ES2992653T3

ES2992653T3 - Methods of preparing lipid nanoparticles

Info

Publication number: ES2992653T3
Application number: ES20711358T
Authority: ES
Inventors: Mike Smith; Allen Horhota; Jason Auer; Brie Skinner
Original assignee: ModernaTx Inc
Current assignee: ModernaTx Inc
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2020-01-31
Publication date: 2024-12-16
Anticipated expiration: 2040-01-31
Also published as: US20220062175A1; CN113939282A; WO2020160397A1; JP7635131B2; EP3917503B1; EP4427739A2; KR20210135494A; CN118697900A; AU2020214843A1; JP2025060720A; SG11202108100PA; MX2021009245A; IL285213A; JP2022519557A; EP4427739A3; CA3128215A1; BR112021014845A2; EP3917503A1

Abstract

La presente divulgación proporciona métodos para producir formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP) y las formulaciones de LNP producidas a partir de ellas. La presente divulgación también proporciona usos terapéuticos y de diagnóstico relacionados con las formulaciones de LNP producidas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de preparación de nanopartículas lipídicas

Solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Núm.

62/799,620, presentada el 31 de enero de 2019.

Campo de la divulgación

La presente divulgación proporciona métodos novedosos de producción de formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP, por sus siglas en inglés) de ácido nucleico, las formulaciones producidas a partir de las mismas y los usos terapéuticos relacionados.

Antecedentes

El suministro dirigido eficaz de sustancias biológicamente activas tales como fármacos de molécula pequeña, proteínas, y ácidos nucleicos representa un desafío médico continuo. En particular, el suministro de ácidos nucleicos a las células se dificulta por la relativa inestabilidad y baja permeabilidad celular de tales especies. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar métodos y composiciones para facilitar el suministro de agentes terapéuticos y profilácticos tales como ácidos nucleicos a las células.

Se ha demostrado que las nanopartículas que contienen lípidos o nanopartículas lipídicas, los liposomas y los lipoplejos son eficaces como vehículos de transporte hacia las células y/o compartimientos intracelulares para sustancias biológicamente activas tales como fármacos de molécula pequeña, proteínas, y ácidos nucleicos. Aunque se ha mostrado una variedad de tales nanopartículas que contienen lípidos, todavía faltan mejoras de seguridad, eficacia y especificidad.

Se proporcionan nanopartículas lipídicas y métodos para su formación en los documentos WO 2018/089801, WO 2013/086373, Kulkarni J. A.et al.,Nucleic Acid Therapeutics, 2018, Vol. 28, Núm. 3, páginas 146-157, y Cullis P. R.et al,Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 2017, vol. 25, Núm. 7, páginas 1467-1475.

Declaración relacionada con la lista de secuencias

La Lista de secuencias asociada a esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de como copia en papel. El nombre del archivo de texto que contiene la lista de secuencias es MRNA_062_001WO_ST25.txt. El archivo de texto tiene un tamaño de 614 bytes, fue creado el 30 de enero de 2020 y se presenta en forma electrónica.

Compendio

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método de producción de una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP), comprendiendo el método: i) mezclar una solución lipídica que comprende un lípido ionizable con una solución tampón acuosa que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5, opcionalmente de aproximadamente 4,9 s 5,25, formando así una solución de nanopartículas lipídicas que comprende una nanopartícula lipídica; y ii) añadir una solución de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico a la solución de nanopartículas lipídicas, formando así una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) que comprende la nanopartícula lipídica asociada con el ácido nucleico.

Según otro aspecto, la presente divulgación se refiere a la formulación de nanopartículas lipídicas descrita anteriormente, para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno en un sujeto.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una gráfica que muestra que se observa una encapsulación del ARNm comparable o mayor cuando el ARNm se introduce en tiempos de permanencia más largos después de la generación de la LNP (es decir, mayores tiempos de permanencia). La encapsulación se evaluó mediante el ensayo de fluorescencia Ribogreen.

La Fig. 2 es una gráfica que muestra que se observa una encapsulación del ARNm comparable o mayor cuando el ARNm se introduce en tiempos de permanencia más largos después de la generación de la LNP (es decir, mayores tiempos de permanencia) con respecto a los controles (línea punteada). La encapsulación se evaluó mediante el ensayo de intercambio iónico (AEX).

La Fig. 3 son imágenes de crio-EM que demuestran que se observa morfología de partícula comparable con un modo de procedimiento de carga post-hoc (“PHL”, por sus siglas en inglés) con respecto a un procedimiento convencional en donde el ARNm se incluye durante una formación de partícula inicial (“Convencional”). La Fig. 4 es un análisis de dispersión de rayos x de ángulo pequeño (SAXS) que demuestra las características estructurales de aumento (q = ~1,3 nm-1, espaciado d calculado de 5-6 nm) en el lote de procedimiento de carga post-hoc con respecto al procedimiento de lote convencional.

La Fig. 5 es un gráfico que demuestra el funcionamiento in vivo de un procedimiento de PHL frente a un procedimiento Convencional que muestra un aumento de respuesta a la primera dosis (3 semanas después de la sensibilización) para una PHL en un contexto de vacuna profiláctica y que demuestra IgG total comparable observada después de un refuerzo a las 2 semanas. Las entradas A-D reflejan versiones alternativas del procedimiento convencional como una comparación.

La Fig. 6 es una gráfica que demuestra el efecto que tuvo el diámetro inicial de una dispersión de LNP en la encapsulación de ARNm y que muestra que los lotes de LNP con diámetro reducido dieron como resultado una mayor encapsulación de ARNm.

La Fig. 7 es un ajuste de modelo que demuestra que el contenido de etanol y la temperatura son parámetros críticos que afectan al índice de polidispersidad (PDI) de la LNP mediante caracterización de dispersión de luz dinámica (DLS) donde el ajuste de modelo permitió el cálculo de un intervalo ventajoso de condiciones del procedimiento para favorecer un bajo PDI (p. ej., etanol al 30%, 40°C) lo que permite partículas pequeñas uniformes y una composición favorable.

La Fig. 8 es un ajuste de modelo que demuestra que el contenido de etanol y la temperatura son parámetros críticos que afectan al diámetro de LNP mediante caracterización de DLS donde el ajuste de modelo permitió el cálculo de un intervalo ventajoso de condiciones del procedimiento para favorecer el control del tamaño de partícula en un intervalo favorable para la encapsulación de ARNm mediante los procedimientos descritos en el presente documento (< 100 nm), lo que permite partículas pequeñas uniformes y una composición favorable. La Fig. 9 es una gráfica que demuestra que el procedimiento para la generación de LNP vacías afectó a las características estructurales mediante el análisis de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS), lo que muestra que todas las condiciones del procedimiento dieron como resultado partículas con una característica pronunciada a q = 1,4 nm-1 (espaciado D calculado ~4 nm). El procedimiento A sin maduración generó una característica adicional a q = 0,45 (espaciado D calculado ~14 nm). Esta característica se asocia con una población de pequeñas estructuras liposomales o micelares en las muestras mediante análisis crio-TEM. Los Procedimientos B y C que incorporan un tiempo de maduración mostraron polidispersidad (mediante análisis de DLS) y homogeneidad estructural (mediante análisis crio-TEM) mejoradas en comparación con el Procedimiento A.

La Fig. 10 es una gráfica que demuestra que el ARNm cargado mediante procedimientos descritos en el presente documento produjo partículas que muestran un alto grado de estructura, con una característica pronunciada a q = 1,3 nm-1 (espaciado D calculado~5nm). Los procedimientos B y C, que aprovechan las condiciones del procedimiento óptimas que favorecen el tiempo de maduración y bajo PDI, mostraron menor polidispersidad y homogeneidad estructural mejorada en comparación con el procedimiento A.

La Fig. 11 son imágenes de crio-EM que demuestran homogeneidad de partícula la mejorada observada con el procedimiento B (aumento de maduración) con respecto al procedimiento A (convencional) para lotes generados con procedimientos descritos en el presente documento.

La Fig. 12 es un diagrama de flujo de procedimiento ilustrativo que demuestra un procedimiento de nanoprecipitación continua para la formación de LNP.

La Fig. 13 es una gráfica que demuestra que la sacarosa presentó un efecto crioprotector para las dispersiones de LNP, lo que permite la conservación del diámetro de partícula después de la tensión de congelación/descongelación, y se determinó que la concentración de sacarosa ventajosa es > 15% en peso. La Fig. 14 es una gráfica que demuestra que la inclusión del excipiente crioprotector sacarosa permitió la encapsulación completa del ARNm mediante los procedimientos que se describen en el presente documento (ensayo Ribogreen) para las nanopartículas lipídicas que experimentan una tensión de congelación/descongelación antes de la adición de ARNm.

La Fig. 15A es una gráfica que demuestra una población primaria convencional de LNP caracterizada por análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) en estado líquido (~50 nm).

La Fig. 15B es una gráfica que demuestra una conservación de la población de nanopartículas primaria después de someter la formulación (Acetato-sacarosa) a liofilización y reconstitución en agua destilada desionizada.

La Fig. 16 son gráficas que demuestran la superposición de distribución de partículas para formulaciones de LNP de producto líquidas y liofilizadas/reconstituidas.

La Fig. 17 es una gráfica que demuestra que la mayor expresión in vitro se observó para la formulación liofilizada con pH 5,0 en comparación con la de pH 5,75.

La Fig. 18 es una gráfica que demuestra que se determinó un pH ventajoso al variar los valores de pH de la solución de LNP y ARNm antes de la combinación en el procedimiento de mezclado en el campo. El control del tamaño de partícula se logró de manera ventajosa a pH < 6,0.

La Fig. 19 es una gráfica que demuestra que se determinó un pH ventajoso al variar los valores de pH de la solución de LNP y ARNm antes de la combinación en los procedimientos descritos en el presente documento y el aumento de encapsulación se logró a pH < 6,0 (ensayo Ribogreen).

La Fig. 20 es una gráfica que demuestra que se determinó un pH ventajoso al variar los valores de pH de la solución de LNP y ARNm antes de la combinación en los procedimientos descritos en el presente documento y el aumento de aumentada se logró a pH < 6,0 (ensayo AEX).

La Fig. 21 es una gráfica que demuestra que la sensibilidad de la fuerza iónica se evaluó mediante la variación de la concentración molar de NaCl dentro de la solución de LNP y ARNm juntos en los procedimientos descritos en el presente documento y las concentraciones ventajosas que favorecen la encapsulación de ARNm fueron <200 mM.

La Fig. 22 es una gráfica que demuestra que se observa una baja variabilidad lote a lote en la encapsulación del ARNm con los procedimientos descritos en el presente documento y que las LNP cargadas con ARNm mostraron encapsulación de ARNm uniforme después de reposar durante 24 h.

La Fig. 23 es una gráfica que demuestra el impacto de la velocidad de flujo de inyección en el tamaño de las partículas mediante medición de DLS, donde una solución de ARNm se inyectó directamente en un vial que contenía una solución tamponada de LNP y el diámetro de partícula resultante fue sensible a la velocidad de inyección.

La Fig. 24 es una gráfica que demuestra el impacto de la velocidad de flujo de inyección sobre la encapsulación del ARNm (ensayo Ribogreen), donde una solución de ARNm se inyectó directamente en un vial que contenía una solución tamponada de LNP.

La Fig. 25 es una gráfica que demuestra que las formulaciones de nanopartículas lipídicas de ARNm cargadas mediante un procedimiento descrito en el presente documento comprendieron partículas que mostraron un alto grado de estructura, con una característica pronunciada a q = 1,3 nm-1 (espaciado D calculado ~5 nm), y que se observaron características estructurales comparables con diferente velocidad de flujo (muestra 9-14).

La Fig. 26 es una gráfica que demuestra que la adición de niveles crecientes de producto conjugado de PEG-Lípido en la solución de LNP disminuyó el tamaño de partícula después de la mezcla con ARNm.

La Fig. 27 es una gráfica que demuestra que la adición de niveles crecientes de producto conjugado de PEG-Lípido en la solución de<l>Nno afectó a la encapsulación de ARNm.

La Fig. 28 es una gráfica que demuestra que las formulaciones de nanopartículas lipídicas de ARNm cargadas mediante un procedimiento descrito en el presente documento comprendieron partículas que mostraron un alto grado de estructura, con una característica pronunciada a q = 1,3 nm-1 (espaciado D calculado ~5 nm), y que se observaron características estructurales comparables con % en moles de PEG-Lípido incluido en la etapa de mezcla.

La Fig. 29A es una gráfica que demuestra que la adición de niveles crecientes de un producto conjugado de PEG-Lípido a la solución de LNP disminuyó la sensibilidad a la velocidad de flujo de inyección en procedimientos de mezcla descritos en el presente documento.

La Fig. 29B es una gráfica que demuestra que la adición de niveles crecientes de producto conjugado de PEG-Lípido a la solución de LNP disminuyó la sensibilidad a la velocidad de flujo de inyección en procedimientos de mezcla descritos en el presente documento.

La Fig. 30 es una gráfica que demuestra que la adición de niveles crecientes de producto conjugado de PEG-lípido a la solución de LNP aumentó la encapsulación (Ensayo Ribostar).

La Fig. 31 es una gráfica que demuestra que la neutralización del producto mezclado dio como resultado una mayor encapsulación de ARNm (ensayo AEX) y la neutralización se puede lograr a través de la adición de una solución de fosfato de sodio concentrada a un valor de pH objetivo.

La Fig. 32 es una gráfica que demuestra que un ensayo Ribogreen no pudo detectar sensibilidad a la neutralización de pH del producto mezclado y la neutralización se logró a través de la adición de una solución concentrada de fosfato de sodio a un valor de pH objetivo.

La Fig. 33 es una gráfica que demuestra que la neutralización del producto mezclado dio como resultado un mayor diámetro de LNP (~10 nm) y la neutralización se logró a través de la adición de una solución concentrada de fosfato de sodio a un valor de pH objetivo.

La Fig. 34 es una gráfica que demuestra que las formulaciones de nanopartículas lipídicas de ARNm cargadas mediante un procedimiento descrito en el presente documento comprendieron partículas que mostraban un alto grado de estructura, con una característica pronunciada a q = 1,3 nm-1 (espaciado D calculado~5nm), y se observó una ligera disminución a 1,3 nm-1 con neutralización, adicionalmente la neutralización del producto mezclado dio como resultado la reducción de una característica estructural a 0,3 nm-1 (espaciado D ~21 nm). La Fig. 35 es una gráfica que demuestra la mayor potencia de procedimientos de formulación mixta descritos en el presente documento (“Procedimiento PHL”) con respecto a un control (“Procedimiento de referencia”) que muestra el aumento de respuestas de linfocitos T específicas de antígeno con los procedimientos de mezcla descritos en el presente documento en comparación con el modo de procedimiento convencional.

Descripción detallada

La presente divulgación se basa, en parte, en el descubrimiento de que el método de producción de la nanopartícula lipídica (LNP) o formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) como se divulga en el presente documento puede influir en, y/o regir, la distribución de determinados componentes dentro de las nanopartículas lipídicas, y que esta distribución puede influir en, y/o regir, las propiedades físicas (p. ej., estabilidad) y/o biológicas (p. ej., eficacia, suministro intracelular, inmunogenicidad) de las nanopartículas lipídicas.

En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación mitiga un cambio no deseado en una propiedad de la nanopartícula lipídica (LNP) o formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) producidas. En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación mitigan un cambio no deseado en una propiedad de la nanopartícula lipídica (LNP) o formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) producidas en comparación con la LNP o formulación de LNP producidas mediante un método comparable (p. ej., un método sin una o más de las etapas divulgadas en el presente documento).

En algunas realizaciones, el cambio no deseado de la propiedad es provocado por una tensión que sufre la formulación de nanopartículas lipídicas o la nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, la tensión es inducida durante la producción, purificación, envasado, almacenamiento, transporte y/o uso de la formulación de nanopartículas lipídicas o nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, la tensión consiste en calor, cizallamiento, agitación excesiva, polarización por concentración de la membrana (cambio en estado de carga), deshidratación, tensión por congelación, tensión por secado, tensión por congelación/descongelación y/o tensión por nebulización. En algunas realizaciones, la tensión es inducida durante el almacenamiento de la formulación de nanopartículas lipídicas o nanopartícula lipídica.

En algunas realizaciones, el cambio no deseado de la propiedad es una reducción de la estabilidad física de la formulación de LNP. En algunas realizaciones, el cambio no deseado de la propiedad es un aumento de la cantidad de impurezas y/o partículas subvisibles, o un aumento del tamaño promedio de las LNP en la formulación de LNP.

En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación mitiga una reducción de la estabilidad física (p. ej., un aumento en el tamaño promedio de la LNP) de la formulación de LNP producida en comparación con la formulación de LNP producida mediante un método comparable como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, la formulación de LNP producida mediante el método de la presente divulgación tiene un diámetro de LNP promedio de aproximadamente 99% o menos, aproximadamente 98% o menos, aproximadamente 97% o menos, aproximadamente 96% o menos, aproximadamente 95% o menos, aproximadamente 90% o menos, aproximadamente 85% o menos, aproximadamente 80% o menos, aproximadamente 75% o menos, aproximadamente 70% o menos, aproximadamente 65% o menos, aproximadamente 60% o menos, aproximadamente 55% o menos, aproximadamente 50% o menos, aproximadamente 40% o menos, aproximadamente 30% o menos, aproximadamente 20% o menos o aproximadamente 10% o menos en comparación con el diámetro de LNP promedio de la formulación de LNP producida mediante un método comparable como se divulga en el presente documento.

En algunas realizaciones, el cambio no deseado de la propiedad es una reducción de la estabilidad química de la formulación de LNP. En algunas realizaciones, el cambio no deseado de la propiedad es una reducción de la integridad del ácido nucleico (p. ej., ARN (p. ej., ARNm)) en la formulación de LNP.

En algunas realizaciones, el cambio no deseado de la propiedad es una reducción de la propiedad biológica de la formulación de LNP. En algunas realizaciones, el cambio no deseado de la propiedad es una reducción de la eficacia, el suministro intracelular y/o la inmunogenicidad de la formulación de LNP.

En algunas realizaciones, la formulación de LNP producida mediante el método de la presente divulgación tiene una eficacia, un suministro intracelular y/o una inmunogenicidad mayores que la eficacia, el suministro intracelular y/o la inmunogenicidad de la formulación de LNP producida mediante un método comparable como se divulga en el presente documento.

En algunas realizaciones, la formulación de LNP producida mediante el método de la presente divulgación tiene una eficacia, un suministro intracelular y/o una inmunogenicidad mayores que la eficacia, el suministro intracelular y/o la inmunogenicidad de la formulación de LNP producida mediante un método comparable en aproximadamente 5% o superior, aproximadamente 10% o más, aproximadamente 15% o más, aproximadamente 20% o más, aproximadamente 30% o más, aproximadamente 40% o más, aproximadamente 50% o más, aproximadamente 60% o más, aproximadamente 70% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 90% o más, aproximadamente 1 vez o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 4 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 20 veces o más, aproximadamente 30 veces o más, aproximadamente 40 veces o más, aproximadamente 50 veces o más, aproximadamente 100 veces o más, aproximadamente 200 veces o más, aproximadamente 300 veces o más, aproximadamente 400 veces o más, aproximadamente 500 veces o más, aproximadamente 1000 veces o más, aproximadamente 2000 veces o más, aproximadamente 3000 veces o más, aproximadamente 4000 veces o más, aproximadamente 5000 veces o más o aproximadamente 10000 veces o más.

En algunas realizaciones, la formulación de LNP producida mediante el método de la presente divulgación presenta una expresión de ácidos nucleicos (p. ej., la expresión de ARNm) más alta que la expresión de ácidos nucleicos (p. ej., la expresión de ARNm) de la formulación de LNP producida mediante un método comparable.

En algunas realizaciones, la formulación de LNP producida mediante el método de la presente divulgación presenta una expresión de ácidos nucleicos (p. ej., la expresión de ARNm) más alta que la expresión de ácidos nucleicos (p. ej., la expresión de ARNm) de la formulación de LNP producida mediante un método comparable en aproximadamente 5% o superior, aproximadamente 10% o más, aproximadamente 15% o más, aproximadamente 20% o más, aproximadamente 30% o más, aproximadamente 40% o más, aproximadamente 50% o más, aproximadamente 60% o más, aproximadamente 70% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 90% o más, aproximadamente 1 vez o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 4 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 20 veces o más, aproximadamente 30 veces o más, aproximadamente 40 veces o más, aproximadamente 50 veces o más, aproximadamente 100 veces o más, aproximadamente 200 veces o más, aproximadamente 300 veces o más, aproximadamente 400 veces o más, aproximadamente 500 veces o más, aproximadamente 1000 veces o más, aproximadamente 2000 veces o más, aproximadamente 3000 veces o más, aproximadamente 4000 veces o más, aproximadamente 5000 veces o más o aproximadamente 10000 veces o más.

Tradicionalmente, las nanopartículas lipídicas cargadas con ARN mensajero (LNP con ARNm) se han producido mediante mezcla de alta energía de solución acuosa de ARNm y una solución de lípidos en etanol. Las soluciones acuosas son malos disolventes de los lípidos utilizados en el procedimiento, que con mayor frecuencia son una mezcla de un lípido catiónico, un fosfolípido, un lípido estructural y un lípido PEG. La mezcla de los lípidos, por lo tanto, da como resultado el autoensamblaje de los lípidos en nanopartículas, p. ej., de diámetros menores de 100 nm.

Adicionalmente, los esfuerzos recientes hacia formulaciones “de cabecera” y/o en el “punto de atención” han sido alentadores, según los cuales el ARNm puede encapsularse dentro de vesículas preformadas preparadas en una fecha anterior. Este modo de producción ofrece ventajas en el contexto del suministro clínico, ya que las vesículas de LNP vacías pueden producirse y almacenarse de forma separada antes de la recombinación con ARNm en un entorno de compuesto clínico. Específicamente, las formulaciones de cabecera pueden promover un aumento de estabilidad ya que el ARNm y las materias primas vacías pueden almacenarse en condiciones optimizadas por separado. La complejidad del procedimiento y el coste de los productos puede reducirse dado que la preparación de LNP se produce con independencia de la carga, lo que permite un enfoque de plataforma para múltiples construcciones de agente activo o ARNm. Puede hacerse referencia a la modalidad de LNP vacía más ARNm como “carga post hoc” (PHL), “adición post-hoc” o “post-hoc”.

La presente divulgación se basa, en parte, en esfuerzos que exploran los principios fundamentales de la carga post hoc y en la investigación del impacto y condiciones de la adición de ARNm a escalas de tiempo después de la generación de LNP vacías. El tiempo de adición de ARNm después de la precipitación de lípidos se ha variado en más de siete órdenes de magnitud (p. ej., 1 ms a 10,000,000 ms) sin afectar negativamente las propiedades fisicoquímicas de la formulación (p. ej., tamaño de partícula, encapsulación, morfología y/o integridad estructural). Las similitudes en las propiedades fisicoquímicas fueron sorprendentes y no intuitivas, dado que el ARNm se incluye convencionalmente como un componente crítico dentro de las corrientes acuosas de entrada de las reacciones de precipitación de lípidos. Adicionalmente, a menudo se describen oligonucleótidos que participan en las etapas tempranas de ensamblaje de partículas. Los resultados de los experimentos empíricos sugieren que la encapsulación del ARNm se puede producir a escalas de tiempo significativamente más largas que la precipitación de lípidos/formación de partículas, sin afectar negativamente las propiedades fisicoquímicas de la LNP. Esos experimentos demostraron que la formación de partículas lipídicas y la subsiguiente encapsulación del ARNm pueden separarse en dos etapas de reacción. El concepto de carga post hoc como se divulga en el presente documento puede permitir el control y/u optimización de cada etapa por separado. Adicionalmente, la carga post hoc puede permitir la adición de ARNm a escalas de tiempo que permitan la formulación en el punto de atención (p. ej., meses o años después de la producción de la<l>Nvacía).

Históricamente, los procedimientos no se han desarrollado para generar nanopartículas lipídicas (LNP) vacías preformadas a escalas adecuadas para el suministro clínico. La presente divulgación se basa, en parte, en esfuerzos para determinar una multitud de parámetros de procedimientos ventajosos para la producción a escala que incluyen, pero sin limitarse a, concentraciones de lípidos, temperatura, composición del tampón (p. ej., fuerza iónica, pH, contraión) y contenido de etanol para permitir control del tamaño de partícula mientras que

La presente divulgación se basa, en parte, en el descubrimiento de que el método de producción de la nanopartícula lipídica (LNP) o formulación de nanopartículas lipídicas (LNp ), como se divulga en el presente documento, puede influir en, y/o regir, la distribución de determinados componentes dentro de las nanopartículas lipídicas, y que esta distribución puede influir en, y/o regir, las propiedades físicas (p. ej., la estabilidad) y/o biológicas (p. ej., la eficacia, el suministro intracelular, la inmunogenicidad) de las nanopartículas lipídicas.

En algunas realizaciones, la presente divulgación produce composiciones que comprenden nanopartículas lipídicas con una distribución ventajosa de los componentes.

En algunas realizaciones, la formulación de LNP producida mediante el método de la presente divulgación muestra características estructurales deseables mediante análisis de dispersión de rayos X pequeña para actividad in vitro/in vivo en comparación con la de la formulación de LNP producida mediante un método comparable.

En algunas realizaciones, la formulación de LNP producida mediante el método de la presente divulgación muestra características estructurales más homogéneas mediante análisis mediante análisis crio-TEM en comparación con la de la formulación de LNP producida mediante un método comparable.

En algunas realizaciones, la formulación de LNP producida mediante el método de la presente divulgación presenta una expresión de ácidos nucleicos (p. ej., la expresión de ARNm) más alta que la expresión de ácidos nucleicos (p. ej., la expresión de ARNm) de la formulación de LNP preparada mediante un método comparable en aproximadamente 5% o superior, aproximadamente 10% o más, aproximadamente 15% o más, aproximadamente 20% o más, aproximadamente 30% o más, aproximadamente 40% o más, aproximadamente 50% o más, aproximadamente 60% o más, aproximadamente 70% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 90% o más, aproximadamente 1 vez o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 4 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 20 veces o más, aproximadamente 30 veces o más, aproximadamente 40 veces o más, aproximadamente 50 veces o más, aproximadamente 100 veces o más, aproximadamente 200 veces o más, aproximadamente 300 veces o más, aproximadamente 400 veces o más, aproximadamente 500 veces o más, aproximadamente 1000 veces o más, aproximadamente 2000 veces o más, aproximadamente 3000 veces o más, aproximadamente 4000 veces o más, aproximadamente 5000 veces o más o aproximadamente 10000 veces o más.

Métodos de producción de composiciones de nanopartículas lipídicas (LNP) y composiciones de LNP producidas a partir de las mismas

En contraste con otras técnicas de producción (p. ej., extrusión/rehidratación de película fina), la precipitación por goteo con etanol ha sido el patrón de la industria para generar nanopartículas lipídicas de ácido nucleico estables (SNALP). Se favorecen las reacciones de precipitación debido a su naturaleza continua, escalabilidad y facilidad de adopción. Esos procedimientos a menudo utilizan mezcladores de alta energía (p. ej., unión en T, impacto de chorros confinados, mezclador de vórtice) para introducir lípidos (en etanol) en un antidisolvente adecuado (es decir, agua) de una manera controlable, impulsando la sobresaturación de líquidos y la precipitación espontánea en partículas lipídicas.

La presente divulgación proporciona un método de producción de una composición de nanopartículas lipídicas, comprendiendo el método: i) mezclar una solución lipídica que comprende un lípido ionizable con una solución tampón acuosa que comprende un primer tampón acuoso, formando así una nanopartícula lipídica vacía; y ii) añadir una solución de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico a la nanopartícula lipídica, formando así una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) que comprende una nanopartícula lipídica que encapsula el ácido nucleico.

Solución lipídica

En realizaciones, los métodos de la presente divulgación proporcionan una solución lipídica.

En realizaciones, la solución lipídica comprende un lípido ionizable. En algunas realizaciones, la solución lipídica puede comprender el lípido ionizable a una concentración de más de aproximadamente 0,01 mg/mL, 0,05 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,07 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,09 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,15 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL o 1,0 mg/mL. En algunas realizaciones, la solución lipídica puede comprender un lípido ionizable a una concentración que varía entre aproximadamente 0,01-1,0 mg/mL, 0,01-0,9 mg/mL, 0,01-0,8 mg/mL, 0,01-0,7 mg/mL, 0,01-0,6 mg/mL, 0,01 0,5 mg/mL, 0,01-0,4 mg/mL, 0,01-0,3 mg/mL, 0,01-0,2 mg/mL, 0,01-0,1 mg/mL, 0,05-1,0 mg/mL, 0,05-0,9 mg/mL, 0,05-0,8 mg/mL, 0,05-0,7 mg/mL, 0,05-0,6 mg/mL, 0,05-0,5 mg/mL, 0,05-0,4 mg/mL, 0,05-0,3 mg/mL, 0,05-0,2 mg/mL, 0,05-0,1 mg/mL, 0,1-1,0 mg/mL, 0,2-0,9 mg/mL, 0,3-0,8 mg/mL, 0,4-0,7 mg/mL o 0,5-0,6 mg/mL. En algunas realizaciones, la solución lipídica puede comprender un lípido ionizable a una concentración de hasta aproximadamente 5,0 mg/mL, 4,0 mg/mL, 3,0 mg/mL, 2,0 mg/mL, 1,0 mg/mL, 0,09 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,07 mg/mL, 0,06 mg/mL o 0,05 mg/mL.

En realizaciones, la solución lipídica comprende un lípido ionizable. En algunas realizaciones, la solución lipídica puede comprender el lípido ionizable a una concentración de más de aproximadamente 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1,0 mg/mL, 1,5 mg/mL, 2,0 mg/mL, 3,0 mg/mL, 4,0 mg/mL, 5,0 mg/mL, 6,0 mg/mL, 7,0 mg/mL, 8,0 mg/mL, 9,0 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL o 30 mg/mL. En algunas realizaciones, la solución lipídica puede comprender un lípido ionizable a una concentración que varía entre aproximadamente 0,1-20,0 mg/mL, 0,1-19 mg/mL, 0,1-18 mg/mL, 0,1-17 mg/mL, 0,1-16 mg/mL, 0,1-15 mg/mL, 0,1-14 mg/mL, 01-13 mg/mL, 0,1-12 mg/mL, 0,1-11 mg/mL, 0,5-10,0 mg/mL, 0,5-9 mg/mL, 0,5-8 mg/mL, 0,5-7 mg/mL, 0,5-6 mg/mL, 0,5-5,0 mg/mL, 0,5-4 mg/mL, 0,5-3 mg/mL, 0,5-2 mg/mL, 0,5-1 mg/mL, 1-20 mg/mL, 1-15 mg/mL, 1-12 mg/mL, 1-10 mg/mL o 1-8 mg/mL. En algunas realizaciones, la solución lipídica puede comprender un lípido ionizable a una concentración de hasta aproximadamente 30 mg/mL, 25 mg/mL, 20 mg/mL, 18 mg/mL, 16 mg/mL, 15 mg/mL, 14 mg/mL, 12 mg/mL, 10 mg/mL, 8 mg/mL, 6 mg/mL, 5,0 mg/mL, 4,0 mg/mL, 3,0 mg/mL, 2,0 mg/mL, 1,0 mg/mL, 0,09 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,07 mg/mL, 0,06 mg/mL o 0,05 mg/mL.

En algunos ejemplos, la solución lipídica comprende un lípido ionizable en un tampón y/o solución orgánica acuosos. En algunas realizaciones, la solución de nanopartículas lipídicas puede comprender adicionalmente un agente tamponador y/o una sal. Los agentes tamponadores adecuados ilustrativos incluyen, pero sin limitarse a, sulfato de amonio, bicarbonato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio, fosfato de potasio, fosfato de sodio, HEPES y similares. En algunas realizaciones, la solución lipídica comprende un agente tamponador a una concentración que varía entre aproximadamente 0,1-100 mM, aproximadamente 0,5-90 mM, aproximadamente 1.0-80 mM, aproximadamente 2-70 mM, aproximadamente 3-60 mM, aproximadamente 4 50 mM, aproximadamente 5-40 mM, aproximadamente 6-30 mM, aproximadamente 7-20 mM, aproximadamente 8-15 mM, aproximadamente 9-12 mM. En algunas realizaciones, la solución lipídica comprende un agente tamponador a una concentración de, o mayor de, aproximadamente 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 mM. Las sales adecuadas ilustrativas incluyen, pero sin limitarse a, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de sodio y similares. En algunas realizaciones, la solución lipídica comprende una sal a una concentración que varía entre aproximadamente 1-500 mM, aproximadamente 5-400 mM, aproximadamente 10-350 mM, aproximadamente 15-300 mM, aproximadamente 20-250 mM, aproximadamente 30-200 mM, aproximadamente 40-190 mM, aproximadamente 50-180 mM, aproximadamente 50-170 mM, aproximadamente 50-160 mM, aproximadamente 50-150 mM o aproximadamente 50-100 mM. En algunas realizaciones, la solución de nanopartículas lipídicas comprende una sal a una concentración de, o mayor de, aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM o 100 mM.

En algunas realizaciones, la solución lipídica puede tener un pH que varía de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 7,0, aproximadamente 4,8 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,9, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,8, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,7, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,6, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,5. En algunas realizaciones, una solución lipídica adecuada puede tener un pH de, o no mayor de, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.

Solución tampón acuosa

En algunas realizaciones, la solución tampón acuosa comprende un agente tamponador acuoso. En algunas realizaciones, una solución adecuada puede comprender adicionalmente uno o más agentes tamponadores y/o una sal. Los agentes tamponadores adecuados ilustrativos incluyen, pero sin limitarse a, sulfato de amonio, bicarbonato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio, fosfato de potasio, fosfato de sodio, HEPES y similares. En algunas realizaciones, la solución tampón acuosa comprende un agente tamponador a una concentración que varía entre aproximadamente 0,1-100 mM, aproximadamente 0,5-90 mM, aproximadamente 1,0-80 mM, aproximadamente 2-70 mM, aproximadamente 3-60 mM, aproximadamente 4-50 mM, aproximadamente 5-40 mM, aproximadamente 6-30 mM, aproximadamente 7-20 mM, aproximadamente 8-15 mM, aproximadamente 9-12 mM. En algunas realizaciones, la solución tampón acuosa comprende un agente tamponador a una concentración de, o mayor de, aproximadamente 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 mM. Las sales adecuadas ilustrativas incluyen, pero sin limitarse a, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de sodio y similares. En algunas realizaciones, la solución tampón acuosa comprende una sal a una concentración que varía entre aproximadamente 1-500 mM, aproximadamente 5-400 mM, aproximadamente 10-350 mM, aproximadamente 15-300 mM, aproximadamente 20-250 mM, aproximadamente 30-200 mM, aproximadamente 40-190 mM, aproximadamente 50-180 mM, aproximadamente 50-170 mM, aproximadamente 50-160 mM, aproximadamente 50-150 mM o de aproximadamente 50-100 mM. En algunas realizaciones, la solución de ácido nucleico comprende una sal a una concentración de, o mayor de, aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM o 100 mM.

En algunos ejemplos, la solución tampón acuosa puede tener un pH que varía de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0, aproximadamente 4,6 a aproximadamente 7,0, aproximadamente 4,8 a aproximadamente 7,0, aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,0, aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0, aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,9, aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,7, aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,5. En algunos ejemplos, una solución tampón acuosa adecuada puede tener un pH de, o no mayor de, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,95,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.

Solución de ácido nucleico o agente activo

En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación proporcionan una solución de agente activo que comprende un agente terapéutico y/o profiláctico. El agente terapéutico y/o profiláctico se puede proporcionar en una solución que se va a mezclar con, o añadir a, una nanopartícula lipídica o solución de nanopartículas lipídicas, de manera que el agente terapéutico y/o profiláctico se pueda encapsular en la nanopartícula lipídica.

En algunos ejemplos, el agente terapéutico y/o profiláctico es una vacuna o un compuesto capaz de provocar una respuesta inmunitaria.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico y/o profiláctico es un ácido nucleico.

En realizaciones de la invención, los métodos de la presente divulgación proporcionan una solución de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico. El ácido nucleico se proporciona en una solución que se va a mezclar con, o añadir a, una nanopartícula lipídica o solución de nanopartículas lipídicas, de manera que el ácido nucleico se pueda encapsular en la nanopartícula lipídica.

En algunas realizaciones, la solución de ácido nucleico puede comprender el ácido nucleico que se va a encapsular a diversas concentraciones. En algunas realizaciones, la solución de ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico a una concentración de más de aproximadamente 0,01 mg/mL, 0,05 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,07 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,09 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,15 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL o 1,0 mg/mL. En algunas realizaciones, la solución de ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico a una concentración que varía entre aproximadamente 0,01-1,0 mg/mL, 0,01-0,9 mg/mL, 0,01-0,8 mg/mL, 0,01-0,7 mg/mL, 0,01-0,6 mg/mL, 0,01 0,5 mg/mL, 0,01-0,4 mg/mL, 0,01-0,3 mg/mL, 0,01-0,2 mg/mL, 0,01-0,1 mg/mL, 0,05-1,0 mg/mL, 0,05-0,9 mg/mL, 0,05-0,8 mg/mL, 0,05-0,7 mg/mL, 0,05-0,6 mg/mL, 0,05-0,5 mg/mL, 0,05-0,4 mg/mL, 0,05-0,3 mg/mL, 0,05-0,2 mg/mL, 0,05-0,1 mg/mL, 0,1-1,0 mg/mL, 0,2-0,9 mg/mL, 0,3-0,8 mg/mL, 0,4-0,7 mg/mL o 0,5-0,6 mg/mL. En algunas realizaciones, la solución de ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico a una concentración de hasta aproximadamente 5,0 mg/mL, 4,0 mg/mL, 3,0 mg/mL, 2,0 mg/mL, 1,0 mg/mL, 0,09 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,07 mg/mL, 0,06 mg/mL o 0,05 mg/mL.

En algunas realizaciones, la solución de ácido nucleico comprende un ácido nucleico en un tampón acuoso. En algunas realizaciones, una solución de ácido nucleico adecuada puede comprender adicionalmente un agente tamponador y/o una sal. Los agentes tamponadores adecuados ilustrativos incluyen, pero sin limitarse a, sulfato de amonio, bicarbonato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio, fosfato de potasio, fosfato de sodio, HEPES y similares. En algunas realizaciones, la solución de ácido nucleico comprende un agente tamponador a una concentración que varía entre aproximadamente 0,1-100 mM, de aproximadamente 0,5-90 mM, de aproximadamente 1,0-80 mM, de aproximadamente 2-70 mM, de aproximadamente 3-60 mM, de aproximadamente 4-50 mM, de aproximadamente 5-40 mM, de aproximadamente 6-30 mM, de aproximadamente 7-20 mM, de aproximadamente 8-15 mM, de aproximadamente 9-12 mM. En algunas realizaciones, la solución de ácido nucleico comprende un agente tamponador a una concentración de, o mayor de, aproximadamente 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 mM. Las sales adecuadas ilustrativas incluyen, pero sin limitarse a, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de sodio y similares. En algunas realizaciones, la solución de ácido nucleico comprende una sal a una concentración que varía entre aproximadamente 1-500 mM, de aproximadamente 5-400 mM, de aproximadamente 10-350 mM, de aproximadamente 15-300 mM, de aproximadamente 20-250 mM, de aproximadamente 30-200 mM, de aproximadamente 40-190 mM, de aproximadamente 50-180 mM, de aproximadamente 50-170 mM, de aproximadamente 50-160 mM, de aproximadamente 50-150 mM o de aproximadamente 50-100 mM. En algunas realizaciones, la solución de ácido nucleico comprende una sal a una concentración de, o mayor de, aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM o 100 mM.

En algunas realizaciones, la solución de ácido nucleico puede tener un pH que varía de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,9, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,8, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,7, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,6, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,5. En algunas realizaciones, una solución de ácido nucleico adecuada puede tener un pH de, o no mayor de, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.

Solución de nanopartículas lipídicas:

En algunos ejemplos, los métodos de la presente divulgación proporcionan una solución de nanopartículas lipídicas que comprende un agente terapéutico y/o profiláctico. El agente terapéutico y/o profiláctico se puede proporcionar en una solución que se va a mezclar con, o añadir a, una nanopartícula lipídica o solución de nanopartículas lipídicas, de manera que el agente terapéutico y/o profiláctico se pueda encapsular en la nanopartícula lipídica.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente divulgación proporcionan una solución de nanopartículas lipídicas que comprende una nanopartícula lipídica vacía. La nanopartícula lipídica se puede proporcionar en una solución que se va a mezclar con, o añadir a, una nanopartícula lipídica o solución de nanopartículas lipídicas, de manera que el ácido nucleico se pueda encapsular en la nanopartícula lipídica.

En algunas realizaciones, la solución de nanopartículas lipídicas puede comprender la nanopartícula lipídica vacía. En algunas realizaciones, la solución de nanopartículas lipídicas puede comprender la partícula lipídica a una concentración de más de aproximadamente 0,01 mg/mL, 0,05 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,07 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,09 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,15 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL o 1,0 mg/mL. En algunas realizaciones, la solución de nanopartículas lipídicas puede comprender la nanopartícula lipídica a una concentración que varía entre aproximadamente 0,01-1,0 mg/mL, 0,01-0,9 mg/mL, 0,01-0,8 mg/mL, 0,01-0,7 mg/mL, 0,01-0,6 mg/mL, 0,01-0,5 mg/mL, 0,01-0,4 mg/mL, 0,01-0,3 mg/mL, 0,01-0,2 mg/mL, 0,01-0,1 mg/mL, 0,05-1,0 mg/mL, 0,05-0,9 mg/mL, 0,05-0,8 mg/mL, 0,05-0,7 mg/mL, 0,05-0,6 mg/mL, 0,05-0,5 mg/mL, 0,05-0,4 mg/mL, 0,05-0,3 mg/mL, 0,05-0,2 mg/mL, 0,05-0,1 mg/mL, 0,1-1,0 mg/mL, 0,2-0,9 mg/mL, 0,3-0,8 mg/mL, 0,4-0,7 mg/mL o 0,5-0,6 mg/mL. En algunas realizaciones, la solución de nanopartículas lipídicas puede comprender una nanopartícula lipídica vacía a una concentración de hasta aproximadamente 5,0 mg/mL, 4,0 mg/mL, 3,0 mg/mL, 2,0 mg/mL, 1,0 mg/mL, 0,09 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,07 mg/mL, 0,06 mg/mL o 0,05 mg/mL.

