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ES3030504T3 - Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries - Google Patents

Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries

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Publication number
ES3030504T3
ES3030504T3 ES17890676T ES17890676T ES3030504T3 ES 3030504 T3 ES3030504 T3 ES 3030504T3 ES 17890676 T ES17890676 T ES 17890676T ES 17890676 T ES17890676 T ES 17890676T ES 3030504 T3 ES3030504 T3 ES 3030504T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
amplification
solution
nucleic acids
target nucleic
flow cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17890676T
Other languages
English (en)
Inventor
Shaun Hunter
Peter Mcinerney
Jonathan Boutell
Claire Bevis-Mott
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Illumina Cambridge Ltd
Illumina Inc
Original Assignee
Illumina Cambridge Ltd
Illumina Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Illumina Cambridge Ltd, Illumina Inc filed Critical Illumina Cambridge Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES3030504T3 publication Critical patent/ES3030504T3/es
Active legal-status Critical Current
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Abstract

Un método de ejemplo incluye la reacción de una primera solución y una segunda solución diferente en una celda de flujo, haciendo fluir la primera solución sobre los sitios de amplificación de la celda y, posteriormente, la segunda solución sobre los sitios de amplificación. La primera solución incluye ácidos nucleicos diana y una primera mezcla de reactivos que comprende nucleósidos trifosfato y enzimas de replicación. Los ácidos nucleicos diana de la primera solución se transportan y se unen a los sitios de amplificación a una velocidad de transporte. La primera mezcla de reactivos amplifica los ácidos nucleicos diana unidos a los sitios de amplificación para producir poblaciones clonales de amplicones procedentes de los ácidos nucleicos diana correspondientes. Los amplicones se producen a una velocidad de amplificación superior a la velocidad de transporte. La segunda solución incluye una segunda mezcla de reactivos y carece de los ácidos nucleicos diana. La segunda solución consiste en aumentar el número de amplicones en los sitios de amplificación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Amplificación por exclusión cinética de bibliotecas de ácidos nucleicos
Antecedentes
El análisis genético está adquiriendo una importancia cada vez mayor en la sociedad moderna. Los análisis genéticos ya han demostrado su utilidad para predecir el riesgo de que una persona contraiga algunas enfermedades (diagnóstico), determinar la probabilidad de beneficio terapéutico frente al riesgo de efectos secundarios para una persona que esté considerando ciertos tratamientos (pronósticos) e identificar a las personas desaparecidas, los autores de delitos, las víctimas de delitos y las víctimas de la guerra (análisis forense), por nombrar algunos. Sin embargo, en muchos casos, las pruebas genéticas apropiadas aún no están disponibles o presentan altas tasas de error. Una fuente de estos problemas es que muchas de las pruebas genéticas que se utilizan actualmente para el diagnóstico, el pronóstico y la ciencia forense se basan en tecnologías que exploran solo una fracción del genoma de una persona. Los rasgos genéticos de una persona están codificados por un genoma que contiene más de 3 mil millones de pares de bases y, sin embargo, la mayoría de las pruebas genéticas investigan mutaciones solo en unos pocos de estos pares de bases. Al aumentar la fracción del genoma analizada, idealmente hasta incluir los 3 mil millones de pares de bases del genoma, se puede mejorar la precisión de las pruebas genéticas y se pueden desarrollar pruebas genéticas para situaciones más diagnósticas y pronósticas.
Un componente de muchas pruebas genéticas es la preparación del material genético que se va a analizar. Este no es un asunto trivial cuando se intenta capturar un genoma completo y mantener su integridad. Dos métodos que están disponibles actualmente para capturar grandes cantidades de material genético son la reacción en cadena de la polimerasa en emulsión (ePCR, por sus siglas en inglés) y la amplificación por conglomerados (p. ej., mediante amplificación en puente). El uso de estos métodos en aplicaciones clínicas y de diagnóstico es actualmente limitado.
Para la ePCR, se forman gotículas acuosas en una fase oleosa junto con fragmentos del genoma y perlas portadoras. Las condiciones se eligen para optimizar la probabilidad de que cada gotícula aísle un fragmento de genoma individual y una sola perla portadora. El objetivo es que las gotículas formen microrreactores que impidan la difusión de los fragmentos del genoma entre las gotitas y, por lo tanto, entre diferentes perlas. A continuación, se pueden llevar a cabo varios ciclos de amplificación por PCR para la emulsión en masa, de tal modo que en cada gotícula la perla se recubra con copias clonales del fragmento de genoma existente. Tras la amplificación, las perlas se transfieren a un sustrato de detección para su evaluación en un instrumento analítico. Una complicación de la ePCR es que algunas de las perlas terminan en gotículas sin un fragmento del genoma, lo que produce perlas en blanco. Se puede llevar a cabo un proceso de enriquecimiento de perlas para eliminar las perlas en blanco antes de utilizarlas en el instrumento analítico; sin embargo, este proceso puede resultar engorroso e ineficaz. Otra complicación de la ePCR es que algunas gotículas terminan con más de un fragmento del genoma, lo que produce perlas de clones mixtos. Aunque las perlas de clones mixtas a menudo pueden identificarse y después ignorarse durante el análisis, su presencia disminuye la eficiencia y, en algunos casos, la precisión del análisis.
La amplificación por conglomerados proporciona un enfoque más simplificado para la captura y amplificación del material genético. En los ejemplos comerciales, los fragmentos del genoma se capturan en la superficie de un sustrato para formar “ semillas” en ubicaciones aleatorias. Después de eliminar el exceso de fragmentos del genoma (es decir, los que no se han capturado), se llevan a cabo varios ciclos de amplificación para crear copias clonales que forman un conglomerado en la superficie alrededor de cada semilla. Las ventajas de la amplificación por conglomerados en comparación con la ePCR incluyen evitar el paso de enriquecimiento de las perlas, evitar el paso de transferencia de las perlas (de la emulsión al sustrato de detección) y evitar las emulsiones oleosas desordenadas y, a menudo, delicadas. Sin embargo, una complicación potencial de las técnicas comerciales de amplificación por conglomerados es que forman un patrón aleatorio de grupos en la superficie. Aunque se han desarrollado protocolos de registro de imágenes para localizar y distinguir conglomerados ubicados de forma aleatoria, dichos protocolos suponen una carga de análisis adicional para los dispositivos analíticos. Además, los conglomerados localizados aleatoriamente tienden a llenar una superficie de manera menos eficiente de lo que es teóricamente posible para un patrón de conglomerados ordenado espacialmente.
Por lo tanto, existe la necesidad de métodos mejorados para preparar material genético para análisis de diagnóstico, pronóstico y forenses. La presente descripción aborda esta necesidad y también proporciona otras ventajas.
La patente WO 2016/075204 A1 describe un método para amplificar un ácido nucleico, que incluye: a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie del pocillo interior, en donde la primera capa cubre la superficie del pocillo interior; b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa; c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo; d) poner en contacto una muestra que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un polinucleótido diana se hibride con un cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura, y e) realizar un primer ensayo de exclusión cinética (KEA, por sus siglas en inglés) para producir una población clonal de amplicones a partir del polinucleótido diana dentro del pocillo, amplificando así el polinucleótido diana. En algunas realizaciones, el método incluye además realizar una amplificación en puente o un segundo KEA para aumentar la población clonal de amplicones de polinucleótidos diana.
La patente US-9.415.368 B2 describe un sistema o dispositivo para la creación de matrices de conglomerados de ácidos nucleicos mediante amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, dichos sistemas/dispositivos comprenden un chasis de cuerpo; un colector; una válvula fluídica para dirigir el flujo de fluido entre los depósitos y las celdas de flujo, etc.; una bomba fluídica; un depósito de reactivos; al menos un componente de control de temperatura y, opcionalmente, uno o más de dichos componentes; y un componente de control informático. En tales realizaciones, los depósitos, las válvulas, las bombas, los colectores, el componente de control de temperatura y el componente informático están conectados funcionalmente entre sí y los depósitos, válvulas, bombas y colectores están conectados directa o indirectamente de manera fluida entre sí. También, en tales realizaciones, uno o más fluidos pueden fluir bajo el control del ordenador desde los depósitos de reactivos a una superficie (p. ej., de una celda de flujo), lo que permite la amplificación de ácidos nucleicos y la creación de matrices de conglomerados de ácidos nucleicos sobre la superficie.
La patente WO 2016/193695 A1 describe métodos y composiciones para mejorar la utilización de cebadores de superficie durante el proceso de amplificación de superficie. En la presente memoria se presentan métodos y composiciones para preparar moldes inmovilizados para una reacción de secuenciación de ácidos nucleicos que comprende: (a) proporcionar un soporte sólido que tiene una pluralidad de cebadores de amplificación directa e inversa inmovilizados en el mismo, en donde un subconjunto de la pluralidad de cebadores de amplificación comprende un sitio de escisión; (b) amplificar una plantilla utilizando el subconjunto de cebadores del soporte para producir una pluralidad de moléculas de ácido nucleico bicatenarias, en donde ambas cadenas de cada molécula de ácido nucleico bicatenario están unidas al soporte sólido en sus extremos 5'; (c) escindir el subconjunto de cebadores en el sitio de escisión; y (d) someter la cadena escindida a condiciones parcialmente desnaturalizantes para facilitar la hibridación de una parte de la cadena no inmovilizada del producto de amplificación con el cebador de amplificación inmovilizado complementario, seguido de la extensión del cebador de amplificación inmovilizado para generar una copia de la cadena no inmovilizada del producto de amplificación. En algunas realizaciones, el paso (d) comprende aplicar cebadores en solución para facilitar la hibridación de los cebadores con el extremo no inmovilizado del producto de amplificación inmovilizado.
Resumen de la invención
Se proporciona un método (p. ej., para amplificar bibliotecas de ácidos nucleicos) tal como se reivindica en la reivindicación 1, que incluye hacer reaccionar una primera solución y una segunda solución diferente en una celda de flujo haciendo fluir la primera solución sobre una matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo y, posteriormente, hacer fluir la segunda solución sobre la matriz de sitios de amplificación. La primera solución incluye varios ácidos nucleicos diana y una primera mezcla de reactivos que comprende nucleósidos trifosfatos (NTP, por sus siglas en inglés) y una o más enzimas de replicación. Los ácidos nucleicos diana en la primera solución se transportan y se unen a los sitios de amplificación a una velocidad de transporte. La primera mezcla de reactivos amplifica los ácidos nucleicos diana que están unidos a los sitios de amplificación para producir poblaciones clonales de amplicones que se originan a partir de los ácidos nucleicos diana correspondientes. Los amplicones se producen a una velocidad de amplificación que supera la velocidad de transporte. La segunda solución incluye una segunda mezcla de reactivos y carece de los ácidos nucleicos diana. La segunda solución es aumentar el número de amplicones en las poblaciones clonales en los sitios de amplificación.
La segunda mezcla de reactivos incluye los NTP y una o más enzimas de replicación de la primera mezcla de reactivos.
La celda de flujo incluye una pluralidad de cebadores unidos a la celda de flujo en los sitios de amplificación, en donde la primera solución reacciona en la celda de flujo para unir los ácidos nucleicos diana y los amplicones a un primer subconjunto de los cebadores, y en donde la segunda solución reacciona en la celda de flujo para producir amplicones adicionales y unir los amplicones adicionales a al menos algunos de los cebadores en un subconjunto expuesto de los cebadores diferente del primer subconjunto.
Este método puede incluir además eliminar la primera solución de la celda de flujo antes de hacer fluir la segunda solución sobre la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo, de tal modo que los únicos ácidos nucleicos diana en la celda de flujo a medida que la segunda solución fluye sobre la matriz de sitios de amplificación estén unidos a la celda de flujo y no floten libremente dentro de la primera solución.
En un ejemplo de este método, la matriz de sitios de amplificación está dispuesta a lo largo de una superficie de la celda de flujo, en donde la primera solución fluye a través de un puerto de entrada de la celda de flujo a través de la superficie de la celda de flujo, y en donde la segunda solución fluye posteriormente a través del puerto de entrada a través de la superficie de la celda de flujo.
En un ejemplo de este método, la celda de flujo incluye una pluralidad de cebadores unidos a la celda de flujo en los sitios de amplificación, en donde al menos algunos de los cebadores se unen a los ácidos nucleicos diana en la primera solución en respuesta al flujo de la primera solución por la matriz de sitios de amplificación, y en donde, posteriormente, la segunda solución que carece de los ácidos nucleicos diana por la matriz de sitios de amplificación no produce una unión adicional de los cebadores a los ácidos nucleicos diana.
En un ejemplo de este método, la primera solución y la segunda solución fluyen isotérmicamente sobre la matriz de sitios de amplificación.
En algunos ejemplos, la segunda mezcla de reactivos incluye los NTP y una polimerasa, y en otros ejemplos, la segunda mezcla de reactivos incluye una o más de una helicasa y una recombinasa, y en otros ejemplos más, la segunda mezcla de reactivos incluye un cebador que tiene al menos una secuencia de cebador P5 o una secuencia de cebador P7.
En un ejemplo de este método, los sitios de amplificación son pocillos a lo largo de una superficie de la celda de flujo, los pocillos están separados entre sí por regiones intersticiales a lo largo de la superficie.
Un ejemplo de este método comprende además controlar la velocidad de transporte de los ácidos nucleicos diana a los sitios de amplificación utilizando uno o más de los siguientes métodos: controlar la concentración de los ácidos nucleicos diana en la primera solución, controlar la viscosidad de la primera solución, controlar el tamaño promedio de los ácidos nucleicos diana y controlar la presencia o ausencia de un reactivo de aglomeración molecular en la primera solución.
Otro ejemplo de este método comprende además controlar la velocidad de amplificación de los ácidos nucleicos diana utilizando uno o más de: controlar una concentración de los NTP en la primera mezcla de reactivos, controlar una concentración de una o más enzimas de replicación en la primera mezcla de reactivos y controlar la temperatura en los sitios de amplificación.
Debe entenderse que todas las características del método pueden combinarse de cualquier forma y/o configuración deseable.
En otro ejemplo, se proporciona un sistema fluídico (p. ej., para amplificar bibliotecas de ácidos nucleicos) tal como se reivindica en la reivindicación 14, que incluye un colector de reactivos y un controlador. El colector de reactivos incluye al menos una válvula en comunicación fluida con un puerto de entrada de una celda de flujo que incluye una serie de sitios de amplificación. El colector de reactivos incluye además una pluralidad de canales conectados de manera fluida entre la al menos una válvula y los depósitos de reactivos correspondientes. El controlador incluye uno o más procesadores. El controlador debe controlar al menos una válvula y una bomba para hacer fluir una primera solución a través del puerto de entrada sobre la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo y, posteriormente, hacer fluir una segunda solución diferente a través del puerto de entrada sobre la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo. La primera solución incluye varios ácidos nucleicos diana y una primera mezcla de reactivos que comprende nucleósidos trifosfatos (NTP) y una o más enzimas de replicación. El número de ácidos nucleicos diana en la primera solución supera el número de sitios de amplificación de la matriz. La primera solución reacciona en la célula de flujo para producir poblaciones clonales de amplicones en los sitios de amplificación que se originan a partir de los ácidos nucleicos diana correspondientes. Los ácidos nucleicos diana en la primera solución se transportan y se unen a los sitios de amplificación a una velocidad de transporte. La primera mezcla de reactivos amplifica los ácidos nucleicos diana que están unidos a los sitios de amplificación para producir los amplicones a una velocidad de amplificación que supera la velocidad de transporte. La segunda solución incluye una segunda mezcla de reactivos y carece de los ácidos nucleicos diana. La segunda solución reacciona en la celda de flujo para aumentar el número de amplicones en las poblaciones clonales de amplicones en los sitios de amplificación.
En un ejemplo de este sistema fluídico, el controlador controla al menos una válvula y la bomba para mezclar una plantilla de muestra que incluye los ácidos nucleicos diana con la primera mezcla de reactivos para formar la primera solución, y en donde el controlador controla la al menos una válvula y la bomba para formar la segunda solución mezclando la segunda mezcla de reactivos sin mezclar la plantilla de muestra con la segunda mezcla de reactivos. En otro ejemplo de este sistema fluídico, el controlador debe controlar al menos una válvula y la bomba para eliminar la primera solución de la celda de flujo antes de hacer fluir la segunda solución sobre la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo, de tal modo que los únicos ácidos nucleicos diana que están presentes cuando la segunda solución fluye sobre la matriz de sitios de amplificación se unan a la celda de flujo y no floten libremente dentro de la primera solución.
Debe entenderse que todas las características del sistema fluídico pueden combinarse de cualquier forma deseable. Además, debe entenderse que puede utilizarse conjuntamente cualquier combinación de características del sistema fluídico y/o del método, y/o que las características de cualquiera o ambos de estos aspectos puede combinarse con cualquiera de los ejemplos descritos en la presente memoria.
En un ejemplo, se proporciona un método (p. ej., para amplificar bibliotecas de ácidos nucleicos) tal como se reivindica en la reivindicación 13, que incluye mezclar una primera mezcla de reactivos con una cantidad de ácidos nucleicos diana dentro de un depósito para definir una primera solución. La primera mezcla de reactivos comprende nucleósidos trifosfatos (NTP) y una o más enzimas de replicación. El método también incluye hacer fluir la primera solución desde el depósito a través de una serie de sitios de amplificación en una celda de flujo. Los ácidos nucleicos diana en la primera solución se transportan y se unen a los sitios de amplificación a una velocidad de transporte. La primera mezcla de reactivos amplifica los ácidos nucleicos diana que están unidos a los sitios de amplificación para producir poblaciones clonales de amplicones que se originan a partir de los ácidos nucleicos diana correspondientes. Los amplicones se producen a una velocidad de amplificación que supera la velocidad de transporte. Después de hacer fluir la primera solución desde el depósito, el método incluye mezclar una segunda mezcla de reactivos dentro del depósito sin añadir una cantidad adicional de los ácidos nucleicos diana al depósito para definir una segunda solución. La segunda mezcla de reactivos comprende cantidades frescas de los NTP y una o más enzimas de replicación. El método incluye además hacer fluir la segunda solución desde el depósito sobre la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo. La segunda mezcla de reactivos reacciona con los amplicones para aumentar el número de amplicones en las poblaciones clonales en los sitios de amplificación.
En un ejemplo de este método, la primera mezcla de reactivos y la segunda mezcla de reactivos incluyen un componente regulador, y la segunda mezcla de reactivos incluye una mayor cantidad del componente regulador en relación con la primera mezcla de reactivos para compensar la falta de adición de la cantidad adicional de los ácidos nucleicos diana dentro de la segunda solución.
Debe entenderse que cualesquiera características de este ejemplo del método pueden combinarse de cualquier manera deseable. Además, debe entenderse que puede utilizarse conjuntamente cualquier combinación de características de este método y/o el sistema fluídico y/o el otro método puede utilizarse y/o que cualquier característica de cualquiera de estos aspectos pueden combinarse con cualquiera de las características de los ejemplos descritos en la presente memoria.
Breves descripciones de los dibujos
Las características de los ejemplos de la presente descripción se harán evidentes como referencia a la siguiente descripción detallada y los siguientes dibujos, en los cuales los mismos números de referencia corresponden a componentes similares, aunque quizás no idénticos. En aras de la brevedad, los números de referencia o las características cuya función ya se haya descrito anteriormente podrán o no describirse en relación con otros dibujos en los que aparezcan.
La figura 1A muestra una imagen compuesta (cuatro canales de color) obtenida después de un primer ciclo de secuenciación para un ejemplo de celda de flujo modelada producida por exclusión cinética.
La figura 1B muestra una imagen compuesta (cuatro canales de color) obtenida después de un único ciclo de secuenciación para un ejemplo de celda de flujo que tiene conglomerados localizados aleatoriamente.
La figura 2 muestra las funciones de la función de distribución de pares (PDF, por sus siglas en inglés) y del vecino más cercano (NN, por sus siglas en inglés) para una imagen compuesta obtenida después de un primer ciclo de secuenciación utilizando un ejemplo de celda de flujo modelada producida por exclusión cinética.
La figura 3 muestra, en un ejemplo, un diagrama de dispersión de las posiciones espaciales de los conglomerados que se alinean con las primeras 5 posiciones genómicas del genoma PhiX. Las diferentes posiciones genómicas se indican mediante équises, asteriscos, cuadrados, triángulos y rombos.
La figura 4 muestra, en (a) y (b), vistas esquemáticas y parcialmente transversales de ejemplos de arquitecturas de celdas de flujo para la desorción electroquímica de especies de la superficie de la celda de flujo y también muestra, en (c), imágenes de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF, por sus siglas en inglés) de superficies de electrodos de la configuración de celdas de flujo mostrada en (b) después de utilizarse para la extracción asistida por campo de ácido desoxirribonucleico (ADN). El potencial eléctrico se puede aplicar a través de una superficie conductora y el electrolito como se ve en (a) o a través de dos superficies conductoras como se muestra en (b). La configuración de celdas de flujo que se muestra en (b) también se puede utilizar para la extracción asistida por campo de ADN en tiempo real, logrando una concentración de ADN de más de 100 veces en la superficie del electrodo en unos pocos segundos, como se muestra en (c).
La figura 5 muestra un ejemplo de flujo de trabajo para la formación asistida por campo eléctrico de patrones de biomoléculas, y vistas esquemáticas y parcialmente transversales del flujo de trabajo ejemplar antes y después de la aplicación del campo eléctrico.
La figura 6 muestra, en un ejemplo, la siembra de plantillas y la amplificación por conglomerados de las plantillas sobre características de oro (Au) de 2 pm sobre un fondo de óxido de indio y estaño (ITO, por sus siglas en inglés) en presencia de un campo eléctrico (a) y sin campo eléctrico (b). Los perfiles de línea correspondientes muestran la intensidad de fluorescencia en las regiones etiquetadas.
La figura 7 muestra, en un ejemplo, imágenes de fluorescencia de área grande después de la siembra y la formación de conglomerados en presencia de un campo eléctrico. (a) muestra un carril de celdas de flujo que contiene puntos de Au de 2 |jm; y (b) muestra un carril que contiene puntos de Au de 200 nm. Los cúmulos están alineados en grandes áreas con las características con patrones micro y nanométricos, la naturaleza ordenada espacialmente de estos conglomerados se confirma mediante las correspondientes transformadas de Fourier (FFT).
La figura 8 muestra ejemplos de formación de conglomerados de ADN en sitios de SiO<2>de 700 nm de diámetro en presencia de campo eléctrico. Los conglomerados están muy ordenados con poca fluorescencia de las áreas intersticiales.
La figura 9 muestra, en un ejemplo, (a) los resultados de un ensayo de hibridación en una celda de flujo instrumental HISEQ® (1) antes del injerto de cebadores P5 y P7 asistido por campo eléctrico, (2) después del injerto de cebadores P5 y P7 asistido por campo eléctrico, (3) después del injerto y reinjerto de cebadores P5 y P7 asistido por campo eléctrico, y (4) después del injerto de cebadores P5 y P7 asistido por campo eléctrico. cebadores para injertos de P5 y P7, revestimiento de acrilamida sin silano (SFA, por sus siglas en inglés) y reinjerto de cebadores P5 y P7; y (b) un gráfico que representa la intensidad de fluorescencia media (en unidades arbitrarias, a.u.) por carril de celdas de flujo después de cada paso.
La figura 10 muestra, en un ejemplo, (a) una representación esquemática de la hibridación directa en sitios dieléctricos utilizando un campo eléctrico; (b) grupos con patrones espaciales formados en presencia de un campo eléctrico repelente de ácidos nucleicos en las regiones intersticiales y (c) conglomerados ordenados al azar formados en ausencia del campo eléctrico repelente de ácidos nucleicos en las regiones intersticiales.
La figura 11 es un diagrama de flujo de un método para generar conglomerados genéticos según un ejemplo descrito en la presente memoria.
La figura 12 es un gráfico de barras que muestra, en un ejemplo, la intensidad de la señal (en unidades arbitrarias, es decir,) de los conglomerados genéticos en una celda de flujo para diferentes métodos de generación de conglomerados.
La figura 13 es un gráfico de barras que muestra, en un ejemplo, los valores del filtro de paso porcentual (% PF) para los métodos de generación de conglomerados mostrados en la figura 12.
La figura 14 es una ilustración esquemática de un sistema fluídico para generar conglomerados genéticos según un ejemplo descrito en la presente memoria.
Descripción detallada
Se describen, pero no se reivindican, bibliotecas de ácidos nucleicos y métodos para fabricar bibliotecas de ácidos nucleicos. En ejemplos particulares, una biblioteca de ácidos nucleicos de la presente descripción está en forma de una matriz de sitios.
La matriz puede tener sitios que son clonales con respecto a secuencias de nucleótidos particulares. En consecuencia, los sitios individuales de la matriz pueden tener cada uno múltiples copias de una única secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, los sitios pueden tener copias clonales de un ácido nucleico derivado de una muestra biológica, tal como un genoma o una subfracción del mismo (p. ej., un exoma), o un transcriptoma (p. ej., una biblioteca de ARNm o una biblioteca de ADNc) o una subfracción de los mismos.
La fracción de sitios en una matriz que son clonales puede superar la fracción predicha por la distribución de Poisson. Por lo tanto, una matriz producida mediante los métodos expuestos en la presente memoria puede tener una distribución super-Poissoniana de sitios clonales. La distribución super-Poissoniana puede producirse durante la síntesis de la matriz y sin la necesidad de pasos posteriores de enriquecimiento del sitio o purificación del sitio (aunque los pasos de enriquecimiento y purificación se pueden llevar a cabo si se desea en al menos algunos ejemplos).
En algunos ejemplos, los sitios pueden estar presentes como características en (o en) un sustrato. En tales ejemplos, las características pueden ser clonales, la fracción de características de una matriz que son clonales puede superar la distribución de Poisson y las características pueden estar dispuestas espacialmente en un patrón repetitivo. Por lo tanto, los sitios pueden ordenarse espacialmente, por ejemplo, en una cuadrícula rectilínea, una cuadrícula hexagonal u otro patrón deseado.
