ES2301668T3 - Procedimiento de analisis de los linfocitos t por medio de los receptores de los linfocitos t de un organismo. - Google Patents
Procedimiento de analisis de los linfocitos t por medio de los receptores de los linfocitos t de un organismo. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de análisis de la activación y de la movilización de las células T por medio de un análisis de los receptores de los linfocitos T de un organismo, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: - determinar el número de transcritos para cada gen Va, para obtener unos primeros datos. - amplificar la región CDR3 de los receptores de los linfocitos T para cada uno de los genes Va asociados al organismo, - separar las diferentes longitudes de la CDR3 de los receptores de los linfocitos T para cada uno de los genes Va asociados al organismo, y estimar la proporción de los transcritos de cada longitud de la CDR3 en cada familia Va para obtener unos segundos datos, - representar en un diagrama de cuatro variables los primeros y los segundos datos en función de los genes Va y de la longitud de las regiones CDR3.
Description
Procedimiento de análisis de los linfocitos T
por medio de los receptores de los linfocitos T de un organismo.
La invención se refiere al estudio del sistema
inmunitario de los organismos tales como el ser humano o los
animales, en particular al análisis de los linfocitos T activados o
no de un organismo mediante el estudio de su receptor.
Las respuestas inmunitarias se pueden clasificar
en dos grandes categorías: las respuestas naturales y las
respuestas adaptativas (o específicas). Las células implicadas en la
respuesta natural usan unos sistemas de reconocimiento primitivos y
no específicos. Este tipo de respuesta representa por lo tanto la
primera línea de defensa contra las infecciones, y predomina en los
estados iniciales de la infección. En el caso en el que la
inmunidad natural es ineficaz, se utiliza la inmunidad adaptativa,
que usa unas respuestas específicas adaptadas a cada
microorganismo. Los linfocitos están en el origen de este
reconocimiento adaptativo.
Existen dos tipos de linfocitos: los linfocitos
B, responsables de la inmunidad humoral (producción de anticuerpos)
y los linfocitos T, responsables de la inmunidad celular. Estos
últimos desempeñan una función central en biología. Reconocen unos
péptidos que proceden de la degradación intracelular de antígenos,
pero sólo cuando estos péptidos están asociados con unas moléculas
portadas por las células presentadores de antígeno denominadas
moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad o CMH (asimismo
denominado Human Leucocyte Antigen o HLA), portadas por las células
presentadoras de antígeno. Para esta función, los linfocitos T usan
un receptor específico denominado receptor de antígeno de los
linfocitos T o TCR.
El receptor de las células T (TCR) es un
heterodímero constituido por dos cadenas: \alpha y \beta. Los
inventores se interesarán en la presente memoria únicamente en la
cadena \beta que comprende los genes V\beta (24 en el ser
humano), D\beta (2 en el ser humano), J\beta (12 en el ser
humano) y C\beta (2 en el ser humano), inicialmente separados
sobre el ADN. Uno de los genes V\beta se une de manera aleatoria
con uno de los genes D\beta, J\beta y C\beta para formar un
receptor funcional. Así, un gran número de TCR diferentes se puede
generar teóricamente (aproximadamente 25\cdot10^{6} TCR
diferentes). El encuentro de un antígeno conlleva la selección de
linfocitos T que portan un TCR específico constituido por un
conjunto V\beta-D\beta-J\beta
particular. El reconocimiento del antígeno se realiza principalmente
a nivel de la región hipervariable CDR3 (Complementary Determining
Region 3) que se forma mediante la reestructuración de los genes
V\beta, D\beta y J\beta y que es de longitud variable.
Normalmente, en un individuo sano, los transcritos que codifican
para una familia V\beta cualquiera usan todos las longitudes
posibles de la CDR3.
Hasta ahora, el análisis del receptor de las
células T se ha realizado principalmente de manera
"cualitativa" (es decir: búsqueda de una eventual selección)
gracias a unos procedimientos tales como los usados por el programa
conocido con la marca Immunoscope® y que estudia este receptor a
nivel de la distribución de las longitudes de la región CDR3,
región que sería la más implicada en el reconocimiento del
péptido.
Después de la amplificación de esta región CDR3,
de la longitud variable, gracias a un cebador C\beta y a un
cebador V\beta, el programa Immunoscope suministra los resultados
en forma de picos, estando cada perfil constituido por 7 a 11
picos, es decir de 7 a 11 tamaños diferentes de la CDR3, separados
cada uno por 3 nucleótidos. Así, cuando todas las longitudes de la
CDR3 están representadas en una familia V\beta dada, se observa un
perfil gaussiano, característico de una respuesta policlonal. Es,
por ejemplo, lo que se observa, generalmente, en un individuo sano.
A la inversa, una longitud de la CDR3 puede estar mayoritariamente
representada tras una activación particular que ha seleccionado
unos clones de linfocitos T particulares, y se observa entonces una
"alteración" oligo- o monoclonal de la distribución de las
longitudes de la región CDR3, perdiendo entonces los perfiles su
carácter gaussiano.
Un medio de comparar el perfil de una muestra
frente al perfil de control es usar el cálculo descrito en el
artículo de G. Gorochov (Nat. Med., 1998, 4(2):215) que
calcula la diferencia entre el espacio debajo de cada pico del
perfil de control y el espacio debajo de cada pico del perfil de la
muestra. Así, se obtienen unos porcentajes de alteración con
relación al gaussiano, y los resultados se representan en forma de
estructuras tridimensionales que permiten visualizar las
alteraciones asociadas con todas las familias V\beta de una
muestra dada en una misma gráfica. Estas gráficas, habitualmente
denominadas Reperturb, aparecen planas cuando el repertorio no está
alterado, y perturbadas cuando el repertorio está alterado.
A pesar de su interés, estos métodos de análisis
cualitativo del receptor de las células T no permiten tener un
conocimiento preciso de la cantidad de ARNm V\beta afectado por un
proceso de selección (y, por lo tanto, indirectamente de la
importancia del grupo de células T que usan una reestructuración
V\beta dada) y presentan por lo tanto un límite importante siendo
incapaces de jerarquizar las anomalías observadas.
