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ES3030689T3 - Method for measuring a change in an individual's immunorepertoire - Google Patents

Method for measuring a change in an individual's immunorepertoire

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Publication number
ES3030689T3
ES3030689T3 ES16762225T ES16762225T ES3030689T3 ES 3030689 T3 ES3030689 T3 ES 3030689T3 ES 16762225 T ES16762225 T ES 16762225T ES 16762225 T ES16762225 T ES 16762225T ES 3030689 T3 ES3030689 T3 ES 3030689T3
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cdr3
immune
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patient
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ES16762225T
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Inventor
Jian Han
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Original Assignee
Irepertoire Inc
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Publication date
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Abstract

La presente invención se refiere a métodos para determinar el cambio en el repertorio inmunitario de un individuo que padece una enfermedad o que recibe tratamiento para dicha enfermedad. Los métodos utilizan la diferencia entre el cambio en el nivel de diversidad de células inmunitarias observado en un individuo antes, durante o después de un evento de salud para determinar el efecto de la enfermedad o de un régimen de tratamiento en el individuo. La diferencia en el nivel de diversidad de células inmunitarias se denomina Índice Delta y se define como el cambio cuantitativo y cualitativo (ganancia o pérdida de clones) de las células inmunitarias más dinámicas de un individuo a lo largo del tiempo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para medir un cambio en el repertorio inmunitario de un individuo
Referencia cruzada a solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 62/129,706, titulada "Method for Measuring a Change in an Individual's Immunorepertoire" y presentada el 6 de marzo de 2015.
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a procedimientos para calcular un cambio en el repertorio inmunitario de un individuo.
Antecedentes de la invención
A través del proceso de homeostasis, el sistema inmunitario mantiene un cierto número y repertorio de linfocitos T y B, denominados colectivamente "repertorio inmunitario" de un individuo. Sin embargo, el repertorio inmunitario de un individuo cambia constantemente, como resultado del recambio celular continuo y la exposición a antígenos. Tales cambios en el repertorio inmunitario pueden incluir, por ejemplo, la generación de nuevos linfocitos T y B (vírgenes), la expansión de linfocitos T y B activos y la formación de nuevos linfocitos T y B de memoria.
Las inmunoterapias y las terapias celulares se están convirtiendo en herramientas cada vez más populares para el tratamiento del cáncer y las enfermedades autoinmunitarias. Las inmunoterapias pueden incluir tratamientos con anticuerpos para modular las vías inmunitarias o para reforzar la respuesta inmunitaria de un paciente a una enfermedad. Las terapias celulares pueden incluir la exposición de la sangre o los glóbulos blancos de un paciente a un antígeno de la enfermedad ex vivo y subsecuentemente la reintroducción de la sangre o los glóbulos blancos tratados al paciente. Si bien los procedimientos convencionales utilizan moléculas pequeñas sintéticas para dirigirse a vías de enfermedad particulares, las inmunoterapias y las terapias celulares pueden actuar educando el sistema inmunitario de un paciente para combatir la enfermedad.
Cuando se está en un estado de enfermedad, o durante el tratamiento de dicho estado de enfermedad, el sistema inmunitario de un paciente se moviliza para combatir la enfermedad. Como resultado, la tasa de recambio del repertorio inmunitario puede cambiar. Una medición de tal cambio puede dar una indicación de la eficacia del tratamiento. Sin embargo, actualmente no hay herramientas o procedimientos disponibles que permitan a los científicos o médicos medir la tasa de recambio del repertorio inmunitario; los procedimientos actuales, tales como los recuentos de glóbulos blancos y la citometría de flujo, no son ideales. La medición del recuento de glóbulos blancos de un paciente proporciona solo el número total de linfocitos o el número de células que pertenecen a la categoría de linfocitos, y la citometría de flujo permite la clasificación de linfocitos T y B en base a marcadores de superficie. Sin embargo, ninguno de estos procedimientos proporciona una medición exacta de la tasa de recambio del repertorio inmunitario. Como tal, los procedimientos actuales no son ideales para la evaluación de los resultados terapéuticos de las terapias, tales como las inmunoterapias, la generación de marcadores para el precribado de pacientes y la identificación de aquellos pacientes más adecuados para una terapia particular. Por lo tanto, se necesita una herramienta para clasificar los linfocitos T y B a nivel de célula individual en base a los receptores de linfocitos T o B expresados diferencialmente y un procedimiento para utilizar esta información para determinar un cambio en el repertorio inmunitario de un individuo. El documento US 2014/235478 se refiere a la