Se puede crear una biblioteca de ácidos nucleicos utilizando un método que aproveche la exclusión cinética. Puede producirse exclusión cinética cuando un proceso se produce a una velocidad lo suficientemente rápida como para excluir de forma efectiva que se produzca otro evento o proceso. Tomemos por ejemplo la elaboración de una matriz de ácido nucleico donde los sitios de la matriz se siembran aleatoriamente con ácidos nucleicos diana a partir de una solución y se generan copias del ácido nucleico diana en un proceso de amplificación para llenar cada uno de los sitios sembrados hasta su capacidad. Según los métodos de exclusión cinética de la presente exposición, los procesos de siembra y amplificación pueden llevarse a cabo simultáneamente en condiciones en que la velocidad de amplificación supere la velocidad de siembra. Como tal, la velocidad relativamente rápida a la que se realizan copias en un sitio que se ha sembrado con un primer ácido nucleico diana excluirá eficazmente la siembra de un segundo ácido nucleico en el sitio para la amplificación. En la patente US-2016/0053310 A1 se describen métodos de exclusión cinética adicionales para amplificar bibliotecas de ácidos nucleicos.
La exclusión cinética puede explotar una velocidad relativamente lenta para hacer una primera copia de un ácido nucleico diana frente a una velocidad relativamente rápida para hacer copias posteriores del ácido nucleico diana o de la primera copia. En el ejemplo del párrafo anterior, la exclusión cinética se produce debido a la velocidad relativamente lenta de siembra de ácido nucleico diana (p. ej., difusión o transporte relativamente lento) frente a la velocidad relativamente rápida a la que se produce la amplificación para llenar el sitio con copias de la semilla de ácido nucleico. En otro ejemplo, la exclusión cinética puede producirse debido a un retraso en la formación de una primera copia de un ácido nucleico diana que ha sembrado un sitio (p. ej., activación retardada o lenta) frente a la velocidad relativamente rápida a la que se hacen copias posteriores para llenar el sitio. En este ejemplo, puede haberse sembrado un sitio individual con varios ácidos nucleicos diana distintos (p. ej., puede haber presentes varios ácidos nucleicos diana en cada sitio antes de la amplificación). Sin embargo, la primera formación de copias para cualquier ácido nucleico diana dado puede activarse de forma aleatoria, de modo que la velocidad promedio de la primera formación de copias sea relativamente lenta en comparación con la velocidad a la que se generan copias posteriores. En este caso, aunque un sitio individual pueda haberse sembrado con varios ácidos nucleicos diana distintos, la exclusión cinética permitirá que solo se amplifique uno de esos ácidos nucleicos diana. Más específicamente, una vez activado un primer ácido nucleico diana para la amplificación, el sitio se llenará rápidamente a capacidad con sus copias, impidiendo de este modo que se hagan copias de un segundo ácido nucleico diana en el sitio.
Una ventaja de las matrices producidas mediante los métodos expuestos en la presente memoria es que la naturaleza clonal de los sitios proporciona precisión en los análisis posteriores. Esto evita la confusión de los resultados que, de cualquier otra manera, surgirían al detectar sitios con poblaciones mixtas.
Otra ventaja de las matrices expuestas en la presente memoria es que tienen una distribución super-Poissoniana de sitios clonales. Esto aumenta la complejidad de la biblioteca al evitar la pérdida de contenido genético que, de cualquier otra manera, podría producirse debido al secuestro en sitios mixtos.
Una ventaja adicional de los métodos y matrices expuestos en la presente memoria es la provisión de una matriz que tiene características sobre un sustrato, en donde las características están dispuestas espacialmente en un patrón repetitivo. Como se expuso anteriormente, la fracción de las características que son clonales puede superar la distribución de Poisson. La distribución de Poisson establece un máximo de alrededor del 37 % de ocupación. Según los métodos expuestos en la presente memoria, el complemento de características que son clonales puede superar aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 75 % o más. Las matrices producidas mediante los métodos expuestos en la presente memoria proporcionan un llenado más eficiente de un sustrato en comparación con las matrices de conglomerados aleatorios. Estas matrices también son más fáciles de evaluar analíticamente al evitar las complejidades de los métodos de registro de imágenes utilizados para las matrices de conglomerados aleatorios.
Además, los métodos expuestos en la presente memoria son ventajosos para crear matrices sobre sustratos que están modelados para facilitar la detección. Por ejemplo, varias plataformas de secuenciación comercialmente disponibles se basan en sustratos que tienen pocillos que proporcionan una barrera a la difusión de los reactivos de detección (p. ej., pirofosfato en plataformas disponibles en 454 LifeSciences (una subsidiaria de Roche, Basel Suiza) o protones en plataformas disponibles en Ion Torrent (una subsidiaria de Life Technologies, Carlsbad, California)) durante los pasos de detección de secuencias. Los métodos expuestos en la presente memoria pueden ser ventajosos para aumentar el número de pocillos que están cargados con poblaciones clonales en comparación con los métodos de amplificación por conglomerados estándar que estarían limitados por Poisson. Los métodos de la presente descripción también son ventajosos con respecto a los métodos de ePCR al evitar la manipulación de emulsiones y manipulaciones de perlas.
Debe entenderse que los términos utilizados en la presente memoria adoptarán su significado habitual en la técnica correspondiente, a menos que se especifique lo contrario. A continuación se exponen varios términos utilizados en la presente memoria, y sus significados.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “siembra activa” se refiere a las fuerzas no difusivas impuestas sobre uno o más ácidos nucleicos para mover el ácido o los ácidos nucleicos hacia o lejos de una ubicación. La ubicación puede ser un sitio de amplificación de una matriz. Las fuerzas no difusivas pueden ser proporcionadas por una fuente externa, como las que producen campos eléctricos o magnéticos, o un agente que impone aglomeraciones moleculares o gradientes químicos dentro de un volumen de reacción.
Como se utiliza en la presente memoria, cuando el término “ amplicón” se utiliza en referencia a un ácido nucleico, significa el producto de copiar el ácido nucleico, en donde el producto tiene una secuencia de nucleótidos que es igual o complementaria a al menos una porción de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico. Un amplicón puede producirse por cualquiera de una variedad de métodos de amplificación que utilicen el ácido nucleico, o un amplicón del mismo, tal como un molde, incluyendo, por ejemplo, extensión por polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de círculo rodante (RCA), extensión por ligamiento o reacción en cadena de ligamiento. Un amplicón puede ser una molécula de ácido nucleico que tenga una sola copia de una secuencia de nucleótidos particular (p. ej., un producto de PCR) o múltiples copias de la secuencia de nucleótidos (p. ej., un producto concatamérico de RCA). Un primer amplicón de un ácido nucleico diana puede ser una copia complementaria. Los amplicones posteriores son copias que se crean, después de la generación del primer amplicón, a partir del ácido nucleico diana o del primer amplicón. Un amplicón posterior puede tener una secuencia que sea al menos sustancialmente complementaria a la del ácido nucleico diana o al menos sustancialmente idéntica a la del ácido nucleico diana.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ sitio de amplificación” se refiere a un sitio en o sobre una matriz donde se pueden generar uno o más amplicones. Un sitio de amplificación puede configurarse además para contener, sujetar o unir al menos un amplicón que se genera en el sitio.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ matriz” se refiere a una población de sitios que pueden diferenciarse entre sí según la ubicación relativa. Las diferentes moléculas que se encuentran en diferentes sitios de una matriz se pueden diferenciar entre sí según las ubicaciones de los sitios en la matriz. Un sitio individual de una matriz puede incluir una o más moléculas de un tipo particular. Por ejemplo, un sitio puede incluir una sola molécula de ácido nucleico diana que tenga una secuencia particular o un sitio puede incluir varias moléculas de ácido nucleico que tengan la misma secuencia (y/o secuencia complementaria, de la misma). Los sitios de una matriz pueden ser diferentes casillas situadas en el mismo sustrato. Como casillas de ejemplo se incluyen, sin limitación, pocillos en un sustrato, perlas (u otras partículas) en o sobre un sustrato, proyecciones desde un sustrato, crestas sobre un sustrato o canales en un sustrato. Los sitios de una matriz pueden ser diferentes sustratos, cada uno con una molécula diferente. Se pueden identificar diferentes moléculas unidas a diferentes sustratos según las ubicaciones de los sustratos en una superficie a la que están asociados los sustratos o según las ubicaciones de los sustratos en un líquido o gel. Como matrices de ejemplo en que se ubican distintos sustratos en una superficie se incluyen, sin limitación, las que tienen perlas en pocillos.
Como se utiliza en la presente memoria, cuando el término “ capacidad” se utiliza en referencia a un sitio y a un material de ácido nucleico, significa la cantidad máxima de material de ácido nucleico que puede ocupar el sitio. Por ejemplo, el término puede referirse al número total de moléculas de ácido nucleico que pueden ocupar el sitio en una condición particular. También pueden utilizarse otras medidas incluyendo, por ejemplo, la masa total de material de ácido nucleico o el número total de copias de una secuencia de nucleótidos particular que puede ocupar el sitio en una condición particular. La capacidad de un sitio para un ácido nucleico diana puede ser al menos sustancialmente equivalente a la capacidad del sitio para amplicones del ácido nucleico diana.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ agente de captura” se refiere a un material, sustancia química, molécula o resto de la misma, que es capaz de fijarse, retenerse o unirse a una molécula diana (p. ej., un ácido nucleico diana). Los ejemplos de agentes de captura incluyen, sin limitación, un ácido nucleico de captura que es complementario a al menos una porción de un ácido nucleico diana, un miembro de un par de unión receptor-ligando (p. ej., avidina, estreptavidina, biotina, lectina, hidrato de carbono, proteína de unión a ácido nucleico, epítopo, anticuerpo, etc.) capaz de unirse a un ácido nucleico diana (o un resto de enlace unido al mismo), o un reactivo químico capaz de formar un enlace covalente con un ácido nucleico diana (o resto de enlace unido al mismo).
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ población clonal” se refiere a una población de ácidos nucleicos que es homogénea con respecto a una secuencia de nucleótidos particular. La secuencia homogénea puede tener una longitud de al menos aproximadamente 10 nucleótidos, pero puede ser incluso más larga incluyendo, por ejemplo, una longitud de al menos aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 250, aproximadamente 500 o aproximadamente 1000 nucleótidos. Una población clonal puede proceder de un solo ácido nucleico diana o ácido nucleico molde. La mayoría de, si no todos, los ácidos nucleicos de una población clonal tienen la misma secuencia de nucleótidos. Se entenderá que, en una población clonal, puede producirse un pequeño número de mutaciones (p. ej., debidas a artefactos de amplificación) sin apartarse de la clonalidad.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ ciclo de desnaturalización” se refiere a una manipulación de una reacción de amplificación de ácidos nucleicos que cambia el curso de la reacción de amplificación de tal modo que las cadenas de ácido nucleico complementarias se separan unas de otras. Los ejemplos de manipulaciones incluyen, por ejemplo, la introducción de un reactivo químico que desnaturalice los ácidos nucleicos, o la alteración física de la reacción, mediante calentamiento u otra manipulación, para desnaturalizar los ácidos nucleicos. Se pueden incluir varios ciclos de desnaturalización en una reacción de amplificación cíclica. También se pueden incluir varios otros ciclos, tales como manipulaciones cíclicas para inducir a un cebador a hibridar con una cadena de ácido nucleico. Se pueden omitir uno o más ciclos de desnaturalización u otros ciclos en un método expuesto en la presente memoria. Como tal, una reacción de amplificación de la presente descripción puede llevarse a cabo sin manipulaciones cíclicas en al menos algunos ejemplos.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ diferente” , cuando se utiliza en referencia a ácidos nucleicos, significa que los ácidos nucleicos tienen secuencias de nucleótidos que no son iguales entre sí. Dos o más ácidos nucleicos pueden tener secuencias de nucleótidos que son diferentes en toda su longitud. Alternativamente, dos o más ácidos nucleicos pueden tener secuencias de nucleótidos que son diferentes en una porción sustancial de su longitud. Por ejemplo, dos o más ácidos nucleicos pueden tener porciones de secuencias de nucleótidos diana que son diferentes entre sí y al mismo tiempo tener una región de secuencia universal que son iguales entre sí.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ acceso fluídico” , cuando se usa en referencia a una molécula en un fluido y un sitio en contacto con el fluido, se refiere a la capacidad de la molécula de moverse en o a través del fluido para entrar en contacto o entrar en el sitio. La expresión también puede referirse a la capacidad de la molécula para separarse o salir del sitio para entrar en la solución. El acceso fluídico puede tener lugar cuando no hay barreras que impidan que la molécula entre en el sitio, entre en contacto con el sitio, se separe del sitio y/o salga del sitio. Sin embargo, se entiende que el acceso fluídico existe incluso si la difusión se retarda, reduce o altera, siempre que no se impida absolutamente el acceso.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ bicatenario” , cuando se utiliza en referencia a una molécula de ácido nucleico, significa que al menos sustancialmente todos los nucleótidos en la molécula de ácido nucleico están unidos por enlaces de hidrógeno a un nucleótido complementario. Un ácido nucleico parcialmente bicatenario puede tener al menos el aproximadamente 10 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 % o aproximadamente 95 % de sus nucleótidos unidos por enlaces de hidrógeno a un nucleótido complementario.
Como se utiliza en la presente memoria, cuando el término “cada uno(a)” se utiliza en referencia a una colección de artículos, pretende identificar un artículo individual en la colección, pero no se refiere necesariamente a cada artículo de la colección, a menos que el contexto indique lo contrario con claridad.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ aproximadamente” , cuando se utiliza en referencia a un valor numérico, indica aproximadamente el valor tal como se indica, por ejemplo, dentro del ± 5 % del valor.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ al menos sustancialmente” , cuando se utiliza en referencia a la modificación de un adjetivo, indica un grado que está en o cerca del adjetivo objeto, tal como dentro de un margen de ± 5 %. Por ejemplo, la frase “ al menos sustancialmente todos los ácidos nucleicos” puede referirse a todos (p. ej., el 100 %) de los ácidos nucleicos o a menos de todos los ácidos nucleicos dentro del margen designado, tal como del 95 % al 99,99 % de los ácidos nucleicos.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ cantidad traza” se refiere a una concentración muy baja de un analito en una mezcla o solución, tal como inferior o igual a aproximadamente 100 ppm.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “volumen excluido” se refiere al volumen del espacio ocupado por una molécula particular con exclusión de otras moléculas similares.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ extensible” o “ estado extensible” , cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico tal como un cebador, significa que el ácido nucleico es competente para la adición de un nucleótido (p. ej., mediante catálisis de polimerasa) o la adición de un oligonucleótido (p. ej., mediante catálisis de ligasa). Un ácido nucleico que es “ no extensible” o está en un “ estado no extensible” no es tan competente, por ejemplo, debido a la presencia de un resto que bloquea la extensión o a la ausencia de un hidroxilo 3'.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ región intersticial” se refiere a un área en un sustrato o en una superficie que separa otras áreas del sustrato o superficie. Por ejemplo, una región intersticial puede separar una característica de una matriz de otra característica de la matriz. Las dos regiones que están separadas entre sí pueden ser discretas, sin contacto entre sí. En otro ejemplo, una región intersticial puede separar una primera parte de una característica de una segunda parte de una característica. La separación proporcionada por una región intersticial puede ser una separación parcial o total. Las regiones intersticiales pueden tener un material de superficie que difiere del material de superficie de las características en la superficie. Por ejemplo, las características de una matriz pueden tener una cantidad o concentración de agentes de captura o cebadores superior a la cantidad o concentración presente en las regiones intersticiales. En algunos ejemplos, los agentes de captura o cebadores pueden no estar presentes en las regiones intersticiales.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ polimerasa” pretende ser concordante con su uso en la técnica e incluye, por ejemplo, una enzima que produce una réplica complementaria de una molécula de ácido nucleico utilizando el ácido nucleico como cadena molde. Las polimerasas de ADN pueden unirse a la cadena molde y después se mueven hacia abajo de la cadena molde añadiendo secuencialmente nucleótidos al grupo hidroxilo libre del extremo 3' de una cadena en crecimiento de ácido nucleico. Las ADN polimerasas sintetizan moléculas de ADN complementarias a partir de patrones de ADN y las ARN (ácido ribonucleico) polimerasas sintetizan moléculas de ARN a partir de patrones de ADN (transcripción). Las polimerasas pueden utilizar una cadena corta de ARN o ADN, llamada cebador, para iniciar el crecimiento de la cadena. Algunas polimerasas pueden desplazar la cadena, secuencia arriba del sitio donde están añadiendo bases a una cadena. Se dice que dichas polimerasas desplazan la cadena, lo que significa que tienen una actividad que elimina una cadena complementaria de una cadena molde que lee la polimerasa. Ejemplos de polimerasas que tienen actividad de desplazamiento de cadena incluyen, por ejemplo, el fragmento grande de polimerasa de Bst(Bacillus stearothermophilus),la polimerasa exo-KIenow o exo-polimerasa T7 de grado de secuenciación. Algunas polimerasas degradan la cadena delante de ellas, reemplazándola efectivamente por la cadena en crecimiento por detrás (actividad exonucleasa 5'). Algunas polimerasas tienen una actividad que degrada la cadena detrás de ellas (actividad exonucleasa 3'). Se han modificado algunas polimerasas útiles, ya sea por mutación o de otro modo, para reducir o eliminar la actividad exonucleasa 3' y/o 5'.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ ácido nucleico” pretende ser consistente con su uso en la técnica e incluye los ácidos nucleicos naturales y análogos funcionales de los mismos. Los análogos funcionales particularmente útiles pueden hibridarse a un ácido nucleico de una manera específica de secuencia o pueden utilizarse como un molde para la replicación de una secuencia de nucleótidos particular. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen una cadena principal que contiene enlaces fosfodiéster. Una estructura análoga puede tener un enlace de cadena principal alternativo que incluye cualquiera de una variedad de los conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos naturales generalmente tienen un azúcar desoxirribosa (p. ej., en el ácido desoxirribonucleico (ADN)) o un azúcar ribosa (p. ej., en el ácido ribonucleico (ARN)). Un ácido nucleico puede contener cualquiera de una variedad de análogos de estos restos de azúcar que se conocen en la técnica. Los ácidos nucleicos pueden incluir bases naturales o no naturales. En este sentido, un ácido desoxirribonucleico natural puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, timina, citosina o guanina y un ácido ribonucleico puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en uracilo, adenina, citosina o guanina. En la técnica se conocen bases no naturales y útiles que pueden incluirse en un ácido nucleico. El término “ diana” , cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico, pretende ser un identificador semántico para el ácido nucleico en el contexto de un método o composición expuesto en la presente memoria y no limita necesariamente la estructura o función del ácido nucleico más allá de lo que se indica explícitamente.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “velocidad” , cuando se utiliza en referencia al transporte, amplificación, captura u otros procesos químicos, pretende ser concordante con su significado en cinética química y cinética bioquímica. Las velocidades de dos procesos se pueden comparar con respecto a velocidades máximas (p. ej., en saturación), velocidades previas al estado estacionario (p. ej., antes del equilibrio), constantes de velocidad cinética u otras medidas conocidas en la técnica. En ejemplos particulares, se puede determinar una velocidad para un proceso particular con respecto al tiempo total para completar el proceso. Por ejemplo, se puede determinar una velocidad de amplificación con respecto al tiempo necesario para que se complete la amplificación. Sin embargo, no es necesario determinar una velocidad para un proceso particular con respecto al tiempo total para completar el proceso.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ recombinasa” pretende ser concordante con su uso en la técnica e incluye, por ejemplo, la proteína RecA, la proteína T4 uvsX y cualquier proteína homóloga o complejo proteico de cualquier filo, o variantes funcionales de los mismos. Los homólogos eucarióticos de RecA generalmente se llaman Rad51 en alusión al primer miembro de este grupo identificado. Se pueden usar otras recombinasas no homólogas en lugar de RecA, por ejemplo, RecT o RecO.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ proteína de unión monocatenaria” pretende referirse a cualquier proteína que tenga la función de unirse a un ácido nucleico monocatenario, por ejemplo, para impedir la hibridación prematura, para proteger el ácido nucleico monocatenario de la digestión con nucleasas, para eliminar la estructura secundaria del ácido nucleico o para facilitar la replicación del ácido nucleico. La expresión pretende incluir, por ejemplo, proteínas identificadas formalmente como proteínas de unión monocatenaria por el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB). Las proteínas de unión monocatenaria de ejemplo incluyen, por ejemplo, SSB de E.coli,T4 gp32, SSB de T7 gen 2.5,<s>S<b>de fago phi 29, cualquier proteína homóloga o complejo proteico de cualquier filo, o variantes funcionales de las mismas.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “transporte” se refiere al movimiento de una molécula a través de un líquido. El término puede incluir transporte pasivo, tal como el movimiento de moléculas a lo largo de su gradiente de concentración (p. ej., difusión pasiva). El término también puede incluir transporte activo mediante el cual las moléculas pueden moverse a lo largo de su gradiente de concentración o en contra de su gradiente de concentración. Por lo tanto, el transporte puede incluir la aplicación de energía para mover una o más moléculas en una dirección deseada o en una ubicación deseada, tal como un sitio de amplificación.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ secuencia universal” se refiere a una región de secuencia que es común a dos o más moléculas de ácido nucleico donde las moléculas también tienen regiones de secuencia que difieren entre sí. Una secuencia universal que está presente en diferentes elementos de una colección de moléculas puede permitir la captura de múltiples ácidos nucleicos diferentes utilizando una población de ácidos nucleicos de captura universal que sean complementarios a la secuencia universal. De forma similar, una secuencia universal presente en distintos elementos de una colección de moléculas puede permitir la replicación o amplificación de múltiples ácidos nucleicos distintos utilizando una población de cebadores universales que sean complementarios a la secuencia universal. Por lo tanto, un ácido nucleico de captura universal o un cebador universal incluye una secuencia que puede hibridar específicamente con una secuencia universal. Las moléculas de ácido nucleico diana se pueden modificar para unir adaptadores universales, por ejemplo, en uno o ambos extremos de las diferentes secuencias diana.
Se describe, pero no se reivindica, un método para amplificar ácidos nucleicos. El método incluye proporcionar un reactivo de amplificación que incluye (i) un matriz de sitios de amplificación y (ii) una solución que tiene una pluralidad de ácidos nucleicos diana diferentes; y (b) hacer reaccionar el reactivo de amplificación para producir una pluralidad de sitios de amplificación, cada uno de los cuales tiene una población clonal de amplicones de un ácido nucleico diana individual de la solución, en donde la reacción incluye simultáneamente (i) transportar los diferentes ácidos nucleicos diana a los sitios de amplificación a una velocidad de transporte promedio, y (ii) amplificar los ácidos nucleicos diana en los sitios de amplificación a una velocidad de amplificación promedio, en donde la velocidad de amplificación promedio supera la velocidad de transporte promedio. En ejemplos particulares, el número de diferentes ácidos nucleicos diana en la solución supera el número de sitios de amplificación en la matriz. Los diferentes ácidos nucleicos diana tienen acceso fluídico a la pluralidad de sitios de amplificación. Además, cada uno de los sitios de amplificación puede tener opcionalmente una capacidad para varios ácidos nucleicos en la pluralidad de ácidos nucleicos diferentes.
También se describe, pero no se reivindica, un método para amplificar ácidos nucleicos que incluye proporcionar (a) un reactivo de amplificación que incluye (i) un matriz de sitios de amplificación y (ii) una solución que tiene una pluralidad de ácidos nucleicos diana diferentes; y (b) hacer reaccionar el reactivo de amplificación para producir una pluralidad de sitios de amplificación, cada uno de los cuales incluye una población clonal de amplicones de un ácido nucleico diana individual de la solución, en donde la reacción incluye (i) producir un primer amplicón a partir de un ácido nucleico diana individual en cada uno de los sitios de amplificación, y (ii) producir amplicones posteriores a partir del ácido nucleico diana individual en cada uno de los sitios de amplificación o a partir del primer amplicón, en donde la velocidad promedio a la que se generan los amplicones posteriores en los sitios de amplificación supera la velocidad promedio a la que se genera el primer amplicón en los sitios de amplificación. En ejemplos particulares, el número de diferentes ácidos nucleicos diana en la solución supera el número de sitios de amplificación en la matriz. Los diferentes ácidos nucleicos diana tienen acceso fluídico a la pluralidad de sitios de amplificación. Además, cada uno de los sitios de amplificación puede tener opcionalmente una capacidad para varios ácidos nucleicos en la pluralidad de ácidos nucleicos diferentes.
Adicionalmente se describe, pero no se reivindica, un método para amplificar ácidos nucleicos que incluye proporcionar (a) un reactivo de amplificación que incluye (i) un matriz de sitios de amplificación y (ii) una solución que tiene una pluralidad de ácidos nucleicos diana diferentes; y (b) hacer reaccionar el reactivo de amplificación para producir una pluralidad de sitios de amplificación que tienen cada uno una población clonal de amplicones de un ácido nucleico diana individual de la solución. La reacción incluye simultáneamente (i) capturar los diferentes ácidos nucleicos diana en los sitios de amplificación a una velocidad de captura promedio, y (ii) amplificar los ácidos nucleicos diana capturados en los sitios de amplificación a una velocidad de amplificación promedio. La velocidad de amplificación promedio supera la velocidad de captura promedio.
También se describe, pero no se reivindica, un método para amplificar ácidos nucleicos que incluye proporcionar (a) un reactivo de amplificación que incluye (i) un matriz de sitios de amplificación y (ii) una solución que tiene una pluralidad de ácidos nucleicos diana diferentes; y (b) hacer reaccionar el reactivo de amplificación para producir una pluralidad de sitios de amplificación que incluyen cada uno una población clonal de amplicones de un ácido nucleico diana individual de la solución. La reacción incluye (i) producir un primer amplicón a partir de un ácido nucleico diana individual que se captura en el sitio o sitios de amplificación, y (ii) producir amplicones posteriores a partir del ácido nucleico diana individual que se captura en cada uno de los sitios de amplificación o a partir del primer amplicón. La velocidad promedio a la que se generan los amplicones posteriores en los sitios de amplificación supera la velocidad promedio a la que se genera el primer amplicón en los sitios de amplificación.
