ES2925227T3 - Composiciones y procedimientos para detectar el cáncer de pulmón - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a composiciones y métodos para el diagnóstico in vitro de cáncer de pulmón, en donde dichas composiciones comprenden un anticuerpo que se une a la progastrina y dichos métodos comprenden el uso de un anticuerpo que se une a la progastrina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos para detectar el cáncer de pulmón
Introducción
La presente exposición se refiere al diagnóstico in vitro del cáncer, más particularmente se refiere a procedimientos para el diagnóstico in vitro del cáncer de pulmón. Las composiciones divulgadas en la presente memoria comprenden una molécula de unión a la progastrina, en particularmente un anticuerpo anti-hPG, mientras que los procedimientos descritos en la presente memoria comprenden la utilización de una molécula de unión a la progastrina y particularmente a un anticuerpo anti-hPG.
El cáncer de pulmón sigue siendo la neoplasia maligna más letal en todo el mundo. A pesar de las mejoras en el tratamiento quirúrgico, la terapia sistémica y la radioterapia, la tasa de supervivencia a 5 años de todos los pacientes con diagnóstico de cáncer de pulmón sigue siendo de entre 15 % y 20 %.
El cáncer de pulmón comprende dos tipos principales de tumor, concretamente, el cáncer de pulmón microcítico (CPM) y el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). El CPM representa entre el 15 % y el 18 % de todos los cánceres de pulmón, mientras que el CPNM constituye aproximadamente entre el 80 % y el 85 % de todos los cánceres de pulmón. Otros tipos de cáncer de pulmón, tales como los carcinomas quísticos adenoides, los linfomas y los sarcomas, así como tumores de pulmón benignos, tales como los hamartomas, son raros.
Los cánceres de pulmón microcíticos y no microcíticos se tratan de manera diferente. En particular, el CPM responde mejor a la quimioterapia y a la terapia de radiación que otros tipos celulares de cáncer de pulmón. Sin embargo, resulta difícil conseguir la curación debido a que el CPM presenta una mayor tendencia a diseminarse ampliamente para cuando se llega al diagnóstico. Hasta la fecha no hay biomarcadores moleculares que se hayan trasladado a la práctica clínica general para el cáncer de pulmón. Se han propuesto algunos biomarcadores, tales como el péptido liberador de progastrina (Chi-Shing Cho, et. al.; Biomedicine and Pharmacotherapy, vol. 61(9), octubre de 2007, páginas 515 a 519).
Los tratamientos dependen del desarrollo del cáncer y entre ellos habitualmente se incluyen la cirugía, para tumores localizados pequeños, o la quimioterapia, posiblemente en combinación con terapia de radiación.
Por lo tanto, todavía existe una necesidad de procedimientos que permitan un diagnóstico rápido, fiable y económico del cáncer de pulmón.
Descripción
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualesquiera otros aspectos o formas de realización expuestos en la presente memoria se proporcionan a título exclusivamente informativo.
En la presente memoria se describen procedimientos para el diagnóstico in vitro del cáncer de pulmón, comprendiendo dicho procedimiento la detección de progastrina en una muestra biológica de un sujeto. Preferentemente, se determina la cantidad de progastrina en dicha muestra, permitiendo de esta manera la cuantificación de la progastrina.
La presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico in vitro del cáncer de pulmón en un sujeto, que comprende las etapas siguientes:
a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con por lo menos un anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno de la misma,
b) detectar la unión de dicho anticuerpo de unión a progastrina, o fragmento de unión a antígeno del mismo, a la progastrina en dicha muestra, indicando dicha unión la presencia de cáncer de pulmón en dicho sujeto, seleccionándose dicha muestra biológica de entre: sangre, suero y plasma, y siendo dicho anticuerpo de unión a la progastrina un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en:
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 4, n.° 5 y n.° 6 , respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 7, n.° 8 y n.° 9, respectivamente,
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 10, n.° 11 y n.° 12, respectivamente, y una cadena ligera
que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 13, n.° 14 y n.° 15, respectivamente;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 16, n.° 17 y n.° 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC iD n.° 19, n.° 20 y n.° 21, respectivamente;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 22, n.° 23 y n.° 24, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC iD n.° 25, n.° 26 y n.° 27, respectivamente;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 28, n.° 29 y n.° 30, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC iD n.° 31, n.° 32 y n.° 33, respectivamente;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 34, n.° 35 y n.° 36, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC iD n.° 37, n.° 38 y n.° 39, respectivamente, y
- un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma en depósito en el CNCM, Institut Pasteur, 25-28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris, CEDEX 15, Francia, el 27 de diciembre de 2016 bajo la referencia I-5158.
En una forma de realización particular, la etapa b) comprende, además, determinar la concentración de progastrina y en la que la concentración de progastrina de por lo menos 10 pM en dicha muestra biológica es indicativa de la presencia de cáncer de pulmón en dicho sujeto.
En una forma de realización particular, el procedimiento de la invención comprende las etapas adicionales siguientes:
c) determinar una concentración de referencia de progastrina en una muestra de referencia,
d) comparar la concentración de progastrina en dicha muestra biológica con dicha concentración de referencia de progastrina,
e) determinar, a partir de la comparación de la etapa d), la presencia de cáncer de pulmón.
En una forma de realización particular, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se selecciona de entre anticuerpos monoclonales antiprogastrina N-terminales y anticuerpos monoclonales antiprogastrina C-terminales.
En una forma de realización particular, el anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en:
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 41 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 42;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 43 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 44;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 45 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 46;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 47 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 48;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 49 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 50; y
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 51 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 52.
En una forma de realización particular, la determinación de la etapa a) incluye:
(i) poner en contacto dicha muestra con una primera molécula de unión a progastrina que se une a una primera parte de la progastrina, y
(ii) poner en contacto dicha muestra con una segunda molécula de unión a progastrina que se une a una segunda parte de la progastrina.
En una forma de realización particular, la primera molécula de unión a progastrina se une a un epítopo dentro del extremo C-terminal de la progastrina.
En una forma de realización particular, la molécula de unión a progastrina es un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma en depósito en el CNCM, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, CEDEX 15, Francia, el 27 de diciembre de 2016 bajo la referencia I-5158.
En una forma de realización particular, la segunda molécula de unión a progastrina se une a un epítopo dentro del extremo N-terminal de la progastrina.
En una forma de realización particular, la segunda molécula de unión a progastrina es un anticuerpo policlonal que se une a un epítopo dentro del extremo N-terminal de la progastrina o un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes: CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 16, n.° 17 y n.° 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes: CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 19, n.° 20 y n.° 21, respectivamente.
En una forma de realización particular, el nivel de progastrina se determina en la etapa a) con un ELISA.
En una forma de realización particular, la muestra biológica se pone en contacto con una primera molécula, que se une a una primera parte de la progastrina y con una segunda molécula, que se une a una segunda parte de la progastrina.
En una forma de realización particular, la muestra biológica es de plasma, y en la que una concentración de progastrina de por lo menos 10 pM es indicativa de la presencia de cáncer de pulmón en dicho sujeto.
La invención se refiere, además, a la utilización de un anticuerpo de unión a progastrina o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, divulgado anteriormente para el diagnóstico in vitro del cáncer de pulmón.
La preprogastrina humana, un péptido de 101 aminoácidos (referencia de secuencia de aminoácidos: AAB19304.1) es el producto de traducción principal del gen gastrina. La progastrina se forma mediante el corte de los primeros 21 aminoácidos (el péptido de señal) de la preprogastrina. La cadena de 80 aminoácidos de la progastrina es procesada adicionalmente por enzimas de corte y modificadores en varias formas de hormona gastrina biológicamente activas: gastrina 34 (G34) y gastrina 34 extendida con glicina (G34-Gly), que comprende los aminoácidos 38 a 71 de la progastrina, gastrina 17 (G17) y gastrina extendida con glicina (G17-Gly), que comprende los aminoácidos 55 a 71 de la progastrina.
Los anticuerpos monoclonales antiprogastrina humana (anti-hPG) y su utilización para el diagnóstico o la terapia se han descrito en los documentos siguientes: WO 2011/083088 para el cáncer colorrectal, WO 2011/083090 para el cáncer de mama, WO 2011/083091 para el cáncer pancreático, WO 2011/116954 para el cáncer colorrectal y gastrointestinal y WO 2012/013609 y W o 2011/083089 para patologías hepáticas.
Un primer aspecto (no parte de la invención) se refiere a un procedimiento para la evaluación in vitro del riesgo de presencia de cáncer de pulmón, en el que dicho procedimiento comprende una etapa de detección de la progastrina en una muestra biológica procedente de un sujeto. La presencia de progastrina en la muestra indica que existe un riesgo de presencia de cáncer de pulmón.
De esta manera, el procedimiento in vitro de evaluación del riesgo de presencia de cáncer de pulmón en un sujeto, preferentemente comprende las etapas siguientes:
a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con por lo menos una molécula de unión a progastrina, y
b) detectar la unión de dicha molécula de unión a progastrina a la progasrina en dicha muestra, indicando dicha unión un riesgo de presencia de cáncer de pulmón.
La unión de la molécula de unión a progastrina puede detectarse mediante diversos ensayos disponibles para el experto en la materia. Aunque se encuentran incluidos en la exposición cualesquiera medios adecuados para llevar a cabo los ensayos, puede mencionarse en particular FACS, ELISA, RIA, transferencia western e IHQ.
Preferentemente, el procedimiento para la evaluación in vitro del riesgo de presencia de cáncer de pulmón en un sujeto comprende las etapas siguientes:
a) poner en contacto dicha muestra biológica de dicho sujeto con por lo menos una molécula de unión a progastrina,
b) determinar la concentración de progastrina en dicha muestra biológica, siendo una concentración de progastrina de por lo menos 10 pM en dicha muestra biológica indicativa de un riesgo de presencia de cáncer de pulmón.
