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ES3032734T3 - Anti-galectin-9 antibodies and uses thereof - Google Patents

Anti-galectin-9 antibodies and uses thereof

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Publication number
ES3032734T3
ES3032734T3 ES18870270T ES18870270T ES3032734T3 ES 3032734 T3 ES3032734 T3 ES 3032734T3 ES 18870270 T ES18870270 T ES 18870270T ES 18870270 T ES18870270 T ES 18870270T ES 3032734 T3 ES3032734 T3 ES 3032734T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
galectin
seq
cancer
antibodies
Prior art date
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Active
Application number
ES18870270T
Other languages
English (en)
Inventor
Shohei Koide
George Miller
Akiko Koide
Linxiao Chen
Aleksandra Filipovic
Eric Elenko
Joseph Bolen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
New York University NYU
Puretech LYT Inc
Original Assignee
New York University NYU
Puretech LYT Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=66246040&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES3032734(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by New York University NYU, Puretech LYT Inc filed Critical New York University NYU
Application granted granted Critical
Publication of ES3032734T3 publication Critical patent/ES3032734T3/es
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Abstract

Se describen aquí anticuerpos anti-Galectina-9 y métodos para su uso con el fin de inhibir una vía de señalización mediada por la Galectina-9 o eliminar células patológicas que la expresan. Dichos anticuerpos anti-Galectina-9 también pueden utilizarse para diagnosticar y/o tratar enfermedades asociadas con la Galectina-9, como enfermedades autoinmunes y tumores sólidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-galectina-9 y usos de los mismos
Antecedentes de la invención
El bloqueo de los puntos de control inmunitario ha demostrado un éxito sin precedentes en los últimos años como tratamiento del cáncer. A menudo se utilizan anticuerpos para bloquear las vías inhibidoras inmunitarias, tal como las vías de la proteína 4 asociada al linfocito T citotóxico (CTLA-4) y de la muerte programada 1 (PD-1). Si bien las terapias dirigidas a esas dos vías han demostrado tener éxito en el tratamiento de varios tipos de cáncer, las terapias anti-CTLA-4 y anti-PD-1 tienen una tasa de respuesta del 10 al 60 % de los pacientes tratados, dependiendo del tipo de cáncer, y aún no han demostrado la capacidad de superar una tasa de respuesta del 60 %, incluso cuando se usan en combinación (Kyvistborg et al., Enhancing responses to cancer inmunotherapy; Science. 2018 Feb 2;359(6375):516-517). Además, un gran número de tipos de cáncer son refractarios a estas terapias. Como parte de los esfuerzos por mejorar las inmunoterapias existentes en la clínica, el campo ha comenzado a centrarse en el papel de las anomalías en la señalización del interferón y la regulación positiva de los puntos de control alternativos como posibles causas de la limitación de las terapias actuales. Uno de esos posibles puntos de control alternativos es la inmunoglobulina de células T mucina-3 (Tim-3)/Galectina-9 (por ejemplo, revisado en Yang y Hung; The role of T-cell immunoglobulin mucin-3 and its ligand galectin-9 in antitumor immunity and cancer immunotherapy;Cancer biology and cancer treatment; octubre de 2017, vol. 60, n.° 10: 1058-1064 y referencias allí citadas).
La Galectina-9 es una lectina de repetición en tándem que consiste en dos dominios de reconocimiento de carbohidratos (CRD) y fue descubierta y descrita por primera vez en 1997 en pacientes que sufrían de linfoma de Hodgkin (L<h>) (Tureci et al., J. Biol. Chem. 1997, 272, 6416-6422). Existen tres isoformas y pueden localizarse dentro de la célula o extracelularmente. Se han observado niveles elevados de Galectina-9 en una amplia rango de cánceres, incluidos el melanoma, el linfoma de Hodgkin, el cáncer hepatocelular, el cáncer de páncreas, el cáncer gástrico, el cáncer de colon y el cáncer de células claras renales (Wdowiak et al. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 210). En el cáncer renal, los pacientes con alta expresión de Galectina-9 mostraron una progresión más avanzada de la enfermedad con mayor tamaño del tumor y necrosis (Kawashima et al.; BJU Int. 2014;113:320-332). En el melanoma, un cáncer considerado como uno de los más letales debido a su metástasis agresiva y resistencia a la terapia, la Galectina-9 se expresó en el 57 % de los tumores y aumentó significativamente en el plasma de pacientes con melanoma avanzado en comparación con los controles sanos (Enninga et al., Melanoma Res. 2016 Oct; 26(5): 429-441). Varios estudios han demostrado la utilidad de Gal-9 como marcador pronóstico y, más recientemente, como posible nueva diana farmacológico (Enninga et al., 2016; Kawashima et al. BJU Int 2014; 113: 320-332; Kageshita et al., Int J Cancer. 2002 Jun 20;99(6):809-16, y referencias allí citadas). Se ha descrito que la Galectina-9 desempeña un papel importante en varios procesos celulares como la adhesión, la agregación de células cancerosas, la apoptosis y la quimiotaxis. Estudios recientes han demostrado un papel de la Galectina-9 en la modulación inmune en apoyo del tumor, por ejemplo, a través de la regulación negativa de las respuestas de tipo Th1, la polarización Th2 y la polarización de los macrófagos al fenotipo M2. Este trabajo también incluye estudios que han demostrado que la Galectina-9 participa en la inactivación directa de las células T a través de interacciones con el receptor de inmunoglobulina de células T y proteína mucina 3 (TIM-3) (Dardalhon et al., J Immunol., 2010, 185, 1383-1392;Sanchez-Fueyo et al., Nat Immunol., 2003, 4, 1093-1101). También se ha descubierto que la Galectina-9 desempeña un papel en la polarización de la diferenciación de células T en fenotipos supresores de tumores, además de promover la programación de macrófagos tolerogénicos y la supresión inmunitaria adaptativa (Daley et al., Nat Med., 2017, 23, 556-567). En modelos de ratones con adenocarcinoma ductal pancreático (PDA), se ha demostrado que el bloqueo de la interacción del punto de control entre la Galectina-9 y el receptor dectina-1 que se encuentra en las células inmunes innatas en el microambiente tumoral (EMT) aumenta las respuestas inmunes antitumorales en el EMT y retarda la progresión del tumor (Daley et al., Nat Med., 2017, 23, 556-567). También se ha descubierto que la Galectina-9 se une a CD206, un marcador de superficie de los macrófagos de tipo M2, lo que resulta en una secreción reducida de CVL22 (MDC), una quimiocina derivada de los macrófagos que se ha asociado con una mayor supervivencia y un menor riesgo de recurrencia en el cáncer de pulmón (Enninga et al, J Pathol. 2018 agosto;245(4):468-477).
Barjon et al. (Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16) se refiere a un anticuerpo monoclonal para la detección de Galectina-9 en secciones de tejido. Tuereci et al. (J. Biol. Chem 1997, 272:10, 6416) define una galectina humana que es inmunogénica en pacientes con enfermedad de Hodgkin.
Por consiguiente, modular la actividad de la Galectina-9 y/o uno o más de sus receptores puede proporcionar un nuevo enfoque de terapia contra el cáncer, solo o en combinación con terapias existentes. Se describen en este documento nuevos anticuerpos humanos que se unen a la Galectina-9 humana y su uso terapéutico en el tratamiento del cáncer.
Compendio de la invención
Se debe entender que cualquier referencia a un método de tratamiento del cuerpo humano o animal debe entenderse como una referencia a un compuesto para tal uso.
La presente divulgación se basa, al menos en parte, en el desarrollo de anticuerpos anti-Galectina-9 que suprimen potentemente la señalización desencadenada por la Galectina-9. Estos anticuerpos son capaces de suprimir la señalización de Galectina-9 y/o eliminar células patológicas positivas para Galectina-9, beneficiando así el tratamiento de enfermedades asociadas con Galectina-9.
Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-Galectina-9 aislado, que se une a un epítopo en un dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) de un polipéptido de Galectina-9, por ejemplo, un polipéptido de Galectina-9 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galactina-9 descrito en este documento puede unirse tanto a un polipéptido de galactina-9 humano como a un polipéptido de galactina-9 no humano (por ejemplo, una galactina-9 de ratón, una galactina-9 de rata o una galactina-9 de primate). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galactina-9 se une exclusivamente a uno de los CRD de Galectina-9. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galactina-9 se une a ambos CRD de Galectina-9, por ejemplo, con afinidades similares o diferentes. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 divulgado en este documento se une a un epítopo dentro de la región CRD1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento se une a un epítopo dentro de la región CRD1, cuya región CRD1 puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento se une a un epítopo dentro de la región CRD1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se une al mismo epítopo que un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, Anticuerpos G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13, G9.1-8m14, G9.1-9, G9.1-10 y G9.1-11, y/o compite contra el anticuerpo de referencia para unirse a la región CRD1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se une al mismo epítopo que el anticuerpo G9.1-8 o el anticuerpo G9.1-8m13 y/o compite contra el anticuerpo G9.1-8 o el anticuerpo G9.1-8m13 por la unión a la región CRD1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 divulgado en este documento es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13, G9.1-8m14, G9.1-9, G9.1-10 y anticuerpos G9.1-11. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo G9.1-8. En algunas realizaciones, el anticuerpo es el anticuerpo G9.1-8m13. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender las mismas regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR) y las mismas CDR de cadena ligera que el anticuerpo de referencia, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de referencia proporcionados en este documento. En un ejemplo específico, el anticuerpo anti-Galectina-9 comprende la misma región variable de cadena pesada y la misma región variable de cadena ligera que el anticuerpo de referencia, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de referencia proporcionados anteriormente y en otras partes del presente documento.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<l>que comprende SEQ ID NO: 21 o que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 21 o que consiste en SEQ ID NO: 21. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<h>que comprende la SEQ ID NO: 86 o consisten esencialmente en SEQ ID NO: 86 o consisten en SEQ ID NO: 86. IEn algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<l>que comprende la SEQ ID NO: 21 y una secuencia V<h>que comprende la SEQ ID NO: 86. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<l>que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 21 y una secuencia V<h>que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 86. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<l>que consiste en SEQ ID NO: 21 y una secuencia V<h>que consiste en SEQ ID NO: 86.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina tiene una secuencia V<h>que comprende SEQ ID NO: 22 o que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 22 o que consiste en SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<l>que comprende la SEQ ID NO: 21 y una secuencia V<h>que comprende la SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<l>que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 21 y una secuencia V<h>que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<l>que consiste en SEQ ID NO: 21 y una secuencia V<h>que consiste en SEQ ID NO: 22.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<l>que comprende una o más de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs: 328, 329 y 337. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<h>que comprende una o más de las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 361, 364, 374, 366 y 383. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<l>que comprende una o más de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs: 328, 329 y 337, y una secuencia V<h>que comprende una o más de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs: 361, 364 y 374.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<l>que comprende una o más de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs: 328, 329 y 337, y una secuencia V<h>que comprende una o más de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs: 361, 366 y 383.
In algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 aquí divulgado se une a un epítopo dentro de la región CRD2 de Galectina-9. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 divulgado en este documento se une a un epítopo dentro de la región CRD2 de Galectina-9, cuya región CRD2 puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 divulgado en este documento se une a un epítopo dentro de la región CRD2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se une a un epítopo dentro de la región CRD2 de Galectina-9 que comprende un residuo de triptófano que se corresponde con el residuo W309 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se une a un epítopo dentro de la región CRD2 de Galectina-9 que no comprende uno o más residuos que se corresponden con R253, R271, Y330, R334, R341 e Y236 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede unirse a un epítopo dentro de la región CRD2 de Galectina-9 que comprende un residuo de triptófano correspondiente al residuo W309 de SEQ ID NO: 1 y, además, no comprende uno o más residuos correspondientes a R253, R271, Y330, R334, R341 e Y236 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se une al mismo epítopo que un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y G9.2 son anticuerpos de unión de baja afinidad y/o compiten contra el anticuerpo de referencia para unirse a la región CRD2. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se une al mismo epítopo que el anticuerpo G9.2-17 o el anticuerpo G9.2-17mut6 y/o compite contra el anticuerpo G9.2-17 o el anticuerpo G92-17mut6 por la unión a la región CRD2. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25 y G9.2-26. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo G9.2-17 o el anticuerpo G9.2-17mut6. El anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<l>que comprende SEQ ID NO: 54 o puede consistir esencialmente en SEQ ID NO: 54 o puede consistir en SEQ ID NO: 54. El anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<h>que comprende SEQ ID NO: 55 o puede consistir esencialmente en SEQ ID NO: 55 o puede consistir en SEQ ID NO: 55. El anticuerpo anti-Galectina-9 tiene una secuencia V<l>que comprende la SEQ ID NO: 54 y una secuencia V<h>que comprende la SEQ ID NO: 55. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede tener una secuencia V<l>que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 54 y una secuencia Vh que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 55. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede tener una secuencia V<l>que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 54 y una secuencia V<h>que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 55. Alternativamente, el anticuerpo puede tener una secuencia V<h>que comprende SEQ ID NO: 56. Alternativamente, el anticuerpo puede tener una secuencia Vh que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 56 o que consiste en SEQ ID NO: 56. Alternativamente, el anticuerpo aislado puede tener una secuencia Vl que comprende SEQ ID NO: 54 y una secuencia Vh que comprende SEQ ID NO: 56. Alternativamente, el anticuerpo aislado puede tener una secuencia V<l>que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 54 y una secuencia V<h>que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 56. Alternativamente, el anticuerpo aislado puede tener una secuencia Vl que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 54 y una secuencia Vh que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 56.
Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo aislado, que se une a la Galectina-9 humana,
en donde el anticuerpo tiene una CDR1 de V<h>que comprende SEQ ID NO: 361, una CDR2 de V<h>que comprende SEQ ID NO: 388 y una CDR3 de VH que comprende SEQ ID NO: 406 y
en donde el anticuerpo tiene una CDR1 de VL que comprende SEQ ID NO: 328, una CDR2 de VL que comprende SEQ ID NO: 329 y una CDR3 de Vl que comprende SEQ ID NO: 352; y
en donde el anticuerpo tiene una región Vl que comprende SEQ ID NO: 54 y una región Vh que comprende SEQ ID NO: 55.
En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender las mismas regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada y las mismas CDR de cadena ligera que el anticuerpo de referencia, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de referencia proporcionados en este documento. En un ejemplo específico, el anticuerpo anti-Galectina-9 comprende la misma región variable de cadena pesada y la misma región variable de cadena ligera que un anticuerpo de referencia, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de referencia proporcionados en este documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada 1 (CDR1), una región determinante complementaria de la cadena pesada 2 (CDR2), y una región determinante complementaria de la cadena pesada 3 (CDR3), que colectivamente son al menos 90 %(por ejemplo,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%o 99 %) idénticas a las CDR de cadena pesada de un anticuerpo de referencia, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de referencia proporcionados en este documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera y una CDR3 de cadena ligera, que colectivamente son al menos 90 %(por ejemplo,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) idénticas a las CDR de cadena ligera de un anticuerpo de referencia, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de referencia proporcionados en este documento.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 comprende tanto una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (CDR1), una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (CDR2) y una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (CDR3), que colectivamente son al menos 90 %(por ejemplo,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) idénticas a las CDR de cadena pesada de un anticuerpo de referencia, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de referencia proporcionados en este documento y una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera y una CDR3 de cadena ligera, que colectivamente son al menos 90 %(por ejemplo,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) idénticas a la cadena ligera CDR de un anticuerpo de referencia, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de referencia proporcionados en este documento. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender los mismos CDR de cadena pesada y los mismos CDR de cadena ligera que los anticuerpos de referencia mencionados anteriormente. En un ejemplo específico, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender la misma región variable de cadena pesada y la misma región variable de cadena ligera que un anticuerpo de referencia, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos de referencia proporcionados en este documento. Los anticuerpos anti-Galectina 9 aislados ejemplares que se unen a CRD2 incluyen G9.2-17.
Los anticuerpos anti-Galectina 9 aislados, o su parte de unión a antígeno, comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 54. Los anticuerpos anti-Galectina 9 aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en las que la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 55.
Los anticuerpos anti-Galectina 9 aislados, o su parte de unión a antígeno, comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 54, y la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 55. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina 9 aislados, o su parte de unión a antígeno, comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 54, y la región variable de cadena pesada consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 55.
En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 divulgados en este documento puede comprender un dominio variable de cadena pesada (V<h>) que es al menos 85 % idéntico al V<h>de un anticuerpo de referencia divulgado en este documento. Alternativamente o además, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender un dominio variable de cadena ligera (V<l>) que es al menos 85 % idéntico al V<l>del anticuerpo de referencia.
El anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión a antígeno comprende una región VL que comprende SEQ ID NO: 54. El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión a antígeno del mismo comprende una región VH que comprende SEQ ID NO: 55. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región VL que consiste en SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión a antígeno puede comprender una región VH que consiste en SEQ ID NO: 55. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región VL y VH que comprende SEQ ID NO: 54 y 55, respectivamente. En algunas realizaciones específicas, el anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión a antígeno comprende una región VL y VH que consiste en SEQ ID NO: 54 y 55, respectivamente. El anticuerpo anti-Galectina-9 es el clon 9.2-17.
El anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión a antígeno comprende una región VL que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la región VL del anticuerpo 9.2-17 (SEQ ID NO: 54). El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión a antígeno del mismo comprende una región VH que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la región VH del anticuerpo 9.2-17 (SEQ ID NO: 55). El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende regiones VL y VH que tienen las mismas secuencias de aminoácidos que las regiones VL y VH de 9.2-17 (SEQ ID NO: 54 y 55, respectivamente).
El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región VL que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con una región VL establecida en SEQ ID NO: 54. El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región VH que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia con una región VH establecida en SEQ ID NO:55. El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región VL que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con una región VL establecida en SEQ ID NO: 54 y una región VH que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con una región VH establecida en SEQ ID NO: 55.
El anticuerpo anti-Galectina-9 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un VL que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de los mismos) de identidad de secuencia con una región VL establecida en SEQ ID NO: 54. El anticuerpo anti-Galectina-9 o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una región VH que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia con una región VH establecida en SEQ ID NO: 55. El anticuerpo anti-Galectina-9 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una región VL y/o VH que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia con una región VL y/o VH establecida en SEQ ID NO: 54 y 55, respectivamente. El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región VL que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia con la región VL de G9.2-17. El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región VH que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la región VH de G9.2-17. El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender regiones VL y VH que tengan al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de las mismas) de identidad de secuencia con las regiones VL y VH de G9.2-17.
Según la invención, se proporciona un anticuerpo anti-Galectina-9 o porciones de unión a antígeno del mismo que comprende (a) la secuencia de aminoácidos VL CDR1 expuesta en SEQ ID NO: 328; (b) la secuencia de aminoácidos CDR2 de VL expuesta en SEQ ID NO: 329; (c) la secuencia de aminoácidos VL CDR3 expuesta en SEQ ID NO: 352; (d) la secuencia de aminoácidos CDr 1 de VH expuesta en SEQ ID NO: 361; (d) la secuencia de aminoácidos CDR2 de VH expuesta en SEQ ID NO: 388; (e) la secuencia de aminoácidos CDR3 de VH expuesta en SEQ ID NO: 406.
El anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR1 comprende SEQ ID NO: 328. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR1 consiste en SEQ ID NO: 328.
El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR1 comprende SEQ ID NO: 328. El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR2 comprende SEQ ID NO: 329. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR1 consiste en SEQ ID NO: 328. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR2 consiste en SEQ ID NO: 329. El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena pesada CDR1 comprende SEQ ID NO: 361. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR1 consiste en SEQ ID NO: 361.
El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR1 comprende SEQ ID NO: 328.. El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR2 comprende SEQ ID NO: 329. El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR3 comprende SEQ ID NO: 352. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR1 consiste en SEQ ID NO: 328. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR2 consiste en SEQ ID NO: 329. El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo consta de regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR3 comprende SEQ ID NO: 352. El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden<s>E<q>ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente. En algunas realizaciones, las regiones variables de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 constan de SEQ ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende los mismos CDR VL que G9.2-17. El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden SEQ ID NO: 361, 388 y 406, respectivamente. En algunas realizaciones, las regiones variables de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 consisten en SEQ ID NO: 361, 388 y 406, respectivamente. El anticuerpo comprende los mismos<c>D<r>VH que G9.2-17. El anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las regiones variables de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 comprenden SEQ ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente, y las regiones variables de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 comprenden SEQ ID NO: 361, 388 y 406, respectivamente. En algunas realizaciones, las regiones variables de cadena ligera y pesada CDR1, C<d>R2 y<c>D<r>3 constan de SEQ ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente, y SEQ ID NO: 361, 388 y 406, respectivamente. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende las mismas CDRs VL y VH que G9.2-17.
Por consiguiente, los anticuerpos anti-Galectina-9 o porciones de unión a antígeno de los mismos pueden comprender (a) una secuencia de aminoácidos VL CDR1 que tiene al menos un 80 %(por ejemplo,85%, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos VL CDR1 establecida en SEQ ID NO: 328; (b) una secuencia de aminoácidos CDR2 de VL que tiene al menos un 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos CDR2 de VL establecida en SEQ ID NO: 329; (c) secuencia de aminoácidos VL CDR3 que tiene al menos un 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos VL CDR3 seleccionada de SEQ ID NO: 352; (d) secuencia de aminoácidos CDR1 de VH que tiene al menos un 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos CDR1 de VH establecida en SEQ ID NO: 361; (d) Secuencia de aminoácidos CDR2 de VH que tiene al menos un 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos CDR2 de VH seleccionada de SEQ ID NO: 388(e) Secuencia de aminoácidos CDR3 de VH que tiene al menos un 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos CDR3 de VH seleccionada de SEQ ID NO: 406.
El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en las que las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera pueden tener al menos el 80 %(porejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y<c>DR3 de la región variable de la cadena ligera establecidas en SEQ ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo VL pueden tener al menos un 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en las mismas) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de VL de G9.2-17. El anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión puede comprender regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada tienen al menos un 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en las mismas) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada establecidas en SEQ ID NO: 361, 388 y 406, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo VH pueden tener al menos 80 % (por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en las mismas) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de VH de G9.2-17. El anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión puede comprender regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera tienen al menos un 80 %(por ejemplo,85%, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en las mismas) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera establecidas en comprenden SEQ ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada tienen al menos un 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en las mismas) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada establecido en SEQ ID NO: 361, 388 y 406, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo VL y CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo VH pueden tener al menos 80 % (por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en las mismas) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos VL CDR1, CDR2 y CDR3 y VH CDR1, CDR2 y CDR3 de G9.2-17.
En algunas realizaciones de cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina proporcionados en este documento, la región constante de cadena pesada del anticuerpo anti-Galectina-9 es de una IgG humana (una cadena pesada gamma) de cualquier subfamilia de IgG como se describe en este documento, por ejemplo, IgG1 o IgG4.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 o su parte de unión al antígeno pueden comprender una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 108. En algunas realizaciones, las cadenas ligeras de anticuerpos anti-Galectina-9 pueden comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99%y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 108 (o sus regiones variables). En algunas realizaciones, la región constante de cadena pesada del anticuerpo anti-Galectina-9 proviene de una IgG1 humana. En algunas realizaciones, la IgG1 es un mutante con una participación mínima del receptor Fc. En algunas realizaciones, la región constante de cadena pesada del anticuerpo anti-Galectina-9 es de una IgG4 humana. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 o la parte de unión a antígeno de los mismos comprenden una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 242. En algunas realizaciones, el IgG4 es un mutante de intercambio de IgG4.
En algunas realizaciones, las cadenas pesadas de los anticuerpos anti-Galectina-9 comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 316 (o su región variable).
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 o su parte de unión al antígeno comprenden una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 108 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 316.
En una realización, el anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 108 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 316.
Cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 proporcionados en este documento puede comprender un marco de región variable de cadena pesada de VH 3-48; y/o un marco de región variable de cadena ligera de V<k>1-39. En algunas realizaciones, cualquiera de los marcos VH y/o VL descritos en este documento son genes VH y/o VL de línea germinal. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento son anticuerpos de longitud completa(porejemplo.,una molécula IgG) o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un Fab o un anticuerpo de cadena monocatenaria. En cualquier caso, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico aislado o un conjunto de ácidos nucleicos que codifican o codifican colectivamente cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 divulgados en este documento. En algunos casos, la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo están codificadas por dos moléculas de ácido nucleico separadas (un conjunto de ácidos nucleicos). En otros casos, la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo están codificadas por una molécula de ácido nucleico, que puede estar en formato multicistrónico o bajo el control de promotores distintos. El ácido nucleico o el conjunto de ácidos nucleicos pueden estar ubicados en uno o dos vectores. En algunos ejemplos, los uno o dos vectores pueden ser uno o dos vectores de expresión. Además, la presente divulgación proporciona una célula huésped que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos aislados o conjuntos de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento.
También se describe en este documento un método para producir el anticuerpo anti-Galectina-9, que comprende cultivar la célula huésped descrita en este documento en condiciones adecuadas que permitan la expresión del anticuerpo y recolectar el anticuerpo así producido del cultivo celular(por ejemplo,del medio de cultivo).
Además, un segundo aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 o un ácido nucleico que los codifica, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada con Galectina-9 en un sujeto, comprendiendo el uso administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención. El sujeto que lo necesita es un paciente humano que padece, se sospecha que padece, se sospecha que padece o está en riesgo de padecer la enfermedad asociada con Galectina-9, que es una enfermedad autoinmune, un cáncer sólido, una enfermedad microbiana, una neoplasia hematológica o un trastorno alérgico. Las enfermedades autoinmunes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad reumatoide(por ejemplo,artritis reumatoide), una enfermedad respiratoria autoinmune, un trastorno metabólico y/o endocrino autoinmune(por ejemplo,diabetes tipo I) o una enfermedad fibrótica. Los tumores sólidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinoma ductal pancreático (PDA), cáncer colorrectal (CRC), melanoma, colangiocarcinoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, neoplasias malignas gastrointestinales superiores e inferiores, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello de células escamosas, cáncer genitourinario, carcinoma hepatocelular, cáncer de ovario, sarcomas, mesotelioma, glioblastoma, cáncer de esófago, cáncer de vejiga, cáncer urotelial, cáncer renal, cáncer de cuello uterino y de endometrio. Las neoplasias hematológicas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas, mieloma múltiple y leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, síndromes mielodisplásicos o neoplasias mieloproliferativas y otros trastornos mieloproliferativos y mielodisplásicos. En algunos ejemplos, la cantidad efectiva de la composición farmacéutica es suficiente para bloquear la interacción entre Galectina-9 y Dectina-1. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de la composición farmacéutica es suficiente para bloquear la interacción entre Galectina-9 y CD206. Alternativamente, o además, pero no limitado a, la cantidad efectiva de la composición farmacéutica es suficiente para bloquear la interacción entre Galactina-9 y Tim-3.
Además, se describe un método para modificar, eliminar y/o reducir células patológicas que expresan Galectina-9(por ejemplo,a través de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o ADCC), comprendiendo el método administrar a un sujeto que tiene células patológicas que expresan Galectina-9 una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento, o una composición farmacéutica del mismo. En algunas realizaciones, el sujeto es un paciente humano que tiene células cancerosas que expresan Galectina-9 y/o células inmunes patológicas que expresan Galectina-9. En algunas realizaciones, la cantidad efectiva de la composición farmacéutica es suficiente para iniciar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o bloquear las células patológicas que expresan Galectina-9.
Cualquiera de los métodos de tratamiento descritos en este documento puede comprender además la administración al sujeto de un inhibidor de una molécula de punto de control, un activador de un receptor coestimulador o un inhibidor de una diana de célula inmune innata. Los ejemplos de moléculas de punto de control incluyen, entre otros, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIM-3 y A2aR. Los ejemplos de receptores coestimuladores incluyen, pero no se limitan a, OX40, GITR, CD137, CD40, CD27 e ICOS. Los ejemplos de dianas de células inmunes innatas incluyen, pero no se limitan a, KIR, NKG2A, CD96, TLR e IDO.
La presente divulgación también proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada a Galectina-9 (e.g., descritos en este documento), en donde la composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-Galectina-9, como cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento, o uno o varios ácidos nucleicos que codifican dicho anticuerpo, y un portador farmacéuticamente aceptable. También, la presente divulgación proporciona usos de los anticuerpos anti-Galectina-9 o los ácidos nucleicos codificantes para fabricar un medicamento para su uso en el tratamiento de las enfermedades diana como se describe en este documento.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en la descripción siguiente. Otras características o ventajas de la presente invención se desprenderán del siguiente dibujo y de la descripción detallada de varias realizaciones, así como de las reivindicaciones adjuntas. El alcance de la invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar aún más ciertos aspectos de la presente divulgación, que pueden entenderse mejor mediante referencia al dibujo en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en este documento.
Las figuras 1A-1Bincluyen gráficos que muestran una caracterización de la unión de Fabs para Galectina-9 CRD2 usando ELISA de fagos. Figura 1A: unión a Galectina-9 humana y de ratón mostrada mediante ELISA de fagos. Figura 1B: afinidad de los clones Fabs a Galectina-9 CRD2 determinada por ELISA de fagos de competición.
Las figuras 2A-2Bincluyen gráficos que muestran una caracterización de unión de Fabs para Galectina-9 CRD1 utilizando ELISA de fagos. Figura 2A: unión de clones Fab a Galectina-9 CRD1 humana y de ratón mostrada mediante ELISA de fagos. Figura 2B: afinidad de los clones Fabs a Galectina-9 CRD1 determinada por ELISA de competición de fagos.
Las figuras 3A-3Bincluyen gráficos que muestran la agrupación de epítopos de clones Fab G.9-2 (unión a CRD2) utilizando ELISA de fagos de competencia. Figura 3A: pocillos recubiertos con Galectina-9 CRD2 de ratón preincubados con Fabs G9.2-1 o G9.2-3 purificados antes de la adición de clones Fab de unión a Galectina-9 CRD2 mostrados en fagos. Figura 3B: pocillos recubiertos con Galectina-9 CRD2 humana preincubados con Fabs G9.2-15 o G9.2-17 purificados antes de la adición de clones Fab de unión a Galectina-9 CRD2 visualizados por fagos.
La figura 4incluye diagramas que muestran la afinidad de los Fabs G9.2 purificados por Galectina-9 CRD2, caracterizados mediante un ensayo de unión basado en microesferas. Las curvas muestran el mejor ajuste del modelo de enlace uno a uno. Arriba a la izquierda: G9.2-1 Fab. Arriba a la derecha: G9.2-3 Fab. Abajo a la izquierda: G9.2-15 Fab. Abajo a la derecha: G9.2-17 Fab. Los valores aparentes de Kd se muestran en la tabla.
La figura 5incluye diagramas que muestran la afinidad de los Fabs G9.1 purificados con la Galectina-9 CRD1, caracterizada mediante un ensayo de unión basado en microesferas. Los experimentos se realizaron de la misma manera que en la Figura 4. Arriba a la izquierda: G9.1-6 Fab. Arriba a la derecha: G9.1-5 Fab. Abajo a la izquierda: G9.1-8 Fab. Abajo a la derecha: G9.1-11 Fab. Los valores aparentes de Kd se muestran en la tabla.
La figura 6incluye diagramas que muestran un análisis de resonancia plasmónica de superficie de la unión de Fab G9.2-15 y Fab G9.2.17 a CRD2 de la Galectina-9 humana (arriba) y de ratón (abajo). Las fases de unión y disociación de los experimentos están marcadas en los paneles superiores. Izquierda: G9.2-15 Fab. Derecha: G9.2-17 Fab.
La figura 7incluye diagramas que muestran un análisis SPR de la unión de IgG4 humana G9.2-17 a CRD2 de Galectina-9 humana (arriba) y de ratón (abajo). Las líneas grises muestran los sensorgramas para el control negativo no vinculante, IgG4 humana G9.2-iso.
La figura 8incluye diagramas que muestran la tinción de muestras de líneas celulares con Fabs para Galectina-9 CRD2. Se muestran histogramas de datos de citometría de flujo. Arriba a la izquierda: G9.2-1 Fab. Arriba a la derecha: G9.2-3 Fab. Abajo a la izquierda: G9.2-15 Fab. Abajo a la derecha: G9.2-17 Fab.
La figura9 es un gráfico que muestra los efectos inhibidores de G9.2-17 y G9.1-8 sobre la activación de la señalización de Dectina-1 mediada por Galectina-9.
Las figuras 10A-10Bincluyen diagramas que muestran el mapeo del epítopo de G.9-2.17 en la Galectina-9 CRD2 humana mediante mutagénesis sistemática. Figura 10A: Diagrama que muestra la actividad de unión de G9.2-17 a mutantes CRD2 de Galectina-9 determinada mediante ELISA de fagos. La reducción en la señal ELISA indica un sitio en el CRD2 de Galectina-9 que es crítico para la unión de G9.2-17. Figura 10B: un diagrama que representa la ubicación de W309 tal como aparece en la estructura cristalina de la Galectina-9 CRD2 humana (PDB ID 3NV2), que es opuesta al sitio de unión del ligando de azúcar tal como aparece en la estructura cristalina (W309 corresponde con W277 en UniProt ID 000182-2; PDB ID 3NV2).
La figura11 contiene gráficos que muestran los análisis de cromatografía de exclusión por tamaño de Fab G9.2-17 (arriba), Fab G9.2-17mut6 (medio) y Fab G9.2-Iso (abajo). Las muestras de Fab purificadas se procesaron en la columna TOSOH TSK Bioassist G2WXL en PBS y se detectaron mediante absorbancia a 280 nm.
La figura 12contiene gráficos que muestran los análisis de resonancia plasmónica de superficie de la unión de Fab G9.2-17 (arriba) y Fab G9.2.17mut6 (abajo) al CRD2 de la Galectina-9 humana (izquierda) y de ratón (derecha). La Galectina-9 CRD2 humana o de ratón se inmovilizó en un chip Avicap precargado con neutravidina en un instrumento Pall ForteBio Pioneer. Luego, las muestras Fab se hicieron fluir utilizando el método OneStep. Las fases de unión y disociación de los experimentos están marcadas en los paneles superiores.
La figura 13es un gráfico que muestra una caracterización de la unión del clon Fab G9.2 para la Galectina-9 CRD2 de tipo salvaje o el mutante W3039K usando ELISA de fagos. Unión de clones Fab a Galectina-9 CRD2 humana analizada mediante ELISA de fagos. Se inmovilizó Galectina-9 CRD2 humana de tipo salvaje biotinilada, el mutante W309K Galectina-9 CRD2 o Galectina-9 CRD2 preincubada con IgG G9.2-17 en pocillos revestidos con neutravidina y se incubó con clones Fab individuales presentados en fagos.
La figura 14es un gráfico de Kaplan-Meier que muestra que el bloqueo de Galectina-9 da como resultado una extensión significativa de la supervivencia en modelos animales de cáncer de páncreas (ratones KPC).
La figura 15es una fotografía de tumores de ratón que muestra que el bloqueo de Galectina-9 y anti-PD1 genera una respuesta superior.
La figura 16es un gráfico de barras que muestra la masa tumoral de los ratones tratados con G9.2-17 mIgG1. Los ratones (n = 10/grupo) con tumores KPC implantados ortotópicamente fueron tratados con isotipo comercial (200 |jg) o mAb aGal9 comercial (200 |jg) o g 9.2-Iso mIgGI (200 |jg) o G9.2-17 mIgGI en dos dosis (200 |jg o 400 jig) una vez por semana durante tres semanas. Se extrajeron y pesaron los tumores y posteriormente se procesaron y tiñeron para citometría de flujo.
La figura 17muestra un gráfico de barras que muestra el peso del tumor de ratones tratados con G9.2-17 mIgG2a solo o en combinación con mAb aPD1. Los ratones (n = 10/grupo) con tumores KPC implantados ortotópicamente fueron tratados con mAb aPD-1 comercial (200 jig) o G9.2-17 mIg2a (200 jig), o una combinación de G9.2-17 y aPD-1, o un isotipo coincidente una vez por semana durante tres semanas. Los tumores se extrajeron y pesaron y posteriormente se procesaron y tiñeron para citometría de flujo. Cada punto representa un ratón; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001; mediante prueba t de Student no pareada.
Las figuras 18A-18Crepresentan gráficos que muestran la unión de G9.1-8m1-5 mIgGI purificado a Galectina-9 CRD1 humana caracterizada mediante un ensayo de unión basado en microesferas.