En realizaciones de la invención, la solución de nanopartículas lipídicas comprende una nanopartícula lipídica en un tampón acuoso. En algunas realizaciones, la solución de nanopartículas lipídicas puede comprender adicionalmente un agente tamponador y/o una sal. Los agentes tamponadores adecuados ilustrativos incluyen, pero sin limitarse a, sulfato de amonio, bicarbonato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio, fosfato de potasio, fosfato de sodio, HEPES y similares. En algunas realizaciones, la solución de nanopartículas lipídicas comprende un agente tamponador a una concentración que varía entre aproximadamente 0,1-100 mM, aproximadamente 0,5-90 mM, aproximadamente 1,0-80 mM, aproximadamente 2-70 mM, aproximadamente 3-60 mM, aproximadamente 4-50 mM, aproximadamente 5-40 mM, aproximadamente 6-30 mM, aproximadamente 7-20 mM, aproximadamente 8-15 mM, aproximadamente 9-12 mM. En algunas realizaciones, la solución de nanopartículas lipídicas comprende un agente tamponador a una concentración de, o mayor de, aproximadamente 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 mM. Las sales adecuadas ilustrativas incluyen, pero sin limitarse a, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de sodio y similares. En algunas realizaciones, la solución de nanopartículas lipídicas comprende una sal a una concentración que varía entre aproximadamente 1-500 mM, aproximadamente 5-400 mM, aproximadamente 10-350 mM, aproximadamente 15-300 mM, aproximadamente 20-250 mM, aproximadamente 30-200 mM, aproximadamente 40-190 mM, aproximadamente 50-180 mM, aproximadamente 50-170 mM, aproximadamente 50-160 mM, aproximadamente 50-150 mM o aproximadamente 50-100 mM. En algunas realizaciones, la solución de nanopartículas lipídicas comprende una sal a una concentración de, o mayor de, aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM o 100 mM.

En algunas realizaciones, la solución de nanopartículas lipídicas puede tener un pH que varía de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 7,0 aproximadamente 4,8 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7.0, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7.0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,9, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,8, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,7, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,6, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,5. En algunas realizaciones, una solución de nanopartículas lipídicas adecuada puede tener un pH de, o no mayor de, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,95,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.

Provisión de soluciones de LNP

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para producir una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP), comprendiendo el método: (i) mezclar una solución lipídica que comprende un lípido ionizable con una solución tampón acuosa que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5, opcionalmente de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 5,25, formando así una solución de nanopartículas lipídicas que comprende una nanopartícula lipídica; y (ii) añadir una solución de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico a la solución de nanopartículas lipídicas, formando así una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) que comprende la nanopartícula lipídica que encapsula el ácido nucleico.

En el presente documento se divulgan adicionalmente ácidos nucleicos adecuados para el método de la presente divulgación. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un ARN (p. ej., ARNm).

En el presente documento se divulgan adicionalmente lípidos ionizables adecuados para los métodos de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, la LNP comprende adicionalmente un fosfolípido, un lípido PEG, un lípido estructural o cualquier combinación de los mismos. En el presente documento se divulgan adicionalmente fosfolípidos, lípidos PEG y lípidos estructurales adecuados para los métodos de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, la etapa de provisión de la solución de LNP comprende mezclar una solución tampón acuosa y una solución lipídica en donde la solución lipídica comprende un lípido ionizable en un disolvente orgánico.

Procesamiento de soluciones de LNP

El término “procesamiento”, como se emplea en el presente documento incluye una o más etapas para purificar, ajustar el pH, intercambiar el tampón y/o concentrar las LNP.

En algunas realizaciones, la etapa de procesamiento de la solución de LNP comprende:

iia) filtrar la solución de LNP.

En algunas realizaciones, la filtración elimina un disolvente orgánico (p. ej., un alcohol o etanol) de la solución de LNP. En algunas realizaciones, el procesamiento comprende una filtración de flujo tangencial (TFF). En algunas realizaciones, tras la eliminación del disolvente orgánico (p. ej., un alcohol o etanol), la solución de LNP se convierte en una solución tamponada a un pH neutro, un pH de 6,5 a 7,8, un pH de 6,8 a un pH de 7,5, p. ej., un pH de 7,0 a un pH de 7,2 (p. ej. tampón HEPES o fosfato). En algunas realizaciones, la solución de LNP resultante se esteriliza antes de su almacenamiento o uso, p. ej., mediante filtración (p. ej., a través de un filtro de 0,1-0,5 pm).

En algunas realizaciones, la etapa de procesamiento de la solución de LNP comprende adicionalmente envasar la solución de LNP.

Como se emplea en el presente documento, el “envasado” puede hacer referencia al almacenamiento del producto farmacológico en su estado final o al almacenamiento de LNP durante el procesamiento antes de colocarse en su envase final. Los modos de almacenamiento y/o envasado incluyen, pero sin limitarse a, la refrigeración en bolsas estériles, formulaciones refrigeradas o congeladas en viales, formulaciones liofilizadas en viales y jeringas, etc.

En algunas realizaciones, la etapa de envasado de la solución de LNP comprende una o más de las siguientes etapas:

iib) añadir un crioprotector a la solución de LNP;

iic) liofilizar la solución de LNP, para formar de ese modo una composición de LNP liofilizada;

iid) almacenar la solución de LNP de la composición de LNP liofilizada; y

iie) añadir una solución tamponadora a la solución de LNP o la composición de LNP liofilizada, para formar de ese modo la formulación de LNP.

En algunas realizaciones, el crioprotector se añade a la solución de LNP antes de la liofilización. En algunas realizaciones, el crioprotector comprende uno o más agentes crioprotectores, y cada uno de los uno o más agentes crioprotectores es independientemente un poliol (p. ej., un diol o un triol tal como propilenglicol (es decir, 1,2-propanodiol), 1,3-propanodiol, glicerol, (+/-)-2-metil-2,4-pentanodiol, 1,6-hexanodiol, 1,2-butanodiol, 2,3-butanodiol, etilenglicol o dietilenglicol), una sulfobetaína no detergente (p. ej., NDSB-201 (3-(1-piridino)-1-propanosulfonato), un osmolito (p. ej., L-prolina o N-óxido de trimetilamina dihidrato), un polímero (p. ej., polietilenglicol 200 (PEG 200), PEG 400, PEG 600, PEG 1000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 8000, PEG 10000, PEG 20000, monometil éter de polietilenglicol 550 (mPEG 550), mPEG 600, mPEG 2000, mPEG 3350, mPEG 4000, mPEG 5000, polivinilpirrolidona (p. ej., polivinilpirrolidona K 15), propoxilato de pentaeritritol o polipropilenglicol P 400), un disolvente orgánico (p. ej., dimetilsulfóxido (DMSO) o etanol), un azúcar (p. ej., D-(+)-sacarosa, D-sorbitol, trehalosa, monohidrato de D-(+)-maltosa, meso-eritritol, xilitol, mio-inositol, pentahidrato de D-(+)-rafinosa, dihidrato de D-(+)-trehalosa o monohidrato de D-(+)-glucosa), o una sal (p. ej., acetato de litio, cloruro de litio, formiato de litio, nitrato de litio, sulfato de litio, acetato de magnesio, cloruro de sodio, formiato de sodio, malonato de sodio, nitrato de sodio, sulfato de sodio, o cualquier hidrato de los mismos), o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el crioprotector comprende sacarosa. En algunas realizaciones, el crioprotector y/o el excipiente es sacarosa.

En algunas realizaciones, la liofilización se lleva a cabo en un receptáculo de vidrio adecuado (p. ej., un vial de vidrio cilindrico de 10 mL). En algunas realizaciones, el receptáculo de vidrio resiste cambios extremos de temperaturas de entre menos de -40°C y más que la temperatura ambiente en períodos de tiempo cortos, y/o se corta en una forma uniforme. En algunas realizaciones, la etapa de liofilización comprende congelar la solución de LNP a una temperatura de más de aproximadamente -40°C y, p. ej., de menos de aproximadamente -30°C, para formar de ese modo una solución de LNP congelada; y secar la solución de LNP congelada para formar la composición de LNP liofilizada. En algunas realizaciones, la etapa de congelación da como resultado una disminución lineal de la temperatura hasta la final durante aproximadamente 6 minutos, p. ej., a aproximadamente 1°C por minuto de 20°C a -40°C. En algunas realizaciones, se puede utilizar sacarosa al 12-15%, y la etapa de secado se realiza en un vacío que varía de aproximadamente 0,066 mbar (50 mTorr) a aproximadamente 0,20 mbar (150 mTorr), p. ej., primero a una temperatura baja que varía de aproximadamente -35°C a aproximadamente -15°C, y después a una temperatura más alta que varía de temperatura ambiente a aproximadamente 25°C, y p. ej., la etapa de secado se completa en tres a siete días. En algunas realizaciones, la etapa de secado se realiza en un vacío que varía de aproximadamente 0,066 mbar (50 mTorr) a aproximadamente 0,13 mbar (100 mTorr), p. ej., primero a una temperatura baja que varía de aproximadamente -15°C a aproximadamente 0°C, y después a una temperatura más alta.

En alguna realización, la solución de LNP o la composición de LNP liofilizada se almacenan a una temperatura de aproximadamente -80°C, aproximadamente -78°C, aproximadamente -76°C, aproximadamente -74°C, aproximadamente -72°C, aproximadamente -70°C, aproximadamente -65°C, aproximadamente -60°C, aproximadamente -55°C, aproximadamente -50°C, aproximadamente -45°C, aproximadamente -40°C, aproximadamente -35°C o aproximadamente -30°C antes de añadir la solución tampón.

En alguna realización, la solución de LNP o la composición de LNP liofilizada se almacenan a una temperatura de aproximadamente -40°C, aproximadamente -35°C, aproximadamente -30°C, aproximadamente -25°C, aproximadamente -20°C, aproximadamente -15°C, aproximadamente -10°C, aproximadamente -5°C, aproximadamente 0°C, aproximadamente 5°C, aproximadamente 10°C, aproximadamente 15°C, aproximadamente 20°C o aproximadamente 25°C antes de añadir la solución tampón.

En algunas realizaciones, la solución de LNP o la composición de LNP liofilizada se almacenan a una temperatura que varía de aproximadamente -40°C a aproximadamente 0°C, de aproximadamente -35°C a aproximadamente -5°C, de aproximadamente -30°C, aproximadamente -10°C, de aproximadamente -25°C a aproximadamente -15°C, de aproximadamente -22°C a aproximadamente -18°C o de aproximadamente -21°C a aproximadamente -19°C antes de añadir la solución tampón.

En algunas realizaciones, la solución de LNP o la composición de LNP liofilizada se almacenan a una temperatura de aproximadamente -20°C antes de añadir la solución tampón.

Administración de formulaciones de LNP

Las referencias a los métodos de tratamiento en los siguientes párrafos se deben interpretar como formulaciones de nanopartículas lipídicas de la divulgación para su uso en esos métodos.

En algunos ejemplos, la presente divulgación se refiere a un método para administrar una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) a un paciente, comprendiendo el método: (i) proporcionar una solución de agente activo que tiene un pH en un intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0 que comprende un agente terapéutico y/o profiláctico y una solución de nanopartículas lipídicas que tiene un pH en un intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,5 que comprende una nanopartícula lipídica, comprendiendo la nanopartícula lipídica un lípido ionizable; (ii) formar una formulación de nanopartículas lipídicas que comprende la nanopartícula lipídica que encapsula el agente terapéutico y/o profiláctico mediante la mezcla de la solución de nanopartículas lipídicas y la solución de agente activo de tal manera que la formulación de nanopartículas lipídicas tenga un pH en un intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente menos de 7,0; y (iii) administrar la formulación de nanopartículas lipídicas al paciente menos de aproximadamente 72 horas después de la mezcla.

En algunos ejemplos, el primer pH y el segundo pH se encuentran en un intervalo de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,1, o aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,8, o aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,7, o aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,6, o aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,5.

En algunos ejemplos, el primer pH y el segundo pH se encuentran en un intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,5, o aproximadamente 4,6 a aproximadamente 6,0, o aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5.

En algunos ejemplos, la administración se realiza menos de aproximadamente 72 horas después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 60 horas después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 48 horas después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 36 horas después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 24 horas después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 20 horas después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 16 horas después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 12 horas después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 8 horas después de la mezcla.

En algunos ejemplos, la administración se realiza menos de aproximadamente 120 minutos después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 100 minutos después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 90 minutos después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 80 minutos después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 70 minutos después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 60 minutos después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 50 minutos después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 40 minutos después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 30 minutos después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 20 minutos después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 15 minutos después de la mezcla, p. ej., menos de aproximadamente 10 minutos después de la mezcla.

En algunos ejemplos, la formulación de nanopartículas lipídicas no se procesa entre la mezcla y la administración.

En algunos ejemplos, el método de la presente divulgación no comprende un ajuste de pH entre la mezcla y la administración.

En algunos ejemplos, la formulación de nanopartículas lipídicas no se filtra entre la mezcla y la administración. En algunos ejemplos, el método comprende adicionalmente recibir en una primera entrada de un dispositivo de mezcla y administración la solución orgánica.

En algunos ejemplos, el método comprende adicionalmente recibir en una segunda entrada de un dispositivo de mezcla y administración la solución tampón acuosa.

En algunos ejemplos, la mezcla se realiza en un sitio mezclador de un dispositivo de mezcla y administración. En algunos ejemplos, la formulación de nanopartículas lipídicas se administra a través de una salida de un dispositivo de mezcla y administración.

En algunos ejemplos, la provisión, la formación, la mezcla y la administración se realizan todas empleando un único dispositivo de mezcla y administración, p. ej., un dispositivo de mezcla y administración con comunicación de fluidos.

En algunos ejemplos, el dispositivo de mezcla y administración comprende una jeringa de doble cámara. En algunos ejemplos, el dispositivo de mezcla y administración comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en una jeringa K y una jeringa L.

En algunos ejemplos, el dispositivo de mezcla y administración comprende un mezclador estático en el sitio mezclador.

En algunos ejemplos, el mezclador estático es un mezclador estático helicoidal.

En algunos ejemplos, el pH de la solución tampón acuosa y el pH de la formulación de nanopartículas lipídicas son casi iguales.

En algunos ejemplos, la formulación de nanopartículas lipídicas comprende de aproximadamente 1% en volumen a aproximadamente 50% en volumen del disolvente orgánico con respecto al volumen total de la formulación de nanopartículas lipídicas, p. ej., de aproximadamente 2% en volumen a aproximadamente 45% en volumen, p. ej., de aproximadamente 3% en volumen a aproximadamente 40% en volumen, p. ej., de aproximadamente 4% en volumen a aproximadamente 35% en volumen, p. ej., de aproximadamente 5% en volumen a aproximadamente 33% en volumen del disolvente orgánico con respecto al volumen total de la formulación de nanopartículas lipídicas.

En algunos ejemplos, el disolvente orgánico es un alcohol.

En algunos ejemplos, el disolvente orgánico es etanol.

En algunos ejemplos, el disolvente orgánico comprende un primer disolvente orgánico y un segundo disolvente orgánico.

En algunos ejemplos, el primer disolvente orgánico es un alcohol y el segundo disolvente orgánico es un alcohol.

En algunos ejemplos, el primer disolvente orgánico es etanol y el segundo disolvente orgánico es alcohol bencílico.

En algunos ejemplos, una razón peso/peso del primer disolvente orgánico con respecto al segundo disolvente orgánico se encuentra en un intervalo de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 1:1, o de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 1:1, o de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:1, o de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:1.

En algunos ejemplos, la solución orgánica comprende adicionalmente un agente humectante. Como se emplea en el presente documento, un agente humectante puede hacer referencia a un agente que aumenta, disminuye o mejora la capacidad de un líquido de mantener contacto con una superficie, tal como una superficie sólida y/o una superficie líquida.

En algunos ejemplos, el agente humectante es un disolvente orgánico.

En algunos ejemplos, el agente humectante es dimetilsulfóxido (DMSO).

En algunos ejemplos, una razón peso/peso del agente humectante con respecto al disolvente orgánico se encuentra en un intervalo de aproximadamente 1000:1 a aproximadamente 1:1, o de aproximadamente 500:1 a aproximadamente 5:1, o de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 10:1.

En algunos ejemplos, la solución tampón acuosa es al menos una seleccionada del grupo que consiste en tampón de acetato, tampón de citrato, tampón de fosfato y tampón tris. En algunos ejemplos, la solución tampón acuosa puede ser cualquier tampón adecuado para mantener un pH fisiológico. En algunos ejemplos, la solución tampón acuosa puede ser cualquier tampón adecuado para mantener un pH adecuado para administración a un paciente, p. ej., un paciente mamífero, p. ej., un paciente humano.

En algunos ejemplos, la solución tampón acuosa comprende adicionalmente un agente de tonicidad. Como se emplea en el presente documento, un agente de tonicidad puede hacer referencia a un agente que aumenta, disminuye o mejora el gradiente de presión osmótica eficaz, según lo definido por el potencial hídrico de dos soluciones, o una concentración relativa de solutos disueltos en una solución que repercute en la dirección y extensión de difusión.

En algunos ejemplos, el agente de tonicidad es un azúcar.

En algunos ejemplos, el azúcar es sacarosa.

Sales estabilizantes

El término “sal estabilizante” como se emplea en el presente documento hace referencia a una sal que es adecuada para los métodos de la presente divulgación y/o las formulaciones de LNP de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la sal estabilizante, cuando se utiliza de acuerdo con los métodos de la presente divulgación, mitiga un cambio no deseado de una propiedad de la formulación de nanopartículas lipídicas LNP producida en comparación con una formulación de<l>Nproducida mediante un método comparable (p. ej., un método que no implica el uso de la sal estabilizante (p. ej., un método sin la etapa ia) y/o la etapa iia) sin la etapa ia), etapa iia), etapa iic) y/o etapa iid)).

En algunas realizaciones, la sal estabilizante tiene una afinidad por el ácido nucleico (p. ej., la cadena principal PO4- del ARNm) que es más alta que la afinidad de una sal de sodio comparable (p. ej., una sal de sodio que tiene el mismo anión que la sal estabilizante) por el ácido nucleico.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante tiene una afinidad por el ácido nucleico (p. ej., la cadena principal PO4- del ARNm) que es más alta que la afinidad de una sal de sodio comparable p. ej., una sal de sodio que tiene el mismo anión que la sal estabilizante) por el ácido nucleico en aproximadamente 5% o superior, aproximadamente 10% o más, aproximadamente 15% o más, aproximadamente 20% o más, aproximadamente 30% o más, aproximadamente 40% o más, aproximadamente 50% o más, aproximadamente 60% o más, aproximadamente 70% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 90% o más, aproximadamente 1 vez o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 4 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 20 veces o más, aproximadamente 30 veces o más, aproximadamente 40 veces o más, aproximadamente 50 veces o más, aproximadamente 100 veces o más, aproximadamente 200 veces o más, aproximadamente 300 veces o más, aproximadamente 400 veces o más, aproximadamente 500 veces o más, aproximadamente 1000 veces o más, aproximadamente 2000 veces o más, aproximadamente 3000 veces o más, aproximadamente 4000 veces o más, aproximadamente 5000 veces o más o aproximadamente 10000 veces o más.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es una sal alcalina o una sal alcalinotérrea, p. ej., una sal de litio, una sal de sodio, una sal de potasio, una sal de berilio, una sal de magnesio o una sal de calcio.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es una sal alcalina, p. ej., una sal de litio, una sal de sodio o una sal de potasio.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es una sal litio.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es una sal fluoruro, una sal bromuro, una sal bromato, una sal perbromato, una sal cloruro, una sal clorito, una sal hidróxido, una sal hiperclorito, una sal perclorato, una sal yoduro, una sal yodato, una sal peryodato, una sal azida, una sal carbonato, una sal fosfato o una sal sulfato. En algunas realizaciones, la sal estabilizante es una sal fluoruro, una sal cloruro, una sal bromuro o una sal yoduro.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es una sal cloruro.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es fluoruro de litio, bromuro de litio, bromato de litio, perbromato de litio, cloruro de litio, clorito de litio, hidróxido de litio, hiperclorito de litio, perclorato de litio, yoduro de litio, yodato de litio, peryodato de litio, azida de litio, carbonato de litio, fosfato de litio o sulfato de litio. En algunas realizaciones, la sal estabilizante es fluoruro de litio, cloruro de litio, bromuro de litio o yoduro de litio.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es cloruro de litio.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es una sal acetato, una sal adipato, una sal antranilato, una sal ascorbato, una sal benzoato, una sal butirato, una sal cinamato, una sal citrato, una sal decanoato, una sal etilhexanoato, una sal formiato, una sal fumarato, una sal gluconato, una sal glutamato, una sal isobutirato, una sal lactato, una sal laurato, una sal malato, una sal malonato, una sal octanoato, una sal oxalato, una sal palmitato, una sal ftalato, una sal pivalato, una sal propionato, una sal salicilato, una sal sorbato, una sal estearato, una sal succinato, una sal tartrato o una sal valerato.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es una sal acetato.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es acetato de litio, adipato de litio, antranilato de litio, ascorbato de litio, benzoato de litio, butirato de litio, cinamato de litio, citrato de litio, decanoato de litio, etilhexanoato de litio, formiato de litio, fumarato de litio, gluconato de litio, glutamato de litio, isobutirato de litio, lactato de litio, laurato de litio, malato de litio, malonato de litio, octanoato de litio, oxalato de litio, palmitato de litio, ftalato de litio, pivalato de litio, propionato de litio, salicilato de litio, sorbato de litio, estearato de litio, succinato de litio, tartrato de litio o valerato de litio.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es acetato de litio.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es una sal alcalinotérrea, p. ej., una sal de berilio, una sal de magnesio o una sal de calcio.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es una sal de calcio.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es fluoruro de calcio, bromuro de calcio, bromato de calcio, perbromato de calcio, cloruro de calcio, clorito de calcio, hidróxido de calcio, hiperclorito de calcio, perclorato de calcio, yoduro de calcio, yodato de calcio, peryodato de calcio, azida de calcio, carbonato de calcio, fosfato de calcio o sulfato de calcio.

En algunas realizaciones, la sal estabilizante es acetato de calcio, adipato de calcio, antranilato de calcio, ascorbato de calcio, benzoato de calcio, butirato de calcio, cinamato de calcio, citrato de calcio, decanoato de calcio, etilhexanoato de calcio, formiato de calcio, fumarato de calcio, gluconato de calcio, glutamato de calcio, isobutirato de calcio, lactato de calcio, laurato de calcio, malato de calcio, malonato de calcio, octanoato de calcio, oxalato de calcio, palmitato de calcio, ftalato de calcio, pivalato de calcio, propionato de calcio, salicilato de calcio, sorbato de calcio, estearato de calcio, succinato de calcio, tartrato de calcio o valerato de calcio. Se entiende que, además de las sales específicamente divulgadas en el presente documento, puede ser adecuado que la sal estabilizante sea una variedad de sales conocidas en la técnica (p. ej., disponibles comercialmente). Un experto en la técnica puede determinar la eficacia de una sal con respecto a los métodos de formulaciones de LNP de la presente divulgación, p. ej., al comparar la formulación de LNP producida con una formulación de LNP producida mediante un método comparable.

Primer y segundo tampones

En algunos ejemplos, el valor de pH del primer tampón es mayor que el valor de pH del segundo tampón. En algunos ejemplos, el valor de pH del primer tampón es aproximadamente 7,0 o superior, aproximadamente 7,25 o superior, aproximadamente 7,5 o superior, aproximadamente 7,75 o superior, o aproximadamente 8,0 o superior.

En algunos ejemplos, el valor de pH del primer tampón varía de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 10, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9,5, de aproximadamente 7,75 a aproximadamente 9,25 o de aproximadamente 8 a aproximadamente 9.

En algunos ejemplos, el primer tampón comprende un primer agente tamponador.

En algunos ejemplos, el primer agente tamponador puede eliminarse sustancialmente mediante liofilización.

En algunos ejemplos, el primer agente tamponador puede eliminarse completamente mediante liofilización. En algunos ejemplos, el primer agente tamponador se elimina sustancialmente mediante liofilización.

En algunos ejemplos, aproximadamente 50% o más, aproximadamente 60% o más, aproximadamente 70% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 90% o más, aproximadamente 95% o más, aproximadamente 98% o más, aproximadamente 99% o más, aproximadamente 99,5% o más, aproximadamente 99,8% o más, aproximadamente 99,9% o más o aproximadamente 99,95% o más del primer agente tamponador se elimina mediante liofilización.

En algunos ejemplos, el primer agente tamponador tiene un punto de sublimación de ** o menos, ** o menos, o ** o menos a ** mm Hg.

En algunos ejemplos, el primer agente tamponador es una sal de trietilamonio.

En algunos ejemplos, el primer agente tamponador es bicarbonato de trietilamonio.

En algunos ejemplos, la concentración de bicarbonato de trietilamonio en el primer tampón varía de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 25 mM.

En algunos ejemplos, la concentración de bicarbonato de trietilamonio en el primer tampón es de aproximadamente 20 mM.

En algunos ejemplos, el valor de pH del segundo tampón es aproximadamente 9,0 o menos, aproximadamente 8,75 o menos, aproximadamente 8,5 o menos, aproximadamente 8,25 menos o más, aproximadamente 8,0 o menos, aproximadamente 7,75 o menos, aproximadamente 7,5 o menos, aproximadamente 7,25 o menos o aproximadamente 7,0 o menos.

En algunos ejemplos, el valor de pH del segundo tampón varía de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 7,25 a aproximadamente 8,75, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5 o de aproximadamente 7,75 a aproximadamente 8,25.

En algunos ejemplos, el segundo tampón es agua. En algunos ejemplos, el segundo tampón comprende tris(hidroximetil)aminometano.

En algunos ejemplos, la concentración de tris(hidroximetil)aminometano en el segundo tampón varía de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, o de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 25 mM.

En algunos ejemplos, la concentración de tris(hidroximetil)aminometano en el segundo tampón es de aproximadamente 20 mM.

Formulaciones de LNP y nanopartículas lipídicas (LNP)

En aspectos de la invención, la formulación de LNP de la presente divulgación se prepara mediante un método divulgado en el presente documento.

En algunos aspectos, la formulación de LNP de la presente divulgación comprende múltiples LNP, en donde las LNP comprenden un ácido nucleico y un lípido ionizable.

En el presente documento se divulgan adicionalmente ácidos nucleicos adecuados para los métodos de la presente divulgación. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ARN (p. ej., ARNm).

En algunas realizaciones, la formulación de LNP de la divulgación incluye al menos un componente de nanopartícula lipídica. Las nanopartículas lipídicas pueden incluir un componente lipídico y uno o más componentes adicionales, tales como un agente terapéutico y/o profiláctico, tal como un ácido nucleico. Una LNP puede diseñarse para una o más aplicaciones o dianas específicas. Los elementos de una LNP pueden seleccionarse en función de una aplicación o diana particulares, y/o en función de la eficacia, toxicidad, coste, facilidad de uso, disponibilidad, u otra característica de uno o más elementos. De manera similar, la formulación particular de una LNP se puede seleccionar para una aplicación o diana particulares de acuerdo con, por ejemplo, la eficacia y toxicidad de una combinación particular de elementos. La eficacia y tolerabilidad de una formulación de LNP pueden verse afectadas por la estabilidad de la formulación.

El componente lipídico de una LNP puede incluir, por ejemplo, un lípido de acuerdo con la Fórmula (IL-I), (IL IA), (IL-IB), (IL-II), (IL-IIa), (IL-IIb), (IL-IIc), (IL-IId), (IL-IIe), (IL-IIf), (IL-IIg), (IL-III), (IL-IIIa1), (IL-IIIa2), (IL-IIIa3), (IL-IIIa4), (IL-IIIa5), (IL-IIIa6), (IL-IIIa7) o (IL-IIIa8), un fosfolípido (tal como un lípido insaturado, p. ej., DOPE o DSPC), un lípido PEG y un lípido estructural. El componente lipídico de una LNP puede incluir, por ejemplo, un lípido de acuerdo con la Fórmula (IL-I), (IL-IA), (IL-IB), (IL-II), (IL-IIa), (IL-IIb), (IL-IIc), (IL-IId), (IL-IIe), (IL-IIf), (IL-IIg), (IL-III), (IL-IIIa1), (IL-IIIa2), (IL-IIIa3), (IL-IIIa4), (IL-IIIa5), (IL-IIa6), (IL-IIIa7) o (IL-IIIa8), un fosfolípido (tal como un lípido insaturado, p. ej., DOPE o DSPC) y un lípido estructural. Los elementos del componente lipídico pueden proporcionarse en fracciones específicas.

En algunas realizaciones, el componente lipídico de una LNP incluye un lípido de acuerdo con la Fórmula (IL-I), (IL-IA), (IL-IB), (IL-II), (IL-IIa), (IL-IIb), (IL-IIc), (IL-IId), (IL-IIe), (IL-IIf), (IL-IIg), (IL-III), (IL-IIIa1), (IL-IIIa2), (IL-IIIa3), (IL-IIIa4), (IL-IIIa5), (IL-IIIa6), (IL-IIIa7) o (IL-IIIa8), un fosfolípido, un lípido PEG y un lípido estructural. En algunas realizaciones, el componente lípido de la nanopartícula lipídica incluye de aproximadamente 30% en moles a aproximadamente 60% en moles del compuesto con la Fórmula (IL-I), (IL-IA), (IL-IB), (IL-II), (IL-IIa), (IL-IIb), (IL-IIc), (IL-IId), (IL-IIe), (IL-IIf), (IL-IIg), (IL-III), (IL-IIIa1), (IL-IIIa2), (IL-IIIa3), (IL-IIIa4), (IL-IIIa5), (IL-IIIa6), (IL-IIIa7) o (IL-IIIa8), de aproximadamente 0% en moles a aproximadamente 30% en moles de fosfolípido, de aproximadamente 18,5% en moles a aproximadamente 48,5% en moles de lípido estructural y de aproximadamente 0% en moles a aproximadamente 10% en moles de lípido PEG, siempre que % en moles total no exceda 100%. En algunas realizaciones, el componente lipídico de la nanopartícula lipídica incluye de aproximadamente 35% en moles a aproximadamente 55% en moles del compuesto con la Fórmula (IL-I), (IL IA), (IL-IB), (IL-II), (IL-IIa), (IL-IIb), (IL-IIc), (IL-IId), (IL-IIe), (IL- IIf), (IL-IIg), (IL-III), (IL-IIIa1), (IL-IIIa2), (IL-IIIa3), (IL-IIIa4), (IL-IIIa5), (IL-IIIa6), (IL-IIIa7) o (IL-IIIa8), de aproximadamente 5% en moles a aproximadamente 25% en moles de fosfolípido, de aproximadamente 30% en moles a aproximadamente 40% en moles de lípido estructural y de aproximadamente 0% en moles a aproximadamente 10% en moles de lípido PEG. En una realización particular, el componente lipídico incluye aproximadamente 50% en moles de dicho compuesto, aproximadamente 10% en moles de fosfolípido, aproximadamente 38,5% en moles de lípido estructural y aproximadamente 1,5% en moles de lípido PEG. En otra realización particular, el componente lipídico incluye aproximadamente 40% en moles de dicho compuesto, aproximadamente 20% en moles de fosfolípido, aproximadamente 38,5% en moles de lípido estructural y aproximadamente 1,5% en moles de lípido PEG. En algunas realizaciones, el fosfolípido puede ser DOPE o DSPC. En algunas realizaciones, el lípido PEG puede ser PEG-DMG y/o el lípido estructural puede ser colesterol.

Las nanopartículas lipídicas pueden diseñarse para una o más aplicaciones o dianas específicas. En algunas realizaciones, una<l>Npuede diseñarse para suministrar un agente terapéutico y/o profiláctico tal como un ARN a una célula, un tejido, un órgano o un sistema particular, o grupo de los mismos, en el organismo de un mamífero. Las propiedades fisioquímicas de las nanopartículas lipídicas pueden alterarse con el fin de aumentar la selectividad con respecto a dianas corporales particulares. Por ejemplo, se pueden ajustar los tamaños de partículas en función de los tamaños de abertura de diferentes órganos. El agente terapéutico y/o profiláctico incluidos en una LNP también pueden seleccionarse en función de la diana o las dianas de suministro deseadas. En algunas realizaciones, se puede seleccionar un agente terapéutico y/o profiláctico para una indicación, una afección, una enfermedad o un trastorno particulares y/o para el suministro a una célula, un tejido, un órgano o un sistema particulares, o grupo de los mismos (p. ej., suministro localizado o específico). En algunas realizaciones, una LNP puede incluir un ARNm que codifica un polipéptido de interés que puede traducirse dentro de una célula para producir el polipéptido de interés. Tal composición puede diseñarse para su suministro específico a un órgano particular. En algunas realizaciones, una composición puede diseñarse para su suministro específico al hígado de un mamífero.

La cantidad de un agente terapéutico y/o profiláctico en una LNP puede depender del tamaño, la composición, la diana y/o aplicación deseadas, u otras propiedades de la nanopartícula lipídica, así como de las propiedades del agente terapéutico y/o profiláctico. En algunas realizaciones, la cantidad de un ARN útil en una<l>Npuede depender del tamaño, la secuencia y otras características del ARN. Las cantidades relativas de un agente terapéutico y/o profiláctico y otros elementos (p. ej., lípidos) en una LNP también pueden variar. En algunas realizaciones, la razón peso/peso del componente lipídico con respecto a un agente terapéutico y/o profiláctico, tal como un ácido nucleico, en una LNP puede ser de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 60:1, tal como 5:1,6:1,7:1, 8:1,9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1,25:1, 30:1, 35:1,40:1,45:1, 50:1 y 60:1. En algunas realizaciones, la razón peso/peso del componente lipídico con respecto a un agente terapéutico y/o profiláctico puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 40:1. En algunas realizaciones, la razón peso/peso es de aproximadamente 20:1. La cantidad de un agente terapéutico y/o profiláctico en una LNP puede medirse, por ejemplo, mediante el uso de espectroscopia de absorción (p. ej., espectroscopia ultravioleta-visible).

En algunas realizaciones, una LNP incluye uno o más ARN, y los uno o más ARN, lípidos y las cantidades de los mismos, se pueden seleccionar para proporcionar una razón N:P específica. La razón N:P de la composición hace referencia a la razón molar de átomos de nitrógeno en uno o más lípidos con respecto a la cantidad de grupos fosfato en un ARN. En general, se prefiere una razón N:P más baja. Los uno o más ARN, lípidos y las cantidades de los mismos se pueden seleccionar para proporcionar una razón N:P de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 30:1, tal como 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 12:1, 14:1, 16:1, 18:1, 20:1, 22:1, 24:1, 26:1, 28:1 o 30:1. En algunas realizaciones, la razón N:P puede ser de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1. En algunas realizaciones, la razón N:P es de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 8:1. En algunas realizaciones, la razón N:P puede ser de aproximadamente 5,0:1, aproximadamente 5,5:1, aproximadamente 5,67:1, aproximadamente 6,0:1, aproximadamente 6,5:1 o aproximadamente 7,0:1. En algunas realizaciones, la razón N:P puede ser de aproximadamente 5,67:1.

En algunas realizaciones, la formulación que incluye una LNP puede incluir adicionalmente una sal, tal como una sal cloruro.

En algunas realizaciones, la formulación que incluye una LNP puede incluir adicionalmente un azúcar, tal como un disacárido. En algunas realizaciones, la formulación incluye adicionalmente un azúcar, pero no una sal, tal como una sal cloruro.

Propiedades físicas

Las propiedades físicas de la LNP de la presente divulgación se pueden caracterizar mediante una variedad de métodos. En algunas realizaciones, se puede utilizar microscopía (p. ej., microscopía electrónica de transmisión o microscopía electrónica de barrido) para examinar la morfología y la distribución de tamaño de una LNP. La dispersión de luz dinámica o potenciometría (p. ej., titulaciones potenciométricas) se pueden utilizar para medir potenciales zeta. También se puede utilizar la dispersión de luz dinámica para determinar los tamaños de las partículas. También se pueden utilizar aparatos tales como el Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire, RU) para medir múltiples características de una LNP, tales como el tamaño de partícula, el índice de polidispersidad y el potencial zeta.

El diámetro de LNP promedio de la formulación de LNP puede ser de entre decenas de nm y centenas de nm, p. ej., medido mediante dispersión de luz dinámica (DLS). En algunas realizaciones, el diámetro de LNP promedio de la formulación de LNP puede ser de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm, tal como aproximadamente 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm o 150 nm. En algunas realizaciones, el diámetro de LNP promedio de la formulación de LNP puede ser de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 90 nm o de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 100 nm. En algunas realizaciones, el diámetro de LNP promedio de la formulación de LNP puede ser de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 100 nm. En una realización particular, el diámetro de LNP promedio de la formulación de LNP puede ser de aproximadamente 80 nm. En algunas realizaciones, el diámetro de LNP promedio de la formulación de LNP puede ser de aproximadamente 100 nm.

En algunas realizaciones, el diámetro de LNP promedio de la formulación de LNP varía de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 500 mm, de aproximadamente 5 mm a aproximadamente 200 mm, de aproximadamente 10 mm a aproximadamente 100 mm, de aproximadamente 20 mm a aproximadamente 80 mm, de aproximadamente 25 mm a aproximadamente 60 mm, de aproximadamente 30 mm a aproximadamente 55 mm, de aproximadamente 35 mm a aproximadamente 50 mm o de aproximadamente 38 mm a aproximadamente 42 mm.

En algunas realizaciones, el diámetro de LNP promedio de la formulación de LNP es de aproximadamente 99% o menos, aproximadamente 98% o menos, aproximadamente 97% o menos, aproximadamente 96% o menos, aproximadamente 95% o menos, aproximadamente 90% o menos, aproximadamente 85% o menos, aproximadamente 80% o menos, aproximadamente 75% o menos, aproximadamente 70% o menos, aproximadamente 65% o menos, aproximadamente 60% o menos, aproximadamente 55% o menos, aproximadamente 50% o menos, aproximadamente 40% o menos, aproximadamente 30% o menos, aproximadamente 20% o menos o aproximadamente 10% o menos en comparación con la formulación de LNP producida mediante un método comparable.

Una LNP puede ser relativamente homogénea. Se puede utilizar un índice de polidispersidad para indicar la homogeneidad de una LNP, p. ej., la distribución de tamaño de partícula de las nanopartículas lipídicas. Un índice de polidispersidad pequeño (p. ej., menos de 0,3) generalmente indica una distribución del tamaño de partícula estrecha. Una LNP puede tener un índice de polidispersidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,25, tal como 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24 o 0,25. En algunas realizaciones, el índice de polidispersidad de una LNP puede ser de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 0,20.

El potencial zeta de una LNP se puede utilizar para indicar el potencial electrocinético de la composición. En algunas realizaciones, el potencial zeta puede describir la carga de superficie de una LNP. Las nanopartículas lipídicas con cargas relativamente bajas, positivas o negativas, son generalmente deseables, ya que las especies con carga más alta pueden interactuar de manera indeseable con las células, tejidos y otros elementos del organismo. En algunas realizaciones, el potencial zeta de una LNP puede ser de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 0 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente -5 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 0 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 15 mV o de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 10 mV.

La eficiencia de la encapsulación de un agente terapéutico y/o profiláctico, tal como un ácido nucleico, describe la cantidad del agente terapéutico y/o profiláctico encapsulado o asociado de otro modo a una LNP después de la preparación, con respecto a la cantidad inicial proporcionada. La eficiencia de encapsulación es deseablemente alta (p. ej., cerca de 100%). La eficiencia de la encapsulación puede medirse, por ejemplo, mediante la comparación de la cantidad del agente terapéutico y/o profiláctico en una solución que contiene la nanopartícula lipídica antes y después de la ruptura de la nanopartícula lipídica con uno o más detergentes o disolventes orgánicos. Se puede utilizar una resina de intercambio de aniones para medir la cantidad de agente terapéutico y/o profiláctico libre (p. ej., ARN) en una solución. Se puede utilizar fluorescencia para medir la cantidad de agente terapéutico y/o profiláctico libre (p. ej., ARN) en una solución. Para las nanopartículas lipídicas descritas en el presente documento, la eficiencia de la encapsulación de un agente terapéutico y/o profiláctico puede ser de al menos 50%, por ejemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. En algunas realizaciones, la eficiencia de la encapsulación puede ser de al menos 80%. En algunas realizaciones, la eficiencia de la encapsulación puede ser de al menos 90%. En algunas realizaciones, la eficiencia de la encapsulación puede ser de al menos 95%.

Una LNP puede comprender opcionalmente uno o más recubrimientos. En algunas realizaciones, una LNP puede formularse en una cápsula, una película o un comprimido con un recubrimiento. Una cápsula, una película o un comprimido que incluye una composición descrita en el presente documento puede tener cualquier tamaño, resistencia a la tracción, dureza o densidad útiles.

Propiedades químicas

Las propiedades químicas de la LNP, la solución de LNP, la composición de LNP liofilizada o la formulación de LNP de la presente divulgación se pueden caracterizar mediante una variedad de métodos.En algunas realizaciones, se pueden utilizar electroforesis (p. ej., electroforesis capilar) o cromatografía (p. ej., cromatografía líquida de fase inversa) para examinar la integridad del ARNm.

