[go: up one dir, main page]

WO2016097643A1 - Modele de peau humaine et son utilisation pour evaluer ex vivo les effets dermatologiques, cosmetiques et/ou nutraceutiques de composés - Google Patents

Modele de peau humaine et son utilisation pour evaluer ex vivo les effets dermatologiques, cosmetiques et/ou nutraceutiques de composés Download PDF

Info

Publication number
WO2016097643A1
WO2016097643A1 PCT/FR2015/053611 FR2015053611W WO2016097643A1 WO 2016097643 A1 WO2016097643 A1 WO 2016097643A1 FR 2015053611 W FR2015053611 W FR 2015053611W WO 2016097643 A1 WO2016097643 A1 WO 2016097643A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
skin
sample
days
human skin
vivo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2015/053611
Other languages
English (en)
Inventor
Thierry Passeron
Jérôme AUBERT
Agnès PERRIN
David Piwnica
Yves Rival
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Galderma Research and Development SNC
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Galderma Research and Development SNC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Galderma Research and Development SNC filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of WO2016097643A1 publication Critical patent/WO2016097643A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/60—Materials for use in artificial skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C12N5/0698—Skin equivalents

Definitions

  • the invention lies in the field of tests performed ex vivo to evaluate compounds of interest in dermatology, cosmetics and / or nutraceuticals.
  • the present invention relates to a model of human skin maintaining ex vivo histological integrity and biological functionality of the skin. It also relates to the use of said ex vivo human skin model to evaluate the dermatological, cosmetic and / or nutraceutical effects of compounds. The invention also relates to a method for modeling and analyzing a selected treatment of human skin. Finally, the invention relates to the use of an ex vivo human skin sample for analyzing a selected treatment of the skin.
  • the human skin model commonly used and well known for evaluating compounds or formulations of interest is a model using metal rings (called "O-rings"). It consists in depositing a sample of degreased human skin, generally derived from plastic surgery carried out in a hospital environment, in a petri dish containing about 3 ml of a culture medium and placing metal rings on the skin sample. Samples are then taken at the end of the topical or systemic treatment of the skin to evaluate the effectiveness of the treatment administered.
  • this model of human skin has the major disadvantage that it remains intact histologically ex vivo only three days at most. As a result, some biological functions that require more than three days of culture can not be studied and may require kinetics of five, nine, eleven or fifteen days.
  • the document DE10317402 describes a method for producing a human ex vivo skin model or animal, including pig.
  • the method involves taking a pork skin sample comprising the epidermis / dermis and bringing it into contact with an androgen.
  • the document gives no indication of viability of the skin sample beyond seven days.
  • the document EP2019316 describes the use of a sample of human or animal skin comprising an epidermis, a dermis, a subcutaneous layer of thickness 0.5-5 mm and hair follicles.
  • the skin sample is placed on a sterile support such as cork or a piece of cotton and is immersed in a culture medium. Sterile support is willing to the conventional six-well type plate interior.
  • the presence of the subcutaneous layer and a certain density of hair follicles increase, according to this document, the viability of the skin sample.
  • the document however, gives no evidence of viability of the ex vivo human skin sample.
  • the problem that the present invention proposes to solve is therefore to produce a model of human skin that makes it possible to maintain ex vivo histological integrity and effective biological functionality up to eleven days and more.
  • a first object according to the invention consists of an ex vivo human skin model maintaining a histological integrity and a biological functionality of the skin, characterized in that it comprises in combination:
  • ex vivo means "out of the living” and applies to biological tests performed on skin samples from a living organism, said tests being set up outside the body .
  • - "size” or “dimensions” means the measurable ranges of the human skin sample over its length and width.
  • the skin sample once prepared, can have a varied shape such as a square, a rectangle or a circle (or round). In the case of a round / circular shape, the dimension will be assimilated to the diameter of the circle. Otherwise, it is the lengths and widths of the chosen shape.
  • maintain histological integrity means that cells of the skin sample remain intact or normally formed in the epidermis and dermis, - “maintain biological functionality” the fact that the biological mechanisms of the skin remain functional, including transcription, translation, enzymatic activity, etc.
  • a sample of human skin means a part of skin obtained by taking from human skin or isolated from a human being. This may be for example a biopsy of human skin or a sample taken by plastic surgery.
  • skin or “skin sample” comprises a skin and a fat-free dermis, washed and cut with a punch to the desired size.
  • support having at its porous base an insert-type support or other having a rounded shape, circular, square or rectangular and whose base is pierced with holes.
  • any device for containing the culture medium and the support may be a device commonly called a sink.
  • topical treatment or topical application, the application on the epidermis portion of the skin sample of a compound or formulation of interest.
  • systemic treatment means the addition in the culture medium in which the dermis of the skin sample is bathed with a compound or formulation of interest.
  • cosmetic treatment the application of a compound or formulation of interest on the epidermis portion of the skin sample or in the culture medium, said compound or said formulation exhibiting an activity other than as preventive and curative on the skin, for example an activity of hydration, anti-aging, etc. This is a non-therapeutic cosmetic treatment.
  • “dermatological treatment” means the application of a compound or formulation of interest to the part of the epidermis of the skin sample or to the culture medium, said compound or said formulation having a preventive activity or curative on the skin, to prevent the development of a pathology and / or its symptoms or to decrease, preferably avoid, the appearance of its symptoms,
  • a selected treatment comprising a compound which will be applied topically and / or systemically,
  • compound and “compound or formulation of interest” means any active compound alone or in a formulation adapted to its topical or systemic administration.
  • the human skin model according to the invention comprises technical features which make it possible to maintain a histological integrity and a biological functionality of the skin sample up to eleven days and more.
  • the technical characteristics of interest are more precisely:
  • the sample of human skin has at least a dimension of between 5 and 10 mm, for example between 6 and 10 mm or between 6 and 8 mm, and comprises an epidermis and a dermis. Said sample was defatted to remove the subcutaneous layer and washed. Preferably, the skin sample does not include hair follicles. It is placed so that the epidermis is positioned in the upper part and the dermis in the lower part on a support, so as to apply the desired topical and / or systemic treatments.
  • the support is porous at its base (lower part) and is of any shape, the porous base of the support having the same size (s) as the skin sample. In this way, the skin sample remains integral with the porous base of the support.
  • the dermis of the skin sample and the porous base of the support are immersed in a container comprising a culture medium that is suitable for maintaining the life of the skin cells, mainly keratinocytes.
  • the support is held for example by fins on the container so that the culture medium is flush with the epidermis without covering it.
  • the culture medium will advantageously be renewed every one to three days. These three characteristics are preferably combined within the skin model according to the invention.
