FR2847589A1

FR2847589A1 - Procede de detection universelle de microorganismes et milieu reactionnel permettant la mise en oeuvre du procede

Info

Publication number: FR2847589A1
Application number: FR0214789A
Authority: FR
Inventors: Faure Isabelle Besson; Jean Pierre Hermet; Sebastien Ribault
Original assignee: Hemosystem
Current assignee: Hemosystem
Priority date: 2002-11-25
Filing date: 2002-11-25
Publication date: 2004-05-28
Anticipated expiration: 2022-11-25
Also published as: FR2847589B1; AU2003294087A1; EP1565568A1; CA2507079A1; JP2006507010A; US20060134729A1; WO2004050902A1; CN1717495A

Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de détection de microorganismes mettant en oeuvre un milieu réactionnel comprenant un agent de marquage, au moins un agent de pénétration cellulaire qui favorise le passage moléculaire dudit agent de marquage vers le génome des microorganismes. L'invention a également pour objet ledit milieu réactionnel de marquage.

Description

PROCEDE DE DETECTION UNIVERSELLE DE MICROORGANISMES ET MILIEU REACTIONNEL PERMETTANT LA MISE EN #UVRE DU PROCEDE.

La présente invention appartient au domaine de la microbiologie et, en particulier, elle concerne les procédés de détection et d'identification de microorganismes dans les différents milieux dans lesquels ils peuvent se trouver.

De nombreux procédés de détection des microorganismes ont été mis au point répondant ainsi à des besoins variés. On peut ainsi citer l'analyse d'échantillons médicaux, le contrôle de la qualité dans l'industrie agroalimentaire et le suivi du traitement des eaux.

La méthode de détection idéale des microorganismes devrait être rapide, spécifique (absence de faux positifs), sensible et simple à mettre en #uvre. Elle permettrait la détection des microorganismes vivants et morts dans des milieux divers. Enfin, une première identification des types de bactéries impliquées serait un atout supplémentaire.

Les méthodes de culture, sur boîte ou en phase liquide, permettent la détection de toutes les bactéries en phase de croissance dans la plupart des milieux, avec une bonne sensibilité. Une seule bactérie suffit, en théorie, pour obtenir un résultat positif après culture et les cultures en phase liquide sont automatisables (Aubert G et al., 1993). Cependant, le temps nécessaire à l'obtention du résultat est parfois très long. Ainsi la détection dans les produits sanguins des souches de propionibacterium demande plus

de quatre jours de culture (Brecher ME. et al., 2001).

Quant aux mycobacterium, plus de vingt jours peuvent être nécessaires à leur détection (Saitoh H. et al., 2000). La croissance d'une bactérie est, également, fortement conditionnée par le choix du milieu de culture qui peut être simple ou enrichi et qui contient ou non des inhibiteurs d'agents antibactériens. Les conditions de culture sont également spécifiques de la souche à détecter. On utilisera ainsi des températures d'incubation variées et des conditions aérobies ou anaérobies. Avec ces méthodes, l'identification des microorganismes doit se faire dans un deuxième temps suivant la culture. Enfin la détection des bactéries mortes ou non revivifiables est impossible avec ce type de technologie.

Les procédés mettant en #uvre des techniques de biologie moléculaire sont rapides, puisque quelques heures d'incubation sont suffisantes pour déclarer un échantillon positif, et sensibles avec la possibilité de détecter moins de dix microorganismes par réaction.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) permet la détection en temps réel des contaminations bactériennes dans un échantillon en utilisant des sondes fluorescentes spécifiques de l'ADN cible (He Q. et al., 2002). Il est nécessaire de purifier cet échantillon afin de protéger la polymérase nécessaire à la réaction d'amplification des inhibiteurs potentiels. On rencontre par exemple de nombreux inhibiteurs de PCR dans le plasma (Al-Soud WA. et al., 2000). Cette étape préalable de purification fait que le procédé de détection de microorganismes mettant en #uvre la PCR n'est pas un processus d'utilisation aisée. Aussi, dans le cas d'un

échantillon ayant contenu des bactéries phagocytées par des leucocytes, toute trace d'ADN résiduel entraînera la positivité de l'échantillon ce qui nuit fortement à la spécificité de la méthode.

Les techniques d'hybridation permettent la détection universelle et/ou la détection spécifique des bactéries (Braun-Howland EB. et al., 1992 ; S. et al., 2002). Comme pour la PCR, l'étape de préparation de l'échantillon est encore une fois une étape contraignante et limitante dans cette méthode. La présence d'acides nucléiques résiduels est une fois encore source de faux positifs.

La principale limitation des techniques de biologie moléculaire réside dans le choix de l'amorce dont la spécificité doit être suffisamment large pour une détection générique et cependant spécifique des microorganismes à détecter pour éviter les réactions faussement positives. Un mélange de différentes amorces est généralement nécessaire provoquant des contraintes techniques.

Les méthodes de marquage immunohistochimiques ou immunocytochimiques (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) faisant appel à un anticorps dirigé contre la paroi bactérienne sont limitées par la spécificité de l'anticorps. En effet, à ce jour, aucun anticorps ne permet la détection universelle des microorganismes. Cette technique n'est utilisable que pour des souches de bactéries précisément identifiées (Kakinoki K. et al., 2001 ; Guarner J. et al., 2002). Elle demande également une préparation particulière des cellules ou tissus à analyser comprenant, par exemple, des étapes de fixation et de pénétration cellulaire de l'échantillon

faisant intervenir des solvants de type acétone, formaldéhyde et méthanol.

Les méthodes microscopiques qui font appel à la colorimétrie utilisant par exemple des colorants de GRAM, ou des colorants vitaux ou des fluorochromes permettent une identification visuelle morphologique du type de bactérie impliquée dans la contamination (Fazii P. et al., 2002). Cependant, elles manquent de sensibilité et elles demandent un temps de manipulation élevé ainsi qu'une croissance de plusieurs jours du microorganisme pour permettre sa visualisation (Mirrett S. et al., 1982).

L'utilisation de la cytométrie permet la détection des microorganismes de façon rapide et simple (Reynolds DT. et al., 1999 ; Okada H. et al., 2000).

Toutefois, la limitation de cette méthode réside dans le procédé de marquage. En effet, on utilise soit des anticorps spécifiques de la paroi de la souche ciblée qui ne permettent pas la détection universelle des bactéries, soit des marqueurs de l'ADN de type agents intercalants (molécules capables de s'insérer entre les plateaux formés par les bases appariées d'un acide nucléique). Cette dernière option nécessite toutefois une manipulation préalable des bactéries visant à perméabiliser leur paroi pour laisser pénétrer le marqueur (Marie D. et al., 1996 ; Okada H. et al., 2000) . Il est notable que ces agents sont particulièrement sensibles au milieu et ne seront efficaces que dans des conditions strictement définies de concentrations en ions et de pH (Marie D. et al., 1996).

Pour pallier les inconvénients ci-dessus énumérés, la Demanderesse a conçu un procédé de détection universelle des microorganismes qui met en #uvre un marqueur commun à toutes les bactéries, levures, moisissures et parasites, par exemple un composé intercalant de l'ADN, non spécifique d'une séquence nucléique particulière.