Una vez se ha determinado la concentración de progastrina presente en la muestra, el resultado puede compararse con los de una o más muestras de control, que se obtienen de una manera similar a las muestras de ensayo, aunque de uno o más individuos que es conocido que no sufren de un cáncer de pulmón. En el caso de que la concentración de progastrina sea significativamente más elevada en la muestra de ensayo, puede concluirse que existe una probabilidad incrementada de que el sujeto del que se ha obtenido presente un cáncer de pulmón. De esta manera, más preferentemente, el procedimiento comprende las etapas adicionales siguientes:
c) determinar una concentración de referencia de progastrina en una muestra de referencia,
d) comparar la concentración de progastrina en dicha muestra biológica con dicha concentración de referencia de progastrina,
e) evaluar, a partir de la comparación de la etapa d), el riesgo de presencia de cáncer de pulmón.
Otra exposición se refiere a un procedimiento in vitro de diagnóstico de cáncer de pulmón en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con por lo menos una molécula de unión a progastrina, y
b) detectar la unión de dicha molécula de unión a progastrina a la progastrina en dicha muestra, indicando dicha unión la presencia de cáncer de pulmón en dicho sujeto.
Preferentemente, el presente procedimiento para el diagnóstico in vitro del cáncer de pulmón en un sujeto comprende las etapas siguientes:
a) poner en contacto dicha muestra biológica de dicho sujeto con por lo menos una molécula de unión a progastrina,
b) determinar la concentración de progastrina en dicha muestra biológica, siendo una concentración de progastrina de por lo menos 10 pM en dicha muestra biológica indicativa de la presencia de cáncer de pulmón en dicho sujeto.
Específicamente, una concentración de progastrina de por lo menos 10 pM, de por lo menos 20 pM, de por lo menos 30 pM, en dicha muestra biológica es indicativa de la presencia de cáncer de pulmón en dicho sujeto. Más preferentemente, el presente procedimiento comprende las etapas adicionales siguientes:
a) determinar una concentración de referencia de progastrina en una muestra de referencia,
b) comparar la concentración de progastrina en dicha muestra biológica con dicho nivel o concentración de referencia de progastrina,
e) diagnosticar, a partir de la comparación de la etapa d), la presencia de cáncer de pulmón.
Una exposición adicional se refiere a un procedimiento in vitro de diagnóstico de cáncer de pulmón metastatizado en un sujeto, en el que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes:
a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con por lo menos una molécula de unión a progastrina, y
b) detectar la unión de dicha molécula de unión a progastrina a la progastrina en dicha muestra, indicando dicha unión la presencia de cáncer de pulmón metastatizado en dicho sujeto.
Preferentemente, el presente procedimiento para el diagnóstico in vitro del cáncer de pulmón metastatizado en un sujeto, a partir de una muestra biológica de dicho sujeto, comprende las etapas siguientes:
a) poner en contacto dicha muestra biológica con por lo menos una molécula de unión a progastrina,
b) determinar mediante un ensayo bioquímico el nivel o concentración de progastrina en dicha muestra biológica, siendo una concentración de progastrina por lo menos 10 pM superior en dicha muestra biológica indicativa de la presencia de cáncer de pulmón metastatizado en dicho sujeto.
Específicamente, una concentración de progastrina de por lo menos 10 pM, de por lo menos 20 pM, de por lo menos 30 pM, de por lo menos 40 pM o de por lo menos 50 pM en dicha muestra biológica es indicativa de la presencia de cáncer de pulmón metastatizado en dicho sujeto.
Más preferentemente, el presente procedimiento comprende las etapas adicionales siguientes:
a) determinar una concentración de referencia de progastrina en una muestra de referencia,
b) comparar la concentración de progastrina en dicha muestra biológica con dicha concentración de referencia de progastrina,
c) diagnosticar, a partir de la comparación de la etapa d), la presencia de cáncer de pulmón metastatizado.
Específicamente, el presente procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer de pulmón en un sujeto comprende la determinación de la concentración de progastrina en una muestra biológica y la comparación de dicho valor obtenido con la concentración de progastrina en una muestra de referencia.
En un caso más particular, en un procedimiento para el diagnóstico de cáncer de pulmón, la muestra biológica de dicho sujeto se pone en contacto con por lo menos una molécula de unión a progastrina, siendo dicha molécula de unión a progastrina un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
La expresión "evaluación del riesgo de presencia de cáncer de pulmón en un sujeto" designa la determinación de una probabilidad relativa para un sujeto dado de sufrir de cáncer de pulmón, en comparación con un sujeto o valor de referencia. Un procedimiento tal como los divulgados en la presente memoria representa una herramienta en la evaluación de dicho riesgo, en combinación con otros procedimientos o indicadores, tales como el examen clínico, la biopsia y la determinación del nivel de un biomarcador conocido de cáncer de pulmón.
La expresión "diagnóstico in vitro" se refiere a determinar si un sujeto sufre de una afección particular. Es conocido que el diagnóstico de cáncer de pulmón implica por lo menos una observación clínica de los síntomas de dicho sujeto, tal como, por ejemplo, exploración portomografía computarizada (TC) helicoidal de baja dosis. Aunque se identificaron algunos biomarcadores en la etapa de identificación, todavía constituye un reto importante transferirlos al contexto clínico principalmente debido a la falta de un procedimiento sistemático de evaluación (Li et al., Neoplasma. 2012, 59(5): 500-507).
Por lo tanto, un procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer de pulmón, tal como se divulga puede considerarse una herramienta dentro de un procedimiento de diagnóstico.
La expresión "cáncer de pulmón" designa un cáncer que se origina en tejidos del pulmón, habitualmente en las células que revisten las vías respiratorias. Un "cáncer de pulmón" tal como se utiliza en la presente memoria comprende en particular, cáncer de pulmón microcítico (CPM), incluyendo el carcinoma microcítico y el carcinoma microcítico combinado, y los cánceres de pulmón no microcíticos (CPNM), incluyendo el carcinoma de células escamosas, el carcinoma de células grandes y el adenocarcinoma. Otros tipos de cáncer de pulmón, tales como los carcinomas quísticos adenoides, los linfomas y los sarcomas, así como tumores de pulmón benignos, tales como los hamartomas, también se encuentran incluidos en los cánceres de pulmón tal como se utiliza en la presente memoria.
El término "progastrina" designa el péptido progastrina de mamífero, y particularmente la progastrina humana. A fin de evitar toda duda, sin ninguna especificación, la expresión "progastrina humana" se refiere a la PG humana de secuencia SEC ID n° 1. La progastrina humana comprende especialmente un dominio N-terminal y un dominio C-terminal que no se encuentran presentes en las formas biológicamente activas de hormona gastrina indicadas anteriormente. Preferentemente, la secuencia de dicho dominio N-terminal se representa mediante la SEC ID n.° 2. Preferentemente, la secuencia de dicho dominio C-terminal se representa mediante la SEC ID n.° 3.
La determinación de la concentración de progastrina, según un procedimiento divulgado en la presente memoria, se lleva a cabo mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia de la bioquímica.
Preferentemente, la determinación de los niveles de progastrina en una muestra incluye poner en contacto dicha muestra con una molécula de unión a progastrina y medir la unión a la progastrina de dicha molécula de unión a la progastrina.
Al medir los niveles de expresión al nivel de las proteínas, la medición especialmente puede llevarse a cabo utilizando moléculas específicas de unión a progastrina, tales como, por ejemplo, anticuerpos, en particular utilizando técnicas bien conocidas, tales como la tinción de membrana celular con biotinilación u otras técnicas equivalentes, seguido de la inmunoprecipitación con anticuerpos específicos, la transferencia western, ELISA o e L iSPOT, los ensayos de inmunosorción ligada a enzima (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), inmunohistoquímica (IHQ), inmunofluorescencia (IF), micromatrices de anticuerpos o micromatrices de tejidos acopladas con inmunohistoquímica. Entre otras técnicas adecuadas se incluyen FRET o BRET, procedimientos microscópicos o histoquímicos de células individuales utilizando una o múltiples longitudes de onda de excitación y aplicando cualquiera de los procedimientos ópticos adaptados, tales como procedimientos electroquímicos (técnicas de voltametría y amperometría), microscopía de fuerza atómica y procedimientos de radiofrecuencia, por ejemplo, espectroscopía de resonancia multipolar, detección confocal y no confocal de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia y birrefringencia o índice de refracción (por ejemplo, resonancia del plasmón superficial, elipsometría, un procedimiento de espejo resonante, un procedimiento de rejilla acopladora de guía de ondas o interferometría), ELISA celular, citometría de flujo, obtención de imágenes de resonancia magnética radioisotópica, análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), HPLC-espectroscopía de masas, cromatografía líquida/espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC-MS/MS, por sus siglas en inglés). La totalidad de dichas técnicas son bien conocidas en la técnica y no necesitan detallarse adicionalmente en la presente memoria. Dichas diferentes técnicas pueden utilizarse para medir los niveles de progastrina.
Dicho procedimiento puede seleccionarse en particular de entre: un procedimiento basado en la inmunodetección, un procedimiento basado en la transferencia Western, un procedimiento basado en la espectrometría de masas, un procedimiento basado en la cromatografía y un procedimiento basado en la citometría de flujo. Aunque cualesquiera medios adecuados para llevar a cabo los ensayos se encuentran incluidos en la exposición, procedimientos tales como FACS, ELISA, RIA, transferencia Western e IHQ resultan particularmente útiles para llevar a cabo el procedimiento divulgado en la presente memoria.