A título de ejemplo, la figura 2 representa un
perfil gaussinao, y la figura 1 representa una expansión monoclonal
obtenidas mediante Immunoscope®. Usando el método Reperturb,
aparecen en la figura 3 cuatro picos que corresponden cada uno a
una familia V\beta que presenta una expansión clonal. A pesar de
su interés, este análisis cualitativo solo no permite saber si las
TCR que presentan estas expansiones interesan a una fracción
importante del transcriptoma V\beta, o si sólo representan una
minoría entre el grupo de células T. Por ejemplo, en la figura 3, no
se sabe si las células T que portan una de las 4 expansiones
clonales están más representadas que otras entre la población de
células T totales, y están, por lo tanto, más particularmente
implicadas en la reacción inmunitaria estudiada. A la inversa, la
gráfica permanece plana cuando todas las familias V\beta presentan
una distribución gaussiana de las longitudes de la CDR3 como se
muestra en la figura 4. Este perfil plano se puede deber:
- -
- a una ausencia de respuesta (no está implicado ningún linfocito T)
- -
- a una respuesta policlonal debida a la activación de un gran número de clones T, enmascarando esta activación la presencia de expansiones clonales potenciales, o
- -
- a la activación de células T sin ninguna modificación de la distribución de longitud de la CDR3. Es el caso, por ejemplo, de un perfil observado después de la estimulación mediante unos ligandos policlonales (anticuerpo anti-CD3, Concanavalina A, PHA, etc.) o mediante unos superantígenos.
El análisis cualitativo solo no permite
diferenciar entre estas tres hipótesis.
El solicitante ha sido el primero en usar el
método Immunoscope® para estudiar el rechazo y la tolerancia de
aloinjertos o, más recientemente, de xenoinjertos. Sin embargo,
aunque estos estudios han sido realizados en líneas de ratas
congénicas (una combinación mucho más "simplificada" que la
combinación alogénica), han revelado unas alteraciones de tipo
privado (específicas de un individuo) para la mayoría, mientras que
las alteraciones públicas (misma longitud y misma secuencia de la
CDR3 encontrada en varios animales) son unos eventos extremadamente
raros. Debido a este perfil privado dominante (y por lo tanto
aparentemente caótico) y de la fuerte reactividad cruzada del TCR,
no se puede obtener ninguna información reproducible sobre la
fisiología del alorreconocimiento. Partiendo de estas observaciones
y de este hecho, parece que un análisis combinado de las
alteraciones cualitativas (privadas/públicas) y de la estimación
cuantitativa del grupo de células T que intervienen en estas
alteraciones (número de transcritos V\beta para cada perfil
alterado) es el único medio de acercarse a la cinética de la
respuesta de los linfocitos T.
Así, la capacidad de evaluación y de estudio de
la dinámica y de la importancia de la respuesta de los linfocitos T
in vivo de los inventores es muy limitada. El análisis del
repertorio de TCR es un reflejo indirecto del estado de la
movilización y de la activación de las células T en una situación
biológica dada. Sin embargo, la importante reactividad cruzada del
TCR, así como la gran diversidad de los péptidos afectados, hace
difícil el uso de las alteraciones cualitativas del repertorio
V\beta considerado aisladamente (por ejemplo según el método
Immunoscope) como marcador para identificar y jerarquizar de manera
precisa la población de células T implicada en una reacción
inmunitaria compleja, incluso si el estudio del repertorio se
realiza a nivel de las secuencias y de las variaciones de longitud
de la región CDR3. A pesar de su interés, los métodos conocidos
previamente de análisis del TCR no permitían por lo tanto tener un
conocimiento preciso del grupo de ARNm de linfocitos T (con
relación al transcriptoma C\beta global), usando una
reestructuración de las cadenas V\beta dadas. Además, la
acumulación de los transcritos V\beta es un parámetro diferente de
la expresión de las proteínas correspondientes en la superficie de
las células T porque éstas pueden ser subreguladas después de la
interacción con el antígeno.
Uno de los objetivos de la invención es
proporcionar un nuevo método de análisis que permita añadir una
dimensión cuantitativa, parámetro esencial para el análisis de las
alteraciones del repertorio.
Con vistas a la realización de este objetivo, el
solicitante propone, según la invención, un procedimiento de
análisis de los receptores de los linfocitos T de un organismo, que
comprenden las etapas que consisten en:
- -
- determinar el número de transcritos para cada gen V\beta, para obtener unos primeros datos. Después, este número de transcritos se puede representar, por ejemplo, en forma de valores brutos (número de transcritos para cada familia V\beta), en forma de proporción entre este número de transcritos y el número de transcritos de un gen de referencia, por ejemplo el gen HPRT (Hipoxantina fosforibosilo transferasa), siendo éste un gen presente en todas las células y que permite uniformizar los datos, en forma de porcentaje de cada transcrito V\beta entre la suma de los transcritos V\beta o en forma de una medición de la variación entre el número de transcritos en una familia V\beta dada de una muestra dada y el número de transcritos de la misma familia V\beta de una muestra de referencia.
- -
- amplificar la región CDR3 de los receptores de los linfocitos T para cada uno de los genes V\beta asociados al organismo,
- -
- separar las diferentes longitudes de la CDR3 de los receptores de los linfocitos T para cada uno de los genes V\beta asociado al organismo, y estimar la proporción de los transcritos de cada longitud de la CDR3 en cada familia V\beta para obtener unos segundos datos,
- -
- representar en un diagrama de cuatro variables los primeros y segundos datos en función de los genes V\beta y de la longitud de las regiones CDR3.
Así, la invención permite seguir precisamente la
existencia y la jerarquía cuantitativa de anomalías de la
distribución de las longitudes de la región CDR3 durante la
iniciación, la cinética, la expansión, la memoria y el grado de
propagación de epítopo en una situación de respuesta inmune compleja
(por ejemplo un contexto patológico), debido al hecho de que los
dos parámetros (perfil de alteración de la distribución de las
longitudes de la región CDR3 del TCR con relación a la situación de
reposo y evaluación cuantitativa de los transcritos V\beta del
grupo de células T implicadas) pueden ser globalmente visualizados,
de manera simultánea, en el diagrama.
La invención ofrece por lo tanto una vista
integrada de las alteraciones del TCR, en lugar de sólo la
descripción individual de las alteraciones de cada familia
V\beta. Es más propicia a la comprensión de los eventos
inmunológicos fundamentales y aplicados que implican una respuesta
linfocitaria T (enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes,
cánceres, injertos, etc.). La presentación de los resultados es
asimismo completa, didáctica y fácil de comprender.