  • Figure 1 (A) illustrates the ring pattern called "O-rings”.
  • FIG. 1 (B) describes an example of an ex vivo human skin model according to the invention.
  • the epidermis (1) and the dermis (2) of the human skin sample are placed on the porous base (4) of a support (3), said support and the sample human skin bathed in a culture medium (5) disposed in the container (6).
  • FIG. 2 represents the graphs of the pharmacological responses of Example 3.4 obtained in the model according to the invention (A) versus the ring model called "O-rings" (B).
  • Figure 3 shows the histological sections of the skin sample that was used in Example 3.5. The sections demonstrate the histological maintenance of the skin up to 9 days without treatment.
  • Figure 4 (A) shows the histological sections of the skin sample that has been treated with forskolin (pro-pigmenting agent). The cuts demonstrate the histological maintenance of the skin up to 15 days without treatment.
  • Figure 4 (B) demonstrates forskolin induction at the transcriptional level of melanogenesis markers (qPCR).
  • the Figure 4 (C) demonstrates forskolin induction at the protein level of these same markers (ICH).
  • Figure 5 shows the ex vivo activation of the Wnt (A) pathway and induction of expression of melanoblastic markers [(B), (C), (D) and (E)] on a patient skin model. reached vitiligo (A) under the effect of pharmacological activators of the Wnt pathway (CHIR99021, SKL2001 and LiCI).
  • Figure 6 shows that the ex vivo treatment of depigmented skin from patients with vitiligo using pharmacological activators of the Wnt [control (A), SKL2001 (B), CHIR99021 (C) and LiCl (D) pathway. ] induces the differentiation of resident stem cells into pre-melanocytes
  • Any support having a porous base for receiving the skin sample and any container for immersing ex vivo the dermis of the skin sample in the culture medium, regardless of their shape and size, will be suitable to achieve the human skin model according to the invention.
  • the histological integrity and the biological functionality of the human skin sample can be maintained ex vivo up to eleven days and preferably up to at least fifteen days.
  • the tests included in the present invention were conducted ex vivo up to fifteen days on the skin model. The results obtained confirm the maintenance of the histological integrity and the biological functionality of the skin for at least fifteen days.
  • the skin sample is round / circular in shape and its diameter is between 6 and 8 mm. It is preferably 6 mm, 7 mm or 8 mm. Since the size of the sample or biopsy of a patient's skin may be limited when it is not a question of surgical plasty, it will be even more preferred to use a sample having a diameter of 6 mm.
  • the porosity of the base of the support is greater than or equal to 0.4 ⁇ . This porosity is defined so that the dermis can be placed in contact with the culture medium and that the exchanges required for systemic treatment are sufficient and effective.
  • the culture medium is a complex culture medium such that the cells present in the skin, mainly the keratinocytes, can be kept alive.
  • Those skilled in the art will be able to adapt the culture medium according to the treatment to be administered or the studies to be performed on the human skin sample.
  • the culture medium is the Medium Long Term Medium (SLTM) medium or "Long Term Skin Culture Medium” Biopredic® company (reference MIL305 on the website of the company biopredic. com).
  • SLTM Medium Long Term Medium
  • Biopredic® company reference MIL305 on the website of the company biopredic. com.
  • This culture in air / liquid interface facilitates the renewal of the culture medium every one to three days.
  • the medium is eliminated or preserved if it is desired to dose mediators produced by the skin following systemic treatments.
  • the medium is then replaced by an identical and sufficient amount of medium to flush with the basal layer of the epidermis.
  • the quantity or volume of culture medium will depend on the size of the container used and the type of support suspended in the container so that the culture medium is flush with this basal layer.
  • a pipette will preferably be used for topical application of a compound, formulated or not, the necessary dose will be deposited on the surface of the epidermis and spread using either the pipette or an instrument deemed relevant as in particular a disc made of inert material (reference 03 / 150-38, supplier SEFAR NITEX) for spreading the formulation more easily.
  • the samples will advantageously be placed in a controlled atmosphere incubator (37 ° C., 5% CO 2 and saturated hygrometry).
  • the compound will preferably be introduced directly into the medium either directly into the container once the culture medium is changed or in the culture medium and then distributed in the container, as needed.
  • the change of culture medium is carried out every two to three days, preferably every other day.
  • the human skin sample can come from all parts of the human body, for example from the abdomen, thigh, arms or breasts. In one embodiment preferred according to the invention the human skin sample is a sample from the abdomen.
  • the skin sample comprises, in the human skin model according to the invention, an epidermis and a dermis.
  • the skin comes for example from surgery, usually for aesthetic purposes. It is taken by the surgeon and sent within a few hours for the preparation of the skin model (intended to be used ex vivo).
  • the skin is defatted and cleaned to remove residual blood and fat.
  • the skin thus prepared is cut with the aid of a punch having the desired shape, preferably circular / round. The cuts thus obtained are placed in the sterile inserts, in the presence of sterile medium.
  • a second object according to the invention is the use of the ex vivo human skin model as described above for evaluating the dermatological, cosmetic and / or nutraceutical effects of compounds or formulations of interest.
  • Compounds or formulations of interest useful in dermatology include, for example, compounds or formulations intended to evaluate:
  • a third object according to the invention is a method for modeling and analyzing a selected treatment of human skin, comprising the steps below:
  • the treatment selected is, as indicated above, for dermatological, cosmetic and / or nutraceutical purposes.
  • the selected compounds or formulations of interest will typically be applied topically to the surface of the epidermis for dermatological and cosmetic treatments. They will preferably be applied systemically by dilution in the culture medium included in the container for dermatological and / or nutraceutical treatments.
  • the sample is processed every two days.
  • the treatment is topical, it is best to clean the skin before any other application of compounds or formulations of interest.
  • the culture medium is preferably changed every one to three days, preferably every other day. It may be necessary to keep the culture medium to renew to study the effects of systemic treatments on the human skin sample.
  • the selected treatment is topical, the skin is cleaned before any further exposure of the skin sample to the selected treatment.
  • a fourth object according to the invention relates to the use of a human skin sample for ex vivo analysis of a selected treatment of the skin, characterized in that the human skin sample i) has a size of between 5 and 10. mm, ii) consists of an epidermis (1) and a dermis (2), and iii) is placed on an insert-type support (3) having at its porous base (4) the same dimension as said skin sample, the dermis (2) of the skin sample and the base of the support (4) immersed in a container (6) comprising a culture medium (5) renewed every one to three days.
  • the ex vivo use of the skin model according to the invention made from excised skins of Vitiligo patients has made it possible to show that treatments with inhibitors of GSK3P induce a significant increase in melanocyte markers.
  • the use of the ex vivo skin model according to the invention has thus made it possible to show that these treatments induce the differentiation of the stem cells of the melanocytes residing in the pre-melanocytes which express PAX3 and DCT.
