FR2873925A1 - Procede et dispositif de lyse-rescellement pour l'incorporation de principe actif notamment asparaginase ou inositol hexaphosphate, dans des erythrocytes - Google Patents

Abstract

Procédé de lyse-rescellement pour la préparation d'érythrocytes renfermant un principe actif, le procédé comprenant les étapes suivantes :- mise en suspension d'un culot globulaire dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 %, réfrigération entre + 1 et + 8 °C,- mesure de la fragilité osmotique à partir d'un échantillon d'érythrocytes de ce même culot globulaire,les étapes 1 et 2 pouvant être réalisées dans un ordre quelconque,- procédure de lyse et d'internalisation du principe actif, à l'intérieur d'une même enceinte, à une température constamment maintenue entre + 1 et + 8 °C, comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 % et d'une solution de lyse hypotonique réfrigérée entre + 1 et + 8 °C, dans une cartouche de dialyse ; les paramètres de lyse étant ajustés en fonction de la fragilité osmotique mesurée précédemment ; et- procédure de rescellement conduite dans une deuxième enceinte à une température comprise entre + 30 et + 40 °C à l'aide d'une solution hypertonique.

Description

Procédé et dispositif de lyse-rescellement pour l'incorporation de

principe actif

notamment asparaginase ou inositol hexaphosphate, dans des érythrocytes La présente invention est relative à un procédé permettant la mise en oeuvre de la technique dite de lyse-rescellement qui permet d'incorporer des principes actifs dans les érythrocytes. L'invention est également relative à un dispositif adapté à la mise en oeuvre de ce procédé. io

L'invention est encore relative à des compositions d'érythrocytes renfermant de l'asparaginase ou un analogue, ou de l'inositol hexaphosphate, susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.

La technique de lyse-rescellement est décrite dans les brevets EP-A-101 341 et EPA-679 101. Ce dernier décrit une installation relativement complexe comportant d'une part un boîtier réfrigéré pour la partie lyse dans lequel vient se placer un ensemble réunissant des éléments à usage unique, incluant cartouche de dialyse, tubulures, poches à chicanes ou serpentin et des éléments amovibles métalliques tels que serpentin de refroidissement, et d'autre part un boîtier pour le rescellement, muni de moyens de réchauffement dans lequel vient se placer un ensemble à usage unique en matière plastique.

Les globules rouges, préalablement séparés du plasma, soumis à des faibles forces ioniques (en milieu hypotonique) gonflent jusqu'à atteindre un volume critique où la membrane est distendue au point de devenir perméable aux ions et aux macromolécules. L'examen au miscrocope des membranes érythrocytaires révèle alors l'apparition de pores mesurant de 20 à 500 nm, d'où l'hémoglobine peut s'échapper (P. Seeman J. Cell. Biol. 1967, 32(1) : 55-70). La restauration de l'isotonicité du milieu de suspension entraîne la fermeture des pores rendant la membrane imperméable aux macromolécules. Seule une perméabilité ionique est maintenue.

Le choc hypotonique est réalisé en faisant circuler des globules rouges dans le compartiment sang d'un dialyseur, de préférence à fibres creuses, et en faisant circuler à contre flux une solution hypotonique dans le compartiment dialysat . L'intérêt de cette technique réside dans le confinement des globules rouges durant le choc hypotonique, ce qui permet de réduire considérablement les pertes de constituants essentiels à la vie de ces cellules. Ainsi la demi-vie des globules rouges n'est pas modifiée significativement in vivo.

L'intérêt de l'utilisation des globules rouges comme vecteurs de médicaments, par io rapport à d'autres techniques comme l'encapsulation dans des liposomes ou microsphères, réside essentiellement dans le fait que ces corpuscules ont une biocompatibilité naturelle , sont totalement biodégradables selon un processus bien connu, ont une durée de vie in vivo relativement longue (120 jours environ), et que diverses molécules chimiques et thérapeutiques peuvent y être encapsulées.

Le processus d'internalisation par lyse et rescellement des érythrocytes est un phénomène multifactoriel complexe. Des paramètres physicochimiques importants influant sur la variabilité des résultats sont la concentration en hémoglobine avant dialyse, le débit de la suspension d'érythrocytes dans le dialyseur, l'osmolarité du tampon de dialyse hypotonique, les températures de dialyse et de rescellement, la pression transmembranaire dans le dialyseur. La fragilité osmotique des érythrocytes varie d'un échantillon sanguin à un autre et pourrait être un facteur biologique prépondérant. Ainsi, L. Boucher et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 1996, 24, 73-78, ont étudié l'influence des variations de la fragilité osmotique de différentes populations de globules rouges sur la distribution et la concentration finale en inositol hexaphosphate. En conclusion, les auteurs indiquent que la fragilité osmotique initiale des globules rouges a un rôle prédominant dans le degré de lyse et dans les variations d'internalisation du principe actif et que cette fragilité osmotique dépend de nombreux facteurs tels que la perméabilité des globules rouges, le rapport surface/volume et contenu ionique, l'état physiologique et l'âge du donneur (voir aussi A.A. Hussain et al., Br. J. Haematol. 1984, 57(4) : 716-718), la durée de conservation du sang, la présence de médicaments, maladies (voir aussi K. Kolanjiappan et al., Clin. Chim. Acta 2002, 326(1-2) : 143-149), traitements. Les résultats obtenus en faisant varier le débit de suspension d'érythrocytes ont montré l'extrême sensibilité des conditions opératoires, avec un débit variant entre 12 et 14 ml/min selon que les globules rouges appartiennent à un groupe de fragilité réduite ou à un groupe de fragilité élevée.

Ces travaux donnent donc des premières informations sur les différents facteurs influant sur la fragilité osmotique des globules rouges et sur les performances de l'incorporation par la technique de lyse-rescellement. Ils permettent de comprendre les difficultés rencontrées en pratique, qui expliquent que cette technique ne puisse pas être appliquée en routine en clinique humaine. i0

Une publication toute récente résume bien la situation actuelle. C. G. Millan et al. Ont publié, dans Journal of Controlled Release 2004, 95: 2749, une revue générale sur l'utilisation des érythrocytes comme vecteurs pharmaceutiques, où ils concluent que malgré l'intérêt qu'ils suscitent en médecine humaine, leur développement est encore aujourd'hui très limité, en raison des difficultés de conservation, des risques de contamination et l'absence de procédure industrielle validée permettant leur préparation.

L'asparaginase est une enzyme produite à partir de microorganismes bactériens (E.

