CN117836627A - 从脱石蜡细胞开始的单细胞elisa用于检测感兴趣分子的用途 - Google Patents
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Abstract
本文提供了检测样本诸如患者的体液或组织中分子的存在的方法，其中所述方法包括：a.从样本中获得细胞；b.用固定剂处理所述细胞；c.石蜡包埋所固定的细胞；d.将所述细胞脱石蜡并悬浮以获得单细胞悬浮液；e.使悬浮细胞与结合至少一个所述悬浮细胞的分子的第一检测试剂接触；使结合至所述第一检测试剂的所述细胞与第二检测试剂接触；以及f.检测与所述样本的所述细胞结合的所述第二检测试剂的存在；其中与所述样本结合的所述第二检测试剂的量在背景之上的检测指示所述样本中至少一个分子的存在。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年6月23日提交的美国序列号63/214177的权益，其全文以引用方式并入本文。
技术领域
本文提供了检测样本诸如患者的体液或组织中分子的存在的方法。
发明内容
在一个方面，本文提供了一种检测样本中的分子的方法，包括：从样本中获得细胞；用固定剂处理所述细胞；石蜡包埋所固定的细胞；将所述细胞脱石蜡并悬浮以获得单细胞悬浮液；使悬浮细胞与结合所述悬浮细胞的至少一个分子的第一检测试剂接触；使结合至所述第一检测试剂的所述细胞与第二检测试剂接触；以及检测与所述样本的所述细胞结合的所述第二检测试剂的存在；其中与所述样本结合的所述第二检测试剂的量在背景之上的检测指示所述样本中至少一个分子的存在。
在一些实施方案中，所述分子为核酸或蛋白质。在一些实施方案中，所述核酸为RNA。在一些实施方案中，所述核酸为DNA。
在一些实施方案中，所述方法在使所述悬浮的细胞与第一检测试剂接触后进一步去除未结合的细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括在使结合至所述第一检测试剂的所述细胞与第二检测试剂接触后去除所述未结合的第二检测试剂。
在一些实施方案中，所述固定剂选自包括以下的组：甲醛、多聚甲醛、戊二醛或中性缓冲福尔马林。在一些实施方案中，所述固定剂为中性缓冲福尔马林。在一些实施方案中，所述中性缓冲福尔马林为10％中性缓冲福尔马林。
在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约30分钟至60分钟、1小时至2小时、2小时至3小时、3小时至4小时、4小时至5小时、5小时至6小时、6小时至7小时、7小时至8小时、8小时至9小时、9小时至10小时、10小时至11小时、11小时至12小时、12小时至13小时、13小时至14小时、14小时至15小时、15小时至16小时、16小时至17小时、17小时至18小时、18小时至19小时、19小时至20小时、20小时至21小时、21小时至22小时、22小时至23小时、23小时至24小时、24小时至36小时或36小时至48小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤在4℃、室温、40℃或60℃下进行。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤在室温下进行24小时。
在本文提供的方法的一个方面，固定的细胞的所述石蜡包埋包括：使所述细胞与乙醇接触；使所述细胞与二甲苯接触；以及用石蜡孵育所述细胞。
在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括：使所述细胞与70％乙醇水溶液接触30分钟；使所述细胞与80％乙醇水溶液接触30分钟；使所述细胞与95％乙醇水溶液接触30分钟；以及使所述细胞与100％乙醇接触30分钟。
在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换，每次20分钟。
在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次20分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括在60℃下进行。
在一些实施方案中，所述细胞通过使所述细胞与二甲苯接触而脱石蜡。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约5分钟至10分钟、10分钟至15分钟、15分钟至20分钟、20分钟至30分钟、30分钟至60分钟、60分钟至90分钟或90分钟至120分钟。
在一些实施方案中，所述细胞进一步与连续乙醇梯度接触。在一些实施方案中，其中所述细胞进一步与连续乙醇梯度接触，包括：使所述细胞与70％乙醇水溶液接触约15至约30分钟；使所述细胞与95％乙醇水溶液接触约15至约30分钟；以及最后使所述细胞与100％乙醇接触约15至约30分钟。
在本文提供的方法的一个方面，所述细胞在抗原修复溶液中重悬。
在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约30分钟。在一些实施方案中，所述细胞通过微波辐射加热。
在一些实施方案中，所述第一检测试剂和/或第二检测试剂为抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一检测试剂和/或第二检测试剂为基于RNA的粘结剂分子。
在本文提供的方法的一个方面，所述样本包含来自体液或组织的细胞。在一些实施方案中，所述体液为血液、血清或血浆。在一些实施方案中，所述样本来自患者。在一些实施方案中，所述患者为哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述样本包含来自永生化细胞系的细胞。
在另一方面，本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于执行根据本文提供的实施方案中任一项所述的方法。
在另一方面，本文提供了一种细胞的样本，所述细胞的样本根据本文提供的实施方案中任一项所述的方法制备。
附图说明
结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述发明内容和以下对本专利申请的具体实施方案的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。
图1显示了本文提供的用于增强检测和筛选分子的方法的示意图。
图2显示了在450nm处测量的光密度形式的抗体结合。每孔30000个细胞一式两份地测试每种抗体结合。命名为“对照阴性”的条件属于仅用抗体稀释剂孵育的细胞。
图3A至图3B显示了用各种抗体溶液对细胞颗粒块的4μm切片进行的免疫组织化学(“IHC”)测定的结果。图3A显示了每种抗体的IHC细胞颗粒染色。图3B显示了每个染色颗粒的H分数。基于计算细胞颗粒的总表面密度染色的面积定量算法计算每个染色颗粒的H分数。
图4显示本文提供的类ELISA方法与IHC染色之间的相关性评估。皮尔逊相关系数r＝0.929(GraphPad Prism)表明通过高通量类ELISA方法获得的筛选结果与对福尔马林固定的石蜡包埋(“FFPE”)组织样本进行的传统IHC之间的足够可比性。
具体实施方式
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均关于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。
本文描述或引用的技术和程序包括本领域技术人员通常熟知的和/或使用常规方法通常采用的那些，诸如例如以下文献中描述的广泛利用的方法：Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版，2001)；Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编辑，2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编辑，2009)；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar编辑，2010)；以及Antibody Engineering，第1卷和第2卷(Kontermann和Dübel编辑，第2版，2010)。除非本文另有定义，否则本说明书中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下术语描述，并且只要适当，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。在所阐述的术语的任何描述与以引用方式并入本文的任何文档冲突的情况下，将以下面所阐述的术语的描述为准。
以下参考文献的全部内容以引用方式并入本文：美国专利申请号10/872462、美国专利申请号14/115327、美国专利申请号13/536021、美国专利申请号10/320219、美国专利申请号11/319118、美国专利申请号14/652407、美国专利申请号13/571854、美国专利申请号11/772288，McGinnis等人(Journal of Pathology；2021；254(4)；405-417)，Sun等人(PLoS ONE；16(2)e0247238；2021)，Gentles等人(Journal of Clinical Pathology 2021；74:469-474)，Wilgenbusch等人，2020(Journal of the American Society ofCytopathology；9,20-25)和Mairaville等人(Antibodies；2021,10,4)。
5.1.定义
此处指出的是，如本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一种”、“一个”、“该”和“所述”包括复数指代，除非上下文中明确表示其他含义。
在本文的术语存在多个定义的情况下，除非另有说明，否则以该部分中的术语为准。
术语“约”或“大约”是指如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差，这部分地取决于如何测量或确定值。在某些方面，术语“约”或“大约”是指在1、2、3或4标准偏差内。在某些方面，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的50％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％内。
除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同方案。此类等同方案旨在由本发明所涵盖。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其它变型应被理解为是指包括指明的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其它元素。此外，除非明确地指明相反，否则“或”是指包括性的或而不是指排他性的或。例如，条件A或B由以下任一项满足：A为真(或存在)而B为假(或不存在)，A为假(或不存在)而B为真(或存在)，以及A和B两者为真(或存在)。
如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。超过一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，但不能将附加的整数或整数组添加到指定的方法、结构或组成中。
如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“基本上由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质上改变指定方法、结构或组成的基本或新型特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。
如本文所用，“施用”是指将存在于体外的物质注射或以其他方式物理递送至患者体内的动作，诸如通过口服、粘膜、皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。当治疗疾病或其症状时，通常在疾病或其症状发作后施用该物质。当预防疾病或其症状时，通常在疾病或其症状发作前施用该物质。
如本文所用，同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的术语“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。
如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到RNA的转录。该术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的抗体可处于宿主细胞的细胞质内，处于胞外环境诸如细胞培养物的生长培养基中，或锚定至细胞膜。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”可指由氨基酸组成的分子，并且可被本领域的技术人员识别为蛋白质。本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可为直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可夹杂有非氨基酸。该术语还涵盖已被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；天然修饰或干预修饰为例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
本文所述的肽序列根据通常的惯例书写，其中肽的N端区在左侧，并且C端区在右侧。虽然氨基酸的同分异构形式是已知的，但除非另外明确指明，它是所表示的氨基酸的L形式。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换使用，并且以最广泛的意义使用，并且具体地涵盖例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整的单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们表现出期望的生物活性即可)、单链抗体、单结构域抗体(例如VHH)及它们的片段(例如结构域抗体)。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的和/或亲和力成熟的，以及来自其他物种例如小鼠、兔、美洲驼等的抗体。术语“抗体”旨在包括免疫球蛋白多肽类别内的B细胞的多肽产物，其能够与特定分子抗原结合并且由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50kDa-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100个至约130个或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如，Antibody Engineering(Borrebaeck编辑，第2版，1995)；和Kuby，Immunology(第3版，1997)。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、包括来自骆驼科物种(例如美洲驼或羊驼)的单结构域抗体或其人源化变体、细胞内抗体、抗独特型(抗Id)抗体和上述任一种的功能性片段(例如，抗原结合片段)，其是指保留了该片段所来源的抗体的一些或全部结合活性的抗体重链或轻链多肽的部分。功能性片段(例如，抗原结合片段)的非限制性示例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab)2片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微抗体。具体地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，含有结合抗原的抗原结合位点的抗原结合结构域或分子(例如，抗体的一个或多个CDR)。此类抗体片段可见于例如Harlow和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers编辑，1995)；Huston等人.，1993,Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515；和Day,Advanced Immunochemistry(第2版，1990)。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。抗体可能既不是激动性的也不是拮抗性的。
“抗原”是抗体可选择性结合的结构。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原是多肽。在某些实施方案中，抗原与细胞缔合，例如，存在于细胞上或细胞中。
“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”或“结合抗原的结构域”是指特异性结合抗原的分子的一部分。抗原结合结构域可包括免疫球蛋白的结合抗原的部分，诸如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)、VH和VL、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd和Fv片段，由一个VH或一个VL组成的结构域抗体(dAb)，鲨鱼可变IgNAR结构域，驼峰化VH结构域，VHH，由模拟抗体的CDR诸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3以及LCDR1、LCDR2和/或LCDR3的氨基酸残基组成的最小识别单元，以及结合抗原的非抗体支架。
如本文所用，“表位”是本领域的术语，并且是指结合分子(例如包含单链抗体序列的抗体)可特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是线性表位或构象、非线性或不连续表位。在多肽抗原的情况下，例如，表位可以是多肽的连续氨基酸(“线性”表位)，或者表位可包含来自多肽的两个或更多个非连续区域的氨基酸(“构象”、“非线性”或“不连续”表位)。本领域技术人员将理解，一般来讲，线性表位可取决于或不取决于二级、三级或四级结构。例如，在一些实施方案中，结合分子与一组氨基酸结合，而无论它们是否在天然三维蛋白质结构中折叠。在其他实施方案中，结合分子需要构成表位的氨基酸残基表现出特定的构象(例如弯曲、扭曲、翻转或折叠)以便识别和结合表位。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及轻链的恒定结构域(CL)和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可包括人恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施方案中，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，该sFv多肽还包含在VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得该sFv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,New York，第269-315页(1994)。