Preferentemente, un procedimiento para el diagnóstico in vitro del cáncer de pulmón comprende la puesta en contacto de una muestra biológica procedente de un sujeto con una molécula de unión a progastrina utilizando un ensayo inmunoenzimático, preferentemente basándose en técnicas seleccionadas de entre RIA y ELISA.
Una "muestra biológica" tal como se utiliza en la presente memoria es una muestra de tejido o líquido biológico que contiene ácidos nucleicos o polipéptidos, por ejemplo, de una proteína, polinucleótido o transcrito del cáncer de pulmón. Dicha muestra debe permitir la determinación de los niveles de expresión de la progastrina. Es conocido que la progastrina es una proteína secretada. De esta manera, entre las muestras biológicas preferidas para la determinación del nivel de proteína progastrina se incluyen líquidos biológicos. Un "líquido biológico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier líquido que incluye material de origen biológico. Entre los líquidos biológicos preferidos para la utilización en los presentes procedimientos se incluyen líquidos corporales de un animal, por ejemplo, un mamífero, preferentemente un sujeto humano. El líquido corporal puede ser cualquier líquido corporal, incluyendo, aunque sin limitación, sangre, plasma, suero, linfa, líquido cefalorraquídeo (LCR), saliva, sudor y orina. Entre las muestras biológicas líquidas utilizadas en la presente invención se incluyen una muestra sanguínea, una muestra plasmática o una muestra de suero. Más preferentemente, la muestra biológica es una muestra de sangre. En efecto, dicha muestra de sangre puede obtenerse mediante una extracción de sangre completamente inofensiva del paciente y, de esta manera, permite una evaluación no invasiva de los riesgos de que el sujeto desarrolle un tumor.
Una "muestra biológica" tal como se utiliza en la presente memoria incluye además una muestra de cáncer sólida del paciente que debe someterse a ensayo, en el caso de que el cáncer sea un cáncer sólido. Dicha muestra de cáncer sólida permite al experto en la materia realice cualquier tipo de medición del nivel del biomarcador divulgado en la presente memoria. En algunos casos, los presentes procedimientos pueden comprender además una etapa preliminar de obtener una muestra de cáncer sólida del paciente. La expresión "muestra de cáncer sólida" se refiere a una muestra de tejido tumoral. Incluso en un paciente canceroso, el tejido que es el sitio del tumor todavía comprende tejido sano no tumoral. La "muestra de cáncer", de esta manera, debería limitarse a tejido tumoral obtenido del paciente. Dicha "muestra de cáncer" puede ser una muestra de biopsia o una muestra obtenida de una terapia de resección quirúrgica.
Se obtiene una muestra biológica típicamente de un organismo eucariótico, muy preferentemente un mamífero, o un ave, reptil o pez. En efecto, un "sujeto" que puede someterse al procedimiento descrito en la presente memoria
puede ser cualquier animal mamífero, incluyendo el ser humano, el perro, el gato, la vaca, la cabra, el cerdo, el puerco, la oveja y el mono, o un ave, reptil o pez. Preferentemente, el sujeto es un ser humano; el sujeto humano puede conocerse como "paciente".
La expresión "obtención de una muestra biológica" en la presente memoria se refiere a obtener una muestra biológica para la utilización en procedimientos descritos en la presente memoria. Con más frecuencia, lo anterior se lleva a cabo extrayendo una muestra de células de un animal, aunque también puede llevarse a cabo mediante la utilización de células previamente aisladas (por ejemplo, aisladas de otra persona, en otro momento y/o para otro fin) o mediante la realización de los presentes procedimientos in vivo. Los tejidos de archivo, que presentan una historia de tratamiento o de resultado, resultarán particularmente útiles.
Dicha muestra puede obtenerse y, en caso necesario, prepararse, según procedimientos conocidos por el experto en la materia. En particular, es bien conocido en la técnica que la muestra debe obtenerse de un sujeto en ayuno.
La determinación de la concentración de progastrina se refiere a la determinación de la cantidad de progastrina en un volumen conocido de muestra. La concentración de progastrina puede expresarse respecto a una muestra de referencia, por ejemplo, en forma de proporción o porcentaje. La concentración también puede expresarse como la intensidad o localización de una señal, dependiendo del procedimiento utilizado para la determinación de dicha concentración. Preferentemente, la concentración de un compuesto en una muestra se expresa después de la normalización de la concentración total de compuestos relacionados en dicha muestra, por ejemplo, el nivel o concentración de una proteína se expresa después de la normalización de la concentración total de proteínas en la muestra.
Preferentemente, el riesgo de que dicho sujeto sufra de cáncer de pulmón se determina mediante comparación del nivel de progastrina medido en dicha muestra biológica respecto a un nivel de referencia.
La expresión "nivel de referencia", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere al nivel de expresión del marcador de cáncer de pulmón bajo consideración, es decir, progastrina, en una muestra de referencia. Una "muestra de referencia", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una muestra obtenida de sujetos, preferentemente dos o más individuos, que es conocido que están libres de la enfermedad, o alternativamente, de la población general. Los niveles de expresión de referencia adecuados de progastrina pueden determinarse mediante medición de los niveles de expresión de dicho marcador en varios sujetos adecuados, y dichos niveles de referencia pueden ajustarse a poblaciones de sujetos específicas. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que presenta un límite superior o inferior, un intervalo de valores, un valor medio, un valor de la mediana, o un valor comparado con un valor de control o basal particular. El valor de referencia puede estar basado en el valor de una muestra individual, tal como, por ejemplo, un valor obtenido de una muestra del sujeto que se somete a ensayo, aunque en un punto temporal anterior. El valor de referencia puede basarse en un gran número de muestras, tal como de una población de sujetos del grupo de edad cronológica correspondiente, o basarse en un grupo de muestras que incluye o que excluye la muestra que debe someterse a ensayo.
Ventajosamente, un "nivel de referencia" es un nivel de progastrina predeterminado, obtenido de una muestra biológica procedente de un sujeto con un estado particular conocido con respecto al cáncer. En particular, el nivel de referencia utilizado para la comparación con la muestra de ensayo en la etapa (b) puede haberse obtenido de una muestra biológica de un sujeto sano, o de una muestra para ensayo de un sujeto que sufre de cáncer; se entiende que el perfil de expresión de referencia también puede obtenerse de un grupo de muestras biológicas de sujetos sanos o de un grupo de muestras de sujetos que presentan cáncer.
En un caso particular del presente procedimiento, la muestra de referencia se recoge de sujetos exentos de cualquier cáncer y preferentemente exentos de cualquier patología. Debe entenderse que, según la naturaleza de la muestra biológica recogida de un paciente, la muestra de referencia será una muestra biológica de la misma naturaleza que dicha muestra biológica.
El nivel de progastrina se determina en el presente procedimiento mediante la determinación de la cantidad de progastrina que se encuentra unida a una molécula de unión a progastrina, preferentemente a un anticuerpo que reconoce la progastrina.
La expresión "molécula de unión a progastrina" en la presente memoria se refiere a cualquier molécula que se une a la progastrina pero que no se une a la gastrina-17 (G17), gastrina-34 (G34), gastrina-17 extendida con glicina (G17-Gly) o gastrina-34 extendida con glicina (G34-Gly). La presente molécula de unión a progastrina puede ser cualquier molécula de unión a progastrina, tal como, por ejemplo, una molécula de anticuerpo o una molécula de receptor. La molécula de unión a progastrina utilizada en la presente invención es un anticuerpo antiprogastrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo, según se define en las reivindicaciones.
Preferentemente, el presente procedimiento de diagnóstico in vitro de un cáncer de pulmón comprende la
determinación de la concentración de progastrina en una muestra biológica procedente de un sujeto, mostrando dicho sujeto por lo menos un síntoma clínico de cáncer de pulmón.
Preferentemente, el presente procedimiento de diagnóstico in vitro de un cáncer de pulmón comprende la determinación de la concentración de progastrina en una muestra biológica procedente de un sujeto, mostrando dicho sujeto por lo menos un síntoma clínico de cáncer y/o de metástasis.
La expresión "de unión", "se une" o similar, significa que el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, forma un complejo con un antígeno que, bajo condiciones fisiológicas, es relativamente estable. Los procedimientos para determinar si dos moléculas se unen son bien conocidos en la técnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo, la diálisis de equilibrio, la resonancia del plasmón superficial, y similares. Preferentemente, dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a la progastrina con una afinidad que es por lo menos dos veces superior a su afinidad para la unión a una molécula no específica, tal como BSA o caseína. Más preferentemente, dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une únicamente a la progastrina.
En un caso particular, en un procedimiento para el diagnóstico del cáncer de pulmón divulgado en la presente memoria, se pone en contacto una muestra biológica procedente del sujeto con por lo menos una molécula de unión a progastrina, siendo la afinidad de dicha molécula para la progastrina de por lo menos 100 nM, de por lo menos 90 nM, de por lo menos 80 nM, de por lo menos 70 nM, de por lo menos 60 nM, de por lo menos 50 nM, de por lo menos 40 nM, de por lo menos 30 nM, de por lo menos 20 nM, de por lo menos 10 nM, de por lo menos 5 nM, de por lo menos 1 nM, de por lo menos 100 pM, de por lo menos 10 pM o de por lo menos 1 pM, según se determine mediante un procedimiento tal como se describe anteriormente.
En un caso particular, el presente procedimiento para el diagnóstico del cáncer de pulmón comprende la detección de la concentración de progastrina en una muestra biológica procedente de un sujeto, poniéndose dicha muestra biológica en contacto con un anticuerpo anti-hPG, o con un fragmento de unión a antígeno del mismo.