Coli ou Erwiniase) qui hydrolyse et déplète l'asparagine, acide aminé indispensable à la fabrication des protéines nécessaires à la vie cellulaire, notamment des fibroblastes. Or, certaines cellules lymphoblastiques cancéreuses n'ont pas, à l'inverse des cellules normales, la capacité de fabriquer elles-mêmes leur asparagine et sont dépendantes des sources extracellulaires. Le traitement par l'asparaginase les prive alors de ce constituant, aboutissant à leur mort. Cet antimitotique est sélectif des cellules tumorales.

L'asparaginase native induit cependant chez l'homme la production d'anticorps circulants chez plus de 70 % des patients en moyenne, à l'origine d'une augmentation de la clairance de l'asparaginase et de réactions allergiques parfois très sévères (B. Wang et al., Leukaemia 2003 17,8: 1583-1588). Ainsi, bien que très efficace dans le traitement des leucémies aigues lymphoblastiques, l'asparaginase est hautement toxique et peut entraîner des réactions d'hypersensibilités, allant d'une simple réaction de type urticaire à un véritable choc anaphylactique. Par ailleurs, sont observés des effets néfastes d'ordre neurologique (troubles de la conscience), hémostatique (hypofibrinogénémie, diminution du taux sérique d'antithrombine III et d'autres facteurs de la coagulation, à l'origine de complications hémorragiques et/ou thrombotiques), gastro-intestinal, pancréatique (y compris pancréatites aiguës).

L'encapsulation de l'asparaginase dans des hématies permet d'améliorer l'index thérapeutique (D. Schrijvers et al., Clin. Pharmacokinet. 2003, 42 (9) : 779-791). Il serait donc d'un intérêt majeur de proposer un procédé permettant d'encapsuler de io manière reproductible et industrielle l'asparaginase dans les érythrocytes.

Par ailleurs, l'inositol hexaphosphate a été proposé comme substitut du 2, 3-DPG (2,3-diphosphoglycérate) dans les érythrocytes, pour diminuer significativement l'affinité de l'oxygène pour l'hémoglobine et augmenter la libération de l'oxygène dans les tissus (EP-A-0 101 341). Les brevets US 4,321,259, US 5,612,207 et US 6,610,702 décrivent l'incorporation de ce substitut dans des érythrocytes et l'utilisation de ceux-ci dans diverses applications thérapeutiques. Parmi celles-ci, est mentionnée une indication comme adjuvant d'un traitement de cancer par radiothérapie, pour améliotrer l'oxygénation de tumeurs hypoxiques et leur sensibilité à la radiothérapie. Cette indication n'est cependant accompagnée d'aucun élément de faisabilité.

Pour l'encapsulation, US 4,321,259 utilise la fusion entre érythrocytes et liposomes enfermant l'inositol hexaphosphate. US 5,612,207 utilise une technique par électroporation. US 6 610 702 présente une amélioration de la technique par électroporation, en associant l'inositol hexaphosphate à des cations ammonium pour former un complexe hydrosoluble biocompatible susceptible de favoriser la pénétration dans les érythrocytes. Enfin, dans Biotechnol. Appl. Biochem. 1996, 24, 73-78, décrit supra, L. Boucher et al. étudient l'introduction d'inositol hexaphosphate dans les érythrocytes par la technique de lyse-rescellement. Différentes pistes s'ouvrent donc à l'homme du métier, pour l'incorporation de ce composé dans des érythrocytes. Toutefois, comme le mentionne C. G. Millan et al. (supra), qui mentionne l'inositol hexaphosphate pour le transport d'oxygène en général, l'utilisation d'érythrocytes incorporant une molécule telle que l'inositol hexaphosphate se heurte aujourd'hui à l'absence d'une procédure industrielle validée.

Dans cette application aussi, il serait d'un intérêt majeur de disposer d'un procédé s permettant d'encapsuler de manière reproductible et industrielle l'inositol hexaphosphate dans les érythrocytes.

Compte-tenu de ce qui précède, la déposante s'est donnée pour objectif de proposer lo un procédé de lyse-rescellement industriel permettant de produire des érythrocytes incorporant de manière reproductible des quantités souhaitées de principe actif, et permettant d'obtenir un produit répondant aux normes de la tranfusion sanguine (stérilité, absence de pathogènes et pyrogènes).

Un objectif important de l'invention est de proposer un tel procédé susceptible d'être appliqué aux culots globulaires qualifiés selon les normes de transfusion sanguine.

Un autre objectif est de proposer un tel procédé, permettant d'encapsuler de l'asparaginase ou de l'inositol hexaphosphate dans des érythrocytes, et ce de manière performante, reproductible, sûre et stable.

Cet objectif, ainsi que d'autres, sont atteints par un procédé de lyserescellement pour la préparation d'érythrocytes renfermant au moins un principe actif, le procédé comprenant les étapes suivantes: 1 - mise en suspension d'un culot globulaire dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 %, réfrigération entre + 1 et + 8 C, 2 - mesure de la fragilité osmotique à partir d'un échantillon d'érythrocytes de ce même culot globulaire, les étapes 1 et 2 pouvant être réalisées dans un ordre quelconque (y compris en parallèle), 3 - procédure de lyse et d'internalisation du principe actif, à l'intérieur d'une même enceinte, à une température constamment maintenue entre + 1 et + 8 C, comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 % et d'une solution de lyse hypotonique réfrigérée entre + 1 et 8 C, dans une cartouche de dialyse; les paramètres de lyse étant ajustés en fonction de la fragilité osmotique mesurée précédemment; et 4 - procédure de rescellement conduite dans une deuxième enceinte à l'intérieur de laquelle la température est comprise entre + 30 et + 40 C, et en présence d'une solution hypertonique.

Par internalisation , on entend pénétration du principe actif à l'intérieur des érythrocytes.

io Suivant une première caractéristique de l'invention, le culot globulaire est mis en suspension dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite élevé, égal ou supérieur à 65 %, et de préférence égal ou supérieur à 70 %, et cette suspension est réfrigérée entre + 1 et + 8 C, de préférence entre + 2 et + 6 C, typiquement aux alentours de + 4 C. Suivant une modalité particulière, le taux d'hématocrite est compris entre 65 et 80 %, de préférence entre 70 et 80 %.

Conformément à une caractéristique importante de l'invention, la fragilité osmotique est mesurée sur les érythrocytes juste avant l'étape de lyse. Les érythrocytes ou la suspension les contenant sont avantageusement à une température proche de, ou identique à la température sélectionnée pour la lyse. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, la mesure de la fragilité osmotique effectuée est rapidement exploitée, c'est-à-dire que la procédure de lyse est réalisée à bref délai après la prise d'échantillon. De préférence, ce laps de temps entre prise d'échantillon et début de lyse est inférieur ou égal à 30 minutes, mieux encore inférieur ou égal à 25 et même à 20 minutes.

