FR3015523A1 - Signature moleculaire du lentigo actinique - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une signature moléculaire du lentigo actinique, comprenant les gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1, et diverses applications de cette signature. L'invention concerne notamment une méthode de caractérisation d'une tache pigmentaire apparente chez un être humain, comprenant la comparaison des niveaux d'expression, dans des échantillons de peau issue de ladite tache et de peau adjacente non lésée, des gènes. L'invention concerne également une méthode de prédiction, des méthodes d'évaluation de l'efficacité d'un traitement des taches pigmentaires, des méthodes cosmétiques et thérapeutiques de traitement des taches pigmentaires, ainsi que divers modulateurs desdits gènes et leur utilisation.

Description

- 1 - La présente invention est dans le domaine cosmétique, elle est relative à la peau. Elle s'inscrit plus généralement dans le cadre de la caractérisation des taches pigmentaires de la peau et du traitement du lentigo actinique. La couleur de la peau est principalement due à la présence d'un pigment, la mélanine, dans l'épiderme. La mélanine est synthétisée par des cellules dendritiques spécifiques localisées dans la couche basale de l'épiderme, les mélanocytes. La mélanogénèse prend place dans des organelles, les mélanosomes qui, chargés de mélanine, sont transférés aux cellules voisines épidermiques, les kératinocytes, via les dendrites. La couleur de la peau, ou pigmentation constitutive varie selon les individus en fonction de la quantité de mélanine produite ainsi que de la nature chimique des mélanines. Les mélanines sont des macromolécules formées à partir de tyrosine (eumélanine) ou de tyrosine et de cystéine (pheomélanine). Les mécanismes de synthèse mettent en jeu des enzymes dont les principales sont la tyrosinase et la protéine associée à la tyrosinase (Tyrp-1). Naturellement, la pigmentation de la peau est stimulée par l'exposition au soleil, c'est le phénomène de bronzage.

Il existe cependant des situations où le processus de pigmentation est altéré, et qui peuvent aboutir à des défauts de pigmentation, hypopigmentations (vitiligo, albinisme) ou à l'inverse à un excès de pigmentation, hyperpigmentations. Parmi les désordres hyperpigmentaires bénins, caractérisés par une accumulation anormale (hors bronzage) de mélanine, on peut citer le mélasma, les séquelles pigmentaires d'acné, la pigmentation post-inflammatoires, la dermite des prés, la pigmentation liée à la plante poison ivy et le lentigo actinique. Le lentigo actinique, également dénommé lentigo sénile ou solaire, tache sénile, tache de vieillesse, ou encore communément dénommé "crasse sénile", "marguerites de cimetière" ou "fleurs de cimetière", est de loin la plus fréquente des lésions pigmentaires. Le lentigo actinique est une tache pigmentaire cutanée non pathologique, bénignes, dont l'élimination n'est souhaitable que pour des raisons esthétiques et nullement pour des raisons thérapeutiques. Les irrégularités de pigmentation incluent les imperfections au niveau pigmentaire rendant le teint non uniforme ou la couleur de la peau non homogène. Ce type de lésions apparaît sur des zones de la peau qui ont été photoexposées, telles que le visage, le dos des mains, les membres supérieurs et notamment la face dorsale des avant- - 2 - bras, le dos, et en particulier le haut du dos. Elles touchent en général les individus à partir de 40 ans. Macroscopiquement, les lentigos actiniques sont représentés par des macules pigmentées bénignes de couleur brune plus ou moins foncée, dont les bords sont nets mais irréguliers. 5 De taille très variable, ils peuvent s'étendre de quelques millimètres à plus de deux centimètres. Malgré sa grande fréquence, peu d'études ont été publiées sur la physiologie et la pathogenèse des lentigos actiniques. Sur la base des rares études histologiques existantes, il est connu qu'il existe une augmentation de la charge mélanique épidermique globale et plus 10 particulièrement au niveau de la couche basale. Il existe également un allongement des crêtes épidermiques qui peuvent prendre un aspect en massue dans le derme papillaire [Montagna 1980, ber Rahman 1996, Andersen 1997, Cario-Andre 2004]. Le diagnostic différentiel du lentigo actinique s'effectue principalement grâce à un examen, à l'oeil nu, des caractéristiques macroscopiques de la lésion (taille, couleur, localisation 15 anatomique). Cependant, le lentigo actinique peut être facilement confondu visuellement avec d'autres types de lésions hyperpigmentaires : les éphélides (taches de rousseur), les séquelles pigmentaires d'acné, les hyperpigmentations post-inflammatoires, les carcinomes basocellulaires pigmentés, le mélasma, les lentigo de type tache d'encre (inkspot lentigo), les lentigos induits par la PUVA, les kératoses séborrhéiques pigmentées, les kératoses 20 actiniques pigmentées, le Lentigo Malin (Mélanose de Dubreuil), les acanthomea à cellules claires, les naevi, les mélanomes. Bien que certaines études décrivent des modifications moléculaires ou cellulaires dans le lentigo actinique, par des analyses de l'expression de gènes ou des protéines, comme la dérégulation au niveau génomique ou protéinique de gènes ou protéines étroitement associés aux mélanocytes et la mélanogénèse, ou impliqués dans 25 d'autres mécanismes tels que l'inflammation, la prolifération/différenciation de l'épiderme ou le métabolisme des acides gras(WO 2011091244, WO 2009140550, W02007126104, W02009110279, U520080153912, US626857, W0200809860, W02007083904, FR2009383, FR2890074, W02009113446, FR2930152), il existe un besoin de disposer de marqueurs biologiques permettant de caractériser, précisément et spécifiquement un lentigo 30 actinique. A ce jour, on ne dispose que de peu de marqueurs biologiques permettant de déterminer efficacement et précisément l'état d'un épiderme, et notamment de relier l'apparition du lentigo actinique à un dysfonctionnement de ses fonctions physiologiques. Il existe également un besoin de disposer d'un marqueur biologique qui puisse - 3 - être utilisé de manière fiable dans un procédé de diagnostic du lentigo actinique afin de le distinguer des autres pathologies. Les traitements actuels : Les troubles pigmentaires cutanés bénins sont généralement considérés comme inesthétiques. Du fait de l'association avérée entre l'apparition des lentigos actiniques et l'exposition chronique au soleil, la prévention de leur apparition passe en général par l'application topique de produits dits photoprotecteurs comme les écrans solaires. Dans le cas de traitements « curatifs », de nombreux procédés, principalement à visées cosmétiques, ont donc été développés afin de tenter de les éliminer ou de réduire leur présence. L'élimination ou la réduction de la présence de ces troubles repose, d'ordinaire, sur l'application de traitements dépigmentants, basés sur la réduction de l'activité de synthèse de la mélanine dans les mélanocytes. Les molécules dépigmentantes interfèrent avec une ou des étapes de la mélanogénèse. L'une des voies des principaux produits utilisés à ce jour repose sur l'inhibition de la tyrosinase, une des enzymes clés du processus de mélanogénèse. Le but de ces traitements est de diminuer voire de stopper la synthèse de pigment. Les principales substances dépigmentantes connues sont l'hydroquinone et ses dérivés, l'acide kojique, l'arbutine, les iminophénoles, l'acide ascorbique et ses dérivés, l'association de carnitine et de quinone, les dérivés d'amino-phénol, et les dérivés de benzothiazole, des extraits naturels, des corticoïdes. On trouve souvent aussi associés à ces actifs des exfoliants permettant d'augmenter la desquamation, et ainsi d'éliminer plus facilement la mélanine présente dans le stratum cornéum.

Une autre méthode de traitement non cosmétique consiste à détruire les lésions par des moyens physiques ou chimiques en utilisant les lasers ou les peelings. Cependant, ce sont des procédures assez lourdes qui ne s'attaquent pas à l'étiologie du désordre. Dans la majorité des cas, les lentigos actiniques réapparaissent quelques temps après le traitement.

De plus, il existe des inconvénients majeurs aux traitements existants. Les substances dépigmentantes peuvent présenter une certaine instabilité, une faible efficacité à faible concentration, une activité biologique touchant d'autres fonctions, des propriétés toxiques ou allergisantes. Il existe en plus une grande hétérogénéité de réponse aux différents traitements dépigmentants. Ainsi, pour un traitement donné, administré par exemple de façon topique, - 4 - un trouble pigmentaire cutané bénin donné, comme un lentigo actinique ou un mélasma, peut s'atténuer ou disparaître, alors qu'un autre n'évoluera pas. Cette variabilité peut être observée entre des lésions chez des individus différents mais aussi chez un même individu, entre différentes lésions. Il existe donc des troubles pigmentaires cutanés bénins pour lesquels aucun traitement topique n'est efficace à ce jour. Par conséquent, il existe également un besoin d'identification, de nouvelles cibles cosmétiques ou thérapeutiques pour le traitement du lentigo actinique.

