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EP1565568A1 - PROCEDE DE DETECTION UNIVERSELLE DE MICROORGANISMES ET MILIEU REACTIONNEL PERMETTANT LA MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE - Google Patents

PROCEDE DE DETECTION UNIVERSELLE DE MICROORGANISMES ET MILIEU REACTIONNEL PERMETTANT LA MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE

Info

Publication number
EP1565568A1
EP1565568A1 EP03789502A EP03789502A EP1565568A1 EP 1565568 A1 EP1565568 A1 EP 1565568A1 EP 03789502 A EP03789502 A EP 03789502A EP 03789502 A EP03789502 A EP 03789502A EP 1565568 A1 EP1565568 A1 EP 1565568A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
concentration
microorganisms
agent
labeling
bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03789502A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Isabelle Besson-Faure
Jean-Pierre Hermet
Sébastien RIBAULT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hemosystem
Original Assignee
Hemosystem
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hemosystem filed Critical Hemosystem
Publication of EP1565568A1 publication Critical patent/EP1565568A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention belongs to the field of microbiology and, in particular, it relates to the methods of detection and identification of microorganisms in the various environments in which they may be found. Numerous methods for detecting microorganisms have been developed, thus meeting various needs. We can cite the analysis of medical samples, quality control in the food industry and monitoring of water treatment.
  • the ideal detection method for microorganisms should be rapid, specific
  • the culture methods allow the detection of all bacteria in growth phase in most environments, with good sensitivity.
  • a single bacterium is sufficient, in theory, to obtain a positive result after culture and cultures in liquid phase can be automated (Aubert G et al., 1993). However, the time required to obtain the result is sometimes very long.
  • the detection in blood products of propioni-bacterium strains requires more than four days of culture (Brecher ME. Et al., 2001). As for mycobacterium, more than twenty days may be necessary for their detection (Saitoh H. et al., 2000).
  • the growth of a bacterium is also strongly conditioned by the choice of the culture medium which may be simple or enriched and which may or may not contain inhibitors of antibacterial agents.
  • the culture conditions are also specific for the strain to be detected. Various incubation temperatures and aerobic or anaerobic conditions will thus be used. With these methods, the identification of microorganisms must be done in a second step following the culture. Finally, the detection of dead or non-revivable bacteria is impossible with this type of technology.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Hybridization techniques allow universal detection and / or specific detection of bacteria (Braun-Howland EB. et al., 1992; Poppert S. et al., 2002).
  • the sample preparation step is once again a restrictive and limiting step in this method.
  • the presence of residual nucleic acids is again a source of false positives.
  • the main limitation of molecular biology techniques lies in the choice of the primer, the specificity of which must be sufficiently broad for a generic detection and yet specific for the microorganisms to be detected to avoid false positive reactions.
  • a mixture of different primers is generally necessary causing technical constraints.
  • the immunohistochemical or immunocytochemical (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) labeling methods using an antibody directed against the bacterial wall are limited by the specificity of the antibody. Indeed, to date, no antibody allows universal detection of microorganisms. This technique can only be used for precisely identified strains of bacteria
  • Microscopic methods that use colorimetry using, for example, GRAM dyes, or vital dyes or fluorochromes allow visual morphological identification of the type of bacteria involved in the contamination (Fazii P. et al., 2002). However, they lack sensitivity and require time to handle high as well as a growth of several days of the microorganism to allow its visualization (Mirrett S. et al., 1982).
  • cytometry allows the detection of microorganisms quickly and easily (Reynolds DT. Et al., 1999; Okada H. et al., 2000).
  • the Applicant has designed a universal detection method for microorganisms which uses a marker common to all bacteria, yeasts, molds and parasites, for example a non-specific DNA intercalating compound of a particular nucleic sequence.
  • This detection method can be applied to any biological fluid.
  • biological fluid means any fluid which may contain one or more microorganisms, such as for example, ionic media, culture media, physiological, such as for example blood or its derivatives such as platelet or red blood cell concentrates or plasma, and thus relates to various fields of application, such as the analysis of medical samples, quality control in industry food processing or monitoring water treatment.
  • the method for detecting microorganisms applies to blood or its derivatives such as platelet or red blood cell concentrates or plasma.
  • the method for labeling microorganisms which is the subject of the present invention implements a reaction medium comprising a labeling agent, cell penetration agents which promote the molecular passage of said labeling agent towards the genome of the microorganisms, whatever the nature of said microorganism.
  • the labeling method of the invention makes it possible to keep the structure of microorganisms, in particular bacteria, intact.
  • This reaction medium allows the labeling agent to pass through: the cytoplasmic membrane, namely the lipid bilayer and the membrane proteins of microorganisms whatever they are; the wall of Gram positive bacteria consisting mainly of peptidoglycan or murine which comes into contact with the cytoplasmic membrane and which is possibly covered with a surface layer of polysaccharides; the outer membrane of Gram negative bacteria, which contains a lot of phospholipids, lipoproteins and lipopolysaccharides, which is separated from the cytoplasmic membrane by a space periplasmic where proteins are found and which is pierced with pores.
  • This wall is impermeable to most substances, except those that penetrate through the pores.
  • This new microorganism labeling process allows universal labeling of both living microorganisms and dead or non-revivable microorganisms.
  • An analysis of the microorganisms thus labeled can be carried out, for example, in fluorescence by microscopic methods with an epifluorescence microscope, and / or flow cytometry and / or solid phase cytometry.
  • the method of the invention comprises an original preparation of the microorganisms from the samples containing them. Different reagents are used to, in the same step, penetrate microorganisms without altering their morphology and marking them in fluorescence.
  • the method of the invention makes it possible to keep the structure of the bacteria intact for analysis according to cell biology techniques possibly making it possible to visually differentiate the major families of microorganisms: bacilli, shells, spores, yeasts.
  • the method allows both detection and morphological identification of microorganisms based on their shape and size. This method is applicable to the detection of microorganisms in different physiological, culture and / or ionic media.
  • said method allows both the detection and the morphological identification of microorganisms on the basis of their shape and size in the blood or its derivatives such as platelet or red blood cell or plasma concentrates.
  • the universal microorganism detection process has 4 or 5 steps.
  • the microorganisms suspended in water, buffer, physiological serum, culture medium, blood, plasma or blood derivatives are brought into contact with a single reaction medium comprising the DNA intercalating agent , and at least one cell penetration reagent.
  • cell penetration reagent a solution comprising at least the mixture of at least one permeabilizing agent, a detergent, an ion chelating agent and an antiseptic.
  • the subject of the invention is a method for detecting microorganisms possibly present in a biological fluid, comprising the following steps: a) a sample of said biological fluid is taken, b) said sample is brought into contact with a reaction medium comprising a labeling agent and a cell penetration reagent for the membrane of said microorganisms, c) said sample is filtered on a filter capable of retaining the marked microorganisms possibly present in said sample and d) the marked microorganisms detected in the filter are detected step (c).
  • the labeling agent is a DNA intercalating compound chosen from the group comprising: cyanine derivatives, propidium iodide, acridine orange and ethidium bromide.
  • the cyanine derivatives are chosen from the group made up of Picogreen, SYBR green and Y0PRO1.
  • the concentration of cyanine derivatives is between 0.001% and 0.5% (volume / volume), preferably between 0.003% and 0.05%
  • the concentration of propidium iodide, acridine orange or in ethidium bromide is between 0.1 ⁇ g / ml and 100 ⁇ g / ml and, preferably, between 1 ⁇ g / ml and 40 ⁇ g / ml.
  • the labeling agent is Picogreen.
  • the term “preferred concentration” means the concentration of the product in question in the final reactive medium “biological sample and reaction medium (labeling agent + cell penetration reagent ). Those skilled in the art can easily adapt the concentration of the various constituents of the penetration reagent, for example in a concentrated mother solution.
  • the cell penetration reagent for microorganisms is a solution comprising at least the mixture of at least one permeabilizing agent, a detergent, an ion chelating agent and an antiseptic.
  • the percentages (by weight) of the permeabilizing agent, the detergent, the ion chelating agent and the antiseptic in the final reagent is between 1.10 "4 % / 0.03% / 0.02% / 6.10 "4 % and 2.5.10 " 3 % / 0.8% / 0.6% / 0.015%.
  • the permeabilizing agent is chosen from polyethylene glycol (PEG), digitonin, monensin, polyethyleneimine (PEI), sodium hexamethaphosphate and benzalkonium chloride.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEI polyethyleneimine
  • sodium hexamethaphosphate sodium hexamethaphosphate
  • benzalkonium chloride The preferred concentrations of said permeabilizers are as follows:
  • the PEG concentration is between 0.01% and 1% and, preferably, between 0.05% and 0.5%;
  • the digitonin concentration is between 0.01 ⁇ g / ml and 10 ⁇ g / ml and, preferably, between 0.05 ⁇ g / ml and 5 ⁇ g / ml;
  • the concentration of monensin is between 0.1 ⁇ g / ml and 5 ⁇ g / ml and, preferably, between 0.5 ⁇ g / ml and 1 ⁇ g / ml;
  • the PEI concentration is between 1 ⁇ g / ml and 400 ⁇ g / ml and, preferably, between 5 ⁇ g / ml and 120 ⁇ g / ml;
  • the sodium hexametaphosphate concentration is between 0.005% and 1% and, preferably, between 0.01% and 0.1%;
  • the concentration of benzalkonium chloride is between 0.001% and 0.1% and, preferably, between 0.005% and 0.05%.
