FR3146807A1

FR3146807A1 - Extrait hydrosoluble issu d’une plante d’une espèce du genre prunus pour prévenir les effets délétères de l’exposome

Info

Publication number: FR3146807A1
Application number: FR2302565A
Authority: FR
Inventors: Fidji Briand; Jean-Baptiste GUYON
Original assignee: Odycea SAS
Current assignee: Odycea SAS
Priority date: 2023-03-20
Filing date: 2023-03-20
Publication date: 2024-09-27

Abstract

EXTRAIT HYDROSOLUBLE ISSU D’UNE PLANTE D’UNE ESPECE DU GENRE PRUNUS POUR PREVENIR LES EFFETS DELETERES DE L’EXPOSOME La présente invention concerne l’utilisation d’un extrait de fleur d’une plante de la famille des rosacées et du genre Prunus, ou d’une composition en comprenant, pour préserver la peau des effets délétères de l’exposome, dont la perturbation de la fonction barrière, l’inflammation neurogène, l’irritation ou encore le stress oxydatif. L’invention est destinée ainsi à prévenir les signes cliniques du vieillissement prématuré dont l’apparition de tâches d’hyperpigmentation responsables de la perte de l’homogénéité du teint et l’hyper-réactivité cutanée.

Description

EXTRAIT HYDROSOLUBLE ISSU D’UNE PLANTE D’UNE ESPÈCE DU GENRE PRUNUS POUR PRÉVENIR LES EFFETS DÉLÉTÈRES DE L’EXPOSOME

La présente invention concerne l’utilisation d’un extrait de fleur d’une plante de la famille des rosacées et du genre Prunus, ou d’une composition en comprenant, pour préserver la peau des effets délétères de l’exposome, dont la perturbation de la fonction barrière, l’inflammation neurogène, l’irritation ou encore le stress oxydatif. L’invention est destinée ainsi à prévenir les signes cliniques du vieillissement prématuré dont l’apparition de tâches d’hyperpigmentation responsables de la perte de l’homogénéité du teint et l’hyper-réactivité cutanée.

La fonction principale de l’épiderme, la couche la plus superficielle de la peau, est de produire une couche cornée, formée à partir de l’accumulation de cornéocytes.

Ces cellules mortes anucléées sont issues du processus de différenciation terminale des kératinocytes. Ces cornéocytes adhèrent fortement les uns aux autres dans lestratum compactum, couche profonde de la couche cornée.

A la surface de la couche cornée, les cornéocytes les plus superficiels dustratum disjunctumsont éliminés par le processus de desquamation.

La couche cornée assure en grande partie la fonction barrière de la peau, dont la fonction est de limiter la déshydratation de l’organisme et la pénétration d’agents exogènes (agents chimiques, irritants, polluants, bactéries, virus, allergènes…).

Lors de leur différenciation et de leur migration vers les couches superficielles (épineuse et granuleuse), les kératinocytes vivants expriment de nombreux marqueurs impliqués dans la formation de l’enveloppe cornée (Involucrine, SPRRs, Scieline…), dans la production du ciment lipidique intercornéocytaire (glycerol-3-phosphate acyltransferase 3…), dans l’adhésion des cornéocytes (cornéodesmosine), dans la desquamation (kallikréines 5 et 7), dans la production du facteur naturel d’hydratation (Caspase 14), dans la régulation du microbiote (peptides anti-microbiens).

Dans l’épiderme, il existe un gradient croissant de calcium, depuis la couche basale vers la couche granuleuse. Celui-ci intervient dans la régulation de la différenciation terminale. Il est impliqué dans l’activation de l’expression des gènes de la différenciation des kératinocytes et dans la stimulation des enzymes responsables des liaisons covalentes des différents constituants de l’enveloppe cornée, tels que la transglutaminase 1.

Dans les couches vivantes, des structures telles que les desmosomes et les jonctions serrées assurent la forte cohésion entre les kératinocytes et sont indispensables au maintien de l’intégrité de l’épiderme et de son homéostasie.

Cette homéostasie est indispensable pour préserver une barrière cutanée optimale et pour prévenir certains désordres cutanés.

Au niveau de la couche basale de l’épiderme, les mélanocytes assurent la production de la mélanine, pigment en grande partie responsable de la couleur de peau, et essentiel à la photoprotection.

Des stress environnementaux dont les UVs et d’autres facteurs (polluants, agents chimiques, irritants, allergènes…), regroupés sous le terme d’exposome, peuvent altérer le programme de différenciation terminale des kératinocytes et suractiver la production de mélanine par les mélanocytes.

L’exposome peut par conséquent fragiliser l’épiderme et sa fonction barrière, et favoriser la surproduction de mélanine et donc l’apparition de tâches d’hyperpigmentation.

L’exposome

L'exposome a été introduit pour la première fois par le Dr Christopher Wild en 2005 (Complementing the genome with an "exposome": the outstanding challenge of environmental exposure measurement in molecular epidemiology. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005 Aug;14(8):1847-50.). Il correspond à toutes les expositions auxquelles une personne est soumise tout au long de sa vie, depuis sa conception, jusqu’à sa mort.

L’exposome inclut des facteurs externes tels que les polluants atmosphériques, les irritants, le rayonnement solaire, le climat, mais également des facteurs internes tels que l'alimentation, le mode de vie, la qualité du sommeil, la sédentarité ou encore les niveaux de stress.

L’exposome a été redéfinit en 2014 par Miller et Jones (The nature of nurture: refining the definition of the exposome. Toxicol Sci. 2014 Jan;137(1):1-2. doi: 10.1093/toxsci/kft251. Epub 2013 Nov 9.).

Les deux chercheurs précisent qu’il correspond aux mesures cumulatives des influences environnementales et des réponses biologiques correspondantes ressenties au cours d'une vie, incluant l'exposition aux facteurs environnementaux, la nutrition, le comportement et les processus endogènes.

L’exposome cutané

A l’instar des autres organes, la peau, en tant qu’interface entre notre organisme et notre environnement, est aussi sensible aux facteurs de l’exposome. Les facteurs auxquels elle est soumise ont été regroupés sous le terme d’exposome cutané.

L’exposome cutané spécifie l'ensemble des expositions bénéfiques ou délétères auxquelles notre peau est confrontée tout au long de notre vie.

La génétique et l’âge ne sont que minoritairement impliqués dans les désordres cutanés, alors que l’exposome est responsable de 80% de l’apparition des signes du vieillissement de la peau.

Effets de l’exposome sur la peau

Les facteurs environnementaux dont les rayonnements UV, les polluants atmosphériques ou même certains irritants (tensio-actifs comme le laurylsulfate de sodium, LSS) parfois présents dans les produits de soins, perturbent l’homéostasie de la peau. Ils fragilisent la structure de la couche cornée et par conséquent altèrent la fonction barrière.

Une fonction barrière altérée est de plus généralement associée à une peau sèche, fragile et réactive.

La couche cornée, n’assurant plus une imperméabilité optimale, devient plus poreuse et contribue à la pénétration accrue d’agents exogènes (agents chimiques, irritants, polluants, bactéries, virus, allergènes…). Ils provoquent la production et l’accumulation d’espèces réactives de l’oxygène (Reactive Oxygen Species, ROS) et la déplétion des défenses antioxydantes endogènes.

Ces agents sont également identifiés comme des antigènes du non-soi, dont la liaison à des récepteurs de l’immunité, les Toll-like receptors (TLR), stimule en aval, avec les ROS, la voie de signalisation clé de l’inflammation, la voie NF-kB. Cette dernière conduit à la production de médiateurs pro-inflammatoires via la modulation de la transcription de certains gènes cibles codant pour des chimiokines, de cytokines pro-inflammatoires ou encore de facteurs de croissance impliqués dans l’inflammation neurogène (IL-1α, IL-1β, IL-8, IL-6, IL-10, IL-17, IL-12, TNF-α, FGF, NGF…).

