FR2929291A1 - Composition de permeabilisation cellulaire comprenant nog, hmp, chlorure de rubidium et/ou chlorure de lithium pour la detection sur membrane de cellules vivantes. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une composition de perméabilisation des parois de microorganismes comprenant l'association d'Octyl beta-D-glucopyranoside (NOG), de polyphosphates de sodium (HMP), et d'un sel choisi parmi le chlorure de lithium ou le chlorure de rubidium, ainsi qu'un procédé de dénombrement et d'identification de cellules sur un membrane mettant en oeuvre ladite composition.

Description

La présente invention concerne une nouvelle composition de perméabilisation cellulaire comprenant l'association de N-Octyl-(3-D-glucopyranoside (NOG), de polyphosphates de sodium (HMP), et d'un sel choisi parmi le chlorure de rubidium ou le chlorure de lithium, permettant de marquer les cellules à l'aide de marqueurs fluorogéniques tout en préservant la viabilité desdites cellules. L'invention concerne également un procédé de détection et/ou d'identification de cellules vivantes contenues dans un échantillon liquide ou gazeux sur une membrane de filtration. L'invention s'applique plus particulièrement au contrôle de la qualité microbiologique des milieux liquides et gazeux entrant, par exemple, dans les chaînes de production de produits alimentaires ou pharmaceutiques. Dans ce domaine, les contaminants peuvent être présents sous différentes formes cellulaires, en particulier des bactéries à gram positif ou négatif, diluées dans des volumes importants d'eau ou de gaz. Il ne suffit cependant pas seulement de détecter ces cellules, il faut encore les identifier avec précision et s'assurer qu'il s'agit de cellules vivantes dans ces milieux et non de cellules mortes résultant des traitements que peuvent subir l'air ou l'eau, préalablement à leur utilisation. Par exemple, un traitement de l'eau par le chlore ou l'ozone peuvent laisser subsister des cellules mortes dans le milieu pouvant être visuellement détectables sans pour autant être source de contamination. De nombreux procédés de détection sont décrits dans l'art antérieur pour détecter en temps limité la présence de cellules vivantes dans un milieu liquide ou gazeux sur membrane de filtration. Ces procédés comprennent généralement : - une étape de filtration desdits milieux liquides ou gazeux au travers d'une membrane de filtration; - une étape d'incubation de ladite membrane au contact d'un milieu nutritif pendant quelques heures, durant laquelle les cellules retenues sur la membrane par filtration se divisent pour former des microcolonies non visibles à l'aeil nu ; et - une étape de détection des clones cellulaires formant les microcolonies par différentes techniques de luminescence ou de fluorescence.

Un tel procédé est décrit par exemple dans la demande WO 01/59157. Ce procédé a fait l'objet du développement d'un kit de détection universel de cellules vivantes ayant pour nom Milliflex Rapid (Millipore). Dans ce procédé, l'étape de détection des cellules consiste à lyser les cellules filtrées et incubées sur la membrane de filtration afin de libérer leur contenu en adénosine triphosphate (ATP). L'ATP libéré est utilisé comme marqueur pour identifier et quantifier les cellules vivantes (ATP-bioluminescence), lequel sert de substrat à une enzyme (luciférase) capable de produire une réaction de chimioluminescence. Cette réaction de chimioluminescence donne lieu à un signal lumineux, qui est capté au travers d'une interface vidéo (caméra CCD), puis restitué sous la forme d'une image de synthèse. Cette image de synthèse permet de visualiser in-situ l'endroit de la membrane où le germe s'est développé, de manière analogue à un dénombrement classique effectué sur une boîte de Pétri en milieu gélosé. Cette technique présente l'avantage de détecter les cellules qui sont vivantes de manière universelle car l'ATP est une molécule présente en abondance chez tous les organismes vivants. En cela, elle permet d'obtenir une indication fiable sur le nombre de contaminants présents dans l'échantillon testé. Par contre, l'extraction de l'ATP nécessite de lyser, et donc de tuer les cellules, ce qui ne permet pas de cultiver ultérieurement les germes en vue de les caractériser, c'est-à-dire en déterminer l'espèce. L'information obtenue concernant la contamination est donc de nature quantitative et non qualitative. Un autre procédé de détection de cellules sur membrane est décrit dans la demande de brevet FR 2 289 984. Dans ce procédé, l'étape de détection des cellules retenues sur la membrane de filtration est effectuée à l'aide de sondes d'hybridation spécifiques. Les parois des cellules sont rendues peméables aux sondes de détection par l'emploi d'une composition de perméabilisation associant Polyéthylenimine (PEI) et éthanol, puis, une fois que ces sondes se trouvent à l'intérieur des cellules, les sondes sont hybridées spécifiquement aux séquences génomiques d'ARN ou d'ADN présentes à l'intérieur des cellules. Ces sondes de nature généralement polynucléotidiques sont sélectionnées pour pouvoir s'hybrider spécifiquement aux acides nucléiques afin de cibler une ou plusieurs espèces de contaminants. Les sondes, qui sont marquées par un agent fluorescent ou luminescent sont détectées, après une étape de lavage, à l'aide d'une caméra qui permet de localiser les cellules sur la membrane.