La invención propone una nueva estrategia de
evaluación de la respuesta inmune in vivo, preferentemente
fundada sobre una integración asistida por ordenador de las
alteraciones del transcriptoma V\beta de los linfocitos
T\alpha\beta activados.
El procedimiento de la invención combina el
análisis obtenido por ejemplo mediante los programas Reperturb e
Immunoscope® de la alteración de la longitud de la CDR3 (en una
familia V\beta dada), comparada con el perfil gaussiano en
reposo, con una medición cuantitativa de cada transcrito V\beta
mediante PCR cuantitativa (por ejemplo siguiendo el método conocido
con el nombre de TaqMan) de cada familia V\beta y, por lo tanto,
de los transcritos para todas las señales TCR alteradas. Se usa un
análisis factorial para definir las coherencias de uso de los
V\beta y de su alteración. La invención incluye un programa de
expresión gráfica que permite una vista general y, por ejemplo
tridimensional, de la jerarquía de las alteraciones y, por lo tanto,
del estado de activación de las células T reactivas.
El procedimiento según la invención podrá
presentar además al menos una cualquiera de las características
siguientes:
- -
- al menos una de las variables se representa sin estar asociada a una dimensión del espacio;
- -
- al menos una de las variables se representa mediante diferencias de aspecto local del diagrama;
- -
- las diferencias de aspecto local son unas diferencias de color;
- -
- la variable que no está asociada a una dimensión del espacio corresponde a los segundos datos;
- -
- los primeros datos se representan según la dirección vertical;
- -
- los valores predeterminados corresponden, para cada gen V\beta, a una repartición gaussiana de las proporciones de transcritos que corresponden a las regiones CDR3 asociadas a este gen;
- -
- comprende, después de la determinación de los primeros y de los segundos datos, las etapas que consisten en elegir un gen V\beta en función de los resultados de las dos primeras etapas, y en extraer de la población de células T total las células T que portan un TCR constituido por esta familia V\beta previamente elegida; y
- -
- al menos ciertas de las etapas se realizan de manera automatizada.
Se prevé un programa informático para el
análisis de los receptores de los linfocitos T de un organismo,
apropiado para mandar la realización de al menos la etapa de
representación del procedimiento según la invención.
Se prevé además, según la invención, una
instalación de análisis de los receptores de los linfocitos T de un
organismo, que comprende:
- -
- unos medios automatizados para medir las cantidades de cada gen V\beta y, eventualmente, la relación de estas cantidades con unos valores predeterminados para obtener unos primeros datos;
- -
- unos medios automatizados para amplificar la región CDR3 para cada uno de los genes V\beta de los receptores de los linfocitos T asociados con el organismo, y para medir, para cada gen V\beta, la cantidad relativa de cada región CDR3 con relación a la totalidad de las regiones CDR3 asociadas con un gen V\beta para obtener unos segundos datos; y
- -
- unos medios automatizados para representar en un diagrama de cuatro variables los primeros y los segundos datos en función de los genes V\beta y de la longitud de las regiones CDR3. Este diagrama permite una visión simplificada y global del proceso complejo de movilización de las células T durante una reacción inmunitaria.
Se prevé un soporte de información que presenta
un diagrama de análisis de los receptores de los linfocitos T de un
organismo, que comprende las cuatro variables siguientes:
- -
- los genes V\beta asociados al organismo;
- -
- la longitud de las regiones CDR3 de los receptores de los linfocitos T;
- -
- unos primeros valores que representan la cantidad de transcritos de cada gen V\beta en forma de cantidad relativa o absoluta;
- -
- unos segundos datos que representan para cada una de las longitudes de la región CDR3 en cada gen V\beta la diferencia entre la proporción de los transcritos que corresponden a una región CDR3 de un gen V\beta en una muestra dada con relación a los transcritos que corresponden a la misma región CDR3 del mismo gen V\beta de una muestra de referencia que es una muestra que presenta una distribución gaussiana de las longitudes de la CDR3.
La invención puede ser objeto de numerosas
aplicaciones, por ejemplo en los sectores inmunológicos
siguientes:
- -
- seguimiento de la evolución de diferentes patologías a lo largo del tiempo tales como los cánceres, las enfermedades víricas (SIDA, infección con EBV, etc.), las enfermedades autoinmunes, etc.;
- -
- seguimiento del efecto de diferentes tratamientos (inmunoterapia, etc.);
- -
- estudio de los mecanismos de la respuesta inmunitaria en diferentes enfermedades y/o seguimiento de diferentes terapias;
- -
- estudio de los mecanismos de rechazo y de tolerancia en el trasplante;
- -
- diagnóstico de un "estado memoria";
A continuación se proponen más precisamente
algunos ejemplos de aplicaciones:
- -
- seguimiento de la evolución de la enfermedad e investigación de una eventual correlación entre la regresión o la agravación de la enfermedad, y la importancia de la propagación, que corresponde al hecho de que la selección de los clones T evolucionará a lo largo del tiempo debido al reconocimiento de nuevas estructuras antigénicas mediante mimetismo molecular;
- -
- seguimiento de la evolución, en el tiempo, del repertorio de las células T en unos pacientes que presentan, o no, una regresión continua de la enfermedad después de la inmunoterapia. La invención permitirá al mismo tiempo seguir el efecto de la terapia y el desarrollo de la respuesta inmune contra la enfermedad;
- -
- detección de marcadores específicos relacionados con la evolución de la enfermedad. Por ejemplo, un aumento de las alteraciones clonales, un aumento del número de familias V\beta que presentan unas alteraciones particulares y/o un aumento significativo de los mensajeros V\beta en la sangre extraída según unos intervalos de tiempo importantes, permitirá estudiar la propagación de epítopo.
