulier par des rougeurs, des démangeaisons, des sensations de chaleur, de picotement et de tiraillement.
Méthode de diagnostic d’une exposition à l’ozone de la peau
La présente invention concerne une méthode de diagnostic d’une exposition à l’ozone de la peau, chez un sujet, ladite méthode comprenant la mesure de la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau dudit sujet.
Préférentiellement, cette méthode de l’invention est une méthode de diagnostic d’une exposition chronique ou aigue à l’ozone.
La méthode de l’invention est de préférence mise en œuvrein vitroouex vivo.
L’échantillon de peau du sujet utilisée dans la méthode de diagnostic selon l’invention, est un échantillon prélevé, de préférence de manière non-invasive, sur la peau du sujet, préférentiellement sur le visage du sujet, en particulier sur la joue du sujet. Préférentiellement l’échantillon de peau une biopsie, une microbiopsie notamment réalisée à l’aide d’une aiguille, ou un échantillon de stratum corneum.
Ainsi selon un mode de réalisation, cette méthode selon l’invention comprend une étape de prélèvement de l’échantillon de peau du sujet avant la mesure de la quantité de méthionine sulfoxyde. Cette étape est préférentiellement effectuée de manière non-invasive, et en particulier ne nécessite pas d’anesthésie locale. Selon un mode de réalisation préféré, l’étape de prélèvement de l’échantillon est effectuée en frottant la surface de la peau ou en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®.
Eventuellement la méthode de diagnostic selon l’invention comprend en outre l’étape suivante : sur la base la quantité mesurée, déterminer si la peau dudit sujet a été exposée à l’ozone. Dans un mode de réalisation particulier, cette étape est réalisée après comparaison de la quantité mesurée de méthionine sulfoxyde avec une valeur de référence. Dans un mode de réalisation, la valeur de référence est déterminée par la quantité moyenne de méthionine sulfoxyde mesurée dans une population déterminée qui n’a pas été soumise à une exposition à l’ozone, notamment à une exposition aigue ou chronique à l’ozone.
Dans un mode de réalisation particulier, la valeur de référence est déterminée par la quantité moyenne de méthionine sulfoxyde mesurée chez des êtres humains âgés de 1 mois à 90 ans. Conformément à l’invention une valeur de référence peut être déterminée par une pluralité d'échantillons, de préférence plus de 20, 30, 50, 100, 200 ou 500 échantillons.
Le terme « comparaison » ici fait référence au fait de déterminer si la quantité de méthionine sulfoxyde est essentiellement identique à une valeur de référence ou diffère de celle-ci. De préférence, la quantité de méthionine sulfoxyde est considérée comme différente d'une valeur de référence si la différence observée est statistiquement significative. Si la différence n’est pas statistiquement significative, la quantité de méthionine sulfoxyde et la valeur de référence sont essentiellement identiques.
Sur la base de cette comparaison, on peut déterminer si la peau a été exposée à l’ozone. Typiquement, la peau est considérée comme ayant été exposée à l’ozone lorsque la quantité de méthionine sulfoxyde est significativement supérieure à la valeur de référence, et la peau n’est pas considérée comme ayant été exposée à l’ozone lorsque la quantité de méthionine sulfoxyde est essentiellement identique ou significativement inférieure à la valeur de référence.
Préférentiellement, la méthode selon l’invention comprend une étape de traitement de l’échantillon afin de préparer la mesure de la quantité de méthionine sulfoxyde. Par exemple si l’échantillon de peau a été obtenu par une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®, du méthanol peut être ajouté à la surface puis le liquide obtenu est repris dans un tube.
Eventuellement la méthode de diagnostic selon l’invention comprend en outre l’étape suivante : si la peau dudit sujet est déterminée comme ayant été exposée à l’ozone, traiter la peau dudit sujet avec une composition cosmétique permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone.
Par « composition cosmétique permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone » on comprend toute composition cosmétique connue de l’homme du métier permettant de réduire et/ou de ralentir l’apparition des effets délétères de l’ozone tels que les irritations ou les réactions d’inconfort au niveau de la peau, les rougeurs, les démangeaisons, les sensations de chaleur, de picotement et de tiraillement provoquées par l’ozone. Dans un mode de réalisation de l’invention, la composition cosmétique comprend un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, de préférence identifié par la méthode de l’invention.
