ES3038019T3 - Akkermansia muciniphila for treating cancer - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a Akkermansia muciniphila o a sus fragmentos para el tratamiento de un trastorno metabólico en un sujeto que lo necesite. La presente invención también se refiere a una composición, una composición farmacéutica y un medicamento que comprende Akkermansia muciniphila o sus fragmentos para el tratamiento de un trastorno metabólico. La presente invención también se refiere al uso de Akkermansia muciniphila o sus fragmentos para promover la pérdida de peso en un sujeto que lo necesite. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Akkermansia Muciniphila para el tratamiento del cáncer

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere aAkkermansia mudniphilapara su utilización en la prevención del cáncer, en la que se administran células viables deAkkermansia muciniphila a unsujeto que lo necesite.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La obesidad es un problema mundial, con un número estimado de adultos obesos de aproximadamente 250 millones. Esta epidemia de obesidad se correlaciona con un gran aumento en la prevalencia de trastornos relacionados con la obesidad, tales como, por ejemplo, diabetes, hipertensión, cardiopatías y enfermedades hepáticas. Debido a estas patologías altamente discapacitantes, la obesidad se considera actualmente en los países occidentales uno de los problemas de salud pública más importantes. Por lo tanto, existe una necesidad real de composiciones y procedimientos para tratar o prevenir la obesidad y/o los trastornos relacionados con la obesidad.

[0003] La obesidad y las enfermedades relacionadas con la obesidad se asocian con (i) disfunciones metabólicas (que influyen, por ejemplo, en la homeostasis de la glucosa y el metabolismo lipídico); (ii) un estado inflamatorio de grado leve asociado a niveles más elevados de lipopolisacáridos (LPS) en sangre (también denominado endotoxemia metabólica); y (iii) deterioro de la función de la barrera intestinal (es decir, aumento de la permeabilidad intestinal). Para tratar la obesidad, por lo tanto, es necesario influir en al menos uno, preferiblemente dos y, más preferiblemente, tres de estos tres factores.

[0004] El intestino humano está colonizado por una comunidad diversa, compleja y dinámica de microbios que representan más de 1000 especies diferentes, que interactúan continuamente con el huésped (Zoetendal, Rajilic-Stojanovic y de Vos, Gut 2008, 57: 1605-1615). La homeostasis de la microbiota intestinal depende de las características del huésped (edad, sexo, antecedentes genéticos, etc.) y de las condiciones ambientales (estrés, fármacos, cirugía gastrointestinal, agentes infecciosos y tóxicos, etc.), pero también de los cambios dietéticos diarios. Cada vez hay más evidencia que respalda el papel de la microbiota intestinal en el desarrollo de la obesidad y trastornos relacionados (Delzenne y Cani, Annu. Rev. Nutr. 2011, 31: 15-31).

[0005] Por lo tanto, el tratamiento con productos que se dirigen a la microbiota intestinal parecía una herramienta terapéutica prometedora para el tratamiento de la obesidad y trastornos relacionados. Estos productos pueden consistir en microbios vivos, tales como en el caso de la mayoría de los probióticos, o contener microbios muertos o fragmentos de los mismos. Además, estos productos pueden comprender sustratos que son utilizados por la microbiota intestinal, tal como en el caso de los prebióticos, o contener compuestos que alteran el equilibrio de la microbiota intestinal, tal como compuestos antimicrobianos específicos.

[0006] Por ejemplo, el documento WO 2008/076696 describe la microbiota intestinal como una diana terapéutica para tratar la obesidad y trastornos relacionados. El documento WO 2008/076696 describe específicamente procedimientos para alterar la abundancia de Bacteroides y/o Firmicutes en el intestino de un sujeto, mediante la administración de antibióticos y/o probióticos al sujeto.

[0007] Además, el documento EP 2030623 se refiere a la prevención y/o tratamiento de trastornos metabólicos, tales como, por ejemplo, los trastornos relacionados con la obesidad, mediante la regulación de la cantidad de Enterobacterias en el intestino. El documento EP 2030623 divulga la reducción de la cantidad de Enterobacterias en el intestino mediante la administración de bacterias probióticas, tales como, por ejemplo, Bifidobacterium, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus o Lactobacillus.

[0008] Además, el solicitante describió que la microbiota intestinal está modificada en ratones obesos tratados con prebióticos (Everard et al., Diabetes, noviembre de 2011; 60(11):2775-86). Además, los prebióticos (1) mejoran el metabolismo de la glucosa y de los lípidos en ratones obesos, (2) reducen los LPS plasmáticos y mejoran la función de la barrera intestinal (por ejemplo, reducción de la inflamación) en ratones obesos, (3) inducen un mayor número de células L enteroendocrinas en ratones obesos, y (4) mejoran la sensibilidad a la leptina y la homeostasis de la glucosa en ratones obesos y diabéticos inducidos por la dieta.

[0009] Entre las modificaciones inducidas por el tratamiento con prebiótico en ratones obesos se encuentra una alteración considerable de la composición de la microbiota intestinal, caracterizada por (i) una disminución de la abundancia de Bacteroidetes, Lactobacillus spp. y bacterias del grupo Bacteroides-Prevotella; y (ii) una mayor abundancia de Bifidobacterium spp., de bacterias del grupo E. rectale/C. coccoides y de Akkermansia muciniphila, perteneciente a Verrucomicrobia.A. muciniphila,una bacteria identificada por primera vez en 2004 por el solicitante, representa aproximadamente entre el 1 % y el 3 % de la microbiota total de adultos sanos (Derrien et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004, 54: 1469-1476; Derrien et al. Applied Environmental Microbiology 2008, 74, 1646-1648).

[0010] Evidencias indirectas sugirieron una relación entre la abundancia deA. muciniphilay disfunciones intestinales o trastornos relacionados con la obesidad. Por ejemplo, el documento WO 2011/107481 describe que la ausencia deAkkermansia muciniphilaen el intestino de un sujeto, combinada con la presencia de Bacteroides capillosus y Clostridium leptum, indica que este sujeto padece colitis ulcerosa. Además, Hansen y sus colegas demostraron que la administración de un antibiótico, vancomicina, a ratones NOD neonatales (el modelo de ratón NOD es un modelo de diabetes) suprime la aparición clínica de la diabetes y propagaAkkermansia muciniphila(Hansen et al., Diabetologia, agosto de 2012;55(8):2285-94). Sin embargo, esto puede ser un efecto indirecto debido a la insensibilidad de lasAkkermansia spp.intestinales al antibiótico utilizado.

[0011] Estos resultados demostraron de este modo que la composición completa de la microbiota intestinal se modifica tras la administración de prebióticos en ratones. Más específicamente, no existe evidencia que sugiera un papel específico de una especie bacteriana, tal como, por ejemplo,Akkermansia muciniphila,en la respuesta beneficiosa a la administración de prebióticos. Además, según el conocimiento del solicitante, nunca se ha descrito ni sugerido ningún efecto beneficioso de la administración directa deAkkermansia muciniphila.

[0012] En este caso, el solicitante demostró sorprendentemente que la administración repetida deAkkermansia muciniphilapor sí sola afecta las tres disfunciones subyacentes asociadas con la obesidad y trastornos relacionados, es decir, disfunciones metabólicas, estado inflamatorio de grado leve asociado a niveles más elevados de lipopolisacáridos (LPS) en sangre y deterioro de la función de la barrera intestinal. Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso deAkkermansia muciniphilaen la prevención del cáncer, en el que se administran células viables deAkkermansia muciniphilaal sujeto que las necesite.

RESUMEN

[0013] La presente invención se refiere así aAkkermansia muciniphilapara su utilización en la prevención del cáncer, en la que se administran células viables deAkkermansia muciniphila a unsujeto que las necesite.

[0014] Se administran células viables deAkkermansia muciniphilaal sujeto que las necesite.

[0015] En una realización de la presente invención,Akkermansia muciniphilase administra por vía oral.

[0016] En una realización de la presente invención, se administra al sujeto una cantidad deAkkermansia muciniphilacomprendida que varía de aproximadamente 1.102 a aproximadamente 1.1015ufc, preferiblemente de aproximadamente 1.104 a aproximadamente 1.1012ufc, más preferiblemente de aproximadamente 1.105 a aproximadamente 1.1010 ufc , y aún más preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc. En otra realización de la presente invención, se administra al sujeto una cantidad deAkkermansia muciniphilaque varía de aproximadamente 1.104 a aproximadamente 1.1012ufc, más preferiblemente de aproximadamente 1.105 a aproximadamente 1.1011 ufc, y aún más preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.1010 ufc.

[0017] En una realización de la presente invención, se administraAkkermansia muciniphilaal menos una vez al día. En una realización de la presente invención, se administraAkkermansia muciniphilaal menos tres veces por semana. En otra realización de la presente invención, se administraAkkermansia muciniphilaal menos una vez por semana.

[0018] En una realización de la presente invención,Akkermansia muciniphilase coadministra con otra cepa probiótica y/o con uno o más prebióticos.

[0019] Otro objetivo de la presente divulgación es una composición para el tratamiento, o para su utilización en el tratamiento, de un trastorno metabólico, o para aumentar el gasto energético o para aumentar la saciedad en un sujeto que comprende Akkermansiamuciniphila,tal como se describió anteriormente en el presente documento, en asociación con un excipiente. En una realización, dicha composición es una composición nutricional. En una realización de la presente invención, dicha composición se administra por vía oral.

[0020] La presente divulgación también se refiere a una composición farmacéutica para tratar, o para usar en el tratamiento de un trastorno metabólico o para aumentar el gasto enegético o para aumentar la saciedad en un sujeto que comprendeAkkermansia muciniphilatal como se describió anteriormente en el presente documento en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

DEFINICIONES

[0021] En la presente invención, los siguientes términos tienen los siguientes significados:

• "Tratamiento" significa prevenir (es decir, evitar que ocurra), reducir o aliviar al menos un efecto adverso o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección. Por tanto, este término se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas; en el que el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) la afección o trastorno patológico en cuestión. En una realización de la presente invención, quienes necesitan tratamiento incluyen a quienes ya padecen el trastorno, así como a quienes son propensos a padecer el trastorno o a quienes se desea prevenir el trastorno.

• "Cantidad eficaz" se refiere al nivel o cantidad de agente que se pretende, sin causar efectos secundarios negativos o adversos significativos al objetivo, (1) retrasar o prevenir la aparición de un trastorno metabólico; (2) ralentizar o detener la progresión, agravamiento o deterioro de uno o más síntomas del trastorno metabólico; (3) lograr la mejoría de los síntomas del trastorno metabólico; (4) reducir la gravedad o incidencia del trastorno metabólico; (5) curar el trastorno metabólico; o (6) restablecer la cantidad y/o proporción normal deAkkermansia mudniphilaen el intestino del sujeto a tratar. Una cantidad eficaz puede administrarse antes de la aparición de un trastorno metabólico, con fines profilácticos o preventivos. Alternativamente, o adicionalmente, la cantidad eficaz puede administrarse después del inicio del trastorno metabólico, con fines terapéuticos.

•"Akkermansia muciniphila"se refiere a la bacteria estrictamente anaeróbica degradadora de mucina identificada por Derrien (Derrien et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004, 54: 1469-1476). Las células son ovaladas, inmóviles y se tiñen como Gram-negativas.Akkermansia muciniphilatambién puede denominarseAkkermansia spp.O bacterias similares a Akkermansia. Pertenece al grupo Chlamydiae/Verrucomicrobia; filo Verrucomicrobia. Si la taxonomía cambiara, el experto en la materia sabría cómo adaptar los cambios en la taxonomía para deducir las cepas que podrían utilizarse en la presente invención. Además, el solicitante ha determinado el genoma completo deAkkermansia muciniphila(van Passel et al, PLoS One 6, 2011: e16876). Se acepta generalmente que las cepas con una similitud genómica de aproximadamente el 70 % pueden considerarse la misma especie.

