ES2987603T3 - Regulación genética de la respuesta inmunitaria por interacciones cromosómicas - Google Patents
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Abstract
Un proceso para analizar regiones cromosómicas e interacciones relacionadas con la inmunorrespuesta. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Regulación genética de la respuesta inmunitaria por interacciones cromosómicas
Campo de la invención
La invención se refiere a la detección de interacciones cromosómicas.
Antecedentes de la invención
Los procesos patológicos son complejos y los resultados pueden predecirse mediante el uso de los métodos disponibles. En particular, es difícil predecir cómo los pacientes reaccionarán a terapias específicas. El documento WO 2016/207661 describe un proceso de analizar regiones del genoma epigenéticamente activas. El documento WO 2016/207653 describe un método para determinar las interacciones cromosómicas epigenéticas que son relevantes para un diagnóstico complementario.
Resumen de la invención
Las firmas de conformación cromosómica específicas (CCS) en los loci existen o están ausentes debido a los entornos de control epigenético regulatorio asociados con la patología o el tratamiento. Las CCS tienen tasas de variación leves y, cuando representan un fenotipo o patología particular, solo cambiarán con una transición señalizada fisiológicamente a un nuevo fenotipo, o como resultado de una intervención externa. Además, la medición de estos eventos es binaria, por lo que esta lectura contrasta marcadamente con la lectura continua de niveles variables de metilación del ADN, modificaciones de histonas y la mayoría de los ARN no codificantes. La lectura continua usada hasta la fecha para la mayoría de los biomarcadores moleculares ofrece un desafío para el análisis de datos, ya que la magnitud del cambio para biomarcadores particulares varía mucho de un paciente a otro, lo que causa problemas para las estadísticas de clasificación cuando se usan para para estratificar cohortes de pacientes. Estas estadísticas de clasificación se adaptan mejor al uso de biomarcadores que carecen de magnitud y ofrecen sólo una puntuación binaria de "sí o no" de diferencias fenotípicas, lo que significa que los biomarcadores de conformación cromosómica (EpiSwitch™) son un recurso excelente para posibles biomarcadores de diagnóstico, pronóstico y predicción.
Los inventores han identificado regiones del genoma con interacciones cromosómicas relevantes para la capacidad de respuesta inmunitaria mediante el uso de un enfoque que permite la identificación de subgrupos en una población. Se ha descubierto que las regiones, los genes y las interacciones cromosómicas específicas identificados en dos estudios distintos en los que se utilizaron terapias diferentes para tratar dos afecciones distintas, determinan la capacidad de respuesta inmunitaria general en un paciente, que incluye por la vía de señalización de la superficie celular que regula la respuesta inmunitaria y la regulación de la activación de las células T. El trabajo de los inventores permite seguir los cambios en la capacidad de respuesta inmunitaria, por ejemplo, durante el curso de una enfermedad o terapia.
En consecuencia, la invención proporciona un proceso para determinar cuánto es capaz de responder un individuo a la terapia anti-PD-1 o anti-PD-L1 que comprende determinar si al menos 10 interacciones cromosómicas están presentes o ausentes en el individuo,
en donde dichas al menos 10 interacciones cromosómicas corresponden a cualquiera de las 10 interacciones cromosómicas representadas por cualquier sonda que se muestra en la Tabla 1,
y en donde se determina la presencia o ausencia de al menos la interacción cromosómica ORF712_9_120888366_120893320_120913546_120919710_RR correspondiente a la secuencia de sonda AGTGCTGGTTCCACACCTCTCAGCTCTTCGACCTCCAGGTCCCCCGCCACTTCCACGGC.
Descripción detallada de la invención
Aspectos de la Invención
La invención se refiere a un panel de marcadores epigenéticos que se relacionan con la regulación del sistema inmunitario, en particular a través de vías de señalización de la superficie celular y la activación de células T.
La invención incluye además monitorear el estado del sistema inmunitario para determinar su capacidad de respuesta a terapias particulares. Eso significa que pueden administrarse terapias apropiadas a un paciente y puede determinarse si el paciente conserva o pierde el estado de "respondedor". Por lo tanto, la invención proporciona en una modalidad una lectura continua "en directo" del estado del "respondedor" lo que permite administrar al paciente una terapia personalizada que refleja con precisión sus necesidades.
Capacidad de respuesta inmunitaria
La invención se refiere a la determinación de la capacidad de respuesta inmunitaria. En particular, la capacidad de respuesta inmunitaria a un inhibidor de PD-1 o inhibidor de PD-L1, incluye un anticuerpo específico para PD-1 o PD-L1. PD-1 es "proteína de muerte celular programada" y PD-L1 es "ligando 1 de muerte programada".
La capacidad de respuesta inmunitaria es preferentemente a una terapia contra el cáncer y, por lo tanto, típicamente es relevante para determinar si un individuo específico responde a la terapia, donde el individuo puede tener o no cáncer, o puede estar en riesgo de cáncer. El cáncer es típicamente cualquier cáncer mencionado en el presente documento y, por ejemplo, es melanoma, cáncer de pulmón, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), linfoma difuso de células B grandes, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer de próstata, cáncer de mama, leucemia, leucemia mieloide aguda, cáncer de páncreas, cáncer de tiroides, cáncer nasal, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, linfoma no Hodgkin, cáncer de ovario, cáncer colorrectal o cáncer de riñón.
El término "anticuerpo" incluye todos los fragmentos y derivados de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse al antígeno diana, por ejemplo, scFV o Fab de cadena sencilla.
El proceso de la invención
El proceso de la invención comprende un sistema de tipificación para detectar interacciones cromosómicas relevantes para la capacidad de respuesta inmunitaria. Esta tipificación puede realizarse mediante el uso del sistema EpiSwitch™ mencionado en la presente descripción que se basa en las regiones de entrecruzamiento del cromosoma que se han unido en la interacción cromosómica, lo que somete al ADN cromosómico a escisión y después a ligadura de los ácidos nucleicos presentes en la entidad entrecruzada para derivarse un ácido nucleico ligado con secuencia de ambas regiones que formaron la interacción cromosómica. La detección de este ácido nucleico ligado permite la determinación de la presencia o ausencia de una interacción cromosómica particular.
Las Interacciones Epigenéticas Relevantes para la Invención
Como se usa en la presente, los términos interacciones "epigenéticas" y "cromosómicas" típicamente se refieren a interacciones entre regiones distales de un cromosoma, dichas interacciones son dinámicas y alteran, forman o se rompen en dependencia del estado de la región del cromosoma.
En procesos particulares de la invención, las interacciones cromosómicas típicamente se detectan al generar primero un ácido nucleico ligado que comprende una secuencia de ambas regiones de los cromosomas que forman parte de las interacciones. En tales procesos las regiones pueden entrecruzarse por cualquier medio adecuado. En una modalidad preferida, las interacciones se entrecruzan mediante el uso de formaldehído, pero también pueden entrecruzarse mediante cualquier aldehído, o éster de N-hidroxisuccinimida del ácido D-biotinoil-£-aminocaproico o éster de N-hidroxisuccinimida del ácido digoxigenín 3-O-metilcarbonil-£-aminocaproico. El paraformaldehído puede entrecruzar cadenas de ADN que están separadas por 4 angstroms. Preferentemente, las interacciones cromosómicas están en el mismo cromosoma y opcionalmente con una separación de 2 a 10 angstroms.
La interacción cromosómica puede reflejar el estado de la región del cromosoma, por ejemplo, si se transcribe o reprime en respuesta a un cambio de las condiciones fisiológicas. Se ha descubierto que las interacciones cromosómicas que son específicas de los subgrupos, como se definen en la presente descripción, son estables, lo que proporciona así un medio fiable para medir las diferencias entre los dos subgrupos.
Adicionalmente, las interacciones cromosómicas específicas de una característica (como la capacidad de respuesta inmunitaria) normalmente ocurrirán tempranamente en un proceso biológico, por ejemplo, en comparación con otros marcadores epigenéticos tales como la metilación o cambios en la unión de proteínas histonas. Por tanto, el proceso de la invención es capaz de detectar etapas tempranas de un proceso biológico. Esto permite una intervención temprana (por ejemplo, el tratamiento) que, en consecuencia, puede ser más eficaz. Las interacciones cromosómicas reflejan además el estado actual del individuo y, por lo tanto, pueden usarse para evaluar cambios en la capacidad de respuesta inmunitaria. Además, hay poca variación en las interacciones cromosómicas relevantes entre individuos dentro del mismo subgrupo. La detección de interacciones cromosómicas es muy informativa, con hasta 50 interacciones posibles diferentes por gen, por lo que los procesos de la invención pueden examinar 500 000 interacciones diferentes.
Conjuntos de marcadores preferidos
En la presente descripción, el término "marcador" o "biomarcador" se refiere a una interacción cromosómica específica que puede detectarse (tipificarse) en la invención. En la presente se describen marcadores específicos, cualquiera de los cuales puede usarse en la invención. Pueden usarse conjuntos adicionales de marcadores, por ejemplo, en las combinaciones o números descritos en la presente descripción. Se prefieren los marcadores específicos descritos en las tablas de la presente descripción, así como también se prefieren los marcadores presentes en genes y regiones mencionados en las tablas de la presente descripción. Estos pueden tipificarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, la PCR o los métodos basados en sondas descritos en la presente descripción, que incluyen un método de qPCR. Los marcadores se definen en la presente descripción por ubicación o por secuencias de sonda y/o cebador.
Ubicación y causas de las interacciones epigenéticas.
Las interacciones cromosómicas epigenéticas pueden superponerse e incluir las regiones de los cromosomas que codifican genes relevantes o no descritos, pero igualmente pueden ocurrir en regiones intergénicas. Cabe señalar además que los inventores han descubierto que las interacciones epigenéticas en todas las regiones son igualmente importantes para determinar el estado del locus cromosómico. Estas interacciones no ocurren necesariamente en la región codificante de un gen particular ubicado en el locus y pueden ocurrir en regiones intergénicas.
Las interacciones cromosómicas que se detectan en la invención podrían estar causadas por cambios en la secuencia de ADN subyacente, por factores ambientales, metilación del ADN, transcritos de ARN antisentido no codificantes, carcinógenos no mutagénicos, modificaciones de histonas, remodelación de la cromatina e interacciones locales específicas del ADN. Los cambios que conducen a las interacciones cromosómicas pueden estar causados por cambios en la secuencia de ácido nucleico subyacente, que en sí mismos no afectan directamente a un producto génico o al modo de expresión génica. Dichos cambios pueden ser, por ejemplo, los SNP dentro y/o fuera de los genes, fusiones y/o deleciones de genes de ADN intergénico, microARN y ARN no codificante. Por ejemplo, se sabe que aproximadamente el 20 % de los SNP se encuentran en regiones no codificantes y, por lo tanto, el proceso que se describe es además informativo en situaciones no codificantes. En una modalidad, las regiones del cromosoma que se unen para formar la interacción están separadas por menos de 5 kb, 3 kb, 1 kb, 500 pares de bases o 200 pares de bases en el mismo cromosoma.