Bien que plus spécifique, ce procédé de détection ne permet pas de faire une claire distinction entre cellules vivantes et cellules mortes. En effet l'hybridation des sondes peut avoir lieu aussi bien dans des cellules vivantes que mortes, et donc conduire à des faux positifs. En outre, même si la composition de perméabilisation permet généralement de maintenir l'intégrité de la paroi des cellules, le procédé dans ses différentes étapes ne permet pas de pouvoir maintenir les cellules en vie, du fait, notamment d'une étape de fixation des cellules sur la membrane en cellulose. La demande WO 2004/050902 décrit un autre système de détection sur membrane permettant de détecter la présence de microorganismes contaminant des échantillons sanguins. Ce procédé est conçu pour éviter de provoquer la lyse des microorganismes. La particularité de ce système réside en ce que la détection des microorganismes se fait par la pénétration d'agents de marquage à l'intérieur des microorganismes avant filtration, tandis que les microorganismes sont encore en milieu liquide. A cet égard, l'échantillon liquide à tester est dilué dans une solution de perméabilisation comprenant l'agent de marquage et l'agent de perméabilisation, avant d'être filtré sur la membrane et les cellules détectées. Les agents de marquage utilisés sont des molécules de petite dimension, en particulier des composés intercalants de l'ADN, tels que des dérivés cyanines, l'iodure de propidium, l'acridine orange ou le bromure d'éthidium. Ces composés pénètrent relativement facilement à travers la paroi des microorganismes via l'action d'agents perméabilisants connus de l'homme du métier tels que le Polyéthylenimine (PEI), la digitonine, la nonensine, la polymyxine ou le chlorure de benzalkonium. Les agents intercalants se fixent dans les acides nucléiques au cours de la transcription ou de la réplication de l'ADN, c'est-à-dire exclusivement par les cellules vivantes contenues dans l'échantillon. Cette méthode permet de marquer des cellules vivantes de manière universelle tout en conservant la viabilité des cellules. Cependant, le fait de marquer les cellules en milieu liquide avant leur filtration sur membrane introduit des incertitudes sur les résultats d'énumération finaux obtenus. En effet, si les cellules se divisent en phase liquide lorsqu'on procède à leur marquage, le nombre de cellules détectées sur la membrane peut être le double de celui des cellules initialement présentes. Par ailleurs, la dilution de l'échantillon liquide par la composition de perméabilisation et de marquage, introduit une marge d'erreur non négligeable sur le résultat final, laquelle est augmentée par la probabilité d'une contamination accidentelle liée aux manipulations fluidiques nécessaires pour mener à bien la détection. En outre, dans cette situation, les cellules marquées sont filtrées et détectées individuellement sur la membrane, c'est-à-dire cellule par cellule. Il en résulte un signal de détection qui est faible pour chacune des cellules. Ce problème se pose plus particulièrement lorsque des marqueurs fluorescents sont utilisés. En effet, les membranes utilisées, généralement en PVDF ou en cellulose, produisent elles-mêmes une certaine fluorescence masquant le faible signal de fluorescence provenant des cellules. Depuis quelques années, se sont développés des marqueurs dits fluorogéniques . Ces marqueurs ont la particularité d'émettre en fluorescence uniquement lorsqu'ils ont été préalablement activés par une enzyme. Ces molécules complexes comprennent généralement un groupement fluorophore, capable d'absorber de l'énergie lumineuse et de restituer cette énergie sous forme d'un spectre d'émission en fluorescence caractéristique, et un autre groupement capable de masquer ou empêcher la fluorescence dudit fluorophore de se manifester. L'enzyme a pour effet de modifier ce second groupement afin que la fluorescence du premier puisse être détectée.

Ces marqueurs fluorescents se montrent particulièrement utiles pour la numération des cellules viables en cytométrie ainsi que cela est décrit, par exemple, dans la demande WO 98/55861. Cependant, comme le souligne cette demande, les cellules marquées à l'aide des agents fluorogéniques, ont un signal de fluorescence souvent trop faible pour être détectées isolément sur une membrane, ce qui rejoint les problèmes rencontrés plus haut avec les agents intercalants de l'ADN qui sont fluorescents. La demande WO 96/14431, décrit une technique de détection des micro-organismes et plus particulièrement la détection de bactéries coliformes, basée sur la capacité de ces bactéries à gram négatif de produire des enzymes ayant la possibilité d'activer les marqueurs fluorogéniques : la R-glucuronidase et R-galactosidase. Les substrats fluorogéniques utilisés correspondant sont méthylumbelliferyl-13-D-galactopyranoside (MU-Gal), le 4-triméthylfluoro méthylumbelliferyl-13-D-galactopyranoside (TFMU-gal) et le 4-triméthylfluoro méthylumbelliferyl-13-D-glucoronide (TFMUG). Cette technique repose sur le même principe que les procédés décrits plus haut, où l'on procède d'abord à la filtration de l'échantillon liquide ou gazeux où se trouvent les bactéries coliformes, puis on incube les bactéries sur la membrane de filtration, puis on détecte les microcolonies formées à l'aide des substrats fluorogéniques ci- dessus. Cependant, cette technique se heurte à certaines limitations. La première de ces limitations est que le procédé de détection n'est applicable qu'à certaines bactéries à gram négatif (coliformes) synthétisant la R-glucuronidase et R-galactosidase.

Une deuxième limitation est que la quantité de R-glucuronidase et R-galactosidase produite par les cellules est généralement trop faible pour obtenir un signal détectable. Il est alors nécessaire pour parvenir à une sensibilité satisfaisante de traiter les cellules à l'aide d'un inducteur synthétique de l'expression de la R-glucuronidase et de la R-galactosidase tel que l'Isopropyl- beta-thio-galactoside (IPTG). Une autre limitation, dont dépend directement l'intensité du signal détecté, concerne la pénétration des marqueurs fluorogéniques dans les cellules.

Cette pénétration est rendue difficile, en raison de la taille des marqueurs et du fait que lesdits marqueurs fluorogéniques ont tendance à être refoulés hors des cellules par des mécanismes d'efflux. Pour augmenter la pénétration des marqueurs dans les cellules, l'art antérieur enseigne d'utiliser des perméabilisants cellulaires tels que les antibiotiques polymixine B et colistine en combinaison avec du lysozyme et d'incuber les cellules à 40°C. Cependant cette perméabilisation, si elle peut s'avérer suffisante pour les bactéries coliformes, est loin d'être suffisante pour des bactéries à gram positif comme Staphylococcus aureus, qui est un agent pathogène recherché. En outre, l'utilisation d'agents antibiotiques tels que la polymixine B et la colistine en tant qu'agent de perméabilisation, ne permet pas de maintenir la viabilité des bactéries [Petersen J.P. et al. (2006) J. Antimicrobial. Chem. 57 :573-576]. La méthode susvisée reste donc, non seulement limitée à la détection des bactéries coliformes, mais ne permet pas de maintenir les cellules vivantes. En conséquence, les procédés de l'art antérieur ne répondent pas de manière satisfaisante à la double exigence d'une information quantitative utile pour évaluer le nombre de cellules dans le milieu provenant d'espèces différentes (détection universelle des cellules vivantes) et d'une information qualitative permettant de caractériser lesdites espèces en présence. Il demeure donc nécessaire de pouvoir disposer de compositions de perméabilisation ayant un spectre large, c'est-à-dire permettant de perméabiliser un grand nombre d'espèces de cellules de natures différentes sans être trop agressives vis-à-vis de celles qui sont plus fragiles. Il est bien connu, par exemple, que les microorganismes à gram positif, lesquels possèdent une seule membrane disposant d'une couche externe épaisse formée de peptidoglycanes (polymère formé de chaînes peptidiques et polysaccharidiques) ne présentent pas la même organisation que les bactéries à gram négatif, dont la paroi est constituée d'une double membrane plus fragile, dans laquelle les peptidoglycanes sont moins abondants et plus dispersés, et qu'en conséquence la perméabilisation de ces deux types de microorganismes à la fois est difficile à réaliser. La présente invention a pour but de répondre aux limitations des systèmes de détection existants, mentionnés ci-dessus, notamment en ce qui concerne la perméabilisation de l'ensemble des bactéries à gram positif et négatif dans le cadre du marquage des cellules vivantes en fluorescence. De manière surprenante, les inventeurs ont constaté que l'association de NOG, HMP et de chlorure de rubidium et/ou chlorure de lithium, permettait de parvenir sur membrane à une perméabilisation satisfaisante des bactéries à gram positifs et négatifs. Cette perméabilisation présente l'avantage de préserver la viabilité des cellules détectées, et ainsi de pouvoir procéder à la culture ultérieure des cellules détectées, notamment en vue de leur caractérisation. La présente invention souligne l'intérêt d'associer en des quantités efficaces, le NOG, qui est un agent perméabilisant connu, au HMP, qui est un détergent puissant, dont on aurait pu penser qu'il avait une action destructrice, plutôt que protectrice, vis-à-vis des parois cellulaires. La présente invention souligne également que l'utilisation de chlorure de rubidium et de chlorure de lithium permet d'améliorer sensiblement l'efficacité des compositions de perméabilisation comprenant l'association de NOG et de HMP. La composition de perméabilisation, objet de la présente invention, permet plus particulièrement la mise en oeuvre d'un procédé de marquage des cellules sur membrane à l'aide de composés ou de sondes fluorogéniques.

