FI87216B - Foerfarande foer framstaellning av en hoegervridande enantiomer av metyl-alfa-5-(4,5,6,7-tetrahydro (3,2-c) tienopyridyl)-(2-klorfenyl) acetat. - Google Patents

Description

87216

Metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tetrahydro(3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)asetaatin oikealle kiertävän enantiomee-rin valmistusmenetelmä 5 Tämä keksintö koskee metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tetra hydro (3,2-c)tienopyridyyli)-(kloorifenyyli)asetaatin oikealle kiertävän enantiomeerin valmistusmenetelmää.

Keksinnön yhdiste vastaa seuraavan kaavan (I) mukaista yhdistettä: 10 COOCH3

uO XJ

15 jossa C* on asymmetrinen hiiliatomi. Tämä kaava esittää itse asiassa sekä patenttivaatimusten mukaista, oikealle kiertävää molekyyliä että sen vasemmalle kiertävää enan- 20 tiomeeriäkin. Tätä kaavaa vastaava raseeminen seos kuvattiin FR-patenttihakemuksessa, joka on julkaistu nrolla 2 530 247. Tästä eteenpäin keksinnön patenttivaatimusten ... mukaista, oikealle kiertävää enantiomeeriä merkitään (Idillä ja vasemmalle kiertävää enantiomeeriä (I^):llä.

: 25 Tiedetään, että yhdisteen optinen kiertokyky riip- :"*· puu liuottimesta, jossa se mitataan ja yhdisteen pitoisuu- desta tässä liuottimessa. Keksinnön mukaisen, oikealle kiertävän isomeerin optinen kiertokyky on positiivinen metanolisessa liuoksessa.

. . 30 Vain oikealle kiertävällä enantiomeerillä (1^) on yllättäen verihiutaleiden aggregaatiota estävää vaikutusta, vasemmalle kiertävä enantiomeeri (1^) on tehoton. Lisäksi inaktiivista, vasemmalle kiertävää enantiomeeriä (1^) siedetään huonommin näistä kahdesta enantiomeeristä.

. . 35 Keksintö koskee myös kaavan (I^) mukaisten yhdis- teiden additiosuoloja farmaseuttisesti hyväksyttävien mineraali- tai orgaanisten happojen kanssa.

2 87216

Yhdiste (1^) on öljyä, kun taas sen hydrokloridi on valkoista jauhetta, öljytuotteet on tavallisesti vaikea puhdistaa ja näin farmaseuttisten koostumusten valmistamiseen on edullista käyttää kiteisiä tuotteita, jotka voi-5 daan puhdistaa tavallisesti uudelleen kiteyttämällä.

Kyseessä olevassa tapauksessa on kuitenkin huomattu, että jotkut yhdisteen (1^) suoloista saostuvat tavallisesti amorfisessa muodossa ja/tai ovat hygroskooppisia, ominaisuus, minkä vuoksi niitä on vaikea käsitellä teol-10 lisessa mittakaavassa. Siten on valmistettu farmasiassa perinnäisesti käytettyjen karboksyyli- ja sulfonihappojen suoloja, happojen, kuten etikka-, bentsoe-, maleiini-, sitruuna-, viini-, gentisiini-, metaanisulfoni-, etaani-sulfoni- ja lauryylisulfonihapon yhtä hyvin kuin dobesii-15 lihapon (sp. 70°C) ja para-tolueenisulfonihapon (sp. 51°C) suolojen puhdistaminen on osoittautunut vaikeaksi.

Kaavan (1^) mukaisen yhdisteen oikealle kiertävän isomeerin mineraali- ja orgaanisten happosuolojen joukosta on löydetty suoloja, jotka kiteytyvät helposti, eivät 20 ole hygroskooppisia ja ovat riittävän vesiliukoisia tekemään niiden käytön vaikuttavana, lääkeaineosana erityisen hyödylliseksi.

Tämä keksintö koskee siten erityisemmin metyyli-: alfa-5-(4,5,6,7-tetrahydro(3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloo- : "·· 25 rifenyyli) asetaatin oikealle kiertävän enantiomeerin vety- : sulfaattia, taurokolaattia ja hydrobromidia.

Nämä suolat valmistetaan tavallisella tavalla antamalla vastaavan hapon vaikuttaa liuoksessa olevaan emäkseen liuottimessa, josta ne saostuvat itsestään tai ; 30 sen jälkeen, kun on lisätty liuotinta, johon suola ei liu- I-.' kene.

Metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tetrahydro(3,2-c)tienopy-• ridyyli) - (2-kloorifenyyli) asetaatin oikealle kiertävä iso- t : meeri voidaan valmistaa muodostamalla raseemisen yhdisteen : 35 suola liuottimessa optiivisesti aktiivisen hapon kanssa, kiteyttämällä suola toistuvasti uudelleen, kunnes 3 87216 saadaan tuote, jonka optinen kiertokyky on vakio, minkä jälkeen oikealle kiertävä isomeeri vapautetaan suolastaan emäksen avulla; jos on tarpeen, suola muodostetaan oikealle kiertävän isomeerin ja farmaseuttisesti hyväksyttävän ha-5 pon kesken.

Optisesti aktiivinen happo voi olla edullisesti vasemmalle kiertävä kamferi-10-sulfonihappo.

Suolan muodostamiseen ja uudelleen kiteyttämiseen voidaan käyttää yhtä ja samaa liuotinta: asetoni sopii 10 tässä tapauksessa ihanteellisesti.