La interacción cromosómica que se detecta preferentemente es dentro de cualquiera de los genes mencionados en la Tabla 1.
Subgrupos, Puntos de Tiempo y Tratamiento Personalizado
El objetivo de la presente invención es determinar el nivel de capacidad de respuesta inmunitaria. Esto puede ser en uno o más puntos de tiempo definidos, por ejemplo, al menos 1, 2, 5, 8 o 10 puntos de tiempo diferentes. Las duraciones entre al menos 1, 2, 5 u 8 de los puntos de tiempo pueden ser de al menos 5, 10, 20, 50, 80 o 100 días. Típicamente, al menos 1, 2 o 5 puntos de tiempo son antes de que comience la terapia y/o al menos 1, 2 o 5 puntos de tiempo son después del comienzo de la terapia.
Como se usa en la presente, un "subgrupo" se refiere, preferentemente, a un subgrupo de población (un subgrupo en una población). Un "subgrupo" se refiere a un subgrupo en la población humana.
Los inventores han descubierto que las interacciones cromosómicas difieren entre subconjuntos (por ejemplo, al menos dos subconjuntos) en una población determinada. Identificar estas diferencias permitirá a los médicos categorizar a sus pacientes como parte de un subconjunto de la población como se describe en el proceso. Por lo tanto, la invención proporciona a los médicos un proceso de personalización de la medicina para el paciente basado en sus interacciones cromosómicas epigenéticas.
La invención se refiere a probar si un individuo es un "respondedor". Una vez que se comprueba que un individuo es "respondedor", puede administrársele la terapia correspondiente. Si se comprueba que un individuo es no respondedor, puede administrársele una terapia combinada, como cualquier terapia combinada enumerada en la presente descripción. Típicamente, una terapia combinada comprende un anticuerpo y una molécula pequeña.
Generación de ácidos nucleicos ligados
Determinadas modalidades de la invención utilizan ácidos nucleicos ligados, en particular ADN ligado. Estos comprenden secuencias de ambas regiones que se unen en una interacción cromosómica y, por lo tanto, proporcionan información sobre la interacción. El método EpiSwitch™ descrito en la presente descripción usa la generación de tales ácidos nucleicos ligados para detectar interacciones cromosómicas.
Por tanto, un proceso de la invención puede comprender una etapa de generación de ácidos nucleicos ligados (por ejemplo, ADN) mediante las siguientes etapas (que incluyen un método que comprende estas etapas):
(i) entrecruzamiento de interacciones cromosómicas epigenéticas presentes en el locus cromosómico, preferentemente invitro;
(ii) opcionalmente aislar el ADN entrecruzado de dicho locus cromosómico;
(iii) someter dicho ADN entrecruzado a corte, por ejemplo, mediante digestión de restricción con una enzima que lo corta al menos una vez (en particular una enzima que corta al menos una vez dentro de dicho locus cromosómico);
(iv) ligar dichos extremos de ADN escindidos y entrecruzados (en particular para formar lazos de ADN); y (v) identificar opcionalmente la presencia de dicho ADN ligado y/o dichos lazos de ADN, en particular mediante el uso de técnicas tales como p Cr (reacción en cadena de la polimerasa), para identificar la presencia de una interacción cromosómica específica.
Estas etapas pueden llevarse a cabo para detectar las interacciones cromosómicas para cualquier modalidad mencionada en la presente descripción. Las etapas pueden llevarse a cabo además para generar el primer y/o segundo conjunto de ácidos nucleicos mencionados en la presente descripción.
Puede usarse la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para detectar o identificar el ácido nucleico ligado; por ejemplo, el tamaño del producto de PCR producido puede ser indicativo de la interacción cromosómica específica que está presente y, por lo tanto, puede usarse para identificar el estado del locus. En modalidades preferidas, en la reacción de PCR se usan al menos 1,2 o 3 cebadores o pares de cebadores como se muestra en la Tabla 4. En otras modalidades, en la reacción de PCR se usan al menos 1, 2 o 3 cebadores o pares de cebadores como se muestra en la Tabla 14. El experto será consciente de numerosas enzimas de restricción que pueden usarse para cortar el ADN dentro del locus cromosómico de interés. Será evidente que la enzima particular usada dependerá del locus estudiado y de la secuencia del ADN ubicado en el mismo. Un ejemplo no limitante de una enzima de restricción que puede usarse para cortar el ADN como se describe en la presente invención es Taql.
Modalidades tales como la tecnología EpiSwitch™
La tecnología EpiSwitch™ se relaciona además con el uso de datos de marcadores de micromatrices EpiSwitch™ en la detección de firmas de conformación cromosómica epigenética específicas para fenotipos. Las modalidades tales como EpiSwitch™ que utilizan ácidos nucleicos ligados de la manera descrita en la presente descripción tienen varias ventajas. Tienen un bajo nivel de ruido estocástico, por ejemplo, porque las secuencias de ácido nucleico del primer conjunto de ácidos nucleicos de la presente invención se hibridan o no se hibridan con el segundo conjunto de ácidos nucleicos. Esto proporciona un resultado binario que permite una forma relativamente sencilla de medir un mecanismo complejo a nivel epigenético. La tecnología EpiSwitch™ tiene además un tiempo de procesamiento rápido y un bajo costo. En una modalidad, el tiempo de procesamiento es de 3 horas a 6 horas.
Muestras y tratamiento de las muestras
El proceso de la invención normalmente se llevará a cabo sobre una muestra. La muestra puede obtenerse en un punto de tiempo definido, por ejemplo, en cualquier punto de tiempo definido en la presente descripción. La muestra normalmente contendrá ADN del individuo. Normalmente contendrá células. En una modalidad, una muestra se obtiene por medios mínimamente invasivos y puede ser, por ejemplo, una muestra de sangre. El ADN puede extraerse y cortarse con una enzima de restricción estándar. Esto puede predeterminar qué conformaciones cromosómicas se conservan y se detectarán con las plataformas EpiSwitch™. Debido a la sincronización de las interacciones cromosómicas entre los tejidos y la sangre, que incluye la transferencia horizontal, puede usarse una muestra de sangre para detectar las interacciones cromosómicas en los tejidos, tales como los tejidos relevantes para la enfermedad. Para determinadas afecciones, tales como el cáncer, el ruido genético debido a las mutaciones puede afectar la "señal" de interacción cromosómica en los tejidos relevantes y, por lo tanto, es ventajoso usar sangre.
Propiedades de los ácidos nucleicos de la invención
La invención se refiere a ciertos ácidos nucleicos, tales como los ácidos nucleicos ligados que se describen en la presente descripción como usados o generados en el proceso de la invención. Estos pueden ser los mismos o tener cualquiera de las propiedades del primero y segundo de los ácidos nucleicos mencionados en la presente descripción. Los ácidos nucleicos de la invención, típicamente, comprenden dos porciones, cada una de las cuales comprende una secuencia de una de las dos regiones del cromosoma que se unen en la interacción cromosómica. Típicamente, cada porción tiene al menos 8, 10, 15, 20, 30 o 40 nucleótidos de longitud, por ejemplo, de 10 a 40 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos preferidos comprenden secuencias de cualquiera de los genes mencionados en cualquiera de las tablas. Los ácidos nucleicos típicamente preferidos comprenden las secuencias de sondas específicas mencionadas en la Tabla 1; o fragmentos y/u homólogos de tales secuencias.
Preferentemente los ácidos nucleicos son ADN. Se entiende que cuando se proporciona una secuencia específica, la invención puede usar la secuencia complementaria según se requiera en la modalidad particular. Preferentemente los ácidos nucleicos son ADN. Se entiende que cuando se proporciona una secuencia específica, la invención puede usar la secuencia complementaria según se requiera en la modalidad particular.
Los cebadores que se muestran en la Tabla 4 pueden además usarse en la invención como se menciona en la presente descripción. En una modalidad, se usan cebadores que comprenden cualquiera de: las secuencias que se muestran en la Tabla 4; o fragmentos y/u homólogos de cualquier secuencia de las que se muestran en la Tabla 4. Los cebadores que se muestran en la Tabla 14 pueden además usarse en la invención como se menciona en la presente descripción. En una modalidad, se usan cebadores que comprenden cualquiera de: las secuencias que se muestran en la Tabla 14; o fragmentos y/u homólogos de cualquier secuencia de las que se muestran en la Tabla 14.
El Segundo Conjunto de Ácidos Nucleicos - las Secuencias "Índice"
El segundo conjunto de secuencias de ácidos nucleicos tiene la función de ser un conjunto de secuencias índice, y es esencialmente un conjunto de secuencias de ácidos nucleicos que son adecuadas para identificar una secuencia específica de subgrupo. Pueden representar las interacciones cromosómicas "de fondo" y pudieran o no seleccionarse de alguna manera. En general, son un subconjunto de todas las interacciones cromosómicas posibles.
El segundo conjunto de ácidos nucleicos puede derivarse mediante cualquier proceso adecuado. Pueden derivarse computacionalmente o pueden basarse en la interacción cromosómica en los individuos. Típicamente representan un grupo de población más grande que el primer conjunto de ácidos nucleicos. En una modalidad particular, el segundo conjunto de ácidos nucleicos representa todas las posibles interacciones cromosómicas epigenéticas en un conjunto específico de genes. En otra modalidad particular, el segundo conjunto de ácidos nucleicos representa una gran proporción de todas las posibles interacciones cromosómicas epigenéticas presentes en una población descrita en la presente descripción. En una modalidad particular, el segundo conjunto de ácidos nucleicos representa al menos 50 % o al menos 80 % de las interacciones cromosómicas epigenéticas en al menos 20, 50, 100 o 500 genes, por ejemplo, en 20 a 100 o 50 a 500 genes.
El segundo conjunto de ácidos nucleicos típicamente representa al menos 100 posibles interacciones cromosómicas epigenéticas que modifican, regulan o de alguna manera median un fenotipo en una población. El segundo conjunto de ácidos nucleicos puede representar interacciones cromosómicas que afectan un estado de enfermedad (típicamente relevante para el diagnóstico o pronóstico) en una especie. El segundo conjunto de ácidos nucleicos típicamente comprende secuencias que representan interacciones epigenéticas tanto relevantes como no relevantes para un subgrupo con capacidad de respuesta inmunitaria.