Las figuras 19A-19Grepresentan gráficos que muestran la unión de los Fabs G9.1-8m6-11 purificados a la Galectina-9 CRD1 humana, caracterizada mediante un ensayo de unión basado en microesferas.
Las figuras 20A-20Crepresentan gráficos que muestran la afinidad de los anticuerpos G9.1-8m8, 9 y 11 mIgG2a purificados por la Galectina-9 CRD1 humana caracterizada mediante un ensayo de unión basado en microesferas.
Las figuras 21A-21Drepresentan gráficos que muestran la unión de los Fabs G9.1-8m11-14 purificados a la Galectina-9 CRD1 humana caracterizada mediante un ensayo de unión basado en microesferas.
Las figuras 22A-22Drepresentan gráficos que muestran la unión de los anticuerpos G9.1-8m12-14 mIgG2a purificados a la Galectina-9 CRD1 humana, caracterizada mediante un ensayo de unión basado en microesferas.
Las figuras 23A y 23Brepresentan gráficos que muestran los resultados de un ensayo de apoptosis que demuestra que los anticuerpos Gal-9 inhiben la apoptosis inducida por Galectina-9 de las células Jurkat. Las células Jurkat se trataron con o sin Galectina-9 (280 nM), G9.2-17 IgG (1 j M) y/o G9.1-8m13 IgG (1 j M) durante 6 horas (Figura 23A). Luego, las células se tiñeron con anexina-V y PI seguido de un análisis de citometría de flujo. Las células positivas para AnnexinV representan células en etapa de apoptosis tanto temprana como tardía. Las barras representan el promedio de tres réplicas, representadas como puntos de datos individuales. Análisis estadístico realizado mediante pruebat de Student no pareada.(*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001).
La figura24 muestra un gráfico que muestra la lectura de los ensayos que demuestran que los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento interrumpen la interacción entre Galectina-9 y CD206. La figura 24A muestra un gráfico que muestra una prueba ELISA que mide la interacción entre la Galectina-9 humana inmovilizada y el CD206 soluble en ausencia y presencia de la adición del anticuerpo G9.1-8m13 o G9.2-17. Los pocillos de anticuerpos isotipo sirven como control. Los pocillos recubiertos con Galectina-9 se incubaron con CD206 con o sin G9.1-8m13, G9.2-17, una combinación de ambos anticuerpos o un isotipo. (Experimentos realizados por triplicado; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001; mediante prueba t de Student no pareada). Estos resultados indican que los anticuerpos G9.1-8m13 y G9.2-17 inhiben la interacción entre Galectina-9 y CD206 y sus efectos son aditivos.
La figura 25muestra un gráfico lineal que muestra la unión de los anticuerpos G9.1-8m12-14 mIgG2a purificados a la Galectina-9 CRD2 humana en comparación con G9.18 (WT) caracterizado mediante un ensayo de unión basado en microesferas.
Las figuras 26Ay26Brepresentan gráficos de barras que muestran la expresión de TNF-alfa (figura 26A) e IFNgamma (figura 26B) en células T CD3+ en esferoides tumorales organotípicos derivados del paciente (PDOT) de muestra de tumor primario de adenocarcinoma de páncreas tratados con 9,2-17 IgG4 (100 nM) en comparación con el control de isotipo (100 nM).
Las figuras 27A y 27Crepresentan gráficos de barras que muestran la expresión de CD44 (Fig. 27A), TNF-alfa (Fig. 27B) e IFNgamma (Fig. 27C) en células T CD3+ en muestras de tumor primario de adenocarcinoma pancreático esferoides tumorales organotípicos derivados de pacientes (PDOTS) tratados con 9,2-17 IgG1 (100 nM) o 9,2-17 IgG4 (100 nM) en comparación con el control de isotipo IgG1 o IgG4 (100 nM).
Las figuras 28A - 28Frepresentan gráficos de barras que muestran la expresión del perfil inmunitario en una muestra de tumor de cáncer de vesícula biliar (PDOTS) tratada con 9,2-17 IgG4 (100 nM) en comparación con el control de isotipo IgG4 (100 nM); CD44 en células T C<d>3+ (Figura 28A), TNF-alfa en células T C<d>3+ (Figura 28B), CD44 en células T CD4+ (Figura 28C), TNF-alfa en células T CD4+ (Figura 28D), CD44 en células T CD8+ (Figura 28E), TNF-alfa en células T CD8+ (Figura 28F).
Las figuras 29A - 29Crepresentan gráficos de barras que muestran la expresión de CD44 (figura 29A), TNF-alfa (figura 29B) e IFNgamma (figura 29C) en células T CD3+ en una muestra de metástasis hepática de un paciente con cáncer colorrectal (PDOT) tratado con 9.2-17 IgG1 (100 nM) o 9.2-17 IgG4 (100 nM) en comparación con IgG1 (100 nM) o control no tratado (Utx).
La figura 30muestra un gráfico lineal que muestra el efecto de 9.2-17 en un modelo singénico subcutáneo B16F10. Los tumores se injertaron por vía subcutánea y se trataron con mAb de ratón G9.2-17 IgG1. A los animales se les administró la dosis el día 0 y el día 4 por vía intravenosa (i.v.), a menos que se especifique lo contrario en la leyenda.
La figura 31representa un gráfico lineal que muestra el efecto de 9.2-17 en un modelo singénico subcutáneo B16F10. Los tumores se injertaron por vía subcutánea y se trataron con mAb de ratón G9.2-17 IgG2a. Los animales recibieron la dosis el día 0 y una vez cada 4 días a partir de entonces hasta el final del experimento. Los mAb se administraron por vía intravenosa a menos que se especifique lo contrario en la leyenda.
La figura 32muestra un gráfico que muestra un ensayo de unión basado en células. Las líneas celulares CRL-2134 se incubaron con un Fab biotinilado y el Fab unido se detectó usando neutravidina conjugada con DyLight 650. A continuación, las muestras se analizaron mediante citometría de flujo. Se observaron señales fuertes para el anticuerpo Galectina-9 9.2-17, pero no para los controles de isotipo. Los valores de K<d>(nM) para los anticuerpos Gal-9 en los dos formatos fueron los siguientes: G9.2-17 hIgG1: 0,41 ± 0,07; G9.2-17 mIgG1: 2,91 ± 0,66.
Las figuras 33Ay33Bmuestran gráficos que muestran una determinación de la estabilidad térmica de los anticuerpos anti-Galectina-9. La primera derivada de la emisión de fluorescencia representada en función de la temperatura (-dF/dT). La temperatura de fusión se representa como la temperatura a la que se observa un pico. La transición térmica se determinó utilizando el cambio en la unión del fluoróforo SYPRO Orange (ThermoFisher) usando un instrumento de PCR en tiempo real con una velocidad de calentamiento de 1 °C por minuto, siguiendo esencialmente un método como el descrito en Vedadi et al., Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination; Proc Natl Acad Sci USA. 24 de octubre de 2006; 103 (43): 15835-40.
Descripción detallada de la invención
La divulgación que sigue puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de las reivindicaciones. Los elementos de la divulgación que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo.
Se proporcionan en este documento anticuerpos capaces de unirse a Galectina-9 (e.g., humano, ratón o ambos). En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 se unen a uno o más epítopos en los dominios CRD1 y/o CRD2. Dichos anticuerpos anti-Galectina-9 son capaces de suprimir la señalización mediada por Galectina-9(por ejemplo,la vía de señalización mediada por Galectina-9/Dectina-1 o Galectina-9/Tim-3) o eliminar células patológicas que expresan Galectina-9 a través de,por ejemplo,ADCC. Por consiguiente, los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento se pueden usar para inhibir cualquiera de las señales de Galectina-9 y/o eliminar células patológicas positivas para Galectina-9, beneficiando así el tratamiento de enfermedades asociadas con Galectina-9, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, tumores sólidos, trastornos alérgicos o trastornos hematológicos tales como neoplasias hematológicas.
La Galectina-9, una lectina de repetición en tándem, es una proteína de unión a beta-galactósido, que ha demostrado tener un papel en la modulación de las interacciones célula-célula y célula-matriz. Se encuentra fuertemente sobreexpresado en el tejido de la enfermedad de Hodgkin y en otros estados patológicos. También puede encontrarse circulando en el microambiente tumoral (EMT).
Se ha descubierto que la galectina-9 interactúa con la Dectina-1, un receptor inmunitario innato muy expresado en los macrófagos del CAP, así como en las células cancerosas (Daley D, et al. Dectin 1 activation on macrophages by galectin 9 promotes pancreatic carcinoma and peritumoral immune tolerance; Nat Med.
2017;23(5):556-6). Independientemente de la fuente de Galectina-9, se ha demostrado que la interrupción de su interacción con Dectina-1 conduce a la reprogramación de las células CD4+ y CD8+ en mediadores indispensables de la inmunidad antitumoral. Por tanto, la Galectina-9 sirve como un valiosa diana terapéutica para bloquear la señalización mediada por la Dectina-1. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento interrumpen la interacción entre Galectina-9 y Dectina-1.
También se ha descubierto que la galectina-9 interactúa con TIM-3, una glicoproteína de superficie celular de tipo I que se expresa en la superficie de las células madre leucémicas en todas las variedades de leucemia mieloide aguda (excepto en la M3 (leucemia promielocítica aguda)), pero que no se expresa en las células madre hematopoyéticas (CMH) humanas normales. Se ha descubierto que la señalización TIM-3 resultante de la ligadura de Galectina-9 tiene un efecto pleiotrópico en las células inmunes, induciendo apoptosis en células Th1 (Zhu et al., Nat Immunol., 2005, 6:1245-1252) y estimulando la secreción del factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), lo que conduce a la maduración de monocitos en células dendríticas, lo que resulta en inflamación por inmunidad innata (Kuchroo et al., Nat Rev Immunol., 2008, 8:577-580). Se ha descubierto que la señalización de Galectina-9/TIM-3 coactiva la señalización de NF-<k>B y p-catenina, dos vías que promueven la autorrenovación de LSC (Kikushige et al., Cell Stem Cell, 2015, 17(3):341-352). Un anticuerpo anti-Galectina-9 que interfiere con la unión de Galectina-9/TIM-3 podría tener un efecto terapéutico, especialmente con respecto a la leucemia y otras neoplasias hematológicas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento interrumpen la interacción entre Galectina-9 y TIM-3.
También se ha descubierto que la galectina-9 interactúa con el CD206, un receptor de manosa muy expresado en los macrófagos polarizados M2, lo que favorece la supervivencia de los tumores (Enninga et al., CD206-positive myeloid cells bind galectin-9 and promote a tumor-supportive microenvironment. J Pathol. 2018 agosto;245(4):468-477). Los macrófagos asociados a tumores que expresan CD206 son mediadores de la inmunosupresión, la angiogénesis, la metástasis y la recaída tumoral (véase, por ejemplo, Scodeller et al., Precision Targeting of Tumor Macrophages with a CD206 Binding Peptide). M1 y M2 se han descrito como los estados funcionales de los macrófagos; Sci Rep. 2017 Nov 7;7(1):14655, y referencias allí citadas). Específicamente, los macrófagos M1 (también denominados macrófagos de activación clásica) se activan por citocinas relacionadas con Th1 y productos bacterianos, expresan altos niveles de IL-12 y son tumoricidas. Por el contrario, los macrófagos m2 (denominados macrófagos de activación alternativa) se activan por factores relacionados con Th2, expresan altos niveles de citocinas antiinflamatorias, como IL-10, y facilitan la progresión tumoral (Biswas y Mantovani; Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: cancer as a paradigm; Nat Immunol. 2010 Oct; 11(10):889-96). Los efectos protumorales de M2 incluyen la promoción de la angiogénesis, el avance de la invasión y la metástasis y la protección de las células tumorales de la apoptosis inducida por quimioterapia (Hu et al., Functional meaning of macrophages in pancreatic cancer biology; Tumour Biol.2015 Dec; 36(12): 9119-9126, y referencias allí citadas). Se cree que los macrófagos asociados a tumores tienen un fenotipo similar al M2 y desempeñan una función protumoral. Se ha demostrado que la Galectina-9 media la diferenciación de las células mieloides hacia un fenotipo M2 (Enninga et al., Galectin-9 modulates immunity by promoting Th2/M2 differentiation and impacts survival in patients with metastasic melanoma; Melanoma Res. 2016 Oct;26(5):429-41). Es posible que la unión de Galectina-9 a CD206 pueda resultar en una reprogramación de los TAM hacia el fenotipo<m>2, similar a lo que se ha demostrado previamente para Dectina. Sin ánimo de limitarnos a la teoría, el bloqueo de la interacción de la Galectina-9 con CD206 puede proporcionar un mecanismo por el cual un anticuerpo anti-galectina, por ejemplo, los descritos en las Tablas 1 y 2, tal como el anticuerpo 9.1-8m13 y/o el anticuerpo 9.2-17, puede ser terapéuticamente beneficioso. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento interrumpen la interacción entre la Galectina-9 y CD206.
También se ha demostrado que la Galectina-9 interactúa con la proteína disulfuro isomerasa (PDI) y 4-1BB (Bi S, et al. La unión de la Galectina-9 a la proteína disulfuro isomerasa de la superficie celular regula el entorno redox para mejorar la migración de células T y la entrada del VIH; Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108(26):10650-5; Madireddi et al. La Galectina-9 controla la actividad terapéutica de los anticuerpos dirigidos a 4-1BB. J Exp Med. 2014;211(7):1433-48).
Los anticuerpos anti-Galectina-9 pueden servir como agentes terapéuticos para tratar enfermedades asociadas con la Galectina-9 (por ejemplo, aquellas en las que la señalización de Galectina-9 juega un papel). Sin limitarse a la teoría, un anticuerpo anti-Galectina-9 puede bloquear una vía de señalización mediada por Galectina-9. Por ejemplo, el anticuerpo puede interferir con la interacción entre Galectina-9 y su socio de unión (por ejemplo, Dectina-1, TIM-3 o CD206), bloqueando así la señalización desencadenada por la interacción Galectina-9/Ligando. Alternativamente, o además, un anticuerpo anti-Galectina-9 también puede ejercer su efecto terapéutico induciendo bloqueo y/o citotoxicidad, por ejemplo, ADCC, CDC o ADCP contra células patológicas que expresan Galectina-9. Una célula patológica se refiere a una célula que contribuye al inicio y/o desarrollo de una enfermedad, ya sea directa o indirectamente.
Por consiguiente, en este documento se describen anticuerpos anti-Galectina-9 y usos terapéuticos de los mismos para tratar enfermedades asociadas con la Galectina-9.
Anticuerpos que se unen a la Galectina-9
La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen a la Galectina-9, por ejemplo, Galectina-9 humana y/o de ratón.
En algunos casos, el anticuerpo anti-Galectina descrito en este documento se une a un epítopo en un dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) de Galectina-9, por ejemplo, CRD1 o CRD2. En algunos casos, el anticuerpo anti-galectina puede unirse a CRD1 y CRD2. La Galectina-9 es una proteína bien conocida en la técnica. Por ejemplo, los números de acceso BAB83625.1 y NP_034838.2 del GenBank del NCBI proporcionan información sobre la galectina-1 humana y murina, respectivamente. Se proporcionan en este documento polipéptidos de Galectina-9 humanos y de ratón a modo de ejemplo; la Galectina-9 humana (isoforma 1; también conocida como "larga;") se proporciona como SEQ ID NO: 1; CRD1 y CRD2 humanos se proporcionan en este documento como SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente; la Galectina-9 de ratón (isoforma 1; también conocida como "larga;") se proporciona como SEQ ID NO: 2; CRD1 y CRD2 humanos y de ratón se proporcionan en este documento como s Eq ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 , respectivamente.
El dominio CRD1 de la Galectina-9 humana (SEQ ID NO: 3) abarca los residuos 1-148 de SEQ ID NO: 1, y el dominio CRD2 (SEQ ID NO: 4) abarca los residuos 218-355 de SEQ ID NO: 1. De manera similar, el dominio CRD1 de la Galectina-9 murina (SEQ ID NO: 5) abarca los residuos 1-147 de SEQ ID NO: 2, y el dominio CRD2 (SEQ ID NO: 6) abarca los residuos 226-353 de SEQ ID NO: 2.
Los polipéptidos de Galectina-9 de otras especies son conocidos en la técnica y pueden obtenerse de bases de datos de genes disponibles públicamente, por ejemplo, GenBank, utilizando la secuencia humana o la secuencia de ratón como consulta. Los dominios CRD1 y CRD2 de un polipéptido de Galectina-9 se pueden identificar alineando la secuencia de ese polipéptido de Galectina-9 con la de la Galectina-9 humana o de ratón como se describe en este documento.
Los anticuerpos descritos en este documento se unen a la Galectina-9 o a un fragmento de la misma(por ejemplo,CRD1 o CRD2). Tal como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo anti-Galectina-9" se refiere a cualquier anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido de Galectina-9, que puede ser de una fuente adecuada, por ejemplo, un ser humano o un mamífero no humano(por ejemplo,ratón, rata, conejo, primate como el mono, etc.). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se puede usar terapéuticamente para suprimir la bioactividad de la Galectina-9. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se puede usar en investigación o se puede usar en métodos de diagnóstico/pronóstico,por ejemplo,para la detección de células que expresan Galectina-9 en una evaluación de la elegibilidad y/o eficacia del tratamiento. Alternativamente, o además, un anticuerpo anti-Galectina-9 puede bloquear la interacción entre Galactina-9 y su ligando(por ejemplo,Dectina-1, TIM-3), suprimiendo así la vía de señalización desencadenada por, por ejemplo, la interacción Galactina-9/Dectina-1 o Galectina-9/TIM-3. Un anticuerpo anti-Galectina-9 también puede provocar la muerte de células que expresan Galectina-9, por ejemplo, a través de un mecanismo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
Un anticuerpo (utilizado indistintamente en plural) es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, situado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo",por ejemplo.,anticuerpo anti-Galectina-9, abarca no solo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos (por ejemplo, de longitud completa), sino también fragmentos de unión a antígeno de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadena simple (scFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una parte de anticuerpo, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, diacuerpos, nanocuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos multiespecíficos(por ejemplo,anticuerpos biespecíficos) y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, incluyendo variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpos y anticuerpos modificados covalentemente. Un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-Galectina-9, incluye un anticuerpo de cualquier clase, como IgD, IgE, IgG, IgA o IgM (o subclase de las mismas), y el anticuerpo no necesita ser de ninguna clase en particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a distintas clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse a su vez en subclases (isotipos),por ejemplo.,IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas.
Una molécula de anticuerpo típica comprende una región variable de cadena pesada (Vh) y una región variable de cadena ligera (V<l>), que normalmente están implicadas en la unión del antígeno. Las regiones V<h>y V<l>pueden subdividirse a su vez en regiones de hipervariabilidad, también conocidas como "regiones determinantes de la complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones más conservadas, que se conocen como "regiones marco" ("FR"). Cada V<h>y V<l>se compone típicamente de tres CDR y cuatro<f>R, dispuestas del amino-terminal al carboxi-terminal en el siguiente orden: f R1, CDR1, FR2, CDR2, Fr 3, CDR3, Fr4. La extensión de la región marco y las CDR se puede identificar con precisión utilizando la metodología conocida en la técnica, por ejemplo, mediante la definición de Kabat, la definición de Chothia, la definición de AbM y/o la definición de contacto, todas las cuales son bien conocidas en la técnica. Véase,por ejemplo,Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., publicación de los NIH n.° 91-3242, Chothia et al., (1989) Nature 342:877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948; y Almagro, J. Mol. Recognit.
17:132-143 (2004). Véase también hgmp.mrc.ac.uk y bioinf.org.uk/abs).
El anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento puede ser un anticuerpo de longitud completa, que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, cada una de las cuales incluye un dominio variable y un dominio constante. Alternativamente, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede ser un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos en el término "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo de longitud completa incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1 ; (ii) un fragmento F(ab')2 , un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios V<h>y C<h>1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste en el los dominios V<l>y V<h>de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio V<h>y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada que conserva la funcionalidad. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V<l>y V<h>, son codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite formarse como cadena proteína simple donde las regiones V<l>y V<h>se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv)). Véasepor ejemplo,Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.
El anticuerpo anti-Galectina-9 como se describe en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, puede unirse e inhibir (por ejemplo, reducir o eliminar) la actividad de la Galectina-9. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 como se describe en este documento puede unirse e inhibir la actividad de Galectina-9 en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en la misma). La constante de inhibición aparente (Kiapp o Ki,app), que proporciona una medida de la potencia del inhibidor, está relacionada con la concentración de inhibidor necesaria para reducir la actividad enzimática y no depende de las concentraciones de enzima. La actividad inhibidora de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento puede determinarse mediante métodos rutinarios conocidos en la técnica.
El valor Ki,app de un anticuerpo se puede determinar midiendo el efecto inhibidor de diferentes concentraciones del anticuerpo sobre la extensión de la reacción(por ejemplo,actividad enzimática); ajustar el cambio en la constante de velocidad de pseudo-primer orden (v) como una función de la concentración de inhibidor a la ecuación de Morrison modificada (Ecuación 1) produce una estimación del valor Ki aparente. Para un inhibidor competitivo, la Kiapp se puede obtener a partir de la intersección con el eje y extraída de un análisis de regresión lineal de un gráfico de Ki,app frente a la concentración de sustrato.
. _, ([£] - [/] -kd+v (N -u] - Kri+m -K7
2 (Ecuación 1)
Donde A es equivalente a v0/E, la velocidad inicial(vo)de la reacción enzimática en ausencia de inhibidor(I)dividida por la concentración total de enzima (E). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento puede tener un valor de Kiapp de 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 , 5 pM o menos para el antígeno diana o el epítopo de antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede tener una Kiappmás baja para una primera diana(por ejemplo,la CRD2 de Galectina-9) en relación con una segunda diana(por ejemplo,CRD1 de Galectina-9). Las diferencias en la Kiapp(por ejemplo,para especificidad u otras comparaciones) pueden ser de al menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10000 o 105 veces. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-Galectina-9 inhibe un primer antígeno(por ejemplo,una primera proteína en una primera conformación o un imitador de la misma) en mayor medida que un segundo antígeno(por ejemplo,la misma primera proteína en una segunda conformación o un imitador de la misma; o una segunda proteína). En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 puede madurarse aún más por afinidad para reducir la Kiapp del anticuerpo al antígeno diana o al epítopo antigénico del mismo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 suprime la señalización de Dectina-1, por ejemplo, en células inmunes que se infiltran en tumores, como los macrófagos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 suprime la señalización de Dectina-1 desencadenada por Galectina-9 en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en el mismo). Dicha actividad inhibidora se puede determinar mediante métodos convencionales o los ensayos descritos en este documento, por ejemplo, el Ejemplo 2. Alternativamente o además, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede suprimir la señalización de la mucina-3 de inmunoglobulina de células T (TIM-3) iniciada por la Galectina-9. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 suprime la señalización de la mucina-3 de inmunoglobulina de células T (TIM-3), por ejemplo, en células inmunes que se infiltran en tumores, por ejemplo, en algunas realizaciones en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en las mismas). Dicha actividad inhibidora puede determinarse mediante métodos convencionales o los ensayos descritos en este documento, por ejemplo, el Ejemplo 2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 suprime la señalización de CD206, por ejemplo, en células inmunes que se infiltran en tumores. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 suprime la señalización de CD206 desencadenada por Galectina-9 en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en el mismo). Dicha actividad inhibidora puede determinarse por métodos convencionales o por los ensayos descritos en este documento, por ejemplo, Ejemplo 13. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 bloquea o previene la unión de Galectina-9 a CD206 en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95%o más, incluido cualquier incremento en la misma). Dicha actividad inhibidora puede determinarse por métodos convencionales o por los ensayos descritos en este documento, por ejemplo, Ejemplo 13.
En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento induce citotoxicidad celular, tal como ADCC, en células diana que expresan Galectina-9, por ejemplo, en donde las células diana son células cancerosas o células inmunitarias inmunosupresoras. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 induce apoptosis en células inmunes, tales como células T, o células cancerosas en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en las mismas). Dicha actividad inhibidora puede determinarse por métodos convencionales o por los ensayos descritos en este documento, por ejemplo, Ejemplo 14. En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento induce citotoxicidad celular, como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), contra células diana que expresan Galectina-9.
La fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) es un mecanismo de acción importante para los anticuerpos que median parte o la totalidad de su acción a través de la fagocitosis. En ese caso, los anticuerpos median la captación de antígenos específicos por las células presentadoras de antígenos. La ADCP puede ser mediada por monocitos, macrófagos, neutrófilos y células dendríticas, a través de FcYRIIa, FcyRI y FcYRIIIa, de los cuales FcYRIIa (CD32a) en los macrófagos representa la vía predominante.
En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento induce la fagocitosis celular de células diana, por ejemplo, células cancerosas o células inmunitarias inmunosupresoras que expresan Galectina-9 (ADCP). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 aumenta la fagocitosis de las células diana, por ejemplo, células cancerosas o células inmunitarias inmunosupresoras, en al menos un 30 %(porejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos).
En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento induce citotoxicidad celular, tal como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra células diana, por ejemplo, células cancerosas o células inmunitarias inmunosupresoras. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 aumenta la CDC contra las células diana en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos).
En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento inducen la activación de células T, por ejemplo, en células T infiltradas en tumores, es decir, suprimen la inhibición mediada por Galectina-9 de la activación de células T, ya sea directa o indirectamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 promueve la activación de células T en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento del mismo). La activación de las células T se puede determinar mediante métodos convencionales o los ensayos descritos en este documento, por ejemplo, el Ejemplo 6 (por ejemplo, medición de CD44, OX40, IFNgamma, PD-1). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 promueve la activación de las células CD4+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento del mismo). En un ejemplo no limitante, el anticuerpo anti-galectina induce la expresión de CD44 en células CD4+. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 aumenta la expresión de CD44 en células CD4+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos). En un ejemplo no limitativo, el anticuerpo antigalectina induce la expresión de IFNgamma en células CD4+. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 aumenta la expresión de IFNgamma en las células CD4+ en al menos un 30 %(porejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos). En un ejemplo no limitativo, el anticuerpo antigalectina induce la expresión de TNFalfa en células CD4+. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 aumenta la expresión de TNFalfa en células CD4+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos).
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 promueve la activación de células CD8+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos). En un ejemplo no limitante, el anticuerpo anti-galectina induce la expresión de CD44 en células CD8+. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 aumenta la expresión de CD44 en células CD8+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos). En un ejemplo no limitativo, el anticuerpo antigalectina induce la expresión de IFNgamma en células CD8+. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 aumenta la expresión de IFNgamma en las células CD8+ en al menos un 30 %(porejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos). En un ejemplo no limitativo, el anticuerpo antigalectina induce la expresión de TNFalfa en células CD8+. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 aumenta la expresión de TNFalfa en células CD8+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos).
Los anticuerpos descritos en estos documentos pueden ser murinos, de rata, humanos o de cualquier otro origen (incluidos los anticuerpos quiméricos o humanizados). Estos anticuerpos no se producen de forma natural,es decir,no se producirían en un animal sin la intervención humana(por ejemplo,inmunizar a dicho animal con un antígeno deseado o un fragmento del mismo o aislarlo de bibliotecas de anticuerpos).
Cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, el anticuerpo anti-Galectina-9, puede ser monoclonal o policlonal. Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos homogénea y un "anticuerpo policlonal" se refiere a una población de anticuerpos heterogénea. Estos dos términos no limitan la fuente de un anticuerpo ni la forma en que se produce.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo humanizado que tiene uno o más de los elementos o características descritos a continuación o en otra parte de este documento. Los anticuerpos humanizados se refieren a formas de anticuerpos no humanos(por ejemplo,murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de unión a antígenos de las mismas que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una CDR del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), como el ratón, la rata o el conejo, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o marco importadas, pero que se incluyen para refinar y optimizar aún más el rendimiento del anticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. De manera óptima, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una parte de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos pueden tener regiones Fc modificadas como se describe en el documento WO 99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen uno o más CDR (uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis) que están alterados con respecto al anticuerpo original, que también se denominan uno o más CDR "derivados de" uno o más CDR del anticuerpo original. Los anticuerpos humanizados también pueden implicar la maduración de la afinidad.
Los métodos para construir anticuerpos humanizados también son bien conocidos en la técnica. Véase,por ejemplo,Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989). En un ejemplo, las regiones variables de V<h>y V<l>de un anticuerpo parental no humano se someten a un análisis de modelado molecular tridimensional siguiendo métodos conocidos en la técnica. A continuación, se identifican los residuos de aminoácidos del marco que se prevé que sean importantes para la formación de las estructuras CDR correctas mediante el mismo análisis de modelado molecular. Paralelamente, las cadenas V<h>y V<l>humanas que tienen secuencias de aminoácidos homólogas a las del anticuerpo no humano original se identifican a partir de cualquier base de datos de genes de anticuerpos utilizando las secuencias V<h>y V<l>originales como consultas de búsqueda. Luego se seleccionan los genes aceptores V<h>y<vl>humanos.
Las regiones CDR dentro de los genes aceptores humanos seleccionados pueden reemplazarse con las regiones CDR del anticuerpo no humano original o variantes funcionales del mismo. Cuando sea necesario, los residuos dentro de las regiones marco de la cadena parental que se prevé que sean importantes en la interacción con las regiones CDR se pueden utilizar para sustituir los residuos correspondientes en los genes aceptores humanos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo quimérico que puede incluir una región constante pesada y una región constante ligera de un anticuerpo humano. Los anticuerpos quiméricos se refieren a anticuerpos que tienen una región variable o parte de una región variable de una primera especie y una región constante de una segunda especie. Normalmente, en estos anticuerpos quiméricos, la región variable de las cadenas ligeras y pesadas imita las regiones variables de los anticuerpos derivados de una especie de mamíferos(por ejemplo,un mamífero no humano como el ratón, el conejo y la rata), mientras que las porciones constantes son homólogas a las secuencias de los anticuerpos derivados de otro mamífero, como el ser humano. En algunas realizaciones, se pueden realizar modificaciones de aminoácidos en la región variable y/o en la región constante.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento se unen específicamente al antígeno diana correspondiente o un epítopo del mismo, por ejemplo, antígeno o epítopo de Galectina-9. Un anticuerpo que "se une específicamente" a un antígeno o epítopo es un término bien conocido en la técnica. Se dice que una molécula exhibe unión específica si reacciona con mayor frecuencia, rapidez, duración y/o afinidad con un antígeno diana particular que con dianas alternativas. Un anticuerpo se "une específicamente" a un antígeno o epítopo diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de lo que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente (o preferencialmente) a un antígeno (Galectina-9) o a un epítopo antigénico del mismo es un anticuerpo que se une a este antígeno diana con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que cuando se une a otros antígenos u otros epítopos en el mismo antígeno. También se entiende con esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno diana puede o no unirse específica o preferencialmente a un segundo antígeno diana. Por tanto, la "unión específica" o la "unión preferencial" no requieren necesariamente (aunque pueden incluir) la vinculación exclusiva. En algunos ejemplos, un anticuerpo que se "une específicamente" a un antígeno diana o a un epítopo del mismo puede no unirse a otros antígenos u otros epítopos en el mismo antígeno(es decir,solo se puede detectar la actividad de unión de referencia en un método convencional). En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento se unen específicamente a la Galectina-9. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento se unen específicamente al CRD2 de la Galectina-9. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento se unen específicamente al CRD1 de la Galectina-9. Alternativamente, o además, el anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento se une específicamente a la Galectina-9 humana o un fragmento de la misma en relación con su contraparte de ratón, oviceversa(porejemplo,que tiene una afinidad de unión al menos 10 veces mayor a un antígeno que al otro como se determina en el mismo ensayo bajo las mismas condiciones de ensayo).
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina -9 se une solo a CRD1 (y no a CRD2), por ejemplo, la unión significativa a CRD2 o la unión a CRD2 no es detectable mediante un método de ensayo de rutina. En algunas realizaciones, el anti-Galectina -9 o un fragmento del mismo se une solo a CRD2 (y no a CRD1). En algunas realizaciones, ciertos anticuerpos descritos en este documento pueden unirse tanto a CRD1 como a CRD2. En algunas realizaciones, ciertos anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos en este documento pueden unirse tanto a CRD1 como a CRD2, pero con una menor afinidad a CRD2. En algunas realizaciones, ciertos anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos en este documento pueden unirse tanto a CRD1 como a CRD2, pero con menor afinidad por CRD1.
En algunas realizaciones, el efecto de un anticuerpo Gal-9 que se une a CRD1 y un anticuerpo Gal-9 que se une a CRD2 puede ser aditivo. En algunas realizaciones, el efecto de un anticuerpo Gal-9 de unión a CRD1 y un anticuerpo Gal-9 de unión a CRD2 puede ser sinérgico. En algunas realizaciones, se puede utilizar un "cóctel" ,es decir,una mezcla de dos o más anticuerpos en una composición. Dichas composiciones pueden comprender uno o más anticuerpos que se unen a CRD1 descritos en este documento y uno o más anticuerpos que se unen a CRD2 descritos en este documento. En un ejemplo no limitante, un anticuerpo que comprende la región variable del clon 9.1-8m13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 21 (cadena ligera y SEQ ID NO: 86) se puede combinar con un anticuerpo que comprende la región variable del clon 9.2-17 (SEQ ID NO: 54 (cadena ligera y SEQ ID NO: 55) en una composición. Los anticuerpos pueden mezclarse en cantidades equimolares o en otras proporciones, según se determine como óptimas para su rendimiento.
En algunas realizaciones, un anticuerpo podría unirse tanto a CRD1 como a CRD2. En otros casos, el anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento puede reaccionar de forma cruzada con la Galectina-9 humana y no humana(por ejemplo,ratón),por ejemplo,la diferencia en la afinidad de unión con la Galectina-9 humana y no humana es menor de 5 veces,por ejemplo,menor de 2 veces o sustancialmente similar.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Galectina-9 como se describe en este documento tiene una afinidad de unión adecuada para el antígeno diana(porejemplo,Galectina-9) o epítopos antigénicos del mismo. Como se utiliza en este documento, "afinidad de unión" se refiere a la constante de asociación aparente o K<a>. La K<a>es el recíproco de la constante de disociación (K<d>). El anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento puede tener una afinidad de unión (K<d>) de al menos 10'5, 10'6, 10'7, 10'8, 10'9, 10'10 M, o menor para el antígeno diana o el epítopo antigénico. Una mayor afinidad de unión corresponde a una disminución de K<d>. Una mayor afinidad de unión de un anticuerpo por un primer antígeno en relación con un segundo antígeno se puede indicar mediante un K<a>mayor (o un valor numérico K<d>menor) para la unión del primer antígeno que el K<a>(o valor numérico K<d>) para la unión del segundo antígeno. En tales casos, el anticuerpo tiene especificidad para el primer antígeno(por ejemplo,una primera proteína en una primera conformación o un imitador de la misma) en relación con el segundo antígeno(por ejemplo,la misma primera proteína en una segunda conformación o un imitador de la misma; o una segunda proteína). En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento tienen una mayor afinidad de unión (una K<a>mayor o una K<d>menor) al CRD1 de Galectina-9 en comparación con la afinidad de unión al CRD2 de Galectina-9. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento tienen una mayor afinidad de unión (una K<a>mayor o una K<d>menor) al CRD2 de Galectina-9 en comparación con la afinidad de unión al CRD1 de Galectina-9. Las diferencias en la afinidad de unión(por ejemplo,para especificidad u otras comparaciones) pueden ser de al menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10000 o 105 veces. En algunas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 puede ser madurado por afinidad adicional para aumentar la afinidad de unión del anticuerpo al antígeno diana o epítopo antigénico del mismo.
La afinidad de unión (o especificidad de unión) puede determinarse mediante diversos métodos, como la diálisis de equilibrio, la unión de equilibrio, la filtración en gel, ELISA, la resonancia de plasmón superficial o la espectroscopia( porejemplo,mediante un ensayo de fluorescencia). Las condiciones ejemplares para evaluar la afinidad de unión se encuentran en tampón HBS-P (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005 % (v/v) de tensioactivo P20).