Méthode s d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau
Les méthodes d’identification d’un composé de l’invention sont de préférence mises en œuvrein vitroouex vivo.
L’invention porte également sur une méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
  1. mesurer la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau d’un sujet, ledit échantillon étant traité avec ledit composé;
  2. comparer ladite quantité mesurée à l’étape a) à la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau non traité avec ledit composé ;
  3. identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, lorsque la quantité méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieure à la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé.
Selon un mode de réalisation préféré, les échantillons de peau d’un sujet utilisés dans la méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau selon l’invention sont choisis parmi un explant de peau humaine, une biopsie cutanée, une microbiopsie notamment réalisée à l’aide d’une aiguille et un échantillon de stratum corneum.
La méthode selon l’invention comprend au moins une étape de prélèvement d’un échantillon de peau du sujet. Cette étape est préférentiellement effectuée de manière non-invasive, et en particulier ne nécessite pas d’anesthésie locale. Selon un mode de réalisation préféré, l’étape de prélèvement de l’échantillon est effectuée en frottant la surface de la peau, en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®.
Préférentiellement, la méthode selon l’invention comprend une étape de traitement de l’échantillon afin de préparer la mesure de la quantité de méthionine sulfoxyde. Par exemple si l’échantillon de peau a été obtenu en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®, du méthanol peut être ajouté à la surface adhésive puis le liquide obtenu repris dans un tube.
Dans un mode de réalisation particulier, la méthode selon l’invention ci-dessus comprend une étape supplémentaire d‘exposition des échantillons à l’ozone. Cette étape est préférentiellement réalisée sur les deux échantillons dans les mêmes conditions. Elle peut être réalisée avant ou après traitement de l’échantillon de peau audit composé.
L’invention concerne également une méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
  1. effectuer un traitement d'un échantillon de peau choisi parmi des kératinocytes, un épiderme reconstruit et une peau reconstruite, par la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé;
  2. effectuer une exposition à l’ozone dudit échantillon de peau ;
  3. mesurer la quantité de méthionine sulfoxyde dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé ;
  4. comparer ladite quantité mesurée à l’étape c) à la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau exposé à l’ozone et non traité avec ledit composé ;
  5. identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieure à la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé ;
étant entendu que l’étape b peut être réalisée après l’étape a et inversement, et que les étapes a et b peuvent être répétées au moins 2 fois.
Préférentiellement, cette méthode selon l’invention comprend une étape de traitement des échantillons afin de préparer la mesure de la quantité de méthionine sulfoxyde.
Dans un mode de réalisation préféré, la méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, comprend les étapes suivantes :
  1. effectuer un premier traitement d'un échantillon de peau choisi parmi des kératinocytes, un épiderme reconstruit et une peau reconstruite, par la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé ;
  2. effectuer une première exposition à l’ozone dudit échantillon de peau ;
  3. effectuer un second traitement de l’échantillon de peau par la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé ;
  4. effectuer une seconde exposition à l’ozone dudit échantillon de peau ;
  5. effectuer un troisième traitement de l’échantillon de peau par la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé ;
  6. effectuer une troisième exposition à l’ozone dudit échantillon de peau ;
  7. mesurer la quantité de méthionine sulfoxyde dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé ;
  8. comparer ladite quantité mesurée à l’étape g) à la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau exposé à l’ozone et non traité avec ledit composé ;
  9. identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieure à la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé.
Préférentiellement, cette méthode selon l’invention comprend une étape de traitement des échantillons afin de préparer la mesure du niveau d’expression.
De préférence, dans les méthodes d’identification d’un composé de l’invention, la seule différence entre l’échantillon de peau traité avec ledit composé et l’échantillon de peau non traité avec ledit composé est ledit (ou lesdits) traitement(s) avec le composé.
Typiquement, le traitement de l’échantillon avec ledit composé comprend la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé pendant au moins 5 minutes, au moins 10 minutes ou encore au moins 20 minutes.
Typiquement, la mesure de la quantité de méthionine sulfoxyde est réalisée au moins 5 minutes, au moins 10 minutes ou encore au moins 20 minutes après le dernier traitement de l’échantillon avec ledit composé.