Figure 1 : Principe de la détection des cellules marquées en fluorescence selon le procédé de l'invention.

Figure 2 : Représentation sous forme de diagramme des résultats de détection obtenus à l'aide des compositions 1 à 7 récapitulées dans le tableau 1. L'axe des ordonnées indique l'intensité moyenne de fluorescence obtenue pour chaque composition utilisée. L'axe des abscisses juxtapose lesdites compositions, chacune ayant été testée pour E.coli et S.aureus. Les indications LiRb, NOG, HMP, LiRb/NOG, Chl/HMP, NOG/HMP et formule correspondent respectivement aux compositions 1 à 7 récapitulées dans le tableau 1.

Figure 3 : Photographie de micro-colonies rendues fluorescentes par marquage au 5/6-CFDA après perméabilisation des cellules (E.coli ATCC 8739) par les compositions N°11 et 12. A : colonies de cellules perméabilisées à l'aide de la composition N°11 ne comprenant pas de chlorure de rubidium.

B : colonies de cellules perméabilisées à l'aide de la composition N°12 selon l'invention, comprenant du chlorure de rubidium. Il apparaît sur ces photographies que la composition N°12 permet une détection plus nette des cellules que la composition N°11.

Figure 4: Répartition topologique de l'intensité de fluorescence autour des colonies traitées à l'aide des compositions N°11 et 12. A : colonies de cellules perméabilisées à l'aide de la composition N°11 selon l'invention ne comprenant pas de chlorure de rubidium. B : colonies de cellules perméabilisées à l'aide de la composition N°12 comprenant du chlorure de rubidium. Il ressort de cette analyse que la fluorescence est plus intense et mieux localisée lorsqu'on utilise la composition N°12 selon l'invention qui comprend du chlorure de rubidium.

Un premier aspect de l'invention consiste en une composition de perméabilisation cellulaire utile pour faire pénétrer des macromolécules dans une cellule. Une macromolécule est une molécule complexe résultant de l'assemblage par des liaisons covalentes de plusieurs groupements chimiques semblables ou différents, telles que des protéines, des acides nucléiques, des polysaccharides, dont le poids moléculaire est généralement supérieur à 1000 daltons et le plus souvent supérieur à 5000 daltons.

Une cellule se définit ici comme une entité biologique de petite taille comprenant un cytoplasme délimité par une membrane et renfermant du matériel génétique sous forme d'acides nucléiques. Le terme microorganisme se rapporte, au sens de la présente invention, à une cellule ayant une taille microscopique, c'est-à-dire une taille comprise entre 0,5 et 5 microns, présentant un potentiel métabolique et de reproduction, tels que des algues, des champignons unicellulaires, des protozoaires, des mycètes, des bactéries ou encore des gamètes. Les microorganismes recherchés sont plus particulièrement des bactéries pathogènes à gram positif ou négatif des genres Pseudomonas, Escherichia, Legionella, Salmonella, Listeria, Bacillus, Streptococcus, Vibrio, Yersinia, Staphylococcus, Mycobacterium, Shigella, Clostridium, Campylobacter, ou Aeromonas; les protozoaires du genre Giardia, Entamoeba, Cryptosporidium, Cyclospora; les mycoplasmes du genre Mycoplasma et Uréaplasma, les champignons du genre Saccharomyces, Aspergillus, Candida ou Penicillium. L'invention vise plus particulièrement à faire pénétrer dans des cellules des marqueurs dits fluorogéniques tout en préservant la viabilité desdites cellules. La viabilité des cellules se détermine, au sens de la présente invention, par la capacité desdites cellules à se diviser après transfert des cellules sur un milieu nutritif. Un marqueur fluorogénique au sens de la présente invention est une macromolécule comprenant un groupement fluorophore capable d'absorber de l'énergie lumineuse et de restituer cette énergie sous la forme d'un spectre d'émission caractéristique en fluorescence. Le groupement fluorophore est situé de telle sorte dans la macromolécule, que l'émission en fluorescence à la longueur d'onde attendue, est conditionnée par un changement de la configuration de la macromolécule par l'action d'une enzyme spécifique. En général l'enzyme qui permet cette activation présente une activité estérase visant une liaison particulière de la macromolécule. Il s'agit donc d'un marqueur en fluorescence, qui ne peut être détecté qu'en présence d'une enzyme spécifique.

Cette enzyme est présente dans la cellule, ce qui implique la nécessité que la cellule soit vivante pour être marquée. On distingue selon l'invention deux types de marqueur fluorogéniques : les composés fluorogéniques et les sondes fluorogéniques.