Il existe également un besoin de disposer de nouveaux outils de criblage de molécules susceptibles d'exercer une action cosmétique sur le lentigo actinique. La présente invention a pour objet de satisfaire à l'ensemble de ces besoins.

La présente invention est relative à une signature moléculaire représentative des différences d'expression génique existant entre la peau issue du lentigo actinique et la peau saine adjacente, et aux différentes applications et méthodes faisant usage de la connaissance de cette signature, notamment pour moduler la pigmentation de la peau, dans le traitement cosmétique du lentigo actinique ou pour uniformiser le teint ou homogénéiser la couleur de la peau. Un premier objet de l'invention concerne ainsi une méthode in vitro ou ex vivo de caractérisation d'une tache pigmentaire cutanée chez un individu, Un deuxième objet de l'invention concerne une méthode de prédiction d'apparition d'un lentigo actinique chez un individu. Un troisième objet de l'invention concerne une méthode d'évaluation de l'efficacité d'un traitement du lentigo actinique chez un individu.

Un quatrième objet de l'invention concerne un procédé de sélection d'un composé utile et son utilisation dans la prévention et/ou le traitement du lentigo actinique. - 5 - Méthode de caractérisation d'une tache pigmentaire et méthode pour la prédiction de la formation de lentigo actinique, sénile ou solaire.

Les inventeurs ont en effet mis en évidence, une modulation significative et reproductible de l'expression des gènes HOXD10 (homeobox D10), HOXD11 (homeobox D11), PITX2 (paired-like homeodomain 2), ZIC2 (Zic family member 2 (odd-paired homolog, Drosophila)), CYP39A1 (cytochrome P450, family 39, subfamily A, polypeptide 1)' SLC1A6 (solute carrier family 1 (high affinity aspartate/glutamate transporter), member 6), et TRAM1L1 (translocation associated membrane protein 1-like 1) dans la peau lésionnelle présentant un lentigo actinique par rapport à la peau adjacente non lésionnelle. En effet le taux de modulation est supérieur à 1,5 pour les gènes HODX10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, surexprimés dans la peau présentant un lentigo actinique et inférieur à 0.67 pour les gènes CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 sous-exprimés dans la peau présentant un lentigo par rapport à la peau adjacente non lésée. Cette signature, constituée de 7 gènes, s'avère plus discriminative que les signatures existantes. La présente invention concerne donc notamment une méthode in vitro ou ex vivo de 20 caractérisation d'une tache pigmentaire cutanée chez un individu, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : a) mesurer le niveau d'expression ou d'activité du produit d'expression des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 dans des échantillons provenant d'une peau issue de ladite tache 25 b) mesurer le niveau d'expression ou d'activité du produit d'expression desdits gènes dans des échantillons de peau adjacente non lésée, c) comparer les niveaux d'expression ou d'activité du produit d'expression desdits gènes mesurés aux étapes a) et b) d) en déduire que ledit individu présente un lentigo quand le rapport entre le niveau 30 d'expression ou d'activité du produit d'expression desdits gènes dans l'échantillon de peau issue de la tache mesuré à l'étape a), et le niveau d'expression ou d'activité du produit d'expression desdits gènes dans l'échantillon de peau adjacente non lésée mesuré à l'étape b) est : - 6 - - Supérieur à 1,5 si le gène est choisi parmi HOXD10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, et - Inférieur à 0,67 si le gène est choisi parmi CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1.

Par niveau d'expression d'un gène ou produit d'expression d'un gène, on entend préférentiellement, dans la présente description, le niveau de transcription dudit gène. Cependant, son niveau d'expression peut également se traduire par son niveau de traduction, à supposer toutefois qu'il s'agisse d'un gène codant pour une protéine. Tel est le cas pour les gènes de l'invention.

Une telle méthode permet entre autres de confirmer de manière fiable si la tache pigmentaire est un lentigo actinique dans le cas où cette dernière est déjà apparente, par exemple visuellement à l'oeil nu. Les taches pigmentaires cutanées concernées sont des taches hyperpigmentaires, ou encore 15 dites hyperpigmentées, correspondant à un excès de pigment. Les taches pigmentaires dont il est question sont préférentiellement des taches pigmentaires de la peau humaine. Lesdits gènes s'entendent des gènes humains dénommés ainsi. 20 Au sens de la présente invention, on entend par « peau lésionnelle », la peau présentant une tache pigmentaire cutanée. Par « peau non lésée » ou « peau non lésionnelle » au sens de l'invention, on entend de 25 préférence une peau adjacente aussi proche que possible de la tache mais à une distance suffisante pour que l'échantillon prélevé ne contienne aucune cellule susceptible d'appartenir à la tache pigmentaire. De préférence, la peau adjacente non lésée est une peau ayant une exposition à la lumière et au soleil comparable à la peau présentant la tache pigmentaire. Alternativement, la peau non lésée peut provenir d'une zone symétrique sur l'autre partie du 30 sujet, ayant un emplacement parfaitement identique ; par exemple dans le cas d'une tache sur la main gauche, la peau non lésée peut être la zone correspondante sur la main droite. Dans ce cas, la peau non lésée n'est pas à proprement parler une peau adjacente. Par non lésée, on entend une zone qui ne possède pas de tache pigmentaire, ni d'irrégularité pigmentaire, de préférence une zone homogène en terme de pigmentation. Du fait que la - 7 - zone non lésée sert de référence, elle doit dans tous les cas être aussi comparable que possible à la zone de la tache, mais dépourvue de défaut pigmentaire. La mise en oeuvre de la méthode selon l'invention conduit à la conclusion que la tache supposée ou observée est un lentigo actinique, sénile ou solaire si le rapport entre le niveau d'expression des gènes dans la peau issue de la tache, ou dans l'échantillon de peau issue de la tache, et le niveau d'expression dans la peau adjacente non lésée, ou dans l'échantillon de peau adjacente non lésée, est - Supérieur ou égal à 1,5 si le gène est choisi parmi HODX10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, et - Inférieur ou égale à 0.67 si le gène est choisi parmi CYP39A1, SLC1A6 et TRAIVI1L1. Par ailleurs, les présents inventeurs ont également mis en évidence la modulation différentielle d'autres gènes entre de la peau issue d'une tache pigmentaire et de la peau non lésée, de préférence adjacente. Les inventeurs ont notamment mis en évidence la modulation des gènes suivants: CHL1, BEX2, DLX1, HOXB7, PI3, AMDHD1, BCHE, NMNAT3, NELL2, BTC, PON3, SLC47A2, SLC8A1. Par conséquent, la méthode de caractérisation selon la présente invention peut comprendre également la comparaison des niveaux d'expression au sein de la peau issue de ladite tache et au sein de la peau non lésée, de préférence adjacente, des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1,SLC1A6 et TRAM1L1 et d'au moins un gène choisi parmi la liste des gènes suivants : CHL1, BEX2, DLX1, HOXB7, PI3, AMDHD1, BCHE, NMNAT3, NELL2, BTC, PON3, SLC47A2, SLC8A1.