如本文所用，“单结构域抗体”或“sdAb”是指单个单体可变抗体结构域并且能够抗原结合。单结构域抗体包括如本文所述的VHH结构域。单结构域抗体的示例包括但不限于天然缺乏轻链的抗体，诸如来自骆驼科物种(例如，美洲驼)的那些抗体、衍生自常规4链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除衍生自抗体的那些之外的单结构域支架。单结构域抗体可以来源于任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，如本文所述，单结构域抗体可以来源于骆驼科物种(例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼)中产生的抗体。除骆驼科之外的其它物种可以产生天然不含轻链的重链抗体；来源于此类其它物种的VHH在本公开的范围内。在一些实施方案中，本文所提供的单结构域抗体(例如，VHH)具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。单结构域抗体可以被基因融合或化学缀合至如本文所述的另一分子(例如，药剂)。单结构域抗体可以是较大结合分子的一部分(例如，多特异性抗体或功能性外源受体)。
术语“结合(binds)”或“结合(binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如形成复合物。相互作用可以是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可包括通过共价键或非共价键、相互作用或力保持在一起的两个或多个分子的结合。抗体上的单个抗原结合位点和靶分子诸如抗原的单个表位之间的总非共价相互作用的强度是抗体或功能性片段对该表位的亲和力。结合分子(例如抗体)与单价抗原的解离速率(koff)与缔合速率(kon)的比率(koff/kon)为解离常数KD，其与亲和力成反比。KD值越低，抗体的亲和力越高。KD值随着抗体和抗原的不同复合物而变化，并且取决于kon和koff两者。本文提供的抗体的解离常数KD可使用本文提供的任何方法或本领域技术人员众所周知的任何其他方法来确定。一个结合位点处的亲和力并不总是反映抗体与抗原之间的相互作用的真实强度。当含有多个重复抗原决定簇的复合抗原(诸如多价抗原)与含有多个结合位点的抗体接触时，抗体与抗原在一个位点处的相互作用将增加在第二个位点处反应的概率。多价抗体与抗原之间的这种多重相互作用的强度称为亲合力。
如本文所用，术语“体液”是指从患者诸如哺乳动物(例如人)患者获得的流体。例如，体液可以是血液、脑脊髓液(CSF)、母乳或尿液。体液也可经血液分馏以去除细胞(即血浆)或细胞和凝血因子(即血清)。
如本文所用，术语“捕获部分”或“第一抗体”是指能够被另一组合物特异性结合的组合物，该另一组合物被固定例如附接或以其他方式连接至固体载体。本文提供的许多检测部分也可用作捕获部分，只要涉及结合事件即可。例如，可用的捕获部分包括有特异性和选择性配体可用的亲和标签(例如生物素与抗生物素蛋白，谷胱甘肽与GST)，有抗血清或单克隆抗体可用的半抗原和蛋白质(例如c-Myc)，具有与靶互补的序列的核酸分子，以及有特异性和选择性配体可用的肽(例如组氨酸标签与Ni)。还设想了影响与色谱树脂的结合特性的分子。固体载体可以是例如过滤器、板、膜、色谱树脂或珠。
如本文所用，术语“切割点因子”或“阈值”通常是指用于数学处理来自原始混合基质(例如血清或血浆)的信号的值，用于设定样本被认为是阳性所需的最小信号。
当与本文提供的方法中使用的抗体物质和多肽结合使用时，术语“衍生物”指通过以下技术化学修饰的多肽，该技术包括但不限于泛素化、与治疗或诊断剂缀合、标记(例如用放射性核素或各种酶)、共价聚合物附接诸如聚乙二醇化(即用聚乙二醇衍生化)和通过氨基酸诸如鸟氨酸的化学合成的插入或取代，其通常不在人蛋白质中出现。衍生物能够保留未衍生化分子的结合性质。
如本文所用，术语“可检测部分”、“检测部分”或“标记”是指可通过包括但不限于光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合物(例如多肽或抗体)。例如，可用的可检测部分或标记包括基于钌(Ru)的催化剂、铕、32P、35S、荧光染料、电子高密度试剂、酶(例如在ELISA中常用的)、生物素-链霉亲和素、地高辛、有抗血清或单克隆抗体可用的半抗原和蛋白质以及具有与靶互补的序列的核酸分子。可检测部分或标记通常产生可测量的信号，诸如放射性、显色、发光或荧光信号，其可用于定量样本中结合的可检测部分或标记的量。
如本文所用，术语“可检测抗体”是指可被检测的任何抗体。在一些实施方案中，抗体直接用可检测部分标记。在某些实施方案中，抗体是可检测的抗Ig抗体。如本文所用，术语“可检测的抗Ig抗体”是指可被检测的抗Ig抗体。在一些实施方案中，抗Ig抗体除了与Ig分子的固有结合外，还直接用可检测部分标记。Ig抗体可以是例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY同种型。
如本文所用，术语“初级抗体”是指直接结合感兴趣的抗原的抗体。如本文所用，术语“二级抗体”是指与检测标记缀合的抗体。在一些实施方案中，本文提供的二级抗体直接结合初级抗体。在其他实施方案中，本文提供的二级抗体间接结合初级抗体，例如通过与识别该初级抗体的另一抗体结合。
在肽或多肽的上下文中，如本文所用，术语“片段”是指包含少于全长氨基酸序列的肽或多肽。这样的片段可以例如由在氨基末端的截短、在羧基末端的截短和/或来自氨基酸序列的残基的内部缺失产生。片段可以例如由替代性RNA剪接或由体内蛋白酶活性产生。本文公开的肽或多肽的任何片段都是功能性的。在某些实施方案中，片段包括多肽，该多肽包含免疫特异性结合靶抗原的抗体的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，免疫特异性结合靶抗原的抗体片段保留抗体的至少1种、至少2种或至少3种功能。
在两个或更多个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性时，相同的或具有相同的核苷酸或氨基酸残基的指定百分比的两条或更多条序列或子序列，如使用序列比较算法或通过目视检查所测量的。
术语与靶抗原“免疫特异性结合的抗体”和类似术语在本文中可互换使用，并且是指仅与靶抗原或表位特异性结合的抗体及其片段。在其他实施方案中，本文提供的抗体免疫特异性结合Ig诸如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA同种型。
如本文所用，术语“干扰”通常是指存在于体液(例如血清或血浆)样本中的物质，这些物质会妨碍目标分析物的准确检测和测量。如本文所用，干扰通常是指游离药物或基质(例如血清或血浆)对浓度-响应关系的影响。例如，来自基质的干扰可以被评估为相对于没有潜在干扰的样本的相对准确度，以75-125％相对准确度的范围为目标。
在样本的上下文中，术语“体内”是指从受试者例如患者诸如人类患者获得的样本，包括生物样本诸如生物或体液例如血液、血浆、血清、骨髓、脊髓液、脑液或组织诸如淋巴组织、薄层细胞学样本、新鲜冷冻组织样本或肿瘤组织。术语“体内”不同于术语“体外”，其涵盖已经在活生物体之外培养或繁殖的细胞或细胞系或细胞的生物分子组分。
如本文所用，术语“检测限”、“LOD”或“灵敏度”通常是指可被检测但不必定量为精确值的体液(例如血清或血浆)样本中的最低分析物浓度。例如，LOD可定义为始终产生大于混合原始基质的测量平均响应加上切割点因子的信号的分析物浓度。
如本文所用，术语“基质”通常是指测量抗体的生物学背景。基质的示例包括例如体液和组织。
术语“单克隆抗体”是指从同质或基本上同质的抗体群体获得的抗体，并且每种单克隆抗体通常将识别抗原上的单一表位。在某些实施方案中，如本文所用，“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其他细胞产生的抗体，其中如通过例如ELISA或本领域已知的其他抗原结合或竞争性结合测定所测定，该抗体免疫特异性地仅与一种酶结合。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。例如，用于本文提供的方法中的单克隆抗体可通过如Kohler等人；Nature，256:495(1975)中描述的杂交瘤方法制得或可使用本领域已知的技术从噬菌体文库中分离。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法是本领域熟知的(例如参见Short Protocols in Molecular Biology，(2002)第5版，Ausubel等人编辑，John Wiley and Sons，New York的第11章)。
如本文所用，“多克隆抗体”是指在对具有许多表位的蛋白质的免疫原性应答中产生的抗体群，因此包括针对蛋白质内的相同表位和不同表位的多种不同抗体。生产多克隆抗体的方法是本领域已知的(例如参见，例如参见Short Protocols in Molecular Biology，(2002)第5版，Ausubel等人编辑，John Wiley and Sons，New York的第11章)。
如本文所用，术语“精度”通常是指分析者和日期之间信号的波动。例如，精度可以被评估为变异系数、值的范围或使用ANOVA统计值。
如本文所用，术语“预防”是指由于施用本文提供的疗法或疗法组合而导致的疾病和/或与其相关的症状(例如与患者中升高的苯丙氨酸水平相关的疾病或与其相关的症状，诸如PKU或癌症)的发展、复发、发作或扩散的全部或部分抑制。
如本文所用，术语“试剂稳定性”通常是指试剂的制备和贮存稳定性的稳健性。例如，试剂稳定性可通过仍允许测量值相对于新鲜制备的试剂在75％-125％准确度内的条件来建立。
如本文所用，术语“稳健性”通常是指测定保持不受方法参数的小变化影响的能力，并且指示在正常运行条件期间测定的可靠性。例如，稳健性可以被评估为相对于标称条件仍在75％-125％准确度内产生信号的试剂浓度、试剂体积或孵育时间的百分比变化。
如本文所用，术语“样本”通常是指例如取自患者的测试流体或组织，其可用于本文提供的方法中。在一些实施方案中，样本是体内样本，例如来自受试者例如患者诸如人类患者的体(或生物)液。此类体液的非限制性示例包括血液(例如人外周血(HPB))、血液裂解物、血清、血浆、细针抽吸物、导管灌洗、脊髓液、脑液、骨髓、腹水或它们的任意组合。在其他实施方案中，样本取自活检组织，诸如来自受试者的肿瘤组织或其他身体组织或器官的薄层细胞学样本。在某些实施方案中，样本包括外周血样本、肿瘤组织或疑似肿瘤组织、薄层细胞学样本、细针抽吸物样本、骨髓样本、淋巴结样本、尿液样本、腹水样本、灌洗样本、食管刷检样本、膀胱或肺洗液样本、脊髓液样本、脑液样本、导管抽吸物样本、乳头溢液样本、胸腔积液样本、新鲜冷冻组织样本、石蜡包埋组织样本。在其他实施方案中，样本是从外周血样本、肿瘤组织或疑似肿瘤组织、薄层细胞学样本、细针抽吸物样本、骨髓样本、尿液样本、腹水样本、灌洗样本、食管刷检样本、膀胱或肺洗液样本、脊髓液样本、脑液样本、导管抽吸物样本、乳头溢液样本、胸腔积液样本、新鲜冷冻组织样本或石蜡包埋组织样本中的任一种产生的提取物或加工样本。
在本文提供的一些实施方案中，样本包含来自细胞系的细胞。在一个实施方案中，细胞系是细胞系诸如Vero细胞、CHO细胞、MDCK细胞、293T细胞、HEK293T细胞、Expi293F细胞、BHK细胞、HEK 293细胞、NS0细胞、PER.C6细胞、CRL7O3O细胞、HsS78Bst细胞、HeLa细胞、NIH 3T3细胞或其他细胞系。
在上述或下述实施方案中的任一实施方案的一些实施方案中，其中样本包含来自永生化细胞系的细胞。
如本文所用，“永生化细胞系”描述由于突变而已经逃避正常细胞衰老并且反而可继续进行分裂的细胞群体。因此来自永生化细胞系的细胞可以在体外长时间生长。永生所需要的突变可天然发生或出于实验目的有意诱导。永生化细胞可以是不停止分裂的肿瘤细胞/癌细胞，或者是经过人工操作而无限增殖的细胞，因此可以培养数代。永生化细胞系可包括但不限于：例如气道内皮细胞、主动脉内皮细胞、巴雷特食管上皮细胞、支气管上皮细胞、呼吸上皮细胞、软骨细胞成纤维细胞、表皮微血管内皮细胞(包括TIME细胞)、子宫内膜成纤维细胞、包皮角质细胞、肺内皮细胞、乳房上皮细胞、间充质干细胞、NTAP施万细胞、胰管细胞、前列腺细胞、肾上皮细胞、视网膜色素上皮细胞和皮肤成纤维细胞。
在上述或下述实施方案中的一些实施方案中，提供了方法，其中样本包含来自永生化细胞系的细胞。永生化细胞系可商购获得用于本文所述的用途。各种永生化细胞系是众所周知的并可商购获得(Manassas，VA)。
如本文所用，术语“特异性”通常是指检测与特定蛋白反应的抗体的测定的能力。例如，特异性可以指与特异性分析物成比例的检测响应，而对非特异性蛋白质的响应应低于LOD。可针对大于或等于0.98的相关系数R值来评估成比例的响应。当与本文提供的方法结合使用以检测靶抗原时，特异性是指检测与特定蛋白反应的抗原的能力。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所用，受试者优选是哺乳动物诸如非灵长类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如猴和人)，最优选是人。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选是人。在本文提供的方法和试剂盒的一些实施方案中，患者具有疾病或症状或癌症。在本文提供的方法和试剂盒的其他实施方案中，患者是经历癌症疗法的患者。在本文提供的方法和试剂盒的其他实施方案中，患者是妊娠女性或婴幼儿(例如年龄0至约36个月)。
如本文所用，术语“标签”和“标记”可互换使用，并且指附接到抗体或其抗原结合片段或本文提供的方法中使用的其他多肽的任何类型的部分。关于抗体或标签的术语“可检测”或“检测”是指能够被可视化或其中该抗体或标签的存在能够以其他方式被确定和/或测量(例如通过定量)的任何抗体或标签。可检测标签的非限制性示例包括荧光或其他化学发光标签，以及可使用PCR扩增和定量的标签。在某些实施方案中，本文提供的方法中使用的二级抗体是与标记的链霉亲和素组合使用的生物素酰化的二级抗体。
如本文所用，术语“疗法”是指可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病(或与其相关的症状)或癌症的任何方案、方法和/或药剂。在某些实施方案中，术语“疗法”是指生物疗法、支持疗法和/或可用于预防、管理、治疗和/或改善本领域技术人员(例如医务人员)已知的疾病或癌症的其他疗法。
如本文所用，术语“组织”是指从哺乳动物例如人获得的组织。例如，组织可以来自活检样本、手术取出的组织或死后收集物。此外，可将组织均质化并提取以从该组织中分离酶或抗体。
如本文所用，术语“治疗”是指由施用一种或多种疗法引起的疾病(或与其相关的症状)或癌症的进展、严重程度和/或持续时间的减少或改善。
如本文所用，术语“变体”是指相对于原始多肽编码区域在编码区中包含至少一个氨基酸取代、缺失或插入的多肽序列。变体保留了天然存在的多肽的生物活性。
如本文所用，术语“原位杂交”或“ISH”是指用于定位和显现特定靶核酸并保持源样本形态的技术。
如本文所用，术语“免疫组织化学”或“IHC”是指利用抗体检测源样本中感兴趣的蛋白质并保持源样本形态的技术。免疫荧光(IF)是指荧光标记，因此其也涵盖在术语IHC中。
如本文所用，术语“交联”是指将两个或更多个分子结合在一起的过程。“交联剂”或等效物是指包含两个或更多个化学反应性末端的试剂，该化学反应性末端将它们自身附接到蛋白质和其他分子中发现的官能团上。具体地，如果交联剂是甲醛或其等效物，氨基酸或核酸碱基上的亲核基团与甲醛形成共价键，其在涉及通常在另一分子上的另一官能团的第二步骤中被稳定化，导致亚甲基桥的形成。如果交联剂是氧化剂，它可以与蛋白质的侧链和其他生物分子反应，允许形成稳定组织结构的交联。
如本文所用，当参考在IHC过程中固定样本时，术语“固定”是指防止样本由于例如自溶或腐败而腐烂的程序。它终止任何正在进行的生化反应，并且还可以增加经处理的组织的机械强度或稳定性。
如本文所用，术语“检测”通常是指任何形式的测量，并且包括确定元素是否存在。该术语包括定量和/或定性测定。
5.2 IHC
在福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织上的免疫组织化学(IHC)是通过鉴定表达感兴趣的靶蛋白的细胞和预测潜在毒性的R&D治疗活动中的关键步骤。稳健的IHC测定依赖于以最佳特异性和灵敏度可靠地识别靶的合适的初级抗体。FFPE组织通常存在具有改变的构象的过度固定的蛋白质，这使得在非IHC测定中验证的抗体的再利用极其不确定。在组织制备和保存过程中，如果使用交联剂诸如福尔马林，福尔马林固定可掩蔽表位并导致降低的免疫反应性(参见Arnold等人，Biotech Histochem 71:224-230(1996))。福尔马林固定是一种时间依赖性过程，在该过程中增加的固定时间导致甲醛基团继续与蛋白质结合，达到平衡点(参见Fox等人，J Histochem Cytochem 33:845-853(1985))。研究已经表明，特别是如果延长，福尔马林固定会导致降低的抗原性(参见Battifora和Kopinski，J HistochemCytochem 34:1095-1100(1986))，这限制了福尔马林固定的组织在诊断IHC中的使用(参见Ramos-Vara，Vet Pathol 42:405-426(2005)，Webster等人，J Histochem Cytochem.57(8):753-761(2009))。当合适的试剂不可商购获得时，新IHC抗体的产生需要针对相关对照筛选许多候选物。
本文提供的方法通过修改常规方案克服了上述挑战。本文提供了允许使用固定的细胞系(模拟FFPE组织)筛选FFPE IHC质量抗体同时保持适于基于细胞的ELISA测定的单细胞悬浮液的方法。该方案使得许多抗体和条件的高通量测试能够进行，这在传统的安装在载玻片上的对照中是不可能及时执行的。
5.3用于增强检测和筛选分子的方法
在一个方面，本文提供了一种检测样本中的分子的方法，包括从样本中获得细胞；然后用固定剂处理细胞，然后石蜡包埋固定的细胞，之后进行将细胞脱石蜡并悬浮以获得单细胞悬浮液，然后使悬浮的细胞与第一检测试剂接触，然后使结合至第一检测试剂的细胞与第二检测试剂接触，并检测与样本的细胞结合的第二检测试剂的存在。
在一个优选的实施方案中，样本在进行所述方法的步骤前从受试者获得。
在一些实施方案中，第一检测试剂和/或第二检测试剂包含结合悬浮细胞的至少一个分子的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，在使悬浮细胞与第一检测试剂接触后去除未结合的细胞。
在一些实施方案中，所述第二检测试剂为抗体或其片段。
在一些实施方案中，在使结合至第一检测试剂的细胞与第二检测试剂接触后去除未结合的第二检测试剂。
在本文提供的方法的一个方面，与所述样本结合的所述第二检测试剂的量在背景之上的检测指示所述样本中至少一个分子的存在。