  • the permeabilizing agent is polyethyleneimine (PEI).
  • detergents those of the group comprising: N-octyl ⁇ D-glucopyranoside are preferred.
  • the concentration of saponin or Tween is between 0.005% and 10%, preferably between 0.05% and 0.5%; - the NOG concentration is between
  • the concentration of Triton is between 0.0001% and 0.05%, preferably between 0.0008% and 0.002%; the Igepal concentration is between 0.01% and 20%, preferably between 1% and 5%.
  • the detergent is N-octyl ⁇ D-glucopyranoside (NOG).
  • NOG N-octyl ⁇ D-glucopyranoside
  • ion chelating agent those of the group comprising EDTA and EGTA are preferred.
  • the concentration of ion chelating agent is between 0.05% and 0.8%.
  • the ion chelating agent is EDTA.
  • the concentration of EDTA is between 0.1 mM and 50 mM, preferably between 0.2 mM and 7.5 mM.
  • the antiseptic agent is chosen from the group comprising: betadine, cetrimide, tea tree oil, terpinene-4-ol, chlorhexidine, polymyxin B and rifampicin
  • the antiseptic agent is chlorhexidine.
  • the chlorhexidine concentration is between 0.0005% and 0.5% and, preferably, between 0.001% and 0.05%.
  • the concentration of cetrimide is between 0.01% and 5% and, preferably, between 0.05% and 1%.
  • concentration of betadine is between 0.0001% and 0.001% and, preferably, between 0.0005% and 0.005%.
  • the concentration of tea tree oil is between 0.0001% and 0.1% and, preferably, between 0.0005% and 0.05%.
  • the concentration of terpinen-4 -ol is between 0.05% and 10% and, preferably, between 0.5% and 5%.
  • the concentration of polymixin B and rifampicin is between 0.1 ⁇ g / ml and 100 ⁇ g / ml and, preferably, between 1 ⁇ g / ml and 50 ⁇ g / ml.
  • the penetration reagent may further comprise an enzyme or a bacteriocin.
  • lysozyme is preferably used and, as the bacteriocin, nisin is preferably used.
  • the concentration of lysozyme is between 0.5 ⁇ g / ml and 200 ⁇ g / ml, preferably between 0.05 ⁇ g / ml and 20 ⁇ g / ml and the concentration of nisin is between 0.005 ⁇ g / ml and 10 ⁇ g / ml, preferably between 0.005 ⁇ g / ml and 0.05 ⁇ g / ml.
  • cryoprotective agents such as DMSO, or ions (NaCl, KC1, MgCl 2 , sodium hypochlorite) or sucrose can also be used according to the invention.
  • the DMSO concentration is between
  • the sucrose concentration is between 0.5% and 70% and preferably between 5% and 20%.
  • the sodium hypochlorite concentration is between 0.001% and 5% and preferably between 0.005% and 0.5%.
  • step b) of the method for detecting microorganisms is carried out in two sub-steps b ') and b' ').
  • step b ' the sample is brought into contact with a reaction medium comprising a labeling agent and a permeabilizing polymer chosen from polyethylene glycol (PEG) or polyethyleneimine (PEI).
  • a permeabilizing polymer chosen from polyethylene glycol (PEG) or polyethyleneimine (PEI).
  • PEG polyethylene glycol
  • PEI polyethyleneimine
  • a mixture is added to the reaction medium comprising at least one detergent, an ion chelating agent, an antiseptic and another permeabilizing agent chosen from, nisin, digitonin, monensin, sodium hexamethaphosphate and benzalkonium chloride.
  • step b) of the process of the invention is carried out in two steps b ') and b' '
  • the enzyme is added in step b' ').
  • the invention also relates to a reaction medium for labeling microorganisms comprising a labeling agent and a cell penetration reagent for said microorganisms.
  • the labeling agent and the penetration reagent included in the reaction medium for the labeling of microorganisms are identical, as well as their concentrations or the concentration of their components, to those previously described as used in the process of detection according to the invention.
  • a preferred cell penetration reagent according to the invention comprises:
  • FIG. 1 shows the influence of the addition of nisin on the detection of Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli. The results are expressed in number of bacteria detected by solid phase cytometry (FIG. 1A) and in percentage of bacteria detected (FIG. IB) compared to the enzymatic detection method.
  • FIG. 1A shows the influence of the addition of nisin on the detection of Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli.
  • FIG. IB percentage of bacteria detected
  • FIG. 3 illustrates the results of the test of different concentrations of nisin associated with different concentrations of EDTA to improve the detection of GRAM bacteria - ⁇ Escherichia coli). The results are expressed as a percentage of detection compared to the enzymatic detection method.
  • FIG 4 illustrates the results of the test of different concentrations of nisin associated with a fixed concentration of EDTA at 7.5 mM to detect GRAM bacteria - [Escherichia coli and Serratia marcescens) and GRAM + bacteria (Staphylococcus epidermidis). The results are expressed in number of bacteria detected on the filter in solid phase cytometry.
  • FIG. 5 illustrates the influence of pH on the detection of E. coli with a fluorescent DNA marker in the presence of 0.2 ⁇ g / ml nisin / 7.5mM EDTA.
  • Figure 6 shows the detection of GRAM bacteria - Escherichia coli, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mi rabi lis with a fluorescent DNA marker in the presence of nisin 0, 2 ⁇ g / ml / 7.5mM EDTA at pH 4 8.
  • FIG. 7 shows the results of a test of N Octyl Glucopyranoside as a cell penetration reagent in combination with 0.2 ⁇ g / ml nisin and 7.5 mM EDTA to improve the labeling of Staphylococcus epidermidis (GRAM +) and Pseudomonas aeruginosa (GRAM -).
  • N / E 0.2 ⁇ g / ml nisin solution / 7.5 mM EDTA.
  • FIG. 8 shows the results obtained with chlorhexidine as a cell penetration reagent to improve the labeling of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens (GRAM - bacterial strains) and the effect on Staphylococcus epidermidis.
  • FIG. 9 shows DNA labeling and detection of bacteria (P. aeruginosa) in different media.
  • FIG. 10 shows the DNA labeling and detection of bacteria in chlorhexidine and proves the interest of the association with NOG to increase the permeabilizing power and penetration of the marker.
  • FIG. 10A shows the labeling of a suspension of bacteria in PBS.
  • FIG. 10B shows the labeling of a suspension of bacteria in platelet concentrate.
  • - Figure 11 shows the effect of different PEI concentrations on the detection of Serra t i a marcescens with a fluorescent DNA marker.
  • - Figure 12 shows the effect of PEI on DNA labeling and the detection of E. coli in fluorescence.
  • - Figure 13 shows the detection results of S. epidermidis and E bacteria. coli in the presence of a labeling composition comprising nisin / EDTA / CLX / NOG / PEI in different media.
  • the method for detecting microorganisms in the sample can be carried out by implementing a treatment of the sample in two stages, a first stage of labeling / cell penetration by adding to the sample a composition comprising the labeling agent and a first cell penetration reagent, followed, after an incubation time, by a second step in which a composition comprising other cell penetration reagents is added.
  • Such a method can be implemented, for example, according to the protocol described below:
  • a first cell penetration / labeling solution (Picogreen 0.5ml / l, PEI 60mg / l, PBS solution). This step is carried out at room temperature with stirring.
  • a composition in solution in solution which make it possible to continue labeling (nisin 0.2 mg / l, NOG 2.5 g / l, EDTA l, 86 g / l, chlorhexidine diacetate 50 mg / l). Incubation takes place at room temperature for 20 minutes. The sample is then filtered on a black filter, for example polycarbonate or polyester, and analyzed with a solid phase cytometer.
  • a black filter for example polycarbonate or polyester
  • the method for detecting microorganisms in the sample can also be carried out by implementing a treatment of the sample in a single step, by adding to the sample a composition comprising the labeling agent and one or more cell penetration agents.
  • Such a method can be implemented, for example, according to the protocol described below: Eight milliliters of the sample to be treated are incubated for 60 minutes at room temperature with three milliliters of a cell penetration / labeling solution (Picogreen 0.17 ml / 1, PEI 20 mg / 1, EDTA 4.34 g / 1, nisin 0.47 mg / 1, NOG 5.83 g / 1, chlorhexidine diacetate 116.7 mg / 1). The sample is then filtered on a black polycarbonate filter and analyzed with a solid phase cytometer.
  • a cell penetration / labeling solution Pulicogreen 0.17 ml / 1, PEI 20 mg / 1, EDTA 4.34 g / 1, nisin 0.47 mg / 1, NOG 5.83 g / 1, chlorhexidine diacetate 116.7 mg / 1).
