FR3135992A1 - Signature moléculaire du lentigo actinique associée à la gestion des vésicules - Google Patents

Abstract

Signature moléculaire du lentigo actinique associée à la gestion des vésicules La présente invention concerne une méthode de caractérisation d’une tache pigmentaire cutanée apparente ou soupçonnée chez un être humain, comprenant la comparaison des niveaux d’expression, dans des échantillons de peau issue de ladite tache et de peau adjacente non lésée, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, NAV3 et PCLO, et éventuellement du gène MREG. L’invention concerne également des méthodes d’évaluation de l’efficacité d’un traitement des taches pigmentaires, des méthodes cosmétiques de traitement des taches pigmentaires, ainsi que divers modulateurs desdits gènes et leur utilisation.

Description

Signature moléculaire du lentigo actinique associée à la gestion des vésicules

La présente invention est dans le domaine cosmétique, elle est relative à la peau. Elle s’inscrit plus généralement dans le cadre de la caractérisation des taches pigmentaires de la peau et du traitement de ces taches.

La couleur de la peau est principalement due à la présence d’un pigment, la mélanine dans l’épiderme. La mélanine est synthétisée par des cellules dendritiques spécifiques localisées dans la couche basale de l’épiderme, les mélanocytes. La mélanogénèse prend place dans des organelles, les mélanosomes qui, chargés de mélanine, sont transférés aux cellules voisines épidermiques, les kératinocytes, via les dendrites. La couleur de la peau, ou pigmentation constitutive varie selon les individus en fonction de la quantité de mélanine produite ainsi que de la nature chimiques de mélanines. Les mélanines sont des macromolécules formées à partir de tyrosine (eumélanine) ou de tyrosine et de cystéine (pheomélanine). Les mécanismes de synthèse mettent en jeu des enzymes dont les principales sont la tyrosinase et la protéine associée à la tyrosinase (Tyrp-1). Naturellement, la pigmentation de la peau est stimulée par l’exposition au soleil, c’est le phénomène de bronzage.

Il existe cependant des situations où le processus de pigmentation est altéré, et qui peuvent aboutir à des défauts de pigmentation, hypopigmentations (vitiligo, albinisme) ou à l’inverse à un excès de pigmentation, hyperpigmentations. Parmi les désordres hyperpigmentaires bénins, caractérisés par une accumulation anormale (hors bronzage) de mélanine, on peut citer le lentigo actinique, le mélasma, les séquelles pigmentaires d'acné, la pigmentation post-inflammatoires, la dermite des prés, ou encore les dychromies bénignes du visage.

Le lentigo actinique, également dénommé lentigo sénile ou solaire, tache sénile, tache de vieillesse, ou encore communément dénommé "crasse sénile", "marguerites de cimetière" ou "fleurs de cimetière", est de loin la plus fréquente des lésions pigmentaires. Ce type de lésions apparaît sur des zones de la peau qui ont été photoexposées, telles que le visage, le dos des mains, les membres supérieurs et notamment la face dorsale des avant-bras, le dos, et en particulier le haut du dos. Elles touchent en général les individus à partir de 40 ans.

Macroscopiquement, les lentigos actiniques sont représentés par des macules pigmentées bénignes de couleur brune plus ou moins foncée, dont les bords sont nets mais irréguliers. De taille très variable, ils peuvent s’étendre de quelques millimètres à plus de deux centimètres.

Malgré sa grande fréquence, peu d’études ont été publiées sur la physiologie et la genèse des lentigos actiniques. Sur la base des rares études histologiques existantes, il est connu qu’il existe une augmentation de la charge mélanique épidermique globale et plus particulièrement au niveau de la couche basale. Il existe également un allongement des crêtes épidermiques qui peuvent prendre un aspect en massue dans le derme papillaire (Montagna W, Hu F, Carlisle K. « A reinvestigation of solar lentigines ». Arch Dermatol. 1980 ; Ber Rahman, S. Bhawan, J. Lentigo. Int J Dermatol, 1996, Apr;35(4):229-39 ; Andersen WK, Labadie RR, Bhawan J. «Histopathology of solar lentigines of the face : a quantitive study» J Am Acad Dermatol. 1997 Mar;36(3 Pt 1):444-7 ; Cario-Andre M, Lepreux, S, Pain C, Nizard C, Noblesse E, Taïeb A. «Prelesional vs. Lesional skin changes in senile lentigo» 2004). Enfin, il peut y avoir des anastomoses entre des crêtes adjacentes donnant un aspect en pont ou en réseau.

Une incontinence pigmentaire avec présence de mélanine et de mélanophages peut également exister dans le derme.

Les troubles pigmentaires cutanés bénins sont généralement considérés comme inesthétiques. Du fait de l’association avérée entre l’apparition des lentigos actiniques et l’exposition chronique au soleil, la prévention de leur apparition passe en général par l’application topique de produits dits photoprotecteurs comme les écrans solaires. Dans le cas de traitements « curatifs », de nombreux procédés, principalement à visées cosmétiques, ont donc été développés afin de tenter de les éliminer ou de réduire leur présence. L'élimination ou la réduction de la présence de ces troubles repose, d'ordinaire, sur l'application de traitements dépigmentants, basés sur la réduction de l’activité de synthèse de la mélanine dans les mélanocytes. Les molécules dépigmentantes interfèrent avec une ou des étapes de la mélanogénèse. L’une des voies des principaux produits utilisés à ce jour repose sur l’inhibition de la tyrosinase, une des enzymes clés du processus de mélanogénèse. Le but de ces traitements est de diminuer voire de stopper la synthèse de pigment.

Les principales substances dépigmentantes connues sont l’hydroquinone et ses dérivés, l’acide kojique, l’arbutine, les iminophénoles, l’acide ascorbique et ses dérivés, l’association de carnitine et de quinone, les dérivés d’amino-phénol, et les dérivés de benzothiazole, des extraits naturels, des corticoïdes.

On trouve souvent aussi associés à ces agents actifs des exfoliants permettant d’augmenter la desquamation, et ainsi d’éliminer plus facilement la mélanine présente dans le stratum cornéum.

Une autre méthode de traitement non cosmétique consiste à détruire les lésions par des moyens physiques ou chimiques en utilisant les lasers ou les peelings. Cependant, ce sont des procédures assez lourdes qui ne s’attaquent pas à l’étiologie du désordre. Dans la majorité des cas, les lentigos actiniques réapparaissent quelques temps après le traitement.

Par ailleurs, il existe des inconvénients majeurs aux traitements existants. Les substances dépigmentantes peuvent présenter notamment une certaine instabilité, une faible efficacité à faible concentration, une activité biologique touchant d’autres fonctions indésirables.

De plus, du fait qu’ils ne ciblent pas la cause profonde ayant entrainé le dérèglement de la pigmentation, il existe une grande hétérogénéité de réponse aux différents traitements dépigmentants. Ainsi, pour un traitement donné, administré par exemple de façon topique, un trouble pigmentaire cutané bénin donné, comme un lentigo actinique ou un mélasma, peut s’atténuer ou disparaître, alors qu’un autre n’évoluera pas. Cette variabilité peut être observée entre des lésions chez des individus différents mais aussi chez un même individu, entre différentes lésions. Il existe donc des troubles pigmentaires cutanés bénins pour lesquels aucun traitement topique n’est efficace à ce jour.

Il existe donc un besoin de trouver des traitements plus efficaces et plus inoffensifs pour ce type de lésion.

Pour cela, il est nécessaire d’identifier les dérégulations moléculaires et dysfonctionnements fonctionnels pouvant exister dans ce type de désordre pigmentaire afin de pouvoir identifier de nouvelles cibles et de sélectionner des agents actifs corrigeant ces défauts.

Dans l’art antérieur, concernant le traitement des taches pigmentaires et plus particulièrement des lentigos actiniques, il est décrit la stimulation au niveau génomique ou protéinique de molécules qui sont étroitement associées aux mélanocytes et la mélanogénèse (enzymes de la mélanogénèse, protéine du mélanosome, facteurs paracrine clé de la mélanogénèse). Elle est trouvée dans l’épiderme ou le derme pour les protéines suivantes : Tyrosinase, TRP1, DCT, Pmel-17 , POMC, ET1, ETBR, SCF, c-KIT , KGF , KGFR, Hepatocyte growth factor ( HGF), MIA, TRPM1, Melan-A, Pink eye dilution, P53 et IL1α.

Or il est connu depuis peu, que la mélanogénèse ne représente pas le mécanisme biologique majeur impliqué dans l’apparition des tâches pigmentaires et notamment du lentigo actinique (Warrick et al Br J Dermatol 2017, Aoki Br J Dermatol 2007).

Les présents inventeurs ont mis en évidence pour la première fois l’implication de gènes liés à la gestion (notamment le transport, la fusion, l’accumulation, la rétention, la dégradation) des vésicules, de préférence des mélanosomes, dans les dérèglements pigmentaires se traduisant par des taches pigmentaires de la peau.

En particulier, il a été montré par les présents inventeurs que certains gènes liés à la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, ont des niveaux de transcription différant significativement entre de la peau saine et de la peau issue d’une tache pigmentaire, mettant ainsi en évidence le lien entre dérégulation de la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, au sein de la peau, de préférence l’épiderme, et modulation de la pigmentation induisant notamment l’apparition de taches pigmentaires.

Le mélanosome est un organite intracellulaire sous la forme de vésicule, ladit vésicule étant spécialisée dans la production de mélanine, pigment protégeant la peau humaine des radiations solaires.

Il est produit dans les mélanocytes. Entouré d'une membrane lipidique, sa forme varie d'arrondie à allongée. Au sein de la peau humaine, les mélanosomes ne restent pas dans les mélanocytes, mais sont évacués en direction des kératinocytes le long de bras ressemblant aux dendrites des neurones (les mélanocytes sont d’origine neurale), dans lesquelles ils se déplacent portés par les kinésines, le long d'un système composé de microtubules, d’actine, de filaments intermédiaires et de protéines associées. Ce transport peut être déclenché ou intensifié par certains facteurs notamment par l’intensité des radiations ultraviolettes (bronzage).

Ainsi, les kératinocytes répartissent les mélanosomes au-dessus de leur noyau, le protégeant des dégâts dus aux radiations U.V. Le nombre de mélanosomes produits par le mélanocyte, leur taille, leur concentration en mélanines et la nature de celles-ci (eumélanine ou pheomélanine), ainsi que la façon dont le kératinocyte les répartit au-dessus de son noyau, sont des caractéristiques héréditaires qui influent sur la pigmentation de la peau humaine.