在一些实施方案中，在用固定剂处理细胞前，在火棉胶袋中培养并沉淀细胞。在一个实施方案中，通过用火棉胶溶液涂覆玻璃锥形管的内表面来产生火棉胶袋。在一个方面，首先将火棉胶溶液倒入玻璃试管中，使溶液放置1小时，在旋动试管的同时将火棉胶倒掉，将试管上下颠倒干燥1小时，然后将试管充满自来水，用石蜡膜覆盖并直立储存在4℃的冰箱中直至使用。在一个方面，火棉胶袋如Wilgenbusch等人，2020(Journal of theAmerican Society of Cytopathology；9,20-25)中所述制备。
在一些实施方案中，所述分子为核酸或蛋白质。在一些实施方案中，所述核酸为RNA。在一些实施方案中，所述核酸为DNA。
在一个方面，本文提供了一种检测样本中的RNA的方法，包括从样本中获得细胞；然后用固定剂处理细胞，然后石蜡包埋固定的细胞，之后进行将细胞脱石蜡并悬浮以获得单细胞悬浮液，然后使悬浮的细胞与第一检测试剂接触，然后使结合至第一检测试剂的细胞与第二检测试剂接触，并检测与样本的细胞结合的第二检测试剂的存在。
在一个方面，本文提供了一种检测样本中的DNA的方法，包括从样本中获得细胞；然后用固定剂处理细胞，然后石蜡包埋固定的细胞，之后进行将细胞脱石蜡并悬浮以获得单细胞悬浮液，然后使悬浮的细胞与第一检测试剂接触，然后使结合至第一检测试剂的细胞与第二检测试剂接触，并检测与样本的细胞结合的第二检测试剂的存在。
在一个方面，本文提供了一种检测样本中的蛋白质的方法，包括从样本中获得细胞；然后用固定剂处理细胞，然后石蜡包埋固定的细胞，之后进行将细胞脱石蜡并悬浮以获得单细胞悬浮液，然后使悬浮的细胞与第一检测试剂接触，然后使结合至第一检测试剂的细胞与第二检测试剂接触，并检测与样本的细胞结合的第二检测试剂的存在。
在一些实施方案中，所述固定剂选自包括以下的组：甲醛、多聚甲醛、戊二醛或中性缓冲福尔马林。在一些实施方案中，所述固定剂为甲醛。在一些实施方案中，所述固定剂为多聚甲醛。在一些实施方案中，所述固定剂为戊二醛。在一些实施方案中，所述固定剂为中性缓冲福尔马林。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括用固定剂处理所述样本，所述固定剂为固定剂的混合物。在一些实施方案中，所述固定剂为选自以下列表的两种或更多种固定剂的混合物溶液：甲醛、戊二醛、多聚甲醛、中性缓冲福尔马林、丙烯醛、四氧化锇、高锰酸盐固定剂、重铬酸盐固定剂和铬酸。在一个实施方案中，所述固定剂为Bouin’s固定剂，其为苦味酸、甲醛和乙酸的溶液。在一个实施方案中，所述固定剂为甲醛和戊二醛的混合物。在一个实施方案中，所述固定剂为FAA，其为乙醇、乙酸和甲醛的溶液。在一个实施方案中，所述固定剂为高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛(PLP)，其为多聚甲醛、L-赖氨酸和INaO4的溶液。在一个实施方案中，所述固定剂为磷酸盐缓冲福尔马林(PBF)。在一个实施方案中，所述固定剂为甲醛钙，其为甲醛和氯化钙的溶液。在一个实施方案中，所述固定剂为甲醛盐水，其为甲醛和氯化钠的溶液。在一个实施方案中，所述固定剂为锌福尔马林，其为甲醛和硫酸锌的溶液。在一个实施方案中，所述固定剂为Helly’s固定剂，其为甲醛、重铬酸钾、硫酸钠和氯化汞的溶液。在一个实施方案中，所述固定剂为Hollande’s固定剂，其为甲醛、乙酸铜、苦味酸和乙酸的溶液。在一个实施方案中，所述固定剂为Gendre’s溶液，其为甲醛、乙醇、苦味酸和冰醋酸的溶液。在一个实施方案中，所述固定剂为含醇福尔马林，其为甲醛、乙醇和乙酸钙的溶液。在一个实施方案中，所述固定剂为甲醛乙酸乙醇，其为甲醛、冰醋酸和乙醇的溶液。在一个实施方案中，所述固定剂为固定剂的混合物，其中所述混合物的至少一种固定剂为甲醛、中性缓冲福尔马林或戊二醛。在一个实施方案中，所述固定剂不是同时使用而是分开或连续使用的固定剂，其中至少一种固定剂为甲醛、中性缓冲福尔马林或戊二醛。
在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约30分钟至48小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约60分钟至36小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约2小时至24小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约5小时至20小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约10小时至15小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约30分钟至60分钟、1小时至2小时、2小时至3小时、3小时至4小时、4小时至5小时、5小时至6小时、6小时至7小时、7小时至8小时、8小时至9小时、9小时至10小时、10小时至11小时、11小时至12小时、12小时至13小时、13小时至14小时、14小时至15小时、15小时至16小时、16小时至17小时、17小时至18小时、18小时至19小时、19小时至20小时、20小时至21小时、21小时至22小时、22小时至23小时、23小时至24小时、24小时至36小时或36小时至48小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约30分钟至60分钟。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约1小时至2小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约2小时至3小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约3小时至4小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约4小时至5小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约5小时至6小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约6小时至7小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约7小时至8小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约8小时至9小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约9小时至10小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约10小时至11小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约11小时至12小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约12小时至13小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约13小时至14小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约14小时至15小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约15小时至16小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约16小时至17小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约17小时至18小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约18小时至19小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约19小时至20小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约20小时至21小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约21小时至22小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约22小时至23小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约23小时至24小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约24小时至36小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约36小时至48小时。
在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约30分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、36小时或48小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约30分钟。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约60分钟。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约2小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约3小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约4小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约5小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约6小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约7小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约8小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约9小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约10小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约11小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约12小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约13小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约14小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约15小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约16小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约17小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约18小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约19小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约20小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约21小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约22小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约23小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约24小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约25小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约26小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约27小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约28小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约29小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约30小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约36小时。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约48小时。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括在0℃至100℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在1℃至90℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在2℃至80℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在3℃至70℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在4℃至60℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在0℃至10℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在10℃至20℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在20℃至30℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在30℃至40℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在40℃至50℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在50℃至60℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在60℃至70℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在70℃至80℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在80℃至90℃的温度下用固定剂处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在90℃至100℃的温度下用固定剂处理所述样本。
在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤在4℃、室温、40℃或60℃下进行。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤在4℃下进行。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤在室温下进行。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤在40℃下进行。在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤在60℃下进行。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用5％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用8％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用12％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用15％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用20％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至5％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用5％至10％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％至15％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用15％至20％中性缓冲福尔马林处理所述样本。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括在0℃至100℃的温度下用1％至20％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在1℃至90℃的温度下用1％至20％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在2℃至80℃的温度下用1％至20％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在3℃至70℃的温度下用1％至20％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在4℃至60℃的温度下用1％至20％中性缓冲福尔马林处理所述样本。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括在0℃至20℃的温度下用10％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在20℃至40℃的温度下用10％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在40℃至60℃的温度下用10％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在60℃至80℃的温度下用10％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在80℃至100℃的温度下用10％中性缓冲福尔马林处理所述样本。