NL1013748C2

NL1013748C2 - Met IGF-1-receptor reagerende eiwitten (IIP's) genen die daarvoor coderen en toepassingen daarvan.

Info

Publication number: NL1013748C2
Application number: NL1013748A
Authority: NL
Inventors: Ralf Schumacher; Tanja Ligensa; Michael Weidner
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2001-12-28
Also published as: DE19964269B4; DE19964268B4; JP2000166555A; JP2001218599A; US20090018312A1; IE991020A1; SE526919C8; SE9904389D0; GB9928450D0; US6913883B2; ITMI992519A1; SE526919C2; US6368826B1; CA2289914A1; US20040225114A1; AU6305999A; US7329734B2; IT1314250B1; US20020042389A1; ITMI992519A0

Description

Met IGF-1-receptor reagerende eiwitten (HP's), genen die daarvoor coderen en toepassingen daarvan 5 De onderhavige uitvinding heeft betrekking op met IGF-1-receptor reagerende eiwitten (HP's), nucleïnezuren die daarvoor coderen, hun gebruik voor diagnostiek en therapie, speciaal op het gebied van kanker. In het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op de diagnose van de 10 genoemde genen in zoogdiercellen, speciaal in maligne tumorcellen, op gentherapiewerkwij zen voor het remmen van de interactie tussen IGF-l-receptor en HP's, op werkwijzen voor het screenen op mogelijke kankertherapiemiddelen, en op celllijnen en diermodellen die bruikbaar zijn bij het 15 screenen op en het beoordelen van mogelijk bruikbare farmaceutische middelen die de interactie tussen HP's en IGF-1-receptor remmen.

De onderhavige uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op het kloneren en karakteriseren van het gen 20 IIP-10 en de genproducten daarvan. De genoemde genproducten (polypeptiden, mRNA) woeden in het bijzonder gekenmerkt doordat ze het vermogen hebben de signaleringsroute van de IGF-1-receptor te moduleren. De functie van de genproducten volgens de uitvinding is daarom de signaaltransductie van 25 de IGF-1-receptor te moduleren. Gedwongen activering van HP's correleert daarom met verhoogde tumorcelproliferatie, overleven en ontkomen aan apoptose.

Het IGF-l-receptor-signaleringssysteem speelt een belangrijk rol bij tumorproliferatie en overleven en is 30 betrokken bij remming van tumorapoptose. In aanvulling op en onafhankelijk van de mitogene eigenschappen ervan, kan iGF-lR-activering tegen geprogrammeerde celdood in vitro en in vivo beschermen of deze ten minste vertragen (Harrington et al., EMBO J. 13 (1994) 3286-3295; Sell et al., Cancer 35 Res. 55 (1995) 303-305; Singleton et al., Cancer Res. 56 (1996) 4522-4529). Een afname in het gehalte aan IGF-lR

beneden wild-typegehaltes bleek ook aanzienlijke apoptose 1C 10748 - 2 - van tumorcellen in vivo te veroorzaken (Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 2463-2469; Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 3739-3741). Overexpressie van ligand (IGF) en/of de receptor is een kenmerk van uiteenlopende tumor-5 cellijnen en kan tot tumorvorming in diermodellen leiden. Overexpressie van humaan IGF-1R resulteerde in ligand-afhankelijke verankering-onafhankelijk groei van NIH3T3 of Rat-l-fibroblasten en inoculatie van deze cellen veroorzaakte een snelle tumorvorming in naakte muizen (Kaleko et 10 al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 464-473; Prager et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 2181-2185). Transgene muizen die IGF-II teveel tot expressie brengen, in het bijzonder in de borstklier, ontwikkelen borst-adenocarci-noom (Bates et al., Br. J. Cancer 72 (1995) 1189-1193) en 15 transgene muizen die IGF-II teveel tot expressie brengen onder de controle van een algemenere promotor ontwikkelen een verhoogd aantal en breed spectrum van tumortypes (Roger et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 13779-13784). Eén voor beeld onder vele voor humane tumors die met een erg hoge 20 frequentie (>80%) IGF-I of IGF-II teveel tot expressie brengen, zijn Small Cell Lung Carcinomas (Quinn et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 11477-11483). Het signaleren door het IGF-systeem schijnt ook nodig te zijn voor de transfor-matie-activiteit van bepaalde oncogenen. Foetale fibro-25 blasten met een verstoring van het IGF-lR-gen kunnen niet door het SV40 T-antigeen, geactiveerd Ha-ras, een combinatie van beide getransformeerd worden (Sell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 11217-11221; Sell et al.,

Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 3604-3612) en ook het E5-eiwit 30 van het runderpapillomavirus transformeert niet langer (Morrione et al., J. Virol. 69 (1995) 5300-5303). Inmenging in het IGF/IGF-IR-systeem bleek ook het getransformeerde fenotype om te keren en tumorgroei te remmen (Trojan et al., Science 259 (1993) 94-97; Kalebic et al., Cancer Res. 35 54 (1994) 5531-5534; Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 2181-2185; Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 2218-2222; Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) «Λ ,> -< ·τ ς I sj ; : .. I Η - 3 - 4848-4850; Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 2463- 2469) . Muizen die bijvoorbeeld geïnjecteerd werden met rat-prostaat-adenocarcinoomcellen (PA-III) die met IGF-IR antisense-cDNA (729 bp) getransfecteerd werden, ontwikkelen 5 tumors die 90% kleiner zijn dan controles of bleven na 60 dagen waarneming tumorvrij (Burfeind et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 7263-7268). Door IGF-1R gemedieer-de bescherming tegen apoptose is onafhankelijk van de-novogenexpressie en eiwitsynthese. Het IGF-l oefent zijn 10 anti-apoptotische werking dus uit via de activering van voorgevormde cytosolische mediatoren.

Er zijn enkele signaleringssubstraten beschreven die aan het IGF-IR (b.v. IRS-1, SHC, p85PI3-kinase, enz. voor details zie hierna) binden. Geen van deze transducers 15 is echter identiek aan het IGF-IR en kon dus alleen verantwoordelijk zijn voor de unieke biologische kenmerken van het IGF-IR vergeleken met andere receptor-tyrosinekinasen waaronder de insulinereceptor. Dit geeft aan dat er specifieke doelen van het IGF-IR (of ten minste de IGF-receptor-20 subfamilie) zouden kunnen bestaan die het overleven en reageren tegen apoptose starten en zijn dus farmaceutische hoofddoelen voor antikankertherapie.

Door het gist-twee-hybridesysteem te gebruiken werd aangetoond dat p85, het regulatiedomein van fosfati-25 dylinositol 3 kinase (PI3K), met het IGF-1R reageert (Lamothe, B., et al., FEBS Lett 373 (1995) 51-55; Tartare-Deckert, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 1019-1024).

Er wordt echter ook binding van p85 aan vele andere receptor- tyrosinekinasen van vrijwel alle families waargenomen. 30 Een andere bindingspartner van het IGF-IR die door de twee-hybride screening af gebakend wordt, is SHC dat ook aan andere receptor-tyrosinekinasen, zoals trk, met, EGF-R en de insulinereceptor bindt (Tartare-Deckert, S., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 23456-23460). Het insulinereceptor-35 substaat 1 (IRS-1) en insulinereceptorsubstraat 2 (IRS-2) bleken dus beide met zowel het IGF-lR alsook de insulinereceptor te reageren (Tartare-Deckert, S., et al., J. Biol.

d - 4 -

Chem. 270 (1995) 23456-23460; He, W., et al., J. Biol.

Chem. 271 (1996) 11641-11645; Dey, R.B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641) . Grb 10 dat met het IGF-1R reageert, deelt ook vele tyrosinekinasen als bindingspart-5 ners, b.v. met, insulinereceptor, kit en abl (Dey, R.B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641; Morrione, A., et al., Cancer Res. 56 (1996) 3165-3167). Het fosfatase PTP1D (syp) laat ook een erg willekeurige bindingscapaciteit zien, d.w.z. bindt aan IGF-1R, insulinereceptor, met en 10 andere (Rocchi, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 4944-4952). Recenter werden mSH2-B en wav beschreven als binders van het IGF-IR, maar interactie wordt ook waargenomen bij andere tyros inekinasen, b.v. mSH2-B bindt ook aan ret en de insulinereceptor (Wang, J., en Riedel, H., J. Biol. Chem. 15 273 (1998) 3136-3139). Samengenomen vertegenwoordigen de tot nu toe beschreven IGF-lR-bindingseiwitten relatief niet-specifieke doelen voor therapeutische benaderingen, of zijn in het geval van de insulinereceptorsubstraten (IRS-1, IRS-2) onontbeerlijk voor insuline-gedreven activiteiten.

20 Doelstelling van de uitvinding is te voorzien in :/ nieuwe genen die coderen Voor de bindingseiwitten van IGF-IR alsook de overeenkomstige polypeptiden die de basis zijn voor nieuwe kankertherapie gebaseerd op de modulatie (bij voorkeur, remming) van de interactie tussen IGF-1R en 25 HP's volgens de uitvinding.

De uitvinding omvat bij voorkeur een nucleïnezuur dat codeert voor een eiwit dat aan IGF-1-receptor (IIP-10) bindt, gekozen uit de groep van a) de nucleïnezuren weergegeven in SEQ ID Nr.:5 of 30 een nucleïnezuursequentie die complementair daar aan is, b) nuclexnezuren die onder stringente condities hybridiseren met één van de nuclexnezuren van a) die coderen voor een polypeptide dat ten minste 35 75% homologie met het polypeptide van SEQ ID Nr.:6 laat zien of c) sequenties die vanwege de afbraak van de geneti- 10 13/48 - 5 - sche code coderen voor IIP-10-polypeptiden met de aminozuur sequent ie van de polypeptiden die door de sequenties van a) en b) gecodeerd worden.

Het cDNA van IIP-10 codeert voor een nieuw eiwit 5 van 226 az met een berekend molecuulgewicht van 25697.

IIP-10 is een lysine-rijk eiwit (11%). IIP-10 bevat een N-glycosyleringsplaats, verscheidene N-myristoyleringsplaat-sen, Ck2 en PKC fosforyleringsplaatsen, één tyrosinekina-sefosforyleringsplaats en één vermoedelijk nucleair loka-10 lisatiesignaal (Fig. 5) De cDNA-sequentie van IIP-10 laat 65% homologie met de cDNA-sequentie van het Gallus Gallus thymocyt-eiwit cthy28kD (EMBL toelatingsnummer: GG34350) zien. De aminozuursequenties van IIP-10 en cthy28kD laten 70% volkomen gelijkheid zien. Nt 383 tot nt 584 van het 15 IIP-10 cDNA zijn voor 94% identiek aan een partieel cDNA beschreven in WO 95/14772 (humaan genaanduiding HUMGS062-71; toelatingsnummer T24253). Door immuno-fluorescentie flag-tagged IIP-10 laat zowel een cytoplasmatische als een nucleaire lokalisatie in NIH3T3-cellen die de IGF-l-recep- 20 tor teveel tot expressie brengen, zien. Verder onthulde ï/ gist-twee-hybride-analyse dat IIP-10 op een fosforylerings-afhankelijke wijze met de IGF-i-receptor reageert. IIP-10 reageert niet met de insulinereceptor. Deletie-analyse van IIP-10 onthulde dat az 19 tot az 226 voldoende zijn om aan 25 de IGF-l-receptor te binden.

"Interactie of binding tussen IIP-10 en de IGF-1-receptor" betekent een specifieke binding van het IIP-10-polypeptide aan de IGF-1-receptor, maar niet aan controle-eiwitten zoals lamine in het gist-twee-hybridesysteem. 30 Specifieke binding aan de IGF-l-receptor kan aangetoond worden met behulp van in bacteriën tot expressie gebrachte glutathion-S-transferase (GST)-ΙΙΡ-fusie-eiwitten en in zoogdiercellen tot expressie gebrachte IGF-l-receptoren. Verder kan een verbinding tussen een Flag-tagged IIP-10 35 fusie-eiwit (cf. Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176) en de IGF-l-receptor in zoogdiercelsystemen gevolgd worden. Voor dit doel worden eukaryotische expressie- 101774? - 6 - vectoren gebruikt om de respectievelijke cDNA's te trans-fecteren. Interactie tussen de eiwitten wordt zichtbaar gemaakt door co-immunoprecipitatie-experimenten of subcel-lulaire lokalisatie-onderzoeken met behulp van anti-Flag of 5 anti-IGF-1-receptor-antilichamen.