Ce procédé de détection peut s'appliquer à tout fluide biologique. Au sens de la présente invention, on entend par fluide biologique, tout fluide, pouvant contenir un ou plusieurs microorganismes, tel que par exemple, des milieux ioniques, des milieux de culture, des milieux physiologiques et concerne ainsi des domaines d'application divers, comme l'analyse d'échantillons médicaux, le contrôle de la qualité dans l'industrie agroalimentaire ou encore le suivi du traitement des eaux.

Le procédé de marquage de microorganismes objet de la présente invention met en #uvre un milieu réactionnel comprenant un agent de marquage, des agents de pénétration cellulaire qui favorisent le passage moléculaire dudit agent de marquage vers le génome des microorganismes et ce quelle que soit la nature dudit microorganisme. De manière tout à fait avantageuse, le procédé de marquage de l'invention permet de conserver intègre la structure des microorganismes, notamment des bactéries.

Ce milieu réactionnel permet le passage de l'agent de marquage à travers : - la membrane cytoplasmique, à savoir la bicouche lipidique et les protéines membranaires des microorganismes quels qu'ils soient ;

- la paroi des bactéries Gram positif constituée en majeure partie de peptidoglycane ou muréine qui vient au contact de la membrane cytoplasmique et qui est, éventuellement, recouverte d'une couche superficielle de polysaccharides ; - la membrane externe des bactéries Gram négatif, qui contient beaucoup de phospholipides, de lipoprotéines et de lipopolysaccharides, qui est séparée de la membrane cytoplasmique par un espace périplasmique où l'on trouve les protéines et qui est percée de pores. Cette paroi est imperméable à la plupart des substances, à l'exception de celles qui pénètrent par les pores.

Ce nouveau procédé de marquage des microorganismes permet le marquage universel tant des microorganismes vivants que des microorganismes morts ou non revivifiables.

Une analyse des microorganismes ainsi marqués est réalisable, par exemple, en fluorescence par des méthodes microscopiques avec microscope à épifluorescence, et/ou de cytométrie en flux et/ou de cytométrie en phase solide.

Le procédé de l'invention comprend une préparation originale des microorganismes à partir des échantillons les contenant. Différents réactifs sont utilisés pour, dans une même étape, pénétrer les microorganismes sans altérer leur morphologie et les marquer en fluorescence.

Le procédé de l'invention permet de conserver intègre la structure des bactéries pour une analyse selon des techniques de biologie cellulaire permettant éventuellement de différencier de façon

visuelle les grandes familles de microorganismes : bacilles, coques, spores, levures.

Ledit procédé permet à la fois la détection et l'identification morphologique des microorganismes sur la base de leur forme et de leur taille. Ce procédé est applicable à la détection de microorganismes dans différents milieux physiologiques, de culture et/ou ioniques.

Le procédé de détection universelle des microorganismes comporte une à deux étapes.

Les microorganismes en suspension dans de l'eau, du tampon, du sérum physiologique, du milieu de culture, du plasma ou des dérivés sanguins sont mis en présence d'un milieu réactionnel unique comprenant l'agent intercalant de l'ADN, et au moins un réactif de pénétration cellulaire.

Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé de détection de microorganismes éventuellement présents dans un fluide biologique, comprenant les étapes suivantes : a) on prélève un échantillon dudit fluide biologique, b) on met en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant un agent de marquage et au moins un agent de pénétration cellulaire de la membrane desdits microorganismes, c) on filtre ledit échantillon sur un filtre susceptible de retenir les microorganismes marqués éventuellement présents dans ledit échantillon et d) on détecte les microorganismes marqués et retenus dans le filtre à l'étape (c).

De préférence, l'agent de marquage est un composé intercalant de l'ADN, choisi parmi le groupe comprenant : les dérivés cyanines, l'iodure de propidium, l'acridine orange et le bromure d'éthidium.

Avantageusement, les dérivés cyanines sont choisis dans le groupe constitué par le Picogreen, le SYBR green et le YOPR01. En ce qui concerne leurs concentrations préférées, la concentration en dérivés cyanines est comprise entre 0,001% et 0,5%, de préférence entre 0,01% et 0,1%, la concentration en iodure de propidium, en acridine orange ou en bromure d'éthidium est comprise entre 0,1 ug/mL et 100 ug/mL et, de préférence, entre 1 ug/mL et 40 ug/mL.

De préférence, l'agent de pénétration cellulaire des microorganismes est choisi parmi le groupe comprenant : un détergent, une enzyme, une bactériocine, un chélateur d'ions, un agent de fixation et un agent de perméabilisation.

Parmi les détergents, on préfère ceux du groupe comprenant . le N-octyl P D-glucopyranoside (NOG), la saponine, le Tween, le Triton, l'Igepal et le CHAPS. Leurs concentrations préférées sont détaillées ci-après : - la concentration en saponine ou en Tween est comprise entre 0,005% et 10%, de préférence entre 0 ,05% et 0,5% ; - la concentration en NOG est comprise entre 0,01% et 10%, de préférence entre 0,25% et 0,5% ; - la concentration en Triton est comprise entre 0,0001% et 0,05%, de préférence entre 0,0008% et 0,002 % ;

- la concentration en Igepal est comprise entre 0,01 % et 20%, de préférence entre 1% et 5%.

A titre d'enzyme, on utilise de préférence le lysozyme et, à titre de bactériocine, on utilise préférentiellement la nisine. Avantageusement, la concentration de lysozyme est comprise entre 0,5 ug/ml et 200 ug/ml, de préférence entre 0,05 ug/ml et 20 ug/ml et la concentration de nisine est comprise entre 0,005 ug/ml et 10 ug/ml, de préférence entre 0,05 g/ml et 1 ug/ml.

En tant qu'agent chélateur d'ions, on préfère ceux du groupe comprenant l'EDTA et l'EGTA.

Avantageusement, la concentration de l'EDTA est comprise entre 0,5 mM et 50 mM, de préférence entre 5 mM et 7,5 mM.

Parmi les agents de fixation, on préfère ceux du groupe comprenant le formaldéhyde, le paraformaldéhyde, le glutaraldéhyde, l'éthanol, la streptolysine 0, le tétroxide d'osmium et l'orthophtalaldéhyde. Leurs concentrations préférées sont détaillées ci-après : - la concentration de formaldéhyde ou glutaraldéhyde est comprise entre 0,05% et 10% et de préférence entre 0,5% et 2,5% ; - la concentration d'éthanol ou de streptolysine 0 est comprise entre 0,1% et 20%, de préférence entre 1% et 5% ; - la concentration en tétroxyde d'osmium ou en ortho-phtalaldéhyde est comprise entre 0,005% et 10%, de préférence entre 0,05% et 1%.