medición y comparación de la diversidad inmunitaria mediante secuenciación de alto rendimiento. El documento WO 2014/008448 se refiere a la evaluación cuantitativa de la recuperación del repertorio de células T humanas después del trasplante de células madre hematopoyéticas alogénicas. El documento WO 2013/036459 se refiere a medidas basadas en secuencias de la respuesta inmunitaria. El documento US 2014/065629 se refiere a procedimientos para tratar enfermedades, los procedimientos comprenden el daño tumoral deliberado y la secuenciación del repertorio de células T antes y después del daño para detectar y secuenciar los loci de TCR alfa y beta de clonotipos de células T altamente expandidos. El documento WO 2014/189635 se refiere al seguimiento de TCR reactivo al donante como un biomarcador en el trasplante. Wang y otros, divulgan que la secuenciación de alto rendimiento revela un patrón complejo de interrelaciones dinámicas entre los subconjuntos de células T humanas. El documento WO 2016/086029 se refiere a la caracterización de la respuesta inmunitaria adaptativa a la vacunación o infección mediante el uso de la secuenciación del repertorio inmunitario. El documento WO 2014/124451 se refiere a un procedimiento para evaluar un repertorio inmunitario.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para calcular el cambio en el repertorio inmunitario de un paciente, que comprende las etapas de:
(a) cuantificar los clonotipos de CDR3 de células inmunitarias en una población o subpoblación de células inmunitarias en una primera muestra y una segunda muestra recogida del mismo paciente;
(b) calcular los datos de frecuencia para la primera muestra y la segunda muestra mediante la identificación de la frecuencia de cada clonotipo de CDR3;
(c) normalizar los datos de frecuencia para la primera muestra y la segunda muestra;
(d) determinar la diferencia absoluta en la frecuencia de cada clonotipo de CDR3 presente en la primera muestra y la segunda muestra;
(e) determinar al menos 100 clonotipos de CDR3 comunes a la primera muestra y la segunda muestra con el mayor cambio de frecuencia;
(f) determinar un parámetro de alcance de impacto que se obtiene mediante el cálculo del porcentaje del repertorio inmunitario del paciente al que contribuyen los al menos 100 clonotipos de CDR3; y
(g) determinar un parámetro de índice delta mediante el cálculo del porcentaje total de los clonotipos de CDR3 dentro del alcance de impacto que exhiben una diferencia de frecuencia entre la primera y segunda muestras;
en el que la primera y segunda muestras comprenden glóbulos blancos; en el que el índice delta se calcula a partir de dos muestras recogidas en diferentes períodos de tiempo, y en el que el índice delta proporciona una medición de la diferencia en el nivel de diversidad de células inmunitarias en las dos muestras en los diferentes períodos de tiempo. En determinadas realizaciones, la tasa de cambio en el repertorio inmunitario se determina en un punto de tiempo antes, durante o después de un evento de salud. Los procedimientos divulgados en la presente permiten el análisis de una gran cantidad de datos de secuenciación mientras eliminan las inconsistencias en la obtención de muestras y la secuenciación que anteriormente hacían imposible el cálculo de los cambios en el repertorio inmunitario.
Breve descripción de las figuras
La divulgación puede entenderse mejor con referencia a las siguientes figuras.
La Figura 1 es una ilustración de los datos de secuenciación de CDR3 primarios obtenidos de pacientes en diferentes puntos de tiempo.
La Figura 2 ilustra los cálculos utilizados para determinar los datos de secuencia normalizados: La columna A representa los datos de secuencia primarios y las columnas B y C representan los datos normalizados.
La Figura 3 representa el cálculo utilizado para determinar el índice delta de dos muestras recogidas del mismo paciente: la columna D representa la diferencia absoluta entre las frecuencias de cada recuento de lectura de CDR3 en cada muestra; la columna E representa el cálculo del alcance de impacto de las dos muestras; y la columna F representa el cálculo del índice delta para las dos muestras.
La Figura 4 representa la optimización de la señal para las muestras: la columna H representa el cálculo de la relación señal a ruido para un alcance de impacto de 100; la columna I representa el cálculo de la relación señal a ruido para un alcance de impacto de 1.000; y la columna J representa el cálculo de la relación señal a ruido para un alcance de impacto de 10.000.
La Figura 5 ilustra el índice delta calculado para varios grupos de muestra: el grupo A representa una única muestra tomada de un paciente, donde la muestra se divide en dos submuestras; el grupo B representa múltiples muestras tomadas del mismo individuo en el mismo punto de tiempo; el grupo C representa muestras tomadas del mismo individuo en dos puntos de tiempo diferentes con un intervalo de uno o dos días; el grupo D representa muestras tomadas del mismo individuo en dos puntos de tiempo diferentes con un intervalo de tres meses; y el grupo E representa muestras tomadas de diferentes individuos en diferentes puntos de tiempo. En esta situación, se espera que el índice delta esté cerca del 100 %.