• "Probióticos" se refiere a preparaciones de células microbianas (tales como, por ejemplo, células microbianas vivas) o componentes de células microbianas que, cuando se administran en una cantidad eficaz, proporcionan un efecto beneficioso sobre la salud o el bienestar de un sujeto.

[0022] Por definición, todos los probióticos tienen un carácter no patógeno comprobado. En una realización, estos beneficios para la salud se asocian con la mejora del equilibrio de la microbiota humana o animal en el tracto gastrointestinal y/o la restauración de una microbiota normal.

• "Prebiótico" se refiere a una sustancia, tal como, por ejemplo, una sustancia alimentaria, que no puede ser digerida por los seres humanos, pero que puede ser utilizada por las bacterias de la microbiota intestinal y que está destinada a favorecer el crecimiento de bacterias probióticas en el intestino.

• "Sobrepeso" se refiere a una situación del sujeto en la que dicho sujeto tiene un Índice de Masa Corporal (IMC) de entre 25 y 30. Tal como se utiliza en el presente documento, el IMC se define como la masa corporal del individuo (en kg) dividida entre el cuadrado de su altura (en metros). "Obesidad" se refiere a una situación en la que el sujeto tiene un IMC igual o superior a 30.

• "Sujeto" se refiere a un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. En una realización, el sujeto es un macho. En otra realización, el sujeto es una hembra. En una realización de la presente invención, un sujeto también puede referirse a una mascota, tal como, por ejemplo, un perro, un gato, una cobaya, un hámster, una rata, un ratón, un hurón, un conejo, y similares.

• "Aproximadamente" antes de una cifra significa más o menos el 20%, preferiblemente el 10% del valor de dicha cifra.

[0023]Akkermansia muciniphilaque se produce de otra manera, tal como, por ejemplo, utilizando tecnología de ADN recombinante, en un huésped microbiano o en cualquier otro proceso (bio)sintético.

• El término "trastorno metabólico" se refiere a trastornos, enfermedades y afecciones causados o caracterizados por un aumento de peso anormal, un uso o consumo de energía anormal, respuestas alteradas a nutrientes ingeridos o endógenos, fuentes de energía, hormonas u otras moléculas de señalización dentro del cuerpo, o una alteración del metabolismo de carbohidratos, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos o una combinación de los mismos. Un trastorno metabólico puede estar asociado con una deficiencia o un exceso en una vía metabólica que da lugar a un desequilibrio en el metabolismo de carbohidratos, lípidos, proteínas y/o ácidos nucleicos. Los ejemplos de trastornos metabólicos incluyen, pero sin limitación, síndrome metabólico, trastornos relacionados con la deficiencia de insulina o resistencia a la insulina, diabetes mellitus (tal como, por ejemplo, diabetes tipo 2), intolerancia a la glucosa, metabolismo lipídico anormal, aterosclerosis, hipertensión, patología cardíaca, accidente cerebrovascular, enfermedad del hígado graso no alcohólico, hiperglucemia, esteatosis hepática, dislipidemia, disfunción del sistema inmunitario asociada con sobrepeso y obesidad, enfermedades cardiovasculares, colesterol alto, triglicéridos elevados, asma, apnea del sueño, osteoartritis, neurodegeneración, enfermedad de la vesícula biliar, síndrome X, trastornos inflamatorios e inmunológicos, dislipidemia aterogénica y cáncer.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0024] La presente invención se refiere aAkkermansiamuciniphila para su utilización en la prevención del cáncer, en la que se administran células viables de Akkermansia muciniphila a un sujeto que las necesite.

[0025] Tal como se utiliza en el presente documento, un trastorno metabólico es un trastorno relacionado con una homeostasis metabólica alterada, tal como, por ejemplo, una homeostasis glucídica o lipídica alterada.

[0026] En una realización, dicho trastorno metabólico es la obesidad.

[0027] Los ejemplos de otros trastornos metabólicos incluyen, pero sin limitación, síndrome metabólico, trastornos relacionados con la deficiencia de insulina o resistencia a la insulina, diabetes mellitus (tal como, por ejemplo, diabetes tipo 2), intolerancia a la glucosa, metabolismo lipídico anormal, aterosclerosis, hipertensión, patología cardíaca, accidente cerebrovascular, enfermedad del hígado graso no alcohólico, hiperglucemia, esteatosis hepática, dislipidemia, disfunción del sistema inmunitario asociada con sobrepeso y obesidad, enfermedades cardiovasculares, colesterol alto, triglicéridos elevados, asma, apnea del sueño, osteoartritis, neurodegeneración, enfermedad de la vesícula biliar, síndrome X, trastornos inflamatorios e inmunológicos, dislipidemia aterogénica y cáncer.

[0028] Dicho trastorno metabólico es un trastorno metabólico relacionado con el sobrepeso y/o la obesidad, es decir, un trastorno metabólico que puede estar asociado a o ser causado por el sobrepeso y/o la obesidad. Entre los ejemplos de trastornos metabólicos relacionados con el sobrepeso y/o la obesidad se incluye el cáncer.

[0029] En una realización, dicho trastorno metabólico es diabetes mellitus, preferiblemente diabetes tipo 2. En otra realización, dicho trastorno metabólico es hipercolesterolemia (también conocida como colesterol alto). En una realización, la hipercolesterolemia corresponde a una concentración plasmática de colesterol igual o superior a 2 g/l o 5 mmol/l. En otra realización, la hipercolesterolemia corresponde a una relación entre la concentración plasmática de colesterol total y la concentración plasmática de HDL (colesterol de lipoproteínas de alta densidad) igual o superior a 4,5:1, preferiblemente 5:1.

[0030] En una realización de la presente invención, se utilizan cepas vivas deAkkermansia mudniphilaen la presente invención, preferiblemente las cepas vivas se derivan de células en fase estacionaria de crecimiento.

[0031] Se van a administrar células viables de Akkermansiamuciniphilaal sujeto que las necesite.

[0032] En una realización, se utilizan células metabólicamente activas deAkkermansia muciniphilaen la presente invención. En una realización, las cepas deAkkermansia muciniphilano están metabólicamente inactivadas, lo que puede resultar, por ejemplo, del tratamiento en autoclave.

[0033] En una realización,Akkermansia muciniphilaestá sustancialmente purificada. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sustancialmente purificada" significa queAkkermansia muciniphilaestá comprendida en una muestra en la que representa al menos aproximadamente el 50 %, preferiblemente al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de las cepas bacterianas de dicha muestra.

[0034] En una realización de la presente invención, la cantidad eficaz deAkkermansia muciniphilacorresponde a la cantidad de bacterias suficiente para restablecer una cantidad y/o proporción normal deAkkermansia muciniphilaen el intestino del sujeto. De hecho, el solicitante demostró que el intestino de sujetos obesos o con sobrepeso presenta una deficiencia deAkkermansia muciniphila(véanse los ejemplos). En una realización de la presente invención, la cantidad y/o proporción normal deAkkermansia muciniphilacorresponde a la cantidad y/o proporción deAkkermansia muciniphilapresente en el intestino de un sujeto sano.

[0035] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto sano" se utiliza para definir a un sujeto que no está afectado por la enfermedad a tratar. Por ejemplo, si se utilizaAkkermansia muciniphilapara tratar la obesidad, el sujeto sano está afectado de obesidad. Preferiblemente, el sujeto sano comparte características comunes con el sujeto a tratar, tales como, por ejemplo, el mismo género, edad, sexo, dieta, ingesta de fármacos o ubicación geográfica.

[0036] En una realización de la presente invención, la proporción normal deAkkermansia muciniphilaen el intestino varía de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 % (en número de células deAkkermansia muciniphilacon respecto al número total de células bacterianas del intestino), preferiblemente de aproximadamente el 0,3 % a aproximadamente 5 %, más preferiblemente de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 3 %.

[0037] En una realización de la presente invención, la cantidad efectiva deAkkermansia muciniphilavaría de aproximadamente 1.102 a aproximadamente 1.1015 ufc, preferiblemente de aproximadamente 1.104 a aproximadamente 1.1012 ufc, más preferiblemente de aproximadamente 1.105 a aproximadamente 1.1010 ufc, y aún más preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc, donde ufc significa "unidad formadora de colonias".

[0038] En otra realización de la presente invención, la cantidad efectiva deAkkermansia muciniphilavaría de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.1010 ufc, preferiblemente de aproximadamente 1.108 a aproximadamente 1.1010 ufc, más preferiblemente de aproximadamente 1.109 a aproximadamente 1.1010 ufc.

[0039] En otra realización de la presente invención, la cantidad efectiva deAkkermansia muciniphilavaría de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.1010ufc, preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc, más preferiblemente de aproximadamente 1.108 a aproximadamente 1.109 ufc.

[0040] En una realización de la presente invención, la composición de la presente invención comprende una cantidad deAkkermansia mudniphilaque varía de aproximadamente 1.102 a aproximadamente 1.1015 ufc/g de la composición, preferiblemente de aproximadamente 1.104 a aproximadamente 1.1012 ufc/g de la composición, más preferiblemente, de aproximadamente 1.105 a aproximadamente 1.1010 ufc/g de la composición y aún más preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc/g de la composición. En una realización de la presente invención, la composición de la presente invención comprende una cantidad deAkkermansia muciniphilaque varía de aproximadamente 1.102 a aproximadamente 1.1015 ufc/ml de la composición, preferiblemente de aproximadamente 1.104 a aproximadamente 1.1012 ufc/ml de la composición, más preferiblemente, de aproximadamente 1.105 a aproximadamente 1.1010 ufc/ml de la composición y aún más preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc/ml de la composición. En otra realización de la presente invención, la composición de la presente invención comprende una cantidad deAkkermansia muciniphilaque varía de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.1010 ufc/g o ufc/ml de la composición, preferiblemente de aproximadamente 1.108 a aproximadamente 1.1010 ufc/g o ufc/ml, más preferiblemente, de aproximadamente 1.109 a aproximadamente 1.1010 ufc/g o ufc/ml. En otra realización de la presente invención, la composición de la presente invención comprende una cantidad deAkkermansia muciniphilaque varía de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.1010 ufc/g o ufc/ml de la composición, preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc/g o ufc/ml, más preferiblemente, de aproximadamente 1.108 a aproximadamente 1.109 ufc/g o ufc/ml.

[0041] La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz deAkkermansia muciniphilay al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica de la presente invención es para tratar un trastorno metabólico. En otra realización de la presente invención, la composición farmacéutica es para restablecer una proporción normal deAkkermansia muciniphilaen el intestino de un sujeto que lo necesite.

[0042] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que no produce reacciones adversas, alérgicas ni de otro tipo al administrarse a un animal, preferiblemente a un ser humano. Puede incluir cualquier disolvente, medio de dispersión, recubrimiento, agente isotónico y retardante de la absorción, y similares. Para la administración en seres humanos, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza exigidos por los estándares de Biología de la FDA.

[0043] La presente invención también se refiere a un medicamento que comprende una cantidad eficaz deAkkermansia muciniphila.En una realización de la presente invención, el medicamento de la presente invención es para el tratamiento de un trastorno metabólico. En otra realización de la presente invención, el medicamento es para restablecer una proporción normal deAkkermansia muciniphilaen el intestino de un sujeto que lo necesite.

[0044] La presente invención también se refiere a un procedimiento para tratar un trastorno metabólico en un sujeto que lo necesite, en el que dicho procedimiento comprende administrar una cantidad efectiva de Akkermansiamuciniphilaal sujeto.

[0045] Otro objetivo de la presente invención es un procedimiento para restaurar una proporción normal deAkkermansia muciniphilaen el intestino de un sujeto que lo necesite, en el que dicho procedimiento comprende administrar una cantidad eficaz de Akkermansiamuciniphilaal sujeto.