Adicionalmente se describe, pero no se reivindica, un método para crear una superficie modelada de biomoléculas que incluye (a) proporcionar un reactivo que incluye (i) una matriz que tiene características no contiguas en una superficie de tal modo que las características estén separadas por regiones intersticiales de la superficie, y (ii) una solución que tiene una pluralidad de biomoléculas diana diferentes; y (b) hacer reaccionar el reactivo para transportar las biomoléculas a las características y unir una biomolécula individual a cada una de las características. Se aplica un campo eléctrico a las regiones intersticiales para repeler las biomoléculas de las regiones intersticiales.
Una matriz de sitios de amplificación utilizada en un método expuesto en la presente memoria puede estar presente como uno o más sustratos. Ejemplos de materiales de sustrato que se pueden utilizar para una matriz incluyen vidrio (p. ej., vidrio modificado, vidrio funcionalizado, vidrios inorgánicos), microesferas (p. ej., partículas inertes y/o magnéticas), plásticos, polisacáridos, nailon, nitrocelulosa, cerámica, resinas, sílice, materiales a base sílice, carbono, metales, una fibra óptica o haces de fibras ópticas, polímeros y placas de multipocillo (p. ej., de microtitulación). Los plásticos de ejemplo incluyen acrílicos, poliestireno, copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos y politetrafluoroetileno (p. ej., TEFLON® de DuPont). Los materiales a base de sílice de ejemplo incluyen silicio y diversas formas de silicio modificado.
En ejemplos particulares, un sustrato puede estar dentro o ser parte de un recipiente tal como un pocillo, tubo, canal, cubeta, placa de Petri, frasco o similar. Un recipiente particularmente útil es una celda de flujo, por ejemplo, como se describe en la publicación de patente US-2010/0111768 A1 o Bentley y col., Nature 456:53-59 (2008). Las celdas de flujo de ejemplo son las que son comercializados por Illumina, Inc. (San Diego, California). Otro recipiente particularmente útil es un pocillo en una placa de multipocillo o en una placa de microtitulación.
En algunos ejemplos, los sitios de una matriz se pueden configurar como características en una superficie. Las casillas pueden estar presentes en cualquiera de una variedad de formatos deseados. Por ejemplo, los sitios pueden ser pocillos, huecos, canales, crestas, regiones elevadas, clavijas, postes o similares. Como se indicó anteriormente, los sitios pueden contener perlas. Sin embargo, en ejemplos particulares los sitios no necesitan contener una perla o partícula. Los sitios de ejemplo incluyen pocillos que están presentes en sustratos utilizados para plataformas de secuenciación comerciales vendidas por 454 LifeSciences (una subsidiaria de Roche, Basilea, Suiza) o Ion Torrent (una subsidiaria de Life Technologies, Carlsbad California). Otros sustratos que tienen pocillos incluyen, por ejemplo, fibra óptica grabada y otros sustratos descritos en la patente US- 6.266.459; la patente US- 6.355.431; la patente US-6.770.441; la patente US- 6.859.570; la patente US- 6.210.891; la patente US- 6.258.568; la patente US- 6.274.320; la publicación de patente US- 2009/0026082 A1; la publicación de patente US- 2009/0127589 A1; la publicación de patente US- 2010/0137143 A1; la publicación de patente US- 2010/0282617 A1 o la publicación PCT n.° WO 00/63437. En varios casos, los sustratos se ilustras en estas referencias para aplicaciones que utilizan perlas en los pocillos. Los sustratos que contienen pocillos se pueden usar con o sin perlas en los métodos o composiciones de la presente memoria. En algunos ejemplos, los pocillos de un sustrato pueden incluir material de gel (con o sin perlas) como se expone en la patente US- 9.512.422.
Los sitios de una matriz pueden ser casillas metálicas sobre una superficie no metálica tal como vidrio, plástico u otros materiales ilustrados anteriormente. Se puede depositar una capa metálica sobre una superficie utilizando métodos conocidos en la técnica tales como grabado con plasma en húmedo, grabado con plasma en seco, deposición de capas atómicas, grabado con haz iónico, deposición química de vapor, pulverización catódica en vacío o similares. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de instrumentos comerciales según sea apropiado, incluido, por ejemplo, los sistemas FLEXAL®, OPAL™, IONFAB® 300plus u OPTOFAB ® 3000 (Oxford Instruments, Reino Unido). También se puede depositar una capa de metal mediante evaporación por haz de electrones o pulverización catódica como se expone en Thornton, Ann. Rev. Mater. Sci. 7:239-60 (1977). Las técnicas de deposición de capa metálica, tales como las ilustradas anteriormente, se pueden combinar con técnicas de fotolitografía para crear regiones o parches metálicos en una superficie. Se proporcionan métodos de ejemplo para combinar técnicas de deposición de capas metálicas y técnicas de fotolitografía en los Ejemplos I y II a continuación y en la patente US- 8.778.848.
Una variedad de características puede aparecer como una cuadrícula de puntos o manchas. Las casillas pueden ubicarse en un patrón repetitivo o en un patrón irregular no repetitivo. Los patrones particularmente útiles son patrones hexagonales, patrones rectilíneos, patrones en cuadrícula, patrones que tienen simetría reflectante, patrones que tienen simetría rotacional o similares. Los patrones asimétricos también pueden resultar útiles. La inclinación puede ser el mismo entre diferentes pares de casillas vecinas más cercanas o la inclinación puede variar entre diferentes pares de entidades vecinas más cercanas. En ejemplos particulares, cada una de las características de una matriz puede tener un área mayor que aproximadamente 100 nm2, aproximadamente 250 nm2, aproximadamente 500 nm2, aproximadamente 1 pm2, aproximadamente 2,5 pm2, aproximadamente 5 pm2, aproximadamente 10 pm2, aproximadamente 100 pm2 o aproximadamente 500 pm2 Alternativamente o de forma adicional, cada una de las características de una matriz puede tener un área inferior a aproximadamente 1 mm2, aproximadamente 500 pm2, aproximadamente 100 pm2, aproximadamente 25 pm2, aproximadamente 10 pm2, aproximadamente 5 pm2, aproximadamente 1 pm2, aproximadamente 500 nm2 o aproximadamente 100 nm2. De hecho, una región puede tener un tamaño que esté en un intervalo entre un límite superior e inferior seleccionado de los ilustrados anteriormente.
Para ejemplos que incluyen un matriz de casillas en una superficie, las características pueden ser discretas estando por regiones intersticiales. El tamaño de las casillas y/o el espaciado entre las regiones puede variar de modo que las matrices puedan ser de alta densidad, densidad media o densidad más baja. Las matrices de alta densidad se caracterizan por tener regiones separadas por menos que aproximadamente 15 pm. Las matrices de densidad media tienen regiones separadas por aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pm, mientras que las matrices de baja densidad tienen regiones separadas por más que aproximadamente 30 pm. Una matriz útil en uno o más ejemplos puede tener regiones que estén separadas por menos de aproximadamente 100 pm, aproximadamente 50 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 5 pm, aproximadamente 1 pm o aproximadamente 0,5 pm.
En ejemplos particulares, una matriz puede incluir una colección de perlas u otras partículas. Las partículas pueden suspenderse en una solución o pueden ubicarse en la superficie de un sustrato. Los ejemplos de matrices de perlas en solución son las comercializadas por Luminex (Austin, Tex.). Los ejemplos de matrices que tienen perlas ubicadas en una superficie incluyen aquellas en donde las perlas están ubicadas en pocillos tales como una matriz BEADCHIP™ (Illumina Inc., San Diego California) o sustratos utilizados en plataformas de secuenciación de 454 Life-Sciences (una subsidiaria de Roche, Basilea, Suiza) o de Ion Torrent (una subsidiaria de Life Technologies, Carlsbad California). Otras matrices que tienen perlas ubicadas sobre una superficie se describen en la patente US- 6.266.459; la patente US- 6.355.431; la patente US- 6.770.441; la patente US- 6.859.570; la patente US- 6.210.891; la patente US-6.258.568; la patente US- 6.274.320; la publicación de patente US- 2009/0026082 A1; la publicación de patente US-2009/0127589 A1; la publicación de patente US- 2010/0137143 A1; la publicación de patente US- 2010/0282617 A1 o la publicación<p>C<t>n.° WO 00/63437. Varias de las referencias anteriores describen métodos para unir ácidos nucleicos diana a perlas antes de cargar las perlas en o sobre un sustrato de matriz. Sin embargo, se entenderá que las perlas se pueden fabricar para que incluyan cebadores de amplificación y las perlas se pueden usar a continuación para cargar una matriz, formando así sitios de amplificación para su uso en un método expuesto en la presente memoria. Como se expuso anteriormente en la presente memoria, los sustratos se pueden usar sin perlas. Por ejemplo, los cebadores de amplificación se pueden unir directamente a los pocillos o al material de gel en los pocillos. Por lo tanto, las referencias son ilustrativas de materiales, composiciones o aparatos que pueden modificarse para su uso en los métodos y composiciones expuestos en la presente memoria.
Los sitios de amplificación de una matriz pueden incluir una pluralidad de agentes de captura capaces de unirse a ácidos nucleicos diana. Los ejemplos de agentes de captura incluyen receptores y/o ligandos que tienen un compañero de unión respectivo unido a los ácidos nucleicos diana, cuyos ejemplos se exponen anteriormente en la presente memoria. Un agente de captura particularmente útil es un ácido nucleico de captura que es complementario a una secuencia de uno o más ácidos nucleicos diana. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de captura que están presentes en un sitio de amplificación pueden tener una secuencia de captura universal que es complementaria a una secuencia universal que está presente en una secuencia adaptadora de cada ácido nucleico diana. En algunos ejemplos, el ácido nucleico de captura también puede actuar como un cebador para la amplificación del ácido nucleico diana (contenga o no también una secuencia universal).
En ejemplos particulares, se puede unir un agente de captura, tal como un ácido nucleico de captura, al sitio de amplificación. Por ejemplo, el agente de captura se puede unir a la superficie de una casilla de una matriz. La unión puede realizarse a través de una estructura intermedia tal como una perla, partícula o gel. El acoplamiento de ácidos nucleicos de captura a una matriz a través de un gel se muestra en el Ejemplo I a continuación y además se ilustra mediante celdas de flujo disponibles comercialmente en Illumina Inc. (San Diego, California) o descritas en la patente WO 2008/093098. Los geles de ejemplo que pueden utilizarse en los métodos y aparatos expuestos en la presente memoria incluyen, aunque no de forma limitativa, los que tienen una estructura coloidal, tal como agarosa; una estructura de malla polimérica, tal como gelatina; o una estructura de polímero reticulado, tal como poliacrilamida, SFA (véase, por ejemplo, la publicación de patente US- 2011/0059865 A1) o poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamidacoacrilamida (PAZAM) (véase, por ejemplo, la patente US- 9.012.022). La unión mediante una perla se puede lograr como se ilustra en la descripción y la bibliografía citada expuesta anteriormente en la presente memoria.
En algunos ejemplos, las características en la superficie de un sustrato de matriz no son contiguas y están separadas por regiones intersticiales de la superficie. Son ventajosas las regiones intersticiales que tienen una cantidad o concentración sustancialmente menor de agentes de captura, en comparación con las casillas de la matriz. Las regiones intersticiales que carecen de agentes de captura son particularmente ventajosas. Por ejemplo, una cantidad relativamente pequeña o ausencia de restos de captura en las regiones intersticiales favorece la ubicación de los ácidos nucleicos diana y de los agrupamientos generados posteriormente en las casillas deseadas. En ejemplos particulares, las características pueden ser características cóncavas en una superficie (p. ej., pocillos) y las características pueden contener un material de gel. Las características que contienen gel pueden estar separadas entre sí por regiones intersticiales en la superficie donde el gel está al menos sustancialmente ausente o, si está presente, el gel es al menos sustancialmente incapaz de soportar la ubicación de ácidos nucleicos. Los métodos y composiciones para fabricar y usar sustratos que tienen casillas que contienen gel, tales como pocillos, se exponen en la patente estadounidense 9.512.422.
Los ácidos nucleicos diana utilizados en un método o composición de la presente descripción pueden estar compuestos de ADN, ARN o análogos de los mismos. La fuente de los ácidos nucleicos diana puede ser ADN genómico, ARN mensajero u otros ácidos nucleicos de fuentes nativas. En algunos casos, los ácidos nucleicos diana que se obtienen de tales fuentes se pueden amplificar antes de su uso en un método o composición de la presente memoria. Se puede utilizar cualquiera de una diversidad de técnicas de amplificación conocidas, incluyendo, pero no se limita a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de círculo rodante (RCA), amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) o la amplificación primaria al azar (RPA). Se entenderá que la amplificación de los ácidos nucleicos diana antes de su uso en un método o composición expuesta en la presente memoria es opcional. Como tales, los ácidos nucleicos diana no se amplificarán antes de su uso en algunos ejemplos de los métodos y composiciones expuestos en la presente memoria. Los ácidos nucleicos diana pueden proceder opcionalmente de bibliotecas sintéticas. Los ácidos nucleicos sintéticos pueden tener composiciones de ADN o ARN naturales o pueden ser análogos de los mismos.
Las muestras biológicas de ejemplo de las que se pueden obtener ácidos nucleicos diana incluyen, por ejemplo, las procedentes de un mamífero, tal como un roedor, ratón, rata, conejo, cobaya, ungulado, caballo, oveja, cerdo, cabra, vaca, gato, perro, primate, primate humano o no humano; una planta, tal comoArabidopsis thaliana,maíz, sorgo, avena, trigo, arroz, colza, o soja; un alga, tal comoChlamydomonas reinhardtii;un nematodo tal comoCaenorhabditis elegans;un insecto, tal comoDrosophila melanogaster,mosquito, mosca de la fruta, abeja melífera o araña; un pez, tal como el pez cebra; un reptil; un anfibio, tal como una rana oXenopus laevis;un Dictyostelium discoideum; un hongo, tal comopneumocystis carinii, Takifugu rubripes,levadura,Saccharamoyces cerevisiaeoSchizosaccharomyces pombe;o unPlasmodium falciparum.Los ácidos nucleicos diana también pueden obtenerse de un procariota tal como una bacteria,Escherichia coli,estafilococos omycoplasma pneumoniae;una arquea; un virus tal como el virus de la hepatitis C o el virus de la inmunodeficiencia humana; o un viroide. Los ácidos nucleicos diana pueden obtenerse de un cultivo o población homogénea de los organismos anteriores o, alternativamente, de una colección de varios organismos diferentes, por ejemplo, en una comunidad o ecosistema.
No es necesario derivar ácidos nucleicos diana de fuentes naturales y, en cambio, se puede sintetizar utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, las sondas de expresión génica o las sondas de genotipado pueden sintetizarse y utilizarse para crear una matriz en los métodos expuestos en la presente memoria.
En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos diana se pueden obtener como fragmentos de uno o más ácidos nucleicos más grandes. La fragmentación se puede llevar a cabo usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, nebulización, sonicación, escisión química, escisión enzimática o cizallamiento físico. La fragmentación también puede resultar del uso de una técnica de amplificación particular que produce amplicones copiando solo una porción de un ácido nucleico más grande. Por ejemplo, la amplificación por PCR produce fragmentos que tienen un tamaño definido por la longitud del fragmento entre los cebadores flanqueantes utilizados para la amplificación.
Una población de ácidos nucleicos diana, o amplicones de los mismos, puede tener una longitud de cadena promedio que se desea o que sea apropiada para una aplicación particular de los métodos o composiciones expuestos en la presente memoria. Por ejemplo, la longitud de cadena promedio puede ser menor que aproximadamente 100.000 nucleótidos, aproximadamente 50.000 nucleótidos, aproximadamente 10.000 nucleótidos, aproximadamente 5.000 nucleótidos, aproximadamente 1.000 nucleótidos, aproximadamente 500 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos o aproximadamente 50 nucleótidos. Alternativamente, o de forma adicional, la longitud de cadena promedio puede ser mayor que aproximadamente 10 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 500 nucleótidos, aproximadamente 1.000 nucleótidos, aproximadamente 5.000 nucleótidos, aproximadamente 10.000 nucleótidos, aproximadamente 50.000 nucleótidos o aproximadamente 100.000 nucleótidos. La longitud de cadena promedio para la población de ácidos nucleicos diana, o amplicones de los mismos, puede estar en un intervalo de entre un valor máximo y mínimo expuesto anteriormente. Se entenderá que los amplicones generados en un sitio de amplificación (o fabricados o utilizados de otro modo en la presente memoria) pueden tener una longitud de cadena promedio que está en un intervalo entre un límite superior e inferior seleccionado de los ilustrados anteriormente.
En algunos casos, una población de ácidos nucleicos diana puede producirse en condiciones o configurarse de otro modo para que tenga una longitud máxima para sus miembros. Por ejemplo, la longitud máxima para los miembros que se utilizan en un método expuesto en la presente memoria o que están presentes en una composición particular puede ser de aproximadamente 100.000 nucleótidos, aproximadamente 50.000 nucleótidos, aproximadamente 10.000 nucleótidos, aproximadamente 5.000 nucleótidos, aproximadamente 1.000 nucleótidos, aproximadamente 500 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos o aproximadamente 50 nucleótidos. Alternativamente o de forma adicional, una población de ácidos nucleicos diana, o amplicones de los mismos, puede producirse en condiciones o configurarse de otro modo para tener una longitud mínima para sus miembros. Por ejemplo, la longitud mínima para los miembros que se utilizan en un método expuesto en la presente memoria o que están presentes en una composición particular puede ser de más que aproximadamente 10 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 500 nucleótidos, aproximadamente 1.000 nucleótidos, aproximadamente 5.000 nucleótidos, aproximadamente 10.000 nucleótidos, aproximadamente 50.000 nucleótidos o aproximadamente 100.000 nucleótidos. La longitud de cadena máxima y mínima para los ácidos nucleicos diana en una población puede estar en un intervalo entre un valor máximo y mínimo expuesto anteriormente. Se entenderá que los amplicones generados en un sitio de amplificación (o fabricados o utilizados de otro modo en la presente memoria) pueden tener longitudes de cadena máximas y/o mínimas en un intervalo entre los límites superior e inferior ilustrados anteriormente.
En ejemplos particulares, los ácidos nucleicos diana tienen un tamaño con respecto al área de los sitios de amplificación, por ejemplo, para facilitar la exclusión cinética. Por ejemplo, el área para cada uno de los sitios de una matriz puede ser mayor que el diámetro del volumen excluido de los ácidos nucleicos diana para lograr la exclusión cinética. Tomando, por ejemplo, ejemplos que utilizan una matriz de características en una superficie, el área para cada una de las características puede ser mayor que el diámetro del volumen excluido de los ácidos nucleicos diana que se transportan a los sitios de amplificación. El volumen excluido de un ácido nucleico diana y su diámetro se pueden determinar, por ejemplo, a partir de la longitud del ácido nucleico diana. Los métodos para determinar el volumen excluido de ácidos nucleicos y el diámetro del volumen excluido se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense 7.785.790; Rybenkov y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90: 5307-5311 (1993); Zimmerman y col., J. Mol. Biol. 222:599-620 (1991); o Sobel y col., Biopolymers 31:1559-1564 (1991).
Los sitios de amplificación de una matriz incluyen una pluralidad de cebadores que se utilizan para producir amplicones a partir de un ácido nucleico diana. Los cebadores que están presentes en un sitio de amplificación tienen una secuencia de cebado universal que es complementaria a una secuencia universal que está presente en una secuencia adaptadora de cada ácido nucleico diana. La pluralidad de cebadores está unida al sitio de amplificación. Los cebadores se pueden unir a un sitio de amplificación como se ha expuesto anteriormente para capturar ácidos nucleicos.
Como se estableció anteriormente en la presente memoria, las características en la superficie de un sustrato de matriz pueden no ser contiguas y estar separadas por regiones intersticiales de la superficie. En ejemplos particulares, las regiones intersticiales tendrán una cantidad o concentración de cebadores sustancialmente menor, en comparación con las características de la matriz. Las regiones intersticiales que carecen de cebadores son particularmente ventajosas. Por ejemplo, una cantidad relativamente pequeña o la ausencia de cebadores en las regiones intersticiales favorece la localización de los amplicones en las características de la superficie de la matriz. Esta configuración crea un borde para cada característica de la matriz, lo que confiere a la característica una capacidad finita para los amplicones producidos por la amplificación de un ácido nucleico diana sembrado en los métodos expuestos en la presente memoria.
Un método de la presente descripción incluye hacer reaccionar un reactivo de amplificación para producir una pluralidad de sitios de amplificación que incluyan, cada uno de ellos, una población clonal de amplicones de un ácido nucleico diana individual que se haya sembrado en el sitio. En algunos ejemplos, la reacción de amplificación continúa hasta que se genera una cantidad suficiente de amplicones para llenar la capacidad del sitio de amplificación respectivo. De esta manera, llenar un sitio ya sembrado hasta su capacidad excluye sustancialmente la llegada de los ácidos nucleicos diana en el sitio, produciendo así una población clonal de amplicones en el sitio. Por lo tanto, es deseable en algunos ejemplos que la velocidad a la que se generan los amplicones para llenar la capacidad de los sitios de amplificación supere la velocidad a la que los ácidos nucleicos diana individuales se transportan a los sitios de amplificación individuales, respectivamente.
En algunos ejemplos, la clonalidad aparente puede conseguirse incluso si un sitio de amplificación no se llena hasta su capacidad antes de que un segundo ácido nucleico diana llegue al sitio. En algunas condiciones, la amplificación de un primer ácido nucleico diana puede continuar hasta un punto en que se produce una cantidad suficiente de copias para superar o saturar eficazmente la producción de copias de un segundo ácido nucleico diana que se transporta al sitio. Por ejemplo, en un ejemplo en que se utiliza un proceso de amplificación en puente en una casilla circular con un diámetro menor de 500 nm, se ha determinado que después de 14 ciclos de amplificación exponencial para un primer ácido nucleico diana, la contaminación de un segundo ácido nucleico diana en el mismo sitio producirá una cantidad insuficiente de amplicones contaminantes que afecte negativamente al análisis de secuenciación por síntesis en una plataforma de secuenciación Illumina.
Como se ha demostrado mediante el ejemplo anterior, los sitios de amplificación en una matriz no son necesariamente, completamente clonales en todos los ejemplos. En cambio, para algunas aplicaciones, un sitio de amplificación individual puede estar predominantemente poblado con amplicones de un primer ácido nucleico diana y también puede tener un nivel bajo de amplicones contaminantes de un segundo ácido nucleico diana. Una matriz puede tener uno o más sitios de amplificación que tengan un nivel bajo de amplicones contaminantes siempre que el nivel de contaminación no tenga un impacto inaceptable en un uso posterior de la matriz. Por ejemplo, cuando la matriz va a utilizarse en una aplicación de detección, un nivel aceptable de contaminación sería un nivel que no altere la relación señal a ruido o la resolución de la técnica de detección de una forma inaceptable. En consecuencia, en general, la clonalidad aparente será relevante para un uso o aplicación particular de una matriz creada mediante los métodos expuestos en la presente memoria. Niveles de contaminación ejemplares que pueden ser aceptables en un sitio de amplificación individual para aplicaciones particulares incluyen, aunque no de forma limitativa, como máximo aproximadamente 0,1 %, aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 1 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 % o aproximadamente 25 % de amplicones contaminantes. Una matriz puede incluir uno o más sitios de amplificación que tengan estos niveles de ejemplo de amplicones contaminantes. Por ejemplo, hasta aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 75 % o incluso aproximadamente 100 % de los sitios de amplificación en una matriz pueden tener algunos amplicones contaminantes.
Un método de la presente descripción se lleva a cabo para (i) transportar simultáneamente los ácidos nucleicos diana a los sitios de amplificación a una velocidad de transporte promedio, y (ii) amplificar los ácidos nucleicos diana que están en los sitios de amplificación a una velocidad de amplificación promedio, en donde la velocidad de amplificación promedio supera la velocidad de transporte promedio. En consecuencia, la exclusión cinética se puede lograr en tales ejemplos utilizando una velocidad de transporte relativamente lenta. Por ejemplo, se puede seleccionar una concentración suficientemente baja de ácidos nucleicos diana para lograr una velocidad de transporte promedio deseada, dando como resultado concentraciones más bajas tasas de transporte promedio más lentas. Alternativa o adicionalmente, se puede utilizar una solución de alta viscosidad y/o la presencia de reactivos de aglomeración molecular (denominados en la presente memoria agentes de aglomeración) en la solución para reducir las velocidades de transporte. Los ejemplos de reactivos de aglomeración útiles incluyen, pero no se limita a, polietilenglicol (PEG), FICOLL®, dextrano o alcohol polivinílico. Las formulaciones y reactivos de aglomeración de ejemplo se exponen en la patente 7.399.590. Otro factor que se puede ajustar para lograr una velocidad de transporte deseada es el tamaño promedio de los ácidos nucleicos diana.
En algunos ejemplos de los métodos, los ácidos nucleicos diana pueden transportarse, por ejemplo, mediante difusión u otro proceso, a los sitios de amplificación, antes del inicio de la amplificación. En este caso, la exclusión cinética se puede lograr explotando una velocidad relativamente lenta de creación de un primer amplicón en comparación con la velocidad a la que se producen los amplicones posteriores. Por ejemplo, se pueden lograr diferentes velocidades de formación de amplicones utilizando un primer cebador para la formación del primer amplicón que está inicialmente en un estado temporal no extensible y otros cebadores para la posterior formación de amplicones que están en un estado extensible durante toda la reacción de amplificación. Como tal, un retraso en la conversión del primer cebador a un estado extensible provocará un retraso en la formación del primer amplicón, mientras que la formación posterior del amplicón no experimenta tal retraso. De este modo, la velocidad promedio a la que se generan los amplicones posteriores en los sitios de amplificación supera la velocidad promedio a la que se genera el primer amplicón en los sitios de amplificación.
