FR2788783A1

FR2788783A1 - Proteines entrant en interaction avec le recepteur d'igf (iip),acides nucleiques codant pour ces proteines et leur utilisation

Info

Publication number: FR2788783A1
Application number: FR9915143A
Authority: FR
Inventors: Tanja Ligensa; Ralf Schumacher; Michael Weidner
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 1999-12-01
Publication date: 2000-07-28
Anticipated expiration: 2019-12-01
Also published as: US20090018312A1; ITMI992519A0; CA2289914A1; SE9904389D0; BE1013527A3; SE0301757D0; JP2000166555A; US7202058B2; JP2001218599A; JP2010000082A; US6913883B2; SE9904389L; EP1006184A1; GB2347930B; JP3294575B2; US7329734B2; SE526919C2; IT1314250B1; SE523013C2; US20060040358A1

Abstract

L'invention concerne une molécule d'acide nucléique ayant la séquence SEQ ID ndegre 5 et la séquence complémentaire, et son utilisation en diagnostic et thérapie. Cette molécule d'acide nucléique (IIP-10) est un gène qui code pour un polypeptide de liaison au récepteur d'IGF-1.

Description

Protéines entrant en interaction avec le récepteur d'IGF-1 (IIP), acides nucléiques codant pour ces protéines et leur utilisation
La présente invention concerne des protéines entrant en interaction avec le récepteur d'IGF-l (IIP), des acides nucléiques codant pour ces protéines, leur utilisation pour des agents de diagnostic et des agents thérapeutiques, en particulier dans le domaine du cancer. En particulier, l'invention concerne le diagnostic desdits gènes dans des cellules mammaliennes, notamment dans des cellules tumorales malignes, des méthodes de thérapie génique pour l'inhibition de l'interaction entre le récepteur d'IGF-1 et les IIP, des procédés de criblage d'agents potentiels pour le traitement du cancer, et des lignées cellulaires et des modèles animaux utiles dans le criblage et l'évaluation d'agents pharmaceutiques utiles potentiels, inhibant l'interaction entre les IIP et le récepteur d'IGF-1.

La présente invention concerne en particulier le clonage et la caractérisation du gène IIP-10 et de ses produits géniques. Lesdits produits géniques (polypeptides, ARNm) sont en particulier caractérisés comme ayant l'aptitude à moduler la voie de signalisation du récepteur d'IGF-1. La fonction des produits géniques selon l'invention est par conséquent de moduler la transduction

de signal du récepteur d'IGF-1. L'activation forcée des IIP est par conséquent en corrélation avec la proliféra- tion accrue de cellules tumorales, la survie et l'évite- ment de l'apoptose.

Le système de signalisation du récepteur d'IGF-1 joue un rôle important dans la prolifération de tumeurs et la survie, et est impliqué dans l'inhibition de l'apoptose tumorale. En outre, et indépendamment de ses propriétés mitogènes, l'activation du récepteur d'IGF-1 (IGF-1R) peut protéger contre ou au moins retarder in vitro et in vivo la mort cellulaire programmée [Harrington et coll., EMBO J. 13 (1994), 3286-3295 ; et coll., Cancer Res. 55 (1995), 303-305 ; et coll., Cancer Res. 56 (1996), 4522-4529]. Une diminution du taux d'IGF-1R au- dessous des taux du type sauvage s'est également avérée provoquer une apoptose massive de cellules tumorales in vivo [Resnicoff et coll., Cancer Res. 55 (1995), 2463- 2469 ; Resnicoff et coll., Cancer Res. 55 (1995), 3739- 3741]. La surexpression du ligand (IGF) et/ou du récep- teur est une caractéristique de diverses lignées cellu- laires tumorales et peut conduire à des formations de tumeurs dans des modèles animaux. La surexpression de l'IGF-lR humain a conduit à la croissance, dépendante de ligand et indépendante d'ancrage, de NIH 3T3 ou de fibro- blastes 1 de rat, et l'inoculation de ces cellules provo- quait une rapide formation de tumeurs chez des souris nude [Kaleko et coll., Moll. Cell. Biol. 10 (1990), 464-473; Prager et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 2181-2185]. Chez des souris transgéniques surexprimant IGF-11 spécifiquement dans la glande mammaire, il apparaît un adénocarcinome mammaire [Bates et coll., Br. Cancer 72 (1995), 1189-1193], et chez des souris transgéniques sur- exprimant IGF-1I sous le contrôle d'un promoteur plus général, il apparaît un nombre élevé et un large spectre de types de tumeurs [Rogler et coll., J. Biol. Chem. 269

(1994), 13779-13784]. Les carcinomes pulmonaires à petites cellules sont un exemple parmi de nombreuses tumeurs humaines surexprimant IGF-1 ou IGF-II à une fréquence très élevée (>80 %) [Quinn et coll., J. Biol. Chem. 271 (1996), 11477-11483]. La signalisation par le système IGF semble être également requise pour l'activité transformante de certains oncogènes. Des fibroblastes foetaux présentant une rupture du gène d'IGF-lR ne peuvent pas être transformés par l'antigène T de SV40, Ha-ras activé, une association des deux [SE11 et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 11217-11221 ; et coll., Mol. Cell. Biol. 14 (1994), 3604-3612], et de même la protéine E5 du papillomavirus bovin n'est plus transformante [Morrione et coll., J. Virol. 69 (1995), 5300-5303]. Une interférence avec le système IGF/IGF-1R s'est également révélée inverser le phénotype transformé et inhiber la croissance tumorale [Trojan et coll., Science 259 (1993), 94-97 ; et coll., Cancer Res. 54 (1994), 5531-5534; Prager et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 2181-2185; Resnicoff et coll., Cancer Res. 54 (1994), 2218-2222; Resnicoff et coll., Cancer Res. 54 (1994), 4848-4850; Resnicoff et coll., Cancer Res. 55 (1995), 2463-2469]. Par exemple, chez des souris auxquelles ont été injectées des cellules d'adénocarcinome de la prostate de rat (PA-III) transfectées avec de l'ADNc antisens (729 pb) d'IGF-lR, il apparaît des tumeurs 90 % plus petites que celles des témoins, ou ces souris restaient exemptes de tumeurs après 60 jours d'observation [Burfeind et coll., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 93 (1996), 7263-7268]. La protection due à IGF-1R contre l'apoptose est indépendante de l'expression de gène et de la synthèse de protéine de novo. L'IGF exerce donc probablement sa fonction anti-apoptose par l'intermédiaire de l'activation de médiateurs cytosoliques préformés.

On a décrit certains substrats de signalisation qui se lient à l'IGF-lR (par exemple IRS-I, SHC, la p85 PI3 kinase, etc., pour les détails voir plus loin). Toutefois, aucun de ces transducteurs n'est spécifique de l'IGF-lR et ne pourrait donc être exclusivement responsable des caractéristiques biologiques particulières de l'IGF-lR par comparaison à d'autres tyrosine kinases de récepteurs, y compris le récepteur de l'insuline. Cela indique qu'il pourrait exister des cibles particulières de l'IGF-lR (ou au moins de la sous-famille des récepteurs d'IGF) qui provoquent la survie et s'opposent à l'apoptose, et sont par conséquent des cibles pharmaceutiques de choix pour la thérapie anticancéreuse.

En utilisant le système de double hybride de levure, on a montré que p85, le domaine régulateur de la phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) entre en interaction avec l'IGF-lR [Lamothe B. et coll., FEBS Lett. 373 (1995), 51-55 ; Tartare-Deckert S. et coll., Endocrinology 137 (1996), 1019-1024]. Toutefois, on constate également la liaison de p85 à de nombreuses autres tyrosine kinases de récepteurs de pratiquement toutes les familles. Un autre partenaire de liaison de l'IGF-lR défini par le criblage à double hybride est SHC, qui se lie également à d'autres tyrosine kinases telles que trk, met, EGF-R et le récepteur de l'insuline [Tartare-Deckert S. et coll., J. Biol.

Chem. 270 (1995), 23456-23460]. Le substrat 1 du récepteur de l'insuline (IRS-1) et le substrat 2 du récepteur de l'insuline (IRS-2) se sont également révélés entrer en interaction à la fois avec l'IGF-lR et avec le récepteur de l'insuline [Tartare-Decker S. et coll., J. Biol. Chem.

270 (1995), 23456-23460; He W. et coll., J. Biol. Chem.

271 (1996), 11641-11645; Dey R.B. et coll., Mol.

Endocrinol. 10 (1996), 631-641]. Grb-10, qui entre en interaction avec l'IGF-lR, partage également de nombreuses tyrosine kinases en tant que partenaires de liaison, par

exemple : met, le récepteur d'insuline, kit et abl [Dey R. B. et coll., Mol. Endocrinol. 10 (1996), 631-641; Morrione A. et coll., Cancer Res. 56 (1996), 3165-3167].

La phosphatase PTPID (syp) présente également une capacité de liaison avec de très nombreux partenaires, c'est-à-dire qu'elle se lie à IGF-1R, au récepteur d'insuline, à met et à d'autres [Rocchi S. et coll., Endocrinology 137 (1996), 4944-4952]. Plus récemment, mSH2-B et vav ont été décrits comme des partenaires de liaison de l'IGF-lR, mais l'interaction est également constatée avec d'autres tyrosine kinases, par exemple mSH2-B se lie également à ret et au récepteur d'insuline [Wang J. et Riedel H., Riedel H., J. Biol. Chem. 273 (1998), 3136-3139]. Prises dans leur ensemble, les protéines de liaison à IGF-1R décrites jusqu'à présent représentent des cibles relativement non spécifiques pour des stratégies thérapeutiques, ou, dans le cas des substrats de récepteurs d'insuline (IRS-1, IRS-2) sont indispensables pour des activités conduites par l'insuline.

Un objet de l'invention est de fournir de nouveaux gènes codant pour des protéines de liaison d'IGF-1R ainsi que les polypeptides correspondants, qui sont la base d'une nouvelle thérapie du cancer basée sur la modulation (de préférence l'inhibition) de l'interaction entre IGF-1R et les IIP selon l'invention.

L'invention comprend de préférence un acide nucléique codant pour une protéine se liant au récepteur d'IGF-1 (IIP-10), choisi dans l'ensemble comprenant a) les acides nucléiques représentés dans SEQ ID n 5 ou une séquence d'acide nucléique complémentaire de celle- ci, b) les acides nucléiques qui s'hybrident, dans des condi- tions stringentes, avec l'un des acides nucléiques de a), codant pour un polypeptide présentant au moins 75 % d'homologie avec le polypeptide de SEQ ID n 6, ou

c) des séquences qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, codent pour des polypeptides IIP-10 ayant la séquence d'aminoacides des polypeptides codés par les séquences de a) et b).

L'ADNc d'IIP-10 code pour une nouvelle protéine de 226 aminoacides, avec une masse moléculaire calculée égale à 25 697. IIP-10 est une protéine riche en lysine (11 %).