Les documents FR2974370, FR2974372, FR2974373, et FR2974371 bien que mettant en évidence des dérégulations moléculaires ou des dysfonctionnements fonctionnels dans le lentigo actinique, notamment avec l’implication des gènes de la voie de signalisation biologique TGFβ-SMAD, des gènes participant au remodellage de la matrice extracellulaire, des gènes codant pour des protéoglycanes et glycoprotéines extracellulaires, ceux-ci ne divulguent pas de gènes liés à la gestion des vésicules, notamment des mélanosomes.

Ainsi, la présente invention a pour premier objet une méthode de caractérisation d’une tache pigmentaire cutanée apparente ou soupçonnée chez un être humain, comprenant la comparaison des niveaux d’expression, dans des échantillons de peau issue de ladite tache et de peau adjacente non lésée, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, NAV3 et PCLO, et éventuellement du gène MREG.

La présente invention a pour second objet une méthode d’évaluation de l’efficacité d’un traitement des taches pigmentaires cutanées, comprenant la comparaison des niveaux d’expression dans un échantillon de peau issue d’une telle tâche, avant et après traitement, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, NAV3 et PCLO, et éventuellement du gène MREG.

Un autre objet de la présente invention est une méthode in vitro de criblage d’agent actif pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
i. mettre en contact un modèle cellulaire représentatif de la peau avec au moins un agent actif à tester, ou exposer ledit modèle cellulaire à un traitement physique à tester ;
ii. effectuer une mesure du niveau d’’expression, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, PCLO, NAV3 et MREG, ou du niveau d’expression ou d’activité du produit d’expression dudit gène choisi, et
iii. comparer ladite mesure à une mesure de référence.

L’invention se rapporte également à une méthode cosmétique de traitement ou de prévention de tache pigmentaire cutanée non pathologique de la peau humaine, comprenant l’application sur la peau d’une composition comprenant au moins un agent actif modulant le niveau d’expression ou de l’activité d’un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, où ledit gène est choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, PCLO, NAV3 et MREG.

L’invention concerne en outre, l’utilisation cosmétique d’un modulateur du niveau d’expression ou de l’activité du produit d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, PCLO, NAV3 et MREG dans le traitement de taches pigmentaires cutanées non-pathologiques.

La présente invention se rapporte en outre à une méthode de préparation d’un modèle cellulaire apte à cribler des agents actifs pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, comprenant les étapes suivantes :
i. prélever des kératinocytes et éventuellement des mélanocytes ; puis
ii. transfecter lesdits kératinocytes prélevés à l’étape i. à l’aide de siRNA apte à réprimer le niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG ; et/ou transfecter lesdits kératinocytes prélevés à l’étape i. à l’aide de vecteur d’expression, de préférence un plasmide, d’au moins gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, puis
iii. cultiver les kératinocytes transfectés à l’étape ii. ou co-cultiver les kératinocytes transfectés à l’étape ii. avec les mélanocytes prélevés à l’étape i.

Un autre de ses objets est un modèle cellulaire apte à cribler des agents actifs pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, susceptible d’être obtenu ou directement obtenu selon la méthode de préparation selon l’invention.

Un autre objet de la présente invention est un modèle cellulaire apte à cribler des agents actifs pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, comprenant des kératinocytes et éventuellement des mélanocytes, dans lequel lesdits kératinocytes présentent un niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG, réprimé et/ou dans lequel lesdits kératinocytes présentent un niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, surexprimé.

L’invention concerne en outre une méthode in vitro de criblage d’agent actif pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
i. mettre en contact un modèle cellulaire comprenant des kératinocytes et éventuellement des mélanocytes, dans lequel lesdits kératinocytes présentent un niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG, réprimé et/ou dans lequel lesdits kératinocytes présentent un niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, surexprimé avec au moins un agent actif à tester, ou exposer ledit modèle cellulaire à un traitement physique à tester ;
ii. effectuer une mesure quantitative ou qualitative de la mélanine et/ou une mesure du niveau d’’expression, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP et PCLO, NAV3 et MREG, ou du niveau d’expression ou d’activité du produit d’expression dudit gène choisi, et comparer ladite mesure à une mesure de référence.

Lesdits gènes s’entendent des gènes humains dénommés ainsi.

Définitions

Par « niveau d’expression d’un gène », on entend préférentiellement, le niveau de transcription et/ou le niveau de traduction dudit gène, plus préférentiellement le niveau de transcription dudit gène.

Concernant l’évaluation du niveau de transcription du gène choisi, elle peut être réalisée par différentes manières bien connues de l’homme du métier, directement ou bien après transcription inverse. Le niveau de transcription peut notamment être évalué par l’utilisation de puces à ARN ou puces à ADN vendues dans le commerce à cet effet. Une méthode d’évaluation possible est décrite dans la partie expérimentale.

Par « vésicule » on entend une structure plus ou moins sphérique formée d'une membrane biologique notamment une bicouche lipidique, refermée sur elle-même, présente au niveau des cellules de la peau, de préférence au niveau des kératinocytes.

De préférence les vésicules sont des vésicules de transport intracellulaire, encore plus préférentiellement les vésicules sont des mélanosomes.

Par « gestion des vésicules » ou « gestion des mélanosomes » on entend au sens de la présente invention, le transport, la fusion, l’accumulation, la rétention, la dégradation desdites vésicules ou desdits mélanosomes.

Les noms des gènes précités ainsi que les familles biologiques fonctionnelles auxquelles ils appartiennent sont décrits dans le Tableau 1 ci-dessous.

Sous-famille	Symbole	Nom	Publications
Trafic intracellulaire	JAKMIP2	janus kinase and microtubule interacting protein 2	Cruz-Garcia Bichem J : The Golgi-associated long coiled-coil protein NECC1 participatesin the control of the regulated secretory pathway in PC12 cells
	ARC	activity-regulated cytoskeleton-associated protein	Fila Neural plasticity 2021: mRNA Trafficking in the Nervous System: A Key Mechanism of the Involvement of Activity-Regulated Cytoskeleton-Associated Protein (Arc) in Synaptic Plasticity- Wu Cell 2011: Arc/Arg3.1 Regulates an Endosomal Pathway Essential for Activity-Dependent b-Amyloid Generation Pastuzin Cell 2017 The Neuronal Gene Arc Encodes a Repurposed Retrotransposon Gag Protein that Mediates Intercellular RNA Transfer
Kinésines	KIF21A	kinesin family member 21A	Hirokawa Physiol Rev 2008 Intracellular Transport and Kinesin Superfamily Proteins, KIFs: Structure, Function, and Dynamics (Review) Niwa Anatomical Science International 2015: Kinesin superfamily proteins and the regulation of microtubule dynamics in morphogenesis
Croissance axones	NAV3	neuron navigator 3	Stringham Cell Adhesion & Migration 2009: Navigating the cell/ UNC-53 and the navigators, a family of cytoskeletal regulators with multiple roles in cell migration, outgrowth and trafficking
	SLITRK6	SLIT and NTRK-like family. member 6	Aruga Mol Cell Neuroscience 2003: Identification and characterization of Slitrk, a novel neuronal transmembrane protein family controlling neurite outgrowth
	NRN1	neuritin 1	Zito Brain Struct functio n 2014: Neuritin 1 promotes neuronal migration - Di Giovanni Faseb J 2005: Neuronal plasticity after spinal cord injury: identification of a gene cluster driving neurite outgrowth
Organisation cytosquelette	SCIN	scinderin	Trifano Can J Physiol Pharmacol. 1999 : Scinderin and cortical F-actin are components of the secretory machinery- Trifaro Neurochem Res 2000: Scinderin, a Ca2+-dependent actin filament severing protein that controls cortical actin network dynamics during secretion;
	SYNPO2	synaptopodin 2	Kannan and Tang JCB 2015: Synaptopodin couples epithelial contractility to α-actinin-4–dependent junction maturation- Kingsbury Biochem 2013: Avian Synaptopodin 2 (Fesselin) Stabilizes Myosin Filaments and Actomyosin in the Presence of ATP
Activité contractile	TNNT1	troponin T type 1 (skeletal. slow)	I Cohen Methods Achiev Exp Pathol 1979: The contractile system of blood platelets and its function- Tobacman Biophys J 2021:Troponin Revealed: Uncovering the Structure of the Thin Filament On-Off Switch in Striated Muscle- Wei GENE 2016: TNNT1, TNNT2, and TNNT3: Isoform genes, regulation, and structure–function relationships
	SNTB1	syntrophin, beta 1 (dystrophin-associated protein A1, 59kDa, basic component 1)	Iwata Eur J Cell Biol 2004 : Syntrophin is an actin-binding protein the cellular localization of which is regulated through cytoskeletal reorganization in skeletal muscle cells
Famille Rho/Rab	ARHGAP29	Rho GTPase activating protein 29	Post, et al. 2013 Rasip1 mediates Rap1 regulation of Rho in endothelial barrier function through ArhGAP29 - Biggs J Cell SCIENCE 2014: Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration
	RAB3IP	RAB3A interacting protein (rabin3)	Brondyk Mol cell biol 1995 :Interaction Cloning of Rabin3, a Novel Protein That Associates with the Ras-Like GTPase Rab3A- Hattula Method in Enzymol 2005: Purification and functional properties of a Rab8-specific GEF (Rabin3) in action remodeling and polarized transport
	RHOBTB3	Rho-related BTB domain containing 3	Espinosa Cell 2009:RhoBTB3: A Rho GTPase-family ATPase required for endosome to Golgi transport
	RASIP1	Ras interacting protein 1	Post, et al. 2013 Rasip1 mediates Rap1 regulation of Rho in endothelial barrier function through ArhGAP29
Endocytose	ASGR1	asialoglycoprotein receptor 1	Newman Cell 2021 : Importance of between and within Subject Variability in Extracellular Vesicle Abundance and Cargo when Performing Biomarker Analyses - Susan-Resiga JBC 2021 : Asialoglycoprotein receptor 1 is a novel PCSK9-independent ligand of liver LDLR cleaved by furin
	CHMP4C	charged multivesicular body protein 4C	Russel Mbio 2021:Novel Role for ESCRT-III Component CHMP4C in the Integrity of the Endocytic Network Utilized for Herpes Simplex Virus Envelopment - Tauro Methods 2012: Comparison of ultracentrifugation, density gradient separation, and immunoaffinity capture methods for isolating human colon cancer cell line LIM1863-derived exosomes
Autophagie	SVIP	small VCP/p97-interacting protein	Wang PlosOne 2011: SVIP Induces Localization of p97/VCP to the Plasma and Lysosomal Membranes and Regulates Autophagy
Gestion des vésicules	LRMP	lymphoid-restricted membrane protein	Behrens J Immonol 1994 : Jaw1, A lymphoid-restricted membrane protein localized to the endoplasmic reticulum
	PCLO	piccolo (presynaptic cytomatrix protein)	leal Ortiz JCB 2008: Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis - Mukherjee PNAS 2010: Piccolo and bassoon maintain synaptic vesicle clustering without directly participating in vesicle exocytosis
	MREG	melanoreguline	Moore 1988: Mreg’s role in the suppression of Rab27a-Mlph-Myo5a–deficient phenotype over 30 years ago , O'Sullivan, 2004 :melanosome center aggregation Ohbayashi, 2012: microtubules mediated retrograde transport as a cargo receptor

Description détaillée

Méthode de caractérisation

La présente invention a pour objet une méthode de caractérisation d’une tache pigmentaire cutanée apparente ou soupçonnée chez un être humain, comprenant la comparaison des niveaux d’expression, dans des échantillons de peau issue de ladite tache et de peau adjacente non lésée, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, NAV3 et PCLO, et éventuellement du gène MREG.