En algunas realizaciones, la integridad de LNP de la LNP, solución de LNP, composición de LNP liofilizada o formulación de LNP de la presente divulgación es de aproximadamente 20% o más, aproximadamente 25% o más, aproximadamente 30% o más, aproximadamente 35% o más, aproximadamente 40% o más, aproximadamente 45% o más, aproximadamente 50% o más, aproximadamente 55% o más, aproximadamente 60% o más, aproximadamente 65% o más, aproximadamente 70% o más, aproximadamente 75% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 85% o más, aproximadamente 90% o más, aproximadamente 95% o más, aproximadamente 96% o más, aproximadamente 97% o más, aproximadamente 98% o más o aproximadamente 99% o más.

En algunas realizaciones, la integridad de LNP de la LNP, solución de LNP, composición de LNP liofilizada o formulación de LNP de la presente divulgación es más alta que la integridad de LNP de la LNP, solución de LNP, composición de LNP liofilizada o formulación de LNP producidas mediante un método comparable en aproximadamente 5% o más, aproximadamente 10% o más, aproximadamente 15% o más, aproximadamente 20% o más, aproximadamente 30% o más, aproximadamente 40% o más, aproximadamente 50% o más, aproximadamente 60% o más, aproximadamente 70% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente

90% o más, aproximadamente 1 vez o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 4 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 20 veces o más, aproximadamente 30 veces o más, aproximadamente 40 veces o más, aproximadamente 50 veces o más, aproximadamente 100 veces o más, aproximadamente 200 veces o más, aproximadamente 300 veces o más, aproximadamente 400 veces o más, aproximadamente 500 veces o más, aproximadamente 1000 veces o más, aproximadamente 2000 veces o más, aproximadamente 3000 veces o más, aproximadamente 4000 veces o más, aproximadamente 5000 veces o más o aproximadamente 10000 veces o más.

En algunas realizaciones, el T80% de la LNP, solución de LNP, composición de LNP liofilizada o formulación de

LNP de la presente divulgación es de aproximadamente 12 meses o más, aproximadamente 15 meses o más, aproximadamente 18 meses o más, aproximadamente 21 meses o más, aproximadamente 24 meses o más, aproximadamente 27 meses o más, aproximadamente 30 meses o más, aproximadamente 33 meses o más, aproximadamente 36 meses o más, aproximadamente 48 meses o más, aproximadamente 60 meses o más, aproximadamente 72 meses o más, aproximadamente 84 meses o más, aproximadamente 96 meses o más, aproximadamente 108 meses o más, aproximadamente 120 meses o más.

LNP de la presente divulgación es más largo que el T80% de la<l>N, solución de LNP, composición de LNP liofilizada o formulación de LNP producidas mediante un método comparable en aproximadamente 5% o más, aproximadamente 10% o más, aproximadamente 15% o más, aproximadamente 20% o más, aproximadamente

30% o más, aproximadamente 40% o más, aproximadamente 50% o más, aproximadamente 60% o más, aproximadamente 70% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 90% o más, aproximadamente

1 vez o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 4 veces

0 más, aproximadamente 5 veces o más.

En algunas realizaciones, el T1/2 de la LNP, solución de LNP, composición de LNP liofilizada o formulación de

LNP de la presente divulgación es más largo que el T1/2 de la<l>N, solución de LNP, composición de LNP liofilizada o formulación de LNP producidas mediante un método comparable en aproximadamente 5% o más, aproximadamente 10% o más, aproximadamente 15% o más, aproximadamente 20% o más, aproximadamente

1 vez o más, aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 4 veces o más, aproximadamente 5 veces o más.

Definiciones

Como se emplean en el presente documento, los términos “alquilo” o “grupo alquilo” significan un hidrocarburo saturado, lineal o ramificado, que incluye uno o más átomos de carbono (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más átomos de carbono), que está opcionalmente sustituido. La notación “alquilo C1-C14” significa un hidrocarburo saturado, lineal o ramificado opcionalmente sustituido que incluye 1-14 átomos de carbono. A menos que se indique de otro modo, un grupo alquilo descrito en el presente documento hace referencia a grupos alquilo no sustituidos y sustituidos.

Como se emplean en el presente documento, los términos “alquenilo” o “grupo alquenilo” significan un hidrocarburo lineal o ramificado que incluye dos o más átomos de carbono (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más átomos de carbono) y al menos un enlace doble, que está opcionalmente sustituido. La notación “alquenilo C2-C14” significa un hidrocarburo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que incluye 2-14 átomos de carbono y al menos un enlace doble carbono-carbono. Un grupo alquenilo puede incluir uno, dos, tres, cuatro o más enlaces dobles carbono-carbono. En algunas realizaciones, un alquenilo C18 puede incluir uno o más enlaces dobles. Un grupo alquenilo C18 que incluye dos enlaces dobles puede ser un grupo linoleilo.

A menos que se especifique de otro modo, un grupo alquenilo descrito en el presente documento hace referencia a grupos alquenilo no sustituidos y sustituidos.

Como se emplean en el presente documento, los términos “carbociclo” o “grupo carbocíclico” significan un sistema mono- o multicíclico opcionalmente sustituido que incluye uno o más anillos de átomos de carbono. Los anillos pueden ser anillos de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte miembros. La notación “carbociclo C3-C6” significa un carbociclo que incluye un solo anillo que tiene 3-6 átomos de carbono. Los carbociclos pueden incluir uno o más enlaces dobles o triples carbono-carbono y pueden ser no aromáticos o aromáticos (p. ej., grupos cicloalquilo o arilo). Los ejemplos de carbociclos incluyen grupos ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, fenilo, naftilo y 1,2-dihidronaftilo. El término “cicloalquilo”, como se emplea en el presente documento significa un carbociclo no aromático y puede incluir o no cualquier enlace doble o triple. A menos que se especifique de otro modo, los carbociclos descritos en el presente documento hacen referencia a grupos carbociclo no sustituidos y sustituidos, es decir, carbociclos opcionalmente sustituidos.

Como se emplean en el presente documento, los términos “heterociclo” o “grupo heterocíclico” significan un sistema mono- o multicíclico opcionalmente sustituido que incluye uno o más anillos, donde al menos un anillo incluye al menos un heteroátomo. Los heteroátomos pueden ser, por ejemplo, átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre. Los anillos pueden ser anillos de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce miembros. Los heterociclos pueden incluir uno o más enlaces dobles o triples y pueden ser no aromáticos o aromáticos (p. ej., grupos heterocicloalquilo o heteroarilo). Los ejemplos de heterociclos incluyen grupos imidazolilo, imidazolidinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, pirazolidinilo, pirazolilo, isoxazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolidinilo, isotiazolilo, morfolinilo, pirrolilo, pirrolidinilo, furilo, tetrahidrofurilo, tiofenilo, piridinilo, piperidinilo, quinolilo e isoquinolilo. El término “heterocicloalquilo”, como se emplea en el presente documento significa un heterociclo no aromático y puede incluir o no cualquier enlace doble o triple. A menos que se especifique de otro modo, los heterociclos descritos en el presente documento hacen referencia tanto a grupos heterociclo no sustituidos como sustituidos, es decir, heterociclos opcionalmente sustituidos.

Como se emplea en el presente documento, un “grupo biodegradable” es un grupo que puede facilitar el metabolismo más rápido de un lípido en una entidad de mamífero. Un grupo biodegradable se puede seleccionar del grupo que consiste en, pero sin limitarse a, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-,

-CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo. Como se emplea en el presente documento, un “grupo arilo” es un grupo carbocíclico opcionalmente sustituido que incluye uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen grupos fenilo y naftilo. Como se emplea en el presente documento, un “grupo heteroarilo” es un grupo heterocíclico opcionalmente sustituido que incluye uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen pirrolilo, furilo, tiofenilo, imidazolilo, oxazolilo y tiazolilo. Tanto los grupos arilo como los heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos. En algunas realizaciones, M y M' se pueden seleccionar del grupo no limitante que consiste en fenilo, oxazol y tiazol opcionalmente sustituidos. En las fórmulas del presente documento, M y M' se pueden seleccionar independientemente de la lista de grupos biodegradables anterior. A menos que se especifique de otro modo, los grupos arilo o heteroarilo descritos en el presente documento hacen referencia a grupos no sustituidos y sustituidos, es decir, grupos arilo o heteroarilo opcionalmente sustituidos.

Los grupos alquilo, alquenilo y ciclilo (p. ej., carbociclilo y heterociclilo) pueden estar opcionalmente sustituidos a menos que se indique de otro modo. Se pueden seleccionar sustituyentes opcionales del grupo que consiste en, pero sin limitarse a, un átomo de halógeno (p. ej., un grupo cloruro, bromuro, fluoruro o yoduro), un ácido carboxílico (p. ej., -C(O)OH), un alcohol (p. ej., un hidroxilo, -OH), un éster (p. ej., -C(O)OR o -OC(O)R), un aldehído (p. ej., -C(O)H), un carbonilo (p. ej., -C(O)R, representado de manera alternativa por C=O), un haluro de acilo (p. ej., -C(O)X, en que X es un haluro que se selecciona entre bromuro, fluoruro, cloruro y yoduro), un carbonato (p. ej., -OC(O)OR), un alcoxi (p. ej., -OR), un acetal (p. ej., -C(OR)2R””, en el que cada OR son grupos alcoxi que pueden ser iguales o diferentes y R”” es un grupo alquilo o alquenilo), un fosfato (p. ej., P(O)43-), un tiol (p. ej., -SH), un sulfóxido (p. ej., -S(O)R), un ácido sulfínico (p. ej., -S(O)OH), un ácido sulfónico (p. ej., -S(O)2OH), un tial (p. ej., -C(S)H), un sulfato (p. ej., S(O)42-), un sulfonilo (p. ej., -S(O)2-), una amida (p. ej., -C(O)NR2 o -N(R)C(O)R), un azido (p. ej., -N3), un nitro (p. ej., -NO2), un ciano (p. ej., -CN), un isociano (p. ej., -NC), un aciloxi (p. ej., -Oc (O)R), un amino (p. ej., -NR2, -n R h o -NH2), un carbamoilo (p. ej., -OC(O)n R2, -OC(O)NRH o -OC(O)NH2), una sulfonamida (p. ej., -S(O)2NR2, -S(O)2NRH, -S(O)2NH2, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)S(O)2H o -N(H)S(O)2H), un grupo alquilo, un grupo alquenilo y un grupo ciclilo (p. ej., carbociclilo o heterociclilo). En cualquiera de los anteriores, R es un grupo alquilo o alquenilo, como se define en el presente documento. En algunas realizaciones, los grupos sustituyentes en sí mismos pueden sustituirse de manera adicional con, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituyentes como se define en el presente documento. En algunas realizaciones, un grupo alquilo C1-6 puede estar adicionalmente sustituido, adicionalmente, con uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituyentes tales como se describen en el presente documento.

Aproximadamente, De Manera Aproximada: Como se emplean en el presente documento, los términos “de manera aproximada” y “aproximadamente”, aplicados a uno o más valores de interés, hacen referencia a un valor similar a un valor de referencia indicado. En algunas realizaciones, los términos “de manera aproximada” o “aproximadamente” hacen referencia a un intervalo de valores dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia indicado, a menos que se indique de otro modo o resulte evidente de otro modo a partir del contexto (excepto cuando tal número supere 100% de un valor posible). En algunas realizaciones, cuando se utiliza en el contexto de una cantidad de un compuesto dado en un componente lipídico de una LNP, “aproximadamente” puede significar /- 10% del valor mencionado. Por ejemplo, una LNP que incluye un componente lipídico que tiene aproximadamente 40% de un compuesto dado puede incluir 30-50% del compuesto.

Como se emplea en el presente documento, se pretende que el término “compuesto” incluya todos los isómeros e isótopos de la estructura ilustrada. “Isótopos” hace referencia a los átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números de masa como resultado de un número diferente de neutrones en los núcleos. En algunas realizaciones, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio. Adicionalmente, se pueden preparar un compuesto, sal o complejo de la presente divulgación combinados con moléculas de agua o disolvente para formar solvatos e hidratos mediante métodos de rutina.

Como se emplea en el presente documento, el término “poner en contacto” significa establecer una conexión física entre dos o más entidades. En algunas realizaciones, poner en contacto una célula de mamífero con una LNP significa que se hace que la célula de mamífero y una nanopartícula compartan una conexión física. Los métodos para poner en contacto células con entidades externas tanto in vivo como ex vivo son bien conocidos en las técnicas biológicas. En algunas realizaciones, la puesta en contacto una LNP y una célula de mamífero dispuesta dentro de un mamífero puede realizarse mediante diversas vías de administración (p. ej., intravenosa, intramuscular, intradérmica y subcutánea) y puede implicar diversas cantidades de nanopartículas lipídicas. Por otra parte, se puede poner en contacto más de una célula de mamífero con una LNP.

Como se emplea en el presente documento, el término “método comparable” hace referencia a un método con parámetros o etapas comparables, con respecto al método que se está comparando (p. ej., la producción de la formulación de LNP de la presente divulgación). En algunas realizaciones, el “método comparable” es un método con una o más de las etapas i), ia), iaa), ib), ii), iia), iib), iic), iid) e iie) del método que se está comparando. En algunas realizaciones, el “método comparable” es un método sin una o más de las etapas i), ia), iaa), ib), ii), iia), iib), iic), iid) e iie) del método que se está comparando. En algunas realizaciones, el “método comparable” es un método sin una o más de las etapas ia) e ib) del método que se está comparando. En algunas realizaciones, el “método comparable” es un método que emplea una sal soluble en agua de un ácido nucleico. En algunas realizaciones, el “método comparable” es un método que emplea una solución orgánica que no comprende un ácido nucleico soluble en disolvente orgánico. En algunas realizaciones, el “método comparable” es un método que comprende procesar la nanopartícula lipídica antes de administrar la formulación de nanopartículas lipídicas.

Como se emplea en el presente documento, el término “suministrar” significa proporcionar una entidad a un destino. En algunas realizaciones, suministrar un agente terapéutico y/o profiláctico a un sujeto puede implicar administrar una LNP que incluya el agente terapéutico y/o profiláctico al sujeto (p. ej., mediante una vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea). La administración de una l Np a un mamífero o una célula de mamífero puede implicar poner en contacto una o más células con la nanopartícula lipídica.

Como se emplea en el presente documento, la expresión “suministro mejorado” significa el suministro de más (p. ej., al menos 1,5 veces más, al menos 2 veces más, al menos 3 veces más, al menos 4 veces más, al menos 5 veces más, al menos 6 veces más, al menos 7 veces más, al menos 8 veces más, al menos 9 veces más, al menos 10 veces más) de un agente terapéutico y/o profiláctico mediante una nanopartícula a un tejido diana de interés (p. ej., hígado de mamífero) en comparación con el nivel de suministro de un agente terapéutico y/o profiláctico mediante una nanopartícula de control a un tejido diana de interés (p. ej., MC3, KC2 o DLinDMA). El nivel de suministro de una nanopartícula a un tejido particular puede medirse mediante la comparación de la cantidad de proteína producida en un tejido con el peso de dicho tejido, la comparación de la cantidad de agente terapéutico y/o profiláctico en un tejido con el peso de dicho tejido, la comparación de la cantidad de la proteína producida en un tejido con la cantidad de la proteína total en dicho tejido o la comparación de la cantidad de agente terapéutico y/o profiláctico en un tejido con la cantidad del agente terapéutico y/o profiláctico total en dicho tejido. Se comprenderá que el suministro mejorado de una nanopartícula a un tejido diana no necesariamente se determina en un sujeto bajo tratamiento, sino que puede determinarse en un sustituto tal como un modelo animal (p. ej., un modelo de rata).

Como se emplean en el presente documento, los términos “suministro específico”, “suministrar específicamente” o “suministrando específicamente” significan el suministro de más (p. ej., al menos 1,5 veces más, al menos 2 veces más, al menos 3 veces más, al menos 4 veces más, al menos 5 veces más, al menos 6 veces más, al menos 7 veces más, al menos 8 veces más, al menos 9 veces más, al menos 10 veces más) de un agente terapéutico y/o profiláctico mediante una nanopartícula a un tejido diana de interés (p. ej., hígado de mamífero) en comparación con un tejido no diana (p. ej., bazo de mamífero). El nivel de suministro de una nanopartícula a un tejido particular puede medirse mediante la comparación de la cantidad de proteína producida en un tejido con el peso de dicho tejido, la comparación de la cantidad de agente terapéutico y/o profiláctico en un tejido con el peso de dicho tejido, la comparación de la cantidad de la proteína producida en un tejido con la cantidad de la proteína total en dicho tejido o la comparación de la cantidad de agente terapéutico y/o profiláctico en un tejido con la cantidad del agente terapéutico y/o profiláctico total en dicho tejido. En algunas realizaciones, para el direccionamiento renovascular, se proporciona un agente terapéutico y/o profiláctico específicamente a un riñón de mamífero en comparación con el hígado y bazo si se administrara 1,5, 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, o 20 veces más de agente terapéutico y/o profiláctico por un gramo de tejido a un riñón en comparación con lo suministrado al hígado o bazo después de la administración sistémica del agente terapéutico y/o profiláctico. Se comprenderá que la capacidad de una nanopartícula para ser suministrada específicamente a un tejido diana no necesariamente se determinará en un sujeto bajo tratamiento, sino que puede determinarse en un sustituto tal como un modelo animal (p. ej., un modelo de rata).

Como se emplea en el presente documento, la “eficiencia de la encapsulación” hace referencia a la cantidad de un agente terapéutico y/o profiláctico que se vuelve parte de una LNP, con respecto a la cantidad total inicial de agente terapéutico y/o profiláctico utilizado en la preparación de una LNP. En algunas realizaciones, si se encapsulan 97 mg de agente terapéutico y/o profiláctico en una LNP de un total de 100 mg de agente terapéutico y/o profiláctico proporcionado inicialmente a la composición, la eficiencia de la encapsulación puede determinarse en 97%.

Como se emplean en el presente documento, “encapsulación”, “encapsulado”, “cargado” y “asociado” pueden hacer referencia a un cerramiento, confinamiento, entorno o envoltura completos, sustanciales o parciales. Como se emplean en el presente documento, “encapsulación” o “asociación” pueden hacer referencia al procedimiento de confinamiento de una molécula de ácido nucleico individual dentro de una nanopartícula y/o el establecimiento de una relación fisioquímica entre una molécula de ácido nucleico individual y una nanopartícula. Como se emplea en el presente documento, una “nanopartícula vacía” puede hacer referencia a una nanopartícula que está sustancialmente libre de un agente terapéutico o profiláctico. Como se emplea en el presente documento, una “nanopartícula vacía” puede hacer referencia a una nanopartícula que está sustancialmente libre de un ácido nucleico. Como se emplea en el presente documento, una “nanopartícula vacía” puede hacer referencia a una nanopartícula que consiste sustancialmente solo en componentes lipídicos.

Como se emplea en el presente documento, la “expresión” de una secuencia de ácido nucleico hace referencia a la traducción de un ARNm a un polipéptido o una proteína y/o la modificación post-traduccional de un polipéptido o una proteína.

Como se emplea en el presente documento, el término “in vitro” hace referencia a eventos que ocurren en un ambiente artificial, p. ej., en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en un cultivo celular, en una placa de Petri, etc. y no dentro de un organismo (p. ej., animal, planta o microbio).

Como se emplea en el presente documento, el término “in vivo” hace referencia a eventos que ocurren dentro de un organismo (p. ej., animal, planta o microbio, o una célula o un tejido de los mismos).

Como se emplea en el presente documento, el término “ex vivo” hace referencia a eventos que ocurren fuera de un organismo (p. ej., animal, planta o microbio, o una célula o un tejido de los mismos). Los eventos ex vivo pueden producirse en un entorno mínimamente alterado de un entorno natural (p. ej., in vivo).

Como se emplea en el presente documento, el término “isómero” significa cualquier isómero geométrico, tautómero, zwitterión, estereoisómero, enantiómero o diastereómero de un compuesto. Los compuestos pueden incluir uno o más centros quirales y/o enlaces dobles y, por lo tanto, pueden existir como estereoisómeros, tales como isómeros de enlace doble (es decir, isómeros E/Z geométricos) o diastereómeros (p. ej., enantiómeros (es decir, isómeros (+) o (-)) ocis/trans).La presente divulgación abarca todos y cada uno de los isómeros de los compuestos descritos en el presente documento, incluyendo formas estereoméricamente puras (p. ej., geométricamente puras, enantioméricamente puras o diastereoméricamente puras) y mezclas enantioméricas y estereoisoméricas, p. ej., racematos. Las mezclas enantioméricas y estereoméricas de compuestos y medios para su resolución en sus enantiómeros o estereoisómeros componentes son muy conocidas.

Como se emplea en el presente documento, un “componente lipídico” es el componente de una nanopartícula lipídica que incluye uno o más lípidos. En algunas realizaciones, el componente lipídico puede incluir uno o más lípidos catiónicos/ionizables, PEGilados, estructurales u otros lípidos, tales como fosfolípidos.

Como se emplea en el presente documento, un “conector” es un radical que conecta dos radicales, por ejemplo, la conexión entre dos nucleósidos de una especie de caperuza. Un conector puede incluir uno o más grupos que incluyen, pero sin limitarse a, grupos fosfato (p. ej., fosfatos, boranofosfatos, tiofosfatos, selenofosfatos, y fosfonatos), grupos alquilo, amidatos, o gliceroles. En algunas realizaciones, dos nucleósidos de un análogo de caperuza pueden estar conectados en sus posiciones 5' mediante un grupo trifosfato o mediante una cadena que incluye dos radicales fosfato y un radical boranofosfato.

Como se emplea en el presente documento, “métodos de administración” puede incluir los métodos intravenoso, intramuscular, intradérmico, subcutáneo o de otro tipo para el suministro de una composición a un sujeto. Un método de administración se puede seleccionar para dirigir el suministro (p. ej., para suministrar específicamente) a una región o un sistema específicos de un organismo.

Como se emplea en el presente documento, “modificado” significa no natural. En algunas realizaciones, un ARN puede ser un ARN modificado. Es decir, un ARN puede incluir una o más nucleobases, nucleósidos, nucleótidos o conectores de origen no natural. También se puede hacer referencia en el presente documento a una especie “modificada” como una especie “alterada”. Las especies se pueden modificar o alterar de manera química, estructural o funcional. En algunas realizaciones, una especie de nucleobase modificada puede incluir una o más sustituciones de origen no natural.

Como se emplea en el presente documento, la “razón N:P” es la razón molar de átomos de nitrógeno ionizables (en el intervalo de pH fisiológico) en un lípido con respecto a grupos fosfato en un ARN, p. ej., en una LNP que incluye un componente lipídico y un ARN.

Como se emplea en el presente documento, una “nanopartícula lipídica” es una composición que comprende uno o más lípidos. Las nanopartículas lipídicas tienen típicamente un tamaño en el orden de los micrómetros o menor y pueden incluir una bicapa lipídica. Las nanopartículas lipídicas, como se emplean en el presente documento, a menos que se especifique de otro modo, abarcan nanopartículas lipídicas (LNP), liposomas (p. ej., vesículas lipídicas) y lipoplejos. En algunas realizaciones, una LNP puede ser un liposoma que tiene una bicapa lipídica con un diámetro de 500 nm o menos.

Como se emplea en el presente documento, “de origen natural” significa que existe en la naturaliza sin ayuda artificial.

Como se emplea en el presente documento, “paciente” hace referencia a un sujeto que puede buscar o necesitar tratamiento, requiere tratamiento, recibe tratamiento, recibirá tratamiento, o un sujeto bajo el cuidado de un profesional calificado para una enfermedad o afección particulares.

Como se emplean en el presente documento, “lípido PEG” o “ lípido PEGilado” hacen referencia a un lípido que comprende un componente polietilenglicol.

La expresión “farmacéuticamente aceptable” se utiliza en el presente documento para hacer referencia a los compuestos, los materiales, la composición y/o las formas de dosificación que son adecuados, dentro del alcance del buen criterio médico, para ser utilizados en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin causar una toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones excesivos, de acuerdo con una razón beneficio/riesgo aceptable.

La expresión “excipiente farmacéuticamente aceptable”, como se emplea en el presente documento hace referencia a cualquier ingrediente diferente con respecto a los compuestos descritos en el presente documento (p. ej., un vehículo capaz de suspender, formar complejos con, o disolver el compuesto activo) y que tiene las propiedades de ser sustancialmente no tóxico y no inflamatorio en un paciente. Los excipientes pueden incluir, por ejemplo: antiadherentes, antioxidantes, aglutinantes, recubrimientos, coadyuvantes de compresión, disgregantes, tintes (colores), emolientes, emulsionantes, cargas (diluyentes), formadores de película o recubrimientos, sabores, fragancias, deslizantes (potenciadores de flujo), lubricantes, conservantes, tintas de impresión, sorbentes, agentes de suspensión o dispersión, edulcorantes y aguas de hidratación. Los excipientes ilustrativos incluyen, pero sin limitarse a: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de calcio, fosfato de calcio (dibásico), estearato de calcio, croscarmelosa, polivinilpirrolidona entrecruzada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, metilparabeno, celulosa microcristalina, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, propilparabeno, palmitato de retinilo, goma laca, dióxido de silicio, carboximetilcelulosa de sodio, citrato de sodio, glicolato de almidón sódico, sorbitol, almidón (maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, (alfatocoferol), vitamina C, xilitol y otras especies divulgadas en el presente documento.

Las composiciones también pueden incluir sales de uno o más compuestos. Las sales pueden ser sales farmacéuticamente aceptables. Como se emplea en el presente documento, “sales farmacéuticamente aceptables” hace referencia a derivados de los compuestos divulgados, en donde el compuesto parental se altera mediante la conversión de un radical de ácido o base existente en su forma salina (p. ej., haciendo reaccionar un grupo de base libre con un ácido orgánico adecuado). Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitarse a, sales de ácidos minerales u orgánicos de restos alcalinos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de restos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Las sales de adición de ácido representativas incluyen sales acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptonato, hexanoato, hidroxibromuro, hidroxicloruro, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato, valerato, y similares. Las sales representativas de metales alcalinos o alcalinotérreos incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como cationes de amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos, incluyendo, pero sin limitarse a, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina, y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente divulgación incluyen las sales no tóxicas convencionales del compuesto parental formadas, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente divulgación se pueden sintetizar a partir del compuesto parental que contiene un radical ácido o alcalino mediante métodos químicos convencionales. Por lo general, tales sales se pueden preparar haciendo reaccionar las formas alcalinas o ácidas libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica del ácido o la base adecuados en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de ambos; por lo general, se prefieren los medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Las listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, pág. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl y C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, y Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977).

Como se emplea en el presente documento, un “fosfolípido” es un lípido que incluye un radical fosfato y una o más cadenas de carbono, tales como cadenas de ácidos grasos insaturados. Un fosfolípido puede incluir uno o más enlaces múltiples (p. ej., dobles o triples) (p. ej., una o más insaturaciones). Un fosfolípido o un análogo o derivado del mismo puede incluir colina. Un fosfolípido o un análogo o derivado del mismo puede no incluir colina. Los fosfolípidos particulares pueden facilitar la fusión a una membrana. En algunas realizaciones, un fosfolípido catiónico puede interactuar con uno o más fosfolípidos de carga negativa de una membrana (p. ej., una membrana celular o intracelular). La fusión de un fosfolípido a una membrana puede permitir que uno o más elementos de una composición que contiene lípidos pasen a través de la membrana, lo cual permite, p. ej., el suministro de los uno o más elementos a una célula.

Como se emplea en el presente documento, el “índice de polidispersidad” es una razón que describe la homogeneidad de la distribución del tamaño de partícula de un sistema. Un valor pequeño, p. ej., menor de 0,3, indica una distribución estrecha del tamaño de partícula.

Como se emplea en el presente documento, un “polímero” anfífilo es un compuesto anfífilo que comprende un oligómero o un polímero. En algunas realizaciones, un polímero anfífilo puede comprender un fragmento de oligómero, tal como dos o más unidades monoméricas de PEG. En algunas realizaciones, un polímero anfífilo que se describe en el presente documento puede ser PS 20.

Como se emplean en el presente documento, los términos “polipéptido” o “polipéptido de interés” hacen referencia a un polímero de restos de aminoácidos unidos típicamente mediante enlaces peptídicos que se pueden producir naturalmente (p. ej., aislar o purificar) o sintéticamente.

Como se emplea en el presente documento, un “ARN” hace referencia a un ácido ribonucleico que puede ser de origen natural o no natural. En algunas realizaciones, un ARN puede incluir componentes modificados y/o de origen no natural tales como una o más nucleobases, nucleósidos, nucleótidos o conectores. Un ARN puede incluir una estructura de caperuza, un nucleósido de terminación de cadena, un tallo-bucle, una secuencia de poliA y/o una señal de poliadenilación. Un ARN puede tener una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido de interés. En algunas realizaciones, un ARN puede ser un ARN mensajero (ARNm). La traducción de un ARNm que codifica un polipéptido particular, por ejemplo, la traducción in vivo de un ARNm dentro de una célula de mamífero, puede producir el polipéptido codificado. Los ARN se pueden seleccionar del grupo no limitante que consiste en ARN interferente pequeño (ARNip), ARN interferente asimétrico (ARNia), microARN (miARN), ARN de sustrato Dicer (ARNsd), ARN en horquilla pequeño (ARNhp), ARNm, a R n largo no codificante (ARNlnc), y mezclas de los mismos.

Como se emplea en el presente documento, una “dosis unitaria única” es una dosis de cualquier agente terapéutico que se administra en una dosis/en un momento/por una vía única/por un único punto de contacto, es decir, un evento de administración único.

Como se emplea en el presente documento, una “dosis dividida” es la división de una dosis unitaria única o de una dosis diaria total en dos o más dosis.

Como se emplea en el presente documento, una “dosis diaria total” es una cantidad proporcionada o prescrita en un período de 24 horas. Se puede administrar como una dosis unitaria única.

Como se emplea en el presente documento, el término “sujeto” hace referencia a cualquier organismo al que se pueda administrar una composición o formulación de acuerdo con la divulgación, p. ej., con fines experimentales, de diagnóstico, profilácticos y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen animales (p. ej., mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y seres humanos) y/o plantas.

Como se emplea en el presente documento, “Tx” hace referencia a la cantidad de tiempo que tardó la integridad del ácido nucleico (p. ej., la integridad del ARNm) de una LNP, una solución de LNP, una composición de LNP liofilizada o una formulación de LNP en degradarse a aproximadamente X de la integridad inicial del ácido nucleico (p. ej., ARNm) utilizado para la preparación de la LNP, solución de LNP, composición de LNP liofilizada o formulación de LNP. Por ejemplo, “T80%” hace referencia a la cantidad de tiempo que tardó la integridad del ácido nucleico (p. ej., la integridad del ARNm) de una LNP, una solución de l Np , una composición de LNP liofilizada o una formulación de LNP en degradarse a aproximadamente 80% de la integridad inicial del ácido nucleico (p. ej., ARNm) utilizado para la preparación de la LNP, solución de LNP, composición de LNP liofilizada o formulación de LNP. Para poner otro ejemplo, “T1/2” hace referencia a la cantidad de tiempo que tardó la integridad del ácido nucleico (p. ej., la integridad del ARNm) de una LNP, una solución de LNP, una composición de LNP liofilizada o una formulación de LNP en degradarse a aproximadamente 1/2 de la integridad inicial del ácido nucleico (p. ej., ARNm) utilizado para la preparación de la LNP, solución de LNP, composición de LNP liofilizada o formulación de LNP.

Como se emplea en el presente documento, “células diana” hace referencia a una o más células de interés cualesquiera. Las células pueden encontrarse in vitro, in vivo, in situ o en el tejido u órgano de un organismo. El organismo puede ser un animal, p. ej., un mamífero, p. ej., un ser humano, p. ej., un paciente.

Como se emplea en el presente documento, “tejido diana” hace referencia a uno o más tipos de tejido de interés cualesquiera en los que el suministro de un agente terapéutico y/o profiláctico produciría un efecto biológico y/o farmacológico deseado. Los ejemplos de tejidos diana de interés incluyen tejidos, órganos y sistemas específicos, o grupos de los mismos. En aplicaciones particulares, un tejido diana puede ser un riñón, un pulmón, un bazo, el endotelio vascular en los vasos sanguíneos (p. ej., a nivel intracoronario o intrafemoral) o tejido tumoral (p. ej., mediante inyección intratumoral). Un “tejido no diana” hace referencia a uno o más tipos de tejido cualesquiera en los que la expresión de la proteína codificada no produce un efecto biológico y/o farmacológico deseado. En aplicaciones particulares, los tejidos no diana pueden incluir el hígado y el bazo.

Los términos “agente terapéutico” o “agente profiláctico” hacen referencia a cualquier agente que, al administrarse a un sujeto, tiene un efecto terapéutico, de diagnóstico y/o profiláctico, y/o provoca un efecto farmacológico y/o biológico deseado. También se hace referencia a los agentes terapéuticos como “principios activos” o “agentes activos”. Tales agentes incluyen, pero sin limitarse a, citotoxinas, iones radiactivos, agentes quimioterapéuticos, fármacos de molécula pequeña, proteínas, y ácidos nucleicos.

Como se emplea en el presente documento, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” significa una cantidad de un agente que se va a suministrar (p. ej., ácido nucleico, fármaco, composición, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente profiláctico, etc.) que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retrasar el comienzo de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.

Como se emplea en el presente documento, “transfección” hace referencia a la introducción de una especie (p. ej., un ARN) en una célula. La transfección se puede producir, por ejemplo, in vitro, ex vivo o in vivo.

Como se emplea en el presente documento, el término “tratar” hace referencia a aliviar, mejorar, paliar, mitigar, retrasar el inicio, inhibir la evolución, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia, parcial o totalmente, de uno o más síntomas o rasgos de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particulares. En algunas realizaciones, “tratar” el cáncer puede hacer referencia a inhibir la supervivencia, el crecimiento y/o la expansión de un tumor. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que no presenta signos de una enfermedad, trastorno y/o afección y/o a un sujeto que presenta solamente signos iniciales de una enfermedad, trastorno y/o afección a los efectos de disminuir el riesgo de desarrollar una patología asociada a la enfermedad, trastorno y/o afección.

Como se emplea en el presente documento, el “potencial zeta” es el potencial electrocinético de un lípido, p. ej., en una composición de partículas.

Lípidos ionizables

La presente divulgación proporciona lípidos ionizables, p. ej., lípidos ionizables que incluyen un radical amina central y al menos un grupo biodegradable. Los lípidos descritos en el presente documento se pueden utilizar de manera ventajosa en nanopartículas lipídicas y formulaciones de nanopartículas lipídicas para el suministro de agentes terapéuticos y/o profilácticos, tales como un ácido nucleico, a células u órganos de mamíferos.

En algunos aspectos, los lípidos ionizables de la presente divulgación pueden ser uno o más de los compuestos de Fórmula (IL-1):

o sus N-óxidos, o sales o isómeros de los mismos, en donde:

R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-C30, alquenilo C5-C20, -R*YR”, -YR” y -R”M'R';

R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C14, alquenilo C2-C14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están anclados, forman un heterociclo o carbociclo; R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un carbociclo C3-C6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-C6 no sustituido, donde Q se selecciona entre un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8, -N(R)S(O)2R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR y -C(R)N(R)2C(O)OR, cada o se selecciona independientemente entre 1, 2, 3 y 4, y cada n se selecciona independientemente entre 1, 2, 3, 4 y 5;

cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3 y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3 y H; M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, - C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-,

-C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo, en los que M” es un enlace, alquilo C1-C13 o alquenilo C2-C13;

R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3 y H;

R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo C3-C6 y heterociclo;

R9 se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-C6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-C6, carbociclo C3-C6 y heterociclo;

R10 se selecciona del grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C3 y alquenilo C2-C3;

cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3, (CH2)qOR* y H,

y cada q se selecciona independientemente entre 1, 2 y 3;

cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C18, alquenilo C2-C18, -R*YR”, -YR” y H;

cada R” se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-C15 y alquenilo C3-C15; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C12 y alquenilo C2-C12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-C6;

cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y

m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13; y en donde, cuando R4 es -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR o -CQ(R)2, (i) Q no es -N(R)2 cuando n es 1, 2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es heterocicloalquilo de 5, 6 o 7 miembros cuando n es 1 o 2.

En algunos aspectos, los lípidos ionizables de la presente divulgación pueden ser uno o más de los compuestos de Fórmula (L-X):

o una sal o isómero de los mismos, en donde

R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C14, alquenilo C2-C14, -R*YR”, -YR” y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están anclados, forman un heterociclo o carbociclo; R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un carbociclo C3-C6, (CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ, -CHQR, -CQ(R)2 y alquilo C1-C6 no sustituido, donde Q se selecciona entre un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R,

-N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8, -N(R)S(O)2R8, O(CH2)nOR, N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, - OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR y

-C(R)N(R)2C(O)OR, cada o se selecciona independientemente entre 1, 2, 3 y 4, y cada n se selecciona independientemente entre 1, 2, 3, 4 y 5;

Rx se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, -(CH2)vOH y -(CH2)vN(R)2, en donde v se selecciona entre 1, 2, 3, 4, 5 y 6;

cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3 y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3 y H; M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, - C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo, en los que M” es un enlace, alquilo C1-C13 o alquenilo C2-C13;

R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3 y H;

R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo C3-C6 y heterociclo;

y cada q se selecciona independientemente entre 1, 2 y 3;

cada R” se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C3-C15 y alquenilo C3-C15;

cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C12 y alquenilo C2-C12;

cada Y es independientemente un carbociclo C3-C6;

m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13.

En algunas realizaciones, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-I) incluye aquellos de Fórmula (IL IA):

o su N-óxido, o una sal o isómero de los mismos, en donde l se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5; m se selecciona entre 5, 6, 7, 8 y 9; M1 es un enlace o M'; R4 es hidrógeno, alquilo C1-C3 no sustituido, -(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ o -(CH2)nQ, en los que Q es OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo; M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C14 y alquenilo C2-C14. Por ejemplo, m es 5, 7 o 9. Por ejemplo, Q es OH, -NHC(S)N(R)2 o -NHC(O)N(R)2. Por ejemplo, Q es N(R)C(O)R o N(R)S(O)2R.

En algunas realizaciones, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos de Fórmula (IL-IB):

o su N-óxido, o una sal o un isómero de los mismos, en los que todas las variables se definen como en el presente documento. En algunas realizaciones, m se selecciona entre 5, 6, 7, 8 y 9; R4 es hidrógeno, alquilo C1-C3 no sustituido o -(CH2)nQ, en el que Q es OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo; M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -O<c>(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C14 y alquenilo C2-C14. En algunas realizaciones, m es 5, 7 o 9. En algunas realizaciones, Q es OH, -NHC(S)N(R)2 o -NHC(O)N(R)2. En algunas realizaciones, Q es -N(R)C(O)R o -N(R)S(O)2R.

En algunas realizaciones, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-I) incluye aquellos de Fórmula (IL-II):

o su N-óxido, o una sal o isómero de los mismos, en donde l se selecciona entre 1,2, 3, 4 y 5; M1 es un enlace o M'; R4 es hidrógeno, alquilo C1-C3 no sustituido, o -(CH2)nQ, en los que n es 2, 3 o 4, y Q es -OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo; M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -O<c>(<o>)-, -OC(O)-M”- C(O)O-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C14, y alquenilo C2-C14. En algunos aspectos, los lípidos ionizables de la presente divulgación pueden ser uno o más de los compuestos de Fórmula ( iL-VI):

R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C14, alquenilo C2-C14, -R*YR”, -YR” y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están anclados, forman un heterociclo o carbociclo; cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3 y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en OH, alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3 y H; M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, - C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo, en los que M” es un enlace, alquilo C1-C13 o alquenilo C2-C13;

R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C3, alquenilo C2-C3 y H;

cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C3 y alquenilo C2-C3; RN es H o alquilo C1-C3;

cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I;

Xa y Xb son cada uno independientemente O o S;

R10 se selecciona del grupo que consiste en H, halo, -OH, R, -N(R)2, -CN, -N3, -C(O)OH, -C(O)OR, -OC(O)R, -OR, -SR, -S(O)R, -S(O)OR, -S(O)2OR, -NO2, -S(O)2N(R)2, -N(R)S(O)2R, -NH(CH2)t1N(R)2, NH(CH2)piO(CH2)qiN(R)2, -NH(CH2)siOR, -N((CH2)s iOR)2, un carbociclo, un heterociclo, arilo y heteroarilo; m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,

n se selecciona entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10;

r es 0 o 1;

t1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5;

p1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5;

q1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5; y

s1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5.

En algunas realizaciones, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-VI) incluye aquellos de Fórmula (IL-VI-a):

R1a y R1b se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C14 y alquenilo C2-C14; y R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C14, alquenilo C2-C14, -R*YR”, -YR” y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están anclados, forman un heterociclo o carbociclo; En otra realización, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-VI) incluye aquellos de Fórmula (IL-VII):

l se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5;

M1 es un enlace o M'; y

R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C14 y alquenilo C2-C14. En otra realización, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-VI) incluye aquellos de Fórmula (IL-VIII):

o su N-óxido, o una sal o isómero de los mismos, en donde

l se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5;

M<1>es un enlace o M'; y

Ra' y R b' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<14>y alquenilo C<2>-C<14>; y R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<14>y alquenilo C2-C14. Los compuestos de una cualquiera de las fórmulas (IL-I), (IL-IA), (IL-VI), (IL-VI-a), (IL-VII) o (IL-VIII) incluyen una o más de las siguientes características cuando corresponde.

En algunas realizaciones, M<1>es M'.

En algunas realizaciones, M y M' son independientemente -C(O)O- o -OC(O)-.

En algunas realizaciones, al menos uno de M y M' es -C(O)O- o -OC(O)-.

En ciertas realizaciones, al menos uno de M y M' es -OC(O)-.