En una modalidad particular, el segundo conjunto de ácidos nucleicos deriva al menos parcialmente de secuencias que se producen de forma natural en una población, y se obtienen típicamente mediante procesos in silico. Dichos ácidos nucleicos pueden comprender además mutaciones únicas o múltiples en comparación con una porción correspondiente de ácidos nucleicos presentes en los ácidos nucleicos naturales. Las mutaciones incluyen deleciones, sustituciones y/o adiciones de uno o más pares de bases de nucleótidos. En una modalidad particular, el segundo conjunto de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia que represente un homólogo y/u ortólogo con al menos 70 % de identidad de secuencia con la porción correspondiente de ácidos nucleicos presentes en la especie natural. En otra modalidad particular, se proporciona al menos 80 % de identidad de secuencia o al menos 90 % de identidad de secuencia con la porción correspondiente de ácidos nucleicos presentes en la especie natural.
Propiedades del Segundo Conjunto de Ácidos Nucleicos
En una modalidad particular, hay al menos 100 secuencias de ácidos nucleicos diferentes en el segundo conjunto de ácidos nucleicos, preferentemente al menos 1000, 2000 o 5000 secuencias de ácidos nucleicos diferentes, con hasta 100 000, 1000000 o 10000 000 secuencias de ácidos nucleicos diferentes. Un número típico sería de 100 a 1000 000, tal como por ejemplo de 1000 a 100000 secuencias de ácidos nucleicos diferentes. Todas o al menos 90 % o al menos 50 % de estas corresponderían a diferentes interacciones cromosómicas.
En una modalidad particular, el segundo conjunto de ácidos nucleicos representa interacciones cromosómicas en al menos 20 loci o genes diferentes, preferentemente al menos 40 loci o genes diferentes, y con mayor preferencia al menos 100, al menos 500, al menos 1000 o al menos 5000 loci o genes diferentes, tales como de 100 a 10000 loci o genes diferentes. Las longitudes del segundo conjunto de ácidos nucleicos son adecuadas para que se hibriden específicamente, de acuerdo con el apareamiento de bases de Watson Crick, con el primer conjunto de ácidos nucleicos para permitir la identificación de interacciones cromosómicas específicas de los subgrupos. Típicamente, el segundo conjunto de ácidos nucleicos comprenderá dos porciones correspondientes en secuencia a las dos regiones cromosómicas que se unen en la interacción cromosómica. El segundo conjunto de ácidos nucleicos comprende típicamente secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos 10, preferentemente 20 y preferentemente aún 30 bases (nucleótidos) de longitud. En otra modalidad, las secuencias de ácido nucleico pueden tener como máximo 500, preferentemente como máximo 100 y preferentemente aún como máximo 50 pares de bases de longitud. En una modalidad preferida, el segundo conjunto de ácidos nucleicos comprende secuencias de ácidos nucleicos de entre 17 y 25 pares de bases. En una modalidad, al menos 100, 80 % o 50 % del segundo conjunto de secuencias de ácidos nucleicos tienen longitudes como se describió anteriormente. Preferentemente, los diferentes ácidos nucleicos no tienen secuencias superpuestas, por ejemplo, al menos 100 %, 90 %, 80 % o 50 % de los ácidos nucleicos no tienen la misma secuencia en al menos 5 nucleótidos contiguos.
Dado que el segundo conjunto de ácidos nucleicos actúa como un y "índice", entonces el mismo conjunto de segundos ácidos nucleicos puede usarse con diferentes conjuntos de primeros ácidos nucleicos que representan subgrupos para diferentes características, es decir, el segundo conjunto de ácidos nucleicos puede representar una colección "universal" de ácidos nucleicos que puede usarse para identificar interacciones cromosómicas relevantes para diferentes características.
El Primer Conjunto de Ácidos Nucleicos
El primer conjunto de ácidos nucleicos es típicamente de subgrupos relevantes para la capacidad de respuesta inmunitaria. Los primeros ácidos nucleicos pueden tener cualquiera de las características y propiedades del segundo conjunto de ácidos nucleicos mencionados en la presente descripción. El primer conjunto de ácidos nucleicos normalmente se deriva de muestras de individuos que se han sometido a tratamiento y procesamiento como se describe en la presente descripción, en particular las etapas de entrecruzamiento y escisión de EpiSwitch™. Típicamente, el primer conjunto de ácidos nucleicos representa todas o al menos 80 % o 50 % de las interacciones cromosómicas presentes en las muestras tomadas de los individuos.
Típicamente, el primer conjunto de ácidos nucleicos representa una población más pequeña de interacciones cromosómicas a través de los loci o genes representados por el segundo conjunto de ácidos nucleicos en comparación con las interacciones cromosómicas representadas por el segundo conjunto de ácidos nucleicos, es decir, el segundo conjunto de ácidos nucleicos es representante de un conjunto de antecedentes o índice de interacciones en un conjunto definido de loci o genes.
Biblioteca de Ácidos Nucleicos
Cualquiera de los tipos de poblaciones de ácidos nucleicos mencionados en la presente descripción puede estar presente en forma de una biblioteca que comprende al menos 200, al menos 500, al menos 1000, al menos 5000 o al menos 10000 ácidos nucleicos diferentes de ese tipo, tales como los "primeros" o "segundos" ácidos nucleicos. Una biblioteca de este tipo puede tener la forma de estar vinculada a una matriz.
Hibridación
La invención requiere un medio para permitir que se hibriden secuencias de ácidos nucleicos total o parcialmente complementarias del primer conjunto de ácidos nucleicos y el segundo conjunto de ácidos nucleicos. En una modalidad, todo el primer conjunto de ácidos nucleicos se pone en contacto con todo el segundo conjunto de ácidos nucleicos en un único ensayo, es decir, en una única etapa de hibridación. Sin embargo, puede usarse cualquier ensayo adecuado.
Ácidos Nucleicos Marcados y Patrón de Hibridación
Los ácidos nucleicos mencionados en la presente descripción pueden marcarse, preferentemente, mediante el uso de un marcador independiente como un fluoróforo (molécula fluorescente) o un marcador radiactivo que ayude a la detección de una hibridación exitosa. Determinados marcadores pueden detectarse bajo luz ultravioleta. El patrón de hibridación, por ejemplo, en una matriz descrita en la presente descripción, representa diferencias en las interacciones cromosómicas epigenéticas entre los dos subgrupos y, por lo tanto, proporciona un proceso de comparación de interacciones cromosómicas epigenéticas y determinación de qué interacciones cromosómicas epigenéticas son específicas de un subgrupo en la población de la presente invención.
El término "patrón de hibridación" cubre en términos generales la presencia y ausencia de hibridación entre el primer y segundo conjunto de ácidos nucleicos, es decir, cuáles ácidos nucleicos específicos del primer conjunto se hibridan con cuáles ácidos nucleicos específicos del segundo conjunto, y de este modo no se limita a cualquier ensayo o técnica en particular, o la necesidad de tener una superficie o matriz en la que pueda detectarse un "patrón".
Selección de un subgrupo con características particulares
La invención proporciona un proceso que comprende detectar la presencia o ausencia de interacciones cromosómicas, típicamente de 10 a 20 o de 5 a 500 de tales interacciones, preferentemente de 20 a 300 o de 50 a 100 interacciones, para determinar la presencia o ausencia de una característica relacionada con capacidad de respuesta inmunitaria en un individuo. Preferentemente, las interacciones cromosómicas son aquellas en cualquiera de los genes mencionados en la presente descripción. En una modalidad, las interacciones cromosómicas que se tipifican son las representadas por los ácidos nucleicos en la Tabla 1. La columna titulada "Lazo detectado" en las tablas muestra cuál subgrupo (es decir, respondedor o no respondedor) se detecta por cada sonda.
El individuo que se pone a prueba
El individuo que se pone a prueba en el proceso de la invención puede haber sido seleccionado de alguna manera. El individuo puede ser susceptible a cualquier afección mencionada en la presente descripción y/o puede necesitar cualquier terapia mencionada. El individuo puede estar recibiendo cualquier terapia mencionada en la presente descripción.
En una modalidad, los individuos que se ponen a prueba han mostrado una falta de respuesta a la terapia, y el propósito de ponerlos a prueba es descubrir si es un "individuo con progresión no confirmada" que responderá a la terapia en la segunda etapa de la enfermedad, aunque no haya respondido en una etapa anterior.
Regiones Génicas preferidas, Loci, Genes e Interacciones Cromosómicas
Para todos los aspectos de la invención, las regiones génicas preferidas, loci, genes e interacciones cromosómicas se mencionan en las tablas, por ejemplo, en la Tabla 1. Típicamente, en los procesos de la invención se detectan interacciones cromosómicas de al menos 1,2, 10, 50, 100, 150, 200 o 300 de los genes relevantes enumerados en la Tabla 1. Preferentemente, se detecta la presencia o ausencia de al menos 10, 50, 100, 150, 200 o 300 de las interacciones cromosómicas específicas relevantes representadas por las secuencias de las sondas en la Tabla 1. La interacción cromosómica puede ser aguas arriba o aguas abajo de cualquiera de los genes mencionados en la presente descripción, por ejemplo 50 kb aguas arriba o 20 kb aguas abajo, por ejemplo, de la secuencia codificante.
En una modalidad, se tipifican al menos 5, 10, 15, 20 o todas las interacciones cromosómicas de la Tabla 1.a. En una modalidad, se tipifican al menos 5, 10, 15, 20 o todas las interacciones cromosómicas de la Tabla 1.b. En una modalidad, se tipifican al menos 5, 10, 15, 20 o todas las interacciones cromosómicas de la Tabla 1.c. En una modalidad, se tipifican al menos 5, 10, 15, 20 o todas las interacciones cromosómicas de la Tabla 1.d. En una modalidad, se tipifican al menos 5, 10, 15, 20 o todas las interacciones cromosómicas de la Tabla 1.e. En una modalidad, se tipifican al menos 5, 10, 15, 20 o todas las interacciones cromosómicas de la Tabla 1.f. En una modalidad, se tipifican al menos 5, 10, 15, 20 o todas las interacciones cromosómicas de la Tabla 1.g.