El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente memoria pretende incluir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales. Un anticuerpo (o "inmunoglobulina") consiste en una glucoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región (o dominio) variable de cadena pesada (abreviado en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviado en la presente memoria como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio: CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de complementariedad"(CDR, por sus siglas en inglés) o "regiones hipervariables", que son principalmente responsables de la unión a un epítopo de un antígeno y que se encuentran entremezcladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, por sus siglas en inglés). El procedimiento para identificar las CDR dentro de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo y para determinar su secuencia son bien conocidos por el experto en la materia. A fin de evitar toda duda, en ausencia de cualquier indicación en el texto en sentido contrario, la expresión CDR se refiere a las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo según define IMGT, proporcionando la numeración única de ImgT una delimitación estandarizada de las regiones marco y de las regiones determinantes de complementariedad, CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2.
La numeración única de IMGT se ha definido para comparar los dominios variables, con independencia del receptor de antígeno, del tipo de cadena o de la especie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77, (2003)]. En la numeración única IMGT, los aminoácidos conservados siempre presentan la misma posición, por ejemplo, cisteína 23 (1st-CYS), triptófano 41 (CONSERVED-TRP), aminoácido hidrofóbico 89, cisteína 104 (2nd-CYS), fenilalanina o triptófano 118 (J-PHE o J-TRP). La numeración única de IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones marco (FR1-IMGT, posiciones 1 a 26; FR2-IMGT: 39 a 55; FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones determinantes de complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 117. Como los huecos representan las posiciones no ocupadas, las longitudes de CDR-IMGT (mostradas entre paréntesis y separadas por puntos, por ejemplo, [8.8.13]) se convierten en información crucial. La numeración única de IMGT se utiliza en representaciones gráficas 2D, designadas como IMGT "Colliers de Perles" [Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883, 2002 / Kaas, Q. y Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30, (2007)], y en estructuras 3D en IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210, (2004)].
Cada VH y cada VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas de extremo aminoterminal a extremo carboxiterminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluyendo
diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. Los anticuerpos pueden ser de diferente isotipo (es decir, IgA, IgD, IgE, IgG o IgM).
En un caso particular, dicho anticuerpo de unión a progastrina, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se selecciona de entre el grupo que consiste en: anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos camelizados, anticuerpos IgA1, anticuerpos IgA2, anticuerpos IgD, anticuerpos IgE, anticuerpos IgG1, anticuerpos IgG2, anticuerpos IgG3, anticuerpos IgG4 y anticuerpos IgM.
Un "anticuerpo policlonal" es un anticuerpo que ha sido producido entre o en presencia de otro u otros anticuerpos no idénticos. En general, se producen anticuerpos policlonales a partir de un linfocito B en presencia de varios otros linfocitos B productores de anticuerpos no idénticos. Habitualmente se obtienen anticuerpos policlonales directamente de un animal inmunizado.
La expresión "anticuerpo monoclonal" designa un anticuerpo que aparece a partir de una población de anticuerpos prácticamente homogénea, comprendiendo la población anticuerpos idénticos excepto por unas cuantas posibles mutaciones naturales que pueden observarse en proporciones mínimas. Un anticuerpo monoclonal aparece a partir del crecimiento de un único clon celular, tal como un hibridoma, y se caracteriza por cadenas pesadas de una clase y subclase, y cadenas ligeras de un tipo.
La expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo pretende indicar cualquier péptido, polipéptido o proteína que conserva la capacidad de unirse a la diana (también denominada generalmente "antígeno") de dicho anticuerpo, generalmente el mismo epítopo, y que comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 5 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 10 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 15 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 20 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 25 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 40 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 50 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 60 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 70 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 80 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 90 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 100 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 125 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 150 residuos aminoácidos contiguos, de por lo menos 175 residuos aminoácidos contiguos, o de por lo menos 200 residuos aminoácidos contiguos, de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo.
Divulgado en la presente memoria, dicho fragmento de unión a antígeno comprende por lo menos una CDR del anticuerpo del que se deriva. Todavía en un caso preferido, dicho fragmento de unión a antígeno comprende 2, 3, 4 o 5 CDR, más preferentemente las 6 CDR del anticuerpo del que se deriva.
Los “fragmentos de unión a antígeno” pueden seleccionarse, aunque sin limitación, de entre el grupo que consiste en los fragmentos Fv, scFv ("sc" es cadena sencilla, por sus siglas en inglés), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos, o proteínas de fusión con péptidos desordenados, tales como XTEN (polipéptido recombinante extendido) o motivos PAS, o cualquier fragmento del que la semivida resultaría incrementada mediante modificación química, tal como la adición de polialquilenglicol, tal como polietilenglicol ("PEGilación") (fragmentos pegilados denominados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG o Fab'-PEG) ("Pe G", por "PolietilEnGlicol"), o mediante incorporación en un liposoma, presentando dichos fragmentos por lo menos una de entre las CDR características del anticuerpo. Preferentemente, dichos "fragmentos de unión a antígeno" estará constituidos o comprenderán una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del que se derivan, siendo dicha secuencia parcial suficiente para retener la misma especificidad de unión que el anticuerpo del que proceden y una afinidad suficiente, preferentemente por lo menos igual a 1/100, en un modo más preferido por lo menos igual a 1/10, de la afinidad del anticuerpo del que procede, con respecto a la diana.
En otro caso particular de un procedimiento de diagnóstico del cáncer de pulmón tal como se divulga en la presente memoria, se pone en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo de unión a progastrina, habiéndose obtenido dicho anticuerpo mediante un procedimiento de inmunización conocido por el experto en la materia, utilizándose como inmunógeno un péptido cuya secuencia de aminoácidos comprende la totalidad o una parte de la secuencia de aminoácidos de la progastrina. Más particularmente, dicho inmunógeno comprende un péptido seleccionado de entre:
- un péptido cuya secuencia de aminoácidos comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos de la progastrina de longitud completa, y particularmente la progastrina humana de longitud completa de SEC ID n.° 1,
- un péptido cuya secuencia de aminoácidos corresponde a una parte de la secuencia de aminoácidos de la progastrina, y particularmente la progastrina humana de longitud completa de SEC ID n.° 1,
- un péptido cuya secuencia de aminoácidos corresponde a una parte o a la totalidad de la secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de la progastrina, y en particular, péptidos que comprenden, o que consisten en, la secuencia de aminoácidos: SWKPRSq Qp DAPLG (SEC ID n.° 2), y
- un péptido cuya secuencia de aminoácidos corresponde a una parte o a la totalidad de la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de la progastrina, y en particular, péptidos que comprenden, o que consisten en, la secuencia de aminoácidos: QGPWLe EEe EAYGWMd FGr RSAEDEN (Se C ID n.° 3),
- un péptido cuya secuencia de aminoácidos corresponde a una parte de la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de la progastrina, y en particular, péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos FGRRSAEDEN (SEC ID n.° 40) correspondiente a los aminoácidos 71 a 80 de la progastrina.
El experto en la materia conocerá que dicha inmunización puede utilizarse para generar anticuerpos policlonales o monoclonales, según se desee. Los procedimientos para obtener cada uno de dichos tipos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. De esta manera, el experto en la materia seleccionará e implementará fácilmente un procedimiento para generar anticuerpos policlonales y/o monoclonales contra cualquier antígeno dado.
Entre los ejemplos de anticuerpos monoclonales que se generaron mediante la utilización de un inmunógeno que comprende la secuencia de aminoácidos "SWKPRSQQPDAPLG", correspondiente a la secuencia de aminoácidos 1-14 de la progastrina humana (extremo N-terminal) se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los anticuerpos monoclonales designados como: mAb3, mAb4, mAb16 y mAb19 y mAb20, tal como se indica en las Tablas 1 a 4, siguientes. Se han descrito otros anticuerpos monoclonales, aunque no está claro si estos anticuerpos se unen realmente a la progastrina (documento WO 2006/032980). Los resultados experimentales de mapeado de epítopos muestran que mAb3, mAb4, mAb16 y mAb19 y mAb20 se unen específicamente a un epítopo dentro de dicha secuencia de aminoácidos N-terminal de hPG. Los anticuerpos policlonales que reconocen específicamente un epítopo dentro del extremo N-terminal de la progastrina representada mediante la SEC ID n.° 2, han sido descritos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 2011/083088).
Tabla 1
Tabla 2
Tabla 4
Entre los ejemplos de anticuerpos monoclonales que pueden generarse mediante la utilización de un inmunógeno que comprende la secuencia de aminoácidos "q GpW l EEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN" (parte C-terminal de la progastrina) correspondiente a la secuencia de aminoácidos 55-80 de la progastrina humana se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los anticuerpos designados como: mAb8 y mAb13, en las Tablas 5 y 6 siguientes. Los resultados experimentales de mapeado de epítopos muestran que mAb13 se unen específicamente a un epítopo dentro de dicha secuencia de aminoácidos C-terminal de hPG. Otro ejemplo de un anticuerpo monoclonal que, de esta manera, puede generarse es el anticuerpo Mab14, producido por el hibridoma 2H9F4B7, descrito en el documento WO 2011/083088. El hibridoma 2H9F4B7 ha sido depositado bajo el Tratado de Budapest en el CNCM, Institut Pasteur, 25-28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris, CEDEX 15, Francia, el 27 de diciembre de 2016 bajo la referencia I-5158.
Tabla 5
Tabla 6
Entre otros ejemplos se incluyen anticuerpos monoclonales y/o policlonales anti-hPG generados mediante la utilización de un inmunógeno que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 40.
En particular, dicha muestra biológica se pone en contacto, en un procedimiento descrito en la presente memoria, con un anticuerpo anti-hPG o fragmento de unión a antígeno del mismo, seleccionánose dicho anticuerpo anti-hPG de entre los anticuerpos anti-hPG N-terminales y los anticuerpos anti-hPG C-terminales.