A continuación se muestra un ejemplo más detallado de exclusión cinética mediante tasas diferenciales de formación de amplicones. Un sitio de amplificación puede incluir tres subpoblaciones de cebadores unidos al mismo. La primera subpoblación de cebadores funciona para capturar un ácido nucleico diana (mediante una secuencia de captura) y como cebador para la formación del primer amplicón. Se bloquea reversiblemente la extensión de la primera subpoblación de cebadores, por ejemplo, mediante un nucleótido didesoxi en el extremo 3'. La segunda subpoblación de cebadores puede tener una secuencia de cebadores P5 y la tercera población de cebadores puede tener una secuencia de cebadores P7. Los cebadores de la primera y la segunda subpoblaciones no incluyen el nucleótido didesoxi y, por lo tanto, son totalmente aptos para la extensión. Los ácidos nucleicos diana pueden construirse para incluir (de 5' a 3') una secuencia de unión al cebador P7, una de varias secuencias de nucleótidos diana diferentes, una secuencia de unión al cebador P5 y un complemento de secuencia de captura. Se pueden hibridar varios ácidos nucleicos diana diferentes con la primera subpoblación de cebadores (mediante las secuencias de captura). Los cebadores de captura se pueden convertir entonces a un estado extensible, por ejemplo, mediante tratamiento con una polimerasa en condiciones de pirofosforólisis (p. ej., en presencia de un exceso de pirofosfato). Se pueden utilizar condiciones en donde, en promedio, solo uno de los cebadores de captura se convierta en una forma extensible durante el período de tiempo en el que se producen los amplicones posteriores para llenar el sitio de amplificación. Por lo tanto, aunque pueden estar presentes varios ácidos nucleicos diana potencialmente contaminantes en un sitio de amplificación individual, la exclusión cinética dará como resultado la formación de amplicones a partir de solo uno de los ácidos nucleicos diana, creando así una población clonal de amplicones en el sitio de amplificación. Con fines ilustrativos, este ejemplo se ha descrito con respecto a un único sitio de amplificación, pero se entenderá que la reacción puede implicar la unión del núcleo diana y la amplificación en una serie de sitios de amplificación.
Se puede utilizar cualquiera de una variedad de cebadores temporalmente no extensibles en un método expuesto en la presente memoria junto con las técnicas y reactivos respectivos para convertir esos cebadores en un estado extensible. El ejemplo anterior describe el uso de un nucleótido didesoxi que se elimina mediante pirofosforólisis. Otros nucleótidos no extensibles pueden estar presentes en un cebador y eliminarse mediante pirofosforólisis. Además, los didesoxinucleótidos u otros nucleótidos no extensibles se pueden eliminar mediante otras técnicas conocidas que incluyen, por ejemplo, la actividad exonucleasa de una polimerasa u otra enzima apropiada. En otros ejemplos, un cebador puede incluir un terminador reversible, tal como los utilizados en los métodos de secuenciación por síntesis basados en terminadores. Se describen ejemplos de terminadores reversibles y técnicas para su eliminación, por ejemplo, en Bentley y col., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; la patente US- 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; la patente US- 7.329.492; la patente US- 7.211.414; la patente US- 7.315.019; la patente US- 7.405.281, y la publicación de patente US- 2008/0108082.
Aunque el uso de cebadores diferencialmente activos para provocar diferentes velocidades de formación del primer amplicón y de amplicones posteriores se ha ilustrado anteriormente para un ejemplo donde los ácidos nucleicos diana están presentes en los sitios de amplificación antes de la amplificación, el método también se puede llevar a cabo en condiciones en donde los ácidos nucleicos diana se transportan (p. ej., mediante difusión) a los sitios de amplificación a medida que se produce la amplificación. Por lo tanto, la exclusión cinética puede aprovechar tanto una velocidad de transporte relativamente lenta como una producción relativamente lenta del primer amplicón con respecto a la formación de amplicones posteriores. Por lo tanto, se puede llevar a cabo una reacción de amplificación expuesta en la presente memoria de manera que los ácidos nucleicos diana se transporten de la solución a los sitios de amplificación simultáneamente con (i) la producción de un primer amplicón, y (ii) la producción de los amplicones posteriores en otros sitios de amplificación de la matriz. En ejemplos particulares, la velocidad promedio a la que se generan los amplicones posteriores en los sitios de amplificación puede superar la velocidad promedio a la que los ácidos nucleicos diana se transportan de la solución a los sitios de amplificación. En algunos casos, se puede generar un número suficiente de amplicones a partir de un único ácido nucleico diana en un sitio de amplificación individual para llenar la capacidad del sitio de amplificación respectivo. La velocidad a la que se generan amplicones para llenar la capacidad de los respectivos sitios de amplificación puede, por ejemplo, superar la velocidad a la que los ácidos nucleicos diana individuales se transportan de la solución a los sitios de amplificación.
Un reactivo de amplificación que se usa en un método expuesto en la presente memoria es preferiblemente capaz de fabricar rápidamente copias de ácidos nucleicos diana en sitios de amplificación. Uno o más reactivos de amplificación utilizados en un método de la presente memoria incluirá una polimerasa y nucleósidos trifosfato (los NTP). Se puede utilizar cualquiera de una diversidad de polimerasas conocidas en la técnica, pero en algunos ejemplos, puede ser deseable utilizar una polimerasa que sea exonucleasa negativa. Los NTP pueden ser desoxirribonucleósidos trifosfato (los dNTP) para ejemplos donde se realizan copias de ADN. Las cuatro especies naturales de dNTP, que incluyen dATP, dTTP, dGTP y dCTP, pueden estar presentes en un reactivo de amplificación de ADN; sin embargo, se pueden utilizar análogos si se desea. Los NTP pueden ser ribonucleósidos trifosfato (rNTP) para ejemplos donde se realizan copias de ARN. Las cuatro especies naturales de rNTP, que incluyen rATP, rUTP, rGTP y rCTP, pueden estar presentes en un reactivo de amplificación de ARN; sin embargo, se pueden utilizar análogos si se desea.
Un reactivo de amplificación puede incluir componentes adicionales que faciliten la formación de amplicones y, en algunos casos, aumenten la velocidad de formación de los amplicones. Un ejemplo es una recombinasa. La recombinasa puede facilitar la formación de amplicones al permitir la invasión/extensión repetida. Más específicamente, una recombinasa puede facilitar la invasión de un ácido nucleico diana por la polimerasa y la extensión de un cebador por la polimerasa utilizando el ácido nucleico diana como molde para la formación de amplicones. Este proceso puede repetirse como una reacción en cadena donde los amplicones producidos a partir de cada ronda de invasión/extensión sirven como moldes en una ronda posterior. El proceso puede producirse más rápidamente que la PCR estándar, ya que no se requiere un ciclo de desnaturalización (por ejemplo, mediante calentamiento o desnaturalización química). Como tal, la amplificación facilitada por recombinasa puede llevarse a cabo isotérmicamente. De forma general, es deseable incluir ATP u otros nucleótidos (o, en algunos casos, análogos no hidrolizables de los mismos) en un reactivo de amplificación facilitada por recombinasa para facilitar la amplificación. Una mezcla de recombinasa y proteína de unión monocatenaria (SSB, por sus siglas in inglés) es especialmente útil ya que la SSB puede facilitar aún más la amplificación. Las formulaciones ilustrativas para la amplificación facilitada por recombinasa incluyen las comercializadas como kits TWISTAMP® por TwistDx (Cambridge, Reino Unido). Los componentes útiles del reactivo de amplificación facilitada por recombinasa y las condiciones de reacción se exponen en la patente estadounidense 5.223.414 y patente US- 7.399.590.
Otro ejemplo de un componente que puede incluirse en un reactivo de amplificación para facilitar la formación de amplicones y en algunos casos para aumentar la velocidad de formación de amplicones es una helicasa. La helicasa puede facilitar la formación de amplicones al permitir una reacción en cadena de la formación de amplicones. El proceso puede producirse más rápidamente que la PCR estándar, ya que no se requiere un ciclo de desnaturalización (por ejemplo, mediante calentamiento o desnaturalización química). Como tal, la amplificación facilitada por helicasa puede llevarse a cabo isotérmicamente. Una mezcla de helicasa y proteína de unión monocatenaria (SSB) es especialmente útil ya que la SSB puede facilitar aún más la amplificación. Las formulaciones de ejemplo para la amplificación facilitada por helicasa incluyen las comercializadas como kits de ISOAMP® de Biohelix (Beverly, Mass). Además, se describen ejemplos de formulaciones útiles que incluyen una proteína helicasa en la patente estadounidense 7.399.590 y la patente US- 7.829.284.
Otro ejemplo de componente que puede incluirse en un reactivo de amplificación para facilitar la formación de amplicones y, en algunos casos, aumentar la velocidad de formación de amplicones, es una proteína de unión al origen.
La velocidad a la que se produce una reacción de amplificación se puede aumentar aumentando la concentración o cantidad de uno o más de los componentes activos de una reacción de amplificación. Por ejemplo, se puede aumentar la cantidad o concentración de la polimerasa, los nucleósidos trifosfato, cebadores, recombinasa, helicasa o SSB para aumentar la velocidad de amplificación. En algunos casos, uno o más componentes activos de una reacción de amplificación que aumentan en cantidad o concentración (o se manipulan de otro modo en un método expuesto en la presente memoria) son componentes no de ácido nucleico de la reacción de amplificación.
La velocidad de amplificación también se puede aumentar en un método expuesto en la presente memoria ajustando la temperatura. Por ejemplo, la velocidad de amplificación en uno o más sitios de amplificación se puede aumentar aumentando la temperatura en el sitio o sitios hasta una temperatura máxima donde la velocidad de reacción disminuye debido a la desnaturalización u otros acontecimientos adversos. Las temperaturas óptimas o deseadas pueden determinarse a partir de propiedades conocidas de los componentes de amplificación en uso o empíricamente para una mezcla de reacción de amplificación determinada. Las propiedades de los cebadores utilizados para la amplificación también se pueden ajustar para aumentar la velocidad de amplificación. Por ejemplo, se puede ajustar la secuencia y/o la longitud de los cebadores. Dichos ajustes se pueden realizar basándose en predicciones anteriores de la temperatura de fusión (Tm) del cebador o empíricamente.
Otra opción para aumentar la velocidad de amplificación en un sitio de amplificación es aumentar la concentración local de uno o más componentes activos de la reacción de amplificación en el sitio de amplificación. Los componentes activos pueden incluir uno o más componentes que no son ácidos nucleicos. En algunos ejemplos, uno o más componentes activos de una reacción de amplificación pueden atraerse a un sitio de amplificación utilizando manipulaciones eléctricas tales como electroforesis, isotacoforesis, pulsos directos de corriente o voltaje o similares. Alternativamente o de forma adicional, uno o más de los componentes de amplificación pueden incluir una etiqueta de afinidad que lo reclute en el sitio de amplificación. Se puede cargar una etiqueta de afinidad de tal modo que las manipulaciones eléctricas atraigan un componente etiquetado adecuadamente a un sitio de amplificación. También se pueden utilizar etiquetas de afinidad no cargadas. Por ejemplo, puede utilizarse cualquiera de una variedad de ligandos o receptores conocidos en la técnica, tales como los que se exponen en la presente memoria como ejemplos de agentes de captura, como etiquetas de afinidad para un componente de una reacción de amplificación. Como es el caso de los agentes de captura utilizados para los ácidos nucleicos, un sitio de amplificación puede incluir un compañero de unión para una etiqueta de afinidad de un componente de amplificación. Por lo tanto, la concentración local del componente de amplificación marcado con afinidad puede aumentarse debido a la interacción con el compañero apropiado en el sitio de amplificación. En ejemplos particulares donde el sitio de amplificación es una superficie de un sustrato, se puede unir a la superficie un compañero de unión para una etiqueta de afinidad.
Además, se pueden usar fuerzas magnéticas u ópticas para aumentar la concentración local de los reactivos de amplificación. En tales casos, uno o más reactivos de amplificación pueden incluir una etiqueta magnética o una etiqueta óptica que puede manipularse mediante dichas fuerzas.
La velocidad a la que se produce una reacción de amplificación se puede aumentar aumentando la actividad de uno o más reactivos de amplificación. Por ejemplo, se puede añadir un cofactor que aumente la velocidad de extensión de una polimerasa a una reacción donde se utiliza la polimerasa. En algunos ejemplos, se pueden añadir cofactores metálicos tales como magnesio, cinc o manganeso a una reacción de polimerasa o, en otros ejemplos, se puede añadir betaína.
En algunos ejemplos de los métodos expuestos en la presente memoria, se prefiere utilizar una población de ácidos nucleicos diana que sea bicatenaria. Sorpresivamente, se ha observado que la formación de amplicones en una matriz de sitios en condiciones de exclusión cinética es eficaz para ácidos nucleicos diana bicatenarios. Por ejemplo, se puede producir más eficientemente una pluralidad de sitios de amplificación que tienen poblaciones clonales de amplicones a partir de ácidos nucleicos diana bicatenarios (en comparación con ácidos nucleicos diana monocatenarios a la misma concentración) en presencia de recombinasa y proteína de unión monocatenaria. Sin embargo, se entenderá que se pueden utilizar ácidos nucleicos diana monocatenarios en algunos ejemplos de los métodos expuestos en la presente memoria.
Un método expuesto en la presente memoria puede utilizar cualquiera de una diversidad de técnicas de amplificación. Las técnicas de ejemplo que se pueden utilizar incluyen, aunque no de forma limitativa, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación de círculo rodante (RCA), la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) o la amplificación primaria aleatoria (RPA). Una técnica de amplificación utilizada en condiciones de exclusión cinética en un método de la presente memoria se llevará a cabo en fase sólida. Una pluralidad de cebadores utilizados para la amplificación se unen a una fase sólida en el sitio de amplificación. En ejemplos de PCR, ambos de los cebadores utilizados para la amplificación se unen a una fase sólida. Los formatos que utilizan dos especies de cebadores unidos a la superficie se denominan frecuentemente amplificación puente porque los amplicones bicatenarios forman una estructura similar a un puente entre los dos cebadores unidos a la superficie que flanquean la secuencia molde que se ha copiado. Los reactivos y condiciones de ejemplo que se pueden utilizar para la amplificación en puente se describen, por ejemplo, en la patente US- 5.641.658; la publicación de patente US- US-2002/0055100; la patente US-7.115.400; la publicación de patente US- 2004/0096853; la publicación de patente US- US-2004/0002090; la publicación de patente US- US-2007/0128624; y en la publicación de patente US- 2008/0009420 Las técnicas de PCR ilustradas anteriormente se pueden modificar para amplificación no cíclica (p. ej., amplificación isotérmica) utilizando componentes ilustrados en otros lugares de la presente memoria para facilitar o aumentar la velocidad de amplificación. En consecuencia, las técnicas de PCR ilustradas anteriormente se pueden utilizar en condiciones de exclusión cinética.
Las técnicas de RCA pueden modificarse para su uso en un método de la presente divulgación. Los componentes de ejemplo que se pueden utilizar en una reacción de RCA y los principios por los cuales la RCA produce amplicones se describen, por ejemplo, en Lizardi y col., Nat. Genet. 19:225-232 (1998) y la publicación de patente US- US-2007/0099208 A1. Los cebadores utilizados para la RCA están unidos a una superficie de soporte de apoyo sólida en un lugar de amplificación. Las técnicas de<r>C<a>ilustradas en las referencias anteriores se pueden modificar según las enseñanzas de la presente memoria, por ejemplo, para aumentar la velocidad de amplificación para adaptarse a aplicaciones particulares. Por lo tanto, las técnicas de RCA se pueden utilizar en condiciones de exclusión cinética.
Las técnicas de MDA pueden modificarse para su uso en un método de la presente divulgación. Algunos principios básicos y condiciones útiles para la MDA se describen, por ejemplo, en Dean y col., Proc Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002); Lage y col., Genome Research 13:294-307 (2003); Walker y col., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; Walker y col., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992); la patente US- 5.455.166; la patente US- 5.130.238; y la patente US- 6.214.587. Los cebadores utilizados para la MDA están unidos a una superficie de soporte de apoyo sólida en un lugar de amplificación. Las técnicas de MDA ilustradas en las referencias anteriores se pueden modificar según las enseñanzas de la presente memoria, por ejemplo, para aumentar la velocidad de amplificación para adaptarse a aplicaciones particulares. En consecuencia, las técnicas de MDA se pueden utilizar en condiciones de exclusión cinética.
En ejemplos particulares, se puede utilizar una combinación de las técnicas de amplificación ilustradas anteriormente para fabricar una matriz en condiciones de exclusión cinética. Por ejemplo, se pueden usar RCA y MDA en una combinación en donde se utiliza RCA para generar un amplicón concatemérico en solución (p. ej., usando cebadores en fase de solución). A continuación, el amplicón puede utilizarse como molde para MDA utilizando cebadores que se unen a una superficie de apoyo sólida en un sitio de amplificación. En este ejemplo, los amplicones producidos después de los pasos combinadas de RCA y MDA se unirán a la superficie del sitio de amplificación.
Como se ilustra con respecto a varios de los ejemplos anteriores, un método de la presente memoria no necesita utilizar una técnica de amplificación cíclica. Por ejemplo, la amplificación de ácidos nucleicos diana se puede llevar a cabo en sitios de amplificación sin un ciclo de desnaturalización. Los ciclos de desnaturalización de ejemplo incluyen la introducción de desnaturalizantes químicos en una reacción de amplificación y/o el aumento de la temperatura de una reacción de amplificación. Por lo tanto, la amplificación de los ácidos nucleicos diana no necesita incluir la sustitución de la solución de amplificación por un reactivo químico que desnaturalice los ácidos nucleicos diana y los amplicones. Similarmente, la amplificación de los ácidos nucleicos diana no necesita incluir el calentamiento de la solución a una temperatura que desnaturalice los ácidos nucleicos diana y los amplicones. En consecuencia, la amplificación de ácidos nucleicos diana en los sitios de amplificación se puede llevar a cabo de forma isotérmica durante la duración de un método expuesto en la presente memoria. De hecho, un método de amplificación expuesto en la presente memoria puede producirse sin una o más manipulaciones cíclicas que se llevan a cabo para algunas técnicas de amplificación en condiciones estándar. Adicionalmente, en algunas técnicas de amplificación en fase sólida estándar se lleva a cabo un lavado después de cargar los ácidos nucleicos diana en un sustrato y antes de que se inicie la amplificación. Sin embargo, en ejemplos de los presentes métodos, no es necesario llevar a cabo un paso de lavado entre el transporte de los ácidos nucleicos diana a los sitios de reacción y la amplificación de los ácidos nucleicos diana en los sitios de amplificación. En lugar de ello, se permite que el transporte (p. ej., mediante difusión) y la amplificación se produzcan simultáneamente para proporcionar una exclusión cinética.
En algunos ejemplos, puede ser deseable repetir un ciclo de amplificación que se produce en condiciones de exclusión cinética. Por lo tanto, aunque se pueden hacer copias de un ácido nucleico diana en un sitio de amplificación individual mediante amplificación por exclusión cinética sin manipulaciones cíclicas que impliquen desnaturalizantes químicos o aplicaciones de calor, se puede tratar cíclicamente una serie de sitios de amplificación para aumentar el número de sitios que contienen amplicones y/o el número de amplicones en cada sitio después de cada ciclo de amplificación por exclusión cinética. Con referencia a las figuras 11-14, se realiza una amplificación o refuerzo secundario después de la amplificación por exclusión inicial haciendo fluir una solución fresca sin diana que incluye reactivos (p. ej., componentes activos) sin ácidos nucleicos diana sobre los sitios de amplificación. Los reactivos de la solución sin diana aumentan el número de amplicones en los conglomerados clonales en los sitios de amplificación. Debido a la falta de ácidos nucleicos diana en la solución sin diana, el reactivo puede no provocar una siembra adicional de ácidos nucleicos diana en los sitios de amplificación. En ejemplos particulares, las condiciones de amplificación se pueden modificar de un ciclo al siguiente. Por ejemplo, una o más de las condiciones expuestas anteriormente para alterar la velocidad de transporte o alterar la velocidad de amplificación se pueden ajustar entre ciclos. Como tal, la tasa de transporte se puede aumentar de un ciclo a otro, la tasa de transporte se puede disminuir de un ciclo a otro, la tasa de amplificación se puede aumentar de un ciclo a otro o la tasa de amplificación se puede disminuir de un ciclo a otro.
Un método expuesto en la presente memoria puede modificarse para utilizar el transporte asistido por campo eléctrico (“ e-field” ) de ácidos nucleicos diana a los sitios de amplificación de la matriz. Por ejemplo, cada sitio de amplificación de una matriz pueden acoplarse eléctricamente a una fuente de energía para producir una carga eléctrica que atraiga a ácidos nucleicos diana. En una configuración, una carga positiva en los sitios de amplificación puede atraer ácidos nucleicos a través de la cadena principal de azúcar y fosfato cargada negativamente. Los métodos y aparatos de ejemplo para utilizar la asistencia de e-field para atraer ácidos nucleicos a los sitios de una matriz se describen en la publicación de patente US-2009/0032401 a 1. La asistencia por e-field se puede utilizar en un método de la presente descripción, por ejemplo, en condiciones en donde una pluralidad de ácidos nucleicos diana diferentes estén en solución, de tal modo que los ácidos nucleicos diana tengan acceso fluídico a la matriz de sitios de amplificación durante cada paso de amplificación. La carga en cada sitio de amplificación se puede ajustar para lograr la exclusión cinética. Además o como alternativa al ajuste de la carga, se pueden ajustar otras condiciones expuestas en la presente memoria para alterar las velocidades de transporte del ácido nucleico diana o para alterar las tasas de amplificación para lograr la exclusión cinética. En consecuencia, la carga en los sitios de amplificación de una matriz puede ajustarse para atraer los ácidos nucleicos diana mientras la amplificación se produce simultáneamente en varios sitios de amplificación de la matriz, donde la velocidad de amplificación promedio supera la velocidad promedio a la que los ácidos nucleicos diana se transportan (es decir, bajo transporte asistido por e-field) a los sitios de amplificación.
En los ejemplos particulares que utilizan el transporte asistido por e-field de ácidos nucleicos diana a los sitios de amplificación, el e-field se puede aplicar de manera consistente durante el transcurso de la reacción de amplificación. Alternativamente, el e-field se puede cambiar (p. ej., aumentar o disminuir) a medida que avanza la reacción de amplificación y a medida que los sitios de amplificación se llenan de amplicones. Por ejemplo, aumentar el e-field puede proporcionar el beneficio de aumentar el número de sitios de amplificación que adquieren un ácido nucleico diana (que a su vez se amplifica para producir una población clonal de amplicones en cada uno de los sitios). La velocidad a la que aumenta el e-field y el intervalo de amplitud para el aumento pueden seleccionarse para equilibrar la velocidad creciente de transporte del ácido nucleico diana a lo largo del tiempo con el número creciente de sitios de amplificación que se han llenado eficazmente durante ese mismo período de tiempo. De nuevo, dependiendo de la aplicación de las matrices producidas por el método, el llenado efectivo puede ser el punto en donde los sitios de amplificación se han llenado al máximo con copias de un primer ácido nucleico diana, evitando así la amplificación de cualquier ácido nucleico diana secundario en ese sitio. Alternativamente, el llenado efectivo puede ser el punto en donde la amplificación de un ácido nucleico diana secundario en un sitio de amplificación particular produciría una fracción suficientemente baja de amplicones contaminantes como para considerarse insignificante o aceptable de cualquier otra manera para el uso deseado de la matriz.
En general, la asistencia por e-field permite un nivel adicional de control sobre el transporte de los ácidos nucleicos diana a uno o más sitios de amplificación de una matriz. Aunque el uso de la asistencia por e-field se ha ejemplificado anteriormente en el contexto del transporte de ácidos nucleicos diana a una matriz de sitios de amplificación simultáneamente con la amplificación que se produce en varios sitios de la matriz, en ejemplos alternativos, la asistencia por campo eléctrico se puede utilizar para transportar ácidos nucleicos diana a los sitios de amplificación antes del inicio de la amplificación en los sitios. La asistencia por e-field se puede utilizar en un método o composición descritos en la presente memoria para transportar biomoléculas diana distintas de los ácidos nucleicos diana a un sitio de interés, tal como a una característica de una matriz.
En ejemplos particulares, un e-field se puede aplicar a todos los sitios de amplificación de una matriz al menos de manera sustancialmente uniforme. Por lo tanto, los ácidos nucleicos diana que están en solución tendrán la misma probabilidad de ser transportados a cualquier sitio de amplificación dado. En un ejemplo alternativo, un e-field se puede aplicar solo a un subconjunto de los sitios de amplificación que están presentes en una matriz. De esta manera, la asistencia por e-field se puede utilizar para llenar selectivamente algunos sitios en lugar de otros. Además, si se desea, se puede aplicar una carga atractiva en un primer subconjunto de sitios de amplificación para transportar los ácidos nucleicos diana al primer subconjunto de sitios y, mientras tanto, se puede aplicar una carga repelente a un segundo subconjunto de sitios de amplificación para impedir que los ácidos nucleicos diana se transporten a esos sitios o para eliminar (p. ej., mediante desorción o degradación) los ácidos nucleicos diana del segundo subconjunto de sitios. De manera similar, se puede aplicar una carga repelente a las regiones intersticiales de una matriz para impedir que los ácidos nucleicos diana se transporten a las regiones intersticiales o para eliminar (p. ej., mediante desorción o degradación) los ácidos nucleicos diana de las regiones intersticiales, tal como se expone con más detalle a continuación y en el Ejemplo III.
En ejemplos particulares, las regiones intersticiales de una matriz pueden acoplarse eléctricamente a una fuente de alimentación para producir una carga eléctrica que inhiba la unión o elimine los ácidos nucleicos diana u otras biomoléculas. En una configuración, una carga negativa en las regiones intersticiales puede repeler ácidos nucleicos a través de la cadena principal de azúcar y fosfato cargada negativamente. Alternativamente o de forma adicional, la carga en la región intersticial se puede utilizar para crear cambios de pH localizados en la superficie que dañan electroquímicamente los ácidos nucleicos y las biomoléculas.