Dans le cas des irradiations UV, les dommages directs à l’ADN (formation de dimères cyclobutaniques de pyrimidines/cyclobutane pyrimidine dimer, CPD) ou indirects induits par l’accumulation des ROS, activent également la voie NF-kB, à l’origine du déclenchement de la réponse inflammatoire.

L’accumulation du facteur NGF (Nerve Growth factor) contribue à exagérer la réponse inflammatoireviale déclenchement de l’inflammation neurogène. En effet, le NGF active indirectement le récepteur TRPV1 (transient receptor potential vanilloid type 1),viason récepteur NTRK1 (neurotrophic receptor tyrosine kinase 1) et contribue au relargage excessif de neuropeptides, comme le CGRP (calcitonin gene-related peptide), un important médiateur de l’inflammation neurogène.

Ce phénomène contribue à l’hypersensibilité des fibres nerveuses cutanées et aux sensations d’inconfort des peaux hyper-réactives ou sensibilisées.

La non-résolution de l’état inflammatoire et de l’inflammation neurogène rend ces manifestations persistantes et chroniques. On parle alors d’inflammation de bas grade, accompagnée de la production et relargage permanents, mais à de faibles niveaux, de cytokines, de facteurs de croissance, de neuropeptides. Ceux-ci perturbent le processus de différenciation terminale épidermique, ce qui fragilise davantage la barrière cutanée, et entretiennent l’hypersensibilité des fibres nerveuses cutanés et l’inconfort ressenti.

De plus, l’état inflammatoire de bas grade est également impliqué dans le vieillissement prématuré de la peau, connu sous le terme d’inflamm’aging, et joue aussi un rôle dans l’augmentation de la production de mélanine par les mélanocytes, à l’origine de l’apparition des tâches d’hyperpigmentation.

Compte tenu de l'impact significatif que l'exposome cutané peut avoir sur la beauté de la peau, il est devenu primordial de développer des stratégies visant à prévenir ou à limiter ses effets délétères aux niveaux moléculaire, cellulaire et tissulaire afin de prévenir les signes cutanés dont il est responsable : perturbation de la barrière cutanée, vieillissement prématuré, apparition de tâches d’hyperpigmentation et perte de l’homogénéité du teint dus à l’inflammation de bas grade, hyper-réactivité et inconfort cutanés dus à l’inflammation neurogène.

La présente invention a pour objet de répondre à ces besoins en proposant un nouvel actif permettant de renforcer et rendre moins sensible la peau face aux différents facteurs délétères de l’exposome auxquels elle est soumise.

En particulier, l’invention a pour but de proposer un nouvel actif apte à renforcer la fonction barrière et à améliorer l’hydratation cutanée, à limiter le stress oxydatif, l’inflammation et l’inflammation neurogène provoqués par des facteurs de l’exposome et leurs conséquences au niveau clinique, comme la perte de l’homogénéité du teint caractérisé par l’apparition de tâches d’hyperpigmentation.

Elle a également pour but de proposer un nouvel actif apte à activer les processus de réparation cutanée pour une accélération de la mise en place d’une fonction barrière optimale et d’un effet apaisant rapide à la suite d’une irritation.

C’est dans cette optique que la société demanderesse a mené d’importantes recherches et a mis en évidence qu’un extrait obtenu à partir de fleurs de plantes du genre Prunus permettait de répondre aux objectifs de l’invention.

Ainsi, l’invention concerne l’utilisation cosmétique, sur une peau saine, d’un extrait hydrosoluble d’une plante à fleurs issue de la famille des rosacées et appartenant à une espèce choisie parmi le genre Prunus pour prévenir ou limiter les effets délétères sur la peau des facteurs de l'exposome.

Dans le contexte de l’invention, on entend par « peau saine », une peau qui est considérée non pathologique par un dermatologue, c’est-à-dire qui ne présente aucune infection, maladie d’affection cutanée telle que candidose, impétigo, psoriasis, eczéma, acné ou dermatite, ou encore de blessure.

Selon l’invention, les facteurs de l'exposome sont les UV, les produits irritants cutanés ou les polluants atmosphériques.

Selon un mode de réalisation, la prévention ou la limitation des effets délétères sur la peau des facteurs de l'exposome inclut le renforcement et la réparation de la barrière cutanée.

Ce renforcement et cette réparation sont particulièrement remarquables suite à une exposition aux UV ou aux irritants cutanés. Il a été en effet démontré dans le cadre de l’invention, une activation de marqueurs de différenciation terminale kératinocytaire en conditions d'exposition aux UV, ainsi qu’une réparation rapide sur volontaires après dommage induit par un irritant cutané.

Selon un mode de réalisation, la prévention ou la limitation des effets délétères sur la peau des facteurs de l'exposome inclut la protection de la peau contre l'inflammation neurogène responsable de l'inconfort cutané.

Cette protection est particulièrement remarquable suite à une exposition aux UV ou aux irritants cutanés. Il a été en effet démontré dans le cadre de l’invention, une inhibition de la production du NGF, médiateur de l'inflammation neurogène induit par les UV et un irritant cutané.

Cette protection est particulièrement remarquage lors de l’exposition de neurones sensoriels co-cultivés avec des kératinocytes, à la capsaïcine, molécule activatrice du récepteur TRPV1, qui joue un rôle important dans la sensation de douleur et l'inflammation. Il a en effet été démontré l’inhibition du relargage induit par la capsaïcine, du peptide lié au gène de la calcitonine, le CGRP, un important médiateur de l’inflammation neurogène.

Selon un autre mode de réalisation, la prévention ou la limitation des effets délétères sur la peau des facteurs de l'exposome inclut la protection contre le stress oxydatif, responsable du vieillissement prématuré.

Cette protection est particulièrement remarquable suite à une exposition aux polluants et aux UV. Il a été en effet démontré dans le cadre de l’invention, une inhibition de l'expression d'un marqueur de stress oxydatif, HO-1, induit par les polluants.

Selon un autre mode de réalisation, la prévention ou la limitation des effets délétères sur la peau des facteurs de l'exposome inclut la préservation de l'homogénéité du teint et la prévention de l'apparition des tâches d'hyperpigmentation.

Cette protection est particulièrement remarquable suite à une exposition aux polluants et aux UV. Il a été en effet démontré dans le cadre de l’invention, une inhibition de l’oxydation et du brunissement de la mélanine induits par les polluants.

Selon un autre mode de réalisation, la prévention ou la limitation des effets délétères sur la peau des facteurs de l'exposome inclut la préservation de l’hydratation de la peau.

Selon un autre mode de réalisation, la prévention ou la limitation des effets délétères sur la peau des facteurs de l'exposome inclut l’apaisement et la réparation de la peau après irritation.

Cette protection est particulièrement remarquable suite à une exposition aux irritants cutanés. Il a été en effet démontré dans le cadre de l’invention, une amélioration de la microcirculation et de la fonction barrière après un dommage induit par un irritant cutané.

Avantageusement, l’extrait hydrosoluble est issu d’une fleur d’une espèce choisie plus particulièrement parmiPrunus domestica, Prunus spinosa, Prunus sibirica,Prunus nigra, Prunus persicaouPrunus armeniaca.

L’extrait utilisé dans le cadre de l’invention est tel que décrit dans ce qui suit.

L’invention concerne encore un extrait hydrosoluble issu de fleurs d’une plante de la famille des rosacées appartenant à une espèce choisie parmi le genre Prunus, se caractérisant par :

Un taux de matière sèche supérieur à 5g/L d’extrait liquide, préférentiellement compris entre 5 et 100 g/L d’extrait liquide, plus préférentiellement compris entre 10 et 50 g/L d’extrait liquide ;
Entre 2 et 10g d’acides aminés totaux pour 100g d’extrait sec, préférentiellement entre 3 et 8g d’acides aminés totaux pour 100g d’extrait sec ;
Entre 0,5 et 5g de polyphénols totaux pour 100g d’extrait sec, préférentiellement entre 1 et 3g pour 100g d’extrait sec.