Les deux paramètres permettant de maîtriser la dialyse sont le temps de présence des cellules dans le dialyseur (en fonction des caractéristiques de ce dernier) et l'osmolarité du dialysat. Les deux paramètres doivent être ajustés en fonction des caractéristiques de résistance, ou à l'inverse de fragilité, osmotique des globules rouges conditionnés pour subir les étapes de lyse/rescellement. Cette résistance osmotique peut être caractérisée par au moins un des paramètres suivant: a. l'osmolarité du milieu pour laquelle l'hémolyse apparaît, c'est-à-dire le début de la formation des pores.

b. La vélocité V de l'hémolyse, déterminée par la pente de la partie linéaire de la courbe % hémolyse = f (osmolarité du milieu).

c. Le pourcentage d'hémolyse pour une osmolarité donnée.

d. L'osmolarité qui permet d'obtenir 50 % d'hémolyse (HSO).

e. Le temps pour obtenir un certain pourcentage d'hémolyse (par exemple 50 0/0).

Suivant des modes de réalisation préférés, on caractérise la résistance osmotique à l'aide des paramètres b, d ou b et d. i0

La fragilité osmotique doit donc être mesurée dans un temps court, compatible avec le laps de temps court entre prise d'échantillon et début de lyse. Suivant une caractéristique de l'invention, on mesure un ou plusieurs de ces paramètres d'hémolyse, contre une solution hypotonique, d'isotonicité connue, e.g. eau (eau distillée ou autre), au travers d'une membrane semi-perméable. Une méthode manuelle peut être envisagée. Cependant, suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, la fragilité osmotique est mesurée à l'aide d'un appareil de mesure automatique conformé pour mesurer la fragilité osmotique d'un échantillon d'érythrocytes en moins de 15 minutes, plus particulièrement en moins de 12 minutes et de préférence en moins de 10 minutes, et le résultat obtenu est exploité dans un bref laps de temps pour ajuster les paramètres de lyse, et débuter cette dernière.

La mesure de la fragilité osmotique peut être réalisée à l'aide d'un appareil automatisant au moins en partie la technique manuelle décrite par J.V. Dacie dans Practical Haematology, 2nd edn, Churchill, London 1956. Un exemple d'un tel appareil est décrit dans l'article de J. Didelon et al., Clinical Hemorheology and Microcirculation 23 (2000) 31- 42. Le principe est basé sur l'utilisation d'un dispositif mettant en présence, de part et d'autre d'une membrane semi-perméable, l'échantillon de la suspension d'érythrocytes à évaluer, et une solution hypotonique, d'isotonicité connue, e.g. de l'eau distillée, en volumes adaptés, de façon à générer une hémolyse lente des érythrocytes à mesure que les ions NaCl diffusent vers la solution, e.g. l'eau distillé. L'évolution de l'hémolyse au cours du temps est suivie par mesure de la transmittance (voir aussi J. Didelon et al., Biorheology 37, 2000: 409- 416) au moyen d'un rayonnement laser ayant une longueur d'onde de 808 nm. Une cellule photoélectrique mesure les variations de la lumière transmise au travers de la suspension. Par exemple, les mesures sont effectuées sur 10 minutes. L'appareil permet d'obtenir un ou plusieurs des paramètres a e mentionnés supra.

Suivant une première modalité, on effectue la mesure de la fragilité osmotique sur un échantillon dont la température initiale est comprise entre + 1 et + 8 C, de préférence avec de l'eau distillée également à cette température, dans des conditions où l'évolution de la température n'est pas préjudiciable à la mesure.

io Suivant une deuxième modalité, la mesure de la fragilité osmotique est réalisée sur un échantillon maintenu à la température comprise entre + 1 et + 8 C. Ainsi, l'appareil de mesure décrit dans J. Didelon et al. supra peut être modifié pour permettre la régulation de la température. De préférence cette température est proche de ou identique à la température de lyse.

Une fois un ou plusieurs de ces paramètres déterminé(s), une relation peut être appliquée prenant en compte ce ou ces paramètres afin de déterminer soit le débit des cellules dans le dialyseur, soit l'osmolarité du dialysat, adéquate pour obtenir des globules rouges encapsulant la substance active et/ou la quantité désirée de celle- ci: Débit hématies = [A x (HSO)] + [B x (V)] + K A et B = variables adaptables en fonction du dialyseur et osmolarité de la solution de lyse K = constante d'ajustement.

Osmolarité dialysat = [C x (HSO)] + [D x (V)] + K C et D = variables adaptables en fonction du dialyseur et du débit des hématies dans le dialyseur K = constante d'ajustement.

Suivant un aspect de l'invention, on débute la procédure de lyse lorsque la température de la suspension d'érythrocytes est comprise entre + 1 et + 8 C, et que la fragilité osmotique a été mesurée et les paramètres de lyse enregistrés.

Suivant une caractéristique avantageuse, la suspension initiale à traiter est placée dans l'enceinte de lyse-internalisation mentionnée supra. Suivant un mode de réalisation de l'invention, le procédé utilise un module réfrigéré muni d'une régulation de température, on place dans ce module une poche de la suspension d'érythrocytes réfrigérée entre + 1 et + 8 C, raccordée, ou que l'on raccorde, à un ensemble amovible stérile à usage unique, comportant une cartouche de dialyse, des tubulures de raccordement de la cartouche d'une part à la poche et d'autre part à la solution de lyse, le module comportant en outre des moyens susceptibles d'assurer la circulation de la suspension d'érythrocytes et de la solution de lyse, module à l'intérieur duquel on stabilise la température entre + 1 et + 8 C. Le module réfrigéré est dimensionné pour loger la poche et l'ensemble amovible à usage unique. Le fait de disposer la poche, la cartouche de dialyse, la solution de lyse, reliés par les diverses tubulures, dans un tel module réfrigéré unique est une caractéristique avantageuse du procédé selon l'invention.

Le terme poche renvoie aux poches souples communément utilisées dans le domaine de la transfusion sanguine et des dérivés sanguins.

Suivant un aspect important de l'invention, on fait en sorte de maintenir les érythrocytes en suspension homogène dans la poche, de manière à maintenir stable le taux d'hématocrite de la suspension traversant le dialyseur. Suivant une caractéristique de l'invention, la poche est ainsi munie d'une circulation extérieure en boucle, susceptible d'assurer une circulation de la suspension à partir de, et vers, la poche.