Descripción detallada de la invención
El inventor ha desarrollado un procedimiento para calcular el cambio en el repertorio inmunitario de un individuo; el individuo puede ser uno que padece una enfermedad o se somete a una terapia para el tratamiento de una enfermedad. El procedimiento usa la diferencia entre el nivel de diversidad de células inmunitarias observada en un individuo, por ejemplo antes, durante o después de un evento de salud; esta diferencia puede usarse para determinar el efecto de una enfermedad, o el efecto de un régimen de tratamiento, en el individuo. Tal evento de salud puede incluir una ocurrencia natural (es decir, el inicio de una enfermedad) o una ocurrencia artificial (es decir, el inicio del tratamiento de la enfermedad). La diferencia en el nivel de diversidad de células inmunitarias se denomina índice delta. El índice delta se define como en la reivindicación 1; representa un cambio cuantitativo (regulación positiva o negativa de CDR3) y un cambio cualitativo (ganancia o pérdida de clones) de las células inmunitarias más dinámicas de un individuo a lo largo del tiempo. La tercera región determinante de complementariedad (CDR3) es una región cuya secuencia de nucleótidos es única para cada clon de células T o B. Las células inmunitarias más dinámicas dentro del sistema inmunitario de un individuo se denominan alcance de impacto del repertorio inmunitario. El alcance de impacto se define como en la reivindicación 1. El alcance de impacto puede incluir otros números de clones, por ejemplo, los 1.000 o 10.000 clones que muestran el mayor cambio. Como se usa en la presente memoria, "células inmunitarias" se refiere a linfocitos T y/o linfocitos B.
También se divulga un procedimiento para evaluar la tasa de recambio en las células inmunitarias más dinámicas de un individuo a lo largo del tiempo que comprende las siguientes etapas: (a) recoger al menos dos poblaciones de muestra de glóbulos blancos de un sujeto; (b) amplificar por separado polinucleótidos de cada población de glóbulos blancos en una mezcla de reacción que comprende cebadores anidados específicos de la diana para producir un conjunto de primeros amplicones, al menos una porción de los cebadores anidados específicos de la diana comprenden nucleótidos adicionales que, durante la amplificación, sirven como plantilla para incorporar en los primeros amplicones un sitio de unión para al menos un cebador común; (c) transferir por separado una porción de cada una de las primeras mezclas de reacción que contienen los primeros amplicones a segundas mezclas de reacción que comprenden al menos un cebador común; (d) para cada población, amplificar, mediante el uso del al menos un cebador común, los primeros amplicones para producir un conjunto de segundos amplicones; (e) secuenciar cada uno de los segundos amplicones para identificar la frecuencia de regiones CDR3 específicas presentes en la muestra; (f) normalizar los datos de frecuencia de CDR3; (g) comparar los datos de frecuencia de CDR3 normalizados de la primera muestra y la segunda muestra para determinar la diferencia absoluta entre la frecuencia de cada secuencia de CDR3; (h) determinar las secuencias de CDR3 comunes a la primera muestra y la segunda muestra con los mayores cambios de frecuencia; y (i) determinar las secuencias de la etapa (h) con el mayor grado de cambio. Como se usa en la presente memoria, "sujeto" significa un ser humano o un animal.
Anteriormente, ha sido difícil evaluar el sistema inmunitario de manera amplia, ya que el número y la variedad de células en un sistema inmunitario humano o animal es tan grande que la secuenciación de más de un subconjunto pequeño de células ha sido poco práctica. El inventor desarrolló un procedimiento de PCR semicuantitativa (PCR de brazo, descrito con más detalle en la patente de Estados Unidos núm. 7,999,092), que proporciona una mayor sensibilidad y especificidad con respecto a procedimientos disponibles anteriormente, mientras produce resultados semicuantitativos. Es esta capacidad de aumentar la especificidad y sensibilidad, y de esta manera aumentar el número de dianas detectables dentro de una sola muestra, lo que hace que el procedimiento sea ideal para detectar cantidades relativas de clonotipos del repertorio inmunitario. El inventor ha descubierto más recientemente que el uso de este procedimiento de secuenciación le permite comparar el cambio, o la tasa de recambio, del repertorio inmunitario de sujetos individuales, lo que ha conducido al desarrollo del presente procedimiento. El procedimiento se ha usado para evaluar sujetos que están sometidos a tratamiento para una enfermedad particular, por ejemplo, cáncer. El inventor ha demostrado que un cambio en la diversidad del repertorio inmunitario puede detectarse fácilmente mediante el uso de los procedimientos de la invención. Por lo tanto, estos procedimientos pueden ser útiles como indicadores de la eficacia del tratamiento, tanto como se usan actualmente los recuentos de células y las pruebas bioquímicas en la práctica clínica.