L'agent de perméabilisation est choisi parmi le polyethylène glycol (PEG), la digitonine, la monensine, le polyéthylènimine (PEI), le sodium hexaméthaphosphate et le chlorure de benzalkonium. Les concentrations préférées desdits agents de perméabilisation sont les suivantes : - la concentration en PEG est comprise entre 0,01% et 1% et, de préférence, entre 0,05% et 0,5% ; - la concentration en digitonine est comprise entre 0,01 ug/ml et 10 ug/ml et, de préférence, entre 0,05 ug/ml et 5 ug/ml ; - la concentration en monensine est comprise entre 0,1 ug/ml et 5 ug/ml et, de préférence, entre 0 , 5 ug/ml et 1 ug/ml ; - la concentration en PEI est comprise entre 10 ug/ml et 400 ug/ml et, de préférence, entre 40 ug/ml et 120 ug/ml ; - la concentration en sodium héxamétaphosphate est comprise entre 0,005% et 1% et, de préférence, entre 0,01% et 0,1% ; - la concentration en chlorure de benzalkonium est comprise entre 0,001% et 0,1% et, de préférence, entre 0,005% et 0,05%.

Eventuellement le procédé de marquage de l'invention met en #uvre un milieu réactionnel qui comprend, outre l'agent de marquage et un ou plusieurs agents de pénétration cellulaire, un agent antibiotique ou un agent antiseptique, ou un mélange de ceux-ci.

De préférence, l'agent antibiotique est choisi parmi la polymyxine B ou la rifampicine et l'agent antiseptique est choisi parmi le groupe comprenant : la bétadine, le cetrimide, l'huile de l'arbre à thé, le terpinene-4-ol et la clorhexidine.

L'invention a également pour objet un milieu réactionnel pour le marquage de microorganismes comprenant un agent de marquage et au moins un agent de pénétration cellulaire desdits microorganismes.

De préférence, l'agent de marquage du milieu réactionnel est un composé intercalant de l'ADN et, tout préférentiellement, il est choisi parmi le groupe comprenant : des dérivés cyanines (notamment le Picogreen, le SYBR green, le YOPR01), l'iodure de propidium, l'acridine orange et le bromure d'éthidium.

Avantageusement, la concentration en dérivés cyanines dans le milieu réactionnel est comprise entre 0,001% et 0,5%, de préférence entre 0,01% et 0,1% ou la concentration en iodure de propidium, en acridine orange ou en bromure d'éthidium est comprise entre 0,1 pg/mL et 100 pg/mL, de préférence entre 1 ug/mL et 40 ug/mL.

De préférence, l'agent de pénétration cellulaire des microorganismes du milieu réactionnel est choisi parmi le groupe comprenant : un détergent, une enzyme, une bactériocine, un chélateur d'ions, un agent de fixation et un agent de perméabilisation.

Avantageusement, le détergent du milieu réactionnel est choisi parmi le groupe comprenant : le N-octyl (3 D-glucopyranoside (NOG), la saponine, le Tween, le Triton, l'Igepal et le CHAPS.

Les concentrations préférées des détergents dans le milieu réactionnel sont détaillées ci-après : - la concentration en saponine ou en Tween est comprise entre 0,005% et 10%, de préférence entre 0 ,05% et 0,5% ;

- la concentration en NOG est comprise entre 0,01% et 10%, de préférence entre 0,25% et 0,5% ; - la concentration en Triton est comprise entre 0,0001% et 0,05%, de préférence entre 0,0008% et 0,002 % ; - la concentration en Igepal est comprise entre 0,01% et 20%, de préférence entre 1% et 5%.

Préférentiellement l'enzyme présente dans le milieu réactionnel est la lysozyme et la bactériocine est la nisine, et leurs concentrations préférées sont détaillées ci-après : - la concentration de lysozyme est comprise entre 0,5 ug/ml et 200 ug/ml, de préférence entre 0,05 ug/ml et 20 ug/ml ; - la concentration de nisine est comprise entre 0,005 ug/ml et 10 ug/ml, de préférence entre 0,05 ug/ml et 1 pg/ml.

En ce qui concerne le chélateur d'ions, il peut être choisi parmi l'EDTA ou l'EGTA. De préférence, la concentration d'EDTA est comprise entre 0,5 mM et 50 mM, tout préférentiellement entre 5 mM et 7,5 mM.

L'agent de fixation du milieu réactionnel est choisi parmi le formaldéhyde, le paraformaldéhyde, le glutaraldéhyde, l'éthanol, la streptolysine 0, le tétroxide d'osmium et l'ortho-phtalaldéhyde. Les concentrations préférées desdits agents de fixation sont les suivantes : - la concentration de formaldéhyde ou glutaraldéhyde est comprise entre 0,05% et 10% et de préférence entre 0,5% et 2,5% ;

- la concentration d'éthanol ou de Streptolysine 0 est comprise entre 0,1% et 20%, de préférence entre 1% et 5% ; - la concentration en tétroxyde d'osmium ou en ortho-phtalaldéhyde est comprise entre 0,005% et 10%, de préférence entre 0,05% et 1%.

L'agent de perméabilisation est choisi parmi le polyethylène glycol (PEG), la digitonine, la monensine, le polyéthylènimine (PEI), le sodium hexaméthaphosphate et le chlorure de benzalkonium. Les concentrations préférées desdits agents de perméabilisation sont les suivantes : - la concentration en PEG est comprise entre 0,01% et 1% et, de préférence, entre 0,05% et 0,5% ; - la concentration en digitonine est comprise entre 0,01 ug/ml et 10 ug/ml et, de préférence, entre 0,05 ug/ml et 5 ug/ml ; - la concentration en monensine est comprise entre 0,1 ug/ml et 5 ug/ml et, de préférence, entre 0,5 ug/ml et 1 ug/ml ; - la concentration en PEI est comprise entre 10 ug/ml et 400 ug/ml et, de préférence, entre 40 pg/ml et 120 g/ml ; - la concentration en sodium héxamétaphosphate est comprise entre 0,005% et 1% et, de préférence, entre 0,01% et 0,1% ; - la concentration en chlorure de benzalkonium est comprise entre 0,001% et 0,1% et, de préférence, entre 0,005% et 0,05%.

Eventuellement, le milieu réactionnel comprend un agent antibiotique, de préférence choisi parmi la polymyxine B ou la rifampicine ou un agent

antiseptique, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : la bétadine, le cetrimide, l'huile de l'arbre à thé, le terminene-4-ol et la chlorhexidine, ou un mélange de ceux-ci.

Différents types de composés peuvent être utilisés afin de pénétrer efficacement la paroi bactérienne. On pourra notamment utiliser, de préférence en combinaison : - des détergents comme la saponine, le NOctyl ss D-glucopyranoside (NOG), le polyoxyethylenesorbitan (Tween), des polyoxyethylene ethers (Triton), l'Igepal ou le (3-[ (3- cholamidopropyl) diméthylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), - des enzymes de type lysozyme ou des bactériocines comme la nisine.

- des chélateurs d'ions comme l'EDTA ou l'EGTA, - des fixateurs comme la formaldéhyde, la paraformaldéhyde, le glutaraldéhyde, l'éthanol, la streptolysine 0, le tétroxyde d'osmium ou l'orthophtalaldéhyde, - des perméabilisants comme le polyéthylène glycol (PEG), la digitonine, la monensine, le polyéthylènimine (PEI), le sodium hexamétaphosphate, le chlorure de benzalkonium, - des agents cryoprotecteurs comme le DMSO, - des antibiotiques comme la polymyxine B ou la rifampicine, - des ions (NaCl, KCl, MgCl2, l'hypochlorite de sodium) ou le sucrose, - des antiseptiques comme la bétadine, le cetrimide, l'huile de l'arbre à thé ou le terpinene 4ol et la chlorhexidine qui est un antibactérien opérant

une lyse de la membrane cytoplasmique, se rapprochant ainsi du mécanisme d'action de certains antibiotiques.