  • All of these treatments can be carried out either in an open device, for example in tubes or in a closed device, such as a syringe or a device for preparing blood platelets for bacteriological analysis (Hemosystem, ref SPK01 ).
  • nisin alone as a permeabilizer to promote the penetration of the labeling agent.
  • the filter is analyzed by solid phase cytometry and the results are expressed in number of bacteria detected in solid phase cytometry and in percentage of bacteria detected compared to the enzymatic detection method.
  • nisin (raw material at 2.5% w / w) in 50 ml distilled water, i.e. 10 ⁇ g / ml nisin 0.05 ⁇ g / ml / 7.5 mM EDTA: 250 ⁇ l nisin 10 ⁇ g / ml + 0.140 g disodium EDTA, QSP 50 ml distilled water, nisin 0.1 ⁇ g / ml / 7.5 mM EDTA: 500 ⁇ l of nisin 10 ⁇ g / ml + 0.140 g disodium EDTA, QSP 50 ml of distilled water, nisin 0.5 ⁇ g / ml / 7.5 mM EDTA: 2.5 ml of nisin 10 ⁇ g / ml + 0.140g EDTA disodium QSP 50 ml of water.
  • Escherichia coli (CIP 105901) Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21) Serratia marcescens (CIP 103716) Adjust the preparations to obtain a suspension at 10 3 bacteria / ml.
  • the percentage of labeled Escherichia coli bacteria is maximum for a concentration of nisin at 0.1 ⁇ g / ml and that better detection of the set of bacteria tested is obtained when using nisin at a concentration of 0.2 ⁇ g / ml associated with EDTA at a concentration of 7.5 mM.
  • EDTA 20 mM 0.372 g EDTA disodium, QSP 50 ml of distilled water,
  • Escherichia coli (CIP 105901) Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21) Serratia marcescens (CIP 103716) Enterobacter aerogenes (CIP 60.86T) Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110)
  • the filter After filtration, the filter is analyzed by solid phase cytometry and the results are expressed in number of fluorescent bacteria detected.
  • Nisin / EDTA / NOG solution nisin 100 ⁇ g / ml: 0.2 g of nisin (raw material at 2.5% w / w) QSP 50 ml distilled water
  • N Octyl Glucopyranoside has positive effects on the labeling of Staphylococcus epidermidis and Pseudomonas aeruginosa.
  • Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110) Adjust the preparations to obtain a suspension at 10 3 bacteria / ml. II Method 1.2 ml of labeling solution + 3 ml of bacteria suspension
  • the filter is analyzed by solid phase cytometry and the results are expressed in number of fluorescent bacteria. Counting on a 48 hour petri dish serves as a reference method.
  • the objective of this experiment is to determine the optimal PEI concentration range for labeling E. coli.
  • Escherichia coli (CIP 105901), adjustment of the concentration to 10 4 bacteria / ml.
  • the filter After filtration, the filter is analyzed by solid phase cytometry and the results expressed as the number of bacteria detected as fluorescent.
  • the filter After filtration, the filter is analyzed by solid phase cytometry and the results expressed as the number of bacteria detected as fluorescent.
  • the formula thus defined allows the detection of GRAM + bacteria and GRAM- bacteria in different ionic, cultural and physiological media. This detection is comparable for the two types of bacteria.

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de détection de microorganismes mettant en œuvre un milieu réactionnel comprenant un agent de marquage, au moins un réactif de pénétration cellulaire qui favorise le passage moléculaire dudit agent de marquage vers le génome des microorganismes. L’invention a également pour objet ledit milieu réactionnel de marquage.

Description

PROCEDE DE DETECTION UNIVERSELLE DE MICROORGANISMES ET MILIEU REACTIONNEL PERMETTANT LA MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE.
La présente invention appartient au domaine de la microbiologie et, en particulier, elle concerne les procédés de détection et d'identification de microorganismes dans les différents milieux dans lesquels ils peuvent se trouver. De nombreux procédés de détection des microorganismes ont été mis au point répondant ainsi à des besoins variés. On peut ainsi citer l'analyse d'échantillons médicaux, le contrôle de la qualité dans l'industrie agroalimentaire et le suivi du traitement des eaux.
La méthode de détection idéale des microorganismes devrait être rapide, spécifique
(absence de faux positifs) , sensible et simple à mettre en œuvre. Elle permettrait la détection des microorganismes vivants et morts dans des milieux divers. Enfin, une première identification des types de bactéries impliquées serait un atout supplémentaire.
Les méthodes de culture, sur boîte ou en phase liquide, permettent la détection de toutes les bactéries en phase de croissance dans la plupart des milieux, avec une bonne sensibilité. Une seule bactérie suffit, en théorie, pour obtenir un résultat positif après culture et les cultures en phase liquide sont automatisables (Aubert G et al., 1993). Cependant, le temps nécessaire à l'obtention du résultat est parfois très long. Ainsi la détection dans les produits sanguins des souches de propioni-bacterium demande plus de quatre jours de culture (Brecher ME. et al., 2001). Quant aux mycobacterium, plus de vingt jours peuvent être nécessaires à leur détection (Saitoh H. et al., 2000). La croissance d'une bactérie est, également, fortement conditionnée par le choix du milieu de culture qui peut être simple ou enrichi et qui contient ou non des inhibiteurs d'agents antibactériens. Les conditions de culture sont également spécifiques de la souche à détecter. On utilisera ainsi des températures d'incubation variées et des conditions aérobies ou anaérobies. Avec ces méthodes, l'identification des microorganismes doit se faire dans un deuxième temps suivant la culture. Enfin la détection des bactéries mortes ou non revivifiables est impossible avec ce type de technologie .
Les procédés mettant en œuvre des techniques de biologie moléculaire sont rapides, puisque quelques heures d' incubation sont suffisantes pour déclarer un échantillon positif, et sensibles avec la possibilité de détecter moins de dix microorganismes par réaction.
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) permet la détection en temps réel des contaminations bactériennes dans un échantillon en utilisant des sondes fluorescentes spécifiques de l'ADN cible (He Q. et al., 2002). Il est nécessaire de purifier cet échantillon afin de protéger la polymérase nécessaire à la réaction d'amplification des inhibiteurs potentiels. On rencontre par exemple de nombreux inhibiteurs de PCR dans le plasma (Al-Soud A. et al., 2000). Cette étape préalable de purification fait que le procédé de détection de microorganismes mettant en œuvre la PCR n'est pas un processus d'utilisation aisée. Aussi, dans le cas d'un échantillon ayant contenu des bactéries phagocytées par des leucocytes, toute trace d'ADN résiduel entraînera la positivité de l'échantillon ce qui nuit fortement à la spécificité de la méthode.
Les techniques d'hybridation permettent la détection universelle et/ou la détection spécifique des bactéries (Braun-Howland EB . et al., 1992 ; Poppert S. et al., 2002). Comme pour la PCR, l'étape de préparation de l'échantillon est encore une fois une étape contraignante et limitante dans cette méthode. La présence d'acides nucléiques résiduels est une fois encore source de faux positifs.
La principale limitation des techniques de biologie moléculaire réside dans le choix de l'amorce dont la spécificité doit être suffisamment large pour une détection générique et cependant spécifique des microorganismes à détecter pour éviter les réactions faussement positives. Un mélange de différentes amorces est généralement nécessaire provoquant des contraintes techniques . Les méthodes de marquage immunohistochimiques ou immunocytochimiques (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) faisant appel à un anticorps dirigé contre la paroi bactérienne sont limitées par la spécificité de l'anticorps. En effet, à ce jour, aucun anticorps ne permet la détection universelle des microorganismes. Cette technique n'est utilisable que pour des souches de bactéries précisément identifiées
(Kakinoki K. et al., 2001 ; Guarner J. et al., 2002).
Elle demande également une préparation particulière des cellules ou tissus à analyser comprenant, par exemple, des étapes de fixation et de pénétration cellulaire de l'échantillon faisant intervenir des solvants de type acétone, formaldéhyde et méthanol .
Les méthodes microscopiques qui font appel à la colorimétrie utilisant par exemple des colorants de GRAM, ou des colorants vitaux ou des fluorochromes permettent une identification visuelle morphologique du type de bactérie impliquée dans la contamination (Fazii P. et al., 2002). Cependant, elles manquent de sensibilité et elles demandent un temps de manipulation élevé ainsi qu'une croissance de plusieurs jours du microorganisme pour permettre sa visualisation (Mirrett S. et al. , 1982) .
L'utilisation de la cytométrie permet la détection des microorganismes de façon rapide et simple (Reynolds DT. et al., 1999 ; Okada H. et al., 2000).