Típicamente, al menos 5, 10, 15, 20, 30, 40 o 70 interacciones cromosómicas se tipifican de cualquiera de los genes o regiones que se describen en las tablas en la presente descripción, o partes de las tablas que se describen en la presente descripción. Típicamente, las interacciones cromosómicas que se tipifican están presentes en al menos 20, 50, 100, 200, 300 o en todos los genes mencionados en la Tabla 2. Típicamente, las interacciones cromosómicas que se tipifican están presentes en al menos 10, 20, 50, 70 o en todos los genes mencionados en la Tabla 3.
En una modalidad, se tipifican al menos 5, 10 o 15 o todas las interacciones cromosómicas en la Tabla 15.
En una modalidad, el locus (que incluye el gen y/o el lugar donde se detecta la interacción cromosómica) puede comprender un sitio de unión de CTCF. Esta es cualquier secuencia capaz de unirse al represor de la transcripción CTCF. Esa secuencia puede consistir en o comprender la secuencia CCCTC que puede estar presente en 1, 2 o 3 copias en el locus. La secuencia del sitio de unión de CTCF puede comprender la secuencia CCGCGNGGNGGCAG (SEQ ID NO: 1) (en notación IUPAC). El sitio de unión de CTCF puede estar dentro de al menos 100, 500, 1000 o 4000 bases de la interacción cromosómica o dentro de cualquiera de las regiones cromosómicas que se muestran en la Tabla 1.
Por lo tanto, típicamente podría detectarse la secuencia de ambas regiones de la sonda (es decir, de ambos sitios de la interacción cromosómica). En modalidades preferidas, en el proceso se usan sondas que comprenden o consisten en la misma secuencia o secuencia complementaria a una sonda mostrada en cualquier tabla. En algunas modalidades se usan sondas que comprenden una secuencia que es homóloga a cualquiera de las secuencias de sondas mostradas en las tablas.
Tablas que se proporcionan en la presente descripción
La Tabla 1 muestra los datos de las sondas (marcador EpiSwitch™) y datos de genes que representan interacciones cromosómicas relevantes para la capacidad de respuesta inmunitaria. Las secuencias de las sondas muestran una secuencia que puede usarse para detectar un producto ligado generado a partir de ambos sitios de regiones génicas que se han unido en interacciones cromosómicas, es decir, la sonda comprenderá una secuencia que es complementaria a la secuencia del producto ligado. Los primeros dos conjuntos de posiciones de inicio y fin muestran las posiciones de las sondas y los dos segundos conjuntos de posiciones de inicio y fin muestran la región relevante de 4 kb. La siguiente información se proporciona en la tabla de datos de las sondas:
- HiperG_Estad: valor de p para la probabilidad de encontrar ese número de marcadores EpiSwitch™ significativos en el locus, basados en los parámetros de enriquecimiento hipergeométrico
- Conteo total de sondas: Número total de conformaciones de EpiSwitch™ probadas en el locus
- Conteo de sondas con sig. estad: Número de conformaciones de EpiSwitch™ que se encontraron estadísticamente significativas en el locus
- FDR HiperG: Valor de p hipergeométrico corregido mediante pruebas múltiples (tasa de descubrimientos falsos) - Por ciento Sig: Porcentaje de marcadores EpiSwitch™ significativos en relación con el número de marcadores probados en el locus
- logFC: logaritmo en base 2 de la Relación Epigenética (FC)
- ExprProm: log2 de la expresión promedio para la sonda en todas las matrices y canales
- T: estadístico t moderado
- valor de p: valor p en bruto
- valor de p ajust.: valor p ajustado o valor de q
- B - estadístico B (lods o B) son las probabilidades logarítmicas de que ese gen se exprese diferencialmente. - FC: cambio no logarítmico en el plegado
- FC_1: cambio no logarítmico en el plegado centrado alrededor de cero
- LS: valor binario que se relaciona con los valores FC_1. El valor FC_1 por debajo de -1,1, se establece en -1 y si el valor FC_1 es superior a 1,1, se establece en 1. Entre esos valores el valor es 0
La Tabla 1 muestra genes en los que se ha descubierto que se produce una interacción cromosómica relevante. Otras tablas muestran datos similares. El valor de p en la tabla de loci es el mismo que el de HiperG_Estad (valor de p para la probabilidad de encontrar ese número de marcadores EpiSwitch™ significativos en el locus, basado en los parámetros de enriquecimiento hipergeométrico). La columna LS muestra la presencia o ausencia de la interacción relevante con ese estado de respuesta en particular.
Las sondas se diseñan para estar a 30 pb de distancia del sitio Taq1. En el caso de la PCR, los cebadores de la PCR típicamente se diseñan para detectar el producto ligado, pero sus ubicaciones respecto del sitio Taq1 varían.
Ubicaciones de las sondas:
Inicio 1 - 30 bases aguas arriba del sitio Taq1 en el fragmento 1
Final 1 - sitio de restricción Taq1 en el fragmento 1
Inicio 2 - sitio de restricción Taq1 en el fragmento 2
Final 2 - 30 bases aguas abajo del sitio Taq1 en el fragmento 2
Ubicación de la secuencia de 4kb:
Inicio 1 - 4000 bases aguas arriba del sitio Taq1 en el fragmento 1
Final 1 - sitio de restricción Taq1 en el fragmento 1
Inicio 2 - sitio de restricción Taq1 en el fragmento 2
Final 2 - 4000 bases aguas abajo del sitio Taq1 en el fragmento 2
Valores de GLMNET relacionados con procedimientos para ajustar toda la regularización de lasso o de red elástica (Lambda establecido en 0,5 (red elástica)).
Las Tablas 1 y 4 se relacionan con la detección de la capacidad de respuesta inmunitaria. La Tabla 2 muestra la superposición entre los dos estudios que se realizaron, y la Tabla 3 muestra la superposición con los marcadores con relación al interferón gamma. La invención puede llevarse a cabo mediante del uso de marcadores como se describe/representa en cualquiera de las tablas. Otras tablas pueden interpretarse de manera similar a la establecida en la Tabla 1 anterior.
Modalidades preferidas para la preparación de muestras y la detección de interacciones cromosómicas
En la presente descripción se describen métodos para preparar muestras y detectar conformaciones cromosómicas. Pueden usarse versiones optimizadas (no convencionales) de estos métodos, por ejemplo, como se describe en esta sección.
Típicamente la muestra contendrá al menos 2 ><105 células. La muestra puede contener hasta 5 *105 células. En una modalidad, la muestra contendrá 2 x 105a 5,5x105 células.
En la presente descripción se describe el entrecruzamiento de interacciones cromosómicas epigenéticas presentes en el locus cromosómico. Esto puede realizarse antes de que tenga lugar la lisis celular. La lisis celular puede realizarse durante 3 a 7 minutos, tal como 4 a 6 o aproximadamente 5 minutos. En algunas modalidades, la lisis celular se realiza durante al menos 5 minutos y durante menos de 10 minutos.
En la presente descripción se describe la digestión del ADN con una enzima de restricción. Típicamente, la restricción del a Dn se realiza entre aproximadamente 55 °C y aproximadamente 70 °C, tal como aproximadamente 65 °C, durante un período de aproximadamente 10 a 30 minutos, tal como aproximadamente 20 minutos.
Preferentemente se usa una enzima de restricción cortadora frecuente que da como resultado fragmentos de ADN ligado con un tamaño de fragmento promedio de hasta 4000 pares de bases. Opcionalmente, la enzima de restricción da como resultado fragmentos de<a>D<n>ligado que tienen un tamaño de fragmento promedio de aproximadamente 200 a 300 pares de bases, tal como aproximadamente 256 pares de bases. En una modalidad, el tamaño de fragmento típico es de 200 pares de bases a 4000 pares de bases, tal como de 400 a 2000 o de 500 a 1000 pares de bases. En una modalidad del método EpiSwitch no se realiza una etapa de precipitación del ADN entre la etapa de digestión de restricción del ADN y la etapa de ligación del ADN.
En la presente descripción se describe la ligación del ADN. Típicamente, la ligación del ADN se realiza durante 5 a 30 minutos, tal como aproximadamente 10 minutos.
La proteína de la muestra puede digerirse enzimáticamente, por ejemplo, mediante el uso de una proteinasa, opcionalmente Proteinasa K. La proteína puede digerirse enzimáticamente durante un período de aproximadamente 30 minutos a 1 hora, por ejemplo, durante aproximadamente 45 minutos. En una modalidad, después de la digestión de la proteína, por ejemplo, digestión con Proteinasa K, no hay reversión del entrecruzamiento ni etapa de extracción del ADN con fenol.
En una modalidad, la detección por PCR es capaz de detectar una única copia del ácido nucleico ligado, preferentemente, con una lectura binaria para la presencia/ausencia del ácido nucleico ligado.
La Figura 25 muestra un método preferido para detectar interacciones cromosómicas.
Procesos y Usos de la Invención
La invención incluye detectar interacciones cromosómicas en cualquier locus, gen o regiones mencionados en la Tabla 1. La invención incluye el uso de los ácidos nucleicos y sondas mencionados en la presente descripción para detectar interacciones cromosómicas, por ejemplo, el uso de al menos 1, 5, 10, 50, 100, 200, 250, 300 de dichos ácidos nucleicos o sondas para detectar interacciones cromosómicas, preferentemente, en al menos 1, 5, 10, 50, 100, 200, 250, 300 loci o genes diferentes. La invención incluye la detección de interacciones cromosómicas mediante el uso de cualquiera de los cebadores o pares de cebadores enumerados en la Tabla 4 o mediante el uso de variantes de estos cebadores como se describe en la presente descripción (secuencias que comprenden las secuencias de cebadores o que comprenden fragmentos y/u homólogos de las secuencias de cebadores).
Cuando se analiza si una interacción cromosómica se produce "dentro" de un gen, región o ubicación definidos, ambas partes del cromosoma que se unen en la interacción están dentro del gen, región o ubicación definidos o, en algunas modalidades, solo una parte del cromosoma está dentro del gen, región o ubicación definidos.
Uso del Método de la Invención para Identificar Nuevos Tratamientos
El conocimiento de las interacciones cromosómicas puede usarse para identificar nuevos tratamientos para enfermedades.
Homólogos
En la presente descripción se hace referencia a homólogos de secuencias de polinucleótidos/ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN). Tales homólogos tienen típicamente al menos 70 % de homología, preferentemente al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de homología, por ejemplo, por una región de al menos 10, 15, 20, 30, 100 o más nucleótidos contiguos, o a través de la porción del ácido nucleico que es de la región del cromosoma involucrada en la interacción cromosómica. La homología puede calcularse sobre la base de la identidad de nucleótidos (a veces denominada "homología difícil").