Les fleurs de Prunus peuvent être récoltées à un stade précoce tout comme à un stade mature. Ces fleurs peuvent être soumises à une étape de séchage partiel, voire total.

Préférentiellement, la fleur de Prunus est une fleur fraîche partiellement séchée qui présente une meilleure reproductibilité de la composition de l’extrait.

Selon un mode de réalisation, l’extrait végétal est un extrait aqueux ou hydroglycolique cosmétiquement acceptable, pouvant par exemple, mais non exclusivement, être obtenu par macération de la matière végétale dans un véhicule aqueux, selon une technique classique.

Par exemple, l’extrait selon l’invention peut être obtenu par immersion de la matière première végétale dans un solvant chaud avec un rapport massique solvant/matière première comprise entre 5/1 et 9/1, pendant une durée de quelques heures, par exemple trois heures. Le pH peut être ajusté avant ou après extraction dans le mélange aqueux. La température du solvant mis en œuvre peut être notamment comprise entre 30 et 70°C environ.

De manière préférentielle et avantageuse, l’extrait peut être obtenu par extraction de la matière première grâce à un véhicule d’extraction contenant de l’eau et de la glycérine, la glycérine étant potentiellement présente dans le solvant final dans une quantité en poids supérieur à celle de l’eau. La température de ce solvant peut notamment être comprise entre 30 et 70°C environ, par exemple entre 35 et 65°C. La durée d’extraction peut être de plusieurs heures, par exemple entre 2H et 24H.

De nombreuses techniques peuvent être employées, comme la macération, la lixiviation, la décoction, l’infusion, le Soxhlet, les ultra-sons ou les micro-ondes associés ou non aux solvants, mais aussi des techniques plus poussées comme les fluides super-critiques, l’eau sous critique. L’extrait selon l’invention peut être hydrolysé au cours de l’extraction ou après décantation.

Selon une caractéristique de l’invention, les acides aminés contenus dans l’extrait incluent en majorité au moins un acide aminé choisi parmi l’acide glutamique, la cystéine, l’acide aspartique, la proline, la glycine ou un de leurs mélanges, préférentiellement l’acide glutamique.

Au sens de l’invention, « en majorité » signifie que les acides aminés précités se trouvent à une teneur comprise entre 55 et 95% et plus préférentiellement entre 60 et 90%, en poids total d’acides aminés.

Préférentiellement dans le cadre de l’invention, le dosage de la teneur en acides aminés totaux est réalisé par hydrolyse. L’extrait selon l’invention est pesé puis dilué dans une solution acide. Après hydrolyse acide de 24H, la solution est neutralisée. Les acides aminés totaux sont alors dérivés, car la plupart des acides aminés sont dépourvus de chromophore. A cette fin, le carbamate de 6-aminoquinolyl-N-hydroxysccinimidyle est ajouté en excès sur l’hydrolysat. Les acides aminés dérivés sont alors séparés par UPLC en phase inverse. Les produits sont ensuite détectés en UV à une longueur d’onde de 260nm. La quantification est réalisée à l’aide d’étalons d’acides aminés.

Avantageusement, les acides aminés contenus dans l’extrait incluent en majorité de l’acide glutamique.

L’étude bibliographique illustrée dans le tableau 1 ci-dessous sur les connaissances en teneur en acide glutamique sur les acides aminés totaux montre que l’extrait selon l’invention possède la plus forte teneur en acide glutamique parmi des espèces de Prunus référencées, tissu variable.

Espèce, tissu	Acide glutamique (% /total acide aminé)	Référence
Prunus domestica, fruit	14	Lenchyk et al.,2020
Prunus domestica, fleurs	87	Demanderesse
Prunus persica, fruit	1.8	Sun et al., 2022
Prunus sibirica	27	Yin et al., 2020

Selon une autre caractéristique de l’invention, les polyphénols contenus dans l’extrait incluent au moins un acide phénolique et/ou au moins un flavonoïde.

Préférentiellement, les polyphénols incluent au moins un acide phénolique choisi parmi l’acide néochlorogénique, l’acide protocatéchique glycérol, l’acide chlorogénique, l’acide cryptochlorogénique, l’acide hydroxybenzoïque glycérol, , le cafféoyl glycérol ou un de leurs mélanges.

Préférentiellement encore, les polyphénols incluent au moins un flavonoïde choisi parmi le kaempférol di-rhamnoside, le kaempférol-O-pentoside-O-rhamnoside, la quercétine-O-rhamnoside-O-hexoside, le kaempférol di-pentoside, la quercétine-O-pentoside, la quercétine-O-rhamnoside, le kaempférol-O-hexoside-O-rhamnoside le kaempférol-O-pentoside, le kaempférol-O-rhamnoside ou un de leurs mélanges.

Les teneurs en polyphénols totaux des extraits selon l’invention sont évaluées par le test Folin-Ciocalteu bien connu de l’homme du métier.

L’invention concerne encore une composition cosmétique comprenant au moins un extrait tel que défini précédemment.

Avantageusement, dans cette composition, l’extrait est utilisé à une concentration comprise entre 0,0005 % en poids et 10 % en poids du poids total de la composition.

Préférentiellement, la composition est sous une forme adaptée à l’application topique.

La composition selon l’invention peut notamment être formulée sous forme de crème, de lotion, d’émulsion, de lait, de gel, de mousse ou de spray.

Avantageusement, la composition selon l’invention peut comprendre en outre, au moins un autre composé tel qu’un agent actif, un composé hydratant, un conservateur, un solvant ou tout autre adjuvant habituellement utilisé dans le domaine de la cosmétique.

L’invention concerne encore une méthode de traitement cosmétique pour préserver la peau des effets délétères des facteurs de l'exposome, prévenir et lutter contre ses effets, comprenant l’application topique, sur une peau saine ou des muqueuses saines, d’une composition cosmétique comprenant un extrait tel que décrit précédemment.

Au sens de l’invention, on entend par « traitement cosmétique » ou « traitement cosmétique non thérapeutique » un procédé ou un soin cosmétique appliqué sur une peau ou une muqueuse considérée saine par un dermatologue, c’est-à-dire qui ne présente aucune infection, maladie d’affection cutanée, telle que candidose, impétigo, psoriasis, eczéma, acné ou dermatite, ou encore de blessure.

Les caractéristiques de l'invention mentionnées ci-dessus, ainsi que d'autres, apparaîtront plus clairement à la lecture des exemples qui suivent.

Exemple 1 : Méthodes d’obtention d’extraits selon l’invention

Exemple d’extraction A : Extraction hydroglycolique à chaud (eau/glycérine)

- Incorporation de 64Kg de fleurs de rosacées dans 100Kg d’un mélange hydroglycolique.

- Chauffage entre 35 et 65°C.

- Durée de chauffage et de la solubilisation comprise entre 2H et 24H.

- Séparation des phases solubles et insolubles par décantation et/ou centrifugation et/ou filtration.

- L’extrait est ensuite filtré sur poches puis filtré sur membranes jusqu’à 2um.

Exemple d’extraction B : Extraction hydroglycolique et immobilisation sur support solide (eau/glycérine)

- Incorporation de 64Kg de fleurs de rosacées dans 100Kg d’un mélange de hydroglycolique.

- Chauffage entre 35 et 65°C.

- Durée de chauffage et de la solubilisation comprise entre 2H et 24H.

- Sélection sur support solide.

- L’extrait est ensuite filtré sur poches puis filtré sur membranes jusqu’à 2 µm.

Exemple d’extraction C : Extraction aqueuse

- Incorporation de 64Kg de fleurs de rosacées dans 100Kg d’eau.