Toutefois, la limitation de cette méthode réside dans le procédé de marquage. En effet, on utilise soit des anticorps spécifiques de la paroi de la souche ciblée qui ne permettent pas la détection universelle des bactéries, soit des marqueurs de l'ADN de type agents intercalants (molécules capables de s'insérer entre les plateaux formés par les bases appariées d'un acide nucléique). Cette dernière option nécessite toutefois une manipulation préalable des bactéries visant à perméabiliser leur paroi pour laisser pénétrer le marqueur (Marie D. et al., 1996 ; Okada H. et al., 2000). Il est notable que ces agents sont particulièrement sensibles au milieu et ne seront efficaces que dans des conditions strictement définies de concentrations en ions et de pH (Marie D. et al., 1996) .
Pour pallier les inconvénients ci-dessus énumérés, la Demanderesse a conçu un procédé de détection universelle des microorganismes qui met en œuvre un marqueur commun à toutes les bactéries, levures, moisissures et parasites, par exemple un composé intercalant de l'ADN, non spécifique d'une séquence nucléique particulière. Ce procédé de détection peut s'appliquer à tout fluide biologique. Au sens de la présente invention, on entend par fluide biologique, tout fluide, pouvant contenir un ou plusieurs microorganismes, tels que par exemple, des milieux ioniques, des milieux de culture, des milieux physiologiques, comme par exemple le sang ou ses dérivés comme les concentrés plaquettaires ou de globules rouges ou le plasma, et concerne ainsi des domaines d'application divers, comme l'analyse d'échantillons médicaux, le contrôle de la qualité dans l'industrie agroalimentaire ou encore le suivi du traitement des eaux.
Avantageusement selon l'invention, le procédé de détection des microorganismes s'applique au sang ou ses dérivés comme les concentrés plaquettaires ou de globules rouges ou le plasma.
Le procédé de marquage de microorganismes objet de la présente invention met en œuvre un milieu réactionnel comprenant un agent de marquage, des agents de pénétration cellulaire qui favorisent le passage moléculaire dudit agent de marquage vers le génome des microorganismes et ce quelle que soit la nature dudit microorganisme. De manière tout à fait avantageuse, le procédé de marquage de l'invention permet de conserver intègre la structure des microorganismes, notamment des bactéries .
Ce milieu réactionnel permet le passage de 1 ' agent de marquage à travers : la membrane cytoplasmique, à savoir la bicouche lipidique et les protéines membranaires des microorganismes quels qu'ils soient ; la paroi des bactéries Gram positif constituée en majeure partie de peptidoglycane ou muréine qui vient au contact de la membrane cytoplasmique et qui est, éventuellement, recouverte d'une couche superficielle de polysaccharides ; la membrane externe des bactéries Gram négatif, qui contient beaucoup de phospholipides , de lipoprotéines et de lipopolysaccharides , qui est séparée de la membrane cytoplasmique par un espace périplasmique où l'on trouve les protéines et qui est percée de pores. Cette paroi est imperméable à la plupart des substances, à l'exception de celles qui pénètrent par les pores. Ce nouveau procédé de marquage des microorganismes permet le marquage universel tant des microorganismes vivants que des microorganismes morts ou non revivifiables .
Une analyse des microorganismes ainsi marqués est réalisable, par exemple, en fluorescence par des méthodes microscopiques avec microscope à épifluorescence, et/ou de cytométrie en flux et/ou de cytométrie en phase solide.
Le procédé de l'invention comprend une préparation originale des microorganismes à partir des échantillons les contenant. Différents réactifs sont utilisés pour, dans une même étape, pénétrer les microorganismes sans altérer leur morphologie et les marquer en fluorescence. Le procédé de l'invention permet de conserver intègre la structure des bactéries pour une analyse selon des techniques de biologie cellulaire permettant éventuellement de différencier de façon visuelle les grandes familles de microorganismes : bacilles, coques, spores, levures.
Ledit procédé permet à la fois la détection et l'identification morphologique des microorganismes sur la base de leur forme et de leur taille. Ce procédé est applicable à la détection de microorganismes dans différents milieux physiologiques, de culture et/ou ioniques .
Avantageusement ledit procédé permet à la fois la détection et l'identification morphologique des microorganismes sur la base de leur forme et de leur taille dans le sang ou ses dérivés tels que les concentrés plaquettaires ou de globules rouges ou le plasma .
Le procédé de détection universelle des microorganismes comporte 4 ou 5 étapes. Les microorganismes en suspension dans de l'eau, du tampon, du sérum physiologique, du milieu de culture, du sang, du plasma ou des dérivés sanguins sont mis en présence d'un milieu réactionnel unique comprenant l'agent intercalant de l'ADN, et au moins un réactif de pénétration cellulaire.
Par réactif de pénétration cellulaire on entend selon la présente invention une solution comprenant au moins le mélange d'au moins un agent permeabilisant, un détergent, un agent chélateur d'ions et un antiseptique.
Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé de détection de microorganismes éventuellement présents dans un fluide biologique, comprenant les étapes suivantes : a) on prélève un échantillon dudit fluide biologique, b) on met en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel comprenant un agent de marquage et un réactif de pénétration cellulaire de la membrane desdits microorganismes, c) on filtre ledit échantillon sur un filtre susceptible de retenir les microorganismes marqués éventuellement présents dans ledit échantillon et d) on détecte les microorganismes marqués et retenus dans le filtre à l'étape (c) .
De préférence, l'agent de marquage est un composé intercalant de l'ADN, choisi parmi le groupe comprenant : les dérivés cyanines, l'iodure de propidium, l'acridine orange et le bromure d'éthidium. Avantageusement, les dérivés cyanines sont choisis dans le groupe constitué par le Picogreen, le SYBR green et le Y0PRO1. En ce qui concerne leurs concentrations préférées, la concentration en dérivés cyanines est comprise entre 0,001% et 0,5% (volume/volume), de préférence entre 0,003% et 0,05%, la concentration en iodure de propidium, en acridine orange ou en bromure d'éthidium est comprise entre 0,1 μg/ml et 100 μg/ml et, de préférence, entre 1 μg/ml et 40 μg/ml.
Préfèrentiellement , l'agent de marquage est du Picogreen.
Par la suite dans le texte et dans les revendications, et sauf indication contraire dans les exemples, on entend par concentration préférée, la concentration du produit considéré dans le milieu réactif final « échantillon biologique et milieu réactionnel (agent de marquage + réactif de pénétration cellulaire) . L'Homme du métier sait adapter sans difficulté la concentration des différents constituants du réactif de pénétration, par exemple dans une solution mère concentrée.
De préférence, le réactif de pénétration cellulaire des microorganismes est une solution comprenant au moins le mélange d'au moins un agent permeabilisant, un détergent, un agent chélateur d'ions et un antiseptique.
Selon l'invention, les pourcentages (en poids) de l'agent permeabilisant, du détergent, de l'agent chélateur d'ions et de l'antiseptique dans le réactif final est compris entre 1.10"4%/0 , 03%/0, 02%/ 6.10"4% et 2,5.10"3%/0,8%/0,6%/0,015%.
L ' agent permeabilisant est choisi parmi le polyéthylène glycol (PEG) , la digitonine , la monensine , le polyéthylènimine ( PEI ) , le sodium hexaméthaphosphate et le chlorure de benzalkonium . Les concentrations préférées desdits agents perméabilisants sont les suivantes :
- la concentration en PEG est comprise entre 0,01% et 1% et, de préférence, entre 0,05% et 0,5% ; - la concentration en digitonine est comprise entre 0,01 μg/ml et 10 μg/ml et, de préférence, entre 0,05 μg/ml et 5 μg/ml ;
- la concentration en monensine est comprise entre 0,1 μg/ml et 5 μg/ml et, de préférence, entre 0,5 μg/ml et 1 μg/ml ;
- la concentration en PEI est comprise entre 1 μg/ml et 400 μg/ml et, de préférence, entre 5 μg/ml et 120 μg/ml ; la concentration en sodium héxamétaphosphate est comprise entre 0,005% et 1% et, de préférence, entre 0,01% et 0,1% ;
- la concentration en chlorure de benzalkonium est comprise entre 0,001% et 0,1% et, de préférence, entre 0,005% et 0,05%. Préférentiellement l'agent permeabilisant est du polyéthylènimine (PEI) .
Parmi les détergents, on préfère ceux du groupe comprenant : le N-octyl β D-glucopyranoside
(NOG) , la saponine, le Tween, le Triton, l'Igepal et le CHAPS. Leurs concentrations préférées sont détaillées ci-après :
- la concentration en saponine ou en Tween est comprise entre 0,005% et 10%, de préférence entre 0 ,05% et 0,5% ; - la concentration en NOG est comprise entre
0,01% et 10%, de préférence entre 0,1% et 0,5% ;
- la concentration en Triton est comprise entre 0,0001% et 0,05%, de préférence entre 0,0008% et 0,002 % ; la concentration en Igepal est comprise entre 0,01 % et 20%, de préférence entre 1% et 5%.
Préférentiellement le détergent est le N- octyl β D-glucopyranoside (NOG) . En tant qu'agent chélateur d'ions, on préfère ceux du groupe comprenant 1 ' EDTA et l'EGTA.
Avantageusement, la concentration en agent chélateur d'ions est comprise entre 0,05% et 0,8%.
Préférentiellement l'agent chélateur d'ion est l'EDTA.