Por lo tanto, en una modalidad particular, los homólogos de secuencias de polinucleótidos/ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) se refieren en la presente descripción como referencia al porcentaje de identidad de secuencias. Típicamente tales homólogos tienen al menos 70 % de identidad de secuencia, preferentemente al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia, por ejemplo, por una región de al menos 10, 15, 20, 30, 100 o más nucleótidos contiguos, o a través de la porción del ácido nucleico que es de la región del cromosoma involucrada en la interacción cromosómica.
Por ejemplo, el Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología (por ejemplo, que se usa en sus configuraciones predeterminadas) (Devereux y otros (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden usarse para calcular la homología y/o el % de identidad de secuencias y/o alinear secuencias (tales como identificar secuencias equivalentes o correspondientes (típicamente en sus configuraciones predeterminadas)), por ejemplo, como se describe enAltschul SF (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F y otros (1990) J Mol Biol 215:403-10.
El software para realizar el análisis de BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional de Información de Biotecnología. Este algoritmo consiste, en primer lugar, en identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen algún umbral de puntuación de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de palabras de la vecindad (Altschuly otros,supra). Estos aciertos iniciales en las palabras de la vecindad actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar las HSP que las contienen. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que pueda aumentarse la puntuación acumulativa del alineamiento. Las extensiones para los aciertos de palabras en cada dirección se interrumpen cuando: la puntuación acumulativa del alineamiento cae en la cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa pasa a cero o más abajo, debido a la acumulación de una o más alineamiento de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento.
El programa BLAST usa como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, los alineamientos (B) de la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.
El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; ver, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca por azar una coincidencia entre dos secuencias de polinucleótidos. Por ejemplo, se considera que una secuencia es similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menor que aproximadamente 1, preferentemente menor que aproximadamente 0,1, con mayor preferencia menor que aproximadamente 0,01 y con la máxima preferencia menor que aproximadamente 0,001.
La secuencia homóloga típicamente difiere en 1, 2, 3, 4 o más bases, tal como menos de 10, 15 o 20 bases (que pueden ser sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos). Estos cambios pueden medirse a través de cualquiera de las regiones mencionadas anteriormente en relación con el cálculo de la homología y/o el % de identidad de secuencia.
La homología de un "par de cebadores" puede calcularse, por ejemplo, al considerar las dos secuencias como una secuencia única (como si las dos secuencias estuvieran unidas), con el fin de compararlas después contra el otro par de cebadores que a su vez se considera una secuencia única.
Matrices
El segundo conjunto de ácidos nucleicos puede unirse en una matriz, y en una modalidad hay al menos 15000, 45 000, 100000 o 250000 segundos ácidos nucleicos diferentes unidos en la matriz, que preferentemente representan al menos 300, 900, 2000 o 5000 loci. En una modalidad, una, más o todas las diferentes poblaciones de segundos ácidos nucleicos se unen a más de una región distinta de la matriz, de hecho, se repiten en la matriz, lo que permite la detección de errores. La matriz puede basarse en una plataforma de micromatriz Agilent SurePrint G3 personalizada para CGH. La detección de la unión de los primeros ácidos nucleicos a la matriz puede realizarse mediante un sistema dual de colores.
Agentes terapéuticos
La terapia puede ser monoterapia o terapia de combinación, por ejemplo, con inmunomoduladores de puntos de control (inhibidores) para PD-1 y/o su ligando, PD-L1. La terapia podría ser una combinación de un anti-PD-1 o anti-PD-L1 combinado con otro fármaco que se dirige a un punto de control como CTLA4 (Ipilimumab/Yervoy) o moléculas pequeñas. Los inhibidores de PD-1 podrían ser pembrolizumab (Keytruda) o nivolumab (Opdivo). El modulador de PD-L1 o agente terapéutico podría ser Atezolizumab (Tecentriq), Avelumab (Bavencio), Durvalumab (Imfinzi), CA-170, Ipilimumab, Tremelimumab, Nivolumab, Pembrolizumab, Pidilizumab, BMS935559, GVAXMPDL3280A, MEDI4736, MSB0010718C, MDX- 1105/BMS-936559, AMP-224, MEDI0680.
La terapia puede comprender la administración de agentes que se dirigen a y/o modulan al interferón gamma o la vía JAK-START.
Formas de la Sustancia mencionada en la Presente Descripción
Cualquiera de las sustancias, tales como ácidos nucleicos o agentes terapéuticos, mencionadas en la presente descripción, puede estar en forma purificada o aislada. Pueden estar en una forma diferente de la que se encuentra en la naturaleza, por ejemplo, pueden estar presentes en combinación con otra sustancia con la que no se encuentran en la naturaleza. Los ácidos nucleicos (que incluyen porciones de secuencias definidas en la presente descripción) pueden tener secuencias que son diferentes a las que se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, que tienen al menos 1,2, 3, 4 o más cambios de nucleótidos en la secuencia como se describe en la sección sobre homología. Los ácidos nucleicos pueden tener una secuencia heteróloga en el extremo 5' o 3'. Los ácidos nucleicos pueden ser químicamente diferentes de los que se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, pueden modificarse de alguna manera, pero preferentemente son aún capaces de realizar el apareamiento de bases de Watson-Crick. Cuando sea apropiado, los ácidos nucleicos se proporcionarán en forma bicatenaria o monocatenaria. La invención proporciona todas las secuencias de ácidos nucleicos específicas mencionadas en la presente descripción en forma monocatenaria o bicatenaria y, por tanto, incluye la cadena complementaria de cualquier secuencia que se describa.
Métodos de Detección
En una modalidad, la detección cuantitativa de la secuencia ligada que es relevante para una interacción cromosómica se lleva a cabo mediante el uso de una sonda que es detectable tras la activación durante una reacción de PCR, en donde dicha secuencia ligada comprende secuencias de dos regiones cromosómicas que se unen en una interacción cromosómica epigenética, en donde dicho método comprende poner en contacto la secuencia ligada con la sonda durante una reacción de PCR y detectar el grado de activación de la sonda, y en donde dicha sonda se une al sitio de ligación. El método típicamente permite detectar interacciones particulares de manera compatible con MIQE mediante el uso de una sonda de hidrólisis con marcado doble fluorescente.
La sonda generalmente está marcada con una marca detectable que tiene un estado inactivo y activo, de modo que sólo se detecta cuando se activa. La capacidad de la activación estará relacionada con la capacidad del molde (producto de ligación) presente en la reacción de PCR. La detección puede llevarse a cabo durante toda o parte de la PCR, por ejemplo, durante al menos 50 % u 80 % de los ciclos de la PCR.
La sonda puede comprender un fluoróforo unido covalentemente a un extremo del oligonucleótido y un inactivador unido al otro extremo del nucleótido, de modo que el inactivador inactive la fluorescencia del fluoróforo. En una modalidad, el fluoróforo está unido al extremo 5' del oligonucleótido y el inactivador está unido covalentemente al extremo 3' del oligonucleótido. Los fluoróforos que pueden usarse en los métodos de la invención incluyen FAM, TET, JOE, Yakima Yellow, HEX, Cyanine3, ATTO 550, TAMRA, ROX, rojo Texas, Cianina 3,5, LC610, LC 640, ATTO 647N, Cianina 5, Cianina 5,5 y ATTO 680. Los inactivadores que pueden usarse con el fluoróforo apropiado incluyen TAM, BHQ1, DAB, Eclip, BHQ2 y BBQ650, opcionalmente en los que dicho fluoróforo se selecciona de HEX, rojo Texas y FAM. Las combinaciones preferidas de fluoróforo e inactivador incluyen FAM con BHQ1 y rojo Texas con BHQ2.
Uso de la Sonda en un Ensayo de qPCR
Las sondas de hidrólisis de la invención típicamente tienen un gradiente de temperatura optimizado con controles negativos de concentración equivalente. Preferentemente se optimizan las reacciones de PCR de una sola etapa. Con mayor preferencia se calcula una curva estándar. Una ventaja de usar una sonda específica que se una por la unión de la secuencia ligada es que puede lograrse la especificidad por la secuencia ligada sin usar un enfoque de PCR anidada. Los métodos descritos en la presente descripción permiten una cuantificación exacta y precisa de dianas con un número de copias bajo. La secuencia diana ligada puede purificarse, por ejemplo, purificarse en gel, antes de la optimización del gradiente de temperatura. La secuencia diana ligada puede secuenciarse. Preferentemente, las reacciones de PCR se realizan mediante el uso de aproximadamente 10 ng, o de 5 a 15 ng, o de 10 a 20 ng, o de 10 a 50 ng, o de 10 a 200 ng de ADN molde. Los cebadores directos e inversos se diseñan de manera que un cebador se une a la secuencia de una de las regiones cromosómicas representadas en la secuencia ligada de ADN, y el otro cebador se une a otra región cromosómica representada en la secuencia ligada de ADN, por ejemplo, que es complementario a la secuencia.
Elección de la diana ligada de ADN
Describimos la selección de cebadores y una sonda para su uso en un método de PCR como se define en la presente descripción, que comprende seleccionar cebadores en función de su capacidad para unirse y amplificar la secuencia ligada y seleccionar la secuencia de la sonda basado en las propiedades de la secuencia diana a la que se unirá, en particular la curvatura de la secuencia diana.
Típicamente, las sondas se diseñan/eligen para unirse a secuencias ligadas que son fragmentos de restricción yuxtapuestos que abarcan el sitio de restricción. En una modalidad de la invención, la curvatura predicha de posibles secuencias ligadas relevantes para una interacción cromosómica particular se calcula, por ejemplo, mediante el uso de un algoritmo específico al que se hace referencia en la presente descripción. La curvatura puede expresarse en grados por vuelta helicoidal, por ejemplo 10,5° por vuelta helicoidal. Se seleccionan secuencias ligadas para la orientación donde la secuencia ligada tiene una puntuación máxima de propensión a la curvatura de al menos 5° por vuelta helicoidal, típicamente al menos 10°, 15° o 20° por vuelta helicoidal, por ejemplo, de 5° a 20° por vuelta helicoidal. Preferentemente, la puntuación de propensión a la curvatura por vuelta helicoidal se calcula para al menos 20, 50, 100, 200 o 400 bases, tal como para 20 a 400 bases aguas arriba y/o aguas abajo del sitio de ligación. Por tanto, en una modalidad la secuencia diana en el producto ligado tiene cualquiera de estos niveles de curvatura. Las secuencias diana pueden elegirse además en base a la energía libre de la estructura termodinámica más baja.