Les composés fluorogéniques sont des marqueurs fluorogéniques tels que définis ci-dessus. Ils permettent la détection de toute cellule vivante dans laquelle ils pénètrent, à condition qu'y soit présente l'enzyme qui permet leur activation. Ces composés fluorogéniques sont de préférence choisis parmi les suivants : le FDA (fluorescéine diacétate), le 6-CFDA (6-carboxyfluorescéine diacétate), le 5-CFDA, le 5/6-CFDA, le 5-maléimide FDA, le dilaurate de fluorescéine, le dibutyrate de fluorescéine, le 5 (6) 2',.7' dichloro-CFDA, le 5 (6) sulfo-FDA, le 5 (6) 2',7' dichloro-FDA, l'ester de 5, 6-CFDA N-hydroxy succinimide, le dipropionate de fluorescéine, la di-bêta-D-galactoside fluorescéine, le phosphate de 3-0-méthylfluorescéine, le pentaacétoxy ester de 2',7'-bis(carboxyéthyl)-5(6)-carboxyfluorescéine (BCECF/AM), le pentaacétoxy ester de 2',7'-bis(carboxyéthyl)-5(6)-fluorescéine (BCECF/AM), le diacétate d'azidofluorescéine, le diacétate de chloro-méthylfluorescéine, le diacétate d'éosine, le diacétate de carboxyéosine, l'acétate de 4-méthylumbelliferyl, le 4- méthylumbelliferyl bêta-D-galactoside, le 4-méthyl-umbelliferyl alpha-D- mannopyranoside, le nonanoate de 4-méthyllumbelliferyl, le phosphate de 4-méthylumbelli-feryl, le méthyl-1-unmbelliferylglucoromide, l'alanine-7-amino-4-méthylcoumarine, la glycine-7-amino-4-méthylcoumarine, la proline-7-amino-4-méthylcoumarine, la valine-7-amino-4-méthylcoumarine, la glycyl-L-proline-7- amino-4-méthylcoumarine, le 1,4-diacé-toxy-2,3-dicyanobenzène (ABD), l'hydroéthidine, l'acétate de résorufine. Ces composés sont bien connus de l'homme du métier [Manafi, M., Fluorogenic and chromogenic enzyme substrates in culture media and identification tests (1996) Journal of Food Microbiology 31 :45-58]. Les sondes fluorogéniques sont des composés associant un composé fluorogénique, de préférence l'un de ceux énumérés précédemment, à une sonde permettant une détection spécifique par hybridation d'acides nucléiques contenus dans les cellules. Les sondes spécifiques les plus courantes comprennent un fragment oligonucléotidique d'une longueur généralement comprise entre 10 et 40 nucléotides formant une séquence complémentaire à celle comprise dans un ADN ou ARN du microorganisme. Un ARN cible préféré de ce type de sondes est l'ARN16S de la cellule, qui comprend généralement des séquences spécifiques aux microorganismes pathogènes couramment recherchés. Des sondes de type PNA (peptides d'acides nucléiques) peuvent aussi constituer des sondes avantageuses dans ce type de détection car elles présentent un squelette peptidique moins sensibles aux enzymes de dégradation présentes dans les cellules [Arghya et al., Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future (2000) The FASEB Journal. 14:1041-1060]. Généralement, les sondes fluorogéniques sont conçues de telle sorte que l'émission de la fluorescence est dépendante du fait que la sonde s'est hybridée de manière spécifique à sa cible, ou bien du fait que la sonde a été intégrée au génome cellulaire lors de sa réplication. Ces sondes comprennent souvent un quencher, c'est-à-dire un second groupement fluorophore absorbant la fluorescence du premier fluorophore en l'absence d'hybridation ou d'intégration de la sonde au génome de la cellule. De telles sondes, telles les sondes BeaconTM sont connues de l'homme du métier [Salvatore A.E. et al, Real time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes (2005) European journal of internai medicine]. L'utilisation des marqueurs fluorogéniques pour détecter des cellules, notamment dans le cadre de la microbiologie sur membrane, connaît plusieurs limitations rappelées plus haut, en particulier la difficulté de faire pénétrer ces molécules, qui sont généralement de grande taille, en nombre suffisant, sans altérer définitivement les parois cellulaires. La présente invention parvient à surmonter ce problème en proposant une composition comprenant : - une concentration finale (poids volume) d'au moins 0,01 % de N-Octyl-[3-D-glucopyranoside (NOG) ; - une concentration finale (poids volume) d'au moins 0,1 % de polyphosphates de sodium (HMP) ; et - une concentration finale (moles par litre) d'au moins 1 mmol.l -1 de chlorure de rubidium et/ou de chlorure de lithium.

Il ressort des différentes expériences exposées dans la partie expérimentale de la présente demande, que le NOG, le HMP et le chlorure de lithium ou de rubidium, pris en combinaison, résultent en une composition de perméabilisation permettant de détecter un large spectre de microorganismes à l'aide de marqueurs fluorogéniques, tant des bactéries à gram positif que des bactéries à gram négatif. Cette composition a pour effet surprenant de permettre la pénétration des marqueurs fluorogéniques sans tuer les cellules, de sorte qu'il est possible de les mettre en culture après l'étape de détection. Le N-Octyl-13-D-glucopyranoside (C14H28O6) (CAS: 29836-26-8) est un agent de solubilisation des protéines membranaires connu de l'art antérieur pour avoir un effet perméabilisant vis-à-vis des bactéries à gram négatif. Cependant, comme le montre les résultats ci-après, il est considéré comme inadapté pour perméabiliser les bactéries à gram positif. De préférence, la concentration finale de NOG est comprise entre environ 0,03 et 0,2 %, plus préférentiellement entre environ 0,05 et 0,2 % en poids total de la composition. Le polyphosphates de sodium (HMP) est une mélange de sels à base polymétaphosphate de sodium de composition générale (NaPO3)6 (CAS 50813-16-6). Ces sels sont préparés par fusion de mono orthophosphates suivi d'un refroidissement brutal. Il en résulte une structure cristalline très soluble dans l'eau (Calgon S) qui est hydrolysée sous forme de trimétaphosphate de sodium et d'orthophosphate de sodium. Le HMP est utilisé en tant qu'agent dispersant et détergent. Il peut parfois, à ce titre, entrer dans des compositions de perméabilisation cellulaires. Cependant, les compositions qui en contiennent sont agressives pour les cellules, ce qui ne permet pas de préserver la viabilité des cellules. Comme le montre les résultats ci-après, l'utilisation de HMP seul ne donne pas satisfaction en ce qui concerne la perméabilisation des bactéries à gram négatif. La concentration finale de HMP est généralement comprise entre 0,1 % et 2 % en poids, plus généralement entre environ 0,5 % et 1,5 % en poids, et préférentiellement supérieure à 1 %. Le chlorure de lithium (LiCI) et le chlorure de rubidium (RbCI) sont des sels peu utilisés en microbiologie car on leur prête généralement les mêmes propriétés que le chlorure de sodium (NaCI), qui est beaucoup moins cher et dont l'usage est beaucoup plus répandu.