Des gènes préférés au sein de la seconde liste de gènes sont les gènes AMDHD1, NMAT3, PON3, SLC47A2, SLC8A1. Si un gène supplémentaire, ou plusieurs, est choisi parmi les gènes CHL1, BEX2, DLX1, HOXB7, PI3, AMDHD1, BCHE, NMNAT3, NELL2, BTC, PON3, SLC47A2, SLC8A1, alors la méthode de caractérisation conduit à confirmer que la tache supposée ou observée est un lentigo actinique si le rapport entre le niveau d'expression des gènes dans la peau issue de la tache, ou dans l'échantillon de peau issue de la tache, et le niveau d'expression dans la peau adjacente non lésée, ou dans l'échantillon de peau adjacente non lésée, est : - supérieur à 1,2 si le gène est choisi parmi DLX1, HOXB7 et PI3 et - 8 - - inférieur à 0.83 si le gène est choisi parmi CHL1, BEX2, AIVIDHD1, BCHE, NMNAT3, NELL2, BTC, PON3, SLC47A2 et SLC8A1. Les niveaux d'expression sont avantageusement normalisés à l'aide des niveaux 5 d'expression des gènes codant pour la protéine ribosomale L13a (RPL13A), la beta-2- microglobuline (B2M), la protéine ribosomale S9 (RPS9), la protéine ribosomale S28 (RPS28) et la Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogénase (GAPDH). 10 La méthode décrite est également une méthode pour la prédiction de la formation de lentigo actinique chez un individu, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : a) mesurer le niveau d'expression ou d'activité du produit d'expression des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 dans des échantillons provenant d'une peau prédisposée 15 b) comparer le niveau de d'expression des gènes mesurés à l'étape a) avec le niveau d'expression desdits gènes dans des échantillons de peau non prédisposée, et c) Prédire que ledit individu présente un risque d'apparition d'un lentigo quand le rapport entre le niveau d'expression des gènes dans les échantillons provenant d'une peau prédisposée et le niveau d'expression dans les échantillons provenant 20 d'une peau non prédisposée est : - supérieur ou égale à 1,2 si le gène est choisi parmi HOXD10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, et - inférieur ou égale à 0,83 si le gène est choisi parmi CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1. 25 Selon cette mise en oeuvre, le niveau d'expression des gènes de l'invention est comparé dans un échantillon de peau prédisposé, à son niveau d'expression dans la peau non prédisposé. 30 Au sens de l'invention par « peau prédisposée », on entend la peau ayant une exposition chronique à la lumière et au soleil telle que la peau des mains, du visage, du dessus des bras et particulièrement la peau des mains et du visage. - 9 - Au sens de l'invention « par peau non prédisposée », on entend la peau d'une zone corporelle notoirement dépourvue de taches ou bien des zones peu enclines à la formation de taches pigmentaires et/ou ayant une faible exposition à la lumière et au soleil telle que la peau du dessous des bras, la peau du creux poplité et la peau des fesses. Une modulation significative du niveau d'expression dans la peau prédisposée par rapport à la peau non prédisposée, n'ayant pas été exposée au soleil, permet de conclure que la peau du sujet testé est encline à la formation de taches cutanées telles que le lentigo actinique, sénile ou solaire. Echantillons : Les échantillons sont par exemple prélevés via des méthodes de biopsie ou de stripping. 15 Ces strippings sont des surfaces collantes appliquées à la surface de l'épiderme comme le Blenderm® de 3M, le D' squam (adhésif commercial de CuDERM), la colle cyanoacrylate ou la méthode du « stripping » vernis. Grâce à ces « strippings », les cornéocytes adhérents et le contenu de leurs espaces intercellulaires peuvent être prélevés et soumis par la suite à une extraction permettant d'avoir accès au contenu cellulaire. 20 Le prélèvement d'un échantillon convenant à un procédé de l'invention peut aussi être effectué de façon plus directe par « lavage » de la surface cutanée, au moyen par exemple d'accessoires de type turbine à ailette, ou simplement par ajout/prélèvement d'une goutte de tampon à la surface de la peau. 25 A titre indicatif, d'autres méthodes de prélèvement adaptées à la mise en oeuvre de l'invention peuvent être mentionnées, telles que des méthodes par grattage de la partie supérieure du stratum corneum au moyen d'un système bilames. Cette technique permet de recueillir des squames qui peuvent ensuite être directement analysés. 10 30 La méthode selon l'invention est de préférence pratiquée in vitro ou bien ex vivo. -10- Mesure de l'expression des gènes ou de l'expression et/ou de l'activité du produit desdits gènes : Par niveau d'expression d'un gène, on entend préférentiellement, dans la présente 5 description, le niveau de transcription dudit gène. Cependant, son niveau d'expression peut également se traduire par son niveau de traduction, à supposer toutefois qu'il s'agisse d'un gène codant pour une protéine. Tel est le cas pour les gènes de l'invention. Les niveaux d'expression d'au moins l'un des gènes de l'invention peuvent être évalués par 10 référence ou après normalisation avec le niveau d'expression d'autres gènes, dont le niveau d'expression est supposé sensiblement identique au sein de la tache et dans la zone de peau non lésée choisie. De tels gènes pour la normalisation sont bien connus de l'homme du métier et peuvent dépendre de la zone du corps où se trouve la tache. A titre d'exemple, les gènes suivants peuvent être cités comme susceptibles de servir à la normalisation des 15 niveaux d'expression des gènes de l'invention, codant pour : La protéine ribosomale L13a (RPL13A), la beta-2-microglobuline (B2M), la protéine ribosomale S9 (RPS9), la protéine ribosomale S28 (RPS28) et la Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogénase (GAPDH). 20 Concernant l'évaluation du niveau de transcription du gène choisi, elle peut être réalisée par différentes manières bien connues de l'homme du métier, directement ou bien après transcription inverse. Le niveau de transcription peut notamment être évalué par l'utilisation de puces à ARN ou puces à ADN vendues dans le commerce à cet effet. A titre d'exemple de méthodes convenant à l'invention, il peut être fait mention 25 de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), quantitative (Q-PCR) ou non, en présence ou non de transcriptase inverse (RT-PCR ou Q-RT-PCR), du Northern-blot, des méthodes d'hybridation in situ. A titre d'exemple d'agents convenant à la détection d'une séquence d'acides nucléiques de l'invention, et en particulier d'une séquence d'ARNm, il peut être fait mention 30 de sondes d'acides nucléiques marquées pouvant s'hybrider à une séquence d'acides nucléiques de l'invention. Une telle sonde d'acide nucléique peut être aisément obtenue par toute méthode connue de l'homme de l'art.

L'expression d'une séquence d'acide nucléique peut également être déterminée, de manière indirecte, par la détermination de l'expression de la séquence d'acides aminées codée par ladite séquence, au moyen de toute technique connue dans le domaine, telle que le Western-Blot, l'ELISA, la méthode de BRADFORD ou de LOWRY, ou comme indiqué ci- après. La mesure qualitative ou quantitative, de l'expression, de la maturation, ou de l'activité d'une séquence d'acides aminés, d'une protéine, de l'invention peut être effectuée au moyen de toute méthode connue de l'homme de l'art. A titre de méthodes de détection de l'expression du produit des gènes, plus particulièrement de l'expression des protéines traduites à partir du transcrit des gènes, de la maturation, ou de l'activité d'une séquence d'acides aminés, il peut être fait mention du Western-blot, du Slot-blot, du Dot-blot, des méthodes ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), de l'immunofluorescence, de méthodes immunohistochimiques en microscopie classique, électronique ou confocale, de FRET (fluorescence resonance energy transfer/transfert d'énergie par résonance de fluorescence), des méthodes de TR-FRET (time resolved FRET/FRET en résolution de temps), des méthodes de FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy/imagerie par microscopie en temps de fluorescence), des méthodes de FSPIM (fluorescence spectral imaging microscopy/imagerie par microscopie en spectre de fluorescence), des méthodes de FRAP (fluorescence recovery after photobleaching/recouvrement de fluorescence après photoblanchiment), des méthodes par gène rapporteur, des méthodes d'AFM (atomic force microscopy/microscopie par force atomique), des méthodes de résonance plasmonique de surface, des méthodes de microcalorimétrie, des méthodes de cytométrie en flux, des méthodes de biosenseurs, des méthodes de radioimmuno-essais (RIA), des méthodes de focalisation isoélectrique, et des tests enzymatiques, des méthodes mettant en oeuvre des puces à peptides, des puces à sucre, des puces d'anticorps, des méthodes de spectrométrie de masse, des méthodes de spectrométrie de type SELDI-TOF (Ciphergen). De façon plus générale, des méthodes de dosage immunoenzymatiques à partir de solutions de protéines, plus quantitatives et sensibles peuvent en particulier être utilisées.

Ces méthodes de type ELISA associent des couples d'anticorps de capture et de détection spécifique de l'antigène ciblé. Des anticorps commerciaux ou des anticorps polyclonaux, monoclonaux ou recombinants développés spécifiquement peuvent être utilisés. Des techniques ELISA multiplexes de grande capacité peuvent également être mises en oeuvre. On peut ainsi citer l'approche multiplexe de type anticorps sur billes Luminex (par exemple -12- Bioplex de Bio-Rad), de type anticorps sur surface plane (« antibodies-arrays ») (par exemple approche proposée par la société MesoScale Discovery). On peut aussi citer la technologie sur cartouche microfluidique mise au point par la société Coréenne NanoEntek. Dans une approche récente une technique nouvelle basée sur des anticorps appelés «Quenchbodies» proposés par la société japonaise Ushio permet de n'utiliser qu'un anticorps. En particulier, il peut être avantageux de détecter l'expression d'une séquence d'acides aminés de l'invention au moyen d'un anticorps, le cas échéant sous une forme marquée. Un tel anticorps peut être marqué au moyen d'une substance détectable directement 10 ou détectable par réaction avec un autre réactif. Par « anticorps », on entend désigner de manière générale des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, ainsi que des fragments d'immunoglobuline susceptibles de lier un antigène et qui peuvent être produits par toute technique de génie génétique connue de l'homme de l'art ou par coupure enzymatique ou chimique d'anticorps intact. 15 Un anticorps susceptible d'être utilisé à titre d'outil d'évaluation d'un état d'un épiderme peut être obtenu par tout procédé connu de l'homme de l'art, tel que décrit dans « Antibodies: A Laboratory Manual », Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Selon un mode de réalisation préféré, il peut être avantageux de détecter 20 l'expression d'une séquence d'acides aminés de l'invention au moyen d'une méthode protéomique différentiel « iTRAQ ». Une telle méthode est connue de l'homme de l'art et peut avantageusement être mise en oeuvre comme décrit dans les exemples ci-après. 25 Méthode d'évaluation de l'efficacité d'un traitement. La présente invention concerne également, selon un second aspect, une méthode 30 d'évaluation de l'efficacité d'un traitement du lentigo actinique, utilisant la signature mise en évidence par les inventeurs. Le traitement évalué peut être un traitement visant l'atténuation du lentigo actinique pour notamment uniformiser le teint, homogénéiser la couleur de la peau ou lutter contre les dyschromies. Selon une première mise en oeuvre, cette méthode d'évaluation comprend une étape de comparaison des niveaux d'expression dans la peau -13- issue du lentigo actinique, des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1,SLC1A6 et TRAM1L1 avant et après traitement. Il est important de noter également que la méthode selon l'invention implique la comparaison des niveaux d'expression d'au moins l'un des gènes de l'invention avant et après traitement. De ce fait, il peut être suffisant d'évaluer quantitativement ou qualitativement la différence entre les deux niveaux d'expression, sans pour autant évaluer et quantifier individuellement chacun des niveaux d'expression.