Modalidades particulares
En una modalidad, solo se tipifican/detectan interacciones intracromosómicas, y no se tipifican/detectan interacciones extracromosómicas (entre diferentes cromosomas).
En modalidades particulares, determinadas interacciones cromosómicas no están tipificadas, por ejemplo, cualquier interacción específica mencionada en la presente descripción (por ejemplo, como se define por cualquier par de sondas o cebadores mencionados en la presente descripción). En algunas modalidades, las interacciones cromosómicas no están tipificadas en ninguno de los genes mencionados aquí, por ejemplo, en cualquier gen mencionado en las Figuras, que incluyen cualquiera o todos los genes mencionados en las Figuras 2 y 4.
En una modalidad, ninguna de las interacciones cromosómicas representadas por las sondas o cebadores de cualquiera o todas las Tablas 5 a 7 está tipificada. En otra modalidad, las interacciones cromosómicas presentes en cualquiera de los genes enumerados en cualquiera o en todas las Tablas 5 a 7 no están tipificadas. En una modalidad adicional, las interacciones cromosómicas presentes en cualquiera de las regiones enumeradas en cualquiera o en todas las Tablas 5 a 7 no están tipificadas.
En una modalidad, la capacidad de respuesta inmunitaria no se relaciona con la terapia con anticuerpos. En otra modalidad, la capacidad de respuesta inmunitaria no se relaciona con la terapia anti-PD-1, por ejemplo, la terapia anti-PD-1 de melanoma. En otra modalidad, la capacidad de respuesta inmunitaria no se relaciona con la terapia de uno o más de los siguientes: cáncer de la sangre, leucemia, cáncer de próstata, cáncer de mama, linfoma difuso de células B grandes.
Métodos de Detección
Describimos un método para determinar qué interacciones cromosómicas son relevantes para un estado cromosómico correspondiente a un subgrupo con capacidad de respuesta inmunitaria de la población, que comprende poner en contacto un primer conjunto de ácidos nucleicos de subgrupos con diferentes estados del cromosoma con un segundo conjunto de ácidos nucleicos índice, y permitir que se hibriden secuencias complementarias, en donde los ácidos nucleicos en el primer y segundo conjunto de ácidos nucleicos representan un producto ligado que comprende secuencias de ambas regiones cromosómicas que se han unido en interacciones cromosómicas, y en donde el patrón de hibridación entre el primer y segundo conjunto de ácidos nucleicos permite determinar qué interacciones cromosómicas son específicas de un subgrupo inmunosensible. El subgrupo puede ser cualquiera de los subgrupos específicos definidos en la presente descripción, por ejemplo, con referencia a condiciones o terapias particulares. Tablas
La Tabla 1 muestra el conjunto final de marcadores para probar la capacidad de respuesta inmunitaria.
La Tabla 2 muestra los marcadores compartidos entre los estudios anti-PD-1 y anti-PD-L1.
La Tabla 3 muestra marcadores que se superponen con los ORF activados por interferón gamma.
La Tabla 4 muestra pares de cebadores que pueden usarse para detectar marcadores relacionados con la capacidad de respuesta inmunitaria.
Las Tablas 5 a 7 muestran marcadores, genes y regiones que no están incluidos en determinadas modalidades. La Tabla 8 muestra moléculas de puntos de control inmunitario.
La Tabla 9 proporciona ejemplos de terapias contra el cáncer.
Las Tablas 10 y 11 muestran terapias combinadas y monoterapias.
Las Tablas 12 y 13 describen genes que se relacionan con modalidades de la invención.
La Tabla 15 muestra los marcadores para probar la capacidad de respuesta inmunitaria.
Modalidades Específicas
La tecnología de la plataforma EpiSwitch™ detecta firmas regulatorias epigenéticas de cambios regulatorios entre condiciones normales y anormales en los loci. La plataforma EpiSwitch™ identifica y monitorea el nivel epigenético fundamental de la regulación genética asociada con las estructuras regulatorias de alto orden de los cromosomas humanos, también conocidas como firmas de conformación cromosómica. Las firmas cromosómicas son una etapa primaria diferenciada en una cascada de desregulación génica. Son biomarcadores de alto orden con un conjunto único de ventajas frente a las plataformas de biomarcadores que utilizan biomarcadores epigenéticos tardíos y de expresión génica, como la metilación del ADN y la elaboración de perfiles de ARN.
Ensayo de matriz EpiSwitch™
Las plataformas de detección basadas en matrices EpiSwitch™ personalizadas vienen en 4 densidades de conformaciones cromosómicas únicas de 15K, 45K, 100Ky 250K, cada fragmento quimérico se repite en las matrices 4 veces, lo que hace que las densidades eficaces sean 60K, 180K, 400Ky 1 millón respectivamente.
Matrices EpiSwitch™ personalizadas
La matriz EpiSwitch™ de 15K puede examinar todo el genoma, lo que incluye alrededor de 300 loci interrogados con la tecnología de descubrimiento de biomarcadores EpiSwitch™. La matriz EpiSwitch™ se construye sobre la plataforma de micromatriz Agilent SurePrint G3 personalizada para CGH; esta tecnología ofrece 4 densidades, 60K, 180K, 400K y 1 millón de sondas. La densidad por matriz se reduce a 15K, 45K, 100K y 250K ya que cada sonda de EpiSwitch™ se presenta por cuadruplicado, lo que permite así la evaluación estadística de la reproducibilidad. El número promedio de marcadores EpiSwitch™ potenciales interrogados por loci genéticos es 50; como tal, los números de loci que pueden investigarse es 300, 900, 2000 y 5000.
Flujo de trabajo de las matrices EpiSwitch™ personalizadas
La matriz EpiSwitch™ es un sistema dual de color con un conjunto de muestras, después de la generación de la biblioteca de EpiSwitch™, marcada en Cy5 y la otra de muestra (controles) para comparar/analizar marcada en Cy3. Las matrices se escanean mediante el uso del escáner Agilent SureScan y las características resultantes se extraen mediante el uso del software de extracción Agilent Feature. Después, los datos se procesan mediante el uso de los comandos de procesamiento de matrices EpiSwitch™ en R. Las matrices se procesan mediante el uso de paquetes estándar de doble color en Bioconductor en R: Limma*. La normalización de las matrices se realiza mediante el uso de la función normalisedWithinArrays en Limma * y esto se realiza para los controles positivos en el chip de Agilent y los controles positivos de EpiSwitch™. Los datos se filtran basado en las asignaciones de etiquetas de Agilent, se eliminan las sondas de control de Agilent y se promedian las sondas técnicas replicadas para poder analizarlas mediante el uso de Limma *. Las sondas se modelan en base a su diferencia entre los 2 escenarios que se comparan, y después se corrigen mediante el uso de la tasa de descubrimiento falso. Las sondas con coeficiente de variación (CV) <=30 % que son <=-1,1 o =>1,1 y pasan el valor de p de FDR p<=0,1 se usan para una detección adicional. Para reducir aún más el conjunto de sondas, se realiza un análisis de factores múltiples mediante el uso del paquete FactorMineR en R.
*Nota: LIMMA son Modelos lineales y procesos empíricos de Bayes para la evaluación de la expresión diferencial en experimentos con micromatrices. Limma es un paquete R para el análisis de datos de expresión génica que surgen de micromatrices o RNA-Seq.
La colección de sondas se selecciona inicialmente basado en los parámetros del valor de p ajustado, FC y CV <30 % (límite arbitrario) para la selección final. Los análisis adicionales y la lista final se elaboran basado únicamente en los dos primeros parámetros (valor de p ajustado; FC).
Flujo de trabajo estadístico
Las matrices de detección EpiSwitch™ se procesan mediante el uso del paquete analítico de EpiSwitch™ en R para seleccionar marcadores EpiSwitch™ de alto valor para la traducción en la plataforma de PCR EpiSwitch™.
Etapa 1
Las sondas se seleccionan en función de su valor de p corregido (tasa de descubrimiento falso, FDR), que es el producto de un modelo de regresión lineal modificado. Las sondas por debajo del valor de p <= 0,1 se seleccionan y después se reducen aún más según su relación epigenética (ER); las sondas ER deben ser <= -1,1 o => 1,1 para poder seleccionarlas para análisis adicionales. El último filtro es un coeficiente de variación (CV), las sondas tienen que estar por debajo de <=0,3.
Etapa 2
Los 40 marcadores principales de las listas estadísticas se seleccionan basado en su ER para su selección como marcadores para la traducción por PCR. La lista la forman los 20 marcadores principales con la carga de ER negativa más alta, y los 20 marcadores principales con la carga de ER positiva más alta.
Etapa 3
Los marcadores resultantes de la etapa 1, las sondas estadísticamente significativas, forman las bases del análisis de enriquecimiento mediante el uso del enriquecimiento hipergeométrico (HE). Este análisis permite la reducción de marcadores de la lista de sondas significativas, y junto con los marcadores de la etapa 2 forman la lista de sondas traducidas en la plataforma de PCR EpiSwitch™.
Las sondas estadísticas se procesan por HE para determinar qué localizaciones genéticas tienen un enriquecimiento de sondas estadísticamente significativas, lo que indica qué localizaciones genéticas son centros de diferencias epigenéticas.
Los loci enriquecidos más significativos basados en un valor de p corregido se seleccionan para la generación de la lista de sondas. Se seleccionan las localizaciones genéticas por debajo del valor de p de 0,3 o 0,2. Las sondas estadísticas que mapean con estas localizaciones genéticas, con los marcadores de la etapa 2, forman los marcadores de alto valor para la traducción por PCR EpiSwitch™.
Diseño y procesamiento de matrices
Diseño de la matriz
1. Los loci genéticos se procesan mediante el uso del software SII (actualmente v3.2) para:
a. Extraer la secuencia del genoma en estos loci genéticos específicos (secuencia del gen con 50 kb aguas arriba y 20 kb aguas abajo)
b. Definir la probabilidad de que una secuencia dentro de esta región esté involucrada en las CCS c. Cortar la secuencia mediante el uso de una RE específica
d. Determinar qué fragmentos de restricción es probable que interactúen en una determinada orientación. e. Clasificar la probabilidad de que diferentes c Cs interactúen entre sí.
2. Determinar el tamaño de la matriz y, por lo tanto, el número de posiciones de sondas disponibles (x) 3. Extraer x/4 interacciones.
4. Para cada interacción, definir la secuencia de 30 pb al sitio de restricción de la parte 1 y de 30 pb al sitio de restricción de la parte 2. Verificar que esas regiones no se repitan; de ser así, excluirlas y remover la siguiente interacción de la lista. Unir las 30 pb la vez para definir la sonda.