Dichas diferencias permitirán discriminar las
respuestas T antes y después de un tratamiento de las respuestas
más implicadas durante la regresión de la enfermedad debida a la
terapia;
- -
- distinción entre los procesos inmunes precoces de los usados desde hace mucho tiempo en el caso de enfermedades autoinmunes por ejemplo, y entre los procesos inmunes implicados en diferentes formas de una misma enfermedad;
- -
- comparación de las representaciones gráficas suministradas por la invención con los resultados obtenidos mediante unas técnicas habituales de diagnóstico y de análisis inmunológico realizadas mediante otros métodos (por ejemplo: seguimiento de las células T mediante unos tetrámeros, seguimiento de la producción de las citoquinas mediante el método conocido con el nombre de Elispot) y posibilidad de correlacionar la evolución de la aparición y la desaparición de clones T a lo largo del tiempo con la evolución clínica del paciente para obtener unas informaciones importantes sobre la semiología y los procesos inmunes implicados en la enfermedad;
- -
- se podrán observar diferentes modificaciones después del tratamiento de una enfermedad (desapariciones de clones, modificación de los valores cuantitativos, modificación de la topología global de los perfiles, etc.). Estas modificaciones pueden indicar una subregulación, la deleción de clones autorreactivos o también la evolución de las células T implicadas. Esta semiología puede variar según la estrategia usada. En efecto, ciertos agentes pueden producir la apoptosis de las células autorreactivas mientras que las drogas citotóxicas tales como la ciclosporina o la mitoxantrona pueden conllevar modificaciones no específicas. Teóricamente, los perfiles de los pacientes obtenidos gracias a la invención podrían por lo tanto influir en la decisión del tratamiento. La invención puede asimismo ser útil para establecer unos criterios de tolerancia en unos pacientes aparentemente desprovistos de síntomas clínicos;
- -
- posibilidad de identificar, a nivel periférico, unas representaciones específicas de ciertas enfermedades. Asimismo, se prevé la posibilidad de superponer las gráficas obtenidas a partir de la sangre, y las observadas en el seno del injerto (por ejemplo para la detección de señales de rechazo crónico a través de una extracción de sangre);
- -
- el análisis según la invención sobre unas extracciones de pacientes podrá permitir definir un nuevo parámetro de selección de epítopos candidatos a una inmunoterapia (antitumoral por ejemplo) más eficaz;
- -
- aislamiento de células T detectadas mediante la combinación de los primeros y de los segundos datos como particularmente implicadas en la reacción inmunitaria estudiada. Después se podrá realizar un análisis de la especificidad y de la funcionalidad de estas células T aisladas. Esta identificación y después aislamiento de células T que portan un TCR particular permite realizar unos estudios funcionales o fenotípicos por ejemplo, no en la población de células T totales sino únicamente en las células T implicadas en la reacción inmunitaria estudiada. Este enfoque de búsqueda de genes mejorado permitirá identificar nuevas estrategias de inmunoterapias. A título de ejemplo, véase la figura 14.
El objetivo de numerosos procedimientos
vacunantes es desarrollar una respuesta T y, por lo tanto, medirla.
La invención representa para ello una aportación nueva
potencialmente muy útil. Además, el estudio de la topología de los
repertorios representados puede ser importante para detectar las
"firmas" específicas de un proceso patológico en un individuo.
En efecto, la invención se podrá usar, por ejemplo, para analizar la
evolución del proceso patológico en unos pacientes y/o para
influenciar la decisión de un tratamiento.
En el campo de la investigación farmacéutica y
médica, la invención servirá para la comprensión y el seguimiento
de patologías y/o de tratamientos en diferentes campos tales
como:
- -
- virología;
- -
- cancerología;
- -
- enfermedades autoinmunes;
- -
- tratamiento de las alergias (seguimiento de las desensibilizaciones);
- -
- trasplante de órganos, de tejidos o de médula, anticipación de la aparición de un rechazo agudo o crónico, investigación de clones reguladores en unos pacientes injertados a fin de saber si éstos son susceptibles de ser tolerantes a su injerto en ausencia de cualquier tratamiento inmunosupresor, etc.
En la investigación médica, la invención
servirá, por ejemplo, como herramienta clínica para la ayuda al
diagnóstico (enfermedades víricas, enfermedades autoinmunes,
cáncer) y el seguimiento de las terapias (vacunas, terapias
celulares, terapias génicas).
La invención se puede usar sobre el animal en la
ámbito de proyectos de investigación (ensayos animales, análisis
preclínicos, etc.), y sobre el ser humano en el ámbito de la
evaluación de tratamientos.
Otras características y ventajas de la invención
se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la siguiente
descripción de varios modos preferidos de realización dados a título
de ejemplos no limitativos haciendo referencia a los dibujos
adjuntos:
- la figuras 1 a 8 son unos diagramas relativos
al estudio de los linfocitos T y obtenidos con técnicas de la
técnica anterior;
- las figuras 9, 11 a 13 son unos diagramas
obtenidos con el procedimiento según la invención;
- la figura 10 es una representación esquemática
de los medios de realización de la invención y del soporte obtenido;
y
- la figura 14 representa un ejemplo de
clasificación. En este ejemplo, se ha obtenido un perfil TcLandscape
a partir de un paciente que padece esclerosis en placa. En la
gráfica, se observa que la familia V\beta17 está alterada y que
el número de transcritos V\beta17 es importante. Se han aislado
las células T que portan un TCR compuesto de los genes V\beta17
mediante citometría de flujo, y se han realizado unos estudios
funcionales sobre estas células aisladas. Se observa entonces una
transcripción particularmente elevada de las citoquinas
Il-6, Il-8 y TNFa en estas células.
Esta acumulación no se observa en las células T que portan un TCR
V\beta17+ de un sujeto sano. Por otra parte, estas células
V\beta17+ aisladas a partir del paciente presentan un fenotipo
activado.
Se describirá un primer modo de realización del
método según la invención en el contexto de la respuesta celular en
xenotrasplante.
En trasplante, las células T pueden reconocer
los péptidos antigénicos presentados por las células presentadoras
del receptor (vía indirecta) o del donante (vía directa). Estando la
vía de presentación directa particularmente implicada durante los
rechazos agudos, se ha estudiado el impacto de este tipo de
reconocimiento sobre el repertorio del TCR\beta. Gracias a la
invención, que permite añadir una dimensión cuantitativa a las
alteraciones cualitativas de la distribución de las longitudes de
la región CDR3, apareció que esta distribución no estaba alterada
en el reconocimiento directo mientras que las células T se
seleccionan en función de su segmento V\beta. Además, siguiendo
la regulación de la expresión del TCR como marcador de activación,
se muestra que una proporción importante de las células T no
sometidas a tratamiento previo pueden reconocer unas células
presentadoras "ajenas", fenómeno que permite comprender mejor
la amplitud de la respuesta directa y su implicación en el rechazo
agudo.