Er wordt door de uitvinding verder voorzien in probes en primers voor de genen volgens de uitvinding, evenals nucleïnezuren die coderen voor antigene determinanten van de genproducten volgens de uitvinding. Daarom zijn 10 uitvoeringsvormen die de voorkeur hebben onder andere nucleïnezuren met bij voorkeur 10 tot 50, of met meer voorkeur, 10 tot 20 opeenvolgende nucleotiden van de beschreven sequenties.

De uitdrukking "nucleïnezuur" geeft een polynu-15 cleotide aan dat bijvoorbeeld een DNA, RNA, of gederivati-seerd actief DNA of RNA kan zijn. DNA- en mRNA-moleculen hebben echter de voorkeur.

De uitdrukking "hybridiseren onder stringente omstandigheden" betekent dat twee nucleïnezuurfragmenten 20 onder standaarhybridisatie-omstandigheden, beschreven in Sambrook et al., Molecuikr Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA met elkaar kunnen hybridiseren.

Meer specifiek verwijst "stringente omstandighe-25 den" zoals hier gebruikt wordt naar hybridisatie in 5,0 x SSC, 5 x Denhardt, 7% SDS, 0,5 M fosfaatbuffer, pH 7,0, 10% dextraansulfaat en 100 /xg zalmsperma DNA/ml bij ongeveer 50°C-68°C, gevolgd door twee wasstappen met 1 x SSC bij 68°C. Aanvullend kan de temperatuur bij de was stap verhoogd 30 worden van zwak stringente omstandigheden bij kamertemperatuur, ongeveer 22°C, tot sterk stringente omstandigheden bij ongeveer 68°C.

De uitvinding omvat verder recombinant-expressie-vectoren die geschikt zijn voor de expressie van IIP-10, 35 recombinant-gastheercellen die met dergelijke expressievec-toren getransfecteerd zijn, alsook een werkwijze voor de recombinant-bereiding van een eiwit dat door het IIP-10-gen JQ 1 374 8 - 7 - gecodeerd wordt.

De uitvinding omvat verder synthetische en recom-binante polypeptiden die gecodeerd worden door de nucleïne-zuren volgens de uitvinding, en bij voorkeur gecodeerd 5 worden door de DNA-sequentie die in SEQ ID NR.:5 weergegeven wordt, evenals peptido-nabootsingen die daarop gebaseerd zijn. Dergelijke peptido-nabootsingen hebben een grote affiniteit voor celmembranen en worden gemakkelijk door de cellen opgenomen. Peptido-nabootsingen zijn bij 10 voorkeur verbindingen die uit peptiden en eiwitten afgeleid worden en worden verkregen door structuurmodificatie met behulp van niet-natuurlijke aminozuren, conformationele beperkingen, isosterische plaatsing, cyclisatie, enz.. Zij zijn bij voorkeur gebaseerd op 24 of minder, bij voorkeur 15 20 of minder, aminozuren, waarbij een basis van ongeveer 12 aminozuren in het bijzonder de voorkeur heeft.

De polypeptiden en peptido-nabootsingen kunnen omschreven worden door hun overeenkomstige DNA-sequenties en door de aminozuursequenties die daarvan afgeleid worden. 20 Het geïsoleerde IIP-polypeptide kan in natuurlijke alle-lische variaties voorkomen die van geval tot geval verschillen. Dergelijke variaties van de aminozuren zijn gewoonlijk aminozuursubstituties. Zij kunnen echter ook deleties, inserties of toevoegingen van aminozuren aan de 25 gehele sequentie zijn wat tot biologisch actieve fragmenten leidt. Het IIP-eiwit volgens de uitvinding kan - afhankelijk van zowel de omvang als het type cel en het celtype waarin het tot expressie gebracht wordt - de gegly-cosyleerde of niet-geglycosyleerde vorm hebben. Polypepti-30 den met tumoricidische en/of metastatische activiteit kunnen gemakkelijk geïdentificeerd worden door een tumor-progressie-remmingsbepaling met behulp van carcinoomcellen die genoemde polypeptiden tot expressie brengen en het proliferatievermogen en apoptose te meten in relatie tot 35 cellen die de genoemde polypeptiden niet tot expressie brengen.

"Polypeptide met IIP-10-activiteit of IIP-10” 10 1374 8 - 8 - betekent daarom dus eiwitten met minder belangrijke amino-zuurvariaties, maar met nagenoeg dezelfde activiteit als IIP-10. Nagenoeg dezelfde betekent dat de activiteiten dezelfde biologische eigenschappen hebben en dat de poly-5 peptiden ten minste 75% homologie (identiekheid) in amino-zuursequenties met IIP-10 laten zien. Met meer voorkeur zijn de aminozuursequenties ten minste voor 90% identiek. Homologie volgens de uitvinding kan met behulp van de computerprogramma's Gap of BestFit (universiteit van Wis-10 consin; Needleman en Wunsch, J. Biol. Chem. 48 (1970) 443-453; Smith en Waterman. Adv. Appl. Math. 2 (1981) 482-489 bepaald worden.

Andere HP's volgens de, en gebruikt bij de uitvinding zijn in het bijzonder: 15 IIP-1

Een cDNA dat codeert voor een met IGF-1-receptor reagerend eiwit genoemd IIP-1 (SEQ ID Nr.:l) werd geïsoleerd. Het cDNA van IIP-1 codeert voor een nieuw eiwit van 20 333 az met een berekend molecuulgewicht van 35727. IIP-1 is ·. j een eiwit dat rijk is aaiï glycine (13%) . IIP-1 bevat verscheidene N-myristoyleringsplaatsen, PKC- en Ck2-fosfo-ryleringsplaatsen en twee vermoedelijke nucleaire lokalisa-tiesignalen. Een tweede isovorm, IIP-1 (p26) met een lengte 25 van 236 az met een berekend molecuulgewicht van 26071 werd geïdentificeerd die zeer waarschijnlijk gegenereerd werd door op een ander manier te splitsen (Fig. 3) . Beide iso-vormen binden aan de IGF-1-receptor.

Er zijn eerder cDNA-sequenties van IIP-1 vermeld 30 (Database EMBLI nr. AF089818 en AF061263; De Vries, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 12340-12345). Er werden twee overlappende cDNA-klonen (Fig. 4) geïdentificeerd die hoge homologie met het humane TIP-2 partieel cDNA laten zien (GenBank toelatingsnummer: AF028824) (Rousset, 35 R., et al., Oncogene 16 (1998) 643-654) en werden als IIP-la en IIP-lb aangeduid. Het IIP-la cDNA komt met nt 117 tot 751 van TIP-2 overeen. Het IIP-lb cDNA laat naast TIP- 1013/48 - 9 - 2-sequenties (nt 1 tot 106) aanvullend 5'-sequenties zien die homoloog aan sequentie Y2H35 van WO 97/27296 (nt 25 tot 158) zijn.

IIP-la en ΙΙΡ-lb delen beide de sequentie die 5 codeert voor het PDZ-domein van TIP-2 (nt 156 tot 410) dat een bekend eiwit-eiwit-interactiedomein is (Ponting, C.P., et al., BioEssays 19 (1997) 469-479). Door deletie-analyse werd het PDZ-domein als het essentiële en toereikende IGF-l-receptorbindingsdomein van IIP-1 (Fig. 4) vastgesteld.

10 Verder onthulde gist-twee-hybride-analyse dat binding van het IIP-1-eiwit aan de IGF-l-receptor specifiek voor dit receptor-tyrosinekinase is. Er werd geen interactie met de insulinereceptor of Ros waargenomen. Receptor-tyrosinekinasen van andere families reageerden niet met 15 IIP-1 (b.v. Met, Ret, Kit, Fms, Neu, EGF-receptor) . Aldus is IIP-1 zeer waarschijnlijk het eerste interactie-eiwit dat specifiek voor het IGF-1-receptor-tyrosinekinase bleek te zijn. IIP-1 bindt ook aan de kinase-inactieve mutant van de 20 IGF-1-receptor.

IIP-2 IIP-2 werd geïdentificeerd als een nieuwe binder van het cytoplasmatische deel van de IGF-1-receptor dat met 25 humaan APS (EMBL-toelatingsnummer: HSAB520) overeenkomt.

APS is eerder geïsoleerd bij een gist-twee-hybridescreening met behulp van het oncogene c-kit kinase-domein als lokaas (Yokouchi, M., et al., Oncogene 15 (1998) 7-15). IIP-2 reageert met de IGF-1-receptor op een van kinase afhanke-30 lijke wijze. Binding van IIP-2 werd ook aan andere delen van de insulinereceptorfamilie (insulinereceptor, Ros) waargenomen, maar niet aan een niet-verwant receptortyrosi-nekinase (Met) . De regio van IIP-2 die met de IGF-l-recep-tor bleek te reageren komt met het humane APS (nt 1126 tot 35 1674, EMBLA Acc. Nr. AB000520) overeen, bevat het SH2-domein van APS (nt 1249 tot 1545).

«4 ο *ί Ό 7 ί iS' } O1 i > -ï· *·* - 10 - IIP-3 I IP-3 werd geïsoleerd als een nieuw met IGF-1-receptor reagerend eiwit en is identiek aan PSM (GenBank toelatingsnummer: AF020526) . PSM is bekend als een PH- en 5 SH2-domein bevattend signaaltransductie-eiwit dat aan de geactiveerde insulinereceptor bindt (Riedel, H., et al., J. Biochem. 122 (1997) 1105-1113) . Een variant van PSM is ook beschreven (Riedel, H., et al., J. Biochem. 122 (1997) 1105-1113). Binding van IIP-3 aan de IGF-1-receptor is 10 afhankelijk van tyrosylfosforylering van de receptor.

Een cDNA-kloon overeenkomend met nt 1862 tot 2184 van de variantvorm van PSM werd geïdentificeerd. De geïsoleerde cDNA-kloon bleek voor de IGF-l-receptorbindingsregio te coderen. Het SH2-domein van PSM (nt 1864 tot 2148, EMBL 15 Acc. Nr. AF020526) wordt gecodeerd door de sequentie van de geïsoleerde IIP-3 partiële cDNA-kloon.

IIP-4 IIP-4 werd geïsoleerd als een nieuw reagerend 20 eiwit van het cytoplasmatische domein van de IGF-l-recep-tor. IIP-4 komt met p59fyh overeen, een src-achtig tyrosi-nekinase (EMBL toelatingsnummer: MMU70324 en humaan fyn EM-HUM1:HS66H14) (Cooke, M.P., en Perlmutter, R.M., New Biol. 1 (1989) 66-74). IIP-4 bindt op een van kinase afhankelijke 25 wijze aan de IGF-1-receptor en aan verschillende andere receptor-tyrosinekinasen alsook aan de insulinereceptor en Met. De regio van IIP-4 die met de IGF-1-receptor (nt 665 tot 1044) reageert bevat het SH2-domein van p59fyn (EMBL Acc. Nr. U70324).

30 IIP-5 IIP-5 werd als een nieuw met IGF-1-receptor reagerend eiwit geïsoleerd. IIP-5 laat een hoge homologie met het zinkvinger-eiwit Zfp38 (EMBL toelatingsnummer: 35 MMZFPTA) zien en is voor ten minste 80% homoloog aan het overeenkomstige humane gen. Zfp-38 is bekend als een tran-scriptiefactor (Chowdhury, K., et al., Mech. Dev. 39 (1992) 10 1 37 4 8 - 11 - 129-142). IIP-5 reageert exclusief met de geactiveerde en gefosforyleerde IGF-1-receptor, maar niet met een kinase-inactieve mutant. In aanvulling op binding van IIP-5 aan de IGF-1-receptor werd interactie van IIP-5 met receptor-tyro-5 sinekinasen van de insulinereceptorfamilie (insulinerecep-tor, Ros) waargenomen. IIP-5 bindt niet aan het minder verwante receptor-tyrosinekinase Met.