5. Crear una lista de sondas x/4 más sondas de control definidas y replicarlas 4 veces para crear una lista que se creará en la matriz
6. Cargar la lista de sondas en el sitio web de diseño de Agilent Sure para obtener una matriz personalizada para CGH.
7. Usar el grupo de sondas para diseñar una matriz de Agilent personalizada para CGH.
Procesamiento de matrices
1. Procesar muestras mediante el uso del procedimiento operativo estándar (SOP) de EpiSwitch™ para la producción de moldes.
2. Limpiar con precipitación en etanol en el laboratorio de procesamiento de matrices.
3. Procesar muestras según el kit completo de etiquetado de ADN de Agilent SureTag - CGH basada en matrices de oligonucleótidos de Agilent para análisis de ADN genómico etiquetado enzimático de sangre, células o tejidos
4. Escanear con el escáner Agilent C mediante el uso del software de extracción de características de Agilent.
EpiSwitch™
Las firmas de biomarcadores EpiSwitch™ demuestran una gran solidez, sensibilidad y especificidad en la estratificación de fenotipos de enfermedades complejas. Esta tecnología aprovecha los últimos avances en la ciencia de la epigenética, el seguimiento y la evaluación de las firmas de conformación cromosómica como una clase altamente informativa de biomarcadores epigenéticos. Las metodologías de investigación actuales implementadas en el entorno académico requieren de 3 a 7 días para el procesamiento bioquímico del material celular con el fin de detectar CCS. Esos procedimientos tienen una sensibilidad y reproducibilidad limitadas; y, además, no tienen el beneficio de la información específica proporcionada por el paquete analítico de EpiSwitch™ en la etapa de diseño.
Identificación de marcadores mediante matrices EpiSwitch™ in silico
Los sitios de CCS en todo el genoma se evalúan directamente mediante matrices EpiSwitch™ en muestras clínicas de cohortes de prueba para la identificación de todos los principales biomarcadores estratificadores relevantes. La plataforma de matrices EpiSwitch™ se usa para la identificación de marcadores debido a su capacidad de altas prestaciones y su capacidad para detectar rápidamente una gran cantidad de loci. La matriz usada fue la matriz de Agilent personalizada para c Gh , que permite que los marcadores a interrogar se identifiquen a través del software in silico.
PCR EpiSwitch™
Los marcadores potenciales identificados mediante matriz EpiSwitch™ después se validan mediante PCR EpiSwitch™ o por secuenciadores de ADN (es decir, Roche 454, Nanopore MinION, etc.). Los principales marcadores de PCR que son estadísticamente significativos y muestran la mejor reproducibilidad, se seleccionan para una reducción adicional en el resultado del conjunto final de firmas de EpiSwitch™, y se valida en una cohorte independiente de muestras. La PCR EpiSwitch™ puede realizarse por un técnico capacitado que siga un protocolo de procedimiento operativo estandarizado establecido. Todos los protocolos y fabricación de reactivos se realizan bajo la acreditación ISO 13485 y 9001 para garantizar la calidad del trabajo y la capacidad de transferir los protocolos. Las plataformas de biomarcadores PCR EpiSwitch™ y matriz EpiSwitch™ son compatibles con el análisis tanto de sangre completa como de líneas celulares. Las pruebas son lo suficientemente sensibles como para detectar anomalías en números de copias muy bajos mediante el uso de pequeños volúmenes de sangre.
Ejemplos
En el primer estudio, los pacientes con melanoma fueron tratados con anti-PD-1 (Pembrolizumab) durante 12 semanas. Su estado epigenético, medido por EpiSwitch, se evaluó primero al inicio del tratamiento y luego a las 12 semanas, junto con la lectura clínica de respuesta o falta de respuesta. Después detectamos, evaluamos y validamos partes de los perfiles de la arquitectura del genoma en 3D y las firmas de conformación cromosómica al inicio, para identificar perfiles que conduzcan a una respuesta o falta de respuesta al tratamiento en más de 332 ubicaciones genéticas en todo el genoma. Estos se evaluaron en una matriz EpiSwitch que analiza múltiples interacciones locales de 3C en esas ubicaciones genéticas en repeticiones técnicas y biológicas, al comparar muestras de respondedores y no respondedores en la línea base. Se evaluaron directamente más de 14000 marcadores EpiSwitch en la matriz. Los mejores marcadores se tradujeron en la PCR y se evaluaron en la cohorte de pacientes independientes.
La Figura 1 muestra un ejemplo de anotaciones clínicas de pacientes usadas en el estudio. Marcaje codificado por colores: los pacientes enumerados en rojo se usaron en la detección en matrices. Los pacientes en azul se usaron como parte de una cohorte independiente para la validación; esos pacientes no se usaron para la selección de marcadores, lo cual es importante para el desarrollo de biomarcadores sólidos. La evaluación clínica de la respuesta o la falta de respuesta se definió mediante los criterios estándar de RESIST 1.1.
La etapa 1 consiste en la detección en matrices inicial y la evaluación de los 14 000 principales marcadores (todos predichos mediante reconocimiento de patrones). La etapa 2 es la traducción de los marcadores estadísticamente significativos de la matriz en la PCR. Evaluación adicional por PCR de los marcadores mediante análisis de regresión para reducción del número final de marcadores en la firma final. La etapa 3 es la validación de la firma final de los 6 mejores biomarcadores (que se muestran en la Figura 2). La tabla en la Figura 2 muestra los nombres de los mejores biomarcadores y los loci genéticos en los que se ubican, es decir, en estos loci ellos contribuyen de manera particular a la regulación general.
La Figura 3 muestra el diagrama de Venn para los mejores biomarcadores predictivos del análisis de matrices (se compara el valor inicial para los que responden y los que no responden) y los biomarcadores de mejor respuesta (se compara los que responden al inicio y a las 12 semanas). La superposición no solo proporciona biomarcadores de buena respuesta que están presentes al inicio de la respuesta, sino que también podría monitorearse durante 12 semanas.
La Figura 4 es un ejemplo de una lectura binaria de la PCR en pacientes individuales para algunos de los biomarcadores característicos finales: 1 CCS está presente, 0 CCS está ausente. Puede verse visualmente la diferencia en los perfiles de los que responden y los que no responden. R es uno que responde. NR es uno que no responde.
La Figura 5 muestra dos grupos de pacientes con cáncer de pulmón que se trataron con anticuerpo monoclonal anti-PD-L1. La sangre se recolectó al inicio antes del tratamiento (BL) y dos semanas después del inicio del tratamiento (2W). Se estableció la identidad de los dos grupos para la respuesta, pero en el estudio original se había enmascarado en el grupo I y el grupo II. Los 30 marcadores principales basados en la PCR que predicen la respuesta anti-PD-1 del primer estudio (ver arriba) se evaluaron en todos los pacientes enumerados.
La Figura 6 muestra el análisis estadístico de los 13 marcadores principales estadísticamente significativos que discriminan entre los grupos I y II. PDCD1LG2 y STATS también son los principales marcadores discriminantes en el estudio anti-PD-1 original: PDCD1LG2 para los que no responden, STAT5B para los que responden. Esto ayuda a identificar correctamente los grupos I y II como grupos que responden y que no responden. Los biomarcadores monitorean la desregulación en la misma red celular de puntos de control de inmunoterapias, provocada por PD-1 en el primer estudio o por su ligando PD-L1 en el segundo estudio y, por lo tanto, comparten características que se superponen en los mismos marcadores: 6 falta de respuesta. marcadores, 7 marcadores de respuesta del primer estudio sobre PD-1 siguen siendo válidos en el segundo estudio con PD-L1.
La Figura 7 muestra un análisis de componentes principales (PCA) de los 13 marcadores principales seleccionados de la cohorte de PD-L1. Este es un PCA en 3D que muestra en los tres primeros componentes de la estratificación una buena separación entre los que responden y los que no responden. Marcadamente, los que no responden (triángulos oscuros) también se separan entre los mismos pacientes durante el inicio (A) y a las 2 semanas (B) de tratamiento. Esta es una característica separada relacionada con cuán estrictamente se controlan los perfiles epigenéticos en los que responden y en los que no responden.
La Figura 8 muestra cómo en un tercer estudio independiente, realizado en pacientes con cáncer de pulmón con un anti-PD-L1 monoclonal diferente, se proporcionaron muestras iniciales de 15 pacientes como enmascaradas en la anotación de respuesta/no respuesta al tratamiento. Al combinar el primer y el segundo estudio, mediante el uso de 8 pacientes del primero (tratamiento con PD-1 en melanoma) y 24 del segundo (un PD-L1 diferente en cáncer de pulmón), se evaluó un conjunto de marcadores y se usaron entonces los 5 principales marcadores de significación estadística (enumerados en la tabla) para la clasificación de 15 muestras enmascaradas.
La Figura 9 muestra cómo un clasificador de bosque aleatorio construido sobre los 5 marcadores enumerados produce asignaciones predichas para cada una de las 15 muestras (columna predicho). La Figura 10 muestra las asignaciones predichas para cada muestra comparadas contra validaciones sin enmascaramiento (columna real). La eficiencia de estratificación se enumera en la tabla. Sensibilidad 71 %, especificidad 87,5 %, valor predictivo positivo 83%(importante en este contexto de selección de pacientes), valor predictivo negativo 77 %.
La Figura 11 muestra la curva ROC estándar para el clasificador. AUC = 0,786
La Figura 12 muestra un análisis de componentes principales para todas las muestras usadas en este análisis: 8 del primer estudio, 24 del segundo, 15 de la validación. En cuanto a los componentes del primer principio, la separación entre los que responden y los que no responden ya es obvia. Solo hay dos muestras asignadas erróneamente en el clasificador abierto para las 47 muestras.
El tercer estudio se relaciona con el tratamiento anti-PD-L1 en el cáncer de pulmón. En la etapa de matriz de la detección se compararon 12 que responden y 12 que no responden al inicio en la matriz para un total de 180 000 lecturas (en repeticiones técnicas y biológicas). Después se realizó una traducción por PCR para los 100 principales prospectos de marcadores de la matriz, seguida de una validación.
Hubo una comparación de los prospectos de marcadores a partir de las matrices para PD-1 (estudio I), PD-L1 (estudio II) con el estudio III de PD-L1. La Figura 13 muestra la superposición de 2522 prospectos comunes para los que responden. La Figura 14 muestra lo mismo, pero ahora examina las más significativas estadísticamente: 276 prospectos comunes significativos para ambos estudios para los que responden (estudio I a la izquierda, estudio II a la derecha). La Figura 15 muestra lo mismo, pero para los que no respondieron, de los cuales solo hay uno (estudio I a la izquierda, estudio II a la derecha).