  • the presence of these pre-melanocytes has been observed in the hair follicle and in the dermis, the utility of this new ex vivo skin model appears clearly with regard to the study of the mechanisms involved in the differentiation of melanocytes.
  • the skin of human origin comes from surgery, most often for aesthetic purposes. It is taken by the surgeon and delivered under 2-4 h dry in the laboratory. Once received, the skin is defatted, with a scalpel or scissors, and then cleaned in sterile isotonic baths to remove residual blood and fat. The skin thus prepared is cut with a sterile biopunchs® punch of the desired size, preferably 8 mm in diameter. All operations are performed under sterile conditions, at all stages upon receipt of the skin.
  • Example 2 Preparation of the Ex Vivo Human Skin Model
  • Example 1 The skin samples prepared in Example 1 are placed using forceps in sterile inserts, one per insert. Each insert is then placed in a well of the appropriate size. For an insert whose base has a diameter of 8 mm and pores of 0.4 ⁇ , a 24-well plate is used. The medium is added to the well which is flush with the basal layer of the epidermis.
  • the plates are placed in a controlled atmosphere incubator (37 ° C., 5% CO 2, saturation hygrometry).
  • Example 3 Validation of the culture medium - Comparison of the ring model and the model according to the invention / Study of the maintenance of the pharmacological activity of a retinoid in repeated treatment over a period of fifteen days.
  • the defatted skin as prepared in Example 1 is placed in a petri dish containing 3 ml of culture medium, the metal rings are placed on it. Samples are taken at the end of the treatment for the analysis of the modulation of the expression of the genes of interest and for the histological validation of the integrity of the skin.
  • Example 2 The defatted skin as prepared in Example 1 is placed in the Transwell® inserts with 0.5 ml of medium (change every day of treatment, except weekends), the treatment is carried out well per well. For reproducibility purposes, triplicates per treatment condition are realized. Each of the 2 models is tested with 2 different backgrounds:
  • retinoid acid 3 "-tert-butyl-4 '- (3-hydroxy-propoxy) -4" -pyrrolidin-1-yl [1,1', 3 ', 1 "] terphenyl-4-carboxylic acid or trifarotene of following formula:
  • the retinoid concentration used is 50 ppm or 100 ppm.
  • a pharmacological response characteristic of a topical treatment with retinoids is obtained: normalization of keratinization via the modulation of KRTs, exfoliating properties via regulation of KLKs and also catabolism of retinoids via induction of CYP26A1.
  • the culture medium of Biopredic® (reference MIL305 on the website of the company biopredic.com) provides a response to stimuli, while preserving the histological state of the skin.
  • the model according to the invention in which skin samples 8 mm in diameter are placed in inserts with the SLTM medium of Biopredic®, makes it possible to obtain a pharmacological signature identical to that obtained with the ring / KBM model on a 48 hours.
  • Figure 2 shows the pharmacological responses
  • This example shows that only the skin model according to the invention makes it possible to maintain the pharmacological activity of the retinoid (trifarotene) for at least 9 days.
  • the sections after analysis, make it possible to validate an integrity of the epidermis of the model according to the invention up to 9 days of survival in culture, in an untreated condition.
  • the skin model according to the invention makes it possible to obtain, over a period of at least 9 days, a pharmacological response of the skin ex vivo while maintaining a histological integrity of the skin under untreated conditions (FIGS. 2 and 3).
  • EXAMPLE 4 Model of Skin Usable in the Ex Vivo Study of the Mechanisms Involved in the Repigmentation of Skins of Patients With Vitiligo
  • the culture is carried out in liquid medium by placing the skin (dermis downwards) on a porous support 0.4 ⁇ .
  • the culture medium used is the Biopredic® "Long Term Medium Skin” which is changed every 2 or 3 days.
  • Ex vivo skin culture kinetics were performed with 6 mm diameter samples. The quality of the skin is determined by Hematoxylin / Eosin labeling on histological sections. The structure of the epidermis is maintained for up to 15 days of culture with the presence of a basal layer of keratinocytes at the dermoepidermal junction, a granular layer and a stratum corneum ( Figure 4, A). • The skins show no sign of apoptosis or hypoxia after 15 days of ex vivo culture (gene expression data).
  • the skin samples 6 mm in diameter were stimulated every 2/3 days with forskolin, a pro-pigmenting agent acting on the synthesis.
  • forskolin a pro-pigmenting agent acting on the synthesis.
  • cyclic AMP a pro-pigmenting agent acting on the synthesis.
  • Forskolin is administered topically or systemically at 20 ⁇ , 200 ⁇ and 1 mM.
  • Forskolin induces the genes of melanogenesis after 1 1 to 15 days of culture.
  • MITF microphthalmia-associated transcription factor
  • tyrosinase DCT (dopachrome tautomerase)
  • DCT dopachrome tautomerase
  • the skins are still functional and capable of responding to a pro-pigmenting agent after 15 days of culture. Since forskolin increases the level of MITF, tyrosinase and DCT mRNA, it has been verified whether the skin model according to the invention makes it possible to see ex vivo the increase in the expression of the proteins involved in the pigmentation.
  • a skin sample of 6 mm in diameter cultivated ex vivo for 15 days under the conditions previously described according to the invention has an intact morphology and responds to pigmentation inducers such as forskolin.
  • the response arrives late since the mRNAs of the pigmentation genes are only induced after 1 1 day for MITF and 15 days for tyrosinase and DCT.
  • the expression of these markers at the protein level follows kinetics similar to that of the mRNA levels.
  • Example 5 Pharmacological activators of the Wnt pathway stimulate this route ex vivo on the skin of vitiligo patients and induce the expression of melanoblastic markers.
  • the biopsies were stimulated ex vivo for 14 days each day with a GSK33 inhibitor: CHIR99021 (3 ⁇ ), LiCI (20 ⁇ ) or a Wnt agonist: SKL2001 (40 ⁇ ).
  • the mRNA was extracted and RT-qPCRs performed to quantify the relative expression of the Wnt / LEF isoforms (FIG. 5A) and MITF pre-melanocyte markers (FIG. 5B), DCT (FIG. 5C), PAX3 (FIG. 5D). ) and Brn2 (Figure 5E).
  • the 3 activating treatments of the Wnt pathway increase the transcriptional expression of the Wnt and LEF isoforms (FIG. 5A).
  • MITF mRNA is only induced by SKL2001 whereas the mRNA of the other pre-melanocyte markers DCT (FIG. 5C), PAX3 (FIG. 5D) and Brn2 (FIG. 5E) are induced by the 3 activators.
  • Example 6 The ex vivo treatment of vitiligo skins with activators of the Wnt pathway induces the differentiation of resident stem cells into pre-melanocles.
  • Depigmented skin from patient vitiligo was stimulated daily ex vivo with an agonist of the Wnt pathway: SKL2001 (40 ⁇ l) (FIG. 6B), an inhibitor of GSK33: CHIR99021 (3 ⁇ l) (FIG. 6C) or LiCl 20 ⁇ l ( Figure 6D).
  • the skin response was analyzed in immunohistochemistry (pre-melanocyte markers analyzes). Co-localization makes it possible to visualize the differentiation of melanoblasts in the dermis (see FIG. 6).
  • the 3 activating treatments of the Wnt pathway (CHIR99021, SKL2001, LiCl) induce the differentiation of melanoblasts into pre-melanocytes, identifiable by the expression of markers DCT and PAX3 (IHC).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention concerne un modèle de peau humaine maintenant ex vivo une intégrité histologique et une fonctionnalité biologique de la peau, comprenant en combinaison un échantillon de peau humaine de dimension comprise entre 5 et 10 mm et constitué d'un épiderme (1) et d'un derme (2) placé sur un support (3) présentant au niveau de sa base poreuse (4) la même dimension que l'échantillon de peau, le derme (2) de l'échantillon de peau et la base du support (4) baignant dans un contenant (6) comprenant un milieu de culture (5) renouvelé tous les un à trois jours. L'invention concerne également l'utilisation du modèle de peau humaine pour évaluer ex vivo des composés ou formulations d'intérêt,un procédé de modélisation et d'analyse d'un traitement sélectionné de la peau humaine et l'utilisation d'un échantillon de peau humaine ex vivo pour analyser un traitement sélectionné de la peau.