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括在0℃至100℃的温度下用10％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在1℃至90℃的温度下用10％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在2℃至80℃的温度下用10％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在3℃至70℃的温度下用10％中性缓冲福尔马林处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在4℃至60℃的温度下用10％中性缓冲福尔马林处理所述样本。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约1℃的温度下用10％中性缓冲福尔马林(“NBF”)处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约2℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约3℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约4℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约5℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约6℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约7℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约8℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约9℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约10℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约11℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约12℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约13℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约14℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约15℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约16℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约17℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约18℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约19℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约20℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约21℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约22℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约23℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约24℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约25℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约26℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约27℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约28℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约29℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约30℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约35℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约40℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约45℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约50℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约55℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约60℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约65℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约70℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约75℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约80℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约85℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约90℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约95℃的温度下用10％NBF处理所述样本。在一些实施方案中，本文提供的方法包括在约100℃的温度下用10％NBF用10％NBF处理所述样本。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理所述生物样本0.1小时至48小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理所述生物样本0.1小时至36小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理所述生物样本0.1小时至24小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理所述生物样本0.2小时至22小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理所述生物样本0.25小时至20小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用1％至20％NBF处理所述生物样本0.25小时至18小时。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理所述生物样本0.1小时至48小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理所述生物样本0.1小时至36小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理所述生物样本0.1小时至24小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理所述生物样本0.2小时至22小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理所述生物样本0.25小时至20小时。在一些实施方案中，本文提供的方法包括用10％NBF处理所述生物样本0.25小时至18小时。
在一些实施方案中，用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤在室温下进行24小时。在一些实施方案中，用10％NBF处理所述细胞的所述步骤在室温下进行24小时。
在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在4℃的温度下用固定剂处理所述生物样本超过10小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在4℃的温度下用固定剂处理所述生物样本超过5小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在4℃的温度下用固定剂处理所述生物样本超过1小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在4℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约5小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在4℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约6小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在4℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约7小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在4℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约8小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在4℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约9小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在4℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约10小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在4℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约11小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在4℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约12小时。
在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本少于6小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本少于3小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本少于1小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本少于0.5小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.1小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.15小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.2小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.25小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.3小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.35小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.4小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.45小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.5小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.55小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.6小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.65小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.7小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.75小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.8小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.85小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约0.9小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约1小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约1.5小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约2小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约2.5小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约3小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约3.5小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在室温下用固定剂处理所述生物样本约4小时。
在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用固定剂处理所述生物样本少于6小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用固定剂处理所述生物样本少于3小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用固定剂处理所述生物样本少于1小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用固定剂处理所述生物样本少于0.5小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约0.1小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约0.25小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约0.5小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约0.75小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在40℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约1小时。
在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用固定剂处理所述生物样本少于6小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用固定剂处理所述生物样本少于3小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用固定剂处理所述生物样本少于1小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用固定剂处理所述生物样本少于0.5小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约0.1小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约0.25小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约0.5小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约0.75小时。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法包括在60℃的温度下用固定剂处理所述生物样本约1小时。
在本文提供的方法的一个方面，固定的细胞的所述石蜡包埋包括：使所述细胞与乙醇接触，然后使所述细胞与二甲苯接触，以及用石蜡孵育所述细胞。
在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与1％至100％乙醇接触。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与5％至95％乙醇接触。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与10％至90％乙醇接触。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与15％至85％乙醇接触。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与20％至80％乙醇接触。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括：使所述细胞与25％至75％乙醇接触。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括：使所述细胞与30％至70％乙醇接触。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括：使所述细胞与35％至65％乙醇接触。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括：使所述细胞与40％至60％乙醇接触。