Een cDNA-kloon die aan de IGF-1-receptor bindt die voor nt 756 tot 1194 van Zfp38 (EMBL Acc. Nr. MMZFPTA) 10 codeert en de eerste zinkvinger (nt 1075 tot 1158) bevat werd geïsoleerd. Dit domein is voldoende voor binding van de geactiveerde IGF-1-receptor.

IIP-6 15 IIP-6 werd als een nieuw met IGF-1-receptor reagerend eiwit geïdentificeerd. IIP-6 laat zwakke overeenkomst met het zinkvinger-domein van Zfp29 ((EMBL toela-tingsnummer: MMZF29) zien. Zfp29 bestaat uit een N-termi-naal transcriptioneel activeringsdomein en 14 C-eindstandi-20 ge Cys2His2-zinkvinger s (Denny, P., en Ashworth, A., Gene

V

106 (1991) 221-227). Binding van IIP-6 aan de IGF-l-recep-tor hangt van fosforylering van het IGF-l-receptorkinase af. IIP-6 bindt ook aan de insulinereceptor, maar reageert niet met Met. De regio van IIP-6 die met de IGF-1-receptor 25 (SEQ ID Nr. : 3, SEQ ID Nr. : 4) bleek te reageren, bevat twee zinkvinger-domeinen van het Cys2His2-type.

IIP-7 IIP-7 werd geïsoleerd als een nieuw met IGF-1-30 receptor reagerend eiwit dat met Pax-3 ((EMBL toelatings-nummer: MMPAX3R en humaan Pax3 EM-HUM2:S69369) overeenkomt. Pax-3 is bekend als een DNA-bindingseiwit dat tijdens vroege embryogenese tot expressie gebracht wordt. (Goul-ding, M.D., et al., EMBO J. 10 (1991) 1135-1147) IIP-7 35 bindt op een fosforyleringsafhankelijke wijze aan de IGF-l-receptor. IIP-7 reageert ook met de insulinereceptor en Met. Een partiële IIP-l-cDNA-kloon bleek voor het IGF-1- Λ0 1 37 4 8 — 12 - receptorbindingsdomein van Pax3 (nt 815 tot 1199, (EMBL Acc. Nr. MMPAX3R) te coderen. Deze regio bevat het met Pax-3 gepaarde domein octapeptide (nt 853 tot 876) en het gepaarde type homeodomein (nt 952 tot 1134).

5 IIP-8 IIP-8 codeert voor het cDNA met volledige lengte van GrB7 (EMBL toelatingsnummer: MMGRB7P, humaan Grb7 EM-HUM1:AB008789) . Grb7, een PH-domein en een SH3-domein 10 bevattend signaaltransductie-eiwit werd eerst als een EGF-receptorbindingseiwit gepubliceerd (Margolis, B.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 8894-8898) . IIP-8 reageert niet met de kinase-inactieve mutant van de IGF-1-receptor. Binding van IIP-8 aan verschillende andere recep-15 tor-tyrosinekinasen (b.v. insulinereceptor, Ros en Met) werd ook waargenomen.

IIP-9 IIP-9 werd als een nieuw IGF-l-receptorinteractie- 20 eiwit geïdentificeerd. IIP-9 is identiek aan nck-bèta ;/ ((EMBL Acc. Nr. AF043260) . Nek is een cytoplasmatisch signaaltransductie-eiwit dat uit SH2- en SH3-domeinen bestaat (Lehmann, J.M., et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990) 1048). IIP-9 reageert met de IGF-1-receptor op een fosforylerings-25 afhankelijke wijze, nek bindt aan de juxtamembraanregio van de IGF-1-receptor. Apart van binding van IIP-9 aan de IGF-1-receptor werd interactie met de insulinereceptor, maar niet met Ros of Met waargenomen.

Een doelstelling van de uitvinding die de voorkeur 30 heeft, zijn polypeptiden die homoloog zijn aan en, meer in het bijzonder, polypeptiden die zo goed als identiek zijn aan de polypeptiden van SEQ ID Nr.:6 (IIP-10) . Homologie kan onderzocht worden met behulp van het FastA-algoritme dat beschreven wordt door Pearson, W.R., Methods in Enzy-35 mology 183 (1990) 63-68, Academie Press, San Diego, US. Met "zo goed als identiek" wordt een aminozuursequentie bedoeld die alleen met betrekking tot conservatieve aminozuursub- 10 1 374 8 - 13 - stituties verschilt, bijvoorbeeld substituties van één aminozuur voor een ander van dezelfde klasse (b.v. valine voor glycine, arginine voor lysine, enz.) of met betrekking tot één of meer niet-conservatieve aminozuursubstituties, 5 deleties of inserties gelokaliseerd op posities van de aminozuursequentie die de biologische functie van het polypeptide niet verwoesten. Dit zijn onder andere substitutie van alternatieve covalente peptidebindingen in het polypeptide. Met "polypeptide" wordt een keten van aminozu-10 ren bedoeld, ongeacht de lengte of posttranslationele modificatie (b.v., glycosylering of fosforylering) en kan onderling uitwisselbaar met de uitdrukking "eiwit' gebruikt worden.

Volgens de uitvinding wordt met "biologisch actief 15 fragment" een fragment bedoeld dat een fysiologisch effect van het natuurlijk voorkomende eiwit met de volledige lengte kan uitoefenen (b.v. binding aan het biologische substraat ervan, het veroorzaken van een antigene respons, enz.).

20 De uitvinding kenmerkt ook fragmenten van het polypeptide volgens de uitvinding die antigeen zijn. De uitdrukking "antigeen" zoals hier gebruikt wordt, verwijst naar fragmenten van het eiwit die een specifieke immunogene respons kunnen induceren, b.v. een immunogene respons die 25 antilichamen oplevert die specifiek aan het eiwit volgens de uitvinding binden. De fragmenten hebben bij voorkeur een lengte van ten minste 8 aminozuren, en bij voorkeur tot 25 aminozuren. Bij één uitvoeringsvorm die de voorkeur heeft, omvatten de fragmenten het domein dat verantwoordelijk is 30 voor de binding van de HP's aan de IGF-l-receptor (d.w.z. het PDZ-domein van IIP-1) . Met "domein" wordt de regio van aminozuren in een eiwit bedoeld die direct betrokken is bij de interactie met de bindingspartner ervan. PDZ-domeinen zijn herhalingen van ongeveer 90-residuen die gevonden 35 worden in een aantal eiwitten die betrokken zijn bij ion-, kanaal- en receptorclustering en de koppeling van receptoren aan effectorenzymen. Dergelijke PDZ's worden in het 10 1 37 4 8 - 14 - algemeen beschreven door Cabral, J. H. et al., Nature 382 (1996) 649-652.

De uitvinding omvat verder een werkwijze voor de vorming van een eiwit volgens de uitvinding waarvan de 5 expressie of activering correleert met tumorproliferatie, door een exogeen DNA in prokaryotische of eukaryotische gastheercellen tot expressie te brengen en isolatie van het gewenste eiwit of het genoemde exogene DNA in vivo tot expressie te brengen voor farmaceutische middelen, waarbij 10 voor het eiwit gecodeerd wordt door bij voorkeur een DNA-sequentie die codeert voor IIP-10, bij voorkeur de DNA-sequentie weergegeven in SEQ ID NR.:5.

De polypeptiden volgens de uitvinding kunnen ook op recombinante wijzen of synthetisch gevormd worden. Niet-15 geglycolyseerd IIP-10-polypeptide wordt verkregen als het recombinant in prokaryoten geproduceerd wordt. Met behulp van de nucleïnezuursequenties waarin door de uitvinding voorzien wordt, is het mogelijk naar het IIP-10-gen of de varianten ervan te zoeken in genomen van gewenste cellen 20 (b.v. onafhankelijk van humane cellen, ook in cellen van andere zoogdieren) om deze te identificeren en het gewenste gen dat codeert voor het IIP-10-eiwit te isoleren. Dergelijke werkwijzen en geschikte hybridisatiecondities (zie ook hiervoor "stringente condities") zijn aan een geschool-25 de vakman bekend en worden bijvoorbeeld beschreven door Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA en Hames, B.D., Higgins, S.G., Nucleic acid hybridisation -a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, Engeland, in 30 dit geval worden de standaardprotocollen die in deze publicaties beschreven wordt gewoonlijk voor de experimenten gebruikt.

Het gebruik van recombinant-DNA-technologie maakt de productie van talloze actieve IIP-10-derivaten mogelijk. 35 Dergelijke derivaten kunnen bijvoorbeeld voor wat betreft afzonderlijke of verschillende aminozuren gemodificeerd zijn door substitutie, deletie of additie. De derivatise-

At - - 15 - ring kan bijvoorbeeld uitgevoerd worden door middel van plaatsgerichte mutagenese. Dergelijke variaties kunnen gemakkelijk door een geschoolde vakman uitgevoerd worden (J. Sambrook, B.D. Hames, loc. cit.). Er dient louter, door 5 middel van de hierna genoemde tumorcel-groeiremmingsbepa-ling gegarandeerd te worden dat de karakteristieke eigenschappen van IIP-10 behouden blijven.

Met behulp van dergelijke nucleïnezuren die voor een IIP-10-eiwit coderen, kan het eiwit volgens de uitvin-10 ding op een reproduceerbare wijze verkregen worden en in grote hoeveelheden. Voor expressie in prokaryotische of eukaryotische organismen, zoals prokaryotische gastheercellen of eukaryotische gastheercellen, wordt het nucleïnezuur in geschikte expressieveetoren geïntegreerd, overeenkomstig 15 werkwijzen die aan een geschoolde vakman bekend zijn. Een dergelijke expressievector bevat bij voorkeur een regu-leerbare/induceerbare promotor. Deze recombinant-vectoren worden vervolgens voor de expressie in geschikte gastheercellen ingebracht, zoals b.v. E.coli als een prokaryotische 20 gastheercel of Saccharomyces cerevisiae, teratocarcinoom-cellijn PA-1 sc 9117 (Bütitner et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 3573-3583), insektencellen, CHO- of COS-cellen zoals eukaryotische gastheercellen en de getransformeerde of getransduceerde gastheercellen worden gekweekt onder om-25 standigheden die expressie van het heterologe gen mogelijk maken. De isolatie van het eiwit kan volgens bekende werkwijzen uit de gastheercel of uit de kweeksupernatant van de gastheercel uitgevoerd worden. Dergelijke werkwijzen worden bijvoorbeeld beschreven door Ausubel I., Frederick M., 30 Current Protocols in Mol. Biol. (1992), John Wiley and Sons, New York. Ook kan in vitro reactivering van het eiwit nodig zijn wanneer het niet in oplosbare vorm in de cel-kweek gevonden wordt.

De uitvinding heeft daarom bovendien betrekking op 35 een IIP-polypeptide dat een product van prokaryotische of eukaryotische expressie van een exogeen DNA is.

Het eiwit kan uit de cellen of de kweeksupernatant J 's - 16 - geïsoleerd en gezuiverd worden door chromatografische wijzen, bij voorkeur door ionuitwisselingschromatografie, affiniteitschromatografie en/of reverse fase HPLC.

IIP-10 kan na recombinante productie gezuiverd 5 worden door affiniteitschromatografie met behulp van bekende zuiveringstechnieken, waaronder immunoprecipitatie, gelfiltratie, ionuitwisselingschromatografie, chromatofo-cussen, iso-elektrisch focussen, selectieve precipitatie, elektroforese en dergelijke.

10

Diagnostische werkwijzen:

De uitvinding omvat verder een werkwijze voor het detecteren van een nucleïnezuurmolecuul dat codeert voor een ΙΙΡ-gen, omvattende het incuberen van een monster (b.v. 15 lichaamsvloeistoffen zoals bloed, cellysaten) met een nucleïnezuurmolecuul volgens de uitvinding en het bepalen van hybridisatie onder stringente omstandigheden van het genoemde nucleïnezuurmolecuul · met een doelnucleïnezuurmole-cuul voor het bepalen van de aanwezig van een nucleïnezuur-20 molecuul dat het genoemde ΙΙΡ-gen is en daarom een werkwijze voor de identificatie van IGF-lR-activering of remming in zoogdiercellen of lichaamsvloeistoffem.