Los clonotipos de un repertorio inmunitario se determinan por la reorganización de segmentos génicos variables (V), diversos (D) y de unión (J) a través de la recombinación somática en las primeras etapas de la producción de inmunoglobulinas (Ig) y receptores de células T (TCR) del sistema inmunitario. La reorganización V(D)J puede amplificarse y detectarse a partir de las cadenas alfa, beta, gamma y delta de los receptores de células T, así como también a partir de la cadena pesada (IgH) y las cadenas ligeras (IgK, IgL) de las inmunoglobulinas. Las células pueden obtenerse de un paciente mediante la obtención de sangre periférica, tejido linfoide, tejido canceroso, o tejido o fluidos de otros órganos y/o sistemas de órganos, por ejemplo. Las técnicas para obtener estas muestras, tales como las muestras de sangre, son conocidas para los expertos en la técnica. "Cuantificación de clonotipos", como se usa en la presente memoria, significa contar, u obtener una aproximación confiable de, las cantidades de células que pertenecen a un clonotipo particular. El recuento de células puede extrapolarse a partir del número de secuencias detectadas mediante amplificación por PCR y secuenciación.
La región CDR3, que comprende aproximadamente 30-90 nucleótidos, abarca la unión de los segmentos variables (V), de diversidad (D) y de unión (J) del gen. Codifica la especificidad de unión del receptor y es útil como una etiqueta de secuencia para identificar las reorganizaciones V(D)J únicas.
La PCR de brazo puede usarse para la amplificación de regiones CDR3 de células T, células B y/o subgrupos de células T o B. El término "población" de células, como se usa en la presente memoria, por lo tanto, abarca lo que generalmente se denomina "poblaciones" o "subpoblaciones" de células. Después, las grandes cantidades de productos amplificados pueden secuenciarse eficientemente mediante el uso de plataformas de secuenciación de nueva generación.
El procedimiento de PCR de brazo proporciona una amplificación semicuantitativa altamente sensible de múltiples polinucleótidos en una reacción. El procedimiento de PCR de brazo también puede realizarse mediante procedimientos automatizados en un sistema de cassette cerrado (iCubate®, Huntsville, Alabama), que es beneficioso en el presente procedimiento porque los repertorios de varias células T y B, por ejemplo, son muy grandes. En el procedimiento de PCR de brazo, las cantidades de diana aumentan en una reacción impulsada por la ADN polimerasa, lo que es el resultado de que los cebadores específicos de diana se introduzcan en la reacción. Un resultado adicional de esta reacción de amplificación es la introducción de sitios de unión para cebadores comunes que se usarán en una amplificación posterior mediante la transferencia de una porción de la primera mezcla de reacción que contiene el primer conjunto de amplicones a una segunda mezcla de reacción que comprende cebadores comunes. "Al menos un cebador común", como se usa en la presente memoria, se refiere a al menos un cebador que se unirá a dicho sitio de unión, e incluye pares de cebadores, tales como cebadores directos e inversos. Esta transferencia puede realizarse ya sea mediante la recuperación de una porción de la mezcla de reacción de la primera reacción de amplificación e introduciendo esa muestra en un segundo tubo o cámara de reacción, o la extracción de una porción del líquido de la primera amplificación completada, dejando atrás una porción, y la adición de reactivos frescos al tubo en el que se realizó la primera amplificación. En cualquier caso, tampones, polimerasa, etc. adicionales, se pueden añadir después junto con los cebadores comunes para producir productos amplificados para su detección. La amplificación de moléculas diana mediante el uso de cebadores comunes da un resultado semicuantitativo en el que las cantidades cuantitativas de dianas amplificadas en la primera amplificación se amplifican mediante el uso de cebadores comunes, en lugar de cebadores específicos de diana, lo que hace posible producir cantidades significativamente mayores de dianas para su detección y determinar las cantidades relativas de células que comprenden varias reorganizaciones dentro de la muestra de sangre de un paciente. Además, la combinación de la segunda mezcla de reacción con una porción de la primera mezcla de reacción permite añadir mayores concentraciones de cebadores específicos de diana a la primera mezcla de reacción, lo que da como resultado una mayor sensibilidad en la primera reacción de amplificación. Es la combinación de especificidad y sensibilidad, junto con la capacidad de lograr resultados cuantitativos mediante el uso de un procedimiento tal como el procedimiento de<p>C<r>de brazo que permite una evaluación suficientemente sensible y cuantitativa del tipo y cantidad de clonotipos en una población de células para producir un índice delta que es de uso diagnóstico.