在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.1小时至2小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.5小时至1.5小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.5小时至1小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.1小时至0.5小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.5小时至1小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触1小时至1.5小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触1.5小时至2小时。
在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.1小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.2小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.3小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.4小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.5小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.6小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.7小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.8小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触0.9小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触1小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触1.5小时。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括使所述细胞与乙醇接触2小时。
在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括：使所述细胞与65％-75％乙醇接触，然后使所述细胞与75％-85％乙醇水溶液接触，然后使所述细胞与90％-100％乙醇水溶液接触30分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括在多个时间间隔的多个浓度的乙醇。
在一些实施方案中，使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括：使所述细胞与70％乙醇水溶液接触30分钟，然后使所述细胞与80％乙醇水溶液接触30分钟，然后使所述细胞与95％乙醇水溶液接触30分钟；以及最后使所述细胞与100％乙醇接触30分钟。
在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的两次更换。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的四次更换。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的五次更换。
在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的两次更换，每次5分钟至40分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的两次更换，每次5分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的两次更换，每次10分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的两次更换，每次15分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的两次更换，每次20分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的两次更换，每次25分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的两次更换，每次30分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的两次更换，每次35分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的两次更换，每次40分钟。
在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换，每次5分钟至40分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换，每次5分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换，每次10分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换，每次15分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换，每次20分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换，每次25分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换，每次30分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换，每次35分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换，每次40分钟。
在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的四次更换，每次5分钟至40分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的四次更换，每次5分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的四次更换，每次10分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的四次更换，每次15分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的四次更换，每次20分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的四次更换，每次25分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的四次更换，每次30分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的四次更换，每次35分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的四次更换，每次40分钟。
在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的五次更换，每次5分钟至40分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的五次更换，每次5分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的五次更换，每次10分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的五次更换，每次15分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的五次更换，每次20分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的五次更换，每次25分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的五次更换，每次30分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的五次更换，每次35分钟。在一些实施方案中，使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的五次更换，每次40分钟。
在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的两次更换。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的三次更换。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的五次更换。
在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的两次更换，每次5分钟至40分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的两次更换，每次5分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的两次更换，每次10分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的两次更换，每次15分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的两次更换，每次20分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的两次更换，每次25分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的两次更换，每次30分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的两次更换，每次35分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的两次更换，每次40分钟。
在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的三次更换，每次5分钟至40分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的三次更换，每次5分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的三次更换，每次10分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的三次更换，每次15分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的三次更换，每次20分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的三次更换，每次25分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的三次更换，每次30分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的三次更换，每次35分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的三次更换，每次40分钟。
在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次5分钟至40分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次5分钟至10分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次10分钟至15分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次15分钟至20分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次20分钟至25分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次25分钟至30分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次30分钟至35分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次35分钟至40分钟。
在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次5分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次10分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次15分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次20分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次25分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次30分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次35分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次40分钟。
在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的五次更换，每次5分钟至40分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的五次更换，每次5分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的五次更换，每次10分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的五次更换，每次15分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的五次更换，每次20分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的五次更换，每次25分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的五次更换，每次30分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的五次更换，每次35分钟。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的五次更换，每次40分钟。
在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在5℃至100℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在10℃至90℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在20℃至80℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在30℃至70℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在40℃至60℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在0℃至10℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在10℃至20℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在20℃至30℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在30℃至40℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在40℃至50℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在50℃至60℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在60℃至70℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在70℃至80℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在80℃至90℃之间进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在90℃至100℃之间进行。
在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在5℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在10℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在15℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在20℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在25℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在30℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在35℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在40℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在45℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在50℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在55℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在60℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在65℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在70℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在75℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在80℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在85℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在90℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在95℃下进行。在一些实施方案中，用石蜡孵育所述细胞的所述步骤在100℃下进行。