[0046] En una realización, el procedimiento de la presente invención comprende administrar una cantidad eficaz de la composición, de la composición farmacéutica o del medicamento de la presente invención al sujeto.

[0047] En una realización de la presente invención,Akkermansia muciniphila,o la composición, composición farmacéutica o medicamento, se administra al menos una vez por semana, preferiblemente al menos dos veces por semana, más preferiblemente al menos tres veces por semana, e incluso más preferiblemente tres veces por semana. En otra realización, Akkermansiamuciniphilao un fragmento de la misma, o la composición, composición farmacéutica o medicamento, se administra al menos una vez al día, y preferiblemente al menos dos veces al día.

[0048] En una realización,Akkermansia muciniphila,o la composición, composición farmacéutica o medicamento de la presente invención se administra durante 1 semana, preferiblemente durante 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas o más.

[0049] En una realización,Akkermansia muciniphila,o la composición, composición farmacéutica o medicamento de la presente invención se administra durante un período que dura hasta que se logra el resultado deseado (por ejemplo, pérdida de peso, tratamiento de trastornos metabólicos, disminución del nivel plasmático de colesterol...).

[0050] En una realización, la administración deAkkermansia muciniphila,o la composición, composición farmacéutica o medicamento de la presente invención es permanente, es decir, no está limitada en el tiempo.

[0051] En una realización de la presente invención, la cantidad diaria deAkkermansia muciniphilaadministrada por día varía de 1.102 a aproximadamente 1.1015ufc, preferiblemente de aproximadamente 1.104 a aproximadamente 1.1012 ufc, más preferiblemente de aproximadamente 1.105 a aproximadamente 1.1010 ufc , y aún más preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc/día.

[0052] En otra realización de la presente invención, la cantidad diaria deAkkermansia mudniphilaadministrada por día varía de 1.106 a aproximadamente 1.1010ufc, preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc, más preferiblemente de aproximadamente 1.108 a aproximadamente 1.109 ufc. En otra realización de la presente invención, la cantidad diaria deAkkermansia muciniphilaadministrada por día varía de 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc, preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc, más preferiblemente de aproximadamente 1.108 a aproximadamente 1.109 ufc.

[0053] En una realización de la presente invención, el sujeto tiene sobrepeso. En otra realización, el sujeto es obeso.

[0054] En una realización de la presente invención, al sujeto se le diagnostica un trastorno metabólico.

[0055] En otra realización, el sujeto corre el riesgo de desarrollar un trastorno metabólico, tal como, por ejemplo, un trastorno metabólico relacionado con el sobrepeso y/o la obesidad. En una realización, dicho riesgo está relacionado con el hecho de que el sujeto tiene sobrepeso o es obeso. En otra realización, dicho riesgo corresponde a una predisposición, tal como, por ejemplo, una predisposición familiar a un trastorno metabólico, tal como, por ejemplo, un trastorno metabólico relacionado con el sobrepeso y/o la obesidad.

[0056] En una realización de la presente invención, el sujeto presenta una desregulación de la composición de la microbiota intestinal. Preferiblemente, la microbiota intestinal de dicho sujeto está agotada en cepas deAkkermansia muciniphila.En una realización, la proporción deAkkermansia muciniphilaen el intestino del sujeto es inferior al 1 %, preferiblemente inferior al 0,5 %, más preferiblemente inferior al 0,1 %, en número de célulasde Akkermansia muciniphilacon respecto al número total de células bacterianas en el intestino.

[0057] La presente divulgación también se refiere al uso cosmético deAkkermansia muciniphilapara favorecer la pérdida de peso en un sujeto.

[0058] Otro objetivo es, por lo tanto, una composición cosmética que comprende una cantidad cosméticamente eficaz deAkkermansia muciniphilay el uso de la misma para favorecer la pérdida de peso en un sujeto. Tal como se utiliza en el presente documento, una "cantidad cosméticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una composición cosmética necesaria y suficiente para favorecer un efecto cosmético, tal como, por ejemplo, para inducir la pérdida de peso en un sujeto.

[0059] La presente divulgación también se refiere a un procedimiento para favorecer la pérdida de peso en un sujeto que lo necesite, en el que dicho procedimiento comprende administrar una cantidad cosméticamente eficaz deAkkermansia muciniphilaa dicho sujeto.

[0060] En una realización, el procedimiento comprende administrar una cantidad cosméticamente eficaz de la composición o de la composición cosmética de la presente invención al sujeto.

[0061] En una realización de la presente invención, la cantidad cosméticamente eficaz deAkkermansia muciniphilavaría de aproximadamente 1.102 a aproximadamente 1.1015 ufc, preferiblemente de aproximadamente 1.104 a aproximadamente 1.1012 ufc, más preferiblemente de aproximadamente 1.105 a aproximadamente 1.1010 ufc y aún más preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc. En otra realización de la presente invención, la cantidad cosméticamente eficaz deAkkermansia muciniphilavaría de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.1010 ufc, preferiblemente de aproximadamente 1.108 a aproximadamente 1.1010 ufc, más preferiblemente de aproximadamente 1.109 a aproximadamente 1.1010 ufc. En otra realización de la presente invención, la cantidad cosméticamente eficaz deAkkermansia muciniphilavaría de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.1010ufc, preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc, más preferiblemente de aproximadamente 1.108 a aproximadamente 1.109 ufc.

[0062] En una realización de la presente invención,Akkermansia muciniphila,o la composición o la composición cosmética, se administra al menos una vez por semana, preferiblemente al menos dos veces por semana, más preferiblemente al menos tres veces por semana, e incluso más preferiblemente tres veces por semana. En otra realización,Akkermansia muciniphila,o la composición o la composición cosmética, se administra al menos una vez al día, preferiblemente al menos dos veces al día.

[0063] En una realización,Akkermansia muciniphilao la composición o composición cosmética de la presente invención se administra durante 1 semana, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas o más.

[0064] En una realización,Akkermansia muciniphila,o la composición o composición cosmética de la presente invención se administra durante un período que dura hasta que se logra el resultado deseado (por ejemplo, pérdida de peso...).

[0065] En una realización, la administración deAkkermansia muciniphila,o la composición o composición cosmética de la presente invención es permanente, es decir, no está limitada en el tiempo.

[0066] En una realización de la presente invención, la cantidad diaria deAkkermansia mudniphilaadministrada por día varía de 1.102 a aproximadamente 1.1015 ufc/día, preferiblemente de aproximadamente 1.105 a aproximadamente 1.1012 ufc/día, más preferiblemente de aproximadamente 1.108 a aproximadamente 1.1010 ufc/día, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 1.109 a aproximadamente 1.1010 ufc/día. En otra realización de la presente invención, la cantidad diaria deAkkermansia muciniphilaadministrada por día varía de 1.106 a aproximadamente 1.1010 ufc/día, preferiblemente de aproximadamente 1.108 a aproximadamente 1.1010 ufc/día, más preferiblemente de aproximadamente 1.109 a aproximadamente 1.1010 ufc/día. En otra realización de la presente invención, la cantidad diaria deAkkermansia muciniphilaadministrada por día varía de 1.106 a aproximadamente 1.1010 ufc/día, preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.109 ufc/día, más preferiblemente de aproximadamente 1.108 a aproximadamente 1.109 ufc/día.

[0067] En una realización, dicho sujeto no es un sujeto obeso. En otra realización, dicho sujeto tiene sobrepeso.

[0068] En una realización de la presente invención, la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o el medicamento comprende además cepas o especies probióticas adicionales, tales como, por ejemplo, cepas o especies probióticas bacterianas, probióticos procariotas distintos de las bacterias, o cepas o especies fúngicas, preferiblemente cepas o especies de levaduras. En una realización, dichas cepas o especies probióticas adicionales se seleccionan de entre las presentes de forma natural en el intestino del sujeto, preferiblemente en el intestino humano, más preferiblemente en el intestino de sujetos humanos sanos.

[0069] Los ejemplos de cepas o especies probióticas bacterianas que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero sin limitación, Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium, Veillonella, Desemzia, Coprococcus, Collinsella, Citrobacter, Turicibacter, Sutterella, Subdoligranulum, Streptococcus, Sporobacter, Sporacetigenium, Ruminococcus, Roseburia, Proteus, Propionobacterium, Leuconostoc, Weissella, Pediococcus, Streptococcus, Prevotella, Parabacteroides, Papillibacter, Oscillospira, Melissococcus, Dorea, Dialister, Clostridium, Cedecea, Catenibacterium, Butyrivibrio, Buttiauxella, Bulleidia, Bilophila, Bacteroides, Anaerovorax, Anaerostopes, Anaerofilum, Enterobacteriaceae, Fermicutes, Atopobium, Alistipes, Acinetobacter, Slackie, Shigella, Shewanella, Serratia, Mahella, Lachnospira, Klebsiella, Idiomarina, Fusobacterium, Faecalibacterium, Eubacterium, Enterococcus, Enterobacter, Eggerthella.

[0070] Los ejemplos de cepas o especies procariotas que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero sin limitación, Archaea, Firmicutes, Bacteroidetes (tales como, por ejemplo, Allistipes, Bacteroides ovatus, Bacteroides splachnicus, Bacteroides stercoris, Parabacteroides, Prevotella ruminicola, Porphyromondaceae y géneros relacionados), Proteobacteria, Betaproteobacteria (tales como, por ejemplo, Aquabacterium y Burkholderia), Gammaproteobacteria (tales como, por ejemplo, Xanthomonadaceae), Actinobacteria (tales como, por ejemplo, Actinomycetaceae y Atopobium), Fusobacteria, Methanobacteria, Spirochaetes, Fibrobacters, Deferribacteres, Deinococcus, Thermus, Cyanobacteria, Methanobrevibacteria, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Coprococcus, Subdolingranulum, Dorea, Bulleidia, Anaerofustis, Gemella, Roseburia, Dialister, Anaerotruncus, Staphylococcus, Micrococcus, Propionobacteria, Enterobacteriaceae, Faecalibacteria, Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, Eubacterium, Bacilli (tales como, por ejemplo, Lactobacillus salivarius y especies relacionadas, Aerococcus, Granulicatella, Streptococcus bovis y género relacionado y Streptococcus intermedius y género relacionado), Clostridium (tales como, por ejemplo, Eubacterium hallii, Eubacterium limosum y géneros relacionados) y Butyrivibrio.

[0071] Los ejemplos de cepas o especies probióticas de hongos, preferiblemente cepas o especies probióticas de levadura que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero sin limitación, Ascomycetes, Zygomycetes y Deuteromycetes, preferiblemente de los grupos Aspergillus, Torulopsis, Zygosaccharomyces, Hansenula, Candida, Saccharomyces, Clavispora, Bretanomyces, Pichia, Amylomyces, Zygosaccharomyces, Endomycess, Hyphopichia, Zygosaccharomyces, Kluyveromyces, Mucor, Rhizopus, Yarrowia, Endomyces, Debaryomyces y/o Penicillium.

[0072] El solicitante demuestra en el presente documento que los efectos beneficiosos observados tras la administración deAkkermansia muciniphilason específicos de esta cepa bacteriana. De hecho, los ejemplos demuestran que la administración de Lactobacillus plantarum WCSF-1 no tiene los mismos efectos beneficiosos.

[0073] En una realización de la presente invención, la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o el medicamento no comprenden las cepas bacterianas Lactobacillus-Enterococcus, Bacteroides y/o Atopobium.

[0074] En una realización de la presente invención, la única cepa o especie microbiana, preferiblemente cepa o especie bacteriana, comprendida en la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o medicamento esAkkermansia muciniphila.

[0075] En una realización de la presente invención, la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o el medicamento consiste enAkkermansia muciniphila.