Estas técnicas se pueden utilizar para medir la concentración de proteína de unión unida en función de la concentración de proteína diana. En determinadas condiciones, la concentración fraccionaria de proteína de unión unida ([Unida]/[Total]) generalmente está relacionada con la concentración de proteína diana total ([Diana]) mediante la siguiente ecuación:
[Enlace]/[Total] = [Diana]/(Kd+[Diana])
No siempre es necesario hacer una determinación exacta de K<a>, sin embargo, ya que a veces es suficiente obtener una medición cuantitativa de la afinidad,por ejemplo,determinada usando un método tal como ELISA o análisis FACS, es proporcional a K<a>, y por lo tanto se puede usar para comparaciones, como determinar si una afinidad más alta es,por ejemplo,2veces más alta, para obtener una medición cualitativa de la afinidad, o para obtener una inferencia de la afinidad,por ejemplo ,por la actividad en un ensayo funcional,por ejemplo,un ensayoin vitrooin vivo .En algunos casos, el ensayo de uniónin vitroes indicativo de actividadin vivo .En otros casos, el ensayo de uniónin vitrono es necesariamente indicativo de actividadin vivo.En algunos casos, la unión fuerte es beneficiosa, pero en otros casos, la unión fuerte puede no ser tan deseablein vivoy puede ser más deseable un anticuerpo con menor afinidad de unión. En este documento se proporcionan varios anticuerpos anti-Galectina-9 ejemplares (específicos para CRD1 o CRD2).
Los clones de anticuerpos ejemplares (anticuerpos de referencia) de la divulgación que se unen a CRD1 incluyen G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14. Los clones de anticuerpos ejemplares (anticuerpos de referencia) de la divulgación que se unen a CRD2 incluyen G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y el aglutinante de baja afinidad G9.2.
Regiones variables
Los anticuerpos anti-Galectina-9 ejemplares descritos en este documento que se unen a CRD1 son anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes y/o humanos, que tienen las secuencias de CDR y/o región variable de los anticuerpos G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14. Los anticuerpos anti-Galectina-9 ejemplares descritos en este documento que se unen a CRD2 son anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes y/o humanos, que tienen las secuencias de CDR y/o región variable de los anticuerpos G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y el aglutinante de baja afinidad G9.2. Las secuencias ejemplares y los SEQ ID NO se enumeran en las Tablas 1 y 2. Los CDR determinados utilizando la metodología Kabat se muestran en negrita. En la Tabla 3 se presentan los CDR, determinados con la metodología de Kabat, de clones seleccionados. en este documento los términos "m" y "mut", por ejemplo, "9.1-8m" y "9.1-8mut" se utilizan indistintamente. Por ejemplo, "G9.1-8m1", "G9.1-8m2", "G9.1-8m3", "G9.1-8m4", "G9.1-8m5", "G9.1-8m6", "G9.1-8m7", "G9.1-8m8", "G9.1-8m9", "G9.1-8m10", "G9.1-8m11", "G9.1-8m12", "G9.1-8m13" y "G9.1-8m14" se usan indistintamente con "G9.1-8mut1", "G9.1-8mut2", "G9.1-8mut3", "G9.1-8mut4", "G9.1-8mut5", "G9.1-8mut6", "G9.1-8mut7", "G9.1-8mut8". "G9.1-8mut9", "G9.1-8mut10", "G9.1-8mut11", "G9.1-8mut12", "G9.1-8mut13" y "G9.1-8mut14, respectivamente.
Tabla 1. Anticuerpos dirigidos en contra de CRD1
T l 2 L ni r irii n nr RD2 2-1 rfl n n l riini in 1 n
S
V
Q
T l ni DR ni r l i n
G9.2-17 se refleja en la reivindicación 1 adjunta.
Dichos anticuerpos anti-Galectina-9 que se unen a CRD1 y CRD2 se aíslan y se caracterizan estructuralmente como se describe en este documento. La divulgación también contempla anticuerpos que tienen al menos un 80 % de identidad (por ejemplo, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad) con su región variable o secuencias CDR. Las secuencias de aminoácidos VL de G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26, y el aglutinante de baja afinidad G9.2 se establecen en SEQ ID NO: 29, 13, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 29, 34, 54, 58, 61,63, 65, 73, 67, 69 y 71. Las secuencias de aminoácidos VH de G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26, y el aglutinante de baja afinidad G9.2 se establecen en SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 59, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 y 73. En consecuencia, se proporcionan anticuerpos anti-Galectina-9 aislados, o parte de unión a antígeno de los mismos, que comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, las
regiones variables de la cadena ligera consisten en una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID
NO:54. También se proporcionan anticuerpos anti-Galectina-9 aislados, o porciones de unión a antígeno de los
mismos, que comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena
pesada comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 55. En algunas realizaciones,
las regiones variables de la cadena pesada consisten en una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ
ID NO: 55. En consecuencia, se proporcionan en este documento anticuerpos anti-Galectina-9 aislados, o parte
de unión a antígeno de los mismos, que comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde
la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 54,
y la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:
55. En consecuencia, se proporcionan en este documento anticuerpos anti-Galectina-9 aislados, o parte de
unión a antígeno de los mismos, que comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la
región variable de cadena ligera consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 54, y
la región variable de cadena pesada consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:
55.
El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 54. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 55. El anticuerpo
anti-Galectina-9 comprende una región VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 54 y una región VH que tiene
la secuencia de SEQ ID NO: 55.
Las secuencias de aminoácidos VL de G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8,
G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13, G9.1-8m14 se establecen en SEQ ID NO: 7, 9,
11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 y 27, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos VH de G9.1-1, G9.1-2,
G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3,
G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13, G9.1-8m14 se establecen en SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 75, 76, 77, 78,
79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 y 87.
El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión a antígeno del mismo comprende una región VL que comprende SEQ ID NO: 54. El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión a antígeno del mismo comprende
una región VH que comprende SEQ ID NO: 55. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región V<l>consistente en SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión a antígeno del mismo comprende una región VH que consiste en SEQ ID NO:
55. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región VL y VH que comprende SEQ ID NO: 54 y 55. En
algunas realizaciones específicas, el anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión a antígeno del mismo comprende una región VL y VH que consiste en SEQ ID NO: 54 y 55.
El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión a antígeno del mismo comprende una región VL y una región
VH que comprenden SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55.
El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región VL que tenga al menos un 80 % (por ejemplo,
85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia
con una región VL que comprende la SEQ ID NO: 54. El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una
región VH que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia con una región VH que comprende la SEQ ID NO: 55. El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región VL que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %,
90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia c región VL que comprenda SEQ ID NO: 54 y una región VH que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia c región VH que comprende la SEQ ID NO: 55.
El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región VL que tenga al menos un 80 % (por ejemplo,
85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia
con una región VL de un anticuerpo seleccionado de G9.2-17. El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender
una región VH que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia con una región VH de un anticuerpo seleccionado de G9.2-17. El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender regiones VL y VH que tengan al menos un 80 % (por
ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de las mismas) de identidad de
secuencia con las regiones VL y VH de un anticuerpo seleccionado de G9.2-17.
El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región VL que tenga al menos un 80 % (por ejemplo,
85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia
con la región VL de G9.2-17. El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región VH que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la región VH de G9.2-17. El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender regiones VL y VH que tengan al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de las mismas) de identidad de secuencia con las regiones VL y VH de G9.2-17.
El anticuerpo anti-Galectina-9 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un VL que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de los mismos) de identidad de secuencia con una región VL establecida en la SEQ ID NO: 54. El anticuerpo anti-Galectina-9 o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una región VH que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia con una región VH establecida en la SEQ ID NO: 55. El anticuerpo anti-Galectina-9 o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una región VL y/o VH que tenga al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia con una región VL y/o VH establecida en las SEQ ID NO: 54 y 55.
Regiones Determinantes de la Complementariedad (CDR)
El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende un CDR1 de VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 328. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende un CDR2 de VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 329. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una CDR1 de VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 361.
Los anticuerpos anti-Galectina-9, por ejemplo, que se unen a CRD2, pueden comprender las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera y pesada de G9.2-17. La secuencia de aminoácidos de los CDR1 de VL de G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y el aglutinante de baja afinidad G9.2 se establecen en SEQ ID NO: 328. La secuencia de aminoácidos de las CDR2 de VL de G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6 , G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26, y el aglutinante de baja afinidad G9.2 se establecen en SEQ ID NO: 329. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VL de<g>9.2-1 , G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6 , G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26, y el aglutinante de baja afinidad G9.2 se establecen en SEQ ID NO: 341-360. Las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VH de G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26, y el aglutinante de baja afinidad G9.2 se establecen en SEQ ID NO: 361, 424-434. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de V<h>de G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9. 2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26, y el aglutinante de baja afinidad G9.2 se establecen en SEQ ID NO: 362, 363, 387-389 y 446-466. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VH de G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26, y el aglutinante de baja afinidad G9.2 se establecen en SEQ ID NO: 390-417.
El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende un CDR1 de VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 328. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende un CDR2 de VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 329. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende un CDR3 de VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 352. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende un CDR1 de VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 328, un CDR2 de VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 329 y un CDR3 de VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 352. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una CDR1 de VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 361. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende un CDR2 de VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 388. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una CDR3 de VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 406. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende un CDR1 de VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 361, un CDR2 de VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 388 y un CDR3 de VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 406. El anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una CDR1 de VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 328, una CDR2 de VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 329, una CDR3 de VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 352, una C<d>R1 de VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 361, una CDR2 de VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 388 y una CDR3 de VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 406. En cualquiera de estas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se une a CRD1.
Debido a que la especificidad de unión de Galectina-9 está determinada esencialmente por las regiones CDR1, 2 y 3, las secuencias VH de CDR1, 2 y 3 y las secuencias VL CDR1, 2 y 3 descritas anteriormente, se pueden mezclar y combinar para generar nuevos anticuerpos de unión de Galectina-9, siempre que cada nuevo anticuerpo resultante tenga una VL CDR1, 2 y 3 y una VH de CDR1, 2 y 3. Dichos anticuerpos resultantes de una nueva combinación de CDR descrita en este documento se pueden probar utilizando los ensayos de unión descritos en este documento. En algunas realizaciones, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VH o VL particular se reemplaza con una o más secuencias CDR estructuralmente similares. Se pueden crear nuevas secuencias VH y VL sustituyendo una o más secuencias CDR VH y/o VL con secuencias estructuralmente similares de las secuencias CDR divulgadas en este documento, según métodos conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo puede comprender regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena pesada CDR1 comprende SEQ ID NO: 328. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión puede comprender regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR2 comprende X1X2X3X4X5SX6X7X8SYADSVKG (SEQ ID NO: 467), en la que X1 = Y o S, X2 = I o S, X3 = Y o S, X4 = P o S, X5 = Y o S, X6 = G o S, X7 = Y o S, y X8 = T o S. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión puede comprender regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR3 comprende X1SX2X3X4X5X6X7X8X9X10KX11X12X13GMDY (SEQ ID NO: 468), en la que X1 = Y o S, X2 = T, S o ausente, X3 = Y, S o ausente, X4 = S o ausente, X5 = W, S o ausente, X6 = S o ausente, X7 = G, S o ausente, X8 = G, T, S o ausente, X9 = I, Y, S o ausente, X10 = G, S o Y, X11 = W o S, X12 = V o S, y X13 = W o S. En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-Galectina-9 contiene G en X7, Y en X8 y/o T en X9 en el dominio CDR2 de la cadena pesada. Alternativamente, o además, el anticuerpo anti-Galectina-9 contiene deleciones en uno o más de X4 - X7 en el dominio CDR3 de la cadena pesada. En otros ejemplos, el anticuerpo anti-Galectina-9 contiene S en uno o más de X6- X8 en el dominio CDR2 de la cadena pesada. Alternativamente, o además, el anticuerpo anti-Galectina-9 contiene deleciones en uno o más de X5 - X7 en el dominio CDR3 de la cadena pesada. En otros ejemplos, el anticuerpo anti-Galectina-9 contiene S en uno o más de X6 - X8 en el dominio CDR2 de la cadena pesada. Alternativamente, o además, el anticuerpo anti-Galectina-9 contiene deleciones en uno o más de X3 - X9 y/o X10 es Y en el dominio CDR3 de la cadena pesada.
9.2 Clones de anticuerpos y CDR relacionados
Región variable de cadena ligera derivada del clon 9.2
El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR1 comprende la SEQ ID NO: 328. El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR2 comprende la SEQ ID NO: 329. El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR3 comprende la SEQ ID NO: 352. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR1 consiste en SEQ ID NO: 328. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR2 consiste en SEQ ID NO: 329. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo consta de regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera CDR3 comprende la SEQ ID NO: 352. Los anticuerpos anti-Galectina-9 o su parte de unión comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente. En algunas realizaciones, las regiones variables de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 consisten en SEQ ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende los mismos CDR de VL que G9.2-17.
El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente. En algunas realizaciones, las regiones variables de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 consisten en SEQ ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende los mismos CDR de VL que el aglutinante de baja afinidad G9.2.
Región variable de cadena pesada derivada del clon 9.2
El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las regiones c DR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden SEQ ID NO: 361, 388 y 406, respectivamente. En algunas realizaciones, las regiones variables de cadena pesada CDR1, CDR2 y CdR3 consisten en SEQ ID NO: 361,388 y 406. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende los mismos CDR de VH que G9.2-17.
Región variable de cadena pesada y ligera derivada del clon 9.2
El anticuerpo anti-Galectina-9 o la parte de unión del mismo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en las que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden SEQ ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente, y las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden SEQ ID NO: 361, 388 y 406, respectivamente. En algunas realizaciones, las regiones variables CDR1, CDR2 y CDR3 de las cadenas ligera y pesada consisten en las regiones SEQ ID NO: 328, 329 y 352, y SEQ ID NO: 361, 388 y 406. En una realización específica, el anticuerpo comprende los mismos CDR VL y VH que G9.2-17.
Identidad de secuencia
El anticuerpo anti-Galectina-9(por ejemplo,específico para CRD1 y/o CRD2) puede comprender CDR de cadena ligera que tienen al menos un 80 %(porejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en el mismo) de identidad de secuencia, individual o colectivamente, en comparación con las CDR V<l>correspondientes de un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo seleccionada de G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y el aglutinante de baja afinidad G9.2. El anticuerpo anti-Galectina-9(por ejemplo,específico para CRD1 y/o c RD2) puede comprender CDR de cadena pesada que tienen al menos un 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en el mismo) de identidad de secuencia, individual o colectivamente, en comparación con los CDR V<h>correspondientes de un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo seleccionado entre G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y el aglutinante de baja afinidad G9.2.
El anticuerpo anti-Galectina-9 (por ejemplo,específico para CRD1 y/o CRD2) puede comprender CDR de cadena ligera que tienen al menos un 80 %(porejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en el mismo) de identidad de secuencia, individual o colectivamente, en comparación con las CDR V<l>y las CDR V<h>correspondientes de un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo seleccionada de G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y el aglutinante de baja afinidad G9.2.
El anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión puede comprender regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera tienen al menos 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera establecidas en SEQ ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo VL pueden tener al menos 80 %(por ejemplo,85%, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en las mismas) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de VL de G9.2-17. El anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada pueden tener al menos un 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en las mismas) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada establecidas en SEQ ID NO: 361, 388 y 406, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo VH tienen al menos un 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en las mismas) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos CDR1 , CDR2 y CDR3 de VH de G9.2-17. El anticuerpo anti-Galectina-9 o su parte de unión puede comprender regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera tienen al menos 80 %(por ejemplo85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en las mismas) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera establecidas en comprenden SEQ ID NO: 328, 329 y 352, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada tienen al menos un 80 %(porejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada establecidas en SEQ ID NO: 361, 388 y 406, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos VL CDR1, CDR2 y CDR3 y VH<c>D<r>1 , CD<r>2 y CDR3 tienen al menos 80 %(por ejemplo,85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en las mismas) de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos VL CDR1, CDR2 y CDR3 y VH CDR1, CDR2 y CDR3 de G9.2-17.
Epítopos y regiones constantes
Los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento pueden unirse al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ejemplares descritos en este documento (por ejemplo, anticuerpo que comprende cualquiera de los SEQ ID NO: 7-87 o las CDR de los mismos) o compite contra el anticuerpo ejemplar para unirse al antígeno Galectina-9. Un "epítopo" se refiere al sitio de un antígeno diana que es reconocido y unido por un anticuerpo. El sitio puede estar compuesto enteramente de componentes de aminoácidos, enteramente compuesto de modificaciones químicas de aminoácidos de la proteína(por ejemplo,restos de glicosilo) o compuesto de combinaciones de los mismos. Los epítopos superpuestos incluyen al menos un residuo de aminoácido común. Un epítopo puede ser lineal, es decir, tener una longitud típica de entre 6 y 15 aminoácidos. Alternativamente, el epítopo puede ser conformacional. El epítopo al que se une un anticuerpo puede determinarse mediante técnicas habituales, por ejemplo, el método de mapeo de epítopos (véanse,por ejemplo,las descripciones a continuación). Un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo ejemplar descrito en este documento puede unirse exactamente al mismo epítopo o a un epítopo sustancialmente superpuesto(por ejemplo,que contiene menos de 3 residuos de aminoácidos no superpuestos, menos de 2 residuos de aminoácidos no superpuestos o solo 1 residuo de aminoácido no superpuesto) que el anticuerpo ejemplar. Se puede determinar si dos anticuerpos compiten entre sí por la unión al antígeno cognado mediante un ensayo de competencia, que es bien conocido en la técnica.
El anticuerpo anti-Galectina-9 puede unirse a un epítopo del cual al menos un segmento está en CRD1 de una proteína Galectina-9 (por ejemplo, una Galectina-9 humana o una Galectina-9 de ratón). El anticuerpo puede unirse a un epítopo que se encuentra completamente dentro del CRD1 de la proteína Galectina-9. El anticuerpo puede unirse a un epítopo que se encuentra parcialmente dentro del CRD1 de la proteína Galectina-9. El epítopo al que se une el anticuerpo anti-galectina es un epítopo lineal. El epítopo al que se une el anticuerpo anti-Galectina es un epítopo conformacional.
El anticuerpo anti-Galectina-9 puede unirse a un epítopo del que al menos un segmento se encuentra en CRD2 de una proteína Galectina-9 (por ejemplo, una galectina-9 humana o una galectina-9 de ratón). El anticuerpo anti-Galectina-9 puede unirse a un epítopo que se encuentra enteramente dentro del CRD2 de la proteína Galectina-9. Cuando el anticuerpo anti-Galectina-9 se une a un epítopo parcial o totalmente dentro de CDR2, el anticuerpo puede unirse a un epítopo que comprende al menos el residuo W309. Cuando el anticuerpo anti-Galectina-9 se une a un epítopo parcial o totalmente dentro de CDR2, el epítopo al que puede unirse el anticuerpo anti-Galectina-9 no contiene uno o más de R253, R271, Y330, R334,<r>341 e Y236 de SEQ ID NO: 1. El epítopo al que puede unirse el anticuerpo anti-Galectina es un epítopo lineal que abarca el residuo W309. Alternativamente, el epítopo al que puede unirse el anticuerpo anti-Galectina es un epítopo conformacional que comprende W309.
En algunos ejemplos, el anticuerpo anti-Galectina-9 comprende las mismas CDR V<h>y/o V<l>que un anticuerpo ejemplar descrito en este documento. Dos anticuerpos que tienen los mismos CDR V<h>y/o V<l>significan que sus CDR son idénticos cuando se determinan mediante el mismo enfoque(por ejemplo,el enfoque de Kabat o el enfoque de Chothia como se conoce en la técnica). Dichos anticuerpos anti-Galectina-9 pueden tener la misma V<h>, la misma V<l>o ambas en comparación con un anticuerpo ejemplar descrito en este documento.
Dos regiones variables de cadena pesada (o dos regiones variables de cadena ligera) que tienen los mismos CDR significa que los CDR en las dos regiones variables de cadena pesada (o regiones variables de cadena ligera) según lo determinado por el mismo esquema de numeración son idénticos. Los esquemas de numeración ejemplares para determinar las CDR de anticuerpos incluyen el esquema de numeración "Kabat" (Kabat et al. (1991), 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland), el esquema de numeración "Chothia" (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948), el esquema de numeración "Contact" (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)), el esquema de numeración "IMGT" (Lefranc MP et al., Dev Comp Immunol, enero de 2003; 27(1):55-77), y el esquema de numeración "AHo" (Honegger A y Pluckthun A, J Mol Biol, 8 de junio de 2001; 309(3):657-70). Como lo saben los expertos en la materia, las regiones CDR de los anticuerpos anti-pKal y anti-FXII ejemplares identificados en este documento están determinadas por el esquema de numeración "Chothia", que se utiliza como ejemplo.
También dentro del alcance de la presente divulgación se encuentran variantes funcionales de cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 ejemplares como se divulga en este documento. Estas variantes funcionales son sustancialmente similares al anticuerpo ejemplar, tanto estructural como funcionalmente. Una variante funcional comprende sustancialmente los mismos CDR V<h>y V<l>que el anticuerpo ejemplar. Por ejemplo, puede comprender solo hasta 5(por ejemplo,4, 3, 2 o 1) variaciones de residuos de aminoácidos en las regiones CDR totales del anticuerpo y se une al mismo epítopo de Galectina-9 con una afinidad sustancialmente similar(porejemplo,que tiene un valor K<d>en el mismo orden). Alternativamente o además, las variaciones de residuos de aminoácidos son sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos. Tal como se utiliza en este documento, una "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a una sustitución de aminoácidos que no altera las características relativas de carga o tamaño de la proteína en la que se realiza la sustitución de aminoácidos. Las variantes pueden prepararse de acuerdo con métodos para alterar la secuencia polipeptídica conocidos por un experto en la materia, tales como los que se encuentran en las referencias que recopilan dichos métodos,por ejemploMolecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen las sustituciones realizadas entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; y (g) E, D.
El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos se determina mediante el algoritmo de Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modificado como en Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Un algoritmo de este tipo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación=50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de interés. Cuando existen espacios entre dos secuencias, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., Nucleic Acids Res.
25(17):3389-3402, 1997. Al utilizar los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utiizar los parámetros por defecto de los respectivos programas(por ejemplo,XBLAST y NBLAST). El anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender un marco de región variable de cadena pesada derivado de una subclase de fragmento VH de línea germinal. Dichas regiones VH de la línea germinal son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, la base de datos IMGT (www.imgt.org) o www.vbase2.org/vbstat.php. Los ejemplos incluyen la subfamilia IGHV1(por ejemplo,IGHV1-2, IGHV1-3, IGHV1-8, IGHV1-18, IGHV1-24, IGHV1-45, IGHV1-46, IGHV1-58 e IGHV1-69), la subfamilia IGHV2(por ejemplo,IGHV2-5, IGHV2-26 y IGHV2-70), la subfamilia IGHV3(por ejemplo,IGHV3-7, IGHV3-9, IGHV3-11, IGHV3-13, IGHV3-15, IGHV3-20, IGHV3-21, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV3-33, IGHV3-43, IGHV3-48, IGHV3-49, IGHV3-53, IGHV3-64, IGHV3-66, IGHV3-72, IGHV3-73, IGHV3-74), la subfamilia IGHV4(por ejemplo,IGHV4-4, IGHV4-28, IGHV4-31, IGHV4-34, IGHV4-39, IGHV4-59, IGHV4-61 e IGHV4-B), la subfamilia IGHV(por ejemplo,IGHV5-51 o IGHV6-1) y la subfamilia IGHV7(por ejemplo,IGHV7-4-1).
Alternativamente o además, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región variable de cadena ligera que contiene un marco derivado de un fragmento V<k>de la línea germinal. Los ejemplos incluyen un marco IGKV1(por ejemplo,IGKV1-05, IGKV1-12, IGKV1-27, IGKV1-33 o IGKV1-39), un marco IGKV2(por ejemplo,IGKV2-28), un marco IGKV3(por ejemplo,IGKV3-11, IGKV3-15 o IGKV3-20) y un marco IGKV4(por ejemplo,IGKV4-1). En otros casos, el anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región variable de cadena ligera que contiene un marco derivado de un fragmento VA de la línea germinal. Los ejemplos incluyen un marco IGA1(por ejemplo,IGAV1-36, IGAV1-40, IGAV1-44, IGAV1-47, IGAV1-51), un marco IGA2 (por ejemplo, IGAV2-8, IGAV2-11, IGAV2-14, IGAV2-18, IGAV2-23), un marco IGA3 (por ejemplo, IGAV3-1, IGAV3-9, IGAV3-10, IGAV3-12, IGAV3-16, IGAV3-19, IGAV3-21, IGAV3-25, IGAV3-27), un marco IGA4 (por ejemplo, IGAV4-3, IGAV4-60, IGAV4-69,), un marco IGA5 (por ejemplo, IGAV5-39, IGAV5-45,), un marco IGA6 (por ejemplo, IGAV6-57,), un marco IGA7 (por ejemplo, |GaV7-43, IGAV7-46, ), un marco IGA8(por ejemplo,IGAV8-61), un marco IGA9(por ejemplo,IGAV9-49) o un marco IGA10(por ejemplo,IGAV10-54).
La cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 como se describe en este documento puede comprender además una región constante de cadena pesada (CH) o una parte de la misma (por ejemplo,CH1, CH2, CH3 o una combinación de las mismas). La región constante de cadena pesada puede ser de cualquier origen adecuado,por ejemplo,humano, de ratón, de rata o de conejo. En un ejemplo específico, la región constante de cadena pesada proviene de una IgG humana (una cadena pesada gamma) de cualquier subfamilia de IgG como se describe en este documento.
La región constante de cadena pesada de los anticuerpos descritos en este documento puede comprender un solo dominio(por ejemplo,CH1, CH2 o CH3) o una combinación de cualquiera de los dominios individuales, de una región constante(por ejemplo,SEQ ID NO: 419-423). En algunas realizaciones, la región constante de cadena ligera de los anticuerpos descritos en este documento puede comprender un solo dominio(por ejemplo,CL), de una región constante(porejemplo,SEQ ID NO: 418). A continuación se enumeran secuencias de cadenas ligeras y pesadas a modo de ejemplo. La secuencia hIgG1 LALA incluye dos mutaciones, L234A y L235A, que suprimen la unión de FcgR, así como una mutación P329G para abolir la unión del complemento C1q, eliminando así todas las funciones efectoras inmunes. Estas mutaciones están subrayadas y en negrita en las secuencias enumeradas a continuación. La secuencia del mutante de intercambio del brazo Fab hIgG4 incluye una mutación para suprimir el intercambio del brazo Fab (S228P), subrayada y en negrita. La secuencia de la cadena ligera de G9.2-17 es idéntica entre todas las construcciones G9.-2-17. De manera similar, la secuencia de la cadena ligera de G9.1-8m13 es idéntica entre todas las construcciones de G9.1-8m13.Los residuos en negrita son las regiones VH y VL. Una secuencia señal de IL2 (MYRMQLLSCIALSLALVTNS; SEQ ID NO:469 se encuentra en el extremo N de la región variable. Se utiliza en vectores de expresión, que se escinde durante la secreción y, por lo tanto, no está en la molécula de anticuerpo madura. La proteína madura (después de la secreción) comienza con "EVQ" para la cadena pesada y "DIM" para la cadena ligera.
Secuencias ejemplares de cadenas pesadas y ligeras
Cadena pesada hIgG1 G9.2-17 (SEQ ID NO: 157)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWVAYISSSSGYTYYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWSYPSWWPYRGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS3KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVGVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPESSLGTOTYICWN HKPFMTKVr]KT<VFPF<FmKTHrnnPprP7\PFT T GGPSVFT.FPPYPKnTT.MTSRTPF.VT'CVWnVSPFnPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLMGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOP REP0VYTLPP3REEMTKN0V3LTCLVKGFYF3DIAVEWE3NG0PENNYKTTPPVLD5DG3FFLY3KLTVD KSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSFGK*
Cadena ligera (SEQ ID NO: 108)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTD FTLTISSLQEEDFATYYCQQSSTDPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL3KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC*
Cadena pesada hIgG1 LALA G9.2-17 (SEQ ID NO: 210)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWVAYISSSSGYTYYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWSYPSWWPYRGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS3KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVFVSWMSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICMVW HKPSNTKVDKKVEPK3CDKTHFCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKMQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSFGK*
Cadena ligera (SEQ ID NO: 108)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQSSTDPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC*
Cadena pesada hIgG4 G9.2-17 (SEQ ID NO: 263)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWVAYISSSSGYTYYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWSYPSWWPYRGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPC3RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVCVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCWD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGFSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK3R WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
Cadena ligera (SEQ ID NO: 108)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLLYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQSSTDPITFGQGTKVEIKRTVAAP3VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY FREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSFVTKSFN RGEC*
Cadena pesada mut de brazo de intercambio G9.2-17 hIgG4 Fab (SEQ ID NO: 316)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWAYISSSSGYTYYADSVK
GRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWSYPSWWPYRGMDYWGQGTLVTVSSAST KG P SV F P L APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTY TCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN3TYRVVSVETVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPPEPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPEHNYKTTPPVLDSDGSFFLY'SRLT VDASRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLELSPGK*
Cadena ligera (SEQ ID NO: 108)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQSSTDPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQ5GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL3KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC*
Cadena pesada hIgG1 G9.1-8m13 (SEQ ID NO: 136)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWVAYIYPYSSSSSYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYSTYSSKWVWGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPNDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKT K ? RE EQ YN ST Y RWSVLTVLHQDWLNGKE Y KCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQ PR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLVCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSFGK*
Cadena ligera (SEQ ID NO: 108)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTD
f t l t i s s l q p e d f a t y y c q q s y y d s n p i t f g q g t k v e i k r t v a a p s v f i f p p s d e q l k s g t a s v v c l l n n FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC*
Cadena pesada G9.1-8m13 hIgG1 LALA (SEQ ID NO: 189)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWVAYIYPYSSSSSYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYSTYSSKWVWGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVVVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICMVNH KPSNTKVDKKVEPK3CJKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNffYVEGVEVHNAKTK? RE EQYNST Y R W S VLTVLHQDWLNGKE Y KCKVSNKALGAPIEKTIS1YAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLCCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDC-SFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSFGK*
_Cadena ligera (SEQ ID NO: 108)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDF T L T IS S L Q P E D F A T Y Y C Q Q S Y Y D S N P IT F G Q G T K V E IK R T V A A P S V F IF P P S D E Q L K S G T A S W C L L N N FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC *
Cadena pesada hIgG4 G9.1-8m13 (SEQ ID NO: 242)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSSSIHWVRQAPGKGLEWAYIYPYSSSSSYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYSTYSSKWVWGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT3GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVD'GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS PEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
Cadena ligera (SEQ ID NO: 108)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQSYYDSNPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
Cadena pesada mut de brazo de intercambio G9.1-8m13 hIgG4 Fab (SEQ ID NO: 295)
ev ql ve s ggg l vqpg gs l r l s ca as gf t vs s s si h wvrq apg kgl e wayi y pys s s s sy ad sv kgr f t i SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYSTYSSKWVWGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFFLAPCSRS TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSCALTSCVHTFPAVLQSSCLYSLSSVVTVPSSSLCTKTYTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVD'GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY3RLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
Cadena ligera (SEQ ID NO: 108)
DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDF T L T IS S L Q P E D F A T Y Y C Q Q S Y Y D S N P IT F G Q G T K V E IK R T V A A P S V F P F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina 9 tiene una cadena ligera que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en SEQ ID NO: 108. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina 9 tiene una cadena pesada que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 316. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina 9 tiene una cadena ligera que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID NO: 108 y una cadena pesada que comprende, consiste esencialmente en o consiste en SEQ ID NO: 316.
La región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 puede comprender una región constante de cadena ligera IgG4 que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 418. En una realización, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante de cadena ligera IgG4 que comprende SEQ ID No: 418. En una realización, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante IgG4 de cadena ligera consistente en SEQ ID NO: 418. En algunas realizaciones, la región constante proviene de una IgG1 humana. En una realización, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante IgG1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 418. En una realización, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante IgG4 de cadena ligera consistente en SEQ ID NO: 418.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante modificada. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante modificada que es inmunológicamente inerte,por ejemplo,no desencadena la lisis mediada por complemento o no estimula la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). La actividad de ADCC se puede evaluar utilizando métodos descritos en la Patente de EE. UU. N.° 5,500,362. En otras realizaciones, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; Solicitud PCT N.°PCT/GB99/01441; y/o Solicitud de Patente del Reino Unido N.° 9809951.8. En algunas realizaciones, la región constante IgG4 es un mutante con intercambio de cadena pesada reducido. En algunas realizaciones, la región constante proviene de un mutante S229P de intercambio de brazo Fab de IgG4 humano. En una realización, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante IgG4 de cadena pesada que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 422. En una realización, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante IgG4 de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 422. En una realización, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante IgG4 de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 422. En algunas realizaciones, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante IgG4 de cadena ligera que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 418. En una realización, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante IgG4 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 418. En una realización, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante IgG4 de cadena ligera consistente en SEQ ID NO: 418. En una realización, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante IgG1 de cadena ligera que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento de la misma) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 418. En una realización, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante IgG1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 418. En una realización, la región constante del anticuerpo anti-Galectina-9 comprende una región constante IgG4 de cadena ligera consistente en SEQ ID NO: 418.
Cadenas ligeras derivadas del clon 9.2
Las cadenas ligeras de los anticuerpos anti-Galectina-9 pueden consistir en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 108.
Las cadenas ligeras de los anticuerpos anti-Galectina-9 comprenden una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 108 (o sus regiones variables). En algunas realizaciones, las cadenas ligeras de los anticuerpos anti-Galectina-9 se establecen en la SEQ ID NO: 108.
Cadenas pesadas derivadas del clon 9.2
En algunas realizaciones, las cadenas pesadas de los anticuerpos anti-Galectina-9 comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 316 (o su región variable). En algunas realizaciones, las cadenas pesadas de los anticuerpos anti-Galectina-9 consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 316. En algunas realizaciones, las cadenas pesadas de los anticuerpos anti-Galectina-9 comprenden una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 316 (o su región variable). En algunas realizaciones, las cadenas pesadas de los anticuerpos anti-Galectina-9 consisten en una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 316.
Cadenas pesadas y ligeras derivadas del clon 9.2
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 o su parte de unión al antígeno comprenden una cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 108 y una cadena pesada que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 316.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 o su parte de unión al antígeno comprenden una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 108 y comprenden una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 316. En algunas realizaciones, las cadenas ligeras de los anticuerpos anti-Galectina-9 comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 108 (o sus regiones variables) y las cadenas pesadas de los anticuerpos anti-Galectina-9 comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 316 (o su región variable). En algunas realizaciones, las cadenas ligeras de los anticuerpos anti-Galectina-9 consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 108 y las cadenas pesadas de los anticuerpos anti-Galectina-9 consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y cualquier incremento en la misma) de identidad de secuencia con la secuencia de cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 316. En algunas realizaciones, las cadenas ligeras de los anticuerpos anti-Galectina-9 comprenden una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 108 (o sus regiones variables) y las cadenas pesadas de los anticuerpos anti-Galectina-9 comprenden una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 316. En algunas realizaciones, las cadenas ligeras de los anticuerpos anti-Galectina-9 consisten en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 108 y las cadenas pesadas de los anticuerpos anti-Galectina-9 consisten en una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 316.
Las regiones constantes de cadena pesada y ligera de anticuerpos son bien conocidas en la técnica,por ejemplo,los proporcionados en la base de datos IMGT (www.imgt.org) o en www.vbase2.org/vbstat.php.
Preparación de anticuerpos anti-Galectina-9
Los anticuerpos capaces de unirse a la Galectina-9, como se describe en este documento, pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York.
En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos para un antígeno diana(por ejemplo,Galectina-9 o un CRD de la misma) se producen mediante tecnología de hibridoma convencional. El antígeno diana de longitud completa o un fragmento del mismo, opcionalmente acoplado a una proteína transportadora tal como KLH, se puede utilizar para inmunizar a un animal huésped para generar anticuerpos que se unan a ese antígeno. La ruta y el programa de inmunización del animal huésped generalmente se ajustan a las técnicas establecidas y convencionales para la estimulación y producción de anticuerpos, como se describe en este documento más adelante. Las técnicas generales para la producción de anticuerpos de ratón, humanizados y humanos son conocidas en la técnica y se describen en este documento. Se contempla que cualquier sujeto mamífero, incluidos los humanos, o células productoras de anticuerpos a partir de él, pueden ser manipulados para que sirvan como base para la producción de líneas celulares de hibridoma de mamíferos, incluidos los humanos. Normalmente, al animal huésped se le inocula por vía intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutánea, intraplantar y/o intradérmica una cantidad de inmunógeno, incluida la descrita en este documento.