Selon cette méthode d'évaluation, la comparaison des niveaux d'expression du ou des gènes choisis est réalisée de manière préférée au sein de la peau issue du lentigo actinique ou bien au sein d'un échantillon correspondant, avant et après traitement. Dans ce cas il n'y a donc pas de comparaison à un niveau d'expression au sein de peau saine non lésée. Comme pour la méthode de caractérisation selon le premier aspect de l'invention, les niveaux d'expression sont avantageusement normalisés à l'aide des niveaux d'expression des gènes codant pour la protéine ribosomale L13a (RPL13A), la beta-2-microglobuline (B2M), la protéine ribosomale S9 (RPS9), la protéine ribosomale S28 (RPS28) et la Glyceraldehyde3-phosphate dehydrogénase (GAPDH). Par la méthode d'évaluation telle que décrite, un traitement donné est considéré comme efficace pour le traitement du lentigo actinique si le niveau d'expression est : - significativement inférieur après traitement par rapport au niveau d'expression avant traitement, si le gène est choisi parmi HODX10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, et - significativement supérieur après traitement par rapport au niveau d'expression avant traitement, si le gène est choisi parmi CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1.

Selon une autre mise en oeuvre, la méthode d'évaluation de l'efficacité d'un traitement du lentigo actinique comprend la caractérisation d'une tache pigmentaire selon la méthode de l'invention décrite ci-dessus et la comparaison, avant et après traitement, des différences de niveaux d'expression observées entre la peau lésée de la tache et la peau adjacente non lésée.

Selon cette mise en oeuvre de l'évaluation de l'efficacité d'un traitement, le traitement est considéré comme efficace si la différence entre les niveaux d'expression des gènes dans la peau lésée issue de la tache et dans la peau non lésée est moindre après traitement par rapport à ce qu'elle était avant le traitement, c'est-à-dire si le rapport entre les niveaux d'expression des gènes dans la peau lésée issue de la tache et dans la peau non lésée est : -14- - significativement inférieur après traitement par rapport à sa valeur avant traitement, si le gène est choisi parmi HODX10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, et - significativement supérieur après traitement par rapport à sa valeur avant traitement, si le gène est choisi parmi CYP39A1, SLC1A6 et TRAIVI1L1.

Par « significativement inférieur » au sens de l'invention, on entend une diminution d'au moins 20%, et de préférence de 50%, de manière encore plus préférée de 70 % et préférentiellement de 100% de la surexpression du gène ou de la surexpression du produit du gène. Par « significativement supérieur » au sens de l'invention, on entend une diminution d'au 10 moins 20%, et de préférence de 50%, de manière encore plus préférée de 70 % et préférentiellement de 100% de la sous-expression du gène ou de la sous-expression du produit du gène. Une diminution de 100% de la sur-expression ou de la sous-expression du gène signifie que le niveau d'expression du gène dans la peau lésée issue de la tache après traitement est 15 identique au niveau d'expression du gène dans la peau non lésée. Un traitement sera considéré comme sans effet si les niveaux d'expression du gène choisi, avant et après traitement, sont sensiblement identiques, ou bien si les différences observées ne sont pas significatives. Quand il est comparé les niveaux d'expression de plus d'un gène, le traitement est considéré 20 comme efficace pour le traitement du lentigo actinique si, pour la majorité des gènes testés, et de préférence pour l'ensemble des gènes testés, pris individuellement, le traitement est considéré comme efficace. Pour les autres gènes choisis, le traitement doit de préférence être sans effet, mais non avoir l'effet inverse. Quand il est comparé les niveaux d'expression de plus d'un gène, il est de préférence conclu 25 à l'efficacité du traitement quand pour la majorité des gènes choisis, et de préférence pour l'ensemble des gènes choisis, pris individuellement, on peut conclure à un traitement efficace. Le traitement considéré, évalué par la méthode de l'invention, n'est pas limité à un type particulier de traitement. Il peut s'agit d'un traitement par une molécule chimique, un actif, 30 un extrait naturel, notamment une huile essentielle, un acide nucléique, notamment un ARN interférent, un complexe protéique ou tout autre molécule ou combinaison de molécules. Il peut également s'agir d'un traitement par un moyen physique ou des ondes, notamment électromagnétiques. Il s'agit de préférence d'un traitement topique. -15- Le traitement testé peut viser à atténuer ou faire disparaitre le lentigo actinique, sénile ou solaire, à uniformiser le teint, à homogénéiser la couleur de la peau ou à atténuer les dyschromies. Des traitements particulièrement préférés dans le cadre de cette invention sont des 5 traitements cosmétiques, plus particulièrement des traitements topiques cosmétiques. Par les méthodes de l'invention, il est également possible d'évaluer l'efficacité de la combinaison de plusieurs traitements. Il est en effet possible d'évaluer des combinaisons permettant au mieux de restaurer les niveaux d'expression d'un, de plusieurs ou de tous les gènes de l'invention, tels qu'ils sont exprimés au sein de peau non lésée. 10 Par les méthodes d'évaluation décrites ci-dessus, il est possible d'évaluer l'efficacité d'un nouveau traitement envisagé, ou bien également de quantifier ou qualifier l'efficacité de traitements déjà existants contre les taches pigmentaires. Par ce biais, il peut aussi être envisagé des combinaisons de traitements susceptibles d'être particulièrement efficaces, synergiques ou complémentaires. 15 L'échantillon de peau provient de préférence d'un être humain, de préférence âgé d'au moins quarante ans, de préférence d'au moins cinquante ans, voire au moins soixante ans. La méthode d'évaluation de l'efficacité d'un traitement selon la présente invention est de préférence mise en oeuvre in vitro ou ex vivo. Elle peut également être mise en oeuvre in vivo. 20 Il est souhaitable que l'échantillon de peau avant traitement et après traitement soit prélevé à partir de la même tache pigmentaire, ou bien d'une tache pigmentaire très proche si la taille de la tache ne permet pas d'obtenir aisément des échantillons avant et après traitement. La présente invention concerne également une méthode in vitro ou ex vivo d'évaluation de 25 l'efficacité d'un traitement du lentigo actinique ; une telle méthode comprend la comparaison, avant et après traitement, du niveau d'expression dans un modèle cellulaire représentatif de la peau, des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L 1. Le modèle cellulaire peut être de tout type considéré comme approprié par l'homme du 30 métier. Il peut s'agir notamment de modèles cellulaires mono ou co-cultures, ou bien de modèles tridimensionnels de peau reconstruite, ou bien de peau cultivée ex-vivo. Il existe également des modèles cellulaires représentatifs de taches pigmentaires, plus particulièrement de lentigos actiniques, qui peuvent être utilisés dans le cadre de cette méthode. De tels modèles cellulaires n'ont pas besoin de mimer les taches pigmentaires (ou -16- le lentigo) dans leur globalité mais doivent mimer des évènements biologiques, des caractéristiques morphologiques ou pigmentaires observés dans les taches pigmentaires, notamment le lentigo. De tels modèles in vitro sont bien connus de l'homme du métier. Par ailleurs, au moyen de ces méthodes d'évaluation, il est possible de promouvoir un 5 traitement auprès de consommateurs, en mettant en avant les résultats obtenus avec ce traitement dans les méthodes d'évaluation de l'efficacité décrites dans la présente invention. La présente invention fournit donc également une méthode permettant de recommander un produit en signalant son effet dans un protocole de test constitué par une méthode d'évaluation de l'efficacité telle que décrite précédemment. L'invention a donc également 10 pour objet une méthode pour la promotion d'un produit cosmétique ou traitement cosmétique consistant à faire état d'une efficacité, action ou propriété dudit produit ou traitement, démontrée par au moins une méthode opérée telle que décrite précédemment. Par ailleurs, une méthode cosmétique selon l'invention est avantageusement mise en oeuvre 15 après la caractérisation de la tache pigmentaire que l'on souhaite traiter par une méthode selon le premier aspect. En effet, cette première étape permet de caractériser la tache et donc de détecter les gènes dont le niveau d'expression est fortement modulé entre la zone de la tache et une zone non lésée, de préférence adjacente. Il est ensuite possible d'adapter un traitement qui permette d'agir sur le ou les gènes de l'invention qui sont modulés 20 différentiellement au sein de cette tache, en appliquant spécifiquement des modulateurs pour lesdits gènes. 25 Procédé de sélection d'un composé utile dans la prévention et/ou le traitement du lentigo actinique. Les inventeurs ont montré le rôle important des gènes de l'invention au niveau du lentigo actinique, et notamment le lien entre dérégulation du niveau d'expression de ces gènes et la 30 présence du lentigo actinique. De ce fait, suspendre ou diminuer la modulation de ces gènes peut permettre de diminuer ou abolir les dérégulations observées et ainsi permettre de restaurer une situation compatible avec l'absence de lentigo actinique, avec un teint uniforme et une couleur de peau homogène. -17- La présente invention concerne donc également un procédé de sélection d'un composé utile dans la prévention et/ou le traitement du lentigo actinique comprenant la mise en oeuvre d'une des méthodes décrites précédemment pour déterminer l'efficacité d'un traitement à base de cette molécule.