在一些实施方案中，所述细胞通过使所述细胞与二甲苯接触而脱石蜡。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约5分钟至120分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约5分钟至10分钟、10分钟至15分钟、15分钟至20分钟、20分钟至30分钟、30分钟至60分钟、60分钟至90分钟或90分钟至120分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约5分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约10分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约15分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约20分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约25分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约30分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约35分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约40分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约45分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约50分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约55分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约60分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约90分钟。在一些实施方案中，所述细胞与二甲苯接触约120分钟。
在一些实施方案中，所述细胞进一步与如上所述的连续乙醇梯度接触。
在本文提供的方法的一个方面，所述细胞在抗原修复溶液中重悬。
在一些实施方案中，在60℃至100℃之间进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在60℃至70℃之间进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在70℃至80℃之间进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在80℃至90℃之间进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在90℃至100℃之间进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在75℃下进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞。在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞。
在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞约10分钟至60分钟。在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞约10分钟至20分钟。在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞约20分钟至30分钟。在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞约30分钟至40分钟。在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞约40分钟至50分钟。在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞约50分钟至60分钟。在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞约10分钟。在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞约20分钟。在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞约30分钟。在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞约40分钟。在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞约50分钟。在一些实施方案中，在60℃下进一步加热所述细胞约60分钟。
在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞约10分钟至60分钟。在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞约10分钟至20分钟。在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞约20分钟至30分钟。在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞约30分钟至40分钟。在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞约40分钟至50分钟。在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞约50分钟至60分钟。在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞约10分钟。在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞约20分钟。在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞约30分钟。在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞约40分钟。在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞约50分钟。在一些实施方案中，在65℃下进一步加热所述细胞约60分钟。
在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞约10分钟至60分钟。在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞约10分钟至20分钟。在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞约20分钟至30分钟。在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞约30分钟至40分钟。在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞约40分钟至50分钟。在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞约50分钟至60分钟。在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞约10分钟。在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞约20分钟。在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞约30分钟。在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞约40分钟。在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞约50分钟。在一些实施方案中，在70℃下进一步加热所述细胞约60分钟。
在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞约10分钟至60分钟。在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞约10分钟至20分钟。在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞约20分钟至30分钟。在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞约30分钟至40分钟。在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞约40分钟至50分钟。在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞约50分钟至60分钟。在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞约10分钟。在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞约20分钟。在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞约30分钟。在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞约40分钟。在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞约50分钟。在一些实施方案中，在80℃下进一步加热所述细胞约60分钟。
在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞约10分钟至60分钟。在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞约10分钟至20分钟。在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞约20分钟至30分钟。在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞约30分钟至40分钟。在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞约40分钟至50分钟。在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞约50分钟至60分钟。在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞约10分钟。在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞约20分钟。在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞约30分钟。在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞约40分钟。在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞约50分钟。在一些实施方案中，在85℃下进一步加热所述细胞约60分钟。
在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞约10分钟至60分钟。在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞约10分钟至20分钟。在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞约20分钟至30分钟。在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞约30分钟至40分钟。在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞约40分钟至50分钟。在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞约50分钟至60分钟。在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞约10分钟。在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞约20分钟。在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞约30分钟。在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞约40分钟。在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞约50分钟。在一些实施方案中，在90℃下进一步加热所述细胞约60分钟。
在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约10分钟至60分钟。在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约10分钟至20分钟。在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约20分钟至30分钟。在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约30分钟至40分钟。在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约40分钟至50分钟。在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约50分钟至60分钟。在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约10分钟。在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约20分钟。在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约30分钟。在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约40分钟。在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约50分钟。在一些实施方案中，在95℃下进一步加热所述细胞约60分钟。
在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞约10分钟至60分钟。在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞约10分钟至20分钟。在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞约20分钟至30分钟。在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞约30分钟至40分钟。在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞约40分钟至50分钟。在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞约50分钟至60分钟。在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞约10分钟。在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞约20分钟。在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞约30分钟。在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞约40分钟。在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞约50分钟。在一些实施方案中，在100℃下进一步加热所述细胞约60分钟。
在一些实施方案中，所述细胞通过微波辐射加热。在一些实施方案中，在水浴中加热所述细胞。
在本文提供的方法的一个方面，所述加热导致所述抗原的修复。
在一些实施方案中，所述第一检测试剂和/或第二检测试剂为抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一检测试剂和/或第二检测试剂为基于RNA的粘结剂分子。多个酶或非酶标记中的任一者可用作检测试剂，只要可分别检测酶活性或非酶标记即可。酶由此产生可检测信号，其可用于检测靶分子。特别有用的可检测信号是显色或荧光信号。这样的酶是本领域技术人员熟知的，包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等(参见Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，SanDiego(1996))。具有熟知的显色或荧光底物的其他酶包括各种肽酶，其中显色或荧光肽底物可用于检测蛋白水解裂解反应。显色和荧光底物的使用在细菌诊断中也是众所周知的，包括但不限于使用α-和β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶，6-磷酸-β-D-半乳糖苷6-磷酸半乳糖水解酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、淀粉酶、神经氨酸苷酶、酯酶、脂肪酶等(Manafi等人，Microbiol.Rev.55：335-348(1991))，并且具有已知显色或荧光底物的此类酶可容易地适用于本文提供的方法中。