Description

MODELE DE PEAU HUMAINE ET SON UTILISATION POUR EVALUER EX VIVO LES
EFFETS DERMATOLOGIQUES, COSMETIQUES ET/OU NUTRACEUTIQUES DE COMPOSÉS Domaine de l'invention
L'invention se situe dans le domaine des tests pratiqués ex vivo pour évaluer des composés d'intérêt en dermatologie, cosmétique et/ou nutraceutique.
La présente invention a pour objet un modèle de peau humaine maintenant ex vivo une intégrité histologique et une fonctionnalité biologique de la peau. Elle concerne également l'utilisation dudit modèle de peau humaine ex vivo pour évaluer les effets dermatologiques, cosmétiques et/ou nutraceutiques de composés. L'invention concerne aussi un procédé de modélisation et d'analyse d'un traitement sélectionné de la peau humaine. Enfin, l'invention concerne l'utilisation d'un échantillon de peau humaine ex vivo pour analyser un traitement sélectionné de la peau.
Arrière-plan de l'invention
Le modèle de peau humaine habituellement utilisé et bien connu pour évaluer des composés ou formulations d'intérêt est un modèle utilisant des anneaux en métal (dit « O- rings »). Il consiste à déposer un échantillon de peau humaine dégraissée, généralement issu de chirurgie esthétique réalisée en milieu hospitalier, dans une boîte de pétri contenant environ 3 ml d'un milieu de culture et à poser des anneaux en métal sur l'échantillon de peau. Des prélèvements sont alors réalisés à la fin du traitement topique ou systémique de la peau pour évaluer l'efficacité du traitement administré. Cependant, ce modèle de peau humain présente l'inconvénient majeur qu'il ne demeure intègre histologiquement ex vivo que trois jours au maximum. De ce fait, certaines fonctions biologiques qui nécessitent plus de trois jours de culture ne peuvent être étudiées et peuvent requérir des cinétiques de cinq, neuf, onze ou quinze jours.
Le document DE10317402 décrit une méthode pour produire un modèle de peau ex vivo humaine ou d'origine animale, notamment de porc. La méthode consiste à prélever un échantillon de peau de porc comprenant l'épiderme/derme et de le mettre en contact avec un androgène. Le document ne donne aucune indication de viabilité de l'échantillon de peau au- delà de sept jours. Le document EP2019316 décrit l'utilisation d'un échantillon de peau humaine ou animale comprenant un épiderme, un derme, une couche sous-cutanée d'épaisseur 0,5-5 mm et des follicules pileux. L'échantillon de peau est placé sur un support stérile tel que du liège ou un morceau de coton et baigne dans un milieu de culture. Le support stérile est disposé à l'intérieur de plaque de type conventionnel de six puits. La présence de la couche sous-cutanée et d'une certaine densité de follicules pileux augmentent, selon ce document, la viabilité de l'échantillon de peau. Le document ne donne cependant aucune preuve de viabilité de l'échantillon de peau humaine ex vivo.
Au vu de l'art antérieur qui ne décrit aucun modèle de peau humaine prouvé efficace ex vivo sur une durée supérieure à trois jours, le problème que se propose de résoudre la présente invention est donc de réaliser un modèle de peau humaine permettant de maintenir ex vivo une intégrité histologique et une fonctionnalité biologique effective jusqu'à onze jours et plus.
Exposé de l'invention
Il se trouve que la demanderesse a mis en évidence de manière surprenante un nouveau modèle de peau dont la combinaison des caractéristiques techniques permet de résoudre le problème posé.
Ainsi, un premier objet selon l'invention consiste en un modèle de peau humaine ex vivo maintenant une intégrité histologique et une fonctionnalité biologique de la peau, caractérisé en ce qu'il comprend en combinaison :
- un échantillon de peau humaine de dimension comprise entre 5 et 10 mm et constitué d'un épiderme (1 ) et d'un derme (2) placé sur
- un support de type insert (3) présentant au niveau de sa base poreuse (4) la même dimension que l'échantillon de peau,
le derme (2) de l'échantillon de peau et la base poreuse (4) du support baignant dans un contenant (6) comprenant un milieu de culture (5) renouvelé tous les un à trois jours.
Dans la présente invention, le terme « ex vivo » signifie « hors du vivant » et s'applique à des tests biologiques effectués sur des échantillons de peau provenant d'un organisme vivant, lesdits tests étant mis en place en dehors de l'organisme.
Dans la présente invention, on désigne par :
- « dimension » ou « dimensions » les étendues mesurables de l'échantillon de peau humaine sur sa longueur et sa largeur. L'échantillon de peau, une fois préparé, peut présenter une forme variée comme un carré, un rectangle ou un cercle (ou rond). Dans le cas d'une forme ronde/circulaire, la dimension sera assimilée au diamètre du cercle. Sinon, il s'agit des longueurs et largeurs de la forme choisie.
- « maintenir une intégrité histologique » le fait que les cellules de l'échantillon de peau demeurent intègres ou normalement constituées au niveau de l'épiderme et du derme, - « maintenir une fonctionnalité biologique » le fait que les mécanismes biologiques de la peau restent fonctionnels, notamment la transcription, la traduction, l'activité enzymatique, etc.
- « un échantillon de peau humaine » une partie de peau obtenue par prélèvement sur la peau humaine ou isolée d'un être humain. Il peut s'agir par exemple d'une biopsie de peau humaine ou d'un prélèvement effectué par acte de chirurgie plastique. Dans la présente invention « la peau » ou « l 'échantillon de peau » comprend un épiderme et un derme dégraissé, lavé et découpé par un emporte-pièce à la dimension désirée.
- « support présentant au niveau de sa base poreuse » un support de type insert ou autre ayant une forme arrondie, circulaire, carrée ou rectangulaire et dont la base est percée de trous.
- « contenant» tout dispositif permettant de contenir le milieu de culture et le support. Il peut s'agir d'un dispositif communément appelé puits.
- « traitement topique » ou application topique, l'application sur la partie de l'épiderme de l'échantillon de peau d'un composé ou d'une formulation d'intérêt.
- « traitement systémique » l'ajout dans le milieu de culture, dans lequel baigne le derme de l'échantillon de peau, d'un composé ou d'une formulation d'intérêt.
- « traitement cosmétique» l'application d'un composé ou d'une formulation d'intérêt sur la partie de l'épiderme de l'échantillon de peau ou bien dans le milieu de culture, ledit composé ou ladite formulation présentant une activité autre que préventive et curative sur la peau, par exemple une activité d'hydratation, d'anti-âge, etc. Il s'agit d'un soin cosmétique à visée non thérapeutique.
- « traitement dermatologique » l'application d'un composé ou d'une formulation d'intérêt sur la partie de l'épiderme de l'échantillon de peau ou bien dans le milieu de culture, ledit composé ou ladite formulation présentant une activité préventive ou curative sur la peau, pour prévenir le développement d'une pathologie et/ou de ses symptômes ou pour diminuer, de préférence éviter, l'apparition de ses symptômes ,
- « traitement sélectionné » un traitement choisi comprenant un composé qui sera appliqué par voie topique et/ou systémique,
- « composé » et « composé ou formulation d'intérêt » tout composé actif seul ou en formulation adaptée à son administration topique ou systémique.
- « nutraceutique » produit fabriqué à partir de substances alimentaires, mais rendu disponible sous forme de comprimé, de poudre, de potion ou d'autre formes médicinales habituellement non associées à des aliments, et qui s'est avéré avoir un effet physiologique bénéfique ou protecteur sur la peau. Le modèle de peau humaine selon l'invention comprend des caractéristiques techniques qui permettent de maintenir une intégrité histologique et une fonctionnalité biologique de l'échantillon de peau jusqu'à onze jours et plus. Les caractéristiques techniques d'intérêt sont plus précisément :
- que l'échantillon de peau humaine présente au moins une dimension comprise entre 5 et 10 mm, par exemple entre 6 et 10 mm ou entre 6 et 8 mm, et comprend un épiderme et un derme. Ledit échantillon a été dégraissé afin d'éliminer la couche sous- cutanée et lavé. De préférence, l'échantillon de peau ne comprend pas de follicules pileux. Il est placé de façon à ce que l'épiderme soit positionné en partie supérieure et le derme en partie inférieure sur un support, de manière à pouvoir appliquer les traitements topiques et/ou systémiques souhaités.
- que le support soit poreux en sa base (partie inférieure) et soit de forme quelconque, la base poreuse du support présentant la/les même(s) dimension(s) que l'échantillon de peau. De cette façon, l'échantillon de peau reste solidaire de la base poreuse du support.