Los hibridomas se pueden preparar a partir de linfocitos y células de mieloma inmortalizadas utilizando la técnica general de hibridación de células somáticas de Kohler, B. y Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 o modificada por Buck, D.W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982). Se pueden utilizar en la hibridación las líneas de mieloma disponibles, incluidas, entre otras, X63-Ag8.653 y las del Instituto Salk, Centro de Distribución Celular, San Diego, California, EE. UU. Generalmente, la técnica consiste en fusionar células de mieloma y células linfoides mediante un fusógeno como el polietilenglicol, o por medios eléctricos bien conocidos por los expertos en la materia. Tras la fusión, las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de crecimiento selectivo, como el medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), para eliminar las células progenitoras no hibridadas. Cualquiera de los medios descritos en este documento, suplementado con o sin suero, puede utilizarse para cultivar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales. Como otra alternativa a la técnica de fusión celular, se pueden utilizar células B inmortalizadas por EBV para producir los anticuerpos monoclonales anti-Galectina-9 descritos en este documento. Los hibridomas se expanden y subclonan, si se desea, y los sobrenadantes se analizan para determinar la actividad antiinmunógena mediante procedimientos de inmunoensayo convencionales(por ejemplo,radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático o inmunoensayo de fluorescencia).
Los hibridomas que pueden usarse como fuente de anticuerpos abarcan todos los derivados, células progenie de los hibridomas parentales que producen anticuerpos monoclonales capaces de interferir con la actividad de Galectina-9. Los hibridomas que producen dichos anticuerpos pueden cultivarsein vitrooin vivoutilizando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse de los medios de cultivo o de los fluidos corporales mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como precipitación con sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía y ultrafiltración, si se desea. La actividad no deseada, si está presente, se puede eliminar, por ejemplo, haciendo pasar la preparación sobre adsorbentes hechos del inmunógeno unido a una fase sólida y eluyendo o liberando los anticuerpos deseados del inmunógeno. Inmunización de un animal huésped con un antígeno diana o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana conjugada con una proteína que es inmunogénica en la especie que se va a inmunizar,por ejemplo,hemocianina de lapa, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente derivatizante o bifuncional, por ejemplo éster maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquilo diferentes, pueden producir una población de anticuerpos (por ejemplo,anticuerpos monoclonales).
Si se desea, se puede secuenciar un anticuerpo (monoclonal o policlonal) de interés(por ejemplo,producido por un hibridoma) y luego se puede clonar la secuencia de polinucleótidos en un vector para expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y luego la célula huésped puede expandirse y congelarse para uso futuro. Alternativamente, la secuencia de polinucleótidos puede usarse para manipulación genética para "humanizar" el anticuerpo o para mejorar la afinidad (maduración de la afinidad) u otras características del anticuerpo. Por ejemplo, la región constante puede diseñarse para parecerse más a las regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmune si el anticuerpo se usa en ensayos clínicos y tratamientos en humanos. Puede ser deseable manipular genéticamente la secuencia del anticuerpo para obtener una mayor afinidad con el antígeno diana y una mayor eficacia en la inhibición de la actividad de la Galectina-9. Será evidente para un experto en la técnica que se pueden realizar uno o más cambios de polinucleótidos en el anticuerpo y aún así mantener su especificidad de unión al antígeno diana.
En otras realizaciones, se obtienen anticuerpos completamente humanos utilizando ratones disponibles comercialmente que han sido diseñados para expresar proteínas de inmunoglobulina humana específicas. Los animales transgénicos que están diseñados para producir una respuesta inmune más deseable(por ejemplo,anticuerpos totalmente humanos) o más robusta también pueden usarse para la generación de anticuerpos humanizados o humanos. Ejemplos de dicha tecnología son XenomouseRTM de Amgen, Inc. (Fremont, California) y HuMAb-MouseRTMy TC MouseTM de Medarex, Inc. (Princeton, Nueva Jersey). En otras realizaciones, los anticuerpos se producen de forma recombinante mediante visualización de fagos o tecnología de levadura. Véanse, por ejemplo,las Patentes de EE. UU. n.° 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; y 6,265,150; y Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455. En realizaciones alternativas, se utiliza la tecnología de visualización de fagos (McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerposin vitro,a partir de repertorios de genes del dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados.
En realizaciones alternativas, los anticuerpos capaces de unirse a los antígenos diana como se describe en este documento se aíslan de una biblioteca de anticuerpos adecuada. Las bibliotecas de anticuerpos, que contienen varios componentes, pueden utilizarse para identificar anticuerpos que se unen a un antígeno diana específico(por ejemplo,el CRD1 o el CRD2 de la Galectina-9 en este caso) siguiendo procesos de selección rutinarios, como se conoce en la técnica. En el proceso de selección, una biblioteca de anticuerpos puede sondearse con el antígeno diana o un fragmento del mismo, y los miembros de la biblioteca capaces de unirse a dicho antígeno pueden aislarse, generalmente mediante retención en un soporte. Este proceso de selección puede realizarse en múltiples rondas (por ejemplo, incluyendo selecciones tanto positivas como negativas) para enriquecer el grupo de anticuerpos capaces de unirse al antígeno diana. Luego se pueden aislar clones individuales del grupo enriquecido y caracterizarlos aún más para identificar aquellos que tienen la actividad de unión y la actividad biológica deseadas. Las secuencias de los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera también se pueden determinar mediante la metodología convencional. Hay una serie de métodos rutinarios conocidos en la técnica para identificar y aislar anticuerpos capaces de unirse a los antígenos diana descritos en este documento, incluida la visualización de fagos, la visualización de levaduras, la visualización ribosómica o la tecnología de visualización de mamíferos.
A modo de ejemplo, las exhibiciones de fagos típicamente utilizan un enlace covalente para unir el componente de proteína(por ejemplo,anticuerpo) a una proteína de cubierta de bacteriófago. El enlace resulta de la traducción de un ácido nucleico que codifica el componente del anticuerpo fusionado a la proteína de la cubierta. El enlace puede incluir un enlace peptídico flexible, un sitio de proteasa o un aminoácido incorporado como resultado de la supresión de un codón de parada. La visualización de fagos se describe, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N.° 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; el documento WO 92/18619; el documento WO 91/17271; el documento WO 92/20791; el documento WO 92/15679; el documento WO 93/01288; el documento WO 92/01047; el documento WO 92/09690; el documento WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20;Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8 y Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3)344-8. Se describen métodos adecuados adicionales en Miller et al., PloS One, 2012, 7, e43746; Fellouse et al., J MolBiol, 2007, 373, 924 940. Los bacteriófagos que muestran el componente proteico se pueden cultivar y cosechar utilizando métodos de preparación de fagos estándar,por ejemplo:Precipitación de PEG a partir de medios de crecimiento. Después de la selección de fagos de exhibición individuales, el ácido nucleico que codifica los componentes proteicos seleccionados se puede aislar de las células infectadas con los fagos seleccionados o de los propios fagos, después de la amplificación. Se pueden seleccionar colonias o placas individuales y luego se puede aislar y secuenciar el ácido nucleico.
Otros formatos de visualización incluyen visualización basada en células (véase,por ejemplo,el documento WO 03/029456), fusiones de proteína-ácido nucleico (véase,por ejemplo,rlel documento Patente de EE. UU. N.° 6,207,446), visualización de ribosomas (véase,por ejemplo,Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 y Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol.
328:404-30; y Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-35), y visualización periplásmica deE. coli(J Immunol Methods. 22 de noviembre de 2005; PMID: 16337958).
Después de que los miembros de la biblioteca de exhibición se aíslan para unirse al antígeno diana, cada miembro aislado de la biblioteca también puede probarse para determinar su capacidad de unirse a una molécula no diana para evaluar su especificidad de unión. Los ejemplos de moléculas no diana incluyen estreptavidina en microesferas magnéticas, agentes bloqueadores como albúmina de suero bovino, leche bovina descremada, proteína de soja, cualquier anticuerpo monoclonal de captura o inmovilización de la diana o células no transfectadas que no expresan la diana. Para obtener los datos se puede utilizar, por ejemplo, una prueba ELISA de alto rendimiento. La prueba ELISA también se puede utilizar para obtener datos cuantitativos sobre la unión de cada miembro de la biblioteca a la diana, así como sobre la reactividad entre especies con dianas relacionadas o subunidades del antígeno diana y también en diferentes condiciones, tales como pH 6 o pH 7,5. Los datos de unión de la diana y de la no diana se comparan(porejemplo,utilizando una computadora y un software) para identificar los miembros de la biblioteca que se unen específicamente a la diana.
Después de seleccionar miembros de la biblioteca candidatos que se unen a una diana, cada miembro de la biblioteca candidato se puede analizar más a fondo,por ejemplo,para caracterizar aún más sus propiedades de unión para la diana,por ejemplo,Galectina-9. Cada miembro candidato de la biblioteca puede ser sometido a uno o más ensayos de selección secundarios. El ensayo puede ser para una propiedad de unión, una propiedad catalítica, una propiedad inhibitoria, una propiedad fisiológica(por ejemplo,citotoxicidad, aclaramiento renal, inmunogenicidad), una propiedad estructural(por ejemplo,estabilidad, conformación, estado de oligomerización) u otra propiedad funcional. El mismo ensayo se puede utilizar repetidamente, pero con diferentes condiciones, por ejemplo, para determinar la sensibilidad iónica, térmica o de pH.
Según sea apropiado, los ensayos pueden utilizar directamente un miembro de la biblioteca de visualización, un polipéptido recombinante producido a partir del ácido nucleico que codifica el polipéptido seleccionado, o un péptido sintético sintetizado en base a la secuencia del polipéptido seleccionado. En el caso de Fabs seleccionados, estos pueden evaluarse o modificarse y producirse como proteínas IgG intactas. A continuación se describen ensayos ejemplares para propiedades de unión.
Las proteínas de unión también se pueden evaluar mediante un ensayo ELISA. Por ejemplo, cada proteína se pone en contacto con una placa de microtitulación cuya superficie inferior ha sido recubierta con la diana,por ejemplo,una cantidad limitante de la diana. La placa se lava con tampón para eliminar los polipéptidos unidos de forma no específica. Luego, la cantidad de proteína de unión unida a la diana en la placa se determina sondeando la placa con un anticuerpo que pueda reconocer la proteína de unión,por ejemplo,una etiqueta o parte constante de la proteína de unión. El anticuerpo está vinculado a un sistema de detección(por ejemplo,una enzima como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante (HRP) que produce un producto colorimétrico cuando se proporcionan los sustratos adecuados).
Alternativamente, la capacidad de una proteína de unión descrita en este documento para unirse a un antígeno diana se puede analizar utilizando un ensayo homogéneo,es decir,después de que se agregan todos los componentes del ensayo, no se requieren manipulaciones de fluidos adicionales. Por ejemplo, la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) se puede utilizar como un ensayo homogéneo (véase, por ejemplo, Lakowicz et al., patente de EE. UU. n.° 5,631,169; Stavrianopoulos, et al., patente de EE. UU. n.° 4,868,103). Se selecciona una etiqueta fluorófora en la primera molécula(por ejemplo,la molécula identificada en el resto) de modo que su energía fluorescente emitida pueda ser absorbida por una etiqueta fluorescente en una segunda molécula(porejemplo,la diana) si la segunda molécula está cerca de la primera molécula. La etiqueta fluorescente de la segunda molécula fluoresce cuando absorbe la energía transferida. Dado que la eficiencia de la transferencia de energía entre las etiquetas está relacionada con la distancia que separa las moléculas, se puede evaluar la relación espacial entre las moléculas. En una situación en la que se produce la unión entre las moléculas, la emisión fluorescente de la molécula aceptora en el ensayo debe ser máxima. Un evento de unión configurado para monitorización por FRET puede medirse fácilmente mediante métodos de detección fluorométrica estándar,por ejemplo,con un fluorímetro. Al titular la cantidad de la primera o segunda molécula de unión, se puede generar una curva de unión para estimar la constante de unión de equilibrio.
La resonancia plasmónica de superficie (SPR) se puede utilizar para analizar la interacción de una proteína de unión y un antígeno diana. La SPR o el análisis de interacción biomolecular (BIA) detectan las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar a ninguno de los elementos de interacción. Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativos de un evento de unión) del chip BIA dan lugar a alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de SPR). Los cambios en la refractividad generan una señal detectable, que se mide como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas. Los métodos para utilizar SPR se describen, por ejemplo, en el documento U.S. Patent No.
5,641,640; Raether, 1988, Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander and Urbaniczky, 1991, Anal. Chem.
63:2338-2345; Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 y recursos en línea proporcionados por BIAcore International AB (Uppsala, Suecia).
La información del SPR se puede utilizar para proporcionar una medida precisa y cuantitativa de la constante de disociación de equilibrio (K<d>), y parámetros cinéticos, incluidos Kon y Koff, para la unión de una proteína de unión a una diana. Dichos datos se pueden utilizar para comparar diferentes biomoléculas. Por ejemplo, se pueden comparar proteínas seleccionadas de una biblioteca de expresión para identificar proteínas que tienen alta afinidad por la diana o que tienen una Koff lenta. Esta información también se puede utilizar para desarrollar relaciones estructura-actividad (SAR). Por ejemplo, los parámetros de unión cinética y de equilibrio de las versiones maduras de una proteína parental se pueden comparar con los parámetros de la proteína parental. Es posible identificar aminoácidos variantes en posiciones determinadas que se correlacionan con parámetros de unión particulares,por ejemplo,alta afinidad y Koff lenta. Esta información se puede combinar con modelos estructurales(por ejemplo,mediante modelos de homología, minimización de energía o determinación de la estructura mediante cristalografía de rayos X o RMN). Como resultado, se puede formular una comprensión de la interacción física entre la proteína y su diana y utilizarla para guiar otros procesos de diseño.
Como ejemplo adicional, se pueden utilizar ensayos celulares. Es posible examinar las proteínas de unión para determinar su capacidad de unirse a las células que expresan y muestran de manera transitoria o estable la diana de interés en la superficie celular. Por ejemplo, las proteínas de unión a Galectina-9 se pueden marcar con fluorescencia y la unión a Galectina-9 en presencia o ausencia de anticuerpo antagonista se puede detectar mediante un cambio en la intensidad de fluorescencia utilizando citometría de flujo ,por ejemplo,una máquina FACS.
Los fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo intacto (anticuerpo de longitud completa) se pueden preparar a través de métodos de rutina. Por ejemplo, los fragmentos F(ab')2 se pueden producir mediante la digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo, y los fragmentos Fab se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2.
Los anticuerpos modificados genéticamente, tales como anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena única y anticuerpos biespecíficos, se pueden producir a través de,por ejemplo,tecnología recombinante convencional. En un ejemplo, el ADN que codifica un anticuerpo monoclonal específico para un antígeno diana se puede aislar y secuenciar fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo,mediante el uso de sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Una vez aislado, el ADN puede colocarse en uno o más vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped como célulasE. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Véase,por ejemplo,la Publicación PCT No. WO 87/04462. El ADN puede entonces modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homólogas, Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es inmunoglobulina. De esa manera, se pueden preparar anticuerpos modificados genéticamente, tales como los anticuerpos “quiméricos” o “híbridos”, que tienen la especificidad de unión de un antígeno diana.
Las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" son bien conocidas en la técnica. Véase,por ejemplo,Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; y Takeda et al. (1984) Nature 314:452.
Los métodos para construir anticuerpos humanizados también son bien conocidos en la técnica. Veéase,por ejemplo,Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989). En un ejemplo, las regiones variables de V<h>y V<l>de un anticuerpo parental no humano se someten a un análisis de modelado molecular tridimensional siguiendo métodos conocidos en la técnica. A continuación, se identifican los residuos de aminoácidos del marco que se prevé que sean importantes para la formación de las estructuras CDR correctas mediante el mismo análisis de modelado molecular. Paralelamente, las cadenas V<h>y V<l>humanas que tienen secuencias de aminoácidos homólogas a las del anticuerpo no humano original se identifican a partir de cualquier base de datos de genes de anticuerpos utilizando las secuencias V<h>y V<l>originales como consultas de búsqueda. Luego se seleccionan los genes aceptores V<h>y V<l>humanos.
Las regiones CDR dentro de los genes aceptores humanos seleccionados se pueden reemplazar con las regiones CDR del anticuerpo no humano original o variantes funcionales del mismo. Cuando sea necesario, los residuos dentro de las regiones marco de la cadena principal que se prevé que sean importantes en la interacción con las regiones CDR (ver la descripción anterior) se pueden utilizar para sustituir los residuos correspondientes en los genes aceptores humanos.
Se puede preparar un anticuerpo de cadena única a través de tecnología recombinante uniendo una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera. Preferiblemente, se incorpora un enlazador flexible entre las dos regiones variables. Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única (Patentes de EE. UU. N.os. 4,946,778 y 4,704,692) se pueden adaptar para producir una biblioteca de scFv de fagos o levaduras y los clones de scFv específicos de Galectina-9 se pueden identificar a partir de la biblioteca siguiendo procedimientos de rutina. Los clones positivos pueden someterse a pruebas adicionales para identificar aquellos que inhiben la actividad de la Galectina-9.
Los anticuerpos obtenidos siguiendo un método conocido en la técnica y descrito en este documento se pueden caracterizar utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método es identificar el epítopo al que se une el antígeno, o "mapeo de epítopos". Existen muchos métodos conocidos en la técnica para mapear y caracterizar la ubicación de epítopos en proteínas, incluyendo la resolución de la estructura cristalina de un complejo anticuerpo-antígeno, ensayos de competencia, ensayos de expresión de fragmentos de genes y ensayos basados en péptidos sintéticos, como se describe, por ejemplo, en el Capítulo 11 de Harlow y Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 1999. En un ejemplo adicional, se puede utilizar el mapeo de epítopos para determinar la secuencia a la que se une un anticuerpo. El epítopo puede ser un epítopo lineal,es decir,contenido en un solo tramo de aminoácidos, o un epítopo conformacional formado por una interacción tridimensional de aminoácidos que no necesariamente pueden estar contenidos en un solo tramo (secuencia lineal de estructura primaria). Se pueden aislar o sintetizar(por ejemplo,de forma recombinante) péptidos de longitudes variables(por ejemplo,al menos 4-6 aminoácidos de longitud) y utilizar para ensayos de unión con un anticuerpo. En otro ejemplo, el epítopo al que se une el anticuerpo se puede determinar en una evaluación sistemática utilizando péptidos superpuestos derivados de la secuencia del antígeno diana y determinando la unión mediante el anticuerpo. Según los ensayos de expresión de fragmentos genéticos, el marco de lectura abierto que codifica el antígeno diana se fragmenta aleatoriamente o mediante construcciones genéticas específicas y se determina la reactividad de los fragmentos expresados del antígeno con el anticuerpo que se va a probar. Los fragmentos de genes pueden, por ejemplo, producirse mediante PCR y luego transcribirse y traducirse en proteínas in vitro, en presencia de aminoácidos radiactivos. La unión del anticuerpo a los fragmentos de antígeno marcados radiactivamente se determina luego mediante inmunoprecipitación y electroforesis en gel. Ciertos epítopos también pueden identificarse mediante el uso de grandes bibliotecas de secuencias de péptidos aleatorias mostradas en la superficie de partículas de fagos (bibliotecas de fagos). Alternativamente, se puede probar una biblioteca definida de fragmentos de péptidos superpuestos para determinar su unión al anticuerpo de prueba en ensayos de unión simples. En un ejemplo adicional, se pueden realizar mutagénesis de un dominio de unión a antígeno, experimentos de intercambio de dominios y mutagénesis por escaneo de alanina para identificar residuos requeridos, suficientes y/o necesarios para la unión del epítopo. Por ejemplo, se pueden realizar experimentos de intercambio de dominios utilizando un mutante de un antígeno diana en el que se han reemplazado (intercambiado) varios fragmentos del polipéptido Galectina-9 con secuencias de una proteína estrechamente relacionada, pero antigénicamente distinta (como otro miembro de la familia de lectinas solubles que se unen a p-galactósidos). Al evaluar la unión del anticuerpo a la Galectina-9 mutante, se puede evaluar la importancia del fragmento de antígeno particular para la unión del anticuerpo.
Alternativamente, se pueden realizar ensayos de competencia utilizando otros anticuerpos que se sabe que se unen al mismo antígeno para determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo que los otros anticuerpos. Los ensayos de competencia son bien conocidos por los expertos en la técnica.
En algunos ejemplos, un anticuerpo anti-Galectina-9 se prepara mediante tecnología recombinante como se ejemplifica a continuación.
Los ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada y ligera de un anticuerpo anti-Galectina-9 como se describe en este documento se pueden clonar en un vector de expresión, estando cada secuencia de nucleótidos en enlace operativo con un promotor adecuado. En un ejemplo, cada una de las secuencias de nucleótidos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera está en enlace operativo con un promotor distinto. Alternativamente, las secuencias de nucleótidos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera pueden estar en enlace operativo con un solo promotor, de modo que tanto las cadenas pesadas como las ligeras se expresen desde el mismo promotor. Cuando sea necesario, se puede insertar un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) entre las secuencias codificantes de la cadena pesada y la cadena ligera.
En algunos ejemplos, las secuencias de nucleótidos que codifican las dos cadenas del anticuerpo se clonan en dos vectores, que pueden introducirse en la misma célula o en células diferentes. Cuando las dos cadenas se expresan en células diferentes, cada una de ellas puede aislarse de las células huésped que las expresan y las cadenas pesadas y ligeras aisladas pueden mezclarse e incubarse en condiciones adecuadas que permitan la formación del anticuerpo.
Generalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica una o todas las cadenas de un anticuerpo puede clonarse en un vector de expresión adecuado en enlace funcional con un promotor adecuado mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos y el vector pueden ponerse en contacto, en condiciones adecuadas, con una enzima de restricción para crear extremos complementarios en cada molécula que puedan aparearse y unirse mediante una ligasa. Alternativamente, los enlaces de ácidos nucleicos sintéticos se pueden ligar a los extremos de un gen. Estos enlaces sintéticos contienen secuencias de ácidos nucleicos que corresponden a un sitio de restricción particular en el vector. La selección de vectores de expresión/promotores dependería del tipo de células huésped que se utilizarán para producir los anticuerpos.
Se puede utilizar una variedad de promotores para la expresión de los anticuerpos descritos en este documento, que incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano intermedio del citomegalovirus (CMV), un LTR viral tal como el LTR del virusdel sarcoma de Rous,el LTR del VIH, el LTR del HTLV-1, el promotor temprano del virus de simios 40 (SV40), el promotor lac UV5de E. coliy el promotor del virus tk del herpes simple.
También se pueden utilizar promotores regulables. Tales promotores regulables incluyen aquellos que utilizan el represor lac deE.colicomoun modulador de transcripción para regular la transcripción de promotores de células de mamíferos que llevan el operador lac [Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)], aquellos que utilizan el represor de tetraciclina (tetR) [Gossen, M., y Bujard, H., Proc. Natl. Sci. USA 89:5547-5551 (1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P, et al., Proc. Natl. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)]. Otros sistemas incluyen el dímero FK506, VP16 o p65 utilizando astradiol, RU486, difenol murislerona o rapamicina. Los sistemas inducibles están disponibles en Invitrogen, Clontech y Ariad.
Se pueden utilizar promotores regulables que incluyan un represor con el operón. En una realización, el represor lac deE. colipuede funcionar como un modulador transcripcional para regular la transcripción de los promotores de células de mamíferos que llevan el operador lac (M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987); Gossen y Bujard (1992); M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)) combinaron el represor de tetraciclina (tetR) con el activador de la transcripción (VP 16) para crear una proteína de fusión tetR-activador de la transcripción de células de mamíferos, tTa (tetR-VP 16), con el promotor mínimo que lleva tetO derivado del promotor temprano inmediato principal del citomegalovirus humano (hCMV) para crear un sistema de operador tetR-tet para controlar la expresión génica en células de mamíferos. En una realización, se utiliza un interruptor inducible por tetraciclina. El represor de tetraciclina (tetR) solo, en lugar de los derivados de fusión del factor de transcripción de células de mamíferos con tetR, puede funcionar como un potente transmodulador para regular la expresión genética en células de mamíferos cuando el operador de tetraciclina está ubicado apropiadamente aguas abajo del elemento TATA del promotor CMVIE (Yao et al., Human Gene Therapy, 10(16):1392-1399 (2003)). Una ventaja particular de este interruptor inducible por tetraciclina es que no requiere el uso de un transactivador de células de mamíferos-represores de tetraciclina o una proteína de fusión represora, que en algunos casos puede ser tóxica para las células (Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)), para lograr sus efectos regulables.
Además, el vector puede contener, por ejemplo, algunos o todos los siguientes: un gen marcador seleccionable, tal como el gen de neomicina para la selección de transfectantes estables o transitorios en células de mamíferos; secuencias potenciadoras/promotoras del gen temprano inmediato del CMV humano para altos niveles de transcripción; señales de terminación de la transcripción y procesamiento de ARN de SV40 para la estabilidad del ARNm; orígenes de replicación del polioma de SV40 y ColE1 para la replicación episomal adecuada; sitios de unión a ribosomas internos (IRESes), sitios de clonación múltiple versátiles; y promotores de ARN T7 y SP6 para la transcripciónin vitrode ARN sentido y antisentido. Los vectores y métodos adecuados para producir vectores que contienen transgenes son bien conocidos y están disponibles en la técnica.
Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles para practicar los métodos descritos en este documento incluyen, pero no se limitan a, la señal de poliadenilación de colágeno I humano, la señal de poliadenilación de colágeno II humano y la señal de poliadenilación de SV40.
Uno o más vectores(por ejemplo,vectores de expresión) que comprenden ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los anticuerpos se pueden introducir en células huésped adecuadas para producir los anticuerpos. Las células huésped pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o cualquier cadena polipeptídica del mismo. Dichos anticuerpos o cadenas polipeptídicas de los mismos pueden ser recuperados por las células cultivadas(por ejemplo,de las células o del sobrenadante del cultivo) a través de un método convencional,por ejemplo,purificación por afinidad. Si es necesario, las cadenas polipeptídicas del anticuerpo se pueden incubar en condiciones adecuadas durante un período de tiempo adecuado que permita la producción del anticuerpo.
En algunas realizaciones, los métodos para preparar un anticuerpo descrito en este documento implican un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada como la cadena ligera de un anticuerpo anti-Galectina-9, como también se describe en este documento. El vector de expresión recombinante se puede introducir en una célula huésped adecuada(por ejemplo,una célula CHO dhfr-) mediante un método convencional,por ejemplo,transfección mediada por fosfato de calcio. Las células huésped transformantes positivas se pueden seleccionar y cultivar en condiciones adecuadas que permitan la expresión de las dos cadenas polipeptídicas que forman el anticuerpo, que se puede recuperar de las células o del medio de cultivo. Cuando sea necesario, las dos cadenas recuperadas de las células huésped pueden incubarse en condiciones adecuadas que permitan la formación del anticuerpo.
En un ejemplo, se proporcionan dos vectores de expresión recombinantes, uno que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-Galectina-9 y el otro que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-Galectina-9. Ambos vectores de expresión recombinantes se pueden introducir en una célula huésped adecuada(por ejemplo,una célula CHO dhfr) mediante un método convencional,por ejemplo,transfección mediada por fosfato de calcio. Alternativamente, cada uno de los vectores de expresión puede introducirse en una célula huésped adecuada. Los transformantes positivos se pueden seleccionar y cultivar en condiciones adecuadas que permitan la expresión de las cadenas polipeptídicas del anticuerpo. Cuando los dos vectores de expresión se introducen en las mismas células huésped, el anticuerpo producido en ellas puede recuperarse de las células huésped o del medio de cultivo. Si es necesario, las cadenas polipeptídicas pueden recuperarse de las células huésped 0 del medio de cultivo y luego incubarse en condiciones adecuadas que permitan la formación del anticuerpo. Cuando los dos vectores de expresión se introducen en diferentes células huésped, cada uno de ellos puede recuperarse de las células huésped correspondientes o del medio de cultivo correspondiente. Las dos cadenas polipeptídicas pueden luego incubarse en condiciones adecuadas para la formación del anticuerpo.
Se utilizan técnicas estándar de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar transformantes, cultivar las células huésped y recuperar los anticuerpos del medio de cultivo. Por ejemplo, algunos anticuerpos pueden aislarse mediante cromatografía de afinidad con una matriz acoplada a proteína A o proteína G.
Cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada, la cadena ligera o ambas de un anticuerpo anti-Galectina-9 como se describe en este documento, los vectores(por ejemplo,vectores de expresión) que los contienen; y las células huésped que comprenden los vectores están dentro del alcance de la presente divulgación.
Los anticuerpos anti-Galectina-9 así preparados se pueden caracterizar utilizando métodos conocidos en la técnica, mediante los cuales se detecta y/o mide la reducción, mejora o neutralización de la actividad biológica de Galectina-9. Por ejemplo, un ensayo de tipo ELISA puede ser adecuado para la medición cualitativa o cuantitativa de la inhibición de la señalización de Dectina-1 o TIM-3 por parte de Galectina-9.
La bioactividad de un anticuerpo anti-Galectina-9 se puede verificar incubando un anticuerpo candidato con Dectina-1 y Galectina-9, y monitoreando una o más de las siguientes características: (a) unión entre Dectina-1 y Galectina-9 e inhibición de la transducción de señalización mediada por la unión; (b) prevención, mejora o tratamiento de cualquier aspecto de un tumor sólido; (c) bloqueo o disminución de la activación de Dectina-1; (d) inhibición (reducción) de la síntesis, producción o liberación de Galectina-9. Alternativamente, se puede utilizar TIM-3 para verificar la bioactividad de un anticuerpo anti-Galectina-9 utilizando el protocolo descrito anteriormente. Alternativamente, se puede utilizar CD206 para verificar la bioactividad de un anticuerpo anti-Galectina-9 utilizando el protocolo descrito anteriormente.
Ensayos adicionales para determinar la bioactividad de un anticuerpo anti-Galectina-9 incluyen la medición de la activación de células T CD8+ y CD4+ (convencional) (en un ensayo in vitro o in vivo, por ejemplo, midiendo los niveles de citocinas inflamatorias, por ejemplo, IFNgamma, TNFalfa, CD44, ICOS granzima B, Perforina, IL2 (regulación positiva); CD26L e IL-10 (regulación negativa)); medición de la reprogramación de macrófagos (in vitro o in vivo), por ejemplo, del fenotipo M2 al M1 (por ejemplo, aumento de MHCII, reducción de CD206, aumento de TNF-alfa e iNOS). Alternativamente, los niveles de ADCC se pueden evaluar, por ejemplo, en un ensayo in vitro, como se describe en este documento.
Métodos de tratamiento
La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo y usos de los mismos para inhibir o reducir una señalización mediada por Galectina-9 o eliminar o reducir células positivas para Galectina-9. Cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento se puede utilizar en cualquiera de los métodos descritos en este documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galentin-9 se selecciona de G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1 -9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se selecciona entre G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y combinaciones de oro y aglutinante de baja afinidad G9.2. de los mismos. Los ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 9.2-17 o 9.1-8mut13. Dichos anticuerpos se pueden utilizar para tratar enfermedades asociadas con la Galectina-9. En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para tratar el cáncer. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos para reducir, mejorar o eliminar uno o más síntomas asociados con el cáncer.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar el cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar el cáncer en un sujeto, incluyendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se selecciona del grupo que consiste en G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y aglutinante de baja afinidad G9.2 o combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 9.2-17 o 9.1-8mut13.
Dado que la acción protumoral de la Galectina-9 está mediada por la interacción con las células inmunes (es decir, interacciones con las células linfoides a través de TIM-3, CD44 y 41BB, y con los macrófagos a través de Dectina-1 y CD206) y dado que la Galectina-9 se expresa en una gran cantidad de tumores, la focalización de la Galectina-9, por ejemplo, utilizando un anticuerpo de unión a la Galectina-9 para inhibir la interacción con sus receptores, proporciona un enfoque terapéutico que se puede aplicar en una variedad de diferentes tipos de tumores.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de cáncer suprarrenal, carcinoma adrenocortical, cáncer anal, cáncer de apéndice, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer óseo (por ejemplo, tumores de sarcoma de Ewing, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno), cáncer cerebral (por ejemplo, astrocitomas, glioma del tronco encefálico, craneofaringioma, ependimoma), tumores bronquiales, colangiocarcinoma, colangiosarcoma, tumores del sistema nervioso central, cáncer de mama, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer ocular, cáncer de vesícula biliar, cáncer gastrointestinal, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores del estroma gastrointestinal, cánceres genitourinarios, enfermedad trofoblástica gestacional, cáncer cardíaco, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer hipofaríngeo, leucemia (por ejemplo, linfoblástica aguda leucemia, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica), cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, CPCNP y cáncer de pulmón de células pequeñas, CCP), linfoma (por ejemplo, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hogkin, linfoma no Hogkin, linfoma primario del sistema nervioso central), mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de cavidad nasal, cáncer de seno paranasal, adenocarcinoma del conducto pancreático (CAP), cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de cavidad oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores pituitarios, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, tumor rabdoide, cáncer de glándula salival, sarcoma, cáncer de piel (por ejemplo, carcinoma basocelular, melanoma), cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, tumor teratoide, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cánceres infantiles inusuales, neoplasias malignas gastrointestinales superiores e inferiores (incluyen, pero no se limitan a, cáncer de esófago, gástrico y hepatobiliar), cáncer uretral, cáncer de útero, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de neoplasias hematológicas que incluyen leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas, mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, síndromes mielodisplásicos y neoplasias mieloproliferativas, tales como trombocitemia esencial, policitemia vera, mielofibrosis y cáncer de vesícula biliar (adenocarcinomas o carcinoma de células escamosas). En algunas realizaciones, los síntomas asociados incluyen, pero no se limitan a, anemia, pérdida de apetito, irritación del revestimiento de la vejiga, sangrado y hematomas (trombocitopenia), cambios en el gusto o el olfato, estreñimiento, diarrea, boca seca, disfagia, edema, fatiga, pérdida de cabello (alopecia), infección, infertilidad, linfedema, llagas en la boca, náuseas, dolor, neuropatía periférica, caries, infecciones del tracto urinario y/o problemas de memoria y concentración. El método puede comprender preparar una composición farmacéutica con un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento y administrar la composición farmacéutica a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar el cáncer de vesícula biliar en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 o la Tabla 2 del presente documento, incluyen, pero no se limitan a, 9.1-8m13 y/o 9.2-17, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos.
En ciertas realizaciones, la administración de la composición farmacéutica, por ejemplo, uno o más de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8m13, al sujeto reduce la proliferación celular, el crecimiento tumoral y/o el volumen tumoral en un sujeto, o reduce la cantidad de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo. En algunas realizaciones, la administración de la composición da como resultado una respuesta completa, una respuesta parcial o una enfermedad estable.
El adenocarcinoma ductal pancreático (CAP) es una enfermedad devastadora con pocos sobrevivientes a largo plazo (Yadav et al., Gastroenterology, 2013, 144, 1252-1261). La inflamación es primordial en la progresión de la PDA, ya que las mutaciones oncogénicas por sí solas, en ausencia de inflamación concomitante, son insuficientes para la tumorigénesis (Guerra et al., Cancer Cell, 2007, 11, 291-302). La inmunidad innata y adaptativa cooperan para promover la progresión del tumor en PDA. En particular, subconjuntos inmunes innatos específicos dentro del microambiente tumoral (TME) son aptos para educar a las células efectoras inmunes adaptativas hacia un fenotipo permisivo para los tumores. Las poblaciones de células presentadoras de antígenos (APC), incluidos los macrófagos asociados a tumores (MAT) polarizados por M2 y las células dendríticas mieloides (DC), inducen la generación de células Th2 inmunosupresoras en favor de las células Th1 protectoras de tumores (Ochi et al., J of Exp Med., 2012, 209, 1671-1687; Zhu et al., Cancer Res., 2014, 74, 5057-5069). De manera similar, se ha demostrado que las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) anulan las respuestas antitumorales de los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) en PDA y promueven la progresión metastásica (Connolly et al., J Leuk Biol., 2010, 87, 713-725; Pylayeva-Gupta et al., Cancer Cell, 2012, 21, 836-847; Bayne et al., Cancer Cell, 2012, 21, 822-835).