Avantageusement, la concentration de l'EDTA est comprise entre 0,1 mM et 50 mM, de préférence entre 0,2mM et 7,5 mM.
L'agent antiseptique est choisi parmi le groupe comprenant : la bétadine, le cetrimide, l'huile de l'arbre à thé, le terpinene-4-ol, la chlorhexidine, la polymyxine B et la rifampicine
Préférentiellement l'agent antiseptique est de la chlorhexidine. Avantageusement, la concentration en chlorhexidine est comprise entre 0,0005% et 0,5% et, de préférence, entre 0,001% et 0,05%.
La concentration en cetrimide est comprise entre 0,01% et 5% et, de préférence, entre 0,05% et 1%. La concentration en bétadine est comprise entre 0,0001% et 0,001% et, de préférence, entre 0,0005% et 0,005%.
La concentration en huile d'arbre a thé est comprise entre 0,0001% et 0,1% et, de préférence, entre 0,0005% et 0,05%.
La concentration en terpinen-4 -ol est comprise entre 0,05% et 10% et, de préférence, entre 0,5% et 5%. La concentration en polymixine B et en rifampicine est comprise entre 0,1 μg/ml et 100 μg/ml et, de préférence, entre 1 μg/ml et 50 μg/ml.
Le réactif de pénétration peut en outre comprendre une enzyme ou une bactériocine .
A titre d'enzyme, on utilise de préférence le lysozyme et, à titre de bactériocine, on utilise préférentiellement la nisine.
Avantageusement, la concentration de lysozyme est comprise entre 0,5 μg/ml et 200 μg/ml, de préférence entre 0,05 μg/ml et 20 μg/ml et la concentration de nisine est comprise entre 0,005 μg/ml et 10 μg/ml, de préférence entre 0,005 μg/ml et 0,05 μg/ml . Afin de pénétrer efficacement la paroi bactérienne, on peut en outre utiliser selon l'invention des agents cryoprotecteurs comme le DMSO, ou des ions (NaCl, KC1, MgCl2, 1 ' hypochlorite de sodium) ou le sucrose . La concentration en DMSO est comprise entre
0,05% et 20% et, de préférence, entre 0,5% et 5%.
La concentration en sucrose est comprise entre 0,5% et 70% et, de préférence, entre 5% et 20%.
La concentration en hypochlorite de sodium est comprise entre 0,001% et 5% et, de préférence, entre 0,005% et 0,5%.
La concentration en citrate de potassium est comprise entre 0,5 mM et 200 mM et, de préférence, entre 5 mM et 50 mM. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape b) du procédé de détection des microorganismes est réalisée en deux sous-étapes b' ) et b' ' ) .
A l'étape b' ) on met en contact l'échantillon avec un milieu réactionnel comprenant un agent de marquage et un polymère permeabilisant choisi parmi le polyéthylène glycol (PEG) ou le polyéthylènimine (PEI) . Préférentiellement on utilise le polyéthylènimine (PEI) . A l'étape b'') on ajoute au milieu réactionnel un mélange comprenant au moins un détergent, un agent chélateur d'ions, un antiseptique et un autre agent permeabilisant choisi parmi, la nisine, la digitonine, la monensine, le sodium hexaméthaphosphate et le chlorure de benzalkonium.
Lorsque l'étape b) du procédé de l'invention est réalisée en deux étapes b' ) et b' ' ) , l'enzyme est ajoutée à l'étape b'').
L'invention a également pour objet un milieu réactionnel pour le marquage de microorganismes comprenant un agent de marquage et un réactif de pénétration cellulaire desdits microorganismes.
Préférentiellement selon l'invention, l'agent de marquage et le réactif de pénétration compris dans le milieu réactionnel pour le marquage de microorganismes sont identiques, ainsi que leurs concentrations ou la concentration de leurs composants, à ceux précédemment décrits comme utilisés dans le procédé de détection selon l'invention. Un réactif de pénétration cellulaire préféré selon l'invention comprend :
- du Picogreen au 1/22000 (Molecular Probes) ;
- du PEI à la concentration finale de 5,5 μg/ml ;
- de la Chlorhexidine diacétate à la concentration finale de 4,5 xlO"4 % ;
- du N Octyl glucopyranoside à la concentration finale de 0,16 % ;
- de la nisine a la concentration finale de 0,018 μg/ml ; - de l'EDTA à la concentration finale de 0,45mM ; - du tampon Phosphate salin (PBS) , en quantité suffisante pour le volume final désiré
La présente invention est illustrée à l'aide des exemples de mise en œuvre indiqués ci-dessous accompagnés des figures en annexe dans lesquelles les concentrations sont indiquées comme les concentrations dans le réactif de pénétration :
- la figure 1 montre l'influence de l'ajout de nisine sur la détection de Staphylococcus epidermidis et Escherichia coli . Les résultats sont exprimés en nombre de bactéries détectées en cytométrie en phase solide (figure 1A) et en pourcentage de bactéries détectées (figure IB) par rapport à la méthode de détection enzymatique. - la figure 2 montre l'effet de l'EDTA utilisé seul pour la détection de Staphylococcus epidermidis et Escherichia coli préparés dans différents milieux tests.
- la figure 3 illustre les résultats du test de différentes concentrations de nisine associées à différentes concentrations d'EDTA pour améliorer la détection des bactéries GRAM - {Escherichia coli) . Les résultats sont exprimés en pourcentage de détection par rapport à la méthode de détection enzymatique. - la figure 4 illustre les résultats du test de différentes concentrations de nisine associées à une concentration fixe d'EDTA à 7,5 mM pour détecter les bactéries GRAM - [Escherichia coli et Serratia marcescens) et les bactéries GRAM + (Staphylococcus epidermidis) . Les résultats sont exprimés en nombre de bactéries détectées sur le filtre en cytométrie phase solide .
- la figure 5 illustre l'influence du pH sur la détection d'E. coli avec un marqueur fluorescent d'ADN en présence de nisine 0.2μg/ml/EDTA 7,5mM. la figure 6 montre la détection des bactéries GRAM - Escherichia coli , Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mi rabi l i s avec un marqueur fluorescent d'ADN en présence de nisine 0 , 2μg/ml/EDTA 7,5mM à pH 4,8.
- la figure 7 montre les résultats d'un test du N Octyl Glucopyranoside en tant que réactif de pénétration cellulaire en association avec de la nisine 0,2 μg/ml et de l'EDTA 7,5 mM pour améliorer le marquage de Staphylococcus epidermidis (GRAM +) et de Pseudomonas aeruginosa (GRAM -). (N/E = solution de nisine 0,2 μg/ml / EDTA 7,5 mM.
- la figure 8 montre les résultats obtenus avec la chlorhexidine en tant que réactif de pénétration cellulaire pour améliorer le marquage d' Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa et Serratia marcescens (souches bactériennes GRAM -) et l'effet sur Staphylococcus epidermidis .
- la figure 9 montre le marquage ADN et la détection des bactéries (P. aeruginosa) dans différents milieux.
- la figure 10 montre le marquage ADN et détection des bactéries en chlorhexidine et prouve l'intérêt de l'association avec du NOG pour augmenter le pouvoir permeabilisant et la pénétration du marqueur. La figure 10A montre le marquage d'une suspension de bactéries en PBS . La figure 10B montre le marquage d'une suspension de bactéries en concentré plaquettaire. - la figure 11 montre l'effet de différentes concentrations en PEI sur la détection de Serra t i a marcescens avec un marqueur fluorescent de l'ADN.
- la figure 12 montre l'effet du PEI sur le marquage DNA et la détection d' E. coli en fluorescence. - la figure 13 montre les résultats de détection des bactéries S. epidermidis et E . coli en présence d'une composition de marquage comprenant de la nisine/EDTA/CLX/NOG/PEI dans différents milieux. Le procédé de détection de microorganismes dans l'échantillon peut s'effectuer en mettant en œuvre un traitement de l'échantillon en deux étapes, une première étape de marquage/pénétration cellulaire en ajoutant audit échantillon une composition comprenant l'agent de marquage et un premier réactif de pénétration cellulaire, suivi, après un temps d'incubation, d'une deuxième étape dans laquelle on ajoute une composition comprenant d'autres réactifs de pénétration cellulaire. Un tel procédé peut être mis en œuvre, par exemple, selon le protocole décrit ci-dessous :
Trois millilitres de l'échantillon à traiter sont incubés pendant 40 minutes dans un millilitre d'une première solution de pénétration cellulaire/marquage (Picogreen 0,5ml/l, PEI 60mg/l, solution de PBS) . Cette étape est réalisée à température ambiante sous agitation.
Dans la deuxième étape, on ajoute sept millilitres d'une composition en solution permettant de poursuivre le marquage (nisine 0,2mg/l, NOG 2,5g/l, EDTA l,86g/l, diacétate de chlorhexidine 50mg/l). L'incubation se fait à température ambiante pendant 20 minutes. L'échantillon est alors filtré sur un filtre noir, par exemple en polycarbonate ou en polyester, et analysé avec un cytomètre en phase solide.