Les étapes b, d ou h. de comparaison des méthodes d’identification ci-dessus font référence au fait de déterminer si la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée à l’étape a. est essentiellement identique à la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans un échantillon de peau non traité avec ledit composé. De préférence, la quantité de méthionine sulfoxyde est considérée comme différente si la différence observée est statistiquement significative. Si la différence n’est pas statistiquement significative, les deux quantités de méthionine sulfoxyde sont essentiellement identiques.
Sur la base de cette comparaison, on peut déterminer si le composé permet de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau. Typiquement, le composé est considéré comme permettant de prévenir et/ou de de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, lorsque la quantité de méthionine sulfoxyde est significativement inférieure dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé par rapport à la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon qui n’a pas été traité avec ledit composé, alternativement le composé n’est pas considéré comme permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, lorsque la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée est essentiellement identique ou significativement supérieure dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé par rapport la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon qui n’a pas été traité avec ledit composé.
De préférence, les étapes d’exposition à l’ozone sont réalisées de manière identique sur l’échantillon traité avec ledit composé et l’échantillon qui n’est pas traité avec ledit composé.
Typiquement les échantillons sont incubés dans une atmosphère enrichie en ozone.
Dans un mode de réalisation, les étapes d’exposition à l’ozone b, d ou f durent au moins 5 heures, plus particulièrement au moins 10 heures et de manière préférée au moins 18 heures. Ces étapes peuvent également être entrecoupées par des périodes d’incubation dans une atmosphère normale, ambiante. Typiquement les échantillons sont incubés dans une atmosphère enrichie en ozone pendant 18h puis une atmosphère normale pendant les 6 heures suivantes et ensuite à nouveau dans une atmosphère enrichie en ozone pendant 18h.
Les méthodes d’identification d’un composé selon l’invention permettent d’identifier des composés permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau suite à une exposition chronique ou aigue à l’ozone.
Dans un autre mode de réalisation, les étapes d’exposition à l’ozone b, d ou f durent de 10 à 120 minutes, de préférence de 20 à 60 minutes. Ces étapes peuvent également être entrecoupées par des périodes d’incubation dans une atmosphère normale, ambiante.
Par « atmosphère » dans lequel l’échantillon de peau est incubé, on entend le gaz ou mélange de gaz dans lequel l’échantillon est placé. De préférence l’échantillon est incubé dans une atmosphère similaire à l’air ambiant.
Par « atmosphère enrichie en ozone », on entend une atmosphère similaire à l’air ambiant comprenant au moins 0,05 ppm (partie par million) d’ozone, de préférence au moins 0,07 ppm d’ozone, au moins 0,1 ppm d’ozone ou encore au moins 0,3 ppm d’ozone.
Méthode d’évaluation de l’efficacité d’un composé permettant de prévenir et/ou traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau d’un sujet
L’invention porte également sur une méthode d’évaluation de l’efficacité d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau d’un sujet, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
  1. mesurer la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau dudit sujet avant traitement avec ledit composé.
  2. traiter la peau dudit sujet avec ledit composé,
  3. mesurer la quantité de méthionine sulfoxyde, après l’étape b, dans un second échantillon de peau dudit sujet;
  4. comparer lesdites quantités mesurées à l’étape a. et à l’étape c. ;
  5. évaluer l’efficacité dudit composé candidat quant à la prévention et/ou le traitement des effets délétères de l’ozone sur la peau.
La méthode de l’invention est de préférence mise en œuvrein vitroouex vivo.
Les échantillons de peau du sujet utilisés dans la méthode d’évaluation selon l’invention, sont prélevés de préférence de manière non-invasive, sur la peau du sujet, préférentiellement sur le visage du sujet, en particulier sur la joue du sujet.
Préférentiellement l’échantillon de peau est une biopsie, une microbiopsie notamment réalisée à l’aide d’une aiguille, ou un échantillon de stratum corneum.
Ainsi selon un mode de réalisation, cette méthode selon l’invention comprend plusieurs étapes de prélèvement d’échantillon de peau du sujet. Cette étape est préférentiellement effectuée de manière non-invasive, et en particulier ne nécessite pas d’anesthésie locale. Selon un mode de réalisation préféré, l’étape de prélèvement de l’échantillon est effectuée en frottant la surface de la peau ou en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®.