IIP-10 contient un site de N-glycosylation, plusieurs sites de N-myristoylation, des sites de phosphorylation de Sk2 et PKC, un site de phosphorylation de tyrosine kinase et un signal supposé de localisation nucléaire (NLS) (figure 5). La séquence d'ADNc d'IIP-10 présente 65 % d'homologie avec la séquence d'ADNc de la protéine de thymocyte de Gallus gallus cthy28kD (numéro de dépôt EMBL : GG34350). Les séquences d'aminoacides d'IIP-10 et de cthy28kD présentent 70 % d'identité. Les nucléotides 383 à 584 de l'ADNc d'IIP-10 sont identiques à 94 % à un ADNc partiel décrit dans WO 95/14772 (signature de gène humain HUMGS06271; numéro de dépôt T24253). IIP-10 marquée par immunofluorescence présente à la fois une localisation cytoplasmique et une localisation nucléaire dans des cellules NIH 3T3 surexprimant le récepteur d'IGF-1. En outre, l'analyse par double hybride de levure révèle qu'IIP-10 entre en interaction, d'une façon dépendant de la phosphorylation, avec le récepteur d'IGF-1. IIP-10 n'entre pas en interaction avec le récepteur d'insuline. L'analyse par délétion d'IIP-10 a révélé que les aminoacides 19 à 226 sont suffisants pour la liaison au récepteur d'IGF-1.

L'expression "interaction ou liaison entre IIP-10 et le récepteur d'IGF-1" signifie une liaison spécifique du polypeptide IIP-10 au récepteur d'IGF-1, mais non à des protéines témoins, telles que la lamine, dans le système à double hybride de levure. On peut démontrer la liaison spécifique au récepteur d'IGF-1 en utilisant des protéines de fusion IIP-glutathion S-transférase (GST), exprimées

dans des bactéries et des récepteurs d'IGF-1 exprimés dans des cellules mammaliennes. En outre, une association entre une protéine de fusion IIP-10 étiquetée (Flag tagged) [voir Weidner M. et coll., Nature 384 (1996), 173-176], et le récepteur d'IGF-1 peut être contrôlé dans des systèmes de cellules mammaliennes. A cette fin, on utilise des vecteurs d'expression eucaryotes pour transfecter les ADNc respectifs. L'interaction entre les protéines est visualisée par des essais de co-immunoprécipitation ou des études de localisation subcellulaire, en utilisant des anticorps anti-Flag ou anti-récepteur d'IGF-1.

L'invention fournit en outre des sondes et des amorces pour les gènes selon l'invention, ainsi que des acides nucléiques qui codent pour des déterminants antigéniques des produits géniques selon l'invention. En conséquence, des réalisations préférées comprennent des acides nucléiques ayant de préférence de 10 à 50 ou encore mieux de 10 à 20 nucléotides successifs hors des séquences décrites.

L'expression "acide nucléique" désigne un polynucléotide qui peut être, par exemple, un ADN, un ARN ou un ADN ou ARN actif transformé en dérivé. Les molécules d'ADN et d'ARNm sont toutefois préférées.

L'expression "hybridation dans des conditions stringentes" signifie que deux fragments d'acide nucléique sont capables de s'hybrider l'un avec l'autre dans les conditions d'hybridation classiques décrites par Sambrook et coll. dans Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.

Plus particulièrement, l'expression "conditions stringentes", telle qu'utilisée ici, désigne une hybridation dans du SSC (solution salée au citrate de sodium) 5,Ox, solution de Denhardt 5x, 7 % de SDS (dodécylsulfate de sodium), tampon phosphate 0,5 M, pH 7,0,10 % de sul-

fate de dextran et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon, à environ 50-68 C, suivie de deux étapes de lavage avec SSC lx à 68 C. En outre, la température dans l'étape de lavage peut être élevée, à partir de conditions de faible stringence aux températures ambiantes, aux environs de 22 C, jusqu'à des conditions de forte stringence à environ 68 C.

L'invention comprend en outre des vecteurs d'expression recombinants qui sont appropriés à l'expression d'IIP-10, des cellules hôtes recombinants transfectées avec de tels vecteurs d'expression, ainsi qu'un procédé pour la production par recombinaison d'une protéine qui est codée par le gène IIP-10.

L'invention comprend en outre des polypeptides synthétiques et des polypeptides recombinants qui sont codés par les acides nucléiques selon l'invention, et de préférence codés par la séquence d'ADN représentée dans SEQ ID n 5, ainsi que des agents peptidomimétiques à base de ceux-ci. De tels agents peptidomimétiques ont une haute affinité pour les membranes cellulaires et sont aisément captés par les cellules. Les agents peptidomimétiques sont de préférence des composés dérivés de peptides et de protéines, et sont obtenus par une modification structurale utilisant des aminoacides non naturels, des contraintes conformationnelles, un placement isostérique, une cyclisation, etc. Ils sont de préférence à base de 24 aminoacides ou moins, de préférence de 20 aminoacides ou moins, une base d'environ 12 aminoacides étant particulièrement pré- férée.

Les polypeptides et agents peptidomimétiques peuvent être définis par leurs séquences d'ADN correspondantes et par les séquences d'aminoacides dérivées de celles-ci. Le polypeptide IIP isolé peut apparaître dans des variations allèles naturelles qui diffèrent d'un individu à l'autre. De telles variations des aminoacides sont

habituellement des remplacements d'aminoacides. Toutefois, elles peuvent également être des délétions, insertions ou additions d'aminoacides à la séquence complète conduisant à des fragments biologiquement actifs. La protéine IIP selon l'invention - en fonction, à la fois eu égard au degré et au type, de la cellule et du type de cellule dans laquelle elle est exprimée - peut être sous forme glycosylée ou non glycosylée. Des polypeptides à activité métastasique et/ou tumoricide peuvent être aisément identifiés par un essai d'inhibition de progression tumorale, au moyen de cellules de carcinome exprimant lesdits polypeptides, et la mesure de la capacité de prolifération et de l'apoptose, par rapport à des cellules de carcinome n'exprimant pas lesdits polypeptides.

L'expression "polypeptides à activité d'IIP-10 ou IIP-10" signifie par conséquent des protéines présentant des variations mineures d'aminoacides mais ayant pratiquement la même activité qu'IIP-10. Pratiquement la même activité signifie que les activités sont les mêmes activités biologiques et que les polypeptides présentent au moins 75 % d'homologie (identité) de séquencs d'aminoacides avec IIP-10. Encore mieux, les séquences d'aminoacides sont identiques à raison d'au moins 90 %. L'homologie selon l'invention peut être déterminée à l'aide des programmes d'ordinateur Gap ou BestFit [University of Wisconsin, Needleman et Wunsch, J. Biol. Chem. 48 (1970), 443-453 ; Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2 (1981), 482-489] .

D'autres IIP conformes à et utilisées par l'invention sont en particulier: IIP-1
On a isolé un ADNc codant pour une protéine entrant en interaction avec le récepteur d'IGF-1, qui a été dénommée IIP-1 (SEQ ID n 1). L'ADNc d'IIP-1 code pour une nouvelle protéine de 333 aminoacides, ayant une masse

moléculaire calculée de 35 727. IIP-1 est une protéine riche en glycine (13 %). IIP-1 contient plusieurs sites de N-myristoylation, des sites de phosphorylation de PKC et Ck2 et deux signaux supposés de localisation nucléaire. On a identifié une seconde isoforme, IIP-1 (p26), d'une longueur de 236 aminoacides, ayant une masse moléculaire calculée de 26 071, qui a été très probablement engendrée par épissage alternatif (figure 3). Les deux isoformes se lient au récepteur d'IGF-1.

Des séquences d'ADNc d'IIP-1 ont été rapportées précédemment [base de données EMBL n AF089818 et AF061263; DeVries L. et coll. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998), 12340-12345]. On a identifié deux clones d'ADNc se chevauchant (figure 4) qui présentent une grande homologie avec l'ADNc partiel de TIP-2 humain (numéro de dépôt GenBank : AF028824) [Rousset R. et coll., Oncogene 16 (1998), 643-654] et qui ont été désignés par IIP-la et IIP-1b. L'ADNc d'IIP-la correspond aux nucléotides 117 à 751 de TIP-2. L'ADNc d'IIP-lb présente, outre deux séquences TIP-2 (nucléotides 1 à 106), des séquences supplémentaires en 5' qui sont homologues de la séquence Y2H35 de WO 97/27296 (nucléotides 25 à 158).

IIP-la et IIP-lb ont en commun la séquence codant pour le domaine PDZ de TIP-2 (nucléotides 156 à 410), qui est un domaine connu d'interaction protéine-protéine [Ponting C. P. et coll., BioEssays 19 (1997), 469-479]. Par analyse de délétion, on a déterminé que le domaine PDZ était le domaine essentiel et suffisant de liaison au récepteur d'IGF-1 d'IIP-1 (figure 4).

En outre, l'analyse à double hydride de levure a révélé que la liaison de la protéine IIP-1 au récepteur d'IGF-1 était spécifique pour cette tyrosine kinase de récepteur. Aucune interaction n'a été constatée avec le récepteur d'insuline ou Ros. Les tyrosine kinases de récepteurs d'autres familles n'entraient pas en inter-

action avec IIP-1 (par exemple le récepteur Met, Ret, Kit, Fms, Neu, EGF). IIP-1 est donc très probablement la première protéine d'interaction qui s'est révélée être spécifique de la tyrosine kinase de récepteur d'IGF-1. IIP-1 se lie également aux mutants kinase-inactifs du récepteur d'IGF-1.

IIP-2
IIP-2 a été identifiée comme un nouveau partenaire de liaison de la partie cytoplasmique du récepteur d'IGF-1 qui correspond à APS humaine (numéro de dépôt EMBL : HSAB520). APS a été isolée précédemment dans un criblage à double hybride de levure, avec utilisation comme leurre du domaine oncogène de la c-kit kinase [Yokouchi M. et coll., Oncogene 15 (1998), 7-15]. IIP-2 entre en interaction avec le récepteur d'IGF-1 d'une façon dépendant de la kinase. On a également constaté la liaison d'IIP-2 à d'autres membres de la famille des récepteurs de l'insuline (récepteur d'insuline, Ros), mais non à une tyrosine kinase de récepteur non apparenté (Met). La région d'IIP-2 qui s'est révélée entrer en interaction avec le récepteur d'IGF-1 correspond à APS humaine (nucléotides 1126 à 1674, numéro de dépôt EMBL : contient le domaine SH2 d'APS (nucléotides 1249 à 1545).

IIP-3
On a isolé IIP-3 en tant que nouvelle protéine entrant en interaction avec le récepteur d'IGF-1, et elle est identique à PSM (numéro de dépôt GenBank: AF020526).

PSM est connue comme une protéine de transduction de signal contenant des domaines PH et SH2, qui se lie au récepteur d'insuline activé [Riedel H. et coll., J.

Biochem. 122 (1997), 1105-1113]. On a également décrit un variant de PSM [Riedel H. et coll., J. Biochem. 122 (1997), 1105-1113]. La liaison d'IIP-3 au récepteur d'IGF-1 est fonction de la tyrosyl-phosphorylation du récepteur.

On a identifié un clone d'ADNc correspondant aux nucléotides 1862 à 2184 de la forme variante de PSM. Le clone d'ADNc isolé s'est révélé coder pour la région de liaison au récepteur d'IGF-1. Le domaine SH2 de PSM (nucléotides 1864 à 2148, numéro de dépôt EMBL : est codé par la séquence du clone d'ADNc partiel d'IIP-3 isolé.