Las expresiones "anticuerpos anti-hPG N-terminales" y "anticuerpos anti-hPG C-terminales" designan anticuerpos que se unen a un epítopo que comprende los aminoácidos situados en la parte N-terminal de hPG o a un epítopo que comprende aminoácidos situados en la parte C-terminal de hPG, respectivamente. Preferentemente, la expresión "anticuerpos anti-hPG N-terminales" se refiere a anticuerpos de unión a un epítopo situado en un dominio de la progastrina cuya secuencia se representa mediante la SEC ID n.° 2. Preferentemente, la expresión "anticuerpos anti-hPG C-terminales" se refiere a anticuerpos de unión a un epítopo situado en un dominio de la progastrina cuya secuencia se representa mediante la SEC ID n.° 3.
El término "epítopo" se refiere a una región de un antígeno al que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subgrupo de los epítopos estructurales y presentan aquellos aminoácidos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos también pueden ser conformacionales. Entre los epítopos pueden incluirse determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos, cadenas laterales sacáridas, grupos fosforilo o grupos sulfonilo, y, en ciertos casos, pueden presentar características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. La determinación del epítopo al que se une un anticuerpo puede llevarse a cabo mediante cualquier técnica de mapeado de epítopos conocida por el experto en la materia. Un epítopo puede comprender diferentes aminoácidos que se localizan secuencialmente dentro de la secuencia de aminoácidos de una proteína. Un epítopo puede comprender, además, aminoácidos que no se localizan secuencialmente dentro de la secuencia de aminoácidos de una proteína.
Preferentemente (no parte de la presente invención), dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en:
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 4, n.° 5 y n.° 6 , respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80 %, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 4, n.° 5 y n.° 6 , respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 7, n.° 8 y n.° 9, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 7, n.° 8 y n.° 9, respectivamente;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 10, n.° 11 y n.° 12, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 10, n.° 11 y n.° 12, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 13, n.° 14 y n.° 15, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98%, tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 13, n.° 14 y n.° 15, respectivamente;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 16, n.° 17 y n.° 18, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las
secuencias SEC ID n.° 16, n.° 17 y n.° 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 19, n.° 20 y n.° 21, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80 %, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 19, n° 2o y n° 21, respectivamente;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 22, n.° 23 y n.° 24, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 22, n.° 23 y n.° 24, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 25, n.° 26 y n.° 27, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98%, tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 25, n.° 26 y n.° 27, respectivamente;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente por lo menos tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 28, n.° 29 y n.° 30, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 28, n.° 29 y n.° 30, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 31, n.° 32 y n.° 33, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 31, n.° 32 y n.° 33, respectivamente, y
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 34, n.° 35 y n.° 36, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 34, n.° 35 y n.° 36, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 37, n.° 38 y n.° 39, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98%, tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 37, n.° 38 y n.° 39, respectivamente.
En otro caso, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma en depósito en el CNCM, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, CEDEX 15, Francia, el 27 de diciembre de 2016 bajo la referencia I-5158.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el "porcentaje de identidad" o "% de identidad" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se refiere al porcentaje de nucleótidos o residuos aminoácidos entre las dos secuencias que deben compararse, obtenido después de la alineación óptima, siendo este porcentaje puramente estadístico y estando las diferencias entre las dos secuencias distribuidas aleatoriamente a lo largo de su longitud. La comparación entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos tradicionalmente se lleva a cabo mediante la comparación de las secuencias después de haberlas alineado óptimamente, pudiendo llevar a cabo dicha comparación por segmento o mediante la utilización de una "ventana de alineación". La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, además de comparando manualmente, mediante procedimientos conocidos por el experto en la materia.
Para la secuencia de aminoácidos que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia, entre los ejemplos preferidos se incluyen los que contienen la secuencia de referencia, determinadas modificaciones, especialmente una deleción, adición o sustitución de por lo menos un aminoácido, el truncado o la extensión. En el caso de la sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, se prefieren las sustituciones en las que los aminoácidos sustituidos se sustituyen por aminoácidos "equivalentes". En la presente memoria, la expresión "aminoácidos equivalentes pretende indicar cualesquiera aminoácidos que es probable que sean sustituidos por uno de los aminoácidos estructurales sin modificar, sin embargo, las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y los de ejemplos específicos definidos posteriormente.
Pueden determinarse los aminoácidos equivalentes basándose en su homología estructural con los aminoácidos a los que sustituyen o en los resultados de ensayos comparativos de actividad biológica entre los diversos anticuerpos que es probable que se generen.
Más preferentemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en:
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 41 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 42;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 43 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 44;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 45 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 46;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 47 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 48;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 49 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 50; y
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 51 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 52.
Preferentemente, el anticuerpo utilizado en el presente procedimiento es un anticuerpo humanizado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano; las demás partes de la molécula de anticuerpo se derivan de uno o varios anticuerpos humanos. Además, algunos de los residuos de segmento esquelético (denominados FR, por marco por sus siglas en inglés) pueden modificarse para conservar la afinidad de unión, según técnicas conocidas por el experto en la materia (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986). El objetivo de la humanización es la reducción de la inmunogenicidad de un anticuerpo xenogénico, tal como un anticuerpo murino, para la introducción en un ser humano, manteniendo simultáneamente la afinidad de unión y especificidad de antígeno completas del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos pueden prepararse mediante técnicas conocidas por el experto en la materia (tales como, por ejemplo, los indicados en los documentos Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992). Dichos anticuerpos humanizados resultan preferentes para su utilización en procedimientos que implican diagnósticos in vitro o el tratamiento preventivo y/o terapéutico in vivo. Otras técnicas de humanización también son conocidas por el experto en la materia. En efecto, los anticuerpos pueden humanizarse utilizando una diversidad de técnicas, incluyendo la injertación de CDR (patentes EP 0451261; EP 0682040, EP 0939 127, EP 0 566647, US 5.530.101, US 6.180.370, US 5.585.089, US 5.693.761, US 5.639.641, US 6.054.297,US 5.886.152 yUS 5.877.293), recubrimiento o resuperficialización (patentes EP 0 592 106 y EP 0 519 596; Padlan E. A., Molecular Immunology 28(4/5): 489-498, 1991; Studnicka G. M. et al., Protein Engineering 7(6): 805-814, 1994 Roguska M.A. et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A., 91:969-973, 1994), y reorganización de cadenas (patente US 5.565.332). Pueden producirse anticuerpos humanos utilizando una diversidad de procedimientos conocidos de la técnica, incluyendo procedimientos de expresión fágica. Véanse también las patentes US 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806 y 5.814.318, y las solicitudes publicadas de patente internacional WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741.
Más preferentemente (no parte de la presente invención), dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado, seleccionado de entre el grupo que consiste en:
- un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 4, n.° 5 y n.° 6 , respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 4, n.° 5 y n.° 6 , respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 7, n.° 8 y n.° 9, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 7, n.° 8 y n.° 9, respectivamente;
- un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 10, n.° 11 y n.° 12, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las
secuencias SEC ID n.° 10, n.° 11 y n.° 12, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 13, n.° 14 y n.° 15, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98%, tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 13, n.° 14 y n.° 15, respectivamente;
- un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 16, n.° 17 y n.° 18, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 16, n.° 17 y n.° 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 19, n.° 20 y n.° 21, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 19, n.° 20 y n.° 21, respectivamente;
- un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 22, n.° 23 y n.° 24, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 22, n.° 23 y n.° 24, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 25, n.° 26 y n.° 27, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98%, tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 25, n° 26 y n° 27, respectivamente;
- un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 28, n.° 29 y n.° 30, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 28, n.° 29 y n.° 30, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 31, n.° 32 y n.° 33, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 31, n.° 32 y n.° 33, respectivamente, y
- un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 34, n.° 35 y n.° 36, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 34, n.° 35 y n.° 36, respectivamente, y una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente por lo menos dos, preferentemente tres, de entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 37, n.° 38 y n.° 39, respectivamente, o secuencias con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98%, tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n.° 37, n.° 38 y n.° 39, respectivamente,
comprendiendo dicho anticuerpo además regiones constantes de la cadena ligera y de la cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano.
Más preferentemente (aunque no parte de la presente invención), dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado, seleccionado de entre el grupo que consiste en:
- un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 53 y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 54;
- un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 55 y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 56;
- un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre s Ec ID n.° 57, n.° 58 y n.° 59, y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n.° 60, n.° 61 y n.° 62;
- un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre s Ec ID n.° 63, n.° 64 y n.° 65, y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n.° 66 , n.° 67 y n.° 68;
- un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n.° 69 y n.° 71, y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n.° 70 y n.° 72, y
- un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n.° 75 y n.° 76, y una región variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n.° 77 y n.° 78,
comprendiendo dicho anticuerpo además regiones constantes de la cadena ligera y de la cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano.
En un primer caso, el presente procedimiento divulgado comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-hPG de unión a un epítopo de hPG, estando dicho epítopo localizado dentro de la parte C-terminal de hPG o con un epítopo localizado dentro de la parte N-terminal de hPG.
Más específicamente, el presente procedimiento comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-hPG de unión a un epítopo de hPG, incluyendo dicho epítopo una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de la progastrina seleccionada de entre una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 10 a 14 de hPG, los aminoácidos 9 a 14 de hPG, los aminoácidos 4 a 10 de hPG, los aminoácidos 2 a 10 de hPG y los aminoácidos 2 a 14 de hPG, siendo la secuencia de aminoácidos de hPG es SEC ID n.° 1.