La expansión clonal debido al reconocimiento del antígeno da como resultado una población más grande de células que reconocen ese antígeno particular, y la evaluación de las células por sus cantidades relativas proporciona un procedimiento para determinar si una exposición al antígeno ha influido en la expansión de células B productoras de anticuerpos o células T portadoras de receptores. Esto es útil para evaluar si puede haber una población particular de células predominante en individuos que se han diagnosticado con una enfermedad particular. Por ejemplo, el procedimiento puede ser especialmente útil para evaluar si un tratamiento o vacuna ha logrado o no la respuesta inmunitaria deseada en individuos a los que se les ha administrado el tratamiento o vacuna.
Los cebadores para amplificar y secuenciar regiones variables de células del sistema inmunitario están disponibles comercialmente y se han descrito en publicaciones tales como las solicitudes de patente publicadas del inventor WO2009137255 y US201000021896A1.
Existen varias tecnologías de secuenciación de alto rendimiento disponibles comercialmente, tales como el sistema de secuenciación 454 de Hoffman-LaRoche, Inc. En el procedimiento de secuenciación 454°, por ejemplo, el adaptador A y B se unen a los productos de PCR ya sea durante la PCR o se ligan después de la reacción de PCR. Los adaptadores se usan para las etapas de amplificación y secuenciación. Cuando se realiza junto con la técnica de PCR de brazo, los adaptadores A y B pueden usarse como cebadores comunes (que a veces se denominan "cebadores comunitarios" o "supercebadores") en las reacciones de amplificación. Después de que los adaptadores A y B se hayan unido físicamente a una biblioteca de muestras (tal como los amplicones de<p>C<r>), se prepara una biblioteca de ADN monocatenario mediante el uso de técnicas conocidas para los expertos en la técnica. La biblioteca de ADN monocatenario se inmoviliza sobre perlas de captura de ADN diseñadas específicamente. Cada perla porta un fragmento de biblioteca de ADN monocatenario único. La biblioteca unida a perlas se emulsiona con reactivos de amplificación en una mezcla de agua en aceite, que produce microrreactores, cada uno de los cuales contiene solo una perla con un fragmento de biblioteca de muestras únicas. Cada fragmento de la biblioteca de muestras únicas se amplifica dentro de su propio microrreactor, que excluye secuencias competidoras o contaminantes. La amplificación de toda la colección de fragmentos se realiza en paralelo. Para cada fragmento, esto da como resultado números de copias de varios millones por perla. Subsecuentemente, la PCR en emulsión se rompe mientras que los fragmentos amplificados permanecen unidos a sus perlas específicas. Los fragmentos amplificados clonalmente se enriquecen y se cargan en un dispositivo PicoTiterPlate® para la secuenciación. El diámetro de los pocillos del PicoTiterPlate® permite solo una perla por pocillo. Después de la adición de las enzimas de secuenciación, en el subsistema de fluidos del instrumento de secuenciación fluyen nucleótidos individuales en un orden fijo a través de los cientos de miles de pocillos, cada uno de los cuales contiene una sola perla. La adición de uno (o más) nucleótido(s) complementario(s) a la hebra molde da como resultado una señal quimioluminiscente registrada por una cámara CCD dentro del instrumento. La combinación de intensidad de la señal e información de posición generada a través del dispositivo PicoTiterPlate® permite que el software determine la secuencia de más de 1.000.000 de lecturas individuales, cada una es de hasta aproximadamente 450 pares de bases, con el sistema GS FLX.
En una realización de la invención, la información de secuenciación de la región CDR3 de células T, células B y/o subconjuntos de células T o B se obtiene de un solo paciente. Como se ilustra en la Figura 1, estas células pueden recogerse en diferentes puntos de tiempo. Por ejemplo, pueden recogerse múltiples muestras del mismo paciente en el mismo punto de tiempo (PAT1S1, PAT1S2). En esta realización, las muestras se recogen antes del comienzo de un régimen de tratamiento. Como se describirá con más detalle más abajo, el análisis de la información de secuencia de muestras tomadas en el mismo punto de tiempo permite el establecimiento de una tasa de recambio del repertorio inmunitario de referencia o de referencia de las células inmunitarias más dinámicas del paciente. Los procedimientos de la invención se practican en muestras recogidas del mismo paciente en diferentes puntos de tiempo (PAT1S1, PAT2S1) (Figura 1). En una realización, las muestras pueden recogerse antes, durante y después de un régimen de tratamiento, cuyo momento puede ser dictado por el médico del paciente. El análisis de esta información de secuencia permite determinar un cambio en la tasa de recambio del repertorio inmunitario de las células inmunitarias más dinámicas del paciente como resultado del régimen de tratamiento.
Las diferencias en la forma en que se recoge la muestra, el número de células recogidas, el número de lecturas de secuenciación obtenidas (es decir, el número de secuencias obtenidas de una muestra) y el número de secuencias de CDR3 muestreadas hacen que la comparación de dos muestras sea imposible sin primero normalizar las muestras a un recuento de lecturas común. Por lo tanto, debe establecerse una referencia como base de comparación para las mediciones posteriores. Por lo tanto, después de obtener las secuencias mediante el uso de un procedimiento cuantitativo y/o semicuantitativo, los datos se normalizan para tener en cuenta tales diferencias.