De uitvinding omvat daarom ook een werkwijze voor het detecteren van het proliferatievermogen van een poten-25 tiële tumorcel, omvattende a) het incuberen van een monster lichaamsvloeistof van een patiënt die aan kanker lijdt, een monster kankercellen, of een monster van een celextract of een celsupernatant van de genoemde kankercellen, 30 waarbij het genoemde mengsel nucleïnezuren bevat met een nucleïnezuurprobe, die gekozen wordt uit de groep van

(i) de nucleïnezuren weergegeven in SEQ ID

NR. :1, 3 of 5 of een nucleïnezuur dat 35 complementair daaraan is en (ii) nucleïnezuren die onder stringente omstandigheden hybridiseren met één of meer van , \ iu * ^ ^ - 17 - de nucleïnezuren van (i) en b) het detecteren van hybridisatie door middel van een andere bindingspartner van het nucleïnezuur van het monster en/of de nuclelnezuurprobe of door 5 röntgenradiografie.

Hybridisatie tussen de probe en nucleïnezuren uit het monster geeft de aanwezig van het RNA van dergelijke eiwitten aan. Dergelijke werkwijzen zijn aan een geschoolde vakman volgens de stand van de techniek bekend en worden 10 bijvoorbeeld beschreven in WO 89/06698, EP-A-0200362, USP 2915082, EP-A-0063879, EP-A-0173251, EP-A-0128018.

Bij een uitvoeringsvorm van de uitvinding die de voorkeur heeft, wordt het coderende nucleïnezuur van het 15 monster voor de proef geamplificeerd, bijvoorbeeld door middel van de bekende PCR-techniek. Gewoonlijk wordt een gederivatiseerde (gemerkte) nucleïnezuurprobe in het kader van nucleïnezuurdiagnostiek gebruikt. Deze probe wordt in aanraking gebracht met een gedenatureerd DNA of RNA uit het 20 monster dat aan een drager gebonden is en bij deze werkwij- ; i ze worden de temperatuur, ionsterkte, pH en andere buffer-omstandigheden zodanig gekozen - afhankelijk van de lengte en samenstelling van de nucleïnezuurprobe en de resulterende smelttemperatuur van het verwachte hybride - dat het 25 gemerkte DNA of RNA aan homoloog DNA of RNA kan binden (hybridisatie zie ook Wahl, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 3683-3687). Geschikte dragers zijn membranen of dragermaterialen gebaseerd op nitrocellulose (b.v. Schleicher en Schüll, BA 85, Amersham Hybond, C.), 30 versterkt of gebonden in poedervorm of nylonmembranen gederivatiseerd met verschillende functionele groepen (b.v. nitrogroepen) (b.v. Schleicher and Schüll, Nytran; NEN, Gene Screen; Amersham Hybond M; Pall Biodyne).

Het hybridiseren van DNA of RNA wordt vervolgens 35 gedetecteerd door de drager met een antilichaam of antili-chaamfragment te incuberen na grondig wassen en verzadiging om niet-specifieke binding te voorkomen.

i fi ï /. Ά - 18 -

Het antilichaam of het antilichaamfragment is gericht tegen de stof die tijdens derivatisering in de nucleïnezuurprobe opgenomen is. Het antilichaam wordt op zijn beurt gemerkt. Het is echter ook mogelijk een recht-5 streeks gemerkt DNA te gebruiken. Na incubatie met de antilichamen wordt het opnieuw gewassen teneinde alleen specifiek gebonden antilichaanconjugaten te detecteren. De bepaling wordt vervolgens overeenkomstig bekende werkwijzen uitgevoerd door middel van het label op het antilichaam of 10 het antilichaamfragment.

De detectie van de expressie kan bijvoorbeeld uitgevoerd worden als: in situ hybridisatie met gefixeerde complete cellen, waarbij gefixeerd weefsel vlekken maakt en 15 geïsoleerde metafasechromosomen koloniehybridisatie (cellen) en plaquehybridisatie (fagen en virussen),

Southern-hybridisatie (DNA-detectie) Northern-hybridisatie (RNA-detectie) 20 - serumanalyse (b.v. celtype-analyse van cellen in ;/ het serum door slot-blot-analyse), na amplificatie (b.v. PCR-techniek).

Bij voorkeur wordt de nucleïnezuurprobe met het nucleïnezuur van het monster geïncubeerd en de hybridisatie 25 wordt eventueel gedecteerd door middel van een andere bindingspartner voor het nucleïnezuur van het monster en/of de nucleïnezuurprobe.

De nucleïnezuren volgens de uitvinding zijn daarom waardevolle prognostische merkers bij de diagnose van het 30 metastatische en progressievermogen van tumorcellen van een patiënt.

Screening op antagonisten en agonisten van HP's of remmers Volgens de uitvinding kunnen antagonisten van 35 IIP-10 of remmers voor de expressie van IIP (b.v., antisense nucleïnezuren) gebruikt worden om tumorprogressie te remmen en omvangrijke apoptose van tumorcellen in vivo te

i ü i ; ·„ < £ O

- 19 - veroorzaken, bij voorkeur door somatische gentherapie.

Daarom heeft de onderhavige uitvinding ook betrekking op werkwijzen voor het screenen op mogelijke therapeutische middelen voor kanker, diabetes, neurodegeneratieve 5 aandoeningen, botziektes, op werkwijzen voor de behandeling voor ziekte en op cellijnen en diermodellen die bruikbaar zijn bij het screenen op en beoordelen van een mogelijke bruikbare therapie voor een dergelijke ziekte. Daarom zijn een andere doelstelling van de uitvinding werkwijzen voor 10 het identificeren van verbindingen die bruikbaar zijn bij de behandeling van de hiervoor genoemde en verwante aandoeningen. Deze werkwijze zijn onder andere werkwijzen voor het moduleren van de expressie van polypeptiden volgens de uitvinding, werkwijzen voor het identificeren van verbin-15 dingen die selectief aan de eiwitten volgens de uitvinding kunnen binden en werkwijzen voor het identificeren van verbindingen die de activiteit van de genoemde polypeptiden kunnen moduleren. Deze werkwijzen kunnen in vitro en in vivo uitgevoerd worden en men kan erbij van getransfor-20 meerde cellijnen en transgene diermodellen van de uitvinding gebruik maken.

Een antagonist van HP's of een remmer van IIP wordt omschreven als een stof of verbinding die de interactie tussen IGF-IR en IIP, bij voorkeur IIP-10, remt. Daarom 25 neemt de biologische activiteit van IGF-IR in aanwezigheid van een dergelijke verbinding af. In het algemeen houden screeningswerkwijzen voor ΙΙΡ-antagonisten het in aanraking brengen van kandidaatstoffen met ΙΙΡ-dragende gastheercellen onder omstandigheden die voor het binden gunstig zijn 30 in en het meten van de mate van afname van receptor geme-dieerde signalering (in het geval van een antagonist). Een dergelijke antagonist is als een farmaceutisch middel bruikbaar voor gebruik bij tumortherapie. Voor de behandeling van diabetes, neurale aandoeningen, of botaandoenin-35 gen, is stimulatie van de signaleringsroute vereist, d.w.z. screening op antagonisten is nuttig.

ΙΙΡ-activering kan op verschillende manieren 's vH ^ - 20 - gemeten worden. In het algemeen is de activering duidelijk door een verandering in celfysiologie zoals een toename of afname in groeisnelheid of door een verandering in de differentiatietoestand of door verandering in celmetabolis-5 me die gedetecteerd kan worden bij standaardcelbepalingen, bijvoorbeeld MTT- of XTT-bepalingen (Roch Diagnostics GmbH, DE) .

De nucleïnezuren en eiwitten volgens de uitvinding konden daarom gebruikt worden om geneesmiddelen te identi-10 ficeren en te bedenken die de interactie van IGF-IR en IIP"s belemmeren. Een geneesmiddel dat met één van de eiwitten reageert, kon het bijvoorbeeld bij voorkeur binden in plaats van binding aan de natuurlijke tegenhanger ervan mogelijk te maken. Een willekeurig geneesmiddel dat 15 aan de IGF-1-receptor zou kunnen binden, en daardoor binding aan een IIP verhindert of omgekeerd aan een IIP bindt en daardoor de binding aan de IGF-l-receptor verhindert. In beide gevallen zou de signaaltransductie van het IGF-1-receptorsysteem gemoduleerd (bij voorkeur geremd) worden. 20 Screening van geneesmiddelen op dit vermogen vindt plaats door instelling van een Competitieve bepaling (bepalings-standaard volgens de stand van de techniek) tussen de proefverbinding en interactie van IIP en de IGF-1-receptor en met behulp van gezuiverd eiwit of fragmenten met dezelf-25 de eigenschappen als de bindingspartners.

Het eiwit volgens de uitvinding is geschikt voor gebruik bij een bepalingsprocedure voor de identificatie van verbindingen die de activiteit van de eiwitten volgens de uitvinding moduleren. Het moduleren van de activiteit 30 zoals hier omschreven wordt, omvat de remming of activering van het eiwit en omvat direct of indirect beïnvloeden van de normale regulatie van de genoemde eiwitactiviteit. Verbindingen die de eiwitactiviteit moduleren zijn onder andere agonisten, antagonisten en verbindingen die direct 35 of indirect de regulatie van de activiteit van het eiwit volgens de uitvinding beïnvloeden. Het eiwit volgens de uitvinding kan uit zowel natuurlijke als recombinante bron- 1 ü 1 o i 4 ö - 21 - nen verkregen worden voor gebruik bij een bepalingsprocedu-re om modulators te identificeren. In het algemeen zal een bepalingsprocedure om modulators te identificeren de IGF-receptor, een eiwit van de onderhavige uitvinding, en een 5 proef verbinding of monster dat een vermoedelijke modulator van de genoemde eiwitactiviteit bevat, omvatten. De proef-verbindingen kunnen direct getest worden op, bijvoorbeeld, gezuiverd eiwit van de uitvinding, hetzij natuurlijk of recombinant, subcellulaire fracties van cellen die het 10 genoemde eiwit produceren, hetzij natuurlijk of recombinant, en/of gehele cellen die het genoemde eiwit tot expressie brengen, hetzij natuurlijk of recombinant. De proefverbinding of het monster kunnen aan het eiwit volgens de uitvinding toegevoegd worden met of zonder bekende modu-15 lators van het genoemde eiwit. De modulerende activiteit van de proefverbinding of het monster kan bijvoorbeeld bepaald worden door het vermogen van de proefverbinding of het monster te analyseren om aan het genoemde eiwit te binden, het genoemde eiwit te activeren, de activiteit 20 ervan te remmen, de binding van andere verbindingen aan het genoemde eiwit te remmen of te vergroten, de receptorre-gulatie te modificeren of de intracellulaire activiteit te modificeren.

De identificatie van modulators van de eiwitacti-25 viteit is bruikbaar bij het behandelen van aandoeningen waarbij de eiwitactiviteit betrokken is. Er kunnen andere verbindingen bruikbaar zijn voor het stimuleren of remmen van de activiteit van het eiwit volgens de uitvinding. Dergelijke verbindingen zouden nuttig kunnen zijn bij de 30 behandeling van ziektes waarbij activering of inactivering van het eiwit volgens de uitvinding resulteert in cellulaire proliferatie, celdood, niet-proliferatie, inductie van cellulaire neoplastische transformaties, of metastatische tumorgroei resulteert en zouden daarom gebruikt kunnen 35 worden bij de verhindering en/of behandeling van kankers zoals bijvoorbeeld prostaat- en borstkanker. De isolatie en zuivering van een DNA-molecuul dat codeert voor het eiwit 10 1 3746 - 22 - volgens de uitvinding zou bruikbaar zijn voor het vaststellen van de weef selverspreiding van het genoemde eiwit alsook het gangbaar maken van een werkwijze voor het identificeren van verbindingen die de activiteit van het ge-5 noemde eiwit en/of de expressie ervan moduleren.