产生可检测信号的各种显色或荧光底物是本领域技术人员熟知的并且是可商购获得的。可用于产生可检测信号的示例性底物包括但不限于用于辣根过氧化物酶的3，3’-二氨基联苯胺(DAB)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、氯萘酚(4-CN)(4-氯-1-萘酚)、2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺二盐酸盐(OPD)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)；用于碱性磷酸酶的5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-磷酸酯(BCIP)、氮蓝四唑(NBT)、Fast Red(Fast Red TR/AS-MX)和对硝基苯基磷酸酯(PNPP)；用于β-半乳糖苷酶的1-甲基-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷和2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃半乳糖苷；用于β-葡糖苷酶的2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃葡萄糖苷；等。示例性的荧光底物包括但不限于用于碱性磷酸酶的4-(三氟甲基)伞形酮磷酸酯；用于磷酸酶的4-甲基伞形酮磷酸酯双(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、4-甲基伞形酮磷酸酯双(环己基铵)和4-甲基伞形酮磷酸酯；用于辣根过氧化物酶的QuantaBluTM和Quintolet；用于β-半乳糖苷酶的4-甲基伞形酮β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)和萘并荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)；用于β-葡糖苷酶的3-乙酰基伞形酮β-D-吡喃葡萄糖苷和4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡萄糖苷；用于α-半乳糖苷酶的4-甲基伞形酮-α-D-吡喃半乳糖苷。用于产生可检测信号的示例性酶和底物还描述于例如美国公开2012/0100540中。各种可检测酶底物，包括显色或荧光底物，是众所周知的并且是可商购获得的(Pierce，Rockford IL；Santa CruzBiotechnology，Dallas TX；Invitrogen，Carlsbad CA；42 Life Science；Biocare)。通常，底物转化为形成沉淀的产物，沉淀沉积在靶核酸的位点上。其他示例性基底包括但不限于HRP-Green(42 Life Science)，Betazoid DAB，Cardassian DAB，Romulin AEC，BajoranPurple，Vina Green，Deep Space BlackTM，Warp RedTM，Vulcan Fast Red and FerangiBlue from Biocare(Concord CA；biocare.net/products/detection/chromogens)。
适合作为可检测标记的示例性稀土金属和金属同位素包括但不限于镧系元素(III)同位素诸如141Pr、142Nd、143Nd、144Nd、145Nd、146Nd、147Sm、148Nd、149Sm、150Nd、151Eu、152Sm、153Eu、154Sm、155Gd、156Gd、158Gd、159Tb、160Gd、161Dy、162Dy、163Dy、164Dy、165Ho、166Er、167Er、168Er、169Tm、170Er、171Yb、172Yb、173Yb、174Yb、175Lu和176Yb。例如，可以使用飞行时间质谱(TOF-MS)(例如，Fluidigm Helios和Hyperion系统，fluidigm.com/systems；South San Francisco,CA)来检测金属同位素。
生物素-抗生物素蛋白(或生物素-链霉亲和素)是众所周知的信号扩增系统，其基于以下事实：两个分子彼此具有非常高的亲和力，并且一个抗生物素蛋白/链霉亲和素分子可以结合四个生物素分子。抗体广泛用于免疫组织化学中的信号扩增。酪胺信号扩增(TSA)是基于通过过氧化物酶活性沉积大量半抗原化的酪胺分子。酪胺是酚类化合物。在存在少量过氧化氢的情况下，固定的辣根过氧化物酶(HRP)将标记的底物转化成寿命短、活性极强的中间体。然后，活化的底物分子在过氧化物酶结合位点处或附近与蛋白质的富电子部分诸如酪氨酸非常快速地反应并共价结合。以这种方式，许多与酪胺缀合的半抗原分子可以原位引入到杂交位点。随后，沉积的酪胺-半抗原分子可直接或间接可视化。例如在美国公开2012/0100540中更详细地描述了这种检测系统。
本文所述的实施方案可利用酶使用合适的显色或荧光底物产生可检测信号。应当理解，另选地，标记探针可具有直接与该标记探针的核酸部分偶联的可检测标记。示例性的可检测标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于显色或荧光标记(参见Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego(1996))。可用作标记的示例性荧光团包括但不限于罗丹明衍生物，例如四甲基罗丹明、罗丹明B、罗丹明6G、磺基罗丹明B、德克萨斯红(磺基罗丹明101)、罗丹明110及它们的衍生物诸如四甲基罗丹明-5-(或6)、丽丝胺罗丹明B等；7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)；荧光素及其衍生物；萘诸如丹酰基(5-二甲基氨基萘-1-磺酰)；香豆素衍生物诸如7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、7-二乙基氨基-3-[(4’-(碘乙酰基)氨基)苯基]-4-甲基香豆素(DCIA)、Alexa荧光染料(MolecularProbes)等；4,4-二氟-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省(BODIPYTM)及其衍生物(MolecularProbes；Eugene，OR)；芘和磺化芘诸如Cascade BlueTM及其衍生物，包括8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸等；吡啶基噁唑衍生物和dapoxyl衍生物(Molecular Probes)；荧光黄(3,6-二磺酸酯-4-氨基-萘酰亚胺)及其衍生物；CyDyeTM荧光染料(Amersham/GE Healthcare LifeSciences；Piscataway NJ)、ATTO 390、DyLight 395XL、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 490LS、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO 532、ATTO Rho6G、ATTO 542、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho3B、ATTO Rho11、ATTO Rho12、ATTO Thio12、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 594、ATTO Rho13、ATTO 610、ATTO 620、ATTO Rho14、ATTO 633、ATTO 643、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTO Oxa12、ATTO 665、ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740、Cyan 500NHS-Ester(ATTO-TECH、Siegen、Germany)等。示例性发色团包括但不限于酚酞、孔雀绿、硝基芳香化合物诸如硝基苯基、重氮染料、dabsyl(4-二甲基氨基偶氮苯-4’-磺酰基)等。
熟知的方法诸如显微镜法、细胞计量术(例如大量细胞计量术、飞行时间细胞计量术(CyTOF)、流式细胞术)或光谱学可用于可视化与各靶核酸相关的显色、荧光或金属可检测信号。通常，如果在相同测定中使用不同的标记，显色底物或荧光底物，或显色或荧光标记，或稀土金属同位素将用于特定测定，使得单一类型的仪器可用于检测相同样本中的核酸靶。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使用标记的初级抗体，因此除去进行其他IHC步骤的需要。在具体的实施方案中，所述初级抗体用显色标记来标记。在具体的实施方案中，所述初级抗体用荧光标记来标记。在具体的实施方案中，所述初级抗体用多核苷酸来标记。在具体的实施方案中，通过NHS(琥珀酰亚胺)酯方法标记所述初级抗体。在具体的实施方案中，通过异硫氰酸酯方法标记所述初级抗体。在具体的实施方案中，通过碳二亚胺方法标记所述初级抗体。在具体的实施方案中，通过双标签方法(催化剂及其底物)标记所述初级抗体。在具体的实施方案中，通过高碘酸盐方法标记所述初级抗体。初级抗体后的交联可适用于基于荧光的检测，与BasescopeTM信号扩增系统组合使用(参见Baker等人，Nature Communication 8:1998(2017))，或与使用类似方案的其他核酸检测方法组合使用。
在本文提供的方法的一个方面，所述样本包含来自体液或组织的细胞。在一些实施方案中，所述体液为血液、血清或血浆。在一个实施方案中，所述体液为血液。在一个实施方案中，所述体液为血清。在一个实施方案中，所述体液为血浆。在一个实施方案中，所述样本为组织标本或来源于组织标本。在一个实施方案中，所述样本为血液样本或来源于血液样本。在一个实施方案中，所述样本为细胞学样本或来源于细胞学样本。在一个实施方案中，所述样本为培养的细胞。在另一个实施方案中，所述样本为含有外来体的样本。在上述或下述实施方案中的任一实施方案的一些实施方案中，样本包含永生化细胞系。
组织标本包括例如组织活检样本。血液样本包括例如为诊断目的采集的血液样本。在血液样本的情况下，可直接分析血液，诸如在血液涂片中，或可处理血液，例如红细胞的裂解、PBMC或白细胞的分离、靶细胞的分离等，使得通过本公开的方法分析的样本中的细胞在血液样本中或来源于血液样本。类似地，可对组织标本进行加工，例如将组织标本切碎并进行物理处理或酶促处理，以将组织破坏成单个细胞或细胞簇。另外，如果需要的话，可处理细胞学样本以分离细胞或破坏细胞簇。因此，可以使用本领域公知的方法获得和处理组织、血液和细胞学样本。本公开的方法可用于诊断应用，以基于指示病理学的生物标记的核酸靶的存在或不存在来鉴定病理性细胞的存在或不存在。
本领域技术人员应理解，许多合适的样本类型中的任一者可用于使用本文提供的方法检测靶核酸和靶蛋白。用于本文提供的方法中的样本通常是生物样本或组织样本。这种样本可以从生物受试者获得，包括从个体或一些其他生物材料来源诸如活检、尸体解剖或法医材料收集的生物组织或流体来源的样本。生物样本还包括来自包含或怀疑包含癌前期或癌细胞或组织的生物受试者区域的样本，例如组织活检，包括细针抽吸物、血液样本或细胞学标本。这样的样本可以是但不限于从生物体诸如哺乳动物分离的器官、组织、组织部分、细胞和/或外来体。示例性生物样本包括但不限于细胞培养物，包括细胞、原代细胞培养物、细胞系、组织、器官、类器官、生物流体等。另外的生物样本包括但不限于皮肤样本、组织活检，包括细针抽吸物、细胞学样本、粪便、体液，包括血液和/或血清样本、唾液、精液等。此类样本可用于医学或兽医学诊断目的。
用于通过本文提供的方法进行分析的细胞样本的收集是本领域公知的(参见例如Dey，“Cytology Sample Procurement,Fixation and Processing”in Basic andAdvanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology pp.121-132,Springer,Singapore(2018)；“Non-Gynecological Cytology Practice Guideline”American Society of Cytopathology，由ASC执行委员会于2004年3月2日批准)。
例如，用于处理用于子宫颈组织分析的样本的方法，包括组织活检和细胞学样本，是本领域公知的(参见例如Cecil Textbook of Medicine,Bennett和Plum编辑，第20版，WBSaunders，Philadelphia(1996)；Colposcopy and Treatment of CervicalIntraepithelial Neoplasia:A Beginner’s Manual,Sellors和Sankaranarayanan编辑，International Agency for Research on Cancer，Lyon，France(2003)；Kalaf和Cooper，J.Clin.Pathol.60:449-455(2007)；Brown和Trimble，Best Pract.Res.Clin.Obstet.Gynaecol.26:233-242(2012)；Waxman等人，Obstet.Gynecol.120:1465-1471(2012)；CervicalCytology Practice Guidelines TOC，由美国细胞病理学会(ASC)执行委员会批准，2000年11月10日))。
在上述或下述实施方案中的任一实施方案的一些实施方案中，所述细胞由永生化细胞系组成。
在另一方面，本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于执行根据本文提供的实施方案中任一项所述的方法。在另一方面，本文提供了一种细胞的样本，所述细胞的样本根据本文提供的实施方案中任一项所述的方法制备。
本文提供的方法是有价值的研究工具以及诊断工具。在一些实施方案中，本文提供的方法用于映射复合组织中的空间组织。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法用于鉴定细胞类型和新细胞类型。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法用于鉴定细胞状态。在其他具体的实施方案中，本文提供的方法用于鉴定肿瘤微环境中的细胞类型和新细胞类型。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法用于鉴定肿瘤微环境中的细胞状态。
在一些实施方案中，本文提供的方法可用于自动化系统。在一些实施方案中，本文提供的方法可用于自动化方法。在一些实施方案中，自动化系统可用于所述固定细胞的石蜡包埋。在一些实施方案中，自动化方法可用于所述固定细胞的石蜡包埋。在一些实施方案中，自动化系统可用于所述细胞的脱石蜡。在一些实施方案中，自动化方法可用于所述细胞的脱石蜡。在本文提供的各种方法的一些实施方案中，每个步骤可以独立地是手动的或自动化的。在本文提供的各种方法的一些实施方案中，一些步骤是手动进行的，并且其他步骤是自动化的。
在一些实施方案中，本文提供的方法用于检测患病细胞和组织中改变的基因表达。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法用于定位特定细胞类型中改变的基因表达和理解肿瘤异质性。在一些具体的实施方案中，本文提供的方法用于研究肿瘤-免疫细胞相互作用。在一些实施方案中，本文提供的方法用于检测用于癌症诊断和预后的生物标记。在一些实施方案中，本文提供的方法用于检测用于癌症治疗的治疗靶。在一些实施方案中，本文提供的方法用于促进新抗体的验证。
实施方案
本发明提供了以下非限制性实施方案。
在一组实施方案中，提供了：
1.一种检测样本中的分子的方法，包括：
a.从样本中获得细胞；
b.用固定剂处理所述细胞；
c.石蜡包埋所固定的细胞；
d.将所述细胞脱石蜡并悬浮以获得单细胞悬浮液；
e.使悬浮细胞与结合所述悬浮细胞的至少一个分子的第一检测试剂接触；
f.使结合至所述第一检测试剂的所述细胞与第二检测试剂接触；以及
g.检测与所述样本的所述细胞结合的所述第二检测试剂的存在；
其中与所述样本结合的所述第二检测试剂的量在背景之上的检测指示所述样本中至少一个分子的存在。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述分子为核酸或蛋白质。
3.根据实施方案2所述的方法，其中所述核酸为RNA。
4.根据实施方案2所述的方法，其中所述核酸为DNA。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述方法在使所述悬浮的细胞与第一检测试剂接触后进一步去除未结合的细胞。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在使结合至所述第一检测试剂的所述细胞与第二检测试剂接触后去除所述未结合的第二检测试剂。
7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中所述固定剂选自包括以下的组：甲醛、多聚甲醛、戊二醛或中性缓冲福尔马林。
8.根据实施方案7所述的方法，其中所述固定剂为中性缓冲福尔马林。
9.根据实施方案8所述的方法，其中所述中性缓冲福尔马林为10％中性缓冲福尔马林。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约30分钟至60分钟、1小时至2小时、2小时至3小时、3小时至4小时、4小时至5小时、5小时至6小时、6小时至7小时、7小时至8小时、8小时至9小时、9小时至10小时、10小时至11小时、11小时至12小时、12小时至13小时、13小时至14小时、14小时至15小时、15小时至16小时、16小时至17小时、17小时至18小时、18小时至19小时、19小时至20小时、20小时至21小时、21小时至22小时、22小时至23小时、23小时至24小时、24小时至36小时或36小时至48小时。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤在4℃、室温、40℃或60℃下进行。
12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤在室温下进行24小时。
13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中固定的细胞的所述石蜡包埋包括：
a.使所述细胞与乙醇接触；
b.使所述细胞与二甲苯接触；以及
c.用石蜡孵育所述细胞。
14.根据实施方案13所述的方法，其中使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括：
a.使所述细胞与70％乙醇水溶液接触30分钟；
b.使所述细胞与80％乙醇水溶液接触30分钟；
c.使所述细胞与95％乙醇水溶液接触30分钟；以及
d.使所述细胞与100％乙醇接触30分钟。
15.根据实施方案13或14中任一项所述的方法，其中使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换，每次20分钟。
16.根据实施方案13至15中任一项所述的方法，其中用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次20分钟。
17.根据实施方案16所述的方法，其中用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括在60℃下进行。