- que le derme de l'échantillon de peau et la base poreuse du support baignent dans un contenant comprenant un milieu de culture approprié pour le maintien en vie des cellules de la peau, principalement des kératinocytes. Le support est maintenu par exemple par des ailettes sur le contenant afin que le milieu de culture affleure l'épiderme sans le recouvrir. Le milieu de culture sera avantageusement renouvelé tous les un à trois jours. Ces trois caractéristiques sont de préférence combinées au sein du modèle de peau selon l'invention.
La figure 1 (A) illustre le modèle anneau dit «O-rings».
La figure 1 (B) décrit un exemple de modèle de peau humaine ex vivo selon l'invention. Dans la figure 1 (B), l'épiderme (1 ) et le derme (2) de l'échantillon de peau humaine sont placés sur la base poreuse (4) d'un support (3), ledit support et l'échantillon de peau humaine baignant dans un milieu de culture (5) disposé dans le contenant (6).
La figure 2 représente les graphes des réponses pharmacologiques de l'exemple 3.4 obtenues dans le modèle selon l'invention (A) versus le modèle anneau dit «O-rings» (B).
La figure 3 montre les coupes histologiques de l'échantillon de peau qui a été utilisé dans l'exemple 3.5. Les coupes démontrent le maintien histologique de la peau jusqu'à 9 jours sans traitement.
La figure 4 (A) présente les coupes histologiques de l'échantillon de peau qui a été traitée avec la forskoline (agent pro-pigmentant). Les coupes démontrent le maintien histologique de la peau jusqu'à 15 jours sans traitement. La figure 4 (B) démontre l'induction par la forskoline au niveau transcriptionnel de marqueurs de la mélanogénèse (qPCR). La figure 4 (C) démontre l'induction par la forskoline au niveau protéique de ces mêmes marqueurs (ICH).
La figure 5 montre l'activation ex vivo de la voie Wnt (A) et une induction de l'expression des marqueurs mélanoblastiques [(B), (C), (D) et (E)] sur un modèle de peau de patient atteint de vitiligo (A) sous l'effet d'activateurs pharmacologiques de la voie Wnt (CHIR99021 , SKL2001 et LiCI).
La figure 6 montre que le traitement ex vivo de peaux dépigmentées provenant de patients atteints de vitiligo à l'aide d'activateurs pharmacologiques de la voie Wnt [contrôle (A), SKL2001 (B), CHIR99021 (C) et LiCI (D)] induit la différentiation de cellules souches résidentes en pré-mélanocytes
Tout support ayant une base poreuse permettant de recevoir l'échantillon de peau et tout contenant permettant d'immerger ex vivo le derme de l'échantillon de peau dans le milieu de culture, quel que soit leur forme et dimensions, seront appropriés pour réaliser le modèle de peau humaine selon l'invention.
Comme exemple d'un support et contenant du modèle de peau humaine ex vivo selon l'invention, on peut citer le dispositif d'insert dit « Transwell® » commercialisé par la société Corning Life Sciences. Ce dispositif permet de mettre en application l'invention en combinant les caractéristiques mentionnées ci-dessus, notamment les particularités de l'échantillon de peau humaine, la porosité de la base du support, la dimension de la base du support en relation avec l'échantillon de peau et enfin le renouvellement du milieu de culture dont le niveau supérieur affleure la couche basale de l'épiderme. Il est bien entendu possible de combiner toute sorte de forme(s) et dimension(s) afin d'obtenir un support et un contenant adéquat à la réalisation de l'invention.
Dans le modèle de peau humaine selon l'invention, l'intégrité histologique et la fonctionnalité biologique de l'échantillon de peau humaine peuvent être maintenues ex vivo jusqu'à onze jours et préférentiellement jusqu'à au moins quinze jours. Les tests inclus dans la présente invention ont été menés ex vivo jusqu'à quinze jours sur le modèle de peau. Les résultats obtenus permettent de confirmer le maintien de l'intégrité histologique et la fonctionnalité biologique de la peau jusqu'à au moins quinze jours.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, l'échantillon de peau est de forme ronde/circulaire et son diamètre est compris entre 6 et 8 mm. Il est de préférence de 6 mm, 7 mm ou 8 mm. Dans la mesure où la dimension du prélèvement ou de la biopsie de la peau d'un patient peut s'avérer limitant lorsqu'il ne s'agit pas de déchet de plastie chirurgicale, il sera encore plus préféré d'utiliser un échantillon présentant un diamètre de 6 mm. Dans un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, la porosité de la base du support est supérieure ou égale à 0,4 μηι. Cette porosité est définie afin que le derme puisse être placé en contact avec le milieu de culture et que les échanges nécessaires au traitement par voie systémique soient suffisants et efficaces.
Le milieu de culture est un milieu de culture complexe tel que les cellules présentes dans la peau, principalement les kératinocytes, puissent se maintenir en vie. L'homme du métier saura adapter le milieu de culture en fonction du traitement à administrer ou des études à réaliser sur l'échantillon de peau humaine.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le milieu de culture est le milieu Skin Long Term Médium (SLTM) ou « Long Term Skin Culture Médium » de la société Biopredic® (référence MIL305 sur le site internet de la société biopredic.com).
Cette culture en interface air/liquide facilite le renouvellement du milieu de culture tous les un à trois jours. Pour ce faire, le milieu est éliminé ou conservé si on veut doser des médiateurs produits par la peau suite aux traitements systémiques. Le milieu est ensuite remplacé par une quantité identique et suffisante de milieu pour affleurer la couche basale de l'épiderme. La quantité ou volume de milieu de culture dépendra de la taille du contenant utilisé et du type de support suspendu dans le contenant afin que le milieu de culture affleure cette couche basale.
Une pipette sera de préférence utilisée pour une application topique d'un composé, formulé ou non, la dose nécessaire sera déposée à la surface de l'épiderme et étalée à l'aide soit de la pipette, soit d'un instrument jugé pertinent comme notamment un disque en matière inerte (référence 03/150-38, fournisseur SEFAR NITEX) permettant d'étaler plus facilement la formulation. Après application, les échantillons seront avantageusement disposés dans un incubateur à atmosphère régulée (37°C, 5% CO2 et hygrométrie saturante).
Pour un traitement systémique, le composé sera de préférence introduit directement dans le milieu : soit directement dans le contenant une fois le milieu de culture changé soit dans le milieu de culture puis distribué dans le contenant, suivant le besoin.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le changement de milieu de culture est effectué tous les deux à trois jours, de préférence tous les deux jours.
L'échantillon de peau humaine peut provenir de toutes parties du corps humain, par exemple de l'abdomen, de la cuisse, des bras ou des seins. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention l'échantillon de peau humaine est un échantillon provenant de l'abdomen.
L'échantillon de peau comprend, dans le modèle de peau humaine selon l'invention, un épiderme et un derme. La peau provient par exemple d'intervention chirurgicale, le plus souvent à visée esthétique. Elle est prélevée par le chirurgien et acheminée sous quelques heures pour la préparation du modèle de peau (destiné à être utilisé ex vivo). Une fois réceptionnée, la peau est dégraissée et nettoyée afin d'éliminer le sang et la graisse résiduels. La peau ainsi préparée est découpée à l'aide d'un emporte-pièce ayant la forme souhaitée, de préférence circulaire/ronde. Les découpes ainsi obtenues sont placées dans les inserts stériles, en présence de milieu lui aussi stérile.
Un second objet selon l'invention est l'utilisation du modèle de peau humaine ex vivo tel que décrit précédemment pour évaluer les effets dermatologiques, cosmétiques et/ou nutraceutiques de composés ou formulations d'intérêt.
Comme composés ou formulations d'intérêt utiles en cosmétique on peut citer par exemple les composés ou formulations destinés à évaluer :
- les effets anti-âges,
- le potentiel allergène et/ou l'irritation,
- la protection contre les UV,
- les effets induits par la lumière visible ou la lumière infrarouge,
- les effets causés par une contrainte mécanique, par exemple une abrasion ou une pression,
- la modulation des propriétés des tissus conjonctifs, en particulier pour évaluer les propriétés anti-rides de composés,
- l'efficacité filmogène sur la peau,
- la modulation de l'épaisseur épiderme-derme,
- l'hydratation,
- les propriétés de pénétration, et/ou
- les propriétés de libération des compositions.
Comme composés ou formulations d'intérêt utiles en nutraceutique on peut citer par exemple les composés ou formulations destinés à évaluer :
- les effets anti-âges,
- le potentiel allergène et/ou l'irritation,
- la modulation des propriétés des tissus conjonctifs, en particulier pour évaluer les propriétés anti-rides de composés, et/ou
