ES2920502T3 - Controles sintéticos para inmunohistoquímica - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se relaciona con controles sintéticos útiles, por ejemplo, para la inmunohistoquímica (IHC), así como kits y métodos de fabricación y uso relacionados con el mismo. En algunas realizaciones, los controles sintéticos incluyen un gel de proteína de antígeno/portador sólido que comprende un antígeno purificado (por ejemplo, a una cantidad conocida) y una proteína portadora como una proteína de albúmina (por ejemplo, una proteína de albúmina sérica), una proteína de blanco huevo o proteína o proteína o proteína de huevo Mezcla de proteínas de clara de huevo, gelatina o polilisina. En algunas realizaciones, el antígeno purificado está reticulado a la proteína portadora en el gel de proteína de antígeno/portador sólido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Controles sintéticos para inmunohistoquímica

Campo

La presente divulgación se refiere a controles sintéticos útiles, por ejemplo, para inmunohistoquímica (IHC, del inglés immunohistochemistry), así como a métodos de fabricación y usos relacionados con los mismos. En la divulgación, los controles sintéticos incluyen un gel sólido que comprende un antígeno purificado (por ejemplo, en una cantidad conocida) reticulado con una proteína transportadora que es una proteína seroalbúmina.

Antecedentes

La IHC representa una herramienta importante tanto para la investigación como para aplicaciones clínicas. Entre las muchas técnicas utilizadas para caracterizar la expresión de proteínas, la IHC es una de las pocas que proporciona información sobre el nivel de expresión, así como sobre la localización, por ejemplo, a nivel celular y/o tisular. Por lo tanto, la IHC es una herramienta fundamental utilizada en la investigación para caracterizar una proteína de interés. La IHC también se ha convertido en una herramienta de diagnóstico importante en la clínica, por ejemplo, para clasificar a los pacientes para varias aplicaciones de medicina personalizada. Como ejemplo, el ensayo de IHC semicuantitativo de HER2 HercepTest™ (Dako, Dinamarca A/S) se ha aprobado por la FDA para su uso en la evaluación del estado de la proteína HER2 durante casi 20 años. Esta prueba permite a los médicos identificar a pacientes cuyos tumores sobreexpresan HER2. Si bien HER2 se sobreexpresa en muchos tipos de cáncer, se ha demostrado que entre el 25 y el 30 % de los cánceres de mama sobreexpresan HER2, y este marcador se correlaciona con una menor supervivencia sin enfermedad y general. Las terapias que se dirigen a HER2 en estos pacientes (por ejemplo, el tratamiento con anticuerpos anti-HER2) proporcionan una mejora significativa de la supervivencia general, la tasa de respuesta, la duración de la respuesta y el tiempo hasta la progresión de la enfermedad. Véase, por ejemplo, Slamon, D. J. et al. (2001) N Engl J Med 344:783-792.

El establecimiento de un ensayo de IHC fiable para una diana concreta presenta múltiples retos. En primer lugar, se debe identificar un anticuerpo que sea específico para la diana de interés y que no reaccione de forma cruzada con otras dianas. Esto requiere controles positivos y negativos adecuados que expresen la diana a niveles conocidos, que son difíciles de identificar cuando la expresión de la diana no está caracterizada.

En segundo lugar, incluso si hay un anticuerpo disponible, puede ser difícil identificar controles positivos y negativos que sean fiables, estén disponibles fácilmente y sean fáciles de producir en masa. Las muestras de tejido y las estirpes celulares (por ejemplo, sedimentos celulares) se han utilizado como controles de IHC; sin embargo, ambos tienen limitaciones significativas. Para muchas dianas, no se dispone de tejidos adecuados. Para otras, la expresión en los tejidos puede ser variable, sin caracterizar o demasiado débil para detectar. Las estirpes celulares son más fáciles de obtener que las muestras de tejido (aunque puede ser difícil cultivar determinadas estirpes celulares a escala industrial), pero al igual que la expresión en las muestras de tejido, la expresión en las estirpes celulares puede ser variable, sin caracterizar o demasiado débil para detectar. Se puede genomanipular una estirpe celular para sobreexpresar una diana de interés, pero la sobreexpresión puede ser significativamente mayor que la expresión en tejidos reales y puede conducir a una localización subcelular distorsionada. La sobreexpresión también puede ser heterogénea dentro de una población de células cultivadas. Las estirpes celulares se pueden producir en lotes, pero estos pueden agotarse rápidamente, lo que requiere la producción de nuevos lotes que pueden tener diferentes características.

Se han intentado varios enfoques destinados a establecer un enfoque normalizado para generar controles de IHC. Hace más de 45 años, Brandtzaeg describió un método para crear muestras de "tejido artificial": bloques de tamaño milimétrico de suero de conejo fijado con glutaraldehído, en los que permitió la difusión de fracciones de inmunoglobulina humana o suero completo (Brandtzaeg, P. (1972) Immunology; 22(1):177-183). Esta técnica general se revisó y extendió con aparente éxito durante los siguientes doce años (Millar y Williams (1982) Histochem J. 14(4):609-620; Schipper y Tilders (1983) J. Histochem Cytochem. 31(1):12-18; Valnes et al. (1984) J. Histochem Cytochem. 33(8):755-61; Valnes y Brandtzaeg (1985) Histochemistry. 81(4):313-9), pero también se ha descrito como propenso a la tinción no homogénea y no específica (Shi et al. (2005) J. Histochem Cytochem. 53(9):1167-1170) y ha visto poco uso en la práctica reciente. Más ampliamente utilizadas son las estirpes celulares clonales con una abundancia variable y bien caracterizada de proteínas diana (Mohd Omar et al. (2010) Acta Histochem.

112(6):519-28). Estas son muy valiosas en muchos entornos, pero los controles de las estirpes celulares pueden mostrar una expresión notablemente heterogénea de dianas específicas en subclones separados, diferentes pases de un clon o incluso dentro de una población de cultivo, lo que frustra el objetivo de crear un patrón homogéneo y reproducible.

Sompuram, S. R. et al. (2002) Clin Chem 48:410-420 describe la aplicación puntual de péptidos directamente en portaobjetos de vidrio o el acoplamiento de péptidos en perlas de vidrio. (Véase además Sompuram et al. (2015) J. Histochem Cytochem 63:681-690). Sin embargo, la implementación de este enfoque generó problemas técnicos. Por ejemplo, ya que era difícil para los técnicos ver las manchas en los que se aplicaron los péptidos al vidrio (son invisibles antes de la tinción), muchos portaobjetos se tiñeron con cantidades insuficientes de reactivo para cubrir todos los controles, lo que condujo a distorsiones en la tinción (Véase Bogen, S. A. et al. (2009) Appl Immunohistochem Mol Morphol 17:239-246). Estas manchas de péptido también eran mucho más delgadas que las secciones de tejido reales y, por lo tanto, era difícil lograr una tinción intensa de control positivo. Otros grupos han tratado de mezclar una diana de interés en una solución de lisocima, que se puede preparar como una sección de tejido incluida en parafina y fijada con formalina (Véase Fowler, C. B. et al. (2007) Lab Invest 87:836-846). Se señaló que la formación de gel dependía de la concentración de proteína y del punto isoeléctrico (Fowler et al., (2007) Lab Invest. 87(8):836-46.). Sin embargo, este enfoque no funcionó para muchas dianas, tales como péptidos, que pueden escaparse de la gelatina de lisocima. La agarosa también se probó como un posible sustituto de tejido. Sin embargo, los péptidos dispersados en agarosa no eran homogéneos. Además, cuando se someten estos geles de péptidos a base de agarosa a la recuperación de antígenos, que normalmente incluye la ebullición, la agarosa se derritió y provocó que se separara en el portaobjetos de vidrio.

Por lo tanto, existe una necesidad de un enfoque que proporcione controles de IHC positivos y negativos fiables que sean sensibles, específicos y que se puedan adaptar a una amplia gama de dianas, incluidas las dianas para los que no existe un control biológico adecuado. Dicho enfoque también proporcionaría un ensayo útil para determinar la especificidad de los anticuerpos, lo cual es particularmente ventajoso cuando se analiza una gran cantidad de anticuerpos para identificar y validar un nuevo anticuerpo específico para una diana de interés, así como para optimizar los protocolos de tinción de IHC.

El documento US 2003/157523 describe la mezcla de una muestra que comprende una molécula biológica con un material de inclusión (gel) y la preparación de una matriz para la detección de la molécula biológica. El material de inclusión es agarosa y el gel se pone en contacto con un agente de reticulación después de la formación del gel. Toda et al., Journal of Pathology, 188:415-422 (1999) describen el uso de un cultivo en gel de matriz de colágeno para estudiar el papel de los factores de crecimiento en la regeneración del tejido tiroideo, mediante el examen de sus efectos en la foliculogénesis tiroidea y la angiogénesis. El colágeno se puso en contacto con un agente de reticulación después de la formación del gel.

Mourra et al., Journal Francais D'Ophtalmologie 21(4):287-294 (1998) describen el uso de colágeno como transportador en la formación de un gel sólido de antígeno/proteína transportadora, donde el colágeno se puso en contacto con un agente de reticulación después de la formación del gel.

Raja et al., Scientific reports 5: 15977; doi:10.1038/srep15977 (2015) describen geles que se utilizan como vehículos de administración de fármacos que se forman a partir de BSA a través de un mecanismo redox y entran en contacto con un agente de reticulación después de la formación del gel.

Sumario

Para satisfacer estas y otras demandas, en el presente documento se proporcionan métodos para generar un gel sólido de antígeno/proteína transportadora. Estos geles sólidos se pueden procesar como muestras de tejido u otras muestras biológicas de acuerdo con los métodos de procesamiento convencional de IHC o microscopía electrónica (EM, del inglés electrón microscopy) (incluida la fijación, el corte, la recuperación de antígenos, etc.). Dado que los geles contienen una cantidad conocida de un antígeno de interés, se pueden utilizar, por ejemplo, para crear una serie de geles con concentraciones conocidas de antígeno para normalizar la tinción con un anticuerpo particular o para detectar anticuerpos que reconozcan de manera específica un antígeno de interés y que sean adecuados para análisis de IHC/EM. Se cree que estos métodos proporcionan un planteamiento general que permite controlar la tinción de cualquier antígeno de interés, simular múltiples niveles de expresión utilizando concentraciones conocidas de antígeno. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

En la figura 1 se muestra un flujo de trabajo ilustrativo para la tinción IHC utilizando portaobjetos obtenidos de muestras de tejido.

En la figura 2A se muestra un gel de seroalbúmina bovina (BSA, del inglés bovine serum albumin) creado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y después eliminado de él.

En las figuras 2B y 2C se muestran diferentes vistas de secciones de un gel de BSA creado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y después eliminado de él.

En la figura 2D se muestra una porción de gel cortada y preparada para deshidratación y procesamiento en parafina.

En la figura 2E se muestra una porción de gel cortada e incluida en un "bloque donante" de parafina. Barra de escala: 1 cm.

En la figura 2F se muestra una micromatriz de tejido (TMA, del inglés tissue microarray) creada a partir de varios bloques donantes de gel de parafina. Los núcleos más oscuros son referencias de orientación que contienen pigmento negro y verde.

En la figura 3A se muestran los resultados de la tinción IHC de una sección de 4 micrómetros de espesor de cilindros de gel de péptido BCL2/BSA incluidos en un bloque de parafina. Los insertos muestran un aumento de 40* de la tinción IHC de BCL2 utilizando secciones obtenidas de geles de péptido BCL2/BSA que contienen (de izquierda a derecha) no péptido, 5 * 10-5 mg/ml (2,5 * 10-8 M) de péptido Bc L2, 5 * 10-4 mg/ml (2,5 * 10-7 M) de péptido BCL2, 5 * 10-3 mg/ml (2,5 * 10-6 M) de péptido BCL2, 5 * 10-2 mg/ml (2,5 * 10-5 M) de péptido BCL2 o 0,5 mg/ml (2,5 * 10-4 M) de péptido BCL2. Las secciones correspondientes a la tinción de ^bC^l2 de 0, 1+, 2+ o 3+ (en una escala cualitativa de 0 a 3+) están marcadas.

En la figura 3B se muestran los resultados de seis experimentos independientes que analizan las secciones que se muestran en la figura 3A para la densidad óptica (DO) frente a la concentración del péptido BCL2.

En la figura 3C se muestran los resultados de seis experimentos independientes que analizan las secciones que se muestran en la figura 3A para la intensidad de la imagen frente a la concentración del péptido BCL2.

En las figuras 3D y 3E se muestran los resultados de la tinción de inmunofluorescencia (IF) cuantitativa de una sección de 4 micrómetros de espesor de cilindros de gel de péptido BCL2/BSA incluidos en un bloque de parafina, teñidos con anticuerpo primario anti-BCL2 y detectados con un indicador de fluorescencia (con el sistema de detección de HRP anti-ratón OmniMAP de Ventana Medical Systems, seguido del sistema de detección Ventana Discovery Red 610). Las muestras de prueba incluyen el péptido BCL2 de tipo silvestre (no mutado), péptidos BCL2 con seis sustituciones de aminoácidos individuales diferentes y un péptido de la proteína MCL1 (una muestra de control negativo que no se espera que se una al anticuerpo anti-BCL2). En la figura 3D se muestra la fluorescencia roja del indicador. En la figura 3E se muestra la fluorescencia de la misma TMA fotografiada en el canal del filtro DAPI (detecta la autofluorescencia azul en los núcleos de BSA).

En las figuras 3F y 3G se muestran los resultados de la tinción de inmunofluorescencia (IF) cuantitativa de una sección de 4 micrómetros de espesor de cilindros de gel de péptido BCL2/BSA incluidos en un bloque de parafina, teñidos con un anticuerpo primario de control no tratado previamente. En la figura 3F se muestra la fluorescencia del indicador. En la figura 3G se muestra la fluorescencia de la misma TMA fotografiada en el canal del filtro DAPI (detecta la autofluorescencia en los núcleos de BSA).

En la figura 3H se muestra la cuantificación de los resultados (indicada como emitencia óptica promedio) mostrados en la figura 3D. El péptido BCL2 de tipo silvestre muestra la señal más fuerte en cada concentración; el péptido MCL1 de control negativo muestra una señal mínima, como cabía esperar. Los seis péptidos BCL2 con sustituciones de un solo aminoácido muestran una señal variable, en general, intermedia entre el péptido BCL2 de tipo silvestre y el MCL1 de control negativo.

En la figura 3I se muestra la cuantificación de los resultados (indicada como emitencia óptica promedio) mostrados en la figura 3F. El anticuerpo de control sin tratamiento previo muestra una señal casi indetectable, como cabía esperar.

En la figura 3J se muestra la cuantificación de los resultados (informada como intensidad de señal promedio) mostrados en la figura 3D. El péptido BCL2 de tipo silvestre muestra la señal más fuerte en cada concentración; el péptido MCL1 de control negativo muestra una señal mínima, como cabía esperar. Los seis péptidos BCL2 con sustituciones de un solo aminoácido muestran una señal variable, en general, intermedia entre el péptido BCL2 de tipo silvestre y el MCL1 de control negativo.