Une telle méthode permet entre autres de confirmer la nature de la tache pigmentaire dans le cas où cette dernière est déjà apparente, par exemple visuellement à l’œil nu. La méthode permet également de prédire l’apparition d’une tache, quand cette dernière n’est pas encore observée mais uniquement soupçonnée, ou bien de conclure qu’une peau est encline à la formation de taches cutanées, ou sujette à des défauts de pigmentation, par exemple quand aucune tâche n’est encore apparente.

Les taches pigmentaires cutanées concernées sont de préférence des taches hyperpigmentaires, ou encore dites hyperpigmentées, correspondant à un excès de pigment.

Des désordres hyperpigmentaires bénins envisageables dans le cadre de l’invention, sont notamment caractérisés par une accumulation anormale (hors bronzage) de mélanine, et peuvent être choisi parmi le lentigo actinique, le mélasma, les séquelles pigmentaires d'acné, la pigmentation post-inflammatoires, la dermite des prés, ou encore les dyschromies bénignes du visage, les imperfections ou irrégularités de pigmentation rendant le teint non uniforme, ou la couleur de la peau non homogène.

De préférence les taches pigmentaires sont le lentigo actinique.

Les taches pigmentaires dont il est question sont préférentiellement des taches pigmentaires de la peau humaine.

Les niveaux d’expression de l’un au moins des gènes de l’invention sont mesurés au niveau de la peau issue de tache avérée ou supposée, et au niveau de la peau adjacente non lésée. De préférence, les niveaux sont mesurés sur des échantillons de peau prélevés au sein de la tache et au sein d’une zone adjacente non lésée. Les échantillons sont par exemple des biopsies de peau, des shaves, des échantillons de peaux ex vivo, des bulles de succion. Concernant les biopsies, quelques millimètres de diamètres sont suffisants, par exemple une biopsie de 2 mm, ou bien 3mm de diamètre. On peut envisager également l’excision totale d’une lésion.

La zone non lésée est de préférence une zone adjacente aussi proche que possible de la tache mais à une distance suffisante pour que l’échantillon prélevé ne contienne aucune cellule susceptible d’appartenir à la tache pigmentaire. De préférence, la zone adjacente non lésée est une zone ayant une exposition à la lumière et au soleil comparable à la zone de la tache pigmentaire.

Alternativement, la zone non lésée peut provenir d’une zone symétrique sur l’autre partie du sujet, ayant un emplacement parfaitement identique ; par exemple dans le cas d’une tache sur la main gauche, la zone non lésée peut être la zone correspondante sur la main droite. Dans ce cas, la zone non lésée n’est pas à proprement parler une zone adjacente. Par non lésée, on entend une zone qui ne possède pas de tache pigmentaire, ni d’irrégularité pigmentaire, de préférence une zone homogène en terme de pigmentation.

Du fait que la zone non lésée sert de référence, elle doit dans tous les cas être aussi comparable que possible que la zone de la tache, mais dépourvue de défaut pigmentaire.

Il est important de noter également que la méthode selon l’invention implique la comparaison des niveaux d’expression d’au moins l’un des gènes de l’invention. De ce fait, il peut être suffisant d’évaluer quantitativement ou qualitativement la différence entre les deux niveaux d’expression, sans pour autant évaluer et quantifier individuellement chacun des niveaux d’expression.

La méthode selon l’invention est de préférence pratiquée in vitro ou bien ex vivo.

Selon un mode de réalisation de la méthode de l’invention, la tache pigmentaire est une tache non pathologique, bénigne, notamment par opposition aux lésions pathologiques telles que les naevi ; il peut s’agir d’une irrégularité dans la pigmentation de la peau.

De préférence, une méthode selon l’invention comprend la comparaison des niveaux d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, SYNPO2, TNNT1, et LRMP.

Encore plus préférentiellement, une méthode selon l’invention comprend la comparaison des niveaux d’expression d’au moins deux gènes distincts parmi les gènes de l’invention, de préférence d’au moins trois gènes distincts, voire cinq gènes distincts. Il est également envisageable de comparer les niveaux d’expression d’au moins 6 gènes, voire d’au moins 8 gènes distincts.

Lorsqu’au moins deux gènes sont choisis, ils sont de préférence choisis parmi les listes des 8 gènes préférés suivants : JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, SYNPO2, TNNT1, et LRMP. Toutes les combinaisons deux à deux, parmi les 8 gènes préférés, sont des combinaisons préférentielles pour la mise en œuvre de l’invention.

La mise en œuvre de la méthode selon l’invention conduit à la conclusion que la tache supposée ou observée est une tache hyperpigmentaire si le niveau d’expression est :
- supérieur dans l’échantillon de peau issue de la tache par rapport au niveau dans l’échantillon de peau adjacente non lésée, si le gène est choisi parmi ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, et/ou
- inférieur dans l’échantillon de peau issue de la tache par rapport au niveau dans l’échantillon de peau adjacente non lésée, si le gène est choisi parmi JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, NAV3 et PCLO, et éventuellement MREG.

En effet, les présents inventeurs ont mise en évidence la surexpression des gènes ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP dans la peau issue de tache hyperpigmentaire, notamment de lentigo actinique, par rapport au niveau d’expression dans la peau adjacente non lésée. Ils ont également mis en évidence la sous-expression des gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, NAV3 et PCLO, et éventuellement MREG dans la peau issue de tache hyperpigmentaire, notamment de lentigo actinique, par rapport au niveau d’expression dans la peau adjacente non lésée.

Par « supérieur » ou « inférieur », on entend une différence de niveaux d’expression qui est statistiquement significative, supérieure au bruit et reproductible. Par exemple, la différence de niveau d’expression est d’au moins 10 %, c’est-à-dire que si le niveau d’expression d’un gène de l’invention dans la peau non lésée est fixé à 1, le taux de modulation est d’au moins 1,1 pour un gène surexprimé dans la peau lésionnelle et d’au plus 0,9 pour un gène sous-exprimé dans la peau lésionnelle.

Dans un premier mode de réalisation préféré, dans le cadre de cette méthode de caractérisation, le niveau d’expression d’un des gènes de l’invention est comparé au sein de la peau d’un individu de type caucasien.

Dans un second mode de réalisation préféré, dans le cadre de cette méthode de caractérisation, le niveau d’expression d’un des gènes de l’invention est comparé au sein de la peau d’un individu de type asiatique.

De préférence, ledit individu est âgé d’au moins quarante ans, de préférence d’au moins cinquante ans, voire de soixante ans. L’individu considéré, dans le cadre de la présente invention, est de préférence de sexe féminin.

Comme précédemment détaillé, le niveau d’expression d’un ou de plusieurs gènes de l’invention peut être comparé au sein d’échantillon de peau dudit individu.

La méthode décrite est également une méthode de test pour la prédiction de la formation de taches cutanées chez un sujet. Selon cette mise en œuvre, le niveau d’expression d’au moins un, et de préférence plusieurs, gène de l’invention est comparé dans un échantillon de peau, à son niveau d’expression dans la peau normale. Une modulation significative du niveau d’expression dudit ou desdits gène(s) par rapport au niveau d’expression dudit ou desdits gène(s) dans une peau normale permet de conclure que la peau du sujet testé est encline à la formation de taches cutanées.

Par « niveau d’expression dans la peau normale», on entend soit le niveau d’expression dudit ou desdits gène(s) de la peau du même sujet, dans une zone corporelle notoirement dépourvue de taches, par exemple des zones non exposées au rayonnement solaire, ou bien des zones peu enclines à la formation de taches pigmentaires soit le niveau d’expression moyen dudit ou desdits gène(s), dans la peau de personnes dépourvues de taches et ayant de préférence le même type de peau que le sujet testé.

Méthode d’évaluation de l’efficacité d’un traitement des taches pigmentaires cutanées

La présente invention concerne également, une méthode d’évaluation de l’efficacité d’un traitement des taches pigmentaires cutanées, comprenant la comparaison des niveaux d’expression dans un échantillon de peau issue d’une telle tâche, avant et après traitement, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, NAV3 et PCLO, et éventuellement des gènes MREG.

Le traitement évalué peut être un traitement visant l’atténuation de tache pigmentaire ou toute autre modulation de la pigmentation, pour notamment uniformiser le teint, homogénéiser la couleur de la peau ou lutter contre les dyschromies.

Selon cette méthode d’évaluation, la comparaison des niveaux d’expression du ou des gènes choisis est réalisée au sein de la peau issue d’une tache pigmentaire, ou bien au sein d’un échantillon correspondant, avant et après traitement. Il n’y a donc pas de comparaison à un niveau d’expression au sein de peau saine non lésée.

Par la méthode d’évaluation telle que décrite, un traitement donné est considéré comme efficace pour le traitement d’une tache hyperpigmentaire si le niveau d’expression est :
- inférieur après traitement par rapport au niveau d’expression avant traitement, si le gène est choisi parmi ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, et/ou
- supérieur après traitement par rapport au niveau d’expression avant traitement, si le gène est choisi parmi JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, NAV3 et PCLO, et éventuellement MREG.