Par cartouche de dialyse, on entend un élément comportant deux compartiments séparés par une paroi de dialyse à travers laquelle peut se faire un échange ionique qui permet de modifier de façon contrôlée la pression osmotique d'une solution aqueuse située dans l'un des compartiments en introduisant dans l'autre compartiment une solution aqueuse comportant un sel. Ce type de cartouche est largement utilisé dans le domaine médical. Suivant une modalité préférée, on utilise une cartouche de dialyse à fibres creuses, par exemple une telle cartouche ayant les spécificités suivantes: diamètre intérieur des fibres compris entre 100 et 400 um, surface extérieure totale des fibres comprise entre 0,3 et 2 m2, longueur des fibres i0 comprise entre 10 et 40 cm, coefficient d'ultrafiltration compris entre 1,5 et 8 ml/h.mmHg.

Comme il a été précisé plus haut, on peut débuter la procédure de lyse lorsque la température de la suspension dans la poche est comprise entre + 1 et + 8 C. Suivant une modalité intéressante, on contrôle la température de la suspension à l'aide d'un capteur placé sur la circulation extérieure en boucle.

Suivant la fragilité osmotique relevée, on peut jouer sur deux paramètres principaux, io le débit de la suspension d'érythrocytes dans la cartouche de dialyse et l'osmolarité de la solution de lyse, étant entendu qu'il est préférable de fixer, dans les deux cas, un débit constant pour la solution de lyse. La valeur du débit n'est pas critique. Typiquement, pour une cartouche de dialyse à fibres creuses, telle que décrite supra, le débit de la solution de lyse est fixé entre 50 et 300 ml/min, de préférence entre 150 et 250 ml/min.

La solution de lyse est une solution saline hypotonique par rapport à la suspension de globules rouges. Lorsqu'elle est fixée à une valeur constante, son osmolarité peut typiquement être située entre 20 et 120 mOsm, de préférence entre 70 et 110 mOsm, par exemple de l'ordre de 90 mOsm.

A titre d'exemple, la solution de lyse peut comprendre Na2HPO4 et/ou NaH2PO4 et un sucre tel que le glucose.

Suivant une première modalité, on adapte le débit de la suspension d'érythrocytes au travers de la cartouche de dialyse, tandis que débit et osmolarité du tampon de lyse sont fixés. Plus la fragilité osmotique est élevée, plus le débit de la supension est augmenté. Typiquement, pour une cartouche dont les spécifications on été indiquées supra, le débit sera amené à varier dans l'intervalle de 5 à 200 ml/min, de préférence 3o de 10 à 40 ml/min.

Suivant une deuxième modalité, on adapte l'osmolarité de la solution de lyse, tandis que les débits de suspension et de la solution de lyse sont fixés. Plus la fragilité osmotique est élevée, plus l'osmolarité de la solution de lyse est augmentée.

Typiquement, l'osmolarité sera amenée à varier dans l'intervalle de 10 à 200 mOsm/l, de préférence de 20 à 150 mOsm/l.

Suivant une troisième modalité, on adapte à la fois le débit de la suspension s d'érythrocytes au travers de la cartouche de dialyse, et l'osmolarité de la solution de lyse.

Conformément à l'invention, on introduit un ou plusieurs principes actifs destinés à être incorporés dans les érythrocytes. Le ou les principes actifs peuvent être w présents dans la poche de suspension et/ou être introduits, de préférence progressivement, dans la circulation de suspension en amont ou en aval de la cartouche de dialyse. Les volumes introduits étant faibles, une réfrigération du principe actif est optionnelle.

De préférence, la suspension de globules rouges est produite à partir d'un culot globulaire de groupe sanguin compatible avec le receveur, déleucocyté, sans pathogène recensé, notamment présenté en poche, par exemple de 500 ml. Les globules rouges peuvent avoir été irradiés lorsqu'ils sont destinés à des patients fortement immunodéprimés susceptibles d'exprimer une réaction immunologique greffon/hôte (R.J. Davey Immunol. Invest. 1995, 24 (1-2) : 143-149).

Suivant une particularité de l'invention, le culot globulaire initial, servant à préparer la suspension, a subi au préalable un traitement visant à éliminer les éléments du sang autres que les érythrocytes. Ce type de traitement, par exemple lavage avec une solution saline pour éliminer le plasma ou une solution de conservation, est connu de l'homme du métier.

Suivant une modalité particulière, le lavage est réalisé en présence d'un ou plusieurs principes actifs à encapsuler.

Le lavage peut être réalisé par toute technique usuelle, telle que la technique poche quadruple ou 4 poches pour le lavage de globules rouges (méthode et poche de transfert MacoPharma). On peut aussi utiliser un laveur de globules rouges automatique du type COBE 2991 Oeil Processor.

Suivant une autre caractéristique de l'invention, les érythrocytes peuvent être préalablement traités avec une solution susceptible d'augmenter et/ou d'homogénéiser leur résistance osmotique. De telles solutions sont connues de s l'homme du métier. Par exemple, une solution contenant de la L-carnitine peut permettre d'obtenir une amélioration de la résistance osmotique des globules rouges. Comme autres exemples, on peut citer les solutions d'héparine, de citratephosphate-dextrose (CPD) et de mannitol.

De préférence, la température lors de l'étape de lyse, est maintenue entre + 2 et + 6 C, et de manière encore plus préférée aux environs de + 4 C.

La procédure de rescellement est de préférence effectuée par réchauffage de la suspension lysée et ajout d'une solution de rescellement hypertonique. La température de rescellement peut être comprise entre + 30 et + 40 C. Elle est de préférence comprise entre + 35 et + 38 C, par exemple 37 C environ. L'incubation peut typiquement durer de 15 à 45 minutes.

De préférence, la suspension sortant de la cartouche de dialyse ainsi qu'une solution hypertonique de rescellement sont introduites, de préférence en continu, dans une poche intermédiaire. La suspension y est réchauffée, et incubée à la température souhaitée pendant un délai suffisant pour assurer le rescellement. Suivant un aspect particulier, la poche intermédiaire est placée dans un module ou enceinte chauffée, dont la température intérieure est régulée à la température choisie.

En variante, la suspension est amenée dans une poche intermédiaire, ainsi que la solution de rescellement. Lorsque la totalité de la suspension a été recueillie dans cette poche, elle est scellée et transférée dans un module permettant le chauffage et l'incubation à la température souhaitée.

La suspension de globules rouges rescellés peut ensuite subir une ou plusieurs étapes de lavage à l'aide d'une solution saline, en vue d'éliminer les cellules non ou mal rescellées, les résidus et l'hémoglobine extracellulaire.