La repulsión por e-field se puede utilizar en un método de la presente descripción, por ejemplo, en condiciones en donde una pluralidad de ácidos nucleicos diana diferentes estén en solución, de tal modo que los ácidos nucleicos diana tengan acceso fluídico a la matriz de sitios de amplificación durante cada paso de amplificación. La carga en las regiones intersticiales de una matriz se puede ajustar para repeler los ácidos nucleicos (p. ej., mediante la eliminación o la inhibición de la unión) mientras los ácidos nucleicos se capturan en las características de la matriz y, opcionalmente, se amplifican en las características en condiciones de exclusión cinética. Además o como alternativa al ajuste de la carga, se pueden ajustar otras condiciones expuestas en la presente memoria para alterar las velocidades de transporte del ácido nucleico diana a características o para alterar las velocidades de amplificación para lograr la exclusión cinética. En consecuencia, la carga en las regiones intersticiales de una matriz se puede ajustar para repeler los ácidos nucleicos diana mientras la amplificación se produce simultáneamente en varios sitios de amplificación de la matriz, donde la velocidad de amplificación promedio supera la velocidad promedio a la que los ácidos nucleicos diana se transportan a los sitios de amplificación. En consecuencia, la repulsión por campo eléctrico en las regiones intersticiales se puede utilizar en combinación con otros métodos establecidos en la presente memoria para transportar ácidos nucleicos (u otras biomoléculas) a las características de una matriz y lograr la exclusión cinética.
La repulsión por campo eléctrico en las regiones intersticiales utilizando los métodos y aparatos expuestos en la presente memoria puede proporcionar la ventaja de mejorar la localización específica de los ácidos nucleicos (u otras biomoléculas) en las características en lugar de en las regiones intersticiales. Estas ventajas pueden derivarse de si la repulsión funciona mediante un mecanismo de repulsión de carga para inhibir la unión de los ácidos nucleicos u otras biomoléculas, mediante el daño electroquímico localizado en la superficie de los ácidos nucleicos y biomoléculas o mediante otros mecanismos. La repulsión por campo eléctrico en las regiones intersticiales se puede utilizar para mejorar la localización específica de los ácidos nucleicos u otras biomoléculas en las características de interés, particularmente cuando las características de interés tienen una altura mayor que el alcance del daño electroquímico localizado en la superficie.
Algunos ejemplos pueden utilizar el transporte asistido por campo eléctrico de ácidos nucleicos (u otras biomoléculas) a las características de una matriz en combinación con la repulsión asistida por campo eléctrico de los ácidos nucleicos (u otras biomoléculas) desde las regiones intersticiales de la matriz. El campo eléctrico atractivo y el campo eléctrico repulsivo se pueden aplicar simultáneamente a la matriz o los dos campos se pueden aplicar por separado. Por ejemplo, los dos campos se pueden aplicar por separado de tal modo que los campos se apliquen en repeticiones alternas (p. ej., el campo atractivo se puede aplicar a las características mientras el campo repulsivo está desactivado, después el campo atractivo se puede desactivar mientras el campo repulsivo se aplica a las regiones intersticiales, y esta secuencia se puede repetir una o más veces).
Se puede aplicar un campo eléctrico a través de una región de una matriz y un electrolito o se puede aplicar a través de la región de la matriz y una segunda superficie. Por ejemplo, la figura 4 (a) muestra una configuración en donde se puede aplicar un campo eléctrico a través de una región intersticial de una matriz y un electrolito y la figura 4 (b) muestra una configuración en donde se puede aplicar un campo eléctrico a través de una región intersticial de una matriz y una segunda superficie. Se pueden utilizar configuraciones similares para aplicar campos atractivos a las características de una matriz. Además, los campos eléctricos, tanto si se aplican a una característica como a una región intersticial, pueden crearse mediante la aplicación de una corriente alterna (CA) o una corriente continua (CC) a la región apropiada de la matriz.
En consecuencia, la descripción proporciona un método para crear una superficie modelada de biomoléculas, en donde el método puede incluir (a) proporcionar un reactivo que incluye (i) una matriz que tiene características no contiguas en una superficie, estando las características separadas por regiones intersticiales de la superficie, y (ii) una solución que tiene una pluralidad de biomoléculas diana diferentes; y (b) hacer reaccionar el reactivo para transportar las biomoléculas a las características y unir una biomolécula individual a cada una de las características, en donde se aplica un campo eléctrico a las regiones intersticiales para repeler las biomoléculas de las regiones intersticiales. Las biomoléculas particularmente útiles para su uso en el método son los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos se pueden amplificar en las características de este método en condiciones de exclusión cinética, tales como las que se exponen en otra parte de la presente memoria. En algunos ejemplos que utilizan campos eléctricos, un sustrato utilizado para una matriz puede incluir una capa de conductor eléctrico transparente. La capa de conductor eléctrico puede utilizarse como un electrodo para conectar una fuente eléctrica, tal como una batería o un generador de señales. Si se desea, una característica de una matriz (p. ej., las superficies internas de un pocillo en una matriz de pocillos) puede contener una capa conductora expuesta o aislada, en donde se puede utilizar un voltaje a través de las capas conductoras para manipular la fuerza sobre un ácido nucleico y/o los reactivos de amplificación para controlar la velocidad de transporte al sitio, captura en el sitio, eliminación del sitio y/o amplificación en el sitio. En ejemplos particulares, se puede aplicar un campo eléctrico en las superficies exteriores de un pocillo de tal modo que el campo eléctrico que penetra en las paredes del vaso induzca una fuerza eléctrica sobre los reactivos dentro del recipiente, proporcionando un grado de control sobre las velocidades de transporte, captura, eliminación y/o amplificación.
Una matriz de la presente memoria, que por ejemplo se ha producido mediante un método expuesto en la presente memoria, se puede utilizar para cualquiera de una diversidad de aplicaciones. Una aplicación particularmente útil es la secuenciación de ácidos nucleicos. Un ejemplo es la secuenciación por síntesis (SBS). En la SBS, para determinar la secuencia de nucleótidos en el molde, se monitoriza la extensión de un cebador de ácido nucleico a lo largo de un molde de ácido nucleico (p. ej., un ácido nucleico diana o amplicón del mismo). El procesamiento químico subyacente puede ser polimerización (p. ej., catalizada por una enzima polimerasa). En un ejemplo particular de SBS basada en polimerasa, se añaden nucleótidos etiquetados con fluorescencia a un cebador (extendiéndose de ese modo el cebador) de una manera dependiente del molde, de tal modo que, para determinar la secuencia del molde, pueda utilizarse la detección del orden y tipo de nucleótidos añadidos al cebador. Una pluralidad de moldes diferentes en sitios diferentes de una matriz expuesta en la presente memoria puede someterse a una técnica de SBS en condiciones en que los acontecimientos que se producen para distintos moldes pueden distinguirse debido a su ubicación en la matriz.
Las celdas de flujo proporcionan un formato conveniente para alojar una matriz que se produce por los métodos de la presente memoria y que se somete a una SBS u otra técnica de detección que implica el suministro repetido de reactivos en ciclos. Por ejemplo, para iniciar un primer ciclo de SBS, uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc., pueden fluir hacia/a través de una celda de flujo que aloja una matriz de moldes de ácidos nucleicos. Pueden detectarse aquellos sitios de una serie en los que la extensión del cebador provoca que se incorpore un nucleótido marcado. Opcionalmente, los nucleótidos pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que finalice la extensión adicional del cebador una vez que se haya añadido un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, a un cebador se le puede añadir un análogo de nucleótido que tenga una fracción de terminación reversible, de modo que no se pueda producir la extensión posterior hasta que se suministre un agente desbloqueante para eliminar la fracción. Por lo tanto, para ejemplos que utilizan terminación reversible, puede suministrarse un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo (antes o después de que se produzca la detección). Los lavados pueden llevarse a cabo entre los diversos pasos de suministro. El ciclo puede repetirse a continuación n veces para extender el cebador en n nucleótidos, detectando de este modo una secuencia de longitud n. Los procedimientos de SBS, sistemas fluídicos y plataformas de detección de ejemplo que pueden adaptarse fácilmente para su uso con una matriz producida por los métodos de la presente memoria se describen, por ejemplo, en Bentley y col., Nature 456:53-59 (2008), la patente WO 04/018497; la patente US- 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; la patente US- 7.329.492; la patente US-7.211.414; la patente US- 7.315.019; la patente US- 7.405.281, y la publicación de patente US- 2008/0108082.
Pueden utilizarse otros procedimientos de secuenciación que utilizan reacciones cíclicas, como la pirosecuenciación. La pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi) a medida que se incorporan nucleótidos particulares en una cadena de ácido nucleico incipiente (Ronaghi, y col., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi y col. Science 281(5375), 363 (1998); la patente US-6.210.891; la patente US- 6.258.568 y la patente Us -6.274.320). En la pirosecuenciación, el PPi liberado se puede detectar convirtiéndolo inmediatamente en trifosfato de adenosina (ATP) por la ATP sulfurilasa, y el nivel de ATP generado se puede detectar mediante fotones producidos por luciferasa. Por lo tanto, la reacción de secuenciación se puede controlar a través de un sistema de detección de luminiscencia. Las fuentes de radiación de excitación utilizadas para los sistemas de detección a base de fluorescencia no son necesarias para los procedimientos de pirosecuenciación. Los sistemas fluídicos, detectores y procedimientos útiles que pueden utilizarse para la aplicación de la pirosecuenciación a las matrices de la presente descripción se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente de la patente US- 9.096.899, publicación de patente US- 2005/0.191.698 A1 o la patente US-7.595.883, y la patente US-7.244.559.
Las reacciones de secuenciación por ligación también son útiles, incluidas, por ejemplo, las descritas en Shendure y col. Science 309:1728-1732 (2005); la patente US- 5.599.675; y la patente U<s>- 5.750.341. Algunos ejemplos pueden incluir procedimientos de secuenciación por hibridación como se describe, por ejemplo, en Bains y col., Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988); Drmanac y col., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998); Fodor y col., Science 251(4995), 767-773 (1995); y la patente WO 1989/10977. En los procedimientos de secuenciación por ligadura y de secuenciación por hibridación, los ácidos nucleicos (o amplicones de los mismos) que están presentes en los sitios de una matriz se someten a ciclos repetidos de suministro y detección de oligonucleótidos. Los sistemas fluídicos para los métodos de SBS expuestos en la presente memoria o en las referencias citadas en la presente memoria se pueden adaptar fácilmente para el suministro de reactivos para procedimientos de secuenciación por ligadura o secuenciación por hibridación. Los oligonucleótidos pueden estar marcados con fluorescencia y detectarse utilizando detectores de fluorescencia similares a los descritos con respecto a los procedimientos de SBS en la presente memoria o en las referencias citadas en la presente memoria.
Algunos ejemplos pueden utilizar métodos que suponen la monitorización en tiempo real de la actividad de la ADN polimerasa. Por ejemplo, las incorporaciones de nucleótidos pueden detectarse a través de interacciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre una polimerasa portadora de fluoróforo y nucleótidos marcados con Y-fosfato o con guías de ondas de modo cero (ZMW, por sus siglas en inglés). Se describen técnicas y reactivos de secuenciación basada en FRET, por ejemplo, en Levene y col. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist y col. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 105, 1176-1181 (2008).
Algunos ejemplos de SBS incluyen la detección de un protón liberado tras la incorporación de un nucleótido en un producto de extensión. Por ejemplo, en la secuenciación basada en la detección de protones liberados se puede utilizar un detector eléctrico y técnicas asociadas que son comercializadas por Ion Torrent (Guilford, Conn., una filial de Life Technologies) o métodos y sistemas de secuenciación descritos en la publicación de patente US-2009/0026082 A1; la publicación de patente US- 2009/0127589 A1; la publicación de patente US- 2010/0137143 A1; o la publicación de patente US- 2010/0282617 A1. Los métodos expuestos en la presente memoria para amplificar ácidos nucleicos diana utilizando exclusión cinética pueden aplicarse fácilmente a sustratos utilizados para detectar protones. Más específicamente, los métodos expuestos en la presente memoria pueden utilizarse para producir poblaciones clonales de amplicones en los sitios de las matrices que se utilizan para detectar protones.
Otra aplicación útil para una matriz de la presente memoria, que por ejemplo se ha producido mediante un método expuesto en la presente memoria, es el análisis de la expresión génica. La expresión génica se puede detectar o cuantificar usando técnicas de secuenciación de ARN, tales como las denominadas secuenciación de ARN digital. Las técnicas de secuenciación de ARN se pueden realizar usando metodologías de secuenciación conocidas en la técnica, tales como las expuestas anteriormente. La expresión génica también se puede detectar o cuantificar usando técnicas de hibridación llevadas a cabo mediante hibridación directa con una matriz o usando un ensayo múltiplex, cuyos productos se detectan en una matriz. Una matriz de la presente memoria, por ejemplo, que se haya producido mediante un método expuesto en la presente memoria, también se puede usar para determinar genotipos para una muestra de ADN genómico de uno o más individuos. Los métodos de ejemplo para el análisis de expresión y genotipado basados en matriz que pueden llevarse a cabo en una matriz de la presente memoria se describen en las patentes US-7.582.420; US-6.890.741; US-6.913.884 o US-6.355.431 o la publicación de patente US-2005/0.053.980 A1; US-2009/0.186.349 A1 o US-2005/0.181.440 A1.
Una ventaja de los métodos expuestos en la presente memoria es que permiten la creación rápida y eficiente de matrices a partir de cualquiera de una diversidad de bibliotecas de ácidos nucleicos. En consecuencia, la presente memoria proporciona sistemas integrados capaces de fabricar una matriz usando uno o más de los métodos expuestos en la presente memoria y además capaces de detectar ácidos nucleicos en las matrices usando técnicas conocidas en la técnica tales como las ilustradas anteriormente. Por lo tanto, un sistema integrado de la presente memoria puede incluir componentes fluídicos capaces de suministrar reactivos de amplificación a una matriz de sitios de amplificación, tales como bombas, válvulas, depósitos, líneas fluídicas y similares. Un componente fluídico particularmente útil es una celda de flujo. Se puede configurar y/o usar una celda de flujo en un sistema integrado para crear una matriz de la presente memoria y para detectar la matriz. Se describen celdas de flujo de ejemplo, por ejemplo, en la publicación de patente US- 2010/0111768 A1 o la publicación de patente US- 8.951.781. Como se ilustra en las cubetas de lectura, puede utilizarse uno o más de los componentes fluídicos de un sistema integrado para un método de amplificación y para un método de detección. Tomando un ejemplo de secuenciación de ácidos nucleicos, puede utilizarse uno o más de los componentes fluídicos de un sistema integrado para un método de amplificación expuesto en la presente memoria y para el suministro de reactivos de secuenciación en un método de secuenciación tales como en los ilustrados anteriormente. Como alternativa, un sistema integrado puede incluir sistemas fluídicos distintos para llevar a cabo métodos de amplificación y para llevar a cabo métodos de detección. Como ejemplos de sistemas de secuenciación integrados que son capaces de crear matrices de ácidos nucleicos y también de determinar la secuencia de los ácidos nucleicos se incluyen, sin limitación, la plataforma de instrumento MISEQ™ (Illumina, Inc., San Diego, California) y los dispositivos descritos en la patente US- 8,951,781 (a la que se hace referencia anteriormente). Dichos dispositivos se pueden modificar para fabricar matrices que utilizan exclusión cinética según las directrices expuestas en la presente memoria.
Un sistema capaz de llevar a cabo un método expuesto en la presente memoria no necesita estar integrado con un dispositivo de detección. Más bien, también es posible un sistema autónomo o integrado con otros dispositivos. En tales ejemplos se pueden utilizar componentes fluídicos similares a los ilustrados anteriormente en el contexto de un sistema integrado.
Un sistema capaz de llevar a cabo un método expuesto en la presente memoria, ya sea integrado con capacidades de detección o no, puede incluir un controlador de sistema que sea capaz de realizar un conjunto de instrucciones para realizar uno o más métodos, técnicas o procesos expuestos en la presente memoria. Por ejemplo, las instrucciones pueden dirigir la realización de pasos para crear una matriz en condiciones de exclusión cinética. Opcionalmente, las instrucciones pueden dirigir adicionalmente la realización de los pasos para detectar ácidos nucleicos usando métodos expuestos anteriormente en la presente memoria. Un controlador del sistema útil puede incluir cualquier sistema basado en procesador o microprocesador, incluidos sistemas que utilicen microcontroladores, ordenadores de conjunto de instrucciones reducidas (RISC), circuitos integrados de aplicación específica (ASIC), matrices de puertas programables en campo (FPGA), circuitos lógicos y cualquier otro circuito o procesador capaz de realizar las funciones descritas en la presente memoria. Un conjunto de instrucciones para un controlador de sistema puede tener la forma de un programa de informático. Como se usa en la presente memoria, los términos “software” y “firmware” son intercambiables, e incluyen cualquier programa informático almacenado en la memoria para su ejecución por un ordenador, incluyendo memoria RAM, memoria ROM, memoria EPROM, memoria EEPROM y memoria RAM no volátil (NVRAM). Elsoftwarepuede adoptar varias formas, tal como unsoftwarede sistema o unsoftwarede aplicación. Además, elsoftwarepuede adoptar la forma de una colección de programas independientes, o un módulo de programa dentro de un programa más amplio o una parte de un módulo de programa. Elsoftwaretambién puede incluir programación modular en forma de programación orientada a objetos.
Varias aplicaciones para matrices de la presente memoria se han ilustrado anteriormente en el contexto de la detección por conjuntos, en donde se detectan juntos múltiples amplicones presentes en cada sitio de amplificación. En ejemplos alternativos, se puede detectar un único ácido nucleico, ya sea un ácido nucleico diana o un amplicón del mismo, en cada sitio de amplificación. Por ejemplo, un sitio de amplificación puede configurarse para contener una única molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos diana que se va a detectar y una pluralidad de ácidos nucleicos de relleno. En este ejemplo, los ácidos nucleicos de relleno actúan llenando la capacidad del sitio de amplificación y no necesariamente están destinados a ser detectados. La molécula individual que se va a detectar se puede detectar mediante un método que sea capaz de distinguir la molécula individual en el fondo de los ácidos nucleicos de relleno. Puede usarse cualquiera de una diversidad de técnicas de detección de moléculas individuales, incluidas, por ejemplo, modificaciones de las técnicas de detección por conjuntos expuestas anteriormente para detectar los sitios con mayor ganancia o usando marcadores más sensibles. Otros ejemplos de métodos de detección de moléculas individuales que se pueden utilizar se exponen en la publicación de patente US- 2011/0312529 A1; la patente US- 9.279.154; y en la publicación de patente US- 2013/0085073 A1.
Se puede crear una matriz útil para la detección de ácidos nucleicos de una sola molécula usando uno o más de los métodos expuestos en la presente memoria con las siguientes modificaciones. Se puede configurar una pluralidad de ácidos nucleicos diana diferentes para incluir tanto una secuencia de nucleótidos diana que se va a detectar como una o más secuencias de nucleótidos de relleno que se van a amplificar para crear amplicones de relleno. La pluralidad de diferentes ácidos nucleicos diana se puede incluir en un reactivo de amplificación, tal como los expuestos en otra parte de la presente memoria, y se pueden hacer reaccionar con una matriz de sitios de amplificación en condiciones de exclusión cinética tales que la(s) secuencia(s) de nucleótidos de relleno llenen los sitios de amplificación. Las configuraciones de ejemplo que pueden utilizarse para permitir que las secuencias de relleno se amplifiquen al tiempo que prohíben la amplificación de la secuencia diana incluyen, por ejemplo, una molécula diana individual que tiene una primera región con secuencias de relleno flanqueadas por sitios de unión para cebadores de amplificación presentes en el sitio de amplificación y una segunda región que tiene una secuencia diana fuera de la región flanqueada. En otra configuración, un ácido nucleico diana puede incluir moléculas o cadenas separadas que portan la secuencia diana y la secuencia o secuencias de relleno, respectivamente. Las moléculas o cadenas separadas pueden estar unidas a una partícula o formadas como brazos de un dendrímero de ácido nucleico u otra estructura ramificada.
En un ejemplo particular, se puede detectar una matriz que tiene sitios de amplificación que contienen cada uno secuencias de relleno y una secuencia diana utilizando un ensayo de extensión de cebadores o una técnica de secuenciación por síntesis. En tales casos, se puede lograr una extensión específica en la secuencia de nucleótidos diana en lugar de en la gran cantidad de secuencia de relleno mediante el uso de sitios de unión de cebadores ubicados apropiadamente. Por ejemplo, los sitios de unión para los cebadores de secuenciación pueden colocarse secuencia arriba de la secuencia diana y pueden estar ausentes en cualquiera de las secuencias de relleno. Alternativamente, o de forma adicional, la secuencia diana puede incluir uno o más análogos de nucleótidos no nativos que no son capaces de formar enlaces de hidrógeno con nucleótidos estándar. El o los nucleótidos no naturales pueden colocarse secuencia abajo del sitio de unión del cebador (p. ej., en la secuencia diana o en una región intermedia entre la secuencia diana y el sitio de unión del cebador) y, como tales, evitarán la extensión o la secuenciación por síntesis hasta que se añada un compañero nucleotídico apropiado (es decir, uno capaz de formar enlaces de hidrógeno con el (los) análogo(s) no natural(es) en la secuencia diana). Los análogos de nucleótidos isocitosina (isoC) e isoguanina (isoG) son particularmente útiles ya que se emparejan específicamente entre sí pero no con otros nucleótidos estándar utilizados en la mayoría de las técnicas de extensión y secuenciación por síntesis. Un beneficio adicional de usar isoC y/o isoG en una secuencia diana o secuencia arriba de la secuencia diana es evitar la amplificación no deseada de la secuencia diana durante los pasos de amplificación al omitir el compañero respectivo en la mezcla de nucleótidos usada para la amplificación.
Se entenderá que una matriz de la presente memoria, por ejemplo, que se haya producido mediante un método expuesto en el presente documento, no necesita utilizarse para un método de detección. Más bien, la matriz se puede utilizar para almacenar una biblioteca de ácidos nucleicos. En consecuencia, la matriz se puede almacenar en un estado que conserve los ácidos nucleicos que contiene. Por ejemplo, una matriz se puede almacenar en estado desecado, congelado (p. ej., en nitrógeno líquido) o en una solución que proteja los ácidos nucleicos. Alternativamente, o de forma adicional, la matriz se puede utilizar para replicar una biblioteca de ácidos nucleicos. Por ejemplo, se puede usar una matriz para crear amplicones replicados de uno o más de los sitios en la matriz.
En la presente memoria se han ilustrado varios ejemplos con respecto al transporte de ácidos nucleicos diana a sitios de amplificación de una matriz y a la fabricación de copias de los ácidos nucleicos diana capturados en los sitios de amplificación. Se pueden utilizar métodos similares para moléculas diana que no sean ácidos nucleicos. Por lo tanto, los métodos expuestos en la presente memoria se pueden usar con otras moléculas diana en lugar de los ácidos nucleicos diana ilustrados. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un método de la presente memoria para transportar moléculas diana individuales de una población de moléculas diana diferentes. Cada molécula diana puede transportarse a (y en algunos casos capturarse en) un sitio individual de una matriz para iniciar una reacción en el sitio de captura. La reacción en cada sitio puede, por ejemplo, producir copias de la molécula capturada o la reacción puede alterar el sitio para aislar o secuestrar la molécula capturada. En cualquier caso, el resultado final pueden ser sitios de la matriz que sean puros con respecto al tipo de molécula diana que está presente en una población que contiene diferentes tipos de moléculas diana.
En ejemplos particulares que utilizan moléculas diana distintas de ácidos nucleicos, se puede crear una biblioteca de diferentes moléculas diana utilizando un método que aproveche la exclusión cinética. Por ejemplo, se puede preparar una matriz de moléculas diana en condiciones en que los sitios de la matriz se siembran al azar con moléculas diana de una solución y se generan copias de la molécula diana para llenar cada uno de los sitios sembrados hasta su capacidad. Según los métodos de exclusión cinética de la presente memoria, los procesos de siembra y copia pueden proceder simultáneamente en condiciones en que la velocidad a la que se fabrican las copias supera la velocidad de siembra. Como tal, la velocidad relativamente rápida a la que se fabrican las copias en un sitio que se ha sembrado por una primera molécula diana excluirá de forma efectiva que una segunda molécula diana siembre el sitio. En algunos casos, la siembra de una molécula diana iniciará una reacción que llena un sitio al máximo de su capacidad mediante un proceso distinto de la copia de la molécula diana. Por ejemplo, la captura de una molécula diana en un sitio puede iniciar una reacción en cadena que eventualmente hace que el sitio sea incapaz de capturar una segunda molécula diana. La reacción en cadena puede producirse a una velocidad que supere la velocidad a la que se capturan las moléculas diana, teniendo lugar de este modo en condiciones de exclusión cinética.
Como se ilustra para los ácidos nucleicos diana, la exclusión cinética cuando se aplica a otras moléculas diana puede aprovechar una velocidad relativamente lenta para iniciar una reacción repetitiva (p. ej., una reacción en cadena) en un sitio de una matriz, frente a una velocidad relativamente rápida para continuar la reacción repetitiva una vez iniciada. En el ejemplo del párrafo anterior, la exclusión cinética se produce debido a la velocidad relativamente lenta de siembra de la molécula diana (p. ej., difusión relativamente lenta) frente a la velocidad relativamente rápida a la que se produce una reacción, por ejemplo, para llenar el sitio con copias de la semilla de la molécula diana. En otro ejemplo, la exclusión cinética puede producirse debido a un retraso en la formación de una primera copia de una molécula diana que ha sembrado un sitio (p. ej., activación retardada o lenta) frente a la velocidad relativamente rápida a la que se hacen copias posteriores para llenar el sitio. En este ejemplo, es posible que se haya sembrado un sitio individual con varias moléculas diana diferentes. Sin embargo, la primera formación de copias para cualquier molécula diana dada puede activarse de al azar, de modo que la velocidad promedio de la primera formación de copias sea relativamente lenta en comparación con la velocidad a la que se generan copias posteriores. En este caso, aunque un sitio individual puede haberse sembrado con varias moléculas diana diferentes, la exclusión cinética sólo permitirá copiar una de esas moléculas diana.