- Etape de réaction enzymatique avec un cocktail d’enzymes. Avantageusement, l’étape de réaction enzymatique a lieu à pH neutre, à une température inférieure à 50°C, durant 2 à 24h, et avec un cocktail d’enzymes ayant au moins une activité pectinase et une activité cellulase.

- Après désactivation des enzymes, l’extrait est centrifugé puis filtré sur membranes jusqu’à 2 µm.

Exemple d’extraction D : Extraction hydroglycolique (eau/éthanol)

- Incorporation de 64Kg de fleurs de rosacées dans 100Kg d’un mélange eau/éthanol.

- Extraction à une température de 35 à 65°C pendant 2 à 24H.

- L’extrait est ensuite filtré sur poches puis filtré sur membranes jusqu’à 2 µm. Les solvants sont évaporés sous vide.

Exemple 2 : Obtention d’extraits

Des extraits de fleurs dePrunus domestica, Prunus spinosa, Prunus sibirica, Prunus persica et Prunus armeniacaont été obtenus par la méthode d’extraction A présentée dans l’exemple 1.

Les teneurs en polyphénols totaux des extraits obtenus sont déterminées par la méthode bien connue Folin-Ciocalteu. Les résultats obtenus pour la teneur en polyphénols totaux par la méthode Folin-Ciocalteu sont présentés dans la Table 2 ci-dessous :

Espèce, tissu	Solvant extraction	Teneur Eq. Acide gallique
Prunus domestica	Eau/glycérine	1,66 mg/g extrait liquide
Prunus spinosa	Eau/glycérine	1,39 mg/g extrait liquide
Prunus sibirica	Eau/glycérine	1,21 mg/g extrait liquide
Prunus persica	Eau/glycérine	1,09 mg/g extrait liquide
Prunus armeniaca	Eau/glycérine	0,97 mg/g extrait liquide

La caractérisation des principaux composés phénoliques de l’extrait dePrunus domesticaa été déterminée par une mesure UPLC-DAD-MS bien connue de l’homme du métier (Table 3).

Acides phénoliques

Acide néochlorogénique (3-CQA)

Acide protocatéchique glycerol

Acide chlorogénique (5-CQA)

Acide cryptochlorogénique (4-CQA)

Flavonoïdes

Kaempférol di-rhamnoside

Kaempférol-O-pentoside-O-rhamnoside

Quercétine-O-rhamnoside-O-hexoside

Kaempférol di-pentoside

Quercétine-O-pentoside

Quercétine-O-rhamnoside

Kaempférol-O-hexoside-O-rhamnoside

Kaempférol-O-pentoside

Kaempférol-O-rhamnoside

Exemple 3 : Renforcement de la barrière cutanée

Les effets d’un extrait aqueux dePrunus domesticaobtenu dans l’exemple 2 ont été évalués sur l’expression de marqueurs de la différenciation terminale épidermique dans des kératinocytes en culture.

L’étude au niveau protéique est réalisée sur 3 marqueurs de référence de la différenciation terminale et de l’intégrité épidermique.

Protocole

L’étude a été réalisée sur des kératinocytes humains normaux (NHEK) en culture.

Les NHEKs ont été ensemencés sur des lames de verre de 0,7 cm2 (Millipore, PEZGS0816) dans un milieu complet 24h avant le traitement.

Ils ont ensuite été traités ou non (condition bas calcium) pendant 72h avec l’extrait aqueux dePrunus domesticaprésenté dans l’exemple 2 à une concentration de 2% (n=3).

Parallèlement, les cellules ont également été cultivées dans des conditions hyper-calciques (1,8 mM CaCl2) afin d'induire l'expression des 3 protéines de référence, utilisées comme des marqueurs de la différenciation terminale épidermique : l’involucrine, la claudine 4 et la transglutaminase 1.

A la fin des traitements, les NHEKs ont été fixés et placés en présence des anticorps primaires spécifiques des 3 protéines de référence. Des anticorps secondaires conjugués à la fluorescéine ont ensuite été utilisés pour détecter les anticorps primaires.

Le DAPI ou 4',6'-diamidino-2-phénylindole, une molécule fluorescente capable de se lier aux bases adénine et thymine de l'ADN, a été utilisé pour détecter les noyaux cellulaires.

Les lames ont été montées avec du Mowiol (Sigma, 32.459-0) ou le montage ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher, P36962) et stockées à 4°C et dans l'obscurité jusqu'à ce que 3 images soient capturées par culture, en utilisant un microscope et appareil Leica, respectivement DM 2000, objectif 40x et DFC420C.

Pour chacune des conditions, 9 photos représentatives du marquage observé ont ainsi été enregistrées.

L'analyse des images par le logiciel QWin (Leica) a permis d'exprimer la surface cellulaire marquée par fluorescence en utilisant les pixels comme unité de surface (1 pixel = 1 μm2). Une photo est représentée à l'aide de 4761460 pixels.

L'intensité moyenne du marquage a été déterminée pour chaque photo.

Les noyaux ont été quantifiés en utilisant le programme ImageJ pour rapporter la zone marquée et l'intensité moyenne de la coloration au nombre de cellules par image.

Pour les analyses statistiques, un test t de student a été réalisé pour comparer l'effet de chaque traitement avec les contrôles.

Résultats

Le tableau 4 ci-dessous résume les résultats des analyses des quantifications des immunomarquages réalisés sur les NHEK cultivés en bas calcium, haut-calcium, ou avec l’extrait à 2%.

Pour les statistiques, les valeurs de 0,01<p<0,05 sont considérées comme significatives (*), 0,001<p<0,01 sont considérées comme très significatives (**) et p <0,001 sont très hautement significatives (***) (test t de Student par rapport au contrôle non traité, bas calcium), ns : non significatif.

Quantification Immunomarquage, Surface cellulaire marquée exprimée en pixels	Control Bas calcium	Control Haut-calcium	Extrait (Ex.2)
Involucrine	100 ± 8	4005 ± 953**	2552 ± 339***
Claudine 4	100 ± 114	5834 ± 4345 ns	7496 ±2492**
Transglutaminase 1	100 ± 27	327 ± 114*	980 ± 203**

L’extrait aqueux dePrunus domesticaà 2% a significativement activé l’expression de protéines impliquées dans l’intégrité de l’épiderme et sa différenciation, démontrant des propriétés de renforcement de la fonction barrière.

Exemple 4 : Amélioration de l’hydratation de la couche cornée

Une fonction barrière optimale est associée à une meilleure hydratation de la couche cornée. Ainsi, les effets de l’extrait aqueux dePrunus domesticaprésenté dans l’exemple 2 ont été évalués sur l’hydratation cutanée à l’aide d’un modèleex vivod’explants de peau humaine en culture à l’aide du cornéomètre.

Protocole

Des explants de peau issue d’abdominoplastie (n=3) ont été utilisés dans l’heure qui a suivi l’intervention de chirurgie plastique. Des disques de peau de 28 mm de diamètre ont été réalisés et mis en culture dans des inserts de plaque 6 puits.

L’extrait aqueux dePrunus domesticaa été dilué à 3% dans de l’eau distillée puis déposé à la surface de la peau à raison de 4 µl/cm². Les fragments de peau ont été massés pendant 20 secondes avec un doigtier. Les explants de peau ont été ensuite placés en survie.

La mesure de l'hydratation cutanée a été effectuée à l'aide d’un cornéomètre. La mesure d'hydratation a été réalisée de la même façon à T0 et après 1, 2, 4, 8, 12 et 24h de culture. Trois mesures ont été réalisées par explant.

Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à T0. Une analyse statistique ANOVA one way a été réalisée, suivie si nécessaire d'un test de Fisher. Le seuil de significativité retenu est p<0,05.

Résultats

Le tableau 5 ci-dessous résume les taux d’hydratation (%/T0) moyenne de l’extrait aqueux dePrunus domesticaen fonction du temps ***p<0,001versustémoin.