Kaavan (11^) mukaisen, kiraalisen, vasemmalle kiertävän kamferi-10-sulfonihapon annetaan reagoida inertissä liuottimessa kaavan (I) mukaisen raseemisen seoksen kanssa seuraavan reaktiokaavion mukaisesti: 15

H*° /»J

Y » cCr5o * —’fcöto | io, \ I11*

20 (Il I 9 I

V w n. / «n.» > \ (II vasemmalle kiertävä) \ / 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Suolan muodostaminen voidaan toteuttaa liuottimissa, kuten 2 esimerkiksi alkoholit, ketonit, dimetyyliformamidi. Suola 3 saostuu itsestään tai se eristetään poistosuolauksella tai 4 haihduttamalla liuotin. Muodostuu kaavan (lila) mukaista, 5 kahden diastereoisomeerin seosta. Toistuvilla uudelleen 6 kiteytyksillä liuottimessa, kuten asetonissa, saostuma ri 7 kastetaan yhdisteen (I) oikealle kiertävän isomeerin suo 8 laksi. Jokaisen uudelleen kiteytyksen jälkeen saostuman 9 optinen kiertokyky mitataan metanolissa 20°C:ssa 10 konsentraationa, joka vaihtelec välillä 1,5-2 g/100 ml.

11

Kun A\/ lakkaa suurenemasta, kaavan (lp) mukainen emäs vapautetaan suolasta (lila) antamalla emäksen, kuten nat- 4 87216 rium- tai kaliumvetykarbonaatin vaikuttaa vesipitoisessa väliaineessa lämpötiloissa, jotka vaihtelevat 5 - 20°C:n välillä. Ensimmäisestä uudelleen kiteyttämisestä (IV) saadun suodoksen haihduttamisesta, sen jälkeen kun saostuneen 5 suolan (lila) kiteet on suodatettu pois, saadaan seos, joka on rikastunut enantiomeerin (1^) suolaksi. Tämän diaste-reoisomeerisuolojen seoksen tekeminen emäksiseksi heikon emäksen, kuten esimerkiksi natrium- tai kaliumvetykarbonaatin, vesiliuoksella lämpötiloissa, jotka vaihtelevat 10 5 - 20°C:n välillä, johtaa kahden enantiomeerin (I,) ja d (1^) seokseen, joka on rikastunut vasemmalle kiertäväksi enantiomeeriksi (1-^) .

Tämän seoksen (1^) + (1^), joka on rikastunut enantiomeeriksi (1^), annetaan reagoida liuottimessa oikealle 15 kiertävän kamferi-10-sulfonihapon kanssa, jota merkitään (Il^zllä, seuraavan reaktiokaavion mukaisesti: "ΛΛ * j°* M «»»s 20 C, ♦ <U> ♦ -’(OÖtO ) jossa on (I^):tä < ylimäärin lil^l 1 (oikealle kiertävä II) ® j ***** 1¾ i

Diastereoisomeerisuolojen (Illb) kiteinen seos, joka saadaan, kiteytetään uudelleen asetonista, kunnes saostuman 20 optinen kiertokyky /x/D pysyy vakiona. Kuten aikaisemmin 30 mainittiin, diastereoisomeerisuolan (Illb) optinen kierto-20 kyky L<\1 D määritetään jokaisen uudelleen kiteytyksen jälkeen .

Stereoisomeeri (1^) vapautetaan suolastaan tavallisella tavalla, kuten yhdisteen (1^) kohdalla käytetyllä 35 tavalla. Vasemmalle kiertävää kamferi-10-sulfonihappoa (II^) voidaan saada kaupallisesti saatavissa olevasta, 8721 6 kaavan (V) mukaisesta ammoniumkamferi-10-sulfonaatista reaktiokaavion mukaisesti: -<r- „ -4· r" tvl (Πι, 10

Ammoniumsuolan (V) vesiliuos kromatografoidaan Amberlite IRN-77 hartsilla. Eluaatin lyofilisoinnin (kylmäkuivaus) jälkeen saadaan kaavan (11^) mukainen kamferi-10-sulfoni-happo talteen.

15 Menetelmän koko ketju esitetään seuraavassa kaava maisesti : , 87216

O

(I) ♦ (Ilf) asetoni p— —— — —— -η tehdään 5 <ΣΣΖ«}·*Ι Liuos (^j^emäksiseksi (Id) + (It} I 1 , τ λ vesipitoisel- v1^ ylimäärin la NaHCCyila +(IId) asetoni uudelleen kiteyttäminen asetoni 10 l ^ (III·) puhdasta (Illb) uudelleen ki- _ ...... ... , . teyttäminen tehdään emäksiseksi vesipitoisella NaHCO :11a , asetoni 15 (Illb) puhdasta Ξ tehdään emäk siseksi vesipitoisella oikealle kiertävä ^ NaHCO., :11a 20 enantiomeeri _ ->

El vasemmalle kiertävä enantiomeeri 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2

Kumpikin puhtaista enantiomeereistä (1^) ja (1^) 3 voidaan muuttaa suolaksi perusmenetelmien avulla: esimer 4 kiksi hydrokloridit valmistetaan lisäämällä liuosta, jos 5 sa on vetykloridikaasua dietyylieetterissä, liuokseen, 6 jossa on (1^):tä tai (1^):ää dietyylieetterissä.