Un traitement sera considéré comme sans effet si les niveaux d’expression du gène choisi, avant et après traitement, sont sensiblement identiques, ou bien si les différences observées ne sont pas significatives.

Quand il est comparé les niveaux d’expression de plus d’un gène, le traitement est considéré comme efficace pour le traitement d’une tache ou d’une irrégularité pigmentaire si, pour la majorité des gènes testés, et de préférence pour l’ensemble des gènes testés, pris individuellement, le traitement est considéré comme efficace. Pour les autres gènes choisis, le traitement doit de préférence être sans effet, mais non avoir l’effet inverse.

Selon une autre mise en œuvre, la méthode d’évaluation de l’efficacité d’un traitement des taches pigmentaires cutanées comprend la caractérisation d’une tache ou irrégularité pigmentaire selon la méthode de l’invention, avant et après traitement, et la comparaison des différences de niveaux d’expression observées entre la peau lésée de la tache ou irrégularité pigmentaire et la peau saine.

Selon cette mise en œuvre de l’évaluation de l’efficacité d’un traitement, le traitement est considéré comme efficace si la différence entre les niveaux d’expression du ou des gènes choisis dans la peau lésée issue de la tache par rapport à la peau saine, de préférence adjacente, est moindre après traitement par rapport à ce qu’elle était avant le traitement.

Quand il est comparé les niveaux d’expression de plus d’un gène, il est de préférence conclu à l’efficacité du traitement quand pour la majorité des gènes choisis, et de préférence pour l’ensemble des gènes choisis, pris individuellement, on peut conclure à un traitement efficace.

De préférence, la comparaison des niveaux d’expression du ou des gènes choisis est réalisée sur des échantillons de peau prélevés à partir de la tache pigmentaire.

Le traitement considéré, évalué par la méthode de l’invention, n’est pas limité à un type particulier de traitement.

Il peut s’agit d’un traitement par une molécule chimique, un agent actif, un extrait naturel, notamment une huile essentielle, un acide nucléique, notamment un ARN comme des siRNA ou des ARNm, un complexe protéique ou tout autre molécule ou combinaison de molécules.

Il peut également s’agir d’un traitement par un moyen physique ou des ondes, notamment électromagnétiques.

Il s’agit de préférence d’un traitement topique, mais il est également envisagé d’évaluer l’efficacité de traitements administrés par voie orale, par injection, ou par tout autre moyen d’administration.

Le traitement testé peut viser à atténuer ou faire disparaitre une tache cutanée, à moduler la pigmentation de la peau, à uniformiser le teint, à homogénéiser la couleur de la peau ou à atténuer les dyschromies.

Des traitements particulièrement préférés dans le cadre de cette invention sont des traitements cosmétiques, plus particulièrement des traitements topiques cosmétiques. Dans ce cas, la tache pigmentaire considérée est une tache ou irrégularité pigmentaire non pathologique, par exemple il s’agit d’un lentigo actinique, solaire ou sénile.

Par les méthodes de l’invention, il est également possible d’évaluer l’efficacité de la combinaison de plusieurs traitements. Il est en effet possible d’évaluer des combinaisons permettant au mieux de restaurer les niveaux d’expression d’un, de plusieurs ou de tous les gènes de l’invention, tels qu’ils sont exprimés au sein de peau non lésée.

Par les méthodes d’évaluation décrites ci-dessus, il est possible d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement envisagé, ou bien également de quantifier ou qualifier l’efficacité de traitements déjà existants contre les taches pigmentaires, notamment hyperpigmentaires. Par ce biais, il peut aussi être envisagé des combinaisons de traitements susceptibles d’être particulièrement efficaces, synergiques ou complémentaires.

Comme explicité pour les méthodes de caractérisation selon le premier aspect de l’invention, il est de préférence comparé les niveaux d’expression de plus d’un gène, de préférence d’au moins deux, trois, cinq, six, ou huit gènes de l’invention.

Des gènes ou des combinaisons de gènes tout particulièrement préférés ont déjà été explicités en regard du premier aspect de l’invention ; les mêmes gènes ou combinaisons sont préférés dans cet aspect.

Notamment, il est tout particulièrement préféré que le gène choisi le soit parmi les gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, SYNPO2, TNNT1, et LRMP, et toutes les combinaisons deux à deux ou trois à trois des gènes de cette liste sont particulièrement préférées.

L’échantillon de peau provient de préférence d’un être humain de type caucasien ou asiatique, de préférence âgé d’au moins quarante ans, de préférence d’au moins cinquante ans, voire au moins soixante ans.

De préférence, dans le cadre de la présente invention et notamment pour la méthode d’évaluation décrite, il s’agit de traitement de taches hyperpigmentaires, et tout préférentiellement de lentigos actiniques, solaires ou séniles.

La méthode d’évaluation de l’efficacité d’un traitement selon la présente invention est de préférence mise en œuvre in vitro ou ex vivo.

Il est souhaitable que l’échantillon de peau avant traitement et après traitement soit prélevé à partir de la même tache pigmentaire, ou bien d’une tache pigmentaire très proche si la taille de la tache ne permet pas d’obtenir aisément des échantillons avant et après traitement.

Méthode in vitro de criblage d’agent actif pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées

La présente invention concerne également une méthode in vitro de criblage d’agent actif pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
i. mettre en contact un modèle cellulaire représentatif de la peau avec au moins un agent actif à tester, ou exposer ledit modèle cellulaire à un traitement physique à tester ;
ii. effectuer une mesure du niveau d’’expression, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, PCLO, NAV3 et MREG, ou du niveau d’expression ou d’activité du produit d’expression dudit gène choisi, et
iii. comparer ladite mesure à une mesure de référence.

Par « modèle cellulaire représentatif de la peau » on entend au sens de la présente invention un modèle comprenant au moins des cellules de la peau comme les kératinocytes et éventuellement les mélanocytes.

Les niveaux d’expression d’au moins l’un des gènes de l’invention peuvent être évalués par référence ou après normalisation avec le niveau d’expression d’autres gènes, dont le niveau d’expression est supposé sensiblement identique au sein de la tache et dans la zone de peau non lésée choisie. De tels gènes pour la normalisation sont bien connus de l’homme du métier et peuvent dépendre de la zone du corps où se trouve la tache. A titre d’exemple, les gènes suivants peuvent être cités comme susceptibles de servir à la normalisation des niveaux d’expression des gènes de l’invention, codant pour : la protéine ribosomale L13a (RPL13A), la beta-2-microglobuline (B2M), la protéine ribosomale S9 (RPS9), la protéine ribosomale S28 (RPS28) et la Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogénase (GAPDH ).

De préférence, une mesure de référence peut être une valeur quantitative ou qualitative relative au niveau d’expression dudit ou desdits gène(s), ou du niveau d’expression ou d’activité du produit d’expression dudit ou desdits gène(s) choisi(s) déterminée dans un échantillon en l’absence d’agent actif ou de traitement physique testé.

Ainsi, une mesure de référence peut être obtenue en réitérant les étapes d’un procédé de l’invention, et notamment les étapes i. et ii. d’une méthode selon l’invention telle que définie précédemment, en l’absence d’agents actifs, ou de traitements physiques à tester.

Une comparaison de la mesure test à une mesure de référence, et une observation d’une déviation ou d’une absence de déviation entre les deux mesures, permet de tirer une information quant à l’effet de l’agent actif ou du traitement physique testé.

La détermination quantitative ou qualitative du niveau d’expression dudit ou desdits gène(s), ou du niveau d’expression ou d’activité du produit d’expression dudit ou desdits gène(s) peut être effectuée par toute méthode connue de l’homme de l’art, et notamment comme décrit précédemment.

Le modèle cellulaire peut être de tout type considéré comme approprié par l’homme du métier. Il peut s’agir notamment de modèles cellulaires mono ou co-cultures, ou de modèles tridimensionnels de peau reconstruite, ou de peau cultivée ex-vivo. Il existe également des modèles cellulaires représentatifs de taches pigmentaires, plus particulièrement de lentigos actiniques, qui peuvent être utilisés dans le cadre de cette méthode.

De tels modèles cellulaires n’ont pas besoin de mimer les taches pigmentaires (ou le lentigo) dans leur globalité mais doivent mimer des évènements biologiques, des caractéristiques morphologiques ou pigmentaires observés dans les taches pigmentaires, notamment le lentigo. De tels modèles in vitro sont bien connus de l’homme du métier.

De préférence, ledit modèle cellulaire est un modèle comprenant des kératinocytes et des mélanocytes.

Selon une mise en œuvre préférée de la méthode in vitro décrite ci-dessus, elle comprend la comparaison des niveaux d’expression d’au moins deux gènes, de préférence d’au moins trois, cinq, six, ou huit gènes de l’invention, comme explicité pour les autres méthodes d’évaluation selon l’invention.

L’invention concerne en outre une méthode in vitro de criblage d’agent actif pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
i. mettre en contact un modèle cellulaire comprenant des kératinocytes et éventuellement des mélanocytes, dans lequel lesdits kératinocytes présentent un niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG, réprimé et/ou dans lequel lesdits kératinocytes présentent un niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, surexprimé avec au moins un agent actif à tester, ou exposer ledit modèle cellulaire à un traitement physique à tester ;
ii. effectuer une mesure quantitative ou qualitative de la mélanine et/ou une mesure du niveau d’expression, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, PCLO, NAV3 et MREG, ou du niveau d’expression ou d’activité du produit d’expression dudit gène choisi, et comparer ladite mesure à une mesure de référence.

On entend au sens de la présente invention par « gène réprimé » un gène dont le niveau d’expression est inférieur au niveau d’expression moyen dudit gène dans la peau de personnes dépourvues de taches pigmentaires.

On entend au sens de la présente invention par « gène surexprimé » un gène dont le niveau d’expression est supérieur au niveau d’expression moyen dudit gène dans la peau de personnes dépourvues de taches pigmentaires.

Par « mesure qualitative ou quantitative de la mélanine » on entend au sens de la présente invention aussi bien la détermination de la présence des mélanosomes, et/ou de l’organisation des mélanosomes et/ou la morphologie des mélanosomes dans les kératinocytes notamment à l’aide d’un microscope optique ou électronique, mais aussi le dosage de mélanine par des techniques bien connues de l’homme du métier, ou encore le marquage de protéine(s) caractéristique(s) de la présence de mélanosomes comme par exemple la protéine PMEL 17 et son(leurs) dosage(s) par immunofluorescence.