	Témoin	Extrait aqueux
Temps (Heure)	Moyenne (%)	Ecart-type	Moyenne (%)	Ecart-type
T0 MIN	100,0	2,25	100,0	2,57
T1h	96,5	1,98	153,89***	4,9
T2h	103,1	3,43	141,62***	4,01
T4h	97,9	2,95	141,18***	4,85
T8h	100,5	3,2	127,23***	3,4
T12h	100,0	2,5	123,49***	3,85
T24h	97,3	2,77	117,21***	3,97

L’application topique de l’extrait aqueux dePrunus domesticaa significativement augmenté l'hydratation de la couche cornée à court et à long terme et après une application unique.

Exemple 5 : Renforcement et protection de la barrière cutanée face à un stress de l’exposome, le rayonnement UVA

Etude au niveau transcriptomique réalisée sur des marqueurs clés de l’homéostasie et de la différenciation terminale épidermique en situation de stress UVA

Les effets de l’extrait aqueux dePrunus domesticaprésenté dans l’exemple 2 ont été évalués sur l’expression de marqueurs de la différenciation terminale épidermique dans des kératinocytes en cultures stressés par des irradiations UVA.

Protocole

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits, 24h avant le traitement avec l’extrait aqueux dePrunus domesticaà 3% présenté dans l’exemple 2.

Après 18h de traitement, les cellules ont été irradiées par UVA à 5J/cm² dans du PBS (phosphate buffered saline solution) en l’absence de l’extrait aqueux dePrunus domestica .

Ensuite, l’extrait aqueux dePrunus domesticaa été réappliqué pendant 6h.

A la fin des traitements, les ARN totaux ont été extraits avec le kitQiagen RNeasyet conservés à -80°C. L'intégrité des échantillons a été analysée par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire.

Les ADNc ont ensuite été synthétisés à partir des ARNm par transcription inverse.

Les effets avec l’extrait aqueux dePrunus domesticaont été analysés à l'aide de matrices microfluidiques TaqMan qPCR conçues par StratiCELL et fabriqués à la demande par Applied Biosystems.

Parmi les gènes représentés, 3 contrôles internes ou gènes de référence et des gènes d'intérêt ont été utilisés.

Les puces TaqMan ont été traitées comme décrit par les instructions du fabricant (Micro Fluidic Card Getting Started Guide, Applied Biosystems).

En bref, les ADNc ont été mélangés avec un tampon spécifique (TaqMan Fast Advanced Master Mix, 4444557, Applied Biosystems) avant d'être injectés dans les matrices et dispersés dans les puits par centrifugation.

Les matrices ont été scellées et les qPCR ont été exécutées à l'aide du système PCR en temps réel Quantstudio7 (Applied Biosystems) et de son logiciel (logiciel QuantStudio real time PCR Software v1.3., Applied Biosystems).

Des cycles de seuil (Ct) ont été obtenus pour chaque gène. Les fichiers de résultats ont été exportés à partir de l'appareil de qPCR et analysés à l'aide du logiciel DataAssist (v3.01, Applied Biosystems) conçu pour effectuer une quantification relative de l'expression des gènes à l'aide du Ct comparatif (ΔΔCt) (Pfaffl, 2001 ; Livak & Schmittgen, 2001), par une combinaison d'analyses statistiques.

Les données avec l’extrait aqueux dePrunus domesticaont été comparées à la condition de référence, c'est-à-dire le contrôle irradié non traité.

Les valeurs de Ct ont été normalisées par rapport au Ct d'un gène de référence présent sur la matrice (β2-microglobuline ; B2M).

La valeur seuil de Ct maximale a été fixée à 36 cycles.

Résultats

Le tableau 6 ci-dessous résume les effets significatifs de l’extrait aqueux dePrunus domesticasur l’expression des gènes par rapport à la condition contrôle non traitée, irradiée.

Le tableau 6 liste les gènes différentiellement exprimés après 24h de traitement des kératinocytes NHEK avec l’extrait aqueux dePrunus domesticaà 3%. Irradiation effectuée après 18h de traitement. Le symbole, le nom des gènes, l'expression relative (fold change, FC) par rapport au contrôle non traité irradié (FC > 1 : augmentation - FC < 1 : diminution), et la significativité (valeur p) sont présentés.

Pour les statistiques, les valeurs de 0,01<p<0,05 sont considérées comme significatives, 0,001<p<0,01 sont considérées comme très significatives et p <0,001 sont très hautement significatives (test t de Student par rapport au contrôle non traité, irradié).

Fonctions principales	Symbol du gène	Nom du gène	FC (Fold change) UVA Stress + Extrait aqueux 3%versuscontrôle non traité irradié	P Value
Adhésion cellulaire, intégrité de l’épiderme	OCLN	Occludine	3,19733	0,0173
	CLDN1	Claudine 1	3,66218	0,00051
	CLDN4	Claudine 4	6,03629	0,00386
	CLDN7	Claudine 7	3,52259	4,9E-06
	DSC1	Desmocolline 1	3,54719	0,06361
	DSG1	Desmogléine 1	4,65396	0,01603
	CDSN	Cornéodesmosine	7,63615	0,00294
Desquamation	KLK5	Kallikreine 5	3,26837	0,0011
Desquamation	KLK7	Kallikreine 7	10,143	0,00032
Hydratation, NMF	CASP14	Caspase 14	2,35289	0,01782
Lipides intercornéocytaires	GPAT3	Glycerol-3-phosphate acyltransferase 3	3,3945	0,00939
Enveloppe cornée	IVL	Involucrine	5,43599	0,00546
	SCEL	Scielline	5,04414	0,04727
	SPRR1A	Small proline-rich protein IA	7,1921	0,00916
	TGM1	Transglutaminase 1	11,1703	0,00012
Inflammation neurogène	NGF	Nerve Growth Factor	0,26137	0,00781

Le rayonnement UV perturbe l’expression de nombreux marqueurs de l’homéostasie épidermique.

En situation de stress UV, l’extrait aqueux dePrunus domesticaà 3% neutralise les effets délétères des UV sur la fonction barrière, en activant l’expression de marqueurs clés impliqués dans l’adhésion cellulaire et l’intégrité de l’épiderme et de la couche cornée (Occludine, Claudine 1, Claudine 4, Claudine 7, Desmocolline 1, Desmogléine 1, Cornéodesmosine). Il a également activé l’expression des gènes codant pour les enzymes clés du processus de desquamation et de la production du facteur naturel d’hydratation (NMF) (Kallikreine 5, Kallikreine 7, caspase 14) ainsi que des gènes impliqués dans la formation de l’enveloppe cornée et du ciment lipidique intercornéocytaire (Glycerol-3-phosphate acyltransferase 3, Involucrine, Scielline, Small proline-rich protein IA, Transglutaminase 1).

De plus, l’extrait aqueux dePrunus domesticaa significativement inhibé l’expression du gène codant pour le NGF, un facteur clé de l’inflammation neurogène, impliqué dans l’hypersensibilisation des fibres nerveuses et les sensations d’inconfort cutanées.

Exemple 6 : Protection contre l’inflammation neurogène induite par un des stress de l’exposome : un irritant cutané, le lss

Etude au niveau protéique réalisée sur le NGF, un marqueur clé de l’inflammation neurogène, en situation de stress d’irritation cutanée induite par le laurylsulfate de sodium (LSS).

Les effets de l’extrait aqueux dePrunus domesticaprésenté dans l’exemple 2 ont été évalués sur l’expression du NGF induite par le LSS, à l’aide d’un modèleex vivod’explants de peau humaine en culture.

Protocole

Des explants de peau humaine d'un diamètre moyen de 12 mm (±1mm) ont été préparés à partir d’une abdominoplastie provenant d'une femme caucasienne de 54 ans (référence : P2377-AB54) avec un phototype II (selon la classification des types de peau de Fitzpatrick).