Las Figuras 2 y 3 ilustran el proceso de cálculo del cambio de referencia en el repertorio inmunitario. La columna A de la Figura 2 representa los datos de secuencia primarios para varias regiones CDR3 de una población de células inmunitarias de una primera muestra de paciente. Como es evidente en la columna A, cada secuencia génica detectada tiene una frecuencia acompañante de 10 millones (lecturas). En una realización de la invención, cada muestra se normaliza a 10 millones de lecturas para tener en cuenta estas discrepancias. En esta realización, se obtiene un recuento de lecturas normalizado multiplicando el recuento de lecturas (es decir, el número de veces que se detecta cada secuencia de CDR3 única en la muestra) para cada secuencia de CDR3 por un factor de normalización (10 millones/número total de lecturas para la muestra) (columna B), que después se divide por 10 millones (columna C). Aunque el presente ejemplo normaliza el recuento de lecturas a 10 millones, el recuento puede normalizarse a otras concentraciones celulares en otras realizaciones.
Para establecer una tasa de recambio del repertorio de referencia para un individuo, los datos de secuencia normalizados de dos muestras recogidas en un único período de tiempo (PAT1S1 y PAT1S2) se comparan después. Con referencia ahora a la Figura 3, se determina la diferencia absoluta entre las frecuencias de cada recuento de lectura de CDR3 en cada muestra (columna D). Debido a que el presente procedimiento se usa para determinar el cambio en el repertorio inmunitario de un individuo, todos los cambios cuantitativos (es decir, el aumento o disminución en la frecuencia de una secuencia de CDR3 única) se incluyen en estos cálculos. En una realización adicional, la diferencia absoluta entre las frecuencias de cada secuencia de CDR3 también incluirá cambios cualitativos. Por ejemplo, el hecho de que una secuencia de CDR3 específica pueda estar presente en la primera muestra pero ausente de la segunda muestra (o viceversa) estará en los cálculos para determinar la diferencia absoluta en la diversidad de clonotipos entre las dos muestras.
Con referencia nuevamente a la Figura 3, la siguiente etapa para determinar la tasa de recambio del repertorio inmunitario de referencia para un paciente incluye el cálculo del alcance de impacto de las dos muestras (columna E). Como se usa en la presente memoria, el alcance de impacto se calcula al determinar el porcentaje del repertorio inmunitario del paciente al que contribuyen los clones más dinámicos, como se define además en la reivindicación 1. Es necesario determinar el alcance de impacto para que se eliminen las diferencias en la obtención de muestras entre las dos poblaciones. Como se describió anteriormente, tales inconsistencias en la obtención de muestras pueden incluir, por ejemplo, diferencias en el número de células incluidas en la muestra de paciente, diferencias en la eficiencia de amplificación durante la PCR de brazo, introducción de sesgo de secuenciación y diferencias en la profundidad de secuenciación. La presencia de estas variables de muestra hace que sea imposible comparar la variabilidad de la frecuencia entre las dos poblaciones. Normalizar los datos de secuenciación a 10 millones de lecturas, como se describió anteriormente, ayuda a eliminar algunas de estas inconsistencias. Sin embargo, deben realizarse etapas adicionales, tales como calcular el alcance de impacto, para permitir el análisis de la gran cantidad de datos de secuenciación y permitir la comparación directa de las dos muestras. Las variables analizadas anteriormente enmascararán cualquier cambio de frecuencia y harán que dicha comparación sea imposible. El alcance de impacto se determina mediante el cálculo del por ciento del repertorio inmunitario del paciente al que contribuyen los 100 clones de CDR3 con la mayor diferencia de frecuencia entre las muestras, como se define en la reivindicación 1. Como se ilustra en la Figura 4, pueden incluirse otras cantidades de clones en el cálculo del alcance de impacto en otras realizaciones, por ejemplo, los 1.000 o 10.000 clones con la mayor diferencia de frecuencia entre las muestras.
En la siguiente etapa ilustrada en la Figura 3, columna F, el índice delta se calcula para las dos muestras. Como se usa en la presente memoria, el índice delta es como se define en la reivindicación 1; representa el porcentaje total de los clones de CDR3 secuenciados dentro del alcance de impacto que exhiben una diferencia de frecuencia entre la primera y segunda muestras. En el ejemplo ilustrado en la Figura 4, columna H, el alcance de impacto de las muestras 1 y 2 (promediado) es de 7,27 %, lo que indica que los 100 clones de CDR3 más dinámicos constituyen el 7,27 % del repertorio inmunitario secuenciado del paciente. En la etapa final, el índice delta se calcula para las dos muestras. En esta realización, el índice delta es el porcentaje de los clones de CDR3 incluidos en el alcance de impacto que ha cambiado entre la muestra 1 y la muestra 2. Como se ilustra en la Figura 4, columna H, el índice delta de 6,53 % es un cálculo del recambio de repertorio inmunitario de referencia para el paciente, calculado a partir de dos muestras recogidas en el mismo punto de tiempo, por ejemplo, antes del inicio de un evento de salud.