Ce procédé de sélection d'un composé utile dans la prévention et/ou le traitement du lentigo actinique, comprend les étapes suivantes : a) Mesurer dans un échantillon de peau et/ou un modèle cellulaire représentatif de la peau le niveau d'expression ou de l'activité du produit d'expression d'au moins un gène parmi la liste constituée des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 b) Mettre ledit composé à sélectionner en contact avec ledit échantillon de peau et/ou ledit modèle cellulaire représentatif de la peau c) Mesurer le niveau d'expression ou de l'activité du produit d'expression d'au moins un gène choisi parmi la liste constituée des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1, d) Comparer les mesures des étapes a) et c) e) Sélectionner en tant que composé utile dans la prévention et/ou le traitement du lentigo, un composé capable d'augmenter le niveau d'expression ou l'activité d'au moins un gène choisi parmi CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 et/ou de diminuer le niveau d'expression ou l'activité d'au moins un gène choisi parmi HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2. Il est de préférence choisi plus d'un gène au sein des gènes de l'invention, par exemple au moins deux gènes, au moins trois, quatre, cinq, six, sept. Selon une mise en oeuvre, la méthode cosmétique a pour but de moduler le niveau d'expression de l'intégralité des gènes de l'invention. La méthode cosmétique selon l'invention a pour but de restaurer des niveaux d'expression proches de ceux qui sont observés au sein de la peau saine, adjacente par exemple d'une tache pigmentaire. Dans un tel cas, la modulation recherchée dans les méthodes cosmétiques selon l'invention est une inhibition, totale, partielle ou temporaire, de l'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes HODX10, HOXD11, PITX2 et ZIC2 ou bien une augmentation, éventuellement temporaire de l'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1. De préférence, l'inhibition n'est pas une inhibition - 18 - totale, mais partielle, tendant à diminuer le niveau d'expression du gène choisi eans pour autant inhiber entièrement son expression. Par augmentation ou diminution du niveau d'expression, il est inclus l'augmentation ou la diminution du niveau de transcription desdits gènes, et l'augmentation ou la diminution du niveau de traduction desdits gènes, ainsi que l'augmentation ou la diminution de l'activité des protéines codées par ces gènes. Elle consiste à évaluer des composés sur leur pouvoir d'inhibition ou d'augmentation de l'expression des gènes cités et/ou de l'expression ou l'activité des produits protéiques desdits gènes et à sélectionner en tant que facteurs permettant de prévenir, ou traiter le lentigo 10 actinique. La vérification de l'efficacité des composés peut être réalisés sur des modèles cellulaires mono ou co cultures, ou des modèles tri dimensionnels de peau reconstruite, ou de la peau ex vivo. Parmi les modulateurs négatifs des protéines on pourra citer notamment des inhibiteurs de synthèse, et/ou de la sécrétion et/ou activateur de la dégradation des protéines retrouvés 15 surexprimés dans le lentigo. A l'inverse parmi les modulateurs positifs, on pourra citer des stimulants de synthèse, des inducteurs de sécrétion ou des inhibiteurs de la dégradation des protéines sous exprimés dans le lentigo. De préférence, concomitamment à la modulation du niveau d'expression recherché pour les 20 gènes de l'invention, une méthode cosmétique selon l'invention comprend de préférence également la modulation d'au moins un autre gène, choisi parmi les gènes CHL1, BEX2, DLX1, HOXB7, PI3, AMDHD1, BCHE, NMNAT3, NELL2, BTC, PON3, SLC47A2, SLC8A1,. Des gènes préférés au sein de cette seconde liste de gènes sont les gènes AMDHD1, NMAT3, PON3, SLC47A2, SLC8A1. 25 Les modulations appliquées, s'il s'agit d'un lentigo actinique, sénile ou solaire sont l'augmentation du niveau d'expression pour les gènes CHL1, BEX2 AMDHD1, BCHE, NMNAT3, NELL2, BTC, PON3, SLC47A2, SLC8A1, et la diminution du niveau d'expression pour les gènes DLX1, HOXB7, PI3. Une méthode cosmétique selon la présente invention comprend donc l'application d'un 30 produit, notamment molécule chimique, extrait naturel, actif, acides nucléiques, peptides, ou d'un traitement modulant le niveau d'expression ou l'activité du produit d'expression d'au moins un des gènes de l'invention. S'il s'agit d'un produit, il est de préférence appliqué de façon topique. -19- Utilisation d'un modulateur de l'expression ou du produit d'expression des gènes La présente invention concerne également l'utilisation d'un modulateur du niveau d'expression ou de l'activité du produit d'expression d'au moins un gène choisi parmi la liste constituée des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1, 5 pour une application cosmétique dans le traitement du lentigo actinique. Pour le traitement du lentigo actinique, le modulateur dont il est fait usage est un inhibiteur d'au moins un gène ou du produit d'expression d'au moins un gène choisi parmi HODX10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, ou bien un activateur d'au moins un gène ou du produit d'expression d'au moins un gène choisi parmi CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1. De 10 préférence, l'inhibiteur est un inhibiteur partiel conduisant à la diminution du niveau d'expression ou à la diminution de l'activité du produit d'expression dudit gène, sans pour autant abolir entièrement l'expression ou l'activité de ce gène. Les agents modulateurs selon l'invention peuvent par exemple être une molécule 15 biologique, ou une petite molécule chimique organique ou inorganique. Le modulateur peut être choisi parmi un des inhibiteurs de promoteurs des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2 ou un activateur de promoteurs des gènes CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1. Lorsque l'agent modulateur est « inhibiteur », ledit agent modulateur peut aussi être 20 un anticorps monoclonal ou polyclonal, en particulier un anticorps bloquant, un aptamère, un oligonucléotide antisens (ADN), un ARN interférent, en particulier siRNA, shRNA, miRNA, dsRNA. Un oligonucléotide anti-sens ou un ARN interférent peut être aisément préparé par 25 l'homme du métier. En effet, ces acides nucléiques sont ou comprennent une séquence complémentaire de l'ARNm du gène dont l'expression doit être inhibée, et ils empêchent la traduction de l'ARNm ou induisent sa dégradation spécifique. 30 Des modulateurs tels que décrits peuvent être utilisés dans les méthodes cosmétiques selon l'invention en association avec des modulateurs des gènes CHL1, BEX2, DLX1, HOXB7, PI3, AMDHD1, BCHE, NMNAT3, NELL2, BTC, PON3, SLC47A2, SLC8A1. Des combinaisons de gènes préférées ont déjà été décrites. -20- Parmi les modulateurs connus de l'expression ou du produit d'expression des gènes définis selon l'invention, on peut citer la trétinoïne, la carbamazepine, les acides gras de type oméga 3, l'acide valproïque, la caféine, la troglitazone, la Triiodothyronine, l'acétaminophène ; l'huile de palme, la vitamine E, la génistéine, l'adldéhyde cinnamique, le calcitriol, la Norepinephrine, la Phenylephrine ou bien une association de ces modulateurs. Les modulateurs peuvent être utilisés en association avec d'autres produits, actifs ou excipients. De préférence, ils sont conditionnés sous une forme adaptée à une application topique, par exemple sous forme de pommade, de crème ou d'onguent.