Lesdites cellules dans lesquelles le niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG, , est réprimé, est encore appelées cellules « knock-out ».

La répression ou surexpression du niveau d’expression d’un ou plusieurs desdits gènes précités peut notamment être réalisée par toute méthode connue de l’homme de l’art.

A titre d’exemple, de telles cellules peuvent être obtenues par transfection et recombinaison homologue d’un fragment d’acide nucléique venant s’insérer dans ou prendre la place du gène exprimant la séquence d’acides aminés dont l’expression est à supprimer ou surexprimer.

Également, il peut être possible de supprimer l’expression d’un gène donné par transfection, par exemple à l’aide d’un lentivirus, dans la cellule d’une séquence d’acide nucléique codant pour un ARN interférant spécifique de l’ARNm issu du gène dont l’expression est à supprimer.

De préférence, le niveau d’expression d’au moins un desdits gènes précités est réprimé par transfection dans les cellules, de préférence les kératinocytes, de siRNA.

En outre, il peut être possible de surexprimer l’expression d’un gène donné par transfection, par exemple à l’aide d’un vecteur d’expression, de préférence un plasmide comprenant la séquence d’acide nucléique du gène donné ainsi qu’une séquence promotrice de l’expression dudit gène,

Toutes ces techniques de biologie moléculaire permettant de réprimer ou surexprimer l’expression d’un gène sont connues de l’homme de l’art et ne nécessitent pas de développement spécifique.

Modèle cellulaire

La présente invention concerne également un modèle cellulaire apte à cribler des agents actifs pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, comprenant des kératinocytes et éventuellement des mélanocytes, dans lequel lesdits kératinocytes présentent un niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG, réprimé et/ou dans lequel lesdits kératinocytes présentent un niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, surexprimé.

On entend au sens de la présente invention par « gène réprimé » un gène dont le niveau d’expression est inférieur au niveau d’expression moyen dudit gène dans la peau de personnes dépourvues de taches pigmentaires.

On entend au sens de la présente invention par « gène surexprimé » un gène dont le niveau d’expression est supérieur au niveau d’expression moyen dudit gène dans la peau de personnes dépourvues de taches pigmentaires.

De manière préférée, le ou lesdits gène(s) est(sont) réprimé(s) par transfection de siRNA dans lesdits kératinocytes.

Méthode de préparation du modèle cellulaire

La présente invention se rapporte également à une méthode de préparation d’un modèle cellulaire apte à cribler des agents actifs pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, comprenant les étapes suivantes :
i. prélever des kératinocytes et éventuellement des mélanocytes ; puis
ii. transfecter lesdits kératinocytes prélevés à l’étape i. à l’aide de siRNA apte à réprimer le niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG ; et/ou transfecter lesdits kératinocytes prélevés à l’étape i. à l’aide de vecteur d’expression, de préférence un plasmide notamment un plasmide, d’au moins gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, puis
iii. cultiver les kératinocytes transfectés à l’étape ii. ou co-cultiver les kératinocytes transfectés à l’étape ii. avec les mélanocytes prélevés à l’étape i.

De préférence, les kératinocytes et mélanocytes humains sont notamment obtenus à partir d’explants provenant de déchets opératoires.

Les milieux de cultures utilisés pour cultiver les kératinocytes et les mélanocytes à l’étapes iii. sont bien connus de l’homme du métier.

De préférence, les kératinocytes et les mélanocytes sont co-cultivés pendant une durée de 48h à 72h, de préférence 72h.

De préférence, les kératinocytes sont cultivés pendant une durée de 48h à 72h, de préférence 72h.

La présente invention concerne en outre un modèle cellulaire susceptible d’être obtenu ou directement obtenu par le procédé de préparation précité.

Méthode cosmétique de traitement ou de prévention de tache pigmentaire cutanée non pathologique de la peau humaine

Selon un autre aspect, la présente invention concerne également une méthode cosmétique de traitement ou de prévention de tache pigmentaire cutanée non pathologique de la peau humaine, comprenant l’application sur la peau d’une composition comprenant au moins un agent actif modulant le niveau d’expression ou de l’activité d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, où ledit gène est choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, PCLO, NAV3 et MREG.

Les taches pigmentaires cutanées non pathologiques s’entendent de taches bénignes, dont l’élimination n’est souhaitable que pour des raisons esthétiques et nullement pour des raisons thérapeutiques. Les irrégularités de pigmentation incluent les imperfections au niveau pigmentaire rendant le teint non uniforme ou la couleur de la peau non homogène.

L’application de ladite composition est réalisée de préférence sur une peau saine.

Les présents inventeurs ont montré le rôle important des gènes de l’invention au sein du derme au niveau des taches pigmentaires, et notamment le lien entre dérégulation du niveau d’expression de ces gènes et apparition de taches pigmentaires. De ce fait, suspendre ou diminuer la modulation de ces gènes peut permettre de diminuer ou abolir les dérégulations observées et ainsi permettre de restaurer une situation au niveau des gènes impliqués dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, notamment du transport des mélanosomes au sein des kératinocytes compatible avec l’absence de tache pigmentaire, avec donc un teint uniforme et une couleur de peau homogène.

Pour les mêmes raisons qu’explicitées en regard des autres aspects de l’invention, il est de préférence choisi plus d’un gène au sein des gènes de l’invention, par exemple au moins deux gènes, au moins trois, cinq, six, huit.

Selon une mise en œuvre, la méthode cosmétique a pour but de moduler le niveau d’expression de l’intégralité des gènes de l’invention.

La méthode cosmétique selon l’invention a pour but de restaurer des niveaux d’expression proches de ceux qui sont observés au sein de la peau saine, adjacente par exemple d’une tache pigmentaire.

Des gènes particulièrement préférés sont les gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, SYNPO2, TNNT1, LRMP, NAV3 et MREG.

Selon une mise en œuvre préférée, ladite tache pigmentaire est une tache hyperpigmentaire, par exemple un lentigo actinique, sénile ou solaire. Dans un tel cas, la modulation recherchée dans les méthodes cosmétiques selon l’invention est une inhibition, totale, partielle ou temporaire, de l’expression d’au moins un gène choisi parmi les gènes ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP et/ou une augmentation, éventuellement temporaire de l’expression d’au moins un gène choisi parmi JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG.

De préférence, l’inhibition n’est pas une inhibition totale, mais partielle, tendant à diminuer le niveau d’expression du gène choisi sans pour autant inhiber entièrement son expression.

Par « augmentation ou diminution du niveau d’expression », il est inclus l’augmentation ou la diminution du niveau de transcription desdits gènes, et l’augmentation ou la diminution du niveau de traduction desdits gènes, ainsi que l’augmentation ou la diminution de l’activité des protéines codées par ces gènes.

Une méthode cosmétique selon la présente invention comprend donc l’application d’une composition cosmétique comprenant notamment au moins un agent actif choisi parmi une molécule chimique, un extrait naturel, un acide nucléique, un peptide, ou d’un traitement modulant le niveau d’expression ou l’activité du produit d’expression d’au moins un des gènes de l’invention.

La composition cosmétique est de préférence appliquée de façon topique.

De préférence, la modulation est effectuée grâce à l’utilisation d’un modulateur d’un des gènes de l’invention. Par exemple, une méthode cosmétique selon l’invention comprendra avantageusement l’application d’un composé choisi parmi la caféine, le calcitriol, l’acide folique, l’acide hyaluronique, l’huile de palme, l’huile de sésame, la curcumine, et leurs mélanges.

De préférence, une méthode cosmétique selon l’invention est mise en œuvre après la caractérisation de la tache pigmentaire que l’on souhaite traiter par une méthode selon le premier aspect. En effet, cette première étape permet de caractériser la tache et donc de détecter les gènes dont le niveau d’expression est fortement modulé entre la zone de la tache et une zone non lésée, de préférence adjacente. Il est ensuite possible d’adapter un traitement qui permette d’agir sur le ou les gènes de l’invention qui sont modulés différentiellement au sein de cette tache, en appliquant spécifiquement des modulateurs pour lesdits gènes.

Ainsi, de manière encore plus préférée, la méthode cosmétique de traitement ou de prévention de tache pigmentaire cutanée non pathologique de la peau humaine, comprends les étapes suivantes :
i. caractériser une tache pigmentaire cutanée apparente ou soupçonnée chez un être humain selon la méthode de caractérisation selon l’invention ;
ii. déduire de l’étape i. si ladite tache apparente ou soupçonnée est une tache pigmentaire cutanée ;
iii. si ladite tache est identifiée comme étant une tache pigmentaire cutanée à l’étape ii., traiter ladite tache avec une composition cosmétique comprenant un agent actif permettant la modulation du niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP et PCLO, NAV3 et MREG.

Quel que soit le traitement considéré, la méthode cosmétique selon l’invention peut également comprendre l’application d’un ou plusieurs agents actifs additionnels visant à renforcer les effets recherchés par exemple, toute substance décrite comme dépigmentante, des agents kératolytiques et/ou desquamants, des antioxydants, des filtres solaires chimiques ou physiques UV, des agents anti-inflammatoires et/ou apaisants, des acides désoxyribonucléiques et leurs dérivés.

La méthode cosmétique selon la présente invention est également applicable dans le cas de la prévention de l’apparition de taches pigmentaires ou d’autres irrégularités du teint ou de la couleur de la peau, et notamment de taches hyperpigmentées telles que le lentigo actinique.

Utilisation cosmétique de modulateur dans la prévention et/ou le traitement de taches pigmentaires cutanées non-pathologiques

La présente invention concerne également l’utilisation cosmétique d’un modulateur du niveau d’expression ou de l’activité du produit d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, PCLO, NAV3 et MREG dans la prévention et/ou le traitement de taches pigmentaires cutanées non-pathologiques.

Pour le traitement de taches hyperpigmentaires, le modulateur dont il est fait usage est un inhibiteur d’au moins un gène choisi parmi ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, et/ou un activateur d’au moins un gène choisi parmi JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG. De préférence, l’inhibiteur est un inhibiteur partiel conduisant à la diminution du niveau d’expression ou à la diminution de l’activité du produit d’expression dudit gène, sans pour autant abolir entièrement l’expression ou l’activité de ce gène.