18.根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其中所述细胞通过使所述细胞与二甲苯接触而脱石蜡。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述细胞与二甲苯接触约5分钟至10分钟、10分钟至15分钟、15分钟至20分钟、20分钟至30分钟、30分钟至60分钟、60分钟至90分钟或90分钟至120分钟。
20.根据实施方案18或19所述的方法，其中所述细胞进一步与连续乙醇梯度接触，包括：使所述细胞与70％乙醇水溶液接触约15至约30分钟；使所述细胞与95％乙醇水溶液接触约15至约30分钟；以及最后使所述细胞与100％乙醇接触约15至约30分钟。
21.根据实施方案1至20中任一项所述的方法，其中所述细胞在抗原修复溶液中重悬。
22.根据实施方案21所述的方法，其中在95℃下进一步加热所述细胞约30分钟。
23.根据实施方案22所述的方法，其中所述细胞通过微波辐射加热。
24.根据实施方案1至23中任一项所述的方法，其中所述第一检测试剂和/或第二检测试剂为抗体或其抗原结合片段。
25.根据实施方案1至23中任一项所述的方法，其中所述第一检测试剂和/或第二检测试剂为基于RNA的粘结剂分子。
26.根据实施方案1至25中任一项所述的方法，其中所述样本包含来自体液或组织的细胞。
27.根据实施方案26所述的方法，其中所述体液为血液、血清或血浆。
28.根据实施方案1至27中任一项所述的方法，其中所述样本来自患者。
29.根据实施方案28所述的方法，其中所述患者为哺乳动物。
30.根据实施方案29所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
31.根据实施方案1至30中任一项所述的方法，其中所述样本包含来自永生化细胞系的细胞。
32.一种试剂盒，所述试剂盒用于执行根据实施方案1至31中任一项所述的方法。
33.一种细胞的样本，所述细胞的样本根据实施方案1至31中任一项所述的方法制备。
本文描述了本发明的特定实施方案。在阅读前述描述后，所公开的实施方案的变型对于本领域的技术人员来说可能变得显而易见，并且预期那些技术人员可适当地采用此类变型。因此，本发明旨在以不同于本文具体描述的方式实践，并且本发明包括在适用法律允许的情况下在所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或以其它方式与上下文明显矛盾，否则在其所有可能变型中的上述元素的任何组合均涵盖于本发明中。已描述了本发明的多个实施方案。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可进行各种修改。因此，实施例部分中的描述旨在说明而非限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例
以下是对在研究中使用的各种方法和材料的描述，并且被提出以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本公开的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为其公开的范围，也不旨在表示执行以下实验并且是可以执行的所有实验。应当理解，不一定要执行以现在时态书写的示例性描述，而是可以执行这些描述以生成与本公开的教导相关联的数据等。已努力确保关于所使用的数字(例如量、百分比等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。
实施例1：适于组织IHC的抗体的高通量筛选方法
测试的抗体在表1中示出。
表1.抗体
| 抗体 | 提供者 | 目录号 | 稀释 |
| CD13 | Abcam | ab108382 | 1/750 |
| 波形蛋白 | Abcam | ab92547 | 1/500 |
| Ki67 | Abcam | ab16667 | 1/100 |
| α-SMA | Abcam | ab32575 | 1/250 |
| Lamp2 | Invitrogen | 51-2200 | 1/800 |
| CD3 | Abcam | ab16669 | 1/25 |
| GST | Argutus Medical | AML001 | 1/1000 |
| CK19 | Abcam | ab52625 | 1/800 |
| CD8 | Abcam | ab4055 | 1/200 |
培养NRK52E细胞(褐家鼠，肾上皮细胞)并在火棉胶袋中沉淀，然后在室温下在10％NBF中固定24小时。火棉胶袋通过用l溶液(Macron Chemicals目录号4560-04)涂覆15mL玻璃锥形管的整个内表面而产生。在处理后，将小的细胞颗粒包埋在石蜡块中，并且将剩余的细胞从火棉胶袋中去除并转移到二甲苯中。在二甲苯中洗涤3×15分钟后(直到所有可见的石蜡溶解)，通过连续乙醇梯度使细胞水合，然后沉淀。将细胞重悬于抗原修复溶液中，并通过微波辐射在95℃下加热30分钟。冷却后，将它们在PBS中洗涤，计数，并分布在96孔板中(30000/孔)。包括过滤器插入件的板也可用于该步骤并且可商购获得(Millipore，Burlington，MA)。例如，过滤器插入件可具有0.45μm孔径以防止在板的洗涤和离心之间损失细胞。
使用ImmPRESS HRP抗兔IgG聚合物检测试剂盒(Vector Labs，目录号MP-7451)。细胞在室温下用抗体溶液在搅拌下孵育60分钟。洗涤并用适当的二级抗体检测后，每孔加入50μL TMB溶液，并在室温下孵育30分钟。停止显色反应，在450nm处测量各孔的光密度。图2显示了在450nm处测量的光密度形式的抗体结合。每孔30000个细胞一式两份地测试每种抗体结合。命名为“对照阴性”的条件属于仅用抗体稀释剂孵育的细胞。
为了直接比较，用相同的抗体溶液对细胞颗粒块的4μm切片进行IHC分析(在DAKO自动染色机上进行IHC实验)。基于计算细胞颗粒的总表面密度染色的面积定量算法计算每个染色颗粒的H分数(Halo软件，IndicaLabs)。每个颗粒的H分数计算如下：H分数＝(％表面积1+)×1+(％表面积2+)×2+(％表面积3+)×3。图3A至图3B显示了用各种抗体溶液对细胞颗粒块的4μm切片进行的免疫组织化学(“IHC”)测定的结果。图3A显示了每种抗体的IHC细胞颗粒染色。图3B显示了每个染色颗粒的H分数。基于计算细胞颗粒的总表面密度染色的面积定量算法计算每个染色颗粒的H分数。
图4显示本文提供的类ELISA方法与IHC染色之间的相关性评估。皮尔逊相关系数r＝0.929(GraphPad Prism)表明通过高通量类ELISA方法获得的筛选结果与对福尔马林固定的石蜡包埋(“FFPE”)组织样本进行的传统IHC之间的足够可比性。
实施例2：人细胞材料和方法
获得并培养人细胞并在火棉胶袋中沉淀，然后在室温下在10％NBF中固定24小时。火棉胶袋通过用火棉胶溶液(Macron Chemicals目录号4560-04)涂覆15mL玻璃锥形管的整个内表面而产生。在处理后，将小的细胞颗粒包埋在石蜡块中，并且将剩余的细胞从火棉胶袋中去除并转移到二甲苯中。在二甲苯中洗涤3×15分钟后(直到所有可见的石蜡溶解)，通过连续乙醇梯度使细胞水合，然后沉淀。将细胞重悬于抗原修复溶液中，并通过微波辐射在95℃下加热30分钟。冷却后，将它们在PBS中洗涤，计数，并分布在96孔板中(30000/孔)。一些板不具有插入件，并且在一些情况下，使用包括过滤器插入件的板，其中所述板具有0.45μm孔径。如实施例1进行检测和定量。
实施例3：非人细胞材料和方法
获得并培养非人细胞并在火棉胶袋中沉淀，然后在室温下在10％NBF中固定24小时。火棉胶袋通过用火棉胶溶液(Macron Chemicals目录号4560-04)涂覆15mL玻璃锥形管的整个内表面而产生。在处理后，将小的细胞颗粒包埋在石蜡块中，并且将剩余的细胞从火棉胶袋中去除并转移到二甲苯中。在二甲苯中洗涤3×15分钟后(直到所有可见的石蜡溶解)，通过连续乙醇梯度使细胞水合，然后沉淀。将细胞重悬于抗原修复溶液中，并在微波中在95℃下加热30分钟。冷却后，将它们在PBS中洗涤，计数，并分布在96孔板中(30000/孔)。一些板不具有插入件，并且在一些情况下，使用包括过滤器插入件的板，其中所述板具有0.45μm孔径。如实施例1进行检测和定量。
实施例4：人组织细胞材料和方法
获得包含细胞的人组织，并且在火棉胶袋中培养并沉淀来自组织的细胞，然后在室温下在10％NBF中固定24小时。火棉胶袋通过用火棉胶溶液(Macron Chemicals目录号4560-04)涂覆15mL玻璃锥形管的整个内表面而产生。在处理后，将小的细胞颗粒包埋在石蜡块中，并且将剩余的细胞从火棉胶袋中去除并转移到二甲苯中。在二甲苯中洗涤3×15分钟后(直到所有可见的石蜡溶解)，通过连续乙醇梯度使细胞水合，然后沉淀。将细胞重悬于抗原修复溶液中，并通过微波辐射在95℃下加热30分钟。冷却后，将它们在PBS中洗涤，计数，并分布在96孔板中(30000/孔)。一些板不具有插入件，并且在一些情况下，使用包括过滤器插入件的板，其中所述板具有0.45μm孔径。如实施例1进行检测和定量。
实施例5：非人组织细胞材料和方法
获得包含细胞的非人组织，并且在火棉胶袋中培养并沉淀来自组织的细胞，然后在室温下在10％NBF中固定24小时。火棉胶袋通过用火棉胶溶液(Macron Chemicals目录号4560-04)涂覆15mL玻璃锥形管的整个内表面而产生。在处理后，将小的细胞颗粒包埋在石蜡块中，并且将剩余的细胞从火棉胶袋中去除并转移到二甲苯中。在二甲苯中洗涤3×15分钟后(直到所有可见的石蜡溶解)，通过连续乙醇梯度使细胞水合，然后沉淀。将细胞重悬于抗原修复溶液中，并通过微波辐射在95℃下加热30分钟。冷却后，将它们在PBS中洗涤，计数，并分布在96孔板中(30000/孔)。一些板不具有插入件，并且在一些情况下，使用包括过滤器插入件的板，其中所述板具有0.45μm孔径。如实施例1进行检测和定量。
实施例6：细胞中多核苷酸的检测
获得并培养细胞并在火棉胶袋中沉淀，然后在室温下在10％NBF中固定24小时。火棉胶袋通过用火棉胶溶液(Macron Chemicals目录号4560-04)涂覆15mL玻璃锥形管的整个内表面而产生。在处理后，将小的细胞颗粒包埋在石蜡块中，并且将剩余的细胞从火棉胶袋中去除并转移到二甲苯中。在二甲苯中洗涤3×15分钟后(直到所有可见的石蜡溶解)，通过连续乙醇梯度使细胞水合，然后沉淀。将细胞重悬于抗原修复溶液中，并通过微波辐射在95℃下加热30分钟。冷却后，将它们在PBS中洗涤，计数，并分布在96孔板中(30000/孔)。一些板不具有插入件，并且在一些情况下，使用包括过滤器插入件的板，其中所述板具有0.45μm孔径。如实施例1进行检测和定量，其中检测多核苷酸。
实施例7：细胞中非多核苷酸的检测
获得并培养细胞并在火棉胶袋中沉淀，然后在室温下在10％NBF中固定24小时。火棉胶袋通过用火棉胶溶液(Macron Chemicals目录号4560-04)涂覆15mL玻璃锥形管的整个内表面而产生。在处理后，将小的细胞颗粒包埋在石蜡块中，并且将剩余的细胞从火棉胶袋中去除并转移到二甲苯中。在二甲苯中洗涤3×15分钟后(直到所有可见的石蜡溶解)，通过连续乙醇梯度使细胞水合，然后沉淀。将细胞重悬于抗原修复溶液中，并通过微波辐射在95℃下加热30分钟。冷却后，将它们在PBS中洗涤，计数，并分布在96孔板中(30000/孔)。一些板不具有插入件，并且在一些情况下，使用包括过滤器插入件的板，其中所述板具有0.45μm孔径。如实施例1进行检测和定量，其中检测不是多肽的分子。
实施例8：永生化细胞材料和方法
获得并培养永生化细胞并在火棉胶袋中沉淀，然后在室温下在10％NBF中固定24小时。火棉胶袋通过用火棉胶溶液(Macron Chemicals目录号4560-04)涂覆15mL玻璃锥形管的整个内表面而产生。在处理后，将小的细胞颗粒包埋在石蜡块中，并且将剩余的细胞从火棉胶袋中去除并转移到二甲苯中。在二甲苯中洗涤3×15分钟后(直到所有可见的石蜡溶解)，通过连续乙醇梯度使细胞水合，然后沉淀。将细胞重悬于抗原修复溶液中，并通过微波辐射在95℃下加热30分钟。冷却后，将它们在PBS中洗涤，计数，并分布在96孔板中(30000/孔)。一些板不具有插入件，并且在一些情况下，使用包括过滤器插入件的板，其中所述板具有0.45μm孔径。如实施例1进行检测和定量。
本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下，可对上述实施方案作出修改。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施方案，而是旨在涵盖如本说明书所定义的本发明实质和范围内的修改。
Claims (33)
1.一种检测样本中的分子的方法，包括：
a.从样本中获得细胞；
b.用固定剂处理所述细胞；
c.石蜡包埋所固定的细胞；
d.将所述细胞脱石蜡并悬浮以获得单细胞悬浮液；
e.使悬浮细胞与结合所述悬浮细胞的至少一个分子的第一检测试剂接触；
使结合至所述第一检测试剂的所述细胞与第二检测试剂接触；以及
f.检测与所述样本的所述细胞结合的所述第二检测试剂的存在；
其中与所述样本结合的所述第二检测试剂的量在背景之上的检测指示所述样本中至少一个分子的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子为核酸或蛋白质。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸为RNA。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸为DNA。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，所述方法在使所述悬浮的细胞与第一检测试剂接触后进一步去除未结合的细胞。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，所述方法还包括在使结合至所述第一检测试剂的所述细胞与第二检测试剂接触后去除所述未结合的第二检测试剂。
7.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述固定剂选自包括以下的组：甲醛、多聚甲醛、戊二醛或中性缓冲福尔马林。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述固定剂为中性缓冲福尔马林。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述中性缓冲福尔马林为10％中性缓冲福尔马林。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤持续约30分钟至60分钟、1小时至2小时、2小时至3小时、3小时至4小时、4小时至5小时、5小时至6小时、6小时至7小时、7小时至8小时、8小时至9小时、9小时至10小时、10小时至11小时、11小时至12小时、12小时至13小时、13小时至14小时、14小时至15小时、15小时至16小时、16小时至17小时、17小时至18小时、18小时至19小时、19小时至20小时、20小时至21小时、21小时至22小时、22小时至23小时、23小时至24小时、24小时至36小时或36小时至48小时。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤在4℃、室温、40℃或60℃下进行。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中用所述固定剂处理所述细胞的所述步骤在室温下进行24小时。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中固定的细胞的所述石蜡包埋包括：
a.使所述细胞与乙醇接触；
b.使所述细胞与二甲苯接触；以及
c.用石蜡孵育所述细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中使所述细胞与乙醇接触的所述步骤包括：
a.使所述细胞与70％乙醇水溶液接触30分钟；
b.使所述细胞与80％乙醇水溶液接触30分钟；
c.使所述细胞与95％乙醇水溶液接触30分钟；以及
d.使所述细胞与100％乙醇接触30分钟。
15.根据权利要求13或14中任一项所述的方法，其中使所述细胞与二甲苯接触的所述步骤包括二甲苯的三次更换，每次20分钟。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括石蜡的四次更换，每次20分钟。
17.根据权利要求16所述的方法，其中用石蜡孵育所述细胞的所述步骤包括在60℃下进行。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述细胞通过使所述细胞与二甲苯接触而脱石蜡。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞与二甲苯接触约5分钟至10分钟、10分钟至15分钟、15分钟至20分钟、20分钟至30分钟、30分钟至60分钟、60分钟至90分钟或90分钟至120分钟。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述细胞进一步与连续乙醇梯度接触，包括：
a.使所述细胞与70％乙醇水溶液接触约15至约30分钟；
b.使所述细胞与95％乙醇水溶液接触约15至约30分钟；
c.以及最后使所述细胞与100％乙醇接触约15至约30分钟。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述细胞在抗原修复溶液中重悬。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在95℃下进一步加热所述细胞约30分钟。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞通过微波辐射加热。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述第一检测试剂和/或第二检测试剂为抗体或其抗原结合片段。
25.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述第一检测试剂和/或第二检测试剂为基于RNA的粘结剂分子。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述样本包含来自体液或组织的细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述体液为血液、血清或血浆。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述样本来自患者。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述患者为哺乳动物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述样本包含来自永生化细胞系的细胞。
32.一种试剂盒，所述试剂盒用于执行根据权利要求1至31中任一项所述的方法。
33.一种细胞的样本，所述细胞的样本根据权利要求1至31中任一项所述的方法制备。
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