Daarom is een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding een werkwijze voor het screenen op een verbinding die de interactie tussen IGF-1R en IGF-1 of IIP-10 remt, omvattende 10 a) het zodanig combineren van IGF-lR- en IIP-l- of IIP-10-polypeptide met een oplossing met een kandidaatverbinding dat het IGF-IR- en IIP-1- of IIP-10-polypeptide een complex kan vormen en b) het bepalen van de hoeveelheid complex ten opzich- 15 te van het vooraf bepaalde bindingsniveau zonder de genoemde kandidaatverbinding en daaruit het vermogen van de genoemde kandidaatverbinding vast te stellen om de binding van IGF-lR- aan IIP-1- of IIP-10-polypeptide te remmen.

20 Een dergelijke screeningsbepaling wordt bij voorkeur uitgevoerd als een ELISA-bepaling, waarbij IGF-lR of IIP-1 of IIP-10 aan een vaste fase gebonden wordt.

Een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding is een werkwijze voor de bereiding van een therapeutisch 25 middel voor de behandeling van carcinomen in een patiënt, omvattende het combineren van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een verbinding die de interactie tussen IGF-lR en IIP bij biochemische en/of cellulaire bepalingen in een mate van ten minste 50% remt. Biochemische bepa-30 lingen zijn bij voorkeur op ELISA gebaseerde bepalingen of homogene bepalingen. In het geval van het ELISA-systeem worden antilichamen die specifiek voor de twee bindings-partners zijn, gebruikt voor de detectie van de complexen. In het geval van de homogene bepaling wordt ten minste één 35 bindingspartner gemerkt met fluoroforen die de analyse van de complexen mogelijk maken. Cellulaire bepalingen zijn bij voorkeur bepalingen, waarbij tumorcellen of cellen getrans- 10 1 374 8 - 23 - fecteerd met expressieconstructen van het IGF-lR en de respectievelijke bindingseiwitten met of zonder geneesmiddelen behandeld worden en complexvorming tussen de twee componenten vervolgens geanalyseerd wordt met behulp van 5 standaardcelbepalingen.

Een uitvoeringsvorm van de uitvinding die de voorkeur heeft, is een werkwijze voor de bereiding van een therapeutisch middel voor de behandeling van carcinomen in een patiënt, omvattende het combineren van een farmaceu-10 tisch aanvaardbare drager met een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een verbinding die de interactie tussen IGF-IR en IIP-1 of IIP-10 remt bij een cellulaire bepaling, waarbij bij de genoemde cellulaire bepaling tumorcellen of cellen getransfecteerd met expressieconstructen van IGF-1R 15 en van het respectievelijke IIP met de genoemde verbinding behandeld worden, en complexvorming tussen IGF-IR en het genoemde respectievelijke IIP geanalyseerd wordt en de mate van genoemde complexvorming in het geval van remming, onder verwijzing naar 100% voor complexvorming zonder de genoemde 20 verbinding bij dezelfde genoemde cellulaire bepaling, 50% niet te boven gaat.

Een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding is een werkwijze om een patiënt die aan een carcinoom lijdt te behandelen met een therapeutisch effectieve hoeveelheid van 25 een verbinding die de interactie tussen IGF-IR en IIP-1 of IIP-10 remt bij een cellulaire bepaling, waarbij bij de genoemde cellulaire bepaling tumorcellen of cellen getransfecteerd met expressieconstructen van IGF-IR en van het respectievelijke IIP met de genoemde verbinding behandeld 30 worden, en complexvorming tussen IGF-IR en het genoemde respectievelijke IIP geanalyseerd wordt en de mate van genoemde complexvorming in het geval van remming, onder verwijzing naar 100% voor complexvorming zonder de genoemde verbinding bij dezelfde genoemde cellulaire bepaling, 50% 35 niet te boven gaat.

Een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding is een antilichaam tegen IIP-1 of IIP-10 volgens de uitvin- 1 fi ·ί ·λ

* w i! 'J i 4 U

- 24 - ding.

Er werden antilichamen gegenereerd uit de humane, muis-, of ratpolypeptiden. Antilichamen die in het bijzonder IIP-ι of IIP-10 herkennen worden door de uitvinding 5 omvat. Dergelijke antilichamen worden opgewekt met behulp van immunologische standaardtechnieken. Antilichamen kunnen polyklonaal of monoklonaal zijn of kunnen recombinant gevormd zijn zoals voor een gehumaniseerd antilichaam. Er wordt ook voorzien in een antilichaamfragment dat het 10 vermogen van interactie met IIP-1 of IIP-10 behoudt. Een dergelijk fragment kan gevormd worden door proteolytische splitsing van een antilichaam met de volledige lengte of gevormd worden door recombinant-DNA-werkwijzen. Antilichamen van de uitvinding zijn bruikbaar bij diagnostische en 15 therapeutische toepassingen. Zij worden gebruikt om IIP-1 of IIP-10 in biologische monsters, in het bijzonder weef-selmonsters en lichaamsvloeistoffen te detecteren en te kwantificeren. Zij worden ook gebruikt om de activiteit van IIP-1 of IIP-10 te moduleren door als een agonist of anta-20 gonist te werken.

De volgende voorbeelden, verwijzingen, sequentie-lijsten en tekeningen worden gegeven om de onderhavige uitvinding te helpen begrijpen, waarbij het werkelijke kader ervan in de bijgevoegde conclusies beschreven wordt. 25 Het dient duidelijk te zijn dat er modificaties van de beschreven werkwijzen gemaakt kunnen worden zonder van de geest van de uitvinding af te wijken.

Beschrijving van de Figuren en Sequenties 30

Figuur 1 Domeinstructuur van gist-twee-hybridelokazen die gebruikt werden om de cDNA-bibliotheken voor cytoplasmatische bindingseiwitten van de IGF-1-receptor te screenen. Het LexA-DNA-bindingssdomein 35 werd gefuseerd met het cytoplasmatische (cp) domein (nt 2923 tot 4154) van de wild-type IGF-1-receptor (a) of de kinase-inactieve mutant (K/A- 10 1374 3 - 25 - mutatie op az 1003) (b) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512; Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176). De nucleotide- en aminozuur-sequentie van twee verschillende linkers ingevoegd 5 tussen het LexA DNA-bindingsdomein en het recep- tordomein worden hierna weergegeven. De II- (wt IGF-1-receptor) en KI- (kinase-inactieve mutant IGF-1-receptor) constructen bevatten een extra proline en glycine vergeleken met de 12- en K2-10 constructen.

Figuur 2 Modificatie van het gist-twee-hybride LexA/lGF-l-receptor lokaasconstruct.

a) Schematische illustratie van cytoplasmatische 15 bindingsplaatsen van de IGF-1-receptor. De or- subeenheden van de IGF-1-receptor zijn met de S-ketens via disuifidebindingen verknoopt. Het cytoplasmatische deel van de β-keten bevat bindingsplaatsen voor substraten in het juxtamembraan 20 en C-terminale domein.

j j b) Domeinstructuur van het twee-hybride-lokaas bevattende alleen de juxtamembraan-IGF-l-receptor-bindingplaatsen. Het juxtadomein van de IGF-1-receptor (nt 2923 tot 3051) (Ullrich, A., et al., 25 EMBO J. 5 (1986) 2503-2512) werd gefuseerd met het kinase-domein van tprmet (nt 3456 tot 4229) (Gen-Bank toelatingsnummer: HSU19348).

c) Domeinstructuur van het twee-hybride-lokaas met alleen de C-terminale IGF-l-receptorbindingsplaat- 30 sen. Het C-terminale domein van de IGF-1-receptor (nt 3823 tot 4149) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512) werd gefuseerd met het kinase-domein van tprmet (nt 3456 tot 4229) (GenBank toelatingsnummer: HSU19348).

35 ilO 1 $ i 4 (j - 26 -

Figuur 3 Isovormen van IIP-1.

a) Afbakening van de cDNA-sequenties van IIP-1 en IIP-1 (p26). Nucleotiden zijn hiervoor genummerd. De potentiële translatie-initiatieplaats in het 5 IIP- 1-cDNA zit op positie 63. Het eerste ATG als potentiële translatie-initiatieplaats in de alternatieve splitsingsvariant IIP-1 (p26) zit op positie 353. Beide cDNA's bevatten een stopcodon op positie 1062.

10 b) Domeinstructuur van IIP-1 en IIP-1 (p26).

Aminozuurposities zijn hiervoor aangegeven. In vergelijking met IIP-l (p26) bevat IIP-1 extra 97 aminozuren bij het N-uiteinde. Beide isovormen van IIP-1 bevatten een PDZ-domein dat een regio tussen 15 de aminozuren 129 en 213 omspant.

Figuur 4 Afbakening van het IGF-l-receptorbindingsdomein van IIP-1.

IIP-1 met de volledige lengte, de partiële cDNA-20 klonen ervan (IIP-la en IIP-lb) en deletiemutanten (IIP-la/mul, IIP’-la/mu2, IIP-la/mu3, IIP-lb/mul) werden op interactie met de IGF-1-receptor onderzocht in het gist-twee-hybridesysteem. Gistcellen werden gecotransfecteerd met een LexA IGF-l-recep-25 torfusreconstruct en een activeringsplasmide dat codeert voor IIP-1 of de verschillende IIP-1-mutanten gefuseerd met het VP16-activeringsdomein. Interactie tussen IIP-1 of de mutanten ervan en de IGF-l-receptor werd geanalyseerd door de groei van 30 gisttransfectanten te volgen die op histidinedefi- ciënt medium uitgeplaat en 6 dagen bij 30°C ge-incubeerd waren (diameter van gistkolonies: +++, > 1 mm in 2 dagen; ++, > 1 mm in 4 dagen; +, > 1 mm in 6 dagen; -, geen gedetecteerde groei). Het PDZ-35 domein kan omschreven worden als essentieel en voldoende voor het mediëren van de interactie met de IGF-1-receptor. Nucleotide-posities met be- 10 i /: ö -21 - trekking tot IIP-1 met de volledige lengte worden hiervoor aangegeven.

Figuur 5 Eiwitsequentiemotieven van IIP-10.

5 De aminozuursequentie van IIP-10 werd geanalyseerd met behulp van het computerprogramma "Motifs", dat naar eiwitmotieven zoekt door naar eiwitsequenties voor periodieke expressiepatronen die in de PROSI-TE Dictionary beschreven worden, te zoeken.

10 SEQ ID NR.: 1 Nucleotidesequentie van IIP-1 (cDNA).

SEQ ID MR.: 2 Voorspelde aminozuursequentie van IIP-l.

SEQ ID NR.: 3 Nucleotidesequentie van de IIP-6 partiële cDNA-kloon.

15 SEQ ID NR.: 4 Gededuceerde aminozuursequentie van de IIP-6 partiële cDNA-kloon. Cysteine- en histidineresiduen van de twee Cys2His2Zink-vinger-domeinen zijn de aminozuren 72, 75, 88, 92, 100, 103, 116 en 120.

20 SEQ ID NR.: 5 Nucleotidesequentie van IIP-10 (cDNA).

, I

SEQ ID NR.: 6 Gededuceërde aminozuursequentie van IIP- 10.

SEQ ID NR.: 7 Primer TIP2c-s.

SEQ ID NR.: 8 Primer TIP2b-r.

25 SEQ ID NR.: 9 Primer Hcthy-s.

SEQ ID NR.: 10 Primer Hcthy-r.

Voorbeeld 1 30 Isolatie en karakterisering van IGF-lR-bindingsei- witten

Het gist-twee-hybridesysteem (Fields, S., en Song, 0., Naure 340 (1989) 245-246) werd gebruikt om onbekende cytosolische IGF-l-receptorbindingsplaatsen te isoleren. 35 Voor het screenen werd een gemodificeerde versie van het gist-twee-hybridesysteem gebruikt die tyrosylfosforylering tussen de ketens van de receptoren in gist mogelijk maakt.

...... — ,, o ‘t f\ \ -u O iu k ' - - 28 -

Het gist-twee-hybride-lokaasplasmide (BTM116-cpIGF-l-receptor) werd geconstrueerd door het cytoplasmatische domein van de β-subeenheid van de IGF-1-receptor (nt 2923 tot 4154) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 5 (1986) 2503-2512) te fuseren met het LexA-DNA-bindingsdo- mein dat dimeren vormt en de situatie van de geactiveerde wildtype-receptor nabootst (cf. Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176). Door het inbrengen van een proline- glycine-spacer tussen het LexA-DNA-bindingsdomein en het 10 receptordomein werd het vermogen van het lokaas om bekende substraten van de IGF-l-receptor te binden opmerkelijk verhoogd in vergelijking met andere spacer-aminozuren (Fig. 1) .