De tels modulateurs peuvent notamment être la caféine, le calcitriol, l’acide folique, l’acide hyaluronique, l’huile de palme, l’huile de sésame, la curcumine, et leurs mélanges, pour un usage dans le traitement cosmétique de taches hyperpigmentaires.

Des modulateurs bien connus sont également des molécules antisens, des siRNAs, et des microARNs.

Des modulateurs préférés dans le cadre de la présente invention sont notamment la caféine, le calcitriol, l’acide folique, l’acide hyaluronique, l’huile de palme, l’huile de sésame, la curcumine, et leurs mélanges.

Il est également envisageable d’utiliser une association d’au moins deux de ces modulateurs.

Les modulateurs peuvent être utilisés en association avec d’autres produits, agents actifs ou excipients. De préférence, ils sont conditionnés sous une forme adaptée à une application topique, par exemple sous forme de pommade, de crème notamment sous la forme d’emulsion, de lotion ou d’onguent.

Les diverses mises en œuvre détaillées dans la section relative aux méthodes cosmétiques selon l’invention sont applicables aux utilisations pour les applications cosmétiques décrites ci-dessus.

Les taches pigmentaires considérées sont de préférence des taches hyperpigmentaires et tout préférentiellement des lentigos actiniques, solaires ou séniles.

Exemple 1 : Etude transcriptionnelle

Matériel et méthodes

Sélection clinique

2 études indépendantes ont été réalisées : une étude en France sur 15 volontaires, de sexe féminin, phototypes II à IV, âgées de 51 à 67 ans et une étude au Japon sur 12 volontaires, de sexe féminin, phototypes III à IV, âgées de 57 à 70 ans.

Les lentigos actiniques sont choisis sur le dos de la main, de taille minimum 3mm.

Ils sont caractérisés par epiluminescence. Cet examen permet :

1°) de vérifier le diagnostic clinique de la lésion (lentigo actinique exclusivement) selon les critères de motifs de la jonction dermo-épidermique (structure pigmentée en réseau, de type « empreinte digitale » ) à différencier des éphélides (absence de structure pigmentée en réseau, pigmentation homogène et bords dentelés) et des kératoses séborrhéiques planes (présence de microkystes (« milia-like cysts) ou pseudo-kystes, bords francs à dentelés, ouvertures pseudofolliculaires et zones irrégulières de type « empreintes digitales ») [Menzies et al 1996; Stolz et al 2002; Marghoob et al 2005]

2°) de délimiter des zones homogènes en terme de structure/pattern à l’intérieur de ces lésions où seront faites les biopsies cutanées,

3°) d’établir un score phénotypique basé sur une analyse d’image quantitative avec le logiciel spécifique qui a été développé sur Matlab® (logiciel SQA, CMLA, ENS Cachan, UMR CNRS 8536).

Deux biopsies de 3mm de diamètres sont réalisées sur une des mains de chaque patient. Pour chaque volontaire, une des biopsies correspond à la lésion de lentigo actinique (LA) et l’autre à une zone adjacente de peau non lésionnelle (PN) (vérifiée également en épiluminescence).

Les biopsies de 3mm sont placées, dès le prélèvement, dans une solution de stabilisation des ARN (RNAlater, Qiagen référence 76154) de 16 à 24h à 4°C. Le lendemain les échantillons sont placés à -20°C jusqu’aux étapes d’homogénéisation et d’extraction.

Extraction des ARN

A la décongélation, les échantillons sont découpés au scalpel pour faciliter l’homogénéisation, puis transférés dans le tampon de lyse (Qiagen lysis buffer, RLT + 10% beta-Mercapthoethanol). Pour l’étude France, l’homogénéisation est réalisée dans un potter (Fisher Labosi ref A6391000) avec des pistons en polypropylène RNase free (Fisher Labosi ref A1419753). Pour l’étude Japon, l’homogénéisation est réalisée avec le TissueRuptor de Qiagen (ref 990890).

L’ARN a été extrait avec les kits RNeasy micro (Qiagen ref : 74004) en suivant les instructions du fournisseur. Pour l’étude France, la quantification des ARNs est réalisée par un dosage ribogreen (Molecular Probes réf R11490). Pour l’étude Japon, la quantification des ARNs est réalisée par spectrophotométrie (Nanodrop 8000).

La qualité des ARN est validée avec un bio analyseur Agilent 2100 qui donne le ratio des intensités des ARNs ribosomaux 28S sur 18S ainsi qu’un RNA Integrity Number (RIN) qui tient compte de la dégradation des ARNs. Un ARN de bonne qualité a un ratio >1,5 et un RIN > 7.

Préparation des sondes et hybridation

Une réaction de reverse transcriptase (RT) est réalisée pour obtenir les ADNc correspondants. Pour l’étude France une étape d’amplification des ADNc est réalisée.

Les ADNc sont ensuite marqués par des fluorochromes (Affymetrix labelling kit) et hybridés sur puces à ADN Affymetrix® permettant de révéler le niveau d’expression de l’ensemble des gènes du génome humain. (bio-puces à ADN de type Affymetrix U133A 2.0 contenant 54 000 sondes, permettant ainsi l’étude de l’expression de 47000 transcripts, incluant 38500 gènes caractérisés).

Le logiciel Affymetrix RMA a été utilisé pour générer les fichiers bruts et pour effectuer les contrôles qualité des deux études avant une analyse des données. Après révélation des hybridations spécifiques et traitement des données brutes (extraction, soustraction du bruit de fond, normalisation), l’expression des gènes est comparée entre la peau saine et la peau lésée.

Pour l’étude France, 2 puces Affymetrix HG_U133 Plus 2 ont été hybridées par échantillons. Les patients ne sont retenus pour la suite de l’analyse que si les 2 puces Affymetrix ont une qualité d’hybridation correcte. 13 patients sur les 15 initiaux ont pu être analysés. L’analyse statistique a été réalisée sur la moyenne des duplicats. De même, pour l’étude Japon, les résultats de l’hybridation des sondes sur les puces Affymétrix® HG_U133 Plus 2 (1 puce par échantillon) sont obtenus et contrôlés grâce au logiciel Expression Console®. Plusieurs contrôles sont effectués afin de valider la qualité de l’hybridation sur chaque puce. A l’issue de ces contrôles qualité, les résultats d’hybridation des 12 puces sont conservés pour l’analyse différentielle.

Génération des listes de gènes différentiellement exprimés entre peau lésée et peau saine
- Filtre sur le niveau d’expression : seuls les ProbeSets avec un niveau d’expression ≥ 2⁶(64) dans au moins une condition (PN ou LA) sont retenus. Après ce filtre 24393 ProbeSets sont retenus pour l’étude France et 26943 ProbeSets sont retenus pour l’étude Japon.
- Analyse supervisée :
Test t : un T-test linéaire a été appliqué aux données avec l’aide du logiciel ArrayStudio afin de comparer le profil d’expression génique du groupe des biopsies de lentigo actinique avec celui du groupe des biopsies de peau non lésionnelle. Une liste de 1973 ProbeSets modulés de façon significative (p< 0.05) dans le lentigo actinique par rapport à la peau non lésionnelle a ainsi été établie pour l’étude France et une liste de 3084 ProbeSets modulés de façon significative dans le lentigo actinique par rapport à la peau non lésionnelle pour l’étude Japon.
- Analyse non supervisée :
i. Suppression de l’effet patient : afin de supprimer l’effet patient observé dans les résultats des analyses différentielles, l’algorithme suivant a été réalisé : pour chaque patient et chaque probeset, 1) soustraction de l’expression moyenne en log2 des deux conditions (lésionnelle, non lésionnelle), 2) addition de l’expression moyenne en log2 de l’ensemble des patients et des conditions.
ii. Analyse différentielle : une analyse NMF (Non Negative Matrix Factorisation) a permis d’identifier 3296 ProbeSets dans l’étude France et 3288 ProbeSets dans l’étude Japon qui permettent de différencier le groupe des biopsies de lentigo actinique du groupe des biopsies de peau non lésionnelle (p<0,05).
- Filtre sur la modulation et union des listes : les listes de probesets différentiellement exprimés ont tout d’abord été filtrées sur le niveau de modulation : moyenne géométrique des folds corrigés 1,25 ≤|FC|< 1,5 (p value < 0.05) et |FC| ≥ 1,5 (p value < 0.05) de l’expression des gènes . Les deux listes obtenues grâce à l’analyse supervisée (test t) et l’analyse non supervisée (NMF) ont ensuite été unies afin de générer la liste finale des gènes exprimés différentiellement dans le lentigo actinique par rapport à la peau non lésionnelle. Ainsi 266 probeSets (196 gènes) sont exprimés différentiellement dans le lentigo actinique par rapport à la peau non lésionnelle dans l’étude France. 332 probeSets (245 gènes) sont exprimés différentiellement dans le lentigo actinique par rapport à la peau non lésionnelle dans l’étude Japon.

Comparaison des deux études

Les listes de gènes exprimés différentiellement dans le lentigo actinique par rapport à la peau non lésionnelle dans les deux études ont été comparées. 178 probesets, correspondant à 136 gènes, sont communs aux deux études, c’est-à-dire que 136 gènes sont modulés dans le même sens dans le lentigo actinique par rapport à la peau saine à la fois dans l’étude France et dans l’étude Japon.

Concernant les autres gènes, après analyse fine des modulations de ces gènes, il s’avère que la plupart d’entre eux sont également modulés dans le même sens de variation dans les deux populations.

À la suite de cette analyse, la signature commune aux deux études comprend donc 245 gènes significativement modulés dans les deux études.

Résultats : Liste de gènes d’intérêt - signature moléculaire du lentigo associée à la gestion des vésicules/mélanosomes

L’ensemble de ces gènes a été subdivisé en plusieurs familles fonctionnelles grâce à une analyse bibliographique ciblée. Une famille de gènes tout à fait originale dans un désordre pigmentaire /lentigo actinique est trouvée associée à une fonction biologique particulière « Transport et Gestion des vésicules » et sous-entend un défaut de gestion des vésicules, incluant les vésicules spécifiques responsables de la pigmentation, les mélanosomes. En particulier, le gène MREG (mélanoréguline) est significativement sous exprimé dans les deux études, et est associé au transport rétrograde des mélanosomes de la périphérie de la cellule au noyau (Ohbayashi N et al. 2012) et joue un rôle dans la pigmentation (Moore K.J.et al. 1988).