En la figura 3K se muestra la cuantificación de los resultados (indicada como intensidad de señal promedio) mostrados en la figura 3F. El anticuerpo de control sin tratamiento previo muestra una señal casi indetectable, como cabía esperar.

En la figura 4A se muestra la tinción IHC de control utilizando un anticuerpo secundario de burro anti-ratón en secciones de gel de BSA que contienen IgG de ratón (izquierda) o IgG de rata (derecha).

En la figura 4B se muestra la tinción IHC de control utilizando un anticuerpo secundario de burro anti-rata en secciones de gel de BSA que contienen IgG de ratón (izquierda) o IgG de rata (derecha).

En la figura 4C se muestra el efecto en la tinción IHC de las sustituciones de aminoácidos (como se indica) introducidas en el epítopo del anticuerpo clon 124 anti-BCL2 de BCL2 humano (aminoácidos 41 a 54 de la secuencia de BCL2 humano como se establece en UniProt con n.° de referencia P10415). Esta imagen es de una sección de 4 micrómetros de espesor, cortada de una micromatriz de tejido incluida en parafina construida con cilindros de gel de péptido BCL2/BSA (cada uno de 1 mm de diámetro), teñida con el anticuerpo clon 124 anti-BCL2 y detectada con reactivos y métodos cromogénicos.

En la figura 4D se muestra la cuantificación de los resultados (indicada como densidad óptica (DO)) mostrados en la figura 4C.

En las figuras 5A a 5D se muestran los resultados de la detección de veintisiete anticuerpos diferentes obtenidos de ratones inmunizados con KSR2 humano mediante IHC utilizando geles de proteína/BSA (en comparación con la tinción con IgG de ratón sin tratamiento previo en la figura 5D). En la fila superior de cada una se muestran los resultados de la tinción IHC utilizando cada anticuerpo en geles de BSA sin proteína. En la fila inferior se muestran los resultados de la tinción IHC utilizando cada anticuerpo en geles de BSA en los que está incluida la proteína KSR2 humana utilizada para inmunizar a los ratones. El clon de anticuerpo de ratón se indica para cada columna respectiva. Las marcas de verificación indican los clones de mayor rendimiento, como lo demuestra la fuerte señal en la muestra de proteína diana (fila inferior) junto con una señal mínima en la muestra de control negativo (fila superior).

En la figura 6 se muestran los resultados de evaluar los efectos de la temperatura y el tiempo de calentamiento en la formación de gel de BSA. La temperatura indica la temperatura a la que se calentó la solución líquida de BSA al 25 %. El tiempo indica la duración durante la cual se calentó la solución de BSA y después se probó la fase sólida/líquida antes de enfriarse a temperatura ambiente. S = sólida; L = líquida; semi-S = semisólida.

En la figura 7 se muestran los resultados de evaluar los efectos del tiempo, la temperatura y la concentración de BSA en la formación de gel de BSA. La temperatura indica la temperatura a la que se calentó la solución líquida de BSA. El tiempo indica la duración durante la cual se calentó la solución de BSA y después se probó la fase sólida/líquida antes de enfriarse a temperatura ambiente. El porcentaje indica la concentración de BSA en una solución líquida de BSA/PBS. S = sólida; L = líquida; d/n = durante la noche.

En la figura 8 se muestra la tinción IHC de geles hechos de BSA, proteína de clara de huevo o gelatina con (fila inferior) o sin (fila superior) IgG de conejo, detectada utilizando un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo. En la figura 9 se muestran los geles no homogéneos hechos de lactoalbúmina, polvo de proteína de hígado o harina de soja con (fila inferior) o sin (fila superior) IgG de conejo.

En la figura 10 se muestra que los geles elaborados con caseína o leche desnatada en polvo con (fila inferior) o sin (fila superior) IgG de conejo no se adhirieron a los portaobjetos de vidrio para la tinción IHC.

En las figuras 11A a 11D se muestran los resultados de dos experimentos separados utilizando ensayos cromogénicos para examinar la distribución de antígenos en geles. Se tiñeron secciones de "bloque donante" de cuatro micrómetros de espesor de gel de BSA que contiene péptido BCL2 5 * 10-5M (filas superiores en las figuras 11A y 11C) o sin péptido (filas inferiores en figuras l lA y 11C) con el clon 124 anti-BCL2 en dos experimentos separados (Experimento 1: columnas de la izquierda en las figuras 11A y 11C; Experimento 2: columnas de la derecha en las figuras 11A y 11C). Las imágenes digitales de las secciones teñidas se cuantificaron a lo largo de los ejes horizontal (Figura 11A) y vertical (Figura 11C) con la función Plot Profile en ImageJ. Los resultados se muestran en la figura 11B y la figura 11D, respectivamente. Los experimentos 1 y 2 se indican en negro y gris, respectivamente. Los datos para las secciones de control del péptido BCL2 y solo BSA se indican en líneas continuas y discontinuas, respectivamente.

En las figuras 12A a 12E se muestran los resultados del análisis IHC de BCL2 utilizando una TMA del péptido BCL2. (Figura 12A) Una sección de micromatriz de tejido teñida con el clon 124 anti-BCL2 incluye núcleos de TMA duplicados que no contienen péptido añadido (BSA) o que contienen una serie de diluciones de péptidos que codifican los aminoácidos 41 a 54 de la proteína BCL2 o un péptido de control negativo de la proteína MCL1 humana en las concentraciones indicadas. Las imágenes de las filas BCL2 y MCL1 son diferentes campos de visión de la misma sección de TMA. Los núcleos de la TMA tienen 1 mm de diámetro. Una sección en serie de la misma TMA descrita en la figura 12A se tiñe con el clon 124 anti-BCL2 mediante detección inmunofluorescente (Figura 12B) o con el clon EPR17509 anti-BCL2 mediante detección cromogénica (Figura 12C). (Figura 12D) Cuantificación de la señal en núcleos individuales que contienen péptido BCL2 (círculos) o péptido MCL1 (cuadrados), como se muestra en las figuras 12A a 12C. (Figura 12E) Los parámetros relevantes para las curvas mostradas en la figura 12D. El parámetro HillSlope transmite la inclinación de la curva. ACHM es la concentración de antígeno a la mitad de la señal máxima.

En la figura 13A se muestran secciones secuenciales de una sola micromatriz de tejido que contiene núcleos de gel de BSA que no tiene péptido añadido (BSA) o que tiene péptido que codifica los aminoácidos 41 a 54 de la proteína BCL2 o un péptido de control negativo de la proteína MCL1 humana. Dos portaobjetos se tiñeron de manera cromogénica para el antígeno BCL2 utilizando el clon SP66 o el clon E17 anti-BCL2. En la figura 13B se muestra la cuantificación de las imágenes ilustradas en la figura 13A.

En las figuras 14A a 14C se muestra la reproducibilidad de las secciones replicadas. (Figura 14A) Imágenes de seis secciones en serie de una sola micromatriz de tejido que contiene núcleos de TMA duplicados sin péptido añadido (BSA) o con péptido que codifica los aminoácidos 41 a 54 de la proteína BCL2. Cada portaobjetos se tiñó para BCL2 con el clon 124 en seis días diferentes por dos operadores. El operador 1 tiñó el desarrollo 1; el operador 2 tiñó los desarrollos 2 a 6. (Figura 14B) Cuantificación de las imágenes ilustradas en la figura 14A. Se muestra la señal promedio de núcleos duplicados en cada concentración de péptido en cada uno de las seis TMA. (Figura 14C) La tabla resume los parámetros importantes para las curvas mostradas en la figura 14B. En las figuras 15A a 15C se muestra la tinción IHC para el péptido BCL2 con y sin recuperación de antígeno. (Figura 15A) La TMA contenía núcleos de gel de BSA sin péptido añadido (BSA) o con péptidos que codifican los aminoácidos 41 a 54 de la proteína BCL2 en las concentraciones indicadas. Las secciones se tiñeron con (RA) o sin (Sin RA) antes de la recuperación del antígeno. (Figura 15B) Cuantificación de las imágenes mostradas en la figura 15A. Cuadrados sólidos: con recuperación de antígeno; cuadrados blancos: sin recuperación de antígeno. Se muestran las señales promedio de núcleos duplicados en cada concentración de péptido. (Figura 15C) La tabla resume los parámetros importantes para las curvas mostradas en la figura 15B. En las figuras 16A a 16C se muestra que los extremos N y C del péptido BCL2 alternativo afectan la intensidad de la señal. (Figura 16A) Imágenes de una sola sección de TMA que contiene núcleos de gel de BSA duplicados sin péptido añadido (BSA) o con péptidos de 22 aminoácidos que codifican los aminoácidos 41 a 54 de la proteína BCL2 (filas I a V) flanqueados por la secuencia de tres aminoácidos, GSG, con aminoácidos amino y carboxiterminales alternativos (acetil-N, C-amida) como se indica. (Figura 16B) Cuantificación de las imágenes ilustradas en la figura 16A. Se muestra la señal promedio de núcleos duplicados en cada concentración de péptido. (Figura 16C) La tabla resume los parámetros importantes para las curvas mostradas en la figura 16B. En las figuras 17A a 17E se muestra la tinción IHC de los péptidos BCL2 y MYC. (Figura 17A) Secciones de bloques donantes que contienen péptidos 2,5 * 10'4 M de MYC humano como se indica. La barra de escala es de 1 mm. (Figuras 17B y 17C) Una sola sección de TMA teñida con el clon 124 anti-BCL2 (Figura 17B) o el clon Y69 anti-MYC (Figura 17C) incluye núcleos duplicados formulados para no contener péptidos (BSA), o contener péptidos que codifican los aminoácidos 41 a 54 de BCL2 y los aminoácidos 9 a 24 de MYC. (Figura 17D) Cuantificación de las imágenes mostradas en las figuras 17B y 17C. Se muestran las señales promedio de núcleos duplicados en cada concentración de péptido. (Figura 17E) Los parámetros importantes para las curvas mostradas en la figura 17D.

En las figuras 18A a 18C se muestra el análisis de imágenes de inmunofluorescencia (IF) doble MYC/BCL2. (Figura 18A) Una sola sección de una TMA que incluía núcleos sin péptido (BSA) o con péptidos que codifican los aminoácidos 41 a 54 de BCL2 y los aminoácidos 9 a 24 de MYC en las concentraciones indicadas. La sección se tiñó de manera secuencial con el clon 124 anti-BCL2 y el clon Y69 anti-MYC, detectada con los kits Ventana Discovery FAM (BCL2; verde) o Discovery Cy5 (MYC; rojo), después se tomaron imágenes en las longitudes de onda apropiadas para cada fluorocromo. (Figura 18B) Cuantificación de las imágenes ilustradas en la figura 18A. Se muestran las señales promedio de núcleos duplicados en cada concentración de péptido. Las barras de error indican una desviación típica de ±1. (Figura 18C) La tabla resume los parámetros importantes para las curvas mostradas en la figura 18B.

En las figuras 19A y 19B se muestran datos añadidos del clon 124 anti-BCL2. (Figura 19A) Los datos de las figuras 12A a 12E y 14A a 17E (n = 10 ensayos IHC independientes, cada uno con núcleos duplicados en cada concentración de péptido) se agruparon y representaron gráficamente. Las barras de error representan 1 desviación típica (n = 10). (Figura 19B) Los parámetros importantes para los datos en la figura 19A.

Las figuras 20A y 20B analizan los anticuerpos examinados en las figuras 5A a 5D contra KSR2 humano para tinción con y sin recuperación de antígeno. Las imágenes en la figura 20A muestran secciones de gel de BSA que no contienen proteína (BSA) o con la proteína de interés 6,3*10"6M teñida con una selección de anticuerpos de ratón con (RA) o sin (Sin RA) recuperación previa del antígeno. La figura 20B proporciona la cuantificación de los resultados mostrados en la figura 20A.

En las figuras 21A y 21B se muestran geles de BSA con IgG ratón, de rata y de conejo. (Figura 21A) Las secciones en serie de una TMA compuesta por núcleos de gel de BSA duplicados que contienen IgG de conejo, de rata o de ratón sin tratamiento previo (0,1 mg/ml; 6,7 * 10-7 M) se tiñeron con anticuerpos secundarios de burro específicos para IgG de las especies indicadas. Los núcleos de la TMA tienen 1 mm de diámetro. (Figura 21B) Cuantificación de las imágenes mostradas en la figura 21A: antígeno IgG de conejo (barras sólidas); IgG de rata (barras discontinuas); IgG de ratón (barras abiertas). Para cada anticuerpo específico de especie, la señal en los núcleos que contenían la IgG diana fue significativamente mayor que en los núcleos que contenían las IgG no diana (p <0,0001). Las barras de error son 1 DT. Hay que tener en cuenta que estos datos también se muestran en la figura 3C.

En las figuras 22A a 22C se muestran los resultados de generar geles peptídicos utilizando fijadores alternativos. (Figura 22A) Los núcleos donantes se prepararon con péptido BCL2 o MYC mediante calentamiento durante 10min a 85 °C en presencia de formaldehído al 18,5% o fijador de zinc al 50%. Los bloques donantes se formularon para que no contuvieran péptido (BSA) o para contener péptidos que codifican los aminoácidos 41 a 54 de BCL2 y los aminoácidos 9 a 24 de MYC. Las secciones se tiñeron con el clon 124 anti-BCL2 o el clon Y69 anti-MYC según corresponda. (Figura 22B) Cuantificación de las imágenes ilustradas en la figura 22A. (Figura 22C) Los parámetros importantes para las curvas mostradas en la figura 22B.

En las figuras 23A y 23B se muestran los resultados de las pruebas con fijadores alternativos. (Figura 23A) Los geles de BSA que contenían el péptido BCL2 se prepararon mediante el calentamiento a 85 °C en presencia de un fijador que contenía zinc (Zn y calor) o formaldehído concentrado (Form. al 37 % y calor) o el calentamiento a 85 °C en ausencia de fijador, después se fijaron a temperatura ambiente en un fijador que contenía zinc (Calor, Zn), PFA al 4 % (Calor, PFA al 4 %) o formalina tamponada neutra (Calor, NBF). (Figura 23B) Cuantificación de las imágenes en la figura 23A.

En las figuras 24A a 24C se muestra el análisis de citometría de masas de imágenes de la TMA del péptido BCL2. (Figura 24A) Campos de visión representativos (aprox. 150 micrómetros cuadrados) de secciones de TMA teñidas con el clon EPR17509 anti-BCL2 conjugado con un marcador 146Nd de espectrometría de masas y con imágenes de un espectrómetro de masas de barrido Fluidigm Hyperion. Los núcleos de TMA duplicados no contenían péptido añadido (BSA) o contenían péptido que codifica los aminoácidos 41 a 54 de la proteína BCL2 o un péptido de control negativo de la proteína MCL1 humana en las concentraciones indicadas. (Figura 24B) Cuantificación de las imágenes mostradas en la figura 24A. Las barras de error indican 1 desviación típica. (Figura 24C) La tabla resume los parámetros importantes para las curvas mostradas en la figura 24B. El parámetro HillSlope transmite la inclinación de la curva. ACHM es la concentración de antígeno a la mitad de la señal máxima.

Descripción detallada

I. Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención.

El término "péptido" o "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje o toxina. En la definición también se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la materia. Los términos "polipéptido" y "proteína", tal como se utilizan en el presente documento, abarcan de manera específica anticuerpos.