Recientemente, se demostró que la dectina-1 en los macrófagos se une a la Galectina-9 en el adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) (Daley et al., 2017). La eliminación de la señalización de dectina-1 (en ratones Dectina-/-) resultó en una disminución de la infiltración tumoral de macrófagos de tipo M2 (CD206+ supresores). Además, la neutralización de Galectina-9 basada en anticuerpos solo mejoró la activación de las células T en los huéspedes Dectina-1+/+, lo que indica que Galectina-9 ejerce efectos inmunosupresores primarios específicos de la señalización Dectina-1. Tras la interrupción del eje Dectina-1-Galectin-9, las células T CD4+ y CD8+ (que son prescindibles para la progresión de la PDA en huéspedes con un eje de señalización intacto) se reprogramaron para convertirse en mediadores indispensables de la inmunidad antitumoral. Sin querer limitarnos a la teoría, el bloqueo de la señalización de Galectina-9-Dectina-1 presenta un mecanismo ejemplar (además de TIM-3 y otras vías de señalización) que podría ser la base de una fuerte respuesta antitumoral en un enfoque de inmunoterapia dirigido a Galectina-9 en PDA, por ejemplo, administrando un anticuerpo que se una a Galectina-9, tal como los que se describen en este documento.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar el adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galentin-9 se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se selecciona del grupo que consiste en G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y aglutinante de baja afinidad G9.2 y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 9.2-17 o 9.1-8mut13. En cualquiera de estos métodos de tratamiento, el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.2-17 y/o el anticuerpo 9.1-8mut13.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, y en donde el cáncer es adenocarcinoma ductal pancreático (PDA). En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.1-8m13 y/o 9.2-17, y en donde el cáncer es adenocarcinoma ductal pancreático (PDA). El cáncer colorrectal (CCR), también conocido como cáncer de intestino, cáncer de colon o cáncer rectal, es cualquier cáncer que afecta el colon y el recto. Se sabe que el CCR es impulsado por alteraciones genéticas de las células tumorales y también está influenciado por las interacciones tumor-huésped. Informes recientes han demostrado una correlación directa entre las densidades de ciertas subpoblaciones de linfocitos T y un resultado clínico favorable en el CCR, lo que respalda un papel importante de la inmunidad mediada por células T en la represión de la progresión tumoral del CCR.
Tim-3, como se indica en otra parte del presente documento, es una molécula reguladora inmunitaria, que desencadena eventos en cascada posteriores tras la estimulación por Galectina-9 (Zhu C, et al. The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type 1 immunity; Nature inmunology. 2005; 6:1245-1252). Se ha descubierto que Tim-3 es un mediador crítico en la progresión del CCR (Yu et al;, Tim-3 está regulado positivamente en el carcinoma colorrectal humano y asociado con la progresión tumoral; Mol Med Rep. 2017 Feb; 15(2): 689-695). En este estudio, la expresión de Tim-3 se asoció significativamente con el tamaño del tumor (P = 0,007), la estadificación de la metástasis en los ganglios linfáticos del tumor (P < 0,0001) y la metástasis a distancia (P < 0,0001). Además, el aumento de la expresión de Tim-3 está asociado con la polarización de los macrófagos M2 en el cáncer de colon y promueve el crecimiento tumoral. El bloqueo de la vía Tim-3 inhibió tanto la polarización de los macrófagos que sostienen los tumores como el crecimiento del cáncer de colon (Jiang et al., Tim-3 promotes tumor-promoting M2 macrophage polarization by binding to STAT1 and suppressing the STAT1-miR-155 signaling axis; Oncoimmunology, 3 de agosto de 2016;5(9):e1211219). Dados estos hallazgos y la alta expresión de Galectina-9 observada en cánceres colorrectales (Lahm et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol.2001;127:375-386), la modulación del eje Galectina-9/TIM-3 mediante la inhibición de la interacción entre Galectina-9 y TIM-3, por ejemplo, mediante la administración de un anticuerpo que se une a Galectina-9, es un enfoque novedoso para tratar dichos cánceres en la clínica que puede producir mejores resultados.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar el cáncer colorrectal (CCR) en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galentin-9 se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se selecciona del grupo que consiste en G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26, y aglutinante de baja afinidad G9.2 y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 9.2-17 o 9.1-8mut13. En cualquiera de estos métodos de tratamiento, el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.2-17 y/o el anticuerpo 9.1-8mut13.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, y en donde el cáncer es cáncer colorrectal (CCR). En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.1-8m13 y/o 9.2-17, y en donde el cáncer es cáncer colorrectal (CCR).
El melanoma es la forma más mortal de cáncer de piel y su incidencia ha ido aumentando durante los últimos 30 años, especialmente entre adultos jóvenes. Los avances recientes han dado lugar al desarrollo de numerosas terapias inmunoactivadoras que han mejorado enormemente la supervivencia de los pacientes.
La acumulación de trastornos genéticos, con mayor frecuencia mutaciones en B-Raf y N-Ras, en el melanocito son un sello distintivo del melanoma (Rodríguez-Cerdeira et al., Advances in Immunotherapy for Melanoma: A Comprehensive Review; Mediators Inflamm. 2017; 2017: 3264217, y referencias allí). Sin embargo, la interacción del microambiente es necesaria para que estas alteraciones resulten en la transformación de un melanocito displásico en una célula de melanoma. El microambiente también favorece aún más la invasión y la metástasis. Se han desarrollado nuevas estrategias terapéuticas, incluidos los bloqueadores CTLA-4, PD-1 y PD-L1/2, que han mejorado drásticamente los resultados para los pacientes con melanoma (Farkona et al., Cancer immunotherapy: the beginning of the end of cancer? BMC Med. 2016;14:73). Sin embargo, estas terapias dependen de la presencia de un sistema inmunológico funcional, que está suprimido en pacientes con cáncer avanzado, y se necesitan nuevos métodos para reactivar esta inmunidad sistémica suprimida para mejorar aún más los resultados para los pacientes con melanoma.
En pacientes con melanoma metastásico, los altos niveles sanguíneos de Galectina-9 se correlacionan con una peor supervivencia general y un sesgo hacia un estado inflamatorio Th2 que apoya el crecimiento del tumor. Además, la Galectina-9 está co-localizada con la población de macrófagos M2 en el melanoma metastásico y las formas solubles de Galectina-9 en la sangre se corresponden con una supervivencia pobre (Enninga et al., Melanoma Res. 2016 Oct;26(5):429-41). Se descubrió que la asociación de Galectina-9 con macrófagos M2 se debía a la ligadura de Galectina-9 a CD206 en los macrófagos M2, lo que resultó en un fenotipo protumoral en el microambiente local. En consecuencia, tanto las interacciones Galectina-9/dectina-1 como Galectina-9/CD206 pueden promover efectos inmunosupresores mediados por macrófagos. Sin querer limitarnos a la teoría, estos hallazgos indican que inhibir las interacciones de Galectina-9/dectina-1 y Galectina-9/CD206, por ejemplo, mediante la administración de un anticuerpo que se une a la Galectina-9, puede presentar una justificación para emplear anticuerpos anti-Galectina-9 en un enfoque terapéutico en el melanoma, lo que conducirá a una mejor supervivencia general en los pacientes, que incluyen, pero no se limitan a, aquellos refractarios a las terapias anti-CTLA-4, PD-1 y PD-L1/2.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar el melanoma en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galentin-9 se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se selecciona del grupo que consiste en G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y aglutinante de baja afinidad G9.2 y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 9.2-17 o 9.1-8mut13. En cualquiera de estos métodos de tratamiento, el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.2-17 y/o el anticuerpo 9.1-8mut13.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, y en donde el cáncer es melanoma. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.1-8m13 y/o 9.2-17, y en donde el cáncer es melanoma.
El colangiocarcinoma (CCA) es un cáncer epitelial que se forma en los conductos biliares y es la neoplasia maligna biliar más común y la segunda neoplasia maligna hepática más común después del carcinoma hepatocelular y la incidencia general de colangiocarcinoma ha aumentado progresivamente en todo el mundo durante las últimas cuatro décadas. Los CCA se clasifican en tres subtipos según su ubicación anatómica: colangiocarcinoma intrahepático (iCCA), CCA perihiliar (pCCA) y CCA distal (dCCA) (véase, por ejemplo, Loeuillard et al., Animal models of cholangiocarcinoma; Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 5 de abril de 2018., y Rizvi et al., Cholangiocarcinoma - evolving concepts and therapeutic strategies; Nat Rev Clin Oncol. Febrero de 2018; 15(2): 95-111).
En un estudio retrospectivo de perfil inmunológico de 99 iHCC resecados quirúrgicamente, se observó una tinción positiva para TIM-3 de linfocitos infiltrantes tumorales ubicados centralmente, en niveles 3 veces mayores que la tinción de PD-1. La supervivencia general se asoció significativamente con un menor número de linfocitos TIM-3 infiltrados en tumores (ascopubs.org/doi/abs/10.1200/JCO.2018.36.15_suppl.12049). En consecuencia, reducir la actividad o la señalización de TIM-3, por ejemplo, inhibiendo la interacción Gal-9/Tim-3 en un enfoque inmunoterapéutico, por ejemplo, administrando un anticuerpo anti-Galectina-9 tal como uno o más de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento, puede tener un impacto positivo en la supervivencia general.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar el colangiocarcinoma en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galentin-9 se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14, y combinaciones de los mismos. EEn algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se selecciona del grupo que consiste en G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y aglutinante de baja afinidad G9.2 y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 9.2-17 o 9.1-8mut13. En cualquiera de estos métodos de tratamiento, el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.2-17 y/o el anticuerpo 9.1-8mut13.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, y en donde el cáncer es colangiocarcinoma. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.1-8m13 y/o 9.2-17, y en donde el cáncer es colangiocarcinoma.
El carcinoma de células renales (CCR) tiene la tasa de mortalidad más alta de los cánceres genitourinarios y la incidencia del CCR ha aumentado de manera constante, mientras que el pronóstico sigue siendo malo. Se diagnostican aproximadamente 273.000 nuevos casos de cáncer de riñón cada año en todo el mundo. Aproximadamente un tercio de los pacientes con enfermedad localizada sufrirán recurrencia o metástasis. Una vez que se produce la metástasis, la malignidad hace metástasis y la supervivencia de los pacientes a los 5 años es inferior al 10 %. El carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) es el principal subtipo histológico y representa entre el 80 y el 90 % de todos los RCC. El RCC es sensible a la inmunoterapia y a la terapia dirigida, mientras que es altamente resistente tanto a la quimioterapia como a la radioterapia.
En pacientes con RCC, Gal-9 se expresa en niveles mucho más altos en lesiones cancerosas que en el tejido normal circundante, y los pacientes con alta expresión de Galectina-9 mostraron una progresión más avanzada de la enfermedad con un mayor tamaño del tumor y necrosis (Kawashima et al.; BJU Int. 2014;113:320-332). La Gal-9 en el tejido tumoral de pacientes con ccRCC se asoció positiva y significativamente con el tamaño del tumor, el grado de Fuhrman, la necrosis y el deterioro del resultado clínico, incluida la mala supervivencia y la recurrencia temprana (Fu et al., Galectin-9 predicts postoperative recurrence and survival of patients with clearcell renal cell carcinoma; Tumour Biol. 2015 agosto;36(8):5791-9). TIM-3 también se asocia con un mal pronóstico en el CCR, y la eliminación de TIM-3 suprime la proliferación y la capacidad de invasión de las líneas celulares de ccRCC (Yuan et al., Prognostic implication of Tim-3 in clear cell renal cell carcinoma. Neoplasma.
2014;61:35-40). En consecuencia, el eje Gal-9/TIM-3 podría desempeñar un papel importante en el desarrollo del carcinoma de células renales y la administración de agentes inmunoterapéuticos que inhiben la unión de Gal-9 a TIM-3, tal como los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, puede dar como resultado una mayor supervivencia y una menor recurrencia en el CCR.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar el cáncer renal en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galentin-9 se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se selecciona del grupo que consiste en G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y aglutinante de baja afinidad G9.2 y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 9.2-17 o el anticuerpo 9.1-8mut13. En cualquiera de estos métodos de tratamiento, el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.2-17 y/o el anticuerpo 9.1-8mut13.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, y en donde el cáncer es carcinoma de células renales (RCC). En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.1-8m13 y/o 9.2-17, y en donde el cáncer es carcinoma de células renales (CCR).
El carcinoma hepatocelular (CHC) es el tipo más común de cáncer de hígado primario. El carcinoma hepatocelular se presenta con mayor frecuencia en personas con enfermedades hepáticas crónicas, tales como cirrosis causada por infección de hepatitis B o hepatitis C. El CHC suele ir acompañado de hígado cirrótico con infiltración linfocitaria extensa debido a una infección viral crónica. Muchos estudios han demostrado que las células T CD8+ efectoras que se infiltran en tumores y las células T cooperadoras 17 (Th17) se correlacionan con una mejor supervivencia después de la resección quirúrgica de tumores. Sin embargo, las células T efectoras que se infiltran en los tumores no controlan el crecimiento y la metástasis del tumor Pang et al., EThe immunosuppressive tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma; Cancer Immunol Immunother 2009;58:877-886).
La interacción TIM-3/Galectina-9 contribuye a la disfunción inmune en el CHC humano (Li, et al., La vía de señalización Tim-3/Galectina-9 media la disfunción de las células T y predice un mal pronóstico en pacientes con carcinoma hepatocelular asociado al virus de la hepatitis B; Hepatology. Octubre de 2012;56(4):1342-51). Se encuentra una alta expresión de Galectina-9 en las CPA mieloides y se encuentran grandes cantidades de células T Tim-3+ en el CHC asociado al VHB, y el bloqueo de la señalización de Tim-3/Galectina-9 mediante anticuerpos TIM-3 recupera la función de las células T efectoras en las células T aisladas del CHC humano. Por lo tanto, la focalización del eje Tim-3/Galectina-9, por ejemplo, mediante la administración de anticuerpos anti-Galectina-9, por ejemplo, como los anticuerpos anti-Galectina-9 que se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2 en este documento, que incluyen, pero no se limitan a, el anticuerpo 9.1-8mut13 y/o el anticuerpo 9.2-17, constituye una nueva estrategia terapéutica inmunológica para tratar pacientes con CHC asociado al VHB.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar el carcinoma hepatocelular en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galentin-9 se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se selecciona del grupo que consiste en G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y aglutinante de baja afinidad G9.2 y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 9.2-17 o 9.1-8mut13. En cualquiera de estos métodos de tratamiento, el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.2-17 y/o el anticuerpo 9.1-8mut13. La leucemia mieloide aguda (LMA) es la forma más común de leucemia aguda, con una incidencia que aumenta con la edad avanzada. La LMA, comúnmente de etiología desconocida, también puede ocurrir como resultado de la exposición a agentes genotóxicos o después de un trastorno hematológico previo. La LMA es compleja, con heterogeneidad genética, epigenética y fenotípica (Lowenberg y Rowe, Introduction to the review series on advances in acute myeloid leukemia (LMA); Blood 2016 127:1).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, y en donde el cáncer es carcinoma hepatocelular (CHC). En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.1-8m13 y/o 9.2-17, y en donde el cáncer es carcinoma hepatocelular (CHC).
Estudios recientes sugieren que el eje TIM-3/Gal-9 está relacionado con el establecimiento de la leucemia mieloide aguda (LMA). Las células madre malignas logran una selección clonal dominante a través de la adquisición de múltiples anomalías genéticas. Estas anomalías genéticas se acumulan progresivamente en las células madre hematopoyéticas (HSC) autorrenovables y, como consecuencia, estas HSC preleucémicas genéticamente dañadas se transforman en células madre leucémicas (LSC). Como parte de este proceso, las HSC preleucémicas superan a las HSC normales y finalmente se autorenuevan en una etapa de célula progenitora hematopoyética para convertirse en LSC mieloides (Walter et al., Clonal architects of primary myeloid leukemia; N. Engl. J. Med., 366 (2012), págs. 1090-1098). Kikshige et al., (Kikushige et al., A TIM-3/Gal-9 Autocrine Stimulatory Loop Drives Self-Renewal of Human Myeloid Leukemia Stem Cells and Leukemic Progression (Cell Stem Cell 17; 3(2015), 341-352) observaron que los niveles séricos de Galectina-9 estaban significativamente elevados en pacientes con LMA y que el eje Tim3/Gal-9 estimula un bucle autocrino que funciona para permitir el dominio clonal y la autorrenovación de las LSC. La estimulación de TIM-3 mediada por Gal-9 conduce a la inducción de vías de autorrenovación de LSC. Cabe destacar que, dado que se observó una regulación positiva significativa de TIM-3 en las poblaciones de HSC y HPC, así como una elevación del Gal-9 sérico, en pacientes con trastornos mieloides preleucémicos, la adquisición de la secreción de Galectina-9 probablemente ocurre temprano durante la progresión de la leucemia. Por consiguiente, la orientación al eje Gal-9/TIM-3, por ejemplo, a través de la administración de un anticuerpo anti-Galectina-9, tal como uno o más de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, incluido el anticuerpo 9.1-8mut13 y/o el anticuerpo 9.2-17, puede constituir un nuevo enfoque para la terapia con células madre cancerosas común en las neoplasias mieloides humanas y, además, dichas terapias pueden ser útiles no solo para erradicar las LSC en las LMA, sino también para prevenir la progresión de los trastornos preleucémicos a LMA manifiesta. Estos trastornos preleucémicos incluyen la etapa de citopenia refractaria con displasia multilinaje (RCMD) en los síndromes mielodisplásicos (SMD) o la fase crónica de las neoplasias mieloproliferativas (NMP), incluida la leucemia mieloide crónica.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar una neoplasia maligna hematológica en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar una neoplasia maligna hematológica en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar la leucemia mieloide aguda en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para prevenir la progresión de trastornos preleucémicos a leucemia mieloide aguda en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, los trastornos preleucémicos comprenden la etapa RCMD en SMD o la fase crónica de NMP, incluida la leucemia mieloide crónica. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galentin-9 se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se selecciona del grupo que consiste en G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y aglutinante de baja afinidad G9.2 y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 9.2-17 o 9.1-8mut13. En cualquiera de estos métodos de tratamiento, el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.2-17 y/o el anticuerpo 9.1-8mut13.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, y en donde el cáncer es una neoplasia maligna hematológica. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.1-8m13 y/o 9.2-17, y en donde el cáncer es una neoplasia maligna hematológica.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, y en donde el cáncer es LMA. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.1-8m13 y/o 9.2-17, y en donde el cáncer es LMA.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, y en donde el cáncer es LLA. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.1-8m13 y/o 9.2-17, y en donde el cáncer es LLA. En cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el método de tratamiento comprende además administrar al sujeto un inhibidor de una molécula de punto de control, un activador de un receptor coestimulador y/o un inhibidor de una diana de célula inmune innata. En algunas realizaciones, el método de tratamiento comprende además administrar al sujeto un inhibidor de una molécula de punto de control. En algunas realizaciones, la molécula de punto de control se selecciona del grupo que consiste en PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIM-3 y A2aR. En algunas realizaciones, el método de tratamiento comprende además administrar al sujeto un inhibidor de un activador de un receptor coestimulador y/o un inhibidor de una diana de célula inmune innata. En algunas realizaciones, el receptor coestimulador se selecciona del grupo que consiste en OX40, GITR, CD137, CD40, CD27 e ICOS. En algunas realizaciones, el método de tratamiento comprende además administrar al sujeto un inhibidor de una diana de célula inmune innata. En algunas realizaciones, la diana de la célula inmune innata se selecciona del grupo que consiste en KIR, NKG2A, CD96, TLR e IDO. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se selecciona del grupo que consiste en los anticuerpos G9.1-1, G9.1-2, G9.1-3, G9.1-4, G9.1-5, G9.1-6, G9.1-7, G9.1-8, G9.1-9, G9.1-10, G9.1-11, G9.1-8m1, G9.1-8m2, G9.1-8m3, G9.1-8m4, G9.1-8m5, G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m9, G9.1-8m10, G9.1-8m11, G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 se selecciona del grupo que consiste en G9.2-1, G9.2-2, G9.2-3, G9.2-4, G9.2-5, G9.2-6, G9.2-7, G9.2-8, G9.2-9, G9.2-10, G9.2-11, G9.2-12, G9.2-13, G9.2-14, G9.2-15, G9.2-16, G9.2-17, G9.2-17mut6, G9.2-18, G9.2-19, G9.2-20, G9.2-21, G9.2-22, G9.2-23, G9.2-24, G9.2-25, G9.2-26 y aglutinante de baja afinidad G9.2 y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 9.2-17 o 9.1-8mut13. En cualquiera de estos métodos de tratamiento, el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.2-17 y/o el anticuerpo 9.1-8mut13. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de cáncer de páncreas, por ejemplo, adenocarcinoma ductal pancreático, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal, melanoma, carcinoma de células renales y leucemia mieloide aguda.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer en combinación con una molécula inhibidora de puntos de control, por ejemplo, en donde la molécula inhibidora de puntos de control se selecciona del grupo que consiste en PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIM-3 y A2aR, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer en combinación con una molécula inhibidora de puntos de control, en donde la molécula inhibidora de puntos de control se selecciona del grupo que consiste en PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIM-3 y A2aR, y en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.1-8m13 y/o 9.2-17.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer en combinación con una molécula coestimuladora, por ejemplo, en donde la molécula coestimuladora se selecciona del grupo que consiste en OX40, GITR, CD137, CD40, CD27 e ICOS, y en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 como medicamento para el tratamiento del cáncer en combinación con un coestimulador, en donde la molécula coestimuladora se selecciona del grupo que consiste en OX40, GITR, CD137, CD40, CD27 e ICOS, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 es el anticuerpo 9.1-8m13 y/o 9.2-17. En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación pueden aumentar la actividad antitumoral (por ejemplo, reducir la proliferación celular, el crecimiento tumoral, el volumen tumoral y/o la carga tumoral o reducir la cantidad de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo) en al menos aproximadamente un 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control. En algunas realizaciones, la reducción se mide comparando la proliferación celular, el crecimiento tumoral y/o el volumen tumoral en un sujeto antes y después de la administración de la composición farmacéutica. En algunas realizaciones, el método para tratar o mejorar un cáncer en un sujeto permite que uno o más síntomas del cáncer mejoren en al menos aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más. Antes, durante y después de la administración de la composición farmacéutica, se pueden medir células cancerosas y/o biomarcadores en un sujeto en una muestra biológica, tal como sangre, suero, plasma, orina, líquido peritoneal y/o una biopsia de un tejido u órgano. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir la administración de las composiciones de la invención para reducir el volumen, tamaño, carga o carga tumoral en un sujeto a un tamaño indetectable, o a menos de aproximadamente 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 % o 90 % del volumen, tamaño, carga o carga tumoral del sujeto antes del tratamiento. En otras realizaciones, los métodos pueden incluir la administración de las composiciones de la invención para reducir la tasa de proliferación celular o la tasa de crecimiento tumoral en un sujeto a una tasa indetectable, o a menos de aproximadamente 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 % o 90 % de la tasa antes del tratamiento. En otras realizaciones, los métodos pueden incluir la administración de las composiciones de la invención para reducir el desarrollo o la cantidad o el tamaño de las lesiones metastásicas en un sujeto a una tasa indetectable o a menos de aproximadamente 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 % o 90 % de la tasa anterior al tratamiento.
En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden uno o más anticuerpos anti-Galectina-9, que pueden usarse para tratar, controlar, mejorar y/o prevenir el cáncer. En algunas realizaciones, las composiciones de la divulgación comprenden dos o más anticuerpos anti-Galectina-9, solos o en combinación con agentes profilácticos, agentes terapéuticos (por ejemplo, quimioterapia o inmunoterapia) y/o vehículos farmacéuticamente aceptables y se proporciona el uso de los mismos. En algunas realizaciones, uno o más anticuerpos se unen a CRD1. En algunas realizaciones, uno o más anticuerpos se unen a CRD2. En algunas realizaciones, uno o más anticuerpos se unen a CRD1. En algunas realizaciones, las composiciones pueden comprender una combinación de anticuerpos, algunos de los cuales se unen a CRD1 y algunos de los cuales se unen a CRD2. Un ejemplo no limitativo de una combinación es una combinación que comprende 9.2 17 y 9.1-8mut1. Los anticuerpos se pueden combinar en cantidades equimolares o no equimolares.
Composiciones farmacéuticas
Los anticuerpos anti-Galectina-9, así como los ácidos nucleicos codificantes o conjuntos de ácidos nucleicos, los vectores que los comprenden o las células huésped que comprenden los vectores, como se describe en este documento, se pueden mezclar con un vehículo farmacéuticamente aceptable (excipiente) para formar una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad diana. "Aceptable" significa que el vehículo debe ser compatible con el ingrediente activo de la composición (y preferiblemente, capaz de estabilizar el ingrediente activo) y no perjudicial para el sujeto a tratar. Excipientes farmacéuticamente aceptables (vehículos), incluyendo tampones, bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20.a ed. (2000) Lippincott Williams y Wilkins, Ed. KE Hoover.
Las composiciones farmacéuticas que se utilizarán en los presentes métodos pueden comprender vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, y pueden comprender tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextranos; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). En algunos ejemplos, la composición farmacéutica descrita en este documento comprende liposomas que contienen los anticuerpos (o los ácidos nucleicos codificantes), los cuales pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica, como los descritos en Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y Patentes de EE. UU. N.° 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con un tiempo de circulación mejorado se describen en la patente estadounidense N.° 5,013,556. Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado.
Los anticuerpos anti-Galectina-9, o los ácidos nucleicos codificantes, también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas son conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).
En otros ejemplos, la composición farmacéutica descrita en este documento puede formularse en formato de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que tienen la forma de artículos moldeados, por ejemplo películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (U.S. Pat. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y 7-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), acetato isobutirato de sacarosa y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Las composiciones farmacéuticas que se vayan a utilizar para administración in vivo deberán ser estériles. Esto se consigue fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones de anticuerpos terapéuticos generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden estar en formas de dosificación unitaria tales como comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones, o supositorios, para administración oral, parenteral o rectal, o administración por inhalación o insuflación.
Para preparar composiciones sólidas tales como comprimidos, el ingrediente activo principal se puede mezclar con un vehículo farmacéutico, por ejemplo, ingredientes de comprimidos convencionales tales como almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato dicálcico o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, por ejemplo, agua, para formar una composición de preformulación sólida que contenga una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable no tóxica del mismo. Cuando se hace referencia a que estas composiciones de formulación previa son homogéneas, significa que el ingrediente activo se dispersa uniformemente en toda la composición para que esta pueda subdividirse fácilmente en formas de dosificación unitarias igualmente eficaces, tales como comprimidos, píldoras y cápsulas. Esta composición de preformulación sólida se subdivide luego en formas de dosificación unitarias del tipo descrito anteriormente que contienen de 0,1 a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo de la presente invención. Las tabletas o píldoras de la nueva composición pueden recubrirse o combinarse de otro modo para proporcionar una forma de dosificación que ofrezca la ventaja de una acción prolongada. Por ejemplo, el comprimido o la píldora pueden comprender un componente de dosificación interno y un componente de dosificación externo, este último en forma de una envoltura sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y permite que el componente interno pase intacto al duodeno o que su liberación se retrase. Diversos materiales se pueden utilizar para dichas capa gastrorresistente o recubrimientos, dichos materiales incluyen diversos ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con dichos materiales como laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa. Los agentes tensioactivos adecuados incluyen, en particular, agentes no iónicos, tales como polioxietilensorbitanos (por ejemplo, Tween™ 20, 40, 60, 80 o 85) y otros sorbitanos (por ejemplo, Span™ 20, 40, 60, 80 o 85). Las composiciones con un agente tensioactivo comprenderán convenientemente entre 0,05 y 5 % de agente tensioactivo, y pueden estar entre 0,1 y 2,5 %. Se apreciará que se pueden agregar otros ingredientes, por ejemplo manitol u otros vehículos farmacéuticamente aceptables, si es necesario. Se pueden preparar emulsiones adecuadas utilizando emulsiones de grasa disponibles comercialmente, como Intralipid ™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ y Lipiphysan™. El ingrediente activo puede disolverse en una composición de emulsión premezclada o, alternativamente, puede disolverse en un aceite (por ejemplo, aceite de soja, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendras) y formar una emulsión al mezclar con un fosfolípido (por ejemplo, fosfolípidos de huevo, fosfolípidos de soja o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que se pueden agregar otros ingredientes, por ejemplo glicerol o glucosa, para ajustar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas normalmente contienen hasta un 20 % de aceite, por ejemplo, entre un 5 y un 20 %. La emulsión de grasa puede comprender gotitas de grasa entre 0,1 y 1,0 .im, particularmente 0,1 y 0,5 .im, y tener un pH en el rango de 5,5 a 8,0.
Las composiciones de emulsión pueden ser aquellas preparadas mezclando un anticuerpo con Intralipid™ o sus componentes (aceite de soja, fosfolípidos de huevo, glicerol y agua).
Las composiciones farmacéuticas para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en disolventes acuosos u orgánicos farmacéuticamente aceptables, o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados como se establece anteriormente. En algunas realizaciones, las composiciones se administran a través de la vía respiratoria nasal u oral para un efecto local o sistémico.
Las composiciones en disolventes farmacéuticamente aceptables, preferiblemente estériles, pueden nebulizarse mediante el uso de gases. Las soluciones nebulizadas se pueden respirar directamente desde el dispositivo nebulizador o el dispositivo nebulizador se puede conectar a una máscara facial, una tienda de campaña o una máquina de respiración con presión positiva intermitente. Las composiciones en solución, suspensión o polvo pueden administrarse, preferiblemente por vía oral o nasal, desde dispositivos que administran la formulación de manera adecuada.
Aplicaciones terapéuticas
La presente divulgación proporciona métodos para eliminar células patológicas que expresan Galectina-9, comprendiendo el método administrar a un sujeto que tiene células patológicas que expresan Galectina-9 una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento. La presente divulgación también proporciona métodos para inhibir la señalización celular mediada por Galectina-9 en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento.
Para practicar los métodos divulgados en este documento, se puede administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica descrita en este documento a un sujeto(por ejemplo,un humano) que necesita el tratamiento a través de una vía adecuada, sistémica o localmente. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-Galectina-9 se administran mediante administración intravenosa,por ejemplo,en bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarterial, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intratumoral, oral, por inhalación o tópica. Los nebulizadores disponibles comercialmente para formulaciones líquidas, incluidos los nebulizadores a chorro y los nebulizadores ultrasónicos, son útiles para la administración. Las formulaciones líquidas se pueden nebulizar directamente y el polvo liofilizado se puede nebulizar después de la reconstitución. Alternativamente, los anticuerpos como se describe en este documento pueden aerosolizarse utilizando una formulación de fluorocarbono y un inhalador de dosis medida, o inhalarse como un polvo liofilizado y molido.
El sujeto a tratar mediante los métodos descritos en este documento puede ser un mamífero, más preferiblemente un humano. Los mamíferos incluyen, entre otros, animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates, caballos, perros, gatos, ratones y ratas. Un sujeto humano que necesita el tratamiento puede ser un paciente humano que padece, está en riesgo de padecer o se sospecha que padece una enfermedad o trastorno determinado, tal como un tumor sólido, una neoplasia maligna hematológica, una enfermedad autoinmune (como un trastorno alérgico), una enfermedad microbiana y una afección fibrótica. Los ejemplos de cánceres de tumores sólidos incluyen adenocarcinoma del conducto pancreático (PDA), cáncer colorrectal (CCR), melanoma, colangiocarcinoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, CPCNP, y cáncer de pulmón de células pequeñas, CCP), neoplasias malignas gastrointestinales superiores e inferiores (incluyen, pero no se limitan a, cáncer de esófago, gástrico y hepatobiliar), cáncer de cabeza y cuello de células escamosas, cánceres genitourinarios, cáncer de ovario y sarcomas. Las neoplasias hematológicas incluyen la leucemia linfoblástica aguda, la leucemia linfocítica crónica, los linfomas, el mieloma múltiple, la leucemia mieloide aguda, la leucemia mieloide crónica, los síndromes mielodisplásicos y las neoplasias mieloproliferativas, como la trombocitemia esencial, la policitemia vera y la mielofibrosis. Un sujeto que tiene un tumor sólido o una neoplasia maligna hematológica puede identificarse mediante un examen médico de rutina,por ejemplo,pruebas de laboratorio, pruebas funcionales de órganos, TAC o ecografías. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar mediante el método descrito en este documento puede ser un paciente humano con cáncer que se ha sometido o se está sometiendo a una terapia contra el cáncer, por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia o cirugía.
Los ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen afecciones reumatoides, afecciones metabólicas y endocrinas, así como afecciones respiratorias y alérgicas. Un sujeto que padece una enfermedad autoinmune puede identificarse mediante un examen médico de rutina,por ejemplo,con pruebas de laboratorio, como anticuerpos antinucleares, autoanticuerpos antimitocondriales, anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos, anticuerpos antifosfolípidos, antipéptido citrulinado (anti-CCP), factor antirreumatoide, inmunoglobulina A, prueba de proteína C reactiva, prueba del complemento, prueba de velocidad de sedimentación globular (VSG), perfil de coagulación sanguínea y electroforesis de proteínas/electroforesis de inmunofijación, entre otros. En algunas realizaciones, el sujeto a ser tratado por el método descrito en este documento puede ser un sujeto humano con una enfermedad autoinmune que se ha sometido o está sometiéndose a un tratamiento de enfermedad autoinmune, por ejemplo, mediación inmunosupresora, terapia de reemplazo hormonal, transfusiones de sangre, medicación antiinflamatoria y/o medicación para el dolor.
Las enfermedades microbianas pueden ser causadas por una variedad de patógenos, incluidas bacterias, hongos, protozoos y virus. Las bacterias infecciosas ejemplares incluyenStreptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenas, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus. aureus, Vibrio colerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Bacillus aereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella Dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushiyChlamydia especiesLos ejemplos de hongos patológicos incluyen:Coccidioides immitis, Aspergillusfumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans,yHistoplasma capsulatum.Losprotozoos patológicos incluyenEntomoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Tryoanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparumyPlasmodium malaria.Entre los ejemplos de helmintos se incluyenEnterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobiumy anquilostomas. Las enfermedades infecciosas virales incluyen las causadas por adenovirus, virus de la fiebre de Lassa (Arenavirus), astrovirus, hantavirus, virus de la fiebre del Valle del Rift (Flebovirus), calicivirus, virus del Ébola, virus de Marburgo, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis G, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis D, virus del herpes simple 1, virus del herpes simple 2, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus de la varicela-zóster, virus del herpes humano 7, virus del herpes humano 8, virus de la gripe, virus de la parainfluenza, virus de la rubéola, virus de las paperas, morbilivirus, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial, virus del papiloma, virus JC (Poliomavirus), virus BK (Poliomavirus), parvovirus, virus Coxsackie (A y B), virus de la hepatitis A, poliovirus, rinovirus, reovirus, rabia. Virus (Lyssavirus), virus de inmunodeficiencia humana 1 y 2 y virus de la leucemia de células T humanas. Un sujeto que padece una enfermedad microbiana puede identificarse mediante un examen médico de rutina,por ejemplo,pruebas de laboratorio. Por ejemplo, se pueden utilizar microscopía(por ejemplo,tinción de bacterias grampositivas y/o gramnegativas), cultivo de muestras, pruebas bioquímicas(por ejemplo,pruebas de productos metabólicos y/o enzimáticos, tales como productos de fermentación, ácidos, alcohol o gases) y diagnósticos moleculares(por ejemplo,PCR). En algunas realizaciones, el sujeto a tratar mediante el método descrito en este documento puede ser un paciente con una enfermedad infecciosa humana que se ha sometido o se está sometiendo a una terapia antimicrobiana, por ejemplo, inmunoterapia.
Los ejemplos de afecciones fibróticas incluyen fibrosis pulmonar(por ejemplo,fibrosis quística, fibrosis pulmonar idiopática), cirrosis, atresia biliar, fibrosis auricular, fibrosis endomiocárdica, cicatriz glial, artrofibrosis, enfermedad de Crohn, contractura de Dupuytren, queloide, fibrosis mediastínica, mielofibrosis, fibrosis sistémica nefrogénica, fibrosis masiva progresiva, fibrosis retroperitoneal y esclerodermia/esclerosis sistémica. Un sujeto con una condición fibrótica puede identificarse mediante un examen médico de rutina,por ejemplo,pruebas de laboratorio, TAC, radiografías, ecocardiogramas o ecografías. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar mediante el método descrito en este documento puede ser un paciente fibrótico humano que se ha sometido o se está sometiendo a una terapia antifibrótica, por ejemplo, medicación, fisioterapia, oxigenoterapia o cirugía.