7

Oikealle kiertävän (I,) ja vasemmalle kiertävän 8 d 9 (1^) enantiomeerin enantiomeerisen puhtauden määrittäminen____ 10

On käytetty kahta menetelmää: 11 - protoni-NMR-spektroskopia lisäämällä kiraalista, harvinaista maametallia 7 87216 - korkeapainenestekromatografia käyttäen koraalista stationaarifaasia.

a) Protoni-NMR-spektroskopia lisäämällä koraalista, harvinaista maametallia 5 Enantiomeerinen puhtaus (optinen puhtaus) määritet tiin 60 MHz:n ^HNMR-spektroskopialla koraalisen, harvinaisen maametallikompleksin läsnä ollessa G.M. WHITESIDES et al:n (J. Am. chem. Soc. 96, 1974, 1038) kuvaaman menetelmän mukaisesti.

10 Raseemisessa tuotteessa (I) asymmetriakeskukseen liittyvä, esteriryhmään nähden cx-asemassa oleva vety tulee näkyviin singlettinä, kemiallinen siirtymä 6 = 4,87 ppm CDCl^ liuottimena. Harvinaisen maametallikompleksin,

Eu(tfc)2I Ztris-3-(trifluorimetyylihydroksimetyleeni)-d-15 kamforaattoeuropium(111)7 lisääminen näytelaitteeseen, jossa on raseemisen (I) :n liuosta CDCl^ssa, johtaa alkuperäisen singleton erottumiseen kahdeksi, hyvin erottuvaksi singletiksi, jotka vastaavat kummankin kahden enantio-meerin (1^) ja (I^) protonia. Kun moolisuhde harvinainen 20 maametallikompleksi/yhdiste (I) = 0,4, ero kahden single-tin välillä on noin 6 Hz.

Kumpaankin kahdesta valmistetusta enantiomeeristä, (1^) ja (I-^) , käytettiin samanlaista menetelmää kuin ra-semaatiin (I). Pienempi kemiallinen siirtymä vastaa oi-25 kealle kiertävän enantiomeerin (1^) protonia ja suurempi kemiallinen siirtymä vasemmalle kiertävän enantiomeerin (I2) protonia.

Menetelmän tarkkuus määritettiin vertaamalla kummastakin kahdesta enantiomeeristä (1^) ja (1^) puhtaassa 30 olomuodossa tai seoksina, joissa oli toista enantiomeeriä suurenevat määrät, saatuja 60 MHz:n 1HNMR-spektrejä, jotka ajettiin lisäämällä harvinaisen maametallin kompleksia tai ilman sitä. Huomattiin, että toisen enantiomeerin läsnä ollessa toinen enantiomeeri, jota oli enemmän kuin 35 5 paino-%, voitiin havaita helposti.

8 8721 6 b) Korkeapainenestekromatografia käyttäen koraalista satiomaarifaasia

Tutkimus suoritettiin nestekromatografiällä HP-1084 käyttäen UV-detektoria aallonpituudella 215 nm. Kiraali-5 nen stationaarifaasi oli DEAE-silikageeli (10 ^um), johon oli ympätty alfa-l-happoglykoproteiinia (0,4 x 100 mm) (ENANTIOPAC R-LKB). Liikkuva faasi koostui vesipitoisesta fosfaattipuskuriseoksesta, 8 mM (NaH2pO^/Na2HPO^), jossa oli 0,1 M NaCl ja jonka pH oli säädetty 7,4:ään ja 15-%:is-10 ta isopropanolia (v/v). Virtausnopeus oli asetettu 0,3 ml:ksi/min ja kolonnin lämpötila pidettiin 18 - 20°C:ssa. Oikealle kiertävän enantiomeerin (1^) retentioaika on näissä olosuhteissa 45 minuuttia ja vasemmalle kiertävän enantiomeerin (1^) retentioaika 35 minuuttia.

15 Kahden enantiomeerin optisen puhtauden määrittämi sen tarkkuus arvioitiin kromatografoimalla kumpikin kahdesta valmistetusta enantiomeeristä (Id) ja UI^) joko yksinään tai seoksena, jossa toista enantiomeeriä oli suurenevat määrät. Huomattiin, että oli helppo havaita: 20 - 2 % (paino/paino) enantiomeeriä (Id) enantiomee- rissä (1^) - 4 % (paino/paino) enantiomeeriä 1^) enantiomee-rissä (Id).

Näiden edellytysten nojalla voidaan tehdä se johtopäätös, 25 että kahden enantiomeerin (Id) ja (1^) optinen puhtaus, joka on saatu esimerkkien mukaan, on vähintään 96 % oikealle kiertävän enantiomeerin Id> kohdalla ja vähintään 98 % vasemmalle kiertävän enantiomeerin (1^) kohdalla.

Seuraavat esimerkit eivät ole rajoittavia, vaan 30 ne esitetään tämän keksinnön havainnollistamiseksi. Esimerkki 1

Oikealle kiertävän metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tetra-hydro(3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)ase-taatin suolat 35 a) Vasemmalle kiertävä kamferi-10-sulfonihappo

Amberlite IRN -hartsista valmistetaan kolonni ja se käsitellään päästämällä sen läpi 1 M:sta vetykloridi- 8721 6 9 happoa ja pesemällä sitten tämä happamaksi tehty hartsi-kolonni runsaalla vedellä. Vasemmalle kiertävä ammonium-kamferi-10-sulfonaatti liuotetaan mahdollisimman pieneen määrään vettä ja sijoitetaan aikaisemmin valmistettuun 5 hartsikolonniin. Eluointi suoritetaan vedellä. Hapon sisältävät eluoituvat fraktiot lyofilisoidaan.