De préférence, la seule différence entre l’échantillon de peau de l’étape a. et l’échantillon de peau de l’étape c. est ledit traitement avec le composé.
L’échantillon de peau de l’étape c. est prélevé après que la peau dudit sujet ait été traitée avec ledit composé. Dans un mode de réalisation, l’échantillon de peau de l’étape c. est prélevé après que la peau dudit sujet ait été traitée avec ledit composé pendant au moins 14 jours, de préférence au moins 28 jours. Typiquement, cet échantillon est prélevé au moins 5 minutes, au moins 10 minutes ou encore au moins 20 minutes après le dernier traitement de l’échantillon avec ledit composé.
Préférentiellement, la méthode selon l’invention comprend une étape de traitement de l’échantillon afin de préparer la mesure de la quantité de méthionine sulfoxyde. Par exemple si l’échantillon de peau a été obtenu en utilisant une surface adhésive telle qu’un disque D-squame®, du méthanol peut être ajouté à la surface adhésive puis le liquide obtenu est repris dans un tube.
L’étape d. de comparaison ici fait référence au fait de déterminer si la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée à l’étape a. est essentiellement identique à la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée à l’étape c. De préférence, la quantité de méthionine sulfoxyde est considérée comme différente si la différence observée est statistiquement significative. Si la différence n’est pas statistiquement significative, les deux quantités de méthionine sulfoxyde sont essentiellement identiques.
Sur la base de cette comparaison, on peut évaluer l’efficacité d’un composé à prévenir et/ou traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau. Typiquement, plus la quantité de méthionine sulfoxyde est inférieure dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé par rapport à la quantité méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon qui n’a pas été traité avec ledit composé, plus le composé est considéré efficace pour prévenir et/ou traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau. Alternativement, le composé n’est pas considéré efficace pour prévenir et/ou traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée est essentiellement identique ou significativement supérieure dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé par rapport la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon qui n’a pas été traité avec ledit composé.
Exemple: Exemple 1 : Matériel et méthode : 1- Système d’exposition à l’ozone in vitro 1.1-Dispositif externe à l’incubateur :
Pour mimer une pollution à l’ozone le laboratoire utilise un analyseur/générateur d’ozone MEGATEC 49i couplé à une pompe externe, et relié également à un incubateur de culture régulé à 37°C, 5% CO2et saturé en humidité (environ 95%).
La pompe externe permet de prélever de l’air ambiant et d’alimenter l’analyseur/générateur d’ozone MEGATEC. L’air va alors passer devant la lampe UV de l’appareil (réglée à la longueur d’onde de 185nm) qui va transformer une partie des molécules d’oxygène (O2) de l’air en molécules d’ozone (O3). L’air est alors enrichi en ozone.
Cet air enrichi en ozone va pouvoir alors être transféré dans l’incubateur contenant les plaques de culture avec le modèle de peau reconstruite T-SkinTM.
L’analyseur/générateur MEGATEC permet de régler et de contrôler :
  • Le débit d’air enrichi en ozone (alimentant l’incubateur) au moyen d’un détendeur placé en amont du circuit dans l’analyseur/générateur MEGATEC.
  • La concentration en ozone généré en réglant la puissance de la lampe UV de l’analyseur/générateur MEGATEC.
Par ailleurs l’analyseur/générateur MEGATEC possède une seconde pompe et un système d’analyse en interne qui permettent de mesurer la concentration réelle en ozone : soit en sortie d’appareil (concentration générée, en amont de l’exposition dans l’incubateur), soit dans l’incubateur (concentration résiduelle, en aval de l’exposition).
1.2-Dispositif interne à l’incubateur :
Au sein de l’incubateur un système de fluidique développé au laboratoire permet de distribuer la même quantité d’ozone sur chaque insert de peau reconstruite. Ce système est semi-ouvert pour permettre à la fois : une distribution homogène de l’ozone sur le dessus des plaques, et une bonne régulation des conditions de culture des peaux reconstruites.