Le procédé de détection de microorganismes dans l'échantillon peut aussi s'effectuer en mettant en œuvre un traitement de l'échantillon en une seule étape, en ajoutant audit échantillon une composition comprenant l'agent de marquage et un ou plusieurs agents de pénétration cellulaire.
Un tel procédé peut être mis en œuvre, par exemple, selon le protocole décrit ci-dessous : Huit millilitres de l'échantillon à traiter sont incubés pendant 60 minutes à température ambiante avec trois millilitres d'une solution de pénétration cellulaire/marquage (Picogreen 0,17 ml/1, PEI 20 mg/1, EDTA 4,34 g/1, nisine 0,47 mg/1, NOG 5,83 g/1, diacétate de chlorhexidine 116,7 mg/1). L'échantillon est alors filtré sur un filtre noir en polycarbonate et analysé avec un cytomètre en phase solide.
L'ensemble de ces traitements peuvent être réalisés indifféremment dans un dispositif ouvert, par exemple dans des tubes ou dans un dispositif fermé, comme une seringue ou un dispositif pour la préparation des plaquettes sanguines en vue d'une analyse bactériologique (Hemosystem, ref SPK01) .
DETECTION DES MICROORGANISMES.
DETERMINATION DES COMPOSITIONS OPTIMALES DU MILIEU REACTIONNEL POUR LE MARQUAGE/PENETRATION CELLULAIRE.
1 - Marquage en présence de nisine .
Utilisation de la nisine seule en tant que permeabilisant pour favoriser la pénétration de l'agent de marquage .
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buf f er sal ine , pH 7 , 4 ) une solut ion de Picogreen au 1/ 2000 (Molecular Probe) . Solution de nisine
Préparer en eau distillée une série de dilutions de nisine (matière première à 2,5% poids/poids) : 0 , 1 g de nisine dans 50 ml eau distillée = solution 50 μg/ml
0,02 g de nisine dans 50 ml eau distillée = solution 10 μg/ml
0,004 g de nisine dans 50 ml eau distillée = solution 2 μg/ml.
Suspension de Bactéries préparées en PBS Escherichia coli (CIP 105901) Staphylococcus epidermidis (68.21) Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 104 bactéries /ml.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage + 3 ml de suspension de bactérie Incubation 15 minutes à 22 °C + 7 ml de solution de nisine
Filtration sur filtre noir 0,4 μm de porosité.
III Analyse et résultats
Après la filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries détectées en cytométrie en phase solide et en pourcentage de bactéries détectées par rapport à la méthode de détection enzymatique . Ces résultats montrent l'influence de l'ajout de nisine sur la détection de Staphylococcus epidermidis et Escherichia coli et sont illustrés dans les figures 1A et IB en annexe. On peut constater que l'ajout de nisine permet d'obtenir un bon marquage des GRAM+ et que des concentrations faibles sont préférables.
2 - Utilisation de l'EDTA seul en tant que permeabilisant pour favoriser la pénétration de l'agent de marquage.
I Réactifs Solution de marquage Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) .
Solution de EDTA
EDTA 5 mM : 0,093g EDTA disodique, QSP 50 ml d'eau distillée.
Suspension de Bactéries préparées en PBS, en eau distillée, en milieu TSB (tryptone soj broth) et en plasma.
Escherichia coli (CIP 105901) Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage + 3 ml de suspension de bactéries dans les différents milieux
Incubation 15 minutes à 22 °C
+ 7 ml de solution d'EDTA
Filtration sur filtre noir 0,4 μm de porosité.
III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries fluorescentes. Ces résultats montrent l'effet de l'EDTA utilisé seul pour la détection de Staphylococcus epidermidis et Escherichia coli préparés dans différents milieux tests et sont illustrés dans la figure 2 en annexe.
On peut constater que l'EDTA seul ne permet pas un marquage correct des bactéries Gram + et Gram -.
3 - Utilisation de 1' association nisine/EDTA en tant que permeabilisant pour favoriser la pénétration de l'agent de marquage.
I Réactifs Solution de marquage Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) .
Solution de nisine/EDTA nisine 10 μg/ml : 0,02 g de nisine (matière première à 2.5% poids/poids) QSP 50 ml eau distillée
EDTA 20 mM : 0,372 g EDTA disodique, QSP 50 ml d'eau distillée,
Préparer une gamme de EDTA avec 0,25 ; 2,5 ; 12,5 et 18,75 ml d'EDTA 20 mM (gamme de concentration 0,1 ; 1 ; 5 et 7,5 M)
Ajouter 50, 250, 500 μL ou 1 ml de nisine 10 μg/ml (gamme de concentration 0,01 ; 0,05 ; 0,1 et 0,2 μg/ ml)
QSP 50 ml d'eau distillée. Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode 1,2 ml de solution de marquage + 3 ml de suspension de bactérie
Incubation 15 minutes à 22 °C
+ 7 ml de solution de nisine ou nisine/EDTA
Filtration sur filtre noir 0,4 μm de porosité
III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries détectées en cytométrie en phase solide et en pourcentage de bactéries détectées par rapport à la méthode de détection enzymatique .
Ces résultats montrent l'influence de l'ajout de nisine combiné à l'EDTA sur la détection de Escherichia coli et sont illustrés dans la figure 3 en annexe .
On peut constater un effet synergique sur la détection des bactéries lorsque le marquage est effectué en présence du mélange nisine/EDTA. On peut constater également que le pourcentage des bactéries Escheri chia col i marquées est maximal pour une concentration de nisine à 0,1 μg/ml et EDTA 7,5 mM
4 - Optimi sa t ion des concen tra tions de l ' association ni sine/EDTA en tant que réactif de pénétration cellulaire pour détecter les bactéries I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) .
Solution de nisine/EDTA
0,02 g de nisine (matière première à 2,5% poids/poids) dans 50 ml eau distillée soit 10 μg/ml nisine 0,05 μg/ml/EDTA 7,5 mM : 250 μl de nisine 10 μg/ml + 0,140 g EDTA disodique, QSP 50 ml d'eau distillée, nisine 0,1 μg/ml/EDTA 7,5 mM : 500 μl de nisine 10 μg/ml + 0,140 g EDTA disodique, QSP 50 ml d'eau distillée, nisine 0,5 μg/ml/EDTA 7,5 mM : 2,5 ml de nisine 10 μg/ml + 0,140g EDTA disodique QSP 50 ml d' eau. Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901) Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21) Serratia marcescens (CIP 103716) Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode
1 , 2 ml de solution de marquage + 3 ml de suspension de bactéries Incubation 15 minutes à 22 °C + 7 ml de solut ion de ni s ine /EDTA à dif férentes concentrations
Fi l trat ion sur f i l t re noi r 0 , 4 μm de porosité .
III Analyse et résultats Après la filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries détectées en cytométrie en phase solide Les résultats de cette expérience montrant la détection des bactéries GRAM - (Escherichia coli , Serratia marcescens) et GRAM + ( Staphylococcus epidermidis) en présence de différentes concentrations de nisine associées à de l'EDTA 7,5 mM sont illustrés dans la figure 4 en annexe.
On peut constater que le pourcentage des bactéries Escherichia coli marquées est maximal pour une concentration de nisine à 0,1 μg/ml et que l'on obtient une meilleure détection de l'ensemble de bactéries testées lorsque l'on utilise la nisine à une concentration de 0,2 μg/ml associée à de l'EDTA à une concentration 7,5 mM.
5 - Infl uence du p sur le marquage des bactéries en présence de nisine/EDTA
I Réactifs Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) .
Solution de nisine/EDTA nisine 10 μg/ml : 0,02 g de nisine (matière première à 2,5% poids/poids) QSP 50 ml eau distillée
EDTA 20 mM : 0,372g EDTA disodique, QSP 50 ml d'eau distillée,
18,75 ml EDTA 20 mM + 1 ml de nisine 10 μg/ml
QSP 50 ml d'eau distillée Cette solution est à pH 4,8
Tamponner avec NaOH (1 M) jusqu'à pH 6 , pH 7 , pH 8. Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901) Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21) Serratia marcescens (CIP 103716) Enterobacter aerogenes (CIP 60.86T) Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110)
Proteus mirabilis (CIP 104588)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode 1,2 ml de solution de marquage + 3 ml de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22 °C
+ 7 ml de solution de nisine/EDTA à différents pH Filtration sur filtre noir 0,4 μm de porosité .
III Analyse et résultats
Après la filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries fluorescentes détectées .
Les résultats de cette expérience montrant l'influence du pH sur la détection d E . col i avec un marqueur fluorescent d'ADN en présence de nisine 0,2 μg/ml / EDTA 7,5mM sont illustrés figure 5 en annexe.
On peut constater que dans les conditions prédéfinies, l'augmentation du pH n'améliore pas le marquage d' Escherichia coli .
La détection des bactéries GRAM + Staphylococcus epidermidis et GRAM - Escherichia coli , Serra t i a marcescens, En t e roba c t e r a e rogen e s , Pseudomonas aeruginosa , Proteus mirabil is avec un marqueur fluorescent d'ADN en présence de nisine 0,2 μg/ml / EDTA 7,5mM à pH 4,8 est illustrée figure 6 en annexe .