En ciertas realizaciones, M es -OC(O)- y M' es -C(O)O-. En algunas realizaciones, M es -C(O)O- y M' es -OC(O)-. En ciertas realizaciones, M y M' son cada uno -OC(O)-. En algunas realizaciones, M y M' son cada uno -C(O)O-.

En ciertas realizaciones, al menos uno de M y M' es -OC(O)-M”-C(O)O-.

En algunas realizaciones, M y M' son independientemente -S-S-.

En algunas realizaciones, al menos uno de M y M' es -S-S-.

En algunas realizaciones, uno de M y M' es -C(O)O- o -OC(O)- y el otro es -S-S-. Por ejemplo, M es -C(O)O-o -OC(O)- y M' es -S-S- o M' es -C(O)O-, o -OC(O)- y M es -S-S-.

En algunas realizaciones, uno de M y M' es -OC(O)-M”-C(O)O-, en el que M” es un enlace, alquilo C<1>-C<13>o alquenilo C<2>-C<13>. En otras realizaciones, M” es alquilo C<1>-C<6>o alquenilo C<2>-C<6>. En ciertas realizaciones, M” es alquilo C<1>-C<4>o alquenilo C<2>-C<4>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, M” es alquilo C<1>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, M” es alquilo C<2>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, M” es alquilo C<3>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, M” es alquilo C<4>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, M” es alquenilo C<2>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, M” es alquenilo C<3>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, M” es alquenilo C4.

En algunas realizaciones, l es 1, 3 o 5.

En algunas realizaciones, R4 es hidrógeno.

En algunas realizaciones, R4 no es hidrógeno.

En algunas realizaciones, R4 es metilo no sustituido o -(CH<2>)nQ, en el que Q es OH, -NHC(S)N(R)<2>, -NHC(O)N(R)<2>, -N(R)C(O)R o -N(R)S(O)<2>R.

En algunas realizaciones, Q es OH.

En algunas realizaciones, Q es -NHC(S)N(R)<2>.

En algunas realizaciones, Q es -NHC(O)N(R)<2>.

En algunas realizaciones, Q es -N(R)C(O)R.

En algunas realizaciones, Q es -N(R)S(O)<2>R.

En algunas realizaciones, Q es -O(CH<2>)nN(R)<2>.

En algunas realizaciones, Q es -O(CH<2>)nOR.

En algunas realizaciones, Q es -N(R)R8.

En algunas realizaciones, Q es -NHC(=NR9)N(R)<2>.

En algunas realizaciones, Q es -NHC(=CHR9)N(R)<2>.

En algunas realizaciones, Q es -OC(O)N(R)<2>.

En algunas realizaciones, Q es -N(R)C(O)R.

En algunas realizaciones, n es 2.

En algunas realizaciones, n es 3.

En algunas realizaciones, n es 4.

En algunas realizaciones, M<1>está ausente.

En algunas realizaciones, al menos un R5 es hidroxilo. Por ejemplo, un R5 es hidroxilo.

En algunas realizaciones, al menos un R6 es hidroxilo. Por ejemplo, un R6 es hidroxilo.

En algunas realizaciones, uno de R5 y R6 es hidroxilo. Por ejemplo, un R5 es hidroxilo y cada R6 es hidrógeno.

Por ejemplo, un R6 es hidroxilo y cada R5 es hidrógeno.

En algunas realizaciones, Rx es alquilo C<1>-C<6>. En algunas realizaciones, Rx es alquilo C<1>-C<3>. Por ejemplo, Rx

es metilo. Por ejemplo, Rx es etilo. Por ejemplo, Rx es propilo.

En algunas realizaciones, Rx es -(CH<2>)vOH y v es 1, 2 o 3. Por ejemplo, Rx es metanoilo. Por ejemplo, Rx es

etanoilo. Por ejemplo, Rx es propanoilo.

En algunas realizaciones, Rx es -(CH<2>)vN(R)<2>, v es 1, 2 o 3 y cada R es H o metilo. Por ejemplo, Rx es metanamino, metilmetanamino o dimetilmetanamino. Por ejemplo, Rx es aminometanilo, metilaminometanilo o dimetilaminometanilo. Por ejemplo, Rx es aminoetanilo, metilaminoetanilo o dimetilaminoetanilo. Por ejemplo,

Rx es aminopropanilo, metilaminopropanilo o dimetilaminopropanilo.

En algunas realizaciones, R' es alquilo C<1>-C<18>, alquenilo C<2>-C<18>, -R*YR” o -YR”.

En algunas realizaciones, R2 y R3 son independientemente alquilo C<3>-C<14>o alquenilo C<3>-C<14>.

En algunas realizaciones, R 1b es alquilo C<1>-C<14>. En algunas realizaciones, R 1b es alquilo C<2>-C<14>. En algunas realizaciones, R 1b es alquilo C<3>-C<14>. En algunas realizaciones, R 1b es alquilo C<1>-C<8>. En algunas realizaciones,

R 1b es alquilo C<1>-C<5>. En algunas realizaciones, R 1b es alquilo C<1>-C<3>. En algunas realizaciones, R 1b se selecciona

entre alquilo C<1>, alquilo C<2>, alquilo C<3>, alquilo C<4>y alquilo C<5>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R 1b es

alquilo C<1>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R 1b es alquilo C<2>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R 1b

es alquilo C<3>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R 1b es alquilo C<4>. Por ejemplo, en algunas realizaciones,

R 1b es alquilo C<5>.

En algunas realizaciones, R 1 es diferente de -(CHR5R6)m-M-CR2R3R7.

En algunas realizaciones, -CH R1aR 1b- es diferente de -(CHR5R6)m-M-CR2R3R7.

En algunas realizaciones, R7 es H. En algunas realizaciones, R7 se selecciona entre alquilo C<1>-C<3>. Por ejemplo,

en algunas realizaciones, R7 es alquilo C<1>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R7 es alquilo C<2>. Por ejemplo,

en algunas realizaciones, R7 es alquilo C3. En algunas realizaciones, R7 se selecciona entre alquilo C4,

alquenilo C4, alquilo C5, alquenilo C5, alquilo C6, alquenilo C6, alquilo C7, alquenilo C7, alquilo C9, alquilo C<11>, alquenilo C<11>, alquilo C17, alquenilo C17, alquilo C<18>y alquenilo C<18>.

En algunas realizaciones, Rb' es alquilo C1-C14. En algunas realizaciones, Rb' es alquilo C2-C14. En algunas realizaciones, Rb' es alquilo C<3>-C<14>. En algunas realizaciones, Rb' es alquilo Ci-Cs. En algunas realizaciones, R b' es alquilo C<1>-C<5>. En algunas realizaciones, Rb' es alquilo C<1>-C<3>. En algunas realizaciones, R b' se selecciona entre alquilo C<1>, alquilo C<2>, alquilo C<3>, alquilo C<4>y alquilo C<5>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, Rb' es alquilo C<1>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R b' es alquilo C<2>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R b' es alquilo C<3>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R b' es alquilo C<4>.

En algunas realizaciones, los compuestos de Fórmula (IL-I) son de Fórmula (IL-IIa):

(IL-lla),

o sus N-óxidos, o sales o isómeros de los mismos, en donde R<4>se describe como en el presente documento. En otra realización, los compuestos de Fórmula (IL-I) son de fórmula (IL-IIb):

o sus N-óxidos, o sales o isómeros de los mismos, en donde R<4>se describe como en el presente documento. En otra realización, los compuestos de Fórmula (IL-I) son de Fórmula (IL-IIc) o (IL-IIe):

o sus N-óxidos, o sales o isómeros de los mismos, en donde R<4>es tal como se divulga en el presente documento.

En otra realización, los compuestos de Fórmula (IL-I) son de Fórmula (IL-IIf):

o sus N-óxidos, o sales o isómeros de los mismos, en donde M es -C(O)O- o -OC(O)-, M” es alquilo C<1>-C<6>o alquenilo C<2>-C<6>, R<2>y R<3>se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C<5>-C<14>y alquenilo C<5>-C<14>, y n se selecciona entre 2, 3 y 4.

En una realización adicional, los compuestos de Fórmula (IL-I) son de Fórmula (IL-IId):

(IL-lld)

o sus N-óxidos, o sales o isómeros de los mismos, en donde n es 2, 3 o 4; y m, R', R ” y R<2>a R6 se describen como en el presente documento. En algunas realizaciones, cada uno de R<2>y R3 se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste en alquilo C<5>-C<14>y alquenilo C<5>-C<14>.

En una realización adicional, los compuestos de Fórmula (IL-I) son de Fórmula (IL-IIg),

entre 5, 6, 7, 8 y 9; M<1>es un enlace o M'; M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y R<2>y R<3>se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<14>y alquenilo C<2>-C<14>. En algunas realizaciones, M'' es alquilo C<1>-C<6>(p. ej., alquilo C<1>-C<4>) o alquenilo C<2>-C<6>(p. ej., alquenilo C<2>-C<4>). En algunas realizaciones, R<2>y R<3>se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C<5>-C<14>y alquenilo C<5>-C<14>.

En otra realización, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-VI) incluye aquellos de Fórmula (IL-VIIa):

-óxido, o una sal o isómero de los mismos.

En otra realización, un subconjunto de compuestos de Fórmula (VI) incluye aquellos de Fórmula (IL-VIIIa):

En otra realización, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-VI) incluye aquellos de Fórmula (IL-VIIIb):

En otra realización, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-VI) incluye aquellos de Fórmula (IL-VIIb-1):

En otra realización, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-VI) incluye aquellos de Fórmula (IL-VIIb-2):

En otra realización, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-VI) incluye aquellos de Fórmula (IL-VIIb-3):

En otra realización, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-VI) incluye aquellos de Fórmula (IL-VIIc):

En otra realización, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-VI) incluye aquellos de Fórmula (IL-VIIIc):

En otra realización, un subconjunto de compuestos de Fórmula (IL-VI) incluye aquellos de Fórmula (IL-VIIId):

Los compuestos de una cualquiera de las fórmulas (IL-I), (IL-IA), (IL-IB), (IL-II), (IL-IIa), (IL-IIb), (IL-IIc), (IL-IId), (IL-IIe), (IL-IIf), (IL-IIg), (IL-III), (IL-VI), (IL-VI-a), (IL-VII), (IL-VIII), (IL-VIIa), (IL-VIIIa), (IL-VIIIb), (IL-VIIb-1), (IL-VIIb-2), (IL-VIIb-3), (IL-VIIc), (IL-VIId), (IL-VIIIc) o (IL-VIIId) incluyen una o más de las siguientes características cuando corresponde.

En algunas realizaciones, los lípidos ionizables son uno o más de los compuestos que se describen en las Solicitudes de Estados Unidos Núm. 62/220.091, 62/252.316, 62/253.433, 62/266.460, 62/333.557, 62/382.740, 62/393.940, 62/471.937, 62/471.949, 62/475.140, y 62/475.166, y la solicitud PCT Núm. PCT/US2016/052352.

En algunas realizaciones, los lípidos ionizables se seleccionan entre los Compuestos 1-280 que se describen en la Solicitud de Estados Unidos Núm. 62/475.166.

En algunas realizaciones, el lípido ionizable es

o una sal del mismo.

En algunas realizaciones, el lípido ionizable es

o una sal del mismo.

En algunas realizaciones, el lípido ionizable es

, o una sal del mismo.

En algunas realizaciones, el lípido ionizable es

o sales o isómeros de los mismos, en donde

Ai y A<2>se seleccionan cada uno independientemente entre CH o N;

Z es CH<2>o está ausente en donde, cuando Z es CH<2>, cada una de las líneas discontinuas (1) y (2) representan un enlace sencillo; y, cuando Z está ausente, las líneas discontinuas (1) y (2) están ambas ausentes;

Ri, R<2>, R<3>, R<4>y R<5>se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C<5>-C<20>, alquenilo C<5>-C<20>, -R ”MR', -R*YR”, -YR” y -R*OR”;

R<x1>y R<x2>son cada uno independientemente H o alquilo C<1>-C<3>;

cada M se selecciona independientemente del grupo que consiste en -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)<2>-, -C(O)S-, -SC(O)-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;

M* es alquilo C<1>-C<6>,

W 1 y W 2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -O- y -N(R6)-;

cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y alquilo C<1>-C<5>;

X 1, X 2 y X 3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un enlace, -CH<2>-, -(CH<2>)<2>-, -CHR-, -CHY-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -(CH2)n-C(O)-, -C(O)-(CH2)n-, -(CH2)n- C(O)O-, -OC(O)-(CH2)n-, -(CH2)n-OC(O)-, -C(O)O-(CH<2>)n-, -CH(OH)-, -C(S)- y - CH(SH)-;

cada Y es independientemente un carbociclo C<3>-C<6>;

cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<12>y alquenilo C<2>-C<12>; cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<3>y un carbociclo C<3>-C<6>; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<12>, alquenilo C<2>-C<12>y H; cada R ” se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<3>-C<12>, alquenilo C<3>-C<12>y -R*MR'; y

n es un número entero de 1-6;

en donde cuando el anillo

i) al menos uno de X 1, X 2 y X3 no es -CH<2>-; y/o

ii) al menos uno de R<1>, R<2>, R<3>, R<4>y R<5>es -R”MR'.

En algunas realizaciones, el compuesto tiene cualquiera de las fórmulas (IL-MIa1)-(IL-i!ia8):

En algunas realizaciones, los lípidos ionizables son uno o más de los compuestos descritos en las Solicitudes de Estados Unidos Núm. 62/271,146, 62/338,474, 62/413,345 y 62/519,826, Solicitud PCT Núm. PCT/US2019/052009 y la Solicitudes Internacionales Núm. WO 2017/112865, WO 2017/049245 y WO 2018/170306.

En algunas realizaciones, los lípidos ionizables se seleccionan entre los Compuestos 1-156 que se describen en la Solicitud de Estados Unidos Núm. 62/519,826.

En algunas realizaciones, los lípidos ionizables se seleccionan entre los Compuestos 1-16, 42-66, 68-76 y 78 156 que se describen en la Solicitud de Estados Unidos Núm. 62/519.826.

En algunas realizaciones, el lípido ionizable es

una sal del mismo.

El radical amina central de un lípido de acuerdo con la Fórmula (IL-1), (IL-IA), (IL-IB), (IL-II), (IL-IIa), (IL-IIb), (IL-IIc), (IL-IId), (IL-IIe), (IL-IIf), (IL-IIg), (IL-III), (IL-IIIa1), (IL-IIIa2), (IL-IIIa3), (IL-IIIa4), (IL-IIIa5), (IL-IIIa6), (IL-IIIa7) o (IL-IIIa8) puede protonarse a un pH fisiológico. Por lo tanto, un lípido puede tener una carga positiva o positiva parcial a un pH fisiológico. Se puede hacer referencia a tales lípidos como (amino)lípidos catiónicos o ionizables. Los lípidos también pueden ser zwitteriónicos, es decir, moléculas neutras con carga positiva y negativa.

En algunas realizaciones, el lípido ionizable se selecciona del grupo que consiste en 3-(didodecilamino)-N1,N1,4-tridodecil-1-piperazintanamina (KL10), N1-[2-(didodecilamino)etil]-N1,N4,N4-tridodecil-1,4-piperazindietanamina (KL22), 14,25-ditridecil-15,18,21,24-tetraaza-octatriacontano (KL25), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), 4-(dimetilamino)butanoato heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (DLin-MC3-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA), 2-({8[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA), (2R)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2R)), y (2S)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]propan-1 -amina (Octil-CLinDMA (2S)).

Lípidos con polietilenglicol (PEG)

Como se emplea en el presente documento, el término “lípido PEG ” hace referencia a lípidos modificados con polietilenglicol (PEG). Los ejemplos no limitantes de lípidos PEG incluyen fosfatidiletanolamina y ácido fosfatídico modificados con PEG, productos conjugados de PEG-ceramida (p. ej., PEG-CerC14 o PEG-CerC20), dialquilaminas modificadas con PEG y 1,2-diaciloxipropan-3-aminas modificadas con PEG. También se hace referencia a tales lípidos como lípidos PEGilados. En algunas realizaciones, un lípido PEG puede ser un lípido PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC o PEG-DSPE.

En algunas realizaciones, el lípido PEG incluye, pero sin limitarse a 1,2-dimiristoil-sn-glicerol metoxipolietilenglicol (PEG-DMG), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)] (PEG-DSPE), PEG-diestearil glicerol (PEG-DSG), PEG-dipalmitoleilo, PEG-dioleilo, PEG-diestearilo, PEG-diacilglicamida (PEG-DAG), PEG-dipalmitoil fosfatidiletanolamina (PEG-DPPE) o PEG-1,2-dimiristiloxipropil-3-amina (PEG-c-DMA).

En algunas realizaciones, el lípido PEG se selecciona del grupo que consiste en una fosfatidiletanolamina modificada con PEG, un ácido fosfatídico modificado con PEG, una ceramida modificada con PEG, una dialquilamina modificada con PEG, un diacilglicerol modificado con PEG, un dialquilglicerol modificado con PEG y mezclas de los mismos.

En algunas realizaciones, el radical lipídico de los lípidos PEG incluye los que tienen longitudes de aproximadamente C<14>a aproximadamente C<22>, preferentemente de aproximadamente C<14>a aproximadamente C<16>. En algunas realizaciones, un radical de PEG, por ejemplo, un mPEG-NH<2>, tiene un tamaño de aproximadamente 1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 15.000 o 20.000 daltons. En algunas realizaciones, el lípido PEG es PEG<2>k-DMG.

En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas descritas en el presente documento pueden comprender un lípido PEG que sea un PEG no difusible. Los ejemplos no limitantes de PEG no difusibles incluyen PEG-DSG y PEG-DSPE.

Se conocen lípidos PEG en la técnica, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Núm. 8158601 y la Publicación Internacional Núm. WO 2015/130584 A2.

En general, algunos de los otros componentes lipídicos (p. ej., lípidos PEG) de diversas fórmulas, que se describen en el presente documento pueden sintetizarse como se describe en la Solicitud de Patente Internacional Núm. PCT/US2016/000129, presentada el 10 de diciembre de 2016, titulada “Compositions and Methods for Delivery of Therapeutic Agents”.

El componente lipídico de una nanopartícula lipídica o formulación de nanopartículas lipídicas puede incluir una o más moléculas que comprendan polietilenglicol, tal como PEG o lípidos modificados con PEG. Se puede hacer referencia de manera alternativa a tales especies como lípidos PEGilados. Un lípido PEG es un lípido modificado con polietilenglicol. Un lípido PEG se puede seleccionar del grupo no limitante que incluye fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG, ácidos fosfatídicos modificados con PEG, ceramidas modificadas con PEG, dialquilaminas modificadas con PEG, diacilgliceroles modificados con PEG, dialquilgliceroles modificados con PEG y mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, un lípido PEG puede ser un lípido PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC o PEG-DSPE.

En algunas realizaciones, los lípidos modificados con PEG son una forma modificada de PEG-DMG. PEG-DMG tiene la siguiente estructura:

En algunas realizaciones, los lípidos PEG útiles en la presente invención pueden ser lípidos PEGilados descritos en la Publicación Internacional Núm. WO2012099755. Cualquiera de estos lípidos PEG ilustrativos descritos en el presente documento se puede modificar para que comprenda un grupo hidroxilo en la cadena de PEG. En algunas realizaciones, el lípido PEG es un lípido PEG-OH. Como se define en términos generales en el presente documento, un “lípido PEG-OH” (al que también se hace referencia en el presente documento como “lípido hidroxi-PEGilado”) es un lípido PEGilado que tiene uno o más grupos hidroxilo (-O H) en el lípido. En algunas realizaciones, el lípido PEG-OH incluye uno o más grupos hidroxilo en la cadena de PEG. En algunas realizaciones, un lípido PEG-OH o hidroxi-PEGilado comprende un grupo -O H en el extremo de la cadena de PEG. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

En algunas realizaciones, un lípido PEG útil en la presente invención es un compuesto con la Fórmula (PL-I). En el presente documento, se proporcionan compuestos de Fórmula (PL-I):

o sales de los mismos, en donde:

R3 es — ORO;

RO es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de oxígeno;

r es un número entero entre 1 y 100, inclusive;

L1 es alquileno C<1>-C<10>opcionalmente sustituido, en donde al menos un metileno del alquileno C<1>-C<10>opcionalmente sustituido se remplaza independientemente por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, O, N(RN), S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O, o NRnC(O)N(Rn);

D es un radical obtenido por química clic o un radical escindible en condiciones fisiológicas;

m es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;

A tiene la fórmula: o

cada caso de L2 es independientemente un enlace o alquileno C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, en donde una unidad de metileno del alquileno C<1>-C<6>opcionalmente sustituido se remplaza opcionalmente por O, N(RN), S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O o NRNC(O)N(RN);

cada caso de R2 es independientemente alquilo C<1>-C<30>opcionalmente sustituido, alquenilo C<1>-C<30>opcionalmente sustituido o alquinilo C<1>-C<30>opcionalmente sustituido; opcionalmente en donde una o más unidades de metileno de R2 se remplazan independientemente por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, N(RN), O, S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), NRNC(O)N(RN), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=N R n), C(=N R n)N(Rn), NRnC(=N R n), NRnC(=N R n)N(Rn), C(S), C(S)N (Rn), NR<n>C(S), NR<n>C(S)N (R<n>), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O)2, S(O)2O, OS(O)2O, N(R<n>)S(O), S(O)N(R<n>), N(RN)S(O)N(RN), OS(O)N(RN), N(RN)S(O)O, S(O)2, N(RN)S(O)2, S(O)2N(RN), N(RN)S(O)2N(RN), OS(O)2N(RN) o N(Rn)S(O)<2>O;

cada caso de RN es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno;

el Anillo B es carbociclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y

p es 1 o 2.

En algunas realizaciones, el compuesto con la Fórmula (PL-I) es un lípido PEG-OH (es decir, R3 es -O R O y RO es hidrógeno). En algunas realizaciones, el compuesto con la Fórmula (PL-I) tiene la Fórmula (PL-I-OH):

(PL-I-OH),

o una sal del mismo.

En algunas realizaciones, un lípido PEG útil en la presente invención es un ácido graso PEGilado. En algunas realizaciones, un lípido PEG útil en la presente invención es un compuesto con la Fórmula (PL-II). En la presente se proporcionan compuestos de Fórmula (PL-II):

(PL-II),

o una sal del mismo, en donde:

R3 es -ORO;

r es un número entero entre 1 y 100, inclusive;

R5 es alquilo C<10>-C<40>opcionalmente sustituido, alquenilo C<10>-C<40>opcionalmente sustituido o alquinilo C<10>-C<40>opcionalmente sustituido; y opcionalmente uno o más grupos metileno de R5 se remplazan por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, N(RN), O, S, C(O), -C(O)N(RN), NRNC(O), NRNC(O)N(RN), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRnC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=N Rn), C(=NRn)N(Rn), NRnC(=NRn), NRNC(=NRN)N(RN), C(S), C(S)N(RN), NRNC(S), NRNC(S)N(RN), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O)2, S(O)2O, OS(O)2O, N(RN)S(O), S(O)N(RN), N(RN)S(O)N(RN), OS(O)N(RN), N(RN)S(O)O, S(O)2, N(RN)S(O)2, S(O)<2>N(RN), N(RN)S(O)<2>N(RN), OS(O)<2>N(RN) o N(RN)S(O)<2>O; y cada caso de RN es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno.

En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (PL-II) tiene la Fórmula (PL-II-OH):

r es un número entero entre 1 y 100;

R5 es alquilo C<10>-C<40>opcionalmente sustituido, alquenilo C<10>-C<40>opcionalmente sustituido o alquinilo C<10>-C<40>opcionalmente sustituido; y opcionalmente uno o más grupos metileno de R5 se remplazan por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, N(RN), O, S, C(O), -C(O)N(RN), NRNC(O), NRnC(O)N(Rn), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), -NRNC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=NRN), C(=NRN)N(RN), NRNC(=NRN), NR<n>C(=N R<n>)N(Rn), C(S), C(S)N (Rn), NR<n>C(S), NR<n>C(S)N (Rn), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O)2, -S(O)2O, OS(O)2O, N(RN)S(O), S(O)N(RN), N(RN)S(O)N(RN), OS(O)N(RN), N(RN)S(O)O, S(O)2, N(RN)S(O)2, S(O)<2>N(RN), N(RN)S(O)<2>N(RN), OS(O)<2>N(RN) o N(RN)S(O)<2>O; y

cada caso de RN es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno.

En algunas realizaciones, r es un número entero entre 10 y 80, entre 20 y 70, entre 30 y 60 o entre 40 y 50. En algunas realizaciones, r es 45.

En algunas realizaciones, R5 es alquilo C<1 7>.

En otras realizaciones más, el compuesto de Fórmula (PL-II) es:

o una sal del mismo.

En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (PL-II) es

En algunos aspectos, la composición lipídica de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprende un lípido PEG.

En algunas realizaciones, los lípidos PEG pueden ser uno o más de los lípidos PEG descritos en la Solicitud de Estados Unidos Núm. 62/520.530.

En algunas realizaciones, el lípido PEG es un compuesto de Fórmula (PL-III):

o una sal o isómero del mismo, en donde s es un número entero entre 1 y 100.

En algunas realizaciones, el lípido PEG es un compuesto con la siguiente fórmula:

Lípidos estructurales

Como se emplea en el presente documento, el término “lípido estructural” hace referencia a esteroles y también a lípidos que contienen radicales de esterol.

La incorporación de lípidos estructurales a la nanopartícula lipídica puede ayudar a mitigar la agregación de otros lípidos en la partícula. Los lípidos estructurales se pueden seleccionar del grupo que incluye, pero sin limitarse a, colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol, tomatidina, tomatina, ácido ursólico, alfa-tocoferol, hopanoides, fitoesteroles, esteroides y mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el lípido estructural es una mezcla de dos o más componentes, cada uno seleccionado independientemente entre colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol, tomatidina, tomatina, ácido ursólico, alfa-tocoferol, hopanoides, fitoesteroles y esteroides. En algunas realizaciones, el lípido estructural es un esterol. En algunas realizaciones, el lípido estructural es una mezcla de dos o más esteroles. Como se definen en el presente documento, los “esteroles” son un subgrupo de esteroides que consisten en alcoholes esteroideos. En algunas realizaciones, el lípido estructural es un esteroide. En algunas realizaciones, el lípido estructural es colesterol. En algunas realizaciones, el lípido estructural es un análogo de colesterol. En algunas realizaciones, el lípido estructural es alfa-tocoferol.

En algunas realizaciones, los lípidos estructurales pueden ser uno o más lípidos estructurales descritos en la Solicitud de Estados Unidos Núm. 62/520.530.

Agente de encapsulación

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el agente de encapsulación es un compuesto de Fórmula (EA-I):

(EA-I),

o sales o isómeros del mismo, en donde

R<201>y R<202>se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<6>, alquenilo C<2>-C<6>y (C=NH)N(R<10 1>)<2>en donde cada R<101>se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<6>y alquenilo C<2>-C<6>;

R<203>se selecciona del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<20>y alquenilo C<2>-C<20>;

R<204>se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<20>, alquenilo C<2>-C<20>, C(O)(Oalquilo C<1>-C<20>), C(O)(Oalquenilo C<2>-C<20>), C(O)(NHalquilo C<1>-C<20>) y C(O)(NHalquenilo C<2>-C<20>);

n1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10;

En algunas realizaciones, R<201>y R<202>se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H y CH<3>.

En algunas realizaciones, R<201>y R<202>se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en (C=NH)NH<2>y (C=NH)N(CH<3>)<2>

En algunas realizaciones, R<203>se selecciona del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<20>, alquilo C<8>-C<18>y alquilo C<12>-C<16>.

En algunas realizaciones, R<204>se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<20>, alquenilo C<2>-C<20>, C(O)(Oalquilo C<1>-C<20>), C(O)(Oalquenilo C<2>-C<20>), C(O)(NHCalquilo C<1>-C<20>) y C(O)(NHalquenilo C<2>-C<20>); alquilo C<8>-C<18>, alquenilo C<8>-C<18>, C(O)(Oalquilo C<8>-C<18>), C(O)(Oalquenilo C<8>-C<18>), C(O)(NHalquilo C<8>-C<18>) y C(O)(NHalquenilo C<8>-C<18>); y alquilo C<12>-C<16>, alquenilo C<12>-C<16>, C(O)(Oalquilo C<12>-C<16>), C(O)(Oalquenilo C<12>-C<16>), C(O)(NHalquilo C<12>-C<16>) y C(O)(NHalquenilo C<12>-C<16>);

En algunas realizaciones, n1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10; n1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4, 5 y 6; n1 se selecciona entre 2, 3 y 4.

En algunas realizaciones, n1 es 3.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el agente de encapsulación es un compuesto de Fórmula (EA-II):

(EA-II),

o sales o isómeros del mismo, en donde

X<101>es un enlace, NH u O;

R<101>y R<102>se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<6>y alquenilo C<2>-C<6>.

R<103>y R<104>se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<20>y alquenilo C<2>-C<20>; y

n1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10;

En algunas realizaciones, X<101>es un enlace.

En algunas realizaciones, X<101>es NH.

En algunas realizaciones, X<101>es O.

En algunas realizaciones, R<101>y R<102>se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y CH<3>. En algunas realizaciones, R<103>se selecciona del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<20>, alquilo C<8>-C<18>y alquilo C<12>-C<16>.

En algunas realizaciones, R<104>se selecciona del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<20>, alquilo C<8>-C<18>y alquilo C<12>-C<16>.

En algunas realizaciones, n1 es 3.

Los agentes de encapsulación ilustrativos incluyen, pero sin limitarse a, etil lauroil arginato, etil miristoil arginato, etil palmitoil arginato, etil colesterol arginato, etil oleico arginato, etil cáprico arginato y etil caprílico arginato.

En ciertas realizaciones, el agente de encapsulación es etil lauroil arginato,

una sal o isómero del

mismo.

En ciertas realizaciones, el agente de encapsulación es al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

��

o sales e isómeros del mismo, tales como, por ejemplo, bases libres, sales de TFA y/o sales de HCl.

Fosfolípidos

Los fosfolípidos pueden ensamblarse en una o más bicapas lipídicas. En general, los fosfolípidos comprenden un radical fosfolipídico y uno o más radicales de ácidos grasos.

Un radical fosfolipídico se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo no limitante que consiste en fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil glicerol, fosfatidil serina, ácido fosfatídico, 2-lisofosfatidil colina y una esfingomielina.

Un radical de ácidos grasos se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo no limitante que consiste en ácido láurico, ácido mirístico, ácido miristoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolénico, ácido erúcico, ácido fitanoico, ácido araquídico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido behénico, ácido docosapentaenoico y ácido docosahexaenoico.

Los fosfolípidos particulares pueden facilitar la fusión con una membrana. En algunas realizaciones, un fosfolípido catiónico puede interactuar con uno o más fosfolípidos de carga negativa de una membrana (p. ej., una membrana celular o intracelular). La fusión de un fosfolípido con una membrana puede permitir que uno o más elementos (p. ej., un agente terapéutico) de una composición que contenga lípidos (p. ej., LNP) pasen a través de la membrana permitiendo, p. ej., el suministro de uno o más elementos a un tejido diana.

También se contemplan especies de fosfolípidos no naturales que incluyen especies naturales con modificaciones y sustituciones que incluyen ramificación, oxidación, ciclación y alquinos. En algunas realizaciones, un fosfolípido puede funcionalizarse o entrecruzarse con uno o más alquinos (p. ej., un grupo alquenilo en el que uno o más enlaces dobles se remplazan por un enlace triple). En condiciones de reacción adecuadas, un grupo alquino puede experimentar una cicloadición catalizada por cobre tras exponerse a una azida. Tales reacciones pueden ser útiles en la funcionalización de una bicapa lipídica de una composición de nanopartículas para facilitar la permeación de la membrana o el reconocimiento celular o en la conjugación de una composición de nanopartículas con un componente útil tal como un radical de direccionamiento u obtención de imágenes (p. ej., un tinte).

Los fosfolípidos incluyen, pero sin limitarse a, glicerofosfolípidos tales como fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatidilgliceroles y ácidos fosfatídicos. Los fosfolípidos también incluyen fosfoesfingolípidos, tales como esfingomielina.

En algunas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención es un análogo o una variante de DSPC. En algunas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención es un compuesto de Fórmula (PL-I):

o una sal del mismo, en donde:

cada R 1 es independientemente alquilo opcionalmente sustituido; u opcionalmente dos R 1 están unidos junto con los átomos intervinientes para formar carbociclilo monocíclico opcionalmente sustituido o heterociclilo monocíclico opcionalmente sustituido; u opcionalmente tres R 1 están unidos junto con los átomos intervinientes para formar carbociclilo bicíclico opcionalmente sustituido o heterociclilo bicíclico opcionalmente sustituido; n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;

m es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;

A tiene la fórmula: o

cada caso de L2 es independientemente un enlace o alquileno C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, en donde una unidad de metileno del alquileno C<1>-C<6>opcionalmente sustituido se remplaza opcionalmente por -O-, -N(RN)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O- o -NRNC(O)N(RN)-;

cada caso de R2 es independientemente alquilo C<1>-C<30>opcionalmente sustituido, alquenilo C<1>-C<30>opcionalmente sustituido o alquinilo C<1>-C<30>opcionalmente sustituido; opcionalmente en donde una o más unidades de metileno de R2 se remplazan independientemente por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, -N(RN)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NRNC(O)N(RN)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NRN)-, -C(=NRN)N(RN)-, -NRNC(=N RN)-, -NR<n>C(=N R<n>)N(Rn)-, -C(S)-, -C(S)N (RN)-, -NRNC(S)-, -NRNC(S)N (RN)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(RN)S(O)-, -S(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)N(RN)-, -OS(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)O-, -S(O)<2>-, -N(RN)S(O)<2>-, -S(O)<2>N(RN)-, -N(RN)S(O)<2>N(RN)-, -OS(O)<2>N(RN)- o -N(RN)S(O)<2>O-;

cada caso de RN es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, o un grupo protector de nitrógeno;

p es 1 o 2;

siempre que el compuesto no tenga la fórmula:

en donde cada caso de R2 es independientemente alquilo no sustituido, alquenilo no sustituido o alquinilo no sustituido.

En algunas realizaciones, los fosfolípidos pueden ser uno o más de los fosfolípidos descritos en la Solicitud de Estados Unidos Núm. 62/520.530.

En algunas realizaciones, los fosfolípidos se pueden seleccionar del grupo no limitante que consiste en 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoilsn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-fosfocolina (DMPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diundecanoil-sn-glicero-fosfocolina (DUPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-di-O-octadecenil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 Diéter PC), 1-oleoil-2-colesterilhemisuccinoil-sn-glicero-3-fosfocolina (OChemsPC), 1-hexadecil-snglicero-3-fosfocolina (C16 Liso PC),1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16.0 PE), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, sal de sodio de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) (DOPG) y esfingomielina. En algunas realizaciones, una LNP incluye DSPC. En algunas realizaciones, una LNP incluye DOPE. En algunas realizaciones, una LNP incluye DSPC y DOPE.

i) M o d ifica c io n e s de la ca b e za fo s fo lip íd ica

En algunas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención comprende una cabeza fosfolipídica modificada (p. ej., un grupo colina modificado). En algunas realizaciones, un fosfolípido con una cabeza modificada es DSPC, o un análogo de la misma, con una amina cuaternaria modificada. En algunas realizaciones, en realizaciones de Fórmula (PL-I), al menos uno de R 1 no es metilo. En algunas realizaciones, al menos uno de R1 no es hidrógeno ni metilo. En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (PL-I) tiene una de las siguientes fórmulas:

cada t es independientemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10;

cada u es independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y

cada v es independientemente 1, 2 o 3.

En algunas realizaciones, un compuesto de Fórmula (PL-I) tiene la Fórmula (PL-I-a):

En algunas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención comprende un radical cíclico en lugar del radical glicérido. En algunas realizaciones, un fosfolípido útil en la presente invención es DSPC, o análogo de la misma, con un radical cíclico en lugar del radical glicérido. En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (PL-I) tiene la Fórmula (PL-I-b):

ii) M o d ifica c io n e s de la co la fo s fo lip íd ica

En algunas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención comprende una cola modificada. En algunas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención es DSPC, o análogo de la misma, con una cola modificada. Como se describe en el presente documento, una “cola modificada” puede ser una cola con cadenas alifáticas más cortas o más largas, cadenas alifáticas con ramificación introducida, cadenas alifáticas con sustituyentes introducidos, cadenas alifáticas en donde uno o más metilenos se remplazan por grupos cíclicos o heteroátomos, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, en algunas realizaciones, el compuesto (PL-I) tiene la Fórmula (PL-I-a), o una sal del mismo, en donde al menos un caso de R 2 es cada caso de R2 es alquilo C<1>-C<30>opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de R2 se reemplazan independientemente por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, -N(RN)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NRNC(O)N(RN)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NR<n>C(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NRn)-, -C(=NR<n>)N(Rn)-, -NRNC(=NRN)-, -NRNC(=NRN)N(RN)-, -C(S)-, -C(S)N(RN)-, -NRNC(S)-, -NRNC(S)N(RN)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(RN)S(O)-, -S(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)N(RN)-, -OS(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)O-, -S(O)<2>-, -N(RN)S(O)<2>-, -S(O)<2>N(RN)-, -N(RN)S(O)<2>N(RN)-, -OS(O)<2>N(RN)- o -N(RN)S(O)2O-.

En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (PL-I) tiene la Fórmula (PL-I-c)):

o una sal del mismo, en donde:

cada x es independientemente un número entero entre 0-30, inclusive; y

cada caso de G se selecciona independientemente del grupo que consiste en carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, -N(RN)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NRNC(O)N(RN)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NRN)-, -C(=NRN)N(RN)-, -NRNC(=NRN)-, -NRNC(=NRN)N(RN)-, -C(S)-, -C(S)N(RN)-, -NRNC(S)-, -NRNC(S)N(RN)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(RN)S(O)-, -S(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)N(RN)-, -OS(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)O-, -S(O)<2>-, -N(RN)S(O)<2>-, -S(O)<2>N(RN)-, -N(RN)S(O)<2>N(RN)-, -OS(O)<2>N(RN)- o -N(RN)S(O)<2>O-. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

En algunas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención comprende un radical fosfocolina modificado, en donde la cadena alquílica que conecta la amina cuaternaria al grupo fosforilo no es etileno (p. ej., n no es 2). Por lo tanto, en algunas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención es un compuesto de Fórmula (PL-I), en donde n es 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas realizaciones, un compuesto de Fórmula (PL-I) tiene una de las siguientes fórmulas:

o una sal del mismo.

L íp id o s a lte rn a tivo s

En algunas realizaciones, se utiliza un lípido alternativo en lugar de un fosfolípido de la presente divulgación. Los ejemplos no limitantes de esos lípidos alternativos incluyen los siguientes:

Adyuvantes

En algunas realizaciones, una LNP que incluye uno o más lípidos descritos en el presente documento puede incluir adicionalmente uno o más adyuvantes, p. ej., adyuvante lipídico glucopiranosilo (GLA, por sus siglas en inglés), oligodesoxinucleótidos CpG (p. ej., Clase A o B), poli(I:C), hidróxido de aluminio y Pam3CSK4.

A g e n te s te ra p é u tico s

Las nanopartículas lipídicas pueden incluir uno o más agentes terapéuticos y/o profilácticos, tales como un ácido nucleico. La divulgación presenta métodos de suministro de un agente terapéutico y/o profiláctico, tal como un ácido nucleico a un órgano o una célula de mamífero, producción de un polipéptido de interés en una célula de mamífero, y tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un mamífero que lo necesite que comprenden administrar a un mamífero y/o poner en contacto una célula de mamífero con una LNP que incluya un agente terapéutico y/o profiláctico, tal como un ácido nucleico.

Los agentes terapéuticos y/o profilácticos incluyen sustancias biológicamente activas y se hace referencia de manera alternativa a estos como “agentes activos”. Un agente terapéutico y/o profiláctico puede ser una sustancia que, una vez suministrada a una célula o un órgano, da lugar a un cambio conveniente en la célula, el órgano, u otro tejido o sistema corporal. Tales especies pueden ser útiles en el tratamiento de una o más enfermedades, trastornos o afecciones. En algunos ejemplos, un agente terapéutico y/o profiláctico es un fármaco de molécula pequeña útil en el tratamiento de una enfermedad, un trastorno o una afección particulares. Los ejemplos de fármacos útiles en las nanopartículas lipídicas incluyen, pero sin limitarse a, agentes antineoplásicos (p. ej., vincristina, doxorrubicina, mitoxantrona, camptotecina, cisplatino, bleomicina, ciclofosfamida, metotrexato y estreptozotocina), agentes antitumorales (p. ej., actinomicina D, vincristina, vinblastina, arabinósido de citosina, antraciclinas, agentes alquilantes, compuestos de platino, antimetabolitos y análogos de nucleósidos, tales como metotrexato y purina y análogos de pirimidina), agentes antiinfecciosos, anestésicos locales (p. ej., dibucaína y clorpromazina), bloqueadores beta-adrenérgicos (p. ej., propranolol, timolol y labetalol), agentes antihipertensivos (p. ej., clonidina e hidralazina), antidepresivos (p. ej., imipramina, amitriptilina y doxepina), anticonvulsivos (p. ej., fenitoína), antihistaminas (p. ej., difenhidramina, clorfeniramina y prometazina), agentes antibióticos/antibacterianos (p. ej., gentamicina, ciprofloxacina y cefoxitina), agentes antifúngicos (p. ej., miconazol, terconazol, econazol, isoconazol, butaconazol, clotrimazol, itraconazol, nistatina, naftifina y anfotericina B), agentes antiparasitarios, hormonas, antagonistas hormonales, inmunomoduladores, antagonistas de neurotransmisores, agentes antiglaucoma, vitaminas, narcóticos y agentes para obtención de imágenes.