Suivant une autre caractéristique, on conditionne les érythrocytes dans une solution de conservation des hématies, par exemple contenant de la Lcarnitine.

Les érythrocytes produits sont de préférence conservés à une température comprise entre + 1 et + 8 C, de préférence entre + 2 et + 6 C, typiquement à environ + 4 C.

Le taux d'hématocrite final du produit prêt-à-l'emploi est de préférence comprise entre 60 et 90 %.

La présente invention a également pour objet un dispositif de lyserescellement susceptible d'être utilisé pour la mise en oeuvre du procédé de préparation d'érythrocytes conforme à l'invention, le dispositif comprenant: - un module susceptible d'être réfrigéré à une température comprise entre + 1 et + 8 C, comprenant des moyens de refroidissement et de régulation de température, - un ensemble amovible stérile à usage unique, conçu pour pouvoir être placé dans le module et comprenant une cartouche de dialyse susceptible d'être raccordée d'une part à une arrivée de solution de lyse et d'autre part à une arrivée de suspension d'érythrocytes, - des moyens de réglage du débit de la suspension d'érythrocytes au travers de la cartouche de lyse et/ou d'ajustement de l'osmolarité de la solution de lyse, en fonction de la fragilité osmotique des érythrocytes à traiter.

Suivant un mode de réalisation, l'ensemble amovible, qui est en soit un objet de l'invention, est un kit à usage unique et comporte une pochesusceptible de contenir la suspension d'érythrocytes et une tubulure raccordant cette poche à la cartouche de dialyse, et le module comporte une pompe susceptible de coopérer avec cette tubulure et de faire circuler la suspension d'érythrocytes à partir de la poche vers et au travers de la cartouche, cette pompe étant éventuellement couplée aux moyens de réglage de débit. L'ensemble permet d'assurer le maintien de la stérilité.

Suivant une caractéristique avantageuse, la poche est en outre munie d'une tubulure en boucle raccordée à la poche à ses deux extrémités, et le module comporte une pompe susceptible de coopérer avec cette tubulure et d'assurer une circulation du contenu de la poche depuis et vers cette poche. Une telle poche souple munie d'une tubulure en boucle et d'au moins un point d'entrée ou sortie, constitue un objet de l'invention en soi. Cette poche peut comporter au moins une autre tubulure souple, raccordée à chaque entrée/sortie. La poche peut être associée à une pompe (e.g. péristaltique) agencée pour coopérer avec la tubulure en boucle et/ou un support pour la poche et éventullement la pompe. Une telle poche peut être utilisée pour l'administration de compositions (e.g. suspension, émulsion) à l'homme ou à l'animal, dès lors qu'il est souhaitable de conserver une certaine homogénéité à la composition, par exemple composition pour alimentation parentérale.

Suivant une autre caractéristique avantageuse, une sonde de température est disposée sur cette tubulure en boucle.

Suivant une autre caractéristique, une tubulure d'injection de principe actif est raccordée à la tubulure reliant la poche à l'entrée sang de la cartouche de dialyse.

Suivant une autre caractéristique, la cartouche de dialyse est raccordée par une tubulure à un flacon susceptible de contenir la solution de lyse et le module réfrigéré comporte des moyens de réception de ce flacon et d'une pompe susceptible de coopérer avec ladite tubulure pour faire circuler la solution de lyse vers et au travers de la cartouche de dialyse.

Suivant une caractéristique préférée de l'invention, les moyens de refroidissement et 25 de régulation de température sont susceptibles de maintenir une température comprise entre + 2 et + 6 C, de préférence de l'ordre de + 4 C dans le module.

Suivant une autre caractéristique, la sortie sang de la cartouche de dialyse est raccordée à une tubulure de sortie débouchant ou susceptible de déboucher à l'extérieur du module. Suivant une autre caractéristique, une tubulure d'injection de principe actif est raccordée à cette tubulure de sortie. La tubulure de sortie peut être raccordée à une deuxième poche (poche intermédiaire) susceptible de recueillir la suspension d'érythrocytes issue de la lyse ainsi qu'une solution de rescellement (introduite de préférence par une tubulure secondaire débouchant dans la tubulure de sortie un peu en amont de son débouché dans la poche intermédiaire). Cette poche est avantageusement disposée dans un second module muni de moyens susceptible de réguler la température dans ce module entre + 30 et + 40 C, de préférence entre + 35 C et + 38 C.

Suivant un mode de réalisation avantageux, l'ensemble amovible à usage unique comporte d'un seul tenant les poches, tubulures de circulation, tubulures d'injection (munies d'un dispositif d'injection ou d'un réceptable destiné à coopérer avec un tel dispositif), cartouche de dialyse, et de préférence flacon de solution de lyse. i0

De préférence, l'ensemble amovible lui-même ne comporte pas de moyens spécifiques destinés au refroidissement ou au réchauffage. Ces fonctions sont uniquement apportées par les modules ou enceintes dans lesquels les deux parties de l'ensemble seront placées.

Les pompes utilisées dans le procédé et le dispositif de l'invention sont de préférence des pompes péristaltique (pompes occlusives) ; suivant un mode de réalisation, la pompe assurant la recirculation de la suspension de et vers la poche initiale et la pompe de circulation du tampon de lyse ont une vitesse de rotation constante prédéterminée, tandis que la pompe envoyant la suspension vers la cartouche de dialyse a une vitesse de rotation réglable en fonction de la fragilité osmotique des érythrocytes à traiter.

L'introduction de principe actif peut se faire par tout moyen adapté, par exemple un pousse-seringue à débit fixe, éventuellement piloté, raccordé à la tubulure d'injection correspondante. En variante, on peut remplacer les pousse-seringue par des pompes péristaltiques.

Le dispositif comporte des moyens de réglage du débit de la suspension 30 d'érythrocytes au travers de la cartouche de lyse et/ou d'ajustement de l'osmolarité de la solution de lyse, en fonction de la fragilité osmotique des érythrocytes à traiter.

Suivant une caractéristique, les moyens de réglage de débit sont conçus pour piloter la pompe envoyant la suspension vers la cartouche de dialyse. Suivant une autre caractéristique alternative, les moyens de réglage sont conçus pour réguler l'osmolarité d'une solution de lyse, soit pour diluer et faire baisser l'osmolarité, soit pour augmenter cette osmolarité en introduisant un soluté adapté. En variante, on choisit d'introduire dans le module, une solution de lyse d'osmolarité adaptée à la fragilité osmotique des érythrocytes à traiter.