Después de establecer la tasa de recambio del repertorio inmunitario de referencia, el índice delta puede calcularse para dos muestras recogidas en diferentes períodos de tiempo. En una realización, una primera muestra puede recogerse antes del inicio del tratamiento y una segunda muestra puede recogerse durante, o después de que se complete el tratamiento. Como se ilustra en la Figura 4, los datos de secuencia de CDR3 primarios de dos muestras recogidas en diferentes puntos de tiempo (PAT1S1 y PAT2S1): (1) se normalizan; (2) se calcula la diferencia absoluta entre las frecuencias calculadas; (3) se calcula el alcance de impacto de las dos muestras; y (4) se determina el índice delta para las dos muestras. Estas etapas se realizan de la misma manera que se describió anteriormente con respecto a las Figuras 2-4 (es decir, de la misma manera que en el cálculo del índice delta de referencia). Como se ilustra además en la Figura 4, la relación señal-ruido del cálculo del índice delta puede determinarse entonces mediante la comparación del índice delta de referencia con el índice delta experimental, como se ilustra mediante el siguiente cálculo:
Señal/Ruido = Índice Delta (PAT1S1-PAT2S2) / Índice Delta (PAT1S1-PAT2S2)
En la realización ilustrada en la Figura 4, la selección de un alcance de impacto de 100 produce la relación señal-ruido más baja y proporciona resultados con menos ruido.
La presente invención permite el cálculo de la tasa del repertorio de las células inmunitarias más dinámicas. Las etapas del procedimiento implican la manipulación de grandes cantidades de datos de secuencia, por ejemplo, cuando se normalizan los tamaños de muestra, se obtienen valores de frecuencia para cada CDR3, se obtienen cambios de frecuencia absolutos y se calculan los alcances de impacto. Estos cálculos son necesarios para tener en cuenta que algunos clones pueden estar regulados positivamente durante un evento de salud, otros pueden estar regulados negativamente, algunos clones pueden desaparecer en un segundo punto de tiempo y algunos clones nuevos pueden aparecer en un punto de tiempo diferente. La presente invención supera estos problemas mediante la determinación de los cambios generales del repertorio y la cuantificación de los cambios asociados con cada CDR3. Los presentes procedimientos permiten el análisis de una gran cantidad de datos de secuenciación mientras eliminan las inconsistencias de la obtención de muestras y la secuenciación que anteriormente hacían imposible la comparación de los cambios en el repertorio inmunitario.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Cálculos del índice delta para muestras de pacientes
Se recogieron dos muestras de sangre total de cada uno de dos individuos sanos a intervalos de tres meses. Se realizaron dos protocolos de secuenciación de nueva generación (NGS) en las muestras de cada individuo. El ARN se extrajo de, en promedio, 1 millón de células, y se usó la PCR de brazo para generar la biblioteca de NGS. La secuenciación se realizó mediante el uso del instrumento Illumina HiSeq®.
La Figura 5 ilustra el índice delta calculado para varios grupos de muestra:
El grupo A representa una única muestra tomada de un paciente, donde la muestra se divide en dos submuestras. El índice delta es 0,00 % para esta población porque las dos muestras se recogieron en el mismo punto de tiempo sin variación de la muestra.
El grupo B representa múltiples muestras tomadas del mismo individuo en el mismo punto de tiempo. El cambio en el repertorio (índice delta) se mide entre 3,88 % y 6,53 %. Estos tipos de muestras son útiles para calcular el cambio en el repertorio de referencia para un individuo.
El grupo C representa muestras tomadas del mismo individuo en dos puntos de tiempo diferentes con un intervalo de uno o dos días. Estos cambios en el repertorio calculados pueden variar entre 0 % y 100 % y son útiles para determinar los cambios en el repertorio provocados por un evento de salud.
El grupo D representa muestras tomadas del mismo individuo en dos puntos de tiempo diferentes con un intervalo de tres meses. Estos cambios en el repertorio calculados pueden variar entre 0 % y 100 % y son útiles para determinar los cambios en el repertorio provocados por un evento de salud.
El grupo E representa muestras tomadas de diferentes individuos en diferentes puntos de tiempo. En esta situación, se espera que el índice delta esté cerca del 100 %.