Les concentrations des différents agents permettant la pénétration cellulaire des microorganismes sans que des phénomènes de lyse se produisent sont indiquées ci-après :
Concernant les détergents :
La concentration en saponine et en Tween dans la composition de la solution est comprise entre 0,005% et 10% et de préférence entre 0,05% et 0,5%.

La concentration en NOG dans la composition de la solution est comprise entre 0,01% et 10% et, de préférence, entre 0,25% et 0,5%.

La concentration en triton dans la composition de la solution est comprise entre 0,0001% et 0,05% et, de préférence, entre 0,0008% et 0,002%.

La concentration en Igepal dans la composition de la solution est comprise entre 0,01% et 20% et, de préférence, entre 1% et 5%.

Concernant les enzymes :
La concentration en lysozyme dans la composition de la solution est comprise entre 0,5 ug/ml et 200 ug/ml et, de préférence, entre 5 ug/ml et 20 ug/ml.

La concentration en bactériocine, notamment en nisine dans la composition de la solution est comprise entre 0,005 ug/ml et 10 ug/ml et, de préférence, entre 0,05 ug/ml et 1 ug/ml.

Concernant les chélateurs d'ions :

La concentration en EDTA dans la composition de la solution est comprise entre 0,5 mM et 50 mM et, de préférence, entre 5 mM et 7,5 mM.

Concernant les fixateurs :
La concentration en formaldéhyde et en glutaraldéhyde dans la composition de la solution est comprise entre 0,05% et 10% et, de préférence, entre 0,5% et 2,5%.

La concentration en éthanol et en streptolysine 0 dans la composition de la solution est comprise entre 0,1% et 20% et, de préférence, entre 1% et 5%.

La concentration en tétroxyde d'osmium et en ortho-phtalaldéhyde dans la composition de la solution est comprise entre 0,005% et 10% et, de préférence, entre 0,05% et 1%.

Concernant les perméabilisants
La concentration en PEG dans la composition de la solution est comprise entre 0,01% et 1% et, de préférence, entre 0,05% et 0,5%.

La concentration en digitonine dans la composition de la solution est comprise entre 0,01 ug/ml et 10 ug/ml et, de préférence, entre 0,05 ug/ml et 5 ug/ml .

La concentration en monensine dans la composition de la solution est comprise entre 0,1 ug/ml et 5 ug/ml et, de préférence, entre 0,5 ug/ml et 1 ug/ml.

La concentration en PEI dans la composition de la solution est comprise entre 10 ug/ml et 400 ug/ml et, de préférence, entre 40 ug/ml et 120 ug/ml .

La concentration en sodium héxamétaphosphate dans la composition de la solution

est comprise entre 0,005% et 1% et, de préférence, entre 0,01% et 0,1%.

La concentration en chlorure de benzalkonium dans la composition de la solution est comprise entre 0,001% et 0,1% et, de préférence, entre 0,005% et 0,05%.

Concernant les agents cryoprotecteurs
La concentration en DMSO dans la composition de la solution est comprise entre 0,05% et 20% et, de préférence, entre 0,5% et 5%.

Concernant les antibiotiques :
La concentration en polymixin B et en rifampicine dans la composition de la solution est comprise entre 0,1 ug/ml et 100 ug/ml et, de préférence, entre 1 ug/ml et 50 ug/ml.

Concernant le sucrose :
La concentration en sucrose dans la composition de la solution est comprise entre 0,5% et 70% et, de préférence, entre 5% et 20%.

Concernant les antiseptiques :
La concentration en chlorhexidine dans la composition de la solution est comprise entre 0,0005% et 0,5% et, de préférence, entre 0,005% et 0,05%.

La concentration en cetrimide dans la composition de la solution est comprise entre 0,01% et 5% et, de préférence, entre 0,05% et 1%.

La concentration en bétadine dans la composition de la solution est comprise entre 0,0001% et 0,001% et, de préférence, entre 0,0005% et 0,005%.

La concentration en huile d'arbre à thé dans la composition de la solution est comprise entre

0,0001% et 0,1% et, de préférence, entre 0,0005% et 0,05%.

La concentration en terpinen-4-ol dans la composition de la solution est comprise entre 0,05% et 10% et, de préférence, entre 0,5% et 5%.

Concernant les ions :
La concentration en hypochlorite de sodium dans la composition de la solution est comprise entre 0,001% et 5% et, de préférence, entre 0,005% et 0,5%.

La concentration en citrate de potassium dans la composition de la solution est comprise entre 0,5 mM et 200 mM et, de préférence, entre 5 mM et 50 mM.

Concernant l'urée :
La concentration en urée dans la composition de la solution est comprise entre 0,01% et 20% et, de préférence, entre 0,1% et 5%.

Comme agents intercalants de l'ADN, les dérivés cyanines (comme le Picogreen, le SYBR green ou le YOPRO1), l'iodure de propidium, l'acridine orange et le bromure d'éthidium peuvent être utilisés.

La concentration en Picogreen, SYBR green ou YOPRO1 dans la composition de la solution est comprise entre 0,001% (volume/volume) et 0,5% et, de préférence, entre 0,01% et 0,1%.

La concentration en iodure de propidium, en acridine orange ou en bromure d'éthidium dans la composition de la solution est comprise entre 0,1 ug/mL et 100 ug/mL et, de préférence, entre 1 ug/mL et 40 ug/mL .

La présente invention est illustrée à l'aide des exemples de mise en #uvre indiqués cidessous accompagnés des figures en annexe dans lesquelles : - la figure 1 montre l'influence de l'ajout de nisine sur la détection de Staphylococcus epidermidis et Escherichia coli. Les résultats sont exprimés en nombre de bactéries détectées en cytométrie en phase solide (figure 1A) et en pourcentage de bactéries détectées (figure 1B) par rapport à la méthode de détection enzymatique.

- la figure 2 montre l'effet de l'EDTA utilisé seul pour la détection de Staphylococcus epidermidis et Escherichia coli préparés dans différents milieux tests.

- la figure 3 illustre les résultats du test de différentes concentrations de nisine associées à différentes concentrations d'EDTA pour améliorer la détection des bactéries GRAM - (Escherichia coli). Les résultats sont exprimés en pourcentage de détection par rapport à la méthode de détection enzymatique.

- la figure 4 illustre les résultats du test de différentes concentrations de nisine associées à une concentration fixe d'EDTA à 7,5 mM pour détecter les bactéries GRAM - (Escherichia coli et Serratia marcescens) et les bactéries GRAM + (Staphylococcus epidermidis). Les résultats sont exprimés en nombre de bactéries détectées sur le filtre en cytométrie phase solide.

- la figure 5 illustre l'influence du pH sur la détection d'E. coli avec un marqueur fluorescent d'ADN en présence de nisine 0.2 g/mL/EDTA 7,5mM.