- l'hydratation. Comme composés ou formulation d'intérêt utile en dermatologie on peut citer par exemple les composés ou formulations destinés à évaluer :
- la modulation de la pigmentation de la peau, notamment pour le traitement du vitiligo,
- la modulation de la viabilité et/ou de la prolifération de la peau,
- la réparation d'un stress provoqué par les UV,
- les effets anti-oxydants,
- la cicatrisation,
- la modulation de la fonction barrière cutanée,
- l'immunostimulation,
- l'efficacité anti-microbienne, en particulier l'efficacité anti-acné
- l'efficacité anti-psoriatique,
- la phototoxicité, et/ou
- le métabolisme cutané.
Un troisième objet selon l'invention est un procédé de modélisation et d'analyse d'un traitement sélectionné de la peau humaine, comprenant les étapes ci-dessous :
a) exposition de l'échantillon de peau d'un modèle de peau humaine selon l'invention au traitement sélectionné,
b) renouvellement du milieu de culture tous les un à trois jours, et
c) observation de l'effet exercé par le traitement sur l'échantillon de peau.
Le traitement sélectionné est, comme indiqué précédemment, à visée dermatologique, cosmétique et/ou nutraceutique. Les composés ou formulations d'intérêt choisis seront typiquement appliqués de manière topique sur la surface de l'épiderme pour les traitements à visée dermatologique et cosmétique. Ils seront de préférence appliqués de manière systémique par dilution dans le milieu de culture compris dans le contenant pour les traitements à visée dermatologique et/ou nutraceutique.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, l'échantillon est traité tous les deux jours. Lorsque le traitement est topique, il est préférable de nettoyer la peau avant toute autre application de composés ou formulations d'intérêt. Lorsque le traitement est systémique, le milieu de culture est de préférence changé tous les un à trois jours, avantageusement tous les deux jours. Il peut être nécessaire de garder le milieu de culture à renouveler pour étudier les effets des traitements systémiques sur l'échantillon de peau humaine. Lorsque dans l'étape a) le traitement sélectionné est topique, la peau est nettoyée avant toute nouvelle exposition de l'échantillon de peau au traitement sélectionné.
Enfin, un quatrième objet selon l'invention concerne l'utilisation d'un échantillon de peau humaine pour analyser ex vivo un traitement sélectionné de la peau caractérisé en ce que l'échantillon de peau humaine i) présente une dimension comprise entre 5 et 10 mm, ii) est constitué d'un épiderme (1 ) et d'un derme (2), et iii) est placé sur un support de type insert (3) présentant au niveau de sa base poreuse (4) la même dimension que ledit échantillon de peau, le derme (2) de l'échantillon de peau et la base du support (4) baignant dans un contenant (6) comprenant un milieu de culture (5) renouvelé tous les un à trois jours.
L'utilisation ex vivo du modèle de peau selon l'invention réalisé à partir de peaux excisées de patients atteints de Vitiligo a permis de montrer que des traitements avec des inhibiteurs de GSK3P induisent une augmentation significative de marqueurs de mélanocytes. L'utilisation du modèle de peau ex vivo selon l'invention a ainsi permis de montrer que ces traitements induisent la différenciation des cellules souches des mélanocytes résidant dans les pré-mélanocytes qui expriment PAX3 et DCT. De plus, la présence de ces pré-mélanocytes ayant été observée dans le follicule pileux et dans le derme, l'utilité de ce nouveau modèle de peaux ex vivo apparaît clairement en ce qui concerne l'étude des mécanismes impliqués dans la différenciation des mélanocytes dans le cas du Vitiligo, mais d'une façon générale, pour l'étude de la différenciation de cellules souches dans le cas de n'importe quelle autre pathologie dermatologique. L'utilisation du modèle de peau ex vivo selon l'invention apparaît donc utile pour tester tout nouveau traitement dermatologique. Divers exemples de réalisation selon l'invention sont fournis ci-dessous à titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif.
Exemples Exemple 1 : Préparation de l'échantillon de peau humaine
La peau d'origine humaine provient d'intervention chirurgicale, le plus souvent à visée esthétique. Elle est prélevée par le chirurgien et acheminée sous 2-4 h à sec au laboratoire. Une fois réceptionnée, la peau est dégraissée, avec un scalpel ou des ciseaux, puis nettoyée dans des bains de milieu stérile isotonique afin d'éliminer le sang et la graisse résiduels. La peau ainsi préparée est découpée à l'aide d'un emporte-pièce type biopunchs® stériles de dimension désirée, de préférence de diamètre 8 mm. Toutes les opérations sont réalisées en conditions stériles, à toutes les étapes dès la réception de la peau. Exemple 2 : Préparation du modèle de peau humaine ex vivo
Les échantillons de peau préparés dans l'exemple 1 sont placés à l'aide de pinces dans des inserts stériles, un par insert. Chaque insert est alors placé dans un puits de la taille adéquate. Pour un insert dont la base présente un diamètre de 8 mm et des pores de 0,4 μηη, on utilise une plaque 24 puits. Le milieu est ajouté dans le puits qui affleure la couche basale de l'épiderme.
Une fois les échantillons placés dans les inserts avec le milieu de culture, les plaques sont placées dans un incubateur à atmosphère régulée (37°C, 5% CO2, hygrométrie saturante).
Exemple 3 : Validation du Milieu de culture - Comparaison du modèle anneaux et du modèle selon l'invention/ Etude du maintien de l'activité pharmacologique d'un rétinoïde en traitement répété sur une période de quinze jours.
3.1 Les modèles Modèle anneaux de métal :
La peau dégraissée telle que préparée dans l'exemple 1 est posée dans une boite de pétri contenant 3 ml de milieu de culture, les anneaux de métal sont posés dessus. Des prélèvements sont réalisés à la fin du traitement pour l'analyse de la modulation de l'expression des gènes d'intérêt et pour la validation histologique de l'intégrité de la peau.
Modèle de l'exemple 2 selon l'invention :
La peau dégraissée telle que préparée dans l'exemple 1 est placée dans les inserts Transwell® avec 0,5 ml de milieu (changement tous les jours de traitement, sauf le week-end), le traitement s'effectue puits par puits. A des fins de reproductibilité, des triplicatas par condition de traitement sont réalisés. Chacun des 2 modèles est testé avec 2 milieux différents :
Milieu commercial Biopredic® Skin Long Term (SLTM)
- Milieu KBM (Keratinocyte Basai Médium) + 1 ,4 mM CaC + antibiotiques (0.25 μg ml amphotericine B, 10 μg ml gentamycine)
3.2 Sélection des gènes d'intérêt :
Des gènes d'intérêts de 2 voies de signalisation impliquées dans la réponse à un rétinoïde décrit ci-après (différenciation et métabolisme/transport) sont sélectionnés. Résultats exprimés en facteurs de modulations (moyennes absolues).
Figure imgf000012_0002
3.3 Comparaison entre les modèles et les milieux à 48 h : modulation de gènes d'intérêt décrit ci-dessus en qRT-PCR.
Le rétinoïde acide 3"-tert-Butyl-4'-(3-hydroxy-propoxy)-4"-pyrrolidin-1 -yl-[1 ,1 ';3',1 "]terphenyl-4- carboxylique ou Trifarotène de formule suivante :
Figure imgf000012_0001
est utilisé dans les tests qui suivent. Il est nommé Trifarotène dans la suite des exemples. Le terme EtOH signifie éthanol.
La concentration de rétinoïde utilisée est de 50 ppm ou de 100 ppm.
Quelle que soit le milieu et la méthode utilisée, une réponse pharmacologique caractéristique d'un traitement topique aux rétinoïdes est obtenue : normalisation de la kératinisation via la modulation des KRTs, propriétés exfoliantes via la régulation des KLKs et également catabolisme des rétinoïdes via l'induction de la CYP26A1 . Le milieu de culture de Biopredic® (référence MIL305 sur le site internet de la société biopredic.com) permet d'obtenir une réponse aux stimuli, tout en préservant l'état histologique de la peau. Le modèle selon l'invention, dans lequel des échantillons de peau de 8 mm de diamètre sont placés dans des inserts avec le milieu SLTM de Biopredic®, permet d'obtenir une signature pharmacologique identique à celle obtenue avec le modèle anneaux /KBM sur un temps de 48 heures.
3.4 : Réponse pharmacologique sur un temps supérieur à 7 jours - Comparaison du modèle anneaux et du modèle selon l'invention
La figure 2 présente les réponses pharmacologiques :
Graphe figure 2 (A) : modèle des anneaux de métal - milieu Skin Long Term de Biopredic®. Graphe figure 2 (B) : modèle selon l'invention - milieu Skin Long Term de Biopredic®
A 7 jours et avec le modèle des anneaux, on n'obtient plus de modulation génique, due principalement à une nécrose des tissus décelable en histologie. Le temps 9 jours ne peut donc pas être réalisé avec ce modèle. Le modèle des anneaux en métal (méthode utilisée sur 48 h) ne permet pas de maintenir la réponse pharmacologique aux rétinoïdes sur 7 jours (voir graphe figure 2 (A)). Par contre, le modèle de peau selon l'invention permet de maintenir la réponse pharmacologique aux rétinoïdes sur 9 jours (voir graphe figure 2 (B)).