Ejemplo 2: Muestras de pacientes sanos
Se recogieron dos muestras de sangre total de cada uno de 19 individuos sanos a intervalos de tres meses. Se realizaron dos protocolos de NGS en las muestras de cada individuo. El ARN se extrajo de, en promedio, 1 millón de células, y se usó la PCR de brazo para generar la biblioteca de NGS. La secuenciación se realizó mediante el uso del instrumento Illumina HiSeq®. En promedio, se secuenciaron 5 millones de moléculas de receptor de células T para cada muestra (10 millones de lecturas totales por individuo). Se obtuvieron aproximadamente de 100.000 a 300.000 secuencias de CDR3 únicas de cada muestra.
La Tabla 1 ilustra los resultados del análisis de cerca de 200 millones de lecturas de secuencia (una lectura = una molécula), que incluye el índice delta calculado, con un intervalo de 5,52 % a 23,33 %, con un promedio de 13 %.
Tabla 1. Índice delta calculado
Ejemplo 3: Muestras de cáncer de mama
Las muestras se obtuvieron de 12 pacientes con cáncer de mama que se sometieron a tratamiento neoadyuvante, es decir, quimioterapia antes de la cirugía para reducir la carga tumoral antes de la cirugía.
Las muestras de sangre periférica se recogieron antes y después del tratamiento. Se realizaron dos protocolos de NGS en las muestras de cada individuo. El ARN se extrajo de, en promedio, 1 millón de células, y se usó la PCR de brazo para generar la biblioteca de NGS. La secuenciación se realizó mediante el uso del instrumento Illumina HiSeq®. Como se ilustra en la Tabla 2, el intervalo del índice delta calculado fue de 20,49 % a 97 %, con un promedio de 58,85 %.
Tabla 2: Indice delta calculado
Estos intervalos de índice delta calculados indican una tasa de recambio del repertorio significativamente mayor en comparación con la observada en individuos sanos (Tabla 1). El cálculo de la tasa de recambio en el repertorio inmunitario, mediante el uso de las metodologías descritas en la presente memoria, ofrece varias ventajas en comparación con los procedimientos actuales. Las metodologías divulgadas en la presente memoria pueden, por ejemplo, ayudar a evaluar los resultados del tratamiento o a indicar el inicio de un estado de enfermedad.
Las metodologías y las diversas realizaciones de estas descritas en la presente memoria son ilustrativas. Son posibles diversas realizaciones adicionales de las metodologías descritas en la presente memoria.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un procedimiento para calcular el cambio en el repertorio inmunitario de un paciente, que comprende las etapas de:
    (a) cuantificar los clonotipos de CDR3 de células inmunitarias en una población o subpoblación de células inmunitarias en una primera muestra y una segunda muestra recogida del mismo paciente;
    (b) calcular los datos de frecuencia para la primera muestra y la segunda muestra mediante la identificación de la frecuencia de cada clonotipo de CDR3;
    (c) normalizar los datos de frecuencia para la primera muestra y la segunda muestra;
    (d) determinar la diferencia absoluta en la frecuencia de cada clonotipo de CDR3 presente en la primera muestra y la segunda muestra;
    (e) determinar al menos 100 clonotipos de CDR3 comunes a la primera muestra y la segunda muestra con el mayor cambio de frecuencia;
    (f) determinar un parámetro de alcance de impacto que se obtiene mediante el cálculo del porcentaje del repertorio inmunitario del paciente al que contribuyen los al menos 100 clonotipos de CDR3; y
    (g) determinar un parámetro de índice delta mediante el cálculo del porcentaje total de los clonotipos de CDR3 dentro del alcance de impacto que exhiben una diferencia de frecuencia entre la primera y segunda muestras;
    en el que la primera y segunda muestras comprenden glóbulos blancos;
    en el que el índice delta se calcula a partir de dos muestras recogidas en diferentes períodos de tiempo, y en el que el índice delta proporciona una medición de la diferencia en el nivel de diversidad de células inmunitarias en las dos muestras en los diferentes períodos de tiempo.
    El procedimiento como se reivindicó en la reivindicación 1, en el que el índice delta se calcula primero a partir de dos muestras recogidas en el mismo punto de tiempo, en el que el índice delta es un cálculo del recambio del repertorio inmunitario de referencia para el paciente.
    El procedimiento como se reivindicó en la reivindicación 1, en el que los al menos 100 clonotipos de CDR3 son 100, 1.000 o 10.000 clonotipos de CDR3.
    El procedimiento como se reivindicó en la reivindicación 1, en el que la etapa (f) comprende:
    (f) determinar un parámetro de alcance de impacto que se obtiene mediante el cálculo del porcentaje del repertorio inmunitario del paciente al que contribuyen los 100 mejores clonotipos de CDR3.
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