Valkoisia kiteitä, sp. 198°C; /oc7p^ = -20,53 (c = 2,075 g/100 ml vettä).

b) Metyyli-aifa-5-(4,5,6,7-tetrahydro(3,2-c)tie-10 nopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)asetaatin kamferi-10-sulfo-nihapon suola (SR 25990 B) 32 g (0,0994 mol) raseemista metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tetrahydro(3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)asetaat-tia liuotetaan 150 mlraan asetonia. 9,95 g (0,0397 mol) 15 vasemmalle kiertävää kamferi-10-sulfonihappomonohydraat-tia lisätään. Kirkas liuos jätetään seisomaan huoneen lämpötilaan. 48 tunnin kuluttua on muodostunut joitakin kiteitä. Reaktioseos väkevöidään 50 ml:ksi ja jätetään seisomaan huoneen lämpötilaan 24 tunniksi. Saadut kiteet 20 suodatetaan pois, pestään asetonilla ja kuivataan (saanto: 55 % lähtörasemaatin perusteella).

Valkoisia kiteitä, sp. 165°C; /c*/^ 0 +24,67 (c = 1,58 g/100 ml metanolia).

Edellä saadut kiteet liuotetaan uudelleen mahdol-25 lisimman pieneen määrään kiehuvaa asetonia (50 ml). Jäähdyttämisen jälkeen saatavat kiteet suodatetaan pois, pestään asetonilla ja kuivataan (saanto: 88 %).

Valkoisia kiteitä, sp. 165°C; /of/^ = +24,75 (c = 1,68 g/100 ml metanolia).

30 c) Oikealle kiertävä metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tet rahydro (3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)asetaatti 12 g (0,022 mol) kohdassa b) saatua puhdasta tuotetta liuotetaan mahdollisimman pieneen määrään vettä.

Sen jälkeen kun saatu liuos on jäähdytetty 5°C:seen, se 35 tehdään emäksiseksi natriumvetykarbonaatin kyllästetyllä vesiliuoksella. Emäksistä vesifaasia uutetaan dikloori- 10 8721 « metaanilla. Orgaaniset uutokset kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla. Kun liuotin haihdutetaan, saadaan vä- - 20 ritöntä öljyä (kvantitatiivinen saanto). öljyä, = +51,52 (c = 1,61 g/100 ml metanolia).

5 d) Metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tetrahydro(3,2-c)tieno pyridyyli) -( 2-kloorifenyyli) asetaatin (oikealle kiertävä) hydrokloridi (SR 25990 A) 7 g (0,0228 mol) oikealle kiertävää metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tetrahydro(3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyy-10 li)asetaattia liuotetaan 100 ml:aan dietyylieetteriä. Lisätään 30 ml liuosta, jossa on 1 M HCl dietyylieetterissä ja saadut kiteet suodatetaan pois. Kiteet pestään dietyy-lieetterillä ja kuivataan (saanto: 94 %).

Valkoisia kiteitä, sp. 117°C; = +62,23 (c = 15 1,82 g/100 ml metanolia).

e) Oikealle kiertävän metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tetrahydro (3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)asetaatin vetysulfaatti (SR 25990 C) 800 ml natriumvetykarbonaatin kyllästettyä vesi-20 liuosta lisätään suspensioon, jossa on 200 g SR 25990 B:tä 800 ml:ssa dikloorimetaania. Voimakkaan sekoittamisen jälkeen orgaaninen faasi erotetaan, kuivataan natriumsulfaatilla ja liuotin poistetaan alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan 500 ml:aan jääkylmää asetonia ja 20,7 ml 25 väkevää rikkihappoa (93,64 %, d = 1,83) lisätään tipoittaan. Muodostunut saostuma eristetään suodattamalla ja pestään 1 000 ml:11a asetonia, sitten kuivataan vakuumis-sa 50°C:ssa.

Näin saadaan 139 g analyyttisesti puhtaita, valkoi- 30 siä kiteitä, joiden sulamispiste on 184°C. Empiirinen 20 kaava: C16H16C1N02S x H2S04, = +55,10 (c = 1,891 g/100 ml metanolia).

8721 6 11 f) Oikealle kiertävän metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tet-rahydro(3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)asetaatin hydrobromidi (SR 25990 D)

Suspensioon, jossa on 20 g SR 25990 B:tä 200 ml:ssa 5 dikloorimetaania, lisätään 150 ml natriumvetykarbonaatin vesiliuosta. Orgaanisen faasin erottamisen, liuottimen kuivaamisen ja haihduttamisen jälkeen saatu jäännös liuotetaan 150 ml:aan dietyyli- tai di-isopropyylieetteriä ja siihen lisätään tipoittain 4,4 ml 48-%:ista (w/v) vety-10 bromidihapon vesiliuosta. Muodostunut saostuma eristetään. Kuivaamisen jälkeen saadaan 14,4 g kiteitä, joiden sulamispiste on 111°C (saanto 99 %).

13,4 g näistä kiteistä kiteytetään uudelleen seoksesta, jossa on isopropyylieetteriä (100 ml) ja isopropa-15 nolia (150 ml), jolloin saadaan 10,2 g analyyttisesti puhdasta hydrobromidia: sp. 140°C; empiirinen kaava: 90 C16H16C1N°2S X HBr' = +59'23 ic = 2'09 g/100 ml me- tanolia).

g) Oikealle kiertävän metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tet-20 rahydro(3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)asetaatin taurokolaatti (SR 25990 E)

Taurokoolihapon natriumsuola kromatografoidaan Amberlite-IRN-77-hartsilla vedellä eluoiden. Saadut fraktiot lyofilisoidaan.