Suivant une modalité préférée, le dispositif comporte des moyens électroniques aptes à commander le processus de lyse et éventuellement le processus de rescellement, suivant des instructions entrées par l'opérateur (e.g. l'opérateur entre directement les données concernant le débit de la suspension d'érythrocytes), ou suivant des données entrées par l'opérateur, se rapportant à la fragilité osmotique (les moyens électroniques étant conçus alors pour déterminer et régler les paramètres de lyse, e.g. le débit de la suspension d'érythrocytes). Ces moyens électroniques sont de préférence reliés aux capteurs de température (permettant de contrôler la température dans les modules et/ou au capteur de température pour la suspension d'érythrocytes). Ces moyens sont susceptibles de commander et piloter les pompes, par exemple la pression et le débit de suspension au travers de la cartouche de dialyse.

De préférence, les modules sont munis sur une face au moins, d'une surface vitrée, permettant de contrôler visuellement l'installation et la circulation des solutions et suspensions.

Le procédé et le dispositif selon l'invention sont utilisables pour l'incorporation de nombreux principes actifs, choisis notamment parmi les médicaments, vaccins, enzymes, peptides, antigènes et agents de contraste utilisés en thérapie humaine ou animale (voir par exemple C. G. Millan, J. Controllled Released 2004, 95: 27-49).

Un autre objet de l'invention est l'application du procédé conforme à l'invention, à l'incorporation performante, reproductible, sûre et stable de l'asparaginase. Par asparaginase, on entend conformément à l'invention toute asparaginase quelle que soit son origine, naturelle, synthétique, artificielle, recombinante et les dérivés l'incorporant, par exemple combinaisons d'asparaginase et d'un polymère tel que le polyéthylène glycol (PEG) (par exemple l'asparaginase péguilée ou pegasparaginase qui est une forme d'asparaginase encapsulée dans du PEG; e.g. Oncaspar commercialisé par Enzon et Medac).

Suivant les différentes modalités possibles, l'asparaginase est introduite dans la poche initiale et/ou dans la circulation de la suspension en amont et/ou en aval de la cartouche de dialyse. Elle est de préférence introduite dans la circulation de la suspension en amont de la cartouche de dialyse. La suspension est ensuite rescellée, lavée, éventuellement additionnée d'une solution de conservation, puis stockée, de préférence en poche souple, en vue de son usage.

On connaît des méthodes permettant de doser l'asparaginase dans la suspension, si bien qu'il est possible de régler le volume de suspension dans la poche finale pour correspondre à une dose prescrite pour le traitement.

Suivant un mode de réalisation préféré, le culot de départ est déleucocyté et/ou irradié.

Suivant un aspect particulier, on introduit également un principe actif destiné à un traitement combiné, par exemple la vincristine et/ou du methotrexate, et/ou éventuellement tout autre principe actif utile au côté de l'asparaginase.

L'invention a aussi pour objet une suspension ou un culot d'érythrocytes renfermant de l'asparaginase, susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Les érythrocytes peuvent aussi contenir de la vincristine et/ou du methotrexate, et/ou éventuellement tout autre principe actif utile au côté de l'asparaginase.

La présente invention a aussi pour objet un procédé de traitement des leucémies aigues lymphoblastiques et des lymphomes, par administration d'une quantité efficace d'une suspension d'érythrocytes renfermant de l'asparaginase, susceptible d'être obtenue suivant le procédé de l'invention. Un aspect particulier de l'invention comprend le prélèvement d'un ou plusieurs échantillons de sang, d'un patient ou d'un ou plusieurs donneurs, la préparation d'un culot d'érythrocytes, l'incorporation d'asparaginase conformément à l'invention et la production d'un lot d'érythrocytes incorporant de l'asparaginase, puis l'administration de la suspension au patient, par voie intra-veineuse. Typiquement, on administre un volume de suspension d'érythrocytes traités correspondant à de 60 à 200 unités d'asparaginase par kg de poids corporel.

Elle a aussi pour objet l'utilisation d'érythrocytes renfermant de l'asparaginase, susceptibles d'être obtenus suivant le procédé de l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter un patient contre une leucémie aigue lymphoblastique ou un lymphome. Un aspect particulier de l'invention comprend l'utilisation d'une ou io plusieurs unités de sang prélevées sur un patient ou un ou plusieurs donneurs, pour la préparation d'un culot d'érythrocytes, l'incorporation d'asparaginase conformément à l'invention et la production d'un lot d'érythrocytes incorporant de l'asparaginase, pour le traitement dudit patient avec ces érythrocytes. Suivant une modalité particulière, l'utilisation vise à produire une poche contenant une dose, par exemple un volume de suspension d'érythrocytes traités comprenant l'équivalent de 60 à 200 unités d'asparaginase par kg de poids corporel.

Un autre objet de l'invention est l'application du procédé conforme à l'invention à l'incorporation performante, reproductible, sûre et stable d'inositol phosphate, notamment inositol hexaphosphate et inositol pentaphosphate, ou leurs dérivés. II s'agit de préférence d'inositol hexaphosphate.

Suivant les différentes modalités possibles, l'inositol phosphate est introduit dans la poche initiale et/ou dans la circulation de la suspension en amont et/ou en aval de la cartouche de dialyse. Elle est de préférence introduite dans la poche initiale. La suspension est ensuite lysée, rescellée, lavée, éventuellement additionnée d'une solution de conservation, puis stockée, de préférence en poche souple, en vue de son usage.

On connaît des méthodes permettant de doser l'inositol phosphate dans la suspension, si bien qu'il est possible de régler le volume de suspension dans la poche finale pour correspondre à une dose prescrite pour le traitement.

Suivant un mode de réalisation préféré, le culot de départ est déleucocyté et/ou irradié.

L'invention a aussi pour objet une suspension ou un culot d'érythrocytes renfermant 5 de l'inositol phosphate, en particulier inositol hexaphosphate ou pentaphosphate susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre du procédé de l'invention.

L'invention a également pour objet une méthode d'oxygénation tumorale, notamment associée à une radiothérapie, comprenant l'administration au patient d'une quantité efficace d'une suspension d'érythrocytes incorporant de l'inositol phosphate, notamment inositol hexaphosphate, susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention. Un aspect particulier de l'invention comprend le prélèvement d'un ou plusieurs échantillons de sang, d'un patient ou d'un ou de plusieurs donneurs, la préparation d'un culot d'érythrocytes, l'incorporation d'inositol phosphate, notamment inositol hexaphosphate, conformément à l'invention, et la production d'un lot d'érythrocytes incorporant ce composé, puis l'administration de la suspension au patient par voie intra-veineuse. De préférence, cette méthode est associée à un traitement de radiothérapie et l'on peut ainsi administrer par voie intra-veineuse, les érythrocytes traités, en continu, pendant tout ou partie du traitement de radiothérapie et de préférence en sus avant et/ou après ce traitement, pendant une période de temps suffisante.