La Figura 16 muestra cómo los loci genéticos para lecturas de matrices para marcadores de respuesta y de no respuesta (Estudios I y III) se superponen con genes implicados en la vía del interferón gamma. El tratamiento con interferón gamma puede aumentar la expresión de PD-L1, lo cual es una observación clínica para la predisposición a responder al tratamiento. La Figura 17 muestra lo mismo, pero sólo para datos estadísticamente significativos. La Figura 18 muestra lo mismo, pero para todos los estudios I-III.
La Figura 19 muestra diagramas de Venn en las cuatro cohortes: loci génicos (ORF) para la vía de INFG, los que responden y los que no responden a anti-PD-L1, todos los anti-PD-1.
La Figura 20 muestra diagramas de Venn en las cuatro cohortes: loci génicos (ORF) para la vía de INFG, los que responden y los que no responden a anti-PD-1, todos los anti-PD-L1.
La Figura 21 muestra todos los loci génicos para marcadores de los que responden compartidos entre los estudios I-III y los genes de INFG. La Figura 22 muestra lo mismo, pero con la lista de 95 loci que contienen algunos de los marcadores EpiSwitch significativos de respuesta compartidos entre los tres estudios I-III. La Figura 23 muestra la lista de loci de la Figura 22 que muestra el número de prospectos de marcadores significativos y el número total de prospectos de marcadores cuando estos loci se evaluaron en una matriz. La Figura 24 muestra la vía de señalización de interferón coincidente con los ORF significativos asociados a las CCS de aPD-L1 en EpiSwitch™.
Después de establecer los entornos epigenéticos comunes como marcadores para los que responden en los tratamientos con PD-1 y PD-L1, seguimos las ubicaciones genéticas observadas bajo el control de entornos epigenéticos para sus productos proteicos e investigamos la relación de la red para esas proteínas en el contexto de redes de proteína-proteína conocidas y sus roles funcionales. La sobreimposición de los loci genéticos afectados por los marcadores de respuesta EpiSwitch en la red de la base de datos String muestra que las proteínas controladas epigenéticamente en los que responden están involucradas en la estrecha red asociada con las dos funciones: Vía de señalización del receptor de la superficie celular que regula la respuesta inmunitaria y regulación de la activación de las células T.
Conclusiones específicas
Se han identificado marcadores que tienen poderes estadísticamente significativos de diseminarse para identificar en los pacientes iniciales aquellos que están preparados para una buena respuesta a las inmunoterapias (que incluyen las terapias de puntos de control inmunitario), es decir, los que responden, y los que no, es decir, los que no responden o los que presentan progresión de la enfermedad. Los marcadores de la Tabla 1 representan un perfil universal común de los que responden a través de tres cohortes independientes con melanoma o con cáncer de pulmón (NSCLC). Los pacientes con melanoma se trataron con PD-1 (pembrolizumab), NSCLC con dos PD-L1 diferentes. Estos son marcadores agnósticos predictivos del tratamiento y están presentes por diferentes tipos de cánceres. Existe además un importante marcador predictivo agnóstico y universal de falta de respuesta, ubicado entre los loci PD-L1 y PD-L2.
La lista de marcadores en la Tabla 1 refleja una regulación de red común en los que responden. Estos pueden usarse como marcadores agnósticos para monitorear la respuesta/falta de respuesta en diversos tratamientos y condiciones, que incluyen en respuesta a tratamientos dirigidos a moléculas de puntos de control inmunitario estándar que controlan la respuesta de la red inmunológica.
Trabajo adicional
Continuar con el objetivo de identificar cambios epigenéticos basados en firmas de conformación cromosómica (CCS) que permitan seleccionar, a priori, pacientes que responderán a la terapia anti PD-1, sola o en combinación, para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Los marcadores EpiSwitch™ descubiertos a partir de esta detección en matrices, después se examinaron y validaron mediante el uso de la plataforma de PCR EpiSwitch™ que usa tres cohortes de inmunoterapias, dos terapias anti-PD-L1 y una terapia anti-PD-1 (Pembrolizumab) en muestras iniciales de pacientes. Las dos CCS de respuesta anti-PD-L1 se desarrollaron en pacientes con NSCLC y las CCS de respuesta a pembrolizumab en pacientes con melanoma y se validaron adicionalmente en pacientes con NSCLC. La Tabla 15 proporciona los resultados de trabajos adicionales y muestra un conjunto adicional de marcadores que pueden usarse para determinar la capacidad de respuesta inmunitaria.
Diseños del estudio
En el estudio del melanoma metastásico, se estudió un total de 32 muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de 16 pacientes con melanoma metastásico. Estos pacientes habían recibido terapia anti-PD1. Los pacientes fueron evaluados en 2 puntos de tiempo: al inicio y la evaluación del tumor a las 12 semanas. Se usó un total de 16 muestras para la etapa de descubrimiento mediante el uso de matrices EpiSwitch. Los 100 marcadores principales en EpiSwitch identificados a partir de la detección en matrices se verificaron en las muestras al inicio y a las 12 semanas para identificar la respuesta a la terapia anti-PD1 y los efectos farmacodinámicos. Los principales marcadores EpiSwitch se clasificaron en dos grupos: los que responden y los que no responden a la terapia anti-PD-1.
En el estudio de NSCLC se estudió un número total de 16 PBMC iniciales de pacientes con carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) tratados con una terapia anti-PD-L1. Se evaluaron 30 marcadores EpiSwitch™ predictivos. El objetivo de este proyecto fue confirmar la capacidad predictiva de los marcadores EpiSwitch comunes para un perfil predictivo anti-PD-1 y anti-PD-L1 en pacientes al inicio con NSCLC que han sido tratados con terapia anti-PD-L1.
Tabla 1.a1
Tabla 1.a2
Tabla 1.a3
Tabla 1.a5
Tabla 1.a6
Tabla 1. b1
Tabla 1. b2
Tabla 1. b3
Tabla 1. b5
Tabla 1. b6
Tabla 1.c1
Tabla 1.c2
Tabla 1.c3
-O
0
oo
Tabla 1.c5
Tabla 1.c6
Tabla 1. d i
Tabla 1. d2
Tabla 1. d3
_0
_Q
I<(>
-<O>
-O
0
Tabla 1. d5
Tabla 1. d6
Tabla 1. e l
Tabla 1. e2
Tabla 1. e3
-0
Tabla 1. e5
Tabla 1. e6
Tabla 1. f1
Tabla 1. f2
Tabla 1. f3
2:
_0
-Q
H<03>
-0
-0
Tabla 1. f5
Tabla 1. f
T l 1. 2
T l 1.
-0
T l 1.
Tabla 2.a
Tabla 2.b
Tabla 2.c
Tabla 2.d
Tabla 2.e
Tabla 2.f
Tabla 2.
Tabla 2.h
Tabla 2.i
Tabla 2.k
Tabla 3.a
Tabla 3.b
Tabla 3.c
Tabla 4.a
Tabla 4.b
Tabla 4.c
Tabla 4.d
Tabla 4.e
Tabla 4.f
Tabla 4.
Tabla 4.h
Tabla 4.i
T l 4.
Tabla 5b
Tabla b
Tabla<8>
Tabla 9
Tabla 10. Combinaciones en inmunoterapia contra el cáncer (agentes biológicos, inmunocitocinas (L19-IL2 y L19-TNF a entes citotóxicos Paxlitaxel
T l 11. r m l l in ivi l inm n i in r i l i r l r i nr l n r
Tabla 12.a
Tabla 12.b
Tabla 12.c
Tabla 12.d
Tabla 12.e
Gen Marcador GLMNET
ORF3 OBD117.1.585.587 0,000108113
ORF3 OBD117.1.593.595 -0,012488304 ORF3 OBD117.1.1717.1719<0>
ORF3 OBD117.1.1617.1919<0>
Tabla 12.f
Tabla 12.
Tabla 12.h
Tabla 12.i
Tabla 13
Tabla 14.a
Tabla 14.b
Tabla 15
Claims (7)
- REIVINDICACIONESi .Un proceso para determinar cuán sensible es un individuo a la terapia anti-PD-1 o anti-PD-LI que comprende determinar si al menos<10>interacciones cromosómicas están presentes o ausentes en el individuo,en donde las dichas al menos<10>interacciones cromosómicas corresponden a cualquiera de las<10>interacciones cromosómicas representadas por cualquier sonda que se muestra en la Tabla 1, y en donde se determina la presencia o ausencia de al menos la interacción cromosómica ORF712_9_120888366_120893320_120913546_120919710_RR correspondiente a la secuencia de sondaAGTGCTGGTTCCACACCTCTCAGCTCTTCGACCTCCAGGTCCCCCGCCACTTCCACGGC.
- 2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la presencia o la ausencia de interacciones cromosómicas se determina:- en una muestra de un individuo, y/o- mediante detección de la presencia o ausencia de un lazo de ADN en el sitio de las interacciones cromosómicas, y/o- detección de la presencia o ausencia de regiones distales de un cromosoma que se reúnen en una conformación cromosómica, y/o- mediante detección de la presencia de un ácido nucleico ligado que se genera durante dicha tipificación y cuya secuencia comprende dos regiones correspondientes cada una a las regiones del cromosoma que se unen en la interacción cromosómica, en donde la detección del ácido nucleico ligado preferentemente es mediante el uso de una sonda que tiene al menos 70 % de identidad con cualquiera de las secuencias de sondas específicas mencionadas en la Tabla 1.
- 3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el proceso se lleva a cabo para seleccionar un individuo para un tratamiento médico.
- 4. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde determinar la presencia o ausencia de las interacciones cromosómicas comprende la detección específica del producto ligado mediante PCR cuantitativa (qPCR) que usa cebadores capaces de amplificar el producto ligado y una sonda que se une el sitio de ligación durante la reacción de PCR, en donde dicha sonda comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia de cada una de las regiones cromosómicas que se han unido en la interacción cromosómica.
- 5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha sonda comprende:un oligonucleótido que se une específicamente a dicho producto ligado, y/oun fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' del oligonucleótido, y/oun inactivador unido covalentemente al extremo 3' del oligonucleótido.
- 6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 en donde:dicho fluoróforo se selecciona de HEX, rojo Texas y FAM; y/odicha sonda comprende una secuencia de ácido nucleico de 10 a 40 bases de nucleótidos de longitud.
- 7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación<6>, en donde la sonda tiene una longitud de 20 a 30 bases de nucleótidos.
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