Les gènes, regroupés dans la famille fonctionnelle nommée « Transport et Gestion des mélanosomes » sont listés ci-dessous dans le Tableau 1. Ce tableau regroupe le gène MREG ainsi que les 19 autres gènes associés au « Transport et Gestion des mélanosomes » issus de l’analyse décrite précédemment des 245 gènes de la signature forte et faible commune aux deux études :
- Gènes sur-exprimés dans le lentigo actinique par rapport à la peau non lésionnelle : ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, LRMP.
- Gènes sous-exprimés dans le lentigo actinique par rapport à la peau non lésionnelle : JAKMIP2, KIF21A, NAV3, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, MREG.

Les gènes de cette famille sont majoritairement sous exprimés dans le lentigo actinique.

Sous-famille	Symbole	Nom	FC Japon	P value	FC France	P value
Trafic intra-cellulaire	JAKMIP2	janus kinase and microtubule interacting protein 2	-1,93	7,52E-05	-1,69	2,40E-03
	ARC	activity-regulated cytoskeleton-associated protein	1,50	4,92E-06	1,39	9,00E-03
Kinésines	KIF21A	kinesin family member 21A	-1,60	6,67E-07	-1,64	2,81E-02
Croissance axones	NAV3	neuron navigator 3	-1,78	9,49E-07	-1,78	6,80E-05
	SLITRK6	SLIT and NTRK-like family. member 6	-1,93	4,00E-04	-1,73	3,00E-04
	NRN1	neuritin 1	1,46	2,00E-04	1,59	1,00E-03
Organisation cytosquelette	SCIN	scinderin	-1,80	2,00E-04	-1,54	1,00E-04
	SYNPO2	synaptopodin 2	1,97	1,68E-05	1,63	4,00E-04
Activité contractile	TNNT1	troponin T type 1 (skeletal. slow)	-1,72	4,57E-05	-1,71	1,10E-03
	SNTB1	syntrophin, beta 1 (dystrophin-associated protein A1, 59kDa, basic component 1)	-1,51	4,92E-06	-1,41	2,00E-04
Famille Rho/Rab	ARHGAP29	Rho GTPase activating protein 29	-1,50	7,34E-06	-1,42	5,40E-03
	RAB3IP	RAB3A interacting protein (rabin3)	-1,81	2,44E-06	-1,48	2,00E-04
	RHOBTB3	Rho-related BTB domain containing 3	-1,55	4,66E-05	-1,30	3,70E-03
	RASIP1	Ras interacting protein 1	1,67	2,82E-06	1,45	2,00E-04
Endocytose	ASGR1	asialoglycoprotein receptor 1	-1,80	3,82E-05	-1,47	1,74E-06
	CHMP4C	charged multivesicular body protein 4C	-1,45	2,79E-06	-1,51	1,23E-05
Autophagie	SVIP	small VCP/p97-interacting protein	-1,55	5,12E-05	-1,321	9,00E-03
Gestion des vésicules	LRMP	lymphoid-restricted membrane protein	1,82	1,88E-02	1,71	3,40E-03
	PCLO	piccolo (presynaptic cytomatrix protein)	-1,37	4,00E-04	-1,56	1,00E-04
	MREG	melanoreguline	-1,18	1,60E-03	-1,20	4,00E-04

Tableau 1 : Liste des gènes regroupés dans des sous -familles toutes associées à la famille fonctionnelle de régulation des vésicules /mélanosomes. La première colonne indique la sous famille de gènes reliés à l’organisation des vésicules/mélanosomes, la seconde colonne le symbole du gène, la troisième colonne détaille le nom du gène. Les colonnes 4 et 6 indiquent le taux de modulation moyen (Fold-change (FC)), moyenne géométrique des taux de modulation individuels sur l’ensemble des patients de l’étude dans le Lentigo Actinique)par rapport à la peau non lésionnelle adjacente (PNL) dans l’étude France et dans l’étude Japon, respectivement. Les colonnes 5 et 7 indiquent les p-values associées à ces modulations dans l’étude France et l’étude Japon, respectivement.

Exemple 2 : Procédé de criblage : silencing et quantification des mélanosomes – Démonstration de l'effet de MREG sur l’organisation des mélanosomes.

Matériel et méthodes

Modèle expérimental de coculture : Système expérimental vitro 2D de kératinocytes chargés en mélanine

Les kératinocytes et mélanocytes humains normaux sont obtenus à partir de prélèvements de déchets opératoires, respectivement pour les kératinocytes de plastie mammaire issue d’un sujet féminin de 18ans de peau faiblement pigmentée, et pour les mélanocytes du prépuce d’un donneur de 2ans masculin de peau moyennement pigmentée. Les kératinocytes sont cultivés en milieu prolifératif MEM-7F : MEM (Gibco), contenant 10% de Serum bovin foetal (Sigma), 1% de Sodium Pyruvate (Gibco), 1% d’acides aminés non essentiels (Gibco), 1% de L-Glutamine (Gibco), et additionné d’antibiotiques/antimycotiques et de 7 facteurs de croissance (EGF 10 ng/ml, choléra toxine 10-10 M, hydrocortisone 0.4 μg/ml, adénine 180 μM, transferrine 5 μg/ml, Triiodothyonine 2 nM , insuline 5μg/ml). Ils sont décongelés à une densité de 3000 cellules/cm2, et amplifiés pendant 7 jours à 37°C, 5% de CO2 en présence de cellules nourricières (fibroblastes murins 3T3 traités à la mitomycine C). Les mélanocytes sont cultivés en milieu M2 : DMEM/F12 (1 :1), additionné de « Melanocyte Growth Medium Supplement Mix » (PromoCell), de 1% de L-Glutamine (Gibco), et d’antibiotiques/antimycotiques. Ils sont décongelés à une densité de 10 000 cellules/cm2, et amplifiés pendant 7 jours à 37°C, 5% de CO2.

Le modèle in vitro de co-culture kératinocytes/mélanocytes permet un contact entre les kératinocytes et mélanocytes, afin que les mélanocytes transfèrent les mélanosomes aux kératinocytes comme dans la peau normale. Le modèle de co-culture consiste à ensemencer les deux types cellulaires de part et d’autre d’une membrane poreuse, dans des nacelles/inserts immergées dans le milieu de culture. . Les kératinocytes sont ensemencés dans le milieu de culture DMEM-7F ou KGM-Gold lors de la transfection pendant 48h. Les mélanocytes sont ensuite ensemencés 48 heures après les kératinocytes, en milieu DMEM-7F-M2 (culture (MEM-7F additionné de «Melanocyte Growth Medium Supplement Mix » à raison de 0,833 μl de Mix par ml de milieu). Après 3 jours de co-culture, les mélanocytes sont détachés de la membrane. Les kératinocytes sont ensuite analysés directement.

Ce modèle permet le suivi des mélanosomes et de la mélanine au cours du temps au sein des kératinocytes.

Silencing du gène cible MREG
- Mise en contact de l’échantillon avec les siRNA :
La transfection des siRNA pour éteindre l’expression de la protéine MREG (NM_018000.2) est réalisée à partir d’un pool de 3 séquences de siRNA (Invitrogen Stealth RNAi siMREG 04 HSS124804, siMREG 97 HSS183197, siMREG 98 HSS183198). La séquence contrôle correspondante est notée LowGC (Stealth RNAi Negative control Low GC Invitrogen 12935-200).
Les kératinocytes en suspension sont transfectés avec 20 nM de siRNA en utilisant la lipofectamine RNAiMax (Invitrogen), puis ensemencés en milieu KGM-Gold (Lonza) sur la nacelle poreuse. Les kératinocytes sont de nouveau transfectés avec 20 nM de siRNA en utilisant la lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) en milieu KGM-Gold pendant 24h après adhésion sur la nacelle. Le lendemain le milieu est changé en DMEM-7F, et les mélanocytes sont ensemencés le jour suivant en DMEM-7F-M2.
- Analyse Western Blot et qPCR de l’extinction de MREG
Afin de valider l’extinction de l’expression de MREG, les niveaux d’expression de l’ARNm et de la protéine sont mesurés par qPCR et par Western-Blot, respectivement. Après 5 jours de transfection, une diminution moyenne de 99% du niveau d’expression de l’ARNm, et de 97% du niveau d’expression de la protéine est observée.

Analyse et quantification de l’organisation des mélanosomes dans les kératinocytes
- Marquage en immunofluorescence :
Les mélanosomes dans les kératinocytes sont analysés en immunofluorescence par le marquage de la protéine PMEL17. Les kératinocytes sont fixés en méthanol -20°C sur glace, puis incubés 1h dans la solution de blocage (PBS contenant 5% de Goat Serum, Dako), et marqués pendant 1h à température ambiante avec l’anticorps primaire dirigé contre PMEL17 (Mouse NKI/beteb antibody, Monosan, dilution 1/20). Après rinçage au PBS-Tween 0,05%, les cellules sont incubées avec les anticorps secondaires (Goat anti-Mouse Alexa Fluor 488, dilution 1/150, Life Technologies). Les noyaux sont ensuite marqués pendant 15 minutes avec Hoesch (Life Technologies 1/5000). Après rinçages en PBS, les membranes sont découpées, puis montées entre lames et lamelles (milieu de montage Fluoromount G, Southern Biotech). Les cellules sont observées au 63x à immersion avec un microscope à épifluorescence inversé Leica DMIRB4000B dans les 2 canaux à 488nm pour les vésicules de mélanine marquées PMEL17, et 405nm pour les noyaux en Hoesch.
- Analyse des images sous ImageJ :
Les images sont analysées automatiquement avec une macro ImageJ pour segmenter les cellules, et les vésicules de mélanine afin de mesurer les localisations des vésicules de mélanine marquées en vert (488nm) avec PMEL17 dans le cytoplasme.
Les étapes majeures de l’analyse de chaque image sont : la segmentation des noyaux puis des cellules, la segmentation des vésicules, et enfin la mesure et quantification des caractéristiques suivantes : taille/aire des vésicules, nombre de vésicules par cellules, densité de vésicules/µm², distance relative de chaque vésicule au noyau de la cellule, et pourcentage de vésicules présentes dans une zone périnucléaire.
Segmentation des noyaux : les étapes suivantes ont été appliquées pour segmenter les noyaux dans le canal 405nm : filtrage avec un filtre gaussien de sigma=10, soustraction du fond de fluorescence avec un rolling ball=200px, seuillage du masque des noyaux via l’intensité du marquage à 405nm manuellement, analyse des particules (taille minimum 1500px), séparation des objets avec un processus watershed, correction manuelle du masque de noyaux si besoin, enregistrement des ROInoyaux.
Segmentation cellulaire : à partir de la segmentation des noyaux, la cellule est individualisée. Une approche de « watershed» est employée. Pour chaque noyau une région cellulaire est initialisée sur le contour extérieur du noyau. Cette région est agrandie en rajoutant itérativement les pixels touchant la région en partant des pixels les plus sombres jusqu’aux pixels les plus intenses. Une analyse de particules sans filtration de taille est réalisée pour sauvegarder les ROIcellule.
Segmentation des vésicules de mélanine : les vésicules de mélanine marquées PMEL17 dans le canal 488nm sont segmentées en appliquant un filtre médian de rayon 10, puis une soustraction de ce filtre sur l’image, une segmentation par seuillage avec l’algorithme « triangle dark », une resegmentation par watershed. Une analyse des particules est effectuée avec un seuil de 3px pour les plus petites, et les coordonnées des vésicules sont sauvegardées dans les ROIvesicules.
- Quantification de la distance au noyau des vésicules de mélanine dans les kératinocytes
Plusieurs paramètres peuvent être mesurés à partir de ces différents objets : noyaux/cellules/vésicules, notamment la taille/aire des vésicules, le nombre de vésicules par cellules, la densité de vésicules/µm², la distance relative de chaque vésicule au noyau de la cellule, et le pourcentage de vésicules présentes dans une zone périnucléaire. Afin de calculer des distances entre les vésicules entre la membrane cytoplasmique et la membrane nucléaire, une carte des distances à la membrane cytoplasmique, ainsi qu’une carte des distances à la membrane nucléaire sont créées avec l’algorithme « Distance map ». Le ratio de ces deux cartes est calculé de la manière suivante (distance au noyau)/(distance au noyau + distance à la membrane cytoplasmique). Il permet d’avoir à la valeur 0 toute la zone nucléaire, à la valeur 1 la membrane cytoplasmique. La zone périnucléaire est définie comme la région comprise entre 0 et 0.35 c’est-à-dire le noyau et une zone de 35% autour du noyau.