En el presente documento, el término "antígeno" se utiliza en el sentido más amplio y abarca varias formas de antígenos polipeptídicos y no polipeptídicos, que incluyen, sin limitación, pequeños antígenos peptídicos, antígenos de proteína de longitud completa, antígenos glucídicos, antígenos lipídicos y antígenos de ácidos nucleicos.

El término "anticuerpo" se utiliza en el presente documento en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo, que incluyen, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se utiliza indistintamente con anticuerpo en el presente documento.

Un antígeno "purificado" se refiere a un antígeno que ha aumentado su pureza, de tal manera que existe en una forma que es más pura que la que existe en su entorno natural y/o cuando se produce y/o sintetiza y/o amplifica inicialmente en condiciones de laboratorio. La pureza es un término relativo y no necesariamente significa pureza absoluta. En algunas realizaciones, el antígeno se purifica con una pureza de al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 %.

II. Geles sólidos de antígeno/proteína transportadora y métodos de producción

La presente divulgación se refiere a geles sólidos de antígeno/proteína transportadora, así como a métodos para generar un gel sólido de antígeno/proteína transportadora.

La presente divulgación proporciona un gel sólido de antígeno/proteína transportadora que comprende un antígeno purificado y una proteína transportadora que es una proteína seroalbúmina. El antígeno purificado se entrecruza con la proteína transportadora. Como se describe a continuación, estos geles pueden encontrar uso, por ejemplo, como control para tinción IHC o análisis de imágenes de EM.

En algunas realizaciones, la proteína seroalbúmina es una proteína seroalbúmina de mamíferos. Los ejemplos de proteínas seroalbúmina incluyen, sin limitación, seroalbúmina de ratón, de rata, de cobaya, de conejo, porcina, bovina, de cabra, de oveja, de caballo y humana.

En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora comprende la proteína transportadora en una concentración superior o igual al 0,5 %, al 1 %, al 2 %, al 5 %, al 7 %, al 10 %, al 15 % o al 20 % (p/v). En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora comprende la proteína transportadora en una concentración inferior o igual al 25 %, al 20 %, al 15 %, al 10 %, al 7 %, al 5 %, al 2 % o al 1 % (p/v). Es decir, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora puede comprender la proteína transportadora en cualquier concentración de un intervalo de concentraciones que tiene un límite superior del 25 %, el 20 %, el 15 %, el 10 %, el 7 %, el 5 %, el 2 % o el 1 % (p/v) y un límite inferior seleccionado de manera independiente del 0,5 %, el 1 %, el 2 %, el 5 %, el 7 %, el 10 %, el 15 % o el 20 % (p/v), en donde el límite inferior es menor que el límite superior. En algunas realizaciones, la proteína transportadora comprende una proteína albúmina (por ejemplo, una proteína seroalbúmina) y el gel sólido de antígeno/proteína transportadora comprende la proteína transportadora en más del 2 % (p/v), por ejemplo, entre el 2 % y el 25 % (p/v). En algunas realizaciones, la proteína transportadora comprende una proteína de clara de huevo o una mezcla de proteínas de clara de huevo y el gel sólido de antígeno/proteína transportadora comprende la proteína transportadora en más del 2 % (p/v), por ejemplo, entre el 2 % y el 25 % (p/v). En algunas realizaciones, la proteína transportadora comprende gelatina y el gel sólido de antígeno/proteína transportadora comprende la proteína transportadora en más del 0,5 % (p/v), por ejemplo, entre el 0,5 % y el 25 % (p/v) o aproximadamente un 10 % (p/v).

En algunos casos, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora contiene el antígeno a una concentración de al menos aproximadamente 25 nM. En otra realización, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora contiene el antígeno a una concentración de aproximadamente 25 nM. En aún otra realización, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora contiene el antígeno a una concentración de aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 80, 90 o 100 nM, o más. En otra realización, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora contiene el antígeno a una concentración de al menos aproximadamente: 10 nM, 15 nM, 20 nM o de 25 nM a aproximadamente 100 nM. Como se describe en el presente documento, un gel sólido de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación puede comprender el antígeno en un amplio intervalo de concentraciones, dependiendo, por ejemplo, de la sensibilidad del método de detección, la aplicación deseada del gel, etc.

En una realización, los métodos incluyen dos o más geles de antígeno/proteína transportadora. En una realización, se utilizan dos geles donde cada gel tiene de manera opcional una concentración diferente de antígeno. En otra realización, se utilizan tres geles donde cada gel tiene de manera opcional una concentración diferente de antígeno. De hecho, múltiples geles que comprenden un antígeno a diferentes concentraciones pueden ser útiles, por ejemplo, como control para la tinción IHC para representar un intervalo de concentraciones de antígeno.

En la invención, el antígeno es un antígeno polipeptídico (por ejemplo, un antígeno peptídico o un antígeno proteico de longitud completa). En algunas realizaciones, el antígeno polipeptídico comprende una tirosina aminoterminal, una cisteína carboxiterminal o ambas (por ejemplo, para la reticulación químico del antígeno con una proteína transportadora). En algunas realizaciones, la tirosina aminoterminal y/o la cisteína carboxiterminal se entrecruzan con la proteína transportadora. Por ejemplo, se puede utilizar una cisteína carboxiterminal para entrecruzar el antígeno con la proteína transportadora. Se conocen en la materia varios reactivos que reaccionan con la cisteína e incluyen, sin limitación, grupos reactivos de reticulación reactivos con sulfhidrilo tales como haloacetilos, maleimidas (por ejemplo, sulfo-SMCC y sus análogos), aziridinas, acriloílos, agentes de arilación, vinilsulfonas, disulfuros de piridilo, TNB-tioles y agentes reductores de disulfuro.

En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se ha fijado con un fijador, por ejemplo, como se describe a continuación. En algunas realizaciones, el fijador es un fijador de reticulación (por ejemplo, un fijador a base de aldehído). En algunas realizaciones, el fijador no es un fijador de reticulación (por ejemplo, un fijador precipitante, tal como el de Carnoy). Como se describe en el presente documento, se puede preparar un gel sólido que contiene una proteína transportadora y un antígeno mediante la desnaturalización y precipitación de la proteína transportadora y/o el antígeno mediante calentamiento, o mediante la adición de un fijador precipitante a la mezcla, lo que provoca que el antígeno se inmovilice en el gel de proteína. Para algunos antígenos (particularmente aquellos de pequeño tamaño molecular), se cree que la reticulación del antígeno con la proteína transportadora (ya sea durante el proceso de formación de un gel mediante la desnaturalización de la proteína transportadora o después de él) ayuda a retener al antígeno en el gel y en las secciones resultantes, por ejemplo, durante los procesos de inclusión, seccionamiento y/o tinción.

En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora tiene un espesor de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 50 pm. Un espesor adecuado para el gel sólido de antígeno/proteína transportadora puede depender, por ejemplo, de la aplicación. En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora tiene un espesor mayor o igual a aproximadamente 0,03, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 o 48 pm. En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora tiene un espesor menor o igual a aproximadamente 50, 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 o 1 pm. Es decir, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora puede tener un espesor con un límite superior de 50, 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 o 1 pm y un límite inferior seleccionado de manera independiente de 0,03, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 o 48 pm, en donde el límite inferior es menor que el límite superior. Por ejemplo, un gel sólido de antígeno/proteína transportadora utilizado para la tinción IHC puede tener un espesor, por ejemplo, de entre aproximadamente 2 pm y aproximadamente 30 pm, mientras que un gel sólido de antígeno/proteína transportadora utilizado para EM puede tener un espesor, por ejemplo, de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 50 pm o entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 100 nm. Los métodos para cortar un gel sólido de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación se describen a continuación.

En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se ha sometido a recuperación de antígeno. Los métodos ilustrativos para la recuperación de antígenos se describen con mayor detalle a continuación.

En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora está incluido en un medio de la presente divulgación, tal como parafina (por ejemplo, inclusión en un bloque de parafina); resina epoxi, acrílica o plástica (por ejemplo, resinas EPON™, metacrilato, resina blanca LR, Araldite®, plástico Spurr, LOWICRYL® y similares); ceras sintéticas; mezclas de cera de parafina y polímeros plásticos o aleaciones de copolímeros; polietilenglicol; o medio de inclusión GACH (glutaraldehído-carbohidrazida). En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se fija a un sustrato sólido, que incluye, sin limitación, un portaobjetos de vidrio (por ejemplo, para IHC), soporte, cuadrícula o portamuestra (por ejemplo, para EM).

En la invención, el método para generar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora comprende mezclar un antígeno purificado con una solución líquida que comprende una proteína transportadora para producir una solución líquida de antígeno/proteína transportadora y calentar la solución líquida de antígeno/proteína transportadora para formar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora.

En algunas realizaciones, la solución líquida de antígeno/proteína transportadora comprende la proteína transportadora a una concentración superior o igual al 0,5 %, al 1 %, al 2 %, al 5 %, al 7 %, al 10 %, al 15 % o al 20 % (p/v). En algunas realizaciones, la solución líquida de antígeno/proteína transportadora comprende la proteína transportadora a una concentración inferior o igual al 25 %, al 20 %, al 15 %, al 10 %, al 7 %, al 5 %, al 2 % o al 1 % (p/v). Es decir, la solución líquida de antígeno/proteína transportadora puede comprender la proteína transportadora a cualquier concentración de un intervalo de concentraciones que tiene un límite superior del 25 %, el 20 %, el 15 %, el 10 %, el 7 %, el 5 %, el 2 % o el 1 % (p/v) y un límite inferior seleccionado de manera independiente del 0,5 %, el 1 %, el 2 %, el 5 %, el 7 %, el 10 %, el 15 % o el 20 % (p/v), en donde el límite inferior es menor que el límite superior. En algunas realizaciones, la solución líquida de antígeno/proteína transportadora comprende la proteína transportadora en más del 2 % (p/v), por ejemplo, entre el 2 % y el 25 % (p/v).

En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación incluyen (por ejemplo, antes de calentar la solución líquida de antígeno/proteína transportadora) entrecruzar el antígeno con la proteína transportadora utilizando un reactivo que reacciona con la cisteína. Se conocen en la materia varios reactivos que reaccionan con la cisteína e incluyen, sin limitación, grupos reactivos de reticulación reactivos con sulfhidrilo tales como haloacetilos, maleimidas (por ejemplo, sulfo-SMCC y sus análogos), aziridinas, acriloílos, agentes de arilación, vinilsulfonas, disulfuros de piridilo, TNB-tioles y agentes reductores de disulfuro.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación incluyen la fijación del antígeno con la proteína transportadora. En algunas realizaciones, se incluye un fijador en la solución líquida de antígeno/proteína transportadora. En algunas realizaciones, el fijador es un fijador de reticulación. En algunas realizaciones, el fijador es un fijador que no se entrecruza. Los ejemplos de fijadores adecuados incluyen, sin limitación, formaldehído, formalina, paraformaldehído (PFA), glutaraldehído, fijador de Davidson, fijador de Bouin, fijador de Karnovski (por ejemplo, fijador de Karnovski diluido 1^), solución de Zenker, solución de Helly, solución de Carnoy, formalina de zinc, formalina tamponada neutra (NBF), periodato-lisina-paraformaldehído (PLP), fijador de Zamboni, suberimidato de dimetilo (DMS), acetona, alcoholes (por ejemplo, metanol o etanol) y sales de zinc (por ejemplo, acetato de zinc, cloruro de zinc, trifluoroacetato de zinc, etc.). En determinadas realizaciones, el fijador comprende formaldehído (por ejemplo, a una concentración de al menos aproximadamente un 1 % o al menos aproximadamente un 2 %).

En algunas realizaciones, el antígeno se entrecruza con la proteína transportadora utilizando química selectiva, que incluye, sin limitación, la adición de azida-alquino. En algunas realizaciones, la química selectiva se utiliza para entrecruzar un antígeno no proteico con la proteína transportadora, por ejemplo, un antígeno glucídico o lipídico.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación incluyen la deshidratación del gel sólido de antígeno/proteína transportadora. Los compuestos adecuados para la deshidratación son conocidos en la materia y pueden incluir, por ejemplo, alcoholes tales como etanol o metanol. En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación incluyen la inclusión del gel sólido de antígeno/proteína transportadora. En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se incluye después de la deshidratación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se deshidrata mediante la exposición a una secuencia de alcoholes crecientes o graduados (por ejemplo, una secuencia de concentraciones crecientes de etanol), seguido de intercambio de alcoholes por xileno e intercambio de xileno por parafina. En la materia se conocen varios medios que se pueden utilizar para la inclusión, que incluyen, sin limitación, parafina (por ejemplo, inclusión en un bloque de parafina); resina epoxi, acrílica o plástica (por ejemplo, resinas EPON™, metacrilato, resina blanca LR, Araldite®, plástico Spurr, LOWICRYL® y similares); ceras sintéticas; mezclas de cera de parafina y polímeros plásticos o aleaciones de copolímeros; polietilenglicol; y medio de inclusión GACH (glutaraldehído-carbohidrazida).