Par ailleurs, le couvercle de chaque plaque de culture (généralement en polystyrène, matériel sensible à l’ozone) est remplacé par un couvercle spécifique pour l’exposition : il s’agit d’un couvercle en PTFE ou en PEEK percé au-dessus de chaque insert de peau reconstruite, et permettant ainsi une exposition directe de la surface des peaux reconstruites à l’air enrichi en ozone. De plus ce couvercle permet de protéger le milieu de culture pour éviter son oxydation par l’ozone, afin de ne réaliser qu’une exposition de la surface des peaux.
2-Exposition à l’ozone de peaux reconstruites in vitro
2.1- Réception et culture du modèle de peau reconstruite T-Skin TM .
Le modèle de peau reconstruite utilisé est le modèle de peau reconstruite T-SkinTM.produit et fourni par la société EPISKIN SA (FR-69007, Lyon).
Il s’agit d’un modèle de peau reconstruite composé :
  • D’un derme reconstruit constitué d’une lattice de collagène 1, contenant des fibroblastes d’origine humaine extraits de plasties mammaires issues de donneurs sains adultes (déchet chirurgical obtenu avec le consentement des patientes lors d’interventions de chirurgie esthétique de réductions mammaires).
  • D’un épiderme reconstruit réalisé à partir de kératinocytes d’origine humaine extraits de plasties mammaires issues de donneurs sains adultes (déchet chirurgical obtenu avec le consentement des patientes lors d’interventions de chirurgie esthétique de réductions mammaires).
Ce modèle est cultivé dans un insert de culture de 4,5cm² qui permet de le suspendre au-dessus du milieu de culture et de le cultiver à l’interface air liquide.
Dans cet insert la lattice de collagène, ou équivalent dermique, recouvre une surface qui peut varier de 2 à 2,5 cm² au centre de l’insert. L’épiderme lui recouvre généralement l’ensemble des 4,5cm² de l’insert.
Le modèle T-SkinTMest réceptionné au laboratoire après 12 jours de culture du derme (J12). L’épiderme lui est à 7 jours de culture et il est relativement immature (peu différencié). Durant le transport ces inserts sont posés sur un milieu de culture nutritif semi-solide adapté au transport.
A réception, les inserts sont rapidement transférés dans des nouvelles plaques de culture 6 puits dites « deep well » permettant de mettre 8,5ml de milieu de culture liquide sous chaque insert (culture à l’interface air liquide). Ces plaques peuvent être les plaques de la marque Corning référence 355467. Le milieu de culture utilisé est celui commercialisé par la société EPISKIN pour les kits T-SkinTM: milieu dénommé « Culture medium for T-Skin ».
Les peaux reconstruites sont placées ensuite dans un incubateur de culture régulé à 37°C, 5% CO2et avec une humidité saturée (environ 95% d’humidité).
Le milieu de culture est ensuite remplacé de la même manière à J13 et J15 (derme).
Enfin à J18, les inserts sont placés dans des plaques de culture 6 puits standards au format SBS (type plaque de la marque COSTAR référence 3506) avec 2,5ml de milieu culture pour TSKIN sous chaque insert.
Par la suite ces plaques sont remplacées avec le milieu de culture au minimum tous les jours.
2.2- Expositions répétées du modèle T-Skin TM .à l’ozone 0,1 ppm :
Pour ce type d’exposition le générateur d’ozone est réglé sur des valeurs basses :
  • Ozone généré en sortie d’appareil : environ 0,130 ppm pour une concentration mesurée à l’intérieur de l’incubateur inférieure à 0,1 ppm
  • Le débit de sortie de l’air enrichi en ozone au-dessus de chaque peau reconstruite est d’environ 20 ml/min (à noter que les sorties d’ozone sont à plus de 10cm des peaux reconstruites à l’intérieur de l’incubateur pour éviter un stress direct du flux de sortie).
Les expositions sont réalisées trois fois successivement : 18h entre J18 et J19, 18h entre J19 et J20, et 18h entre J20 et J21. Entre chaque exposition le modèle est à l’incubateur sans ozone pendant un peu moins de 6h.
Une fois les peaux prêtes à être exposées, les couvercles standards en polystyrène sont remplacés par des couvercles percés en PEEK ou en PTFE.
Une partie des échantillons sont traités sous ozone, et une autre partie, les témoins, sont préparés exactement de la même façon, mais incubés dans un incubateur classique sans ozone.