[0076] En otra realización de la presente invención, la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o el medicamento consiste esencialmente enAkkermansia muciniphila,en la que "que consiste esencialmente en" en el presente documento significa queAkkermansia mudniphilaes la única cepa o especie microbiana, preferiblemente la única cepa o especie bacteriana comprendida en la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o el medicamento.

[0077] En una realización de la presente invención,Akkermansia muciniphilaactiva o inhibe el crecimiento y/o la actividad biológica de otra cepa o cepas o especies bacterianas de la microbiota intestinal.

[0078] En una realización de la presente invención, la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o el medicamento comprende además un prebiótico.

[0079] Los ejemplos de prebióticos que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, inulina y fructanos de tipo inulina, oligofructosa, xilosa, arabinosa, arabinoxilano, ribosa, galactosa, ramnosa, celobiosa, fructosa, lactosa, salicina, sacarosa, glucosa, esculina, tween 80, trehalosa, maltosa, manosa, melibiosa, moco o mucinas, rafinosa, fructooligosacáridos, galactooligosacáridos, aminoácidos, alcoholes y cualquier combinación de los mismos.

[0080] Otros ejemplos no limitantes de prebióticos incluyen derivados de celulosa solubles en agua, derivados de celulosa insolubles en agua, avena sin procesar, metamucil, salvado total y cualquier combinación de los mismos.

[0081] Los ejemplos de derivados de celulosa solubles en agua incluyen, pero sin limitación, metilcelulosa, metil etil celulosa, hidroxietil celulosa, etil hidroxietil celulosa, hidroxietil celulosa catiónica, hidroxipropil celulosa, hidroxietil metilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa y carboximetil celulosa.

[0082]Akkermansia muciniphilao la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o el medicamento de la presente invención pueden administrarse por diversas vías de administración. Ejemplos de vías de administración adaptadas incluyen, pero sin limitación, la administración oral, la administración rectal, la administración por esofagogastroduodenoscopia, la administración por colonoscopia, la administración mediante sonda nasogástrica u orogástrica, y similares.

[0083] Según una realización,Akkermansia muciniphilao la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o el medicamento de la presente invención están en una forma adaptada para administración oral. Según una primera realización, la forma adaptada para administración oral es una forma sólida seleccionada del grupo que comprende comprimidos, píldoras, cápsulas, cápsulas de gelatina blanda, píldoras recubiertas de azúcar, comprimidos orodispersantes/orodispersantes, comprimidos efervescentes u otros sólidos. Según una segunda realización, la forma adaptada para administración oral es una forma líquida, tal como, por ejemplo, una solución bebible, formas liposomales y similares.

[0084] En una realización, la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o el medicamento de la presente invención comprenden además excipientes, diluyentes y/o portadores seleccionados según la vía de administración prevista. Entre los ejemplos de excipientes, diluyentes y/o portadores se incluyen, pero sin limitación, agua, solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con fosfato anaeróbica, bicarbonato de sodio, zumo, leche, yogur, fórmula infantil, productos lácteos, agentes colorantes, tales como, por ejemplo, dióxido de titanio (E171), dióxido de hierro (E172) y negro brillante BN (E151); agentes aromatizantes; espesantes, tales como, por ejemplo, monoestearato de glicerol; edulcorantes; agentes de recubrimiento, tales como, por ejemplo, aceite de colza refinado, aceite de soja, aceite de cacahuete, lecitina de soja o gelatina de pescado; agentes diluyentes, tales como, por ejemplo, lactosa, lactosa monohidratada o almidón; agentes aglutinantes, tales como, por ejemplo, povidona, almidón pregelatinizado, gomas, sacarosa, polietilenglicol (PEG) 4000 o PEG 6000; agentes disgregantes, tales como, por ejemplo, celulosa microcristalina o carboximetilalmidón sódico, tal como, por ejemplo, carboximetilalmidón sódico tipo A; agentes lubricantes, tales como, por ejemplo, estearato de magnesio; agente de fluidez, tal como, por ejemplo, sílice coloidal anhidra, etc...

[0085] En una realización de la presente invención, la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o el medicamento están en forma de una composición nutricional, es decir, comprende alimento líquido o sólido, pienso o agua potable. En una realización de la presente invención, la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o el medicamento es un producto alimenticio, tal como, por ejemplo, productos lácteos, bebidas lácteas, yogur, zumo de frutas o verduras o su concentrado, polvos, bebidas a base de malta o soja o cereales, cereales para el desayuno, tales como copos de muesli, zumo de frutas y verduras en polvo, barritas de cereales y/o chocolate, dulces, cremas para untar, harinas, leche, batidos, dulces, producto lácteo, leche en polvo, leche reconstituida, leche cultivada, yogur, yogur líquido, yogur cuajado, bebida, bebida láctea, bebida de leche, chocolate, geles, helados, cereales, productos de fruta reconstituidos, barritas de refrigerio, barritas alimenticias, barritas de muesli, cremas para untar, salsas, salsa para acompañar, productos lácteos, incluyendo yogures y quesos, bebidas, incluyendo bebidas lácteas y no lácteas, suplementos deportivos, incluyendo suplementos deportivos lácteos y no lácteos.

[0086] En una realización de la presente invención, la composición, la composición farmacéutica, la composición cosmética o el medicamento están en forma de un aditivo alimentario, aditivo de bebida, suplemento dietético, producto nutricional, alimento médico o composición nutracéutica.

[0087]Akkermansia mudniphilaes una bacteria estrictamente anaerobia. Por lo tanto, en la realización donde se utilizan cepas viables o vivas, debe evitarse el contacto prolongado con el oxígeno. Ejemplos de medios para evitar el contacto prolongado con el oxígeno incluyen, pero sin limitación, la congelación de las células bacterianas o el envasado en un recipiente sellado, y similares.

[0088] El solicitante demostró en el presente documento que la obesidad y los trastornos relacionados están asociados con una mayor permeabilidad intestinal y con una producción deteriorada de moco, barrera epitelial, sistema inmunitario y/o producción de compuestos antibacterianos por parte del sujeto; y que la administración deA. muciniphilapuede restaurar estos parámetros.

[0089] El solicitante demostró sorprendentemente que la administración deA. muciniphilacontrola la barrera intestinal al regular el grosor de la capa mucosa y la producción de péptidos antimicrobianos en el colon (tales como, por ejemplo, RegIIIgamma). Además, también demostró queA. muciniphilaregula la producción de acilgliceroles, pertenecientes a la familia de los endocannabinoides, implicados en el control de la inflamación, la barrera intestinal y la secreción de péptidos intestinales (GLP-1 y GLP-2). GLP-1 y GLP-2 participan en diversas funciones, que incluyen la mejora de la señalización de la insulina, la disminución de la inflamación y la estimulación de la saciedad.

[0090] Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere aAkkermansia muciniphilapara controlar la función de la barrera intestinal, y a un procedimiento para controlar la función de la barrera intestinal que comprende la administración de una cantidad eficaz o cosméticamente eficaz deAkkermansia muciniphilaa un sujeto que lo necesite. En una realización,Akkermansia muciniphilaregula el grosor de la capa mucosa (que puede disminuir en casos de obesidad u otros trastornos metabólicos). En otra realización, la administración deAkkermansia muciniphilainduce la producción de péptidos antimicrobianos de colon, tales como, por ejemplo, RegIIIgamma. En otra realización, la administración deAkkermansia muciniphilainduce la producción de compuestos de la familia de los endocannabinoides, tales como, por ejemplo, acilgliceroles seleccionados del grupo que comprende 2-oleoilglicerol, 2-palmitoilglicerol y 2-araquidonoilglicerol. En otra realización, la administración deAkkermansia muciniphilaregula el recambio mucoso.

[0091] El solicitante también demostró que la administración deAkkermansia muciniphilacontrola el almacenamiento de grasa y el metabolismo del tejido adiposo.

[0092] El solicitante también demostró que la administración deAkkermansia muciniphilaregula el metabolismo del tejido adiposo y la homeostasis de la glucosa.

[0093] Además, el solicitante demostró que la administración deAkkermansia muciniphilaconduce a la normalización de la subpoblación de macrófagos CD11c en el tejido adiposo. La cantidad de células de esta población de macrófagos aumenta en trastornos metabólicos, tales como, por ejemplo, la obesidad y la diabetes tipo 2, y es un signo distintivo de la inflamación relacionada con estos trastornos metabólicos. Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere aAkkermansia muciniphilapara el tratamiento de la inflamación, preferiblemente inflamación de grado leve, asociada con o causada por trastornos metabólicos; y a un procedimiento para el tratamiento de la inflamación relacionada con trastornos metabólicos que comprende la administración de una cantidad eficaz o cosméticamente eficaz deAkkermansia muciniphilaa un sujeto que lo necesite. En una realización de la presente invención, la administración deAkkermansia muciniphiladisminuye la cantidad de macrófagos CD11c en el tejido adiposo.

[0094] Finalmente, el solicitante demostró que la administración deAkkermansia muciniphiladisminuye el colesterol plasmático en ratones alimentados con una dieta rica en grasas.

[0095] La administración deAkkermansia muciniphilaa un sujeto no afecta en la ingesta de alimentos de dicho sujeto.

[0096] La administraciónde Akkermansia muciniphilaa un sujeto aumenta el gasto de energía de dicho sujeto, preferiblemente sin afectar la ingesta de alimentos de dicho sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0097]

• La Figura 1 es una combinación de gráficos que muestran que la abundanciade Akkermansia muciniphiladisminuye en ratones obesos y diabéticos, mientras que el tratamiento con prebiótico la restaura a niveles basales y mejora la endotoxemia metabólica y los trastornos relacionados. (a) Abundancia deAkkermansia muciniphila(Log10 de bacterias/g de contenido cecal) medida en el contenido cecal de ratones obesos deficientes en leptina (obob) (n = 5) y sus compañeros de camada delgados (delgado) (n = 5). (b) Abundancia deAkkermansia muciniphila(Log10 de bacterias/g de contenido cecal) medida en el contenido cecal de ratones obesos alimentados con una dieta de pienso normal (ob-CT) o tratados con prebióticos (ob-Pre) durante 5 semanas (n = 10). (c) Abundancia deAkkermansia mudniphila(Log10 de bacterias por g de contenido cecal) medida en el contenido cecal de ratones alimentados con dieta de control (CT) o ratones alimentados con dieta CT tratados con prebióticos (CT-Pre) añadidos en agua del grifo y ratones alimentados con dieta HF (HF) o ratones alimentados con dieta HF tratados con prebióticos (HF-Pre) añadidos en agua del grifo durante 8 semanas (n = 10). (d) Niveles séricos de LPS en la vena porta (n = 7 9). (e) ARNm de CD11c marcador de infiltración de macrófagos del tejido adiposo (n = 10). (f) Correlación de Pearson entre los valores logarítmicos de los niveles de LPS en la vena porta y la abundancia deAkkermansia muciniphila(Log10 de bacterias por g de contenido cecal), el recuadro indica el coeficiente de correlación de Pearson (r) y el valor P correspondiente. (g) Aumento de masa grasa total medida por resonancia magnética nuclear de dominio temporal (n = 10). Los datos en a-c se muestran como diagramas de caja. * P < 0,05, mediante la prueba t de Student de dos colas. Los datos en c-g se obtuvieron del mismo grupo de ratones. Los datos en d, e y g se muestran como media ± s.e.m. Los datos con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P < 0,05), según el análisis estadístico ANOVA post-hoc de una vía.