En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación incluyen la incubación del gel sólido de antígeno/proteína transportadora en un medio de inclusión (por ejemplo, un medio de inclusión líquido). Se conocen en la materia varios medios de inclusión y pueden incluir, sin limitación, el compuesto Optimum Cutting Temperature (OCT) (por ejemplo, el compuesto OCT Tissue-Tek® o el compuesto OCT Tissue-plus®), el compuesto de crioincrustación PELCO®, el medio de inclusión PolarStat™ o PolarStat Plus™ y el medio de congelación de tejidos o TFM™. Estos medios de inclusión pueden contener, por ejemplo, resinas y glicoles solubles en agua; el compuesto OCT del medio de inclusión ilustrativo que incluye del 5 al 15 % de alcohol polivinílico y del 1 al 10 % de polietilenglicol. En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación incluyen la congelación del gel sólido de antígeno/proteína transportadora (por ejemplo, después de incubar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora en un medio de inclusión). En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación incluyen la congelación de un gel sólido de antígeno/proteína transportadora que no se ha fijado (por ejemplo, que no incluye un fijador), de forma similar a la preparación de muestras de tejido fresco congeladas y sin fijar.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación incluyen cortar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora en una o más secciones de gel sólido de antígeno/proteína transportadora. En algunas realizaciones, las una o más secciones de gel sólido de antígeno/proteína transportadora tienen un espesor de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 50 pm. En algunas realizaciones, las una o más secciones de gel sólido de antígeno/proteína transportadora tienen un espesor superior o igual a aproximadamente 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 o 48 pm. En algunas realizaciones, las una o más secciones de gel sólido de antígeno/proteína transportadora tienen un espesor inferior o igual a aproximadamente 50, 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 pm. Es decir, las una o más secciones de gel sólido de antígeno/proteína transportadora pueden tener un espesor que tiene un límite superior de 50, 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 pm y un límite inferior seleccionado de manera independiente de 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 o 48 pm, en donde el límite inferior es menor que el límite superior. Por ejemplo, una sección de gel sólido de antígeno/proteína transportadora utilizada para la tinción IHC puede tener un espesor, por ejemplo, de entre aproximadamente 2 pm y aproximadamente 30 pm, mientras que una sección de gel sólido de antígeno/proteína transportadora utilizada para EM puede tener un espesor, por ejemplo, de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 50 pm o entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 100 nm. Los instrumentos para cortar un gel sólido de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación son conocidos en la materia y pueden incluir, sin limitación, un micrótomo, criostato (para geles congelados), cuchilla (por ejemplo, diamante, vidrio o zafiro) y similares. En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se deshidrata, incluye, fija, congela o una combinación de los mismos antes del corte.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación incluyen someter el gel sólido de antígeno/proteína transportadora a la recuperación de antígeno. En la materia se conocen varios métodos de recuperación de antígenos. En algunas realizaciones, someter el gel sólido de antígeno/proteína transportadora a la recuperación de antígeno comprende calentar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora en una solución líquida (por ejemplo, recuperación de epítopos inducida por calor), tal como mediante ebullición. En algunas realizaciones, la solución líquida comprende un tampón, tal como Tris/EDTA o tampón de citrato de sodio. En algunas realizaciones, someter al gel sólido de antígeno/proteína transportadora a la recuperación de antígeno comprende el tratamiento con una o más enzimas proteolíticas (por ejemplo, tripsina, proteinasa K, pepsina, ficina o pronasa) o con reactivos de recuperación de antígenos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido fórmico, dodecil sulfato de sodio (SDS), tampón citrato, EDTA, citrato-EDTA, Tris, Tris-EDTA, Tris-HCl, solución salina tamponada con Tris o anhídrido citracónico). Para obtener descripciones adicionales de la recuperación de antígenos, véase, por ejemplo, Shi, S. R. et al. (2011) J. Histochem. Cytochem. 59:13-32.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación incluyen el bloqueo de un gel sólido de antígeno/proteína transportadora. Tal como se conoce en la materia, el bloqueo (por ejemplo, antes de la tinción IHC) reduce las interacciones no específicas con antígenos al impedir la unión a sitios no relacionados con interacciones específicas antígeno:anticuerpo. Se conocen en la materia varios reactivos de bloqueo adecuados y pueden incluir, sin limitación, suero o una solución de proteínas (por ejemplo, que comprende una proteína seroalbúmina, gelatina, leche desnatada en polvo o similares).

En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación incluyen fijar un gel sólido de antígeno/proteína transportadora (por ejemplo, mediante la inclusión de un fijador en la solución líquida de antígeno/proteína transportadora), deshidratar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora, incluir el gel sólido de antígeno/proteína transportadora deshidratado, cortar el bloque de parafina con el gel sólido de antígeno/proteína transportadora incluido en una o más secciones, someter la una o más secciones a recuperación de antígeno y bloquear la una o más secciones después de la recuperación de antígeno. En otras realizaciones, los métodos de la presente divulgación incluyen incubar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora en un medio de inclusión líquido, congelar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora en el medio de inclusión, cortar el gel de antígeno/proteína transportadora congelado en una o más secciones y bloquear la una o más secciones.

Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a micromatrices de tejido (TMA) que comprenden uno, dos o más geles sólidos de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación. Por ejemplo, una TMA de la presente divulgación se puede preparar mediante la preparación de un gel sólido de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación (por ejemplo, incluido en un bloque de parafina como se describe anteriormente), la perforación de un núcleo que comprende el gel sólido de antígeno/proteína transportadora y la transferencia del núcleo a una TMA receptora. En algunas realizaciones, el núcleo tiene un diámetro de aproximadamente 1 mm. Se describe un método ilustrativo para preparar una TMA a continuación, por ejemplo, mediante la transferencia de núcleos de un bloque de parafina donante a un bloque de TMA receptora, a continuación, el calentamiento (por ejemplo, a 37 °C durante la noche, después a 70 °C durante 10 minutos), el enfriado y la sección del bloque de TMA receptora. En algunas realizaciones, las TMA incluyen dos o más geles sólidos de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación con diferentes antígenos. En algunas realizaciones, las t Ma incluyen dos o más geles sólidos de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación con el mismo antígeno a diferentes concentraciones. En algunas realizaciones, la TMA comprende además una o más referencias de orientación, por ejemplo, que comprende un pigmento coloreado para su identificación. En algunas realizaciones, la TMA es una sección de TMA en un portaobjetos de histología. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que los geles sólidos de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación son particularmente ventajosos para su uso en TMA, por ejemplo, para proporcionar un intervalo de concentraciones y/o tipos de epítopos. Este intervalo también se puede proporcionar junto a una sección de tejido, permitiendo así una referencia conveniente para los análisis cuantitativos.

III. Usos de los geles sólidos de antígeno/proteína transportadora

Los geles sólidos de antígeno/proteína transportadora (por ejemplo, como se describe en la sección II anterior y/o ejemplificados en los ejemplos a continuación) pueden encontrar uso en varias aplicaciones, incluidas, pero sin limitación, controles para análisis de IHC o EM.

En algunas realizaciones, un método para controlar la tinción inmunohistoquímica (IHC) de un antígeno comprende proporcionar múltiples geles sólidos de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, etc.) que representan diferentes concentraciones de un antígeno de interés. Por ejemplo, los métodos pueden incluir proporcionar dos geles sólidos de antígeno/proteína transportadora elaborados con diferentes concentraciones de un antígeno purificado. En algunas realizaciones, los métodos incluyen poner en contacto los geles sólidos de antígeno/proteína transportadora con un anticuerpo primario que se une de manera específica al antígeno y se acopla a una fracción detectable. En otras realizaciones, los métodos incluyen poner en contacto los geles sólidos de antígeno/proteína transportadora con un anticuerpo primario que se une de manera específica al antígeno, después, poner en contacto los geles sólidos de antígeno/proteína transportadora con un anticuerpo secundario que se une de manera específica al antígeno primario y se acopla a una fracción detectable. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además la detección de señal(es) de la fracción detectable de uno o más de los múltiples geles sólidos de antígeno/proteína transportadora. La cantidad de señal detectada a partir de los múltiples geles sólidos de antígeno/proteína transportadora puede detectarse y, opcionalmente, compararse con la cantidad o concentración de antígeno presente en cada uno de los múltiples geles sólidos de antígeno/proteína transportadora para proporcionar una tinción IHC de control del antígeno a varios niveles.

En algunas realizaciones, uno de los geles de antígeno/proteína transportadora no contiene antígeno (por ejemplo, 0 nM) y la ausencia de una señal detectable de la tinción IHC de este gel indica un control negativo o tinción IHC de fondo de la muestra. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además poner en contacto una muestra con el anticuerpo primario que se une de manera específica al antígeno y se acopla a una fracción detectable, o con el anticuerpo primario que se une de manera específica al antígeno y con el anticuerpo secundario que se une de manera específica al antígeno primario y se acopla a una fracción detectable, y detectar una señal de la fracción detectable de la muestra. Por tanto, la cantidad de señal detectada de la muestra se puede comparar con la cantidad de señal(es) detectada(s) del gel(es) sólido de antígeno/proteína transportadora, por ejemplo, para comparar la cantidad de antígeno presente en la muestra con concentraciones o cantidades conocidas de antígeno presente en los geles sólidos de antígeno/proteína transportadora.

En algunas realizaciones, un método de tinción inmunohistoquímica (IHC) de control con un anticuerpo secundario comprende proporcionar múltiples geles sólidos de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, etc.) que representan diferentes isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, los métodos pueden incluir proporcionar dos geles sólidos de antígeno/proteína transportadora elaborados con anticuerpos que representan diferentes isotipos de anticuerpos. En algunas realizaciones, los métodos incluyen poner en contacto los geles sólidos de antígeno/proteína transportadora con un anticuerpo secundario que se une de manera específica a uno de los isotipos de anticuerpo y se conjuga con una fracción detectable. Para la tinción de control del anticuerpo secundario, la señal se puede detectar a partir de los múltiples geles sólidos de antígeno/proteína transportadora. En este ejemplo, el anticuerpo secundario se une de manera específica al isotipo de anticuerpo afín y cualquier señal detectada en un gel que carece del isotipo de anticuerpo afín indica una tinción de fondo. Por lo tanto, la detección de la señal asociada al gel sólido de antígeno/proteína transportadora que contiene el isotipo de anticuerpo afín y la ausencia de la señal asociada al gel sólido de antígeno/proteína transportadora que carece del isotipo de anticuerpo afín indica una tinción de control con el anticuerpo secundario.

En algunas realizaciones, un método para la tinción inmunohistoquímica (IHC) de un antígeno comprende proporcionar uno o más geles sólidos de antígeno/proteína transportadora que contienen el antígeno y una muestra; poner en contacto el gel sólido de antígeno/proteína transportadora y la muestra con un anticuerpo primario que se une de manera específica al antígeno y se acopla a una fracción detectable, o poner en contacto el gel sólido de antígeno/proteína transportadora y la muestra con un anticuerpo primario que se une de manera específica al antígeno y poner en contacto el gel sólido de antígeno/proteína transportadora y la muestra con un anticuerpo secundario que se une de manera específica al anticuerpo primario y se acopla a una fracción detectable; detectar una señal de la fracción detectable del gel sólido de antígeno/proteína transportadora; y detectar una señal de la fracción detectable de la muestra. Por lo tanto, el uno o más geles sólidos de antígeno/proteína transportadora se pueden utilizar como control positivo para la tinción IHC de la muestra.

Un diagrama de flujo ilustrativo para el proceso 100 para la tinción IHC de un antígeno, tal como un antígeno en una muestra y en un gel sólido de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación (utilizado como control para la tinción de la muestra para el antígeno) se muestra en la figura 1. En el bloque 102, se recoge tejido para proporcionar una muestra para el análisis y/o se produce un gel sólido de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación (por ejemplo, como se describe en la sección II anterior). En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora contiene un antígeno (por ejemplo, un antígeno purificado) de interés, que pueden estar también presentes en la muestra o no. Opcionalmente, en el bloque 104, se fija la muestra y/o el gel sólido de antígeno/proteína transportadora (por ejemplo, como se describe en la sección II anterior). En algunas realizaciones, el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se incuba con un fijador. En otras realizaciones, la solución líquida de antígeno/proteína transportadora utilizada para preparar el gel sólido comprende un fijador. Opcionalmente, en el bloque 106, se incluye la muestra y/o el gel sólido de antígeno/proteína transportadora (por ejemplo, como se describe en la sección II anterior). Como alternativa opcional al bloque 104, en el bloque 106, la muestra y/o el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se pueden congelar en un medio de inclusión. Opcionalmente, en el bloque 108, se seccionan la muestra y/o el gel sólido de antígeno/proteína transportadora (por ejemplo, como se describe en la sección II anterior). Opcionalmente, en el bloque 110, la muestra y/o el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se someten a la recuperación del antígeno y a bloqueo (por ejemplo, como se describe en la sección II anterior).

En algunas realizaciones, como se muestra en el bloque 112, la muestra y el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se ponen en contacto con un anticuerpo primario que se une de manera específica al antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo primario puede comprender una fracción detectable. En otras realizaciones, como se muestra en el bloque 114, la muestra y el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se ponen en contacto con un anticuerpo secundario que se une de manera específica al anticuerpo primario. En algunas realizaciones, el anticuerpo secundario comprende una fracción detectable conjugada con el anticuerpo secundario (en este ejemplo, biotina).

En algunas realizaciones, se detecta una señal de la fracción detectable a partir de la muestra y/o del gen sólido de antígeno/proteína transportadora. Como se describe a continuación, se contempla varias fracciones detectables. En este ejemplo, se utiliza un método de detección cromogénico. En el bloque 116, la muestra y el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se ponen en contacto con un complejo enzimático que se une al anticuerpo secundario (por ejemplo, un complejo enzimático conjugado con estreptavidina que se une a un anticuerpo secundario biotinilado). En el bloque 118, la muestra y el gel sólido de antígeno/proteína transportadora se ponen en contacto con un sustrato cromogénico o una solución cromogénica que, tras la incubación con el complejo enzimático, conduce a la formación de un precipitado coloreado que indica la presencia del antígeno en el gel sólido de antígeno/proteína transportadora y, si el antígeno está presente, de la muestra.

En algunas realizaciones, la presencia de un antígeno en un gel sólido de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación se detecta mediante detección directa, por ejemplo, mediante la incubación del gel con un anticuerpo u otra fracción de unión a antígeno que se une de manera específica al antígeno y se acopla a una fracción detectable. En otras realizaciones, la presencia de un antígeno en un gel sólido de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación se detecta mediante detección indirecta, por ejemplo, mediante la incubación del gel con un anticuerpo primario u otra fracción de unión a antígeno que se une de manera específica al antígeno y un anticuerpo secundario u otra fracción de unión a antígeno que se une de manera específica al anticuerpo primario u otra fracción de unión a antígeno, donde el anticuerpo secundario u otra fracción de unión a antígeno se acopla a una fracción detectable.

Se contempla varias fracciones detectables para su uso con un gel sólido de antígeno/proteína transportadora de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la fracción detectable comprende una enzima, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP, del inglés horseradish peroxidase) o fosfatasa alcalina (AP, del inglés alkaline phosphatase). A continuación, se detecta la señal mediante la exposición de la fracción detectable a un sustrato cromogénico de la enzima y la detección de una señal del sustrato cromogénico tras la reacción con la enzima (por ejemplo, como se describió anteriormente para los bloques 116 y 118). Los ejemplos de sustratos cromogénicos incluyen, sin limitación, 3,3'-diaminobencidina (DAB), que se convierte en un producto marrón mediante la HRP; y 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), que se convierte en un producto rojo mediante la AP. De manera alternativa, una peroxidasa puede activar químicamente una fracción de tiramida conjugada con uno de varios indicadores (por ejemplo, una molécula fluorescente); el conjugado de tiramida activado se puede acoplar, a continuación, de manera covalente a moléculas cercanas en la muestra, creando una señal detectable en la ubicación de la peroxidasa. La detección indirecta también se puede utilizar con la tinción cromogénica. Por ejemplo, un anticuerpo secundario biotinilado se puede incubar con un complejo enzimático marcado con avidina o estreptavidina, un polímero tal como un dextrano se puede acoplar con uno o más anticuerpos secundarios y uno o más complejos enzimáticos, o un complejo enzimático se puede polimerizar directamente sobre un anticuerpo secundario. En algunas realizaciones, la fracción detectable puede comprender un fluoróforo, tal como fluoresceína (FITC), rodamina o derivados de las mismas, TRITC, cianina Cy3, ficoeritrina (R-PE) y CF™, etc. Por ejemplo, un fluoróforo se puede conjugar con el anticuerpo primario o secundario, o se puede conjugar con una fracción de tiramida que se puede acoplar de manera covalente a la muestra después de activarse por una peroxidasa. En algunas realizaciones, la fracción detectable comprende una partícula de metal, tal como oro. Por ejemplo, una partícula de oro se puede conjugar con el anticuerpo primario o secundario y obtener imágenes, por ejemplo, mediante inmuno-EM. En algunas realizaciones, la fracción detectable comprende un radioisótopo, tal como 35S, 125I o 131I y obtener imágenes, por ejemplo, mediante radioinmunodetección. Por ejemplo, un radioisótopo se puede conjugar con el anticuerpo primario o secundario. En algunas realizaciones, la fracción detectable comprende un ácido nucleico, tal como ADN o ARN. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede conjugar con el anticuerpo primario o secundario. Un anticuerpo primario o secundario se puede acoplar a un ion metálico detectable con un espectrómetro de masas o un citómetro de masas [CYTOF y MIBI; véanse Giesen et al., Nat Methods. Abril de 2014; 11(4):417-22 y Motzer et al., Nat Med. Abril de 2014; 20(4):436-42. Un anticuerpo primario o secundario se puede acoplar a una nanopartícula en estado sólido, semiconductora o basada en carbono (por ejemplo, "puntos cuánticos") detectable mediante imágenes de fluorescencia [véase Wu et al., Nat Biotechnol. Enero de 2003; 21(1):41-6]. Un anticuerpo primario o secundario se puede acoplar a una peroxidasa tal como la peroxidasa de rábano picante que después se detecta mediante incubación con un sustrato quimioluminiscente. Un anticuerpo primario o secundario se puede acoplar a un indicador electroquimioluminiscente (por ejemplo, rutenio; véase Valenti et al., J Am Chem Soc. 8 de noviembre de 2017).