On peut constater que dans les conditions de pH à 4,8, le marquage des bactéries GRAM ( - ) est homogène d'une souche à l'autre. La détection de
Staphylococcus epidermidis GRAM(+) est plus élevée que celle des GRAM(-) .
6 - Associ a t i on ni sine/EDTA/N Oc tyl Glucopyranosi de
I Réactifs
Solution de marquage Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) .
Solution de nisine/EDTA/NOG nisine 100 μg/ml : 0 , 2 g de nisine (matière première à 2,5% poids/poids) QSP 50 ml eau distillée
EDTA 100 mM : 1,86g EDTA disodique, QSP 50 ml d'eau distillée,
N Octyl glucopyranoside 5% : 2,5 g dans 50 ml eau distillée
20, 10, 5 ou 2,5 ml NOGà 5%
+ 3,75 ml EDTA 100 mM
+ 0,1 ml de nisine 100 μg/ml
QSP 50 ml d'eau distillée Cette solution est à pH 4.8.
Suspension de Bactéries préparées en PBS
Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21)
Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage
+ 3 ml de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22°C + 7 ml de solution de nisine/EDTA ou nisine/EDTA/NOG
Filtration sur filtre noir 0,4 μm de porosité.
III Analyse et résultats
Après filtration le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries fluorescentes
Les résultats de cette expérience, avec une composition du milieu réactionnel associant du N Octyl Glucopyranoside en tant que réactif de pénétration cellulaire des microorganismes, avec de la nisine 0,2 μg/ml et de l'EDTA 7 , 5 mM pour améliorer le marquage de Staphylococcus epidermidis (GRAM +) et de Pseudomonas aeruginosa (GRAM -) sont illustrés figure 7 en annexe.
On peut constater que l'ajout du N Octyl Glucopyranoside à 0.25% et à 0,5% a des effets positifs sur le marquage de Staphylococcus epidermidis et de Pseudomonas aeruginosa .
7 - Marquage en présence de chlorhexidine Test mettant en œuvre la chlorhexidine seule en tant qu'agent permeabilisant pour favoriser la pénétration de l'agent de marquage des bactéries. I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) . Solution de chlorhexidine
Chlorhexidine diacétate 5% : 1 g dans 20 ml eau distillée
50, 25 ou 10 μl de chlorhexidine diacétate 5 % dans 50 ml d'eau distillée pour obtenir une gamme de concentration de 0,01% ; 0,005% ou 0,001%.
Suspension de Bactéries préparées en PBS, en concentré plaquettaire et plasma autologue Escherichia coli (CIP 105901) Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21) Serratia marcescens (CIP 103716)
Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110) Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries /ml. II Méthode 1,2 ml de solution de marquage + 3 ml de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22 °C
+ 7 ml de solution de chlorhexidine a différentes concentrations Filtration sur filtre noir 0,4 μm de porosité.
III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries fluorescentes. Le comptage sur boîte de pétri à 48 heures tient lieu de méthode de référence.
Les résultats de cette expérience, avec une composition du milieu réactionnel comprenant de la chlorhexidine en tant que réactif de pénétration cellulaire pour améliorer le marquage d' Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Serratia marcescens
(souches bactériennes GRAM -) et de Staphylococcus epidermidis sont illustrés figure 8 en annexe. On peut constater que la concentration optimale de chlorhexidine pour la détection des bactéries GRAM - est de 0,005 %. Cette concentration est cependant toxique pour les bactéries GRAM + qui sont détruites. On constate que la présence de plasma antagonise l'effet de la chlorhexidine sur la pénétration cellulaire du marqueur pour Pseudomonas aeruginosa comme illustré figure 9. Pour un marquage universel dans différents milieux incluant les fluides biologiques, la chlorhexidine seule ne peut être utilisée .
8 - Association chlorhexidine/ N-Octyl Glucopyranoside
I Réactifs Solution de marquage Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) .
Solution de chlorhexidine/N Octyl Glucopyranoside
Chlorhexidine diacétate 5% : 1 g dans 20 ml eau distillée
N Octyl glucopyranoside 1% : 0,5 g dans 50 ml eau distillée 50 ou 25 μl de chlorhexidine diacétate 1 %
(concentration finale de 0,001% ou 0,0005%)
+ N Octyl glucopyranoside à 5% (concentration finale = 0,25 %)
QSP 50 ml d'eau distillée. Suspension de Bactéries préparées en PBS et en concentré plaquettaire d'aphérèse
Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (68.21)
Serratia marcescens (CIP 103716) Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110)
Ajuster les préparations pour obtenir une suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage + 3 ml de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22 °C
+ 7 ml de solution de Chlorhexidine /NOG
Filtration sur filtre noir 0,4 μm de porosité.
III Analyse et résultats
Après f iltration , le f iltre est analysé par cytométrie en phase sol ide et les résultats sont exprimés en nombre de bactéries fluorescentes . Les résultats de cette expérience montrant le marquage de l'ADN et la détection des bactéries marquées en présence d'une composition du milieu réactionnel comprenant de la chlorhexidine en association avec du NOG pour augmenter le pouvoir permeabilisant et la pénétration du marqueur sont illustrés figures 10A et 10B en annexe.
On observe que la concentration de chlorhexidine la plus élevée permet d'obtenir le meilleur marquage des bactéries.
9 - Marquage en présence de PEI seul
I Réactifs Solution de marquage Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) et ajouter du PEI pour une concentration finale à 40, 80, 100, 120, 140 et 160 μg/ml . Suspension de Bactéries préparées en PBS
Serratia marcescens (CIP 103716) Echantillon analysé
Dilution >l/20 de la suspension bactérienne dans un échantillon de concentré plaquettaire pour obtenir une concentration finale en bactérie Serratia marcescens de 104 /ml .
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage
+ 3 ml d'échantillon Incubation 45 minutes à
23°C
Filtration 5 μm (filtres PALL 32 mm) Incubation 20 minutes dans 7 ml de PBS Filtration 0,4 μm de porosité. III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats exprimés en nombre de bactéries détectées fluorescentes. Les résultats de cette expérience montrant l'effet de différentes concentrations en PEI sur la détection de Serratia marcescens avec un marqueur fluorescent de l'ADN sont illustrés figure 11 en annexe . On peut constater qu'une détection optimale des bactéries est obtenue avec une gamme de concentrations en PEI comprise entre 40 et 100 μg/ml.
1 0 - Associ a t i on ni sine/EDTA/N Octyl Glucopyranoside /Chlorhexidine /PEI
L'objectif de cette expérience est de déterminer la gamme de concentration optimale en PEI pour le marquage d' E. coli . I Réactifs Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) et ajouter du PEI pour une concentration finale à 100, 80 et 60 μg/ml. Solution de chlorhexidine/N Octyl
Glucopyranoside/EDTA
500 μL de chlorhexidine diacétate à 0,5 % (Chlorhexidine diacétate 5xl0"3 % final)
+ 1 ml ou 500 μL N Octyl glucopyranoside 25% (N Octyl glucopyranoside 0,5 ou 0,25 % final)
+ 500 μL nisine 20 μg/ml (nisine 0,2 μg/ml final)
+ 500 μL EDTA 0,5 M (EDTA 5mM final) QSP 50 ml PBS. Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901) , ajustement de la concentration à 104 bactéries/ml. Echantillon analysé 3 ml de suspension bactérienne + 27 ml de concentré plaquettaire soit une dilution au 1/10 de la suspension bactérienne dans un échantillon de concentré plaquettaire pour obtenir une concentration finale en bactérie de 105/ml. II Méthode
1,2 ml de solution de marquage à 60, 80 ou 100 μg/ml de PEI
+ 3 ml d'échantillon Incubation 45 minutes à 23 °C Filtration 5 μm (filtres PALL 32 mm)
Incubation 20 minutes dans 7 ml de solution de pénétration cellulaire à 0,5% ou 0,25% de NOG
Filtration 0,4 μm (filtres noirs Whatman monocolorés) . III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats exprimés en nombre de bactéries détectées fluorescentes.
Les résultats de cette expérience montrant l'effet du PEI sur le marquage DNA et la détection d' E . col i en fluorescence sont illustrés figure 12 en annexe .
On peut constater que la concentration de 60 μg/ml en PEI permet une pénétration optimale du marqueur DNA quelle que soit la concentration en NOG.
11 - Marquage universel des bactéries dans différents milieux I Réactifs Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000 (Molecular probe) et ajouter du PEI pour une concentration finale à 60 μg/ml.
Solution de chlorhexidine/N Octyl Glucosamine/EDTA/Nisine
500 μl de chlorhexidine diacétate à 0,5% (Chlorhexidine diacétate 5xl0"3 % final) + 500 μl N Octyl glucopyranoside 25% (N Octyl glucopyranoside 0,25 % final)
+ 500 μl nisine 20 μg/ml (nisine 0,2 μg/ml final)
+ 500 μl EDTA 0,5 M (EDTA 5mM final) QSP 50 ml PBS.