25 3 g (0,0054 mol) SR 25990 B:tä käsitellään natrium vetykarbonaatin kyllästetyllä vesiliuoksella ja seosta uutetaan dikloorimetaanilla. Orgaaninen faasi erotetaan, kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan kuiviin. Saatu vapaa emäs otetaan 30 ml:aan isopropanolia; tähän liuok-30 seen lisätään 2,8 g (0,0054 mol) taurokoolihappoa liuotettuna 100 ml:aan isopropanolia. Seosta sekoitetaan yön yli huoneen lämpötilassa, sitten se haihdutetaan kuiviin.

Jäännös kiteytyi hierrettäessä sitä eetterillä. Saadaan 3,5 g beigenvärisiä kiteitä. Sp. 120°C, = +39,53 35 (c = 1,791 g/100 ml metanolia) . C^gH^ClN02S x C26H45N07S; C-, H-, N-analyysit sopusoinnussa teorian kanssa.

i2 87216

Esimerkki 2

Vasemmalle kiertävän metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tetra-hydro(3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)ase-taatin suolat 5 a) d-kamferi-10-sulfonihapon suola (SR 25989 B)

Sen jälkeen kun esimerkissä 1-b SR 25990 B on erotettu, saadusta asetonisuodoksesta haihdutetaan liuotin.

Jäännös otetaan veteen ja dietyylieetteriin. Eet-terifaasi dekantoidaan. Vesifaasi jäähdytetään 5°C:seen 10 ja tehdään emäksiseksi natriumvetykarbonaatin kyllästetyllä vesiliuoksella. Emäksistä vesifaasia uutetaan dietyy-lieetterillä. Eetteriuutokset yhdistetään ja kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla.

Haihduttamalla liuotin saadaan öljyä, joka puhdis-15 tetaan suodattamalla se silikageelikerroksen läpi (eluent-ti: dietyylieetteri). Tästä on saantona väritöntä Öljyä, joka on seosta, jossa on noin 65 % vasemmalle kiertävää enantiomeeriä ja 35 % oikealle kiertävää enantiomeeriä, suhteet määritettiin 60 MHz:n ^HNMR-spektroskopialla ki-20 raalisen, harvinaisen maametallin kompleksin lisäämisen jälkeen.

16,66 g (0,0517 mol) näin saatua seosta liuotetaan 70 ml:aan asetonia. 7,77 g (0,0310 mol) oikealle kiertävää kamferi-10-sulfonihappomonohydraattia lisätään. Homogee-25 ninen seos jätetään seisomaan yön yli huoneen lämpötilaan. Saadut kiteet suodatetaan pois, pestään asetonilla ja kuivataan (saanto: 44 % seokseen perustuen).

Saadut kiteet liuotetaan mahdollisimman pieneen määrään asetonia (60 ml), jota keitetään palautusjäähdyt-30 täjällä varustetussa kolvissa. Saostuma, joka saadaan jäähdytettäessä huoneen lämpötilaan, suodatetaan pois, pestään asetonilla ja kuivataan. Valkoisia kiteitä, sp. 167°C, /o(7q^ = -24,85 (c = 1,79 g/100 ml metanolia) .

i3 8721 6 b) vasemmalle kiertävä metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tet-rahydro(3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)asetaatti 11,3 g (0,0204 mol) a):ssa saatua kamferi-10-sul-fonaattia liuotetaan mahdollisimman pieneen määrään vettä.

5 Saatu vesiliuos jäähdytetään 5°C:seen ja tehdään emäksiseksi natriumvetykarbonaatin kyllästetyllä vesiliuoksella. Emäksistä vesifaasia uutetaan dikloorimetaanilla. Orgaaninen liuos kuivataan ja liuotin haihdutetaan. Eristetään väritöntä öljyä (kvantitatiivinen saanto).

on 10 öljyä, = -50,74 (c = 1,58 g/100 ml metano- lia) .

c) Vasemmalle kiertävän metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tetrahydro(3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)asetaa-tin hydrokloridi (SR 25989 A) 15 Valmistettu esimerkissä Id) kuvatun menetelmän mu kaisesti. Saanto 94 %.

Valkoisia kiteitä, sp. 117°C, /«y^0 = -62,56 (c = 1,80 g/100 ml metanolia).

d) Vasemmalle kiertävän metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-20 tetrahydro(3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)asetaa- tin vetysulfaatti (SR 25989 C) 70 g (0,126 mol) saatua kamferisulfonaattia SR 25989 B käsitellään, kuten edellä a):ssa on kuvattu natriumvetykarbonaatin kyllästetyllä vesiliuoksella dikloori-25 metaanin läsnä ollessa. Orgaaninen faasi erotetaan, kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan kuiviin. Jäännös otetaan 300 ml:aan asetonia ja 7,2 ml (0,126 mol) väkevää rikkihappoa lisätään tipoittain. Sekoittamisen jälkeen muodostuneet kiteet suodatetaan erilleen ja pestään aseto-30 nilla. Saadaan 47,8 g valkoisia kiteitä, sp. 182°C, = -51,61 (c = 2,044 g/100 ml metanolia). Analyysit (C, H, N) ovat sopusoinnussa teorian kanssa.

Farmakologinen tutkimus Näiden uusien yhdisteiden verihiutaleiden aggre-35 gaatiota estävää vaikutusta ja toksisuutta verrattiin 14 87216 FR-patentissa nro 82 12 599 (julkaisu-nro 2 530 247) kuvatun raseemisen seoksen vastaaviin ominaisuuksiin.