Toutefois, de manière surprenante, le chlorure de lithium et le chlorure de rubidium permettent, dans le cadre de la présente invention, et dans des proportions très différentes, d'obtenir une meilleure détection des composés fluorogéniques, notamment dans le cas du marquage de microcolonies sur membrane. L'utilisation de ces sels, permet d'obtenir en particulier une meilleure netteté du signal intercepté par le détecteur de fluorescence. Cet effet, perceptible sur l'image de synthèse présentée dans la figure 3, pourrait résulter d'une moindre diffusion des marqueurs fluorogéniques autour des microcolonies liée au fait que les parois des cellules sont moins fragilisées. Comme le montre la figure 4, la comparaison des profils de répartition de la fluorescence au niveau des microcolonies révèle une intensité de fluorescence au niveau des cellules marquées plus élevée et mieux localisée. De préférence, la concentration finale de chlorure de rubidium est comprise entre environ 1 et 20 mmol.l-1. Le cas échéant, la concentration finale en chlorure de rubidium est comprise entre environ 10 et 15 mmol.l-1.

De préférence, la concentration finale du chlorure de lithium est comprise est comprise entre environ 0,5 et 2 mol.l', plus préférentiellement entre environ 1 et 2 mol.l'. Le mélange des deux sels s'étant avéré optimal dans les expériences décrites, la composition de perméabilisation, selon un aspect préféré de l'invention, comprend du chlorure de lithium et de chlorure de rubidium en mélange. Le ratio entre le chlorure de lithium et le chlorure de rubidium dans ce mélange est de préférence compris entre 10 et 1000, de préférence entre 50 et 200. Les raisons pour lesquelles la combinaison de ces composés : NOG, HMP et un sel choisi parmi le chlorure de lithium et le chlorure de rubidium, se montre particulièrement appropriée pour perméabiliser, à la fois les parois des bactéries à gram positif et les bactéries à gram négatif, ne sont pas connues avec précision. Selon un aspect préféré de l'invention, la composition de perméabilisation telle que définie ci-dessus est en solution dans de l'eau, un tampon MOPS, MES ou HEPES. Il est en effet avantageux que la composition ne comprenne pas de tampon de type PBS (Phosphate Buffer Solution). Il s'est avéré que les solutions tampon de type PBS n'étaient pas compatibles avec un certain nombre de composés fluorogéniques, tels le CFDA ou le FDA, qui sont les marqueurs fluorogéniques préférés selon l'invention.

La composition selon l'invention peut comprendre au moins un marqueur fluorogénique tel que défini précédemment. Cependant le marqueur fluorogénique peut aussi être conservé à part et être appliqué directement, en étant incorporé par exemple dans une solution dite de marquage, au moment où l'on procède à la détection des cellules perméabilisées.

L'invention vise en particulier l'utilisation d'une composition de perméabilisation telle que définie précédemment, dans un procédé de dénombrement et/ou d'identification de cellules. Ladite composition est particulièrement avantageuse pour la détection de cellules vivantes fluorescentes (par fluorescence), notamment lorsqu'on cherche à détecter simultanément différents types de cellules, en particulier à la fois des microorganismes à gram positif et négatif. L'invention a ainsi plus particulièrement pour objet un procédé de dénombrement et/ou d'identification de cellules vivantes sur une membrane, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on dépose une ou plusieurs cellules vivantes sur une membrane ; b) on met en contact les cellules déposées sur la membrane avec une composition de perméabilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9; c) on met en contact, de manière simultanée ou différée, les cellules perméabilisées avec un ou plusieurs marqueurs fluorogéniques aptes à traverser la paroi des microorganismes ; d) on détecte les marqueurs ayant pénétré à l'intérieur des microorganismes par fluorescence. En général, les cellules à l'étape a) sont déposées sur la membrane par filtration d'un milieu liquide ou gazeux, à travers ladite membrane, dans lequel se trouvent initialement les cellules. Par milieu liquide ou gazeux, on entend ici tout fluide pouvant être filtré en appliquant une différence de pression au travers d'une membrane ayant des pores d'un diamètre moyen compris généralement entre 0,1 et 1,5 microns, de préférence entre 0,15 et 0,8 microns, plus préférentiellement entre 0,2 et 0,6 microns. Un tel fluide peut consister en des solutions pures entrant dans la fabrication de produits stériles mais aussi en des solutions complexes telles que l'eau potable, des boissons, des fluides médicaux (sérum, urines, liquide amniotique...etc..).

Le présent procédé peut de ce fait avoir des applications dans le domaine du diagnostic pour l'analyse d'échantillons liquides provenant d'animaux ou de patients. Par membrane , on désigne dans la présente demande un support synthétique présentant deux faces, dont les pores ont un diamètre 25 moyen connu. La membrane utilisée dans le cadre de la présente invention présente, en général, un rapport surface/volume élevé et une épaisseur constante comprise, de préférence, entre 10 et 200 microns. Une telle membrane peut être mono ou multicouche. Elle est en 30 général constituée d'un ou plusieurs matériaux choisis parmi le polytetrafluoroéthylène, le fluorure de poly(vinylidene) (PVDF), le polycarbonate, le polyamide, le polyester, le polyethersulfone, l'acétylcellulose et la nitrocellulose. Les matériaux sont de préférence choisis pour être compatibles avec les solvants utilisés, en particulier, les alcools et aldéhydes susceptibles 5 d'être employés aux différentes étapes du procédé. La membrane sur laquelle sont détectés les microorganismes est, de préférence, principalement constituée de PVDF (polyvinylidenedifluoride) ou de Nylon . Plus préférentiellement, il s'agit d'une membrane filtrante en PVDF, du type de celle commercialisée par la firme Millipore sous le nom de marque 10 Milliflex et les références MXHVWP124 ou RMHVMFX24. La filtration, si elle a lieu, peut, par exemple, être effectuée au moyen des modules de filtration de Millipore connus sous le nom de Milliflex . Une fois les microorganismes filtrés et retenus sur la membrane, une étape facultative de culture des microorganismes au contact d'un milieu de 15 culture approprié peut être incluse dans le procédé entre les étapes a) et b). Ce milieu de culture est préférentiellement un milieu gélosé sur lequel on dépose la membrane après filtration. Cette étape, qui est facultative, permet d'obtenir des colonies de chacun des microorganismes initialement filtrés, ce qui augmente le nombre de cellules à détecter. 20 Selon l'invention, les microorganismes sont ensuite mis en contact à l'étape b) avec une composition de perméabilisation selon l'invention telle que décrite précédemment. Cette étape se produit de préférence dans un faible volume de solution formant un film à la surface de la membrane. Alternativement, la composition de perméabilisation peut être contenue dans un support solide sur 25 lequel la membrane sera déposée comme par exemple un tampon imprégné ou une gélose, ce qui limite les éventuels déplacements de liquide à la surface de la membrane, et donc le mélange des microorganismes. Elle est conduite à une température comprise entre 20°C et 45°C pour une durée d'environ 5 à 60 minutes. 30 A l'étape c), selon les cas, les marqueurs fluorogéniques sont incorporés à la composition de perméabilisation, ou bien les cellules perméabilisées sont mises en contact desdits marqueurs de manière différée, c'est-à-dire par mise en contact des cellules avec une solution de marquage comprenant lesdits marqueurs. La composition de perméabilisation est alors diluée ou remplacée par la solution de marquage. Lorsque les marqueurs fluorogéniques consistent en des sondes spécifiques, il est possible de détecter de manière ciblée certains types cellulaires ou microorganismes, en fonction du choix des sondes. L'étape d) de détection est réalisée par une mesure de fluorescence à l'aide d'un capteur de fluorescence réalisée dans des conditions standard. La fluorescence est généralement captée par une caméra CCD dans une chambre noire qui permet avec un logiciel de traitement d'image de mesurer l'énergie lumineuse émise par les composés fluorogéniques. Le procédé selon l'invention est avantageux en ce qu'il permet une détection des cellules réalisée directement sur la membrane, les cellules étant vivantes. Ce procédé permet donc une mise en culture des cellules détectées, à l'issue de l'étape d) de détection, dans un milieu de culture approprié, notamment en vue de réaliser une caractérisation plus complète des microorganismes testés. Il est ainsi possible de vérifier les espèces cellulaires en présence. Un autre aspect de l'invention consiste en des kits permettant la mise en oeuvre du procédé de détection et/ou de dénombrement de cellules sus- visé. Un tel kit comprend généralement une composition de perméabilisation des parois des cellules telle que définie précédemment et éventuellement un élément complémentaire tel qu'un marqueur fluorogénique ou une membrane de filtration. De préférence, la membrane de filtration est une membrane constituée principalement de cellulose, de polyvinylidenedifluoride (PVDF) ou de polyethersulfone.

Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer l'invention sans y apporter de limitation.

Exemples

1.1 Détections en fluorescence réalisées à l'aide de différentes compositions de perméabilisation :

Les souches testées d'E.coli (bactérie à gram négatif) ATCC 8739 et de S. aureus (bactérie à gram positif) ATCC 6538 ou B. subtilis (bactérie à gram positif) ATCC 6633 sont conservées dans des cryotubes (Dutscher, réf.028049) congelés à -80°C préparés à partir de souches lyophilisées provenant des collections. Pour la fabrication des cryotubes, un flacon de bouillon TS de 100mI (Biomérieux, réf. 41146) est ensemencé le jour de la préparation des tubes et incubé à 35-37°C. Pendant la croissance, des mesures de DO à 600nm sont effectuées à intervalles réguliers à l'aide d'un spectrophotomètre (Eppendorf, Biophotometer réf.6131 000.012). La croissance est stoppée quand la DO atteint 0.5. Dans chaque cryotube, on répartit 600pl de cryoprotecteur (Sigma, cell freezing with glycerol, réf. C6039) et 600 pl de culture. Les tubes sont mélangés puis placés à -80°C.

On procède à un dénombrement du bouillon et d'un cryotube non congelé par étalement des dilutions 10-5 et 10-6. Ces dilutions sont préparées dans des flacons de 9ml d'eau peptonnée (Biomérieux, réf. 42111). 100pI de chaque dilution est étalé au râteau sur une gélose TSA (Biomérieux, réf. 43011) incubée 24 heures à 35°C. L'opération est répétée trois fois. Le jour suivant, un cryotube est décongelé et dénombré de la même manière. Une galerie API (Biomérieux) permet l'identification et la confirmation de la pureté des cryotubes préparés. Pour tous les tests, les souches bactériennes sont diluées dans des tubes d'eau peptonnée (Biomérieux, réf. 42111). On procède à une dilution en cascade en ajoutant 1 ml du cryotube de la souche utilisée aux 9ml du tube d'eau peptonnée jusqu'à la dilution désirée. La concentration a été ajustée pour obtenir 18 en moyenne 30 bactéries par échantillon. Cette concentration a été vérifiée sur boite de Pétri par un test de numération classique sur milieu gélosé. La filtration est réalisée à l'aide de la pompe Milliflex Plus Vacuum (Millipore, réf. MXP PLUS01) dans des entonnoirs Milliflex avec une membrane en ester de cellulose ou en PVDF de 0.45pm de porosité (Millipore, réf. MXHVWP124). Les bactéries sont ajoutées à 50-100mI d'eau physiologique 0.9% NaCl (B.Braun, réf 0066570 E). Les membranes sont incubées sur des cassettes de milieux solides Milliflex Trypcase-soja agar (Millipore, réf. MXSM CTS48) ou R2A (Millipore, réf.

MXSM CRA 48) dans une étuve à 32.5°C +1- 2.5° pendant le temps nécessaire pour que les microorganismes forment des microcolonies. Après l'incubation, les membranes sont séparées du milieu gélosé et mises en contact avec 2 ml de solution de perméabilisation sur un support étanche (pads absorbants des cassettes pour milieu liquide Millipore, réf. MXLM CO120) durant 30 minutes à température ambiante ou à 35°C. Les solutions de perméabilisation suivantes ont été testées : Composition n° 1 : NaAc 50 mM LiCI 1,13 M RbCI 10 mM Eau

Composition n° 2 : NaAc 50 mM NOG 0,10 % Eau Composition n° 3 : NaAc 50 mM HMP 1 % Eau20 Composition n° 4 : NaAc 50 mM LiCI 1,13 M RbCI 10 mM NOG 0,10% Eau Composition n° 5 : NaAc 50 mM LiCI 1,13 M RbCI 10 mM HMP 1% Eau Composition n° 6 : NaAc 50 mM NOG 0,10 % HMP 1% Eau Composition n° 7 : NaAc 50 mM LiCI 1,13 M RbCI 10 mM NOG 0,10 % HMP 1% Eau Composition n° 8 : LiCI 1,13 M RbCI 10 mM NOG 0,10 % HMP 1 % Tampon HEPES 20 mM Composition n° 9 : LiCI 1,13 M RbCI 10 mM NOG 0,10 % HMP 1 % Tampon MOPS 0,1 M Composition n° 10 : LiCI 1,13 M RbCI 10 mM NOG 0,10 % HMP 1 % Eau Composition n° 11 : NaAc 50 mM NaCl 1,13 M NOG 0,10 % HMP 1 % Eau Composition n° 12 : NaAc 50 mM RbCI 10 mM NOG 0,10 % HMP 1 % Eau Un marqueur fluorogénique universel, à savoir du 5/6-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) (Sigma 21879-100MG) dilué dans du DMSO, est ajouté aux compositions de perméabilisation pour atteindre une concentration finale de 100 pg/ml. La membrane reste au contact du substrat marqueur pendant 30 minutes à 35°C. La membrane est ensuite retirée de la solution de marquage, placée dans un illuminateur équipé d'une caméra pour mesurer la fluorescence émise entre 520 et 530 nm. 22