Ejemplos

La presente divulgación se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: Validación de geles de BSA como enfoque de planteamiento para controles de IHC

En la figura 1 se muestra un flujo de trabajo 100 ilustrativo para la tinción IHC en muestras de tejido. Es importante destacar que, la tinción IHC muestra no solo el nivel de expresión de una diana, sino también sus distribuciones subcelulares y tisulares.

El siguiente ejemplo describe un nuevo enfoque de planteamiento para generar controles de IHC que se pueden adaptar a una amplia gama de dianas. Este enfoque se validó utilizando BCL2 humano, una diana para la que se pueden identificar tejidos de control positivo 3+ (por ejemplo, las muestras de tumores de leucemia linfocítica crónica humana a menudo obtienen una puntuación de 3+ en este ensayo), pero son difíciles de adquirir o están limitadas por consideraciones éticas, para su uso rutinario como controles de tinción. La generalidad del enfoque también se demostró con IgG de ratón y rata y una proteína humana de interés.

Métodos

Aproximadamente de 0 a 0,5 mg de antígeno que contiene aproximadamente de 0 a 10-4M del epítopo diana se mezcló con 0,5 ml de BSA al 25 % en PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se añadieron al tubo 0,5 ml de formaldehído al 37 %. El tubo se calentó durante 10 minutos a 85 °C, después se dejó toda la noche a temperatura ambiente para que solidificase si contenía un fijador (por ejemplo, formalina). El gel resultante se retiró del tubo y se puso en formalina tamponada neutra (NBF) al 10%. Posteriormente, el gel se deshidrató a través de alcoholes graduales hasta llegar a xileno, se infiltró con cera de parafina tibia, se incluyó en un bloque de parafina, se seccionó en un micrótomo y se tiñó con el anticuerpo monoclonal 124 de ratón primario anti-BCL2 y el sistema cromogénico de enzima/sustrato de peroxidasa de rábano picante (HRP)/3,3'-diaminobencidina (dAb ) de acuerdo con los métodos convencionales de IHC.

El ensayo de detección mediante IF se desarrolló en el instrumento de tinción automatizado Ventana Discovery Ultra. Se cortaron secciones de cuatro micrómetros que contenían las muestras diana de BSA/péptido, se desparafinaron y se pretrataron con solución acondicionadora de células CC1. El anticuerpo monoclonal 124 de ratón primario anti-BCL2 se incubó durante 16 minutos a 37 °C y se detectó con el sistema de detección de HRP anti-ratón OmniMAP durante 8 minutos, seguido por el sistema de detección Ventana Discovery Red 610 durante 16 minutos.

Se adquirieron imágenes inmunofluorescentes y de campo claro de portaobjetos completos a una resolución de barrido de 0,46 micrómetros/píxel utilizando el escáner de portaobjetos digital Hamamatsu Nanozoomer-XR equipado con una lente de objetivo 20* 0,75 NA y un módulo fluorescente. Se realizaron imágenes de campo claro y se utilizaron para enfocar. Cuando correspondía, la señal de inmunofluorescencia se adquirió utilizando un filtro TRITC con una exposición de 1* (colección de fotones de 3,4 ms) y una ganancia de 1*. La autofluorescencia se capturó con un ^dA^p I (exposición 2*, colección de fotones de 6,8 ms, ganancia 2*) y filtro CFP (exposición 4*, colección de fotones de 13,6 ms, ganancia 2*). La potencia de iluminación se fijó al 50% para todas las adquisiciones de inmunofluorescencia. El análisis de imágenes se realizó utilizando Matlab versión 9.3. Las regiones de interés (ROI, del inglés regions of interest) se marcaron de manera manual (solo barrido de campo claro) o se generaron mediante umbralización y filtrado morfológico en los canales de autofluorescencia y se transfirieron al canal TRITC para medir la intensidad. La intensidad media de la escala de grises se calculó con una profundidad de 8 bits. La absorbencia óptica promedio (marcada con DAB de campo claro) o la emitencia (marcada con fluorescencia) se calculó mediante la suma de todos los valores de absorbencia o emitencia de los píxeles dentro de una ROI (tal como se calcula mediante la fórmula logarítmica natural respectiva a continuación) y se normalizó al recuento total de píxeles de la ROI. Todos los valores de intensidad de escala de grises de cero píxeles se aproximaron utilizando un valor de 1. Absorbencia de píxeles de campo claro = log(255/intensidad de la escala de grises de píxeles). Emitencia de píxeles fluorescentes = log(intensidad de la escala de grises de píxeles).

Para experimentos de validación, las muestras de gel de BSA se generaron en tubos de microcentrífuga como se describe anteriormente, se incluyeron en bloques de parafina, después se utilizaron para crear una micromatriz de tejido de cilindros de 600 micrómetros de diámetro cortados de los bloques de parafina y vueltos a incluir en la matriz utilizando técnicas convencionales de micromatriz de tejido.

Para experimentos con BCL2, se utilizó un péptido que comprende la secuencia Ac-YGSGGAAPAPGIFSSQPGGSGC-amida (SEQ ID NO: 1). Los aminoácidos subrayados corresponden a los aminoácidos de tipo silvestre (no mutados) 41 a 54 de la secuencia de BCL2 humano como se establece en el número de registro de UniProt P10415. El péptido también incluye una secuencia enlazadora aminoterminal (Ac-YGSG) (SEQ ID NO: 6) con acetil-Y (tirosina) que permite el acoplamiento con un aldehído (por ejemplo, formaldehído) y una secuencia enlazadora carboxiterminal (GSGC-amida) (SEQ ID NO: 7) con C (cisteína)-amida que es reactiva con varios reactivos de reticulación, por ejemplo, compuestos que contienen disulfuro de maleimida, haloacetilo o disulfuro de piridilo.

Resultados

Los geles de BSA/péptido se prepararon como se describe anteriormente. La mezcla del antígeno (por ejemplo, un péptido) con BSA en una solución líquida antes de producir un gel permitió que el péptido se mezclara de manera uniforme. El gel resultante (Figura 2A) se puede construir en cualquier forma deseada (en este ejemplo, se produjo un gel con la forma de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml). El gel también se puede cortar (Figuras 2B y 2C) y someter a las etapas normales de procesamiento de IHC tal como la recuperación de antígenos, bloqueo, incubación de anticuerpos primarios/secundarios y detección (por ejemplo, utilizando un enfoque de enzima/sustrato). Por ejemplo, en la figura 2D se muestra una porción de gel cortada preparada para la deshidratación y el procesamiento en parafina, y en la figura 2E se muestra una porción de gel cortada incluida en un bloque donante de parafina. En la figura 2F se muestra una TMA creada a partir de varios bloques donantes de gel de parafina, junto con núcleos que contienen pigmento negro y verde para referencias de orientación. Los antígenos peptídicos son capaces de entrecruzarse con la BSA de manera más eficaz que con la lisocima, reteniendo así el antígeno en el gel de BSA durante el procesamiento de IHC y la detección.

Para examinar la viabilidad de los geles de péptido/BSA como controles de IHC, se mezclaron concentraciones variables del péptido BCL2 en geles de BSA, a continuación se cortaron y se prepararon de acuerdo con las técnicas convencionales de IHC. El BCL2 se detectó utilizando un anticuerpo primario BCL2 dirigido contra la proteína BCL2 humana (el "anticuerpo primario monoclonal de ratón CONFIRM anti-bcl-2 (124)" BCL2 de Ventana Medical Systems), un anticuerpo secundario biotinilado, HRP conjugada con avidina como indicador cromogénico y DAB como sustrato cromogénico. Como se muestra en la figura 3A, el aumento en serie de los niveles de BCL2 de 0 a 0,5 mg/ml (2,5 * 10-4 M) condujo a un aumento gradual en la intensidad de la tinción IHC. Un control negativo que carecía de péptido no provocó tinción, mientras que el péptido BCL2 se pudo resolver en todo el intervalo probado de 5 * 10-5 mg/ml (correspondiente a una concentración del péptido de 25 nM) a 0,5 mg/ml (correspondiente a una concentración del péptido de 2,5 * 10-4 M). Es importante destacar que, los niveles de tinción de BCL2 1 , 2+ y 3+ se lograron cada uno a diferentes concentraciones del péptido. Como la tinción estable y uniforme de BCL23+ suele ser difícil de encontrar en muestras de tejido fácilmente disponibles, este enfoque alternativo proporciona una forma más fácil y estandarizada de obtener un gradiente de controles de expresión de BCL2 que analizar diferentes tipos de tejidos.

Para examinar la consistencia de la tinción, se realizaron seis experimentos independientes mediante la tinción de los geles de péptido BCL2/BSA como se describe anteriormente y el análisis de las imágenes resultantes con MATLAB. Los análisis de la densidad óptica (DO; figura 3B) y de la intensidad de la imagen (Figura 3C) en función de la concentración del péptido indicaron que la tinción fue estable entre los experimentos.

Los geles de péptido BCL2/BSA también se sometieron a tinción de inmunofluorescencia cuantitativa. Al igual que los resultados obtenidos mediante la tinción cromogénica, los análisis de IF mostraron un aumento gradual en la intensidad de la tinción en función de la concentración del péptido (Figura 3D). Los análisis de emitencia óptica (Figura 3H) y de la intensidad de la señal (Figura 3J) una vez más demostraron aumentos estables y graduales en la tinción. La tinción de control negativo con un anticuerpo primario de control sin tratamiento (Figuras 3F, 3I, y 3K) o la autofluorescencia de los geles (Figuras 3E y 3G) no mostraron un aumento en la intensidad, como cabía esperar.

También se examinaron controles de anticuerpos secundarios. Con un anticuerpo secundario de burro anti-ratón, la IgG de ratón incluida en un gel de BSA se detectó fácilmente, mientras que la IgG de rata no dio ninguna señal detectable, como se muestra en la figura 4A. De manera análoga, con un anticuerpo secundario de burro anti-rata, la IgG de rata incluida en un gel de BSA se detectó fácilmente, mientras que la IgG de ratón no dio ninguna señal detectable (Figura 4B). Esto confirma la especificidad del enfoque del gel de BSA, demostrando que el anticuerpo secundario no se une de manera no específica a los geles de péptido/BSA que carecen de la diana del anticuerpo.

Para examinar la especificidad de la tinción, se sintetizaron seis péptidos con sustituciones de un solo aminoácido clínicamente relevantes en el epítopo del anticuerpo clon 124 anti-BCL2, incluidos en BSA como se describe anteriormente, y se tiñeron. Como se muestra en la figura 4C (y visto en las figuras 3D, 3H y 3J), estas mutaciones mostraron un efecto claro en la tinción IHC (es decir, una disminución de grado variable en la intensidad de la señal, dependiendo de la sustitución de aminoácido específico), demostrando la practicidad de cuantificar el efecto de las sustituciones de aminoácidos específicos en la intensidad de la tinción.

A continuación, la generalidad del planteamiento del gel de péptido/BSA se examinó mediante la selección de varios anticuerpos no caracterizados para la detección específica de una diana de interés. Veintisiete (27) clones de anticuerpos aislados de ratones inmunizados con KSR2 humano se seleccionaron mediante IHC para la detección de controles positivos y negativos (Figuras 5A a 5D). Para el control negativo, se utilizó gel de BSA sin otra proteína o péptido añadido. Para el control positivo, se generaron geles de BSA con la proteína KSR2 humana que se había utilizado para inmunizar los ratones. Como era de esperar, debido a que los clones de anticuerpos candidatos se habían seleccionado en un proceso separado para unirse a la proteína diana humana no fijada, la mayoría de los clones de anticuerpos pudieron detectar la proteína humana en los geles de proteína/BSA (como lo demuestra la señal DAB de cierta intensidad por encima del fondo). Sin embargo, los anticuerpos más adecuados para su uso en ensayos de IHC deben mostrar poca o ninguna señal detectable para el control negativo, mientras que al mismo tiempo muestra una fuerte tinción para el control positivo. Entre los anticuerpos probados, los clones 5, 6, 7, 11, 12, 15 y 23 fueron los más prometedores, ya que estos dieron la proporción más elevada de tinción específica del antígeno diana a tinción no específica en la muestra de control negativo. En cambio, los clones 4, 13, 26 y 27 mostraron una tinción ineficaz del antígeno diana, mientras que los anticuerpos 10 y 20 mostraron una tinción no específica débil pero significativa de la muestra de control negativo. Estos resultados sirven para ilustrar el problema de que no todos los anticuerpos capaces de unirse a una diana de interés en su estado no fijado son adecuados para su uso en la tinción IHC. Los procesos y reactivos de control de péptidos descritos en el presente documento pueden ayudar a identificar los anticuerpos más adecuados para su uso en aplicaciones IHC.

Considerados en conjunto, estos resultados demuestran que el enfoque de gel de antígeno/BSA proporciona un planteamiento fuerte para generar controles de IHC que es aplicable a muchos antígenos diana. El enfoque produce controles que representan un gradiente de tinción IHC que se correlaciona con un intervalo de concentración diana, demostrando así el potencial cuantitativo de los geles diana/BSA. A diferencia de los controles de IHC de tejidos o estirpes celulares, los geles de péptido/BSA se crean fácilmente en el laboratorio según lo requiera la necesidad, son estables, reproducibles, baratos, versátiles y específicos de antígeno. Los controles de anticuerpos secundarios demostraron la especificidad del enfoque. Asimismo, el enfoque es ideal para identificar anticuerpos adecuados para el análisis de IHC de una diana de interés, un proceso en el que normalmente se seleccionan de cientos a miles de anticuerpos candidatos para identificar un pequeño puñado (por ejemplo, de 2 a 5) de pistas para una caracterización adicional.

Ejemplo 2: Examen de las condiciones para la formación del gel

El siguiente ejemplo describe el ensayo de una gama de condiciones para determinar su efecto sobre la formación del gel.

Métodos

Para la evaluación de la formación del gel de BSA, se calentó 1 ml de una solución de BSA en PBS a un intervalo de temperaturas de 25 a 85 °C. No se incluyó formaldehído en la solución BSA/PBS. La solución se calentó de manera continua y se observó en condiciones de calor en varios puntos temporales para la fase líquida/sólida. Las soluciones se probaron a las siguientes concentraciones de BSA: 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % y 2 %.