• La Figura 2 es una combinación de gráficos e imágenes que muestran queAkkermansia muciniphilacambia la composición de la microbiota intestinal, contrarresta la disfunción de la barrera intestinal inducida por la dieta, cambia el nivel intestinal de endocannabinoides y mejora los trastornos metabólicos en ratones con obesidad inducida por la dieta. Los ratones fueron tratados por sonda oral diaria conAkkermansia muciniphila(2.108 células bacterianas suspendidas en 200 pl de solución salina tamponada con fosfato anaeróbica estéril (PBS)) y alimentados con una dieta de control (CT-Akk) o una dieta HF (HF-Akk) en comparación con ratones alimentados con una dieta de control (CT) o una dieta rica en grasas (HF,High Fat)y tratados por sonda oral diaria con un volumen equivalente de PBS anaeróbico estéril durante 4 semanas (n = 10). (a) Análisis de PCA basado en huellas filogenéticas MITChip de la microbiota intestinal de los contenidos cecales de los grupos de control (CT y HF) y los grupos tratados conAkkermansia muciniphila(CTA y HFA). (b) Niveles séricos de LPS en la vena porta (n = 6-10). (c) Abundancia total de masa grasa medida por resonancia magnética nuclear de dominio temporal (n = 10). (d) El índice de resistencia a la insulina se determinó multiplicando el área bajo la curva (de 0 min a 15 min) de la glucosa en sangre y la insulina plasmática obtenida después de una carga oral de glucosa (2 g de glucosa por kg de peso corporal) realizada después de 4 semanas de tratamiento (n = 10). (e) ARNm de CD11c marcador de infiltración de macrófagos del tejido adiposo (n = 10). (f) La expresión de ARNm de los marcadores de diferenciación de adipocitos (CCAAT/proteína a de unión al potenciador, codificada por Cebpa), lipogénesis (acetil-CoA carboxilasa, codificada por Acc1, ácido graso sintasa, codificada por Fasn) y oxidación de lípidos (carnitina palmitoiltransferasa-1, codificada por Cpt1; acil-CoA-oxidasa codificada por Acox1; coactivador del receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas, codificado por Pgcla; y receptor alfa activado por el proliferador de peroxisomas, codificado por Ppara) se midió en los depósitos de grasa visceral (grasa mesentérica) (n = 10). (g) 2-palmitoilglicerol (2-PG), 2-oleilglicerol (2-OG), 2-araquidonoilglicerol (2-AG) del íleon (expresados como % del control) (n = 10). (h) Grosor de la capa mucosa medido mediante análisis histológicos tras tinción con azul alcián. Imágenes representativas de azul alcián utilizadas para las mediciones del grosor de la capa mucosa, barras = 40 pm (n = 7-8). (i) Expresión del ARNm de 3-gamma derivado de islotes regeneradores de colon (RegNIy, codificada por Reg3g) (n = 10). Los datos en a-i se han obtenido en el mismo grupo de ratones. Los datos en b-i se muestran como media ± s.e.m. Los datos con diferentes letras en superíndice son significativamente diferentes (P < 0,05), según el análisis estadístico ANOVA de una vía post-hoc.

• La Figura 3 es una combinación de gráficos e imágenes que muestran que los ratones tratados con prebióticos exhibieron una relación inversa entreAkkermansia muciniphilay la infiltración de macrófagos del tejido adiposo o el aumento de masa grasa. (a) Correlación de Pearson entre los niveles de ARNm de CD11c del tejido adiposo y la abundanciade Akkermansia muciniphila(Log10 de bacterias por g de contenido cecal) medida en el contenido cecal de ratones alimentados con dieta de control (CT) o ratones alimentados con dieta CT tratados con prebióticos (CT-Pre) añadidos en agua del grifo y ratones alimentados con dieta HF (HF) o ratones alimentados con dieta HF tratados con prebióticos (HF-Pre) añadidos en agua del grifo durante 8 semanas, el recuadro indica el coeficiente de correlación de Pearson (r) y el valor P correspondiente. (b) Peso de los depósitos de grasa subcutánea, mesentérica y epididimaria (g por 100 g de peso corporal) (n = 10). (c) Correlación de Pearson entre el aumento de masa de tejido adiposo y la abundanciade Akkermansia muciniphilaen el contenido cecal (Log10 de bacterias por g de contenido cecal), el recuadro indica el coeficiente de correlación de Pearson (r) y el valor P correspondiente. Los datos en a-c se obtuvieron en el mismo grupo de ratones y se muestran como media ± s.e.m. Los datos con diferentes letras en superíndice son significativamente diferentes (P < 0,05), según el análisis estadístico de ANOVA de una vía post-hoc.

• La Figura 4 es una combinación de gráficos que muestran que la sonda oral diaria conAkkermansia muciniphilaaumenta la abundancia cecal de estas bacterias. Abundanciade Akkermansia muciniphilaexpresada como (a) % del ARN 16S total o (b) Log10 copias de ADN medidas en ratones tratados mediante sonda oral diaria conAkkermansia muciniphila(2.108 células bacterianas suspendidas en 200 pl de solución salina tamponada con fosfato anaeróbica estéril (PBS)) y alimentados con una dieta de control (CT-Akk) o una dieta con HF (HF-Akk) en comparación con ratones alimentados con una dieta de control (CT) o una dieta rica en grasas (HF) y tratados mediante sonda oral diaria con un volumen equivalente de PBS anaeróbica estéril durante 4 semanas (n = 10).

• La Figura 5 es una combinación de gráficos e imágenes que muestran que el tratamiento conAkkermansia muciniphilareduce la masa grasa sin afectar la ingesta de alimentos. (a) Peso de los depósitos de grasa subcutánea, mesentérica y epididimaria (g por 100 g de peso corporal) de ratones tratados mediante sonda oral diaria conAkkermansia muciniphila(2.1o8 células bacterianas suspendidas en 200 j l de solución salina tamponada con fosfato anaeróbico estéril (PBS)) y alimentados con una dieta de control (CT-Akk) o una dieta con HF (HF-Akk) o ratones alimentados con una dieta de control (CT) o una dieta rica en grasas (HF) y tratados mediante sonda oral diaria con un volumen equivalente de PBS anaeróbico estéril durante 4 semanas (n = 10). (b) Ingesta acumulada de alimento (g) durante las 4 semanas de tratamiento. (c) Peso corporal final (n = 10). (d) Masa grasa y magra final expresada en porcentaje del peso corporal final y medida utilizando RMN de dominio temporal de 7,5 MHz (LF50 minispec; Bruker, n = 10). Los datos se muestran como media ± s.e.m. Los datos con diferentes letras en superíndice son significativamente diferentes (P < 0,05), según el análisis estadístico ANOVA de una vía post-hoc.

• La Figura 6 es una combinación de gráficos que muestran que el tratamiento conAkkermansia muciniphilanormaliza la glucemia en ayunas y reduce la expresión hepática del ARNm de G6pc en ayunas. (a) Glucemia en ayunas medida en ratones tratados mediante sonda oral diaria conAkkermansia muciniphila(2.108 células bacterianas suspendidas en 200 j l de solución salina tamponada con fosfato anaeróbica estéril (PBS)) y alimentados con una dieta de control (CT-Akk) o una dieta con HF (HF-Akk) o ratones alimentados con una dieta de control (CT) o una dieta rica en grasas (HF) y tratados mediante sonda oral diaria con un volumen equivalente de PBS anaeróbica estéril durante 4 semanas (n = 10). (b) Niveles de expresión del ARNm de la glucosa-6 fosfatasa (codificada por G6pc) medidos en el hígado al final del período de 4 semanas (n = 10). Los datos se muestran como media ± s.e.m. Los datos con diferentes letras en superíndice son significativamente diferentes (P < 0,05), según el análisis estadístico de ANOVA de una vía post-hoc.

• La Figura 7 es una combinación de gráficos que muestran que el tratamiento conAkkermansia muciniphilatiene efectos menores en el contenido de péptidos antibacterianos en el íleon y en los niveles de IgA en las heces. Expresión de ARNm de péptidos antibacterianos de (a) 3-gamma derivado de islotes regeneradores (RegIIIy, codificada por Reg3g), (b) fosfolipasa A2 grupo IIA (codificada por Pla2g2a), (c) a-defensinas (codificadas por Defa) y (d) lisozima C (codificada por Lyzl) medida en el íleon de ratones tratados mediante sonda oral diaria conAkkermansia muciniphila(2.108 células bacterianas suspendidas en 200 j l de solución salina tamponada con fosfato anaeróbica estéril (PBS)) y alimentados con una dieta de control (CT-Akk) o una dieta con HF (HF-Akk) o ratones alimentados con una dieta de control (CT) o una dieta rica en grasas (HF) y tratados mediante sonda oral diaria con un volumen equivalente de PBS anaeróbico estéril durante 4 semanas (n = 10). (e) Niveles de IgA fecal (jg /g de heces). Los datos se muestran como media ± s.e.m. Los datos con diferentes superíndices presentan diferencias significativas (P < 0,05), según el análisis estadístico ANOVA de una vía post-hoc.

• La Figura 8 es una combinación de histogramas, gráficos e imágenes que muestran que A.muciniphilainactivada por calor no contrarrestó la endotoxemia metabólica, la obesidad inducida por la dieta, la intolerancia oral a la glucosa, no mejoró el metabolismo del tejido adiposo ni la función de la barrera intestinal en ratones con obesidad inducida por la dieta. Los ratones de control fueron alimentados con una dieta de control (CT) o con HF (HF) y tratados con una sonda oral diaria que contenía PBS anaeróbica estéril y glicerol durante 4 semanas diariamente. Los ratones tratados recibieron una sonda oral de A.muciniphilaviva (HF-Akk) oA. muciniphilametabólicamente inactivada (HF-K-Akk) (2.108 células bacterianas suspendidas en 200 j l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) anaeróbica estéril) y se alimentaron con una dieta de HF (n = 8). (A) Niveles séricos de LPS de la vena porta (n = 6-7). (B) Abundancia total de masa grasa medida por resonancia magnética nuclear de dominio temporal (n = 7-8). (C) Perfil de glucosa plasmática después de una estimulación oral de glucosa de 2 g/kg en ratones que se mueven libremente, y el histograma en (D) muestra el área media bajo la curva (AUC) medida entre 0 y 120 min después de la carga de glucosa (n = 7-8). (E) La expresión de ARNm de marcadores de diferenciación de adipocitos (Cebpa), lipogénesis (Accl; Fasn) y oxidación lipídica (Cptl; Acoxl; Pgcla; y Ppara) se midió en depósitos de grasa visceral (grasa mesentérica) (n = 8). (F) Grosor de la capa de moco medido mediante análisis histológicos después de tinción con azul alcián (CT n = 4, HF n = 6, HF-Akk y HF-K-Akk n = 5). (G) Imágenes representativas de azul alcián que se utilizaron para mediciones del grosor de la capa de moco, barras = 40 jm . M = mucosa, IM = capa de moco interna. Los datos se muestran como medias ± s.e.m. Los datos con diferentes letras en superíndice son significativamente diferentes (P < 0,05) según el análisis estadístico de ANOVA de una vía post-hoc. •

• La Figura 9 es una combinación de histogramas que muestra queA. muciniphilainactivada por calor no redujo la masa grasa subcutánea, mesentérica y epididimaria y no aumentó los péptidos antimicrobianos del colon en ratones con una dieta con HF. (A) Pesos de los depósitos de grasa subcutánea, mesentérica y epididimaria (g por 100 g de peso corporal) medidos en ratones de control alimentados con una dieta de control (CT) o con HF (HF) y tratados con una sonda oral diaria que contenía PBS anaeróbico estéril y glicerol durante 4 semanas diariamente. Los ratones tratados recibieron una sonda oral deA. muciniphilaviva (HF-Akk) oA. muciniphilamuerta (HF-K-Akk) (2.108 células bacterianas suspendidas en 200 j l de PBS anaeróbico estéril) y alimentados con una dieta con HF (n = 8). (B) Expresión de ARNm de 3-gamma derivado de islotes regeneradores de colon (RegIIIy, codificada por Reg3g) (n = 8 18), los datos representan los resultados de los dos estudiosde A. muciniphila.Los datos se muestran como media ± s.e.m. Los datos con diferentes letras en superíndice son significativamente diferentes (P < 0,05) según un análisis estadístico ANOVA de una vía post-hoc.