El análisis del repertorio del TCR permite
evaluar la diversidad de una población de linfocitos T y de seguir
su evolución en diferentes condiciones experimentales o durante la
progresión de una patología dada. Así, se pueden determinar unas
restricciones (ausencia de ciertas familias V\beta) o unas
alteraciones del repertorio (modificación de la repartición de las
longitudes de la CDR3 en una familia V\beta).
Se han desarrollado diferentes técnicas a fin de
analizar la región CDR3 y/o cuantificar las variaciones del
repertorio a nivel de la cadena V\beta del TCR. Actualmente, el
análisis cuantitativo del TCR se puede realizar mediante diferentes
métodos: el RNAse Protection Assay que adolece de la desventaja de
ser difícil técnicamente, la cuantificación a partir de una PCR
competitiva sobre CDR3, que no discrimina las diferentes familias
V\beta, los anticuerpos monoclonales
anti-V\beta. Para el análisis cuantitativo,
numerosos anticuerpos monoclonales dirigidos contra las diferentes
regiones variables del TCR \alpha\beta están disponibles en el
ser humano y en el ratón, y permiten un análisis de la expresión a
nivel proteico. Sin embargo, en el ratón, sólo tres anticuerpos
están disponibles y son eficaces, lo que limita el interés de este
método. Además, el análisis únicamente a nivel proteico no tiene en
cuenta los eventos de selección que se producen a nivel de la región
CDR3, que es la base de la especificidad del reconocimiento del
antígeno. Además, el porcentaje de expresión de una proteína
V\beta no es representativo del porcentaje de transcritos V\beta
correspondiente. En efecto, dicha cuantificación mediante unos
anticuerpos tiene el riesgo de subestimar el número de TCR puesto
que éstos son internalizados después de la activación. Otras
técnicas, basadas en la amplificación mediante PCR de las regiones
variables del TCR con la ayuda de cebadores específicos, permiten
analizar el repertorio a partir de ADN genómico. Los productos de
amplificación así obtenidos se pueden analizar mediante
autorradiografía, se pueden clonar y se pueden secuenciar.
El análisis cualitativo de la cadena \beta del
TCR (segundos datos) se basa en el estudio de la distribución de
las longitudes de la región hipervariable CDR3 del TCR en cada
familia V\beta de una población de linfocitos T dada. Un grupo de
células T en reposo se caracteriza por una repartición gaussiana de
las diferentes longitudes de la CDR3 en cada familia V\beta. La
movilización de clones T específicos tras el reconocimiento de un
antígeno se acompaña del uso preferente de ciertos TCR compuestos de
una familia V\beta y de una longitud de la CDR3 particular.
El principio de la técnica Immunoscope® consiste
en una amplificación, mediante PCR, de las diferentes regiones CDR3
usando un cebador 3' común dispuesto en el segmento C\beta y un
cebador 5' específico de cada familia V\beta (véase la lista de
secuencias). Después, los productos amplificados se someten a una
etapa de elongación efectuada con un segundo cebador C\beta
marcado con un fluoróforo. Los productos de amplificación
fluorescentes se separan en función de su longitud mediante
migración sobre gel de poliacrilamida. El perfil de migración se
analiza mediante un secuenciador de ADN conectado al programa
Immunoscope®. Así, se obtiene, con referencia a la figura 5, una
imagen de la distribución de las longitudes CDR3 para cada par de
cebadores. Se pueden observar entre 1 y 11 picos de amplificación
que corresponden cada uno a un tamaño particular de la región CDR3
y separados cada uno por tres nucleótidos. Este análisis se puede
afinar todavía más si se usa un cebador específico de un segmento
J\beta en lugar del cebador común C\beta. Como se ilustra en la
figura 6, el análisis de la repartición de las diferentes
longitudes de CDR3 permite identificar eventuales expansiones
oligoclonales.
El programa Reperturb permite comparar la
distribución de las longitudes CDR3 en una muestra dada con la
obtenida en un individuo de referencia (perfil gaussiano, no
alterado). Cada longitud CDR3 analizada mediante el programa
Immunoscope® se traduce en probabilidad de distribución, teniendo en
cuenta el espacio bajo la curva de cada pico. Para cada una de
ellas, la diferencia de valor absoluto entre la muestra (Rn) y el
perfil de referencia (Cn) permite obtener el porcentaje de
alteración de la muestra con relación a un perfil gaussiano. Este
análisis permite por lo tanto precisar el nivel de alteración
observado en un perfil Immunoscope®. Las variaciones obtenidas para
cada expansión CDR3 en una familia V\beta se expresarán, por lo
tanto, en porcentaje de alteración de un pico dentro de esta
familia. La suma de las alteraciones en todas las familias V\beta
permite estimar el porcentaje de alteración global de la cadena
V\beta del TCR en una población de células T.
Después, es preciso efectuar la cuantificación
de los transcritos V\beta que se puede abordar mediante varias
técnicas. En este caso, se puede usar el método de PCR cuantitativa
en tiempo real. Este procedimiento, basado en el uso de la
tecnología TaqMan®, puede usar el programa conocido con el nombre de
"ABI Prism 7700 Sequence Detection System" que permite
entre otros, detectar y medir la fluorescencia emitida por el enlace
de un marcador (Sybr®Green) a las moléculas de ADN de doble hebra.
El nivel de fluorescencia, directamente proporcional a la cantidad
del producto en un pocillo, se colecta durante cada ciclo de
amplificación. Paralelamente a las muestras, se puede usar un
estándar, que corresponde a una gama de dilución de la secuencia
diana, y permitirá establecer una curva patrón que se usa para
deducir la cantidad de la diana en cada muestra. A fin de eliminar
las variaciones experimentales entre las diferentes muestras, estos
valores se indican en la medición del gen de regulación HPRT.