Les diverses mises en oeuvre détaillées dans la section relative aux méthodes cosmétiques selon l'invention sont applicables aux utilisations pour les applications cosmétiques décrites ci-dessus. Les modulateurs selon l'invention peuvent être utilisés notamment dans des applications cosmétiques en vue d'uniformiser le teint, d'homogénéiser la couleur de la peau ou de lutter 15 contre les dyschromies. Exemples : Partie expérimentale : 20 Matériel et méthodes Sélection clinique 2 études indépendantes ont été réalisées : une étude sur des volontaires de type caucasien (étude France) et une étude sur des volontaires de type asiatique (étude Japon). 25 Etude France : 15 volontaires, de sexe féminin, phototypes II à IV, âgées de 51 à 67 ans ont été sélectionnées. Etude Japon : 12 volontaires, de sexe féminin, phototypes III à IV, âgées de 57 à 70 ans ont été sélectionnées. 30 Les lentigos actiniques sont choisis sur le dos de la main, de taille minimum 3mm. Ils sont caractérisés par Epiluminescence. Cet examen permet : 1°) de vérifier le diagnostic clinique de la lésion (lentigo actinique exclusivement) selon les critères de pattern de la jonction dermo-épidermique (structure pigmentée en réseau, « fingerprint-like structure ») à différencier des éphélides (absence de structure pigmentée - 21 - en réseau, pigmentation homogène et zones de « moth-eaten edges ») et des kératoses séborrhéiques planes (multiple milia-like cysts or pseudocysts, zones de « moth-eaten edges », pseudofollicular openings et fingerprint-like pattern) [Menzies et al ; Stolz et al ; Marghoob et al] 2°) de délimiter des zones homogènes en terme de structure/pattern à l'intérieur de ces lésions où seront faites les biopsies cutanées, 3°) d'établir un score phénotypique basé sur une analyse d'image quantitative avec le logiciel spécifique qui a été développé sur Matlab® (logiciel SQA, CMLA, ENS Cachan, UM R CNRS 8536).

Deux biopsies de 3mm de diamètres sont réalisées sur une des mains de chaque patient. Pour chaque volontaire, une des biopsies correspond à la lésion de lentigo actinique (LA) et l'autre à une zone adjacente de peau non lésionnelle (PN) (vérifiée également en épiluminescence). Les biopsies de 3mm sont placées, dès le prélèvement, dans une solution de stabilisation des 15 ARN (RNAlater, Qiagen référence 76154) de 16 à 24h à 4°C. Le lendemain les échantillons sont placés à -20°C jusqu'aux étapes d'homogénéisation et d'extraction. Extraction des ARN A la décongélation, les échantillons sont découpés au scalpel pour faciliter 20 l'homogénéisation, puis transférés dans le tampon de lyse (Qiagen lysis buffer, RLT + 10% beta-Mercapthoethanol). Etude France : L'homogénéisation est réalisée dans un potter (Fisher Labosi ref A6391000) avec des pistons en polypropylène RNase free (Fisher Labosi ref A1419753). Etude Japon : L'homogénéisation est réalisée avec le TissueRuptor de Qiagen (ref 990890). 25 L'ARN a été extrait avec les kits RNeasy micro (Qiagen ref : 74004) en suivant les instructions du fournisseur. Etude France : La quantification des ARNs est réalisée par un dosage ribogreen (Molecular Probes réf R11490). 30 Etude Japjn : La quantification des ARNs est réalisée par spectrophotométrie (Nanodrop 8000). La qualité des ARN est validée avec un bio analyseur Agilent 2100 qui donne le ratio des intensités des ARNs ribosomaux 28S sur 18S ainsi qu'un RNA Integrity Number (RIN) qui -22- tient compte de la dégradation des ARNs. Un ARN de bonne qualité a un ratio >1,5 et un RIN > 7. - Préparation des sondes et hybridation Une réaction de reverse transcriptase (RT) est réalisée pour obtenir les ADNc correspondants. Pour l'étude France une étape d'amplification des ADNc est réalisée. Les ADNc sont ensuite marqués par des fluorochromes (Affymetrix labelling kit) et hybridés sur puces à ADN Affymétrix® permettant de révéler le niveau d'expression de l'ensemble des gènes du génome humain. (bio-puces à ADN de type Affymetrix U133A 2.0 contenant 54 000 sondes, permettant ainsi l'étude de l'expression de 47000 transcripts, incluant 38500 gènes caractérisés). Le logiciel Affymetrix RMA a été utilisé pour générer les fichiers bruts et pour effectuer les contrôles qualité des deux études avant une analyse des données. Après révélation des hybridations spécifiques et traitement des données brutes (extraction, soustraction du bruit de fond, normalisation), l'expression des gènes est comparée entre la peau saine et la peau lésée. Etude France : 2 puces Affymetrix HG U133 Plus 2 ont été hybridées par échantillons. Les patients ne sont retenus pour la suite de l'analyse que si les 2 puces Affymetrix ont une qualité d'hybridation correcte. 13 patients sur les 15 initiaux ont pu être analysés. L'analyse 20 statistique a été réalisée sur la moyenne des duplicats. - Génération des listes de gènes différentiellement exprimés entre peau lésée et peau saine 25 1) Filtre sur le niveau d'expression : seuls les ProbeSets avec un niveau d'expression 26 (64) dans au moins une condition (PN ou LA) sont retenus. Après ce filtre 24393 ProbeSets sont retenus pour l'étude France et 26943 ProbeSets sont retenus pour l'étude Japon. 2) Analyse supervisée : 30 - Test t Un T-test linéaire a été appliqué aux données avec l'aide du logiciel ArrayStudio afin de comparer le profil d'expression génique du groupe des biopsies de lentigo actinique avec celui du groupe des biopsies de peau normale. Une liste de 1973 ProbeSets modulés de façon significative (p< 0.05) dans le lentigo actinique par rapport à la peau normale a ainsi été -23- établie pour l'étude France et une liste de 3084 ProbeSets modulés de façon significative dans le lentigo actinique par rapport à la peau normale pour l'étude Japon. - Filtre sur la modulation Pour les gènes surexprimés dans le lentigo actinique par rapport à la peau normale, sélection des ProbeSets ayant une moyenne géométrique des folds corrigés (FC=LA/PN) sur l'ensemble des patients > 1.5 : liste de 82 ProbeSets surexprimés pour l'étude France et de 131 ProbeSets surexprimés pour l'étude Japon. Pour les gènes sous-exprimés dans le lentigo actinique par rapport à la peau normale, sélection des ProbeSets ayant une moyenne géométrique des folds corrigés FC sur l'ensemble des patients < 0.67 : liste de 138 ProbeSets sous-exprimés pour l'étude France et de 175 ProbeSets sous-exprimés pour l'étude Japon. 3) Analyse non supervisée : - Suppression de l'effet patient : Afin de supprimer l'effet patient observé dans les résultats des analyses différentielles, l'algorithme suivant a été réalisé : pour chaque patient et chaque probeset, 1) soustraction de l'expression moyenne en log2 des deux conditions (lésionnelle, non lésionnelle), 2) addition de l'expression moyenne en log2 de l'ensemble des patients et des conditons - Analyse différentielle : Une analyse NMF (Non Negative Matrix Factorisation) a permis d'identifier 3296 ProbeSets dans l'étude France et 3288 ProbeSets dans l'étude Japon qui permettent de différencier le groupe des biopsies de lentigo actinique du groupe des biopsies de peau normale (p<0,05). Filtre sur la modulation : Pour les gènes surexprimés dans le lentigo actinique par rapport à la peau normale, sélection des ProbeSets ayant une moyenne géométrique des folds corrigés (FC) sur l'ensemble des patients > 1.5 : liste de 117 ProbeSets surexprimés pour l'étude France et de 153 ProbeSets surexprimés pour l'étude Japon. Pour les gènes sous-exprimés dans le lentigo actinique par rapport à la peau normale, sélection des ProbeSets ayant une moyenne géométrique des folds corrigés FC sur l'ensemble des patients < 0.67 : liste de 148 ProbeSets sous-exprimés pour l'étude France et de 170 ProbeSets sous-exprimés pour l'étude Japon. -24- 3) Union des listes Les deux listes obtenues grâce à l'analyse supervisée (test t) et l'analyse non supervisée (NMF) ont été unies afin de générer la liste finale des gènes exprimés différentiellement dans 5 le lentigo actinique par rapport à la peau normale. Ainsi 266 probeSets (201 gènes) sont exprimés différentiellement dans le lentigo actinique par rapport à la peau normale dans l'étude France (117 surexprimés, 149 sous-exprimés). 332 probeSets (245 gènes) sont exprimés différentiellement dans le lentigo actinique par rapport à la peau normale dans l'étude Japon (153 surexprimés, 179 sous-exprimés). 10 Comparaison des deux études Les listes de gènes exprimés différentiellement dans le lentigo actinique par rapport à la peau normale dans les deux études ont été comparées. 138 gènes sont communs aux deux études, c'est-à-dire que 138 gènes sont modulés dans le même sens dans le lentigo actinique par 15 rapport à la peau saine à la fois dans l'étude France et dans l'étude Japon. Parmi ces 138 gènes, 60 gènes sont surexprimés dans le lentigo actinique par rapport à la peau saine dans les deux études (FC > 1,5, p<0,05) et 78 gènes sont sous-exprimés dans le lentigo actinique dans les deux études (FC < 0.67, p<0,05). 20 Résumé des résultats : Deux études comparatives du profil d'expression génique de la peau issue d'une lésion de lentigo actinique (LA) et de peau adjacente non lésée (PN) ont été réalisées de façon indépendante : une étude en France et une étude au Japon. 25 Le but de ces études est d'identifier des marqueurs pertinents, reproductibles et significatifs reflétant les altérations associées à la formation du lentigo actinique, afin de les utiliser comme cibles pour des traitements efficaces, ou comme biomarqueurs pour analyser l'efficacité d'un traitement donné. 30 15 volontaires féminins sains pour l'étude France et 12 volontaires féminins sains pour l'étude Japon ont été recrutées afin de participer à une étude transcriptomique « full génome » (puces Affymétrix). Pour chaque volontaire, une lésion de type lentigo actinique a été diagnostiquée sur le dos de la main et le diagnostic de lentigo actinique a été vérifié par épiluminescence. Une biopsie centrée sur la lésion (peau lésée, PL) a été réalisée ainsi -25- qu'une biopsie de taille identique sur une zone de peau adjacente non lésée (peau non lésée, PN). Les ARN totaux de ces prélèvements ont été extraits et amplifiés. Des sondes ont été générées pour hybridation sur les puces Affymetrix. Des profils d'expression de gènes ont été générés pour chacune à partir d'échantillon, et une analyse comparative a été réalisée entre PN et LA par volontaire et sur l'ensemble des volontaires pour chaque étude. Les gènes statistiquement exprimés de façon différentielle (moyenne géométrique des patients) ont été compilés dans des listes et regroupés par familles fonctionnelles. Pour l'étude France, une liste de 201 gènes a été constituée et représente une signature moléculaire large de la lésion lentigo actinique dans la population caucasienne. Parmi les 201 gènes identifiés, 117 gènes ont un niveau d'expression significativement plus élevé dans la lésion 'lentigo actinique' que dans la peau saine (gènes surexprimés) alors que 149 gènes ont un niveau d'expression significativement plus faible dans la lésion 'lentigo actinique' que dans la peau saine (gènes sous-exprimés).