- la figure 6 montre la détection des bactéries GRAM - Escherichia coli, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Proteus

mirabilis avec un marqueur fluorescent d'ADN en présence de nisine 0,2 g/mL/EDTA 7,5mM à pH 4,8.

- la figure 7 montre les résultats d'un test du N Octyl Glucopyranoside en tant que réactif de pénétration cellulaire en association avec de la nisine 0,2 ug/mL et de l'EDTA 7,5 mM pour améliorer le marquage de Staphylococcus epidermidis (GRAM +) et de Pseudomonas aeruginosa (GRAM -). (N/E = solution de nisine 0,2 ug/mL / EDTA 7,5 mM).

- la figure 8 montre les résultats obtenus avec la chlorexhidine en tant que réactif de pénétration cellulaire pour améliorer le marquage d'Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Serratia marcescens (souches bactériennes GRAM-) et l'effet sur Staphylococcus epidermidis.

- la figure 9 montre le marquage ADN et la détection des bactéries (P. aeruginosa) dans différents milieux.

- la figure 10 montre le marquage ADN et détection des bactéries en chlorexhidine et prouve l'intérêt de l'association avec du NOG pour augmenter le pouvoir perméabilisant et la pénétration du marqueur. La figure 10A montre le marquage d'une suspension de bactéries en PBS. La figure 10B montre le marquage d'une suspension de bactéries en concentré plaquettaire.

- la figure 11 montre l'effet de différentes concentrations en PEI sur la détection de Serratia marcescens avec un marqueur fluorescent de l'ADN.

- la figure 12 montre l'effet du PEI sur le marquage DNA et la détection d'E. coli en fluorescence.

- la figure 13 montre les résultats de détection des bactéries S. epidermidis et E. coli en

présence d'une composition de marquage comprenant de la nisine/EDTA/CLX/NOG/PEI dans différents milieux.

Le procédé de détection de microorganismes dans l'échantillon peut s'effectuer en mettant en #uvre un traitement de l'échantillon en deux étapes, une première étape de marquage/pénétration cellulaire en ajoutant audit échantillon une composition comprenant l'agent de marquage et un premier agent de pénétration cellulaire, suivi, après un temps d'incubation, d'une deuxième étape dans laquelle on ajoute une composition comprenant d'autres agents de pénétration cellulaire.

Un tel procédé peut être mis en #uvre, par exemple, selon le protocole décrit ci-dessous :
Trois millilitres de l'échantillon à traiter sont incubés pendant 40 minutes dans un millilitre d'une première solution de pénétration cellulaire/marquage (Picogreen 0,5mL/L, PEI 60mg/L, solution de PBS). Cette étape est réalisée à température ambiante sous agitation.

Dans la deuxième étape, on ajoute sept millilitres d'une composition en solution permettant de poursuivre le marquage (nisine 0,2mg/L, NOG 2,5g/L, EDTA l,86g/L, diacétate de chlorhexidine 50mg/L).

L'incubation se fait à température ambiante pendant 20 minutes. L'échantillon est alors filtré sur un filtre noir, par exemple en polycarbonate ou en polyester, et analysé avec un cytomètre en phase solide.

Le procédé de détection de microorganismes dans l'échantillon peut aussi s'effectuer en mettant en #uvre un traitement de l'échantillon en une seule étape, en ajoutant audit échantillon une composition comprenant l'agent de marquage et un ou plusieurs agents de pénétration cellulaire.

Un tel procédé peut être mis en #uvre, par exemple, selon le protocole décrit ci-dessous :
Huit millilitres de l'échantillon à traiter sont incubés pendant 60minutes à température ambiante avec trois millilitres d'une solution de pénétration cellulaire/marquage (Picogreen 0,17 mL/L, PEI 20 mg/L, EDTA 4,34 g/L, nisine 0,47 mg/L, NOG 5,83 g/L, diacétate de chlorhexidine 116,7 mg/L). L'échantillon est alors filtré sur un filtre noir en polycarbonate et analysé avec un cytomètre en phase solide.

L'ensemble de ces traitements peuvent être réalisés indifféremment dans un dispositif ouvert, par exemple dans des tubes ou dans un dispositif fermé, comme une seringue ou un dispositif pour la préparation des plaquettes sanguines en vue d'une analyse bactériologique (Hemosystem, ref SPK01).

DETECTION DES MICROORGANISMES.

DETERMINATION DES COMPOSITIONS OPTIMALES DU MILIEU REACTIONNEL POUR LE MARQUAGE/PENETRATION CELLULAIRE.

1 - Marquage en présence de nisine.

Utilisation de la nisine seule en tant que perméabilisant pour favoriser la pénétration de l'agent de marquage.

I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular Probe).

Solution de nisine
Préparer en eau distillée une série de dilutions de nisine (matière première à 2,5% poids/poids):

0,1 g de nisine dans 50 mL eau distillée = solution 50 g/mL
0,02 g de nisine dans 50 mL eau distillée = solution 10 ug/mL
0,004 g de nisine dans 50 mL eau distillée = solution 2 ug/mL.

Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (68.21)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 104 bactéries/mL.

II Méthode
1,2 mL de solution de marquage + 3 mL de suspension de bactérie
Incubation 15 minutes à 22 C + 7 mL de solution de nisine
Filtration sur filtre noir 0,4 m de porosité.

III Analyse et résultats
Après la filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries détectées en cytométrie en phase solide et en pourcentage de bactéries détectées par rapport à la méthode de détection enzymatique.

Ces résultats montrent l'influence de l'ajout de nisine sur la détection de Staphylococcus epidermidis et Escherichia coli et sont illustrés dans les figures 1A et 1B en annexe.

On peut constater que l'ajout de nisine permet d'obtenir un bon marquage des GRAM+ et que des concentrations faibles sont préférables.

2 - Utilisation de l'EDTA seul en tant que perméabilisant pour favoriser la pénétration de l'agent de marquage.

Solution de EDTA
EDTA 5 mM : 0,093g EDTA disodique, QSP 50 mL d'eau distillée.

Suspension de Bactéries préparées en PBS, en eau distillée, en milieu TSB (tryptone soj broth) et en plasma.

Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries/mL.

II Méthode
1,2 mL de solution de marquage + 3 mL de suspension de bactéries dans les différents milieux
Incubation 15 minutes à 22 C + 7 mL de solution d'EDTA
Filtration sur filtre noir 0,4 m de porosité.

III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries fluorescentes.

Ces résultats montrent l'effet de l'EDTA utilisé seul pour la détection de Staphylococcus epidermidis et Escherichia coli préparés dans

différents milieux tests et sont illustrés dans la figure 2 en annexe.

On peut constater que l'EDTA seul ne permet pas un marquage correct des bactéries Gram + et Gram-.

3- Utilisation de l'association nisine/EDTA en tant que perméabilisant pour favoriser la pénétration de l'agent de marquage.