A fin de mejorar la especificidad y la
sensibilidad de la PCR, se usa la enzima denominada polimerasa
AmpliTaq Gold® DNA. Una modificación de esta enzima la activa
únicamente a temperaturas elevadas, temperatura a la que el ADN
está completamente desnaturalizado. A fin de evitar una
contaminación con otros productos de PCR, se añade AmpErase®
uracil-N-glicosilasa (UNG) a la
mezcla de reacción en el momento de la dosificación. Esta enzima,
activa únicamente por debajo de 60ºC, actúa hidrolizando los puentes
de uracilo a nivel del ADN hebra simple o doble que contienen las
bases uracilos y que no tiene ninguna actividad sobre el ADN que
contiene unos timidinas. Esos puentes de uracilo se generan
mediante la introducción de las bases dUTP en la mezcla de
reacción. Durante la amplificación, una etapa inicial de 2 minutos a
50ºC activa esta amperasa y permite la eliminación de eventuales
contaminantes procedentes de la amplificación anterior.
Los estándares se preparan a partir de ARN
retrotranscritos procedentes de esplenocitos de un animal no tratado
previamente, o bien de linfocitos T procedentes de la sangre de
individuos sanos en el ser humano. Para la preparación de cada
estándar V\beta, se realiza la amplificación en un termociclador
clásico. Después, los productos de PCR se depositan a continuación
sobre un gel de agarosa y se extrae la banda de interés. La
concentración del producto de PCR se estima mediante el valor
DO_{260} y después, en función de la masa molecular, se calcula
el número de copias por ml. Después, se preparan unas diluciones de
cada estándar V\beta, C\beta o HPRT a 10^{7}, 10^{6},
10^{5}, 10^{4}, 10^{3} y 10^{2} copias por pocillo, a fin de
obtener una gama de concentración que cubre la de las muestras.
A fin de validar cada estándar, se realiza una
segunda PCR, esta vez en el ABI PRISM 7700 Sequence Detector
en presencia del marcador fluorescente Sybr®Green. Después, los
productos de PCR se depositan sobre un gel de agarosa, lo que
permite controlar la disminución decreciente de cada banda en
función de la dilución, así como el tamaño del producto de PCR. En
paralelo, el aumento de la intensidad de fluorescencia, seguido en
función del tiempo, se relaciona con el número de copias de ADN
contenidas en cada dilución. Esto permite verificar la precisión de
las diluciones del estándar, el rendimiento de la PCR y la ausencia
de contaminación.
Una vez validados, estos estándares permiten
deducir el número de copias de la diana en cada muestra, ensayada
por duplicado, indicando el nivel de fluorescencia en la línea
patrón. Esta línea se tiene en cuenta sólo si la eficacia de la PCR
es cercana de 100% (pendiente = -3,3) y si el coeficiente de
correlación es superior a 0,95.
Después, se trata de combinar los análisis
cualitativos y cuantitativos para dar una dimensión cuantitativa a
las alteraciones de la repartición de las longitudes de las CDR3.
Esta información puede permitir evaluar la representatividad de una
expansión oligoclonal en una población dada y puede asimismo
permitir visualizar unas modificaciones del repertorio que no están
asociadas a unas alteraciones a nivel de la región CDR3.
Se podrá usar un programa informático
desarrollado a fin de obtener una imagen que contiene el conjunto de
las informaciones relativas al repertorio estudiado. Para este fin,
se puede usar el programa de marca Matlab® puesto que permite así
la gestión flexible de un volumen muy grande de datos, y una puesta
en imagen suficientemente clara e informativa. Para cada familia
V\beta, el porcentaje de alteración con relación al perfil
gaussiano se mide mediante el método de Gorochov. Gracias al
programa Matlab®, estos valores se combinan con los primeros datos
(cuantitativos) a fin de obtener una representación 3D que ilustra
las variaciones al mismo tiempo cualitativas y cuantitativas del
transcriptoma V\beta en la que la altura de los picos ilustra la
cantidad de transcritos correspondientes V\beta mientras que los
porcentajes de alteraciones se ilustran mediante un código de
color.
En la gráfica de la figura 9, aparecen:
- -
- en abscisas, cada una de las familias V\beta;
- -
- en ordenadas, los datos cuantitativos (es decir la importancia relativa de cada familia V\beta);
- -
- según el eje Z, las diferentes longitudes posibles de la CDR3; y
- -
- siguiendo un código de colores, una visualización de las alteraciones del repertorio con relación a un perfil gaussiano.
El código de colores puede comprender una serie
de colores, por ejemplo del verde al rojo en el sentido de la
alteración creciente, es decir a medida que se aleja del 0% de
alteración. En el ejemplo, se tratará de diferentes niveles de
grises, siendo el gris cada vez más oscuro a medida que aumenta la
alteración.
Así, los transcritos V\beta alterados o no se
expresan según una gráfica tridimensional que presenta en abscisas
cada familia V\beta y en ordenadas los datos cuantitativos
obtenidos mediante TaqMan (PCR TaqMan de C\beta y de cada especie
de ARNm V\beta). El porcentaje de alteración de cada V\beta con
relación a un perfil gaussiano se visualiza según un código de
color (a cada color corresponde un "intervalo" de
alteraciones).
El procedimiento se usará mediante una
instalación que permite el análisis de los receptores de los
linfocitos T de un organismo, ilustrada esquemáticamente en la
figura 10. Esta instalación comprenderá unos medios automatizados
para amplificar la región CDR3 de cada uno de los genes V\beta de
los receptores de los linfocitos T asociados al organismo
(obtención de los segundos valores), y para cuantificar cada gen
V\beta (primeros datos). Podrá tratarse, por ejemplo, de una
máquina (2) tal como el aparato TaqMan® que permite, gracias a un
seguimiento de las amplificaciones en tiempo real, cuantificar los
transcritos V\beta durante su amplificación: los valores
cuantitativos así obtenidos permiten comparar unas cantidades de
transcritos de una cierta familia V\beta con unas cantidades de
transcritos de otra familia V\beta (ejemplo de aparato: ABI Prism
7900 de la compañía Applied Biosystems).
La instalación comprenderá asimismo unos medios
automatizados para medir las cantidades relativas de cada longitud
de la región CDR3 en cada familia V\beta, y la relación de estas
cantidades con valores predeterminados para obtener unos segundos
datos. Podrá tratarse de un secuenciador (4) que permite conocer la
parte relativa de cada transcrito que presenta un tamaño particular
de la CDR3 en una familia V\beta dada, pero que no permite
comparar las familias V\beta entre sí: (por ejemplo el
secuenciador capilar Megabace de la compañía Amersham pharmacia
biotech).