IIP-4
On a isolé IIP-4 en tant que nouvelle protéine interagissante du domaine cytoplasmique du récepteur d'IGF-1. IIP-4 correspond à p59fyn, une tyrosine kinase ressemblant à src (numéro de dépôt EMBL : et fyn EM~HUM1:HS66H14 humain) [Cooke M.P. et Perlmutter R.M., New Biol. 1 (1989), 66-74]. IIP-4 se lie, d'une façon dépendant de la kinase, au récepteur d'IGF-1 et à plusieurs autres tyrosine kinases de récepteurs, comme au récepteur d'insuline et Met. La région d'IIP-4 entrant en interaction avec le récepteur d'IGF-1 (nucléotides 665 à 1044) contient le domaine SH2 de p59fyn (numéro de dépôt EMBL : U70324).

IIP-5
On a isolé IIP-5 en tant que nouvelle protéine entrant en interaction avec le récepteur d'IGF-1. IIP-5 présente une grand homologie avec la protéine de doigts à zinc Zfp38 (numéro de dépôt EMBL : et a une homo- logie d'au moins 80 % avec le gène humain correspondant.

Zfp38 est connue en tant que facteur de transcription [Chowdhury K. et coll., Mech. Dev. 39 (1992), 129-142].

IIP-5 entre en interaction exclusivement avec le récepteur d'IGF-1 activé et phosphorylé, mais non avec un mutant kinase-inactif. En plus de la liaison d'IIP-5 au récepteur d'IGF-1, on a constaté une interaction d'IIP-5 avec les tyrosine kinases de récepteurs de la famille des récepteurs de l'insuline (récepteur d'insuline, Ros). IIP-5 ne se lie pas à la tyrosine kinase de récepteur Met, de

parenté plus éloignée.

On a isolé un clone d'ADNc se liant au récepteur d'IGF-1, qui code pour les nucléotides 756 à 1194 de Zfp38 (numéro de dépôt EMBL : et contient le premier doigt à zinc (nucléotides 1075 à 1158). Ce domaine est suffisant pour la liaison au récepteur d'IGF-1 activé.

IIP-6
IIP-6 a été identifiée comme une nouvelle protéine entrant en interaction avec le récepteur d'IGF-1. IIP-6 présente une légère similarité avec le domaine de doigts à zinc de Zfp29 numéro de dépôt EMBL: MMZFP29). Zfp29 consiste en un domaine d'activation transcriptionnelle N-terminal et 14 doigts à zinc Cys2His2C-terminaux [Denny P. et Ashworth A., Gene 106 (1991), 221-227]. La liaison d'IIP-6 au récepteur d'IGF-1 dépend de la phosphorylation de la kinase du récepteur d'IGF-1. IIP-6 se lie également au récepteur d'insuline, mais n'entre pas en interaction avec Met. La région d'IIP-6 qui s'est révélée entrer en interaction avec le récepteur d'IGF-1 (SEQ ID n 3, SEQ ID n 4) contient deux domaines de doigts à zinc du type Cys2His2.

IIP-7
IIP-7 a été isolée comme une nouvelle protéine entrant en interaction avec le récepteur d'IGF-1, qui cor- respond à Pax-3 (numéro de dépôt EMBL : et Pax3 EM-HUM2:S69369 humain). Pax-3 est connue comme une protéine de liaison à l'ADN qui est exprimée pendant les premiers stades de l'embryogénèse [Goulding M. D. et coll., EMBO J. 10 (1991), 1135-1147]. IIP-7 se lie, d'une façon dépendant de la phosphorylation, au récepteur d'IGF-1.

IIP-7 entre également en interaction avec le récepteur d'insuline et Met. Un clone d'ADNc partiel d'IIP-7 s'est révélé coder pour le domaine de liaison au récepteur d'IGF-1 de PAX-3 (nucléotides 815 à 1199, numéro de dépôt EMBL : MMPAX3R). Cette région contient l'octapeptide de

domaine apparié à PAX-3 (nucléotides 853 à 876) et l'homéodomaine de type apparié (nucléotides 952 à 1134).

IIP-8
IIP-8 code pour l'ADNc complet de Grb7 (numéro de dépôt EMBL : MMGRB7P,EM~HUM1:AB008789 de Grb7 humaine).

Grb7, une protéine de transduction de signal contenant le domaine PH et le domaine SH3, a été publiée en premier lieu en tant que protéine de liaison au récepteur d'EGF [Margolis D.L. et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992), 8894-8898]. IIP-8 n'entre pas en interaction avec le mutant kinase-inactif du récepteur d'IGF-1. On a également constaté la liaison d'IIP-8 à des tyrosine kinases de plusieurs autres récepteurs (par exemple le récepteur d'insuline, Ros et Met).

IIP-9
IIP-9 a été identifiée comme une nouvelle protéine d'interaction avec le récepteur d'IGF-1. IIP-9 est identique à nck- (numéro de dépôt EMBL: AF043260). nck est une protéine de transduction de signal cytoplasmique constituée des domaines SH2 et SH3 [Lehmann J. M. et coll., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 1048]. IIP-9 entre en interaction avec le récepteur d'IGF-1 d'une façon dépendant de la phosphorylation. nck se lie à la région juxtamembranaire du récepteur d'IGF-1. A part la liaison d'IIP-9 au récepteur d'IGF-1, on a constaté une interaction avec le récepteur d'insuline mais non avec Ros ni Met.

Un objet préféré de l'invention consiste en des polypeptides qui sont homologues et, de façon particulièrement préférée, des polypeptides qui sont pratiquement identiques aux polypeptides de SEQ ID n 6 (IIP-10). On peut examiner l'homologie en utilisant l'algorithme FastA décrit par Pearson W.R., Methods in Enzymology 183 (1990), 63-68, Académie Press, San Diego, US. Par "pratiquement identique" on entend une séquence d'aminoacides qui ne

diffère que par des remplacements conservateurs d'aminoacides, par exemple des remplacements d'un aminoacide par un autre de la même classe (par exemple la glycine par la valine, la lysine par l'arginine, etc. ) ou par un ou plusieurs remplacements non conservateurs d'aminoacides, des délétions ou des insertions localisées à des positions de la séquence d'aminoacides qui ne détruisent pas la fonction biologique du polypeptide. Cela comprend un remplacement de liaisons peptidiques covalentes alternatives dans le polypeptide. Par "polypeptide" on entend toute chaîne d'aminoacides, indépendamment de la longueur ou de la modification post-traductionnelle (par exemple glycosylation ou phosphorylation), et ce terme peut être utilisé indifféremment avec le terme "protéine".

Selon l'invention, par "fragment biologiquement actif" on entend un fragment qui peut exercer un effet physiologique de la protéine complète existant dans la nature (par exemple la liaison à son substrat biologique, pour donner une réponse antigénique, etc.).

L'invention comprend également des fragments du polypeptide selon l'invention, qui sont antigéniques. Tel qu'utilisé ici, le terme "antigénique" désigne des fragments de la protéine qui peuvent provoquer une réponse immunogène spécifique, par exemple une réponse immunogène qui donne des anticorps qui se fixent spécifiquement à la protéine selon l'invention. Les fragments ont une longueur de préférence d'au moins 8 aminoacides, et encore mieux jusqu'à 25 aminoacides. Dans une réalisation préférée, les fragments comprennent le domaine qui est responsable de la liaison des IIP au récepteur d'IGF-1 (à savoir le domaine PDZ d'IIP-1). Par "domaine" on entend la région d'aminoacides dans une protéine, qui est directement impliquée dans l'interaction avec le partenaire de liaison. Les domaines PDZ sont des répétitions d'environ 90 résidus, qui se rencontrent dans un certain nombre de protéines

impliquées dans le groupement d'ions, canaux et récepteurs et la liaison de récepteurs à des enzymes effectrices. Ces domaines PDZ sont décrits d'une façon générale par Cabral J.H. et coll., Nature 382 (1996), 649-652).

L'invention comprend en outre un procédé pour la production d'une protéine selon l'invention, dont l'expression ou l'activation est en corrélation avec la prolifération de tumeurs, par expression d'un ADN exogène dans des cellules hôtes eucaryotes ou procaryotes, et l'isolement de la protéine recherchée ou l'expression dudit ADN exogène in vivo, pour des moyens pharmaceutiques, dans lequel la protéine est codée de préférence par une séquence d'ADN codant pour IIP-10, de préférence la séquence d'ADN représentée dans SEQ ID n 5.

Les polypeptides selon l'invention peuvent également être produits par des moyens de recombinaison, ou par voie synthétique. Le polypeptide IIP-10 non glycosylé est obtenu lorsqu'il est produit par recombinaison dans des procaryotes. A l'aide des séquences d'acide nucléique fournies par l'invention, il est possible de rechercher le gène d'IIP-10 ou ses variants dans des génomes de toutes cellules désirées (par exemple, mis à part des cellules humaines, également dans des cellules d'autres mammifères), pour les identifier et isoler le gène recherché codant pour la protéine IIP-10. Ces procédés et des conditions d'hybridation appropriées (voir également ci-dessus "conditions stringentes") sont connus du spécialiste et sont décrits, par exemple, par Sambrook et coll., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, et Hames B. D., Higgins S.G., Nucleic acid hybridation - a practical approach (1985), IRL Press, Oxford, Angleterre. En ce cas, les protocoles classiques décrits dans ces publications sont habituellement utilisés pour les essais.

L'utilisation de la technique de l'ADN recombinant permet la production de nombreux dérivés d'IIP-10 actifs.

Ces dérivés peuvent, par exemple, être modifiés au niveau d'un ou de plusieurs aminoacides par remplacement, délétion ou addition. La transformation en dérivés peut être effectuée, par exemple, par mutagénèse dirigée sur un site. De telles modifications peuvent être aisément effectuées par le spécialiste (J. Sambrook, B.D. Hames, réf. cit.). Il faut simplement s'assurer, au moyen de l'essai d'inhibition de la croissance de cellules tumorales, mentionné ci-dessous, que les propriétés caractéristiques dIIP-10 sont conservées.

A l'aide de tels acides nucléiques codant pour une protéine IIP-10, la protéine selon l'invention peut être obtenue d'une façon reproductible et en grandes quantités.

Pour l'expression dans des organismes procaryotes ou eucaryotes, tels que des cellules hôtes procaryotes ou des cellules hôtes eucaryotes, l'acide nucléique est intégré dans des vecteurs d'expression appropriés, selon des méthodes qui sont familières au spécialiste. Un tel vecteur d'expression contient de préférence un promoteur inductible/apte à la régulation. Ces vecteurs recombinants sont ensuite introduits pour l'expression dans des cellules hôtes appropriées, comme par exemple E. coli en tant que cellule hôte procaryote ou Saccharomyces cerevisiae, la lignée cellulaire de tératocarcinome PA-1 sc 9117 [Büttner et coll., Mol. Cell. Biol. 11 (1991), 3573-3583], des cellules d'insectes, des cellules CHO ou COS, en tant que cellules hôtes eucaryotes, et les cellules hôtes transformées ou ayant subi une transduction sont cultivées dans des conditions permettant l'expression du gène hétérologue. L'isolement de la protéine peut être effectué selon des méthodes connues, à partir de la cellule hôte ou à partir du surnageant de culture de la cellule hôte. De telles méthodes sont décrites, par exemple, par

Ausubel I., Frederick M., Current Protocols in Mol. Biol.