Para la evaluación de otras fuentes de proteína para elaborar geles, las soluciones al 25 % de lo siguiente se generaron en PBS: caseína, lactoalbúmina, harina de soja y leche desnatada en polvo. Se mezclaron 500 pl de formaldehído al 37% con 500 pl de la respectiva solución de proteína/PBS al 25% y se incubaron durante 10 minutos a 85 °C.

Para la evaluación de fijadores, se mezclaron 500 pl de fijador con 500 pl de solución de BSA al 25 % en PBS y se incubaron durante 10 minutos a 85 °C. Los fijadores probados incluyeron: formalina tamponada neutra (NBF) al 10 %, Karnovski diluido A (glutaraldehído/paraformaldehído), Methacarn, líquido de Carnoy y de Bouin.

Para la evaluación de la concentración de formaldehído, se mezclaron 500 pl de solución de formaldehído con 500 pl de solución de BSA al 25 % en PBS y se incubaron durante 10 minutos a 85 °C. Las soluciones de formaldehído se probaron a las siguientes concentraciones (la concentración se refiere a la concentración original antes de diluir con la solución de BSA): 1 %, 2 %, 4,5 %, 9 % y 18 %. De manera específica, la solución madre de formaldehído al 37 % se mezcló con agua destilada para obtener un volumen final de 500 microlitros que contenían formaldehído al 1 %, al 2%, al 4,5%, al 9% o al 18%; a continuación, estas soluciones se mezclaron (cada una en tubos de microcentrífuga separados) con un volumen igual (500 microlitros) de solución de BSA al 25 % y se calentaron como se describió anteriormente.

Resultados

La figura 6 ilustra los efectos de la temperatura y el tiempo de calentamiento en la formación de gel de BSA al 25 %. El calentamiento a 25 °C o a 45 °C no produjo ninguna formación de gel, incluso después de calentar durante la noche. A 55 °C, la formación de gel solo se observó después de calentar durante la noche. Sin embargo, después de calentar a 65 °C u 85 °C, se observó formación de gel sólido en 6 y 2 minutos, respectivamente. Estos resultados demuestran los efectos de la temperatura y el tiempo de calentamiento en la formación de gel de BSA.

A continuación, se probó el efecto de la concentración de BSA en la formación de gel. Se disolvió BSA en PBS a las siguientes concentraciones: 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % y 2 %. Como se muestra en la figura 7 (los resultados para BSA 25 % se muestran en la figura 6), se observó formación de gel para todas las concentraciones al calentar a 85 °C. Para concentraciones de BSA del 5 % y superiores, se observó formación de gel en 10 minutos, mientras que la solución de BSA al 2 % formó un gel después de 20 minutos. No se observó formación de gel en ningún momento después del calentamiento a 45 °C o a 55 °C. Estos resultados demuestran que un amplio intervalo de concentraciones de BSA puede generar un gel de BSA en condiciones de calentamiento adecuadas.

A continuación, se probaron la caseína, la lactoalbúmina, la harina de soja y la leche desnatada en polvo para determinar su capacidad para formar geles. Cada una se probó a una concentración final del 12,5% en PBS después de mezclar con formaldehído (concentración final: 18,5%), como se describe anteriormente. En estas condiciones, solo se observó que la harina de soja formaba un gel, pero el sólido resultante no era homogéneo. Estos datos demuestran las propiedades únicas de la seroalbúmina para promover la formación de gel.

A continuación, se probaron varios fijadores para determinar su capacidad para formar un gel de BSA, que incluían NBF al 10%, Karnovski diluido A (glutaraldehído/paraformaldehído), Methacarn, líquido de Carnoy y de Bouin. De estos, NBF al 10% y Methacarn no lograron formar un sólido. Carnoy formó un sólido antes de que pudiera mezclarse. Los fijadores de Karnovski diluido A y de Bouin formaron un sólido transparente.

También se probó el efecto de la concentración de formaldehído en la formación del gel. Todas las concentraciones de formaldehído pudieron promover la formación del gel sólido excepto al 1 %. Estos resultados muestran el efecto del fijador en la formación del gel.

Ejemplo 3: Evaluación de otros sustratos para la formación de gel

El siguiente ejemplo describe la evaluación de proteínas adicionales en cuanto a su capacidad para formar un gel adecuado para la tinción IHC.

Métodos

Se evaluaron la BSA (utilizada a una concentración final del 25 %), la proteína de clara de huevo o una mezcla de proteínas de clara de huevo (utilizada a una concentración final del 25 %), la gelatina (utilizada a una concentración final del 10%), la lactoalbúmina (utilizada a una concentración final del 25%), el polvo de proteína de hígado, la harina de soja (utilizada a una concentración final del 25 %), la caseína (utilizada a una concentración final del 10 %) y la leche desnatada en polvo (utilizada a una concentración final del 25 %) para determinar la capacidad de generar geles sólidos adecuados para la tinción IHC. Las soluciones de proteína se mezclaron con formaldehído al 37 % y se calentaron a 85 °C durante 10 minutos.

Cada tipo de gel se produjo con o sin IgG de conejo normal (DA1E) 0,1 mg/ml. Las secciones se tiñeron con anticuerpo secundario de burro biotinilado anti-conejo a 5 pg/ml, seguido de detección ABC-HRP.

Para geles de gelatina, se mezcló gelatina fundida al 10% con 0,1 mg/ml de IgG de conejo normal (DA1E), a continuación se enfrió durante 1 hora a 4 °C, se transfirió a NBF al 10 % durante la noche, se transfirió a etanol al 70 % durante 2 días, después se procesó para tinción IHC como tejido. Para geles de polvo de proteína de hígado y de lactoalbúmina, se añadió Histogel™ para solidificar los geles. Para geles de caseína, se añadió gota a gota NaOH 100 mM para llevar el pH a 8,0, con agitación según fue necesario para formar la solución.

Para la obtención de imágenes de geles, los portaobjetos se escanearon en un Hamamatsu Nanozoomer y las imágenes digitales se capturaron con un programa informático de visualización de imágenes.

Resultados

Se probaron proteínas de sustrato adicionales para determinar su capacidad para formar geles adecuados para la tinción IHC, por ejemplo, mediante la formación de un gel homogéneo que permite la tinción IHC y se adhiere a un portaobjetos de vidrio de IHC. Como se muestra en la figura 8, además de la BSA, la proteína de clara de huevo o una mezcla de proteínas de clara de huevo y la gelatina formaron geles que presentan una tinción IHC específica (en este caso, después de que los geles que contenían una muestra de anticuerpo IgG de conejo se tiñeron con un anticuerpo secundario anti-conejo) con una tinción no específica baja (como se ve después de teñir un gel que carece de IgG de conejo con un anticuerpo secundario anti-conejo). En cambio, los geles generados a partir de lactoalbúmina, polvo de proteína de hígado o harina de soja no lograron generar un gel homogéneo (Figura 9). Los geles generados a partir de caseína o leche desnatada en polvo no se adhirieron a los portaobjetos de IHC (Figura 10). En la tabla A se proporciona una descripción de cada sustrato de gel y el material resultante del intento de formación de gel.

T l A. l r i l r rir iv r r .

(continuación)

En resumen, la BSA, la(s) proteína(s) de clara de huevo y la gelatina proporcionaron geles susceptibles de tinción IHC específica. Otros sustratos proteicos no lograron formar un gel homogéneo o no se adhirieron a los portaobjetos durante el procesamiento de IHC.

Ejemplo 4: Detección de antígeno en geles

El concepto de control sintético de IHC descrito anteriormente se analizó más a fondo utilizando aplicaciones de prueba de concepto relevantes para la investigación y el uso clínico, incluida la calibración del ensayo de IHC y el control de calidad.

Métodos

Péptidos y proteínas

Los péptidos se sintetizaron con una pureza >95 % por New England Peptide (Gardner, MA). Los aminoácidos 41 a 54 de la proteína BCL2 humana (UniProt P10415) se extendieron en el extremo N por cuatro aminoácidos, incluida la tirosina acetilada para facilitar la reticulación con formaldehído y una secuencia espaciadora, GSG. El extremo C incluía una secuencia espaciadora GSG seguida de cisteína-amida para facilitar la reticulación con formaldehído (Metz, B. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:6235-6243); Toews, J. et al., (2008) Anal. Chim. Acta 618:168-183) o reactivos que reaccionan con sulfhidrilo. La secuencia completa del péptido de 22 aminoácidos es Ac-YGSGGAAPAPGIFSSQPGGSGC-amida (SEQ ID NO: 1). Se sintetizaron péptidos adicionales que contenían secuencias de la proteína MYC humana (UniProt P01106): Ac-YGSGNRNYDLDYDSVQPYFYGSGC-amida (aminoácidos 9 a 24; SEQ ID NO: 2); Ac-YGSGDSVQPYFYCDEEENFYGSGC-amida (aminoácidos 17 a 32; SEQ ID NO: 3); Ac-YGSGQQQSELQPPAPSEDIWGSGC-amida (aminoácidos 35 a 50; SEQ ID NO: 4); Ac-YGSGFELLPTPPLSPSRRSGGSGC-amida (aminoácidos 53 a 68: SEQ ID NO: 5). Se sintetizó un péptido de control negativo que contenía 13 aminoácidos del primer exón de MCL1 humano (UniProt Q07820) con las mismas extensiones de secuencia amino y carboxiterminal descritas anteriormente. Para algunos experimentos, la arginina, la serina o la tirosina reemplazaron los aminoácidos amino y carboxiterminales en los péptidos descritos anteriormente. Los péptidos liofilizados se disolvieron en un volumen mínimo de agua destilada, DMSO o dimetilformamida. Los 301 aminoácidos carboxiterminales (aminoácidos 650 a 950) de la proteína supresora de cinasa de RAS 2 (KSR2, del inglés Kinase Suppressor of RAS 2; Uniprot Q6VAB6) se expresaron como una construcción de fusión de 701 aminoácidos aminoterminales marcados con [His]6 y proteína de unión a maltosa (aminoácidos 9 a 399). La proteína de fusión se expresó como una construcción de baculovirus en células Tni Pro de insecto Tricoplusia ni (Expression Systems; Davis, CA), después se purificó mediante afinidad secuencial de níquelácido nitrilotriacético, afinidad de amilosa y cromatografía de exclusión por tamaño Sepharose S200. El clon MOPC-31C de IgG1 de ratón purificado (BD Pharmingen, San José, CA), el clon R3-34 de IgG1 de rata (BD Pharmingen, San José, CA) y el clon DA1E de IgG de conejo (Cell Signalling Technology, Danvers, MA) se obtuvieron comercialmente. La seroalbúmina bovina (BSA; Ultra Pure) se adquirió de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). La gelatina de calidad alimentaria y las claras de huevo secas eran de Knox (Oakbrook, IL) y Judees Gluten Free (Columbus, OH), respectivamente.

Geles de matriz proteica

A menos que se indique de otro modo, se mezclaron 0,5 ml de solución que contenía el antígeno deseado en BSA al 25 % (p/v)/solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con un volumen igual de formaldehído al 37% (Electron Microscopy Sciences; Hatfield, PA), se calentaron durante 10 minutos a 85 °C para coagular la solución, después se agitaron durante la noche a temperatura ambiente. Las concentraciones finales del reactivo fueron 12,5% (1,8 mM) de BSA y 18,5% (6,2 M) de formaldehído. Los antígenos peptídicos tuvieron concentraciones finales de 2,5 x 10-8 M a 2,5 x 10-4 M en los geles fijos. Los geles que contenían IgG de ratón, rata y conejo sin tratamiento tuvieron una concentración final de 0,1 mg/ml (6,7 x 10-7 M) de IgG. La proteína de fusión [His]6-MBP-KSR2 humana tenía una concentración final en gel de 0,5 mg/ml (6,3 x 10-6 M).

En las pruebas de protocolos de fijación alternativos, se utilizó el fijador de zinc sin formalina (Número de catálogo 552658, BD Pharmingen; San José, CA) en lugar de formaldehído al 37 % y NBF de los protocolos anteriores. En otros experimentos, el antígeno en BSA al 25 % en PBS se solidificó mediante el calentamiento durante 10 minutos a 85 °C en ausencia de formaldehído. A continuación, el gel solidificado se transfirió a formalina tamponada neutra al 10 % (NBF; VWR International, LLC, Radnor, PA), paraformaldehído al 4 % (PFA; VWR International, LLC, Radnor, PA) o fijador de zinc para la fijación durante la noche a temperatura ambiente.

Construcción de micromatrices de tejido (TMA)

Las micromatrices de tejido (TMA) se construyeron utilizando una micromatriz de tejido TMA Grand Master (3DHISTECH, Budapest, Hungría). Se perforaron núcleos duplicados de 1 mm de diámetro a partir de bloques de parafina donantes que contenían los geles de proteína deseados, después se transfierieron a los bloques de parafina receptores. Los bloques de TMA receptores completos se calentaron a 37 °C durante la noche, después a 70 °C durante 10 minutos antes de ser enfriado y seccionado.

Tinción IHC

Los anticuerpos primarios utilizados fueron el clon 124 de ratón anti-BCL2 humano (Ventana Medical Systems; Tucson, AZ), clon EPR17509 de conejo anti-BCL2 humano (Abcam; Cambridge, MA), clon SP66 de conejo anti-BCL2 humano (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), clon E17 de conejo anti-BCL2 humano (Abcam, Cambridge, MA), clon Y69 de conejo anti-MYC humano (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) y clon SP143 de conejo anti-MCL1 humano (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). El anticuerpo Fluidigm EPR17509-146Nd se adquirió de Fluidigm (South San Francisco, CA). Se generó un grupo de 27 anticuerpos de hibridoma de ratón contra la proteína de fusión [His]6-MBP humana en Chempartner (Shanghai, China). Los anticuerpos secundarios biotinilados de burro anticonejo, rata y ratón se adquirieron de Jackson Laboratories. Los detalles del protocolo de tinción se resumen en la tabla 1.

Tabla B. Protocolos de IHC.

continuación

Las secciones de parafina de cuatro micrómetros se desparafinizaron y rehidrataron en xileno y alcoholes graduados. La tinción se realizó en los instrumentos Ventana Benchmark XT, Ventana Discovery XT, Ventana Benchmark Ultra XT (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) o el Dako Universal Autostainer (Agilent, Santa Clara, CA). Las secciones se pretrataron con Cell Conditioning Solution 1 (CC1) (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) o Target Retrieval Solution, pH 6 (Listo para usar) (Dako - Agilent Technologies, Santa Clara, CA) según el protocolo de anticuerpos optimizado. Los portaobjetos teñidos en los instrumentos de Ventana se contrastaron con hematoxilina de Ventana y reactivos de azulado (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) durante 4 minutos cada uno. Los portaobjetos teñidos en el autoteñidor Dako Universal se contrastaron con hematoxilina de Mayer (Rowley Biochemical, Danvers, MA) y Richard-Allen Scientific Bluing Reagent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) durante 1 minuto cada uno. Las secciones teñidas se deshidrataron en alcoholes graduados a xileno antes de cubrirlas. Los portaobjetos de inmunofluorescencia se cubrieron con medios de montaje Prolong Gold (Life Technologies, Carlsbad, CA).