Más específicamente, el presente procedimiento comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo anti-hPG de unión a un epítopo de hPG, incluyendo dicho epítopo una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de la progastrina seleccionada de entre una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 71 a 74 de hPG, los aminoácidos 69 a 73 de hPG, los aminoácidos 71 a 80 de hPG (SEC ID n.° 40), los aminoácidos 76 a 80 de hPG y los aminoácidos 67 a 74 de hPG, siendo la secuencia de aminoácidos de hPG SEC ID n.° 1.
Tal como se divulga en la presente memoria, la presente composición comprende un anticuerpo que reconoce un epítopo que incluye una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de la progastrina.
Más específicamente, la presente composición comprende un anticuerpo que reconoce un epítopo de la progastrina, incluyendo dicho epítopo una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de la progastrina, pudiendo dicha secuencia de aminoácidos incluir los residuos 10 a 14 de hPG, los residuos 9 a 14 de hPG, los residuos 4 a 10 de hPG, los residuos 2 a 10 de hPG o los residuos 2 a 14 de hPG, siendo la secuencia de aminoácidos de hPG SEC ID n.° 1.
Más específicamente, la presente composición comprende un anticuerpo que reconoce un epítopo de la progastrina, incluyendo dicho epítopo una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de la progastrina, pudiendo dicha secuencia de aminoácidos incluir los residuos 71 a 74 de hPG, los residuos 69 a 73 de hPG, los residuos 71 a 80 de hPG (SEC ID n.° 40), los residuos 76 a 80 de hPG o los residuos 67 a 74 de hPG, siendo la secuencia de aminoácidos de hPG SEC ID n.° 1.
En una exposición particular del presente procedimiento para el diagnóstico in vitro del cáncer de pulmón, dicho procedimiento comprende una etapa de puesta en contacto de una muestra biológica procedente de un sujeto con una primera molécula que se une a una primera parte de la progastrina y con una segunda molécula que se une a una segunda parte de la progastrina. Más particularmente, la molécula de unión a progastrina es un anticuerpo, y una muestra biológica procedente de un sujeto se pone en contacto con un anticuerpo que se une a un primer epítopo de la progastrina y con un segundo anticuerpo que se une a un segundo epítopo de la progastrina.
En una exposición particular del presente procedimiento, dicho procedimiento comprende una etapa de puesta en contacto de una muestra biológica procedente de un sujeto, con un primer agente que se une a una primera parte de la progastrina y con un segundo agente que se une a una segunda parte de la progastrina. Más particularmente, dicha molécula de unión a progastrina es un anticuerpo, y una muestra biológica procedente de un sujeto se pone en contacto con un anticuerpo que se une a un primer epítopo de la progastrina y con un segundo anticuerpo que se une a un segundo epítopo de la progastrina.
Preferentemente, dicho primer anticuerpo se une a un portador insoluble o parcialmente soluble. La unión de la progastrina a dicho primer anticuerpo resulta en la captura de la misma en dicha muestra biológica.
Preferentemente, dicho primer anticuerpo es un anticuerpo que se une a un epítopo de hPG, incluyendo dicho epítopo una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de la progastrina, tal como se ha indicado anteriormente. Más preferentemente, dicho primer anticuerpo es el anticuerpo monoclonal Mab14 producido por el hibridoma 2H9F4B7, descrito en el documento WO 2011/083088. El hibridoma 2H9F4B7 ha sido depositado bajo el Tratado de Budapest en el CNCM, Institut Pasteur, 25-28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris, CEDEX 15, Francia, el 27 de diciembre de 2016 bajo la referencia I-5158.
Según otro caso preferido, dicho segundo anticuerpo se marca con una fracción detectable, tal como se indica posteriormente. La unión de la progastrina al segundo anticuerpo permite la detección de las moléculas de progastrina que se encontraban presentes en la muestra biológica. Además, la unión de la progastrina al segundo anticuerpo permite la cuantificación de las moléculas de progastrina que se encontraban presentes en la muestra biológica. Preferentemente, dicho segundo anticuerpo es un anticuerpo que se une a un epítopo de hPG, incluyendo dicho epítopo una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal de la progastrina, tal como se ha indicado anteriormente. Más preferentemente, dicho anticuerpo N-terminal es un anticuerpo policlonal, tal como se ha indicado anteriormente. Alternativamente, también resulta posible utilizar un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo en el extremo N-terminal de la progastrina, tal como, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales N-terminales indicados anteriormente, especialmente un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 16, n.° 17 y n.° 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 19, n.° 20 y n.° 21.
Más preferentemente, el primer anticuerpo se une a un portador insoluble o parcialmente soluble y el segundo anticuerpo se marca con una fracción detectable.
Preferentemente, el presente procedimiento para el diagnóstico del cáncer de pulmón comprende la detección de la progastrina en una muestra biológica procedente de un sujeto humano.
Preferentemente, el presente procedimiento para el diagnóstico del cáncer de pulmón comprende la determinación de la concentración de progastrina en una muestra biológica procedente de un sujeto humano.
Preferentemente, el presente procedimiento para el diagnóstico del cáncer de pulmón comprende la detección de la concentración de progastrina en una muestra biológica de un sujeto humano, seleccionándose dicha muestra biológica de entre sangre, suero y plasma.
Preferentemente, el presente procedimiento comprende poner en contacto una muestra de dicho sujeto con un anticuerpo anti-hPG tal como se ha indicado anteriormente, indicando la unión de dicho anticuerpo anti-hPG en la muestra indica la presencia de cáncer de pulmón en dicho sujeto.
Preferentemente, el presente procedimiento comprende la puesta en contacto de la muestra de dicho sujeto con un anticuerpo anti-hPG tal como se ha indicado anteriormente, siendo una concentración de progastrina superior a 10 pM en dicho plasma indicativa de la presencia de cáncer de pulmón en dicho sujeto.
Más preferentemente, el presente procedimiento comprende la puesta en contacto de una muestra de dicho sujeto con un anticuerpo anti-hPG tal como se ha indicado anteriormente, siendo una concentración de progastrina superior a 10 pM, 20 pM, 30 pM o 40 pM en dicha muestra indicativa de la presencia de cáncer de pulmón en dicho sujeto.
Todavía más preferentemente, el presente procedimiento comprende la puesta en contacto de una muestra de dicho sujeto con un anticuerpo anti-hPG tal como se ha indicado anteriormente, siendo una concentración de progastrina superior a 10 pM, preferentemente superior a 20 pM, más preferentemente superior a 30 pM, todavía más preferentemente superior a 40 pM, aún todavía más preferentemente superior a 50 pM en dicha muestra indicativa de la presencia de cáncer de pulmón metastatizado en dicho sujeto.
La presente exposición se refiere, además, a procedimientos para realizar un seguimiento de la eficacia de un tratamiento para el cáncer de pulmón en un paciente, tal como quimioterapia, terapia biológica, inmunoterapia o terapia de anticuerpos, mediante la determinación de la concentración de progastrina en una primera muestra, tal como un fluido corporal o biopsia de cáncer de pulmón, obtenida de un paciente antes del tratamiento para cáncer de pulmón, seguido de la comparación de la concentración de progastrina en la primera muestra con la de una segunda muestra obtenida del mismo paciente después el tratamiento, en el que una reducción de la concentración de progastrina en dicha segunda muestra en comparación con dicha primera muestra indica que el tratamiento ha resultado eficaz.
Preferentemente, el presente procedimiento comprende comparar la concentración de progastrina en una muestra biológica obtenida de un paciente con un valor predeterminado de concentración de progastrina en la muestra. Más preferentemente, dicho valor predeterminado se selecciona de entre: una media, un promedio, de valores de la muestra basados en la media, o determinaciones promedio del valor en luna población libre de cáncer de pulmón,
un valor de concentración de progastrina obtenido cuando era conocido que el paciente estaba libre de cáncer de pulmón.
Preferentemente, el presente procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer de pulmón comprende la determinación de la concentración de progastrina en una muestra procedente de dicho paciente y un segundo ensayo diagnóstico de cáncer de pulmón. Más preferentemente, el presente procedimiento para el diagnóstico in vitro del cáncer de pulmón comprende la determinación de la concentración de progastrina en una muestra procedente de dicho paciente y un segundo ensayo diagnóstico de cáncer de pulmón, comprendiendo dicho segundo ensayo diagnóstico comprende la detección de un biomarcador particular seleccionado de entre: antígeno carcinoembrionario (CEA, por sus siglas en inglés), enolasa específica de neuronas (NSE), citoqueratina-19 (CYFRA-21-1), alfa-fetoproteína, antígeno carbohidrato-125 (CA-125), antígeno carbohidrato-19.9 (CA-19.9) y ferritina, independientemente o en combinación (Li et aL, 2012).
Preferentemente, el presente procedimiento divulgado comprende la determinación del nivel de progastrina con el tiempo en muestras de un paciente que ha sido o está siendo tratado de cáncer de pulmón.
Leyendas de figura
Figura 1
Se midió la concentración de la progastrina en 40 muestras de plasma procedentes de pacientes de cáncer de pulmón y en 119 muestras de plasma procedentes de donantes sanos, utilizando el kit de ELISA DECODE Lab (anticuerpo de captura: Mab14; anticuerpo de detección: policlonal anti-hPG).
Ejemplos
Ejemplo 1: detección de concentración plasmática de progastrina mediante la utilización de anticuerpos policlonales
Se cuantificaron los niveles plasmáticos de progastrina mediante ELISA a través de la utilización de dos anticuerpos antiprogastrina específicos: los anticuerpos de captura se utilizaron para recubrir los pocillos de la placa, mientras que los anticuerpos de revelado se utilizaron para detectar la progastrina y mediar en el revelado de la señal.
En el presente ejemplo, la cuantificación se basó en el procedimiento de ELISA, que permite, mediante la utilización de un sustrato cuya reacción emite luz, asignar un valor proporcionar al nivel de luminiscencia de los anticuerpos unidos al antígeno retenido por los anticuerpos de captura.