Nyt esitetään tämän tutkimuksen tulokset, jotka osoittavat vielä yhden keksinnön edun, nimittäin sen, että 5 oikealle kiertävän isomeerin suoloilla on parempi terapeuttinen indeksi kuin raseemisen seoksen suolalla; itse asiassa vasemmalle kiertävä isomeeri ei estä lähes ollenkaan verihiutaleiden aggregaatiota ja se on huomattavasti tok-sisempi kuin oikealle kiertävä homologi.

10 Yhdisteiden verihiutaleiden aggregaatiota estävät vaikutukset ja hyytymistä estävät (antitromboottiset) vaikutukset tutkittiin rotalla perusmenetelmin.

ADP:n tai kollageenin vaikutus verihiutaleiden aggregaatioon määritettiin ex vivo.

15 Tuotteet, jotka oli liuotettu etanoliin (200 mg/ml) ja laimennettu arabikumia (5 % w/v) sisältävällä vedellä, annettiin oraalisesti viiden, CD-COBS-kantaa olevan naa-rasrotan, jotka painoivat 250 - 300 g, ryhmille kaksi tuntia ennen verinäytteiden ottamista 10 ml:n suspensiomääri-20 nä kg kohti.

Verinäytteet otettiin dietyylieetterillä nukutetuilta eläimiltä vatsa-aortan punktiolla ja pantiin 3,8-%:iseen natriumsitraatin vesiliuokseen (1 tilavuus/ 9 tilavuutta verta). Sitten plasma, jossa verihiutaleita 25 oli runsaasti, eristettiin sentrifugoimalla 200 g:ssä 10 minuuttia.

Aggregaatio aiheutetaan lisäämällä 2 ^ul aggregoi-vaa liuosta 400 ^ul:aan verihiutalepitoista plasmaa. Käytetyt aggregoivat liuokset olivat: Boehringer Mannheimin 30 myymä, ADP:n 500 ^uM:nen vesiliuos (lopullinen konsentraa-tio 2,5 yUM) ja kollageeniliuos, jota Sigma (tyyppi 1) markkinoi konsentraationa 0,25 g/100 ml 3-%:isessa (v/v) etikkahapossa (lopullinen konsentraatio 12,5 ^ug/ml).

Verihiutaleiden aggregoitumista tarkkailtiin C.V.R.

35 Born’in Naturessa 194 (1967), s. 927 kuvaamalla menetel- 15 &72Ϊ6 mällä käyttäen Coultronics aggregometriä 37°C:n lämpötilassa ja 900 rpm:n sekoituksessa.

ADP:n aiheuttamalle aggregaatiolle aggregometri muodostaa käyrän, joka kuvaa verihiutaleiden aggregaatio-5 ta optisen tiheyden (absorbanssi) muutoksen avulla mitattuna. Tämän käyrän korkeus määritellään aggregaation korkeudeksi. Aggregaatioprosentti on suhde mitatun aggregaation korkeuden ja 100-%:ista aggregaatiota vastaavan korkeuden välillä x 100. Estoprosentti määritetään suhteella: 10

Kontrollin aggregaation korkeus - saadun aggregaation korkeus_ χ ^qq

Kontrollin aggregaation korkeus

Tulokset, jotka saatiin toisaalta raseemisen seok-15 sen (PCR 4099) hydrokloridilla, oikealle kiertävien (SR 25990 C) ja vasemmalle kiertävien (SR 25989 C) isomeerien vetysulfaateilla ja toisaalta PCR 4099:llä ja oikealle kiertävien (SR 25990 A) ja vasemmalle kiertävien (SR 25989 A) isomeerien hydroklorideilla, ADP:lla aiheutetus-20 sa aggregaatiossa, esitetään taulukossa I. Ne osoittavat, että vasemmalle kiertävä isomeeri on tehoton ja että oikealle kiertävä isomeeri on ainakin yhtä tehokas kuin ra-semaatti.

16 8721 6

Taulukko I

Tuote Annos Annetun Aggre- Esto-% p** mg/Kg emäksen gaatio-% po määrä 5

Kontrollit 4 2 4 1 2 3'' 1 · 5 PCR t099 4.4Θ 9.8t 29.Θ ♦ / - 2 . t 3 0 0.01 (rasemaatti) Θ.97 7,69 17,2 1/-2.2 59 0,001 17,9 15,38 11,1 »/-2,3 7t 0,001 10 SR 2 5 9 Θ 9 C 2 0 15,3 8 41,0 »/-1.5 3 n. s t0 30,76 3 7,1 »/-1,7 13 n.s SR 2 5 9 9 0 C 1.25 0,96 3 9,t »/-1.3 7 n. s 2,5 1,92 2Θ,t 1/-2,3 33 0,01 5 3.8t 1t,0 +/-1,6 67 0,001 10 7,69 Θ,5 1/-1.6 80 0.001 15

Kontrollit 33 g »/-2 3 SR 2 5 9 9 0 E 10 3,0t 9,6 »/- 3 7 2 0,0 0 1 20 7,69 t »/-1.6 ΘΘ 0,001 20 =SSBSa = ,s = sssssssss-ssss = = s.ssss-s = -- ss = = = = s--- * 1 1

Aggregaation korkeus

Kontrollit 103 »/-5 PCR 10 9 9 2,5 2, 1t Θ6 1/-5 17 0,05 25 (rasemaatti) 5 t.2 0 7 2 »/- 8 30 0,05 12.5 10,71 3 2 ♦/- 9 69 0,001 SR 2 5 9 β 9A 25 22.t6 101 »/-1 2 n.s SR 2 5 9 9 0A 2.5 2,25 6 7 »/- 7 35 0,0 1 5 t,19 2 6 ♦/- 5 75 0.001 12.5 11,23 19 1/-t 82 0,001 30 25 2 2,t6 1 1 1/- 1 89 0.00 1 tulosten keskiarvo +/- keskiarvon keskivirhe (SEM) 2