La méthode selon l'invention peut être utilisée dans le traitement des différents cancers et notamment des cancers du poumons, de la prostate, du rectum, de l'oesophage ainsi que des tumeurs cérébrales. La méthode vise en particulier les tumeurs faiblement radiosensibles, généralement hypoxiques, et en particulier les gliomes malins. Suivant les aspects particuliers de l'invention, la méthode vise le traitement du glioblastome et des cancers ORL.

La présente invention a encore pour objet l'utilisation de tels érythrocytes renfermant de l'inositol phosphate en particulier inositol hexaphosphate, susceptible d'être obtenu suivant le procédé de l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter un patient contre un cancer du type de ceux décrits supra, en particulier en association avec une procédure de radiothérapie. Un aspect particulier de l'invention comprend l'utilisation d'une ou plusieurs unités de sang prélevées sur un patient ou un ou plusieurs donneurs, pour la préparation de culots d'érythrocytes, l'incorporation du composé actif conformément à l'invention et la production de lots d'érythrocytes incorporant ce composé, pour le traitement dudit patient avec ces érythrocytes.

L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs et se référant au dessin dans lequel: la figure 1 est une représentation schématique d'un dispositif de lyse- ro rescellement conforme à l'invention; - la figure 2 est une synoptique de base du procédé.

On se réfère tout d'abord à la figure 1. Un premier cadre en traits interrompus figure un premier module 1, ayant une forme globalement parallélépipédique, comportant une face avant vitrée non représentée et conformée de manière à pouvoir être ouverte et fermée. Sur le fond de ce module se trouvent disposés des pompes péristaltiques P1, P2 et P3, et des moyens de réception, non représentés, d'un ensemble amovible qui va maintenant être décrit. Les pompes P1 et P3 sont à débit constant prédéterminé. La pompe P2 est pilotée pour en faire varier le débit.

L'ensemble amovible comporte une poche 2 souple, contenant la suspension d'érythrocytes à lyser. Cette poche 2 est équipée d'une tubulure 3 souple, en boucle, coopérant avec la pompe P1, afin d'assurer une circulation depuis et vers la poche pour maintenir les érythrocytes en suspension. Cette poche est en outre raccordée à sa base à une tubulure 4 souple raccordée à l'entrée du compartiment sang d'une cartouche de dialyse 5. Cette tubulure 4 coopère avec la pompe P2, qui assure la circulation de la suspension depuis la poche vers la cartouche. Un pousse- seringue PSI piloté est raccordé à la tubulure 4 en amont de la cartouche 5, ce pousse-seringue étant destiné à l'introduction de principe actif dans la circulation d'érythrocytes. La sortie du compartiment sang de la cartouche 5 est raccordée à une tubulure 6 souple de sortie, débouchant à l'extérieur du module 1. Un deuxième pousse-seringue PS2 piloté est raccordé à la tubulure 6, ce pousse-seringue étant destiné à l'introduction de principe actif dans la circulation d'érythrocytes lysés. Un flacon 7 contenant une solution de lyse est disposé dans le module 1, et raccordé à l'entrée dialysat de la cartouche 5 par une tubulure 8 souple, coopérant avec la pompe P3 assurant la circulation de la solution de lyse au travers de la cartouche 5. Enfin, la solution de lyse sortant de la cartouche est évacuée du module 1 par une tubulure 9 souple d'évacuation, débouchant dans un flacon 10 situé en dehors du module 1.

La tubulure 6 de sortie pénètre dans un second module 11 ayant une forme globalement parallélépipédique, comportant une face avant vitrée non représentée et conformée de manière à pouvoir être ouverte et fermée. Sur le fond de ce module se trouvent disposés des moyens de réception, non représentés, d'éléments faisant partie de l'ensemble amovible qui vient d'être en partie décrit. Il s'agit d'une poche 12 souple, raccordée à la tubulure 6, et dans laquelle vient se stocker la suspension lysée. Un pousse-seringue PS3 piloté est raccordé à la tubulure 6, et permet d'injecter le produit de rescellement.

L'ensemble amovible est entièrement réalisé en matière plastique souple et transparente, permettant une visibilité complète du processus.

Le dispositif est pourvu en outre de divers moyens non représentés: moyens permettant de refroidir l'intérieur du module 1 et d'y réguler la température entre + 2 et + 4 C, comprenant entre autres une sonde de température placée sur la tubulure 3 pour mesurer la température de la suspension y circulant, une sonde de température pour la mesure de la température T1 à l'intérieur du module 1, - le module 11 est pourvu en outre de moyens permettant de chauffer l'intérieur du module 11 et d'y réguler la température T2 entre + 37 et + 38 C; une sonde de température est placée à l'intérieur du module.

- moyens de détection (par exemple ultrasons ou colorimétriques) de la présence d'érythrocytes dans les tubulures, en Dl et D2, moyens PR1 de mesure de pression à l'entrée de la cartouche de dialyse. dispositif électronique recevant d'une part les informations provenant des sondes de température, de pression et des moyens de détection, et d'autre part les informations relatives aux réglages des paramètres de lyse; à partir de ces données, le dispositif pilote les pompes P1, P2 et P3. Un synoptique de procédé est représenté à la figure 2.

Le dispositif électronique est constitué d'un ordinateur conçu pour faire fonctionner le 5 synoptique ci-dessus.

Suivant une caractéristique supplémentaire, il enregistre les paramètres de chaque procédure de lyse et donc de chaque culot traité.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1 Procédé de lyse-rescellement pour la préparation d'érythrocytes renfermant un principe actif, le procédé comprenant les étapes suivantes: - mise en suspension d'un culot globulaire dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 %, réfrigération entre + 1 et + 8 C, io - mesure de la fragilité osmotique à partir d'un échantillon d'érythrocytes de ce même culot globulaire, les étapes 1 et 2 pouvant être réalisées dans un ordre quelconque, - procédure de lyse et d'internalisation du principe actif, à l'intérieur d'une même enceinte, à une température constamment maintenue entre + 1 et + 8 C, comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 % et d'une solution de lyse hypotonique réfrigérée entre + 1 et + 8 C, dans une cartouche de dialyse; les paramètres de lyse étant ajustés en fonction de la fragilité osmotique mesurée précédemment; et procédure de rescellement conduite dans une deuxième enceinte à une 20 température comprise entre + 30 et + 40 C à l'aide d'une solution hypertonique.