Por último, la instalación comprenderá unos
medios automatizados para representar en un diagrama de cuatro
variables los primeros y los segundos datos en función de los genes
V\beta y de la longitud de las regiones CDR3. Podrá tratarse de
un ordenador (6) mandado por un programa desarrollado, por ejemplo,
con la ayuda del programa Matlab® citado anteriormente. El
desarrollo de dicho programa en sí está al alcance del experto en
la materia y no se detallará más aquí. Eventualmente, este programa
será apropiado para mandar otras etapas de desarrollo del
procedimiento, incluso de la integridad de éste. El diagrama se
representará sobre un soporte de informaciones tal como una
pantalla de ordenador o un soporte de papel (8).
Este estudio se puede realizar durante la
cinética de una respuesta inmune en diferentes situaciones.
En este contexto de realización como en otros,
la invención permite realizar unos análisis más avanzados que con
los métodos de la técnica anterior. La invención permite tener una
visión general y tridimensional del tamaño del grupo de células T
que usan una reestructuración V\beta particular, y permite, por lo
tanto, conocer la importancia cuantitativa de las familias V\beta
seleccionadas durante la respuesta inmune.
Así, con referencia a la figura 11 que da un
ejemplo de aspecto de diagrama no relacionado con unas
circunstancias biológicas particulares, aparece que ciertas
familias, aunque altamente alteradas con relación al perfil
gaussiano, están sólo poco representadas a nivel cuantitativo y,
por lo tanto, no parecen desempeñar un papel preponderante
(ejemplo: familia x). La invención permite asimismo diferenciar una
situación de reposo de una situación en la que las células T están
activadas de manera policlonal. En efecto, la gráfica presentada en
la figura 12 procede de un modelo en el que unas células T están
activadas de manera policlonal, y se observa entonces una
movilización muy alta de ciertas familias V\beta que, sin embargo,
presentan una distribución gaussiana de las longitudes de CDR3 (lo
que corresponde al 0% de alteración). Así, esta técnica permite
entre otros, visualizar unas activaciones policlonales (ConA,
superantígeno, vía de presentación directa) que no se habrían
detectado mediante las herramientas habituales. Por lo tanto, se
trata de un medio potente para seguir las evoluciones del
repertorio durante diferentes respuestas inmunitarias.
En efecto, la gráfica procede de un modelo en el
que unas células T se activan in vitro, y se observa una
movilización muy alta de ciertas familias V\beta. En esta misma
escala, una muestra de control daría un perfil verde (gris claro)
porque todas las familias presentan una distribución gaussiana de
las longitudes de CDR3 (lo que corresponde al 0% de alteración) y
plana porque todas las familias V\beta están poco representadas.
Por lo tanto, se trata de un medio potente para seguir las
evoluciones del repertorio durante diferentes respuestas
inmunitarias.
En la figura 13, se ha ilustrado el diagrama
resultante de un segundo modo de realización de la invención. La
invención se usa en este caso en el ámbito de un estudio realizado
sobre unos pacientes que padecen melanoma y vacunados. La familia
V\beta13 parece particularmente implicada en la respuesta
anti-melanoma en la medida en la que aparece un
pico rojo (gris oscuro), y por lo tanto alejado del perfil gaussiano
característico de una respuesta normal, y cuantitativamente
importante. Otra familia parece desempeñar un papel menos
importante: la familia V\beta23 que está perturbada pero poco
importante a nivel cuantitativo. Además, un macizo aparece a nivel
de las primeras familias V\beta. Éste podría corresponder a un
efecto de la vacunación. Unos estudios complementarios permitirán
determinarlo.
A continuación, se describirá un modo de
realización en el que el procedimiento de la invención se completa
por una etapa de aislamiento de los clones que presentan unas
familias V\beta alteradas.
Las alteraciones específicas del repertorio
detectadas con la ayuda de la invención no son, muy a menudo,
detectables mediante unas técnicas habituales de citometría de
flujo. En efecto, mientras que la invención permite detectar una
alteración y una acumulación de transcritos para una familia
V\beta dada, la citometría de flujo permite sólo detectar la
expresión membranaria de la proteína V\beta. Ahora bien, la
expresión proteica en superficie es transitoria y no permite
detectar una modificación de la actividad transcripcional de una
célula en un momento preciso.
Como ya se ha observado, la invención permite
así detectar una modificación de la actividad transcripcional para
una familia dada. Una vez la familia detectada, es posible extraerla
del resto de la población linfocitaria a fin de estudiar sus
características específicas (fenotipo, activación, etc.). En efecto,
si se estudiaran estas características en la población total,
serían enmascaradas por la suma de las características de todas las
demás poblaciones de células T.
El presente modo de representación permite, por
lo tanto, identificar unas poblaciones particulares implicadas en
la respuesta inmunitaria estudiada. Estas células T, que portan un
TCR compuesto de una familia V\beta particular, se pueden aislar
después mediante citómetro de flujo con la ayuda de anticuerpos
anti-V\beta por ejemplo, lo que hace posible la
caracterización de los clones portadores de alteraciones específicas
(cualitativas y/o cuantitativas) del repertorio de la cadena
\beta del TCR.
Después del uso de la invención como se expone
en los modos anteriores, incluyendo la etapa de realización del
diagrama, las células que expresan las diferentes familias V\beta
caracterizadas por unas expansiones oligoclonales y/o grandes
cantidades de ARN mensajeros, se sacan mediante citometría de flujo
gracias a unos anticuerpos dirigidos contra las diferentes familias
V\beta.
Así, cada familia V\beta antes de la selección
representa menos del 5% del repertorio V\beta. Después de la
selección, se puede trabajar sobre una población dada muy pura
puesto que la pureza obtenida es superior a 98%.
Varias selecciones sucesivas son posibles y, por
lo tanto, se pueden aislar varios clones de células T a partir de
una misma extracción puesto que después de la selección de una
población de células T particular, la población que queda comprende
todos los demás tipos de células T. Este mismo extracto celular que
ha permitido aislar una primera población de células T podrá, por
lo tanto, asimismo servir de base para la extracción de otra
familia V\beta. Las posibilidades y las aportaciones de esta
técnica son, por lo tanto, muy importantes y mejoran la técnica de
base de la invención. Una vez determinado el número de células
extraídas, las células se usan para unos estudios fenotípicos y
transcripcionales.