(1992), John Wiley & Sons, New York. Une réactivation de la protéine in vitro peut également être nécessaire, si elle n'est pas rencontrée sous forme soluble dans la culture de cellules.

En conséquence, l'invention concerne en outre un polypeptide IIP qui est un produit de l'expression d'un ADN exogène dans une cellule procaryote ou eucaryote.

La protéine peut être isolée à partir des cellules du surnageant de culture et purifiée par des moyens chromatographiques, de préférence par chromatographie d'échange d'ions, chromatographie d'affinité et/ou HPLC en phases inversées.

IIP-10 peut être purifiée, après production par recombinaison, par chromatographie d'affinité au moyen de techniques connues de purification de protéines, comprenant l'immunoprécipitation, la filtration sur gel, la chromatographie d'échange d'ions, la chromatofocalisation, la focalisation isoélectrique, la précipitation sélective, l'électrophorèse ou similaire.

Procédés de diagnostic:
L'invention comprend en outre un procédé pour la détection d'une molécule d'acide nucléique codant pour un gène d'IIP, comprenant l'incubation d'un échantillon (par exemple des liquides corporels tels que le sang, des lysats de cellules) avec une molécule d'acide nucléique selon l'invention, et la détermination de l'hybridation dans des conditions stringentes de ladite molécule d'acide nucléique avec une molécule d'acide nucléique cible, pour la détermination de la présence d'une molécule d'acide nucléique qui est ledit gène d'IIP, et par conséquent un procédé pour l'identification de l'activation ou de l'inhibition d'IGF-1R dans des cellules mammaliennes ou des liquides corporels.

En conséquence, l'invention comprend également un procédé pour la détection de la prolifération potentielle d'une cellule tumorale, comprenant a) l'incubation d'un échantillon de liquide corporel d'un patient atteint de cancer, d'un échantillon de cellules cancéreuses ou d'un échantillon d'un extrait cellulaire ou d'un surnageant de culture cellulaire desdites cel- lules cancéreuses, ledit échantillon contenant des acides nucléiques, avec un sonde d'acide nucléique qui est choisie dans l'ensemble constitué par (I) les acides nucléiques représentés dans SEQ ID n 1,3 ou 5, ou un acide nucléique qui est com- plémentaire de ceux-ci, et (II) des acides nucléiques qui s'hybrident, dans des conditions stringentes, avec l'un des acides nucléiques provenant de (I), et b) la détection de l'hybridation, au moyen d'un autre par- tenaire de liaison, de l'acide nucléique de l'échantil- lon et/ou de la sonde d'acide nucléique, ou par radio- graphie aux rayons X.

L'hybridation entre la sonde et les acides nucléiques provenant de l'échantillon indique la présence de l'ARN de ces protéines. De telles méthodes sont connues du spécialiste et sont décrites, par exemple, dans WO 89/06698, EP-A-0 200 362, US-A-2 915 082, EP-A-0 063 879, EP-A-0 173 251, EP-A-0 128 018.

Dans une réalisation préférée de l'invention, l'acide nucléique codant de l'échantillon est amplifié avant le test, par exemple, au moyen de la technique PCR connue. Dans le cadre du diagnostic d'acide nucléique, on utilise habituellement une sonde d'acide nucléique transformée en dérivé (marquée). La sonde est mise en contact avec un ADN ou ARN dénaturé provenant de l'échantillon, qui est fixé à un support, et, dans ce processus, on choisit la température, la force ionique, le pH et d'autres

conditions de tampon - en fonction de la longueur et de la composition de la sonde d'acide nucléique et de la température de fusion résultante de l'hybride attendu - de manière que l'ADN ou l'ARN marqué puisse se lier à l'ADN ou ARN homologue [hybridation, voir également Wahl G.M. et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 3683-3687].

Des supports appropriés sont des membranes ou des matériaux de support à base de nitrocellulose (par exemple Schleicher and Schüll, BA 85, Amersham Hybond C. ) de la cellulose renforcée ou liée sous forme de poudre, ou des membranes en Nylon transformées en dérivés avec divers groupes fonctionnels (par exemple des groupes nitro) (par exemple Schleicher and Schüll, Nytran; NEN, Gene Screen; Amersham, Hybond M.; Pall, Biodyne).

On détecte ensuite l'ADN ou l'ARN s'hybridant en mettant le support à incuber avec un anticorps ou un fragment d'anticorps, après lavage complet et saturation totale, pour empêcher la liaison non spécifique.

L'anticorps ou le fragment d'anticorps est dirigé vers la substance incorporée, pendant la transformation en dérivé, dans la sonde d'acide nucléique. L'anticorps est à son tour marqué. Toutefois, il est également possible d'utiliser un ADN marqué directement. Après l'incubation avec les anticorps, on le lave de nouveau, pour détecter seulement les conjugués d'anticorps liés spécifiquement.

La détermination est ensuite effectuée selon des méthodes connues, au moyen du marqueur sur l'anticorps ou le fragment d'anticorps.

La détection de l'expression peut être effectuée, par exemple, en tant que: - hybridation in situ avec des cellules entières fixées, avec des frottis de tissus fixés et des chromosomes en métaphase isolés, - hybridation de colonies (cellules) et hybridation de plages (phages et virus),

- hybridation de Southern (détection d'ADN), - hybridation northern (détection d'ARN), - analyse de sérum (par exemple analyse du type cellulaire de cellules dans le sérum par analyse slot blot), - après amplification (par exemple technique PCR).

De préférence, on met la sonde d'acide nucléique à incuber avec l'acide nucléique de l'échantillon, et on détecte l'hybridation éventuellement au moyen d'un autre partenaire de liaison pour l'acide nucléique ou l'échantillon et/ou la sonde d'acide nucléique.

Les acides nucléiques selon linvention sont par conséquent d'intéressants marqueurs de pronostics dans le diagnostic du potentiel métastasique et de progression de cellules tumorales d'un patient.

Criblage d'antagonistes et d'agonistes d'IIP ou d'inhibiteurs
Selon l'invention, des antagonistes d'IIP-10 ou des inhibiteurs de l'expression d'IIP (par exemple des acides nucléiques antisens) peuvent être utilisés pour inhiber la progression de tumeurs et provoquer une apoptose massive de cellules tumorales in vivo, de préférence par thérapie génique somatique.

En conséquence, la présente invention concerne également des procédés de criblage d'agents thérapeutiques potentiels pour le cancer, le diabète, les troubles neurodégénératifs, les maladies osseuses, des procédés de traitement de maladies et des lignées cellulaires et modèles animaux utiles dans le criblage et l'évaluation de thérapies potentiellement utilisables pour de telles maladies.

Un autre objet de l'invention consiste par conséquent en des procédés pour l'identification de composés utiles dans le traitement des troubles mentionnés précédemment et apparentés. Ces procédés comprennent des procédés pour la modulation de l'expression des polypeptides selon l'inven-

tion, des procédés pour l'identification de composés qui peuvent se lier sélectivement aux protéines selon l'invention, et des procédés d'identification de composés qui peuvent moduler l'activité desdits polypeptides. Ces procédés peuvent être mis en oeuvre in vitro et in vivo et peuvent utiliser les lignées cellulaires transformées et les modèles animaux transgéniques de l'invention.

Un antagoniste d'IIP ou un inhibiteur d'IIP est défini comme une substance ou un composé qui inhibe l'interaction entre IGF-1R et IIP, de préférence IIP-10.

En conséquence, l'activité biologique d'IGF-1R diminue en présence d'un tel composé. En général, les méthodes de criblage d'antagonistes d'IIP comprennent la mise en contact de substances candidates avec des cellules hôtes portant IIP, dans des conditions favorables à la liaison, et la mesure du degré de diminution du signal médié par le récepteur (dans le cas d'un antagoniste). Un tel antagoniste est utile en tant qu'agent pharmaceutique pour utilisation en thérapie tumorale. Pour le traitement du diabète, de maladies neurales ou de maladies osseuses, une stimulation de la voie de signalisation est requise, c'est-à-dire qu'un criblage d'agonistes est utile.

L'activation d'IIP peut être mesurée de plusieurs façons. Normalement, l'activation se manifeste par une modification de la physiologie cellulaire, telle qu'une augmentation ou une diminution du taux de croissance, ou par une modification de l'état de différenciation ou par une modification du métabolisme cellulaire, qui peut être détectée dans des essais classiques de cellules, par exemple les essais MTT ou XTT (Roche Diagnostics GmbH, DE).

Les acides nucléiques et protéines selon l'invention pourraient par conséquent être également utilisés pour identifier et concevoir des substances actives interférant avec l'interaction d'IGF-1R et des IIP. Par

exemple, une substance active entrant en interaction avec l'une des protéines pourrait se lier préférentiellement avec celle-ci au lieu de permettre sa liaison avec son partenaire de liaison naturel. Il est possible d'identifier tout médicament capable de se lier au récepteur d'IGF-1, et par conséquent d'empêcher la liaison d'une IIP ou, vice versa, capable de se lier à une IIP et par conséquent d'empêcher la liaison du récepteur d'IGF-1. Dans les deux cas, la transduction du système de récepteur d'IGF-1 serait modulée (de préférence inhibée). Le criblage de substances actives pour cette possibilité s'effectue par établissement d'un essai compétitif (essai classique dans la technique) entre le composé d'essai et l'interaction d'IIP et du récepteur d'IGF-1, et avec utilisation d'une protéine purifiée ou de fragments ayant les mêmes propriétés que les partenaires de liaison.

La protéine selon l'invention est appropriée à être utilisée dans un procédé d'essai pour l'identification de composés qui modulent l'activité des protéines selon l'invention. La modulation de l'activité, telle que décrite ici, comprend l'inhibition ou l'activation de la protéine, et comprend la modification directe ou indirecte de la régulation normale de ladite activité de la protéine. Les composés qui modulent l'activité de la protéine comprennent des agonistes, des antagonistes et des composés qui modifient directement ou indirectement la régulation de l'activité de la protéine selon l'invention. La protéine selon l'invention peut être obtenue à la fois à partir de sources natives et de sources recombinantes, pour utilisation dans un procédé d'essai pour identifier des modulateurs. En général, un procédé d'essai pour l'identification de modulateurs comprendra le récepteur d'IGF, une protéine de la présente invention et un composé ou échantillon d'essai, contenant un modulateur supposé de ladite activité de la protéine. Les composés ou échantillons

d'essai peuvent être testés directement sur, par exemple, la protéine purifiée de l'invention, qu'elle soit native ou recombinante, des fractions subcellulaires de cellules produisant cette protéine, qu'elle soit native ou recombinante, et/ou des cellules entières exprimant ladite protéine, qu'elle soit native ou recombinante. Le composé ou échantillon d'essai peut être ajouté à la protéine selon l'invention, en présence ou en absence de modulateurs connus de ladite protéine. L'activité de modulation du composé ou échantillon d'essai peut être déterminée, par exemple, par analyse de l'aptitude du composé ou de l'échantillon d'essai à se lier à ladite protiéne, activer ladite protéine, inhiber son activité, inhiber ou favoriser la liaison d'autres composés à ladite protéine, modifiant la régulation de récepteurs ou modifiant l'activité intracellulaire.