Studentin testi 3 aggregaation korkeus mm:ssä : keskiarvo +/- SEM (n=5) 35 n.s ei merkitsevä 17 8721 6

Kollageenillä aiheutetun aggregaation kohdalla esto-prosentti on kontrollilla ja tutkittavalla tuotteella saatujen käyrien, jotka esittävät optisen tiheyden muutosta ajan funktiona, kulmakertoimien erotus jaettuna kontrol-5 lien kulmakertoimella x 100. Taulukossa II esitetyt tulokset osoittavat jälleen, että vain oikealle kiertävä isomeeri on tehokas, kun taas suolat vaikuttavat vertai-lukelpoisesti.

18

Taulukko II

8721 6

Tuote Annos Annetun Kulmakerroin Esto-% P1 mg/Kg emäksen määrä 5

Kontrollit 4.8 »/-0,3 P C R 4 0 9 9 4,48 3.84 3,6-/-0,2 25 0,05 8.97 7,69 2,7-/-0,3 44 0,01 >7,9 16,38 1,5-/-0,3 69 0,001 10 SR 2 5 9 8 9 C 2 0 1 5,38 4,3 -/- 0.2 10 n. s 40 30,76 4,0-/-0. 2 17 n. s SR 2 5 9 9 0 C 1.25 0,96 4.5 -/- 0.3 6 n.s 2,5 1,92 4,1-/-0.2 15 n.s 5 3,84 2.3-/-0.1 52 0,001 15 10 7,69 1,7-/-0.3 65 0,001

Kontrollit 3 5 */_g j SR 2 5 9 9 0 E 1 0 3,8 4 2.1 -/- 0.5 40 0,05 20 20 7,69 1,4-/-0.4 60 0,01

Kontrollit 3,97 »/-0,29 P C R 4 0 9 9 2,5 2,14 3,13-/-0,33 21 n. s (rasemaatti) 5 4.28 2,94 */- 0,3 4 26 0,05 25 12,5 10,71 2,19 */-0,42 45 0,01 SR 2 5 9 8 9A 25 22,4 6 4,32 -/- 0.29 1 0 n.s SR25990A 2.5 2,25 3.05-/-0.19 23 0,05 5 4.49 1.24-/-0.22 69 0,001 12,5 11,23 0,86 -/-0,14 78 0,001 30 25 22,46 0,74 -/-0,13 81 0,001

Studentin testi n.s ei merkitsevä 87216 19 Näiden yhdisteiden hyytymistä estävää vaikutusta on myös tutkittu Kumada T. et al:n, Thromb. Res 18 (1980), s. 189, kuvaamalla, ruuvin kierteiden avulla aiheutetulla laskimotukostestillä.

5 Samaa tyyppiä kuin edellä on kuvattu, olevat naa- rasrotat nukutettiin 10 eläimen ryhmissä dietyylieetteril-lä ja niiden alaonttolaskimo (venca cava) eristettiin vatsan aukaisun jälkeen.

Metalliset, 21 mm pitkät, hammaslääkärin porasta 10 nro 30, jota myy Dyna (Ranska), peräisin olevat ruuvin kierteet asetettiin seinämään vahingoittamatta tämän laskimon onteloon juuri sen munuaishaaran alapuolelle, joka laskee kohti suoliluulaskimoita; ruuvin kierteitä istutetaan 19 - 20 mm:n pituudelta ja jäljelle jäävä 1 mm työn-15 netään suljetun mahan läpi ulkopuolelle.

Hyytymät muodostuivat nopeasti ja viisi tuntia myöhemmin vatsa aikaustiin uudelleen eläinten ollessa pento-barbitaalianestesiassa ja sidelangat sidotaan ylä- ja alapuolelle ruuvin kierteitä, jotka poistetaan laskimoon teh-20 tävän pitkittäisviillon jälkeen ja eristetyt hyytymät punnitaan .

Tulokset, jotka esitetään taulukossa III, osoittavat, että vasemmalle kiertävä isomeeri on tehoton tässä kokeessa, päinvastoin kuin oikealle kiertävä isomeeri ja 25 rasemaatti.

Taulukko III

20 87216

Tuote Annettu Emäksen Hyytymien Vaihtelu % P*“ annos määrä paino mg/kg 5 P°

Kontrollit 3.9 »/-0.3 PCR 4 099 4.48 3.84 2.17 */-0,24 44 0.001 (rasemaat ti) 8.97 7.69 1.39 ♦/-O, 15 64 0,001 17.9 15.38 1 00 */-0,19 74 0.001 10 SR 2 5909C 4 0 3 0.7 6 4.1 7 */- 0.4 2 - 7 n. s SR 2 5 9 9 0 C 1.25 0.96 3.11 */-0.32 20 n.s 2.5 1.92 2,29 */-0.22 41 0.01 5 3.84 1,71 */-0,24 56 0,01 10 7.69 1.26 */-0,1 9 67 0 J)1 15 20 15,38 1.20 */-0.13 69 0,01

Kontrollit 3·7β w_0·1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 SR 2 5 9 9 0 E 10 3.84 1,48 */-0,1 5 60 0,00 1 20 7,69 1 . 1 8 ♦ / -0 . 1 5 68 0.00 1 20 .........................................................