Material
Los reactivos y aparatos se indican en la Tabla 7.
Tabla 7
Se obtuvieron anticuerpos policlonales mediante inmunización de un conejo con progastrina N-terminal (SEC ID n.° 2) o con progastrina C-terminal correspondiente a los aminoácidos 7 l a 80 de hPG y que presentaba la secuencia FGRRSAEDEN (SEC ID n.° 40) según protocolos estándar.
Las características de unión de los anticuerpos policlonales contra la progastrina utilizados en dicho ensayo eran las siguientes: ausencia de unión a G34-Gly, G34, G17-Gly, G17; unión a la progastrina de longitud completa.
Se recubrieron placas de 96 pocillos mediante la preparación de una solución de carbonato-bicarbonato sódico, 50 mM, pH 9.6, mediante disolución del contenido de una cápsula en 100 ml de agua MilliQ. Se preparó en tampón de carbonato una solución de anticuerpo de captura (3 pg/ml), correspondiente a los anticuerpos policlonales obtenidos mediante la utilización del fragmento C-terminal de progastrina FGRRSAEDEN (SEC ID n.° 40). Se
añadieron 100 microlitros de solución de anticuerpos a cada pocilio y se incubaron a 4°C durante 16 horas (1 noche). A continuación, se bloquearon las placas mediante eliminación de la solución de anticuerpos y lavado 3 veces con 300 j l de 1X PBS/Tween-20 al 0.1%, seguido de la adición de 200 j l de tampón de bloqueo (1X PBS/Tween-20 al 0.1%/BSA al 0.1%) en cada pocillo y se incubó durante 2 horas a 22°C. A continuación, se eliminó el tampón de bloqueo y se lavaron los pocillos 3 veces con 300 j l de 1X PBS/Tween-20 al 0.1%.
La dilución del plasma se llevó a cabo de la manera siguiente: el plasma se utilizó puro, diluido 1/2, 1/5 y 1/10. Se prepararon diluciones a partir de plasma puro en 1X PBS/Tween-20 al 0.1%/BSA al 0.1%.
Para el ensayo de control, ELISA en presencia de una concentración conocida de progastrina, se preparó una dilución de progastrina de la manera siguiente: se preparó PG recombinante patrón (progastrina humana de longitud completa producida en E. coli y purificada por afinidad con glutatión-agarosa/eliminación de la etiqueta (Tev)/purificación por IMAC Counter/diálisis, del Institut Pasteur, Paris, Francia) a una concentración de 0.45 mg/ml (45 jM ), por triplicado. Se prepararon intervalos de concentración de progastrina, de la manera siguiente:
- Solución A: predilución 1/10, 2 j l de solución madre 18 j l de tampón
- Solución B: predilución 1/100, 10 j l de A 90 j l de tampón
- Solución C: predilución 1/1000, 10 j l de B 90 j l de tampón
- Solución D: 500 pM, 5,55 j l de C 494,5 j l del diluyente
- Solución E: 250 pM, 250 j l de D 250 j l del diluyente
- Solución F: 100 pM, 200 j l de E 300 j l del diluyente
- Solución G: 50 pM, 250 j l de F 250 j l del diluyente
- Solución H: 25 pM, 200 j l de G 200 j l del diluyente
- Solución I: 10 pM, 100 j l de H 150 j l del diluyente
El intervalo de PG recombinante es lineal y, por lo tanto, puede ser más o menos extenso según el anticuerpo utilizado.
Para la preparación de muestras de ensayo, se apartaron aproximadamente 500 j l de cada muestra y se almacenaron hasta el análisis (y confirmación, en caso necesario) de los resultados. Se sometieron a ensayo 100 j l de cada punto del intervalo y/o plasmas puros, diluidos a 1/2, 1/5 y 1/10, y se incubaron durante 2 horas a 22°C en las placas.
Para el revelado del ensayo, las placas se lavaron 3 veces con 300 j l de 1X PBS/Tween-20 al 0.1%. Se preparó una solución del anticuerpo policlonal de conejo antiprogastrina, habiéndose obtenido dichos anticuerpos mediante la utilización de la parte N-terminal de la progastrina como inmunógeno, acoplado con biotina a razón de 0.5 jg/ml, mediante dilución en 1X PBS/Tween-20 al 0.1%/BSA al 0.1%. Se añadieron 100 j l de dicha solución a cada pocillo. La incubación tuvo lugar durante 1 hora a 22°C. El revelado con estreptavidina-HRP se llevó a cabo eliminando el anticuerpo de detección y el lavado 3 veces con 300 j l de 1X PBS/Tween-20 al 0.1%, seguido de la preparación de una solución de estreptavidina-HRP a razón de 20 ng/ml diluidos en 1X PBS / Tween-20 al 0.1% / BSA al 0.1%, añadiéndose 100 j l de dicha solución a cada pocillo, antes de incubar durante 1 hora a 22°C.
La detección consistía en la eliminación de la estreptavidina-HRP y el lavado 3 veces con 300 j l de 1X PBS / Tween-20 al 0.1%, seguido de la adición de 100 j l de solución de sustrato quimioluminiscente en cada pocillo. La solución de sustrato se preparó mediante la mezcla de volúmenes iguales de las dos soluciones kit de ELISA SuperSignal Femto, 20 ml 20 ml, 30 minutos antes de la utilización y se almacenó a temperatura ambiente en la oscuridad. Se leyó la luminiscencia tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad.
Para cada condición, se llevó a cabo el ensayo por triplicado y los resultados de los intervalos se presentan en forma de gráfico que muestra el cambio de luminiscencia según la concentración de progastrina. Para cada dilución de plasma, se determinó la concentración de progastrina utilizando la ecuación de regresión lineal del intervalo correspondiente (intervalo 1/10 para una muestra diluida 1/ 10).
Procedimientos y resultados
La mediana de concentración plasmática de la progastrina era 0 pM en los pacientes de control (n=103), mientras que pudo detectarse una concentración plasmática significativa de progastrina en los pacientes con cáncer de pulmón. De esta manera, los pacientes con cáncer de pulmón presentan niveles más elevados de progastrina en el plasma que los individuos de control sanos.
Ejemplo 2: detección de la concentración de progastrina mediante la utilización de anticuerpos monoclonales antiprogastrina
Los pocillos de placas de 96 pocillos Nunc MaxiSORP se recubrieron con un primer anticuerpo específico de
progastrina de la manera siguiente. Se diluyeron anticuerpos monoclonales antiprogastrina específicos para la región carboxiterminal hasta una concentración de 3 pg/ml en una solucion de 50 mM, tampón de carbonato/bicarbonato sódico, pH 9.6, en agua MilliQ.
A continuación, se añadió un total de 100 pl de solución de anticuerpo a cada pocillo de las placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 4°C. Tras la unión, se eliminó la solución de anticuerpo de los pocillos, que a continuación se lavaron tres veces con 100 pl de tampón de lavado (1X PBS / Tween-20 al 0.1%). A continuación, se añadió un total de 100 pl de tampón de bloqueo (1X PBS / Tween-20 al 0.1% / BSA al 0.1%) a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas a 22°C. Seguidamente se eliminó el tampón de bloqueo y los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado. A continuación, se añadieron las muestras de plasma o suero aisladas de los pacientes a los pocillos en un volumen de 100 pl en una serie de dilución, típicamente diluciones 1:1, 1:2, 1:5 y 1:10, y después se incubaron durante 2 horas a 22°C. Las muestras de plasma o suero se analizaron por duplicado.
Los ensayos incluían, además, dos curvas patrón. La primera curva patrón se preparó utilizando diluciones de progastrina recombinante a una cantidad final de 1 ng, 0.5 ng, 0.25 ng, 0.1 ng, 0.05 ng, 0.01 ng y 0 ng por pocillo. La segunda curva patrón, que sirve de control negativo, se preparó a partir de suero humano negativo para progastrina diluido en tampón de bloqueo a las mismas diluciones que las muestras de ensayo, es decir, 1:1, 1:2 , 1:5 y 1:10. Alternativamente, al someter a ensayo las muestras de plasma, la segunda curva patrón, que servía de control negativo, se preparó a partir de plasma humano negativo para progastrina diluido en tampón de bloqueo a las mismas diluciones que las muestras de ensayo, es decir, 1:1, 1:2, 1:5 y 1:10.
Tras completar la incubación con las muestras de plasma o suero, se extrajo el contenido de los pocillos y estos se lavaron tres veces con tampón de lavado, 100 pl/pocillo, seguido de la detección de la progastrina unida al primer anticuerpo, mediante la utilización de un segundo anticuerpo específico para la progastrina, de la manera siguiente.
Los anticuerpos monoclonales antiprogastrina acoplados con biotina específicos para la región aminoterminal de la progastrina se diluyeron en tampón de bloqueo hasta una concentración de entre 0.1 y 10 pg/ml, según el anticuerpo. A continuación, se añadió un total de 100 pl de la solución de anticuerpo a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a 22°C.
Tras completar la unión del anticuerpo secundario, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado, 100 pl/pocillo, seguido de la adición de 100 pl de una solución de estreptavidina-HRP (25 ng/ml en tampón de bloqueo) a cada pocillo y la incubación durante 1 hora a 22°C. Tras completar la incubación con la solución de estreptavidina-HRP, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado, 100 pl/pocillo. Después, se añadieron a cada pocillo 100 pl de sustrato quimioluminiscente preparado utilizando un kit de sustrato quimioluminiscente para ELISA de máxima sensibilidad Pierce SuperSignal Femto, se incubó durante 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad y después se leyó en un luminómetro.