L'identification de modulateurs de l'activité de protéines est utile dans le traitement d'états pathologiques impliquant l'activité de protéines. D'autres composés peuvent être utiles pour stimuler ou inhiber l'activité de la protéine selon l'invention. Ces composés pourraient être utiles dans le traitement de maladies dans lesquelles l'activation ou l'inactivation de la protéine selon l'invention conduit à la prolifération cellulaire, la mort cellulaire, la non prolifération, l'induction de transformations néoplasiques cellulaires ou la croissance tumorale métastasique, et par conséquent pourraient être utilisés dans la prévention et/ou le traitement de cancers, comme par exemple le cancer de la prostate et le cancer du sein. L'isolement et la purification d'une molécule d'ADN codant pour la protéine selon l'invention seraient utiles pour établir la distribution tissulaire de ladite protéine et établir un procédé pour l'identification de composés modulant l'activité de ladite protéine et/ou son expression.

En conséquence, une autre réalisation de l'invention est un procédé pour le criblage d'un composé inhibant l'interaction entre IGF-1R et IIP-1 ou IIP-10, comprenant a) la réunion d'IGF-1R et du polypeptide IIP-1 ou IIP-10 avec une solution contenant un composé candidat, de manière que l'IGF-lR et le polypeptide IIP-1 ou IIP-10 soient capables de former un complexe, et b) la détermination de la quantité du complexe par rapport au degré préétabli de liaison en l'absence dudit com- posé candidat et, à partir de celle-ci, l'évaluation de l'aptitude dudit composé candidat à inhiber la liaison d'IGF-1R au polypeptide IIP-1 ou IIP-10.

Un tel essai de criblage est effectué de préférence en tant qu'essai ELISA (essai immunoenzymatique utilisant un corps adsorbé), dans lequel IGF-1R ou IIP-1 ou IIP-10 est fixé à une phase solide.

Une autre réalisation de l'invention est un procédé pour la production d'un agent thérapeutique pour le traitement de carcinomes chez un patient, comprenant la réunion d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé inhibant à un degré d'au moins 50 % l'interaction entre IGF-1R et IIP dans des essais biochimiques et/ou cellulaires. Les essais biochimiques sont de préférence des essais à base ELISA ou des essais homogènes. Dans le cas du système ELISA, on utilise pour la détection des complexes des anticorps spécifiques des deux partenaires de liaison. Dans le cas de l'essai homogène, au moins un partenaire de liaison est marqué avec des fluorophores, ce qui permet l'analyse des complexes. Les essais cellulaires sont de préférence des essais dans lesquels des cellules tumorales ou des cellules transfectées avec des produits de construction d'expression de l'IGF-lR et les protéines de liaison spécifiques sont traitées ou non par des substances actives, et la formation de complexes entres les deux composants est ensuite analysée au moyen d'essais

cellulaires classiques.

Une réalisation préférée de l'invention est un procédé pour la production d'un agent thérapeutique destiné au traitement de carcinomes chez un patient, comprenant la réunion d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable avec une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé inhibant l'interaction entre IGF-1R et IIP-1 ou IIP-10 dans un essai cellulaire, dans lequel, dans ledit essai cellulaire, des cellules tumorales ou des cellules transfectées avec des produits de construction d'expression d'IGF-1R et de l'IIP respective sont traitées par ledit composé, et la formation de complexe entre IGF-1R et ladite IIP respective est analysée, et le degré de formation dudit complexe, dans le cas d'inhibition, n'excède pas 50 %, par rapport à 100 % pour la formation de complexe sans ledit composé dans le même essai cellulaire.

Une autre réalisation de l'invention est un procédé de traitement d'un patient atteint d'un carcinome, par une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé inhibant l'interaction entre IGF-1R et IIP-1 ou IIP-10 dans un essai cellulaire, dans lequel, dans ledit essai cellulaire, des cellules tumorales ou des cellules transfectées avec des produits de construction d'expression d'IGF-1R et de l'IIP respective sont traitées par ledit composé, et la formation de complexe entre IGF-1R et ladite IIP respective est analysée, et le degré de ladite formation de complexe, dans le cas d'inhibition, n'excède pas 50 %, par rapport à 100 % pour la formation de complexe sans ledit composé, dans le même essai cellulaire.

Une autre réalisation de l'invention est un anticorps dirigé contre IIP-1 ou IIP-10 selon l'invention.

Les anticorps ont été produits à partir des polypeptides humains, de souris ou de rat. Des anticorps reconnaissant spécifiquement IIP-1 ou IIP-10 sont englobés par l'invention. Ces anticorps sont suscités au moyen de

techniques immunologiques classiques. Les anticorps peuvent être polyclonaux ou monoclonaux, ou peuvent être produits par recombinaison, par exemple pour un anticorps humanisé. On fournit également un fragment d'anticorps qui conserve l'aptitude à entrer en interaction avec IIP-1 ou IIP-10. Un tel fragment peut être produit par coupure protéolytique d'un anticorps complet, ou peut être produit par des techniques d'ADN recombinant. Les anticorps de l'invention sont utiles dans des applications de diagnostic et des applications thérapeutiques. On les utilise pour détecter et déterminer quantitativement IIP-1 ou IIP-10 dans des échantillons biologiques, en particulier des échantillons de tissus et des liquides corporels. On les utilise également pour moduler l'activité d'IIP-1 ou IIP-10, par une action d'agoniste ou d'antagoniste.

Les exemples descriptifs et non limitatifs ciaprès, références, listes des séquences et dessins sont donnés pour faciliter la compréhension de la présente invention.

Description des figures et séquences Figure 1 Structure de domaines de leurres bihybrides de levure qui ont été utilisés pour cribler des banques d'ADNc à la recherche de pro- téines de liaison cytoplasmique du récepteur d'IGF-1. Le domaine de liaison à l'ADN LexA a été fusionné avec le domaine cytoplasmique (cp) (nucléotides 2923 à 4154) du récepteur d'IGF-l de type sauvage (a) du mutant kinase- inactif (mutation K/A au niveau de l'amino- acide 1003) (b) [Ullrich A. et coll., EMBO J.

5 (1986), 2503-2512 ; M. et coll.,
Nature 384 (1996), 173-176]. La séquence nucléotidique et la séquence d'aminoacides de deux lieurs différents insérés entre le domaine de liaison à l'ADN LexA et le domaine

de récepteur sont indiquées ci-dessous. Les produits de construction Il (récepteur d'IGF-1 de type sauvage) et Kl (récepteur d'IGF-1 mutant kinase-inactif) contiennent un résidu proline et un résidu glycine supplé- mentaires, par comparaison avec les produits de construction 12 et K2.

Figure 2 Modification du produit de construction leurre LexA/récepteur d'IGF-1 bihydride de levure. a) Illustration schématique des sites de liaison cytoplasmique de récepteur d'IGF-1.

Les sous-unités a du récepteur d'IGF-1 sont reliées aux chaînes 9 par des ponts disul- fure. La partie cytoplasmique de la chaîne (3 contient des sites de liaison pour des sub- strats dans le domaine juxtamembranaire et le domaine C-terminal. b) Structure de domaines du leurre bihydride ne contenant que les sites de liaison du récepteur d'IGF-1 juxtamembranaire. Le domaine juxtamembranaire du récepteur d'IGF-1 (nucléotides 2923 à 3051) [Ullrich A. et coll., EMBO J. 5 (1986), 2503-2512] a été fusionné avec le domaine kinase de tprmet (nucléotides 3456 à 4229) (numéro de dépôt
GenBank : HSU19348). c) Structure de domaines du leurre bihydride contenant seulement les sites de liaison
C-terminaux du récepteur d'IGF-1. Le domaine
C-terminal du récepteur d'IGF-1 (nucléotides
3823 à 4149) [Ullrich A. et coll., EMBO J. 5 (1986), 2503-2512] a été fusionné avec le domaine kinase de tprmet (nucléotides 3456 à
4229) (numéro de dépôt GenBank: HSU19348).

Figure 3 Isoformes d'IIP-1. a) Délimitation des séquences d'ADNc d'IIP-1 et IIP-2 (p26). Les nucléotides sont numéro- tés au-dessus des séquences. Le site poten- tiel d'initiation de traduction dans l'ADNc d'IIP-1 se trouve à la position 63. Le pre- mier codon ATG, en tant que site potentiel d'initiation de traduction dans le variant d'épissage alternatif IIP-1 (p26) est à la position 353. Les deux ADNc contiennent un codon d'arrêt à la position 1062. b) Structure de domaines d'IIP-1 et IIP-1 (p26). Les positions d'aminoacides sont indi- quées au-dessus des séquences. Par comparai- son avec IIP-1 (p26), IIP-1 contient
97 aminoacides supplémentaires à l'extrémité
N-terminale. Les deux isoformes d'IIP-1 con- tiennent un domaine PDZ couvrant une région entre les aminoacides 129 et 213.

Figure 4 Délimitation du domaine de liaison au récep- teur d'IGF-1 d'IIP-1.

On a examiné IIP-1 complète, ses clones d'ADNc partiels (IIP-la et IIP-lb) et ses mutants de délétion (IIP-la/mul, IIP-la/mu2,
IIP-la/mu3, IIP-lb/mul) quant à l'interaction avec le récepteur d'IGF-1 dans le système bihydride de levure. Des cellules de levure ont été co-transfectées avec un produit de construction de fusion LexA/récepteur d'IGF-1 et un plasmide d'activation codant pour IIP-1 ou les différents mutants d'IIP-1 fusionnés avec le domaine d'activation VP16. On a ana- lysé l'interaction entre IIP-1 ou ses mutants et le récepteur d'IGF-1, en contrôlant la croissance de transfectants de type levure

étalés sur du milieu déficient en histidine et mis à incuber pendant 6 jours à 30 C (dia- mètre des colonies de levure: +++: > 1 mm au
2e jour; ++: > 1 mm au 4e jour; + : > 1 mm au
6e jour ; aucune croissance détectée). Le domaine PDZ peut être défini comme essentiel et suffisant pour médier l'interaction avec le récepteur d'IGF-1. Les positions des nucléotides par rapport à IIP-1 complète sont indiquées au-dessus des séquences.

Figure 5 Motifs de séquence de protéine d'IIP-10.

On a analysé la séquence d'aminoacides d'IIP-10 en utilisant le programme d'ordina- teur "Motifs", qui recherche les motifs de protéines en analysant les séquences de pro- téines à la recherche de motifs d'expression réguliers décrits dans le dictionnaire
PROSITE.

SEQ ID n 1 Séquence nucléotidique d'IIP-1 (ADNc).

SEQ ID n 2 Séquence d'aminoacides prédite d'IIP-1.

SEQ ID n 3 Séquence nucléotidique du clone d'ADNc par- tiel d'IIP-6.

SEQ ID n 4 Séquence d'aminoacides déduite du clone d'ADNc partiel d'IIP-6. Les résidus cystéine et histidine des deux domaines de doigts à zinc Cys2His2 sont les aminoacides 72,75,
88,92, 100,103, 116 et 120.

SEQ ID n 5 Séquence nucléotidique d'IIP-10 (ADNc).

SEQ ID n 6 Séquence d'aminoacides déduite d'IIP-10.

SEQ ID n 7 Amorce TIP2c-s.

SEQ ID n 8 Amorce TIP2b-r.