Anderzijds werd een lokaas geconstrueerd dat 15 alleen het juxtamembraan of de C-terminale regio van de IGF-1-receptor (nt 2923 tot 3051 of nt 3823 tot 4146) bevat (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512) gefuseerd met het kinase-domein van een niet verwant, zeer krachtig receptor-tyrosinekinase. Hier werd het kinase-domein van 20 tpr met (nt 3456 tot 4229) (GenBank toelatingsnummer: HSU19348) (Fig. 2) gebruikt. Op deze wijze is het mogelijk de regio van de IGF-1-receptor die de binding met beneden-stroomse effectoren medieert af te bakenen.

Het IGF-l-receptor-lokaasplasmide werd gebruikt om 25 activeringsdomein-cDNA-bibliotheken (b.v. op VP16 of Gal4 gebaseerd activeringsdomein) (cf. Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176) te screenen. Het lokaas en de prooiplasmiden werden gecotransfecteerd in Saccharomyces cerevisiae-stam L40 die een HIS3- en lacZ-reportergen 30 bevat. Er werden bibliotheekplasmiden geïsoleerd uit gist-kolonies die op histidinedeficiënt medium groeien, werden gesequenced en opnieuw ingebracht in giststam L40. Door co-transfectie-experimenten met verschillende testlokazen, b.v. BTM116-plasmiden die coderen voor een kinase inactieve 35 mutant van de IGF-1-receptor (L1033A) of het cytoplasmatische domein van receptor-tyrosinekinasen van de insulinere-ceptorfamilie (insulinereceptor, Ros) en van niet verwante 10 1 3 ' 4 8 -29- receptor-tyrosinekinasefamilies (Met, EGF-receptor, Kit, Fms, Neu) werd de specificiteit van de vermoedelijke lok-aas-prooi-interacties vastgesteld. Er werden verschillende cDNA's geïdentificeerd die coderen voor eerder onbekende 5 IGF-l-receptor-interactie-eiwitten (HP's). Bovendien werden bindingsdomeinen van bekende substraten van de IGF-l-receptor zoals het C-terminale SH2-domein van p85PI3K en het SH2-domein van GrblO gevonden. De resultaten worden in Tabel 1 weergegeven.

10

Tabel 1 IIP wtIGF-lR muIGF-lR IR Ros Met 15 IIP-1 + + IIP-2 + + + IIP-3 + + + + IIP-4 + + nd + IIP-5 + - + + 20 IIP-6 + - + nd - \1 IIP-7 + + nd + IIP-8 + - + + + IIP-9 + + IIP-10 + nd nd 25

Afbakening van de bindingsspecificiteit van de HP's voor wat betreft verschillende receptor-tyrosinekina-sen die in het gist-twee-hybridesysteem getest werden. Er werden gistcellen gecotransfecteerd met een LexA-fusiecon-30 struct dat codeert voor de verschillende receptor-tyrosine-kinasen en een activeringsplasmide dat codeert voor de verschillende HP's die gefuseerd zijn met het VP16-active-ringsdomein. Interactie tussen de HP's en de verschillende receptor-tyrosinekinasen werd geanalyseerd door de groei te 35 volgen van gisttransfectanten die op een histidinedeficiënt medium uitgeplaat zijn en 3 dagen bij 30°C geïncubeerd waren (wt IGF-l-R, kinase-actieve IGF-1-receptor; mu IGF-l-R, 10io^8 - 30- kinase- inactieve mutant IGF-1-receptor; IR, insulinerecep-tor; Ros, Ros-receptor-tyrosinekinase; Met, Met-receptor-tyrosinekinase; +, groei van gisttransfectanten binnen 3 dagen groter dan 1 mm in diameter; -, geen gedetecteerde 5 groei; nd, niet bepaald).

Voorbeeld 2

Bepalingssys temen: 10 A) In-vitro/biochemische bepalingen:

Op ELISA-gebaseerde bepaling/homogene bepaling IGF-1R en de bindingseiwitten (HP's) worden 15 zonder of met Tag-enzymen tot expressie gebracht in E.coli of eukaryotische cellen en tot homogeenheid gezuiverd. Interactie van IGF-1R en de respectievelijke bindingseiwitten worden met of zonder geneesmiddelen geanalyseerd. Verbindingen die de binding van IGF-lR en de respectieve-20 lijk bindingseiwitten rammen of bevorderen worden geselecteerd. In het geval van het ELISA-systeem worden anti-lichamen die specifiek voor de twee bindingspartners zijn, gebruikt voor detectie van de complexen. In het geval van de homogene bepaling wordt ten minste één bindingspartner 25 gemerkt met fluoroforen die de analyse van de complexen mogelijk maken. Anderzijds worden anti-Tag-antilichamen gebruikt om de interactie in de gaten te houden.

B) Cellulaire bepalingen: 30

Tumorcellen of cellen getransfecteerd met expres-sieconstructen van het IGF-IR en de respectievelijke bin-dingsplaatsen worden met of zonder geneesmiddelen behandeld en complexvorming tussen de twee componenten wordt vervol-35 gens met behulp van standaardbepalingen geanalyseerd.

1013/48 - 31 -

Voorbeeld 3 cDNA klonering van IIP-1 en IIP-10 (en RT-PCR-bepaling)

De nucleotidesequentie van IIP-1 met de volledige 5 lengte werd op een lijn gebracht met behulp van database-informatie (EST's) en sequenties van de partiële cDNA-klonen van IIP-1 (HP-la, IIP-lb). cDNA-klonering van IIP-1 met de volledige lengte werd uitgevoerd door RT PCR aan volledig RNA dat geïsoleerd was uit een MCF7ADR-borstcello lijn. PT PCR met twee oligonucleotideprimers: TlP2c-s (SEQ ID NR. : 7) en TIP2b-r (SEQ ID NR.: 8) resulteerde in amplificatie van twee DNA-fragmenten van 1,0 kb (IIP-1) en 0,7 kb (IIP-l) (p26)).

De nucleotidesequentie van IIP-10 met de volledige 15 lengte werd op een lijn gebracht met behulp van database-informatie (EST's) en de sequentie van de partiële cDNA-kloon van HP-10. cDNA-klonering van IIP-10 werd aan volledig RNA uitgevoerd dat geïsoleerd was uit de dikke darmkan-kercellijn SW480. RT PCR met twee oligonucleotideprimers: 20 Hcthy-s (SEQ ID NR.: 9) en Hcthy-r (SEQ ID NR. : 10) resul- \j teerde in amplificatie van een cDNA-fragment van 676bp (IIP-10).

DNA-sequencering werd met behulp van de dideoxynu-cleotide-ketenbeëindigingswerkwijze uitgevoerd op een ABI 25 373A sequéncer met behulp van de Ampli Taq*FS Dideoxytermi-nator kit (Perkin Elmer, Foster City, CA). Vergelijking van het cDNA en gededuceerde eiwitsequenties werd uitgevoerd met behulp van Advanced Blast Search (Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410; Altschul, S.F., et 30 al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402).

Voorbeeld 4

Westem-blotanalyse van IIP-1 en IIP-10 35 Er werden volledige cellysaten bereid in een buffer die 50 mM tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholinezuur, 0,1% SDS en l mM EDTA pH bevat en helder J 0 i 37 4 8 - 32 - gemaakt door centrifugering gedurende 15 minuten bij 4°C. De eiwitconcentratie van de supernatanten werd met behulp van de Micro BCA Protein Assay kit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) overeenkomstig de handleiding van de fabrikant 5 gemeten. IGF-1-receptoren werden immunogeprecipiteerd met behulp van anti-IGF-1-receptorantilichamen (Santa Cruz). Eiwitten werden door SDS-PAGE gefractioneerd en elektrofo-retisch op nitrocellulosefilters overgebracht. Nitrocellu-losefilters werden voorgeïncubeerd met 10% (gew./vol.) 10 vetvrij melkpoeder in 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,2% Tween-20. Binding van een muis-monoklonaal antilichaam gericht tegen de flag-epitoop werd gedetecteerd door met mierikswortelperoxidase gemerkt geit-antimuis-IgG-antiserum (Biorad, München, Duitsland) en zichtbaar gemaakt met 15 behulp van een vergroot chemoluminescentiedetectiesysteem, ECL™ (Amersham, Braunschweig, Duitsland) .

Voorbeeld 5 20 Overexpressie van IIP-l tot IIP-10 in zoogdiercel- len door door liposoom geniedieerde transfect ie

De cDNA's voor IIP-1 tot -10 werden in de Notl-plaats van pBATflag of pcDNA3flag (Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176; Behrens, J., et al., Nature 382 25 (1996) 638-642; Behrens, J., et al., Science 280 (1998) 596-599) gekloneerd. NlH3T3-cellen of andere recipiëntcel-len werden met pcDNAflagIIP-l tot -10 of anderzijds met pBATflag IIP-l tot -10 met behulp van FuGENE6 (Roche Bio-chemicals) als transfectiemiddel getransfecteerd. Cellen 30 werden in 0,4 mg/ml G418 geselecteerd. Er werden afzonderlijke klonen geselecteerd en geanalyseerd op expressie van IIP-l tot -10 en functioneel gekarakteriseerd voor wat betreft proliferatie.

35 Northem-blotanalyse

Humaan en muis-mRNA meervoudig weef s el-Nor them-blots werden verkregen bij Clontech (Palo ALto, CA, US).

10 137.18 - 33 -

Een cDNA-probe die IIP-10 nt343-nt676 van de coderende regio omspant werd met DIG-dUTP gemerkt met behulp van de PCR DIG Labeling Mix (Roche Diagnostics GmbH, Duitsland). Een met digoxygenine gemerkte actine RNA-probe werd verkre-5 gen bij Roche Diagnostics GmbH, Duitsland. Hybridisatie werd uitgevoerd met behulp van de DIG EasyHyb hybridisatie-oplossing (Roche Diagnostics GmbH, Duitsland). IIP-10 mRNA werd gedetecteerd met DIG-specifieke antilichamen die geconjugeerd waren met alkalifosfatase en het CSPD-sub-10 straat (Roche Diagnostics GmbH, Duitsland).

Voorbeeld 6

Detectie van mRNA in kankercellen 15 Teneinde te detecteren of eiwitten tot expressie gebracht worden in kankercellen die door nucleïnezuren gecodeerd worden die met SEQ ID NR. : 1 of SEQ ID NR. : 5 of de complementaire sequentie hybridiseren en bijgevolg of mRNA aanwezig is, is het enerzijds mogelijk om de gebruike-20 lijke werkwijzen van nucleïnezuurhybridisatie zoals Nor-thern-hybridisatie, in-situ-hybridisatie, dot- of slothy-bridisatie en daaruit verkregen diagnostische technieken uit te voeren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 25 New York, USA; Hames, B.D., Higgins, S.G., Nucleic acid hybridisation - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, Engeland; WO 89/06698; EP-A-0200362; EP-A-0063879; EP-A-0173251; EP-A-0128018). Anderzijds is het mogelijk om werkwijzen uit het uiteenlopende repertoire van amplifica-30 tie technieken met behulp van specifieke primers te gebruiken (PRC Protocols - A Guide to Methods and Applications (1990) , publ. M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, T.J. White, Academic Press Inc.; PCR - A Practical Approach (1991) , publ. M.J. McPherson, P. Quircke, G.R. Taylor, IRL 35 Press).

Het RNA hiervoor wordt uit het kankerweefsel geïsoleerd door de werkwijze van Chomcszynski en Sacchi, 10 1 w?48 - 34 -

Anal. Biochem. 162 (1987) 156-159. 20 μg volledig RNA werd op een 1,2% agaroseformaldehydgel gescheiden en op nylon-membranen overgebracht (Amersham, Braunschweig, Duitsland) door standaardwerkwijzen (Sambrook et al., Molecular Clo-5 ning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA) . De DNA-sequentie SEQ ID NR. : 1 of SEQ ID NR.: 5 werd radioactief gemerkt als probes (Fein-berg, A.P., en Vogelstein, B., Anal. Biochem. 137 (1984) 266-267) . De hybridisatie werd bij 68°C uitgevoerd in 5 x 10 SSC, 5 x Denhardt, 7% SDS/0,5 M fosfaatbuffer pH 7,0, 10% dextraansulfaat en 100 μg zalmsperma DNA/ml. Vervolgens werden de membranen twee keer een uur gewassen, elke keer in 1 x SSC bij 68°C en vervolgens aan röntgenfilm blootgesteld.