Un sujeto sospechoso de tener cualquiera de dichas enfermedades/trastornos diana podría mostrar uno o más síntomas de la enfermedad/trastorno. Un sujeto en riesgo de padecer una enfermedad o trastorno puede ser un sujeto que tenga uno o más de los factores de riesgo para esa enfermedad o trastorno.
Como se utiliza en este documento, "una cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de cada agente activo requerida para conferir un efecto terapéutico al sujeto, ya sea solo o en combinación con uno o más otros agentes activos. En algunas realizaciones, el efecto terapéutico es una reducción de la actividad y/o cantidad/expresión de Galectina-9, una reducción de la señalización de Dectina-1, una reducción de la señalización de TIM-3, una reducción de la señalización de CD206 o un aumento de las respuestas inmunitarias antitumorales en el microambiente tumoral. Los ejemplos no limitantes de respuestas antitumorales aumentadas incluyen mayores niveles de activación de las células T efectoras, o cambio de los TAM del fenotipo M2 al M1, y mayores respuestas ADCC. La determinación de si una cantidad del anticuerpo logró el efecto terapéutico sería evidente para un experto en la materia. Las cantidades efectivas varían, como reconocen los expertos en la materia, dependiendo de la afección específica que se esté tratando, su gravedad, los parámetros individuales del paciente, tal como la edad, la condición física, la talla, el sexo y el peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hubiera), la vía de administración específica y otros factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional de la salud. Estos factores son bien conocidos por aquellos con conocimientos ordinarios en la materia y pueden abordarse simplemente con experimentación de rutina. Generalmente se prefiere que se utilice una dosis máxima de los componentes individuales o combinaciones de los mismos, es decir, la dosis segura más alta según el criterio médico adecuado.
Las consideraciones empíricas, tal como la vida media, generalmente contribuirán a la determinación de la dosis. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos compatibles con el sistema inmunológico humano, tales como anticuerpos humanizados o anticuerpos totalmente humanos, para prolongar la vida media del anticuerpo y evitar que el sistema inmunológico del huésped lo ataque. La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse a lo largo de la terapia y, generalmente, pero no necesariamente, se basa en el tratamiento y/o la supresión y/o la mejora y/o el retraso de una enfermedad o trastorno diana. Alternativamente, pueden ser apropiadas formulaciones de liberación continua sostenida de un anticuerpo. Se conocen en la técnica diversas formulaciones y dispositivos para lograr una liberación sostenida.
En un ejemplo, las dosis de un anticuerpo como se describe en este documento se pueden determinar empíricamente en individuos a quienes se les ha administrado una o más veces el anticuerpo. A los individuos se les administran dosis incrementales del antagonista. Para evaluar la eficacia del antagonista, se puede seguir un indicador de la enfermedad/trastorno.
Generalmente, para la administración de cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento, tales como los descritos en la Tabla 1 o la Tabla 2 de este documento, tal como por ejemplo, el anticuerpo 9.2-17 y el anticuerpo 9.1-8mut1, una dosis candidata inicial puede ser de aproximadamente 2 mg/kg. A los efectos de la presente divulgación, una dosis diaria típica podría variar desde aproximadamente 0,1 pg/kg a 3 pg/kg a 30 |jg/kg a 300 pg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas o hasta que se alcanzan niveles terapéuticos suficientes para aliviar una enfermedad o trastorno diana, o un síntoma del mismo. Un régimen de dosificación ejemplar comprende la administración de una dosis inicial de aproximadamente 2 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 1 mg/kg del anticuerpo, o seguida de una dosis de mantenimiento de aproximadamente 1 mg/kg cada dos semanas. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles, dependiendo del patrón de descomposición farmacocinética que el médico desee lograr. Por ejemplo, se contempla una dosificación de una a cuatro veces por semana. En algunas realizaciones, se pueden utilizar dosis que varían de aproximadamente 3 pg/mg a aproximadamente 2 mg/kg (tales como aproximadamente 3 pg/mg, aproximadamente 10 pg/mg, aproximadamente 30 pg/mg, aproximadamente 100 pg/mg, aproximadamente 300 pg/mg, aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 2 mg/kg). En algunas realizaciones, la frecuencia de dosificación es una vez por semana, cada 2 semanas, cada 4 semanas, cada 5 semanas, cada 6 semanas, cada 7 semanas, cada 8 semanas, cada 9 semanas o cada 10 semanas; o una vez al mes, cada 2 meses o cada 3 meses, o más. Es posible controlar la evolución de este tratamiento mediante ensayos y técnicas convencionales. El régimen de dosificación (incluido el anticuerpo utilizado) puede variar con el tiempo.
En algunas realizaciones, para un paciente adulto de peso normal, se pueden administrar dosis que oscilan entre aproximadamente 0,3 y 5,00 mg/kg. En algunos ejemplos, la dosis del anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento puede ser de 10 mg/kg. El régimen de dosificación particular,es decir,la dosis, el momento y la repetición, dependerán del individuo en particular y de su historial médico, así como de las propiedades de los agentes individuales (tal como la vida media del agente y otras consideraciones bien conocidas en la técnica).
A los efectos de la presente divulgación, la dosis adecuada de un anticuerpo como se describe en este documento dependerá del anticuerpo, los anticuerpos y/o el péptido no anticuerpo (o composiciones de los mismos) específicos empleados, el tipo y la gravedad de la enfermedad/trastorno, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al antagonista, y la discreción del médico tratante. Normalmente, el médico administrará un anticuerpo hasta alcanzar una dosis que logre el resultado deseado. En algunas realizaciones, el resultado deseado es un aumento de la respuesta inmune antitumoral en el microambiente tumoral. Los métodos para determinar si una dosis produjo el resultado deseado serían evidentes para un experto en la materia. La administración de uno o más anticuerpos puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, del estado fisiológico del receptor, de si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico, y de otros factores conocidos por los profesionales cualificados. La administración de un anticuerpo puede ser esencialmente continua durante un período de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas,por ejemplo,antes, durante o después de desarrollar una enfermedad o trastorno diana.
Como se usa en este documento, el término "tratar" se refiere a la aplicación o administración de una composición que incluye uno o más agentes activos a un sujeto, que tiene una enfermedad o trastorno diana, un síntoma de la enfermedad/trastorno, o una predisposición hacia la enfermedad/trastorno, con el propósito de curar, sanar, aliviar, aliviar, alterar, remediar, mejorar, mejorar o afectar el trastorno, el síntoma de la enfermedad, o la predisposición hacia la enfermedad o trastorno.
Aliviar una enfermedad o trastorno diana incluye retrasar su desarrollo o progresión, reducir su gravedad o prolongar la supervivencia. Aliviar la enfermedad o prolongar la supervivencia no implica necesariamente resultados curativos. Tal como se utiliza allí, "retrasar' el desarrollo de una enfermedad o trastorno diana significa diferir, obstaculizar, retardar, retardar, estabilizar y/o posponer la progresión de la enfermedad. Este retraso puede tener una duración variable, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o de los individuos tratados. Un método que "retrasa" o alivia el desarrollo de una enfermedad, o retrasa la aparición de la enfermedad, es un método que reduce la probabilidad de desarrollar uno o más síntomas de la enfermedad en un período de tiempo determinado y/o reduce la extensión de los síntomas en un período de tiempo determinado, en comparación con no utilizar el método. Estas comparaciones suelen basarse en estudios clínicos que utilizan un número de sujetos suficiente para obtener un resultado estadísticamente significativo.
"Desarrollo" o "progresión" de una enfermedad significa manifestaciones iniciales y/o progresión subsiguiente de la enfermedad. El desarrollo de la enfermedad puede detectarse y evaluarse mediante técnicas clínicas estándar, bien conocidas en la técnica. Sin embargo, el desarrollo también se refiere a la progresión que puede ser indetectable. A los efectos de esta divulgación, el desarrollo o progresión se refiere al curso biológico de los síntomas. "Desarrollo" incluye ocurrencia, recurrencia y aparición. Tal como se utiliza en este documento, "inicio" o "aparición" de una enfermedad o trastorno diana incluye la aparición inicial y/o la recurrencia.
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inhibir la actividad de Galectina-9 (y/o Dectina-1 o TIM-3 o CD206) en células inmunes supresoras inmunitarias en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo.En otras realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran en una cantidad eficaz para reducir el nivel de actividad de Galectina-9 (y/o Dectina-1 o TIM-3 o CD206) en células inmunitarias inmunosupresoras en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más) (en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control). En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para promover la programación similar a M1 en los TAM en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que los necesita en una cantidad suficiente para promover la ADCC en células diana en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para promover la ADCC en células diana en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para promover la CDC en células diana en un tumor. EEn algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para promover la CDC en células diana en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para promover ADCP en células diana en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para promover el ADCP en células diana en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para promover la activación de células T en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para promover la activación de células T en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para promover la activación de células T CD4+ en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para promover la activación de las células T CD4+ en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de CD44 en células<c>D4+ en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de CD44 en células CD4+ en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de TNFalfa en células CD4+ en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de TNFalfa en células CD4+ en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para promover la activación de células T CD8+ en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para promover la activación de células T CD8+ en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de CD44 en células c D8+ en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de CD44 en células CD8+ en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de TNFalfa en células CD8+ en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de TNFalfa en células CD8+ en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En cualquiera de estas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que tiene cáncer, en donde el cáncer se selecciona de cáncer de páncreas, por ejemplo, adenocarcinoma ductal pancreático, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal, melanoma, carcinoma de células renales y leucemia mieloide aguda.
Los inventores realizaron un análisis utilizando datos de secuenciación de ARN de TCGA (The Cancer Genome Atlas) de 29 tipos diferentes de tumores sólidos utilizando aproximadamente 40 000 muestras individuales, para analizar la correlación entre la infiltración de células T en un tipo de tumor particular y los niveles de expresión de PD1, PD-L1, IFNgamma y TNF alfa. Los tipos de tumores se clasificaron según la expresión media de un gen determinado. Se utilizaron la expresión genética de cuatro componentes del 4 TCR (CD3d, CD3e, CD3g, CD3z) y la proteína quinasa efectora específica de células T ZAP70 para establecer el nivel relativo de asociación de células T con un tipo de tumor determinado. También se evaluó TBX21, un factor de transcripción específico de las células Th1 que controla la expresión de las citocinas Th1 distintivas interferóngamma (IFNg) y factor de necrosis tumoral (TNF).
Según el análisis, los niveles de asociación de células T (sustituto de la infiltración de células T) con tipos de tumores individuales son generalmente proporcionales a la clasificación de la expresión de IFNg con la excepción del cáncer de páncreas (PDA). En PDA, el nivel de transcripción de IFNg está significativamente suprimido, lo que sugiere que es superior al observado en otros tumores sólidos, lo que implica que el entorno inmunosupresor de PDA es particularmente robusto. En este conjunto de datos, la expresión de TNF generalmente no se correlaciona con el grado de infiltración de células T. Cabe destacar que, en la mayoría de las condiciones, el TNF es producido por macrófagos activados con menor contribución de las células T Th1, las células NK, los neutrófilos, los mastocitos y los eosinófilos.
Sin querer limitarnos a la teoría, aumentar los niveles de IFNgamma puede ser particularmente útil para combatir el ambiente inmunosupresor y reactivar la respuesta mieloide y linfoide particularmente en PDA. Por consiguiente, en una realización, se proporcionan en este documento métodos para aumentar los niveles de IFNgamma en un cáncer, en donde el método comprende administrar un anticuerpo anti-Galectina-9, por ejemplo, como se describe en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, incliuyen, pero no se limitan a, el anticuerpo 9.1-8m13 y/o el anticuerpo 9.2-17, y en donde los niveles de IFNgamma en el cáncer son bajos antes de la administración, por ejemplo, como se evalúa en relación con los niveles de expresión de marcadores de células T. En algunas realizaciones, el cáncer es PDA.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, en este documento se proporcionan métodos para aumentar los niveles de IFNgamma en un cáncer, en donde el método comprende administrar un anticuerpo anti-Galectina-9, por ejemplo, como se describe en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limita a, el anticuerpo 9.1-8m13 y/o el anticuerpo 9.2-17, y en donde el cáncer es p Da . En algunas realizaciones, en este documento se proporcionan métodos, en donde los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de IFNgamma en células T efectoras en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de IFNgamma en células T efectoras en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de IFNgamma en células CD4+ en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, se proporcionan en este documento métodos, en donde los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de IFNgamma en células c D4+ en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de IFNgamma en células c D4+ en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, incluidos, entre otros, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de IFNgamma en células CD4+ en un tumor en al menos un 20%(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, se proporcionan aquí métodos, en donde los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, incluidos, entre otros, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de IFNgamma en células CD8+ en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, incluidos, entre otros, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de IFNgamma en células CD8+ en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, incluidos, entre otros, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se administran a un sujeto que necesita el tratamiento en una cantidad suficiente para inducir la expresión de IFNgamma en células CD8+ en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vivo(en comparación con los niveles previos al tratamiento o en un sujeto de control).
En algunas realizaciones, se proporcionan en este documento métodos, en donde las poblaciones de células inmunes en muestras tumorales se analizan in vitro oex vivo.En consecuencia, se proporcionan en este documento métodos en los que los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se proporcionan in vitro oex vivoen una cantidad suficiente para inducir la expresión de IFNgamma en células T efectoras en un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, incluidos, entre otros, 9.2-17 y 9.1-8mut13, se proporcionan in vitro oex vivoen una cantidad suficiente para inducir la expresión de IFNgamma en las células T efectoras de un tumor. En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, 9.2 17 y 9.1-8mut13, inducen la expresión de IFNgamma en células CD4+ en un tumor en al menos un 20 %(por ejemplo,30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más)in vitrooex vivo.En algunas realizaciones, la administración de uno o más de los anticuerpos descritos en este documento da como resultado una reducción del tamaño del tumor, una reducción del crecimiento del tumor, la eliminación del tumor, una reducción en el número de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo, una respuesta completa, una respuesta parcial o una enfermedad estable. Se pueden utilizar métodos convencionales, conocidos por aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica de la medicina, para administrar la composición farmacéutica al sujeto, dependiendo del tipo de enfermedad a tratar o del sitio de la enfermedad. Esta composición también puede administrarse por otras vías convencionales, por ejemplo, por vía oral, parenteral, mediante inhalación en aerosol, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o a través de un reservorio implantado. El término "parenteral" como se utiliza en este documento incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional, intratumoral e intracraneal. Además, puede administrarse al sujeto a través de vías de administración de depósito inyectable, como el uso de materiales y métodos inyectables o biodegradables con un depósito de 1, 3 o 6 meses. En algunos ejemplos, la composición farmacéutica se administra por vía intraocular o intravítrea.
Las composiciones inyectables pueden contener diversos vehículos tales como aceites vegetales, dimetilactamida, dimetilformamida, lactato de etilo, carbonato de etilo, miristato de isopropilo, etanol y polioles (glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares). Para la inyección intravenosa, los anticuerpos solubles en agua se pueden administrar mediante el método de goteo, mediante el cual se infunde una formulación farmacéutica que contiene el anticuerpo y un excipiente fisiológicamente aceptable. Los excipientes fisiológicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, dextrosa al 5 %, solución salina al 0,9 %, solución de Ringer u otros excipientes adecuados. Las preparaciones intramusculares, por ejemplo, una formulación estéril de una forma de sal soluble adecuada del anticuerpo, se pueden disolver y administrar en un excipiente farmacéutico como agua para inyección, solución salina al 0,9 % o solución de glucosa al 5 %.
En una realización, se administra un anticuerpo a través de técnicas de administración local dirigida o específica del sitio. Los ejemplos de técnicas de administración local dirigida o específica del sitio incluyen varias fuentes de depósito implantables del anticuerpo o catéteres de administración local, como catéteres de infusión, un catéter permanente o un catéter de aguja, injertos sintéticos, envolturas adventicias, derivaciones y stents u otros dispositivos implantables, portadores de sitio específico, inyección directa o aplicación directa. Véase,por ejemplo,la Publicación PCT N.° WO 00/53211 y la Patente de EE.UU. N.° 5,981,568.
También se puede utilizar la administración dirigida de composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido antisentido, un vector de expresión o polinucleótidos subgenómicos. Las técnicas de administración de ADN mediada por receptores se describen en, por ejemplo, Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338.
Las composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido (por ejemplo, aquellos que codifican los anticuerpos descritos en este documento) se administran en un rango de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de ADN para administración local en un protocolo de terapia génica. En algunas realizaciones, también se pueden utilizar rangos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 2 mg, aproximadamente 5 |jg a aproximadamente 500 jg y aproximadamente 20 jg a aproximadamente 100 jg de ADN o más durante un protocolo de terapia génica.
Los polinucleótidos y polipéptidos terapéuticos descritos en este documento pueden administrarse mediante vehículos de administración de genes. El vehículo de administración de genes puede ser de origen viral o no viral (véase en general,Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; y Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). La expresión de dichas secuencias codificantes se puede inducir utilizando promotores y/o potenciadores endógenos de mamíferos o heterólogos. La expresión de la secuencia codificante puede ser constitutiva o regulada.
Los vectores virales para la administración de un polinucleótido deseado y su expresión en una célula deseada son bien conocidos en la técnica. Entre los vehículos virales ejemplares se incluyen, pero no se limitan a, los retrovirus recombinantes (véase, por ejemplo, las Publicaciones PCT N.os WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; las Pat. de EE. UU. N.os 5,219,740 y 4,777,127; la patente de Reino Unido N.° 2,200,651; y la Patente EP No. 0 345 242), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores del virus Sindbis, virus del bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus del río Ross (AT<c>C VR-373; ATCC VR-1246) y virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), y vectores del virus adenoasociado (AAV) (véase, por ejemplo, las Publicaciones PCT N.os WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655).También se puede emplear la administración de ADN ligado a adenovirus muertos como se describe en Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147.
También se pueden emplear vehículos y métodos de administración no viral, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN condensado policatiónico unido o no unido a adenovirus muerto solo (véase,por ejemplo,Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); ADN unido a ligando (véase,por ejemplo,Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); vehículos de administración de células eucariotas (véase,por ejemplo,Patente de EE. UU. N.° 5.814.482;Publicaciones PCT N.° WO 95/07994;WO 96/17072;WO 95/30763; y WO 97/42338) y neutralización o fusión de carga nucleica con membranas celulares. También se puede utilizar ADN desnudo. Se describen métodos de introducción de ADN desnudo a modo de ejemplo en la Publicación PCT N.° WO 90/11092 y la Patente de EE. UU. N.° 5,580,859. Los liposomas que pueden actuar como vehículos de administración de genes se describen en la Patente de EE. UU. N.° 5,422,120; las Publicaciones PCT N.° WO 95/13796; el documento WO 94/23697; el documento WO 91/14445; y la Patente EP N.° 0524968. Se describen enfoques adicionales en Philip, Mol. Cell. Biol. (1994) 14:2411, y en Woffendin, Proc. Natl. Acad Sci. (1994) 91:1581.
El régimen de dosificación particular,es decir,la dosis, el momento y la repetición utilizados en el método descrito en este documento dependerán del sujeto en particular y de su historial médico.
En algunas realizaciones, se puede administrar más de un anticuerpo, o una combinación de un anticuerpo y otro agente terapéutico adecuado, a un sujeto que necesita el tratamiento. El anticuerpo también se puede utilizar junto con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la eficacia de los agentes. La eficacia del tratamiento para una enfermedad/trastorno diana se puede evaluar mediante métodos bien conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para suprimir la señalización de Dectina-1, por ejemplo, en células inmunitarias inmunosupresoras, por ejemplo, células inmunitarias que se infiltran en tumores, tales como macrófagos, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método suprime la señalización de Dectina-1, por ejemplo, en células inmunes inmunosupresoras, en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en el mismo).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para suprimir la señalización de TIM-3, por ejemplo, en células inmunes que se infiltran en tumores, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método suprime la señalización de TIM-3, por ejemplo, en células inmunes que se infiltran en tumores en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en el mismo).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para suprimir la señalización de CD206, por ejemplo, en células inmunes que se infiltran en tumores, por ejemplo, en macrófagos, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método suprime la señalización de CD206, por ejemplo, en células inmunes que se infiltran en tumores, por ejemplo, macrófagos, en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en el mismo).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para inducir citotoxicidad celular, tal como ADCC, en células diana que expresan Galectina-9, por ejemplo, en donde las células diana son células cancerosas o células inmunitarias inmunosupresoras, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método induce la apoptosis en células inmunes como las células T en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en las mismas).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para inducir citotoxicidad celular tal como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra células diana que expresan Galectina-9 en un sujeto, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método induce citotoxicidad celular, tal como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), contra células diana que expresan Galectina-9 al menos en un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para inducir citotoxicidad celular, tal como ADCC, por ejemplo, contra células diana que expresan Galectina-9 en un sujeto, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método induce citotoxicidad celular en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en el mismo).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para inducir la fagocitosis de células diana que expresan Galectina-9 (ADCP), comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 aumenta la fagocitosis de las células diana en al menos un 30 % (por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para inducir citotoxicidad celular, tal como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), contra células diana que expresan Galectina-9, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método induce citotoxicidad celular contra células diana en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en el mismo).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para inducir la activación de células T, por ejemplo, en células T infiltradas en tumores, es decir, suprimir la inhibición mediada por Galectina-9 de la activación de células T, ya sea directa o indirectamente, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método promueve la activación de células T en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento del mismo).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para promover la activación de células CD4+, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método promueve la activación de células CD4+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento del mismo).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para inducir la expresión de CD44 en células CD4+, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método aumenta la expresión de CD44 en células CD4+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para inducir la expresión de IFNgamma en células CD4+, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método aumenta la expresión de IFNgamma en células CD4+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para inducir la expresión de TNFalfa en células CD4+, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método aumenta la expresión de TNFalfa en células CD4+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para inducir la expresión de CD44 en células CD8+, comprendiendo el método proporcionar o administrar un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método aumenta la expresión de CD44 en células CD8+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para inducir la expresión de IFNgamma en células CD8+, comprendiendo el método proporcionar o administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método aumenta la expresión de IFNgamma en células Cd8+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos).
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para inducir la expresión de TNFalfa en células CD8+, comprendiendo el método proporcionar o administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es un anticuerpo 9.1-8mut13 y/o un anticuerpo 9.2-17. En algunas realizaciones, el método aumenta la expresión de TNFalfa en células Cd8+ en al menos un 30 %(por ejemplo,31 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, incluido cualquier incremento en los mismos).
En algunas de estas realizaciones, los métodos que comprenden proporcionar o administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, inducen CD44, IFNgamma y/o TNFalfa en células CD4+ y c D8+. Las realizaciones del método descritas supra, para suprimir la señalización de Dectina-1, para suprimir la señalización de TIM-3, para suprimir la señalización de CD206, para inducir ADCC contra células diana, para inducir CDC contra células diana, para inducir ADCP contra células diana, para inducir la activación de células T, para promover la activación de células CD4+, para inducir la expresión de CD44 en células CD4+, para inducir la expresión de IFNgamma en células CD4+, para inducir la expresión de TNFalfa en células CD4+, para inducir la expresión de CD44 en células CD8+, para inducir la expresión de IFNgamma en células CD8+, método para inducir la expresión de TNFalfa en células CD8+, en donde el método incluye administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Las realizaciones del método descritas supra (para suprimir la señalización de Dectina-1, para suprimir la señalización de TIM-3, para suprimir la señalización de CD206, para inducir ADCC contra células diana, para inducir CDC contra células diana, para inducir ADCP contra células diana, para inducir la activación de células T, para promover la activación de células CD4+, para inducir la expresión de CD44 en células CD4+, para inducir la expresión de IFNgamma en células CD4+, para inducir la expresión de TNFalfa en células CD4+, para inducir la expresión de CD44 en células CD8+, para inducir la expresión de IFNgamma en células CD8+, para inducir la expresión de TNFalfa en células CD8+), en donde el método incluye proporcionar una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, a una muestra aislada de un tumor, y medirin vitrooex vivouno o más parámetros seleccionados de supresión de Dectina-1, para TIM-3 supresión, para la supresión de CD206, inducción de ADCC, inducción de<c>D<c>, inducción de ADCP, inducción de la activación de células T, promoción de la activación de células CD4+, inducción de la expresión de CD44 en células CD4+, inducción de la expresión de IFNgamma en células CD4+, inducción de la expresión de TNFalfa en células CD4+, inducción de la expresión de CD44 en células CD8+, inducción de la expresión de IFNgamma en células CD8+, inducción de la expresión de TNFalfa en células CD8+.
Las realizaciones de métodos in vivo descritas supra, en donde el sujeto que necesita la administración tiene cáncer, y en donde el cáncer se selecciona de cáncer de páncreas, por ejemplo, adenocarcinoma ductal pancreático, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal, melanoma, carcinoma de células renales y leucemia mieloide aguda. En algunas realizaciones, el cáncer presenta niveles bajos de expresión de IFNgamma en relación con la expresión de marcadores de células T En algunas realizaciones, el cáncer es PDA.
Las realizaciones del métodoin vitrooex vivodescritas supra, en donde la muestra aislada de un tumor es de un cáncer seleccionado de cáncer de páncreas, por ejemplo, adenocarcinoma ductal pancreático, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal, melanoma, carcinoma de células renales y leucemia mieloide aguda.
Terapia de combinación
Cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento se puede utilizar junto con otros tipos de terapia para el cáncer o enfermedades autoinmunes, como quimioterapia, cirugía, radiación, terapia génica, o junto con otros tipos de terapia para enfermedades autoinmunes, como mediación inmunosupresora, terapia de reemplazo hormonal, transfusiones de sangre, medicación antiinflamatoria y/o medicación para el dolor, etc. Dichas terapias pueden administrarse simultáneamente o secuencialmente (en cualquier orden) con la inmunoterapia según la presente divulgación.
En algunas realizaciones, se proporcionan aquí métodos, en donde los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento se utilizan junto con otros tipos de terapia para el cáncer o enfermedades autoinmunes, tales como quimioterapia, cirugía, radiación, terapia génica, o junto con otros tipos de terapia para enfermedades autoinmunes, tales como mediación inmunosupresora, terapia de reemplazo hormonal, transfusiones de sangre, medicación antiinflamatoria y/o medicación para el dolor, etcétera. En algunas realizaciones, los métodos incluyen los pasos de administrar los anticuerpos anti-Galectina-9, tales como cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento, por ejemplo, en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, de manera simultánea o secuencial (en cualquier orden) con la inmunoterapia según la presente divulgación. Cuando se coadministra con un agente terapéutico adicional, las dosis terapéuticamente efectivas adecuadas para cada agente pueden reducirse debido a la acción aditiva o sinergia.
En algunas realizaciones, los métodos se proporcionan en este documento, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9, por ejemplo el anticuerpo 9.2-17 o 9.1-8mut13, se combina con otros tratamientos inmunomoduladores tales como,por ejemplo,inhibidores de una molécula de punto de control(por ejemplo,PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAg 3, TIM3 o A2aR), activadores de un receptor coestimulador(por ejemplo,DX40, GITR, CD137, CD40, CD27 e ICOS) y/o inhibidores de una diana de célula inmune innata (por ejemplo,KIR, NKG2A, CD96, TLR e IDO). Sin limitarse a la teoría, se cree que los anticuerpos anti-Galectina-9, a través de su inhibición de Dectina-1, pueden reprogramar las respuestas inmunes contra las células tumorales ,por ejemplo,inhibiendo la actividad de las células T y§ infiltradas en el microambiente tumoral y/o mejorando la vigilancia inmune contra las células tumorales, porejemplo,activando las células T CD4+ y/o CD8+. Por lo tanto, se esperaría que el uso combinado de un anticuerpo anti-Galectina-9 y un agente inmunomodulador como los descritos en este documento mejore significativamente la eficacia antitumoral.
En algunas realizaciones, se proporcionan los métodos en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 se administra simultáneamente con un inhibidor de puntos de control. En algunas realizaciones, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 se administra antes o después de un inhibidor de puntos de control. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control se administra sistémicamente. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control se administra localmente.
En algunas realizaciones, se proporcionan los métodos, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos de Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, tales como 9.2-17 o 9.1-8mut13, es capaz de mejorar la actividad antitumoral (por ejemplo, reducción de la proliferación tumoral, tamaño, volumen, peso, carga o carga, reducción en el número de lesiones metastásicas con el tiempo) de los inhibidores de puntos de control coadministrados (por ejemplo, PD-1, PD-L1 y/o CTLA-4 u otros enumerados en este documento o conocidos en la técnica), por ejemplo, en un 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más en comparación con una terapia de inhibidor de puntos de control sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos de Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o Tabla 2, por ejemplo el anticuerpo 9.2-17 o el anticuerpo 9.1-8mut13, es capaz de mejorar la actividad antitumoral (por ejemplo, proliferación tumoral, tamaño, volumen, peso, carga o carga, o reducción en el número de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo) de los inhibidores de puntos de control coadministrados (por ejemplo, PD-land/o CTLA-4, por ejemplo, PD-1, PD-L1 y/o CTLA-4 u otros enumerados en este documento o conocidos en la técnica), por ejemplo, 1,0-1,2 veces, 1,2-1,4 veces, 1,4-1,6 veces, 1,6-1,8 veces, 1,8-2 veces o dos veces más o más en comparación con una terapia de inhibidor de puntos de control sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos de Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, el anticuerpo 9.1-8m13 y/o el anticuerpo 9.2-17, es capaz de mejorar la actividad antitumoral (por ejemplo, proliferación tumoral, tamaño, volumen, peso, carga o carga o reducción en el número de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo) del inhibidor de puntos de control coadministrado (por ejemplo, PD-1, PD-L1 y/o CTLA-4 u otros enumerados en este documento o conocidos en la técnica), por ejemplo, aproximadamente tres veces, cuatro veces, aproximadamente tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más en comparación con una terapia con inhibidor de puntos de control sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, los inhibidores de puntos de control coadministrados (por ejemplo, PD-1, PD-L1 y/o CTLA-4 u otros enumerados en este documento o conocidos en la técnica) son capaces de mejorar la actividad antitumoral del anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, incluidos, entre otros, el anticuerpo 9.1-8m13 y/o el anticuerpo 9.2-17, (por ejemplo, proliferación tumoral, tamaño, volumen, peso, carga o reducción en el número de lesiones metastásicas), por ejemplo, en un 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más en comparación con la terapia anti-Galectina-9 sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, los inhibidores de puntos de control coadministrados (por ejemplo, PD-1, PD-L1 y/o CTLA-4 u otros enumerados en este documento o conocidos en la técnica) son capaces de mejorar la actividad antitumoral (por ejemplo, proliferación tumoral, tamaño, volumen, peso, carga o carga o reducción en el número de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo) del anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, incluidos, entre otros, el anticuerpo 9.1-8m13 y/o el anticuerpo 9.2-17, por ejemplo, 1,0-1,2 veces, 1,2-1,4 veces, 1,4-1,6 veces, 1,6-1,8 veces, 1,8-2 veces o dos veces más o más en comparación con una terapia anti-Galectina-9 sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, los inhibidores de puntos de control coadministrados (por ejemplo, PD-1, PD-L1 y/o CTLA-4 u otros descritos en este documento o conocidos en la técnica) son capaces de mejorar la actividad antitumoral (por ejemplo, proliferación tumoral, tamaño, volumen, peso, carga o carga o reducción en el número de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo) del anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos anti-Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, incluidos, entre otros, el anticuerpo 9.1-8m13 y/o el anticuerpo 9.2-17, por ejemplo, aproximadamente tres veces, cuatro veces, aproximadamente tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más en comparación con una terapia anti-Galectina-9 sola en las mismas condiciones.
En algunas realizaciones, se proporcionan los métodos, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o Tabla 2, que incluye pero no se limita a, anticuerpo 9.1-8m13 y/o anticuerpo 9.2-17, es capaz de mejorar la capacidad de la inmunoterapia para activar células T (por ejemplo, medida por marcadores de citocinas descritos en este documento) (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica), por ejemplo, en un 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más en comparación con una terapia de inmunoterapia sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es capaz de mejorar la capacidad de la inmunoterapia para activar las células T (por ejemplo, como se mide mediante los marcadores de citocinas descritos en este documento) (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica), por ejemplo, 1,0-1,2 veces, 1,2-1,4 veces, 1,4-1,6 veces, 1,6 1,8 veces, 1,8-2 veces o dos veces más en comparación con una terapia de inmunoterapia sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, el anticuerpo 9.1-8m13 y/o el anticuerpo 9.2-17, es capaz de mejorar la capacidad de la inmunoterapia para activar las células T (por ejemplo, medida mediante marcadores de citocinas descritos en este documento) (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica), por ejemplo, aproximadamente tres veces, cuatro veces, aproximadamente tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más en comparación con una terapia de inmunoterapia sola en las mismas condiciones.
En algunas realizaciones, se proporcionan los métodos, en donde las inmunoterapias coadministradas (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica) son capaces de mejorar la capacidad del anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o Tabla 2, incluidos, entre otros, el anticuerpo 9.1-8m13 y/o el anticuerpo 9.2-17, para activar las células T (por ejemplo, como se mide por los marcadores de citocinas descritos en este documento), por ejemplo, en un 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más en comparación con una terapia anti-Galectina-9 sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, las inmunoterapias coadministradas (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica) son capaces de mejorar la capacidad del anticuerpo anti-Galectina-9 para activar las células T (por ejemplo, como se mide mediante marcadores de citocinas descritos en este documento), por ejemplo, 1,0-1,2 veces, 1,2-1,4 veces, 1,4-1,6 veces, 1,6-1,8 veces, 1,8-2 veces o dos veces más o más en comparación con una terapia anti-Galectina-9 sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, las inmunoterapias coadministradas (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica) son capaces de mejorar la capacidad del anticuerpo anti-Galectina-9 para activar las células T (por ejemplo, como se mide mediante los marcadores de citocinas descritos en este documento), por ejemplo, aproximadamente tres veces, cuatro veces, aproximadamente tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más en comparación con una terapia anti-Galectina-9 sola en las mismas condiciones.
En otras realizaciones, los métodos se proporcionan en este documento, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos de Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluye, pero no se limita a, el anticuerpo 9.1-8m13 y/o el anticuerpo 9.2-17, se administra en combinación con una o más de las realizaciones existentes para tratar trastornos autoinmunes incluyendo, pero no limitado a: terapia intravenosa con Ig, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y corticosteroides; y tratamientos antiinflamatorios tales como ciclosporinas, rapamicinas o ascomicinas, o sus análogos inmunosupresores,por ejemplo,ciclosporina A, ciclosporina G, FK-506, rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, etc.; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; brequinar; FTY 720; leflunomida; mnizoribina; ácido micofenólico; micofenolato mofetilo; 15-desoxiespergualina; anticuerpos monoclonales inmunosupresores,p.ej.,anticuerpos monoclonales para receptores de leucocitos,p.ej.,MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, Cd28, B7, CD45 o CD58 o sus ligandos; u otros compuestos inmunomoduladores,p.ej.,CTLA4Ig, u otros inhibidores de moléculas de adhesión,p.ej.mAb o inhibidores de bajo peso molecular, incluidos antagonistas de selectina y antagonistas de VLA-4. Estas terapias combinadas pueden ser parte de un régimen inmunomodulador o de un régimen para el tratamiento o prevención de trastornos inflamatorios o trastornos autoinmunes.
En algunas realizaciones, se proporcionan los métodos, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos de Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, el anticuerpo 9.1-8m13 y/o el anticuerpo 9.2-17, también se puede co-utilizar con un agente quimioterapéutico, incluidos agentes alquilantes, antraciclinas, disruptores del citoesqueleto (Taxanos), epotilonas, inhibidores de la histona desacetilasa, inhibidores de la topoisomerasa I, inhibidores de la topoisomerasa II, inhibidores de la quinasa, análogos de nucleótidos y análogos precursores, antibióticos peptídicos, agentes basados en platino, retinoides, alcaloides de la vinca y derivados de los mismos.