SEQ ID n 9 Amorce Hcthy-s.

SEQ ID n 10 Amorce Hcthy-r.

Exemple 1 Isolement et caractérisation de protéines de liaison avec IGF-1R
On a utilisé le système bihydride de levure [Fields S. et Song 0., Nature 340 (1989), 245-246] pour isoler des protéines cytosoliques inconnues de liaison au récepteur d'IGF-1. Pour le criblage, on a utilisé une version modifiée du système bihydride de levure, permettant la tyrosylphosphorylation inter-chaîne des récepteurs dans une levure.

On a construit le plasmide leurre bihydride de levure (BTM116-cp/récepteur d'IGF-1) en faisant fusionner le domaine cytoplasmique de la sous-unité du récepteur d'IGF-1 (nucléotides 2923 à 4154) [Ullrich A. et coll., EMBO J. 5 (1986), 2503-2512] avec le domaine de liaison à l'ADN LexA, qui forme des dimères et mime la situation du récepteur de type sauvage activé [voir Weidner M. et coll., Nature 384 (1996), 173-176]. Par introduction d'un espaceur proline-glycine entre le domaine de liaison à l'ADN LexA et le domaine de récepteur, l'aptitude du leurre à fixer des substrats connus du récepteur d'IGF-1 était remarquablement accrue, par comparaison avec d'autres aminoacides espaceurs (figure 1).

Ou encore, on a construit un leurre contenant seulement la région juxtamembranaire ou C-terminale du récepteur d'IGF-1 (nucléotides 2923 à 3051 ou nucléotides 3823 à 4146) [Ullrich A. et coll., EMBO J. 5 (1986), 2503-2512] fusionnée avec le domaine kinase d'une tyrosine kinase de récepteur très puissant, non apparenté. En ce cas, on a utilisé le domaine kinase de tpr met (nucléotides 3456 à 4229) (numéro de dépôt GenBank: HSU19348) (figure 2). De cette façon, il est possible de délimiter la région du récepteur d'IGF-1 qui médie la liaison aux effecteurs en aval.

On a utilisé le plasmide leurre de récepteur d'IGF-1 pour cribler des banques d'ADNc de domaines d'activation (par exemple le domaine d'activation à base de VP16 ou Gal4) [voir Weidner M. et coll., Nature 384 (1996), 133-176]. Les plasmides leurres et les plasmides proies ont été co-transfectés dans la souche L40 de Saccharomyces cerevisiae contenant un gène rapporteur HIS3 et un gène rapporteur lacZ. On a isolé des plasmides de la banque à partir de colonies de levure croissant sur du milieu déficient en histidine, on les a séquences et réintroduits dans la souche de levure L40. Par des essais de co-transfection avec différents leurres d'essai, à savoir des plasmides BTM116 codant pour un mutant kinase-inactif du récepteur d'IGF-1 (L1033A) ou le domaine cytoplasmique de tyrosine kinase de récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline (récepteur d'insuline Ros) et de familles de tyrosine kinases de récepteurs non apparentés (Met, récepteur EGF, Kit, Fms, Neu), on a évalué la spécificité des interactions leurre-proie supposées. On a identifié plusieurs ADNc codant pour des protéines entrant en interaction avec le récepteur d'IGF-1 (IIP). En outre, on a trouvé des domaines de liaison de substrats connus du récepteur d'IGF-1, tels que le domaine SH2 C-terminal de p85P13K et le domaine SH2 de GrblO. Les résultats sont donnés dans le tableau 1.

Tableau 1

<tb>
<tb> IIP <SEP> wtIGF-1R <SEP> mu <SEP> IGF-IR <SEP> IR <SEP> Ros <SEP> Met
<tb> IIP-1 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> IIP-2 <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> +IIP-3 <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> -+ <SEP> +
<tb> IIP-4 <SEP> ± <SEP> + <SEP> nd <SEP> +
<tb> IIP-5 <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> +IIP-6 <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> nd <SEP> IIP-7 <SEP> + <SEP> + <SEP> nd <SEP> +
<tb> IIP-8 <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> IIP-9 <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> IIP-10 <SEP> ± <SEP> nd <SEP> nd
<tb>
Délimitation de la spécificité de liaison des IIP eu égard à différentes tyrosine kinases de récepteurs testées dans le système bihydride de levure
Des cellules de levure ont été co-transfectées avec un produit de construction de fusion LexA codant pour les différentes tyrosine kinases de récepteurs, et un plasmide d'activation codant pour les différentes IIP fusionnées avec le domaine d'activation VP16. On a analysé l'interaction entre les IIP et les différentes tyrosine kinases de récepteurs, en contrôlant la croissance de transfectants de levure étalés sur du milieu déficient en histidine, et mis à incuber pendant 3 jours à 30 C [wt IGF-1R (type sauvage): récepteur d'IGF-1 kinase-actif; mu IGF-1R: récepteur d'IGF-1 mutant kinase-inactif; IR : récepteur d'insuline ; Ros: tyrosine kinase de récepteur Ros ; tyrosine kinase de récepteur Met ; croissance de trans- fectants de levure en 3 jours > 1 mm de diamètre; -: aucune croissance décelée ; non déterminé].

Exemple 2 Systèmes d'essai: A) Essais biochimiques in vitro:
Essai homogène/essai à base ELISA
IGF-1R et les protéines de liaison (IIP) sont exprimés avec ou sans enzymes de marquage dans des cellules E. coli ou eucaryotes, et purifiés jusqu'à l'homogénéité. On analyse l'interaction d'IGF-1R et des protéines de liaison respectives, en présence ou en absence de substances actives. On sélectionne les composés qui soit inhibent, soit favorisent la liaison d'IGF-1R et des protéines de liaison respectives. Dans le cas du système ELISA, on utilise pour la détection des complexes les anticorps spécifiques des deux partenaires de liaison.

Dans le cas de l'essai homogène, au moins un partenaire de liaison est marqué avec des fluorophores permettant l'analyse des complexes. Ou encore, pour contrôler l'interaction, on utilise des anticorps anti-marqueurs.

B) Essais cellulaires
On traite ou non par des substances actives des cellules tumorales ou des cellules transfectées avec des produits de construction d'expression de l'IGHF-lR et les protéines de liaison respectives, et on analyse ensuite, au moyen d'essais classiques, la formation de complexe entre les deux composants.

Exemple 3 Clonage d'ADNc d'IIP-1 et IIP-10 (et essai de RT-PCR)
On a aligné la séquence nucléotidique de l'IIP-1 complète en utilisant l'information de base de données (ESTs) et des séquences des clones d'ADNc partiels d'IIP-1 (IIP-la, IIP-lb). Le clonage d'ADNc de l'IIP-1 complète a été effectué par RT-PCR (réaction d'amplification en chaîne par polymérase avec transcriptase inverse) sur l'ARN total isolé à partir d'une lignée de cellules mammaires MCF7 . La RT-PCR avec deux amorces oligonucléoti-

diques : TIP2c-s (SEQ ID n 7) et TIP2b-r (SEQ ID n 8) a conduit à l'amplification de deux fragments d'ADN de 1,0 kb (IIP-1) et 0,7 kb [IIP-1 (p26)].

On a aligné la séquence nucléotidique d'IIP-10 complète en utilisant l'information de base de données (ESTs) et la séquence du clone d'ADNc partiel d'IIP-10. On a effectué le clonage d'ADNc d'IIP-10 sur l'ARN total isolé à partir de la lignée cellulaire de cancer du côlon SW 480. La RT-PCR avec deux amorces oligonucléotidiques: Hcthy-s (SEQ ID n 9) et Hcthy-r (SEQ ID n 10) a conduit à l'amplification d'un fragment d'ADNc de 776 pb (IIP-10).

On a effectué le séquençage d'ADN en utilisant la méthode de terminaison de chaîne aux didésoxyribonucléotides sur un séquenceur ABI 373A, en utilisant le nécessaire Ampli Taq# FS Dideoxyterminator (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA). On a effectué la comparaison de la séquence d'ADNc et de la séquence de protéine déduite en utilisant Advanced Blast Search [Altschul S.F. et coll., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410; Altschul S.F. et coll., Nucleic Acids Res. 25 (1997), 3389-3402].

Exemple 4 Analyse western blot d'IIP-1 et IIP-10
On a préparé des lysats de cellules entières dans un tampon contenant Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, 1 % de NP40, 0,5 % d'acide désoxycholique, 0,1 % de SDS (dodécylsulfate de sodium) et EDTA 1 mM, et on les a clarifiés par centrifugation pendant 15 minutes à 4 C. On a mesuré la concentration de protéine des surnageants à l'aide du nécessaire Micro BCA Protein Assay (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA) conformément au manuel du fournisseur. Les récepteurs d'IGF-1 ont été immunoprécipités à l'aide d'anticorps anti-récepteur d'IGF-1 (Santa Cruz). Les protéines ont été fractionnées par SDSPAGE et transférées par électrophorèse sur des filtres de nitrocellulose. Les filtres de nitrocellulose ont été mis

à préincuber avec 10 % (p/v) de lait écrémé en poudre dans du tampon Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,2 % de Tween 20. La liaison d'un anticorps monoclonal de souris, dirigé contre l'épitope marqueur, a été détectée à l'aide d'antisérum de chèvre anti-IgG de souris marqué à la per- oxydase de raifort (Biorad, Munich, DE) et visualisée au moyen d'un système de détection de chimiluminescence activé, ECL (Amersham, Braunschweig, DE).

Exemple 5 Surexpression d'IIP-1 à IIP-10 dans des cellules mamma- liennes par transfection médiée par des liposomes
Les ADNc codant pour IIP-1 à IIP-10 ont été clonés dans le site NotI de pBATflag ou pcDNA3flag [Weidner M. et coll., Nature 384 (1996), 173-176 ; J. et coll., Nature 382 (1996), 638-642 ; J. et coll., Science 280 (1998), 596-599]. Des cellules NIH 3T3 ou d'autres cellules receveuses ont été transfectées avec pcDNAflag IIP-1 à -10 ou bien avec pBATflag IIP-1 à -10, avec utili- sation de FuGENE6 (Roche Biochemicals) en tant qu'agent de transfection. Les cellules ont été sélectionnées dans 0,4 mg/ml de G418. Des clones individuels ont été prélevés et analysés pour l'expression IIP-1 à -10 et caractérisés fonctionnellement eu égard à la prolifération.

Analyse northern blot
Des empreintes northern blot de multiples tissus d'ARNm humain et murin ont été acquis auprès de Clontech (Palo Alto, CA, USA). Une sonde d'ADNc couvrant les nucléotides 343 à 676 d'IIP-10 de la région codante a été marquée par DIG-dUTP, à l'aide de mélange de marquage PCR DIG Labeling Mix (Roche Diagnostics GmbH, DE). Une sonde d'ARN d'actine marquée à la digoxygénine a été acquise auprès de Roche Diagnostics GmbH, DE. On a effectué l'hy- bridation en utilisant la solution d'hybridation DIG EasyHyb (Roche Diagnostics GmbH, DE). L'ARNm d'IIP-10 a été détecté à l'aide d'anticorps spécifiques de DIG, cou-

plés à la phosphatase alcaline, et du substrat CSPD (Roche Diagnostics GmbH, DE).