Basándose en las lecturas del luminómetro, se utilizó el análisis de regresión lineal para derivar la ecuación de las líneas correspondientes a los datos de la curva patrón. Utilizando dicha ecuación, a continuación, se calculó la concentración de progastrina en las diversas muestras de los pacientes.
La mediana de concentración plasmática de progastrina se calculó en los pacientes con cáncer de pulmón y se comparó con la mediana de concentración plasmática de progastrina en el plasma de los pacientes de control. Los pacientes con cáncer de pulmón presentaban niveles más elevados de progastrina en el plasma que los individuos de control sanos.
Ejemplo 3: detección de concentración plasmática de progastrina mediante la utilización de una combinación de anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales
En el presente ejemplo, se cuantificaron los niveles plasmáticos de progastrina mediante ELISA a través de la utilización de anticuerpo específico para progastrina humana (hPG) que se había utilizado para recubrir una placa de 96 pocillos. Se añadieron los patrones y las muestras a los pocillos, y cualquier hPG presente se unió al anticuerpo de captura inmovilizado. Los pocillos se lavaron y se añadió un conjugado de anticuerpo de detección anti-hPG y peroxidasa de rábano (HRP), produciendo un "sándwich" de anticuerpo-antígeno-anticuerpo. Tras un segundo lavado, se añadió solución de sustrato TMB, que produce un color azul en proporción directa a la cantidad de hPG presente, en la muestra inicial. La solución de parada cambia de color de azul a amarillo y los pocillos se leyeron a 450 nm con un lector de microplacas.
Se obtuvieron anticuerpos policlonales mediante inmunización de un conejo con progastrina N-terminal (SEC ID n.° 2) o con progastrina C-terminal correspondiente a los aminoácidos 71 a 80 de hPG y que presentaba la secuencia FGRRSAEDEN (SEC ID n.° 40), según protocolos estándar.
Se obtuvieron anticuerpos monoclonales mediante la utilización de hibridomas productores de anticuerpos contra
la progastrina N-terminal (SEC ID n.° 2) o contra la progastrina C-terminal correspondiente a los aminoácidos 71 a 80 de hPG y que presentaba la secuencia FGRRSAEDEN (SEC ID n.° 40), según protocolos estándar.
Las características de unión de los anticuerpos policlonales y monoclonales contra la progastrina utilizados en dicho ensayo eran las siguientes: ausencia de unión a G34-Gly, G34, G17-Gly, G17; unión a la progastrina de longitud completa.
Para el ensayo de control, ELISA en presencia de una concentración conocida de progastrina, se preparó una dilución de progastrina de la manera siguiente: se preparó PG recombinante patrón (progastrina humana de longitud completa producida en E. coli y purificada por afinidad con glutatión-agarosa/eliminación de la etiqueta (Tev)/purificación por IMAC Counter/diálisis, del Institut Pasteur, Paris, Francia) a una concentración de 0.45 mg/ml (45 |j M), por triplicado. Se prepararon intervalos de concentración de progastrina, de la manera siguiente:
- Solución A: predilución 1/10, 2 j l de solución madre 18 j l de tampón
- Solución B: predilución 1/100, 10 j l de A 90 j l de tampón
- Solución C: predilución 1/1000, 10 j l de B 90 j l de tampón
- Solución D: 500 pM, 5,55 j l de C 494,5 j l del diluyente
- Solución E: 250 pM, 250 j l de D 250 j l del diluyente
- Solución F: 100 pM, 200 j l de E 300 j l del diluyente
- Solución G: 50 pM, 250 j l de F 250 j l del diluyente
- Solución H: 25 pM, 200 j l de G 200 j l del diluyente
- Solución I: 10 pM, 100 j l de H 150 j l del diluyente
El intervalo de PG recombinante es lineal y, por lo tanto, puede ser más o menos extenso según el anticuerpo utilizado.
Procedimientos y resultados
Se determinaron los niveles de progastrina en muestras de plasma de sujetos que era conocido que posteriormente habían desarrollado cáncer de pulmón. La progastrina se capturó con el anticuerpo monoclonal C-terminal mAb 14 producido con el hibridoma 2H9F4B7 indicado en el documento WO 2011/083088 (el hibridoma 2H9F4B7 se depositó para el Tratado de Budapest en el CNCM, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, Francia, el 27 de diciembre de 2016, bajo la referencia I-5158.). La detección se llevó a cabo con anticuerpos policlonales marcados específicos para el extremo N-terminal.
El control estaba constituido por muestras de plasma procedentes de la población general.
Los datos demuestran que los pacientes con cáncer de pulmón presentan niveles detectables de progastrina en el plasma, mientras que en individuos de control sanos son nulos.
Ejemplo 4: detección de concentración plasmática de progastrina utilizando el kit DECODE Lab.
El ensayo permite la medición de hPG en plasma-EDTA mediante ELISA.
El kit utiliza un anticuerpo de captura específico para hPG prerrecubierto sobre una placa de 96 pocillos. El hPG presente en los patrones y en las muestras añadido a los pocillos se une al anticuerpo de captura inmovilizado. Los pocillos se lavaron y se añadió un conjugado de anticuerpo de detección anti-hPG y peroxidasa de rábano (HRP), resultando en un complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo. Tras un segundo lavado, se añadió al pocillo solución de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), que produce un color azul en proporción directa a la cantidad de hPG presente en la muestra inicial. La solución de parada cambia de color de azul a amarillo y los pocillos se leyeron a 450 nm con un lector de microplacas.
Procedimientos y resultados
Se utilizaron 40 muestras de plasma procedentes de pacientes de cáncer de pulmón y 119 muestras de plasma procedentes de donantes sanos, para medir la concentración de progastrina utilizando el kit de ELISA DECODE Lab (anticuerpo de captura: Mab14; anticuerpo de detección: policlonal anti-hPG) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Brevemente:
1. Preparación de todos los reactivos, controles y muestras tal como se indica en la sección anterior, excepto el conjugado 1x.
Claims (14)
1. Procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer de pulmón en un sujeto, que comprende las etapas siguientes:
a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con por lo menos un anticuerpo de unión a progastrina, o un fragmento de unión a antígeno de la misma,
b) detectar la unión de dicho anticuerpo de unión a progastrina, o fragmento de unión a antígeno del mismo, a la progastrina en dicha muestra, indicando dicha unión la presencia de cáncer de pulmón en dicho sujeto,
seleccionándose dicha muestra biológica de entre: sangre, suero y plasma, y siendo dicho anticuerpo de unión a la progastrina un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre el grupo que consiste en:
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 4, n.° 5 y n.° 6 , respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 7, n.° 8 y n.° 9, respectivamente,
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 10, n.° 1l y n.° 12, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos s Ec ID n.° 13, n.° 14 y n.° 15, respectivamente,
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 16, n.° 17 y n.° 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos s Ec ID n.° 19, n.° 20 y n.° 21, respectivamente,
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 22, n.° 23 y n.° 24, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias de aminoácidos s Ec ID n.° 25, n.° 26 y n.° 27, respectivamente,
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 28, n.° 29 y n.° 30, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 31, n.° 32 y n.° 33, respectivamente;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 34, n.° 35 y n.° 36, respectivamente, y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 37, n.° 38 y n.° 39, respectivamente, y
- un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma en depósito en el CNCM, Institut Pasteur, 25-28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris, c Ed EX 15, Francia, el 27 de diciembre de 2016 bajo la referencia I-5158.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa b) comprende, además, determinar la concentración de progastrina y en el que la concentración de progastrina de por lo menos 10 pM en dicha muestra biológica es indicativa de la presencia de cáncer de pulmón en dicho sujeto.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, que comprende las etapas adicionales siguientes:
c) determinar una concentración de referencia de progastrina en una muestra de referencia,
d) comparar la concentración de progastrina en dicha muestra biológica con dicha concentración de referencia de progastrina,
e) determinar, a partir de la comparación de la etapa d), la presencia de cáncer de pulmón.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se selecciona de entre anticuerpos monoclonales antiprogastrina N-terminales y anticuerpos monoclonales antiprogastrina C-terminales.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en:
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 41 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 42;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 43 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 44;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 45 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 46;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 47 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 48;
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 49 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 50; y
- un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 51 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 52.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la determinación de la etapa a) incluye:
(i) poner en contacto dicha muestra con una primera molécula de unión a progastrina que se une a una primera parte de la progastrina, y
(ii) poner en contacto de dicha muestra con una segunda molécula de unión a progastrina que se une a una segunda parte de la progastrina.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la primera molécula de unión a progastrina se une a un epítopo dentro del extremo C-terminal de la progastrina.
8. Procedimiento según la reivindicación 6 o 7, en el que dicha molécula de unión a progastrina es un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma depositado en el CNCM, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, CEDEX 15, Francia, el 27 de diciembre de 2016 bajo la referencia I-5158.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que la segunda molécula de unión a progastrina se une a un epítopo dentro del extremo N-terminal de la progastrina.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que dicha segunda molécula de unión a progastrina es un anticuerpo policlonal que se une a un epítopo dentro del extremo N-terminal de la progastrina o un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes: CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 16, n.° 17 y n.° 18, respectivamente, y una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes: CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 19, n.° 20 y n.° 21, respectivamente.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el nivel de progastrina se determina en la etapa a) con un ELISA.
12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha muestra biológica se pone en contacto con una primera molécula, que se une a una primera parte de la progastrina, y con una segunda molécula, que se une a una segunda parte de la progastrina.
13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha muestra biológica es de plasma, y en el que una concentración de progastrina de por lo menos 10 pM es indicativa de la presencia de cáncer de pulmón en dicho sujeto.
14. Utilización de un anticuerpo de unión a la progastrina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para el diagnóstico in vitro de cáncer de pulmón.
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