Los ejemplos no limitantes incluyen: (i) agentes antiangiogénicos(p.ej.,TNP-470, factor plaquetario 4, trombospondina-1, inhibidores tisulares de metaloproteasas (TIMP1 y TIMP2), prolactina (fragmento de 16 Kd), angiostatina (fragmento de 38 Kd de plasminógeno), endostatina, receptor soluble bFGF, factor de crecimiento transformante beta, interferón alfa, receptores solubles KDR y FLT-1, proteína placentaria relacionada con proliferina, así como los enumerados por Carmeliet y Jain (2000)); (ii) un antagonista de VEGF o un antagonista del receptor de VEGF tal como anticuerpos anti-VEGF, variantes de VEGF, fragmentos solubles del receptor de VEGF, aptámeros capaces de bloquear VEGF o VEGFR, anticuerpos neutralizantes anti-VEGFR, inhibidores de tirosina quinasas VEGFR y cualquier combinación de los mismos; y (iii) compuestos quimioterapéuticos tales como,por ejemplo,análogos de pirimidina (5-fluorouracilo, floxuridina, capecitabina, gemcitabina y citarabina), análogos de purina, antagonistas de folato e inhibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimitóticos, incluyendo productos naturales como alcaloides de la vinca (vinblastina, vincristina y vinorelbina), disruptores de microtúbulos como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas y navelbina, epidipodofilotoxinas (etopósido y tenipósido), agentes que dañan el ADN (actinomicina, amsacrina, antraciclinas, bleomicina, busulfán, camptotecina, carboplatino, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, citoxano, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, hexametilenamina oxaliplatino, ifosfamida, melfalán, merclorhetamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosourea, plicamicina, procarbazina, taxol, taxotere, tenipósido, trietilentiofosforamida y etopósido (VP16)); antibióticos como dactinomicina (actinomicina D), daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), idarrubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina; enzimas (L-asparaginasa que metaboliza sistémicamente la L-asparagina y priva a las células que no tienen la capacidad de sintetizar su propia asparagina); agentes antiplaquetarios; agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos tales como mostazas nitrogenadas (mecloretamina, ciclofosfamida y análogos, melfalán, clorambucilo), etileniminas y metilmelaminas (hexametilmelamina y tiotepa), alquilsulfonatos-busulfán, nitrosoureas (carmustina (BCNU) y análogos, estreptozocina), trazenos-dacarbazinina (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos tales como análogos del ácido fólico (metotrexato); complejos de coordinación de platino (cisplatino, carboplatino), procarbazina, hidroxiurea, mitotano, aminoglutetimida; hormonas, análogos hormonales (estrógeno, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inhibidores de la aromatasa (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sales sintéticas de heparina y otros inhibidores de la trombina); agentes fibrinolíticos (como el activador tisular del plasminógeno, estreptoquinasa y uroquinasa), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigratorios; agentes antisecretores (breveldina); inmunosupresores (ciclosporina, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicina), azatioprina, micofenolato mofetilo); compuestos antiangiogénicos(p.ej.,TNP-470, genisteína, bevacizumab) e inhibidores del factor de crecimiento(p.ej.,inhibidores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)); bloqueador del receptor de angiotensina; donantes de óxido nítrico; oligonucleótidos antisentido; anticuerpos (trastuzumab); inhibidores del ciclo celular e inductores de la diferenciación (tretinoína); inhibidores de mTOR, inhibidores de la topoisomerasa (doxorrubicina (adriamicina), amsacrina, camptotecina, daunorrubicina, dactinomicina, enipósido, epirrubicina, etopósido, idarrubicina, mitoxantrona, topotecán e irinotecán), corticosteroides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona y prednisolona); inhibidores de la quinasa de transducción de señales del factor de crecimiento; inductores de disfunción mitocondrial y activadores de caspasa; y disruptores de la cromatina.
En algunas realizaciones, se proporcionan en este documento métodos en los que el anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, que incluyen, pero no se limitan a, el anticuerpo 9.1-8m13 y/o el anticuerpo 9.2-17, se administra simultáneamente con un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, se proporcionan en este documento métodos, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 se administra antes o después de un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, se proporcionan en este documento métodos en los que el agente quimioterapéutico se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones, se proporcionan aquí métodos en los que el agente quimioterapéutico se administra localmente.
En algunas realizaciones, se proporcionan los métodos, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, por ejemplo el anticuerpo 9.2-17 o el anticuerpo 9.1-8mut13, es capaz de mejorar la actividad antitumoral (por ejemplo, proliferación tumoral, tamaño, volumen, peso, carga o reducción en el número de lesiones metastásicas con el tiempo) de los agentes quimioterapéuticos coadministrados (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica), por ejemplo, en un 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más en comparación con una terapia con agente quimioterapéutico solo en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es capaz de mejorar la actividad antitumoral (por ejemplo, proliferación tumoral, tamaño, volumen, peso, carga o carga o reducción en el número de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo) de los agentes quimioterapéuticos coadministrados (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica), por ejemplo, 1,0-1,2 veces, 1,2-1,4 veces, 1,4-1,6 veces, 1,6-1,8 veces, 1,8-2 veces o dos veces más en comparación con una terapia con agente quimioterapéutico solo en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es capaz de mejorar la actividad antitumoral (por ejemplo, proliferación tumoral, tamaño, volumen, peso, carga o carga o reducción en el número de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo) del agente quimioterapéutico coadministrado (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica), por ejemplo, aproximadamente tres veces, cuatro veces, aproximadamente tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más en comparación con una terapia con agente quimioterapéutico solo en las mismas condiciones.
En algunas realizaciones, se proporcionan los métodos, en donde los agentes quimioterapéuticos coadministrados (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica) son capaces de mejorar la actividad antitumoral del anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o la Tabla 2, por ejemplo el anticuerpo 9.2-17 o el anticuerpo 9.1-8mut13, (por ejemplo, proliferación tumoral, tamaño, volumen, peso, carga o reducción en el número de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo) de, por ejemplo, en un 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más en comparación con una terapia anti-Galectina-9 sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, los agentes quimioterapéuticos coadministrados (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica) son capaces de mejorar la actividad antitumoral (por ejemplo, proliferación tumoral, tamaño, volumen, peso, carga o reducción en el número de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo) del anticuerpo anti-Galectina-9, por ejemplo, 1,0-1,2 veces, 1,2 1,4 veces, 1,4-1,6 veces, 1,6-1,8 veces, 1,8-2 veces o dos veces más o más en comparación con una terapia anti-Galectina-9 sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, los agentes quimioterapéuticos coadministrados (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica) son capaces de mejorar la actividad antitumoral (por ejemplo, proliferación tumoral, tamaño, volumen, peso, carga o carga o reducción en el número de lesiones metastásicas a lo largo del tiempo) del anticuerpo anti-Galectina-9, por ejemplo, aproximadamente tres veces, cuatro veces, aproximadamente tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más en comparación con una terapia anti-Galectina-9 sola en las mismas condiciones.
En algunas realizaciones, se proporcionan los métodos, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos Galectina-9 descritos en este documento en la Tabla 1 y/o Tabla 2, que incluye pero no se limita a, anticuerpo 9.1-8m13 y/o anticuerpo 9.2-17, es capaz de mejorar la capacidad de la inmunoterapia para activar células T (por ejemplo, medida por marcadores de citocinas descritos en este documento) (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica), por ejemplo, en un 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más en comparación con una terapia de inmunoterapia sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es capaz de mejorar la capacidad del agente quimioterapéutico para activar las células T (por ejemplo, como se mide mediante los marcadores de citocinas descritos en este documento) (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica), por ejemplo, 1,0-1,2 veces, 1,2-1,4 veces, 1,4-1,6 veces, 1,6-1,8 veces, 1,8-2 veces o dos veces más o más en comparación con una terapia con agente quimioterapéutico solo en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Galectina-9 es capaz de mejorar la capacidad del agente quimioterapéutico para activar las células T (por ejemplo, según lo medido por los marcadores de citocinas descritos en este documento) (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica), por ejemplo, aproximadamente tres veces, cuatro veces, aproximadamente tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más en comparación con una terapia con agente quimioterapéutico solo en las mismas condiciones.
En algunas realizaciones, se proporcionan aquí métodos, en donde los agentes quimioterapéuticos coadministrados (por ejemplo, como se describe aquí o se conoce en la técnica) son capaces de mejorar la capacidad del anticuerpo anti-Galectina-9, tal como cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento en la Tabla 1 y/o Tabla 2, por ejemplo el anticuerpo 9.2-17 o el anticuerpo 9.1-8mut13, para activar células T (por ejemplo, como se mide por los marcadores de citocinas descritos en este documento), por ejemplo, en un 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más en comparación con una terapia anti-Galectina-9 sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, los agentes quimioterapéuticos coadministrados (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica) son capaces de mejorar la capacidad del anticuerpo anti-Galectina-9 para activar las células T (por ejemplo, como se mide por los marcadores de citocinas descritos en este documento), por ejemplo, 1,0-1,2 veces, 1,2-1,4 veces, 1,4-1,6 veces, 1,6-1,8 veces, 1,8-2 veces o dos veces más o más en comparación con una terapia anti-Galectina-9 sola en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, los agentes quimioterapéuticos coadministrados (por ejemplo, como se describe en este documento o se conoce en la técnica) son capaces de mejorar la capacidad del anticuerpo anti-Galectina-9 para activar las células T (por ejemplo, como se mide mediante los marcadores de citocinas descritos en este documento), por ejemplo, aproximadamente tres veces, cuatro veces, aproximadamente tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más en comparación con una terapia anti-Galectina-9 sola en las mismas condiciones.
En algunas de estas realizaciones de método, en donde la administración de un anticuerpo anti-Galectina-9 se combina con la administración de un inhibidor de puntos de control, el sujeto tiene un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de páncreas, por ejemplo, adenocarcinoma ductal pancreático, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal, melanoma, carcinoma de células renales y leucemia mieloide aguda. En algunas realizaciones, se proporcionan en este documento métodos, en donde el anticuerpo anti-Galectina-9 se administra a un paciente que es refractario a un tratamiento previo, por ejemplo, terapia con inhibidores de puntos de control, tal como PD-1.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar un cáncer en un sujeto que es refractario a la terapia con inhibidores de puntos de control, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la molécula inhibidora de puntos de control se selecciona del grupo que consiste en PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIM3 y A2aR. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar un cáncer en un sujeto que es refractario a la terapia con inhibidores de puntos de control, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Galectina-9 descrito en este documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la molécula inhibidora de puntos de control es PD-1. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de páncreas, por ejemplo, adenocarcinoma ductal pancreático, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal, melanoma, carcinoma de células renales y leucemia mieloide aguda. Se pueden encontrar agentes útiles adicionales en, por ejemplo, Physician's Desk Reference, 59.a edición, (2005), Thomson PDR, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.a edición, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.a edición, (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J..
Se informó que la quimioterapia y/o la terapia inmunológica de los tumores sólidos podrían mejorar el nivel de moduladores inmunes, como las moléculas de puntos de control, lo que da como resultado una inmunidad suprimida contra las células tumorales. Erisson et al., J. Translational Medicine (2016), 14:282; Grabosch et al., J. ImmunoTherapy of Cancer (2015), 3(suppl 2): P302; y Azad et al., EMBO J. (2016). Se ha descubierto que los anticuerpos anti-Galectina-9 reprograman las respuestas inmunes dirigidas a las células tumorales, particularmente en PDA. Como tal, se esperaría que el uso conjunto de un anticuerpo anti-Galectina-9 y un agente quimioterapéutica(por ejemplo,gemcitabina) o un agente inmunoterapéutico(por ejemplo,anticuerpo anti-PD-L1) dé como resultado una actividad terapéutica significativamente mejorada contra tumores sólidos, tal como PDA.
En cualquiera de las terapias combinadas descritas, el agente terapéutico o terapia adicional se puede administrar antes, simultáneamente o después de la administración del anticuerpo anti-Galectina-9.
Kits para su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con la Galectina-9
La presente divulgación también proporciona kits para usar en el tratamiento o alivio de una enfermedad asociada con Galectina-9, por ejemplo asociada con la unión de Galectina-9 a una glicoproteína de la superficie celular(por ejemplo,Dectina-1, TIM3,etc.),o células patológicas(por ejemplo,células cancerosas) que expresan Galectina-9. Los ejemplos incluyen tumores sólidos tal como PDA y otros descritos en este documento, y enfermedades autoinmunes, como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), trastornos endocrinos autoinmunes, trastornos sanguíneos autoinmunes y otros descritos en este documento. Dichos kits pueden incluir uno o más recipientes que comprenden un anticuerpo anti-Galectina-9,por ejemplo,cualquiera de los descritos en este documento, y opcionalmente un segundo agente terapéutico para ser co utilizado con el anticuerpo anti-Galectina-9, que también se describe en este documento.
En algunas realizaciones, el kit puede comprender instrucciones de uso de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en este documento. Las instrucciones incluidas pueden comprender una descripción de la administración del anticuerpo anti-Galectina-9 y, opcionalmente, del segundo agente terapéutico, para tratar, retrasar la aparición o aliviar una enfermedad diana como las que se describen en este documento. El kit puede comprender además una descripción de la selección de un individuo adecuado para el tratamiento basándose en la identificación de si ese individuo tiene la enfermedad diana,por ejemplo,aplicando el método de diagnóstico como se describe en este documento. En otras realizaciones adicionales, las instrucciones comprenden una descripción de la administración de un anticuerpo a un individuo en riesgo de padecer la enfermedad objetivo.
Las instrucciones relacionadas con el uso de un anticuerpo anti-Galectina-9 generalmente incluyen información sobre la dosis, el esquema de dosificación y la vía de administración para el tratamiento previsto. Los envases pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (e.g., envases multidosis) o dosis de subunidades. Las instrucciones suministradas en los kits de la invención normalmente son instrucciones escritas en una etiqueta o prospecto(por ejemplo,una hoja de papel incluida en el kit), pero también son aceptables las instrucciones legibles por máquina(por ejemplo,instrucciones transportadas en un disco de almacenamiento magnético u óptico).
La etiqueta o el prospecto indica que la composición se utiliza para tratar, retrasar la aparición y/o aliviar la enfermedad asociada con la Galectina-9(por ejemplo,señalización de Dectina-1 o TIM-3). Se pueden proporcionar instrucciones para practicar cualquiera de los métodos descritos en este documento.
Los kits de esta invención se presentan en embalajes adecuados. Los embalajes adecuados incluyen, entre otros, viales, botellas, frascos, embalajes flexibles(porejemplo,bolsas de plástico o Mylar selladas) y similares. También se contemplan paquetes para uso en combinación con un dispositivo específico, tal como un inhalador, un dispositivo de administración nasal(por ejemplo,un atomizador) o un dispositivo de infusión tal como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). El recipiente también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-Galectina-9 como los descritos en este documento. Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales, tales como tampones e información interpretativa. Normalmente, el kit consta de un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con él. En algunas realizaciones, la invención proporciona artículos de fabricación que comprenden contenidos de los kits descritos anteriormente.
Técnicas generales
TLa práctica de la presente invención empleará, salvo indicación contraria, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas las técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que se encuentran dentro del ámbito de la técnica. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía, tal como por ejemplo: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P Mather and P E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P Travers, 1997); Antibodies (P Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
Sin más explicaciones, se cree que un experto en la materia puede, basándose en la descripción anterior, utilizar la presente invención en toda su extensión. Por lo tanto, las siguientes realizaciones específicas deben interpretarse como meramente ilustrativas y no limitativas del resto de la divulgación de ningún modo.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos anti-Galectina-9
Los genes optimizados por codones que codifican la Galectina-9 CRD1 humana (residuos 1-148; SEQ ID NO: 3) y la Galectina-9 CRD1 de ratón (residuos 1-147; SEQ ID NO: 5) se clonaron como fusiones de GST utilizando el vector pGEX que incluye el sitio de escisión de trombina y Avitag aguas arriba del gen clonado. La Galectina-9 CRD2 humana (residuos 218-355; SEQ ID NO: 4) y la Galectina-9 CRD2 de ratón (residuos 226-353; SEQ ID NO: 6) se clonaron en el vector pHBT, un vector de expresión inducible por IPTG que contiene una etiqueta de hexahistadina, Avitag y un sitio de escisión de TEV aguas arriba del gen clonado (Sha et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110: 14924-14929). Luego se purificaron muestras de Galectina-9<c>R<d>2 humanas y de ratóna través decolumnas de Ni-Sepharose seguido de filtración en gel hasta homogeneidad aparente y se biotinilaronin vitrousando BirA recombinante. Las muestras de Galectina-9 CRD1 humanas y de ratón se purificarona través decromatografía de afinidad con GST seguida de escisión con trombina. Las muestras se purificaron aún más mediante cromatografía de filtración en gel y se biotinilaron de manera similar a la Galectina-9 CRD2. Cuando fue necesario se utilizó como control la Galectina-9 de ratón recombinante de longitud completa (R&D Systems).
Los clones de anticuerpos capaces de unirse a los fragmentos de Galectina-9 humanos o de ratón como se indicó anteriormente se aislaron de una biblioteca Fab de presentación en fagos. La biblioteca sigue el diseño de la exitosa "Library E" (Miller et al., PloS One, 2012, 7, e43746) con mejoras. Se realizaron un total de cuatro rondas de clasificación de bibliotecas de fagos utilizando muestras CRD1 y CRD2 como dianas, siguiendo esencialmente los procedimientos publicados (Miller et al., PloS One, 2012, 7, e43746; Fellouse et al., J Mol Biol, 2007, 373, 924-940). Para CRD2, se realizaron campañas de selección utilizando (a) solo CRD2 de ratón o humano como diana o (b) utilizando muestras de CRD2 de ratón y humano alternativamente en rondas sucesivas de clasificación de biblioteca. Para CRD1, solo se utilizaron muestras de CRD1 humano.
La unión a los CRD de Galectina-9 se determinó mediante ELISA de fagos (Sidhu et al., Methods Enzymol, 2000, 328, 333-363). Las muestras de CRD biotiniladas se inmovilizaron en pocillos recubiertos con neutravidina y se bloquearon con un exceso de biotina. Los pocillos se incubaron con fagos que mostraban clones Fab individuales y luego los fagos unidos se detectaron con un anticuerpo anti-fago M13 conjugado con HRP
Luego, los clones Fab mostrados en fagos se preincubaron con 50 nM de Galectina-9 CRD2 o CRD1 no biotinilada antes de agregarlos a las placas ELISA. La reducción de la señal ELISA de los clones con competidor en comparación con aquellos sin competidor indicó una alta afinidad y alta especificidad para Galectina-9 CRD1 o CRD2.
A partir de grupos enriquecidos de clones de anticuerpos, se identificaron un total de 23 clones que se unen a c Rd2 (Figs. 1A-1B) y un total de 11 clones a CRD1 (Figs. 2A-2B). Sus secuencias de aminoácidos se dedujeron determinando las secuencias de ADN de los genes Fab en los clones de fagos (que se proporcionan en este documento como SEQ ID NO: 7-75 y 77-85).
Los genes de un subconjunto de clones de anticuerpos identificados se transfirieron a un vector de expresión deE. colique se ha descrito previamente (Zhang et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109, 8534-8539). Las proteínas Fab se expresaron enE. coliBL21 (EMD Millipore) y se purificaron utilizando la columna HiTrap Protein G HP (GE Healthcare) como se describe (Hattori et al., Nat Methods, 2013, 10, 992-995) seguido de la columna Superdex S200 o ResourceS (GE Healthcare). Cuando fue necesario, el Fab purificado se biotiniló a través del Avitag unido al extremo C de la cadena pesada usando BirA.
Los anticuerpos en los formatos IgG1 humano, IgG4 humano, IgG1 de ratón e IgG2a de ratón se produjeron clonando los genes para las regiones V<h>y V<l>en vectores de expresión de mamíferos para la producción de IgG (Invivogen). En consecuencia, mIgG1 y mIgG2a son híbridos humanos/de ratón, porque el Fc(es decirCH2 y CH2) son IgG1 de ratón, mientras que CH1 y CL son humanas. Las proteínas se produjeron mediante transfección transitoria de células ExpiCHO (ThermoFisher) y se purificaron mediante cromatografía en proteína G Sepharosa seguida de cromatografía Superdex S200 o ResourceS (GE Healthcare).
Ejemplo 2: Caracterización de clones de anticuerpos anti-Galectina-9
Agrupamiento de epítopos
Se examinó si los clones de anticuerpos se unen a epítopos distintos (no superpuestos) en Galectina-9 utilizando ELISA de fagos de competencia. La unión de todos los clones que se unen a CRD2 se inhibió significativamente mediante la preincubación del clon Fab purificado G9.2-1, G9.2-3, G9.2-15 o G9.2-17 (Figs.
3A-3B), lo que indica que los clones aislados se unen a un epítopo superpuesto dentro de CRD2. Los clones G9.2-15 y G9.2-17 fueron seleccionados como clones representativos para una caracterización adicional debido a su fuerte actividad de unión y buena reactividad cruzada entre la Galectina-9 humana y de ratón (Figs.
1A-1B).
Mapeo de epítopos
Se seleccionó el clon G9.2-17 para un análisis adicional de epítopos. Para determinar su epítopo en Galectina-9 CRD2, se construyó una serie de mutantes puntuales. Su capacidad para unirse a G9.2-17 se analizó mediante ELISA de fagos, como se muestra en la Figura 10A. Las reducciones en la señal ELISA indican sitios en Galectina-9 CRD2 que son críticos para la unión de G9.2-17. En particular, la mutación W309K (la numeración de los residuos corresponde a la isoforma 1, número de acceso del GenBank de NCBI BAB83625.1) redujo drásticamente la unión, mientras que las otras mutaciones tuvieron efectos marginales, lo que sugiere que G9.2-17 se une a una región que incluye W309. El análisis de la estructura cristalina de la región mostró que está ubicada frente al sitio de unión del azúcar (Figura 10B). El término "W309" o "residuo W309" se refiere al residuo de triptófano que se encuentra en la posición 309 en SEQ ID NO: 1 (Galectina-9) o al residuo de triptófano ubicado en la posición 277 en la secuencia de la isoforma 2 de Galectina-9, UniProt ID 000182-2 o a un residuo en CRD2 de Galectina-9 que corresponde al residuo que se encuentra en la posición 309 en SEQ ID NO: 1 o en la posición 277 en la secuencia de la isoforma de UniProt ID 000182-2. Los términos "R253", "R271", "R334" y "R341" se refieren al residuo de arginina que se encuentra en las posiciones 253, 271, 334 y 341, respectivamente, en SEQ ID NO: 1 o al residuo de arginina que se encuentra en las posiciones 221,239, 302, 309, respectivamente, en la secuencia de la isoforma 2 de Galectina-9, UniProt ID 000182-2. Los términos "Y330" e "Y236" se refieren al residuo de tirosina que se encuentra en las posiciones 330 y 236, respectivamente, en SEQ ID NO: 1 o al residuo de tirosina que se encuentra en las posiciones 298 y 204, respectivamente, en la secuencia de la isoforma 2 de Galectina-9, UniProt ID 000182-2.
Mutación que suprime la interacción del Fab de G9.2-17 con la matriz cromatográfica
Las muestras de anticuerpos purificados (Fab o IgG) se procesaron en columnas TOSOH TSKgel Bioassist G2WXL en PBS y se detectaron utilizando absorbancia a 280 nm. Se descubrió que la muestra Fab de G9.2-17 presentó un tiempo de retención más largo de lo esperado para su tamaño, lo que sugiere que interactúa con el material de la columna de cromatografía (Figura 11). En comparación, la muestra Fab de G9.2-Iso eluyó con el tiempo esperado. Se descubrió que un mutante puntual de G9.2-17, denominado G9.2.17mut6, tenía un perfil cromatográfico mejorado mientras conservaba la afinidad por la Galectina-9 CRD2 humana y de ratón (Figura 12), lo que sugiere que este mutante tiene un nivel reducido de unión fuera de la diana.
Anticuerpos que se unen a un epítopo distinto dentro de CRD2
Se exploraron posibles epítopos adicionales utilizando clones adicionales que se unen a Galectina-9 CRD2. Se realizó una selección de biblioteca de visualización de fagos utilizando un esquema modificado para enriquecer clones que se unen a un epítopo distinto al de G9.2-17. La Galectina-9 c RD2 biotinilada humana de tipo salvaje, el mutante W309K Galectina-9 CRD2 o la Galectina-9 CRD2 preincubada con G9.2-17 IgG se inmovilizó en pocillos recubiertos con neutravidina y se incubó con clones Fab individuales presentados en fagos. Los resultados se muestran en la figura 13. Tres clones (G9.2-24, G9.2-25 y G9.2-26) exhibieron niveles similares de unión a los tres dianas evaluados, Galectina-9 CRD2 de tipo salvaje, el mutante W309K y CRD2 de tipo salvaje en complejo con G9.2-17. Sus perfiles de unión sugieren que se unen a un epítopo que es distinto del de G9.2-17.
Mediciones de afinidad
Las afinidades de los anticuerpos se evaluaron utilizando un ensayo basado en microesferas como se describió previamente (Nishikori et al., J Mol Biol, 2012, 424, 391-399) y resonancia plasmónica de superficie (SPR). En el ensayo basado en microesferas, una proteína biotinilada (ya sea una muestra de Galectina-9 o una muestra de Fab) se inmovilizó en Dynabeads M280 recubiertas con estreptavidina a través de la interacción biotinaestreptavidina. Después de bloquear los sitios de unión de biotina en exceso en las microesferas usando biotina no conjugada, se realizó una titulación de unión incubando el segundo componente(es decir,Fab para Galectina-9 inmovilizada o viceversa), seguido de una cuantificación usando una neutravidina marcada con colorante (ThermoFisher) y un análisis de citometría de flujo. Los resultados obtenidos de este experimento se proporcionan en las figuras 4 y 5. En los experimentos donde el segundo componente es una IgG, se utilizó un anticuerpo anti-IgG humana o anti-IgG de ratón marcado con colorante para la detección.
En experimentos SPR, una muestra de Galectina-9 biotinilada se inmovilizó en un chip Avicap (Pall ForteBio) que había sido precargado con neutravidina (ThermoFisher). Las muestras de anticuerpos se hicieron fluir utilizando el método OneStep en un instrumento Pioneer SPR (Pall ForteBio) y los resultados se muestran en la Figura 6.
Los dos ensayos mencionados anteriormente revelaron que las muestras Fab analizadas tenían unos valores de la constante de disociación (K<d>) en el rango bajo o sub nanomolar a sus respectivos dianas, como se proporciona en las Figuras. 4-6.
La conversión de G9.2-17 al formato IgG4 humano redujo sustancialmente la tasa de disociación, como se esperaba debido a la naturaleza bivalente de IgG4 (Figura 7). Esto se demostró utilizando el método OneStep descrito anteriormente.
Detección de Galectina-9 endógena en células
Para confirmar que los anticuerpos se unen a la Galectina-9 endógena producida en células humanas, las líneas celulares HEK293T y CRL-2134 se incubaron con un Fab biotinilado y el Fab unido se detectó utilizando neutravidina conjugada con DyLight 650. Se analizaron las muestras usando citometría de flujo. Se observaron señales fuertes para CRL-2134 que expresa Galectina-9, pero no para HEK293T que no expresa Galectina-9 (Lahm et al., J Cancer Res Clin Oncol, 2001, 127, 375-386) (Figura 8).
Los datos demuestran que estos anticuerpos reconocen la Galectina-9 endógena y también muestran que tienen una reactividad cruzada mínima para otras proteínas de la superficie celular. Para medir la unión de anticuerpos a la Galectina-9 endógena producida en células humanas, las células CRL-2134 se tiñeron utilizando concentraciones variables de anticuerpo anti-Galectina-9 o un control negativo. Luego se lavaron las muestras y se detectaron los anticuerpos unidos utilizando IgG anti-ratón conjugado con Dylight 650 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Antes del análisis de citometría de flujo, se añadió yoduro de propidio (1 pg/mL) a cada muestra. Se analizaron las muestras usando citometría de flujo. El porcentaje de células positivas a Galectina-9 se determinó utilizando células no teñidas como control negativo. La constante de disociación basada en células (K<d>) se calculó a partir de una curva de saturación generada en función del porcentaje de células positivas a Galectina-9 en función de la concentración de anticuerpos y el modelo de unión 1:1.
Inhibición de la activación de la señalización de Dectina-1 mediada por Galectina-9
Utilizando una línea de células reporteras para la señalización de Dectina-1 humana (Invivogen), se examinaron los efectos de los anticuerpos anti-Galectina-9 sobre la activación de la señalización mediada por Galectina-9. En este ensayo, la activación de la vía de señalización Dectina-1 conduce a la secreción de fosfatasa alcalina en el medio celular, lo que se detecta como cambios colorimétricos cuantificables. Las líneas celulares se incubaron con las moléculas indicadas durante 16 horas. En ausencia de un anticuerpo, Galectina-9 (R&D Systems) activó robustamente el reportero a la par con el zimosano agotado, un ligando conocido para Dectina-1, como se muestra en la Figura 9. Como se esperaba, Galectina-9 no presentó activación en la línea celular coincidente que no expresó Dectina-1.
Los anticuerpos inhibieron el efecto de activación de Galectina-9, lo que sugiere que bloquean la interacción de Galectina-9 con Dectina-1 en la superficie celular.
Ejemplo 3: Evaluación de anticuerpos anti-Gal-9 en un modelo murino de adenocarcinoma ductal (PDA)
Para probar el efecto del tratamiento con un anticuerpo anti-Gal9 en el adenocarcinoma ductal pancreático (PDA), se pueden utilizar dos modelos de ratón con PDA: el modelo de PDA de progresión lenta p48Cre;LSL-KrasG12D (KC) en el que los ratones expresan Kras oncogénico en sus células progenitoras pancreáticas, y un modelo de PDA ortotópico más agresivo que utiliza células tumorales de ratones Pdx1Cre;LSL-KrasG12D;Tp53R172H (KPC), que expresa Kras mutante y p53; así como en PDA42,43 humano. Se puede utilizar una combinación de análisis inmunohistoquímico, citometría de flujo o microscopía inmunofluorescente para realizar el perfil inmunológico y evaluar el efecto del tratamiento con anticuerpos anti-galectina en comparación con los controles de isotipo. Se utilizan técnicas similares para estudiar muestras humanas derivadas de pacientes con PDA.
En un ejemplo de un estudio con ratones, se tratan ratones KC de seis semanas de edad con el anticuerpo anti-galectina, por ejemplo, G9.2-17, para probar la capacidad del anticuerpo anti-galectina para reducir o prevenir el crecimiento del tumor. Se evalúa la progresión del tumor una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete y ocho semanas después en comparación con los animales tratados con el vehículo. Se sacrifican los animales y se evalúa y puntúa la arquitectura acinar del páncreas. El perfil inmunológico se realiza según los métodos FACS conocidos en la técnica.
Ejemplo 4: Preparación de esferoides y cultivo microfluídico de muestras de tumores de pacientes
Las muestras de tumores frescos (pacientes humanos) se reciben en medio (DMEM) en hielo y se pican en un plato de 10-cm (en hielo) utilizando fórceps y bisturí estériles. El tumor picado se resuspende en DMEM (4,5 mmol/L de glucosa, 100 mmol/L de piruvato de sodio, 1:100 de penicilina-estreptomicina; Corning CellGro) 10 % de FBS (Gemini Bio-Products), 100 U/mL de colagenasa tipo IV (Life Technologies) y 15 mmol/L de HEPES (Life Technologies). Las muestras se sedimentan y se resuspenden en 10 a 20 mL de medio. Los glóbulos rojos (RBC) se eliminan de muestras visiblemente sanguinolentas utilizando un tampón de lisis de RBC (Boston Bio-Products). Las muestras se sedimentan y luego se resuspenden en DMEM fresco 10 % FBS y se cuelan sobre filtros de 100-jm y 40-jm para generar restos esferoides S1 (>100 jm), S2 (40-100 |jm) y S3 (<40 jm), que posteriormente se mantienen en placas de cultivo de tejidos de adhesión ultrabaja. Las restos S2 se utilizan para el cultivoex vivo.Se sedimenta una alícuota de la fracción S2 y se resuspende en colágeno de cola de rata tipo I (Corning) a una concentración de 2,5 mg/ml después de la adición de PBS 10* con rojo fenol con el pH ajustado utilizando NaOH. El pH 7,0-7,5 se confirma utilizando papel Whatman PANPEHA (Sigma-Aldrich). Luego, la mezcla de esferoides y colágeno se inyecta en la región central del gel de un dispositivo de cultivo microfluídico 3-D como se describe en Jenkins et al., Cancer Discov. 2018 Feb;8(2):196-215; Perfil ex vivo del bloqueo de PD-1 usando esferoides tumorales organotípicos. Los hidrogeles de colágeno que contienen esferoides tumorales organotípicos derivados del paciente (PDOTS) se hidratan con medios con o sin anticuerpos monoclonales anti-Gal-9 después de 30 minutos a 37 °C.
En algunos casos, para probar la sinergia con inhibidores de puntos de control u otros agentes de inmunoterapia, los<p>D<o>TS se tratan con anti-PD-1 (pembrolizumab, 250 jg/mL), anti-CTLA4 (ipilimumab, 50 jg/mL) o una combinación (250 jg/mL de pembrolizumab 50 jg/mL de ipilimumab). Para estudios PDOTS indicados, anti-PD-L1 humano (atezolizumab a 600 jg/mL IFNgamma humano. El perfil inmunológico se realiza mediante citometría de flujo como se describe en Jenkins et al.
Ejemplo 5: Generación y análisis de variantes del clon G9.1-8
Los mutantes del clon G9.1-8 se diseñaron reemplazando los residuos de CDR con Ser o mediante el truncamiento de las regiones CDR. Los genes mutantes se construyeron utilizando métodos estándar de mutagénesis dirigida al sitio y se produjeron como se describe en el Ejemplo 1. Un total de 14 mutantes fueron designados como G9.1-8m1- G9.1-8m1 (véase Tabla 4-9). G9.1-8m1 y G9.1-8m2 tienen mutaciones en CDR-H2. Mutaciones G9.1-8m3, G9.1-8m4 y G9.1-8m5 en CDR-H3. G9.1-8m6, G9.1-8m7, G9.1-8m8, G9.1-8m8, G9.1-8m10 y G9.1-8m11 tienen truncamientos en CDR-H3. G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14 tienen mutaciones en CDR-H2 y CDR-H3. G9.1-8m12 comprende una combinación de mutaciones G9.1-8m2 y G9.1-8m8; G9.1-8m13 comprende una combinación de mutaciones G9.1-8m2 y G9.1-8m9; G9.1-m14 comprende una combinación de mutaciones G9.1-8m2 y G9.1-8m11.
Tabla 4. Secuencias de cadena ligera y pesada para mutantes G9.1-8
Las figuras 18 a 22representan gráficos que muestran datos de unión para estos clones medidos utilizando el ensayo de unión de microesferas como se describe en el Ejemplo 2. La Tabla 5-Tabla XXX enumera la KD para varios clones. Como se describió anteriormente, los anticuerpos en formato IgG1 de ratón e IgG2a de ratón se produjeron clonando los genes de las regiones V<h>y V<l>en vectores de expresión de mamíferos para la producción de IgG (Invivogen).
Tabla 5. Unión de clones mIgG1 mutantes G9.1-8 purificados, caracterizados mediante un ensayo de unión basado en microesferas.
Tabla 6. Unión del Fab mutante G9.1-8 purificado, caracterizada mediante un ensayo de unión basado en microesferas.
Tabla 7. Unión de mIgG2a mutante G9.1-8 purificada, caracterizada mediante un ensayo de unión basado en microesferas.
Tabla 8. Unión del Fab mutante G9.1-8 purificado, caracterizado mediante un ensayo de unión basado en microesferas.
Tabla 9. Unión de mIgG2a mutante G9.1-8 purificada, caracterizada mediante un ensayo de unión basado en microesferas.