Les explants ont été maintenus en survie dans le milieu de culture BEM (BIO-EC's Explants Medium) à 37°C dans une atmosphère humide et à 5 % de CO2.

L’extrait aqueux dePrunus domesticaà 3% a été appliqué par voie topique sur la base de 2 µL/cm2 et étalé à l'aide d’une petite spatule au jour 0 (J0), J1 et J4 (avant le stress LSS).

Les explants témoins n'ont reçu aucun traitement à l'exception du renouvellement du milieu de culture.

Le milieu de culture a été renouvelé à moitié (1ml par puits) à J1 et complètement à J4 (2ml par puits).

Le jour 4, des disques de papier (9 mm de diamètre) imbibés de 30 µl d'une solution de LSS 5% (dans de l'eau distillée stérile) ont été appliqués topiquement sur les explants.

Les disques de LSS ont été retirés après 24 heures de contact avec la peau.

A J5, à la fin du contact avec le LSS, les explants sont collectés, fixés, déshydratés et inclus en paraffine.

Des sections de 5 µm d’épaisseur sont réalisées à l’aide d’un microtome.

L'immunomarquage du NGF a été réalisé sur des coupes déparaffinées et réhydratées avec un anticorps monoclonal anti-NGF dilué dans du PBS-BSA 0,3% et incubé pendant une nuit à température ambiante en utilisant un système d'amplification Vectastain Kit Vector système amplificateur avidine/biotine, et révélé par le VIP, un substrat de la peroxydase (laboratoires Vector, réf. SK-4600).

L'immunomarquage a été réalisé manuellement et a été évalué par observation microscopique.

Pour chaque lot d'explants, le pourcentage de la région d'intérêt couverte par la coloration due à l’immunomarquage du NGF (pourcentage de surface colorée) est déterminé par analyse d'image selon la méthode décrite par Bio-EC utilisant le logiciel Cell^D.

Résultats

Le tableau 7 ci-dessous résume les effets significatifs de l’extrait aqueux dePrunus domesticasur l’expression du NGF dans des explants stressés par le LSS.

Pour les statistiques, les valeurs de 0,001<p<0,01 sont considérées comme très significatives (**), (test t de Student par rapport au contrôle stressé LSS, non traité).

	Control non stressé, non traité	Stressé avec le LSS, non traité	Stressé LSS + Traité Extrait à 3%
Moyenne % de la surface marquée	26,4	50,4	5,7**
Ecart-type	6	6,7	6,9

Le LSS, un irritant cutané, a induit une importante inflammation neurogène, en stimulant significativement l’expression du NGF de 91%.

L’extrait aqueux dePrunus domesticaappliqué en topique sur des explants de peau humaine a significativement diminué cette expression du NGF (-89%) induite par le LSS, démontrant un effet protecteur de celui-ci vis-à-vis de l’irritant cutané.

Exemple 7 : Protection contre l’inflammation neurogène induite par le relargage de cgrp, suite à l’activation par la capsaïcine du récepteur trvp1

Analyse du relargage du CGRP par des neurones, stimulés par la capsaïcine, un agoniste du récepteur TRPV1, activateur des nerfs sensoriels et inducteur de l’inflammation neurogène

Les effets de l’extrait aqueux dePrunus domesticaprésenté dans l’exemple 2 ont été évalués sur le relargage du CGRP induit par la capsaïcine, à l’aide d’un modèlein vitrode co-culture de neurones sensoriels et de kératinocytes.

Protocole

Les neurones sensoriels humains sont dérivés de cellules hiPS (cellules souches pluripotentes induites humaines) obtenues par transfection de fibroblastes humains.

Les cellules sont placées dans des plaques 96 puits recouvertes d'une fine couche de Matrigel® dans un milieu de différenciation. Les cellules sont incubées à 37°C et 5% de CO2 pendant 6 jours et le milieu de culture est changé tous les 2 jours.

Après 14 jours de culture, les kératinocytes sont ajoutés au-dessus des neurones sensoriels. La co-culture sera maintenue à 37°C et 5% CO2 dans un milieu de culture approprié. Le milieu de culture sera changé tous les 2 à 3 jours.

Au 17ème jour de culture, le milieu est retiré et du milieu frais est ajouté. Les conditions suivantes ont été appliquées : - Milieu témoin, - Milieu témoin + l’extrait aqueux dePrunus domesticaprésenté dans l’exemple 2 à 0,1%,

Après 24 heures d'incubation, le milieu sera retiré et du milieu frais sera ajouté.

Les conditions suivantes sont réalisées : - Milieu témoin,- Milieu témoin + capsaïcine 10µM - Milieu témoin + l’extrait aqueux dePrunus domesticaprésenté dans l’exemple 2+ capsaïcine 10µM.

Après 30 minutes d'incubation des composés, les surnageants sont prélevés et conservés à -80°C.

Les quantités de CGRP libérées sont dosées par ELISA dans les surnageants recueillis 30 minutes après le traitement à la capsaïcine. Les résultats sont comparés au contrôle capsaïcine.

Résultats

Le tableau 8 ci-dessous résume les effets significatifs de l’extrait aqueux dePrunus domesticasur le relargage du CGRP induit par la capsaïcine dans une co-culture de neurones sensoriels / kératinocytes.

Pour les statistiques, les valeurs de p <0,001 sont très hautement significatives (***) (test t de Student par rapport au contrôle stimulé, non traité).

Dosage du CGRP dans les surnageants de culture	Contrôle non stimulé, non traité	Stimulé par la capsaïcine, non traité	Stimulé par la capsaïcine + Traité Extrait à 0,1%
Quantité de CGRP en pg/mL	1,56	2,04	1,60***
Ecart-type	0,04	0,07	0,02

La capsaïcine a activé le relargage du CGRP (+31%), démontrant une stimulation du récepteur TRPV1, médiateur de la réponse inflammatoire neurogène.

L’extrait aqueux dePrunus domesticaprévient ce relargage induit par la capsaïcine (-22%) démontrant ainsi ses propriétés de protection contre l’inflammation neurogène et apaisantes afin de diminuer l’hypersensibilité des fibres nerveuses et les inconforts cutanés.

Exemple 8 : Protection contre l’inflammation induite par un stress de l’exposome : les polluants atmosphériques

Analyse au niveau protéique de l’expression et/ou relargage de l’IL-8, une cytokine pro-inflammatoire, en situation de stress induit par des polluants atmosphériques

Les effets de l’extrait aqueux dePrunus domesticaprésenté dans l’exemple 2 ont été évalués sur l’expression et le relargage de la cytokine pro-inflammatoire IL-8, par des kératinocytes en cultures stressés par des polluants atmosphériques.

Protocole

Les kératinocytes ont été ensemencés dans une plaque 96 puits et cultivés pendant 24 heures dans un milieu de culture.

Le milieu a ensuite été remplacé par un milieu de culture contenant ou non (contrôle intoxiqué) l’extrait aqueux dePrunus domesticaprésenté dans l’exemple2à 1% et les cellules ont été intoxiquées par la poussière urbaine 1649b (Urban dust NIST® SRM® 1649b) à 0,5 mg/ml, contenant les polluants atmosphériques.

En parallèle, une condition de contrôle non intoxiqué a été réalisée. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 72 heures.

Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en n=3, à l'exception de la condition témoin stimulée réalisée en n=6.

A la fin de l'incubation, les surnageants de culture ont été collectés pour quantifier la libération d'IL-8.

Le relargage de l’IL-8 a été quantifié par ELISA (Ref : DY208) en suivant les instructions du fournisseur R&D system.

Résultats

Le tableau 9 ci-dessous résume les effets significatifs de l’extrait aqueux dePrunus domesticasur le relargage de l’IL-8 par des kératinocytes stressés par des polluants atmosphériques.

Pour les statistiques, les valeurs de p <0,001 sont très hautement significatives (***) (test t de Student par rapport au contrôle stressé avec la poussière urbaine).