Les résultats d'intensité de florescence récapitulés dans les tableaux 1 à 3 ci-dessous correspondent à l'énergie lumineuse (luminescence) captée et enregistrée au pixel près par la caméra CCD en utilisant le logiciel d'analyse d'image Sherlock (Insosys Inc.). Les valeurs indiquées sont des valeurs photométriques absolues (ratio de luminescence entre luminescence mesurée et bruit de fond) dans une échelle comprises entre 0 et 255. Le logiciel est paramétré de sorte à ce que la valeur 0 correspond à la fluorescence de la membrane seule en l'absence de cellules. La marge d'erreur des mesures est estimée à 1,5. Les différentes compositions de perméabilisation mentionnées correspondent aux compositions 1 à 7 dont le détail est donné plus haut.

Tableau 1 Récapitulatif des compositions 1 à 7 testées Tableau 2 Intensités de fluorescence mesurées pour les compositions 1 à 7 Compositions 1 2 3 4 5 6 7 E. coli 0 0 0 45 0 0 46 S. aureus 45 58 37 0 58 38 33 Compositions 1 2 3 4 5 6 7 NaAc 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM 1.13 M 10mM 0,10% / 0,10% LiCI 1.13 M RbCI 10 mM NOG / 1.13 M 10 mM / / / 1.13 M 10 mM 0,10% 0,10% HMP 1% / 1% 1% 1% Eau eau eau eau eau eau eau eau

Tableau 3 Intensités de fluorescence mesurées pour les compositions 8 à 10 N~ Composition de Intensité fluorescence Intensité fluorescence perméabilisation S.aureus E.coli (Gram +) (Gram-) Membrane ester cellulose 0 0 LiCI : 1,13 M RbCI : 10 mM 8 NOG : 0,10 % 24,8 40,4 HMP : 1 % Tampon Hepes : 20 mM 9 LiCI : 1,13 M 31,9 51,6 RbCI : 10 mM NOG : 0,10 % HMP : 1 % Tampon MOPS : 0,1 M 10 LiCI : 1,13 M 24,9 44,4 RbCI : 10 mM NOG : 0,10 % HMP : 1 % Tampon : Eau Tableau 4 Taux de recouvrement des différents micro-organismes traités avec la composition n° 7 Micro-organisme ATCC Recouvrement Recouvrement Viabilité (°/U) (°/U ) Escherichia coli 8739 100 122 Bacillus subtilis 6633 104 104 Staphylococcus.aureus 6538 102 111 Salmonella enterica 13314 117 117 Pseudomonas aeruginosa 9027 111 96 1.2 Interprétation des résultats :

Les résultats comparatifs obtenus avec les compositions 1 à 7 (figure 2 et tableau 2) montrent que l'association de HMP, NOG et de chlorure de Rubidium et/ou lithium dans une même composition de perméabilisation (composition 7 selon l'invention) permet d'obtenir à une détection satisfaisante aussi bien d'E. coli (gram-) que de S. aureus (gram+). Les résultats obtenus avec les compositions 8, 9 et 10 montrent que les tampons sans phosphates MOPS, MES ou HEPES sont bien adaptés aux compositions selon l'invention, au même titre que l'eau, et peuvent se substituer au tampon PBS utilisé dans l'art antérieur. L'utilisation des compositions 11 et 12, illustrée dans les figures 3 et 4, laisse apparaître un effet positif du chlorure de Rubidium sur l'intensité et la localisation de la fluorescence. La figure 3, qui est une photographie, montre une meilleure netteté du marquage lorsque les cellules sont traitées à l'aide de la composition 12 selon l'invention. Cet effet est perceptible à l'oeil nu (au moyen d'un filtre qui permet de mieux visualiser la fluorescence). La figure 4 traduit les différences d'intensité de fluorescence obtenues lorsqu'on réalise des mesures ponctuelles au niveau des microcolonies marquées. Les résultats de recouvrement reportés dans le tableau 4 ci-dessus, qui correspondent au nombre de bactéries viables à l'issue du traitement des cellules à l'aide de la composition 7 selon l'invention par rapport aux mêmes cellules non traitées, indiquent que la viabilité des cellules est préservée quelque soit les microorganismes utilisés (gram+ et gram-).

Claims (35)