A J22, les échantillons de peaux reconstruites ont été prélevés, l’épiderme a été séparé du derme, coupé en deux et congelé à -80°C pour les analyses.
2.3- Expositions répétées du modèle T-Skin TM .à l’ozone 0,4 ppm :
Pour ce type d’exposition le générateur d’ozone est réglé sur des valeurs modérées en ozone mais un peu supérieures à des pics réalistes d’ozone :
  • Ozone généré en sortie d’appareil : environ 0,4ppm pour une concentration mesurée à l’intérieur de l’incubateur inférieure à 0,3ppm
  • Le débit de sortie de l’air enrichi en ozone au-dessus de chaque peau reconstruite est d’environ 20 ml/min (à noter que les sorties d’ozone sont à plus de 10cm des peaux reconstruites à l’intérieur de l’incubateur pour éviter un stress direct du flux de sortie).
Les expositions sont réalisées deux fois successivement : 18h entre J18 et J19, et 18h entre J20 et J21. Entre J19 et J20 et entre J21 et J22 les peaux reconstruites sont placées dans un incubateur sans ozone.
Une fois les peaux prêtes à être exposées, les plaques et milieux de culture sont à nouveau remplacés (pour éviter le risque d’avoir de la solution de matière première qui soit passée dans le milieu de culture sous l’insert durant l’application), et les couvercles standards en polystyrène sont remplacés par des couvercles percés en PEEK ou en PTFE.
Une partie des échantillons sont traités sous ozone, et une autre partie, les témoins, sont préparés exactement de la même façon, mais incubés dans un incubateur classique sans ozone.
A J22, les échantillons de peaux reconstruites ont été prélevés, l’épiderme a été séparé du derme, coupé en deux et congelé à -80°C pour les analyses.
3-Exposition à l’ozone de peaux reconstruites in vivo
L’étude clinique a inclus 10 volontaires (8 femmes et 3 hommes), ayant un âge moyen de 36,2 ans, de phototype III-IV et une quantité de sébum mesurée sur le front supérieur à 140 µg/cm2(quantité de sébum de 146 à 299 µg/cm2).
Les expositions en mini-zones ont été réalisées au CIDP à l’Ile Maurice à l’aide de cloches reliées à un générateur d’ozone, d’air médical ou à l’air ambiant, posées sur la peau du dos des volontaires (Controlled Pollution Exposure System (CPES)). Le système de génération d’ozone et les cloches utilisées sont décrits dans la publication Curpen et al., 2020 – A novel method for evaluating the effect of pollution on the human skin under controlled conditions, Skin Res Technol.). Les expositions à l’ozone et à l’air médical ont été réalisées de façon aléatoire gauche-droite sur chaque volontaire. 3 conditions ont été réalisées :
  • 6 expositions à 0,3 ppm (débit de gaz : 0.2-0.3 l/min), trois fois par semaine pendant 2 semaines. Chaque exposition a duré 2 heures.
  • 6 expositions à de l’air médical (débit de gaz : 0.2-0.3 l/min), selon le même protocole.
Des D-squames ont été prélevés avant et 1h après chaque exposition à J1 (1 exposition), J5 (3 expositions) et J12 (6 expositions).
4-Analyse de la méthionine sulfoxyde sur des échantillons de peaux reconstruites in vitro ou des D-squames in vivo
4.1- Extraction pour l’analyse de la méthionine sulfoxyde
Pour extraire la méthionine sulfoxyde, du méthanol est ajouté à chaque D-squame en petit flacon (1 mL). Il est agité durant 30 minutes à 37 °C, pour être ensuite repris en tube à hémolyse et évaporé à l’aide d’un concentrateur à vide. L’extrait évaporé, est repris avec 200 µL d’un mélange méthanol:isopropanol 2:1. Les échantillons sont mis au bain à ultrasons pendant 5 min et filtrés à 0,2 µm.