Exemple 6 Détection d'ARNm dans des cellules cancéreuses
Pour détecter si sont exprimés dans des cellules cancéreuses des protéines qui sont codées par-des acides nucléiques qui s'hybrident avec SEQ ID n 1 ou SEQ ID n 5 ou la séquence complémentaire et, par conséquent, si de l'ARNm est présent, il est possible d'effectuer les méthodes établies d'hybridation d'acides nucléiques, telles que l'hybridation northern, l'hybridation in situ, l'hybridation dot ou slot et des techniques de diagnostic dérivées de celles-ci (Sambrook et coll., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames B. D., Higgins S.G., Nucleic acid hybridisation - a practical approach (1985), IRL Press, Oxford, Angleterre ; 89/06698; EP-A-0 200 362; EP-A-0 063 879; EP-A-0 173 251; EP-A-0 128 018]. D'autre part, il est possible d'utiliser des méthodes pour l'ample éventail de techniques d'amplification utilisant des amorces spécifiques [PCR Protocols - A Guide to Methods and Applications (1990), publ.

M.A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, T. J. White, Academic Press Inc.; PCR - A Practical Approach (1991), publ. M. J. McPherson, P. Quirke, G. R. Taylor, IRL Press].

On isole l'ARN pour cela à partir du tissu cancéreux, par la méthode de Chomcszynski et Sacchi, Anal.

Biochem. 162 (1987), 156-159. On a séparé 20 g d'ARN total sur un gel de formaldéhyde-agarose à 1,2 %, et on les a transférés sur des membranes en Nylon (Amersham, Braunschweig, DE) par des méthodes classiques [Sambrook et coll., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA]. La séquence d'ADN SEQ ID n 1 ou SEQ ID n 5 a été radiomarquée en tant que sonde [Feinberg A.P. et Vogelstein B.,

Anal. Biochem. 137 (1984), 266-267]. L'hybridation a été effectuée à 68 C dans SSC 5x, solution de Denhardt 5x, 7 % de SDS/tampon phosphate 0,5 M, pH 7,0,10 % de sulfate de dextran et 100 g/ml d'ADN de spermatozoïdes de saumon.

Les membranes ont été ensuite lavées à deux reprises pendant 1 heure chaque fois dans SSC lx, à 68 C, et ensuiet exposées à un film radiographique.

Exemple 7 Méthode pour l'identification de modulateurs de l'activité de la protéine selon l'invention
Le vecteur d'expression de l'exemple 5 (soit pour IIP-1, soit pour IIP-10,10 g/106 cellules) est transféré dans des cellules NIH 3T3 par des méthodes classiques connues dans la technique (Sambrook et coll. ). On identifie les cellules qui ont capté le vecteur grâce à leur aptitude à croître en présence de la sélection ou dans des conditions sélectives (0,4 mg/ml de G418). Les cellules qui expriment l'ADN codant pour IIP produisent de l'ARN qui est détecté par analyse northern blot, comme décrit dans l'exemple 5. Ou encore, les cellules exprimant la protéine sont identifiées par identification de la protéine par analyse western blot, à l'aide des anticorps décrits dans l'exemple 4. Les cellules qui expriment la protéine à partir du vecteur d'expression manifestent une morphologie modifiée et/ou des propriétés de croissance accrues.

Les cellules qui expriment la protéine et manifestent une ou plusieurs des propriétés modifiées décrites plus haut sont cultivées avec ou sans un composé modulateur supposé. Par criblage de banques chimiques et de banques naturelles, on peut identifier ces composés à l'aide d'essais cellulaires à haut rendement contrôlant la croissance cellulaire [essais de prolifération cellulaire utilisant comme substrats chromogènes les sels de tétrazolium WST-1, MTT ou XTT, ou un essai ELISA de détection de

mort cellulaire utilisant la bromodésoxy-uridine (BrdU); voir Boehringer Mannheim GmbH, Apoptosis and Cell Proliferation, 2e édition, 1998, p. 70-84].

Le composé modulateur provoquera un accroissement ou une diminution de la réponse cellulaire à l'activité de la protéine IIP et sera soit un activateur, soit un inhibiteur de la fonction du récepteur d'IGF, respectivement.

Ou encore, on ajoute des modulateurs supposés à des cultures de cellules tumorales, et les cellules manifestent une morphologie modifiée et/ou manifestent des propriétés de croissance réduite ou accrue. On ajoute aux cellules un composé modulateur supposé, avec ou sans protéine IIP, et on mesure la réponse cellulaire par observation directe des caractéristiques morphologiques des cellules, et/ou on contrôle les cellules quant à leur propriété de croissance. Le composé modulateur provoquera un accroissement ou une diminution de la réponse cellulaire à la protéine IIP et sera soit un activateur, soit un inhibiteur, respectivement, de l'activité du récepteur d' IGF-1 .

Il doit être bien entendu que la description qui précède n'a été donnée qu'à titre illustratif et non limitatif et que toutes variantes ou modifications peuvent y être apportées sans sortir pour autant du cadre général de la présente invention, tel que défini dans les revendications ci-annexées.

Références Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410 Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402 Ausubel I., Frederick M., Current Protocols in Mol. Biol. (1992), John Wiley and Sons,
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WO 89/06698 WO 95/14772 Yokouchi, M., et al., Oncogene 15 (1998) 7-15

LISTE DES SEQUENCES <110> DEMANDERESSE : HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> TITRE DE LA DEMANDE : entrant en inter- action avec le récepteur d'IGF-1 (IIP), acides nucléiques codant pour ces protéines et leur utili- sation <130> Cas 20273 <140> <141> <150> n EP 98122992.5 <151> 03.12.1998 <160> NOMBRE DE SEQUENCES : <170> LOGICIEL: PatentIn Release version 2.0 >210> NUMERO DE LA SEQUENCE : <211> LONGUEUR : <212> TYPE DE MOLECULE : <213> ORGANISME : sapiens <400> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID n 1 gaaacccaca ggaggcaacc acactagttt agatcttctg gtgaccccac ttctcgctgc 60 tcatgccgct gggactgggg cggcggaaaa aggcgccccc tctagtggaa aatgaggagg 120 ctgagccagg ccgtggaggg ctgggcgtgg gggagccagg gcctctgggc ggaggtgggt 180 cggggnnccc ccaaatgggc ttncnccccc ctcccccagc cctgcggccc cgcctcgtgt 240 tccacaccca gctggcccat ggcagtccca ctggccgcat cgagggcttc accaacgtca 300 aggagctgta tggcaagatc gccgaggcct tccgcctgcc aactgccgag gtgatgttct 360 gcaccctgaa cacccacaaa gtggacatgg acaagctcct ggggggccag atcgggctgg 420 aggacttcat cttcgcccac gtgaaggggc agcgcaagga ggtggaggtg ttcaagtcgg 480 aggatgcact cgggctcacc atcacggaca acggggctgg ctacgccttc atcaagcgca 540 tcaaggaggg cagcgtgatc gaccacatcc acctcatcag cgtgggcgac atgatcgagg 600 ccattaacgg gcagagcctg ctgggctgcc ggcactacga ggtggcccgg ctgctcaagg 660 agctgccccg aggccgtacc ttcacgctga agctcacgga gcctcgcaag gccttcgaca 720 tgatcagcca gcgttcagcg ggtggccgcc ctggctctgg cccacaactg ggcactggcc 780 gagggaccct gcggctccga tcccggggcc ccgccacggt ggaggatctg ccctctgcct 840 ttgaagagaa ggccattgag aaggtggatg acctgctgga gagttacatg ggtatcaggg 900 acacggagct ggcagccacc atggtggagc tgggaaagga caaaaggaac ccggatgagc 960 tggccgaggc cctggacgaa cggctgggtg actttgcctt ccctgacgag ttcgtctttg 1020 acgtctgggg cgccattggg gacgccaagg tcggccgcta ctaggactgc ccccggaccc 1080 tgcgatgatg acccgggcgc aacctggtgg gggcccccag cagggacact gacgtcagga 1140 cccgagcctc cagcctgagc ctagctcagc agcccaagga cgatggtgag gggaggtggg 1200 gccaggcccc ctgccccgct ccactcggta ccatcccctc cctggttccc agtctggccg 1260 gggtccccgg cccccctgtg ccctgttccc cacctacctc agctgggtca ggcacaggga 1320 ggggagggat cagccaaatt gggcggccac ccccgcctcc accactttcc accatcagct 1380 gccaaactgg tccctctgtc tccctggggc cttgggttct gtttgggggt catgaccttc 1440 ctagtttcct gacgcaggga atacagggga gagggttgtc cttcccccca gcaaatgcaa 1500 taatgccctc acccctcctg agaggagccc cctccctgtg gagcctgtta cctccgcatt 1560 tgacacgagt ctgctgtgaa ccccgcaacc tcctccccac ctcccatctc tccttccagg 1620 cccatccctg gcccagagca ggagggaggg agggacgatg gcggtgggtt tttgtatctg 1680 aatttgctgt cttgaacata aagaatc 1707

<210> NUMERO DE LA SEQUENCE : <211> LONGUEUR: 333 <212> TYPE DE MOLECULE : <213> ORGANISME : sapiens <400> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID n 2
Met Pro Leu Gly Leu Gly Arg Arg Lys Lys Ala Pro-Pro Leu Val Glu 1 5 10 15
Asn Glu Glu Ala Glu Pro Gly Arg Gly Gly Leu Gly Val Gly Glu Pro
20 25 30
Gly Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Xaa Pro Gln Met Gly Xaa Xaa
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Ala Leu Arg Pro Arg Leu Val Phe His Thr Gln Leu
50 55 60
Ala His Gly Ser Pro Thr Gly Arg Ile Glu Gly Phe Thr Asn Val Lys
65 70 75 80
Glu Leu Tyr Gly Lys Ile Ala Glu Ala Phe Arg Leu Pro Thr Ala Glu
85 90 95
Val Met Phe Cys Thr Leu Asn Thr His Lys Val Asp Met Asp Lys Leu
100 105 110
Leu Gly Gly Gln Ile Gly Leu Glu Asp Phe Ile Phe Ala His Val Lys
115 120 125
Gly Gln Arg Lys Glu Val Glu Val Phe Lys Ser Glu Asp Ala Leu Gly
130 135 140
Leu Thr Ile Thr Asp Asn Gly Ala Gly Tyr Ala Phe Ile Lys Arg Ile
145 150 155 160
Lys Glu Gly Ser Val Ile Asp His Ile His Leu Ile Ser Val Gly Asp
165 170 175
Met IleGlu Ala Ile Asn Gly Gln Ser Leu Leu Gly Cys Arg His Tyr
180 185 190
Glu Val Ala Arg Leu Leu Lys Glu Leu Pro Arg Gly Arg Thr Phe Thr
195 200 205
Leu Lys Leu Thr Glu Pro Arg Lys Ala Phe Asp Met Ile Ser Gln Arg
210 215 220
Ser Ala Gly Gly Arg Pro Gly Ser Gly Pro Gln Leu Gly Thr Gly Arg
225 230 235 240
Gly Thr Leu Arg Leu Arg Ser Arg Gly Pro Ala Thr Val Glu Asp Leu
245 250 255