Dosage de IL-8 dans les surnageants de culture	Contrôle non stressé, non traité	Stressé avec la poussière urbaine, non traité	Stressé + traité Extrait à 1%
Quantité d’IL-8 en pg/ml	87	486	210***
Ecart type	15	24	29

Les polluants de la poussière urbaine (Urban dust NIST® SRM® 1649b) ont fortement augmenté l'expression et/ou la libération de l’IL-8 (+459%), démontrant une induction de la réponse inflammatoire.

L’extrait aqueux dePrunus domesticaprévient l'expression et/ou la libération de l’IL-8 induite par les polluants (-57%) démontrant ainsi ses propriétés anti-inflammatoires et anti-pollution.

Exemple 9 : Protection contre le stress oxydatif induit par un des stress de l’exposome : les polluants atmosphériques

Analyse au niveau protéique de l’expression de l’hème oxygénase-1, un marqueur du stress oxydatif, en situation de stress induit par des polluants atmosphériques

Les effets de l’extrait aqueux dePrunus domesticaprésenté dans l’exemple 2 ont été évalués sur l’expression l’hème oxygénase-1 (HO-1) induite par des polluants atmosphériques, à l’aide d’un modèleex vivod’explants de peau humaine en culture.

Protocole

Des explants de peau humaine d'un diamètre moyen de 12 mm (±1mm) ont été préparés à partir d’une abdominoplastie provenant d'une femme caucasienne de 42 ans (référence : P2097- AB42).

L’extrait aqueux dePrunus domesticaprésenté dans l’exemple 2 à 3% a été appliqué par voie topique sur la base de 2 µL/cm2 et étalé à l'aide d’une petite spatule au jour 0 (J0), J1, J2 et J5 (4 heures avant l’exposition aux polluants).

A J5, 4 heures après l'application du produit, les explants à stresser ont été placés sur le système PolluBox® avec 900 µl par puits de HBSS, et exposés par pulvérisation, à un mélange d'hydrocarbures aromatiques polycycliques + métaux lourds + particules fines pendant 1,5 heures.

A la fin de l’exposition aux polluants, les explants sont collectés, fixés, déshydratés et inclus en paraffine.

L'immunomarquage de HO-1 a été réalisé sur des coupes déparaffinées et réhydratées avec un anticorps monoclonal (Novus, ref. NBP1-97507, clone 09011624) dilué dans du PBS-BSA 0,3% et incubé pendant une nuit à température ambiante en utilisant un système d'amplification Vectastain Kit Vector système amplificateur avidine/biotine, et révélé par le VIP, un substrat de la peroxydase (laboratoires Vector, réf. SK-4600).

Pour chaque lot d'explants, le pourcentage de la région d'intérêt couverte par la coloration due à l’immunomarquage de HO-1 (pourcentage de surface colorée) est déterminé par analyse d'image selon la méthode décrite par Bio-EC utilisant le logiciel Cell^D.

Résultats

Le tableau 10 ci-dessous résume les effets significatifs de l’extrait aqueux dePrunus domesticasur l’expression de HO-1 dans des explants stressés par des polluants atmosphériques

Pour les statistiques, les valeurs de 0,001<p<0,01 sont considérées comme très significatives (**), (test t de Student par rapport au contrôle stressé aux polluants, non traité).

	Contrôle non stressé, non traité	Stressé avec les polluants, non traité	Stressé polluants + traité Extrait à 3%
Moyenne % de la surface marquée	54,4	68,9	50,4**
Ecart-type	10,7	11,2	4,8

Les polluants atmosphériques ont induit du stress oxydatif, démontré par l’activation significative de l’expression de HO-1 de +27%.

L’extrait aqueux dePrunus domesticaappliqué par voie topique sur des explants de peau humaine a significativement diminué l’expression de l’HO-1 (-27%) induite par les polluants, démontrant un effet anti-oxydant et protecteur vis-à-vis du stress oxydatif et anti-pollution.

Exemple 10 : Protection contre l’hyperpigmentation due à une oxydation et brunissement de la mélanine induite par un stress de l’exposome : les polluants atmosphériques.

Lors de la quantification du marquage de l’HO-1 présenté dans l’exemple 9, il a été remarqué un brunissement significatif de la couche basale des explants stressés par les polluants, suggérant une surproduction et accumulation de la mélanine induite par les polluants atmosphériques.

Des marquages Fontana-Masson montrant la distribution des granules de mélanine dans l'épiderme ont été réalisés sur les explants utilisés et traités dans l’exemple 9. Cependant, ceux-ci n’ont pas démontré de changement de la quantité de mélanine.

Ce brunissement de la mélanine témoigne par conséquent de l’oxydation de la mélanine, induite par le stress oxydatif provoqué par les polluants, et non pas de l’activation de sa synthèse, comme observé lors de la photo-oxydation de la mélanine induite par les UVA, connue sous le nom de « phénomène de Meirowski ».

Ce brunissement a été quantifié pour les 3 conditions et par image (n=7 par condition) à l’aide du logiciel ImageJ avec le mode MaxEntropy et du comptage du nombre de particules, considéré comme le plus optimal pour isoler l’apparence des dépôts de mélanine.

Résultats

Le tableau 11 ci-dessous résume les effets significatifs de l’extrait aqueux dePrunus domesticasur l’inhibition de l’oxydation et du brunissement de la mélanine dans des explants stressés par des polluants atmosphériques.

Nombre de particules de dépôt de mélanine comptées à l’aide d’ImageJ / image	Contrôle non stressé, non traité	Stressé avec les polluants, non traité	Stressé polluants + traité Extrait à 3%
Moyenne du nombre de particules	13,85	28,71	5,43**
Ecart-type	1,78	5,60	1,925

Les polluants atmosphériques ont induit une oxydation et un brunissement significatifs de la mélanine, la rendant beaucoup plus visible et augmentant de +107% le nombre de particules de dépôts de mélanine identifiés avec le mode MaxEntropy d’ImageJ.

L’extrait aqueux dePrunus domesticaappliqué par voie topique sur des explants de peau humaine a significativement diminué le nombre de particules (-81%) induites par les polluants, démontrant un effet protecteur vis-à-vis de l’oxydation et du brunissement de la mélanine induits par les polluants et responsables de l’apparition des tâches d’hyperpigmentation et de la perte de l’homogénéité du teint.

Exemple 11 : Tests cliniques : effets restructurant, réparateur et apaisant sur peaux endommagées par un des stress de l’exposome : un irritant cutané, le lss

L’étude clinique a été réalisée sur les avant-bras de 23 volontaires en bonne santé de sexe féminin âgés en moyenne de 40±3 ans, dont la peau est sèche (taux d'hydratation cutanée ≤50 U.A., vérifié à l'aide du Cornéomètre®) et de phototype II et III.

L’analyse de l’effet apaisant a été réalisée avec le TiVi700®.

Le TiVi700® ou Tissues Viability Imaging (Wheels Bridge) est un système d'imagerie par spectroscopie de polarisation qui évalue la microcirculation cutanée et plus précisément la quantification de l'érythème et de l'irritation.

Les mesures au TiVi700® reflètent la concentration de globules rouges au niveau cutané.

Une importante quantité de globules rouges témoigne d’une peau irritée, alors que la diminution des hématies démontre un effet apaisant.

L’analyse des effets restructurant et réparateur a été réalisée avec le Tewamètre TM 300®.

Le Tewameter TM 300® permet de mesurer la perte insensible en eau ou le TEWL (TransEpidermal Water Loss).

Une augmentation du TEWL témoigne d’une fonction barrière cutanée altérée, alors que sa diminution démontre un effet restructurant et réparateur.