Résultats : Démonstration de l'effet de MREG sur l’organisation des mélanosomes

L’organisation des vésicules de mélanine est analysée par immunofluorescence avec le marquage PMEL17 pour des kératinocytes après 3 jours de contact et de chargement en mélanine sur le modèle de co-culture en nacelle avec les mélanocytes normaux. L’organisation des vésicules est comparée pour des kératinocytes normaux non traités notés NT, des kératinocytes silencés avec 20nM de la séquence contrôle appelés LowGC, et silencés avec 20nM pour la protéine mélanoréguline MREG notés siMREG.

Afin de quantifier l’effet de la modulation via le silencing de MREG sur la distribution de mélanine autour du noyau dans les kératinocytes, le pourcentage de vésicules marquées PMEL17 présentes dans la zone périnucléaire est mesuré dans les kératinocytes siMREG et dans le cas contrôle LowGC. En silencing MREG seulement 42,8% des vésicules atteignent la région proche du noyau comparé à 55,4% dans le cas contrôle. Cela montre que la diminution d’expression de MREG conduit à une dispersion significative des vésicules de mélanine dans les kératinocytes, qui se retrouvent moins proches du noyau.

Exemple 3 : Modulateurs d’intérêt sur la signature

Plusieurs modulateurs chimiques sont connus pour moduler certains des gènes de la signature moléculaire du lentigo actinique associée à la gestion des vésicules/mélanosomes. Afin de rétablir l’activité, l’intérêt pour le traitement du lentigo actinique est d’avoir des inhibiteurs du niveau d’expression d’au moins un gène choisi parmi ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, ou des activateurs du niveau d’expression d’au moins un gène choisi parmi JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG. Dans le tableau ci-dessous sont regroupées plusieurs molécules d’intérêt.

Molécules Modulateurs gènes/protéines	Genes	sens modulation du modulateur	sens par rapport à la signature
Cafeine	RAB3IP	augmenté	opposé
Calcitriol	NAV3	augmenté	opposé
	TNNT1	augmenté	opposé
	SNTB1	augmenté	opposé
	CHMP4C	augmenté	opposé
	MREG	augmenté	opposé
Acide Folique	NRN1	diminué	opposé
	CHMP4C	augmenté	opposé
Acid Hyaluronique	ARHGAP29	augmenté	opposé
Huile de palme	KIF21A	augmenté	opposé
	TNNT1	augmenté	opposé
Huile de sésame	NAV3	augmenté	opposé
	NRN1	diminué	opposé
Curcumine	LRMP	diminué	opposé

Claims (17)

1. Méthode de caractérisation d’une tache pigmentaire cutanée apparente ou soupçonnée chez un être humain, comprenant la mesure puis la comparaison des niveaux d’expression mesurés, dans des échantillons de peau issue de ladite tache et de peau adjacente non lésée, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, NAV3 et PCLO, et éventuellement du gène MREG.
2. Méthode selon la revendication 1, comprenant la comparaison des niveaux d’expression d’au moins deux gènes distincts, de préférence d’au moins cinq gènes distincts choisis parmi ladite liste.
3. Méthode selon la revendication 1, où ledit gène est choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP et PCLO.
4. Méthode selon la revendication 1, où ladite tache est confirmée comme tache hyperpigmentaire quand le niveau d’expression mesuré est :

   • supérieur dans l’échantillon de peau issue de la tache par rapport au niveau dans l’échantillon de peau adjacente non lésée, si le gène est choisi parmi ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, et/ou
   • inférieur dans l’échantillon de peau issue de la tache par rapport au niveau dans l’échantillon de peau adjacente non lésée, si le gène est choisi parmi JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, NAV3 et PCLO, et éventuellement MREG.
5. Méthode selon la revendication 1, où ladite tache pigmentaire est un lentigo actinique, sénile ou solaire.
6. Méthode d’évaluation de l’efficacité d’un traitement du lentigo actinique, comprenant la mesure puis la comparaison des niveaux d’expression mesurés dans un échantillon de peau issue d’un lentigo actinique, avant et après traitement, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, NAV3 et PCLO, et éventuellement du gène MREG.
7. Méthode selon la revendication 6, où ledit traitement est considéré comme efficace pour le traitement du lentigo actinique quand le niveau d’expression mesuré est :

   1. inférieur après traitement par rapport au niveau d’expression avant traitement, si le gène est choisi parmi ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, et/ou
   2. supérieur après traitement par rapport au niveau d’expression avant traitement, si le gène est choisi parmi JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, NAV3 et PCLO et éventuellement MREG.
8. Méthodein vitrode criblage d’agents actif pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :

   1. mettre en contact un modèle cellulaire représentatif de la peau avec au moins un agent actif à tester, ou exposer ledit modèle cellulaire à un traitement physique à tester ;
   2. effectuer une mesure du niveau d’’expression, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, PCLO, NAV3 et MREG, ou du niveau d’expression ou d’activité du produit d’expression dudit gène choisi, et
   3. comparer ladite mesure à une mesure de référence.
9. Méthode cosmétique de traitement ou de prévention du lentigo actinique de la peau humaine, comprenant l’application sur la peau d’une composition comprenant au moins un agent actif modulant le niveau d’expression ou l’activité d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, où ledit gène est choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, PCLO, NAV3 et MREG.
10. Méthode selon la revendication 9, où ladite méthode comprend la modulation d’au moins deux gènes, de préférence d’au moins cinq gènes distincts, choisis parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, PCLO, NAV3 et MREG.
11. Méthode selon la revendication 9, où ladite modulation est une inhibition si le gène est choisi parmi ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP ; et/ou une augmentation du niveau d’expression ou de l’activité si le gène est choisi parmi JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG.
12. Utilisation cosmétique d’un modulateur du niveau d’expression ou de l’activité du produit d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, PCLO, NAV3 et MREG dans le traitement du lentigo actinique.
13. Utilisation selon la revendication 12, où ledit modulateur est la caféine, le calcitriol, l’acide folique, l’acide hyaluronique, l’huile de palme, l’huile de sésame, la curcumine, et leurs mélanges.
14. Méthode de préparation d’un modèle cellulaire apte à cribler des agents actifs pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, comprenant les étapes suivantes :

    1. transfecter les kératinocytes prélevés à l’aide de siRNA apte à réprimer le niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG ; et/ou transfecter lesdits kératinocytes prélevés à l’aide de vecteur d’expression, de préférence un plasmide, d’au moins gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, puis
    2. cultiver les kératinocytes transfectés à l’étape i. ou co-cultiver les kératinocytes transfectés avec les mélanocytes préalablement prélevés.
15. Modèle cellulaire apte à cribler des agents actifs pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, susceptible d’être obtenu ou directement obtenu selon la méthode de préparation telle que défini dans la revendication 14.
16. Modèle cellulaire apte à cribler des agents actifs pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, comprenant des kératinocytes et éventuellement des mélanocytes, dans lequel lesdits kératinocytes présentent un niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG, réprimé et/ou dans lequel lesdits kératinocytes présentent un niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, surexprimé.
17. Méthode in vitro de criblage d’agent actif pour prévenir et/ou traiter les taches pigmentaires cutanées, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :

    1. mettre en contact un modèle cellulaire comprenant des kératinocytes et éventuellement des mélanocytes, dans lequel lesdits kératinocytes présentent un niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, KIF21A, SLITRK6, SCIN, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, ASGR1, CHMP4C, SVIP, PCLO, NAV3 et MREG, réprimé et/ou dans lequel lesdits kératinocytes présentent un niveau d’expression d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes ARC, NRN1, SYNPO2, RASIP1, et LRMP, surexprimé avec au moins un agent actif à tester, ou exposer ledit modèle cellulaire à un traitement physique à tester ;
    2. effectuer une mesure quantitative ou qualitative de la mélanine et/ou une mesure du niveau d’’expression, d’au moins un gène impliqué dans la gestion des vésicules, de préférence des mélanosomes, choisi parmi la liste constituée des gènes JAKMIP2, ARC, KIF21A, SLITRK6, NRN1, SCIN, SYNPO2, TNNT1, SNTB1, ARHGAP29, RAB3IP, RHOBTB3, RASIP1, ASGR1, CHMP4C, SVIP, LRMP, PCLO, NAV3 et MREG, ou du niveau d’expression ou d’activité du produit d’expression dudit gène choisi, et comparer ladite mesure à une mesure de référence..