Pro Ser Ala Phe Glu Glu Lys Ala Ile Glu Lys Val Asp Asp Leu Leu
260 265 270 Glu Ser Tyr Met Gly Ile Arg Asp Thr Glu Leu Ala Ala Thr Met Val
275 280 285 Glu Leu Gly Lys Asp Lys Arg Asn Pro Asp Glu Leu Ala Glu Ala Leu
290 295 300 Asp Glu Arg Leu Gly Asp Phe Ala Phe Pro Asp Glu Phe Val Phe Asp 305 310 315 320 Val Trp Gly Ala Ile Gly Asp Ala Lys Val Gly Arg Tyr
325 330 <210> NUMERO DE LA SEQUENCE : <211> LONGUEUR : <212> TYPE DE MOLECULE : <213> ORGANISME : sapiens <400> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID n 3 gccgaggaag gagaaggggc taaaccttgg agagtggatg gctcaaagga ttctcagatc 60 acacctcggg aggatcatgg gcaggagagc ctgttggcag ggctccacgg aacgcatcca 120 ccaaagacaa ggcagaaagt cactgcccaa gccggaggcc ccggggatcc catgcttttt 180 tcaagcccag agacagatga gaagcttttt atatgtgcgc agtgtggcaa aaccttcaac 240 aatacctcca acctgagaac gcaccagcgg atccacactg gcgagaagcc ctacatgtgt 300 tccgagtgtg gcaagagttt ctcccggagc tccaaccgca tccggcacga gcgcatccac 360 ctggaagana agcactctga 380 <210> NUMERO DE LA SEQUENCE : <211> LONGUEUR : <212> TYPE DE MOLECULE : <213> ORGANISME: Homo sapiens <400> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID n 4
Ala Glu Glu Gly Glu Gly Ala Lys Pro Trp Arg Val Asp Gly Ser Lys
1 10 15
Asp Ser Gin Ile Thr Pro Arg Glu Asp His Gly Gln Glu Ser Leu Leu
20 25 30
Ala Gly Leu His Gly Thr His Pro Pro Lys Thr Arg Gln Lys Val Thr
35 40 45
Ala Gln Ala Gly Gly Pro Gly Asp Pro Met Leu Phe Ser Ser Pro Glu
50 55 60
Thr Asp Glu Lys Leu Phe Ile Cys Ala Gln Cys Gly Lys Thr Phe Asn
65 70 75 80

Asn Thr Ser Asn Leu Arg Thr His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys
85 90 95
Pro Tyr Met Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ser Ser Asn
100 105 110
Arg Ile Arg His Glu Arg Ile His Leu Glu Xaa Lys His Ser
115 120 125 <210> NUMERO DE LA SEQUENCE : <211> LONGUEUR : <212> TYPE DE MOLECULE : <213> ORGANISME : sapiens <400> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID n 5 atgtcgagac cccggaagag gctggctggg acttctggtt cagacaaggg actatcagga 60 aaacgcacca aaactgagaa ctcaggtgag gcattagcta aagtggagga ctccaaccct 120 cagaagactt cagccactaa aaactgtttg aagaatctaa gcagccactg gctgatgaag 180 tcagagccag agagccgcct agagaaaggt gtagatgtga agttcagcat tgaggatctc 240 aaagcacagc ccaaacagac aacatgctgg gatggtgttc gtaactacca ggctcggaac 300 ttccttagag ccatgaagct gggagaagaa gccttcttct accatagcaa ctgcaaagag 360 ccaggcatcg caggactcat gaagatcgtg aaagaggctt acccagacca cacacagttt 420 gagaaaaaca atccccatta tgacccatct agcaaagagg acaaccctaa gtggtccatg 480 gtggatgtac agtttgttcg gatgatgaaa cgtttcattc ccctggctga gctcaaatcc 540 tatcatcaag ctcacaaagc tactggtggc cccttaaaaa atatggttct cttcactcgc 600 cagagattat caatccagcc cctgacccag gaagagtttg attttgtttt gagcctggag 660 gaaaaggaac caagttaa 678 <210> NUMERO DE LA SEQUENCE : <211> LONGUEUR : <212> TYPE DE MOLECULE : <213> ORGANISME : Homosapiens <400> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID n 6
Met Ser Arg Pro Arg Lys Arg Leu Ala Gly Thr Ser Gly Ser Asp Lys
1 10 15
Gly Leu Ser Gly Lys Arg Thr Lys Thr Glu Asn Ser Gly Glu Ala Leu
20 25 30
Ala Lys Val Glu Asp Ser Asn Pro Gln Lys Thr Ser Ala Thr Lys Asn
35 40 45
Cys Leu Lys Asn Leu Ser Ser His Trp Leu Met Lys Ser Glu Pro Glu
50 55 60
Ser Arg Leu Glu Lys Gly Val Asp Val Lys Phe Ser Ile Glu Asp Leu
65 70 75 80
Lys Ala Gln Pro Lys Gln Thr Thr Cys Trp Asp Gly Val Arg Asn Tyr
85 90 95

Gln Ala Arg Asn Phe Leu Arg Ala Met Lys Leu Gly Glu Glu Ala Phe
100 105 110
Phe Tyr His Ser Asn Cys Lys Glu Pro Gly Ile Ala Gly Leu Met Lys
115 120 125
Ile Val Lys Glu Ala Tyr Pro Asp His Thr Gln Phe Glu Lys Asn Asn
130 135 140
Pro His Tyr Asp Pro Ser Ser Lys Glu Asp Asn Pro Lys Trp Ser Met
145 150 155 160
Val Asp Val Gln Phe Val Arg Met Met Lys Arg Phe Ile Pro Leu Ala
165 170 175
Glu Leu Lys Ser Tyr His Gln Ala His Lys Ala Thr Gly Gly Pro Leu
180 185 190
Lys Asn Met Val Leu Phe Thr Arg Gln Arg Leu Ser Ile Gln Pro Leu
195 200 205
Thr Gln Glu Glu Phe Asp Phe Val Leu Ser Leu Glu Glu Lys Glu Pro
210 215 220
Ser
225 <210> NUMERO DE LA SEQUENCE : <211> LONGUEUR : <212> TYPE DE MOLECULE : <213> ORGANISME : artificielle <220> <223> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE ARTIFICIELLE : amorceTIP2c-s <400> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID n 7 gaaacccaca ggaggcaa 18 <210> NUMERO DE LA SEQUENCE : <211> LONGUEUR : <212> TYPE DE MOLECULE: ADN <213> ORGANISME : artificielle <220> <223> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE ARTIFICIELLE :
TIP2b-r <400> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID n 8 ggtcatcatc gcagggtc 18

<210> NUMERO DE LA SEQUENCE : <211> LONGUEUR : <212> TYPE DE MOLECULE: ADN <213> ORGANISME : artificielle <220> <223> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE ARTIFICIELLE: amorce
Hcthy-s <400> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID n 9 agcttgcggc cgcagatgtc gagaccccgg aag 33 <210> NUMERO DE LA SEQUENCE : <211> LONGUEUR : <212> TYPE DE MOLECULE : <213> ORGANISME : artificielle <220> <223> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE ARTIFICIELLE: amorce
Hcthy-r <400> DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID n 10 agcttgcggc cgcgaattct taacttggtt ccttttcctc 40

Claims

REVENDICATIONS

1. Acide nucléique (IIP-10) codant pour une protéine se liant au récepteur d'IGF-1, choisi dans le groupe comprenant a) les acides nucléiques représentés dans SEQ ID n 5 ou une séquence d'acide nucléique complémentaire de celle- ci, b) les acides nucléiques qui s'hybrident, dans des condi- tions stringentes, avec l'un des acides nucléiques pro- venant de a), codant pour un polypeptide présentant une homologie avec le polypeptide de SEQ ID n 6, ou c) des séquences qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, codent pour des polypeptides IIP-10 ayant la séquence d'aminoacides des polypeptides codés par les séquences de a) et b).

2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il a une séquence conforme à SEQ ID n 5.

3. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hybridation est effectuée dans SSC 5,0#, solution de Denhardt 5x, 7 % de SDS, tampon phosphate 0,5 M, pH 7,0, 10 % de sulfate de dextran et 100 ug/ml d'ADN de sperme de saumon, à environ 50- 68 C, et est suivie de deux étapes de lavage avec SSC lx à 68 C.

4. Vecteur d'expression recombinant, approprié à l'expression d'une molécule d'acide nucléique selon la revendication 1.

5. Cellule hôte, transformée par un acide nucléique des revendications 1 à 3.

6. Polypeptide recombinant, se liant au récepteur d'IGF-1 codé par un acide nucléique selon les revendications 1 à 3.

7. Procédé pour la production d'une protéine se liant au récepteur d'IGF-1, par expression d'un ADN exo-

gène dans des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes, et isolement de la protéine recherchée, caractérisé en ce que la protéine est codée par la séquence d'ADN représentée dans SEQ ID n 5 ou un acide nucléique qui s'hybride, dans des conditions stringentes, avec un acide nucléique complémentaire de l'acide nucléique représenté dans SEQ ID n 5.

8. Procédé pour la détection du potentiel de prolifération de cellules cancéreuses, comprenant a) l'incubation d'un échantillon de liquide corporel d'un patient atteint de cancer, de cellules tumorales ou d'un extrait cellulaire ou d'un surnageant de culture cellulaire desdites cellules tumorales, ledit échantil- lon contenant des acides nucléiques, avec un sonde d'acide nucléique qui est choisie dans l'ensemble con- stitué par (I) l'acide nucléique représenté dans SEQ ID n 1,3 ou 5, ou un acide nucléique complémentaire de celui-ci, et (II) des acides nucléiques qui s'hybrident avec l'un des acides nucléiques provenant de (I), et b) la détection de l'hybridation, au moyen d'un autre par- tenaire de liaison, de l'acide nucléique de l'échantil- lon et/ou de la sonde d'acide nucléique.

9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'hybridation est effectuée au moins avec le fragment d'acide nucléique de SEQ ID n 1 ou SEQ ID n 5 ou le fragment complémentaire.

10. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'acide nucléique à détecter est amplifié avant la détection.

11. Procédé pour le criblage d'un composé inhibant l'interaction entre IGF-1R et IIP-10, comprenant :

a) la réunion d'IGF-1R et dudit polypeptide IIP avec une solution contenant un composé candidat, de manière que l'IGF-lR et ledit polypeptide IIP puissent former un complexe, et b) la détermination de la quantité du complexe par rapport au taux préétabli de liaison en l'absence du composé et, à partir de celle-ci, l'évaluation de l'aptitude du composé à inhiber la liaison d'IGF-lR à ladite IIP.

12. Procédé pour la production d'un agent thérapeutique destiné au traitement de carcinomes chez un patient, comprenant la réunion d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable avec une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé qui module l'interaction entre IGF-1R et IIP-10, dans un essai cellulaire, dans lequel, dans ledit essai cellulaire, des cellules tumorales ou des cellules transfectées avec des produits de construction d'expression d'IGF-1R et de ladite IIP sont traitées par ledit composé, et la formation de complexe entre IGF-1R et ladite IIP respective est analysée, et le degré de formation dudit complexe dans le cas d'inhibition n'excède pas 50 %, par rapport à 100 % pour la formation de complexe sans ledit composé dans le même essai cellulaire.

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le composé inhibe l'interaction.