Estos estudios son fundamentales puesto que
permitirán determinar el papel de un clon linfocitario en una
situación dada. Esta determinación del papel de los clones de
células T es muy importante en la medida en la que el clon
identificado resulta tener una función citotóxica (virus tales como
VIH; CMV; EBV; enfermedades autoinmunes) será preciso inhibirlo en
el marco de estrategias de inmunoterapias. Por el contrario, si este
clon resulta tener una función protectora (trasplante, tratamientos
inmunosupresores), convendrá estimularlo para obtener un efecto
beneficioso.
Para la realización de esta técnica, se podrá
usar un citómetro en flujo que permite aislar las células T
detectadas mediante la tecnología según la invención, después del
marcado de las poblaciones de células T consideradas con un
anticuerpo anti-V\beta, tal como el comercializado
con la denominación "Facscalibur" por la compañía Beckton
Dickinson.
Tal como se ilustra en la figura 14, la
invención se refiere asimismo a un procedimiento que permite la
identificación, en unas poblaciones de linfocitos T particulares,
de genes, de moléculas y de mecanismos implicados en unos procesos
fisiopatológicos.
Se usa el procedimiento de análisis según la
invención y se pueden aislar las poblaciones de células T para las
cuales los transcritos de TCR están muy representados entre el
conjunto de los transcritos de la población de células T total, y
comparar el fenotipo de estas células con relación al fenotipo de
las células de la población general, permitiendo así demostrar las
vías de respuesta a estímulos.
Evidentemente, se podrán aportar numerosas
modificaciones como por ejemplo en el diagrama, la variable
representada por unas diferencias de aspecto local del diagrama
podrá ser diferente a la que corresponde a los segundos datos.
La diferencia de aspecto local se podrá ilustrar
de otra manera diferente de unos colores o matices de gris. Por
ejemplo, podrá tratarse de diferentes tipos de rayados o de otros
tipos de señales.
La invención se refiere asimismo a cada cebador
para la amplificación de las regiones CDR3, tales como las indicadas
en el listado de secuencias.
<110> Institut National de la Santé et de
la Recherche - INSERM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de análisis de los
linfocitos T por medio de los receptores de los linfocitos T de un
organismo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D19540
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 06/283378
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
13-04-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctccttccc attcacccac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgactccacc caaggtctcc ttgtttga
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatgcccag aaaagtccaa gt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcagaactc tgtactgcac ct
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaaattcac cttggagcct ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgagtgtcc cttaaactct ccc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtcgcttc caacctcaca a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgagatgaac atgagtgcct tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaggcagat ggctgtttat ctc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgattct ggagtctgct aa
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttctctctc attctggagt cagc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtcggctt ccccctct
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctctctta acatcacctc tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtcgcttct tgcctcagtc tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaagatcca gaccacacaa cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatccatct ccacgctgaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagagtgact cagccaccta tctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcactcactc tggcttctac ctct
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacatcctga tgacagaggc tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctgaagat ccaacgcaca ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Rattus rattus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Rattus rattus
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<212> ADN
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<213> Rattus rattus
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<211> 19
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill19
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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\hfill25
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<210> 55
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill22
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\hfill22
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<210> 57
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<211> 22
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcttatttctg tgccagctca cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 58
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<211> 22
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipctccactctc aagatccagc ct
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 59
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipccacaaagct ggaggactca g
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagttcct catttcgttt ta
\hfill22
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<212> ADN
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\hskip-.1em\dddseqskipctttctgctt tcttgacatc cg
\hfill22
Claims (9)
1. Procedimiento de análisis de la activación y
de la movilización de las células T por medio de un análisis de los
receptores de los linfocitos T de un organismo, caracterizado
porque comprende las etapas siguientes:
- -
- determinar el número de transcritos para cada gen V\beta, para obtener unos primeros datos.
- -
- amplificar la región CDR3 de los receptores de los linfocitos T para cada uno de los genes V\beta asociados al organismo,
- -
- separar las diferentes longitudes de la CDR3 de los receptores de los linfocitos T para cada uno de los genes V\beta asociados al organismo, y estimar la proporción de los transcritos de cada longitud de la CDR3 en cada familia V\beta para obtener unos segundos datos,
- -
- representar en un diagrama de cuatro variables los primeros y los segundos datos en función de los genes V\beta y de la longitud de las regiones CDR3.
2. Procedimiento según la reivindicación
anterior, caracterizado porque al menos una de las variables
está representada sin estar asociada a una dimensión del
espacio.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la variable que no está asociada a una
dimensión del espacio corresponde a los segundos datos.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos
una de las variables está representada por diferencias de aspecto
local del diagrama.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque las diferencias de aspecto local son
unas diferencias de color.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los
primeros datos están representados siguiendo la dirección
vertical.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende,
después de la determinación de los primeros y de los segundos
datos, las etapas que consisten en elegir un gen V\beta en
función de los resultados de las dos primeras etapas, y en extraer
de la población de células T total las células T que portan un TCR
constituido por esta familia V\beta previamente elegida.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos
algunas de las etapas se realizan de manera automatizada.
9. Instalación de análisis de los receptores de
los linfocitos T de un organismo, caracterizada porque
comprende:
- -
- unos medios automatizados para amplificar la región CDR3 de los receptores de los linfocitos T para cada gen V\beta asociado al organismo;
- -
- unos medios automatizados para medir las cantidades de cada gen V\beta para obtener unos primeros datos;
- -
- unos medios automatizados para medir, para cada gen V\beta, la cantidad relativa de cada región CDR3 con relación a la totalidad de las regiones CDR3 asociadas a un gen V\beta para obtener unos segundos datos; y
- -
- unos medios automatizados para representar en un diagrama de cuatro variables los primeros y los segundos datos en función de los genes V\beta y de la longitud de las regiones CDR3.
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|---|---|---|---|
| US28337801P | 2001-04-13 | 2001-04-13 | |
| US283378P | 2001-04-13 |
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| ES2301668T3 true ES2301668T3 (es) | 2008-07-01 |
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Family Applications (1)
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| EP (1) | EP1393236B1 (es) |
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-
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