• La Figura 10 es una combinación de histogramas que muestran la eficiencia de un tratamiento con A.muciniphila3 veces por semana durante 8 semanas. (A) Peso corporal (g) medido en ratones control alimentados con una dieta de control (CT) (n = 8) o con HF (HF) (n = 10) y tratados 3 veces por semana por sonda oral con PBS anaeróbico estéril que contiene glicerol oA. muciniphila(HF-Akk) (n = 10) durante 8 semanas. (2.108 células bacterianas suspendidas en 200 j l de PBS anaeróbico estéril). (B) Masa de grasa subcutánea. (C) Tejidos adiposos viscerales (mesentérico y epididimario). Los datos se muestran como medias ± s.e.m. Los datos con diferentes letras en superíndice son significativamente diferentes (P<0,05) según un análisis estadístico ANOVA de una vía post-hoc.

• La Figura 11 es un histograma que muestra queA. muciniphilareduce el colesterol plasmático en ratones alimentados con una dieta rica en grasas. (CT) Ratones alimentados con una dieta de control; (Akk) Ratones tratados por sonda oral diaria conAkkermansia muciniphila(2.108 células bacterianas suspendidas en 200 j l de solución salina tamponada con fosfato anaeróbica estéril (PBS)) y alimentados con una dieta de control; (HF) Ratones alimentados con una dieta rica en grasas; (HF-Akk) Ratones tratados por sonda oral diaria conAkkermansia muciniphila(109 células bacterianas suspendidas en 200 j l de solución salina tamponada con fosfato anaeróbica estéril (PBS)) y alimentados con una dieta HF.

• La Figura 12 es una combinación de histogramas que muestran que L. plantarum WCFS1 no redujo la masa grasa ni mejoró el metabolismo del tejido adiposo ni la función de la barrera intestinal en ratones con obesidad inducida por la dieta. Los ratones de control fueron alimentados con una dieta control (CT) o con HF (HF) y tratados con una sonda oral diaria que contenía PBS anaeróbico estéril y glicerol durante 4 semanas. Los ratones tratados recibieron una sonda oral de L. plantarum WCFS1 (HF-LP) (2.108 células bacterianas suspendidas en 200 jL de PBS anaeróbico estéril) y se alimentaron con una dieta de HF (n = 7-8). (A) Masa grasa final medida mediante RMN de dominio temporal (n = 7-8). Pesos de los depósitos de grasa s.c., mesentérica y epididimaria (g/100 g de peso corporal) (n = 7-8). (B) La expresión de ARNm de marcadores de diferenciación de adipocitos (Cebpa ), lipogénesis (Accl; Fasn) y oxidación de lípidos (Cptl; Acoxl; Pgcla; y Ppara ) se midió en depósitos de grasa visceral (grasa mesentérica) (n = 7-8). (C) Grosor de la capa de moco medido mediante análisis histológicos después de la tinción con azul alcián (n = 4-6). (D) Niveles séricos de LPS en la vena porta (n = 6-7). (E) Expresión de ARNm de RegNIy de colon (codificado por Reg3g) Expresión de ARNm (n = 8-18). Los datos se muestran como medias ± s.e.m. Los datos con diferentes letras en superíndice son significativamente diferentes (P < 0,05) según el análisis estadístico post hoc ANOVA de una vía.

EJEMPLOS

[0098] La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos.

Materiales y procedimientos

Ratones

[0099] Experimento ob/ob: Estudio ob/ob versus delgado: Ratones ob/ob de seis semanas de edad (n = 5/grupo) (C57BL/6, Jackson-Laboratory, Bar Harbor, ME, EE. UU.) se alojaron en un ambiente controlado (ciclo de luz diurna de 12 h, con luces apagadas a las 18 h) en grupos de dos o tres ratones por jaula, con libre acceso a alimento y agua. Los ratones se alimentaron con una dieta de control (A04, Villemoisson-sur-Orge, Francia) durante 16 semanas. El contenido cecal se recogió sumergido en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C para su posterior análisis deAkkermansia muciniphila.

[0100] Estudio prebiótico ob/ob: Ratones ob/ob de seis semanas de edad (n = 10/grupo) (C57BL/6, Jackson-Laboratory, Bar Harbor, ME, EE. UU.) se alojaron en un entorno controlado (ciclo de luz diurna de 12 h, con luces apagadas a las 18 h) en grupos de dos ratones por jaula, con libre acceso a alimento y agua. Los ratones se alimentaron con una dieta de control (Ob-CT) (A04, Villemoisson-sur-Orge, Francia) o una dieta de control suplementada con prebióticos, tales como oligofructosa (Ob-Pre) (Orafti, Tienen, Bélgica), durante 5 semanas, tal como se describió previamente (Everard et al. Diabetes 60, 2775-2786 (2011)). Este conjunto de ratones ha sido caracterizado previamente en Everard et al. (Everard et al. Diabetes 60, 2775-2786 (2011))).

[0101] Experimento con prebióticos ricos en grasas: Un grupo de ratones C57BL/6J de 10 semanas de edad (40 ratones, n = 10/grupo) (Charles River, Bruselas, Bélgica) se alojaron en grupos de cinco ratones por jaula, con libre acceso a alimento y agua. Los ratones se alimentaron con una dieta de control (CT) (A04, Villemoisson-sur-Orge, Francia) o una dieta de control y se trataron con prebióticos, tales como oligofructosa (Orafti, Tienen, Bélgica) (0,3 g/ratón/día) añadida al agua del grifo (CT-Pre), o se alimentaron con una dieta rica en grasas (HF) (60 % de grasas y 20 % de carbohidratos [kcal/100 g], D12492, Research diet, New Brunswick, NJ, EE. UU.) o una dieta HF y se trataron con oligofructosa (0,3 g/ratón/día) añadida al agua del grifo (HF-Pre). El tratamiento se prolongó durante 8 semanas.

[0102] Tratamiento conAkkermansia muciniphilaHFD: Un grupo de ratones C57BL/6J de 10 semanas de edad (40 ratones, n = 10/grupo) (Charles River, Bruselas, Bélgica) se alojaron en grupos de 2 ratones por jaula, con libre acceso a alimento y agua. Los ratones se alimentaron con una dieta de control (CT) (AIN93Mi; dieta de investigación, New Brunswick, NJ, EE. UU.) o una dieta rica en grasas (HF) (60%de grasas y 20%de carbohidratos [kcal/100 g], D12492, dieta de investigación, New Brunswick, NJ, EE. UU.). Los ratones se trataron con una administración oral deAkkermansia mudniphilapor sonda oral a una dosis de 2.108 ufc/0,2 ml, suspendida en solución salina tamponada con fosfato anaeróbico estéril (CT-Akk y HF-Akk), y los grupos control se trataron con una sonda oral de un volumen equivalente de solución salina tamponada con fosfato anaeróbico estéril (CT y HF). El tratamiento se prolongó durante 4 semanas.

[0103]A. muciniphilaMucT (ATTC BAA-835) se cultivó anaeróbicamente en un medio basal basado en mucina como se describió previamente (Derrien et al Int J Syst Evol Microbiol 54, 1469-1476 (2004)) y, a continuación, se lavaron y suspendieron en solución salina tamponada con fosfato anaeróbico, que incluía 25 % (v/v) de glicerol, hasta una concentración final de 1.1010 ufc/ml.

[0104] Tratamiento conAkkermansia muciniphilaviva con dieta rica en grasas (HFD) frente a destruida por calor y Lactobacillus platarum WCFS1: Un grupo de ratones C57BL/6J de 10 semanas de edad (40 ratones, n = 8/grupo) (Charles River, Bruselas, Bélgica) se alojaron en grupos de 2 ratones por jaula, con libre acceso a alimento y agua. Los ratones se alimentaron con una dieta de control (CT) (AIN93Mi; dieta de investigación, New Brunswick, NJ, EE. UU.) o una dieta rica en grasas (HF) (60 % de grasas y 20 % de carbohidratos [kcal/100 g], D12492, dieta de investigación, Nuevo Brunswick, NJ, EE. UU.). Los ratones fueron tratados diariamente con una administración oral deAkkermansia muciniphilamediante sonda oral a la dosis de 2.108 ufc/0,2 ml suspendida en solución salina tamponada con fosfato anaeróbico estéril.A. muciniphilafue destruida por calor/inactivada mediante autoclave (15 min, 121°C, 225 kPa). Una comprobación de viabilidad mediante cultivo en medio que contenía mucina confirmó la ausencia de células viables. Lactobacillus plantarum WCFS1 se cultivó anaeróbicamente en medio MRS (caldo Difco Lactobacilli MRS; BD), se lavó, se concentró y se manipuló de forma idéntica a la preparación deA. muciniphila.Los dos grupos de control (CT y HF) fueron tratados diariamente con una sonda oral de un volumen equivalente de PBS anaeróbico estéril que contenía una concentración final similar de glicerol (2,5 %) (reducida con una gota de citrato de titanio 100 mM) como los grupos de tratamiento durante 4 semanas.

[0105] Se registró la ingesta de alimentos y agua una vez por semana. La composición corporal se evaluó utilizando resonancia magnética nuclear de dominio temporal (RMN-DT) de 7,5 MHz (LF50 minispec, Bruker, Rheinstetten, Alemania).

[0106] Todos los experimentos con ratones fueron aprobados y realizados de acuerdo con las directrices del comité de ética local. Las condiciones de alojamiento se especificaron en la Ley belga del 6 de abril de 2010 sobre la protección de los animales de laboratorio (n.° de acuerdo LA1230314).

Muestreo de tejido

[0107] Los animales fueron anestesiados con isoflurano (Forene®, Abbott, Queenborough, Kent, Inglaterra) antes de la exanguinación y la toma de muestras de tejido, posteriormente, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Se diseccionaron y pesaron con precisión los depósitos adiposos (epididimario, subcutáneo y mesentérico) y el hígado; la suma de los tres tejidos adiposos corresponde al índice de adiposidad. Los segmentos intestinales (íleon, ciego y colon), el contenido cecal y los tejidos adiposos se sumergieron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para su posterior análisis.

Grosor de la capa de moco

[0108] Se extrajeron inmediatamente los segmentos proximales del colon y se fijaron en solución de Carnoy (etanolácido acético-cloroformo, 6/3/1 v/v/v) durante dos horas a 4 °C. Posteriormente, las muestras se sumergieron en etanol al 100 % durante 24 horas antes de su procesamiento para inclusión en parafina. Secciones en parafina de 5 pm se tiñeron con azul alcián. Un investigador, que desconocía los grupos experimentales, realizó un mínimo de 20 mediciones diferentes perpendiculares a la capa mucosa interna por campo. Se analizaron de 5 a 19 campos seleccionados aleatoriamente por cada colon, para un total de 2146 mediciones, utilizando un analizador de imágenes (Motic-image Plus 2.0ML, Motic, China).

Preparación de ARN y análisis qPCR en tiempo real

[0109] El ARN total se preparó a partir de tejidos utilizando el reactivo TriPure (Roche). La cuantificación y el análisis de integridad del ARN total se realizaron procesando 1 pl de cada muestra en un bioanalizador Agilent 2100 (kit Agilent RNA 6000 Nano, Agilent).