En algunos ejemplos, un agente terapéutico y/o profiláctico es una citotoxina, un ion radiactivo, un agente quimioterapéutico, una vacuna, un compuesto que provoque una respuesta inmunitaria y/u otro agente terapéutico y/o profiláctico. Una citotoxina o agente citotóxico incluyen cualquier agente que pueda ser perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen, pero sin limitarse a, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, maitansinoides, p. ej., maitansinol, raquelmicina (CC-1065), y análogos u homólogos de los mismos. Los iones radiactivos incluyen, pero sin limitarse a, yodo (p. ej., yodo 125 o yodo 131), estroncio 89, fósforo, paladio, cesio, iridio, fosfato, cobalto, itrio 90, samario 153 y praseodimio. Las vacunas incluyen compuestos y preparaciones capaces de proporcionar inmunidad contra una o más afecciones relacionadas con enfermedades infecciosas, tales como influenza, sarampión, virus del papiloma humano (VPH), rabia, meningitis, tos ferina, tétanos, peste negra, hepatitis y tuberculosis y pueden incluir ARNm que codifiquen epítopos y/o antígenos derivados de enfermedades infecciosas. Las vacunas también incluyen compuestos y preparaciones que dirigen una respuesta inmunitaria contra células cancerosas y pueden incluir ARNm que codifiquen antígenos, epítopos, y/o neoepítopos derivados de células tumorales. Los compuestos que provocan respuestas inmunitarias pueden incluir, pero sin limitarse a, vacunas, corticosteroides (p. ej., dexametasona), y otras especies.

En algunos ejemplos, un agente terapéutico y/o profiláctico es una proteína. Las proteínas terapéuticas útiles en las nanopartículas en la divulgación incluyen, pero sin limitarse a, gentamicina, amikacina, insulina, eritropoyetina (EPO), factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF, por sus siglas en inglés), factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en inglés), Factor VIR, análogos de hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH, por sus siglas en inglés), interferones, heparina, antígeno de la superficie de la Hepatitis B, vacuna contra la fiebre tifoidea y vacuna contra el cólera. En algunos ejemplos, una vacuna y/o un compuesto capaz de provocar una respuesta inmunitaria se administran por vía intramuscular mediante una composición que incluye un compuesto de acuerdo con la Fórmula (IL-I), (IL-IA), (IL-IB), (IL-II), (IL-IIa), (IL-IIb), (IL-IIc), (IL-IId), (IL-IIe), (IL-IIf), (IL-IIg), (IL-III), (IL-IIIa1), (IL-IIIa2), (IL-IIIa3), (IL-IIIa4), (IL-IIIa5), (IL-IIIa6), (IL-IIIa7) o (IL-IIIa8) (p. ej., Compuesto 3, 18, 20, 26 o 29). Otros agentes terapéuticos y/o profilácticos incluyen, pero sin limitarse a, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, dacarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, raquelmicina (CC-1065), melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (p. ej., vincristina, vinblastina, taxol y maitansinoides).

P o lin u c le ó tid o s y ác ido s n u c le ico s

En realizaciones de la invención, un agente terapéutico es un polinucleótido o ácido nucleico (p. ej., ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico). El término “polinucleótido”, en su sentido más amplio, incluye cualquier compuesto y/o sustancia que se encuentre incorporada o pueda incorporarse a una cadena de oligonucleótidos. Los polinucleótidos ilustrativos para su uso de acuerdo con la presente divulgación incluyen, pero sin limitarse a, uno o más de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) incluyendo el ARN mensajero (ARNm), híbridos de los mismos, agentes inductores de ARNi, agentes de ARNi, ARNip, ARNhp, miARN, ARN antisentido, ribozimas, ADN catalítico, ARN que inducen la formación de hélices triples, aptámeros, vectores, etc. En algunas realizaciones, un agente terapéutico y/o profiláctico es un ARN. Los ARN útiles en las composiciones y los métodos que se describen en el presente documento se pueden seleccionar del grupo que consiste en, pero sin limitarse a, cortómeros, antagomirs, antisentido, ribozimas, ARN interferente pequeño (ARNip), ARN interferente asimétrico (ARNia), microARN (miARN), ARN de sustrato Dicer (ARNsd), ARN en horquilla pequeño (ARNhp), ARN de transferencia (ARNt), ARN mensajero (ARNm), y mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el ARN es un ARNm.

En algunas realizaciones, un agente terapéutico y/o profiláctico es un ARNm. Un ARNm puede codificar cualquier polipéptido de interés, que incluye cualquier polipéptido de origen natural o no natural o modificado de otro modo. Un polipéptido codificado por un ARNm puede tener cualquier tamaño y puede tener cualquier estructura secundaria o actividad. En algunas realizaciones, un polipéptido codificado por un ARNm puede tener un efecto terapéutico cuando se expresa en una célula.

En algunas realizaciones, un agente terapéutico y/o profiláctico es un ARNip. Un ARNip puede reprimir o disminuir de manera selectiva la expresión de un gen de interés. En algunas realizaciones, se podría seleccionar un ARNip para silenciar un gen asociado a una enfermedad, un trastorno o una afección particulares tras la administración a un sujeto que lo necesite de una LNP que incluya el ARNip. Un ARNip puede comprender una secuencia complementaria con respecto a una secuencia de ARNm que codifique un gen o una proteína de interés. En algunas realizaciones, el ARNip puede ser un ARNip inmunomodulador.

En algunas realizaciones, un agente terapéutico y/o profiláctico es un ARNhp o un vector o plásmido que lo codifique. Un ARNhp se puede producir dentro de una célula diana a partir del suministro de una construcción adecuada al núcleo. Las construcciones y los mecanismos relacionados con el ARNhp son muy conocidos en las técnicas relevantes.

Los ácidos nucleicos y polinucleótidos útiles en la divulgación incluyen típicamente una primera región de nucleósidos conectados que codifican un polipéptido de interés (p. ej., una región codificante), una primera región flanqueante ubicada en el extremo 5' de la primera región (p. ej., una 5'-UTR), una segunda región flanqueante ubicada en el extremo 3' de la primera región (p. ej., una 3'-UTR) al menos una región de caperuza 5' y una región de estabilización 3'. En algunas realizaciones, un ácido nucleico o polinucleótido incluyen adicionalmente una región poli-A o una secuencia de Kozak (p. ej., en la 5'-UTR). En algunos casos, los polinucleótidos pueden contener una o más secuencias de nucleótidos intrónicas capaces de escindirse del polinucleótido. En algunas realizaciones, un polinucleótido o ácido nucleico (p. ej., un ARNm) pueden incluir una estructura de caperuza 5', un nucleótido de terminación de cadena, un tallo-bucle, una secuencia de poliA y/o una señal de poliadenilación. Cualquiera de las regiones de un ácido nucleico puede incluir uno o más componentes alternativos (p. ej., un nucleósido alternativo). En algunas realizaciones, la región de estabilización 3' puede contener un nucleósido alternativo tal como un L-nucleósido, una timidina invertida o un 2'-O-metil nucleósido y/o la región codificante, 5';-UTR, 3'-UTR o región de caperuza pueden incluir un nucleósido alternativo tal como una uridina 5-sustituida (p. ej., 5-metoxiuridina), una pseudouridina 1 -sustituida (p. ej., 1-metil-pseudouridina) y/o una citidina 5-sustituida (p. ej., 5-metil-citidina).

Por lo general, la longitud más corta de un polinucleótido puede ser la longitud de la secuencia de polinucleótidos que sea suficiente para codificar un dipéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un tripéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un tetrapéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un pentapéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un hexapéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un heptapéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un octapéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un nonapéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un decapéptido.

Los ejemplos de dipéptidos que las secuencias de polinucleótidos alternativas pueden codificar incluyen, pero sin limitarse a, carnosina y anserina.

En algunos casos, un polinucleótido tiene una longitud de más de 30 nucleótidos. En otra realización, la molécula de polinucleótido tiene una longitud de más de 35 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 40 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 45 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 50 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 55 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 60 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 80 nucleótidos. En otras realizaciones, la longitud es de al menos 90 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 100 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 120 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 140 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 160 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 180 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 200 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 250 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 300 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 350 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 400 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 450 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 500 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 600 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 700 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 800 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 900 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1000 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1100 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1200 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1300 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1400 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1500 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1600 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1800 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 2000 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 2500 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 3000 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 4000 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 5000 nucleótidos, o más de 5000 nucleótidos.

Los ácidos nucleicos y polinucleótidos pueden incluir uno o más componentes de origen natural, incluyendo cualquiera de los nucleótidos canónicos A (adenosina), G (guanosina), C (citosina), U (uridina) o T (timidina). En algunas realizaciones, todos o sustancialmente todos los nucleótidos que comprenden (a) la 5'-UTR, (b) el marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en inglés), (c) la 3'-UTR, (d) la cola de poli A, y cualquier combinación de (a, b, c o d nombrados anteriormente) comprenden nucleótidos canónicos de origen natural A (adenosina), G (guanosina), C (citosina), U (uridina) o T (timidina).

Los ácidos nucleicos y polinucleótidos pueden incluir uno o más componentes alternativos, como se describe en el presente documento, que proporcionen propiedades útiles incluyendo el aumento de la estabilidad y/o la falta de una inducción sustancial de la respuesta inmunitaria innata de una célula en la que se introduzca el polinucleótido. En algunas realizaciones, un ácido nucleico o polinucleótido alternativos presentan una menor degradación en una célula en la que se introduce el polinucleótido o ácido nucleico, con respecto a un polinucleótido o ácido nucleico inalterados correspondientes. Estas especies alternativas pueden mejorar la eficiencia de la producción de proteínas, la retención intracelular de los polinucleótidos y/o la viabilidad de las células con las que se genera el contacto, así como poseer una menor inmunogenicidad.

Los polinucleótidos y ácidos nucleicos pueden ser de origen natural o no natural. Los polinucleótidos y ácidos nucleicos pueden incluir una o más nucleobases, nucleósidos o nucleótidos modificados (p. ej., alterados o alternativos), o combinaciones de los mismos. Los ácidos nucleicos y polinucleótidos útiles en una LNP pueden incluir cualquier modificación o alteración útil, tal como de la nucleobase, el azúcar o la conexión internucleosídica (p. ej., de un fosfato conector, de una conexión fosfodiéster, de la cadena principal de fosfodiéster). En algunas realizaciones, las alteraciones (p. ej., una o más alteraciones) se encuentran presentes en cada uno de la nucleobase, el azúcar, y la conexión internucleosídica. Las alteraciones de acuerdo con la presente divulgación pueden ser alteraciones de ácidos ribonucleicos (ARN) para formar ácidos desoxirribonucleicos (ADN), p. ej., la sustitución del 2'-OH del anillo ribofuranosilo por 2'-H, ácidos nucleicos treósicos (ANT), ácidos nucleicos de glicol (ANG), ácidos péptidonucleicos (APN), ácidos nucleicos bloqueados (ANB), o híbridos de los mismos. En el presente documento se describen alteraciones adicionales.

Los polinucleótidos y ácidos nucleicos pueden estar alterados o no de manera uniforme en toda la longitud de la molécula. En algunas realizaciones, uno o más o todos los tipos de nucleótidos (p. ej., purina o pirimidina, o uno o más cualesquiera, o todos de, A, G, U, C) pueden estar alterados o no de manera uniforme en un polinucleótido o ácido nucleico, o en una determinada región de una secuencia predeterminada. En algunos casos, todos los nucleótidos X en un polinucleótido (o en una región de secuencia determinada del mismo) están alterados, en donde X puede ser uno cualquiera de los nucleótidos A, G, U, C, o una cualquiera de las combinaciones A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C o A+G+U+C.

Pueden existir diferentes alteraciones de azúcares y/o conexiones internucleosídicas (p. ej., estructuras de la cadena principal) en diversas posiciones en un polinucleótido. Un experto en la técnica se dará cuenta de que los análogos de nucleótidos u otra u otras alteraciones pueden ubicarse en una o más posiciones cualesquiera de un polinucleótido, de forma tal que la función del polinucleótido no disminuya sustancialmente. Una alteración también puede ser una alteración en el extremo 5' o 3'. En algunas realizaciones, el polinucleótido incluye una alteración en el extremo 3'. El polinucleótido puede contener de aproximadamente 1% a aproximadamente 100% de nucleótidos alternativos (ya sea con respecto al contenido de nucleótidos general, o con respecto a uno o más tipos de nucleótidos, es decir, uno o más cualesquiera de A, G, U o C) o cualquier porcentaje intermedio (p. ej., de 1% a 20%, de 1% a 25%, de 1% a 50%, de 1% a 60%, de 1% a 70%, de 1% a 80%, de 1% a 90%, de 1% a 95%, de 10% a 20%, de 10% a 25%, de 10% a 50%, de 10% a 60%, de 10% a 70%, de 10% a 80%, de 10% a 90%, de 10% a 95%, de 10% a 100%, de 20% a 25%, de 20% a 50%, de 20% a 60%, de 20% a 70%, de 20% a 80%, de 20% a 90%, de 20% a 95%, de 20% a 100%, de 50% a 60%, de 50% a 70%, de 50% a 80%, de 50% a 90%, de 50% a 95%, de 50% a 100%, de 70% a 80%, de 70% a 90%, de 70% a 95%, de 70% a 100%, de 80% a 90%, de 80% a 95%, de 80% a 100%, de 90% a 95%, de 90% a 100% y de 95% a 100%). Se entenderá que cualquier porcentaje restante está representado por la presencia de un nucleótido canónico (p. ej., A, G, U o C).

Los polinucleótidos pueden contener como mínimo cero y como máximo 100% de nucleótidos alternativos, o cualquier porcentaje intermedio, tal como al menos 5% de nucleótidos alternativos, al menos 10% de nucleótidos alternativos, al menos 25% de nucleótidos alternativos, al menos 50% de nucleótidos alternativos, al menos 80% de nucleótidos alternativos o al menos 90% de nucleótidos alternativos. En algunas realizaciones, los polinucleótidos pueden contener una pirimidina alternativa, tal como un uracilo o una citosina alternativos. En algunas realizaciones, al menos 5%, al menos 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 80%, al menos 90% o 100% del uracilo en un polinucleótido se reemplaza por un uracilo alternativo (p. ej., un uracilo 5-sustituido). El uracilo alternativo puede reemplazarse por un compuesto que tenga una sola estructura única, o puede reemplazarse por múltiples compuestos que tengan diferentes estructuras (p. ej., 2, 3, 4 o más estructuras únicas). En algunos casos, al menos 5%, al menos 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 80%, al menos 90% o 100% de la citosina en el polinucleótido se reemplaza con una citosina alternativa (p. ej., una citosina 5-sustituida). La citosina alternativa puede reemplazarse por un compuesto que tenga una sola estructura única, o puede reemplazarse por múltiples compuestos que tengan diferentes estructuras (p. ej., 2, 3, 4 o más estructuras únicas).

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos no inducen sustancialmente una respuesta inmunitaria innata de una célula en la que se introduce el polinucleótido (p. ej., ARNm). Las características de una respuesta inmunitaria innata inducida incluyen 1) un aumento en la expresión de citocinas proinflamatorias, 2) una activación de PRR intracelulares (RIG-I, MDA5, etc.) y/o 3) una terminación o reducción en la traducción de proteínas.

Los ácidos nucleicos pueden incluir opcionalmente otros agentes (p. ej., agentes inductores de ARNi, agentes de ARNi, ARNip, ARNhp, miARN, ARN antisentido, ribozimas, ADN catalítico, ARNt, ARN que induzcan la formación de hélices triples, aptámeros, vectores). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden incluir uno o más ARN mensajeros (ARNm) con uno o más nucleósidos o nucleótidos alternativos (es decir, moléculas de ARNm alternativas).

En algunas realizaciones, una molécula, fórmula, composición de ácido nucleico (p. ej., ARNm) o método asociado con las mismas comprenden uno o más polinucleótidos que comprenden características como se describe en los documentos WO2002/098443, WO2003/051401, WO2008/052770, WO2009127230, WO2006122828, WO2008/083949, WO2010088927, W O2010/037539, WO2004/004743, WO2005/016376, WO2006/024518, WO2007/095976, WO2008/014979, WO2008/077592, WO2009/030481, WO2009/095226, WO2011069586, WO2011026641, WO2011/144358, WO2012019780, WO2012013326, WO2012089338, W O2012113513, W O 2012116811, WO2012116810, W O2013113502, W O2013113501, W O2013113736, WO2013143698, WO2013143699, W O2013143700, WO2013/120626, W O2013120627, WO2013120628, WO2013120629, WO2013174409, W O2014127917, WO2015/024669, WO2015/024668, WO2015/024667, WO2015/024665, WO2015/024666, WO2015/024664, W O2015101415, W O2015101414, WO2015024667, WO2015062738, WO2015101416.

A lte rn a tiv a s de n u c le o b a se s

Los nucleótidos y nucleósidos alternativos pueden incluir una nucleobase alternativa. Una nucleobase de un ácido nucleico es una base orgánica tal como una purina o pirimidina o un derivado de las mismas. Una nucleobase puede ser una base canónica (p. ej., adenina, guanina, uracilo, timina y citosina). Estas nucleobases pueden alterarse o remplazarse completamente para proporcionar moléculas de polinucleótidos que tengan propiedades mejoradas, p. ej., una mayor estabilidad tal como resistencia a las nucleasas. Las bases no canónicas o modificadas pueden incluir, por ejemplo, una o más sustituciones o modificaciones que incluyan, pero sin limitarse a, sustituciones de alquilo, arilo, halo, oxo, hidroxilo, alquiloxi y/o tio; uno o más anillos fusionados o abiertos; oxidación; y/o reducción.

La formación de pares de bases de nucleótidos alternativos comprende no sólo los pares de bases convencionales adenina-timina, adenina-uracilo o guanina-citosina, sino también los pares de bases formados entre nucleótidos y/o nucleótidos alternativos que incluyen bases no convencionales o alternativas, en donde la disposición de donantes de enlaces de hidrógeno y aceptores de enlaces de hidrógeno permite la unión de hidrógenos entre una base no convencional y una base convencional, o entre dos estructuras de bases no convencionales complementarias. Un ejemplo de tal formación de pares de bases no convencionales es la formación de pares de bases entre el nucleótido alternativo inosina y adenina, citosina o uracilo.

En algunas realizaciones, la nucleobase es un uracilo alternativo. Las nucleobases y nucleósidos ilustrativos que tienen un uracilo alternativo incluyen, pero sin limitarse a, pseudouridina (<y>), ribonucleósido piridin-4-ona, 5-aza-uracilo, 6-aza-uracilo, 2-tio-5-azauracilo, 2-tio-uracilo (s2U), 4-tio-uracilo (s4U), 4-tio-pseudouridina, 2-tiopseudouridina, 5-hidroxi-uracilo (ho5U), 5-aminoalil-uracilo, 5-halo-uracilo (p. ej., 5-yodo-uracilo o 5-bromouracilo), 3-metil-uracilo (m3U), 5-metoxi-uracilo (mo5U), ácido uracil-5-oxiacético (cmo5U), éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético (mcmo5U), 5-carboximetil-uracilo (cm5U), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxihidroximetil-uracilo (chm5U), éster metílico de 5-carboxihidroximetil-uracilo (mchm5U), 5-metoxicarbonilmetil-uracilo (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2-tio-uracilo (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uracilo (nm5s2U), 5-metilaminometil-uracilo (mnm5U), 5-metilaminometil-2-tio-uracilo (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-seleno-uracilo (mnm5se2U), 5-carbamoilmetil-uracilo (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uracilo (cmnm5U), 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracilo (cmnm5s2U), 5-propinil-uracilo, 1-propinil-pseudouracilo, 5-taurinometiluracilo (ím5U), 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uracilo (Tm5s2U), 1-taurinometil-4-tiopseudouridina, 5-metil-uracilo (m5U, es decir, que tienen la nucleobase desoxitimina), 1-metil-pseudouridina ( it^y ), 5-metil-2-tio-uracilo (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metilpseudouridina (m3Y), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-desaza-pseudouridina, 2-tio-1 -metil-1-desazapseudouridina, dihidrouracilo (D), dihidropseudouridina, 5,6-dihidrouracilo, 5-metil-dihidrouracilo (m5D), 2-tio-dihidrouracilo, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxi-uracilo, 2-metoxi-4-tio-uracilo, 4-metoxipseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, N1-metil-pseudouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uracilo (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3 y ), 5-(isopentenilaminometil)uracilo (inm5U), 5-(isopentenilaminometil)-2-tio-uracilo (inm5s2U), 5,2'-O-dimetil-uridina (m5Um), 2-tio-2'-O_metil-uridina (s2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metil-uridina (mcm5Um), 5-carbamoilmetil-2'-O-metil-uridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2'-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetil-uridina (m3Um) y 5-(isopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridina (inm5Um), 1-tio-uracilo, desoxitimidina, 5-(2-carbometoxivinil)-uracilo, 5-(carbamoilhidroximetil)-uracilo, 5-carbamoilmetil-2-tio-uracilo, 5-carboximetil-2-tio-uracilo, 5-cianometil-uracilo, 5-metoxi-2-tio-uracilo y 5-[3-(1-E-propenilamino)]uracilo.

En algunas realizaciones, la nucleobase es una citosina alternativa. Las nucleobases y nucleósidos ilustrativos que tienen una citosina alternativa incluyen, pero sin limitarse a, 5-aza-citosina, 6-aza-citosina, pseudoisocitidina, 3-metil-citosina (m3C), N4-acetil-citosina (ac4C), 5-formil-citosina (f5C), N4-metil-citosina (m4C), 5-metil-citosina (m5C), 5-halo-citosina (p. ej., 5-yodo-citosina), 5-hidroximetil-citosina (hm5C), 1-metilpseudoisocitidina, pirrolo-citosina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tio-citosina (s2C), 2-tio-5-metil-citosina, 4-tiopseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina, 1-metil-1-desazapseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citosina, 2-metoxi-5-metil-citosina, 4-metoxi-pseudoisocitidina, 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina, lisidina (k2C), 5,2'-O-dimetil-citidina (m5Cm), N4-acetil-2'-O-metil-citidina (ac4Cm), N4,2'-O-dimetil-citidina (m4Cm), 5-formil-2'-O-metil-citidina (f5Cm), N4,N4,2'-O-trimetil-citidina (m42Cm), 1 -tio-citosina, 5-hidroxicitosina, 5-(3-azidopropil)-citosina y 5-(2-azidoetil)-citosina.

En algunas realizaciones, la nucleobase es una adenina alternativa. Las nucleobases y nucleósidos ilustrativos que tienen una adenina alternativa incluyen, pero sin limitarse a, 2-amino-purina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6- halo-purina (p. ej., 2-amino-6-cloro-purina), 6-halo-purina (p. ej., 6-cloro-purina), 2-amino-6-metil-purina, 8-azido-adenina, 7-desaza-adenina, 7-desaza-8-aza-adenina, 7-desaza-2-amino-purina, 7-desaza-8-aza-2-amino-purina, 7-desaza-2,6-diaminopurina, 7-desaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metil-adenina (m1A), 2-metiladenina (m2A), N6-metil-adenina (m6A), 2-metiltio-N6-metil-adenina (ms2m6A), N6-isopentenil-adenina (i6A), 2- metiltio-N6-isopentenil-adenina (ms2i6A), N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenina (io6A), 2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil)adenina (ms2io6A), N6-glicinilcarbamoil-adenina (g6A), N6-treonilcarbamoil-adenina (t6A), N6-metil-N6-treonilcarbamoil-adenina (m6t6A), 2-metiltio-N6-treonilcarbamoil-adenina (ms2g6A), N6,N6-dimetil-adenina (m62A), N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenina (hn6A), 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenina (ms2hn6A), N6-acetil-adenina (ac6A), 7-metil-adenina, 2-metiltio-adenina, 2-metoxi-adenina, N6,2'-O-dimetil-adenosina (m6Am), N6,N6,2'-O-trimetil-adenosina (m62Am), 1,2'-O-dimetil-adenosina (m1Am), 2-amino-N6-metil-purina, 1-tio-adenina, 8-azido-adenina, N6-(19-amino-pentaoxanonadecil)-adenina, 2,8-dimetil-adenina, N6-formil-adenina y N6 - hidroximetil-adenina.

En algunas realizaciones, la nucleobase es una guanina alternativa. Las nucleobases y nucleósidos ilustrativos que tienen una guanina alternativa incluyen, pero sin limitarse a, inosina (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 4-desmetil-wiosina (imG-14), isowiosina (imG2), wibutosina (yW), peroxiwibutosina (o2yW), hidroxiwibutosina (OHyW), hidroxiwibutosina insuficientemente modificada (OHyW*), 7- desaza-guanina, queuosina (Q), epoxiqueuosina (oQ), galactosil-queuosina (galQ), manosil-queuosina (manQ), 7-ciano-7-desaza-guanina (preQ0), 7-aminometil-7-desaza-guanina (preQ1), arqueosina (G+), 7-desaza-8-aza-guanina, 6-tio-guanina, 6-tio-7-desaza-guanina, 6-tio-7-desaza-8-aza-guanina, 7-metil-guanina (m7G), 6-tio-7-metil-guanina, 7-metil-inosina, 6-metoxi-guanina, 1-metil-guanina (m1G), N2-metil-guanina (m2G), N2,N2-dimetil-guanina (m22G), N2,7-dimetil-guanina (m2,7G), N2, N2,7-dimetil-guanina (m2,2,7G), 8-oxo-guanina, 7-metil-8-oxo-guanina, 1-metil-6-tio-guanina, N2-metil-6-tio-guanina, N2,N2-dimetil-6-tioguanina, N2-metil-2'-O-metil-guanosina (m2Gm), N2,N2-dimetil-2'-O-metilguanosina (m22Gm), 1-metil-2'-O-metil-guanosina (m1Gm), N2,7-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m2,7Gm), 2'-O-metil-mosma (Im), 1,2'-O-dimetilinosina (m1Im), 1-tio-guanina y O-6-metil-guanina.

La nucleobase alternativa de un nucleótido puede ser independientemente una purina, una pirimidina, un análogo de purina o pirimidina. En algunas realizaciones, la nucleobase puede ser una alternativa a adenina, citosina, guanina, uracilo o hipoxantina. En otra realización, la nucleobase también puede incluir, por ejemplo, derivados sintéticos y de origen natural de una base, que incluyen, pero sin limitarse a, pirazolo[3,4-d]pirimidinas, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros alquilderivados de adenina y guanina, 2-propilo y otros alquilderivados de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo (p. ej., 8-bromo), 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxi y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, desazaguanina, 7-desazaguanina, 3- desazaguanina, desazaadenina, 7-desazaadenina, 3-desazaadenina, pirazolo[3,4-d]pirimidina, imidazo[1,5-a]1,3,5-triazinonas, 9-desazapurinas, imidazo[4,5-d]pirazinas, tiazolo[4,5-d]pirimidinas, pirazin-2-onas, 1,2,4-triazina, piridazina; o 1,3,5 triazina. Cuando los nucleótidos se ilustran mediante el uso de la abreviatura A, G, C, T o U, cada letra hace referencia a la base representativa y/o derivados la misma, p. ej., A incluye adenina o análogos de adenina, p. ej., 7-desaza adenina).

A lte ra c io n e s en e l a z ú c a r

Los nucleósidos incluyen una molécula de azúcar (p. ej., un azúcar de 5 carbonos o 6 carbonos, tal como pentosa, ribosa, arabinosa, xilosa, glucosa, galactosa, o un derivado desoxi de las mismas) combinada con una nucleobase, mientras que los nucleótidos son nucleósidos que contienen un nucleósido y un grupo fosfato o grupo alternativo (p. ej., boranofosfato, tiofosfato, selenofosfato, fosfonato, grupo alquilo, amidato y glicerol). Un nucleósido o nucleótido pueden ser una especie canónica, p. ej., un nucleósido o nucleótido que incluyen una nucleobase canónica, azúcar y, en el caso de los nucleótidos, un grupo fosfato, o puede ser un nucleósido o nucleótido alternativos que incluyan uno o más componentes alternativos. En algunas realizaciones, los nucleósidos y nucleótidos alternativos pueden alterarse en el azúcar del nucleósido o nucleótido. En algunas realizaciones, los nucleósidos o nucleótidos alternativos incluyen la estructura:

En cada una de las Fórmulas IV, V, VI y VII,

cada uno de m y n es independientemente un número entero de 0 a 5,

cada uno de U y U', es independientemente O, S, N(RU)nu o C (R U)nu, en donde nu es un entero de 0 a 2 y cada R U es, independientemente, H, halo o alquilo opcionalmente sustituido;

cada uno de R 1', R2', R1”, R2", R 1, R2, R3, R4 y R5 es, independientemente, si está presente, H, halo, hidroxi, tiol, alquilo opcionalmente sustituido, alcoxi opcionalmente sustituido, alqueniloxi opcionalmente sustituido, alquiniloxi opcionalmente sustituido, aminoalcoxi opcionalmente sustituido, alcoxialcoxi opcionalmente sustituido, hidroxialcoxi opcionalmente sustituido, amino opcionalmente sustituido, azido, arilo opcionalmente sustituido, aminoalquilo opcionalmente sustituido, aminoalquenilo opcionalmente sustituido, aminoalquinilo opcionalmente sustituido, o está ausente; en donde la combinación de R3 con uno o más de R 1’, R 1" , R2’, R2" o R5 (p. ej., la combinación de R 1’ y R3, la combinación de R1" y R3, la combinación de R2’ y R3, la combinación de R2" y R3, o la combinación de R5 y R3) puede unirse para formar alquileno opcionalmente sustituido o heteroalquileno opcionalmente sustituido y, tomados junto con los carbonos a los que están anclados, proporcionan un heterociclilo opcionalmente sustituido (p. ej., un heterociclilo bicíclico, tricíclico o tetracíclico); en donde la combinación de R5 con uno o más de R1’ , R 1" , R2’ o R2" (p. ej., la combinación de R 1’ y R5, la combinación de R r ’ y R5, la combinación de R2’ y R5, o la combinación de R 2" y R5) puede unirse para formar alquileno opcionalmente sustituido o heteroalquileno opcionalmente sustituido y, tomados junto con los carbonos a los que están anclados, proporcionan un heterociclilo opcionalmente sustituido (p. ej., un heterociclilo bicíclico, tricíclico o tetracíclico); y en donde la combinación de R4 y uno o más de R 1’ , R 1", R2’ , R2", R3 o R5 puede unirse para formar alquileno opcionalmente sustituido o heteroalquileno opcionalmente sustituido y, tomados junto con los carbonos a los que están anclados, proporcionan un heterociclilo opcionalmente sustituido (p. ej., un heterociclilo bicíclico, tricíclico o tetracíclico); cada uno de m' y m" es, independientemente, un número entero de 0 a 3 (p. ej., de 0 a 2, de 0 a 1, de 1 a 3 o de 1 a 2);

cada uno de Y1, Y2 e Y3, es, independientemente, O, S, Se, — NRN1— , alquileno opcionalmente sustituido o heteroalquileno opcionalmente sustituido, en donde R N1 es H, alquilo opcionalmente sustituido, alquileno opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, o está ausente; cada Y4 es, independientemente, H, hidroxi, tiol, boranilo, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, alcoxi opcionalmente sustituido, alqueniloxi opcionalmente sustituido, alquiniloxi opcionalmente sustituido, tioalcoxi opcionalmente sustituido, alcoxialcoxi opcionalmente sustituido o amino opcionalmente sustituido;

cada Y5 es, independientemente, O, S, Se, alquileno opcionalmente sustituido (p. ej., metileno) o heteroalquileno opcionalmente sustituido; y

B es una nucleobase, modificada o no modificada.

En algunas realizaciones, el grupo 2’-hidroxi (OH) puede modificarse o remplazarse con una cantidad de sustituyentes diferentes. Las sustituciones ilustrativas en la posición 2’ incluyen, pero sin limitarse a, H, azido, halo (p. ej., flúor), alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido (p. ej., metilo); alcoxi C<1>-C<6>opcionalmente sustituido (p. ej., metoxi o etoxi); ariloxi C<6>-C<10>opcionalmente sustituido; cicloalquilo C<3>-C<8>opcionalmente sustituido; arilo C<6>-C<10>-alcoxi C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, (heterociclil)oxi C<1>-C<12>opcionalmente sustituido; un azúcar (p. ej., ribosa, pentosa o cualquiera que se describa en el presente documento); un polietilenglicol (PEG), -O(CH<2>CH<2>O)nCH<2>CH<2>OR, donde R es H o alquilo opcionalmente sustituido, y n es un número entero de 0 a 20 (p. ej., de 0 a 4, de 0 a 8, de 0 a 10, de 0 a 16, de 1 a 4, de 1 a 8, de 1 a 10, de 1 a 16, de 1 a 20, de 2 a 4, de 2 a 8, de 2 a 10, de 2 a 16, de 2 a 20, de 4 a 8, de 4 a 10, de 4 a 16 y de 4 a 20); ácidos nucleicos “bloqueados” (ANB) en los que el 2'-hidroxi se conecta mediante un puente alquileno C<1>-C<6>o heteroalquileno C<1>-C<6>al 4'-carbono del mismo azúcar ribosa, donde los puentes ilustrativos incluyen puentes metileno, propileno, éter o amino; aminoalquilo, como se define en el presente documento; aminoalcoxi, como se define en el presente documento; amino, como se define en el presente documento; y aminoácido, como se define en el presente documento.

Por lo general, el ARN incluye el grupo de azúcar ribosa, que es un anillo de 5 miembros con un oxígeno. Los nucleótidos alternativos no limitantes ilustrativos incluyen el remplazo del oxígeno en la ribosa (p. ej., por S, Se o alquileno, tal como metileno o etileno); la adición de un enlace doble (p. ej., para remplazar ribosa por ciclopentenilo o ciclohexenilo); la contracción del anillo de ribosa (p. ej., para formar un anillo de 4 miembros de ciclobutano u oxetano); la expansión del anillo de ribosa (p. ej., para formar un anillo de 6 o 7 miembros con un carbono o heteroátomo adicional, tal como para anhidrohexitol, altritol, manitol, ciclohexanilo, ciclohexenilo y morfolino (que también tiene una cadena principal de fosforamidato)); formas multicíclicas (p. ej., triciclo y formas “desbloqueadas", tales como ácido nucleico de glicol (ANG) (p. ej., ANG-R o ANG-S, donde la ribosa se remplaza por unidades de glicol ancladas a enlaces fosfodiéster), ácido nucleico treósico (ANT, donde la ribosa se remplaza por a-L-treofuranosilo-(3’— >2’)), y ácido peptidonucleico (APN, donde conexiones de 2-amino-etil-glicina remplazan la cadena principal de fosfodiéster y ribosa).

En algunas realizaciones, el grupo de azúcar contiene uno o más carbonos que poseen la configuración estereoquímica opuesta a la del carbono correspondiente en la ribosa. Por lo tanto, una molécula de polinucleótido puede incluir nucleótidos que contengan, p. ej., arabinosa o L-ribosa, como azúcar.

En algunas realizaciones, el polinucleótido incluye al menos un nucleósido en donde el azúcar es L-ribosa, 2’-O-metil-ribosa, 2’-fluoro-ribosa, arabinosa, hexitol, un ANB o un APN.

A lte ra c io n e s en la c o n e x ió n in te rn u c le o s íd ic a

Los nucleótidos alternativos pueden alterarse en la conexión internucleosídica (p. ej., cadena principal de fosfato). En el presente documento, en el contexto de la cadena principal polinucleotídica, las expresiones “fosfato” y “fosfodiéster” se utilizan de manera intercambiable. Los grupos fosfato de la cadena principal pueden alterarse mediante el remplazo de uno o más átomos de oxígeno por un sustituyente diferente.

Los nucleótidos alternativos pueden incluir el remplazo general de un radical fosfato inalterado por otra conexión internucleosídica como se describe en el presente documento. Los ejemplos de grupos fosfato alternativos incluyen, pero sin limitarse a, fosforotioato, fosforoselenatos, boranofosfatos, ésteres de boranofosfato, hidrogenofosfonatos, fosforamidatos, fosforodiamidatos, alquil o aril fosfonatos y fosfotriésteres. Los fosforoditioatos tienen ambos oxígenos no conectores remplazados por azufre. El conector de fosfato también puede alterarse mediante el remplazo de un oxígeno conector por nitrógeno (fosforamidatos con puente), azufre (fosforotioatos con puente) y carbono (metilenfosfonatos con puente).

Los nucleósidos y nucleótidos alternativos pueden incluir el reemplazo de uno o más de los oxígenos que no forman puentes por un radical borano (BH<3>), azufre (tio), metilo, etilo y/o metoxi. A modo de ejemplo no limitante, dos oxígenos que no forman puentes en la misma posición (p. ej., la posición alfa (a), beta (p) o gamma (y)) pueden remplazarse por un azufre (tio) y un metoxi.

El remplazo de uno o más de los átomos de oxígeno en la posición a del radical fosfato (p. ej., un a-tio fosfato) se proporciona para conferir estabilidad (tal como contra exonucleasas y endonucleasas) al ARN y ADN a través de las conexiones de la cadena principal de fosforotioato no naturales. El ADN y ARN de fosforotioato tienen una mayor resistencia a las nucleasas y en consecuencia una semivida más larga en un entorno celular. En el presente documento se describen otras conexiones internucleosídicas que pueden emplearse de acuerdo con la presente divulgación, incluyendo las conexiones internucleosídicas que no contienen un átomo de fósforo.

S itio s in te rn o s de e n tra d a a l r ib o so m a

Los polinucleótidos pueden contener un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, por sus siglas en inglés). Un IRES puede actuar como el único sitio de unión al ribosoma o puede funcionar como uno de los múltiples sitios de unión al ribosoma de un ARNm. Un polinucleótido que contiene más de un sitio de unión al ribosoma funcional puede codificar varios péptidos o polipéptidos que son traducidos independientemente por los ribosomas (p. ej., ARNm multicistrónico). Cuando los polinucleótidos están provistos de un IRES, también se proporciona opcionalmente una segunda región traducible. Los ejemplos de secuencias de IRES que se pueden utilizar de acuerdo con la presente divulgación incluyen, pero sin limitarse a, aquellos de picornavirus (p. ej., FMDV), virus de la peste (CFFV), poliovirus (PV), virus de encefalomiocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), virus de la leucemia murina (MLV), virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV) o virus de la parálisis del grillo (CrPV).

E s tru c tu ra de ca p e ru za 5 ’

Un polinucleótido (p. ej., un ARNm) puede incluir una estructura de caperuza 5'. La estructura de caperuza 5' de un polinucleótido está involucrada en la exportación nuclear y el aumento de la estabilidad del polinucleótido y se une a la Proteína de Unión a la Caperuza (CBP, por sus siglas en inglés) de ARNm, que es responsable de la estabilidad del polinucleótido en la célula y la competencia de traducción a través de la asociación de la CBP con una proteína de unión a poli-A para formar las especies de ARNm cíclicas maduras. La caperuza ayuda de manera adicional a la eliminación de intrones proximales 5' durante el corte y empalme de ARNm. Las moléculas de polinucleótidos endógenas pueden tener una caperuza de protección en el extremo 5' que genere una conexión 5'-ppp-5'-trifosfato entre un resto de la caperuza de guanosina terminal y el nucleótido efector transcrito 5'-terminal del polinucleótido. Esta caperuza de 5'-guanilato puede metilarse después para generar un resto N7-metil-guanilato. Los azúcares de ribosa de los nucleótidos transcritos terminales y/o anteterminales del extremo 5' del polinucleótido también pueden estar opcionalmente 2'-O-metilados. La eliminación de la caperuza 5' a través de la hidrólisis y escisión de la estructura de caperuza de guanilato pueden dirigirse a una molécula de polinucleótido, tal como una molécula de ARNm, para la degradación. Las alteraciones de polinucleótidos pueden generar una estructura de caperuza no hidrolizable que impida la eliminación de la caperuza y por lo tanto aumenten la semivida del polinucleótido. Dado que la hidrólisis de la estructura de la caperuza requiere la escisión de conexiones fosforodiéster 5'-ppp-5', se pueden utilizar nucleótidos alternativos durante la reacción de formación de caperuza. En algunas realizaciones, se puede utilizar una Enzima de Formación de Caperuza de Vaccinia de New England Biolabs (Ipswich, m A) con nucleótidos de a-tio-guanosina de acuerdo con las instrucciones del fabricante para crear una conexión fosforotioato en la caperuza 5'-ppp-5'. Se pueden utilizar nucleótidos de guanosina alternativos adicionales tales como nucleótidos de a-metil-fosfonato y seleno-fosfato.

Otras alteraciones incluyen, pero sin limitarse a, la 2'-O-metilación de los azúcares de ribosa de nucleótidos 5'-terminales y/o 5'-anteterminales del polinucleótido (tal como se mencionó anteriormente) en el grupo 2'-hidroxi del azúcar. Se pueden utilizar múltiples estructuras de caperuza 5' distintas para generar la caperuza 5' de un polinucleótido, tal como una molécula de ARNm.

Las estructuras de Caperuza 5' incluyen las descritas en las Publicaciones de Patente Internacionales Núm. WO2008127688, WO 2008016473 y WO 2011015347.

Los análogos de caperuzas, a los que en el presente documento también se hace referencia como análogos de caperuzas sintéticas, caperuzas químicas, análogos de caperuzas químicas o análogos de caperuzas estructurales o funcionales, difieren de las caperuzas 5' naturales (es decir, endógenas, de tipo salvaje o fisiológicas) en su estructura química, al tiempo que mantienen la función de caperuza. Los análogos de caperuzas pueden sintetizarse químicamente (es decir, no enzimáticamente) o enzimáticamente y/o conectarse a un polinucleótido.