En consecuencia, se describe, pero no se reivindica, un método para fabricar una matriz de moléculas que puede incluir (a) proporcionar un reactivo que incluya (i) una matriz de sitios, y (ii) una solución que tiene una pluralidad de moléculas diana diferentes, en donde el número de moléculas diana en la solución supera el número de sitios en la matriz, en donde las diferentes moléculas diana tienen acceso fluídico a la pluralidad de sitios, y en donde cada uno de los sitios comprende una capacidad para varias moléculas diana en la pluralidad de diferentes moléculas diana; y (b) hacer reaccionar el reactivo para producir una pluralidad de sitios que tienen cada uno una única molécula diana de la pluralidad o para producir una pluralidad de sitios que tienen cada uno una población pura de copias de una molécula diana individual de la solución, en donde la reacción incluye simultáneamente (i) transportar las diferentes moléculas a los sitios a una velocidad de transporte promedio, e (ii) iniciar una reacción que llena el sitio hasta su capacidad a una velocidad de reacción promedio, en donde la velocidad de reacción promedio supera la velocidad de transporte promedio. En algunos ejemplos, el paso (b) se puede llevar a cabo haciendo reaccionar el reactivo para producir una pluralidad de sitios que tienen cada uno una única molécula diana de la pluralidad o para producir una pluralidad de sitios que tienen cada uno una población pura de copias de una molécula diana individual de la solución, en donde la reacción incluye (i) iniciar una reacción repetitiva (p. ej., una reacción en cadena) para formar un producto a partir de la molécula diana en cada uno de los sitios, y (ii) continuar la reacción en cada uno de los sitios para formar productos posteriores, en donde la velocidad promedio a la que se produce la reacción en los sitios supera la velocidad promedio a la que se inicia la reacción en los sitios.
En los ejemplos anteriores no de ácidos nucleicos, la molécula diana puede ser un iniciador de una reacción repetitiva que se produce en cada sitio de la matriz. Por ejemplo, la reacción repetitiva puede formar un polímero que impida que otras moléculas diana ocupen el sitio. Alternativamente, la reacción repetitiva puede formar uno o más polímeros que constituyen copias moleculares de una molécula diana que fue transportada al sitio.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar la presente materia de invención.
Ejemplo I
Formación super-Poissoniana de matrices de conglomerados en celdas de flujo
Este ejemplo describe un método para lograr la formación de super-Poissoniana de una matriz de conglomerados en una celda de flujo para una plataforma de secuenciación de Illumina (San Diego, California). El método descrito en la presente memoria es un proceso para capturar un elemento de la biblioteca (p. ej., un fragmento del genoma) en una característica y amplificar simultáneamente de forma clonada el elemento de la biblioteca. Una característica clave del proceso en este ejemplo es controlar la velocidad de captura frente a la velocidad de amplificación y hacerlo en un proceso homogéneo. Muchos procesos anteriores desarrollados para la siembra a alta densidad de celdas de flujo de Illumina separan la captura del elemento de la biblioteca del proceso de amplificación clonal. En este ejemplo, el evento de captura inicia un evento de amplificación clonal en la característica.
Se prepara una celda de flujo modelada de la siguiente manera. Las celdas de flujo de vidrio (Illumina, Inc., San Diego, California) se recubren con parches de oro mediante un enfoque de despegue. En resumen, una capa fotorresistente se recubre uniformemente sobre la superficie de la celda de flujo de vidrio y los parches de la fotorresistencia se eliminan mediante fotolitografía para exponer los parches de la superficie del vidrio. Después se deposita una capa de oro sobre la superficie para formar una película delgada continua sobre las regiones fotorresistentes y los parches de vidrio. Se puede depositar oro utilizando evaporación por haz de electrones o pulverización catódica como se expone en Thornton, Ann. Rev. Mater. Sci. 7:239-60 (1977). La capa fotorresistente se retira después mediante un desprendimiento con acetona para dejar parches de oro de forma circular, con un diámetro inferior a 1 micra y rodeadas por regiones intersticiales de la superficie del vidrio. La celda de flujo con patrón de oro se recubre entonces con acrilamida libre de silano (SFA) como se describe en la patente WO 2008/093098. Los cebadores P5 y P7 se injertan en el SFA polimerizado mediante un resto escindible con nitrobencilo por UV (Glenn Research, Sterling, Virginia). La celda de flujo se coloca sobre una fuente de luz UV (302 nm) de tal modo que los parches de oro crean una máscara para los cebadores adheridos sobre los parches, mientras que cualquier cebador adherido sobre las regiones intersticiales se escinde debido a la exposición a la luz UV. Los cebadores P5 y P7 que permanecen en los parches de oro son capaces de soportar la amplificación clonal de las bibliotecas (P5/P7).
Los elementos de la biblioteca se producen de la siguiente manera. Una biblioteca de ADN genómico (ADNg) está fragmentada y los adaptadores bifurcados que tienen sitios de unión a los cebadores que son complementarios a los cebadores P5 y P7 se ligan a los fragmentos de ADNg, según los protocolos comerciales de preparación de muestras de Illumina.
La formación de matrices de conglomerados super-Poissoniana se lleva a cabo de la siguiente manera. Se prepara una solución que contiene los elementos de la biblioteca (en forma bicatenaria) y el reactivo TWISTAMP® Basic (TwistDx, Cambridge, Reino Unido). El reactivo TWISTAMP® Basic contiene una mezcla de enzimas que puede soportar la amplificación dependiente de la plantilla en la superficie (ADN polimerasa, proteína de unión monocatenaria y recombinasa). La concentración de los elementos de la biblioteca en solución se controla de tal modo que la velocidad de captura por hibridación de un elemento de la biblioteca por cualquier característica sea mucho menor que la velocidad de amplificación clonal y de tal modo que haya un agotamiento suficiente de los oligos disponibles en la característica para capturar otro elemento de la biblioteca.
La concentración óptima o deseada de cualquier otra manera de los elementos de la biblioteca para la solución se puede determinar empíricamente mediante titulación utilizando el protocolo de formación de matrices de conglomerados super-Poissoniana anterior seguido de una secuenciación ejecutada en un dispositivo de secuenciación Illumina (p. ej., instrumentos GENOMEANALYZER®, HISEQ® o MISEQ®).
Ejemplo II
Caracterización de matrices de conglomerados modelados creadas en condiciones de exclusión cinética
Este ejemplo demuestra la carga de super-Poissoniana de conglomerados monoclonales en entidades con patrones utilizando condiciones de exclusión cinética.
Se preparó una celda de flujo modelada de la siguiente manera. Las celdas de flujo de vidrio (Illumina, Inc., San Diego, California) se recubrieron con almohadillas de oro utilizando un enfoque de despegue como se describe en la patente US- 8.778.848. En resumen, una capa fotorresistente se recubrió uniformemente sobre la superficie de la celda de flujo de vidrio y los parches de la fotorresistencia se eliminaron mediante fotolitografía para exponer los parches de la superficie de vidrio. Después se depositó una capa de oro sobre la superficie para formar una película delgada continua sobre las regiones fotorresistentes y los parches de vidrio. El oro se depositó mediante evaporación por haz de electrones, tal como se expone en Thornton, Ann. Rev. Mater. Sci. 7:239-60 (1977). La capa fotorresistente se retiró después mediante extracción con acetona para dejar un patrón hexagonal de almohadillas de oro, en donde cada una de las almohadillas de oro tenía forma circular, tenía un diámetro de 500 nm y estaba rodeada por regiones intersticiales de la superficie del vidrio. La celda de flujo con patrón de oro se recubrió después con acrilamida libre de silano (SFA) como se describe en la patente WO 2008/093098. Los cebadores se injertaron en el SFA polimerizado mediante un resto escindible con nitrobencilo UV (Glenn Research, Sterling, Virginia). La celda de flujo se colocó sobre una fuente de luz UV (302 nm) de tal modo que las almohadillas de oro crearon una máscara para los cebadores unidos sobre las almohadillas, mientras que cualquier cebador unido sobre las regiones intersticiales se escindió debido a la exposición a la luz UV. Los cebadores escindidos se eliminaron por lavado dejando los cebadores adheridos sobre las almohadillas de oro.
Los conglomerados se cultivaron en las almohadillas de oro utilizando el kit TWISTAMP® Basic (TwistDx, Cambridge, Reino Unido) de la siguiente manera. Se mezcló una biblioteca de ADN PhiX bicatenario a diferentes concentraciones en el regulador de rehidratación básica TWISTAMP® y los reactivos de acetato de magnesio. Las concentraciones de ADN PhiX analizadas fueron de aproximadamente 72 pM, aproximadamente 144 pM, aproximadamente 432 pM y aproximadamente 864 pM. Estas concentraciones superaban el intervalo típico de aproximadamente 9-10 pM de ADN utilizado para la siembra estándar de celdas de flujo de Illumina. También, el ADN PhiX era bicatenario, a diferencia de la siembra estándar de celdas de flujo de Illumina, donde el ADN molde está en forma monocatenaria. Las mezclas que contenían ADN PhiX se utilizaron para rehidratar los gránulos liofilizados TWISTAMP® Basic y después se purgaron en los carriles respectivos de la celda de flujo modelada a aproximadamente 38 °C. La incubación continuó durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 38 °C antes de lavar con regulador de lavado HT2 (Illumina, Inc., San Diego CA) y teñir los conglomerados con SyBr Green. A continuación, los conglomerados se procesaron para su secuenciación mediante el tratamiento con LMX1 durante aproximadamente 30 minutos para linealizar el ADN en los conglomerados, la desnaturalización con NaOH aproximadamente 0,1 N y la hibridación del cebador de secuenciación. La celda de flujo se secuenció después durante 26 ciclos en un instrumento Illumina HISEQ® 2000.
La inspección visual de las imágenes de las celdas de flujo mostró que los conglomerados estaban ordenados espacialmente en un patrón correspondiente al patrón de las almohadillas de oro en la superficie. La figura 1 (a) muestra una imagen compuesta para los cuatro canales de color obtenida después de un primer ciclo de secuenciación utilizando una celda de flujo producida mediante los métodos de exclusión cinética expuestos anteriormente. A modo de comparación, la figura 1 (b) muestra una imagen compuesta obtenida después de un único ciclo de secuenciación para una celda de flujo estándar que tiene conglomerados localizados al azar.
El análisis de la función de distribución de pares (PDF) y la función de vecino más cercano (NN) para una imagen compuesta de la celda de flujo también indicó un alto grado de orden. La densidad de conglomerados sin procesar se<calculó en aproximadamente 640.000 conglomerados por milímetro cuadrado para la imagen. La función>N<n se utilizó>para medir la distancia promedio entre los conglomerados vecinos más cercanos de la imagen. Como se muestra en la figura 2, la función NN produjo predominantemente un único pico de alrededor de 2,3 píxeles. Esto era coherente con el patrón de inclinación esperado de 1 micra para las almohadillas, lo que sugería una matriz de conglomerados muy ordenada. La formación de conglomerados aleatoria, por el contrario, produce un pico mucho más amplio, con valores más bajos que se acercan al límite de detección del algoritmo de selección de conglomerados (1,2 píxeles). La PDF de la figura 2 es coherente con la estructura esperada para una matriz hexagonal ordenada. Por ejemplo, la función PDF mostró un pico primario esperado de aproximadamente 2,66 píxeles y los picos de orden superior correspondientes a los vecinos más allá del más cercano eran claramente visibles y estaban presentes en las proporciones de pico esperadas. Solo se observó un ligero cambio en la ubicación de los picos entre las funciones NN y PDF. Este bajo nivel de fluctuación indicó que esa desviación de las posiciones teóricamente perfectas era bastante baja y estaba dentro de los niveles aceptables.
La inspección visual de imágenes compuestas a cuatro colores también reveló la ausencia de saltos indeseables entre almohadillas. El salto entre almohadillas se refiere al proceso en donde varias almohadillas adyacentes se amplifican a partir de la misma secuencia de plantilla. Los saltos de almohadilla se caracterizan visualmente en una imagen a cuatro colores como parches contiguos de conglomerados que tienen el mismo color. La ausencia de las mismas manchas de color en las celdas de flujo producidas en condiciones de exclusión cinética que las expuestas en este ejemplo indicó que no se producían niveles indeseables de saltos entre almohadillas. La figura 3 proporciona una representación más cuantitativa del color y la posición espacial de los conglomerados, lo que indica que saltar entre almohadillas no era un problema. Específicamente, la figura 3 muestra un diagrama de dispersión de las posiciones espaciales de los conglomerados que se alinean con las primeras 5 posiciones genómicas del genoma PhiX. Las diferentes posiciones genómicas se indican mediante équises, asteriscos, cuadrados, triángulos y rombos. Los 5 tipos de símbolos se distribuyen aleatoriamente en la figura y no se agrupan, lo que indica que saltar entre almohadillas no era un problema.
El análisis de secuencia para los 26 ciclos de datos se realizó para las celdas de flujo producidas utilizando condiciones de exclusión cinética. Los resultados indicaron que aproximadamente el 64 % de las almohadillas estaban ocupadas y aproximadamente el 56 % de las almohadillas tenían conglomerados que eran clonales. Por lo tanto, los métodos produjeron un aumento de casi 2 veces en los conglomerados clonales con respecto a lo esperado de la carga de Poisson, lo que habría pronosticado que alrededor del 36 % de las almohadillas serían clonales si aproximadamente el 64 % de ellas estuvieran ocupadas. Estos resultados mostraron claramente una carga de super-Poissoniana.
Ejemplo III
Desorción eléctrica activa y modelado de biomoléculas
Este ejemplo demuestra un método para modelar espacialmente biomoléculas utilizando campos eléctricos. Los métodos descritos en este ejemplo siembran rápidamente el ADN en los sitios diana y repelen electroquímicamente las biomoléculas de las regiones intersticiales, lo que da como resultado matrices direccionables y con muchos patrones de conglomerados de ADN. Los resultados que se muestran aquí demuestran la formación de celdas de flujo que tienen patrones de conglomerados de ácidos nucleicos monoclonales.
El método descrito en este ejemplo emplea un potencial eléctrico aplicado a través de una superficie conductora y un electrolito, o a través de dos superficies conductoras para desorber activamente moléculas fisiadsorbidas o químicamente conjugadas de una o ambas superficies polarizadas eléctricamente. Este método de desorción activa no requiere ninguna química o modificación de la superficie, puede desorber moléculas muy rápidamente (menos de 5 minutos) y es menos sensible a las condiciones del proceso que los métodos de desorción pasiva. Las superficies conductoras pueden ser de naturaleza metálica (p. ej., titanio, óxido de indio y estaño) o semiconductoras y el potencial aplicado puede ser de CA o CC, lo que resulta en una reacción electroquímica en la interfaz electrodo/electrolito. La aplicación de un campo eléctrico mejora la relación entre la señal (en los sitios de interés) y el ruido (desde las regiones intersticiales) en un orden de magnitud. El método descrito en este ejemplo también se puede aplicar a electrodos planos para la desorción selectiva, la refuncionalización selectiva de los electrodos y el modelado electroquímico de especies.
Arquitectura de celda de flujo
Las dos arquitecturas descritas anteriormente para la desorción electroquímica de biomoléculas se ilustran en las figuras 4 (a) y 4 (b). Específicamente, se utilizó óxido de indio y estaño (ITO) como material de electrodo transparente conductor. El ITO se depositó sobre una superficie D263 mediante pulverización catódica por radiofrecuencia. La figura 4 (a) muestra el potencial eléctrico aplicado a través de la capa conductora de ITO y el electrolito. La figura 4 (b) muestra el potencial aplicado a través de dos placas de ITO conductoras paralelas separadas por un medio líquido. Ambas arquitecturas se pueden utilizar para desorber eléctricamente especies de la superficie del ITO. Los sitios nanoestampados de oro (Au) son útiles para la captura dirigida de biomoléculas tioladas (p. ej., avidina tiolada). Los sitios Au se separan del ITO subyacente utilizando un espaciador dieléctrico (p. ej., SiO<2>, SiN, carbono similar al diamante) para evitar la electroquímica en el Au.
La arquitectura de la figura 4 (b) también se puede utilizar para concentrar rápidamente y simultáneamente el ADN (p. ej., 100 veces) en la superficie de la celda de flujo utilizando campos eléctricos, como se muestra en las imágenes de lapso de tiempo de la figura 4 (c). En estos experimentos, se aplicó un potencial (V) de aproximadamente 2V a través de un espacio de aproximadamente 100 pm que separa las dos superficies de ITO. El aumento de la fluorescencia a lo largo del tiempo, tal como se observa utilizando imágenes de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) en la figura 4 (c), se debe a un gran aumento en la concentración superficial del ADN de control PhiX (marcado con colorante YOYO) bajo un campo eléctrico aplicado en la superficie superior de la celda de flujo. Por lo tanto, la técnica descrita aquí se puede utilizar para desorber electroquímicamente simultáneamente biomoléculas de la región intersticial al tiempo que se facilita la siembra rápida.
Flujo de trabajo experimental
El flujo de trabajo experimental para los experimentos de desorción activa se describe en la figura 5. El método consiste en recubrir con avidina la superficie de una celda de flujo, seguido de un recubrimiento con acrilamida libre de silano (SFA) e injertar cebadores en el SFA. El recubrimiento con SFA y el injerto de los cebadores P5 y P7 se llevan a cabo como se describe en la patente WO 2008/093098. Sin embargo, en los presentes métodos, la avidina se modela electroquímicamente en sitios dieléctricos o de Au (separados por regiones intersticiales de ITO) que están presentes en la superficie de la celda de flujo utilizando un paso de desorción eléctrica antes del recubrimiento con SFA. También, tras el injerto de los cebadores P5 y P7, el campo eléctrico se aplica tanto para sembrar rápidamente el ADN en los sitios Au o dieléctricos como para desorber electroquímicamente las biomoléculas (ADN, avidina, cebadores) de los intersticiales de ITO. En un ejemplo, se aplican aproximadamente 2V para desorber eficazmente las moléculas. Las duraciones de campo de tan solo 5 minutos pueden desorber eficazmente la mayoría de las moléculas en las regiones intersticiales. Además, los resultados sugieren que la concentración de cebadores en la región intersticial también disminuye después del paso de campo eléctrico. La amplificación por conglomerados se realiza a continuación como se describe en Bentley y col. Nature 456: 53-59 (2008), seguida de tinción en conglomerados con un colorante intercalante de ADNbc y, a continuación, obtención de imágenes microscópicas. La celda de flujo se secuenció a continuación para determinar la clonalidad del conglomerado utilizando un instrumento secuenciador de ADN HISEQ® 2000 (Illumina, Inc. San Diego). En la figura 5 se muestra un esquema que muestra los efectos de la siembra asistida por campo y la desorción electroquímica.
Resultados experimentales
La figura 6 ilustra los resultados obtenidos utilizando la arquitectura de celdas de flujo de la figura 4(b), tanto con campo eléctrico (figura 6(a)) como sin campo eléctrico (figura 6(b)). En presencia del campo eléctrico, los conglomerados están muy confinados a los sitios Au de aproximadamente 2 pm y se observa muy poca fluorescencia en las áreas intersticiales. En los sitios de aproximadamente 2 pm, los conglomerados son altamente policlonales debido al gran tamaño de la almohadilla de Au. El grado de policlonalidad se puede disminuir disminuyendo el tamaño de la almohadilla para impedir que varias plantillas se siembren mediante exclusión estérica o la policlonalidad puede disminuir mediante condiciones de exclusión cinética. Obsérvese también que la intensidad de los píxeles en las regiones intersticiales es cercana a 0 (perfil de línea de la figura 6 (a)). Por el contrario, los conglomerados están presentes tanto en la superficie de Au como en la de ITO intersticial en ausencia del campo eléctrico. El patrón periódico observado en el perfil lineal de la figura 6 (a) no se observa en el perfil lineal de la figura 6 (b), lo que confirma que el confinamiento del conglomerado es el resultado del campo eléctrico.
La técnica del campo eléctrico se puede utilizar para modelar espacialmente conglomerados tanto en sitios de tamaño micrométrico como en sitios con patrones nanométricos en áreas grandes. En las figuras 7 (a) y 7 (b) se ilustran imágenes de área grande de los conglomerados estampados sembrados en sitios Au de aproximadamente 2 pm de diámetro y sitios Au de aproximadamente 200 nm de diámetro, respectivamente, junto con sus correspondientes transformadas de Fourier (FFT). Los conglomerados están bien definidos y tienen un patrón muy alto, con muy poca unión inespecífica en las áreas intersticiales de ITO. Esto se ve confirmado aún más por los puntos bien definidos que se ven en la FFT, lo que sugiere una red ordenada o con patrones. La ocupación de los conglomerados en las características con patrones nanométricos de la figura 7 (b) es de aproximadamente el 40-50 %, pero se puede aumentar aún más mediante el uso de concentraciones de avidina más altas o mediante la manipulación de la forma de onda de voltaje. La misma química/proceso también se puede utilizar para agrupar con alta precisión espacial en sitios dieléctricos. En la figura 8 se muestran conglomerados ordenados en sitios de SiO<2>de aproximadamente 700 nm de diámetro.
Mecanismo
Los datos sugieren que el patrón espacial de los conglomerados se facilita en presencia de un campo eléctrico. Es probable que esto se deba a la eliminación electroquímica de biomoléculas (p. ej., ADN, proteínas y cebadores) en las regiones intersticiales. Se observa que la intensidad del cebador injertado disminuye cuando se aplica el campo eléctrico, como se ve utilizando ensayos de hibridación con sondas etiquetadas con Texas Red (TR). La figura 9 (a) ilustra los escaneos de Typhoon que muestran la intensidad de fluorescencia TR (que se cuantifica en la figura 9(b)) para los ensayos de hibridación realizados en la celda de flujo antes y después de la aplicación del campo eléctrico. La intensidad de la fluorescencia disminuye en más de un factor de dos después de la aplicación del campo eléctrico, lo que confirma la eliminación de los cebadores del SFA. Para aumentar la intensidad del conglomerado, la celda de flujo se volvió a revestir con SFA y se volvió a injertar con los cebadores P5 y P7. Esto resultó en un aumento apreciable en la intensidad del TR. Por lo tanto, es probable que sea posible sembrar ADN, eliminar electroquímicamente moléculas unidas de manera no específica en las regiones intersticiales, recubrir el SFA y volver a injertar cebadores para obtener conglomerados de alta intensidad con patrones espaciales.
Hibridación directa de ADN
El patrón espacial de los conglomerados también se observó en experimentos que involucraron la hibridación directa del ADNmc de PhiX con el césped de imprimación P5 y P7. En la figura 10 (a) se muestra un esquema del proceso. Estos experimentos se realizaron en sitios Sift de aproximadamente 2 pm en ITO. El mismo proceso se puede aplicar a sitios con nanopatrones con una variedad de materiales dieléctricos que forman los sitios. En estos experimentos no se requieren ADN biotinilado ni avidina, lo que resulta en menos pasos químicos, al tiempo que se mantiene la especificidad de los conglomerados en los sitios. La especificidad es probablemente el resultado de la desorción electroquímica de los cebadores en las regiones intersticiales. La figura 10 (b) muestra conglomerados formados en sitios Sift de aproximadamente 2 |jm en presencia de un campo eléctrico (aproximadamente 2V, aproximadamente 0,1 Hz) utilizando el enfoque de hibridación directa. Los conglomerados bien modelados son visibles con muy poco en las regiones intersticiales. La figura 10 (c) es el mismo experimento en ausencia de un campo eléctrico y muestra que los conglomerados están orientados aleatoriamente en las regiones intersticiales SFA e ITO sin que esté presente un orden distinto en ausencia del campo eléctrico. Estos resultados confirman que los campos eléctricos pueden utilizarse para ayudar a modelar el espacio de la formación de conglomerados de ácidos nucleicos.
La figura 11 es un diagrama de flujo de un método 100 para generar conglomerados genéticos en una celda de flujo según un ejemplo. El método 100 se lleva a cabo según las enseñanzas descritas en la presente memoria. En 102, una primera mezcla de reactivos se mezcla con una cantidad de ácidos nucleicos diana para definir una primera solución. La primera solución también se denomina en la presente memoria solución diana porque la primera solución incluye una cantidad sustancial, sin trazas, de ácidos nucleicos diana.
Los ácidos nucleicos diana pueden ser ADN de una biblioteca genética que se va a secuenciar. Los ácidos nucleicos diana se preparan como cadenas con adaptadores en los extremos que están configurados para unirse a los cebadores correspondientes en los sitios de amplificación de la celda de flujo. La primera mezcla de reactivos se compone de varios componentes reactivos que incluyen, pero no se limitan a, los NTP y una o más enzimas de replicación. Las una o más enzimas de replicación pueden incluir polimerasa, recombinasa, helicasa y/o similares. La mezcla de reactivos puede incluir componentes reactivos adicionales además de los NTP y las una o más enzimas de replicación, tales como cebadores, proteínas de unión monocatenarias, reguladores para el transporte fluídico (p. ej., agua, un surfactante, etc.), un agente de aglomeración, magnesio y/o similares. En un ejemplo, la primera mezcla de reactivos se mezcla con los ácidos nucleicos diana en un depósito de mezcla o almacenamiento en un colector de reactivos que está conectado de manera fluida a una celda de flujo. Los ácidos nucleicos diana flotan libremente dentro de la solución diana.
En 104, la solución diana se hace fluir sobre una matriz de sitios de amplificación en una celda de flujo para producir poblaciones clonales de amplicones en la celda de flujo. El flujo de la solución diana sobre los sitios de amplificación produce las poblaciones clonales de amplicones en los sitios de amplificación según las condiciones de amplificación por exclusión cinética descritas en la presente memoria. Las poblaciones clonales de amplicones también se denominan en la presente memoria conglomerados clonales y conglomerados genéticos. En un ejemplo, la solución diana fluye desde el depósito de mezcla del colector de reactivos hasta la celda de flujo y a través de un puerto de entrada de la celda de flujo para contactar con la matriz de sitios de amplificación.
Los sitios de amplificación pueden estar ubicados en características estructurales a lo largo de una superficie de la celda de flujo. Las características estructurales son pocillos cóncavos a lo largo de la superficie en un ejemplo, pero pueden ser otras características tales como perlas en otros ejemplos. Los pocillos están separados entre sí por regiones intersticiales de la superficie de la celda de flujo. Antes de hacer fluir la solución diana sobre los sitios de amplificación, la celda de flujo se prepara uniendo los cebadores P5 y P7 a la superficie de la celda de flujo en los sitios de amplificación. En un ejemplo, los cebadores pueden unirse a la celda de flujo mediante el recubrimiento de la celda de flujo modelada con acrilamida libre de silano (SFA) y después injertando los cebadores en el SFA polimerizado mediante un resto escindible con nitrobencilo UV. Los cebadores pueden guiarse opcionalmente a los sitios de amplificación y alejarlos de las regiones intersticiales mediante transporte asistido por e-field. Alternativamente, los cebadores pueden injertarse tanto en los pocillos como en las regiones intersticiales, pero los cebadores de las regiones intersticiales se eliminan debido a la exposición a la luz UV, al pulido u otro proceso que elimina los cebadores de las regiones intersticiales sin eliminar los cebadores ubicados dentro de los pocillos. La celda de flujo preparada incluye un conjunto de cebadores en cada uno de los sitios de amplificación (p. ej., dentro de cada uno de los pocillos) y tiene solo una pequeña cantidad de cebadores, si los hay, dentro de las regiones intersticiales.