Suspension de Bactéries préparées en PBS Escherichia coli (CIP 105901) , ajustement de la concentration à 104 bactéries / ml
Staphylococcus epidermidis (68.21). Echantillon analysé
Dilution 1/10 de la suspension bactérienne dans un échantillon de fluide biologique pour obtenir une concentration finale en bactérie de 105 /ml soit :
3 ml de suspension bactérienne + 27 ml d'eau distillée
3 ml de suspension bactérienne + 27 ml de PBS 3 ml de suspension bactérienne + 27 ml de milieu de culture (tryptone soij broth)
3 ml de suspension bactérienne + 27 ml de plasma humain
3 ml de suspension bactérienne + 27 ml de concentré plaquettaire. II Méthode
1,2 ml de solution de marquage + 3 ml d'échantillon Incubation 45 minutes à 23 °C
Filtration 5 μm Incubation 20 minutes dans 7 ml de solution de pénétration cellulaire.
Filtration 0,4 μm de porosité. III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par cytométrie en phase solide et les résultats exprimés en nombre de bactéries détectées fluorescentes.
Les résultats de cette expérience montrant la détection de S . epidermidis et E. coli dans différents milieux sont illustrés figure 13 en annexe.
La formule ainsi définie permet la détection des bactéries GRAM+ et des bactéries GRAM- dans différents milieux ioniques, de culture et physiologiques. Cette détection est comparable pour les deux types de bactéries.
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Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de détection de microorganismes éventuellement présents dans un fluide biologique, caractérisé en ce que : a) on prélève un échantillon dudit fluide biologique, b) on met en contact ledit échantillon avec un milieu réactionnel pour le marquage de microorganismes comprenant un agent de marquage et un réactif de pénétration cellulaire de la membrane desdits microorganismes, c) on filtre ledit échantillon sur un filtre susceptible de retenir les microorganismes marqués éventuellement présents dans ledit échantillon et d) on détecte les microorganismes marqués et retenus dans le filtre à l'étape (c) .
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de marquage est un composé intercalant de l'ADN.
3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent intercalant de l'ADN est choisi parmi le groupe comprenant : les dérivés cyanines, l'iodure de propidium, l'acridine orange et le bromure d'éthidium.
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dérivé de cyanines est choisis dans le groupe constitué par le Picogreen, le SYBR green et le Y0PR01. 5) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la concentration en dérivés de cyanines est comprise entre 0,001% et 0,5%, de préférence entre 0,003% et 0,05% ; la concentration en iodure de propidium, en acridine orange ou en bromure d'éthidium est comprise entre 0,1 μg/ml et 100 μg/ml, de préférence entre 1 μg/ml et 40 μg/ml.
6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le réactif de pénétration cellulaire des microorganismes est une solution comprenant au moins le mélange d'au moins un agent permeabilisant, un détergent, un agent chélateur d'ions et un agent antiseptique.
7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que dans le réactif de pénétration cellulaire, le rapport entre l'agent permeabilisant, le détergent, l'agent chélateur d'ions et l'antiseptique dans le réactif final sont compris entre 1.10"4%/0,03%/0,02%/6.10"4% e t 2,5.10"5%/0,8%/0,6%/0,015%.
8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que l'agent de permeabilisation est choisi parmi le polyéthylene glycol (PEG) , la digitonine, la monensine, le polyéthylènimine (PEI) , le sodium hexamethaphosphate ou le chlorure de benzalkonium.
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la concentration en en PEG est comprise entre 0,01% et 1% et de préférence entre 0,05% et 0,5% ; la concentration en digitonine est comprise entre 0,01 μg/ml et 10 μg/ml et, de préférence, entre 0,05 μg/ml et 5 μg/ml ; la concentration en monensine est comprise entre 0,1 μg/ml et 5 μg/ml et, de préférence, entre 0,5 μg/ml et 1 μg/ml ; la concentration en PEI est comprise entre 1 μg/ml et 400 μg/ml et, de préférence, entre 5 μg/ml et 120 μg/ml ; la concentration en sodium héxamétaphosphate est comprise entre 0,005% et 1% et, de préférence, entre 0,01% et 0,1% ; la concentration en chlorure de benzalkonium est comprise entre 0,001% et 0,1% et, de préférence, entre 0,005% et 0,05%.
10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que le détergent est choisi parmi le groupe comprenant : le N- octyl β D-glucopyranoside (NOG) , la saponine, le Tween, le Triton, l'Igepal et le CHAPS.
11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la concentration en saponine ou en Tween est comprise entre 0,005% et 10%, de préférence entre 0,05% et 0,5% ; la concentration en NOG est comprise entre 0,01% et 10%, de préférence entre 0,1% et 0,5% ; la concentration en Triton est comprise entre 0,0001% et 0,05%, de préférence entre 0,0008% et 0,002% ; la concentration en Igepal est comprise entre 0,01 % et 20%, de préférence entre 1% et es-
12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que le chélateur d' ions est choisi parmi le groupe comprenant l'EDTA et l'EGTA.
13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la concentration d'EDTA est comprise entre 0,1 mM et 50 mM, de préférence entre 0,2 mM et 7 , 5 mM .
14) Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 13, caractérisé en ce que l'agent antiseptique est choisi parmi le groupe comprenant : la bétadine, le cetrimide, l'huile de l'arbre à thé, le terpinene-4-ol, la chlorhexidine, la polymyxine B et la rifampicine.
15) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la concentration en chlorhexidine est comprise entre 0,0005% et 0,5% et, de préférence, entre 0,001% et 0,05% ; la concentration en cetrimide est comprise entre 0,01% et 5% et, de préférence, entre 0,05% et 1% ; la concentration en bétadine est comprise entre 0,0001% et 0,001% et, de préférence, entre 0,0005% et 0,005% ; la concentration en huile d'arbre à thé est comprise entre 0,0001% et 0,1% et, de préférence, entre 0,0005% et 0,05% ; la concentration en terpinen-4-ol dans la composition de la solution est comprise entre 0,05% et 10% et, de préférence, entre 0,5% et 5% ; la concentration en polymixine B et en rifampicine est comprise entre 0,1 μg/ml et 100 μg/ml et, de préférence, entre 1 μg/ml et 50 μg/ml.
16) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le réactif de pénétration comprend en outre une enzyme et/ou une bactériocine.
17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'enzyme est le lysozyme utilisée, de préférence, à une concentration comprise entre 0,5 μg/ml et 200 μg/ml et, tout particulièrement, entre 0,05 μg/ml et 20 μg/ml.
18) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la bactériocine est la nisine utilisée, de préférence, à une concentration comprise entre 0,005 μg/ml et 10 μg/ml et, tout particulièrement, entre 0,005 μg/ml et 0,05 μg/ml.
19) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que le réactif de pénétration comprend en outre des agents cryoprotecteurs comme le DMSO, ou des ions (NaCl, KCl, MgCl2, l' hypochlorite de sodium) ou du sucrose.
20) Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la concentration en DMSO est comprise entre 0,05% et 20% et, de préférence, entre 0,5% et 5% ; la concentration en sucrose est comprise entre 0,5% et 70% et, de préférence, entre 5% et 20% ; la concentration en hypochlorite de sodium est comprise entre 0,001% et 5% et, de préférence, entre 0,005% et 0,5%.
21) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que l'étape b) du procédé de détection des microorganismes est réalisée en deux sous-étapes b' ) et b' ' , l'étape b' ) consistant en une mise en contact de l'échantillon avec un milieu réactionnel comprenant un agent de marquage et un polymère permeabilisant choisi parmi le polyéthylene glycol (PEG) ou le polyéthylènimine (PEI) , préférentiellement le PEI ; l'étape b' ' ) consistant en l'addition au milieu réactionnel d'un mélange comprenant au moins un détergent, un agent chélateur d'ions, un antiseptique et un autre agent permeabilisant choisi parmi, la nisine, la digitonine, la monensine, le sodium hexamethaphosphate et le chlorure de benzalkonium.
22) Milieu réactionnel pour le marquage de microorganismes caractérisé en ce qu'il comprend un agent de marquage et au moins un réactif de pénétration cellulaire desdits microorganismes.
23) Milieu réactionnel selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'agent de marquage est tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 2 à 5.
24) Milieu réactionnel selon la revendication 22, caractérisé en ce que le réactif de pénétration cellulaire des microorganismes est tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 6 à 21.
25) Réactif de pénétration cellulaire, caractérisée en ce qu'il comprend :
Du Picogreen au 1/22000 (Molecular Probes) ; du PEI à la concentration finale de 5,5 μg/ml ; de la Chlorhexidine diacétate à la concentration finale de 4 , 5 xlO"4 % ; du N Octyl glucopyranoside à la concentration finale de 0,16 % ; de la nisine à la concentration finale de 0,018 μg/ml ; de l'EDTA à la concentration finale de 0,45mM ; du tampon Phosphate salin (PBS) , en quantité suffisante pour le volume final désiré .
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