Pour l'étude Japon, une liste de 245 gènes a été constituée et représente une signature moléculaire large de la lésion lentigo actinique dans la population japonaise. Parmi les 245 gènes identifiés, 153 gènes ont un niveau d'expression significativement plus élevé dans la lésion 'lentigo actinique' que dans la peau saine (gènes surexprimés) alors que 179 gènes ont un niveau d'expression significativement plus faible dans la lésion 'lentigo actinique' que dans la peau saine (gènes sous-exprimés). Les signatures moléculaires issues de ces deux études ont ensuite été comparées. Nous avons montré que 138 gènes étaient communs aux deux études, c'est-à-dire que 138 gènes sont modulés dans le même sens dans le lentigo actinique par rapport à la peau saine à la fois dans l'étude France et dans l'étude Japon. Parmi ces 138 gènes, 60 gènes sont surexprimés dans le lentigo actinique par rapport à la peau saine dans les deux études et 78 gènes sont sous-exprimés dans le lentigo actinique dans les deux études. Cette signature moléculaire de 138 gènes constitue une signature forte du lentigo actinique, indépendante de l'origine du donneur. Ces gènes appartiennent à différentes familles fonctionnelles.30 -26- Exemple 1 A partir de la liste des 138 gènes modulés dans le même sens dans le lentigo actinique par rapport à la peau normale, nous avons sélectionné 20 gènes représentatifs de nombreuses 5 familles fonctionnelles. Pour la sélection des 20 gènes, nous nous sommes attachées à prendre en compte : - le taux de modulation moyen (moyenne géométrique sur l'ensemble des patients du rapport LA/PN) en prenant pour hypothèse que plus le gène est modulé et plus son activité sera impactée. Tous les gènes de cette liste ont un taux de modulation moyen 10 supérieur à 2 (gènes surexprimés) ou inférieur à 0,5 (gènes sous-exprimés) dans les 2 études. - la pertinence de ce gène en biologie cutanée et son niveau d'expression de base dans la peau - l'originalité du marqueur 15 -27- Modulation moyenne dans le LA France Japon CHL1 NM_006614.3 cell adhesion molecule with homology to L1CAM (close homolog of L1) 0,35 0,30 BEX2 NM_001168399.1 brain expressed X-linked 2 0,50 0,43 DLX1 NM 178120.4 distal-less homeobox 1 2,289 2,52 HOXB7 NM 004502.3 homeobox B7 2,411 3,13 HOXD10 NM 002148.3 homeobox D10 3,67 3,92 HOXD11 NM 021192.2 homeobox D11 3,606 5,06 PITX2 NM_153427.2 paired-like homeodomain 2 4,421 5,4 NM_153426.2 NM_000325.5 ZIC2 NM_007129.3 Zic family member 2 (odd-paired homolog, Drosophila) 5,13 4,61 PI3 NM_002638.3 peptidase inhibitor 3, skin-derived 2,58 2,73 AMDHD1 NM_152435.2 amidohydrolase domain containing 1 0,39 0,28 BCHE NM_000055.2 butyrylcholinesterase 0,49 0,30 NMNAT3 NM_178177.3 nicotinamide nucleotide adenylyltransferase 3 0,47 0,42 CYP39A1 NM_016593.3 cytochrome P450, family 39, subfamily A, polypeptide 1 0,30 0,20 NELL2 NM_001145107.1 NEL-like 2 (chicken) 0,43 0,37 BTC NM_001729.2 betacellulin 0,50 0,39 PON3 NM_000940.2 paraoxonase 3 0,48 0,37 SLC1A6 NM 001272087.1 solute carrier family 1 (high affinity aspartate/glutamate transporter), member 6 0,30 0,30 SLC47A2 NM_152908.3 solute carrier family 47, member 2 0,38 0,35 SLC8A1 NM_021097.2 solute carrier family 8 (sodium/calcium exchanger), member 1 0,48 0,47 TRAM1L1 NM_152402.2 translocation associated membrane protein 1-like 1 0,43 0,38 Tableau 1 : Liste de 20 gènes modulés dans le même sens dans le LA par rapport à la peau normale dans les études France et Japon. La première colonne indique le symbole du gène, la seconde colonne indique le numéro d'accession du gène, la 3ème colonne détaille le nom du gène. Les colonnes 4 et 5 indiquent le taux de modulation moyen (moyenne géométrique des taux de modulation individuels sur l'ensemble des patients de l'étude) dans le LA par rapport à la peau normale adjacente dans l'étude France et l'étude Japon, respectivement. Seuls les taux de modulation significatifs (p-value < 0,05) sont donnés. -28- Exemple 2 Parmi ces 20 gènes, 12 gènes sont modulés dans le même sens chez au moins 95% des patients pris individuellement (soit chez 24/25 patients au moins), avec un ratio d'expression 5 supérieur à 1,2 entre la peau lésionnelle et la peau non lésionnelle pour les gènes surexprimés et un ratio inférieur à 0.83 pour les gènes sous-exprimés (tableau 2). HOXD10 NM_002148.3 homeobox D10 HOXD11 NM_021192.2 homeobox D11 PITX2 NM_153427.2 paired-like homeodomain 2 NM_153426.2 NM_000325.5 ZIC2 NM_007129.3 Zic family member 2 (odd-paired homolog, Drosophila) AMDHD1 NM_152435.2 amidohydrolase domain containing 1 NMNAT3 NM_178177.3 nicotinamide nucleotide adenylyltransferase 3 CYP39A1 NM 016593.3 cytochrome P450, family 39, subfamily A, polypeptide 1 PON3 NM 000940.2 paraoxonase 3 SLC1A6 NM_001272087.1 solute carrier family 1 (high affinity aspartate/glutamate transporter), member 6 SLC47A2 NM_152908.3 solute carrier family 47, member 2 SLC8A1 NM_021097.2 solute carrier family 8 (sodium/calcium exchanger), member 1 TRAM1L1 NM_152402.2 translocation associated membrane protein 1-like 1 Tableau 2 : Liste de 12 gènes modulés dans le même sens dans le LA par rapport à la peau normale adjacente chez au moins 95% des patients pris individuellement, avec un taux de 10 modulation supérieur à 1,2 ou inférieur à 0.83. La première colonne indique le symbole du gène, la seconde colonne indique le numéro d'accession du gène, la 3ème colonne détaille le nom du gène. -29- Exemple 3 Parmi ces 12 gènes, 7 gènes sont modulés dans le même sens chez au moins 95% des patients pris individuellement (soit chez 24/25 patients au moins), avec un ratio d'expression supérieur à 1,5 entre la peau lésionnelle et la peau non lésionnelle pour les gènes 5 surexprimés et un ratio inférieur à 0.67 pour les gènes sous-exprimés (tableau 3). Ces gènes constituent le coeur de la signature moléculaire du lentigo actinique. HOXD10 NM_002148.3 homeobox D10 HOXD11 NM_021192.2 homeobox D11 PITX2 NM_153427.2 paired-like homeodomain 2 NM_153426.2 NM_000325.5 ZIC2 NM_007129.3 Zic family member 2 (odd-paired homolog, Drosophila) CYP39A1 NM_016593 3 cytochrome P450, family 39, subfamily A, polypeptide 1 SLC1A6 NM_001272087.1 solute carrier family 1 (high affinity aspartate/glutamate transporter), member 6 TRAM1L1 NM_152402.2 translocation associated membrane protein 1-like 1 Tableau 3 : Liste des 7 gènes modulés dans le même sens dans le LA par rapport à la peau 10 normale adjacente chez au moins 95% des patients pris individuellement, avec un taux de modulation supérieur à 1,5 ou inférieur à 0.67. La première colonne indique le symbole du gène, la seconde colonne indique le numéro d'accession du gène, la 3ème colonne détaille le nom du gène.