Solution de nisine/EDTA nisine 10 ug/mL : 0,02 g de nisine (matière première à 2.5% poids/poids) QSP 50 mL eau distillée
EDTA 20 mM : 0,372 g EDTA disodique, QSP 50 mL d'eau distillée,
Préparer une gamme de EDTA avec 0,25 ; 2,5 ; 12,5 et 18,75 mL d'EDTA 20 mM (gamme de concentration 0,1 ; 5 et 7,5 mM)
Ajouter 50,250, 500 L ou 1 mL de nisine 10 ug/mL (gamme de concentration 0,01 ; 0,05 ; 0,1 et 0 , 2 g/ ml)
QSP 50 mL d'eau distillée.

Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries/mL.

II Méthode
1,2 mL de solution de marquage + 3 mL de suspension de bactérie
Incubation 15 minutes à 22 C + 7 mL de solution de nisine ou nisine/EDTA

Filtration sur filtre noir 0,4 um de porosité.

III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries détectées en cytométrie en phase solide et en pourcentage de bactéries détectées par rapport à la méthode de détection enzymatique.

Ces résultats montrent l'influence de l'ajout de nisine combiné à l'EDTA sur la détection de Escherichia coli et sont illustrés dans la figure 3 en annexe.

On peut constater un effet synergique sur la détection des bactéries lorsque le marquage est effectué en présence du mélange nisine/EDTA. On peut constater également que le pourcentage des bactéries Escherichia coli marquées est maximal pour une concentration de nisine à 0,1 ug/mL et EDTA 7,5 mM
4 - Optimisation des concentrations de l'association nisine/EDTA en tant que réactif de pénétration cellulaire pour détecter les bactéries
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe).

Solution de nisine/EDTA
0,02 g de nisine (matière première à 2,5% poids/poids) dans 50 mL eau distillée soit 10 ug/mL nisine 0,05 ug/mL/EDTA 7,5 mM : 250 l de nisine 10 ug/mL + 0,140 g EDTA disodique, QSP 50 mL d'eau distillée,

nisine 0,1 ug/mL/EDTA 7, 5 mM : 500 l de nisine 10 ug/mL + 0,140 g EDTA disodique, QSP 50 mL d'eau distillée, nisine 0, 5 ug/mL/EDTA 7,5 mM : 2,5 ml de nisine 10 ug/mL + 0,140g EDTA disodique QSP 50 mL d'eau.

Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21)
Serratia marcescens (CIP 103716)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries/mL.

II Méthode
1,2 mL de solution de marquage + 3 mL de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22 C + 7 mL de solution de nisine/EDTA à différentes concentrations
Filtration sur filtre noir 0,4 m de porosité.

III Analyse et résultats
Après la filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries détectées en cytométrie en phase solide Les résultats de cette expérience montrant la détection des bactéries GRAM - (Escherichia coli, Serratia marcescens) et GRAM + (Staphylococcus epidermidis) en présence de différentes concentrations de nisine associées à de l' EDTA 7,5 mM sont illustrés dans la figure 4 en annexe.

On peut constater que le pourcentage des bactéries Escherichia coli marquées est maximal pour une concentration de nisine à 0,1 ug/mL et que l'on

obtient une meilleure détection de l'ensemble de bactéries testées lorsque l'on utilise la nisine à une concentration de 0,2 ug/mL associée à de l'EDTA à une concentration 7,5 mM.

5 - Influence du pH sur le marquage des bactéries en présence de nisine/EDTA
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe).

Solution de nisine/EDTA nisine 10 ug/mL : 0,02 g de nisine (matière première à 2,5% poids/poids) QSP 50 mL eau distillée
EDTA 20 mM : 0,372g EDTA disodique, QSP 50 mL d'eau distillée,
18,75 mL EDTA 20mM + 1 mL de nisine 10 ug/mL
QSP 50 mL d'eau distillée
Cette solution est à pH 4,8
Tamponner avec NaOH (1 M) juqu'à pH 6, pH 7, pH 8.

Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21)
Serratia marcescens (CIP 103716)
Enterobacter aerogenes (CIP 60.86T)
Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110)
Proteus mirabilis (CIP 104588)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries/mL.

II Méthode
1,2 mL de solution de marquage

+ 3 mL de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22 C + 7 mL de solution de nisine/EDTA à différents pH
Filtration sur filtre noir 0,4 m de porosité.

III Analyse et résultats
Après la filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries fluorescentes détectées.

Les résultats de cette expérience montrant l'influence du pH sur la détection d'E.coli avec un marqueur fluorescent d'ADN en présence de nisine 0,2 ug/mL / EDTA 7,5mM sont illustrés figure 5 en annexe.

On peut constater que dans les conditions prédéfinies, l'augmentation du pH n'améliore pas le marquage d'Escherichia coli.

La détection des bactéries GRAM + Staphylococcus epidermidis et GRAM - Escherichia coli, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis avec un marqueur fluorescent d'ADN en présence de nisine 0,2 ug/mL / EDTA 7,5mM à pH 4,8 est illustrée figure 6 en annexe.

On peut constater que dans les conditions de pH à 4,8, le marquage des bactéries GRAM(-) est homogène d'une souche à l'autre. La détection de Staphylococcus epidermidis GRAM (+) est plus élevée que celle des GRAM(-).

6- Association nisine/EDTA/N Octyl Glucopyranoside
I Réactifs

Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe).

Solution de nisine/EDTA/NOG nisine 100 ug/mL . 0,2 g de nisine (matière première à 2,5% poids/poids) QSP 50 mL eau distillée
EDTA 100 mM : 1,86g EDTA disodique, QSP 50 mL d'eau distillée,
N Octyl glucopyranoside 5% : 2,5 g dans 50 mL eau distillée
20, 10, 5 ou 2,5 mL NOGà 5% + 3,75 mL EDTA 100mM + 0,1 mL de nisine 100 ug/mL
QSP 50 mL d'eau distillée
Cette solution est à pH 4.8.

Suspension de Bactéries préparées en PBS
Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21)
Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries/mL.

II Méthode
1,2 mL de solution de marquage + 3 mL de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22 C + 7 mL de solution de nisine/EDTA ou nisine/EDTA/NOG
Filtration sur filtre noir 0,4 m de porosité.

III Analyse et résultats
Après filtration le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries fluorescentes

Les résultats de cette expérience, avec une composition du milieu réactionnel associant du N Octyl Glucopyranoside en tant que réactif de pénétration cellulaire des microorganismes, avec de la nisine 0,2 ug/mL et de l'EDTA 7,5 mM pour améliorer le marquage de Staphylococcus epidermidis (GRAM +) et de Pseudomonas aeruginosa (GRAM-) sont illustrés figure 7 en annexe.

On peut constater que l'ajout du N Octyl Glucopyranoside à 0. 25% et à 0,5% a des effets positifs sur le marquage de Staphylococcus epidermidis et de Pseudomonas aeruginosa.

7 - Marquage en présence de chlorhexidine
Test mettant en #uvre la chlorexhidine seule en tant qu'agent perméabilisant pour favoriser la pénétration de l'agent de marquage des bactéries.

Solution de chlorexhidine
Chlorhexidine diacétate 5% : 1 g dans 20mL eau distillée
50,25 ou 10 l de chlorexhidine diacétate 5 % dans 50 mL d'eau distillée pour obtenir une gamme de concentration de 0,01% ; ou 0,001%.