*Hyytymien paino mg:na +/- keskiarvon keskivirhe P = Kruskal-Wallis'in U-testi

Toksisuustutkimuksia varten yhdisteet annettiin 2 oraalisesti suspension muodossa samassa tilavuudessa vet 3 tä, jossa oli 10 % (w/v) arabikumia, 120 - 135 g painavil 4 le, paastonneille, Sprague Dawley -kannan naarasrotille, 5 jotka olivat 10 ortan ryhmissä.

6

Kuolleiden eläinten lukumäärä määritettiin 14 päi 7 vän kuluttua tutkittavana olevan yhdisteen antamisesta.

8 Näin määritetyt tappavat annokset, ilmaistuna annetun 9 suolan painona, esitetään taulukossa IV; nämä tulokset 10 osoittavat toisaalta, että raseemisen seoksen ja vasemmal- 11 le kiertävän isomeerin toksisuus on samankaltaista, kun 12 taas oikealle kiertävä isomeeri on huomattavasti vähemmän 21 8721 6 toksinen ja toisaalta, että toksisuus riippuu suolan muodostukseen käytetyn hapon luonteesta.

Taulukko IV

5 Tuotteet D 10 D 50 0 90 Absoluuttinen ( ) tappava annos PCR 4099 1318 1615 1979 2000 (rasemaatti) (1448-1747) 10 SR 25989 A 1259 1702 2299 2000 ( 1 4 4 3 - 1 7 9 7 ) SR 25990 A 3055 4316 6137 5000 (3569-5705) SR 25990 C 2257 2591 2974 4000 15 (2372-2805) SR 25990 D 2634 4268 6914 5000 (3581-6012) 20 ( ) = luotettavuusväli

Juuri esitelty farmakologinen tutkimus on näyttänyt oteen mielenkiintoiset, yhdisteen (1^) verihiutaleiden aggregaatiota estävät ominaisuudet ja vaikutuksen puuttu-25 misen sen isomeeriltä (1^).

Keksinnön mukainen lääke voidaan valmistaa saatavaksi tablettien, sokeripäällysteisten tablettien, kapseleiden, tippojen, rakeiden tai siirapin muodossa, oraalista antamista varten. Se voidaan myös valmistaa saatavaksi 30 peräpuikkojen muodossa rektaalista antamista varten tai injektioliuoksen muodossa parenteraalista antamista varten .

Kukin annosyksikkö sisältää edullisesti 0,001 g:sta 0,100 graan keksinnön johdannaista ja annettavat, vaikut-35 tavan aineosan päivittäiset annokset voivat vaihdella 22 87216 0,001 g:sta 0,500 g:aan potilaan iästä ja hoidettavan sairauden vaikeudesta riippuen.

Alla annetaan esimerkkeinä, jotka eivät ole rajoittavia, keksinnön lääkkeen muutamia farmaseuttisia formu-5 laatioita.

1) Tabletit

Vaikuttava aineosa 0,010 g

Apuaine: laktoosi, sokerijauhe, riisitärkkelys, algiini-happo, magnesiumstearaatti 10 2) Sokeripäällystetyt tabletit

Vaikuttava aineosa 0,005 g

Apuaine: maqncsiumstenraatti, maissitärkkolys, arabi kumi, shellakka, valkoinen sokeri, glukoosi, valkovaha, karnaubavaha, parafiini, kokenilli.

15 3) Kapselit

Vaikuttava aineosa 0,025 g

Apuaine: magnesiumstearaatti, maissitärkkelys, laktoosi.

4) Injektioliuos

Vaikuttava aineosa 0,050 g 20 Isotoninen suolaliuos 3 ml:aan asti.

5) Peräpuikot

Vaikuttava aineosa 0,030 g

Puolisynteettisiä triglyseridejä yhteen peräpuikkoon tarvittava määrä.

25 Mielenkiintoisten, verihiutaleiden aggregaatiota estävien ominaisuuksiensa ja valtimo- ja laskimotukosten muodostumismekanismiin puuttumisensa vuoksi keksinnön lääkettä voidaan antaa tavallisesti hoidettaessa ja ehkäistäessä verihiutalesairauksia, jotka aiheutuvat ruu-30 miin ulkopuolisista veren kierrätyksistä tai valtimohau-raustuman (aterooma) komplikaatioiden seurauksesta.

Claims (5)

8721 6

1. Menetelmä metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tetrahydro-(3,2-c)tienopyridyyli)-(2-kloorifenyyli)asetaatin oikeal-5 le kiertävän isomeerin ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että muodostetaan raseemisen metyyli-alfa-5-(4,5,6,7-tet-rahydro( 3,2-c) tienopyridyyli ) - ( 2-kloorifenyyli ) ase taa tin suola optisesti aktiivisen hapon kanssa liuottimessa, suo-10 la kiteytetään toistuvasti uudelleen, kunnes saadaan tuote, jonka optinen kiertokyky on vakio, sitten oikealle kiertävä isomeeri vapautetaan suolastaan emäksellä, ja haluttaessa muodostetaan mainitun isomeerin suola farmaseuttisesti hyväksyttävän hapon kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että optisesti aktiivinen happo on vasemmalle kiertävä kamferi-10-sulfonihappo.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uudelleenkiteytykset suorite- 20 taan asetonissa.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suolan muodostus suoritetaan asetonissa.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 4 mukainen mene- 25 telmä, tunnettu siitä, että farmaseuttisesti hy väksyttävä happo valitaan vetykloridihaposta, rikkihaposta, vetybromidihaposta ja taurokoolihaposta. 8721 6