Cet exemple montre que seul le modèle de peau selon invention permet de conserver l'activité pharmacologique du rétinoïde (trifarotène) jusqu'à au moins 9 jours.
Seul le modèle de peau selon l'invention permet le maintien de la peau en culture sur 9 jours dans des conditions histologiques et de réponse au stimulus du Trifarotène.
Seul le modèle selon l'invention permet un traitement répété (chronique) de la peau tout en conservant une réponse pharmacologique typique des rétinoïdes.
3.5: Intégrité histologique de la peau - Comparaison du modèle anneaux et du modèle selon l'invention La qualité de l'échantillon de peau a été contrôlée en coupes histologiques, coloration Hématoxyline/Eosine.
Les coupes, après analyse, permettent de valider une intégrité de l'épiderme du modèle selon l'invention jusqu'à 9 jours de survie en culture, en condition non traitée.
Les coupes sont montrées sur la figure 3.
De plus, la réponse pharmacologique au traitement répété du rétinoïde est maintenue durant tout le temps de maintien en survie. Le modèle de peau selon l'invention permet d'obtenir sur une période d'au moins 9 jours une réponse pharmacologique de la peau ex vivo tout en maintenant une intégrité histologique de la peau en conditions non traitées (figures 2 et 3). Exemple 4 : Modèle de peau utilisable dans l'étude ex vivo des mécanismes impliqués dans la repigmentation de peaux de patients atteints de vitiligo
Des déchets opératoires provenant d'abdominoplastie ont été utilisés. La culture s'effectue en milieu liquide en posant la peau (derme vers le bas) sur un support poreux 0,4 μηι. Le milieu de culture utilisé est le "Skin Long Term Médium" de Biopredic® qui est changé tous les 2 ou 3 jours.
4.1 . Détermination de la dimension des échantillons de peau à utiliser
Une expérience a été réalisée en comparatif avec des échantillons de peau de diamètre 4 mm et 8 mm, 4 mm étant la dimension habituellement utilisée lors d'études cliniques. Une cinétique de culture ex vivo de 2 à 15 jours a été réalisée. Après analyse histologique par un marquage Hématoxiline/Eosine, il apparaît que la peau reste morphologiquement intacte jusqu'à 15 jours sur les échantillons de 8 mm, alors qu'elle commence à être dégradée dès le 9ème jour sur les échantillons de 4 mm.
La culture de peau ex vivo est possible jusqu'à 15 jours. Dans le cadre d'étude clinique, des biopsies de 6 mm sur patients sont acceptables. 4.2. Viabilité et fonctionnalité de la peau en culture ex vivo sur des échantillons de 6 mm.
4.2.1 . Viabilité : · L'architecture cellulaire de la peau est maintenue après 15 jours de culture
Une cinétique de culture de peau ex vivo a été réalisée avec des échantillons de diamètre 6 mm. La qualité de la peau est déterminée par marquage Hématoxyline/Eosine sur des coupes histologiques. La structure de l'épiderme est maintenue jusqu'à 15 jours de culture avec la présence d'une couche basale de kératinocytes à la jonction dermo-épidermique, d'une couche granuleuse et d'une couche cornée (figure 4, A). • Les peaux ne montrent pas de signe d'apoptose ou d'hypoxie après 15 jours de culture ex vivo (données d'expression génique).
La peau étant toujours morphologiquement intacte après 15 jours de culture ex vivo, il a été vérifié si elle ne montrait pas de signes de souffrance dus notamment à des processus apoptotiques et hypoxiques. L'expression de gènes marqueurs d'apoptose (Bad, Bcl2) et d'hypoxie HIF1 a a été analysée par qRT-PCR. L'expression de gènes tels que Bad et Bcl2 reste stable au cours du temps suggérant que les cellules de la peau ne subissent pas d'apoptose. N'ayant plus d'apport en oxygène par la vascularisation, l'expression de HIF1 a dans la peau en culture a été analysée. Son expression n'est pas induite au cours du temps ce qui démontre que la peau reste suffisamment oxygénée. Après 15 jours de culture ex vivo la peau apparaît donc toujours viable.
En conclusion, la qualité de l'échantillon de peau de diamètre 6 mm en culture ex vivo est satisfaisante dans les conditions indiquées jusqu'à au moins 15 jours de culture.
4.2.2 Fonctionnalité de la peau en culture ex vivo : réponse à des agents propigmentants
Afin de tester la fonctionnalité de la mélanogenèse dans le modèle de peau ex vivo selon l'invention, les échantillons de peau de 6 mm de diamètre ont été stimulés tous les 2/3 jours avec la forskoline, agent pro-pigmentant agissant sur la synthèse de l'AMP cyclique. La forskoline est administrée par voie topique ou systémique à : 20 μΜ, 200 μΜ et 1 mM.
La forskoline induit les gènes de la mélanogénèse après 1 1 à 15 jours de culture.
La réponse à la forskoline est analysée par l'induction de certains gènes caractéristiques de la mélanogénèse: MITF (microphthalmia-associated transcription factor), tyrosinase et DCT (dopachrome tautomerase) (figure 4 B). Après 5 jours de stimulation, il n'y a pas d'effet de la forskoline sur l'expression génique de MITF, tyrosinase ou DCT. Sur les peaux traitées par la forskoline, de façon systémique, après 1 1 jours de stimulation, une nette augmentation des niveaux d'expression d'ARNm de MITF est observée d'environ 3 fois le témoin (quelle que soit la concentration de forskoline testée) ainsi qu'une légère augmentation de l'expression de tyrosinase et DCT. Après 15 jours de stimulation, les niveaux d'expression des ARNm de MITF, tyrosinase et DCT sont fortement augmentés versus 5 jours.
Le même schéma de réponse est obtenu avec une stimulation par voie topique mais dans des proportions plus faibles
En conclusion, les peaux sont encore fonctionnelles et capables de répondre à un agent pro-pigmentant après 15 jours de culture. Puisque la forskoline augmente le niveau de l'ARNm de MITF, tyrosinase et DCT, il a été vérifié si le modèle de peau selon l'invention permettait de voir ex vivo l'augmentation de l'expression des protéines impliquées dans la pigmentation.
Par immunohistochimie (IHC) les expressions de MITF après 1 1 jours de stimulation et de tyrosinase/DCT après 15 jours de stimulation par la forskoline à 200 μΜ ont été analysées (figure 4 C). La forskoline induit l'augmentation de la protéine MITF après 1 1 jours et de la tyrosinase et DCT après 15 jours de culture ex vivo (IHC). Comme pour les niveaux d'ARNm, la forskoline induit l'augmentation de l'expression des protéines impliquées dans la mélanogénèse : MITF, tyrosinase et DCT dans le modèle de peau ex vivo selon l'invention après au moins 15 jours de culture.
4.3. Conclusion
Un échantillon de peau de 6 mm de diamètre cultivé ex vivo pendant 15 jours dans les conditions précédemment décrites selon l'invention présente une morphologie intacte et répond à des inducteurs de pigmentation comme la forskoline. La réponse arrive tardivement puisque les ARNm des gènes de la pigmentation ne sont induits qu'après 1 1 jours pour MITF et 15 jours pour tyrosinase et DCT. L'expression de ces marqueurs au niveau protéique suit une cinétique similaire à celle des taux d'ARNm.
Exemple 5 : des activateurs pharmacologiques de la voie Wnt stimulent cette voie ex vivo sur de la peau de patients vitiligo et induisent l'expression de marqueurs mélanoblastiques.
Des patients vitiligo (n=9) ont été biopsiés au niveau de zones lésionnelles. Les biopsies ont été stimulées ex vivo durant 14 jours chaque jour avec un inhibiteur de GSK33 : CHIR99021 (3 μΜ), du LiCI (20 μΜ) ou un agoniste Wnt : SKL2001 (40 μΜ). L'ARNm a été extrait et des RT- qPCR réalisées pour quantifier l'expression relative des isoformes de Wnt/LEF (figure 5A) et des marqueurs pré-mélanocytaires MITF (figure 5B), DCT (figure 5C), PAX3 (figure 5D) et Brn2 (figure 5E).
Les 3 traitements activateurs de la voie Wnt (CHIR99021 , SKL2001 , LiCI) augmentent l'expression transcriptionnelle des isoformes de Wnt et de LEF (figure 5A). L'ARNm de MITF est seulement induit par SKL2001 tandis que l'ARNm des autres marqueurs pré-mélanocytaires DCT (figure 5C), PAX3 (figure 5D) et Brn2 (figure 5E) sont induits par les 3 activateurs. Exemple 6 : le traitement ex vivo de peaux vitiligo par des activateurs de la voie Wnt induit la différenciation de cellules souches résidentes en pré-mélanocvtes.
La peau dépigmentée issue de patient vitiligo a été stimulée chaque jour ex vivo avec un agoniste de la voie Wnt : SKL2001 (40 μΜ) (figure 6B), un inhibiteur de GSK33 : CHIR99021 (3 μΜ) (figure 6C) ou LiCI 20 μΜ (figure 6D). Après 14 jours, la réponse de la peau a été analysée en immunohistochimie (analyses des marqueurs pré-mélanocytaires). La co-localisation permet de visualiser la différenciation de mélanoblastes dans le derme (voir figure 6). Les 3 traitements activateurs de la voie Wnt (CHIR99021 , SKL2001 , LiCI) induisent la différenciation des mélanoblastes en pré-mélanocytes, identifiables par l'expression des marqueurs DCT et PAX3 (IHC).