Procedimiento de tinción de Fluidigm

Las secciones se hornearon a 70 °C durante 30 min, se desparafinaron, se rehidrataron en series descendentes de EtOH y pretrataron con Target Retrieval Solution, pH 6 (Dako - Agilent Technologies, Santa Clara, CA), se bloquearon durante 30 minutos en suero de burro al 10 %, BSA al 3 % en PBS, después se incubaron con 146Nd-EPR17509 en tampón de bloqueo. Los portaobjetos se incubaron sin cubreobjetos a 4 °C durante la noche en un recipiente cerrado húmedo, después se enjuagaron 3 veces en PBS, portaobjetos se fijaron en glutaraldehído al 2 %/PBS durante 5 min a 20 °C, se enjuagaron en ddH²O, se deshidrataron en series crecientes de EtOH, se secaron al aire y se almacenaron a 20 °C hasta la toma de imágenes.

Análisis de espectrometría de masas de imágenes

Se analizaron los núcleos de TMA teñidos con EPR17509 marcado con 146Nd en el espectrómetro de masas de imágenes Fluidigm Hyperion (South San Francisco, CA) mediante la definición de regiones de interés (ROI) de ablación de 150 micrómetros cuadrados en cada núcleo de TMA. Los recuentos de iones integrados para cada ROI se convirtieron en masa de anticuerpos utilizando datos convencionales de anticuerpos como se describe a continuación.

Se prepararon alícuotas de control de 1, 5 y 10 pg/ml de EPR17509 marcado con 146Nd en suero de burro al 10 % en BSA al 3 % en PBS. Se colocó un microlitro de cada muestra de anticuerpo en un portaobjetos de vidrio y se secó al aire antes de someterlo a ablación en el aparato Hyperion (intensidad de láser UV = 3). El recuento de iones integrado para cada mancha de anticuerpo se utilizó para calibrar los recuentos de iones medidos en las ROI a partir de núcleos de TMA teñidos.

Adquisición y análisis de imágenes digitales

Se adquirieron imágenes de campo claro de diapositivas completas a una resolución de escaneo de 0,46 micrómetros/píxel utilizando el escáner de diapositivas digital Nanozoomer-XR de Hamamatsu (Bridgewater, NJ) equipado con una lente objetivo de 20* 0,75 NA. La formación de imágenes de campo claro se realizó en modo por lotes semiautomático. El área de escaneado y los puntos de enfoque se crearon de manera manual para cada portaobjetos antes de generar imágenes automatizadas de alta resolución de todo el portaobjetos. Las imágenes de diapositivas completas de inmunofluorescencia se adquirieron utilizando el escáner Nanozoomer-XR o 3D Histech Pannoramic 250 (utilizando una lente objetivo 20* 0,8 NA con una resolución de 0,33 micrómetros/píxel). En el sistema Nanozoomer-XR, la potencia de iluminación del módulo fluorescente se fijó al 50 % y la señal de inmunofluorescencia se capturó mediante un TRITC (señal de anticuerpo con exposición 1*, colección de fotones de 3,4 ms, ganancia 1*), DApI (autofluorescencia con exposición 2*, colección de fotones de 6,8 ms, ganancia 2*) y filtro CFP (autofluorescencia con exposición 4*, colección de fotones de 13,6 ms, ganancia 2*). La adquisición en el sistema Pannoramic 250 se realizó utilizando un CY5 (señal de anticuerpo con exposición de 10 ms), FITC (señal de anticuerpo con exposición de 2 ms), DAPI (autofluorescencia con exposición de 40 ms) y filtro CFP (autofluorescencia con exposición de 200 ms). El análisis de imágenes se realizó utilizando Matlab versión 9.3. Las regiones de interés (ROI) en imágenes de campo claro se crearon y editaron de manera manual para excluir áreas del gel que tenían distorsiones o estaban rotas. Los pequeños agujeros o fisuras dentro del ROI se excluyeron utilizando umbrales de color manuales. Las ROI para las imágenes inmunofluorescentes se crearon de manera manual o se generaron de manera automática cuando hubo suficiente señal por encima del fondo del gel disponible desde la imagen de autofluorescencia mediante umbralización (en el canal DAPI o CFP) y filtrado morfológico. Las ROI se transfirieron a imágenes adquiridas en el canal de anticuerpo-fluorocromo para medir la intensidad. La intensidad media de la escala de grises se calculó con una profundidad de 8 bits tanto para imágenes de campo claro como fluorescentes. Los valores del eje Y trazados de la intensidad media de los píxeles de campo claro representan 255 menos la intensidad media de los píxeles en escala de grises. Las imágenes digitales escaneadas de portaobjetos se presentan sin alteración de la intensidad o del contraste originales. La cuantificación del perfil de intensidad de tinción en las líneas dibujadas a través de las secciones del bloque donante se evaluó mediante la función analizar/trazar perfil en ImageJ (versión 1.52a; Wayne Rasband, imagej.nih.gov/ij).

Análisis estadístico

La representación gráfica se realizó con Prism GraphPad (versión 7). Los datos de la intensidad de la señal, corregidos para el fondo del portaobjetos de vidrio, se trazaron frente al log^-10 de la concentración del antígeno formulado. El ajuste de la curva utilizó el modelo de 4 parámetros de pendiente variable restringido de modo que la parte inferior de la curva ajustada fuera igual a la intensidad media de los núcleos sin antígeno para cada ensayo, informado en las tablas asociadas a cada gráfico como "Inferior". Los demás parámetros informados en las tablas [señal máxima, amplitud, concentración de antígeno a la señal semimáxima (ACHM, del inglés antigen concentraron at half-maximum signal) y HillSlope], se calcularon mediante el programa informático.

Resultados

Como se ha demostrado en los ejemplos 1 a 3, cuando se incorpora en geles proteicos, los péptidos sintéticos que codifican un epítopo diana de anticuerpo se pueden detectar con procedimientos inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes de rutina. Los bloques donantes que contenían péptidos diana tenían una distribución de antígenos relativamente homogénea cuando se evaluaron mediante ensayos cromogénicos (Figuras 11A a 11D). Se puede construir una micromatriz de tejido (TMA) que contenga los antígenos deseados en un intervalo de concentraciones del antígeno. En las figuras 12A a 12E se muestra una TMA compuesta de núcleos duplicados que no contienen péptido añadido pero sí diluciones en serie de un péptido de control negativo de la proteína MCL1 humana o diluciones del péptido que codifica los aminoácidos 41 a 54 de la proteína BCL2. Las secciones paralelas de esta TMA se tiñeron con cuatro anticuerpos anti-BCL2: clon 124, producido contra la misma secuencia peptídica utilizada en el péptido diana; SP66 y E17, ambos producidos contra antígenos peptídicos carboxiterminales a la secuencia en el reactivo (Adam, P. et al. (2013) Human Patology 44:1817-1826; www.abcam.com/bcl2-alphaantibody-sp66-n-terminal-ab93884.html); y EPR17509, producido contra un antígeno peptídico BCL2 no divulgado (www.abcam.com/BCL2-antibody-epr17509-hrp-ab209039.html). Se tiñeron los portaobjetos por separado utilizando métodos cromogénicos (todos los anticuerpos) e inmunofluorescentes (solo para el clon 124).

Como se esperaba, SP66 y E17 no reaccionaron de manera detectable con ningún núcleo en las secciones de esta TMA (Figuras 13A y B). Tanto con el clon 124 como con el EPR17509, la señal en los núcleos de TMA aumentó con el aumento de la concentración del péptido BCL2 (Figuras 12A a 12C), coherente con una interacción específica entre el anticuerpo y el antígeno en los núcleos.

La cuantificación de imágenes digitales permitió una evaluación más precisa de los datos (Figura 12D). Las curvas ajustadas y los parámetros asociados informados en la figura 12E cuantifican la intensidad de señal mínima y máxima, el rango dinámico, la concentración de antígeno a la que la señal es semimáxima (ACHM) y la inclinación de la curva de concentración de antígeno frente a la intensidad de la señal en este intervalo (HillSlope). Con las condiciones probadas en el presente documento, la señal no específica en núcleos que no contenían péptido añadido fue del 2,7 % de la señal máxima detectable en el ensayo cromogénico del clon 124, 1000 veces menor que esto en el ensayo del clon 124 fluorescente y el 23 % en el ensayo de EPR17509. Por otro lado, para EPR17509, el valor ACHM, que refleja la sensibilidad relativa del ensayo, fue aproximadamente 8 veces inferior (es decir, más sensible) que el ACHM para el ensayo cromogénico del clon 124 y más de 50 veces inferior que el ensayo del clon 124 fluorescente. El ensayo inmunofluorescente del clon 124 tuvo una pendiente de entre el 50 y el 75% más pronunciada que cualquiera de los ensayos cromogénicos, lo que refleja el intervalo más estrecho de concentración de antígeno entre el umbral de detección y la señal máxima.

Para evaluar la reproducibilidad de los controles peptídicos en ensayos repetidos, se construyó una segunda TMA de péptido BCL2 utilizando nuevos bloques de parafina donantes formulados para tener las mismas concentraciones de péptido BCL2 diana que las que se utilizaron para construir la TMA en las figuras 12A a 12E. Dos operadores tiñeron las secciones replicadas de esta segunda TMA, en seis días separados en un intervalo de 6 meses utilizando el mismo protocolo de IHC cromogénica con el clon 124 anti-BCL2 utilizado en las figuras 12A a 12E. El análisis cuantitativo de las imágenes digitales de las secciones teñidas mostró que la intensidad de la señal para cada núcleo era altamente reproducible (Figuras 14A a 14C; véanse además las figuras 3B y 3C).

En experimentos paralelos, el clon 124 se utilizó para teñir TMA que contenían el péptido BCL2 con o sin recuperación previa del antígeno. Los resultados mostraron que la recuperación del antígeno mejoró la fuerza de la señal aproximadamente 6 veces, pero no fue necesario para la tinción (Figuras 15A-15C).

Ejemplo 5: Estabilidad de la reticulación de péptidos en la matriz de gel

Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que la concentración de péptido que está disponible para unirse al anticuerpo se reduce del valor formulado mediante tres parámetros: la eficacia de entrecruzar el péptido con la matriz proteica, la integridad bioquímica del péptido y la accesibilidad del péptido reticulado al anticuerpo. El formaldehído estaba destinado a entrecruzar las cadenas laterales de BSA con los péptidos diana mediante la reacción con la tirosina aminoterminal y la cisteína carboxiterminal incluidas en la secuencia peptídica. De los aminoácidos internos al péptido BCL2 (A, F, G, I, P, Q y S), solo se ha informado que la glutamina reacciona con el formaldehído (Metz, B. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:6235-6243).

Para evaluar el efecto de los aminoácidos amino y carboxiterminales alternativos en la intensidad de la señal, se probaron cuatro variantes del péptido BCL2. La tirosina aminoterminal se reemplazó por serina, que se esperaba que fuera mínimamente reactiva con la formalina, o por arginina, que se informó como un 50 % más reactiva que la tirosina (Metz, B. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:6235-6243). Otras variantes incluían tirosina o arginina tanto en el extremo N como en el extremo C. Se prepararon núcleos de TMA que contenían diluciones en serie de cada péptido y se tiñeron como se describe anteriormente.

Los resultados mostraron una señal significativamente superior para el péptido con arginina aminoterminal ("R-C", figuras 16A a 16C). La ACHM para esta variante fue de 4,43 * 10'7 M de péptido, 6 veces inferior que el valor correspondiente para la variante Y-C original. Las otras variantes mostraron un intervalo de intensidades similares a (S-C) o más débiles que (R-R, Y-Y) la variante Y-C original. De manera notable, las variantes que contenían arginina o tirosina en el extremo N con cisteína en el extremo C reaccionaron de manera más fuerte que los péptidos con arginina o tirosina en ambos extremos.

Ejemplo 6: Generalización para controles de IHC sintéticos

A continuación, se llevaron a cabo experimentos para establecer si los péptidos que contenían epítopos para proteínas distintas de BCL2 reaccionarían de manera similar. Se informa que el anticuerpo Y69 anti-MYC se une a un epítopo en los 100 aminoácidos aminoterminales de la proteína MYC humana (www.abcam.com/c-MYC-antibodyy69-ab32072.html). Los epítopos candidatos de esta región se incorporaron en geles de BSA como se describió anteriormente y se probaron para la unión a Y69.

Un péptido que contiene los aminoácidos 9 a 24 de MYC reaccionó con fuerza con el anticuerpo, mientras que otros péptidos reaccionaron solo débilmente (aa 17 a 32) o nada (aa 35 a 50 y aa 53 a 68) (Figura 17A). Se construyó una TMA que contenía núcleos duplicados, en el intervalo de concentraciones descrito anteriormente, tanto de los aa 9 a 24 del péptido MYC como del péptido BCL2. La detección cromogénica utilizando el clon 124 anti-BCL2 y el clon Y69 anti-MYC mostró un intervalo de intensidad de señal, sin reactividad cruzada con el péptido no diana (Figuras 17B y 17C). La cuantificación de los datos resultantes (Figura 17D) mostró que el protocolo con MYC tenía una ACHM 4 veces inferior que el protocolo con BCL2, con un intervalo dinámico y parámetros HillSlope similares (Figura 17E).

La detección inmunofluorescente doble en la misma TMA utilizada en las figuras 17A a 17E se realizó mediante incubación en serie con reactivos de detección adecuados de anticuerpos primarios anti-BCL2 y anti-MYC (Figuras 18A a 18C). Los resultados cualitativos (Figuras 18A y 18B) mostraron la especificidad esperada sin reactividad cruzada entre el anticuerpo y el péptido no diana. Los controles de isotipo utilizados en lugar de anticuerpos primarios específicos de antígeno no dieron como resultado ninguna señal. La cuantificación de los datos fluorescentes resultantes muestra un aumento de los parámetros HillSlope y una mayor variabilidad de réplicas en las condiciones, en relación con el protocolo cromogénico.

Estos resultados confirman la utilidad ampliamente aplicable de los antígenos peptídicos como controles de IHC utilizando diversos epítopos y protocolos de detección.

Ejemplo 7: Límite de detección (LDD) y reproducibilidad

Los datos cuantitativos obtenidos permitieron determinar el límite de detección (LDD) y la reproducibilidad del ensayo de IHC del clon 124 BCL2.

Los experimentos ilustrados en las figuras 12A, 14A a 14C, 15A, y 17B representan 10 análisis independientes, cada uno con núcleos de TMA duplicados que no contienen péptido diana (en blanco) y contienen 6 concentraciones de péptido BCL2. Las figuras 19A y 19B y la tabla C resumen los datos. Para cada experimento, en el cálculo se utilizaron las medias de núcleos de TMA duplicados en cada concentración de péptido. Los valores son intensidades de píxeles de los núcleos de la TMA corregidos por la intensidad de fondo del portaobjetos de vidrio (19,2 ± 0,5 unidades).