Por ejemplo, la caperuza del Análogo de Caperuza AntiInverso (ARCA, por sus siglas en inglés) contiene dos guanosinas conectadas por un grupo 5'-5'-trifosfato, en donde una guanosina contiene un grupo N7-metilo, así como un grupo 3'-O-metilo (es decir, N7,3'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina, m7G-3'mppp-G, que puede designarse de manera equivalente “3' O-Me-m7G(5')ppp(5')G”). El átomo de O en 3' de la otra guanina no modificada se conecta con el nucleótido 5'-terminal del polinucleótido con caperuza (p. ej., un ARNm). La guanosina N7- y 3'-O-metilada proporciona el radical terminal del polinucleótido con caperuza (p. ej., ARNm). Otra caperuza ilustrativa es mCAP, que es similar a ARCA, pero tiene un grupo 2'-O-metilo en la guanosina (es decir, N7,2'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina, m7Gm-ppp-G).

Una caperuza puede ser un análogo de caperuza dinucleotídico. A modo de ejemplo no limitante, el análogo de caperuza dinucleotídico puede modificarse en diferentes posiciones de fosfato con un grupo boranofosfato o un grupo foforoselenoato tal como los análogos de caperuzas dinucleotídicos que se describen en la Patente de Estados Unidos Núm. 8.519.110.

De manera alternativa, un análogo de caperuza puede ser un análogo de caperuza dinucleotídico sustituido con N7-(4-clorofenoxietilo) conocido en la técnica y/o descrito en el presente documento. Los ejemplos no limitantes de análogos de caperuzas dinucleotídicos sustituidos con N7-(4-clorofenoxietilo) incluyen un análogo de caperuza N7-(4-clorofenoxietil)-G(5')ppp(5')G y N7-(4-clorofenoxietil)-m3'-OG(5')ppp(5')G (véanse, p. ej., los diversos análogos de caperuzas y los métodos de síntesis de análogos de caperuza descritos por Kore et al. en Bioorganic & Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574). En otros casos, un análogo de caperuza útil en los polinucleótidos de la presente divulgación es un análogo de 4-cloro/bromofenoxietilo.

Si bien los análogos de caperuza permiten la formación concomitante de caperuzas de un polinucleótido en una reacción de transcripciónin vitro,hasta 20% de los transcritos permanecen sin caperuzas. Esto, así como las diferencias estructurales de un análogo de caperuza con respecto a estructuras de caperuzas 5' endógenas de polinucleótidos producidos mediante el mecanismo de transcripción celular endógeno, puede conducir a una reducción de la competencia de traducción y una reducción de la estabilidad celular.

También se pueden formar caperuzas en polinucleótidos alternativos después de la transcripción, mediante el uso de enzimas, con el fin de generar estructuras de caperuzas 5' más auténticas. Como se emplea en el presente documento, la expresión “más auténtico/a” hace referencia a un elemento que refleja o imita de manera estrecha, ya sea a nivel estructural o funcional, un elemento de tipo salvaje o endógeno. Es decir, un elemento “más auténtico” es más representativo de una función, y/o estructura celulares endógenas, de tipo salvaje, naturales o fisiológicas en comparación con elementos o análogos sintéticos de la técnica anterior, o que tiene un mejor desempeño que el respectivo elemento endógeno, de tipo salvaje, natural o fisiológico en uno o más sentidos. Los ejemplos no limitantes de estructuras de caperuzas 5' más auténticas útiles en los polinucleótidos de la presente divulgación son aquellos que, entre otras cosas, tienen una unión mejorada de proteína de unión a caperuzas, una mayor semivida, una susceptibilidad reducida a las 5'-endonucleasas y/o una menor eliminación de caperuzas 5' en comparación con las estructuras de caperuzas 5' sintéticas conocidas en la técnica (o una estructura de caperuza 5' de tipo salvaje, natural o fisiológica). En algunas realizaciones, la Enzima de formación de Caperuzas del Virus Vaccinia recombinante y la enzima 2'-O-metiltransferasa recombinante pueden crear una conexión 5'-5'-trifosfato canónica entre el nucleótido 5'-terminal de un polinucleótido y un nucleótido de caperuza de guanosina, en donde la guanosina de la caperuza contiene una N7-metilación y el nucleótido de extremo 5' del polinucleótido contiene un 2'-O-metilo. Tal estructura se denomina estructura Cap1. Esta caperuza produce una mayor competencia de traducción, estabilidad celular y una menor activación de las citocinas proinflamatorias celulares, en comparación con, p. ej., otras estructuras análogas de caperuzas 5' conocidas en la técnica. Otros estructuras de caperuza ilustrativas incluyen 7mG(5')ppp(5')N, pN2p (Cap 0), 7mG(5')ppp(5')N1mpNp (Cap 1), 7mG(5')ppp(5')N1mpN2mp (Cap 2) y m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up (Cap 4).

Dado que las caperuzas para los polinucleótidos alternativos pueden formarse después de la transcripción, y dado que este procedimiento es más eficiente, se pueden formar caperuzas en casi 100% de los polinucleótidos alternativos. Esto se diferencia del ~80% cuando un análogo de caperuza se conecta a un polinucleótido en el transcurso de una reacción de transcripción in vitro.

Las caperuzas 5'-terminales pueden incluir caperuzas o análogos de caperuzas endógenos. Una caperuza 5'-terminal puede incluir un análogo de guanosina Los análogos de guanosina útiles incluyen inosina, N1-metilguanosina, 2'-fluoro-guanosina, 7-desaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, ALN-guanosina y 2-azido-guanosina.

En algunos casos, un polinucleótido contiene una caperuza 5' modificada. Una modificación en la caperuza 5' puede aumentar la estabilidad del polinucleótido, aumentar la semivida del polinucleótido y podría aumentar la eficiencia de la traducción del polinucleótido. La caperuza 5' modificada puede incluir, pero sin limitarse a, una o más de las siguientes modificaciones: modificación en la posición 2' y/o 3' de un trifosfato de guanosina (GTP) con caperuza, un remplazo del oxígeno del anillo de azúcar (que produjo el anillo carbocíclico) por un radical metileno (CH2), una modificación en el radical del puente de trifosfato de la estructura de la caperuza, o una modificación en el radical de la nucleobase (G).

5 ’-U T R

Se puede proporcionar una 5'-UTR como una región flanqueante para los polinucleótidos (p. ej., ARNm). Una 5'-UTR puede ser homóloga o heteróloga con respecto a la región codificante que se encuentra en un polinucleótido. Se pueden incluir múltiples 5'-UTR en la región flanqueante y pueden tener secuencias iguales o diferentes. Cualquier parte de las regiones flanqueantes, o incluso ninguna de estas, puede someterse a una optimización de codones y puede contener independientemente una o más alteraciones estructurales o químicas diferentes antes y/o después de la optimización de codones.

En la Tabla 21 de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Núm. 61/775.509 y en la Tabla 21 y la Tabla 22 de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Núm. 61/829.372, se muestra un listado del sitio de inicio y de terminación de polinucleótidos alternativos (p. ej., ARNm). En la Tabla 21, cada 5'-UTR (de la 5'-UTR-005 a la 5'-UTR 68511) se identifica por su sitio de inicio y de terminación con respecto a su transcrito nativo o de tipo salvaje (homólogo) (ENST; el identificador utilizado en la base de datos ENSEMBL).

Para alterar una o más propiedades de un polinucleótido (p. ej., ARNm), se pueden modificar mediante ingeniería genética 5'-UTR que sean heterólogas con respecto a la región codificante de un polinucleótido alternativo (p. ej., ARNm). Los polinucleótidos (p. ej., ARNm) se pueden administrar después a células, tejidos u organismos, y se pueden medir resultados tales como la localización, la semivida y/o el nivel de proteínas, para evaluar los efectos beneficiosos que puede tener la 5'-UTR heteróloga sobre los polinucleótidos alternativos (ARNm). Se pueden utilizar variantes de las 5'-UTR en donde se añaden a, o eliminan de, los extremos uno o más nucleótidos, que incluyen A, T, C o G. Las 5'-UTR también se pueden someter a optimización de codones o alterar de cualquier manera que se describa en el presente documento.

5 -U T R , 3 ’-U T R y e le m e n to s p o te n c ia d o re s de la tra d u cc ió n (T E E )

La 5'-UTR de un polinucleótido (p. ej., ARNm) puede incluir al menos un elemento potenciador de la traducción. El término “elemento potenciador de la traducción” hace referencia a secuencias que aumentan la cantidad de polipéptido o proteína que se producen a partir de un polinucleótido. A modo de ejemplo no limitante, el TEE puede ubicarse entre el promotor de la transcripción y el codón de inicio. Los polinucleótidos (p. ej., ARNm) con al menos un TEE en la 5'-UTR pueden incluir una caperuza en la 5'-UTR. Adicionalmente, al menos un TEE puede ubicarse en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) que experimentan una traducción dependiente de la caperuza o independiente de la caperuza.

En algunos aspectos, los TEE son elementos conservados en la UTR que pueden promover la actividad de traducción de un polinucleótido tal como, pero sin limitarse a, la traducción dependiente de la caperuza o la traducción independiente de la caperuza. La conservación de estas secuencias ha sido mostrada anteriormente por Panek et al. (Nucleic Acids Research, 2013, 1-10) en 14 especies que incluyen seres humanos.

En un ejemplo no limitante, los TEE conocidos pueden encontrarse en el líder 5' de la proteína del homeodominio Gtx (Chappell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004).

En otro ejemplo no limitante, se divulgan TEE en las Publicaciones de Patentes de Estados Unidos Núm.

2009/0226470 y 2013/0177581, las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. WO2009/075886, WO2012/009644 y WO1999/024595, las Patentes de Estados Unidos Núm. 6,310,197 y 6,849,405.

En otro ejemplo no limitante más, el TEE puede ser un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), HCV-IRES o un elemento IRES tal como, pero sin limitarse a, aquellos descritos en la Patente de Estados Unidos Núm. 7.468.275, las Publicaciones de Patente de Estados Unidos Núm. 2007/0048776 y 2011/0124100 y las Publicaciones de Patente Internacionales Núm. WO2007/025008 y WO2001/055369. Los elementos IRES pueden incluir, pero sin limitarse a, las secuencias Gtx (p. ej., Gtx9-nt, Gtx8-nt, Gtx7-nt) descritas por Chappell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) y Zhou et al. (PNAS 102:6273-6278, 2005) y en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos Núm. 2007/0048776 y 2011/0124100 y la Publicación de Patente Internacional Núm. WO2007/025008.

Los “polinucleótidos potenciadores de la traducción” son polinucleótidos que incluyen uno o más de los TEE específicos ilustrados en el presente documento y/o divulgados en la técnica (véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 6,310,197, 6,849,405, 7,456,273, 7,183,395, las Publicaciones de Patente de Estados Unidos Núm. 20090/226470, 2007/0048776, 2011/0124100, 2009/0093049, 2013/0177581, las Publicaciones de Patente Internacionales Núm. WO2009/075886, WO2007/025008, WO2012/009644, WO2001/055371 WO1999/024595 y las Patentes Europeas Núm. 2610341 y 2610340 o sus variantes, homólogos o derivados funcionales. Pueden encontrarse presentes una o múltiples copias de un TEE específico en un polinucleótido (p. ej., ARNm). Los TEE en los polinucleótidos potenciadores de la traducción pueden organizarse en uno o más segmentos de secuencias. Un segmento de secuencia puede albergar uno o más de los TEE específicos que se ilustran en el presente documento, donde cada TEE se encuentra presente en una o más copias. Cuando múltiples segmentos de secuencias se encuentran presentes en un polinucleótido potenciador de la traducción, estos pueden ser homogéneos o heterogéneos. Por lo tanto, los múltiples segmentos de secuencias en un polinucleótido potenciador de la traducción pueden albergar tipos idénticos o diferentes de los TEE específicos que se ilustran en el presente documento, una cantidad idéntica o diferente de copias de cada uno de los TEE específicos, y/o una organización idéntica o diferente de los TEE dentro de cada segmento de secuencia.

Un polinucleótido (p. ej., ARNm) puede incluir al menos un TEE que se describe en las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. WO1999/024595, WO2012/009644, WO2009/075886, WO2007/025008, WO1999/024595, las Publicaciones de Patentes europeas Núm. 2610341 y 2610340, las Patentes de Estados Unidos Núm. 6,310,197, 6,849,405, 7,456,273, 7,183,395, y las Publicaciones de Patentes de Estados Unidos Núm. 2009/0226470, 2011/0124100, 2007/0048776, 2009/0093049 y 2013/0177581. El TEE puede ubicarse en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm).

Un polinucleótido (p. ej., ARNm) puede incluir al menos un TEE que tenga al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de identidad con respecto a los TEE descritos en las Publicaciones de Patentes de Estados Unidos Núm. 2009/0226470, 2007/0048776, 2013/0177581 y 2011/0124100, las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. WO1999/024595, WO2012/009644, WO2009/075886 y WO2007/025008, las Publicaciones de Patentes europeas Núm. 2610341 y 2610340, las Patentes de Estados Unidos Núm. 6,310,197, 6,849,405, 7,456,273, 7,183,395.

La 5'-UTR de un polinucleótido (p. ej., ARNm) puede incluir al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55 o más de 60 secuencias de TEE. Las secuencias de TEE en la 5'-UTR de un polinucleótido (p. ej., ARNm) pueden ser secuencias de TEE iguales o diferentes. Las secuencias de TEE pueden encontrarse en un patrón tal como ABABAB, AABBAABBAABB o ABCABCABC, o variantes del mismo, repetidas una vez, dos veces o más de tres veces. En estos patrones, cada letra, A, B o C representa una secuencia de TEE diferente a nivel de los nucleótidos.

En algunos casos, la 5'-UTR puede incluir un espaciador para separar dos secuencias de TEE. A modo de ejemplo no limitante, el espaciador puede ser un espaciador de 15 nucleótidos y/u otros espaciadores conocidos en la técnica. Como otro ejemplo no limitante la 5'-UTR puede incluir un módulo secuencia de TEE-espaciador repetido al menos una vez, al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o más de 9 veces en la 5'-UTR.

En otros casos, el espaciador que separa dos secuencias de TEE puede incluir otras secuencias conocidas en la técnica que pueden regular la traducción de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente divulgación tal como, pero sin limitarse a, secuencias de miR (p. ej., sitios de unión de miR y semillas de miR). A modo de ejemplo no limitante, cada espaciador utilizado para separar dos secuencias de TEE puede incluir una secuencia de miR o componente de una secuencia de miR (p. ej., secuencia de semilla de miR) diferente.

En algunos casos, el TEE en la 5'-UTR de un polinucleótido (p. ej., ARNm) puede incluir al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o más de 99% de las secuencias de TEE descritas en las Publicaciones de Patentes de Estados Unidos Núm. 2009/0226470, 2007/0048776, 2013/0177581 y 2011/0124100, las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. WO1999/024595, WO2012/009644, WO2009/075886 y WO2007/025008, las Publicaciones de Patentes Europeas Núm.

2610341 y 2610340 y las Patentes de Estados Unidos Núm. 6,310,197, 6,849,405, 7,456,273 y 7,183,395. En otra realización, el TEE en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente divulgación puede incluir un fragmento de 5-30 nucleótidos, un fragmento de 5-25 nucleótidos, un fragmento de 5-20 nucleótidos, un fragmento de 5-15 nucleótidos, un fragmento de 5-10 nucleótidos de las secuencias de TEE divulgadas en las Publicaciones de Patentes de Estados Unidos Núm. 2009/0226470, 2007/0048776, 2013/0177581 y 2011/0124100, las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. WO1999/024595, WO2012/009644, WO2009/075886 y WO2007/025008, las Publicaciones de Patentes Europeas Núm. 2610341 y 2610340, y las Patentes de Estados Unidos Núm. 6,310,197, 6,849,405, 7,456,273 y 7,183,395.

En ciertos casos, el TEE en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente divulgación puede incluir al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o más de 99% de las secuencias de TEE divulgadas por Chappell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) y Zhou et al. (PNAS 102:6273-6278, 2005), en la Tabla complementaria 1 y la Tabla complementaria 2 divulgadas por Wellensiek et al. (Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements, Nature Methods, 2013; Do I:10,1038/NMETH.2522). En otra realización, el TEE en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente divulgación puede incluir un fragmento de 5-30 nucleótidos, un fragmento de 5-25 nucleótidos, un fragmento de 5-20 nucleótidos, un fragmento de 5-15 nucleótidos, un fragmento de 5-10 nucleótidos de las secuencias de TEE divulgadas por Chappell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) y Zhou et al. (PNAS 102:6273-6278, 2005), en la Tabla complementaria 1 y la Tabla complementaria 2 divulgadas por Wellensiek et al. (Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements, Nature Methods, 2013; d O i:10,1038/NMETH.2522).

En algunos casos, el TEE utilizado en la 5'-UTR de un polinucleótido (p. ej., ARNm) es una secuencia de IRES tal como, pero sin limitarse a, aquellas descritas en la Patente de Estados Unidos Núm. 7.468.275 y la Publicación de Patente Internacional Núm. WO2001/055369.

En algunos casos, los TEE utilizados en la 5'-UTR de un polinucleótido (p. ej., ARNm) pueden identificarse mediante los métodos descritos en la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2007/0048776 y 2011/0124100 y las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. WO2007/025008 y WO2012/009644. En algunos casos, los TEE utilizados en la 5'-UTR de un polinucleótido (p. ej., ARNm) de la presente divulgación pueden ser un elemento regulador de la transcripción descrito en las Patentes de Estados Unidos Núm. 7,456,273 y 7,183,395, la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2009/0093049 y la Publicación Internacional Núm. W O2001/055371. Los elementos reguladores de la transcripción pueden identificarse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, los métodos descritos en las Patentes de Estados Unidos Núm. 7,456,273 y 7,183,395, la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm.

2009/0093049 y la Publicación Internacional Núm. W O2001/055371.

En otros casos más, el TEE utilizado en la 5'-UTR de un polinucleótido (p. ej., ARNm) es un polinucleótido o una parte del mismo como se describe en las Patentes de Estados Unidos Núm. 7,456,273 y 7,183,395, la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2009/0093049 y la Publicación Internacional Núm. W O2001/055371.

La 5'-UTR que incluye al menos un TEE descrito en el presente documento puede incorporarse a una secuencia monocistrónica tal como, pero sin limitarse a, un sistema de vector o un vector de polinucleotídico. A modo de ejemplo no limitante, los sistemas de vectores y vectores de polinucleotídicos pueden incluir aquellos descritos en las Patentes de Estados Unidos Núm. 7,456,273 y 7,183,395, las Publicaciones de Patentes de Estados Unidos Núm. 2007/0048776, 2009/0093049 y 2011/0124100, y las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. WO2007/025008 y W O2001/055371.

Los TEE que se describen en el presente documento pueden ubicarse en la 5'-UTR y/o la 3'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm). Los TEE ubicados en la 3'-UTR pueden ser iguales y/o diferentes con respecto a los TEE ubicados en y/o descritos para la incorporación a la 5'-UTR.

En algunos casos, la 3'-UTR de un polinucleótido (p. ej., ARNm) puede incluir al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55 o más de 60 secuencias de TEE. Las secuencias de TEE en la 3'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente divulgación pueden ser secuencias de TEE iguales o diferentes. Las secuencias de TEE pueden encontrarse en un patrón tal como ABABAB, AABBAABBAABB o ABCABCABC, o variantes del mismo, repetidas una vez, dos veces o más de tres veces. En estos patrones, cada letra, A, B o C representa una secuencia de TEE diferente a nivel de los nucleótidos.

En un caso, la 3'-UTR puede incluir un espaciador para separar dos secuencias de TEE. A modo de ejemplo no limitante, el espaciador puede ser un espaciador de 15 nucleótidos y/u otros espaciadores conocidos en la técnica. En otro ejemplo no limitante, la 3'-UTR puede incluir un módulo de secuencia de TEE-espaciador repetido al menos una, al menos dos, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o más de 9 veces en la 3'-UTR.

En otros casos, el espaciador que separa dos secuencias de TEE puede incluir otras secuencias conocidas en la técnica que pueden regular la traducción de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente divulgación tal como, pero sin limitarse a, secuencias de miR que se describen en el presente documento (p. ej., sitios de unión de miR y semillas de miR). A modo de ejemplo no limitante, cada espaciador utilizado para separar dos secuencias de TEE puede incluir una secuencia de miR o componente de una secuencia de miR (p. ej., secuencia de semilla de miR) diferente.

En algunas realizaciones, un polirribonucleótido de la divulgación comprende una secuencia de miR y/o TEE. En algunas realizaciones, la incorporación de una secuencia de miR y/o una secuencia de t E e a un polirribonucleótido de la divulgación puede cambiar la forma de la región de tallo-bucle, lo cual puede aumentar y/o disminuir la traducción. Véase, p. ej., Kedde et al., Nature Cell Biology 2010 12(10): 1014-20).

S e cu e n c ia s de se n so re s y s itio s de un ió n a m ic ro A R N (m iA R N )

Las secuencias de sensores incluyen, por ejemplo, sitios de unión de microARN (miARN), sitios de unión del factor de transcripción, motivos y/o secuencias de ARNm estructurados, sitios de unión artificiales modificados mediante ingeniería genética para que actúen como pseudorrecpetores para moléculas de unión de ácido nucleico de carácter endógeno, y combinaciones de los mismos. Se describen ejemplos no limitantes de secuencias de sensores en la Publicación de Estados Unidos Núm. 2014/0200261.

En algunas realizaciones, un polirribonucleótido (p. ej., un ácido ribonucleico (ARN), p. ej., un ARN mensajero (ARNm)) de la divulgación que comprende un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipéptido comprende adicionalmente una secuencia de sensor. En algunas realizaciones, la secuencia de sensor es un sitio de unión de miARN.

Un miARN es un ARN no codificante de 19-25 nucleótidos de longitud que se une a un polirribonucleótido y regula por disminución la expresión génica mediante la reducción de la estabilidad o mediante la inhibición de la traducción del polirribonucleótido. Una secuencia de miARN comprende una región “semilla”, es decir, una secuencia en la región de las posiciones 2-8 del miARN maduro. Una semilla de miARN puede comprender las posiciones 2-8 o 2-7 del miARN maduro. En algunas realizaciones, una semilla de miARN puede comprender 7 nucleótidos (p. ej., los nucleótidos 2-8 del miARN maduro), en donde el sitio complementario de la semilla en el sitio de unión de miARN correspondiente está flanqueado por una adenosina (A) opuesta a la posición 1 del miARN. En algunas realizaciones, una semilla de miARN puede comprender 6 nucleótidos (p. ej., los nucleótidos 2-7 del miARN maduro), en donde el sitio complementario de la semilla en el sitio de unión a miARN correspondiente está flanqueado por una adenosina (A) opuesta a la posición 1 del miARN. Véase, por ejemplo, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 6 de jul. de 2007;27(1):91-105. La elaboración de perfiles de miARN de las células o los tejidos diana puede llevarse a cabo para determinar la presencia o ausencia de miARN en las células o los tejidos. En algunas realizaciones, un polirribonucleótido (p. ej., un ácido ribonucleico (ARN), p. ej., un ARN mensajero (ARNm)) de la divulgación comprende una o más secuencias diana de microARN, secuencias de microARN o semillas de microARN. Tales secuencias pueden corresponder a cualquier microARN conocido tal como los que se indican en la Publicación de Estados Unidos US2005/0261218 y la Publicación de Estados Unidos US2005/0059005.

Como se emplea en el presente documento, la expresión “sitio de unión de microARN (miARN o miR)” hace referencia a una secuencia dentro de un polirribonucleótido, p. ej., dentro de un ADN o dentro de un transcrito de ARN, incluyendo en la 5'-UTR y/o 3'-UTR, que tiene una complementariedad suficiente con respecto a la totalidad o una región de un miARN para interactuar con, asociarse a o unirse al miARN. En algunas realizaciones, un polirribonucleótido de la divulgación que comprende un ORF que codifica un polipéptido comprende adicionalmente un sitio de unión de miARN. En realizaciones ilustrativas, una 5'-UTR y/o 3'-UTR del polirribonucleótido (p. ej., un ácido ribonucleico (ARN), p. ej., un ARN mensajero (ARNm)) comprende un sitio de unión de miARN.

Un sitio de unión de miARN con complementariedad suficiente con respecto a un miARN hace referencia a un grado de complementariedad suficiente para facilitar la regulación mediada por miARN de un polirribonucleótido, p. ej., represión de la traducción o degradación del polirribonucleótido mediadas por miARN. En aspectos ilustrativos de la divulgación, un sitio de unión de miARN con complementariedad suficiente con respecto al miARN hace referencia a un grado de complementariedad suficiente para facilitar la degradación mediada por miARN del polirribonucleótido, p. ej., escisión de ARNm mediada por el complejo de silenciamiento inducido por ARN guiado por miARN (RISC). El sitio de unión de miARN puede tener complementariedad, por ejemplo, con una secuencia de miARN de 19-25 nucleótidos, con una secuencia de miARN de 19-23 nucleótidos o con una secuencia de miARN de 22 nucleótidos. Un sitio de unión de miARN puede ser complementario solamente con una parte de un miARN, p. ej., con una parte de menos de 1, 2, 3 o 4 nucleótidos de la longitud completa de una secuencia de miARN de origen natural. La complementariedad total o completa (p. ej., complementariedad total o complementariedad completa en la totalidad o una parte significativa de la longitud de un miARN de origen natural) se prefiere cuando la regulación deseada es la degradación de ARNm.

En algunas realizaciones, un sitio de unión de miARN incluye una secuencia que tiene complementariedad (p. ej., complementariedad parcial o completa) con una secuencia semilla de miARN. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN incluye una secuencia que tiene complementariedad completa con una secuencia semilla de miARN. En algunas realizaciones, un sitio de unión de miARN incluye una secuencia que tiene complementariedad (p. ej., complementariedad parcial o completa) con una secuencia de miARN. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN incluye una secuencia que tiene complementariedad completa con una secuencia de miARN. En algunas realizaciones, un sitio de unión de miARN tiene complementariedad completa con una secuencia de miARN, pero con 1 ,2 o 3 sustituciones, adiciones terminales y/o truncamientos de nucleótidos.

En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN tiene la misma longitud que el miARN correspondiente. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce nucleótidos menos que el miARN correspondiente en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. En otras realizaciones más, el sitio de unión de microARN tiene dos nucleótidos menos que el microARN correspondiente en el extremo 5', el extremo 3', o ambos. Los sitios de unión de miARN que son más cortos que los miARN correspondientes siguen siendo capaces de degradar el ARNm con la incorporación de uno o más de los sitios de unión de miARN o evitar la traducción del ARNm.

En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN se une al miARN maduro correspondiente que es parte de un RISC activo que contiene Dicer. En otra realización, la unión del sitio de unión de miARN con el miARN correspondiente en el RISC degrada el ARNm que contiene el sitio de unión de miARN o impide que se traduzca el ARNm. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN tiene una complementariedad suficiente con respecto al miARN de forma tal que un complejo RISC que comprende el miARN escinde el polirribonucleótido que comprende el sitio de unión de miARN. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN tiene una complementariedad imperfecta de forma tal que un complejo RISC que comprende el miARN induce la inestabilidad en el polirribonucleótido que comprende el sitio de unión de miARN. En otra realización, el sitio de unión de miARN tiene una complementariedad imperfecta de forma tal que un complejo RISC que comprende el miARN reprime la transcripción del polirribonucleótido que comprende el sitio de unión de miARN.

En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce emparejamientos erróneos con respecto al miARN correspondiente.

En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN tiene al menos aproximadamente diez, al menos aproximadamente once, al menos aproximadamente doce, al menos aproximadamente trece, al menos aproximadamente catorce, al menos aproximadamente quince, al menos aproximadamente dieciséis, al menos aproximadamente diecisiete, al menos aproximadamente dieciocho, al menos aproximadamente diecinueve, al menos aproximadamente veinte o al menos aproximadamente veintiún nucleótidos contiguos complementarios con respecto a al menos aproximadamente diez, al menos aproximadamente once, al menos aproximadamente doce, al menos aproximadamente trece, al menos aproximadamente catorce, al menos aproximadamente quince, al menos aproximadamente dieciséis, al menos aproximadamente diecisiete, al menos aproximadamente dieciocho, al menos aproximadamente diecinueve, al menos aproximadamente veinte o al menos aproximadamente veintiún nucleótidos contiguos, respectivamente, del miARN correspondiente.

Mediante la modificación genética de uno o más sitios de unión de miARN en un polirribonucleótido de la divulgación, se puede seleccionar el polirribonucleótido como diana para la degradación o reducción de la traducción, siempre y cuanto esté disponible el miARN en cuestión. Esto puede reducir los efectos inespecíficos a partir del suministro del polirribonucleótido. En algunas realizaciones, si no se pretende suministrar un polirribonucleótido de la divulgación a un tejido o una célula, pero este termina allí, un miARN abundante en el tejido o la célula puede inhibir la expresión del gen de interés si uno o múltiples sitios de unión del miARN se modifican genéticamente en la 5'UTR y/o 3'UTR del polinucleótido.

Por el contrario, los sitios de unión de miARN se pueden eliminar de secuencias de polirribonucleótidos en las que aparecen de manera natural con el fin de aumentar la expresión de proteínas en tejidos específicos. En algunas realizaciones, un sitio de unión para un miARN específico se puede eliminar de un polirribonucleótido para mejorar la expresión de proteínas en tejidos o células que contengan el miARN.

En algunas realizaciones, un polirribonucleótido de la divulgación puede incluir al menos un sitio de unión de miARN en la 5'UTR y/o 3'UTR con el fin de dirigir agentes terapéuticos de ARNm citotóxicos o citoprotectores a células específicas tales como, pero sin limitarse a, células normales y/o cancerosas. En otra realización, un polirribonucleótido de la divulgación puede incluir dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más sitios de unión de miARN en la 5'-UTR y/o 3'-UTR con el fin de dirigir agentes terapéuticos de ARNm citotóxicos o citoprotectores a células específicas tales como, pero sin limitarse a, células normales y/o cancerosas. La regulación de la expresión en múltiples tejidos puede lograrse a través de la introducción o eliminación de uno o más sitios de unión de miARN. La decisión de eliminar o insertar un sitio de unión de miARN puede tomarse en función de patrones de expresión de miARN y/o sus perfiles en enfermedades. Se ha indicado la identificación de miARN, sitios de unión de miARN, y sus patrones de expresión y función en la biología (p. ej., Bonauer et al., Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand y Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras y Rao Leukemia 201226:404-413 (20 de dic. de 2011 doi: 10,1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf et al, Cell, 2007 129:1401-1414; Gentner y Naldini, Tissue Antigens. 201280:393-403). Los miARN y sitios de unión de miARN pueden corresponder a cualquier secuencia conocida, incluyendo ejemplos no limitantes descritos en las Publicaciones de Estados Unidos Núm. 2014/0200261, 2005/0261218, y 2005/0059005.

Los ejemplos de tejidos donde se sabe que el miARN regula el ARNm y, por lo tanto, la expresión de proteínas, incluyen, pero sin limitarse a, hígado (miR-122), músculo (miR-133, miR-206, miR-208), células endoteliales (miR-17-92, miR-126), las células mieloides (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), tejido adiposo (let-7, miR-30c), corazón (miR-1d, miR-149), riñón (miR-192, miR-194, miR-204) y células epiteliales pulmonares (let-7, miR-133, miR-126).

Específicamente, se sabe que los miARN se expresan de manera diferencial en las células inmunitarias (también denominadas células hematopoyéticas), tales como las células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) (p. ej., células dendríticas y macrófagos), macrófagos, monocitos, linfocitos B, linfocitos T, granulocitos, células asesinas naturales, etc. Los miARN específicos de células inmunitarias están involucrados en la inmunogenicidad, la autoinmunidad, la respuesta inmunitaria a infecciones, inflamación, así como la respuesta inmunitaria no deseada después de la terapia génica y el trasplante de tejidos/órganos. Los miARN específicos de células inmunitarias también regulan muchos aspectos de desarrollo, proliferación, diferenciación y apoptosis de células hematopoyéticas (células inmunitarias). En algunas realizaciones, miR-142 y miR-146 se expresan exclusivamente en células inmunitarias, particularmente abundantes en células dendríticas mieloides. Se ha demostrado que la respuesta inmunitaria a un polirribonucleótido se puede cortar añadiendo sitios de unión de miR-142 a la 3'-UTR del polirribonucleótido, permitiendo una transferencia génica más estable en tejidos y células. miR-142 degrada de forma eficaz los polirribonucleótidos exógenos en células presentadoras de antígeno y suprime la eliminación citotóxica de células transducidas (p. ej., Annoni A et al., Blood, 2009, 114, 5152-5161; Brown BD, et al., Nat Med. 2006, 12(5), 585-591; Brown BD, et al., Blood, 2007, 110(13): 4144-4152).

Una respuesta inmunitaria mediada por antígenos puede hacer referencia a una respuesta inmunitaria desencadenada por antígenos foráneos que, al entrar en el organismo, son procesados por las células presentadoras de antígenos y se muestran en la superficie de las células presentadoras de antígenos. Las células T pueden reconocer el antígeno presentado e inducir una eliminación citotóxica de células que expresan el antígeno.

La introducción de un sitio de unión de miR-142 en la 5'UTR y/o 3'UTR de un polirribonucleótido de la divulgación puede reprimir de manera selectiva la expresión génica en células presentadoras de antígeno a través de la degradación mediada por miR-142, limitando la presentación de antígenos en células presentadoras de antígenos (p. ej., células dendríticas), y evitando de ese modo la respuesta inmunitaria mediada por antígenos después del suministro del polirribonucleótido. A continuación, el polirribonucleótido se expresa de manera estable en tejidos o células diana sin desencadenar una eliminación citotóxica.

En algunas realizaciones, los sitios de unión para los miARN que se sabe que se expresan en células inmunitarias, en particular, células presentadoras de antígenos, pueden modificarse genéticamente en un polirribonucleótido de la divulgación para suprimir la expresión del polirribonucleótido en células presentadoras de antígenos a través de la degradación de ARN mediada por miARN, lo cual atenúa la respuesta inmunitaria mediada por antígenos. La expresión del polirribonucleótido se mantiene en células no inmunitarias donde no se expresan los miARN específicos de las células inmunitarias. En algunas realizaciones, para prevenir una reacción inmunogénica contra una proteína específica del hígado, se puede eliminar cualquier sitio de unión a miR-122 y se puede modificar genéticamente un sitio de unión de miR-142 (y/o m irR-l46) en la 5'UTR y/o 3'UTR de un polirribonucleótido de la divulgación.

Para impulsar de manera adicional la degradación y supresión selectivas en las APC y los macrófagos, un polirribonucleótido de la divulgación puede incluir un elemento regulador negativo adicional en la 5'UTR y/o 3'UTR, ya sea solo o combinado con sitios de unión de miR-142 y/o miR-146. A modo de ejemplo no limitante, el elemento regulador negativo adicional es un elemento de disgregación de carácter constitutivo (CDE, por sus siglas en inglés).

Los miARN específicos de células inmunitarias incluyen, pero sin limitarse a, hsa-let-7a-2-3p, hsa-let-7a-3p, hsa-7a-5p, hsa-let-7c, hsa-let-7e-3p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7g-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-3p, hsa-let-7i-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-1184, hsa-let-7f-1--3p, hsa-let-7f-2--5p, hsa-let-7f-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p, miR-1279, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-132-3p, miR-132-5p, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-146a-3p, miR-146a-5p, miR-146b-3p, miR-146b-5p, miR-147a, miR-147b, miR-148a-5p, miR-148a-3p, miR-150-3p, miR-150-5p, miR-151b, miR-155-3p, miR-155-5p, miR-15a-3p, miR-15a-5p, miR-15b-5p, miR-15b-3p, miR-16-1-3p, miR-16-2-3p, miR-16-5p, miR-17-5p, miR-181a-3p, miR-181a-5p, miR-181a-2-3p, miR-182-3p, miR-182-5p, miR-197-3p, miR-197-5p, miR-21-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-223-3p, miR-223-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-23b-3p, miR-23b-5p, miR-24-1-5p,miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-26a-1-3p, miR-26a-2-3p, miR-26a-5p, miR-26b-3p, miR-26b-5p, miR-27a-3p, miR-27a-5p, miR-27b-3p,miR-27b-5p, miR-28-3p, miR-28-5p, miR-2909, miR-29a-3p, miR-29a-5p, miR-29b-1-5p, miR-29b-2-5p, miR-29c-3p, miR-29c-5p„ miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-331-5p, miR-339-3p, miR-339-5p, miR-345-3p, miR-345-5p, miR-346, miR-34a-3p, miR-34a-5p, miR-363-3p, miR-363-5p, miR-372, miR-377-3p, miR-377-5p, miR-493-3p, miR-493-5p, miR-542, miR-548b-5p, miR548c-5p, miR-548i, miR-548j, miR-548n, miR-574-3p, miR-598, miR-718, miR-935, miR-99a-3p, miR-99a-5p, miR-99b-3p y miR-99b-5p. Además, se pueden identificar miARN novedosos en células inmunitarias a través del análisis de micrótomo e hibridación de micromatrices (p. ej., Jima DD et al, Blood, 2010, 116:e118-e127; Vaz C et al., BMC Genomics, 2010, 11,288).

Los miARN que se sabe que se expresan en el hígado incluyen, pero sin limitarse a, miR-107, miR-122-3p, miR-122-5p, miR-1228-3p, miR-1228-5p, miR-1249, miR-129-5p, miR-1303, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-152, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-3p, miR-199b-5p, miR-296-5p, miR-557, miR-581, miR-939-3p, y miR-939-5p. Los sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico de hígado se pueden introducir o eliminar de un polirribonucleótido de la divulgación para regular la expresión del polirribonucleótido en el hígado. Los sitios de unión de miARN específicos del hígado se pueden modificar genéticamente solos o de manera adicional combinados con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polirribonucleótido de la divulgación.

Los miARN que se sabe que se expresan en el pulmón incluyen, pero sin limitarse a, let-7a-2-3p, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-127-3p, miR-127-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-130b-3p, miR-130b-5p, miR-133a, miR-133b, miR-134, miR-18a-3p, miR-18a-5p, miR-18b-3p, miR-18b-5p, miR-24-1-5p, miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-296-3p, miR-296-5p, miR-32-3p, miR-337-3p, miR-337-5p, miR-381-3p y miR-381-5p. Los sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico de los pulmones pueden introducirse en, o eliminarse de, un polirribonucleótido de la divulgación para regular la expresión del polirribonucleótido en el pulmón. Los sitios de unión de miARN específicos del pulmón se pueden modificar genéticamente solos o de manera adicional combinados con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polirribonucleótido de la divulgación.

Los miARN que se sabe que se expresan en el corazón incluyen, pero sin limitarse a, miR-1, miR-133a, miR-133b, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-186-3p, miR-186-5p, mi-R208a, miR-208b, miR-210, miR-296-3p, miR-320, miR-451a, miR-451b, miR-499a-3p, miR-499a-5p, miR-499b-3p, miR-499b-5p, miR-744-3p, miR-744-5p, miR-92b-3p y miR-92b-5p. Los sitios de unión de miARN de cualquier microARN específico del corazón pueden introducirse en, o eliminarse de, un polirribonucleótido de la divulgación para regular la expresión del polirribonucleótido en el corazón. Los sitios de unión de miARN específicos del corazón se pueden modificar genéticamente solos o de manera adicional combinados con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polirribonucleótido de la divulgación.

Los miARN que se sabe que se expresan en el sistema nervioso incluyen, pero sin limitarse a, miR-124-5p, miR-125a-3p, miR-125a-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p, miR-1271-3p, miR-1271-5p, miR-128, miR-132-5p, miR-135a-3p, miR-135a-5p, miR-135b-3p, miR-135b-5p, miR-137, miR-139-5p, miR-139-3p, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-153, miR-181c-3p, miR-181c-5p, miR-183-3p, miR-183-5p, miR-190a, miR-190b, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-23a-3p, miR-23a-5p,miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR-30c-5p, miR-30d-3p, miR-30d-5p, miR-329, miR-342-3p, miR-3665, miR-3666, miR-380-3p, miR-380-5p, miR-383, miR-410, miR-425-3p, miR-425-5p, miR-454-3p, miR-454-5p, miR-483, miR-510, miR-516a-3p, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-571, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-7-5p, miR-802, miR-922, miR-9-3p y miR-9-5p. Los miARN que enriquecen el sistema nervioso incluyen adicionalmente aquellos que se expresan específicamente en las neuronas, que incluyen, pero sin limitarse a, miR-132-3p, miR-132-3p, miR-148b-3p, miR-148b-5p, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-320b, miR-320e, miR-323a-3p, miR-323a-5p, miR-324-5p, miR-325, miR-326, miR-328, miR-922 y aquellos que se expresan específicamente en las células gliales, que incluyen, pero sin limitarse a, miR-1250, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-219-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-3065-3p, miR-3065-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-338-5p y miR-657. Los sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico del SNC pueden introducirse en, o eliminarse de, un polirribonucleótido de la divulgación para regular la expresión del polinucleótido en el sistema nervioso. Los sitios de unión de miARN específicos del sistema nervioso se pueden modificar genéticamente solos o de manera adicional combinados con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polirribonucleótido de la divulgación.

Los miARN que se sabe que se expresan en el páncreas incluyen, pero sin limitarse a, miR-105-3p, miR-105-5p, miR-184, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-196a-3p, miR-196a-5p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-30a-3p, miR-33a-3p, miR-33a-5p, miR-375, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-493-3p, miR-493-5p y miR-944. Los sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico del páncreas pueden introducirse en, o eliminarse de, un polirribonucleótido de la divulgación para regular la expresión del polirribonucleótido en el páncreas. Los sitios de unión de miARN específicos del páncreas se pueden modificar genéticamente solos o de manera adicional combinados con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polirribonucleótido de la divulgación.