[0110] El ADNc se preparó mediante transcripción inversa de 1 pg de ARN total utilizando un kit de sistema de transcripción inversa (Promega, Leiden, Países Bajos). Las PCR en tiempo real se realizaron con el sistema y el software de PCR en tiempo real StepOnePlus™ (Applied Biosystems, Den Ijssel, Países Bajos) utilizando Mesa Fast qPCR™ (Eurogentec, Seraing, Bélgica) para la detección, según las instrucciones del fabricante. Se seleccionó RPL19 como gen constitutivo. Todas las muestras se analizaron por duplicado en una placa de reacción de 96 pocillos y los datos se analizaron según el procedimiento 2-ACT. La identidad y la pureza del producto amplificado se comprobaron mediante el análisis de la curva de fusión realizada al final de la amplificación. Las secuencias de cebadores para los genes de ratón diana se presentan en la Tabla 1 a continuación. Cebadores Secuencia RPL-19 Directo GAAGGTCAAAGGGAATGTGTTCA (SEQ ID NO: 1) Inverso CCTGTTGCTCACTTGT (SEQ ID NO: 2) Reg3g Directo TTCCTGTCCTCCATGATCAAA (SEQ ID NO: 3) Inverso CATCACCTCTGTTGGGTTC (SEQ ID NO: 4) Lyz1 Directo GCCAAGGTCTACAATCGTTGTGAGTTG (SEQ ID NO: 5) Inverso CAGTCAGCCAGCTTGACACCACG (SEQ ID NO: 6) Pla2g2a Directo AGGATTCCCCCAAGGATGCCAC (SEQ ID NO: 7) Inverso CAGCCGTTTCTGACAGGAGTTCTGG (SEQ ID NO: 8) CD11cc Directo ACGTCAGTACAAGGAGATGTTGGA (SEQ ID NO: 9) Inverso ATCCTATTGCAGAATGCTTCTTTACC (SEQ ID NO: 10) Defa Directo GGTGATCATCAGACCCCAGCATCAGT (SEQ ID NO: 11) Inverso AAGAGACTAAAACTGAGGAGCAGC (SEQ ID NO: 12) Fasn Directo TTCCAAGACGAAAATGATGC (SEQ ID NO: 13) Inverso AATTGTGGGATCAGGAGAGC (SEQ ID NO: 14) Cptla Directo AGACCGTGAGGAACTCAAACCTAT (SEQ ID NO: 15) Inverso TGAGAGTCGCTCCCACT (SEQ ID NO: 16) Pgcla Directo AGCCGTGACCACTGACAACGAG (SEQ ID NO: 17) Inverso GCTGCATGTTCTGAGTGCTAAG (SEQ ID NO: 18) Ppara Directo CAACGGCGTCGAAGACAAA (SEQ ID NO: 19) Inverso TGACGGTTCCACGGACAT (SEQ ID NO: 20) Acox1 Directo CTATGGGATCAGCCAGAAAGG (SEQ ID NO: 21) Inverso AGTCAAAGGCATCCACCAAAG (SEQ ID NO: 22) Acc1 Directo TGTTGAGACGCTGGTTTGTAGAA (SEQ ID NO: 23) Inverso GGTCCTTATTATTGTCCCAGACGTA (SEQ ID NO: 24) Cebpa Directo GAGCCGAGATAAAGCCAAACA (SEQ ID NO: 25) Inverso GCGCAGGCGGTCATTG (SEQ ID NO: 26) G6pc Directo AGGAAGGATGGAGGAAGGAA (SEQ ID NO: 27) Inverso TGGAACCAGATGGGAAAGAG (SEQ ID NO: 28)

Índice de resistencia a la insulina

[0111] El índice de resistencia a la insulina se determinó multiplicando el área bajo la curva (0 min y 15 min) de la glucemia y la insulina plasmática obtenida después de una carga oral de glucosa (2 g de glucosa por kg de peso corporal) realizada tras 4 semanas de tratamiento (estudiocon A. muciniphila).Se retiró la alimentación dos horas después del inicio del ciclo diurno y los ratones fueron tratados tras un periodo de ayuno de 6 h, tal como se describió previamente (Everard y otros. Diabetes 60, 2775-2786 (2011))).

Análisis bioquímicos

[0112] La concentración de LPS en sangre de la vena porta se midió utilizando Endosafe-MCS (Charles River Laboratories, Lyon, Francia) basado en la metodología cromogénica cinética del lisado de amabocitos de Limulus (LAL), que mide la intensidad del color directamente relacionada con la concentración de endotoxinas en una muestra. El suero se diluyó 1/10 con un tampón sin endotoxinas para minimizar las interferencias en la reacción (inhibición o potenciación) y se calentó durante 15 minutos a 70 °C. Cada muestra se diluyó 1/70 o 1/100 con agua reactiva LAL sin endotoxinas (Charles River Laboratories) y se trató por duplicado, y se incluyeron dos adiciones para cada muestra en la determinación. Todas las muestras han sido validadas para la recuperación y el coeficiente de variación. El límite inferior de detección fue de 0,005 UE/ml. La concentración plasmática de insulina se determinó en 25 pl de plasma utilizando un kit de ELISA (Mercodia, Upssala, Suecia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0113] Los niveles de IgA fecal se determinaron mediante un kit de ELISA (E99-103, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Las heces recién recogidas se congelaron a -80 °C y a continuación se diluyeron en Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,14 M, albúmina sérica bovina al 1 % y Tween 20 al 0,05 %. Se utilizó una dilución 1/250 para medir la IgA mediante ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Aislamiento de ADN a partir de muestras cecales de ratón

[0114] El contenido cecal de los ratones, recogido post mortem, se conservó a -80 °C. Se extrajo ADN metagenómico del contenido cecal utilizando un minikit de heces QIAamp-DNA (Qiagen, Hilden, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Medición de los niveles intestinales de endocannabinoides

[0115] Los tejidos del íleon se homogeneizaron en CHCl3 (10 ml) y se añadieron patrones deuterados. Las curvas de extracción y calibración se generaron como se describió previamente (Muccioli et al., Mol Syst Biol, 2010, 6, 392) y los datos se normalizaron según el peso de la muestra de tejido.

qPCR: cebadores y condiciones

[0116] Los cebadores y sondas utilizados para detectarAkkermansia mudniphilase basaron en secuencias del gen ARNr 16S: F-Akkermansia muciniphila CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT (SEQ ID NO: 29), R -Akkermansia muciniphilaCAGCACGTGAAGGTGGGGAC (SEQ ID NO: 30). La detección se logró con el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus™y el software (Applied Biosystems, Den Ijssel, Países Bajos) utilizando Mesa Fast qPCR™ (Eurogentec, Seraing, Bélgica) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada ensayo se realizó por duplicado en la misma ejecución. El umbral de ciclo de cada muestra se comparó a continuación con una curva estándar (realizada por triplicado) diluyendo ADN genómico (dilución seriada cinco veces) (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Los datos se expresan como Log de bacterias/g de contenido cecal.

MITChip: cebadores y condiciones de PCR

[0117] El ADN extraído del contenido cecal se analizó utilizando el Chip del Tracto Intestinal de Ratón (MITChip), una micromatriz filogenética que consistía en 3580 sondas de oligonucleótidos diferentes dirigidas a dos regiones hipervariables del gen ARNr 16S (regiones VI y V6). El análisis del MITChip se realizó como se describió previamente (Everard et al. Diabetes 60, 2775-2786 (2011); Geurts et al. Front Microbiol 2, 149 (2011)). Brevemente, el análisis de la microbiota se realizó en el nivel 2, correspondiente al nivel de género. El análisis multivariante se realizó mediante el análisis de diferencias representacionales (RDA,representational difference analysis),implementado en el paquete de software CANOCO 4.5 (Biometris, Wageningen, Países Bajos), sobre las intensidades de señal promedio de 99 grupos bacterianos (niveles 2). Todas las variables ambientales se transformaron en logaritmo (1+X). Se utilizó una prueba de permutación de Montecarlo basada en 999 permutaciones aleatorias para evaluar la significancia. Los valores de p < 0,05 se consideraron significativos.

Medición del colesterol plasmático

[0118] Las muestras de plasma se analizaron para determinar el colesterol midiendo el colesterol presente después de la hidrólisis enzimática del colesterol éster, utilizando un kit comercial (DiaSys, Condom, Francia).

Análisis estadístico

[0119] Los datos se expresan como media ± s.e.m. Las diferencias entre dos grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student de dos colas no pareada. Los conjuntos de datos que implicaban más de dos grupos se evaluaron mediante ANOVA seguido de pruebas post hoc de Newman-Keuls. Las correlaciones se analizaron mediante la correlación de Pearson. Los datos con diferentes letras en superíndice son significativamente diferentes (p < 0,05), según el análisis estadístico de ANOVA post hoc. Los datos se analizaron con GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando p < 0,05.

Resultados

[0120] Descubrimos que la abundancia deA. muciniphilaera 3300 veces menor en ratones obesos deficientes en leptina en comparación con sus compañeros de camada delgados (Figura 1a). De manera consistente, encontramos una disminución de 100 veces en los ratones alimentados con alto contenido de grasa (HF) (Figura 1c). En ambos modelos, los prebióticos restauran por completo el recuento deA. muciniphila(Figura 1b,c). En ratones alimentados con HF, los prebióticos eliminaron la endotoxemia metabólica (Figura 1d), normalizaron la subpoblación de macrófagos CD11c del tejido adiposo (Figura 1e) y redujo la masa grasa (Figura 1g y Figura 3b). Estos resultados se correlacionaron significativa e inversamente conA. muciniphila(Figura 1f y Figura 3a,c). Sin embargo, aún quedaba por demostrar si los mecanismos moleculares subyacentes a la aparición de estos trastornos dependen de la falta deA. muciniphilay, por el contrario, si la mejoría después del tratamiento prebiótico resulta de su mayor abundancia.

[0121] Para abordar esta cuestión, se administróA. muciniphilapor vía oral a ratones de control o alimentados con HF durante cuatro semanas, aumentando así laA. muciniphila(Figura 4a,b). Mediante el uso de una micromatriz filogenética (MITChip) (Everard et al. Diabetes 60, 2775-2786 (2011)); Geurts et al. Front Microbiol. 2, 149 (2011)), encontramos que tanto la dieta con HF como la colonizaciónde A. muciniphilaafectaron significativamente la relación compleja entre las bacterias dentro de la composición de la microbiota intestinal, tal como lo muestran los análisis de componentes principales (PCA) (Figura 2a) y está respaldado por cambios relativos de diferentes taxones.

[0122] Descubrimos que el tratamiento conA. muciniphilanormalizó la endotoxemia metabólica inducida por la dieta, la adiposidad y el marcador CD11c del tejido adiposo (Figura 2b, c, e y Figura 5a), sin ningún cambio en la ingesta de alimentos (Figura 5b). Además, el tratamiento conA. muciniphilaredujo el peso corporal y mejoró la composición corporal (es decir, la relación masa grasa/masa magra) (Figuras 5c y 5d). En consecuencia, planteamos la hipótesis de queA. muciniphilaafectaría el metabolismo del tejido adiposo y descubrimos que, con una dieta rica en grasas,A. muciniphilaaumentó la expresión de ARNm de marcadores de diferenciación de adipocitos y oxidación de lípidos sin afectar la lipogénesis (Figura 2f). En conjunto, estos datos sugieren además queA. muciniphilacontrola el almacenamiento de grasa y el metabolismo del tejido adiposo.

[0123] A continuación, descubrimos que la colonización conA. muciniphilarevirtió por completo la hiperglucemia en ayunas inducida por la dieta, mediante un mecanismo asociado con una reducción del 40 % de la expresión de glucosa-6-fosfatasa hepática (Figura 6a,b), sugiriendo así una reducción de la gluconeogénesis. Cabe destacar que el índice de resistencia a la insulina se redujo de forma similar después del tratamiento (Figura 2d). En conjunto, estos resultados sugieren queA. muciniphilacontribuye a la regulación del metabolismo del tejido adiposo y la homeostasis de la glucosa. Una explicación sería queA. muciniphiladesempeña un papel clave en diferentes niveles de regulación de la función de la barrera intestinal. Datos recientes sugieren que las células intestinales también contribuyen al mantenimiento de la barrera intestinal mediante la secreción de péptidos antimicrobianos, configurando así las comunidades microbianas (Pott et al., EMBO Rep (2012)).