15

Voorbeeld 7

Werkwijze voor de identificatie van modulators van de activiteit van het eiwit volgens de uitvinding 20

De expressievectór van voorbeeld 5 (IIP-1 of IIP-10 10 /ig/10‘ cellen) wordt in NIH 3T3-cellen overgebracht door standaardwerkwijzen die bekend zijn volgens de stand van de techniek (Sambrook et al.) . Cellen die de 25 vector opgenomen hebben, worden geïdentificeerd door hun vermogen tot groei in aanwezigheid van de selectie of onder selectieve omstandigheden (0,4 mg G418/ml). Cellen die DNA dat codeert voor IIP tot expressie brengen produceren RNA dat door Northem-blotanalyse gedetecteerd wordt zoals 30 beschreven in voorbeeld 5. Anderzijds worden cellen die het eiwit tot expressie brengen, geïdentificeerd door identificatie van het eiwit door Western-blotanalyse met behulp van de antilichamen die in voorbeeld 4 beschreven worden. Cellen die het eiwit uit de expressiereceptor tot expressie 35 brengen zullen een veranderde morfologie en/of toegenomen groei-eigenschappen laten zien.

Cellen die het eiwit tot expressie brengen en één

4 O \ 7 4 S

i W ( ” 1 - 35 - of meer van de hiervoor beschreven veranderde eigenschappen laten zien worden met en zonder een vermoedelijke modu-latorverbinding gekweekt. Door screening van chemische en natuurlijke bibliotheken, kunnen dergelijke verbindingen 5 geïdentificeeerd worden met behulp van cellulaire bepalingen met een hoge doorvoer snelheid, waarbij de celgroei in de gaten gehouden wordt (celproliferatiebepalingen met behulp van als chromogene substraten de tetrazoliumzouten WST-l, MTT, of XTT of een celdood-detectie ELISA met behulp 10 van broomdesoxyuridine (BrdU) ; cf. Boehringer Mannheim, GmbH, Apoptosis and Cell Proliferation, 2e druk, 1998, biz. 70-84) .

De modulatorverbinding zal een toename of een afname van de cellulaire respons op de IIP-eiwitactiviteit 15 veroorzaken en zal respectievelijk een activator of remmer van de IGF-receptor-functie zijn.

Anderzijds worden vermoedelijke modulators aan de kweken van tumorcellen toegevoegd en laten de cellen een veranderde morfologie zien en/of laten verminderde of 20 vergrote groei-eigenschappen zien. Een vermoedelijke modulatorverbinding wordt met en zonder IIP-eiwit aan de cellen toegevoegd en een celrespons wordt gemeten door rechtstreekse observatie van morfologische eigenschappen van de cellen en/of de cellen worden voor wat betreft hun groei-25 eigenschappen in de gaten gehouden. De modulatorverbinding zal een toename of afname van de celrespons op IIP-eiwit veroorzaken en zal respectievelijk een activator of een remmer van IGF-l-receptoractiviteit zijn.

1013748 - 36 -

Lijst van verwijzingen

Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410 Altschul, S.F., et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402

Ausubel I., Frederick M., Current Protocols in Mol. Biol. (1992), John Wiley and Sons, New York

Bates etai., Br. J. Cancer 72 (1995) 1189-1193 Behrens, J., et al., Nature 382 (1996) 638-642 Behrens, J., et al., Science 280 (1998) 596-599

Boehringer Mannheim GmbH, Apoptosis and Cell Proliferation, 2nd edition, 1998, pp. 70-84

Burfeind et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 7263-7268

Biittner etal., Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 3573-3583

Cabral, J.H., et al., Nature 382 (1996) 649-652

Chomcszynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162 (1987) 156-159

Chowdhury, K., et al., Mech. Dev. 39 (1992) 129-142

Cooke, M.P., and Perlmutter, R.M., New Biol. 1 (1989) 66-74

Database EMBL Nos. AF089818 and AF061263

Denny, P„ and Ashworth, A., Gene 106 (1991) 221-227

DeVries, L, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 12340-12345

Dey, R.B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641 EP-A 0 063 879 EP-A 0 128 018 ' EP-A 0 173 251 EP-A 0 200 362

Feinberg, A.P., and Vogelstem, B., Anal. Biochem. 137 (1984) 266-267 Fields, S., and Song, 0., Nature 340 (1989) 245-246 Goulding, M.D., etal.,EMBOJ. 10(1991) 1135-1147

Hames, B.D., Higgins, S.G., Nucleic acid hybridisation - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England

Harrington et al., EMBO J. 13 (1994) 3286-3295 He, W., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 11641-11645 Kalebic et al., Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534 Kaleko et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 464-473 Lamothe, B., et al., FEBS Lett. 373 (1995) 51-55 Lehmann, J.M., et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990) 1048)

Margolis, B.L., et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89 (1992) 8894-8898 10 1 374 8 - 37 -

Morrione et al., J. Virol. 69 (1995) 5300-5303 Morrione, A., et al., Cancer Res. 56 (1996) 3165-3167 Needleman and Wunsch, J. Biol. Chem. 48 (1970) 443-453 PCR - A Practical Approach (1991), publ. M.J. McPherson, P. Quirke, G.R. Taylor, IRL Press

Pearson, W.R., Methods in Enzymology 183 (1990) 63-68, Academic Press, San Diego, US

Ponting, C.P., et al., BioEssays 19 (1997) 469-479

Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 2181-2185 PRC Protocols - A Guide to Methods and Applications (1990), publ. M.A. Innis, D.H.

Gelfand, J.J. Sninsky, T.J. White, Academic Press Inc.

Quinn et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 11477-11483 Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 2218-2222 Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 4848-4850 Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 2463-2469 Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 3739-3741 Riedel, H„ etal., J. Biochem. 122 (1997) 1105-1113 Rocchi, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 4944-4952 Rogier et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 13779-13784 Rousset, R., et al., Oncogene 16 (1998) 643-654

Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA Sell et al., Cancer Res. 55 (1995) 303-305 Seü et al., Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 3604-3612 Sell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 11217-11221 Singleton et al., Cancer Res. 56 (1996) 4522-4529 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2 (1981) 482-489 Tartare-Decker, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 1019-1024 Tartare-Deckert, S., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 23456-23460 Trojan et al., Science 259 (1993) 94-97 Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512 USP 2915082

Wahl, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 3683-3687 Wang, J., and Riedel, H., J. Biol. Chem. 273 (1998) 3136-3139 Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176 WO 97/27296 -¾ 0 1 c / 4 8 - 38 - WO 89/06698 WO 95/14772

Yokouchi, M„ et al., Oncogene 15 (1998) 7-15 1 ü 1 o f 4 b

Claims

1. Nucleïnezuur (IIP-10) dat codeert voor een 5 eiwit dat bindt aan de IGF-l-receptor gekozen uit de groep van a) de nucleïnezuren weergegeven in SEQ ID NR. :5 of een nuclelnezuursequentie die complementair daaraan is, 10 b) nucleïnezuren die onder stringente omstandigheden hybridiseren met één van de nucleïnezuren van a) die coderen voor een polypeptide dat homologie met het polypeptide van SEQ ID Nr.:6 laat zien, of c) sequenties die vanwege de afbraak van de geneti- 15 sche code coderen voor IIP-10-polypeptiden met de aminozuur sequent ie van de polypeptiden die door de sequenties van a) en b) gecodeerd worden.

2. Nucleïnezuur volgens conclusie 1, waarbij het nucleïnezuur een sequentie heeft overeenkomstig SEQ ID

20 NR.:5. i7

3. Nucleïnezuur volgens conclusie 1, waarbij de hybridisatie uitgevoerd wordt in 5,0 x SSC, 5 x Denhardt, 7% SDS, 0,5 M fosfaatbuffer, pH 7,0, 10% dextraansulfaat en 100 μg zalmsperma DNA/ml bij ongeveer 50°C-68°C, gevolgd 25 door twee wasstappen met 1 x SSC bij 68°C.

4. Recombinant-expressievector die geschikt is voor de expressie van een nucleïnezuurmolecuul volgens conclusie l.

5. Gastheercel die getransformeerd is door een 30 nucleïnezuur volgens de conclusies 1 tot 3.

6. Recombinant-polypeptide dat aan de IGF-l-receptor bindt die gecodeerd wordt door een nucleïnezuur volgens de conclusies 1 tot 3.

7. Werkwij ze voor de vorming van een eiwit dat 35 aan de IGF-1-receptor bindt, door een exogeen DNA in proka- ryotische of eukaryotische gastheercellen tot expressie te brengen en isolatie van het gewenste eiwit, waarbij het 1. i : :"·· " - 40 - eiwit gecodeerd wordt door de DNA-sequentie die weergegeven wordt in SEQ ID NR.:5 of een nucleïnezuur dat onder stringente omstandigheden hybridiseert met een nucleïnezuur dat complementair is aan het nucleïnezuur dat in SEQ ID NR.:5 5 weergegeven wordt.

8. Werkwijze voor het detecteren van het prolife-ratievermogen van een kankerrcel, omvattende a) het incuberen van een monster lichaamsvloeistof van een patiënt die aan kanker lijdt, van tumor- 10 cellen, of van een celextract of een cel superna tant van de tumorcellen, waarbij het mengsel nucleïnezuren bevat, met een nucleïnezuurprobe die gekozen wordt uit de groep van (i) het nucleïnezuur weergegeven in SEQ ID

15 NR.:1, 3 of 5 of een nucleïnezuur dat complementair daaraan is en (ii) nucleïnezuren die met één van de nucleïnezuren van (i) hybridiseren en b) het detecteren van de hybridisatie door middel van 20 een andere bindingspartner van het nucleïnezuur :/ van het monster én/of de nucleïnezuurprobe.

9. Werkwij ze volgens conclusie 7, waarbij de hybridisatie bewerkstelligd wordt met ten minste het nu-cleïnezuurfragment van SEQ ID NR. :1 of SEQ ID NR. :5 of het 25 complementaire fragment daarvan.

10. Werkwijze volgens conclusie 7 of 8, waarbij het te detecteren nucleïnezuur geamplificeerd wordt voor de detectie.

11. Werkwijze voor het screening op een verbinding 30 die de interactie tussen IGF-1R en IIP-10 remt, omvattende a) het zodanig combineren van IGF-1R- en het IIP- polypeptide met een oplossing met een kandidaat-verbinding dat het IGF-IR- en het IIP-polypeptide een complex kunnen vormen en 35 b) het bepalen van de hoeveelheid complex ten opzich te van het vooraf bepaalde bindingsniveau zonder de verbinding en daaruit het vermogen van de '1-0 1 4 8 - 41- ! verb inding vast te stellen om binding van IGF-IR met IIP te remmen.