Los miARN que se sabe se expresan en el riñón incluyen, pero sin limitarse a, miR-122-3p, miR-145-5p, miR-17-5p, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-204-3p, miR-204-5p, miR-210, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-296-3p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR30c-5p, miR-324-3p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-363-3p, miR-363-5p y miR-562. Los sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico del riñón pueden introducirse en, o eliminarse de, un polirribonucleótido de la divulgación para regular la expresión del polirribonucleótido en el riñón. Los sitios de unión de miARN específicos del riñón se pueden modificar genéticamente solos o de manera adicional combinados con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polirribonucleótido de la divulgación.

Los miARN que se sabe se expresan en el músculo incluyen, pero sin limitarse a, let-7g-3p, let-7g-5p, miR-1, miR-1286, miR-133a, miR-133b, miR-140-3p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-188-3p, miR-188-5p, miR-206, miR-208a, miR-208b, miR-25-3p, y miR-25-5p. Los sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico del músculo pueden introducirse en, o eliminarse de, un polirribonucleótido de la divulgación para regular la expresión del polirribonucleótido en el músculo. Los sitios de unión de miARN específicos de músculo se pueden modificar genéticamente solos o de manera adicional combinados con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (p. ej., APC) en un polirribonucleótido de la divulgación.

Los miARN también se expresan de manera diferencial en diferentes tipos de células, tales como, pero sin limitarse a, células endoteliales, células epiteliales y adipocitos.

Los miARN que se sabe se expresan en las células endoteliales incluyen, pero sin limitarse a, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-100-3p, miR-100-5p, miR-101-3p, miR-101-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-1236-3p, miR-1236-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a-3p, miR-18a-5p, miR-19a-3p, miR-19a-5p, miR-19b-1-5p, miR-19b-2-5p, miR-19b-3p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-217, miR-210, miR-21-3p, miR-21-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p, miR-222-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-296-5p, miR-361-3p, miR-361-5p, miR-421, miR-424-3p, miR-424-5p, miR-513a-5p, miR-92a-1-5p, miR-92a-2-5p, miR-92a-3p, miR-92b-3p y miR-92b-5p. Muchos miARN novedosos se descubren en células endoteliales a partir de un análisis de secuenciación profunda (p. ej., Voellenkle C et al., RNA, 2012, 18, 472-484). Los sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico de las células endoteliales pueden introducirse en, o eliminarse de, un polirribonucleótido de la divulgación para regular la expresión del polirribonucleótido en las células endoteliales.

Los miARN que se sabe se expresan en células epiteliales incluyen, pero sin limitarse a, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-1246, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-338-3p, miR-429, miR-451a, miR-451b, miR-494, miR-802 y miR-34a, miR-34b-5p, miR-34c-5p, miR-449a, miR-449b-3p, miR-449b-5p específicos en células epiteliales ciliadas respiratorias, la familia let-7, miR-133a, miR-133b, miR-126 específicos en células epiteliales pulmonares, miR-382-3p, miR-382-5p específicos en células epiteliales renales y miR-762 específicos en células epiteliales corneales. Los sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico de las células epiteliales pueden introducirse en, o eliminarse de, un polirribonucleótido de la divulgación para regular la expresión del polirribonucleótido en las células epiteliales.

Además, las células madre embrionarias están enriquecidas por un gran grupo de miARN, controlando la autorrenovación de células madre, así como el desarrollo y/o la diferenciación de diversos linajes celulares, tales como células neurales, cardíacas, células hematopoyéticas, células de la piel, células osteogénicas y células musculares (p. ej., Kuppusamy KT et al., Curr. Mol Med, 2013, 13(5), 757-764; Vidigal JA y Ventura A, Semin Cancer Biol. 2012, 22(5-6), 428-436; Goff LA et al., PLoS One, 2009, 4:e7192; Morin RD et al., Genome Res,2008,18, 610-621; Yoo JK et al., Stem Cells Dev. 2012, 21(11), 2049-2057). Los miARN abundantes en células madre embrionarias incluyen, pero sin limitarse a, let-7a-2-3p, let-a-3p, let-7a-5p, let7d-3p, let-7d-5p, miR-103a-2-3p, miR-103a-5p, miR-106b-3p, miR-106b-5p, miR-1246, miR-1275, miR-138-1-3p, miR-138-2-3p, miR-138-5p, miR-154-3p, miR-154-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-290, miR-301a-3p, miR-301a-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-302b-3p, miR-302b-5p, miR-302c-3p, miR-302c-5p, miR-302d-3p, miR-302d-5p, miR-302e, miR-367-3p, miR-367-5p, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-370, miR-371, miR-373, miR-380-5p, miR-423-3p, miR-423-5p, miR-486-5p, miR-520c-3p, miR-548e, miR-548f, miR-548g-3p, miR-548g-5p, miR-548i, miR-548k, miR-548l, miR-548m, miR-548n, miR-548o-3p, miR-548o-5p, miR-548p, miR-664a-3p, miR-664a-5p, miR-664b-3p, miR-664b-5p, miR-766-3p, miR-766-5p, miR-885-3p, miR-885-5p,miR-93-3p, miR-93-5p, miR-941, miR-96-3p, miR-96-5p, miR-99b-3p y miR-99b-5p. Muchos miARN novedosos previstos se descubren mediante secuenciación profunda en células madre embrionarias humanas (p. ej., Morin RD et al., Genome Res, 2008,18, 610-621; Goff LA et al., PLoS One, 2009, 4:e7192; Bar M et al., Stem cells, 2008, 26, 2496 2505).

En algunas realizaciones, los sitios de unión de miARN específicos de células madre embrionarias pueden incluirse en, o eliminarse de, la 3'UTR de un polirribonucleótido de la divulgación para modular el desarrollo y/o la diferenciación de células madre embrionarias, para inhibir la senescencia de células madre en una afección degenerativa (p. ej., enfermedades degenerativas), o para estimular la senescencia y apoptosis de células madre en un estado patológico (p. ej., células madre cancerosas).

Muchos estudios de expresión de miARN se llevan a cabo para elaborar perfiles de la expresión diferencial de miARN en diversas células/tejidos de carácter canceroso y otras enfermedades. Algunos miARN se expresan de manera anormalmente alta en determinadas células cancerosas y otros están infraexpresados. En algunas realizaciones, los miARN se expresan de forma diferencial en células cancerosas (documentos WO2008/154098, US2013/0059015, US2013/0042333, W O2011/157294); células madre cancerosas (documento US2012/0053224); cánceres y enfermedades pancreáticas (documentos US2009/0131348, US2011/0171646, US2010/0286232, US8389210); asma e inflamación (documento US8415096); cáncer de próstata (documento US2013/0053264); carcinoma hepatocelular (documentos WO2012/151212, US2012/0329672, WO2008/054828, US8252538); células de cáncer de pulmón (documentos W O2011/076143, WO2013/033640, WO2009/070653, US2010/0323357); linfoma de células T cutáneas (documento W O2013/011378); células de cáncer colorrectal (documentos WO2011/0281756, WO2011/076142); ganglios linfáticos positivos para el cáncer (documentos WO2009/100430, US2009/0263803); carcinoma nasofaríngeo (documento EP2112235); enfermedad pulmonar obstructiva crónica (documentos US2012/0264626, US2013/0053263); cáncer de tiroides (documento WO2013/066678); células de cáncer de ovario (documentos US2012/0309645, WO2011/095623); células de cáncer de mama (documentos WO2008/154098, WO2007/081740, US2012/0214699), leucemia y linfoma (documentos WO2008/073915, US2009/0092974, US2012/0316081, US2012/0283310, WO2010/018563).

A modo de ejemplo no limitante, los sitios de unión de miARN para los miARN que se sobreexpresan en determinadas células cancerosas y/o tumorales pueden eliminarse de la 3'UTR de un polirribonucleótido de la divulgación, lo cual restaura la expresión suprimida por los miARN sobreexpresados en células cancerosas, mejorando así la función biológica correspondiente, por ejemplo, la estimulación y/o represión de la transcripción, detención del ciclo celular, apoptosis y muerte celular. Las células y los tejidos normales, en donde la expresión de miARN no se regula por incremento, permanecerán no afectados.

Los miARN también pueden regular procedimientos biológicos complejos tales como la angiogénesis (p. ej., miR-132) (Anand y Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176). En los polirribonucleótidos de la divulgación, se pueden eliminar o introducir sitios de unión de miARN que están involucrados en tales procedimientos, con el fin de adaptar la expresión de los polirribonucleótidos a tipos de células biológicamente relevantes o procedimientos biológicos relevantes. En este contexto, los polirribonucleótidos de la divulgación se definen como polirribonucleótidos auxotróficos.

T a llos -bu c le s

Los polinucleótidos (p. ej., ARNm) pueden incluir un tallo-bucle tal como, pero sin limitarse a, un tallo-bucle de histona. El tallo-bucle puede ser una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 25 o aproximadamente 26 nucleótidos de longitud tal como, pero sin limitarse a, aquellas descritas en la Publicación de Patente Internacional Núm. WO2013/103659. El tallo-bucle de histona puede encontrarse en una ubicación 3' con respecto a la región codificante (p. ej., en el extremo 3' de la región codificante). A modo de ejemplo no limitante, el tallo-bucle puede ubicarse en el extremo 3' de un polinucleótido que se describe en el presente documento. En algunos casos, un polinucleótido (p. ej., un ARNm) incluye más de un tallo-bucle (p. ej., dos tallos/bucles). Se describen ejemplos de secuencias de tallos/bucles en las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. WO2012/019780 y WO201502667. En algunos casos, un polinucleótido incluye la secuencia de tallo-bucle CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA (SEQ ID NO: 1). En otros, un polinucleótido incluye la secuencia de tallo-bucle CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA (SEQ ID NO: 2).

Un tallo-bucle puede ubicarse en una segunda región terminal de un polinucleótido. A modo de ejemplo no limitante, el tallo-bucle puede ubicarse dentro de una región no traducida (p. ej., 3'-UTR) en una segunda región terminal.

En algunos casos, un polinucleótido tal como, pero sin limitarse a, ARNm, que incluye el tallo-bucle de histona puede estabilizarse mediante la adición de una región de estabilización 3' (p. ej., una región de estabilización 3' que incluye al menos un nucleósido de terminación de la cadena) Sin intención de someterse a limitaciones de carácter teórico, la adición de al menos un nucleósido de terminación de la cadena puede ralentizar la degradación de un polinucleótido y, por lo tanto, puede aumentar la semivida del polinucleótido.

En otros casos, un polinucleótido tal como, pero sin limitarse a, ARNm, que incluye el tallo-bucle de histona puede estabilizarse mediante una alteración de la región 3' del polinucleótido que puede impedir y/o inhibir la adición de oligo(U) (véase, p. ej., la Publicación de Patente Internacional Núm. WO2013/103659).

En otros casos más, un polinucleótido tal como, pero sin limitarse a, ARNm, que incluye el tallo-bucle de histona puede estabilizarse mediante la adición de un oligonucleótido que termina en un 3'-desoxinucleósido, 2',3'-didesoxinucleósido 3'-O-metilnucleósidos, 3'-O-etilnucleósidos, 3'-arabinósidos, y otros nucleósidos alternativos conocidos en la técnica y/o que se describen en el presente documento.

En algunos casos, los polinucleótidos de la presente divulgación pueden incluir un tallo-bucle de histona, una región poli-A y/o una estructura de caperuza 5'. El tallo-bucle de histona puede estar antes y/o después de la región poli-A. Los polinucleótidos que incluyen el tallo-bucle de histona y una secuencia de la región poli-A pueden incluir un nucleósido de terminación de la cadena que se describe en el presente documento.

En otros casos, los polinucleótidos de la presente divulgación pueden incluir un tallo-bucle de histona y una estructura de caperuza 5'. La estructura de caperuza 5' puede incluir, pero sin limitarse a, aquellas que se describen en el presente documento y/o que se conocen en la técnica.

En algunos casos, la región de tallo-bucle conservada puede incluir una secuencia de miR descrita en el presente documento. A modo de ejemplo no limitante, la región de tallo-bucle puede incluir la secuencia semilla de una secuencia de miR que se describe en el presente documento. En otro ejemplo no limitante, la región de tallo-bucle puede incluir una secuencia de semilla de miR-122.

En ciertos casos, la región de tallo-bucle conservada puede incluir una secuencia de miR descrita en el presente documento y también puede incluir una secuencia de TEE.

En algunos casos, la incorporación de una secuencia de miR y/o una secuencia de TEE cambia la forma de la región de tallo-bucle, lo cual puede aumentar y/o disminuir la traducción. (Véase, p. ej., Kedde et al. A Pumilioinduced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility. Nature Cell Biology.

2010).

Los polinucleótidos pueden incluir al menos un tallo-bucle de histona y una región poli-A o señal de poliadenilación. Los ejemplos no limitantes de secuencias de polinucleótidos que codifican al menos un tallobucle de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación se describen en las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. WO2013/120497, WO2013/120629, WO2013/120500, WO2013/120627, WO2013/120498, WO2013/120626, WO2013/120499 y WO2013/120628. En ciertos casos, el polinucleótido que codifica un tallo-bucle de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación puede codificar un antígeno patogénico o fragmento del mismo tal como las secuencias de polinucleótidos que se describen en las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. WO2013/120499 y WO2013/120628. En otros casos, el polinucleótido que codifica un tallo-bucle de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación puede codificar una proteína terapéutica tal como las secuencias de polinucleótidos que se describen en las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. W O2013/120497 y WO2013/120629. En algunos casos, el polinucleótido que codifica un tallo-bucle de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación puede codificar un antígeno tumoral o fragmento del mismo tal como las secuencias de polinucleótidos que se describen en las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. WO2013/120500 y WO2013/120627. En otros casos, el polinucleótido que codifica un tallo-bucle de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación puede codificar un antígeno alergénico o un autoantígeno autoinmunitario tal como las secuencias de polinucleótidos que se describen en las Publicaciones de Patentes Internacionales Núm. WO2013/120498 y WO2013/120626.

R e g io n e s po li-A

Un polinucleótido o ácido nucleico (p. ej., un ARNm) pueden incluir una secuencia poliA y/o señal de poliadenilación. Una secuencia poliA puede estar compuesta en su totalidad o en su mayoría por nucleótidos de adenina o análogos o derivados de los mismos. Una secuencia poliA puede ser una cola en una ubicación adyacente a una región no traducida 3' de un ácido nucleico.

Durante el procesamiento de ARN, se añade normalmente una cadena larga de nucleótidos de adenosina (región poli-A) a moléculas de ARN mensajero (ARNm) para aumentar la estabilidad de la molécula. Inmediatamente después de la transcripción, el extremo 3' del transcrito se escinde para liberar un 3'-hidroxi. A continuación, una polimerasa de poli-A añade una cadena de nucleótidos de adenosina al ARN. El proceso, llamado poliadenilación, añade una región poli-A que tiene entre 100 y 250 restos de longitud.

Las longitudes de la región poli-A particulares pueden proporcionar determinadas ventajas a los polinucleótidos alternativos de la presente divulgación.

Por lo general, la longitud de una región poli-A de la presente divulgación tiene al menos 30 nucleótidos de longitud. En otra realización, la región poli-A es de al menos 35 nucleótidos de longitud. En otra realización, la longitud es de al menos 40 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 45 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 55 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 60 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 70 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 80 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 90 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 100 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 120 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 140 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 160 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 180 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 200 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 250 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 300 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 350 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 400 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 450 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 500 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 600 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 700 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 800 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 900 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1000 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1100 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1200 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1300 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1400 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1500 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1600 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1700 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1800 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1900 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 2000 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 2500 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 3000 nucleótidos.

En algunos casos, la región poli-A puede tener una longitud de 80 nucleótidos, 120 nucleótidos, 160 nucleótidos en una molécula de polinucleótido alternativa descrita en el presente documento.

En otros casos, la región poli-A puede tener una longitud de 20, 40, 80, 100, 120, 140 o 160 nucleótidos en una molécula de polinucleótido alternativa descrita en el presente documento.

En algunos casos, la región poli-A se diseña con respecto a la longitud del polinucleótido alternativo general. Este diseño puede basarse en la longitud de la región codificante del polinucleótido alternativo, la longitud de un elemento o una región particular del polinucleótido alternativo (tal como ARNm), o basarse en la longitud del producto final expresado a partir del polinucleótido alternativo. Cuando se relaciona con cualquier elemento del polinucleótido alternativo (p. ej., que no sea la parte de ARNm que incluya la región poli-A), la región poli-A puede tener una longitud 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% mayor que el elemento adicional. La región poli-A también puede diseñarse como una fracción del polinucleótido alternativo al que pertenece. En este contexto, la región poli-A puede tener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% o más de la longitud total de la construcción o la longitud total de la construcción menos la región poli-A.

En ciertos casos, se pueden utilizar sitios de unión modificados genéticamente y/o la conjugación de polinucleótidos (p. ej., ARNm) para la proteína de unión a poli-A para mejorar la expresión. Los sitios de unión modificados genéticamente pueden ser secuencias de sensores que pueden funcionar como sitios de unión para ligandos del microentorno local de los polinucleótidos (p. ej., ARNm). A modo de ejemplo no limitante, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) pueden incluir al menos un sitio de unión modificado genéticamente para alterar la afinidad de unión de la proteína de unión a poli-A (PABP, por sus siglas en inglés) y sus análogos. La incorporación de al menos un sitio de unión modificado genéticamente puede aumentar la afinidad de unión de la PABP y sus análogos.

De manera adicional, se pueden conectar entre sí múltiples polinucleótidos distintos (p. ej., ARNm) a la PABP (proteína de unión a poli-A) a través del extremo 3' mediante el uso de nucleótidos alternativos en el extremo 3' de la región poli-A. Se pueden llevar a cabo experimentos de transfección en líneas celulares relevantes con, y la producción de proteínas puede someterse a ensayo mediante, ELISA a las 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y el día 7 después de la transfección. A modo de ejemplo no limitante, los experimentos de transfección se pueden utilizar para evaluar el efecto sobre la afinidad de unión de la PABP o sus análogos como resultado de la adición de al menos un sitio de unión modificado genéticamente.

En ciertos casos, se puede utilizar una región poli-A para modular el inicio de la traducción. Si bien no hay intención de someterse a limitaciones de carácter teórico, la región poli-A capta la PABP que a su vez puede interactuar con el complejo de inicio de la traducción y, por lo tanto, puede ser esencial para la síntesis de proteínas.

En algunos casos, también se puede utilizar en la presente divulgación una región poli-A para proteger contra la digestión por 3'-5'-exonucleasas.

En algunos casos, un polinucleótido (p. ej., ARNm) puede incluir un poliA-Cuarteto G. El cuarteto G es un conjunto enlazado por hidrógeno cíclico de cuatro nucleótidos de guanosina que puede ser formado por secuencias ricas en G tanto en el ADN como en el ARN. En esta realización, el cuarteto G se incorpora en el extremo de la región poli-A. Los polinucleótidos resultantes (p. ej., ARNm) pueden someterse a ensayos para determinar su estabilidad, producción de proteínas y otros parámetros que incluyen la semivida en diversos momentos. Se ha descubierto que el poliA- cuarteto G genera una producción de proteínas equivalente al menos al 75% de la observada mediante el uso de una región poli-A de 120 nucleótidos sola.

En algunos casos, un polinucleótido (p. ej., ARNm) puede incluir una región poli-A y puede estabilizarse mediante la adición de una región de estabilización 3'. Los polinudeótidos (p. ej., ARNm) con una región poli-A pueden incluir adicionalmente una estructura de caperuza 5'.

En otros casos, un polinucleótido (p. ej., ARNm) puede incluir un poli-A-cuarteto G. Los polinucleótidos (p. ej., ARNm) con un poli-A-cuarteto G pueden incluir adicionalmente una estructura de caperuza 5'.

En algunos casos, las regiones de estabilización 3' que se pueden utilizar para estabilizar un polinucleótido (p. ej., ARNm) que incluye una región poli-A o poli-A-cuarteto G pueden ser, pero sin limitarse a, aquellas que se describen en la Publicación de Patente Internacional Núm. WO2013/103659. En otros casos, las regiones de estabilización 3' que se pueden utilizar con la presente divulgación incluyen un nucleósido de terminación de cadena tal como 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-desoxiuridina, 3'-desoxicitosina, 3'-desoxiguanosina, 3'-desoxitimina, 2',3'-didesoxinucleósidos, tales como 2',3'-didesoxiadenosina, 2',3'-didesoxiuridina, 2',3'-didesoxicitosina, 2',3'-didesoxiguanosina, 2',3'-didesoxitimina, un 2'-desoxinucleósido o un O-metilnucleósido.

En otros casos, un polinucleótido tal como, pero sin limitarse a, ARNm, que incluye una región poliA o un poli-A-cuarteto G puede estabilizarse mediante una alteración de la región 3' del polinucleótido que puede impedir y/o inhibir la adición de oligo(U) (véase, p. ej., la Publicación de Patente Internacional Núm. W o 2013/103659).

En otros aspectos más, un polinucleótido tal como, pero sin limitarse a, ARNm, que incluye una región poli-A o un poli-A-cuarteto G puede estabilizarse mediante la adición de un oligonucleótido que termina en un 3'-desoxinucleósido, 2',3'-didesoxinucleósido 3'-O-metilnucleósidos, 3'-O-etilnucleósidos, 3'-arabinósidos y otros nucleósidos alternativos conocidos en la técnica y/o que se describen en el presente documento.

N u c le ó s id o s d e te rm in a c ió n de cad en a

Un ácido nucleico puede incluir un nucleósido de terminación de cadena. En algunas realizaciones, un nucleósido de terminación de cadena puede incluir aquellos nucleósidos desoxigenados en la posición 2' y/o 3' de su grupo azúcar. Tales especies pueden incluir 3'desoxiadenosina (cordicepina), 3'desoxiuridina, 3'-desoxicitosina, 3' - desoxiguanosina, 3' - desoxitimina y 2',3' - didesoxinucleósidos, tales como 2',3' -didesoxiadenosina, 2',3'didesoxiuridina, 2',3'didesoxicitosina, 2',3'didesoxiguanosina y 2',3'didesoxitimina.

T écn icas de ed ic ió n de ge n o m a

En algunas realizaciones, el ácido nucleico es adecuado para una técnica de edición de genoma.

En algunas realizaciones, la técnica de edición de genoma consiste en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas (CRISPR, por sus siglas en inglés) o nucleasa efectora de tipo activador de transcripción (TALEN, por sus siglas en inglés).

En algunas realizaciones, el ácido nucleico es al menos un ácido nucleico adecuado para una técnica de edición de genoma que se selecciona del grupo que consiste en un ARN de CRISPR (ARNcr), un ARNcr de activación en trans (ARNcrtra), un ARN guía simple (ARNgs) y un molde de reparación de ADN.

V acunas

En algunas realizaciones, el agente terapéutico y/o profiláctico es una vacuna contra el cáncer de ácido ribonucleico (ARN) de un ARN (p. ej., ARN mensajero (ARNm)) que puede dirigir de forma segura el mecanismo celular del organismo para producir casi cualquier proteína de cáncer o fragmento de la misma de interés. En algunas realizaciones, el ARN es un ARN modificado. Las vacunas de ARN de la presente divulgación se pueden utilizar para inducir una respuesta inmunitaria equilibrada contra cánceres, que comprende tanto inmunidad celular como humoral, sin arriesgarse a la posibilidad de mutagénesis insercional, por ejemplo.

Es posible utilizar las vacunas de ARN en diversos entornos dependiendo con la prevalencia del cáncer o el grado o nivel de la necesidad médica no satisfecha. Las vacunas de ARN se pueden utilizar para tratar y/o prevenir un cáncer de diversos estadios o grados de metástasis. Las vacunas de ARN tienen propiedades superiores debido a que producen títulos de anticuerpo mucho mayores y producen respuestas en forma más temprana que los tratamientos contra el cáncer alternativos, incluidas las vacunas contra el cáncer. Si bien no hay intención de someterse a limitaciones de carácter teórico, se cree que el diseño de las vacunas de ARN, como polinucleótidos de ARNm, están mejor diseñadas para producir la conformación de proteína aproximada tras la traducción debido a que las vacunas de ARN seleccionan mecanismos celulares naturales. A diferencia de las vacunas tradicionales que se producen ex vivo y que pueden desencadenar respuestas celulares no deseadas, las vacunas de ARN se presentan al sistema celular en una forma más natural.

Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan vacunas contra el cáncer que incluyen al menos un polinucleótido de ácido ribonucleico (ARN) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico de cáncer o un fragmento inmunogénico del mismo (p. ej., un fragmento inmunogénico capaz de inducir una respuesta inmunitaria al cáncer). Otras realizaciones incluyen al menos un polinucleótido de ácido ribonucleico (ARN) que tiene un marco de lectura abierto que codifica dos o más antígenos o epítopos capaces de inducir una respuesta inmunitaria al cáncer.

La invención en algunos aspectos es una vacuna de un ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica un antígeno de cáncer y un ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica un modulador de punto de control inmunitario. En algunas realizaciones, el modulador de punto de control inmunitario es un polipéptido de punto de control inhibidor. En algunas realizaciones, el polipéptido de punto de control inhibidor es un anticuerpo o fragmento del mismo que se unen específicamente a una molécula que se selecciona del grupo que consiste en PD-1, TIM-3, VISTA, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR y LAG3. En algunas realizaciones, el polipéptido de punto de control inhibidor es un anticuerpo anti-CTLA4 o anti-PD1. Opcionalmente, la vacuna incluye una nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones se administra a un sujeto una vacuna de un ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica un antígeno de cáncer. En otras realizaciones, un inhibidor de puntos de control se administra 3-10 semanas después. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control se administra 4 semanas después.

En otros aspectos, la invención es una vacuna contra el cáncer personalizada de un ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos 2 antígenos de cáncer, en donde los al menos dos antígenos de cáncer son antígenos de cáncer específicos del paciente, y un portador de nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica tiene un diámetro promedio de 50-200 nm.

En otros aspectos más, la invención es una vacuna contra el cáncer personalizada de un ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos 2 antígenos de cáncer, en donde los al menos dos antígenos de cáncer son representativos de antígenos de un paciente. En algunas realizaciones, los antígenos de un paciente son antígenos identificados de exosoma del paciente. En algunas realizaciones, un único ARNm codifica los antígenos de cáncer. En algunas realizaciones, múltiples ARNm codifican los antígenos de cáncer. Cada ARNm puede codificar 5-10 antígenos de cáncer o un único antígeno de cáncer en otras realizaciones. En algunas realizaciones, el ARNm codifica 2-100 antígenos de cáncer. En otras realizaciones el ARNm codifica 10-100, 20-100, 50-100, 100-200, 300-400, 500-600, 600-700, 700-800, 900-1.000 o 1.000-10.000 antígenos de cáncer.

En algunas realizaciones,

a) los ARNm que codifican cada antígeno de cáncer tienen intercalados sitios sensibles a la escisión; b) los ARNm que codifican cada antígeno de cáncer se conectan directamente entre sí sin un conector; c) los ARNm que codifican cada antígeno se cáncer se conectan entre sí con un conector de nucleótido único. d) cada antígeno de cáncer comprende 25-35 aminoácidos e incluye una mutación SNP ubicada centralmente;

e) al menos 30% de los antígenos de cáncer tiene una afinidad más alta para moléculas del MHC clase I del sujeto;

f) al menos 30% de los antígenos de cáncer tiene una afinidad más alta para moléculas del MHC clase II del sujeto;

g) al menos 50% de los antígenos de cáncer tiene una afinidad de unión prevista de CI >500nM para HLA-A, HLA-B y/o DRB 1;

h) el ARNm codifica 20 antígenos de cáncer;

i) 50% de los antígenos de cáncer tiene una afinidad de unión para MHC clase I y 50% de los antígenos de cáncer tiene una afinidad de unión para MHC clase II; y/o

j) el ARNm que codifica los antígenos de cáncer se dispone de modo que los antígenos de cáncer se ordenen para minimizar pseudoepítopos.

En algunas realizaciones, cada antígeno de cáncer comprende 31 aminoácidos e incluye una mutación SNP ubicada centralmente con 15 aminoácidos flanqueantes a cada lado de la mutación SNP.

En algunas realizaciones, la vacuna es una vacuna contra el cáncer personalizada y en donde el antígeno de cáncer es un antígeno de cáncer específico del sujeto. En algunas realizaciones, el antígeno de cáncer específico del sujeto puede ser representativo de un exorna de una muestra de tumor del sujeto, o de un transcriptoma de una muestra de tumor del sujeto. En algunas realizaciones, el antígeno de cáncer específico del sujeto puede ser representativo de un exosoma del sujeto.

En algunas realizaciones, el marco de lectura abierto codifica adicionalmente uno o más antígenos de cáncer tradicionales. En algunas realizaciones, el antígeno de cáncer tradicional es un antígeno no mutado. En algunas realizaciones, el antígeno de cáncer tradicional es un antígeno mutado.

En algunas realizaciones, la vacuna de ARNm comprende adicionalmente un ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica uno o más antígenos de cáncer tradicionales.

En algunas realizaciones, un único ARNm codifica los antígenos de cáncer. En otras realizaciones, múltiples ARNm codifican los antígenos de cáncer. Cada antígeno de cáncer tiene una longitud de 10-50 aminoácidos en algunas realizaciones. En otras realizaciones, cada antígeno de cáncer tiene una longitud de 15-20 aminoácidos. En otras realizaciones el antígeno de cáncer tiene una longitud de 20-50, 25-100, 100-200, 200 300, 300-400, 400-500, 500-1.000 o 1.000-10.000 aminoácidos.

En algunas realizaciones, las vacunas comprenden adicionalmente un adyuvante.

Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan una vacuna contra el cáncer que incluye al menos un polinucleótido de ácido ribonucleico (ARN) que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido de cáncer, al menos una caperuza 5'-terminal y al menos una modificación química, formulado dentro de una nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, una caperuza 5'-terminal es 7mG(5')ppp(5')NlmpNp.

En algunas realizaciones, al menos una modificación química se selecciona entre pseudouridina, N1-metilpseudouridina, N1-etilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-desazapseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tiopseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina, 5-metoxiuridina y 2'-O-metiluridina. En algunas realizaciones, el grado de incorporación de nucleótidos modificados químicamente se ha optimizado para respuestas inmunitarias mejoradas a la formulación de la vacuna.

En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico, un lípido modificado con PEG, un esterol y un lípido no catiónico. En algunas realizaciones, un lípido catiónico es un lípido catiónico ionizable y el lípido no catiónico es un lípido neutro y el esterol es un colesterol. En algunas realizaciones, un lípido catiónico se selecciona entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleilmetil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319).

En algunas realizaciones la formulación de nanopartículas lipídicas incluye un potenciador inmunitario (p. ej., un agonista de TLR) para potenciar la inmunogenicidad de la vacuna (formulación).

En algunas realizaciones, 100% del uracilo en el marco de lectura abierto tiene una modificación química. En algunas realizaciones, una modificación química se encuentra en la posición 5 del uracilo. En algunas realizaciones, una modificación química es una N1-metil pseudouridina.

En otras realizaciones, se incluye en la vacuna o se administra conjuntamente con la vacuna un ARNm que codifica una molécula de reprogramación de APC. La molécula de reprogramación de APC puede ser una CIITA, una proteína chaperona tal como CLIP, HLA-DO, HLA-DM, una molécula coestimuladora tal como CD40, CD80, CD86, un fragmento de CIITA tal como los aminoácidos 26-137 de CIITA o una proteína que tiene 80% de identidad de secuencia con CIITA.

En otros aspectos, se proporciona un método para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto mediante la identificación de al menos 2 antígenos de cáncer de una muestra de un sujeto, en donde los al menos 2 antígenos de cáncer incluyen mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en mutaciones de desplazamiento de marco y recombinaciones, y la administración de una vacuna de ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica los al menos dos antígenos de cáncer al sujeto.

En algunas realizaciones, los antígenos de cáncer se identifican a partir de un exosoma del sujeto. En algunas realizaciones se identifican 2-100 antígenos a partir del exosoma. En otras realizaciones, la vacuna de ARNm tiene un marco de lectura abierto que codifica los 2-100 antígenos. Un único ARNm o múltiples ARNm pueden codificar los antígenos.

En algunas realizaciones, los antígenos son antígenos de cáncer. Los antígenos de cáncer pueden tener mutaciones seleccionadas entre mutaciones puntuales, mutaciones de desplazamiento de marco y recombinaciones. El método puede implicar adicionalmente confirmar que los antígenos de cáncer son específicos del sujeto mediante análisis del exoma.

En algunas realizaciones, el método puede implicar adicionalmente confirmar que los antígenos de cáncer son específicos del sujeto mediante análisis de transcriptoma.

En algunas realizaciones el método también implica, al menos un mes después de la administración de la vacuna de ARNm, identificar al menos 2 antígenos de cáncer de una muestra del sujeto para producir un segundo conjunto de antígenos de cáncer, y administrar al sujeto una vacuna de ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica el segundo conjunto de antígenos de cáncer al sujeto.

En otras realizaciones, la muestra del sujeto es una muestra de tumor.

En otros aspectos la invención comprende un método para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto mediante la identificación de al menos 2 antígenos de cáncer de una muestra de un sujeto para producir un primer conjunto de antígenos de cáncer, administrar al sujeto una vacuna de ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica un primer conjunto de antígenos de cáncer al sujeto, al menos un mes después de la administración de la vacuna de ARNm, identificar al menos 2 antígenos de cáncer de una muestra de un sujeto para producir un segundo conjunto de antígenos de cáncer, y administrar al sujeto una vacuna de ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica el segundo conjunto de antígenos de cáncer.

La vacuna de ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica un segundo conjunto de antígenos, en algunas realizaciones, se administra al sujeto de 6 meses a 1 año después de la vacuna de ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica un primer conjunto de antígenos de cáncer. En otras realizaciones, la vacuna de ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica un segundo conjunto de antígenos, se administra al sujeto 1-2 años después de la vacuna de ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica un primer conjunto de antígenos de cáncer.

En algunas realizaciones, un único ARNm tiene un marco de lectura abierto que codifica los antígenos de cáncer. En otras realizaciones, múltiples ARNm codifican los antígenos. En algunas realizaciones, el segundo conjunto de antígenos de cáncer incluye 2-100 antígenos. En otras realizaciones, los antígenos de cáncer tienen mutaciones seleccionadas entre mutaciones puntuales, mutaciones de desplazamiento de marco y recombinaciones.

En otros aspectos la invención comprende un método para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto, mediante la identificación de al menos 2 antígenos de cáncer a partir de una muestra de un sujeto, administrar un ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica los al menos 2 antígenos de cáncer al sujeto, y administrar un agente terapéutico contra el cáncer al sujeto. En algunas realizaciones, el agente terapéutico contra el cáncer es una terapia dirigida. La terapia dirigida puede ser un inhibidor de BRAF tal como vemurafenib (PLX4032) o dabrafenib.

En otras realizaciones, el agente terapéutico contra el cáncer es un agente terapéutico de células T. El agente terapéutico de células T puede ser un inhibidor de puntos de control tal como un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-CTLA-4. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es BMS-936558 (nivolumab). En otras realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 es ipilimumab. El agente terapéutico de células T en otras realizaciones es OX40L. En otras realizaciones más, el agente terapéutico contra el cáncer es una vacuna que comprende un agente específico de tumores basado en la población.

En otras realizaciones, el agente terapéutico contra el cáncer es una vacuna que comprende un ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica uno o más antígenos de cáncer tradicionales.

En algunas realizaciones, el ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica los al menos 2 antígenos de cáncer se administra al sujeto simultáneamente con el agente terapéutico contra el cáncer. En algunas realizaciones, el ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica los al menos 2 antígenos de cáncer se administra al sujeto antes de la administración del agente terapéutico contra el cáncer. En algunas realizaciones, el ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica los al menos 2 antígenos de cáncer se administra al sujeto después de la administración del agente terapéutico contra el cáncer.

En otros aspectos de la invención se proporciona un método que comprende mezclar un ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica un antígeno de cáncer con una formulación de nanopartículas lipídicas para producir una vacuna de ARNm contra el cáncer y administrar la vacuna de ARNm contra el cáncer a un sujeto en el plazo de 24 horas desde la mezcla. En algunas realizaciones, la vacuna contra el cáncer de ARNm se administra al sujeto en el plazo de 12 horas desde la mezcla. En otras realizaciones, la vacuna de ARNm contra el cáncer se administra al sujeto en el plazo de 1 hora desde la mezcla. La vacuna de ARNm contra el cáncer codifica 2-100 antígenos de cáncer o 10-100 antígenos de cáncer en algunas realizaciones.

En algunas realizaciones, la vacuna es una vacuna contra el cáncer personalizada y en donde el antígeno de cáncer es un antígeno de cáncer específico del sujeto.

En algunas realizaciones, un único ARNm codifica los antígenos de cáncer. En otras realizaciones, múltiples ARNm codifican los antígenos de cáncer. Cada ARNm codifica 5-10 antígenos de cáncer o un único antígeno de cáncer en otras realizaciones. En otras realizaciones más cada antígeno de cáncer tiene una longitud de 10-50 aminoácidos, o una longitud de 15-20 aminoácidos.

Adicionalmente se proporcionan en el presente documento usos de vacunas contra el cáncer en la fabricación de un medicamento para su uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria específica para un antígeno en un sujeto, comprendiendo el método la administración de la vacuna contra el cáncer al sujeto en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria específica para un antígeno.

En otros aspectos se proporciona un método para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesita, mediante la identificación de al menos 2 antígenos de cáncer a partir de un exosoma aislado del sujeto; la producción, en función de los antígenos identificados, de una vacuna de ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica los antígenos; y la administración de la vacuna de ARNm al sujeto, en donde la vacuna de ARNm induce una respuesta inmunitaria específica del tumor en el sujeto, tratando de ese modo un cáncer en el sujeto. La invención en otros aspectos es una vacuna de ARN que se puede preparar de acuerdo con un método que implica identificar al menos 2 antígenos de cáncer de un exosoma aislado de un sujeto; producir, en función de los antígenos identificados, una vacuna de ARNm que tiene un marco de lectura abierto que codifica los antígenos.

En aspectos de la invención se proporciona un método para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra un antígeno de cáncer. El método implica la administración al sujeto de una vacuna de ARN que comprende al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico o un fragmento inmunogénico del mismo, induciendo de ese modo en el sujeto una respuesta inmunitaria específica al polipéptido antigénico o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde el título de anticuerpo contra el polipéptido antigénico en el sujeto aumenta después de la vacunación respecto al título de anticuerpo contra el polipéptido antigénico en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional contra el cáncer. Un “anticuerpo contra polipéptidos antigénicos” es un anticuerpo sérico que se une específicamente al polipéptido antigénico.

Una dosis profilácticamente eficaz es una dosis terapéuticamente eficaz que previene el avance del cáncer a un nivel clínicamente aceptable. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es una dosis enumerada en un prospecto de la vacuna. Como se emplea en el presente documento, una vacuna tradicional hace referencia a una vacuna diferente a las vacunas de ARNm de la invención. Por ejemplo, una vacuna tradicional incluye, pero sin limitarse a, vacunas de microorganismos vivos, vacunas de microorganismos muertos, vacunas de subunidades, vacunas de antígenos proteicos, vacunas de ADN, etc. En realizaciones ilustrativas, una vacuna tradicional es una vacuna que ha logrado la aprobación regulatoria y/o está registrada por un organismo regulador de fármacos nacional, por ejemplo, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en los Estados Unidos o la Agencia Europea de Medicamentos (EMA).

En algunas realizaciones, el título de anticuerpo contra el polipéptido antigénico en el sujeto aumenta de 1 log a 10 log después de la vacunación con respecto a un título de anticuerpo contra el polipéptido antigénico en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional contra el cáncer.

En algunas realizaciones, el título de anticuerpos contra polipéptidos antigénicos en el sujeto aumenta 1 log después de la vacunación con respecto al título de anticuerpos contra polipéptidos antigénicos en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional contra el cáncer.

En algunas realizaciones, el título de anticuerpos contra polipéptidos antigénicos en el sujeto aumenta 2 log después de la vacunación con respecto al título de anticuerpos contra polipéptidos antigénicos en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional contra el cáncer.

En algunas realizaciones, el título de anticuerpos contra polipéptidos antigénicos en el sujeto aumenta 3 log después de la vacunación con respecto al título de anticuerpos contra polipéptidos antigénicos en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional contra el cáncer.

En algunas realizaciones, el título de anticuerpos contra polipéptidos antigénicos en el sujeto aumenta 5 log después de la vacunación con respecto al título de anticuerpos contra polipéptidos antigénicos en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional contra el cáncer.

En algunas realizaciones, el título de anticuerpos contra polipéptidos antigénicos en el sujeto aumenta 10 log después de la vacunación con respecto al título de anticuerpos contra polipéptidos antigénicos en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional contra el cáncer.

En otros aspectos de la invención se proporciona un método para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra un antígeno de cáncer. El método implica la administración al sujeto de una vacuna de ARN que comprende al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico o un fragmento inmunogénico del mismo, induciendo de ese modo en el sujeto una respuesta inmunitaria específica al polipéptido antigénico o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional contra el antígeno de cáncer a un nivel de dosificación de 2 veces a 100 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN.

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a una dosificación que es dos veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN.

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a una dosificación que es tres veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN.

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a una dosificación que es 4 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN.

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a una dosificación que es 5 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a una dosificación que es 10 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN.

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a una dosificación que es 50 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN.

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a una dosificación que es 100 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN.

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a una dosificación que es 10 a 1000 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN.

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto es equivalente a una respuesta inmunitaria en un sujeto vacunado con una vacuna tradicional a una dosificación que es 100 a 1000 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN.

En otras realizaciones, se evalúa la respuesta inmunitaria mediante la determinación del título de anticuerpo en el sujeto.