La solución diana puede fluir activamente sobre los sitios de amplificación utilizando una o más bombas que requieren una fuente de energía para propulsar la solución diana en relación con la celda de flujo. En otro ejemplo, la solución diana puede fluir pasivamente sobre los sitios de amplificación abriendo una o más válvulas y permitiendo que la gravedad y/o la difusión muevan la solución diana sobre los sitios de amplificación. Los ácidos nucleicos diana flotan libremente dentro de la solución diana a medida que la solución diana fluye sobre los sitios de amplificación. El número de ácidos nucleicos diana en la solución diana supera el número de sitios de amplificación, tales como pocillos, en la celda de flujo.
En 106, la solución diana se incuba en la celda de flujo. La solución diana se incuba manteniéndola en contacto con la serie de sitios de amplificación en la celda de flujo durante un período de tiempo designado en condiciones designadas (p. ej., temperatura, presión, humedad, etc.). Por ejemplo, la solución diana se puede incubar en la celda de flujo a una temperatura entre aproximadamente 20 grados Celsius y aproximadamente 50 grados Celsius, tal como entre aproximadamente 30 y aproximadamente 42 grados Celsius, durante un tiempo entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 90 minutos, tal como aproximadamente 40 minutos o aproximadamente 60 minutos. Las condiciones de incubación pueden ser diferentes en ejemplos alternativos.
Durante la incubación, la solución diana reacciona en la celda de flujo para producir poblaciones clónales de amplicones en los sitios de amplificación. Las poblaciones clonales de amplicones se originan a partir de los ácidos nucleicos diana correspondientes. Los ácidos nucleicos diana se unen a los cebadores unidos a los sitios de amplificación mediante la hibridación entre los extremos del adaptador y los cebadores para unir los ácidos nucleicos diana a la celda de flujo. Los ácidos nucleicos diana se transportan a los sitios de amplificación y se unen a los cebadores a una velocidad de transporte. La velocidad de transporte describe la velocidad de siembra de un ácido nucleico diana en un sitio de amplificación, tal como un pocillo. La velocidad de transporte puede depender de la concentración de ácidos nucleicos diana en la solución diana que fluye sobre los sitios de amplificación. Por ejemplo, una mayor concentración de los ácidos nucleicos diana en la solución diana puede aumentar la velocidad de transporte en comparación con la velocidad de transporte resultante de una menor concentración de los ácidos nucleicos diana en la solución diana. La velocidad de transporte se puede controlar controlando la concentración de los ácidos nucleicos diana en la solución diana. La velocidad de transporte también se puede controlar controlando la viscosidad de la solución diana, controlando el tamaño promedio de los ácidos nucleicos diana y/o decidiendo si se debe añadir un reactivo de aglomeración molecular en la solución diana. Por ejemplo, la velocidad de transporte se puede reducir aumentando la viscosidad de la solución diana, aumentando el tamaño o la longitud promedio de las cadenas de los ácidos nucleicos diana y/o añadiendo un reactivo de aglomeración molecular (que obstruye la capacidad de los ácidos nucleicos que flotan libremente para moverse y unirse a los cebadores en los sitios de amplificación). La velocidad de transporte se puede aumentar reduciendo la viscosidad de la solución diana, reduciendo el tamaño promedio de los ácidos nucleicos diana y/o no utilizando un reactivo de aglomeración molecular.
La presencia de la mezcla de reactivos en la solución diana permite el transporte simultáneo de los ácidos nucleicos diana a los sitios de amplificación y la amplificación de los ácidos nucleicos diana que ya están unidos a los sitios de amplificación. Por ejemplo, las enzimas usan los nucleótidos de los NTP para producir los amplicones, que son copias de los ácidos nucleicos diana. Los amplicones están unidos a los sitios de amplificación. Los amplicones se producen a una velocidad de amplificación, que puede controlarse en función de las concentraciones de los componentes reactivos dentro de la primera mezcla de reactivos, tales como las concentraciones de los NTP y una o más enzimas de replicación. Por ejemplo, mayores concentraciones de polimerasa y recombinasa pueden aumentar la velocidad de amplificación en relación con la velocidad de amplificación resultante de concentraciones más bajas de polimerasa y recombinasa. La velocidad de amplificación también puede verse afectada controlando la temperatura en los sitios de amplificación y/o controlando las propiedades de los cebadores en los sitios de amplificación. Por ejemplo, la secuencia, la longitud y/o el tipo de los cebadores pueden modificarse o seleccionarse para afectar a la velocidad de amplificación.
La velocidad de amplificación se controla para superar la velocidad de transporte con el fin de proporcionar una amplificación de exclusión cinética. Por ejemplo, la velocidad de amplificación puede superar significativamente la velocidad de transporte, de tal modo que una vez que un primer ácido nucleico diana se une a un cebador en un sitio de amplificación, muchos amplicones que se originan en el primer ácido nucleico diana se forman en otros cebadores en el sitio de amplificación antes de que otros ácidos nucleicos diana puedan unirse a los cebadores en el mismo sitio de amplificación. El resultado es una población clonal (o conglomerado) de amplicones en el sitio de amplificación que se origina en el primer ácido nucleico diana. Los diferentes sitios de amplificación tienen poblaciones clonales de amplicones que se originan a partir de diferentes ácidos nucleicos diana, de tal modo que la población clonal de amplicones en un segundo sitio de amplificación se origina a partir de un segundo ácido nucleico diana que difiere del primer ácido nucleico diana. Por lo tanto, un pocillo a lo largo de la celda de flujo puede llenarse con amplicones que se originan a partir de un primer ácido nucleico diana, y un segundo pocillo puede llenarse con amplicones que se originan a partir de un segundo ácido nucleico diana en la solución diana. La velocidad de amplificación supera la velocidad de transporte en una cantidad o medida predeterminada, de tal modo que los ácidos nucleicos diana posteriores que llegan a un sitio de amplificación particular después de que un primer ácido nucleico diana llegue al sitio quedan cinéticamente excluidos de la siembra en ese sitio particular.
Los conglomerados clonales de amplicones separados espacialmente se utilizan para la secuenciación genética. Por ejemplo, las cadenas de amplicones pueden utilizarse como plantillas en el procedimiento de secuenciación por síntesis que reciben nucleótidos marcados con fluorescencia. Los nucleótidos marcados con fluorescencia emiten una señal característica tras la excitación, que se utiliza para determinar la secuencia de los ácidos nucleicos diana.
En 108, la solución diana se retira de la celda de flujo. Por ejemplo, la solución diana se retira de la celda de flujo de tal modo que no haya ácidos nucleicos diana que floten libremente a lo largo de la superficie de la celda de flujo que no estén unidos a la superficie. Por lo tanto, los ácidos nucleicos diana de la solución diana que no se hibridan con uno de los cebadores de la superficie de la celda de flujo se eliminan de la celda de flujo. La solución diana se puede eliminar bombeando la solución diana desde la celda de flujo, enjuagando la celda de flujo con una solución neutra para lavar la solución diana de la celda de flujo, drenando la solución diana de la celda de flujo por gravedad, y/o similares. Los conglomerados clonales de amplicones y los ácidos nucleicos diana unidos a la celda de flujo en los sitios de amplificación permanecen en la celda de flujo después de eliminar la solución diana.
Se lleva a cabo un paso de amplificación por exclusión secundaria después del paso de amplificación por exclusión inicial para aumentar el número de amplicones en los conglomerados clonales en los sitios de amplificación de la celda de flujo. Un mayor número de amplicones en los conglomerados en los sitios de amplificación proporciona más señales y una mejor relación señal/ruido durante la secuenciación por síntesis que los conglomerados con menos amplicones. Por ejemplo, la intensidad de la señal puede aumentar debido a un mayor número de amplicones en los conglomerados, mientras que el ruido de fondo permanece constante, lo que resulta en una mejor relación señal/ruido. La mejor relación señal/ruido permite una secuenciación más precisa y eficiente porque hay menos probabilidades de errores en el nivel base.
En 110, se mezcla una segunda mezcla de reactivos para definir una segunda solución sin diana que carece de ácidos nucleicos diana adicionales. En un ejemplo, la solución sin diana carece de ácidos nucleicos diana. Por ejemplo, la segunda mezcla de reactivos puede mezclarse en un segundo depósito de mezcla que es diferente del depósito de mezcla utilizado para mezclar la primera mezcla de reactivos con los ácidos nucleicos diana para definir la solución diana. Aunque este paso de mezcla 110 se ilustra en el método 100 después de retirar la solución diana de la celda de flujo, opcionalmente la segunda mezcla de reactivos puede mezclarse antes de que la solución diana se retire de la celda de flujo, por ejemplo, simultáneamente con la mezcla de la primera mezcla de reactivos y los ácidos nucleicos diana para definir la solución diana, cuando la solución diana se incuba en la celda de flujo, o similares. La solución sin diana, en un ejemplo, es una solución nueva que no incluye ninguna porción reciclada de la solución diana que ya fluyó sobre los sitios de amplificación.
En un ejemplo alternativo, la solución sin diana puede incluir una cantidad traza distinta de cero de ácidos nucleicos diana. Por ejemplo, cuando la primera solución diana fluye desde el depósito de mezcla a la celda de flujo, una cantidad residual de la solución diana puede retenerse dentro del depósito de mezcla sin fluir a la celda de flujo. Además, la segunda mezcla de reactivos puede mezclarse posteriormente dentro del mismo depósito de mezcla, de tal modo que la cantidad residual de la solución diana se mezcle con la segunda mezcla de reactivos para definir la solución sin diana. La solución sin diana resultante puede contener una cantidad traza de los ácidos nucleicos diana de la cantidad residual de la solución diana en el depósito de mezcla. La concentración de los ácidos nucleicos diana en la solución sin diana es inferior a 100 ppm, que puede ser lo suficientemente baja como para tener un efecto insignificante en la reacción de la solución sin diana en los sitios de amplificación para producir amplicones adicionales.
La segunda mezcla de reactivos en la solución sin diana incluye los mismos tipos de componentes reactivos que la primera mezcla de reactivos en la solución diana. La segunda mezcla de reactivos incluye los mismos tipos de NTP y los mismos tipos de enzimas de replicación que la primera mezcla de reactivos. Se observa que, aunque se pueden utilizar al menos algunos de los mismos tipos de componentes reactivos para ambas soluciones, la segunda mezcla de reactivos está compuesta por cantidades frescas de los componentes reactivos. Por ejemplo, ninguna parte de la primera solución diana, después de fluir a través de la celda de flujo, se recicla al depósito de mezcla para definir la solución sin diana.
Los componentes reactivos de la segunda mezcla de reactivos pueden incluir uno o más de los NTP, la polimerasa, la recombinasa, la helicasa, la proteína de unión monocatenaria, los agentes de aglomeración, los reguladores y/o similares. La segunda mezcla de reactivos puede incluir diferentes cantidades y/o concentraciones de los componentes reactivos con respecto a la primera mezcla de reactivos en la solución diana. Por ejemplo, la segunda mezcla de reactivos puede incluir una mayor concentración de enzimas de replicación, tales como polimerasa, recombinasa y/o helicasa, en relación con la primera mezcla de reactivos para aumentar la velocidad de replicación a la que se forman los amplicones en los sitios de amplificación. En otro ejemplo, la segunda mezcla de reactivos puede incluir una cantidad mayor de un componente regulador (p. ej., agua, un surfactante o una mezcla de agua-surfactante) en relación con la primera mezcla de reactivos para compensar la falta de adición de los ácidos nucleicos diana a la segunda mezcla de reactivos. La segunda mezcla de reactivos puede incluir opcionalmente uno o más tipos diferentes de componentes reactivos que la primera mezcla de reactivos, tales como diferentes proteínas, cebadores o similares. Por ejemplo, la segunda mezcla de reactivos puede incluir cebadores que no están presentes en la primera mezcla de reactivos. Los cebadores pueden ser cebadores P5 que tienen una secuencia cebadora P5 y/o cebadores P7 que tienen una secuencia cebadora P7.
En 112, la solución sin diana se hace fluir sobre la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo. La solución sin diana puede bombearse o drenarse desde el depósito respectivo que contiene la solución sin diana a la celda de flujo. Como se ha descrito anteriormente, la solución sin diana puede estar completamente desprovista de ácidos nucleicos diana o, como alternativa, puede incluir solo una pequeña cantidad de ácidos nucleicos diana debido a la retención de una cantidad residual de la solución diana en el depósito de mezcla utilizado para preparar la solución sin diana. Dado que la solución sin diana no incluye más de una cantidad traza de ácidos nucleicos diana, el flujo de la solución sin diana sobre los sitios de amplificación no provoca una cantidad apreciable de siembra adicional de ácidos nucleicos diana en los sitios de amplificación. Más específicamente, ningún ácido nucleico diana adicional se une a los cebadores en los sitios de amplificación. Los ácidos nucleicos diana de la biblioteca genética se unen a los cebadores en los sitios de amplificación generalmente solo cuando la solución diana fluye a través de la celda de flujo.
En 114, la solución sin diana se incuba en la celda de flujo. La solución sin diana se puede retener en contacto con la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo durante un período de tiempo designado en ciertas condiciones designadas (p. ej., temperatura, humedad, presión, etc.). El período de tiempo y/o las condiciones pueden ser similares o idénticas a la incubación de la solución diana. En un ejemplo, la solución sin diana se puede incubar en la celda de flujo a una temperatura de aproximadamente 38 grados Celsius durante entre aproximadamente 20 y aproximadamente 60 minutos, aunque las condiciones de incubación pueden ser diferentes en otros ejemplos.
La incubación de la solución sin diana en la celda de flujo aumenta el número de amplicones en las poblaciones clonales o conglomerados en los sitios de amplificación, lo que proporciona una amplificación por agrupamiento más completa. Durante la reacción de amplificación por exclusión inicial, los ácidos nucleicos diana y los amplicones producidos se unen a algunos, pero no a todos, los cebadores en cada sitio de amplificación. Por lo tanto, hay varios cebadores en los sitios de amplificación que no están unidos ni a un ácido nucleico diana ni a un amplicón y están expuestos para unirse. Dichos cebadores definen un subconjunto de cebadores expuestos en cada sitio de amplificación. La mezcla de reactivos en la solución sin diana produce amplicones adicionales en los cebadores expuestos, lo que reduce el número de cebadores en el subconjunto expuesto. Por ejemplo, la segunda mezcla de reactivos reacciona con los amplicones existentes en el conglomerado clonal para producir nuevos amplicones que se unen a los cebadores expuestos.
En lugar de, o además de, producir amplicones en cebadores expuestos preexistentes en los sitios de amplificación, la segunda mezcla de reactivos puede incluir cebadores adicionales. En un ejemplo, la segunda mezcla de reactivos incluye un cebador, tal como un cebador P5. Antes de hacer fluir la solución sin diana sobre la celda de flujo, los cebadores P5 existentes (incluidas las cadenas P5 de los amplicones en los conglomerados) en los sitios de amplificación se linealizan y eliminan, dejando principalmente las cadenas P7 de los amplicones en los conglomerados y cualquier cebador P7 sobrante, expuesto (p. ej., no utilizado) unido a la superficie. Dado que la solución sin diana incluye cebadores P5 de la segunda mezcla de reactivos que contiene, hacer fluir la solución sin diana sobre la celda de flujo promueve una mayor amplificación de los conglomerados en los cebadores P7 unidos a la superficie expuestos. Algunos de los cebadores P7 de la superficie quedaron expuestos después de la amplificación por exclusión inicial porque las cadenas de los conglomerados de ADN necesitan formar puentes y permanecer unidas a la superficie en ambos extremos. El impedimento estérico puede restringir el acceso a todos los cebadores para superficies expuestas disponibles. Al eliminar uno de los cebadores (p. ej., el cebador P5) de la superficie después del paso inicial de amplificación por exclusión utilizando la primera solución diana, aumenta la accesibilidad al otro cebador (p. ej., el cebador P7) que permanece en la superficie. Además, un extremo de la cadena del conglomerado de amplicones se libera de la necesidad de unirse a la superficie para la amplificación.
En otro ejemplo, la amplificación secundaria se puede lograr con la segunda mezcla de reactivos que no contiene cebadores adicionales. Por ejemplo, los cebadores P5 unidos a la superficie pueden linealizarse y eliminarse de los sitios de amplificación antes de hacer fluir la solución sin diana, sin desnaturalizar los conglomerados de amplicones de tal modo que las cadenas P5 de los conglomerados permanezcan unidas a la superficie. La solución sin diana que fluye sobre los sitios de amplificación en este estado puede producir más copias de las cadenas P5 mediante la invasión de las cadenas utilizando los cebadores P7 no utilizados de una manera de amplificación lineal. La amplificación secundaria en este ejemplo se permite haciendo que los cebadores P7 no utilizados sean más accesibles mediante la linealización de un extremo de los conglomerados.
La segunda mezcla de reactivos incluye cebadores que se adhieren a la superficie de la celda de flujo de forma similar a una segunda paso de injerto, especialmente en condiciones estables adecuadas para el injerto. Por ejemplo, el P5/P7 unido al BCN (bicilononino) puede injertarse en PAZAM en agua o en condiciones regulador con bajo contenido de sal. Los cebadores en esta segunda paso de injerto se mezclan en la segunda mezcla de reactivos, siempre que el injerto sea compatible con la segunda mezcla de reactivos. Los cebadores de la solución sin diana aumentan el número total de cebadores en los sitios de amplificación y proporcionan nuevas ubicaciones en donde se pueden formar amplicones adicionales para aumentar el número de amplicones en los conglomerados.
Dado que no se utilizan ácidos nucleicos diana adicionales para formar la solución sin diana, el número de amplicones en los conglomerados se puede aumentar sin requerir material genético adicional, lo que puede ser relativamente difícil y/o costoso de obtener en relación con los componentes del reactivo.
En 116, la segunda solución sin diana se retira de la celda de flujo antes de realizar los siguientes pasos de secuenciación con la celda de flujo para la secuenciación de la biblioteca genética. Por ejemplo, la solución sin diana puede bombearse desde la celda de flujo, purgarse de la celda de flujo utilizando una solución neutra o drenarse de la celda de flujo.
Opcionalmente, la solución diana y las soluciones sin diana se hacen fluir sobre los sitios de amplificación en condiciones isotérmicas, de tal modo que ni las soluciones ni la celda de flujo se calientan activamente. Además, los conglomerados clonales se forman sin el uso de desnaturalizantes químicos para desnaturalizar los ácidos nucleicos diana y los amplicones en la celda de flujo. Por lo tanto, el método 100 puede aumentar el rendimiento y/o la calidad de las cadenas de nucleótidos en los conglomerados clonales de la celda de flujo sin requerir aplicaciones de calor o desnaturalizantes químicos, a diferencia de otras técnicas de amplificación, como la amplificación en puente, las técnicas de RCA y las técnicas de MDA.
En un ejemplo alternativo del método 100 para generar conglomerados clonales, la primera solución diana no se retira de la celda de flujo antes de introducir la segunda solución sin diana en la celda de flujo. Por lo tanto, el método 100 puede omitir el paso 108 dirigida a eliminar la solución diana de la celda de flujo. En cambio, después de incubar la solución diana en la celda de flujo durante un primer período de tiempo en el paso 106, la solución sin diana se hace fluir sobre la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo en 112 mientras la solución diana todavía está presente en la celda de flujo. Por ejemplo, la solución diana se puede incubar en la celda de flujo durante aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 60 minutos o similares, antes de introducir la solución sin diana en la celda de flujo. Una vez que la solución sin diana fluye sobre la matriz de sitios de amplificación en 112, la solución sin diana se mezcla con la solución diana en la celda de flujo. La segunda mezcla de reactivos dentro de la solución sin diana aumenta la concentración total de reactivos dentro de la celda de flujo, lo que puede aumentar la velocidad de amplificación a la que se producen los amplicones. En 114, la solución sin diana se incuba en la celda de flujo durante un segundo período de tiempo con la solución diana presente. Por lo tanto, la solución diana se incuba en la celda de flujo durante una cantidad total de tiempo que es la suma del primer período de tiempo en 106 y el segundo período de tiempo en 114. En 116, la solución combinada compuesta tanto por la primera solución diana como por la segunda solución sin diana se retira de la celda de flujo, por ejemplo mediante bombeo, enjuagado con una solución neutra, drenaje o similares, antes de realizar los pasos de secuenciación posteriores con la celda de flujo.
La figura 12 es un gráfico 200 de barras que muestra, en un ejemplo, la intensidad de la señal de los conglomerados genéticos en una celda de flujo para diferentes enfoques de generación de conglomerados. El gráfico 200 ilustra cómo la intensidad de la señal puede compararse entre los diferentes enfoques de generación de conglomerados cuando los enfoques se realizan en condiciones ambientales similares. El gráfico 200 compara los enfoques en términos relativos y no representa los resultados reales de las pruebas. El eje y 202 representa la intensidad de la señal detectada de los conglomerados durante la secuenciación por síntesis cuando los conglomerados que tienen nucleótidos marcados con fluorescencia se excitan, y se marca como 200-550. Se comparan tres métodos diferentes de generación de conglomerados y se representan mediante las barras correspondientes en el gráfico 200. La barra 204 representa la amplificación por exclusión cinética (ExAmp) sin ningún paso de amplificación adicional realizada para aumentar el número de amplicones en los conglomerados. La barra 206 representa la amplificación por exclusión cinética seguida de la amplificación en puente convencional. La barra 208 representa la amplificación por exclusión cinética según los ejemplos descritos en la presente memoria, en los que una primera ronda de amplificación por exclusión cinética va seguida de una ronda secundaria de amplificación por exclusión cinética utilizando una solución sin diana que carece de ácidos nucleicos diana.
Como se muestra en la figura 12, la amplificación por exclusión seguida de la ronda secundaria de amplificación por exclusión (p. ej., bar 208) tiene la mayor intensidad, seguida de la amplificación en puente (p. ej., bar 206) y la amplificación por exclusión sin amplificación secundaria (p. ej., bar 204), que tiene la intensidad más baja. Por ejemplo, si la única ronda de amplificación por exclusión cinética en 204 produce conglomerados genéticos con una intensidad de señal de aproximadamente 285, entonces la amplificación por exclusión cinética seguida de la amplificación en puente en 206 produce conglomerados genéticos con una intensidad de señal de aproximadamente 320, y la amplificación por exclusión cinética seguida de una segunda ronda de amplificación por exclusión en 208 produce conglomerados genéticos con una intensidad de señal de aproximadamente 420. La mayor intensidad de la señal indica que la amplificación de exclusión seguida de la ronda secundaria de amplificación de exclusión puede proporcionar una mejor relación señal/ruido que los otros dos métodos. La mejor relación señal/ruido puede aumentar la precisión y/o la eficiencia de la secuenciación y el análisis de la biblioteca genética en relación con los otros dos métodos.
La figura 13 es un gráfico 300 de barras que muestra, en un ejemplo, los valores del filtro de paso porcentual (% PF) para los mismos métodos de generación de conglomerados que el gráfico 200 de barras. El gráfico 300 ilustra cómo los valores del % de PF atribuibles a los diferentes enfoques de generación de conglomerados pueden compararse cuando los enfoques se realizan en condiciones ambientales similares. El gráfico 300 compara los enfoques en términos relativos y no representa los resultados reales de las pruebas. El eje y 302 representa un porcentaje de los conglomerados generados por cada uno de los tres métodos que superan una condición de filtro de castidad designada, lo que indica que esos conglomerados tienen la calidad suficiente para utilizarse en la secuenciación, y está etiquetado del 60 % al 78 %. La barra 304 representa la amplificación por exclusión cinética sin un paso de amplificación secundaria, la barra 306 representa la amplificación por exclusión cinética seguida de la amplificación en puente, y la barra 308 representa la amplificación por exclusión cinética seguida por la ronda secundaria de amplificación por exclusión cinética. Como se muestra en la figura 13, si la única ronda de amplificación por exclusión cinética en 304 produce conglomerados genéticos en donde aproximadamente el 65 % de los conglomerados pasan por el filtro, entonces la amplificación por exclusión cinética seguida de la amplificación en puente en 306 produce conglomerados genéticos en donde aproximadamente el 71 % de las agrupaciones pasan por el filtro, y la amplificación por exclusión cinética seguida de una segunda ronda de amplificación por exclusión en 208 produce conglomerados genéticos en donde aproximadamente el 73 % de los conglomerados pasan por el filtro. Por lo tanto, la amplificación por exclusión seguida de la ronda secundaria de amplificación por exclusión utilizando una solución sin diana puede proporcionar el mayor rendimiento de conglomerados de calidad en comparación con los otros enfoques de formación de conglomerados en condiciones ambientales similares.
La figura 14 es una ilustración esquemática de un sistema fluídico 400 para generar conglomerados clonales según un ejemplo. El sistema fluídico 400 se puede utilizar para realizar el método 100. El sistema fluídico 400 puede ser similar a los sistemas fluídicos expuestos en la patente US- 9.410.977. El sistema fluídico 400 en el ejemplo ilustrado incluye una celda 402 de flujo modelada, un colector 404 de reactivos, una bandeja 406 o cartucho de reactivos, un controlador 408 y una bomba 410. Alternativamente, el sistema fluídico 400 puede incluir componentes adicionales, menos componentes y/o al menos un componente diferente al del ejemplo ilustrado.