[0124] Para comprender mejor cómo la colonización porA. muciniphilaafecta la función de la barrera intestinal, medimos la expresión de marcadores antibacterianos de Paneth y de células epiteliales en el íleon. Observamos queA. muciniphilaaumentó la expresión de Reg3g (3-gamma derivado de islotes regeneradores, RegNIy) con la dieta control, mientras que este efecto no se observó en ratones alimentados con HF (Figura 7a). La expresión de Pla2g2a y Defa fue similar entre los grupos, mientras que la expresión de Lyz1 tiende a ser menor después de la administración de bacterias (Figura 7b,c,d). Las IgA se secretan en el lumen intestinal y se sabe que restringen la penetración bacteriana en la mucosa (Vaishnava, S., et al. Science 334, 255-258 (2011)), aquí encontramos que los niveles de IgA fecal no se vieron afectados por los tratamientos (Figura 7e). Por lo tanto, se sugiere queA. muciniphilacontrola la función de la barrera intestinal mediante otros mecanismos que involucran su señalización epitelial (Derrien et al. Front Microbiol 2, 166 (2011))). No podemos descartar que el sistema endocannabinoide desempeñe un papel crucial en este contexto, ya que encontramos que el tratamiento conA. muciniphilaaumentó los niveles intestinales de 2-oleoilglicerol, 2-palmitoilglicerol y 2-araquidonoilglicerol (Figura 2g). Es importante destacar que se ha demostrado que el 2-oleoilglicerol estimula la liberación del péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) de las células L intestinales, lo que sugiere que tanto el GLP-1 como el GLP-2 podrían mejorar la barrera intestinal y la homeostasis de la glucosa en este contexto (Hansen, et al. J Clin Endocrinol Metab 96, E1409-1417 (2011)). Además, el 2-araquidonoilglicerol reduce la permeabilidad intestinal y el 2-palmitoilglicerol (Alhouayek et al F<a>S<e>B J 25, 2711-2721 (2011); Ben-Shabat, et al. Eur.J.Pharmacol. 353, 23-31 (1998)) potencia los efectos antiinflamatorios del 2-araquidonoilglicerol. Por lo tanto, es probable que el aumento de los niveles de estos tres endocannabinoides observado tras la colonización conA. muciniphilaconstituya un evento molecular que vincule estas características metabólicas.

[0125] Evidencias recientes apoyan que las interacciones entre la microbiota intestinal y la capa de moco son sistemas dinámicos que afectan la biología de la barrera de mucosa (Belzer et al, ISME J 6, 1449-1458 (2012); Johansson y otros, Proc Natl Acad Sci USA 108 Suppl 1,4659-4665 (2011)). Por lo tanto, investigamos el impacto de la colonización deA. muciniphilaen el grosor de la capa mucosa interna. De manera destacada, encontramos una capa de mucosa un 46 % más delgada en los ratones alimentados con HF (Figura 2h), mientras que la colonización con A. muciniphila contrarresta esta disminución (Figura 2h). En conjunto, estos nuevos hallazgos respaldan la idea de que la presencia deA. muciniphiladentro de la capa de moco es un mecanismo crucial para controlar el recambio de moco (Belzer et al, ISME J 6, 1449-1458 (2012)). A continuación, examinamos siA. muciniphilatambién afecta la expresión de Reg3g en las células epiteliales del colon. Sorprendentemente, la expresión de Reg3g se redujo en aproximadamente un 50 % con la dieta con HF.A. muciniphilamitigó completamente este efecto e incluso aumentó la expresión de Reg3g en un 400 % en comparación con los ratones alimentados con HF (Figura 2i). Por lo tanto, esto vincula la colonización del colon, pero no del íleon, porA. muciniphilacon el mecanismo inmunológico fundamental por el cual RegNIy promueve el mutualismo huésped-bacteria y regula las relaciones espaciales entre la microbiota y el huésped (Vaishnava, S., et al. Science 334, 255-258 (2011)). Es importante señalar que en ratones libres de gérmenes,A. muciniphilainduce la expresión genética en el colon en lugar del íleon (Derrien et al. Front Microbiol 2, 166 (2011))).

[0126] Para demostrar adicionalmente siA. muciniphiladebe estar viva para ejercer sus efectos metabólicos, comparamos el impacto de la administración deA. muciniphilaviable (2.108 células bacterianas suspendidas en 200 |jl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) anaeróbica estéril) conA.muciniphila destruida/inactivada por calor (autoclave, 15 minutos, 121 °C, 225 kPa). Descubrimos que laA. muciniphilaviable y metabólicamente activa contrarrestó la endotoxemia metabólica inducida por la dieta, el desarrollo de masa grasa y la alteración del metabolismo del tejido adiposo (Figura 8A, B, D y Figura9A)en un grado similar al observado en el primer conjunto de experimentos. Cabe destacar que estos efectos no se observaron tras la administración deA. muciniphilainactivada por calor (Figura 8A, B, D y Figura 9A). Además, descubrimos que laA. muciniphilametabólicamente activa redujo significativamente los niveles de glucosa plasmática después de una prueba de tolerancia a la glucosa oral (Figura 8C) mientras queA. muciniphilainactivada por calor exhibió una intolerancia a la glucosa similar a la de los ratones alimentados con HF (Figura 8C). Finalmente, confirmamos que laA. muciniphilametabólicamente activa restauró el grosor de la capa de moco tras la dieta HF, mientras que encontramos que laA. muciniphilainactivada por calor no mejoró el grosor de la capa de moco en comparación con la HF (Figura 8E y F). Cabe destacar que encontramos 100 veces másA. muciniphilametabólicamente activa recuperada del contenido cecal y colónico de ratones tratados conA. muciniphilaen comparación con el grupo de bacterias inactivadas por calor y con HF (HF-Akk: 9,5 ± 1,02 Log10 células/mg de contenido, HF y HF-K-Akk: 6,8 ± 0,51 Log10 células/mg de contenido, 0,0059), lo que evidencia la viabilidad deA. muciniphiladespués de la administración oral.

[0127] Estos resultados confirman de este modo que la obesidad inducida por la dieta HF se asocia con cambios en la composición de la microbiota intestinal. Sin embargo, los péptidos antimicrobianos del íleon no se vieron afectados por los tratamientos. Por el contrario, la expresión de Reg3g en las células epiteliales del colon se redujo significativamente en aproximadamente un 50 % en ratones tratados con HF y conA. muciniphilainactivada por calor, mientras que el tratamiento conA. muciniphilametabólicamente activa mitigó por completo este efecto y aumentó la expresión de Reg3g tras la dieta HF (Figura 9B).

[0128] A continuación, se quiso analizar si la administración deA. muciniphilaseguía siendo eficaz durante un tratamiento prolongado con una dieta rica en grasas (8 semanas) y si la administración deA. muciniphila3 veces por semana (en lugar de diariamente) era suficiente para proteger contra la obesidad inducida por la dieta. Las preparaciones, así como las dosis deA. muciniphila,fueron similares a las presentadas en el protocolo con sonda oral diaria oA. muciniphilametabólicamente inactivada.

[0129] Descubrimos que el tratamiento conA. muciniphilareduce el aumento de peso corporal (Figura 10A) en aproximadamente un 30 %, a pesar de que los ratones ingerían una dieta rica en grasas sin pérdida de grasa en las heces ni cambios en su comportamiento de consumo de alimentos. Esto también se asoció con una reducción de aproximadamente el 45 % del peso del tejido adiposo (tejido adiposo subcutáneo) (Figura 10 B) y una disminución del 35 % en los depósitos de grasa visceral (mesentérica y epididimaria) (Figura 10 C). Por lo tanto, este conjunto de datos respalda el hecho de que la administración deA. muciniphilasigue siendo eficaz durante un tratamiento prolongado y el tratamiento sigue siendo eficaz siA. muciniphilase administra 3 veces por semana en lugar de diariamente.

[0130] Para confirmar que estos resultados eran específicos deA. muciniphila,tratamos a ratones alimentados con HF con un probiótico (es decir, Lactobacillus plantarum WCFS1). Observamos que la administración de L. plantarum no alteró el desarrollo de la masa grasa, el metabolismo del tejido adiposo, el grosor de la capa mucosa, el ARNm de Reg3g en el colon ni la endotoxemia metabólica (Figura 12 A-E).

[0131] La hipercolesterolemia se conoce como un factor clave implicado en las enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, se analizó el efecto de la administración deA. muciniphilasobre el colesterol plasmático en ratones alimentados con una dieta rica en grasas. Tal como se muestra en la Figura 11, el tratamiento conA. muciniphiladisminuye significativamente (aproximadamente el 15 %) el colesterol plasmático, contribuyendo así, junto con el LPS y otros parámetros metabólicos, a mejorar el perfil de riesgo cardiometabólico.

[0132] En resumen, nuestros hallazgos no solo proporcionan conocimientos sustanciales sobre los intrincados mecanismos por los cualesA. muciniphilaregula la comunicación cruzada entre el huésped y la microbiota intestinal, sino que también proporcionan una justificación para considerar el desarrollo de un tratamiento que utilice este colonizador de moco humano para la prevención o el tratamiento de la obesidad y trastornos metabólicos asociados, tales como, por ejemplo, la hipercolesterolemia.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1.Akkermansia mudniphilapara su utilización en la prevención del cáncer,

en la que se administran células viables deAkkermansia muciniphilaa un sujeto que las necesite.

2.Akkermansia muciniphilapara su utilización, según la reivindicación 1, en la que se administraAkkermansia muciniphilapor vía oral.

3.Akkermansia muciniphilapara su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que se administra al sujeto una cantidad deAkkermansia muciniphilaque varía de aproximadamente 1.104 a aproximadamente 1.1012 ufc, más preferiblemente de aproximadamente 1.105 a aproximadamente 1.1011 ufc, y aún más preferiblemente de aproximadamente 1.106 a aproximadamente 1.1010 ufc.

4.Akkermansia muciniphilapara su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la queAkkermansia muciniphilase administra al menos tres veces por semana.

5.Akkermansia muciniphilapara su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la administración de dichaAkkermansia muciniphilaa un paciente con cáncer asegura la restauración de una proporción normal deAkkermansia muciniphilaen el intestino de dicho paciente con cáncer.

6.Akkermansia muciniphilapara su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la administración de dichaAkkermansia muciniphilaa un paciente con cáncer previene una disfunción metabólica asociada con o causada por el cáncer.

7.Akkermansia muciniphilapara su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dichaAkkermansia muciniphilase administra como una composición farmacéutica que comprende dichaAkkermansia muciniphilaen asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8.Akkermansia muciniphilapara su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dichaAkkermansia muciniphilase administra como aditivo alimentario, aditivo de bebida, suplemento dietético, producto nutricional, alimento médico o composición nutracéutica.

9.Akkermansia muciniphilapara su utilización, según la reivindicación 8, en la que dichaAkkermansia muciniphilase coadministra con otra cepa probiótica y/o con uno o más prebióticos.

10.Akkermansia muciniphilapara su utilización, según la reivindicación 9, en la que el prebiótico es inulina y fructanos de tipo inulina, oligofructosa, xilosa, arabinosa, arabinoxilano, ribosa, galactosa, ramnosa, celobiosa, fructosa, lactosa, salicina, sacarosa, glucosa, esculina, tween 80, trehalosa, maltosa, manosa, melibiosa, moco o mucinas, rafinosa, fructooligosacáridos, galactooligosacáridos, aminoácidos, alcoholes y cualquier combinación de los mismos, y preferiblemente inulina, fructanos de tipo inulina u oligofructosa.