1. REVENDICATIONS1. Composition de perméabilisation cellulaire utile pour faire pénétrer des marqueurs fluorogéniques dans une cellule tout en préservant la viabilité de ladite cellule, caractérisée en ce qu'elle comprend : - une concentration finale (poids volume) d'au moins 0,01 0/0 de N-Octyl-13-D-glucopyranoside (NOG) ; - une concentration finale (poids volume) d'au moins 0,1 de polyphosphates de sodium (HMP) ; et - une concentration finale (moles par litre) d'au moins 1 mmol.l-' de chlorure de rubidium et/ou de chlorure de lithium.
2. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend du chlorure de lithium.
3. 3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend du chlorure de rubidium.
4. 4. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de chlorure de lithium et de chlorure de rubidium.
5. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la concentration en HMP finale dans la composition est comprise entre 0,1% et 2 % en poids.
6. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que la concentration de HMP dans la composition finale est supérieure à 1 en poids.
7. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la concentration finale de NOG est comprise entre 0,03 et 0,2 % en poids.
8. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la concentration finale de chlorure de rubidium est comprise entre 1 et 20 mmol.l-1.
9. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la concentration finale de chlorure de lithium est comprise entre 0,5 et 2
10. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle est en solution dans de l'eau ou bien dans un tampon MOPS, MES ou HEPES.
11. 11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas de tampon PBS (Phosphate Buffer Solution).
12. 12. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, au moins un marqueur fluorogénique.
13. 13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que le marqueur fluorogénique est une sonde fluorogénique.
14. 14. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que le marqueur fluorogénique est un composé fluorogénique.
15. 15.Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que le composé fluorogénique est sélectionné parmi: le FDA, le 6-CFDA, le 5-CFDA, le 5/6-CFDA, le 5-maléimide FDA, le dilaurate de fluorescéine, le dibutyrate de fluorescéine, le 5 (6) 2',.7' dichloro-CFDA, le 5 (6) sulfo-FDA, le 5 (6) 21,7' dichloro-FDA, l'ester de 5, 6-CFDA N-hydroxy succinimide, le dipropionate de fluorescéine, la di-bêta-D-galactoside fluorescéine, le phosphate de 3-0-méthylfluorescéine, le pentaacétoxy ester de 2',7'-bis(carboxyéthyl)-5(6)-carboxyfluorescéine (BCECF/AM), le pentaacétoxy ester de 2',7'-bis(carboxyéthyl)-5(6)-fluorescéine (BCECF/AM), le diacétate d'azidofluorescéine, le diacétate de chlorométhylfluorescéine, le diacétate d'éosine, le diacétate de carboxyéosine, l'acétate de 4-méthylumbelliferyl, le 4-méthylumbelliferyl bêta-D-galactoside, le 4-méthyl-umbelliferyl alpha-D-mannopyranoside, le nonanoate de 4-méthyllumbelliferyl, le phosphate de 4-méthylumbelli-feryl, le méthyl-1-unmbelliferylglucoromide, l'alanine-7-amino-4-méthylcoumarine, la glycine-7-amino-4-méthylcoumarine, la proline-7-amino-4-méthylcoumarine, la valine-7-amino-4-méthylcoumarine, la glycyl-L-proline-7-amino-4-méthylcoumarine, le 1,4-diacé-toxy-2,3-dicyanobenzène (ABD), l'hydroéthidine, l'acétate de résorufine.
16. 16. Composition selon la revendication 14, caractérisé en ce que le composé fluorogénique est le CFDA ou le FDA ou un dérivé de ceux-ci.
17. 17. Utilisation d'une composition de perméabilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans un procédé in-vitro de dénombrement et/ou d'identification de cellules.
18. 18. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, pour la détection in-vitro de cellules vivantes en fluorescence.
19. 19. Utilisation d'une composition de perméabilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans un procédé in-vitro dedénombrement ou/ou d'identification de microorganismes à gram positif ou négatif.
20. 20. Procédé de dénombrement et/ou d'identification de cellules vivantes sur une membrane, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on dépose une ou plusieurs cellules vivantes sur une membrane ; b) on met en contact les cellules déposées sur la membrane avec une composition de perméabilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9; c) on met en contact, de manière simultanée ou différée, les cellules perméabilisées avec un ou plusieurs marqueurs fluorogéniques aptes à traverser la paroi des microorganismes ; d) on détecte les marqueurs ayant pénétré à l'intérieur des microorganismes par fluorescence.
21. 21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que les cellules à l'étape a) sont déposées sur la membrane par filtration d'un milieu liquide ou gazeux, à travers ladite membrane, dans lequel se trouvent initialement les cellules.
22. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 ou 21, caractérisé en ce qu'on procède entre l'étape a) et l'étape b) à une culture des microorganismes sur la membrane, de telle sorte que les cellules déposées à l'étape a), se trouvent à l'étape b) sous forme de microcolonies de cellules.
23. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, caractérisé en ce que le marqueur fluorogénique utilisé à l'étape c) est une sonde fluorogénique.
24. 24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que ladite sonde fluorogénique est une sonde d'hybridation, de préférence de type oligonucléotidique ou de type PNA.
25. 25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que le marqueur fluorogénique utilisé à l'étape c) est un composé fluorogénique.
26. 26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que ledit composé fluorogénique utilisé dans l'étape b) est sélectionné parmi : le FDA, le 6CFDA, le 5-CFDA, le 5-maléimide FDA, le dilaurate de fluorescéine, le dibutyrate de fluorescéine, le 5 (6) 2',.7' dichloro-CFDA, le 5 (6) sulfo-FDA, le 5 (6) 2',7' dichloro-FDA, l'ester de 5, 6-CFDA N-hydroxy succinimide, le dipropionate de fluorescéine, la di-bêta-D-galactoside fluorescéine, le phosphate de 3-0-méthylfluorescéine, le pentaacétoxy ester de 2',7'-bis(carboxyéthyl)-5(6)-carboxyfluorescéine (BCECF/AM), le pentaacétoxy ester de 2',7'-bis(carboxyéthyl)-5(6)-fluorescéine (BCECF/AM), le diacétate d'azidofluorescéine, le diacétate de chloro-méthylfluorescéine, le diacétate d'éosine, le diacétate de carboxyéosine, le méthyl-1-unmbelliferylglucoromide, l'acétate de 4-méthylumbelliferyl, le 4-méthylumbelliferyl bêta-D-galactoside, le 4-méthyl-umbelliferyl alpha-D-mannopyranoside, le nonanoate de 4-méthyllumbelliferyl, le phosphate de 4-méthylumbelli-feryl, l'alanine-7-amino-4-méthylcoumarine, la glycine-7-amino-4-méthylcoumarine, la proline-7-amino-4-méthylcoumarine, la valine-7-amino-4-méthylcoumarine, la glycyl-L-proline-7-amino-4-méthylcoumarine, le 1,4-diacé-toxy-2,3-dicyanobenzène (ABD), l'hydroéthidine, l'acétate de résorufine.
27. 27. Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que le composé fluorogénique est le CFDA ou le FDA ou un dérivé de ceux-ci.
28. 28. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 27, caractérisé, en ce que la détection à l'étape d) est réalisée à l'aide d'un capteur de fluorescence.
29. 29. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que la détection des cellules est réalisée directement sur la membrane, les cellules étant vivantes.
30. 30. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 29, caractérisé en ce que la membrane sur laquelle les cellules sont déposées est constituée principalement de cellulose, de polyvinylidenedifluoride (PVDF) ou de polyethersulfone.
31. 31. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 30, caractérisé en ce que la membrane sur laquelle les cellules sont déposées présente un diamètre moyen des pores compris entre 0,1 et 1,5 microns, de préférence entre 0,2 et 0,6 microns.
32. 32. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 31, caractérisé en ce que les cellules détectées sont mises en culture à l'issue de l'étape d) de détection.
33. 33. Kit pour la détection et/ou le dénombrement de cellules, caractérisé en ce qu'il comprend : a) au moins un marqueur fluorogénique; et b) une composition de perméabilisation des parois des cellules selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
34. 34. Kit pour la détection et/ou le dénombrement de cellules, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une membrane de filtration; etb) une composition de perméabilisation des parois des cellules selon l'une quelconque des revendications 1 à 16.
35. 35. Kit selon la revendication 33 ou 34, caractérisé en ce que la membrane de filtration est une membrane constituée principalement de cellulose, de polyvinylidenedifluoride (PVDF) ou de polyethersulfone.