12. Werkwijze voor de productie van een therapeutisch middel voor de behandeling van carcinomen in een 5 patiënt, omvattende het combineren van een farmaceutisch aanvaardbare drager met een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een verbinding die de interactie tussen IGF-IR en IIP-10 moduleert bij een cellulaire bepaling, waarbij bij de cellulaire bepaling tumorcellen of cellen getrans-10 fecteerd met expressieconstructen van IGF-lR en van IIP met de verbinding behandeld worden, en complexvorming tussen IGF-IR en het respectievelijke IIP geanalyseerd wordt en de mate van complexvorming in het geval van remming, onder verwijzing naar 100% voor complexvorming zonder de verbin-15 ding bij dezelfde cellulaire bepaling, 50% niet te boven gaat.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, waarbij de verbinding de interactie remt. 1. t 7 Λ 3 l KJ' i : 5 - 5 - 43 - Sequentielijst <U0> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <i2o> met IGF-1-receptor reagerende eiwitten (HP's), qenen die daarvoor coderen en toepassingen daarvan <130> Case 20273 10 <140> <141> <1S0> EP98122992.S 15 <151> 1998-12-03 <160> 10 <170> PatenCln Ver. 2.0 20 <210> 1 <211> 1707 <212> DNA <213> Homo saoiens 25 <400> 1 gaaacccaca ggaggcaacc acactagtcc agatcttctg gtgaccccac ttctcgctgc 60 tcatgccgct gggacCgggg cggcggaaaa aggcgccccc tctagtggaa aatgaggagg 120 ctgagccagg ccgtggaggg ctgggcgtgg gggagccagg gcctctgggc ggagatgggt 180 30 cggggnnccc ccaaatgggc ttncnccccc ctcccccagc cctgcggccc cgcctcgtgt 240 tccacaccca gctggcccat ggcagtccca ctggccgcat cgagggcttc accaacgtca 300 aggagctgta tggcaagatc gccgaggcct tccgcctgcc aactgcogag gtgatgttct 360 gcaccctgaa cacccacaaa gtggacatgg acaagctcct ggggggccag atcgggctgg 420 aggacttcat cttcgcccac gtgaagggdfc agcgcaagga ggtggaggtg ttcaagtcgg 480 35 aggatgcact cgggctcacc atcacggaca acggggctgg ctacgccttc atcaagcgca 540 tcaaggaggg cagcgegatc gaccacatcc acctcatcag cgtgggcgac atgatcgagg 600 ccattaacgg gcagagcctg ctgggctgcc ggcactacga ggtggcccgg ctgctcaagg 660 agctgccccg aggccgtacc ttcacgctga agctcacgga gcctcgcaag gccttcgaca 720 tgatcagcca gcgttcagcg ggtggccgcc ctggctctgg cccacaactg ggcactggcc 780 ^ 40 gagggaccct gcggctccga tcccggggcc ccgccacggt ggaggatctg ccctctgcct 840 ttgaagagaa ggccaCtgag aaggtggatg acctgctgga gagttacatg ggtatcaggg 900 acacggagct ggcagccacc atggtggagc tgggaaagga caaaaggaac ccggatgagc 960 tggccgaggc cctggacgaa cggctgggtg actttgcctt ccctgacgag ttcgtctttg 1020 acgtctgggg cgccattggg gacgccaagg tcggccgeta ctaggactgc ccccggaccc 1080 45 tgcgatgatg acccgggcgc aacctggtgg gggcccccag cagggacact gacgtcagga 1140 cccgagcctc cagcctgagc ctagctcagc agcccaagga cgatggtgag gggaggtggg 1200 gccaggcccc ctgccccgct ccactcggta ccatcccctc cctggttccc agtctggccg 1260 gggtccccgg cccccctgtg ccctgttccc cacctacctc agctgggtca ggcacaggga 1320 ggggagggat cagccaaatt gggcggccac ccccgcctcc accacCttcc accatcagct 1380 50 gccaaactgg tccctctgtc tccctggggc cttgggttct gtttgggggt catgaccttc 1440 ctagtttcct gacgcaggga atacagggga gagggctgtc cttcccccca gcaaatgcaa 1500 taatgccctc acccctcctg agaggagccc cctccctgtg gagcctgtta cctccgcatt 1560 tgacacgagt ctgctgtgaa ccccgcaacc tcctccccac ctcccatctc tccttccagg 1620 cccatccctg gcccagagca ggagggaggg agggacgatg gcggtgggtt tttgtatctg 1680 55 aatttgctgt cttgaacata aagaatc 1707 <210> 2 <211> 333 <212> PRT i η 1 ' 7 A $· - 44 - <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Leu Gly Leu Gly Arg Arg Lys Lys Ala Pro Pro Leu Val Glu 5 1 S 10 15 Asn Glu Glu Ala Glu Pro Gly Arg Gly Gly Leu Gly Val Gly Glu Pro 20 25 30

10 Gly Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Xaa Pro Gin Met Gly Xaa Xaa 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Ala Leu Arg Pro Arg Leu Val Phe His Thr Gin Leu 50 55 60 15 Ala His Gly Ser Pro Thr Gly Arg He Glu Gly Phe Thr Asn Val Lys 65 70 75 80 Glu Leu'Tyr Gly Lys lie Ala Glu Ala Phe Arg Leu Pro Thr Ala Glu 20 85 90 95 Val Met Phe Cys Thr Leu Asn Thr His Lys Val Asp Met Asp Lys Leu 100 105 110

25 Leu Gly Gly Gin lie Gly Leu Glu Asp Phe He Phe Ala His Val Lys 115 120 125 Gly Gin Arg Lys Glu Val Glu Val Phe Lys Ser Glu Asp Ala Leu Gly 130 135 140 30 Leu Thr He Thr Asp Asn Gly Ala Gly Tyr Ala Phe He Lys Arg He 145 150 155 160 Lys Glu Gly Ser Val lie Asp His He His Leu He Ser Val Gly Asp 35 165 170 175 Met He Glu Ala lie Asn Gly Gin Ser Leu Leu Gly Cys Arg His Tyr 180 185 190 ^

40 Glu Val Ala Arg Leu Leu Lys Glu Leu Pro Arg Gly Arg Thr Phe Thr 195 ’ 200 205 Leu Lys Leu Thr Glu Pro Arg Lys Ala Phe .Asp Met He Ser Gin Arg 210 215 220 45 Ser Ala Gly Gly Arg Pro Gly Ser Gly Pro Gin Leu Gly Thr Gly Arg 225 230 235 240 Gly Thr Leu Arg Leu Arg Ser Arg Gly Pro Ala Thr Val Glu Asp Leu 50 245 250 255 Pro Ser Ala Phe Glu Glu Lys Ala lie Glu Lys Val Asp Asp Leu Leu 260 265 270

55 Glu Ser Tyr Met Gly He Arg Asp Thr Glu Leu Ala Ala Thr Met Val 275 280 285 Glu Leu Gly Lys Asp Lys Arg Asn Pro Asp Glu Leu Ala Glu Ala Leu 290 295 300 Λ G 1 37 4 8 - 45 - Asp Glu Arg Leu Gly Asp Phe Ala Phe Pro Asp Glu Phe Val Phe Asp 305 310 315 320

5 Val Trp Gly Ala lie Gly Asp Ala Lys Val Gly Arg Tyr 325 330 <210> 3 10 <211> 380 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 15 gccgaggaag gagaaggggc taaaccttgg agagtggatg gctcaaagga ttctcagatc 60 acacctcggg aggatcatgg gcaggagagc ctgtcggcag ggctccacgg aacgcatcca 120 ccaaagacaa ggcagaaagt cactgcccaa gccggaggcc ccggggatcc catgcttttc 180 tcaaccccag agacagatga gaagcttttt atatgtgcgc agtgtggcaa aaccttcaac 240 aatacctcca acctgagaac gcaccagcgg atccacactg gcgagaagcc ctacatgtgt 300 20 tccgagcgtg gcaagagttt ctcccggagc tccaaccgca tccggcacga gcgcatccac 360 ctggaagana agcactctga 380 <210> 4 <211> 126 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Glu Glu Gly Glu Gly Ala Lys Pro Trp Arg Val Asp Gly Ser Lys 30 1 5 10 15 Asp Ser Gin lie Thr Pro Arg GM Asp His Gly Gin Glu Ser Leu Leu 20 25 30

35 Ala Gly Leu His Gly Thr His Pro Pro Lys Thr Arg Gin Lys Val Thr 35 40 45 Ala Gin Ala Gly Gly Pro Gly Asp Pro MeC Leu Phe Ser Ser Pro Glu 50 55 60 40 Thr Asp Glu Lys Leu Phe lie Cys Ala Gin Cys Gly Lys Thr Phe Asn 65 70 75 80 Asn Thr Ser Asn Leu Arg Thr His Gin Arg lie His Thr Gly Glu Lys 45 85 90 95 Pro Tyr Met Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ser Ser Asn 100 105 110

50 Arg lie Arg His Glu Arg lie His Leu Glu Xaa Lys His Ser 115 120 125 <210> 5 55 <211> 678 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 1Ü i - ^ - « - 46 - atgecgagac cccggaagag gctggctggg acttctggtt cagacaaggg actatcagga 60 aaacgcacca aaactgagaa ctcaggtgag gcattagcta aagtggagga ctccaacccC 120 cagaagactt cagccactaa aaactgtttg aagaatctaa gcagccactg gctgatgaag 180 tcagagccag agagccgcct agagaaaggt gtagatgtga agttcagcat tgaggatctc 240 5 aaagcacagc ccaaacagac aacatgctgg gatggtgttc gtaactacca ggctcggaac 300 ttccttagag ccatgaagct gggagaagaa gccttcttct accatagcaa ctgcaaagag 360 ccaggcatcg caggactcat gaagatcgtg aaagaggctt acccagacca cacacagttt 420 gagaaaaaca atccccatta tgacccatct agcaaagagg acaaccctaa gtggtccatg 480 gtggatgtac agtttgttcg gatgatgaaa cgtttcattc ccctggctga gctcaaatcc 540 10 tatcatcaag ctcacaaagc tactggtggc cccttaaaaa atatggttct cttcactcgc 600 cagagattat caatccagcc cctgacccag gaagagtttg actttgtttt gagcctggag 660 gaaaaggaac caagttaa 678 <210> 6 15 <211> 225 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

20 Met Ser Arg Pro Arg Lys Arg Leu Ala Gly Thr Ser Gly Ser Asp Lys 15 10 IS Gly Leu Ser Gly Lys Arg Thr Lys Thr Glu Asn Ser Gly Glu Ala Leu 20 25 30 25 Ala Lys Val Glu Asp Ser Asn Pro Gin Lys Thr Ser Ala Thr Lys Asn 35 40 45 Cys Leu Lys Asn Leu Ser Ser His Trp Leu Met Lys Ser Glu Pro Glu 30 50 55 60 Ser Arg Leu Glu Lys Gly Val Astf./Val Lys Phe Ser He Glu Asp Leu 65 70 75 80

35 Lys Ala Gin Pro Lys Gin Thr Thr Cys Trp Asp Gly Val Arg Asn Tyr 85 90 95 Gin Ala Arg Asn Phe Leu Arg Ala Met Lys Leu Gly Glu Glu Ala Phe 100 105 110 40 Phe Tyr His Ser Asn Cys Lys Glu Pro Gly lie Ala Gly Leu Met Lys 115 120 125 lie Val Lys Glu Ala Tyr Pro Asp His Thr Gin Phe Glu Lys Asn Asn 45 130 135 140 Pro His Tyr Asp Pro Ser Ser Lys Glu Asp Asn Pro Lys Trp Ser Met 145 150 155 160

50 Val Asp Val Gin Phe Val Arg Met Met Lys Arg Phe lie Pro Leu Ala 165 170 175 Glu Leu Lys Ser Tyr His Gin Ala His Lys Ala Thr Gly Gly Pro Leu 180 185 190 55 Lys Asn Met Val Leu Phe Thr Arg Gin Arg Leu Ser lie Gin Pro Leu 195 200 205 10 1 : r4 8 — 47 - Thr Gin Glu Glu Pha Asp Phe Val Leu Ser Leu Glu Glu Lys Glu Pro 210 215 220 Ser 5 225 <210> 7 <211> 18 10 <212> DNA <2i3> kunstmatige sequentie <220> <223> beschrijving van kunstmatige sequentie: 13 <4oo> 7 primer TIP2c-s gaaacccaca ggaggcaa 18 <210> 8 20 <211> 18 <212? DNA <2i3> kunstmatige sequentie <220? 25 <223> beschrijving van kunstmatige sequentie: <4oo> a primer TIP2b-r ggtcatcatc gcagggtc 18 30 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> kunstmatige sequentie 35 <220? <223> beschrijving van kunstmatige sequentie: <400> 9 primer Hcthy-s agcttgcggc cgcagatgtc gagaccccgg aag 23 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <2i3> kunstmatige sequentie 45 <220? <223? beschrijving van kunstmatige sequentie: <,oo> l0 primer Hcthy-r 50 agcttgcggc cgcgaattct taacttggtt ccttttcctc 40 \ ο ΐ . ^ J