2 Procédé selon la revendication 1, dans lequel la fragilité osmotique est mesurée à l'aide d'un appareil de mesure conformé pour mesurer la fragilité osmotique d'un échantillon d'érythrocytes en moins de 15 minutes et le résultat obtenu est exploité dans un bref laps de temps pour ajuster les paramètres de lyse.

3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel on mesure un ou des paramètres d'hémolyse de l'échantillon d'érythrocytes contre une solution hypotonique, d'isotonicité connue, de préférence eau distillée, au travers d'une membrane semi-perméable.

4 - Procédé selon la revendication 3, dans lequel on mesure un ou plusieurs des paramètres suivants: a. l'osmolarité du milieu pour laquelle l'hémolyse apparaît, b. La vélocité de l'hémolyse, déterminée par la pente de la partie linéaire de la courbe % hémolyse = f(osmolarité du milieu).

c. Le pourcentage d'hémolyse pour une osmolarité donnée.

d. L'osmolarité qui permet d'obtenir 50 % d'hémolyse.

e. Le temps pour obtenir un certain pourcentage d'hémolyse.

Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on utilise un module réfrigéré muni d'une régulation de température, on place dans ce module une poche de la suspension d'érythrocytes, réfrigérée entre + 1 et + 8 C, io raccordée, ou que l'on accorde, à un ensemble amovible stérile à usage unique, comportant une cartouche de dialyse, des tubulures de raccordement de la cartouche d'une part à la poche et d'autre part au flacon, le module comportant en outre des moyens susceptibles d'assurer la circulation de la suspension d'érythrocytes et de la solution de lyse, module à l'intérieur duquel on stabilise la température entre + 1 et + 8 C.

6 Procédé selon la revendication 5, dans lequel on débute la procédure de lyse lorsque la température de la suspension dans la poche est comprise entre + 1 et + 8 C.

7 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on maintien un taux d'hématocrite stable dans la suspension, tout le temps que dure son passage dans la cartouche de dialyse.

8 Procédé selon la revendication 7, dans lequel on utilise une poche munie d'une circulation extérieure en boucle susceptible d'assurer une circulation de la suspension à partir de, et vers, la poche.

9 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, à partir de la mesure de fragilité osmotique, on règle le débit de la suspension d'érythrocytes passant dans la cartouche de dialyse, ou bien on choisit l'osmolarité de la solution de lyse.

Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le principe actif est présent dans la poche de suspension et/ou est introduit dans la circulation de suspension avant et/ou après le passage au travers de la cartouche de dialyse.

11 - Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le culot globulaire contient des érythrocytes qui ont été préalablement traités avec une solution susceptible d'augmenter et/ou d'homogénéiser leur résistance osmotique.

io 12 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la température lors des étapes 1 et 3 est maintenue entre + 2 et + 6 C, et est de préférence d'environ + 4 C.

13 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le 15 principe actif est choisi parmi asparaginase et inositol hexaphosphate.

14 Dispositif de lyse susceptible d'être utilisé pour la mise en oeuvre du procédé de préparation d'érythrocytes renfermant un principe actif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le dispositif comprenant un module (1) muni de moyens de refroidissement, un ensemble amovible (2 à 12) stérile à usage unique, conçu pour pouvoir être placé dans le module (1) et comprenant une cartouche de dialyse (5) susceptible d'être raccordée d'une part à une arrivée de solution de lyse et d'autre part à une arrivée de suspension d'érythrocytes, caractérisé en ce que le module (1) est muni de moyens de régulation de la température entre + 1 et + 8 C et de moyens de réglage du débit de la suspension d'érythrocytes au travers de la cartouche de lyse et/ou de réglage de l'osmolarité de la solution de lyse, en fonction de la fragilité osmotique des érythrocytes à traiter.

Dispositif selon la revendication 14, dans lequel l'ensemble amovible comporte une poche (2) susceptible de contenir la suspension d'érythrocytes et une tubulure (4) raccordant cette poche à la cartouche de dialyse (5), et le module (1) comporte une pompe (P2) susceptible de coopérer avec cette tubulure (4) et de faire circuler la suspension d'érythrocytes à partir de la poche (2) vers et au travers de la cartouche (5), cette pompe (P2) étant éventuellement couplée aux moyens de réglage de débit.

16 Dispositif selon la revendication 14 ou 15, dans lequel la poche est munie d'une tubulure (3) en boucle raccordée à la poche (2) à ses deux extrémités, et le module (1) comporte une pompe (P1) susceptible de coopérer avec la tubulure (3) et d'assurer une circulation du contenu de la poche depuis et vers cette poche.

17 Dispositif selon la revendication 16, dans lequel une sonde de température est disposée sur la tubulure (3) en boucle.

l0 18 Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une tubulure d'injection de principe actif est raccordée à la tubulure (4) reliant la poche (2) à l'entrée sang de la cartouche de dialyse (5), cette dernière est raccordée par une tubulure (8) à un flacon (7) susceptible de contenir la solution de lyse, et le module (1) comporte des moyens de réception de ce flacon (7) et une pompe (P3) susceptible de coopérer avec ladite tubulure (8) pour faire circuler la solution de lyse vers et au travers de la cartouche de dialyse; et la sortie sang de la cartouche de dialyse est raccordée à une tubulure (6) débouchant ou susceptible de déboucher à l'extérieur du module.

19 Dispositif selon la revendication 18, dans lequel la tubulure (6) est raccordée à une deuxième poche (12) susceptible de recueillir la suspension d'érythrocytes issue de la lyse ainsi qu'une solution de rescellement, cette poche étant disposée dans un second module (11) muni de moyens susceptibles de réguler la température dans le module entre + 30 et + 40 C, de préférence entre + 35 C et + 38 C.

Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant des moyens électroniques aptes à commander le processus de lyse et éventuellement le processus de rescellement, suivant des instructions entrées par l'opérateur, ou suivant des données entrées par l'opérateur, se rapportant à la fragilité osmotique.

21 Ensemble à usage unique en matière plastique souple et adapté à la mise en oeuvre du procédé et du dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une poche (2) munie d'une tubulure (3) en boucle raccordée à la poche par ses deux extrémités, la poche (2) est ensuite raccordée à une tubulure (4) reliée à l'entrée sang d'une cartouche de dialyse (5), la sortie sang de cette dernière est raccordée à une tubulure (6) reliée à une deuxième poche (12), au moins une tubulure supplémentaire débouchant dans la tubulure (4) s ou (6), et la cartouche de dialyse est en outre raccordée à deux tubulures (8 et 9) destinées à la circulation d'une solution de lyse; la tubulure (6) est de préférence raccordée à une deuxième poche (12) et une tubulure secondaire est raccordée à la tubulure (6).

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