Tabla C. Datos añadidos del ensa o de IHC del clon 124 de BCL2

De acuerdo con una convención de laboratorio clínico aceptada (Armbruster y Pry, 2008), el límite de blanco (LDB; = media^blanco + 1,645 * DT^blanco) para estos datos es de 8,0 unidades y el límite de detección ((LDD; = LDB 1,645 x DT^{muestra poco positiva}) es de 16 unidades, correspondiente a 2 ,3 *10 ^{- 7} M del péptido. Esta concentración equivale a una densidad de antígeno formulado de aproximadamente 140 moléculas por micrómetro cúbico de gel.

De acuerdo con estos cálculos, los resultados de las comparaciones de la prueba t bilateral de datos para núcleos con concentraciones crecientes del péptido BCL2 (Tabla C) mostraron que los núcleos con 2,5 x 10^-8 M del péptido (por debajo del LDD calculado) no son significativamente diferentes de los núcleos que carecen de péptido, mientras que los núcleos con 2,5 x 10^{- 7} M del péptido y superior (por encima del LDD calculado) son núcleos adyacentes estadísticamente diferentes. De manera notable, la señal en los núcleos que contienen las dos concentraciones de péptido más elevadas es estadísticamente diferente, a pesar de que la intensidad subjetiva de estos núcleos es similar.

Ejemplo 8: Uso de controles de IHC sintéticos para la validación de anticuerpos

Como se describe en el ejemplo 1 anterior (Véanse las figuras 5A a 5D), se incorporó otra proteína en un gel de BSA y se utilizó para evaluar los anticuerpos generados a partir de clones de hibridomas. En este caso, se utilizó un péptido que incluía los 301 aminoácidos carboxiterminales (es decir, los aminoácidos 650 a 950) de KSR2 humana. Los resultados descritos anteriormente demuestran que el enfoque de controles de IHC sintéticos proporciona un método útil para identificar anticuerpos adecuados para el análisis de IHC de una diana de interés, un proceso en el que normalmente se seleccionan de cientos a miles de anticuerpos candidatos para identificar un pequeño puñado (por ejemplo, de 2 a 5) de pistas para una caracterización adicional.

Los anticuerpos candidatos se analizaron adicionalmente para determinar la reactividad contra el antígeno sin recuperación previa del antígeno. Para cada anticuerpo, se necesitó la recuperación del antígeno para la reactividad detectable (Figuras 20A y 20B). Esto contrasta con los resultados con los péptidos BCL2 descritos en el ejemplo 4, para los cuales la recuperación del antígeno mejoró la fuerza de la señal aproximadamente 6 veces, pero no se necesitaba para la reactividad detectable (Figuras 15A a 15C).

Como prueba de las proteínas de longitud completa, se prepararon inmunoglobulinas de longitud completa de conejo, rata y ratón (IgG; (0,1 mg/ml; 6,7 x 10^{- 7} M) incorporadas en geles de BSA y se utilizaron como controles técnicos para ensayos de IHC que empleaban anticuerpos secundarios de burro biotininaldos anti-conejo, anti-rata y anti-ratón en las etapas de detección. Los resultados muestran la señal esperada y la especificidad de los anticuerpos secundarios anti-conejo, anti-ratón y anti-rata (Figuras 21A y 21B). Como se muestra en las figuras 21A y 21B, la IgG de conejo incorporada detectada con anticuerpo secundario de burro anti-IgG de conejo muestra 136 unidades de intensidad de píxel. Suponiendo una retención cuantitativa de la IgG de conejo añadida, 1 micrómetro cúbico (10-15l) de esta muestra contiene 6,7 * 10-22 moles o aproximadamente 400 moléculas detectables de IgG de conejo.

Ejemplo 9: Prueba de fijadores alternativos para elaborar geles

Debido a que algunos epítopos se vuelven no reactivos mediante fijadores que contienen formalina, se probó un fijador de zinc sin formalina disponible en el mercado como alternativa al formaldehído al 37 % utilizado en experimentos anteriores.

Los bloques donantes que contenían los péptidos BCL2 y MYC en geles de BSA se fijaron con formalina o fijadores a base de zinc con calentamiento a 85 °C (Figuras 22a a 22C). Para los péptidos BCL2 y MYC, la señal fue aproximadamente 10 veces más fuerte con la fijación con formaldehído que con la fijación con zinc durante el calentamiento. La pérdida de intensidad de la señal se correlacionó con el calentamiento en presencia de zinc. Los procedimientos alternativos en los que las mezclas de BSA y antígenos se calentaron a 85 °C en ausencia de fijador, seguido de la fijación a temperatura ambiente en varios fijadores (paraformaldehído al 4 %, formalina tamponada neutra, fijador sin formalina que contiene zinc) dieron como resultado una señal comparable al protocolo convencional descrito anteriormente (Figuras 23A y 23B). Esto demuestra que la técnica puede adaptarse a varios fijadores, potencialmente ampliando la gama de epítopos y anticuerpos que podrían utilizarse.

Ejemplo 10: Análisis de citometría de masas de imágenes

En los experimentos mencionados anteriormente, se desconoce el número de moléculas de cromógeno o fluorocromo depositadas por cada molécula de anticuerpo unido, por lo que no se puede calcular la concentración absoluta del epítopo detectado. Para evitar esta limitación, se probó un procedimiento de detección directa más cuantitativo utilizando el generador de imágenes basado en espectrometría de masas Hyperion.

Las secciones de la TMA con el péptido BCL2 se tiñeron con el anticuerpo EPR 17509 anti-BCL2 marcado con 146Nd, después se analizaron mediante ablación con láser ultravioleta y espectrometría de masas cuantitativa. La muestra de TMA cuantificada era normalmente un área de 150 micrómetros cuadrados por 4 micrómetros de espesor, que contenía 9 * 104 micrómetros cúbicos. Los resultados mostraron una señal graduada que aumenta a medida que aumenta la concentración de péptido BCL2 en la diana (Figuras 24A a 24C). La señal del anticuerpo EPR17509 en núcleos que no contenían péptido o en núcleos que contenían el péptido MCL1 de control negativo fue inferior al 3 % de la señal máxima.

La correlación entre los recuentos de iones medidos y la concentración de los anticuerpos se determinó mediante el análisis de las cantidades conocidas de anticuerpo marcado con 146Nd colocado directamente en el portaobjetos de vidrio. Los datos de calibración resultantes (Tabla D) mostraron una proporción de aproximadamente 340 moléculas de anticuerpo por ion 146Nd detectado.

Tabla D. Cuantificación de iones de anticuer os

Mediante la comparación de la cantidad del péptido BCL2 formulado en cada muestra de núcleo de TMA con la cantidad de anticuerpo anti-BCL2 marcado con 146Nd medido, se determinó la fracción del péptido BCL2 que era detectable en los núcleos de TMA. Los resultados (Tabla E) mostraron que la cantidad del péptido BCL2 detectable aumentó con el aumento de la concentración del péptido, como cabía esperar.

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Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Un método para generar un gel sólido de antígeno/proteína transportadora para la tinción inmunohistoquímica (IHC), comprendiendo el método:

(a) mezclar un antígeno purificado con una solución líquida que comprende una proteína transportadora para producir una solución líquida de antígeno/proteína transportadora; y

(b) calentar la solución líquida de antígeno/proteína transportadora para formar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora,

en donde el antígeno es un antígeno polipeptídico, la proteína transportadora consiste en una proteína de seroalbúmina y la solución líquida de antígeno/proteína transportadora incluye un agente de reticulación.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además, después de (b):

(i) deshidratar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora e incluir el gel sólido de antígeno/proteína transportadora deshidratado en un bloque de parafina y, opcionalmente, transferir un núcleo que comprende el gel de antígeno/proteína transportadora del bloque de parafina a un bloque de micromatriz de tejido (TMA) receptor; o

(ii) incubar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora en un medio de inclusión líquido y congelar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora en el medio de inclusión; o

(iii) incluir el gel sólido de antígeno/proteína transportadora en una resina plástica; o

(iv) cortar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora en una o más secciones de gel sólido de antígeno/proteína transportadora que tienen un espesor de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 50 |jm.

3. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde el agente de reticulación es un fijador a base de aldehído.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el fijador comprende formaldehído, opcionalmente a una concentración final de al menos aproximadamente un 1 %.

5. El método de la reivindicación 1, que comprende además:

después de (b), deshidratar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora;

incluir el gel sólido de antígeno/proteína transportadora deshidratado en un bloque de parafina;

cortar el bloque de parafina con el gel de antígeno/proteína transportadora incluido en una o más secciones que tengan un espesor de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 50 jm;

someter la una o más secciones del gel sólido de antígeno/proteína transportadora incluido a la recuperación del antígeno; y

después de la recuperación del antígeno, bloquear la una o más secciones del gel sólido de antígeno/proteína transportadora incluido.

6. El método de la reivindicación 1, que comprende además:

después de (b), incubar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora en un medio de inclusión líquido; congelar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora en el medio de inclusión;

cortar el gel de antígeno/proteína transportadora congelado en una o más secciones que tengan un espesor de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 50 jm; y

bloquear la una o más secciones del gel de antígeno/proteína transportadora congelado.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el antígeno comprende una tirosina aminoterminal, una cisteína carboxiterminal o ambas.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el agente de reticulación es un reactivo que reacciona con la cisteína.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la proteína seroalbúmina es seroalbúmina bovina, de cabra, de caballo o humana, opcionalmente, en donde la solución líquida de antígeno/proteína transportadora producida en (a) comprende la proteína transportadora a una concentración superior o igual al 2 % (p/v) e inferior o igual al 25 % (p/v).

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la solución líquida de antígeno/proteína transportadora se calienta en (b) a al menos aproximadamente 65 °C, opcionalmente, en donde la solución líquida de antígeno/proteína transportadora se calienta en (b) a al menos aproximadamente 65 °C durante al menos 6 minutos.

11. Un gel sólido de antígeno/proteína transportadora producido mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Una micromatriz de tejido (TMA) que comprende al menos un primer gel sólido de antígeno/proteína transportadora producido mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora producido mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. Un gel sólido de antígeno/proteína transportadora para la tinción inmunohistoquímica (IHC) que comprende un antígeno purificado reticulado con una proteína transportadora, en donde el antígeno es un antígeno polipeptídico, la proteína transportadora consiste en una proteína seroalbúmina y el gel sólido se ha formado en presencia de un agente de reticulación, opcionalmente en donde el gel sólido tiene un espesor de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 50 pm.

14. El gel sólido de la reivindicación 13, en donde el gel sólido se congela en un medio de inclusión; o el gel sólido se incluye en parafina; o el gel sólido se incluye en una resina plástica.

15. El gel sólido de la reivindicación 13 o de la reivindicación 14, en donde el agente de reticulación es un fijador a base de aldehído.

16. El gel sólido de la reivindicación 15, en donde el fijador comprende formaldehído, opcionalmente a una concentración de al menos aproximadamente un 1 %.

17. El gel sólido de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en donde el antígeno comprende una tirosina aminoterminal, una cisteína carboxiterminal o ambas.

18. El gel sólido de la reivindicación 17, en donde el agente de reticulación es un reactivo que reacciona con la cisteína.

19. El gel sólido de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en donde la proteína seroalbúmina es seroalbúmina bovina, de cabra, de caballo o humana, opcionalmente en donde el gel sólido comprende la proteína transportadora a una concentración superior o igual al 2 % e inferior o igual al 25 %.

20. Un método para la tinción inmunohistoquímica (IHC) de un antígeno, que comprende:

proporcionar el gel sólido de antígeno/proteína transportadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19 o producirlo mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el gel sólido de antígeno/proteína transportadora contiene el antígeno;

proporcionar una muestra;

poner en contacto el gel sólido de antígeno/proteína transportadora y la muestra con un anticuerpo primario que se une de manera específica al antígeno;

después de poner en contacto el gel sólido de antígeno/proteína transportadora y la muestra con el anticuerpo primario, poner en contacto el gel sólido de antígeno/proteína transportadora y la muestra con un anticuerpo secundario que se une de manera específica al anticuerpo primario, en donde una fracción detectable se conjuga con el anticuerpo secundario;

detectar una señal de la fracción detectable del gel sólido de antígeno/proteína transportadora; y

detectar una señal de la fracción detectable de la muestra, en donde la detección de una señal a partir de la muestra en comparación con la señal detectada a partir del gel sólido de antígeno/proteína transportadora indica la presencia del antígeno en la muestra, opcionalmente en donde la muestra es una muestra de tejido.

21. Un método para controlar la tinción inmunohistoquímica (IHC) de un antígeno, que comprende:

proporcionar un primer y un segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora, en donde cada uno del primer y del segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora está de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19 o se produce mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el primer gel sólido de antígeno/proteína transportadora contiene el antígeno a una primera concentración y en donde el segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora contiene el antígeno a una segunda concentración superior a la primera concentración;

poner en contacto el primer y el segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora con un anticuerpo primario que se une de manera específica al antígeno;

en donde una fracción detectable se conjuga con el anticuerpo primario, o después de poner en contacto el primer y el segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora con el anticuerpo primario, poner en contacto el primer y el segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora con un anticuerpo secundario que se une de manera específica al anticuerpo primario, en donde una fracción detectable se conjuga con el anticuerpo secundario;

detectar una primera señal de la fracción detectable a partir del primer gel sólido de antígeno/proteína transportadora; y

detectar una segunda señal de la fracción detectable a partir del segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora, en donde la detección de una segunda señal mayor que la primera señal indica tinción IHC de control del antígeno.

22. El método de la reivindicación 21, que comprende además:

proporcionar una muestra;

poner en contacto la muestra con el anticuerpo primario;

después de poner en contacto la muestra con el anticuerpo primario, poner en contacto la muestra con el anticuerpo secundario;

detectar una tercera señal de la fracción detectable de la muestra; y

comparar la tercera señal con la primera y la segunda señal, en donde una cantidad de la tercera señal en relación con las cantidades de la primera y de la segunda señal indica una abundancia del antígeno en la muestra, en relación con las cantidades del antígeno en el primer y el segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora.

23. Un método para la tinción inmunohistoquímica (IHC) de control con un anticuerpo secundario, que comprende:

proporcionar un primer y un segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora, en donde cada uno del primer y del segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora está de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19 o se produce mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el primer gel sólido de antígeno/proteína transportadora comprende un primer anticuerpo que tiene un primer isotipo y en donde el segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora comprende un segundo anticuerpo que tiene un segundo isotipo diferente del primer isotipo;

poner en contacto el primer y el segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora con un anticuerpo secundario que se une de manera específica al primer isotipo, en donde una fracción detectable se conjuga con el anticuerpo secundario;

detectar una señal de la fracción detectable a partir del primer gel sólido de antígeno/proteína transportadora; y detectar una ausencia de la señal de la fracción detectable a partir del segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora, en donde la detección de la señal asociada al primer gel sólido de antígeno/proteína transportadora y la ausencia de la señal asociada al segundo gel sólido de antígeno/proteína transportadora indica una tinción de control con el anticuerpo secundario.

24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde la fracción detectable comprende una enzima, y en donde detectar la señal de la fracción detectable comprende exponer la fracción detectable a un sustrato cromogénico de la enzima y detectar una señal del sustrato cromogénico tras la reacción con la enzima.

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde la fracción detectable comprende un fluoróforo, una partícula metálica, un ion metálico, un radioisótopo, un ácido nucleico, un indicador electroquimioluminiscente o un punto cuántico.