Suspension de Bactéries préparées en PBS, en concentré plaquettaire et plasma autologue
Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21)
Serratia marcescens (CIP 103716)
Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries/mL.

II Méthode
1,2 mL de solution de marquage + 3 mL de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22 C + 7 mL de solution de chlorexhidine à différentes concentrations
Filtration sur filtre noir 0,4 m de porosité.

III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries fluorescentes. Le comptage sur boîte de pétri à 48 heures tient lieu de méthode de référence.

Les résultats de cette expérience, avec une composition du milieu réactionnel comprenant de la chlorexhidine en tant que réactif de pénétration cellulaire pour améliorer le marquage d'Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Serratia marcescens (souches bactériennes GRAM-) et de Staphylococcus epidermidis sont illustrés figure 8 en annexe.

On peut constater que la concentration optimale de chlorexhidine pour la détection des bactéries GRAM - est de 0,005 %. Cette concentration est cependant toxique pour les bactéries GRAM + qui sont détruites.

On constate que la présence de plasma antagonise l'effet de la chlorexhidine sur la pénétration cellulaire du marqueur pour Pseudomonas aeruginosa comme illustré figure 9. Pour un marquage universel dans différents milieux incluant les fluides biologiques, la chlorexhidine seule ne peut être utilisée.

8 - Association chlorexhidine/ N-Octyl Glucopyranoside
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe).

Solution de chlorexhidine/N Octyl Glucopyraanoside
Chlorhexidine diacétate 5% : 1 g dans 20mL eau distillée
N Octyl glucopyranoside 1% : 0,5 g dans 50 mL eau distillée
50 ou 25 l de chlorexhidine diacétate 1 % (concentration finale de 0,001% ou 0,0005%) + N Octyl glucopyranoside à 5% (concentration finale = 0,25 %)
QSP 50 mL d'eau distillée.

Suspension de Bactéries préparées en PBS et en concentré plaquettaire d'aphérèse
Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (68.21)
Serratia marcescens (CIP 103716)
Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries/mL.

II Méthode
1,2 mL de solution de marquage + 3 mL de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22 C + 7 mL de solution de Chlorhexidine /NOG
Filtration sur filtre noir 0,4 m de porosité.

Les résultats de cette expérience montrant le marquage de l'ADN et la détection des bactéries marquées en présence d'une composition du milieu réactionnel comprenant de la chlorexhidine en association avec du NOG pour augmenter le pouvoir perméabilisant et la pénétration du marqueur sont illustrés figures 10A et 10B en annexe.

On observe que la concentration de chlorhexidine la plus élevée permet d'obtenir le meilleur marquage des bactéries.

9 - Marquage en présence de PEI seul
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) et ajouter du PEI pour une concentration finale à 40,80, 100,120, 140 et 160 ug/mL.

Suspension de Bactéries préparées en PBS
Serratia marcescens (CIP 103716)
Echantillon analysé
Dilution >1/20 de la suspension bactérienne dans un échantillon de concentré plaquettaire pour obtenir une concentration finale en bactérie Serratia marcescens de 104 /mL .

II Méthode
1,2 mL de solution de marquage

+ 3 mL d'échantillon Incubation 45 minutes à 23 C
Filtration 5 m (filtres PALL 32 mm)
Incubation 20 minutes dans 7 mL de PBS
Filtration 0,4 m de porosité.

III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats exprimés en nombre de bactéries détectées fluorescentes.

Les résultats de cette expérience montrant l'effet de différentes concentrations en PEI sur la détection de Serratia marcescens avec un marqueur fluorescent de l'ADN sont illustrés figure 11 en annexe.

On peut constater qu'une détection optimale des bactéries est obtenue avec une gamme de concentrations en PEI comprise entre 40 et 100 ug/mL.

10 - Association nisine/EDTA/N Octyl Glucopyranoside/Chlorhexidine/PEI
L'objectif de cette expérience est de déterminer la gamme de concentration optimale en PEI pour le marquage d'E. coli.

I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) et ajouter du PEI pour une concentration finale à 100,80 et 60 ug/mL.

Solution de chlorexhidine/N Octyl Glucopyranoside/EDTA
500 uL de chlorexhidine diacétate à 0,5 % (Chlorhexidine diacétate 5x10-3 % final)

+ 1 mL ou 500 L N Octyl glucopyranoside 25% (N Octyl glucopyranoside 0,5 ou 0,25 % final) + 500 uL nisine 20 pg/mL (nisine 0,2 ug/mL final) + 500 L EDTA 0,5 M (EDTA 5mM final)
QSP 50 mL PBS.

Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901), ajustement de la concentration à 104 bactéries/mL.

Echantillon analysé
3 mL de suspension bactérienne + 27 mL de concentré plaquettaire soit une dilution au 1/10 de la suspension bactérienne dans un échantillon de concentré plaquettaire pour obtenir une concentration finale en bactérie de 105/mL.

II Méthode
1,2 mL de solution de marquage à 60,80 ou 100 pg/mL de PEI + 3 mL d'échantillon
Incubation 45 minutes à 23 C
Filtration 5 m (filtres PALL 32 mm)
Incubation 20 minutes dans 7 mL de solution de pénétration cellulaire à 0,5% ou 0,25% de NOG
Filtration 0,4 m (filtres noir Whatman monocolorés) .

Les résultats de cette expérience montrant l'effet du PEI sur le marquage DNA et la détection d'E. coli en fluorescence sont illustrés figure 12 en annexe.

On peut constater que la concentration de 60 ug/mL en PEI permet une pénétration optimale du marqueur DNA quelle que soit la concentration en NOG.

11 - Marquage universel des bactéries dans différents milieux
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) et ajouter du PEI pour une concentration finale à 60 ug/mL.

Solution de chlorexhidine/N Octyl Glucosamine/EDTA/Nisine
500 L de chlorexhidine diacétate à 0,5% (Chlorhexidine diacétate 5x10-3 % final) + 500 uL N Octyl glucopyranoside 25% (N Octyl glucopyranoside 0,25 % final) + 500 L nisine 20 ug/mL (nisine 0,2 ug/mL final) + 500 L EDTA 0,5 M ( EDTA 5mM final)
QSP 50 mL PBS.

Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901), ajustement de la concentration à 104 bactéries/ mL
Staphylococcus epidermidis (68.21).

Echantillon analysé
Dilution 1/10 de la suspension bactérienne dans un échantillon de fluide biologique pour obtenir une concentration finale en bactérie de 105 /mL soit :
3 mL de suspension bactérienne + 27 mL d'eau distillée
3 mL de suspension bactérienne + 27 mL de PBS

3 mL de suspension bactérienne + 27 mL de milieu de culture (tryptone soij broth)
3 mL de suspension bactérienne + 27 mL de plasma humain
3 mL de suspension bactérienne + 27 mL de concentré plaquettaire.

II Méthode
1,2 mL de solution de marquage + 3 mL d'échantillon
Incubation 45 minutes à 23 C
Filtration 5 m Incubation 20 minutes dans 7 mL de solution de pénétration cellulaire.

Filtration 0,4 um de porosité.