4.2- Méthode chromatographique pour l’analyse de la méthionine sulfoxyde: UPLC Vanquish (Thermofischer)
Colonne Four
°C		 Eluants Débit mL/min %B T0 % B à T x Durée
Acquity CSH Fluoro-Phenyl – 2,1 x 150 x 1,7µm – Waters 50 A : Eau +0,1% d’acide formique

B: Méthanol		 0,2 5%
0-0,8 min		 0,7-2 min montée à 99%
2-3min 99%
3,1-7 min 5 %		 7 min
% B T0 : pourcentage du solvant B à T0 = 0-0,8 min
%B à Tx : pourcentage de solvant B aux différents temps indiqués dans le tableau
4.3- Paramètres du Spectromètre de masse Orbitrap Tribrid IDX Thermofisher
La détection du composé est réalisée à l’aide du détecteur Orbitrap, avec les paramètres suivants :
Mode :
Scan :
Scan range :
Résolution :		 Full MS ESI
Positif
65 – 400
70 000
RESULTATS Méthionine sulfoxyde in vitro
Le tableau 2 montre que la quantité de méthionine sulfoxyde augmente dans des peaux reconstruites exposées à 0,1 ou 0,4 ppm d’ozone.
[Table 2] Tableau 2 : Méthionine sulfoxyde quantifiée en unité arbitraire in vitro sur peaux reconstruites après exposition à l’ozone à 0,1 ou 0,4 ppm.
Métabolite Non exposé Ecart-type Ozone
0,4 ppm 		Ecart-type Ozone
0,1 ppm 		Ecart-type
Méthionine sulfoxyde 1 0,148 23,118 0,606 10,226 0,775
Méthionine sulfoxyde in vivo
Le tableau 3 montre que la quantité de méthionine sulfoxyde augmente dans des D-squames prélevés sur des volontaires exposés à l’ozone par rapport à ceux exposés à de l’air médical à J12 chez 8 volontaires sur 10.
[Table 3] Tableau 3 : Méthionine sulfoxyde quantifiée en unité arbitrairein vivoà Jour 12 après 6 expositions à l’ozone.
Méthionine sulfoxyde Air médical Ozone
Volontaire 1 2,514 7,019
Volontaire 2 1,352 1,625
Volontaire 3 4,370 6,325
Volontaire 4 3,012 3,734
Volontaire 5 3,098 NA
Volontaire 6 2,488 2,962
Volontaire 7 4,358 2,388
Volontaire 8 1,670 2,141
Volontaire 9 7,027 21,035
Volontaire 11 2,330 2,601

Claims (6)

  1. Méthode de diagnostic d’une exposition à l’ozone de la peau, chez un sujet, ladite méthode comprenant la mesure de la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau dudit sujet.
  2. Méthode de diagnostic selon la revendication 1, comprenant l’étape suivante : sur la base la quantité mesurée, déterminer si la peau dudit sujet a été exposée à l’ozone après comparaison de la quantité mesurée de méthionine sulfoxyde avec une valeur de référence.
  3. Méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
    1. mesurer la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau d’un sujet, ledit échantillon étant traité avec ledit composé;
    2. comparer ladite quantité mesurée à l’étape a) à la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau non traité avec ledit composé ;
    3. identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, lorsque la quantité méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieure à la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé.
  4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle lesdits échantillons de peau sont choisi parmi : un explant de peau humaine, une biopsie cutanée, une microbiopsie et un échantillon de stratum corneum.
  5. Méthode selon la revendication 3 ou 4 comprenant une étape supplémentaire d’exposition desdits échantillons à l’ozone.
  6. Méthode d’identification d’un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
    1. effectuer un traitement d'un échantillon de peau choisi parmi des kératinocytes, un épiderme reconstruit et une peau reconstruite, par la mise en contact de l’échantillon de peau avec ledit composé;
    2. effectuer une exposition à l’ozone dudit échantillon de peau ;
    3. mesurer la quantité de méthionine sulfoxyde dans l’échantillon de peau traité avec ledit composé ;
    4. comparer ladite quantité mesurée à l’étape c) à la quantité de méthionine sulfoxyde dans un échantillon de peau exposé à l’ozone et non traité avec ledit composé ;
    5. identifier ledit composé candidat comme un composé permettant de prévenir et/ou de traiter les effets délétères de l’ozone sur la peau lorsque la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui a été traité avec ledit composé est inférieure à la quantité de méthionine sulfoxyde mesurée dans l’échantillon de peau qui n’a pas été traité avec ledit composé ;
    étant entendu que l’étape b peut être réalisée après l’étape a et inversement, et que les étapes a et b peuvent être répétées au moins 2 fois.
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