Claims

REVENDICATIONS
1 . Modèle de peau humaine maintenant ex vivo une intégrité histologique et une fonctionnalité biologique de la peau humaine jusqu'à 1 1 jours et plus, caractérisé en ce qu'il comprend en combinaison :
- un échantillon de peau humaine de dimension(s) comprise(s) entre 5 et 10 mm et constitué d'un épiderme et d'un derme placé sur
- un support de type insert présentant au niveau de sa base poreuse la/les même(s) dimension(s) que l'échantillon de peau, la porosité de la base du support étant supérieure ou égale à 0,4 μηι,
le derme de l'échantillon de peau et la base du support baignant dans un contenant comprenant le milieu de culture Skin Long Term Médium (SLTM) de la société Biopredic®, ledit milieu de culture étant renouvelé tous les un à trois jours.
2. Modèle de peau selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'échantillon de peau humaine est un échantillon abdominal.
3. Modèle de peau selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la dimension de l'échantillon de peau est un diamètre compris entre 6 et 8 mm.
4. Utilisation du modèle de peau humaine ex vivo selon la revendication 1 pour évaluer les effets dermatologiques, cosmétiques et/ou nutraceutiques de composés ou formulations d'intérêt.
5. Utilisation selon la revendication 4 pour mettre en évidence la différenciation de cellules souches dans le cas de n'importe quelle pathologie dermatologique.
6. Procédé de modélisation et d'analyse d'un traitement sélectionné de la peau humaine, comprenant les étapes ci-dessous :
a) exposition de l'échantillon de peau d'un modèle de peau humaine selon la revendication 1 au traitement sélectionné,
b) renouvellement du milieu de culture Skin Long Term Médium (SLTM) de la société Biopredic® tous les un à trois jours jusqu'à onze jours et plus, et
c) observation de l'effet exercé par le traitement sur l'échantillon de peau.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le renouvellement du milieu de culture est effectué tous les deux à trois jours, de préférence tous les deux jours.
8. Utilisation d'un échantillon de peau humaine ex vivo pour analyser un traitement sélectionné de la peau, caractérisé en ce que l'échantillon de peau humaine i) présente une/des dimension(s) comprise(s) entre 5 et 10 mm, ii) est constitué d'un épiderme et d'un derme, et iii) est placé sur un support de type insert présentant au niveau de sa base poreuse la même dimension que ledit échantillon de peau, la porosité de la base du support étant supérieure ou égale à 0,4 μηι, le derme de l'échantillon de peau et la base du support baignant dans un contenant comprenant le milieu de culture Skin Long Term Médium (SLTM) de la société Biopredic®, ledit milieu de culture étant renouvelé tous les un à trois jours jusqu'à onze jours et plus.
PCT/FR2015/053611 2014-12-18 2015-12-18 Modele de peau humaine et son utilisation pour evaluer ex vivo les effets dermatologiques, cosmetiques et/ou nutraceutiques de composés Ceased WO2016097643A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1462836A FR3030572A1 (fr) 2014-12-18 2014-12-18 Modele de peau humaine et son utilisation pour evaluer ex vivo les effets dermatologiques, cosmetiques et/ou nutraceutiques de composes
FR1462836 2014-12-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016097643A1 true WO2016097643A1 (fr) 2016-06-23

Family

ID=53059198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2015/053611 Ceased WO2016097643A1 (fr) 2014-12-18 2015-12-18 Modele de peau humaine et son utilisation pour evaluer ex vivo les effets dermatologiques, cosmetiques et/ou nutraceutiques de composés

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR3030572A1 (fr)
WO (1) WO2016097643A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112034153A (zh) * 2020-09-01 2020-12-04 苏州大学附属第一医院 一种受试物致敏性的检测评价方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10317402A1 (de) 2003-04-15 2004-11-11 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Ex-vivo-Hautorganmodell, insbesondere für männliche Haut
EP2019316A2 (fr) 2008-05-28 2009-01-28 Symrise GmbH & Co. KG Modèle de peau humaine ex vivo

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10317402A1 (de) 2003-04-15 2004-11-11 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Ex-vivo-Hautorganmodell, insbesondere für männliche Haut
EP2019316A2 (fr) 2008-05-28 2009-01-28 Symrise GmbH & Co. KG Modèle de peau humaine ex vivo

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANAXIMANDRE: "Biopredic - Skin Long Term Culture (Product MIL305)", 4 March 2016 (2016-03-04), XP055255180, Retrieved from the Internet <URL:http://www.biopredic.com/index.php?rub=skin> [retrieved on 20160304] *
ANTONIO PERAMO ET AL: "Visible effects of rapamycin (sirolimus) on human skin explants in vitro", ARCHIVES OF DERMATOLOGICAL RESEARCH, vol. 305, no. 2, 1 March 2013 (2013-03-01), pages 163 - 171, XP055216189, ISSN: 0340-3696, DOI: 10.1007/s00403-012-1288-3 *
BEREN ATAÇ ET AL: "Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion", LAB ON A CHIP, vol. 13, no. 18, 1 January 2013 (2013-01-01), pages 3555, XP055216337, ISSN: 1473-0197, DOI: 10.1039/c3lc50227a *
LEBONVALLET N ET AL: "The evolution and use of skin explants: Potential and limitations for dermatological research", EUROPEAN JOURNAL OF DERMATOLOGY, JOHN LIBBEY EUROTEXT, FR, vol. 20, no. 6, 1 November 2010 (2010-11-01), pages 671 - 684, XP002626329, ISSN: 1167-1122, DOI: 10.1684/EJD.2010.1054 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112034153A (zh) * 2020-09-01 2020-12-04 苏州大学附属第一医院 一种受试物致敏性的检测评价方法

Also Published As

Publication number Publication date
FR3030572A1 (fr) 2016-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2596599C (fr) Equivalent d&#39;epiderme capable de se pigmenter obtenu a partir de cellules de la matrice, procede de preparation et utilisation
CA2872313C (fr) Systeme permettant la maintenance en survie et le transport de biopsies de peau et ses applications
JP5872158B2 (ja) 皮膚美白方法、並びに、皮膚シミ形成抑制及び／又は除去因子のスクリーニング方法
EP2953611B1 (fr) Utilisation d&#39;une composition comprenant un perséose d&#39;avocat dans la protection des cellules souches épidermiques
CN114401718A (zh) 用于伤口愈合的yap抑制
EP2699221A1 (fr) Signature moléculaire des taches pigmentaires cutanées, associée à la matrice extracellulaire
Chen et al. Gas-propelled anti-hair follicle aging microneedle patch for the treatment of androgenetic alopecia
Wang et al. Combination and efficiency: preparation of dissolving microneedles array loaded with two active ingredients and its anti-pigmentation effects on guinea pigs
EP3642326B1 (fr) Modeles de peau sensible reconstituee
EP3962447B1 (fr) Procédé de soin cosmétique à base d&#39;extraits photoactifs de microalgues
FR3019186B1 (fr) Procedes d&#39;evaluation des effets deleteres de l&#39;urine sur la peau d&#39;enfant
WO2016097643A1 (fr) Modele de peau humaine et son utilisation pour evaluer ex vivo les effets dermatologiques, cosmetiques et/ou nutraceutiques de composés
FR2736721A1 (fr) Procede pour tester une substance eventuellement active dans le domaine capillaire
CA2925295A1 (fr) Procedes d&#39;evaluation des effets deleteres des uv sur la peau d&#39;enfant
EP3092303B1 (fr) Modele de peau de mammelon reconstitue
JP2011115152A (ja) スクリーニング法
BR112013030828B1 (pt) Processo para preparar um equivalente de couro cabeludo
WO2012059703A1 (fr) Procede in vitro ou ex vivo pour la conservation et/ou la maintenance en survie d&#39;un epiderme
WO2013001232A1 (fr) Procédé in vitro utilisant de la peau humaine pour évaluer l&#39;influence des transporteurs ABC
Williams The progression of interface dermatitis by longitudinal examination of the histopathological features of at three-time intervals histopathology techniques in Fitzpatrick skin types III? VI
FR3061206A1 (fr) Modele de peau incluant epiderme, derme et hypoderme, son procede de preparation et son utilisation
JP2017111065A (ja) 角質細胞の観察方法
FR3153663A1 (fr) Méthode de diagnostic d’une peau exposée à l’ozone
HK40071204A (en) Yap inhibition for wound healing
FR3143355A1 (fr) Compositions et procédés de prévention et/ou de traitement des cicatrices

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15823663

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15823663

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1