La celda 402 de flujo incluye múltiples carriles 412 que se extienden entre y están conectados de manera fluida a un puerto 414 de entrada y un puerto 416 de salida de la celda 402 de flujo. Los carriles 412 pueden incluir pocillos u otras características en sus superficies para definir los sitios de amplificación en los que se producen las poblaciones clonales o los conglomerados de amplicones. El colector 404 de reactivos incluye una válvula 418 que está en comunicación fluida (p. ej., conectada de manera fluida) con el puerto 414 de entrada de la celda 402 de flujo. La válvula 418 puede incluir o estar conectada a al menos un depósito de mezcla (también denominado en la presente memoria depósitos de almacenamiento), que no se muestra en la figura 14. El colector de reactivos 404 incluye además una pluralidad de canales 420 y puertos 422. Los canales 420 se extienden entre los puertos 422 y los conectan de manera fluida a la válvula 418 (y a cualquier depósito de mezcla asociado con la válvula 418). El colector 404 de reactivos puede tener múltiples válvulas 418 en otros ejemplos. Aunque no se muestra, el colector 404 de reactivos puede incluir sorbedores que están dispuestos en los puertos 422 correspondientes.
La bandeja 406 de reactivos incluye múltiples depósitos de reactivos (no mostrados) que contienen diferentes reactivos. El colector 404 de reactivos está montado sobre la bandeja 406 de reactivos para alinear los sorbedores con los depósitos de reactivos de tal modo que los sorbedores entren en los depósitos de reactivos correspondientes y entren en contacto con los reactivos contenidos en ellos. Los sorbedores extraen los reactivos de los depósitos de reactivos de la bandeja 406 para suministrar los reactivos a la celda 402 de flujo a través de los canales 420 y la válvula 418.
El controlador 408 incluye uno o más procesadores (no mostrados) u otros dispositivos basados en la lógica que realizan operaciones basadas en instrucciones almacenadas en un medio de almacenamiento o memoria legible por ordenador tangible y no transitorio (no mostrado). El controlador 408 puede incluir adicional o alternativamente uno o más dispositivos cableados que realizan operaciones basadas en la lógica cableada de los dispositivos. El controlador 408 puede representar el hardware que funciona basado en software o instrucciones programadas, software que dirige el hardware para que realice las operaciones, o una combinación de los mismos. El controlador 408 está acoplado comunicativamente (p. ej., a través de una o más conexiones cableadas o inalámbricas) a la bomba 410 y la válvula 418. Por ejemplo, el controlador 408 puede controlar las operaciones de la bomba 410 y la válvula 418 comunicando señales de control a lo largo de las conexiones cableadas o inalámbricas a los dispositivos respectivos. El controlador 408 puede controlar la válvula 418 controlando a cuál de los canales 420 se le permite que el fluido del canal 420 fluya a través de la válvula 418 hasta la celda 402 de flujo. El controlador 408 controla la bomba 410 controlando los diferenciales de presión creados por la bomba 410 para propulsar el fluido a lo largo del sistema fluídico 400. La bomba 410 en el ejemplo ilustrado está acoplada operativamente a la celda 402 de flujo.
En un ejemplo, el controlador 408 controla la bomba 410 y la válvula 418 para mezclar y hacer fluir la primera solución diana a través del puerto 414 de entrada a través del conjunto de sitios de amplificación en la celda 402 de flujo. La solución diana incluye los ácidos nucleicos diana y la primera mezcla de reactivos. Los ácidos nucleicos diana pueden combinarse con la primera mezcla de reactivos dentro del colector 404 de reactivos, tal como dentro de uno de los depósitos de mezcla (no mostrados) asociados con la válvula 418. Por ejemplo, un primer canal 420A de los canales 420 puede contener una plantilla de muestra genética que incluye los ácidos nucleicos diana en un regulador, tal como agua u otro disolvente. La plantilla de muestra puede extraerse de la bandeja 406 de reactivos con un sorbedor o, alternativamente, puede fluir al canal 420A desde otra fuente distinta de la bandeja 406. Un segundo canal 420B de los canales 420 puede contener uno o más componentes reactivos de la primera mezcla de reactivos, tales como NTP, polimerasa, proteína de unión monocatenaria y uno o más reguladores (p. ej., agua, surfactantes o similares). Un tercer canal 420C y un cuarto canal 420D pueden contener otros componentes reactivos de la primera mezcla de reactivos, tales como recombinasa dentro del tercer canal 420C y magnesio y un agente de aglomeración dentro del cuarto canal 420D. Aunque no se menciona específicamente, todos los componentes del reactivo pueden disolverse en un disolvente, tal como agua u otro regulador. Mantener separados algunos de los componentes reactivos hasta que la solución diana esté lista para utilizarse puede aumentar la vida útil de la mezcla reactiva, ya que algunos de los componentes reactivos pueden ser inestables cuando se mezclan con otros componentes reactivos.
En un ejemplo, el controlador 408 controla la bomba 410 y la válvula 418 para mezclar ciertas cantidades designadas de la plantilla de muestra con los componentes reactivos dentro de los diferentes canales 420A-D para definir la solución diana dentro del colector 404 antes de hacer fluir la solución diana a través del puerto 414 de entrada de la celda 402 de flujo. Por ejemplo, los componentes de la solución diana pueden mezclarse dentro de uno de los depósitos de mezcla. Alternativamente, los componentes de la solución diana pueden separarse hasta que se permita que los componentes se mezclen dentro de un conducto 424 de entrada (p. ej., tubo, tubería o canal) que conecta la válvula 418 al puerto 414 de entrada o dentro de la celda 402 de flujo.
Como se ha descrito anteriormente, la solución diana reacciona en la celda 402 de flujo para producir poblaciones clonales de amplicones en los sitios de amplificación que se originan a partir de los ácidos nucleicos diana correspondientes. Durante el proceso de amplificación por exclusión, los ácidos nucleicos diana se transportan a los sitios de amplificación simultáneamente con la amplificación de los ácidos nucleicos diana ya unidos a los sitios de amplificación para producir los amplicones. El controlador 408 puede manipular la bomba 410 y/o la válvula 418 para controlar la concentración de los ácidos nucleicos diana y la concentración de la primera mezcla de reactivos en la solución diana para que la velocidad de amplificación supere la velocidad de transporte. Por ejemplo, el controlador 408 puede reducir la concentración de la plantilla de muestra y/o aumentar la concentración de uno o más componentes de la primera mezcla de reactivos para mantener la velocidad de amplificación a una velocidad significativamente mayor que la velocidad de transporte para la exclusión cinética.
El controlador 408 también puede configurarse para controlar las condiciones de incubación de la solución diana en la celda 402 de flujo, como la temperatura, la presión, la humedad y similares, dentro de la celda 402 de flujo. Después de una cantidad designada de tiempo de incubación, el controlador 408 puede controlar la bomba 410 para eliminar la solución diana de la celda 402 de flujo. La solución diana puede fluir a través del puerto 416 de salida hacia un depósito 426 de residuos. Opcionalmente, una parte de la solución diana puede recircularse a través de un conducto 428 hasta el colector 404 de reactivos y/o la bandeja 406 para utilizarse para el bombeo de refresco o similares. La solución diana se retira de la celda 402 de flujo de tal modo que no haya ácidos nucleicos diana que floten libremente en la celda 402 de flujo después de eliminar la solución diana. Por ejemplo, todos los ácidos nucleicos diana presentes en los sitios de amplificación después de la eliminación de la solución diana se unen a cebadores dentro de los conglomerados clonales.
Después de hacer fluir la solución diana a través de la celda 402 de flujo, el controlador 408 controla la bomba 410 y/o la válvula 418 para mezclar y hacer fluir la solución sin diana a través del puerto 414 de entrada a través del conjunto de sitios de amplificación en la celda 402 de flujo. La solución sin diana incluye la segunda mezcla de reactivos y carece (p. ej., no tiene) ácidos nucleicos diana adicionales. Por ejemplo, el controlador 408 puede controlar la mezcla de los componentes del reactivo dentro del segundo, tercero y cuarto canales 420B-D dentro de un depósito de mezcla (no mostrado) en el colector 404 para definir la solución sin diana. El controlador 408 controla la válvula 418 para evitar que la plantilla de muestra dentro del primer canal 420A se añada al depósito de mezcla, de tal modo que la solución sin diana resultante no incluya ácidos nucleicos diana adicionales. En un ejemplo, la segunda mezcla de reactivos se mezcla dentro de un depósito de mezcla diferente al depósito de mezcla utilizado para mezclar la primera mezcla de reactivos con la plantilla de muestra para definir la solución diana. En un ejemplo alternativo, la segunda mezcla de reactivos se mezcla dentro del mismo depósito de mezcla que contenía previamente la solución diana, de tal modo que una cantidad residual de la solución diana (incluida una cantidad traza de ácidos nucleicos diana) puede estar presente dentro de la solución sin diana. Por lo tanto, la segunda solución sin diana carece de ácidos nucleicos diana o incluye una cantidad traza de ácidos nucleicos diana que no provoca una siembra adicional en los sitios de amplificación de la celda 402 de flujo.
La segunda mezcla de reactivos puede diferir de la primera mezcla de reactivos en los tipos, cantidades y/o concentraciones de los componentes reactivos. Por ejemplo, la primera mezcla de reactivos y la segunda mezcla de reactivos pueden incluir un componente regulador, tal como agua, un surfactante o una solución de agua-surfactante. Dado que la solución sin diana carece de la plantilla de muestra, el controlador 408 puede incluir opcionalmente una mayor cantidad del componente regulador dentro de la solución sin diana en relación con la cantidad del mismo componente tampón dentro de la primera mezcla de reactivos. La cantidad adicional de regulador compensa la reducción del volumen provocada por la falta de la plantilla de muestra. Como resultado del aumento del volumen del regulador, el volumen de la solución sin diana puede ser similar o idéntico al volumen de la solución diana. Además, el control de la cantidad de regulador también afecta a las concentraciones de los componentes reactivos en la segunda mezcla de reactivos, de tal modo que las concentraciones pueden controlarse para que sean similares o idénticas a las concentraciones de los componentes reactivos dentro de la solución diana. Opcionalmente, el controlador 408 puede variar al menos algunos de los tipos (p. ej., diferentes enzimas, proteínas, oligos o similares), cantidades y/o concentraciones de los componentes reactivos de la segunda mezcla de reactivos con respecto a la primera mezcla de reactivos, para modificar la velocidad de amplificación.
El controlador 408 controla la bomba 410 y/o la válvula 418 para hacer fluir la solución sin diana a la celda 402 de flujo. La solución sin diana se incuba en la celda 402 de flujo, donde la solución reacciona con los amplicones en los sitios de amplificación de la celda 402 de flujo para producir amplicones adicionales en los conglomerados clonales. Como se ha descrito anteriormente, la ronda secundaria de amplificación por exclusión utilizando la solución sin diana da como resultado un mayor rendimiento de conglomerados con calidad de aprobación en comparación con la falta de flujo de la solución sin diana a través de la celda 402 de seguimiento. El aumento del rendimiento de conglomerados de calidad puede aumentar la precisión y/o la eficiencia de la secuenciación porque hay cadenas de nucleótidos adicionales en los conglomerados para producir señales fluorescentes durante la secuenciación por síntesis. La ronda secundaria de amplificación por exclusión también se logra sin utilizar una cantidad adicional de una plantilla de muestra que incluya ácidos nucleicos diana.
Notas adicionales
Los términos “ comprender” , “ incluir” , “contener” , etc., y las variaciones de los mismos, que se utilizan en la especificación y las reivindicaciones de la presente memoria pretenden ser abiertos, incluyendo no solo los elementos citados, sino que abarcan además cualquier elemento adicional. La referencia a lo largo de la memoria descriptiva a “ un ejemplo” , “ otro ejemplo” , etc., significa que un elemento particular (por ejemplo, una función, estructura y/o característica) descrito en relación con el ejemplo está incluido en al menos un ejemplo descrito en la presente memoria, y puede o no estar presente en otros ejemplos. Además, debe entenderse que los elementos descritos para cualquier ejemplo pueden combinarse de cualquier manera adecuada en los diversos ejemplos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Debe tenerse en cuenta que todas las combinaciones de los conceptos anteriores y conceptos adicionales descritos en mayor detalle a continuación (siempre que tales conceptos no sean mutuamente contradictorios) se contemplan como parte de la materia de la invención descrito en la presente memoria. En particular, todas las combinaciones del objeto reivindicado que aparecen al final de esta descripción se contemplan como parte del objeto de la invención descrito en la presente memoria.
Debe entenderse que los intervalos proporcionados en la presente memoria incluyen el intervalo establecido y cualquier valor o subintervalo dentro del intervalo establecido. Por ejemplo, un rango de entre aproximadamente 20 grados Celsius y aproximadamente 50 grados Celsius debe interpretarse como incluyente no solo de los límites explícitamente enumerados de entre aproximadamente 20 grados Celsius y aproximadamente 50 grados Celsius, sino también como incluyente de valores individuales, tales como aproximadamente 28 grados Celsius, aproximadamente 35 grados Celsius, aproximadamente 46,5 grados Celsius, etc., y los subrangos, tales como desde aproximadamente 25 grados Celsius hasta aproximadamente 49 grados Celsius, desde aproximadamente 30 grados Celsius hasta aproximadamente 40 grados Celsius, etc. Además, cuando se utilizan “ aproximadamente” y/o “ sustancialmente” para describir un valor, se pretende que abarquen las variaciones menores (hasta /- 10 %) del valor indicado.
Si bien se han descrito en detalle varios ejemplos, debe entenderse que los ejemplos descritos pueden modificarse. Por lo tanto, la descripción anterior debe considerarse no limitativa. En consecuencia, el alcance del objeto de la invención está limitado únicamente por las reivindicaciones.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Un método para reducir la tasa de error al preparar material genético para el análisis, que produce poblaciones clónales en los sitios de amplificación y aumenta el número y la calidad de los amplicones en las poblaciones clonales en los sitios de amplificación, que comprende:
    hacer reaccionar una primera solución y una segunda solución diferente en una celda de flujo en donde la celda de flujo incluye una pluralidad de cebadores P5 y P7 unidos a la celda de flujo en los sitios de amplificación al hacer fluir la primera solución sobre una matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo, linealizar y eliminar los cebadores P5 de los sitios de amplificación y, posteriormente, hacer fluir la segunda solución sobre la matriz de sitios de amplificación; incluyendo la primera solución varios ácidos nucleicos diana y una primera mezcla de reactivos que comprende nucleósidos trifosfatos (NTP) y una o más enzimas de replicación, en donde los ácidos nucleicos diana comprenden cadenas con adaptadores en los extremos que están configuradas para unirse a los cebadores P5 y P7 correspondientes de la celda de flujo, transportándose los ácidos nucleicos diana de la primera solución y uniéndose a los sitios de amplificación a una velocidad de transporte en donde la primera solución reacciona en la celda de flujo para unir el ácido nucleico diana y los amplicones a un primer subconjunto de cebadores, amplificando la primera mezcla de reactivos los ácidos nucleicos diana que están unidos a los sitios de amplificación para producir poblaciones clonales de amplicones que se originan a partir de los ácidos nucleicos diana correspondientes, en donde los amplicones se producen a una velocidad de amplificación que supera la velocidad de transporte;
    e incluyendo la segunda solución una segunda mezcla de reactivos que comprende los NTP y una o más enzimas de replicación de la primera mezcla de reactivos y cebadores de injerto que se unen a la superficie de la celda de flujo, pero que carecen de los ácidos nucleicos diana, la segunda solución, que reacciona en la celda de flujo para:
    (a) fijar los cebadores de injerto a la superficie de la celda de flujo;
    (b) producir un número adicional de amplicones en las poblaciones clonales en los sitios de amplificación, y
    (c) unir los amplicones adicionales a al menos algunos de los cebadores en un subconjunto expuesto de los cebadores diferente del primer subconjunto,
    en donde los amplicones adicionales se producen mediante amplificación por exclusión a una velocidad de amplificación que supera la velocidad de transporte.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la segunda solución comprende un cebador P5 adicional, y en donde el paso para linealizar y eliminar los cebadores P5 incluye linealizar y eliminar los amplicones derivados de los cebadores P5 en el sitio de amplificación.
  3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde el paso para linealizar y eliminar los cebadores P5 no incluye linealizar y eliminar los amplicones derivados de los cebadores P5 en el sitio de amplificación.
  4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde los cebadores de injerto son cebadores P5 y/o P7 unidos a biciclononinas y la superficie de la celda de flujo comprende PAZAM.
  5. 5. El método de la reivindicación 1, en donde la segunda mezcla de reactivos incluye una mayor concentración de enzimas de replicación, en relación con la primera mezcla de reactivos.
  6. 6. El método de la reivindicación 1, que comprende además eliminar la primera solución de la celda de flujo antes de hacer fluir la segunda solución sobre la matriz de sitios de amplificación de la celda de flujo, de tal modo que los únicos ácidos nucleicos diana en la celda de flujo a medida que la segunda solución fluye sobre la matriz de sitios de amplificación estén unidos a la celda de flujo y no floten libremente dentro de la primera solución.
  7. 7. El método de la reivindicación 1, en donde la matriz de sitios de amplificación está dispuesta a lo largo de una superficie de la celda de flujo, en donde la primera solución fluye a través de un puerto de entrada de la celda de flujo a través de la superficie de la celda de flujo, y en donde la segunda solución fluye posteriormente a través del puerto de entrada a través de la superficie de la celda de flujo.
  8. 8. El método de la reivindicación 1, en donde la celda de flujo incluye una pluralidad de cebadores unidos a la celda de flujo en los sitios de amplificación, en donde al menos algunos de los cebadores se unen a los ácidos nucleicos diana en la primera solución en respuesta al flujo de la primera solución sobre la matriz de sitios de amplificación, y en donde, posteriormente, la segunda solución que carece de los ácidos nucleicos diana sobre la matriz de sitios de amplificación no produce una unión adicional de los cebadores a los ácidos nucleicos diana.
  9. 9. El método de la reivindicación 1, en donde la segunda mezcla de reactivos incluye:
    (a) los NTP y una polimerasa, o;
    (b) uno o más de una helicasa y una recombinasa, o;
    (c) un cebador que tiene al menos una secuencia de cebador P5 o una secuencia de cebador P7.
  10. 10. El método de la reivindicación 1, en donde los sitios de amplificación son pocillos a lo largo de una superficie de la celda de flujo, estando los pocillos separados entre sí por regiones intersticiales a lo largo de la superficie.
  11. 11. El método de la reivindicación 1, que comprende además:
    (a) controlar la velocidad de transporte de los ácidos nucleicos diana a los sitios de amplificación utilizando uno o más de: controlar la concentración de los ácidos nucleicos diana en la primera solución, controlar la viscosidad de la primera solución, controlar el tamaño promedio de los ácidos nucleicos diana y controlar la presencia o ausencia de un reactivo de aglomeración molecular en la primera solución; o
    (b) controlar la velocidad de amplificación de los ácidos nucleicos diana utilizando uno o más de: controlar la concentración de los NTP en la primera mezcla de reactivos, controlar la concentración de una o más enzimas de replicación en la primera mezcla de reactivos y controlar la temperatura en los sitios de amplificación.
  12. 12. El método de la reivindicación 1, en donde la primera solución y la segunda solución fluyen isotérmicamente sobre la matriz de sitios de amplificación.
  13. 13. El método de la reivindicación 1, que comprende además:
    mezclar una primera mezcla de reactivos con una cantidad de ácidos nucleicos diana dentro de un depósito para definir una primera solución, comprendiendo la primera mezcla de reactivos trifosfatos de nucleósidos (NTP) y una o más enzimas de replicación;
    hacer fluir la primera solución desde el depósito sobre una matriz de sitios de amplificación en una celda de flujo, en donde la celda de flujo incluye una pluralidad de cebadores unidos a la celda de flujo en los sitios de amplificación, transportándose los ácidos nucleicos diana de la primera solución y uniéndose a los sitios de amplificación a una velocidad de transporte, amplificando la primera mezcla de reactivos los ácidos nucleicos diana que están unidos a los sitios de amplificación para producir poblaciones clonales de amplicones que se originan a partir de los ácidos nucleicos diana correspondientes, los amplicones producidos a un velocidad de amplificación que supera la velocidad de transporte en donde la primera solución reacciona en la celda de flujo para unir el ácido nucleico diana y los amplicones a un primer subconjunto de cebadores;
    después de hacer fluir la primera solución desde el depósito, mezclar una segunda mezcla de reactivos dentro del depósito sin añadir una cantidad adicional de los ácidos nucleicos diana al depósito para definir una segunda solución, comprendiendo la segunda mezcla de reactivos cantidades frescas de los NTP y una o más enzimas de replicación y cebadores de injerto que se unen a la superficie de la celda de flujo; y
    hacer fluir la segunda solución desde el depósito sobre la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo, reaccionando la segunda mezcla de reactivos en la celda de flujo para:
    (a) fijar los cebadores de injerto a la superficie de la celda de flujo, (b) reaccionar con los amplicones para aumentar un número de amplicones en las poblaciones clonales en los sitios de amplificación, y
    (c) unir los amplicones adicionales a al menos algunos de los cebadores en una zona expuesta
    un subconjunto de los cebadores diferente del primer subconjunto, en donde los amplicones adicionales se producen mediante amplificación por exclusión a una velocidad de amplificación que supera la velocidad de transporte, opcionalmente;
    en donde la primera mezcla de reactivos y la segunda mezcla de reactivos incluyen ambas un componente regulador, la segunda mezcla de reactivos incluye una mayor cantidad del componente regulador en relación con la primera mezcla de reactivos para compensar la falta de adición de la cantidad adicional de los ácidos nucleicos diana dentro de la segunda solución.
  14. 14. Un sistema fluídico para reducir la tasa de error al preparar material genético para el análisis, que produce poblaciones clonales en los sitios de amplificación y aumenta el número y la calidad de los amplicones en las poblaciones clonales en los sitios de amplificación, que comprende:
    un colector de reactivos que incluye al menos una válvula en comunicación fluida con un puerto de entrada de una celda de flujo que incluye una matriz de sitios de amplificación en donde la celda de flujo incluye una pluralidad de cebadores P5 y P7 unidos a la celda de flujo en los sitios de amplificación, el colector de reactivos incluye además una pluralidad de canales conectados de manera fluida entre la al menos una válvula y los depósitos de reactivos correspondientes que comprenden la primera y la segunda soluciones correspondientes, un primer depósito de reactivos que comprende una primera solución que incluye una serie de ácidos nucleicos diana y una primera mezcla de reactivos que comprende nucleósidos trifosfatos (NTP) y una o más enzimas de replicación, en donde los ácidos nucleicos diana comprenden cadenas con adaptadores en los extremos que están configurados para unirse a los cebadores P5 y P7 correspondientes; y un segundo depósito de reactivos que comprende una segunda solución que incluye una segunda mezcla de reactivos que comprende los NTP y una o más enzimas de replicación de la primera mezcla de reactivos, y cebadores de injerto que se unen a la superficie de la celda de flujo, pero que carecen de los ácidos nucleicos diana; y
    un controlador que incluye uno o más procesadores, el controlador para controlar al menos una válvula y una bomba, en donde la bomba está acoplada operativamente a la celda de flujo, para definir la solución dentro del colector de reactivos para hacer fluir una primera solución a través del puerto de entrada sobre la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo y, posteriormente, hacer fluir una segunda solución diferente a través del puerto de entrada sobre la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo;
    en donde la celda de flujo está configurada para linealizar y eliminar los cebadores P5 de los sitios de amplificación antes de hacer fluir la segunda solución sobre la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo;
    en donde la primera solución incluye varios ácidos nucleicos diana y una primera mezcla de reactivos que comprende nucleósidos trifosfatos (NTP) y una o más enzimas de replicación, superando el número de ácidos nucleicos diana en la primera solución un número de sitios de amplificación de la matriz, reaccionando la primera solución en la celda de flujo para unir el ácido nucleico diana y los amplicones a un primer subconjunto de cebadores para producir poblaciones clonales de amplicones en la amplificación sitios que se originan a partir de los ácidos nucleicos diana correspondientes, transportándose los ácidos nucleicos diana en la primera solución y uniéndose a los sitios de amplificación a una velocidad de transporte, amplificando la primera mezcla de reactivos los ácidos nucleicos diana que están unidos a los sitios de amplificación para producir los amplicones a una velocidad de amplificación que supera la velocidad de transporte; y en donde la segunda solución incluye una segunda mezcla de reactivos que comprende los NTP y una o más enzimas de replicación de la primera mezcla de reactivos y cebadores de injerto que se unen a la superficie de la celda de flujo, pero carecen de los ácidos nucleicos diana, reaccionando la segunda solución en la celda de flujo para:
    (a) fijar los cebadores de injerto a la superficie de la celda de flujo,
    (b) producir un número adicional de amplicones en las poblaciones clonales en los sitios de amplificación, y
    (c) unir los amplicones adicionales a al menos algunos de los cebadores en un subconjunto expuesto de los cebadores diferente del primer subconjunto, en donde los amplicones adicionales se producen mediante amplificación por exclusión a una velocidad de amplificación que supera la velocidad de transporte.
    El sistema fluídico de la reivindicación 14, en donde:
    (a) la segunda solución comprende un cebador P5 adicional, y en donde el paso para linealizar y eliminar los cebadores P5 incluye linealizar y eliminar los amplicones derivados de los cebadores P5 en el sitio de amplificación;
    (b) el paso para linealizar y eliminar los cebadores P5 no incluye linealizar y eliminar los amplicones derivados de los cebadores P5 en el sitio de amplificación;
    (c) los cebadores de injerto son cebadores P5 y/o P7 unidos a biciclononinas;
    (d) la segunda mezcla de reactivos incluye una mayor concentración de enzimas de replicación, en relación con la primera mezcla de reactivos;
    (e) el controlador debe controlar al menos una válvula y la bomba para mezclar una plantilla de muestra que incluye los ácidos nucleicos diana con la primera mezcla de reactivos para formar la primera solución, y en donde el controlador debe controlar la al menos una válvula y la bomba para formar la segunda solución al mezclar la segunda mezcla de reactivos sin mezclar la plantilla de muestra con la segunda mezcla de reactivos, o
    (f) el controlador debe controlar al menos una válvula y la bomba para eliminar la primera solución de la celda de flujo antes de hacer fluir la segunda solución sobre la matriz de sitios de amplificación en la celda de flujo, de tal modo que los únicos ácidos nucleicos diana que están presentes cuando la segunda solución fluye sobre la matriz de sitios de amplificación se unan a la celda de flujo y no floten libremente dentro de la primera solución.
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