Les résultats de cette expérience montrant la détection de S. epidermidis et E. coli dans différents milieux sont illustrés figure 13 en annexe.

La formule ainsi définie permet la détection des bactéries GRAM+ et des bactéries GRAMdans différents milieux ioniques, de culture et physiologiques. Cette détection est comparable pour les deux types de bactéries.

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Claims

REVENDICATIONS

1) Procédé de détection de microorganismes éventuellement présents dans un fluide biologique, caractérisé en ce que : a) on prélève un échantillon dudit fluide biologique, b) on met en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant un agent de marquage et au moins un agent de pénétration cellulaire de la membrane desdits microorganismes, c) on filtre ledit échantillon sur un filtre susceptible de retenir les microorganismes marqués éventuellement présents dans ledit échantillon et d) on détecte les microorganismes marqués et retenus dans le filtre à l'étape (c).

2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de marquage est un composé intercalant de l'ADN.

3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent intercalant de l'ADN est choisi parmi le groupe comprenant : les dérivés cyanines, l'iodure de propidium, l'acridine orange et le bromure d'éthidium.

4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la concentration en dérivés cyanines avantageusement choisis dans le groupe constitué par le Picogreen, le SYBR green et le YOPRO1 est comprise entre 0,001% et 0,5%, de préférence entre 0,01% et 0,1% ; la concentration en iodure de propidium, en acridine orange ou en bromure d'éthidium

est comprise entre 0,1 ug/mL et 100 ug/mL, de préférence entre 1 ug/mL et 40 pg/mL.

5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'agent de pénétration cellulaire des microorganismes est choisi parmi le groupe comprenant : un détergent, une enzyme, une bactériocine, un chélateur d'ions, un agent de fixation ou un agent de perméabilisation.

6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le détergent est choisi parmi le groupe comprenant : le N-octyl (3 D-glucopyranoside (NOG), la saponine, le Tween, le Triton, l'Igepal et le CHAPS.

7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la concentration en saponine ou en Tween est comprise entre 0,005% et 10%, de préférence entre 0 ,05% et 0,5% ; la concentration en NOG est comprise entre 0,01% et 10%, de préférence entre 0,25% et 0,5% ; la concentration en Triton est comprise entre 0,0001% et 0,05%, de préférence entre 0,0008% et 0,002% ; la concentration en Igepal est comprise entre 0,01 % et 20%, de préférence entre 1% et 5%.

8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que l'enzyme est le lysozyme utilisée, de préférence, à une concentration comprise entre 0,5 ug/ml et 200 ug/ml et, tout particulièrement, entre 0,05 ug/ml et 20 ug/ml.

9) Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la

bactériocine est la nisine utilisée, de préférence, à une concentration comprise entre 0,005 g/ml et 10 ug/ml et, tout particulièrement, entre 0,05 ug/ml et 1 ug/ml.

10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce que le chélateur d'ions est choisi parmi le groupe comprenant l'EDTA et l'EGTA.

11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la concentration d'EDTA est comprise entre 0,5 mM et 50 mM, de préférence entre 5 mM et 7,5 mM.

12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que l'agent de fixation est choisi parmi le formaldhéhyde, le paraformaldéhyde, le glutaraldéhyde, l'éthanol, la streptolysine 0, le tétroxide d'osmium et l'orthophtalaldéhyde.

13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la concentration de formaldéhyde ou glutaraldéhyde est comprise entre 0,05% et 10% et de préférence entre 0,5% et 2,5% ; la concentration d'éthanol ou de streptolysine 0 est comprise entre 0,1% et 20%, de préférence entre 1% et 5% ; la concentration en tétroxyde d'osmium ou en ortho-phtalaldéhyde est comprise entre 0,005% et 10%, de préférence entre 0,05% et 1%.

14) Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 13, caractérisé en ce que l'agent de perméabilisation est choisi parmi le polyethylène

glycol (PEG), la digitonine, la monensine, le polyéthylènimine (PEI), le sodium hexaméthaphosphate ou le chlorure de benzalkonium.

15) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la concentration en en PEG est comprise entre 0,01% et 1% et de préférence entre 0,05% et 0,5% ; la concentration en digitonine est comprise entre 0,01 ug/ml et 10 ug/ml et, de préférence, entre 0,05 ug/ml et 5 ug/ml ; la concentration en monensine est comprise entre 0,1 ug/ml et 5 ug/ml et, de préférence, entre 0,5 ug/ml et 1 ug/ml ; la concentration en PEI est comprise entre 10 ug/ml et 400 g/ml et, de préférence, entre 40 g/ml et 120 g/ml ; la concentration en sodium héxamétaphosphate est comprise entre 0,005% et 1% et, de préférence, entre 0,01% et 0,1% ; la concentration en chlorure de benzalkonium est comprise entre 0,001% et 0,1% et, de préférence, entre 0,005% et 0,05%.

16) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la composition dudit milieu réactionnel comprend en outre - un agent antibiotique, de préférence choisi parmi la polymyxine B ou la rifampicine, ou - un agent antiseptique, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : la bétadine, le cetrimide, l'huile de l'arbre à thé, le terminene-4-ol et la clorhexidine, ou -un mélange de ceux-ci.

17) Milieu réactionnel pour le marquage de microorganismes caractérisé en ce qu'il comprend un agent de marquage et au moins un agent de pénétration cellulaire desdits microorganismes.

18) Milieu réactionnel selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'agent de marquage est un composé intercalant de l'ADN, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : des dérivés cyanines, l'iodure de propidium, l'acridine orange et le bromure d'éthidium.

19) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce que l'agent de pénétration cellulaire des microorganismes est choisi parmi le groupe comprenant : un détergent, une enzyme, une bactériocine, un chélateur d'ions, un agent de fixation et un agent de perméabilisation.

20) Milieu réactionnel selon la revendication 19, caractérisé en ce que le détergent est choisi parmi le groupe comprenant : le N-octyl B Dglucopyranoside (NOG), la saponine, le Tween, le Triton, l'Igepal et le CHAPS.

21) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce que l'enzyme est la lysozyme.

22) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, caractérisé en ce que la bactériocine est la nisine.

23) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, caractérisé en ce que le chélateur d' ions est choisi parmi l' EDTA et l'EGTA.

24) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 19 à 23, caractérisé en ce que l'agent de fixation est choisi parmi le formaldhéhyde, le paraformaldéhyde, le glutaraldéhyde, l'éthanol, la streptolysine 0, le tétroxide d'osmium et l'ortho-phtalaldéhyde.

25) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 19 à 24, caractérisé en ce que l'agent de perméabilisation est choisi parmi le polyethylène glycol (PEG), la digitonine, la monensine, le polyéthylènimine (PEI), le sodium hexaméthaphosphate ou le chlorure de benzalkonium.

26) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 17 à 25, caractérisé en ce qu'il comprend en outre - un agent antibiotique, de préférence choisi parmi la polymyxine B ou la rifampicine, ou - un agent antiseptique, de préférence choisi parmi le groupe comprenant : la bétadine, le cetrimide, l'huile de l'arbre à thé, le terminene-4-ol et la clorhexidine, ou - un mélange de ceux-ci.