15 Exemple 4 Les taux de modulation dans le LA par rapport à la peau non lésée des 12 gènes de l'exemple 2 sont présentés dans le tableau 4 pour chaque patient pris individuellement. Tableau 4 Modulations patient par patient des 12 gènes de l'exemple 2. Les gènes surexprimés dans la peau lésionnelle par rapport à la peau normale adjacente sont indiqués enr gris foncé et les gènes sous-exprimés en gris clair. Les taux de modulation supérieurs à 1,5 ou inférieurs à 0,67 sont indiqués en gras. Les 7 gènes de l'exemple 3 sont indiqués par un astérisque*. LAJ O 1-1 U1 U1 LA..) Etude France - Modulation LA/PN par patient Etude Japon - Modulation LA/PN par patient PON3 NM_000940.2 paraoxonase 3 Patient 1 HOXD10* HOXD11* PITX2* ZIC2* AMDHD1 N M NAT3 CYP39A1* NM_002148.3 NM_021192.2 NM_153427.2 NM_153426.2 NM_000325.5 NM_007129.3 NM_152435.2 NM_178177.3 homeobox D10 homeobox DII paired-like homeodomain 2 Zic family member 2 (odd-paired homolog, Drosophila) amidohydrolase domain containing 1 nicotinamide nucleotide adenylyltransferase 3 krIMMEMEMO e0;> NM_016593.3 I cytochrome P450, family 39, subfamily A, polypeptide 1 ogt3fEraleMMIMMUMM 111:11111111111101:1:111 111:1 1 01 solute carrier family 1 (high SLC1A6* NM_001272087.1 affinity aspartate/glutamate transporter), member 6 NM_152908.3 solute carrier family 47, member 2 solute carrier family 8 NM_021097.2 (sodium/calcium exchanger), member 1 translocation associated NM 152402.2 membrane protein 1-litre 1 SLC47A2 SLC8A1 TRAMIL1 04.4: 0,» 0,25 :0,48 - 31 - Exemple 5 Il existe des composés connus pour moduler dans le sens recherché les gènes dérégulés dans le lentigo. Ces composés sont listés dans le tableau ci-dessous : Gene Famille chimique Modulateur et action sur l'expression des gènes Références CYP39A1 retinoids Tretinoin results in increased expression of CYP39A1 mRNA Colleoni S, et al. Development of a neural teratogenicity test based on human embryonic stem cells: response to retinoic acid exposure. Toxicol Sci.

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2001 Mar;280(3):H1376-82.

Claims (6)

1. REVENDICATIONS: 1. Méthode in vitro ou ex vivo de caractérisation d'une tache pigmentaire cutanée chez un 5 individu, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : a) mesurer le niveau d'expression ou d'activité du produit d'expression des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 dans des échantillons provenant d'une peau issue de ladite tache b) mesurer le niveau d'expression ou d'activité du produit d'expression desdits 10 gènes dans des échantillons de peau adjacente non lésée, c) comparer les niveaux d'expression ou d'activité du produit d'expression desdits gènes mesurés aux étapes a) et b) d) en déduire que ledit individu présente un lentigo quand le rapport entre le niveau d'expression ou d'activité du produit d'expression desdits gènes dans l'échantillon 15 de peau issue de la tache mesuré à l'étape a), et le niveau d'expression ou d'activité du produit d'expression desdits gènes dans l'échantillon de peau adjacente non lésée mesuré à l'étape b) est : - Supérieur à 1,5 si le gène est choisi parmi HOXD10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, et 20 - Inférieur à 0,67 si le gène est choisi parmi CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1.
2. 2. Méthode selon la revendication 2, où ladite tache pigmentaire cutanée est un lentigo actinique. 25
3. 3. Méthode de prédiction d'un risque d'apparition d'un lentigo actinique chez un individu, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : a) mesurer le niveau d'expression ou d'activité du produit d'expression des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 dans des échantillons provenant d'une peau prédisposée 30 b) comparer le niveau de d'expression des gènes mesurés à l'étape a) avec le niveau d'expression desdits gènes dans des échantillons de peau non prédisposée, et c) Prédire que ledit individu présente un risque d'apparition d'un lentigo quand le rapport entre le niveau d'expression des gènes dans les échantillons provenant-35- d'une peau prédisposée et le niveau d'expression dans les échantillons provenant d'une peau non prédisposée est : - Supérieur ou égale à 1,2 si le gène est choisi parmi HOXD10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, et - Inférieur ou égale à 0,83 si le gène est choisi parmi CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1.
4. 4. Méthode d'évaluation de l'efficacité d'un traitement du lentigo actinique chez un individu 10 comprenant les étapes consistant à : a) Mesurer les niveaux d'expression ou d'activité du produit d'expression dans un échantillon de peau issue dudit lentigo actinique d'au moins un gène parmi la liste constituée des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 15 b) Appliquer le traitement sur l'échantillon de peau présentant ledit lentigo actinique c) Mesurer les niveaux d'expression ou d'activité du produit d'expression dans ledit échantillon de peau traité à l'étape b) d'au moins un gène parmi la liste constituée des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 20 d) Comparer les niveaux d'expression ou d'activité d'expression dans ledit échantillon de peau présentant un lentigo d'au moins un gène parmi la liste constituée des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 mesurés aux étapes a) avant traitement et c) après traitement, et e) En déduire que le traitement est efficace pour le traitement du lentigo atinique 25 quand le niveau d'expression est : - Significativement inférieur après traitement par rapport au niveau d'expression avant traitement, si le gène est choisi parmi HOXD10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, et - Significativement supérieur après traitement par rapport au niveau 30 d'expression avant traitement, si le gène est choisi parmi CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1.-36-
5. 5. Méthode in vitro d'évaluation de l'efficacité d'un traitement du lentigo actinique dans un modèle cellulaire représentatif de la peau comprenant les étapes consistant à : a) Mesurer les niveaux d'expression ou d'activité du produit d'expression dans un modèle cellulaire représentatif de la peau d'au moins un gène parmi la liste constituée des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM b) Appliquer le traitement sur ledit modèle cellulaire représentatif de la peau. c) Mesurer les niveaux d'expression ou d'activité d'expression dans ledit modèle cellulaire représentatif de la peau traité à l'étape b) d'au moins un gène parmi la liste constituée des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 d) Comparer les niveaux d'expression ou d'activité du produit d'expression dans ledit modèle cellulaire représentatif de la peau d'au moins un gène choisi parmi la liste constituée des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1,SLC1A6 et TRAM1L1, mesurés aux étapes a) avant traitement et c) après traitement, et e) En déduire que le traitement est efficace quand le niveau d'expression ou d'activité est : - Significativement inférieur après traitement par rapport au niveau d'expression avant traitement, si le gène est choisi parmi HOXD10, HOXD11, PITX2 et ZIC2, et - Significativement supérieur après traitement par rapport au niveau d'expression avant traitement, si le gène est choisi parmi CYP39A1,SLC1A6 et TRAM1L1.
6. 6. Procédé de sélection d'un composé utile dans la prévention et/ou le traitement du lentigo actinique, comprenant les étapes consistant à : a) Mesurer dans un échantillon de peau et/ou un modèle cellulaire représentative de la peau le niveau d'expression ou de l'activité du produit d'expression d'au moins un gène parmi la liste constituée des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 b) Mettre ledit composé à sélectionner en contact avec ledit échantillon de peau et/ou ledit modèle cellulaire représentatif de la peau-37- c) Mesurer le niveau d'expression ou de l'activité du produit d'expression d'au moins un gène choisi parmi la liste constituée des gènes HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2, CYP39A1, SLC1A6 et TRAMIL1, d) Comparer les mesures des étapes a) et c) e) Sélectionner en tant que composé utile dans la prévention et/ou le traitement du lentigo, un composé capable d'augmenter le niveau d'expression ou l'activité d'au moins un gène choisi parmi CYP39A1, SLC1A6 et TRAM1L1 et/ou de diminuer le niveau d'expression ou l'activité d'au moins un gène choisi parmi HOXD10, HOXD11, PITX2, ZIC2. 10