Estos resultados muestran que ciertos residuos dentro de CDR-H2 y CDR-H3 del clon G9.1-8 pueden reemplazarse o truncarse con efectos mínimos en la unión del antígeno. La conversión de clones mutantes G9.1-8 del formato Fab al formato IgG2A puede reducir la tasa de disociación, como se espera de la naturaleza bivalente de IgG (ver, por ejemplo,Figura21 yFigura 22,por ejemplo, G9.1-8m13 y G9.1-8m14). Cabe destacar que con el clon original G9.1-8 y G9.1-8m8 se observó reactividad con CRD2(Figura25 y datos no mostrados). G9.1-8m12, G9.1-8m13 y G9.1-8m14 no se unen a CRD2 en un ensayo basado en microesferas. Ejemplo 6: Preparación celular y citometría de flujo para el análisis de tejidos de ratón y humanos
Los tumores PDA frescos se colocaron en un tampón FACS frío (PBS con FBS al 2 %) con colagenasa IV (1 mg/mL; Worthington Biochemical, Lakewood, NJ), inhibidor de tripsina (1 mg/mL; EMD Millipore, Billerica, MA) y DNasa I (2 U/mL; Promega, Madison, WI), y se picaron con tijeras en trozos submilimétricos. Los tejidos se incubaron a 37 °C durante 20 min con agitación suave cada 5 min. Las muestras se filtraron a través de una malla de 70 pm y se centrifugaron a 350 g durante 5 min. Los pellets celulares se resuspendieron en el tampón FACS y 1 x 106 células se tiñeron previamente con amarillo zombi (BioLegend) para excluir las células muertas. Después de la tinción de viabilidad, las células se incubaron con un mAb anti-CD16/CD32 (eBiosciences, San Diego, CA) para bloquear F<cy>RNI/N seguido de una tinción de anticuerpos con 1 pg de mAb extracelulares conjugados con fluorescencia. La tinción intracelular para citocinas y factores de transcripción se realizó utilizando el kit de solución de fijación/permeabilización (eBiosciences). Para los especímenes de ratón, utilizamos CD44 (IM7), PD-1 (29F.1A12), CD3 (17A2), CD4 (RM4-5), CD8 (53-6.7), CD45 (30-F11), CD11b (M1/70), Gr1 (RB6-8C5), MHC II (M5/114.15.2), IL-10 (JES5-16E3), IFNy (XMG1.2), TNFa (MP6-XT22), ICOS (15F9), CD69 (H1.2F3), IL-17A (TC11-18H10.1), TGFa (TW7-16B4), LFA-1 (H155-78), T-bet (eBio4B10), RORYt (AFKJS-9) y FoxP3 (FJK-16s; todos eBiociencias). Los anticuerpos fueron de BioLegend a menos que se indique lo contrario. Los anticuerpos de citometría de flujo humanos incluyeron CD45 (HI30), CD3 (UCHT1), CD4 (A161A1), CD8 (HIT8a), CD44 (BJ18), TNFa (MAb11), IFN<y>(4S.B3; todos Biolegend). La citometría de flujo se realizó en el citómetro de flujo LSR-II (BD Biosciences). Los datos se analizaron utilizando FlowJo v.10.1 (Treestar, Ashland, OR).
Ejemplo 7: Evaluación de anticuerpos Gal-9 solos o en combinación con inhibición de puntos de control en un modelo murino de cáncer de páncreas y masa tumoral y perfil inmunológico de ratones tratados con G9.2-17 mIgG1
Se evaluó el efecto de G9.2-17 mIgG1 en el peso del tumor y en el perfil inmunológico en un modelo de ratón de cáncer de páncreas. A ratones machos C57BL/6 de 8 semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se les administraron inyecciones intrapancreáticas de células PDA FC1242 derivadas de ratones Pdx1Cre; KrasG12D; Trp53R172H (KPC) (Zambirinis CP, et al., TLR9 ligation in pancreatic stellate cells promueve la tumorigénesis. J Exp Med. 2015;212:2077-94). Las células tumorales se suspendieron en PBS con 50 % de Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y se inyectaron 1*105 células tumorales en el cuerpo del páncreas mediante laparotomía. Los ratones (n = 10/grupo) recibieron una dosis de pretratamiento ip seguida de 3 dosis (q.w.) de mAb aGalectin 9 comercial (RG9-1,200 ug, BioXcell, Lebanon, NH) o G9.2-17 mIgG1 (200 pg), o un isotipo emparejado, ya sea G9.2-Iso o IgG2a de rata (LTF-2, BioXcell, Lebanon, NH) (200 pg) (una dosis por semana durante tres semanas). Los ratones fueron sacrificados 3 semanas después y se recolectaron tumores para análisis mediante citometría de flujo. Se procesó y preparó el tejido y se realizó un análisis citométrico de flujo como se describe en el Ejemplo 5.
Masa tumoral y perfil inmunitario de ratones tratados con G9.2-17 mIgG2a solo o en combinación con mAb aPD1
Se evaluó el efecto de G9.2-17 mIgG2a sobre el peso del tumor y sobre el perfil inmunológico en un modelo de ratón de cáncer de páncreas, solo o en combinación con inmunoterapia. Se administraron inyecciones intrapancreáticas de células PDA FC1242 derivadas de ratones Pdx1Cre; KrasG12D; Trp53R172H (KPC) a ratones macho C57BL/6 de 8 semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Las células tumorales se suspendieron en PBS con 50 % de Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y se inyectaron 1x105 células tumorales en el cuerpo del páncreas mediante laparotomía. Los ratones recibieron una dosis de pretratamiento ip seguida de 3 dosis (q.w.) de G9.2-17 mIgG2a (200 pg) o un mAb aPD-1 neutralizante (29F.1A12, 200 pg, BioXcell, Lebanon, NH), por separado o en combinación, o isotipo emparejado (LTF-2 y C1.18.4, BioXcell, Lebanon, NH) según se indique. Los ratones fueron sacrificados el día 26 y se recolectaron tumores para su análisis. Se procesó y preparó el tejido y se realizó un análisis citométrico de flujo como se describe en el Ejemplo 5. Los resultados se muestran en las Figuras 17A-17C. Cada punto representa un ratón; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001; mediante prueba t de Student no pareada. Estos resultados muestran que el tratamiento con un solo agente G9.2-17 mIgG2a reduce el crecimiento del tumor en ambos niveles de dosis, mientras que el anti-PD-1 solo no tuvo efecto sobre el tamaño del tumor.
Ejemplo 8: Preparación de esferoides y análisis del efecto del anticuerpo anti-Gal9 en esferoides tumorales derivados de muestras de pacientes
Los esferoides tumorales organotípicos derivados de pacientes (PDOTS) se prepararon a partir de muestras de tumores de pacientes frescos (adenocarcinoma de páncreas, cáncer de vesícula biliar y metástasis hepática de un cáncer colorrectal). Brevemente, las muestras se recibieron en medio en hielo y se picaron en placas de 10 cm y se resuspendieron en DMEM FBS al 10 % 100 U/mL colagenasa tipo IV. Las muestras parcialmente digeridas se sedimentaron, se resuspendieron y se filtraron sobre filtros de 100 pm y 40 pm para generar restos esferoides S1 (>100 pm), S2 (40-100 pm) y S3 (<40 pm), que posteriormente se mantuvieron en placas de cultivo de tejidos de baja adhesión. Una alícuota de la fracción S2 se peletizó y se resuspendió en colágeno de cola de rata tipo I a una concentración de 2,5 mg/ml tras la adición de PBS 10x con rojo fenol, con el pH ajustado con NaOH. La mezcla de esferoides y colágeno se inyectó en la región central del gel del chip de cultivo celular microfluídico DAX-1 3D. Después de 30 minutos a 37 °C, los hidrogeles de colágeno que contenían PDOTS se hidrataron con medio y se trataron con el anticuerpo Gal9 (G9.2-17). Tres días después, se recogieron los PDOTS y se analizaron para detectar cambios inmunes. Los resultados preliminares en muestras de pacientes individuales se muestran en las Figuras 26-29. Si se obtuvieron más de 100 células, entonces se clasificaron las células para CD3+, CD4+ y CD8+, de lo contrario, las células solo se clasificaron para CD3+.
Ejemplo 9: Caracterización de la función efectora, reactividad cruzada e inmunogenicidad de los anticuerpos Gal-9
Ensayo de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC)
En la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), las células efectoras lisan las células diana en las que los anticuerpos se han unido a antígenos específicos en la membrana de la célula diana. El ADCC desarrollado está diseñado para caracterizar la función efectora Fc de los anticuerpos y medir la actividad del ADCC. Aunque el ensayo inicial desarrollado dependía tanto de células diana como de células efectoras, el ensayo se mejora aún más al recubrir directamente las placas con el antígeno de interés, evitando así la necesidad de células diana. Se utiliza una línea de células T Jurkat recombinantes que expresa el gen de luciferasa de luciérnaga bajo el control de elementos de respuesta NFAT con expresión constitutiva de FcYRIIIa humano como una línea celular efectora. El antígeno recubierto en placas ELISA estériles se utiliza como diana y el anticuerpo de prueba se incuba con el antígeno para permitir la unión a través del fragmento Fab. Luego, las células efectoras que muestran el tipo correcto de FcgR se incuban con el complejo antígeno/anticuerpo en la placa. Cuando la parte Fc del anticuerpo se une al FcgRIIIa en la superficie de las células efectoras, la reticulación del receptor conduce a la activación de la vía NFAT, lo que resulta en la expresión de luciferasa. Se deja que la expresión genética continúe durante 5-6 horas y se mide la actividad de la luciferasa utilizando un luminómetro. Se genera una curva dosis-respuesta para cada anticuerpo.
Ensayo de fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP)
La fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) es un mecanismo de acción importante para los anticuerpos que median parte o la totalidad de su acción a través de la fagocitosis. En ese caso, los anticuerpos median la captación de antígenos específicos por las células presentadoras de antígenos. La ADCP puede ser mediada por monocitos, macrófagos, neutrófilos y células dendríticas, a través de FcYRIIa, F<cy>RI y FcYRIIIa, de los cuales FcYRIIa (CD32a) en los macrófagos representa la vía predominante. En el ensayo ADCp que se emplea, se utilizan células THP-1 (línea de células monocíticas humanas derivadas de un paciente con leucemia monocítica aguda) para medir el ADCP. Las microesferas marcadas con fluorescencia se conjugan con el antígeno diana y luego se incuban con el anticuerpo de prueba. Luego se agregan células THP-1 a la placa para permitir su unión a la fracción Fc de anticuerpos unidos a microesferas fluorescentes recubiertas de antígeno. La unión del anticuerpo a las microesferas y la interacción con el receptor Fc dan como resultado una captación de las microesferas por parte de las células THP-1 a través de un mecanismo fagocítico. Los eventos de fagocitosis se analizan mediante citometría de flujo. Se mide la cantidad total de fluorescencia en cada célula (que representa el número de microesferas fagocitadas) y el porcentaje de células con fluorescencia positiva (que representa la frecuencia de fagocitosis). Se genera una curva dependiente de la dosis para evaluar la actividad de ADCP mediada por cada anticuerpo de prueba.
Ensayo de reactividad cruzada
La toxicidad fuera de la diana puede presentar un problema significativo durante el desarrollo de un fármaco de anticuerpo monoclonal terapéutico. Como tal, la especificidad es un factor crítico a evaluar como parte de la caracterización de cualquier nuevo candidato monoclonal y un indicador importante de su seguridad prevista. Para evaluar la especificidad de los anticuerpos y la reactividad cruzada, se prueban los anticuerpos de prueba y las muestras de prueba para determinar su unión a una matriz proteómica humana que consiste en una amplia colección de proteínas humanas, tanto nativas como desnaturalizadas, y en dos concentraciones de trabajo. La especificidad del anticuerpo se evalúa utilizando el microarray del proteoma humano HuProt de CDI (~75 % del proteoma humano). La micromatriz se incuba con el anticuerpo primario, se enjuaga, se incuba con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y posteriormente se analiza para determinar la cantidad de fluorescencia detectada para cada proteína diana. Los resultados se compilan como imágenes de micromatrices.
Detección de anticuerpos antidrogas (ADA)
La detección de anticuerpos antidrogas se realiza en sueros de ratones tratados con mAb anti-Gal9in vivo.El ensayo ADA se ejecuta en la plataforma Mesoscale Discovery (MSD) debido a su mayor sensibilidad y rango dinámico en comparación con los métodos ELISA estándar. Los anticuerpos anti-Gal9 marcados con biotina y Gal9 conjugados con sulfo (fármaco) se incubarán con sueros de prueba para formar un complejo puente. Los complejos puente de ADA se unirán a las placas de estreptavidina y la presencia de ADA en las muestras de suero de prueba se detectará mediante detección electroquimioluminiscente.
Ejemplo 10: Evaluación de los anticuerpos monoclonales humanos Galectina 9 IgG1 e IgG4 del clon 17 de CRD2 en un modelo de leucemia mieloide aguda (LMA) en ratones humanizados.
Se realiza un estudio para evaluar los anticuerpos monoclonales humanos Galectina 9 IgG1 e IgG4 del clon 17 de CRD2 en un modelo de leucemia mieloide aguda en ratones humanizados (CTG-2243, Champions). El protocolo del estudio se muestra en la Tabla 10.
Tabla 10. Diseño del estudio de eficacia de LMA:
Preparación de animales de estudio
Los animales son irradiados subletalmente y reconstituidos con 1 a 5 millones de células LMA primarias mediante inyección en la vena de la cola. La recolección de sangre en vida se realiza una vez al mes y se lleva a cabo una citometría de flujo utilizando el siguiente panel de flujo: huCD45/muCD45/huCD3/huCD33 para determinar el injerto. Una vez que los niveles de CD33+ humanos alcanzan 20-1000 cuentas/ul, se sacrifican 6 animales sustitutos para realizar una inmunofenotipificación completa y se analiza el bazo, la médula ósea y la sangre periférica mediante el panel de flujo de arriba. Los animales se asignan aleatoriamente a grupos de tratamiento según los recuentos de sangre periférica. El análisis del crecimiento/carga del tumor diseminado se realiza hasta 42 días de dosificación y observación. La sangre entera de la mitad terminal se procesa y se analiza para determinar parámetros inmunes y el suero se utiliza para ELISA Gal9.
Se recolecta sangre terminal y médula ósea para citometría de flujo. Se realiza citometría de flujo de superficie celular de 8 colores a partir de médula ósea terminal y sangre periférica de todos los animales: Los paneles de flujo son:
LD/huCD45/huCD3/huCD33/huGalectin9/huTim9/huPD1/huCD34/huCD38/huCD117.
Se recogen muestras fecales frescas de todos los animales (1 pellet/ratón) en un tubo de polipropileno al inicio del estudio (antes de iniciar el tratamiento), al final de la semana 1 del tratamiento y al final del estudio. Las muestras recolectadas se congelarán rápidamente y se almacenarán a -80 °C. Si es posible, se recoge una muestra terminal de sangre y de tejidos para evaluar la toxicidad del fármaco.
Análisis de datos
Para evaluar la toxicidad animal, a partir del día 0, los animales se observan diariamente y se pesan 3 veces por semana usando una balanza digital; los datos, incluidos los pesos individuales y medios en gramos (peso medio ± SEM), el cambio porcentual medio de peso frente al día 0 ( %vD0) se registran para cada grupo y el %vD0 se grafica al finalizar el estudio. Todas las muertes de animales se registran diariamente y se designan como relacionadas con el fármaco (D), técnicas (T), relacionadas con el tumor (B) o desconocidas (U) según la pérdida de peso y la observación bruta; los grupos de agente único o combinación que informan una mortalidad media %vD0 >20 % y/o >10 % se consideran superiores a la dosis máxima tolerada (MTD) para ese tratamiento en el régimen evaluado. El %vD0medio máximo (peso nadir) para cada grupo de tratamiento se informa al finalizar el estudio. Para evaluar la eficacia del anticuerpo Gal-9, se mide la inhibición del crecimiento tumoral. A partir del día 0, las dimensiones del tumor se miden 3 veces por semana con un calibrador digital y se registran los datos, incluidos los volúmenes tumorales individuales y promedio estimados (TV promedio ± SEM), para cada grupo; el volumen del tumor (TV) se calcula utilizando la fórmulaTV = ancho2 * largox 0,52.Al finalizar el estudio, se calculan y se informan los valores de porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral ( %TGI) para cada grupo de tratamiento (T) versus control (C) utilizando mediciones tumorales iniciales (i) y finales (f) mediante la fórmula %TGI = 1 - (Tf-Ti) / (Cf-Ci). Los ratones individuales que informan un volumen tumoral <30 % de la medición del día 0 durante dos mediciones consecutivas se consideran respondedores parciales (PR). Los ratones individuales que carecen de tumores palpables (0,00 mm3 en dos mediciones consecutivas) se clasifican como respondedores completos (CR); un CR que persiste hasta la finalización del estudio se considera un sobreviviente libre de tumores (TFS). El tiempo de duplicación del tumor (DT) se determina para los grupos tratados con vehículo utilizando la fórmula D<t>= (Df - Di) * log2/ (logTVf - logTVi) donde D = Día y TV = Volumen del tumor. Todos los datos recopilados en este estudio se gestionan electrónicamente y se almacenan en un sistema de servidor redundante.
Ejemplo 11: Evaluación del anticuerpo Gal-9 en un modelo de tumor singénico de melanoma B16F10 en ratones inmunocompetentes
El anticuerpo Gal-9 G9.2-17 se evaluó en el modelo de ratón singénico B16F10 de ratones inmunocompetentes con melanoma. A los animales de preestudio (hembras C57BL/6, de 6 a 8 semanas de edad (Charles River Labs)) se les implantó unilateralmente por vía subcutánea en el flanco izquierdo 5e5 B16.F10 en 100 pl de PBS. Los volúmenes tumorales previos al estudio se registraron para cada experimento comenzando 2-3 días después de la implantación. Cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral promedio de 50-100 mm3 (preferiblemente 50-75 mm3), los animales fueron emparejados por volumen tumoral en grupos de tratamiento o control (n = 8) para ser utilizados para la dosificación y la dosificación se inició el día 0. Los animales recibieron la dosis el día 0 y el día 4 iv. El diseño del estudio para probar Anti-Gal9 G9.2-17 IgG1 y Anti-Gal9 G9.2-17 IgG2 se resume en la Tabla 11 y la Tabla 12.
Tabla 11. Anti-Gal9 IgG1
Tabla 12. Anti-Gal9 IgG2
__________
Se tomaron los volúmenes de los tumores y se pesaron los animales tres veces por semana. El punto final del estudio se estableció cuando el volumen tumoral medio del grupo de control (sin censura) alcanzó 1500 mm3. Se tomó el volumen final del tumor el día que el estudio llegó al punto final. Se tomó el peso final el día en que el estudio llegó al punto final (día 10). El volumen del tumor se muestra enla figura 30yla figura 31.
Ejemplo 12: Ensayo de apoptosis de Jurkat
Se evaluó la capacidad de los anticuerpos Galectina-9 G9.2-17 y G9.1-8m9 para prevenir la apoptosis inducida por Galectina-9 de las células Jurkat. Las células Jurkat (TIB-152, ATCC, Manassas, VA) se cultivaron en RPMI modificado (2 mM L-glutamina, 10 mM HEPES, 1 mM piruvato de sodio, 4,5 g/L de glucosa, 1,5 g/L de bicarbonato de sodio) con 10 % de FBS, 100 mU/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina a 37 °C con 5 % de CO2. Las células (2*105 células/pocillo) se incubaron en los pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos con o sin la adición de 280 nM de Galectina-9 (2045-GA, RnD Systems, Minneapolis, MN), 1 pM de G9.2-17 IgG y/o 1 pM de G9.1-8m9 IgG. Las células se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2 durante 5 horas y luego se resuspendieron en tampón de unión a anexina V. Luego, las células se tiñeron con AnnexinV-AlexaFluor488 (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 4 °C durante 30 minutos en la oscuridad. Antes de la citometría de flujo, se añadió yoduro de propidio (PI) (1 pg/mL). Las células se procesaron en un citómetro de flujo Guava easyCyte (MilliporeSigma, Burlington, M<a>) y se analizaron utilizando FlowJo (Treestar, Ashland, OR). La población celular se clasificó mediante dispersión frontal y lateral, luego se analizó en AnnexinV para todas las células apoptóticas y PI para las poblaciones de células apoptóticas tardías. Los resultados se muestran en la Figura23
Ejemplo 13. Los anticuerpos anti-Galectina-9 interrumpen la interacción entre Galectina-9 y CD206 Las placas de 96 pocilios de alta unión Microlon (Greiner Bio-One, Kremsmünster, Austria) se recubrieron con hGalectin-9 (RnD Systems, Minneapolis, MN) (50<j>L, 4 jg/mL en TBS) a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego, las placas se bloquearon con TBS 0,5 % BSA (150<j>L) a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron tres veces con TBS 0,1 % BSA. Se agregaron los anticuerpos G9.1-8m13 y/o G9.2-17 a cada pocillo (50<j>L, 100 nM en TBS 0,1 % BSA) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego se añadió CD206-His (RnD Systems, Minneapolis, MN) a una concentración final de 13 nM y se incubó durante 30 minutos más a temperatura ambiente. Luego, los pocillos se lavaron 3 veces con TBS 0,05 % de Tween20. Se añadió aHis-HRP (ab1187, Abcam, Cambridge, MA) a cada pocillo (50 j L, 1:2500 en TBS 0,05% Tween20 al 0,1 % , BSA al) y se incubó 30 minutos más a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con TBS 0,05 % de Tween20 y una vez con TBS. Se añadió a cada pocillo el sustrato ELISA 1 Step TMB-Ultra (Thermofisher, Waltham, MA) (50<j>L).
La reacción se neutralizó con H2SO4 (50j L) 2M y la señal de absorbancia a 450 nm se leyó utilizando un espectrofotómetro Epoch2 (BioTek, Winooski, VT). (Experimentos realizados por triplicado; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001; mediante prueba t de Student no pareada). Los resultados se muestran en lasFig.
24AyFig. 24Be indican que los anticuerpos G9.1-8m13 y G9.2-17 inhiben la interacción entre Galectina-9 y CD206 y sus efectos son aditivos.
Ejemplo 14. Evaluación de la actividad citotóxica
Para evaluar la actividad citotóxica inducida por el complemento de 9.1-8mut13 y 9.2-17, se realizan ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y se comparan con 2 anticuerpos monoclonales de ratón (formas monoclonales de ratón de g9.2-17 y g9.1-8m9). Los anticuerpos se incuban con las células diana adecuadas que expresan gal-9 y se agrega suero específico de la especie como fuente de proteínas del complemento para unirse a los anticuerpos monoclonales unidos a las células e iniciar la citólisis dependiente del complemento de la célula diana. La muerte celular de las células diana se determina mediante la tinción diferencial obtenida en células con membranas permeables frente a no permeables(es decir,células lisadas frente a no lisadas) después de la incubación con un colorante de viabilidad celular fluorescente y se evalúa mediante citometría de flujo.
Ejemplo 15: Evaluación del anticuerpo Gal-9 en dos modelos singénicos de cáncer colorrectal y melanoma en ratones inmunocompetentes
Se evalúan los anticuerpos Gal-9 G9.2-17 y G9.1-8m13 en modelos singénicos de cáncer colorrectal y melanoma en ratones inmunocompetentes. Los artículos de prueba se formulan y preparan semanalmente durante la duración del estudio según la Tabla 13.
Tabla 13. Artículos de prueba
Diseño experimental
Los animales de preestudio (hembra C57BL/6, de 6 a 8 semanas de edad (Charles River Labs) se aclimatan durante 3 días y luego se les implantan unilateralmente por vía subcutánea en el flanco izquierdo 5e5 B16.F10 (línea celular de melanoma) o células MC38 (línea celular de cáncer colorrectal) resuspendidas en 100 pl de PBS. Los volúmenes tumorales previos al estudio se registran para cada experimento comenzando 2-3 días después de la implantación. Cuando los tumores alcanzan un volumen tumoral promedio de 50-100 mm3 (preferiblemente 50-75 mm3) los animales se agrupan según el volumen del tumor en grupos de tratamiento o control que se utilizarán para la dosificación y la dosificación se inicia el día 0. El diseño del estudio para la prueba de Anti-Gal9 IgG1 y Anti-Gal9 IgG2 se resume en la Tabla 14 y la Tabla 15.
Tabla 14. Anti-Gal9 IgG1 (B16F10 y MC38)
Tabla 15. Anti-Gal9 IgG2 (B16F10 y MC38)
Los volúmenes del tumor se toman tres veces por semana. El volumen final del tumor se toma el día en que el estudio llega al punto final. Se toma un volumen tumoral final si se encuentra que un animal está moribundo. Los animales se pesan tres veces por semana. El peso final se toma el día en que el estudio llega al punto final o si el animal se encuentra moribundo. A los animales que presentan una pérdida de peso >10 % en comparación con el día 0 se les proporciona DietGel® ad libitum. Cualquier animal que presente una pérdida de peso neto >20 % durante un período que dure 7 días o si los ratones muestran una pérdida de peso neto >30 % en comparación con el día 0 se considera moribundo y se sacrifica. El punto final del estudio se establece cuando el volumen tumoral medio del grupo de control (sin censura) alcanza los 1500 mm3. Si esto ocurre antes del día 28, los grupos de tratamiento y los ratones individuales serán dosificados y medidos hasta el día 28. Si el volumen tumoral medio del grupo de control (sin censura) no alcanza los 1500 mm3 el día 28, el punto final para todos los animales es el día en que el volumen tumoral medio del grupo de control (sin censura) alcanza los 1500 mm3 hasta un máximo del día 60. Se recoge sangre de todos los animales de cada grupo. Para la recolección de sangre, se recolecta la mayor cantidad de sangre posible mediante una punción cardíaca en tubos de K2EDTA (400 ul) y tubos separadores de suero (restantes) bajo anestesia profunda inducida por inhalación de isoflurano. La sangre recolectada en tubos con K2EDTA se coloca en hielo húmedo hasta que se utiliza para realizar el flujo del panel inmunológico como se muestra en la Tabla 16.
Tabla 16. Panel 1 Citometría de flujo
La sangre recolectada en tubos separadores de suero se deja coagular a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos. Las muestras se centrifugan a 3500 durante 10 minutos a temperatura ambiente. El suero resultante se separa, se transfiere a tubos de polipropileno transparente con una etiqueta exclusiva y se congela inmediatamente sobre hielo seco o en un congelador configurado para mantener la temperatura a -80 °C hasta el envío para el ensayo de ADA puente (se envía dentro de una semana).
Los tumores de todos los animales se recogen de la siguiente manera. Los tumores de menos de 400 mm3 de tamaño se congelan rápidamente, se colocan en hielo seco y se almacenan a -80 C hasta que se utilizan para el análisis RT-qPCR. Para tumores de entre 400 y 500 mm3 de tamaño, se recolectan tumores completos en medio MACS para su uso en el panel de flujo (que se muestra en la Tabla 16A a continuación). Para tumores de más de 500 mm3 de tamaño, se congela instantáneamente un trozo pequeño (aproximadamente 50 mm3), se coloca en hielo seco y se almacena a -80 C para RT-qPCR, y el tumor restante se recolecta en medio MACS para citometría de flujo (como se muestra en la Tabla 16A). Para la citometría de flujo, los tumores se colocan en medio MACS y se almacenan en hielo húmedo hasta su procesamiento. Se muestra un resumen del análisis de citometría de flujo realizado en la Tabla 16A.
Tabla 16A. Panel 2 Citometría de flujo
El bazo, el hígado, el colon, los pulmones, el corazón y los riñones de todos los animales se conservan en formalina tamponada neutra (NBF) al 10 % durante 18 a 24 horas, se transfieren a etanol al 70 % y se almacenan a temperatura ambiente. Las muestras fijadas con formalina se incluyen en parafina.
Ejemplo 16: Evaluación del anticuerpo Gal-9 en un modelo de colangiocarcinoma
La eficacia del anticuerpo Gal-9 se evalúa en un modelo de ratón de colangiocarcinoma como se describe en S. Rizvi, et al. (Inestabilidad cromosómica asociada a YAP y colangiocarcinoma en ratones, Oncotarget, 9 (2018) 5892-5905). En este modelo de transducción, en el que los oncogenes (AKT/YAP) se instilan directamente en el árbol biliar, los tumores surgen del tracto biliar en huéspedes inmunocompetentes con un microambiente tumoral compatible con la especie. La dosificación se describe en la Tabla 17.
Tabla 17. Dosificación
En resumen, las células CCA murinas (descritas en S. Rizvi, et al) se recolectan y se lavan en DMEM. Los ratones machos C57BL/6 de Jackson Labs están anestesiados con isoflurano al 1,5-3 %. Bajo anestesia profunda, se abre la cavidad abdominal mediante una incisión de 1 cm debajo del proceso xifoides. Se utiliza un aplicador con punta de algodón estéril para exponer el aspecto superolateral del lóbulo medial del hígado. Utilizando una aguja de calibre 27, se inyectan 40 pL de medio estándar que contiene 1 * 10A6 células en el aspecto lateral del lóbulo medial. Se coloca un aplicador con punta de algodón sobre el sitio de la inyección para evitar fugas de células y pérdida de sangre. Posteriormente se cierran la pared abdominal y la piel en capas separadas con material de sutura de tripa crómica 3-0 absorbible.
Dos semanas después de la implantación, los animales se agrupan según el volumen del tumor en grupos de tratamiento o de control que se utilizarán para la dosificación, y la dosificación se inicia el día 0. Se miden los volúmenes del tumor y se pesan los animales tres veces por semana. El volumen y el peso finales del tumor se toman el día en que el estudio llega al punto final (4 semanas o cuando la carga tumoral de control llega a 1500 mm3). Se recoge sangre de todos los animales de cada grupo. Los tumores de todos los animales se recogen esencialmente como se describe en el Ejemplo 15. El análisis se realiza esencialmente como se describe en el Ejemplo 15.
Equivalentes
Si bien se han descrito e ilustrado en este documento varias realizaciones inventivas, aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica visualizarán fácilmente una variedad de otros medios y/o estructuras para realizar la función y/o obtener los resultados y/o una o más de las ventajas descritas en este documento, y cada una de dichas variaciones y/o modificaciones se considera dentro del alcance de las realizaciones inventivas descritas en este documento. De manera más general, los expertos en la materia apreciarán fácilmente que todos los parámetros, dimensiones, materiales y configuraciones descritos en este documento tienen como diana ser ejemplares y que los parámetros, dimensiones, materiales y/o configuraciones reales dependerán de la aplicación o aplicaciones específicas para las que se utilizan las enseñanzas inventivas. Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de determinar, solamente mediante el uso de experimentos de rutina, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descrita en la presente. Por lo tanto, debe entenderse que las realizaciones anteriores se presentan sólo a modo de ejemplo y que, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y equivalentes a las mismas, las realizaciones inventivas pueden practicarse de manera diferente a como se describen y reivindican específicamente. Las realizaciones inventivas de la presente divulgación están dirigidas a cada característica, sistema, artículo, material, kit y/o método individual descrito en este documento. Además, cualquier combinación de dos o más de dichas características, sistemas, artículos, materiales, kits y/o métodos, si dichas características, sistemas, artículos, materiales, kits y/o métodos no son mutuamente inconsistentes, se incluye dentro del alcance inventivo de la presente divulgación.
Los artículos indefinidos "un" y "una", tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben entenderse como "al menos uno".
La frase "y/o", tal como se utiliza en este documento en la especificación y en las reivindicaciones, debe entenderse que significa "cualquiera o ambos" de los elementos así unidos,es decir,elementos que están presentes conjuntivamente en algunos casos y presentes disyuntivamente en otros casos. Los elementos múltiples enumerados con "y/o" deben interpretarse de la misma manera,es decir,"uno o más" de los elementos así unidos. Pueden estar presentes opcionalmente otros elementos además de los elementos específicamente identificados por la cláusula "y/o", ya sea que estén relacionados o no con dichos elementos específicamente identificados. Así, a modo de ejemplo no limitativo, una referencia a "A y/o B", cuando se utiliza junto con un lenguaje abierto como "que comprende", puede referirse, en una realización, solo a A (incluyendo opcionalmente otros elementos además de B); en otra realización, solo a B (incluyendo opcionalmente otros elementos además de A); en otra realización más, tanto a A como a B (incluyendo opcionalmente otros elementos); etc.
Tal como se utiliza en este documento en la especificación y en las reivindicaciones, "o" debe entenderse que tiene el mismo significado que "y/o" tal como se definió anteriormente. Por ejemplo, al separar elementos de una lista, "o" o "y/o" se interpretarán como inclusivos,es decir,la inclusión de al menos uno, pero también la inclusión de más de uno, de un número o lista de elementos y, opcionalmente, elementos adicionales no enumerados. Sólo los términos claramente indicados en contrario, tales como "sólo uno de" o "exactamente uno de", o, cuando se utilizan en las reivindicaciones, "que consiste en", se referirán a la inclusión de exactamente un elemento de un número o lista de elementos. En general, el término "o" como se utiliza en este documento solo se interpretará como indicativo de alternativas exclusivas(es decir,"uno u otro pero no ambos") cuando esté precedido por términos de exclusividad, como "cualquiera", "uno de", "solo uno de" o "exactamente uno de". "Que consiste esencialmente en", cuando se utiliza en las reivindicaciones, tendrá su significado ordinario tal como se emplea en el campo del derecho de patentes.
Tal como se utiliza en este documento en la especificación y en las reivindicaciones, la frase "al menos uno", en referencia a una lista de uno o más elementos, debe entenderse que significa al menos un elemento seleccionado de uno o más de los elementos en la lista de elementos, pero no necesariamente incluyendo al menos uno de todos y cada uno de los elementos específicamente enumerados dentro de la lista de elementos y sin excluir ninguna combinación de elementos en la lista de elementos. Esta definición también permite que opcionalmente puedan estar presentes elementos distintos de los elementos específicamente identificados dentro de la lista de elementos a los que se refiere la frase "al menos uno", ya sean relacionados o no con dichos elementos específicamente identificados. Así, a modo de ejemplo no limitativo, "al menos uno de A y B" (o, equivalentemente, "al menos uno de A o B", o, equivalentemente, "al menos uno de A y/o B") puede referirse, en una realización, a al menos un A, que puede incluir más de uno, sin B presente (y que puede incluir elementos distintos de B); en otra realización, a al menos un B, que puede incluir más de uno, sin A presente (y que puede incluir elementos distintos de A); en otra realización, a al menos un A, que puede incluir más de uno, y al menos un B, que puede incluir más de uno, y que puede incluir otros elementos; etc.
También debe entenderse que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquier método reivindicado en este documento que incluya más de una etapa o acto, el orden de las etapas o actos del método no está necesariamente limitado al orden en el que se recitan los pasos o actos del método.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado, que se une a la Galectina-9 humana,
en donde el anticuerpo tiene una CDR1 de V<h>que comprende SEQ ID NO: 361, una CDR2 de V<h>que comprende SEQ ID NO: 388 y una CDR 3 de V<h>que comprende SEQ ID NO: 406 y
en donde el anticuerpo tiene una CDR1 de V<l>que comprende SEQ ID NO: 328, una CDR2 de V<l>que comprende SEQ ID NO: 329 y una CDR 3 de V<l>que comprende SEQ ID NO: 352; y
en donde el anticuerpo tiene una región V<l>que comprende SEQ ID NO: 54 y una región V<h>que comprende SEQ ID NO: 55.
2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que es: un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión al antígeno del mismo, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo humanizado.
3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, que es una molécula de IgG.
4. El anticuerpo aislado de la reivindicación 3, en donde la molécula de IgG es una molécula de IgG1 o IgG4.
5. El anticuerpo aislado de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo es una molécula IgG4, en donde la IgG4 tiene una mutación S228P.
6. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada establecida como SEQ ID NO: 316 y una cadena ligera establecida como SEQ<i>D NO: 108.
7. Una composición farmacéutica, que comprende un anticuerpo anti-Galectina-9 de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. Una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada con la Galectina-9 en un sujeto, cuyo uso comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición farmacéutica según la reivindicación 7;
en donde el sujeto es un paciente humano que padece, se sospecha que padece o está en riesgo de padecer la enfermedad asociada con la Galectina-9, que es una enfermedad autoinmune, un cáncer sólido, una enfermedad microbiana, una neoplasia hematológica o un trastorno alérgico.
9. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 8, en donde el sujeto es un paciente humano con un tumor sólido seleccionado del grupo que consiste en glioblastoma, glioma de tronco encefálico, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello de células escamosas, carcinoma de células escamosas, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores neuroendocrinos, adenocarcinoma ductal pancreático (CAP), cáncer colorrectal (CCR), melanoma, colangiocarcinoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, neoplasias malignas gastrointestinales superiores e inferiores, cáncer de cabeza y cuello de células escamosas, cánceres de cabeza y cuello, cáncer genitourinario, cáncer de ovario y sarcomas.
10. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 9, en donde las neoplasias malignas del intestino superior e inferior se seleccionan del grupo que consiste en cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cánceres de las vías biliares, colangiocarcinoma, cáncer de vesícula biliar y cáncer de hígado.
11. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende además administrar al sujeto un inhibidor de una molécula de punto de control.
12. La composición para su uso según la reivindicación 11, en donde la molécula de punto de control es PD-1 o se selecciona de PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIM-3 y A2aR.
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