Analyses biométrologiques de la fonction barrière et de la microcirculation cutanée

A Jour 0, une zone est définie sur chaque avant-bras de chaque volontaire, une zone sur laquelle sera appliquée la crème contenant 3% de l’extrait aqueux dePrunus domesticaprésenté dans l’exemple 2 et l’autre zone, la crème placebo, ne contenant pas l’extrait.

A J0, des mesures basales sont réalisées au TiVi700® et au Tewamètre avant l’application du patch contenant le LSS et l’application des crèmes placebo ou avec l’extrait.

A J0, les patchs Hill-Top Chambers® contenant 0,5% de LSS sont appliqués sur les deux zones préalablement définies afin d’endommager et irriter la peau.

A J1, les patchs sont retirés, soit 24h après leur application.

A J2, deux jours après le retrait du patch de LSS à 0,5%, des mesures sont de nouveau réalisées au TiVi700® et au Tewamètre afin de confirmer l’irritation et les dommages à la barrière cutanée. Les valeurs obtenues sont définies comme les mesures de références pour la suite de l’étude.

De J2 à J7, les volontaires ont appliqué une fois par jour la crème contenant l’extrait sur l’une des zones irritées et le placebo sur l’autre zone de l’autre avant-bras.

Des mesures au TiVi700® et au Tewamètre ont été réalisées à J4, J7 ou J8 et comparées aux valeurs obtenues à J2, soit 24h après le retrait du patch.

Résultats : effets restructurant et réparateur

Le tableau 12 ci-dessous résume les effets de l’extrait aqueux dePrunus domesticasur la fonction barrière suite à une altération par le LSS et mesurée à l’aide du Tewamètre à J4 et J7 et ramenée en pourcentage du TEWL mesuré à J2.

Pour les statistiques, les valeurs de p<0,05 sont considérées comme significatives, (test t de Student par rapport au placebo).

	Placebo J4	Extrait J4	Placebo J7	Extrait J7
Evolution TEWL (% de J2)	-25,1%	-31,9%	-46,8%	-51,5%
Ecart-type	2,3	3,5	2,3	2,5
p valueversusplacebo		p = 0,04		P = 0,02

Dès J4 et après seulement 2 applications, l’extrait aqueux a montré un meilleur effet de réparation de la barrière cutanée significatif par rapport au placebo suite à son altération par le LSS.

A J7 et après 5 applications, l’extrait aqueux a également montré un meilleur effet de réparation de la barrière cutanée significatif par rapport au placebo.

Sur des peaux endommagées au LSS, l’application topique d’une formulation cosmétique contenant 3% de l’extrait aqueux dePrunus domesticaa démontré des effets restructurant et réparateur plus importants que la formulation placebo ne contenant pas l’extrait.

Résultats : effet apaisant

Le tableau 13 ci-dessous résume les effets de l’extrait aqueux dePrunus domesticasur l’irritation cutanée induite par le LSS, mesurés à l’aide du TiVi700® à J4 et J8 et ramenés en pourcentage de la microcirculation mesurée à J2.

Pour les statistiques, les valeurs de p<0,01 sont considérées comme très significatives, (test t de Student par rapport au placebo).

	Placebo J4	Extrait J4	Placebo J8	Extrait J8
Evolution de la microcirculation (% de J2)	-2,1%	-4,1%	-6,6%	-9,8%
Ecart-type	1,8	1,9	2,5	2,2
p valueversusplacebo		p = 0,079		P = 0,0066

Dès J4 et après seulement 2 applications, l’extrait aqueux tend à diminuer davantage l’irritation induite par le LSS comparé au placebo.

A J8, après 6 applications, la diminution de l’irritation induite par l’extrait est significativement plus importante comparée au placebo.

Sur des peaux endommagées au LSS, l’application topique d’une formulation cosmétique contenant 3% de l’extrait aqueux dePrunus domesticaa démontré un effet apaisant plus important que la formulation placebo ne contenant pas l’extrait.

Claims

Extrait hydrosoluble d’une plante à fleurs issue de la famille des rosacées appartenant à une espèce choisie parmi le genre Prunus pour son utilisation pour prévenir ou limiter les effets délétères des facteurs de l'exposome.
Extrait selon la revendication 1, dans laquelle les facteurs majoritaires de l'exposome sont les UV, les produits irritants cutanés, les polluants atmosphériques.
Extrait selon la revendication 1 ou 2, pour son utilisation pour le renforcement et la réparation de la barrière cutanée.
Extrait selon l’une des revendications précédentes, pour son utilisation pour la protection de la peau contre l'inflammation neurogène responsable de l'inconfort cutané.
Extrait selon l’une des revendications précédentes, pour son utilisation pour la protection contre le stress oxydatif, responsable du vieillissement prématuré.
Extrait selon l’une des revendications précédentes, pour son utilisation pour la préservation de l'homogénéité du teint et la prévention de l'apparition des tâches d'hyperpigmentation.
Extrait selon l’une des revendications précédentes, pour son utilisation pour l’apaisement et la réparation de la peau après irritation.
Extrait selon l’une des revendications précédentes, pour son utilisation pour la préservation de l’hydratation de la peau.
Extrait selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle l’extrait hydrosoluble est issu d’une fleur d’une espèce choisie parmiPrunus domestica, Prunus spinosa, Prunus sibirica, Prunus nigra, Prunus persica ou Prunus armeniaca.
Extrait selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle l’extrait hydrosoluble est tel que défini dans l’une des revendications 11 à 15.
Extrait hydrosoluble issu de fleurs d’une plante de la famille des rosacées appartenant à une espèce choisie parmi le genre Prunus, qui se caractérise en ce qu’il présente les caractéristiques suivantes :
- Un taux de matière sèche supérieur à 5g/L d’extrait liquide, préférentiellement compris entre 5 et 100 g/L d’extrait liquide, plus préférentiellement compris entre 10 et 50 g/L d’extrait liquide.
- Entre 2 et 10g d’acides aminés totaux pour 100g d’extrait sec, préférentiellement entre 3 et 8g d’acides aminés totaux pour 100g d’extrait sec,
- Entre 0,5 et 5g de polyphénols totaux pour 100g d’extrait sec, préférentiellement entre 1 et 3g pour 100g d’extrait sec .
Extrait selon la revendication 11, caractérisé en ce que les acides aminés incluent en majorité au moins un acide aminé choisi parmi l’acide glutamique, la cystéine, l’acide aspartique, la proline, la glycine ou un de leurs mélanges, en particulier l’acide glutamique.
Extrait selon l’une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que les polyphénols incluent au moins un acide phénolique et/ou au moins un flavonoïde.
Extrait selon l’une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que les polyphénols incluent au moins un acide phénolique choisi parmi l’acide néochlorogénique, l’acide protocatéchique glycérol, l’acide chlorogénique, l’acide cryptochlorogénique, l’acide hydroxybenzoïque glycérol, , le cafféoyl glycérol ou un de leurs mélanges.
Extrait selon l’une des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que les polyphénols incluent au moins un flavonoïde choisi parmi le kaempférol di-rhamnoside, le kaempférol-O-pentoside-O-rhamnoside, la quercétine-O-rhamnoside-O-hexoside, le kaempférol di-pentoside, la quercétine-O-pentoside, la quercétine-O-rhamnoside, le kaempférol-O-hexoside-O-rhamnoside le kaempférol-O-pentoside, le kaempférol-O-rhamnoside ou un de leurs mélanges.
Composition cosmétique, caractérisée en ce qu’elle comprend un extrait tel que défini dans l’une des revendications 11 à 14.
Composition cosmétique de la revendication 16, dans laquelle ledit extrait est utilisé à une concentration comprise entre 0,0005 % en poids et 10 % en poids du poids total de la composition.
Composition cosmétique de la revendication 16 ou 17, dans laquelle ladite composition est sous une forme adaptée à l’application topique.
Composition cosmétique de l’une quelconque des revendications 16 à 18, comprenant, en outre, au moins un autre composé tel qu’un agent actif, un composé hydratant, un conservateur.