En otros aspectos, la invención comprende un método para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra un mediante la administración al sujeto de una vacuna de ARN que comprende al menos un polinucleótido de ARN que tiene un marco de lectura abierto que codifica al menos un polipéptido antigénico de cáncer o un fragmento inmunogénico del mismo, induciendo de ese modo en el sujeto una respuesta inmunitaria específica al polipéptido antigénico o un fragmento inmunogénico del mismo, en donde se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto de 2 días a 10 semanas antes en comparación con una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional contra el antígeno de cáncer. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto se induce en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional a un nivel de dosificación que es 2 veces a 100 veces el nivel de dosificación con respecto a la vacuna de ARN.

En algunas realizaciones, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 2 días antes en comparación con una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional.

En algunas realizaciones, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 3 días antes con respecto a una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional. En algunas realizaciones, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 1 semana antes con respecto a una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional.

En algunas realizaciones, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 2 semanas antes en comparación con una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional.

En algunas realizaciones, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 3 semanas antes en comparación con una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional.

En algunas realizaciones, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 5 semanas antes en comparación con una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional.

En algunas realizaciones, se induce la respuesta inmunitaria en el sujeto 10 semanas antes en comparación con una respuesta inmunitaria inducida en un sujeto vacunado con una dosis profilácticamente eficaz de una vacuna tradicional.

Un método para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra un cáncer mediante la administración al sujeto de una vacuna de ARN contra el cáncer que tiene un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico, en donde el polinucleótido de ARN no incluye un elemento de estabilización y en donde no se formula o se administra un adyuvante junto con la vacuna.

En otros aspectos más la invención comprende un método para producir un ARNm que codifica un antígeno de cáncer concatemérico que comprende entre 1000 y 3000 nucleótidos, comprendiendo el método (a) unir un primer polinucleótido que comprende un marco de lectura abierto que codifica el antígeno de cáncer concatemérico y un segundo polinucleótido que comprende una 5'-UTR con un polinucleótido conjugado con un soporte sólido;

(b) ligar el extremo 3' del segundo polinucleótido al extremo 5' del primer polinucleótido en las condiciones adecuadas, en donde las condiciones adecuadas comprenden una a Dn Ligasa, produciendo de ese modo un primer producto de ligación;

(c) ligar el extremo 5' de un tercer polinucleótido que comprende una 3'-UTR al extremo 3' del primer producto de ligación en las condiciones adecuadas, en donde las condiciones adecuadas comprenden una ARN Ligasa, produciendo de ese modo un segundo producto de ligación; y

(d) liberar el segundo producto de ligación del soporte sólido, produciendo de ese modo un ARNm que codifica el antígeno de cáncer concatemérico que comprende entre 1000 y 3000 nucleótidos. En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados, el ARNm codifica uno o más polimorfismos recurrentes. En algunas realizaciones, los uno o más polimorfismos recurrentes comprenden una mutación de cáncer somática recurrente en p53. En algunas de tales realizaciones, las una o más mutaciones de cáncer somáticas recurrentes en p53 se seleccionan del grupo que consiste en:

(1) mutaciones en el codón p.T125 cercano al sitio de corte y empalme 5' canónico;

(2) mutaciones en el codón p.331 cercano al sitio de corte y empalme 5' canónico;

(3) mutaciones en el codón p.126 cercano al sitio de corte y empalme 3' canónico;

(4) mutaciones en el codón p.224 cercano al sitio de corte y empalme 5' canónico; que inducen un sitio de corte y empalme 5' intrónico alternativo críptico.

En algunas realizaciones, la invención proporciona una vacuna terapéutica contra el cáncer que comprende un ARNm que codifica un marco de lectura abierto (ORF) que codifica uno o más péptidos neoantigénicos (1) a (4). En algunas realizaciones, la invención proporciona la administración selectiva de una vacuna que contiene o codifica uno o más de los péptidos (1)-(4), en función de que el tumor del paciente contenga alguna de las mutaciones anteriores. En algunas realizaciones, la invención proporciona la administración selectiva de la vacuna en función de los criterios duales de que el tumor del sujeto contenga alguna de las mutaciones anteriores y que el tipo de HLA normal del sujeto contenga el alelo de HLA correspondiente que se prevé que se una al neoantígeno resultante.

En otros aspectos de la invención se proporciona un método para tratar a un sujeto con una vacuna de ARNm contra el cáncer personalizada, mediante el aislamiento de una muestra de un sujeto, la identificación de un conjunto de neoepítopos analizando el transcriptoma de un paciente y/o exoma de un paciente de la muestra para producir el mutanoma específico de un paciente, la selección de un conjunto de neoepítopos para la vacuna a partir del mutanoma en función de la fuerza de unión a MHC, diversidad de unión a MHC, grado previsto de inmunogenicidad, baja auto reactividad y/o reactividad de células T, la preparación de la vacuna de ARNm para codificar el conjunto de neoepítopos y la administración de la vacuna de ARNm al sujeto en el plazo de dos meses desde el aislamiento de la muestra del sujeto. En algunas realizaciones, la vacuna de ARNm se administra al sujeto en el plazo de un mes desde el aislamiento de la muestra del sujeto.

En otros aspectos la invención comprende un método para identificar un conjunto de neoepítopos para su uso en una vacuna de ARNm contra el cáncer personalizada que tiene uno o más polinucleótidos que codifican el conjunto de neoepítopos mediante a. la identificación de un mutanoma específico del paciente mediante el análisis de un transcriptoma del paciente y un exoma del paciente, b. la selección de un subconjunto de 15 500 neoepítopos del mutanoma mediante el uso de un valor ponderado para los neoepítopos en función de al menos tres de: una evaluación de expresión a nivel de transcripción o gen en secuenciación de ARN del paciente; puntuación de confianza de llamada de variante; expresión específica del alelo de secuenciación de ARN; sustitución de aminoácidos conservativa frente a no conservativa; posición de mutación puntual (Centrar la Puntuación para aumentar el acoplamiento de TCR); posición de mutación puntual (Anclar la Puntuación para la unión a HLA diferencial); Identidad: <100% de homología de epítopo nuclear con los datos W ES del paciente, CI50 de HLA-A y -B para 8meros-11meros, CI50 de HLA-DRB 1 para 15meros-20meros, Puntuación de promiscuidad (es decir, cantidad de HLA del paciente que se prevé que se unirán), CI50 de HLA-C para 8meros-11meros, CI50 de HLA-DRB3-5 para 15meros-20 meros, CI50 de HLA-DQB1/A1 para 15 meros-20meros, CI50 de HLA-DPB1/A1 para 15meros-20meros, proporción de Clase I frente a Clase II, diversidad de los alotipos HLA-A, -B y DRB 1 del paciente cubiertos, proporción de mutación puntual frente a epítopos complejos (p. ej., desplazamiento de marco) y/o puntuaciones de unión a HLA de pseudoepítopo, y c. la selección de un conjunto de neoepítopos para su uso en una vacuna de ARNm contra el cáncer personalizada a partir del subconjunto en función del valor ponderado más alto, en donde el conjunto de neoepítopos comprende 15-40 neoepítopos.

En algunas realizaciones, las vacunas de ácido nucleico descritas en el presente documento son modificadas químicamente. En otras realizaciones, las vacunas de ácido nucleico no son modificadas.

Otros aspectos más proporcionan composiciones para la vacunación y métodos de vacunación de un sujeto que comprenden administrar al sujeto una vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico o un polipéptido concatemérico, en donde el polinucleótido de ARN no incluye un elemento de estabilización y en donde no se formula o administra un adyuvante junto con la vacuna.

En otros aspectos, la invención es una composición o método para vacunar a un sujeto que comprende administrar al sujeto una vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de<a>R<n>que tienen un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico, en donde se administra al sujeto una dosificación de 10 ug/kg a 400 ug/kg de la vacuna de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la dosificación del polinucleótido de ARN es 1-5 ug, 5-10 ug, 10-15 ug, 15-20 ug, 10-25 ug, 20-25 ug, 20-50 ug, 30-50 ug, 40-50 ug, 40-60 ug, 60-80 ug, 60-100 ug, 50-100 ug, 80-120 ug, 40-120 ug, 40-150 ug, 50-150 ug, 50-200 ug, 80-200 ug, 100-200 ug, 120-250 ug, 150-250 ug, 180-280 ug, 200-300 ug, 50-300 ug, 80-300 ug, 100-300 ug, 40-300 ug, 50-350 ug, 100-350 ug, 200-350 ug, 300-350 ug, 320-400 ug, 40-380 ug, 40-100 ug, 100-400 ug, 200-400 ug o 300-400 ug por dosis. En algunas realizaciones, la vacuna de ácido nucleico se administra al sujeto mediante inyección intradérmica o intramuscular. En algunas realizaciones, la vacuna de ácido nucleico se administra al sujeto en el día cero. En algunas realizaciones, una segunda dosis de la vacuna de ácido nucleico se administra al sujeto en el día veintiuno.

En algunas realizaciones, se incluye en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto una dosificación de 25 microgramos del polinucleótido de ARN. En algunas realizaciones, se incluye en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto una dosificación de 100 microgramos del polinucleótido de ARN. En algunas realizaciones, se incluye en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto una dosificación de 50 microgramos del polinucleótido de ARN. En algunas realizaciones, se incluye en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto una dosificación de 75 microgramos del polinucleótido de ARN En algunas realizaciones, se incluye en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto una dosificación de 150 microgramos del polinucleótido de ARN. En algunas realizaciones, se incluye en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto una dosificación de 400 microgramos del polinucleótido de ARN. En algunas realizaciones, se incluye en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto una dosificación de 200 microgramos del polinucleótido de ARN. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN se acumula a un nivel 100 veces superior en el ganglio linfático local en comparación con el ganglio linfático distal. En otras realizaciones, la vacuna de ácido nucleico se modifica químicamente y, en otras realizaciones, la vacuna de ácido nucleico no se modifica químicamente.

Los aspectos de la invención proporcionan una vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico o un polipéptido concatemérico, en donde el polinucleótido de ARN no incluye un elemento de estabilización y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptables, en donde no se incluye un adyuvante en la vacuna. En algunas realizaciones, el elemento de estabilización es un tallo-bucle de histona. En algunas realizaciones, el elemento de estabilización es una secuencia de ácido nucleico que tiene un contenido de GC superior con respecto a la secuencia de tipo salvaje.

Los aspectos de la invención proporcionan vacunas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico, en donde el polinucleótido de ARN está presente en la formulación para la administración in vivo a un anfitrión, que otorga un título de anticuerpos superior al criterio de seroprotección para el primer antígeno para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. En algunas realizaciones, el título de anticuerpos producido por las vacunas de ARNm de la invención es un título de anticuerpos neutralizante. En algunas realizaciones, el título del anticuerpo neutralizante es mayor que una vacuna de proteína. En otras realizaciones, el título del anticuerpo neutralizante producido por las vacunas de ARNm de la invención es mayor que una vacuna de proteína adyuvada. En otras realizaciones más, el título de anticuerpos neutralizante producido por las vacunas de ARNm de la invención es 1000-10.000, 1200-10.000, 1400-10.000, 1.500-10.000, 1.000-5.000, 1.000-4.000, 1.800-10.000, 2.000-10.000, 2.000-5.000, 2.000-3.000, 2.000-4.000, 3.000-5.000, 3.000-4.000 o 2.000-2.500. Un título de neutralización típicamente se expresa como la mayor dilución en suero necesaria para lograr una reducción de 50% del número de placas.

En aspectos preferidos, las vacunas de la invención (p. ej., vacunas de ARNm encapsulado en LNP) producen niveles, concentraciones y/o títulos eficaces desde el punto de vista profiláctico y/o terapéutico de anticuerpos específicos para un antígeno en la sangre o suero de un sujeto vacunado. Como se define en el presente documento, el término título de anticuerpos hace referencia a la cantidad de anticuerpo específico para el antígeno que se produce en un sujeto, p. ej., un sujeto humano. En realizaciones ilustrativas, el título de anticuerpos se expresa como la inversa de la mayor dilución (en una dilución en serie) que todavía da un resultado positivo. En realizaciones ilustrativas, el título de anticuerpos se determina o se mide a través de un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). En realizaciones ilustrativas, el título de anticuerpos se determina o se mide a través de un ensayo de neutralización, por ejemplo, ensayo de microneutralización. En ciertos aspectos, la medida del título de anticuerpos se expresa como una razón, tal como 1:40, 1:100, etc.

En realizaciones ilustrativas de la invención, una vacuna eficaz produce un título de anticuerpos de más de 1:40, más de 1:100, más de 1:400, más de 1:1000, más de 1:2000, más de 1:3000, más de 1:4000, más de 1:500, más de 1:6000, más de 1:7500, más de 1:10000. En realizaciones ilustrativas, el título de anticuerpos se produce o se alcanza 10 días después de la vacunación, 20 días después de la vacunación, 30 días después de la vacunación, 40 días después de la vacunación o 50 días o más después de la vacunación. En realizaciones ilustrativas, el título se produce o se alcanza después de una dosis única de vacuna administrada al sujeto. En otras realizaciones, el título se produce o se alcanza después de múltiples dosis, por ejemplo, después de una primera y una segunda dosis (p. ej., una dosis de refuerzo).

En aspectos ilustrativos de la invención, los anticuerpos específicos para un antígeno se miden en unidades de |jg/ml o se miden en unidades de UI/L (Unidades Internacionales por litro) o mUI/mL (miliUnidades Internacionales por mL). En realizaciones ilustrativas de la invención, una vacuna eficaz produce >0,5 jg/ml, >0,1 jg/ml, >0,2 jg/ml, >0,35 jg/ml, >0,5 jg/ml, >1 jg/ml, >2 jg/ml, >5 jg/ml o >10 jg/ml. En realizaciones ilustrativas de la invención, una vacuna eficaz produce >10 mlU/ml, >20 mlU/ml, >50 mlU/ml, >100 mlU/ml, >200 mlU/ml, >500 mlU/ml o > 1000 mlU/ml. En realizaciones ilustrativas, el nivel o concentración de anticuerpos se producen o se alcanzan 10 días después de la vacunación, 20 días después de la vacunación, 30 días después de la vacunación, 40 días después de la vacunación o 50 días o más después de la vacunación. En realizaciones ilustrativas, el nivel o concentración se producen o se alcanzan después de una dosis única de vacuna administrada al sujeto. En otras realizaciones, el nivel o concentración se producen o se alcanzan después de múltiples dosis, por ejemplo, después de una primera y una segunda dosis (p. ej., una dosis de refuerzo). En realizaciones ilustrativas, el nivel o concentración del anticuerpo se determinan o se miden mediante un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). En realizaciones ilustrativas, el nivel o concentración de anticuerpos se determinan o se miden a través de un ensayo de neutralización, p. ej., ensayo de microneutralización. También se proporcionan vacunas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico o un polipéptido concatemérico, en donde el polinucleótido de ARN se encuentra presente en una formulación para la administración in vivo a un anfitrión para provocar un título de anticuerpos alto de duración más prolongada que un título de anticuerpos provocado por una vacuna de ARNm que tiene un elemento estabilizador o que se formula con un adyuvante y que codifica el primer polipéptido antigénico. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN está formulado para producir anticuerpos neutralizantes en el plazo de un período de una semana después de una única administración. En algunas realizaciones, el adyuvante se selecciona entre un péptido catiónico y un ácido nucleico inmunoestimulador. En algunas realizaciones, el péptido catiónico es protamina.

Los aspectos proporcionan vacunas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que comprende al menos una modificación química u opcionalmente ninguna modificación de nucleótidos, codificando el marco de lectura abierto un primer polipéptido antigénico o un polipéptido concatemérico, en donde el polinucleótido de ARN está presente en la formulación para la administración in vivo a un anfitrión, de forma tal que el nivel de expresión de antígenos en el anfitrión supere significativamente un nivel de expresión de antígenos producidos por una vacuna de ARNm que tiene un elemento estabilizador o que se formula con un adyuvante y que codifica el primer polipéptido antigénico.

Otros aspectos proporcionan vacunas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que comprende al menos una modificación química u opcionalmente ninguna modificación de nucleótidos, codificando el marco de lectura abierto un primer polipéptido antigénico o un polipéptido concatemérico, en donde la vacuna tiene al menos 10 veces menos polinucleótidos de ARN que los necesarios para que una vacuna de ARNm no modificado produzca un título de anticuerpos equivalente. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN está presente a una dosificación de 25-100 microgramos.

Algunos aspectos de la invención también proporcionan una vacuna de unidad de uso, que comprende entre 10 ug y 400 ug de uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que comprende al menos una modificación química u opcionalmente ninguna modificación de nucleótidos, codificando el marco de lectura abierto un primer polipéptido antigénico o un polipéptido concatemérico, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptables, formulados para su suministro a un sujeto humano. En algunas realizaciones, la vacuna comprende adicionalmente una nanopartícula lipídica catiónica.

Algunos aspectos de la invención proporcionan métodos para crear, mantener o restaurar la memoria antigénica de un tumor en un individuo o población de individuos que comprende administrar a dicho individuo o población una vacuna de ácido nucleico de refuerzo de memoria antigénica que comprende (a) al menos un polinucleótido de ARN, comprendiendo dicho polinucleótido al menos una modificación química u opcionalmente ninguna modificación de nucleótidos y dos o más marcos de lectura abiertos con optimización de codones, codificando dichos marcos de lectura abiertos un conjunto de polipéptidos antigénicos de referencia y (b) opcionalmente un portador o excipiente farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la vacuna se administra al individuo a través de una vía que se selecciona del grupo que consiste en administración intramuscular, administración intradérmica y administración subcutánea. En algunas realizaciones, la etapa de administración comprende poner en contacto un tejido muscular del sujeto con un dispositivo adecuado para la inyección de la composición. En algunas realizaciones, la etapa de administración comprende poner en contacto un tejido muscular del sujeto con un dispositivo adecuado para la inyección de la composición, junto con electroporación.

Algunos aspectos de la invención proporcionan métodos para vacunar a un sujeto que comprenden administrar al sujeto una única dosificación de entre 25 ug/kg y 400 ug/kg de una vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un primer polipéptido antigénico o un polipéptido concatemérico en una cantidad eficaz para vacunar al sujeto.

Otros aspectos proporcionan vacunas de ácido nucleico que comprenden uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que comprende al menos una modificación química, codificando el marco de lectura abierto un primer polipéptido antigénico o un polipéptido concatemérico, en donde la vacuna tiene al menos 10 veces menos polinucleótido de ARN que el necesario para que una vacuna de ARNm no modificado produzca un título de anticuerpos equivalente. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN está presente a una dosificación de 25-100 microgramos.

Otros aspectos proporcionan vacunas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido de ARN formulado con LNP que posee un marco de lectura abierto que no comprende modificaciones de nucleótidos (sin modificar), codificando el marco de lectura abierto un primer polipéptido antigénico o un polipéptido concatemérico, en donde la vacuna tiene al menos 10 veces menos polinucleótido de ARN que el necesario para una vacuna de ARNm sin modificar no formulada en una LNP para producir un título de anticuerpos equivalente. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN está presente a una dosificación de 25-100 microgramos.

En otros aspectos la invención incluye un método para tratar a un sujeto anciano de 60 años o más que comprende administrar al sujeto una vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido antigénico o un polipéptido concatemérico en una cantidad eficaz para vacunar al sujeto.

En otros aspectos la invención incluye un método para tratar un sujeto joven de 17 años o más joven que comprende administrar al sujeto una vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido antigénico o un polipéptido concatemérico en una cantidad eficaz para vacunar al sujeto.

En otros aspectos la invención incluye un método para tratar un sujeto adulto que comprende administrar al sujeto una vacuna de ácido nucleico que comprende uno o más polinucleótidos de ARN que tienen un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido antigénico o un polipéptido concatemérico en una cantidad eficaz para vacunar al sujeto.

En algunos aspectos la invención comprende un método de vacunación de un sujeto con una vacuna de combinación que incluye al menos dos secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos en donde la dosificación para la vacuna es una dosificación terapéutica combinada en donde la dosificación de cada ácido nucleico individual que codifica un antígeno es una dosificación subterapéutica. En algunas realizaciones, la dosificación combinada es de 25 microgramos de polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunas realizaciones, la dosificación combinada es 100 microgramos de polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunas realizaciones, la dosificación combinada es 50 microgramos de polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunas realizaciones, la dosificación combinada es 75 microgramos de polinucleótido de<a>R<n>en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunas realizaciones, la dosificación combinada es 150 microgramos de polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunas realizaciones, la dosificación combinada es 400 microgramos de polinucleótido de ARN en la vacuna de ácido nucleico administrada al sujeto. En algunas realizaciones, la dosificación subterapéutica de cada ácido nucleico individual que codifica un antígeno es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 microgramos. En otras realizaciones, la vacuna de ácido nucleico se modifica químicamente y, en otras realizaciones, la vacuna de ácido nucleico no se modifica químicamente.

Otros componentes

Una LNP puede incluir uno o más componentes además de aquellos descritos en las secciones anteriores. En algunas realizaciones, una LNP puede incluir una o más moléculas hidrófobas pequeñas tales como una vitamina (p. ej., vitamina A o vitamina E) o un esterol.

Las nanopartículas lipídicas también pueden incluir una o más moléculas potenciadoras de la permeabilidad, carbohidratos, polímeros, agentes de alteración de la superficie, u otros componentes. Una molécula potenciadora de la permeabilidad puede ser una molécula descrita por la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos Núm. 2005/0222064, por ejemplo. Los carbohidratos pueden incluir azúcares simples (p. ej., glucosa) y polisacáridos (p. ej., glicógeno y derivados y análogos del mismo).

Un polímero puede incluirse en y/o utilizarse para encapsular o encapsular parcialmente una LNP. Un polímero puede ser biodegradable y/o biocompatible. Un polímero se puede seleccionar, pero sin limitarse a, entre poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poliestirenos, poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos. En algunas realizaciones, un polímero puede incluir poli(caprolactona) (PCL), polímero de etilenvinilacetato (EVA), ácido poli(láctico) (PLA, por sus siglas en inglés), ácido poli(L-láctico) (PLLA, por sus siglas en inglés), ácido poli(glicólico) (PGA, por sus siglas en inglés), ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLG<a>), ácido poli(L-láctico-co-glicólico) (PLLGA), poli(D,L-lactida) (PDLA, por sus siglas en inglés), poli(L-lactida) (PLLA, por sus siglas en inglés), poli(D,L-lactida-co-caprolactona), poli(D,L-lactida-co-caprolactona-co-glicólido), poli(D,L-lactida-co-PEO-co-D,L-lactida), poli(D,L-lactida-co-PPO-co-D,L-lactida), cianoacrilato de polialquilo, poliuretano, poli-L-lisina (PLL), metacrilato de hidroxipropilo (HPMA, por sus siglas en inglés), polietilenglicol, ácido poli-L-glutámico, poli(hidroxi)ácidos, polianhídridos, poliortoésteres, poli(éster amidas), poliamidas, poli(éster éteres), policarbonatos, polialquilenos tales como polietileno y polipropileno, polialquilenglicoles tales como poli(etilenglicol) (PEG), óxidos de polialquileno (PEO, por sus siglas en inglés), tereftalatos de polialquileno tales como tereftalato de polietileno), poli(alcoholes vinílicos) (PVA, por sus siglas en inglés), poli(éteres de vinilo), poli(ésteres de vinilo) tales como poli(acetato de vinilo), poli(haluros de vinilo) tales como poli(cloruro de vinilo) (PVC, por sus siglas en inglés), polivinilpirrolidona (PVP), polisiloxanos, poliestireno, poliuretanos, celulosas derivatizadas tales como alquil celulosas, hidroxialquil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitro celulosas, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, polímeros de ácidos acrílicos, tales como poli(metil(met)acrilato) (PMMA), poli(etil(met)acrilato), poli(butil(met)acrilato), poli(isobutil(met)acrilato), poli(hexil(met)acrilato), poli(isodecil(met)acrilato), poli(lauril(met)acrilato), poli(fenil(met)acrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), poli(octadecil acrilato) y copolímeros y mezclas de los mismos, polidioxanona y sus copolímeros, polihidroxialcanoatos, fumarato de polipropileno, polioximetileno, poloxámeros, poloxaminas, poli(orto)ésteres, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), poli(lactida-co-caprolactona), carbonato de trimetileno, poli(W-acriloilmorfolina) (PAcM), poli(2-metil-2- oxazolina) (PMOX), poli(2-etil-2-oxazolina) (PEOZ) y poliglicerol.

Los agentes de alteración de la superficie pueden incluir, pero sin limitarse a, proteínas aniónicas (p. ej., albúmina sérica bovina), tensioactivos (p. ej., tensioactivos catiónicos tales como bromuro de dimetildioctadecil-amonio), azúcares y derivados de azúcares (p. ej., ciclodextrina), ácidos nucleicos, polímeros (p. ej., heparina, polietilenglicol y poloxámero), agentes mucolíticos (p. ej., acetilcisteína, artemisa, bromelaína, papaína, clerodendrum, bromhexina, carbocisteína, eprazinona, mesna, ambroxol, sobrerol, domiodol, letoseteína, estepronina, tiopronina, gelsolina, timosina p4, dornasa alfa, neltenexina y erdosteína) y ADNasas (p. ej., rhADNasa). Un agente de alteración de la superficie puede disponerse dentro de una nanopartícula y/o en la superficie de una LNP (p. ej., mediante recubrimiento, adsorción, conexión covalente u otro procedimiento).

Una LNP también puede comprender uno o más lípidos funcionalizados. En algunas realizaciones, un lípido puede funcionalizarse con un grupo alquino que, al exponerse a una azida en condiciones de reacción adecuadas, puede experimentar una reacción de cicloadición. En particular, una bicapa lipídica puede funcionalizarse de esta manera con uno o más grupos útiles en la facilitación de la permeación de la membrana, el reconocimiento celular o la generación de imágenes. La superficie de una LNP también puede conjugarse con uno o más anticuerpos útiles. Los grupos funcionales y productos conjugados útiles en el suministro de células seleccionadas, generación de imágenes y permeación de la membrana son muy conocidos en la técnica.

Además de estos componentes, las nanopartículas lipídicas pueden incluir cualquier sustancia útil en composiciones farmacéuticas. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica puede incluir uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables o ingredientes accesorios tales como, pero sin limitarse a, uno o más disolventes, medios de dispersión, diluyentes, auxiliares de dispersión, auxiliares de suspensión, auxiliares de granulación, disgregantes, cargas, deslizantes, vehículos líquidos, aglutinantes, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes, aceites, conservantes, y otras especies. También pueden incluirse excipientes tales como ceras, mantecas, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, saborizantes y agentes aromatizantes. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington'sThe S c ie nce a n d P ra c tice o f P ha rm acy ,21a edición, A. R. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006).

Los ejemplos de diluyentes pueden incluir, pero sin limitarse a, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, fosfato de sodio, lactosa, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo y/o combinaciones de los mismos. Los agentes de granulación y dispersión se pueden seleccionar de la lista no limitante que consiste en almidón de patata, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato de almidón sódico, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar, bentonita, celulosa y productos de madera, esponja natural, resinas de intercambio catiónico, carbonato de calcio, silicatos, carbonato de sodio, poli(vinilpirrolidona) entrecruzada (crospovidona), carboximetilo almidón sódico (glicolato de almidón sódico), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica entrecruzada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón insoluble en agua, carboximetilcelulosa de calcio, aluminosilicato de magnesio (VEEGUM®), lauril sulfato de sodio, compuestos de amonio cuaternario y/o combinaciones de los mismos.

Los agentes tensioactivos y/o emulsionantes pueden incluir, pero sin limitarse a, emulsionantes naturales (p. ej., acacia, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, chondrux, colesterol, goma xantana, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, grasa de lana, colesterol, cera y lecitina), arcillas coloidales (p. ej., bentonita [silicato de aluminio] y VEEGUM ® [aluminosilicato de magnesio]), derivados de aminoácidos de cadena larga, alcoholes de peso molecular alto (p. ej., alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol oleílico, monoestearato de triacetina, diestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol, polialcohol vinílico), carbómeros (p. ej., carboxi polimetileno, ácido poliacrílico, polímero de ácido acrílico y polímero de carboxivinilo), carragenano, derivados de celulosa (p. ej., carboximetilcelulosa sódica, celulosa en polvo, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (p. ej., monolaurato de polioxietilensorbitán [TWEEN®20], polioxietilensorbitán [TWEEN® 60], monooleato de polioxietilensorbitán [TWEEN® 80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monoestearato de sorbitán [SPAN®60], triestearato de sorbitán [SPAN®65], monooleato de glicerilo, monooleato de sorbitán [SPAN®80]), ésteres de polioxietileno (p. ej., monoestearato de polioxietileno [MYRJ® 45], aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado, aceite de ricino polietoxilado, estearato de polioximetileno y SOLUTOL®), ésteres de ácidos grasos de sacarosa, ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol (p. ej.,<c>R<e>MOPHOR®), éteres de polioxietileno (p. ej., lauril éter de polioxietileno [BRIJ®30]), poli(vinil-pirrolidona), monolaurato de dietilengliclol, oleato de trietanolamina, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de etilo, ácido oleico, laurato de etilo, lauril sulfato de sodio, PLURONIC®F 68, POLOXAMe R ® 188, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, docusato sódico y/o combinaciones de los mismos.

Un agente aglutinante puede ser almidón (p. ej., almidón de maíz y pasta de almidón); gelatina; azúcares (p. ej., sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melaza, lactosa, lactitol, manitol); gomas naturales y sintéticas (p. ej., acacia, alginato de sodio, extracto de musgo irlandés, goma panwar, goma ghatti, mucílago de cáscara de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, poli(vinil-pirrolidona), aluminosilicato de magnesio (VEEGUM®) y arabogalactano de alerce); alginatos; óxido de polietileno; polietilenglicol; sales inorgánicas de calcio; ácidos silícicos; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol; y combinaciones de los mismos, o cualquier otro agente aglutinante adecuado.

Los ejemplos de conservantes pueden incluir, pero sin limitarse a, antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes alcohólicos, conservantes ácidos y/u otros conservantes. Los ejemplos de antioxidantes incluyen, pero sin limitarse a, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio y/o sulfito de sodio. Los ejemplos de agentes quelantes incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés), monohidrato de ácido cítrico, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato de sodio, ácido tartárico y/o edetato trisódico. Los ejemplos de conservantes antimicrobianos incluyen, pero sin limitarse a, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, bronopol, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol etílico, glicerina, hexetidina, imidurea, fenol, fenoxietanol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenglicol y/o timerosal. Los ejemplos de conservantes antifúngicos incluyen, pero sin limitarse a, butilparabeno, metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio, sorbato de potasio, benzoato de sodio, propionato de sodio y/o ácido sórbico. Los ejemplos de conservantes alcohólicos incluyen, pero sin limitarse a, etanol, polietilenglicol, alcohol bencílico, fenol, compuestos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato y/o alcohol feniletílico. Los ejemplos de conservantes ácidos incluyen, pero sin limitarse a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, beta-caroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido deshidroascórbico, ácido ascórbico, ácido sórbico y/o ácido fítico. Otros conservantes incluyen, pero sin limitarse a, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (BHA, por sus siglas en inglés), hidroxitolueno butilado (BHT, por sus siglas en inglés), etilendiamina, lauril sulfato de sodio (SLS, por sus siglas en inglés), lauril éter sulfato de sodio (SLES, por sus siglas en inglés), bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de potasio, metabisulfito de potasio, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, metilparabeno, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™ y/o EUXYL®.

Los ejemplos de agentes tamponadores incluyen, pero sin limitarse a, soluciones tampón de citrato, soluciones tampón de acetato, soluciones tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido d-glucónico, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, lactobionato de calcio, ácido propanoico, levulinato de calcio, ácido pentanoico, fosfato de calcio dibásico, ácido fosfórico, fosfato de calcio tribásico, hidróxido fosfato de calcio, acetato de potasio, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, tampones de amino-sulfonato (p. ej., HEPES), hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua libre de pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico y/o combinaciones de los mismos. Los agentes lubricantes se pueden seleccionar del grupo no limitante que consiste en estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, behanato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, lauril sulfato de magnesio, lauril sulfato de sodio, y combinaciones de los mismos.

Los ejemplos de aceites incluyen, pero sin limitarse a, aceites de almendra, semilla de albaricoque, aguacate, babasu, bergamota, semilla de grosellero negro, borraja, cade, manzanilla, canola, comino, carnauba, ricino, canela, manteca de cacao, coco, hígado de bacalao, café, maíz, semilla de algodón, emú, eucaliptus, onagra, pescado, semilla de lino, geraniol, calabaza, semilla de uva, avellana, hisopo, miristato de isopropilo, jojoba, nuez de la India, lavandín, lavanda, limón, litsea cubeba, nuez de macadamia, malva, semilla de mango, semilla de hierba de la pradera, visón, nuez moscada, oliva, naranja, reloj anaranjado, palma, palmiste, semilla de melocotón, cacahuete, semilla de amapola, semilla de calabaza, semilla de colza, salvado de arroz, romero, cártamo, sándalo, sasquana, ajedrea, espino cerval de mar, sésamo, manteca de karité, silicona, soja, girasol, árbol del té, cardo, tsubaki, vetiver, nogal y germen de trigo así como también estearato de butilo, triglicérido caprílico, triglicérido cáprico, ciclometicona, sebacato de dietilo, dimeticona 360, simeticona, miristato de isopropilo, aceite mineral, octildodecanol, alcohol oleílico, aceite de silicona y/o combinaciones de los mismos.

Composiciones farmacéuticas

Las formulaciones que comprenden nanopartículas lipídicas pueden formularse en su totalidad o en parte como composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir una o más nanopartículas lipídicas. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica puede incluir una o más nanopartículas lipídicas que incluyan uno o más agentes terapéuticos y/o profilácticos diferentes. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir, adicionalmente, uno o más excipientes o ingredientes accesorios farmacéuticamente aceptables tales como los descritos en el presente documento. Las reglas generales para la formulación y fabricación de composiciones farmacéuticas y agentes están disponibles, por ejemplo, enThe S c ie n ce a n d P ra c tice o f P h a rm a c yde Remington, 21a edición, A. R. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006. Se pueden utilizar excipientes e ingredientes accesorios convencionales en cualquier composición farmacéutica, excepto en la medida en que cualquier excipiente o ingrediente accesorio convencional pueda ser incompatible con uno o más componentes de una LNP en la formulación de la divulgación. Un excipiente o ingrediente accesorio pueden ser incompatibles con un componente de una LNP de la formulación si su combinación con el componente o la LNP da como resultado cualquier efecto biológico no deseado o efecto perjudicial de otro modo.

En algunas realizaciones, uno o más excipientes o ingredientes accesorios pueden conformar más de 50% de la masa o el volumen total de una composición farmacéutica que incluya una LNP. En algunas realizaciones, los uno o más excipientes o ingredientes accesorios conforman 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de una convención farmacéutica. En algunas realizaciones, un excipiente farmacéuticamente aceptable tiene una pureza de al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%. En algunas realizaciones, el excipiente se encuentra aprobado para el uso en seres humanos y para el uso veterinario. En algunas realizaciones, el excipiente se encuentra aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos. En algunas realizaciones, el excipiente es de grado farmacéutico. En algunas realizaciones, el excipiente cumple con las normas de la Farmacopea de Estados Unidos (USP, por sus siglas en inglés), la Farmacopea Europea (EP, por sus siglas en inglés), la Farmacopea Británica y/o la Farmacopea Internacional.

Las cantidades relativas de las una o más nanopartículas lipídicas, los uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación variarán, dependiendo de la identidad, el tamaño y/o el estado del sujeto en tratamiento y dependiendo adicionalmente de la vía mediante la cual se haya de administrar la composición. A modo de ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender entre 0,1% y 100% (p/p) de una o más nanopartículas lipídicas. En otro ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender entre 0,1% y 15% (peso/vol) de uno o más polímeros anfífilos (p. ej., 0,5%, 1%, 2,5%, 5%, 10% o 12,5% p/v).

En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas y/o composiciones farmacéuticas de la divulgación se refrigeran o congelan para su almacenamiento y/o traslado (p. ej., se almacenan a una temperatura de 4°C o menos, tal como una temperatura de entre aproximadamente -150°C y aproximadamente 0°C o entre aproximadamente -80°C y aproximadamente -20°C (p. ej., aproximadamente -5°C, -10°C, -15°C, -20°C, -25°C, -30°C, -40°C, -50°C, -60°C, -70°C, -80°C, -90°C, -130°C o -150°C). Por ejemplo, la composición farmacéutica que comprende una o más nanopartículas lipídicas es una solución o sólido (p. ej., mediante liofilización) que se refrigera para su almacenamiento y/o traslado, por ejemplo, a aproximadamente -20°C, -30°C, -40°C, -50°C, -60°C, -70°C o -80°C. En ciertas realizaciones, la divulgación también se refiere a un método para aumentar la estabilidad de las nanopartículas lipídicas y mediante el almacenamiento de las nanopartículas lipídicas y/o composiciones farmacéuticas de las mismas a una temperatura de 4°C o menos, tal como una temperatura de entre aproximadamente -150°C y aproximadamente 0°C o entre aproximadamente -80°C y aproximadamente -20°C, p. ej., aproximadamente -5°C, -10°C, -15°C, -20°C, -25°C, -30°C, -40°C, -50°C, -60°C, -70°C, -80°C, -90°C, -130°C o -150°C).

Las nanopartículas lipídicas y/o composiciones farmacéuticas que incluyen una o más nanopartículas lipídicas pueden administrarse a cualquier paciente o sujeto, incluyendo pacientes o sujetos que puedan beneficiarse de un efecto terapéutico proporcionado por el suministro de un agente terapéutico y/o profiláctico a una o más células, tejidos, órganos o sistemas particulares o grupos de los mismos, tales como el sistema renal. Si bien las descripciones que se proporcionan en el presente documento de nanopartículas lipídicas y composiciones farmacéuticas que incluyen nanopartículas lipídicas se dirigen principalmente a composiciones adecuadas para la administración a seres humanos, el experto en la técnica comprenderá que tales composiciones son adecuadas generalmente para la administración a cualquier otro mamífero. La modificación de las composiciones adecuadas para la administración a seres humanos con el fin de hacerlas adecuadas para la administración a diversos animales es muy conocida y el experto farmacéutico veterinario puede diseñar y/o realizar tal modificación con experimentación meramente de rutina, o sin ella. Los sujetos sobre los cuales se contempla la administración de las composiciones incluyen, pero sin limitarse a, seres humanos, otros primates y otros mamíferos, incluyendo mamíferos comercialmente relevantes tales como ganado vacuno, cerdos, caballos, ovejas, gatos, perros, ratones y/o ratas.

Una composición farmacéutica que incluye una o más nanopartículas lipídicas se pueden preparar mediante cualquier método conocido o desarrollado más adelante en la técnica de la farmacología. En general, tales métodos de preparación incluyen la asociación del ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más ingredientes accesorios y después, si fuera necesario o conveniente, la división, la formación y/o el envasado del producto en una unidad de dosis única o de dosis múltiples deseada.

Una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción se puede preparar, envasar y/o comercializar a granel, en una dosis unitaria única y/o en múltiples dosis unitarias únicas. Como se emplea en el presente documento, una “dosis unitaria” es la cantidad específica de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo (p. ej., nanopartícula lipídica). La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosificación del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de esa dosificación tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de tal dosificación.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar de varias maneras adecuadas para una variedad de vías y métodos de administración. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se pueden preparar en formas de dosificación líquida (p. ej., emulsiones, microemulsiones, nanoemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires), formas inyectables, formas de dosificación sólidas (p. ej., cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos), formas de dosificación para la administración tópica y/o transdérmica (p. ej., ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhaladores y parches), suspensiones, polvos, y otras formas.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral y parenteral incluyen, pero sin limitarse a, emulsiones, microemulsiones, nanoemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de ingredientes activos, las formas de dosificación líquidas pueden comprender diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales pueden incluir agentes terapéuticos y/o profilácticos adicionales, agentes adicionales tales como agentes humectantes, emulsionantes y de suspensión, edulcorantes, saborizantes y/o aromatizantes. En ciertas realizaciones para la administración parenteral, las composiciones se mezclan con agentes solubilizantes tales como Cremophor®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros y/o combinaciones de los mismos.

Es posible formular preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles de acuerdo con la técnica conocida mediante el uso de agentes de dispersión, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o disolventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse, se encuentran el agua, la solución de Ringer, USP y la solución isotónica de cloruro de sodio. Los aceites no volátiles estériles se emplean de manera convencional como un medio disolvente o de suspensión. Con este fin, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico, se pueden utilizar en la preparación de inyectables.

Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias y/o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se puedan disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.

Con el fin de prolongar el efecto de un ingrediente activo, a menudo es conveniente ralentizar la absorción del ingrediente activo de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con poca solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco depende, en ese caso, de su velocidad de disolución, que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. De manera alternativa, la absorción retardada de una forma de fármaco mediante administración parenteral se logra al disolver o suspender el fármaco en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se elaboran mediante la formación de matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. Dependiendo de la razón del fármaco con respecto al polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, es posible controlar la velocidad de la liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de depósito inyectables se preparan al capturar el fármaco en liposomas o microemulsiones compatibles con los tejidos corporales.

Las composiciones para la administración rectal o vaginal son típicamente supositorios que se pueden preparar mezclando las composiciones con excipientes no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios, que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal y, por lo tanto, se derriten en el recto o la cavidad vaginal y liberan el ingrediente activo.

Las formas de dosificación sólidas para la administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, películas, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólida, un ingrediente activo se mezcla con al menos un excipiente inerte y farmacéuticamente aceptable tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o cargas o expansores (p. ej., almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico), aglutinantes (p. ej., carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y acacia), humectantes (p. ej., glicerol), agentes disgregantes (p. ej., agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y carbonato de sodio), agentes retardantes de la disolución (p. ej., parafina), aceleradores de la absorción (p. ej., compuestos de amonio cuaternario), agentes humectantes (p. ej., alcohol cetílico y monoestearato de glicerol), absorbentes (p. ej., arcilla de bentonita y caolín, silicatos), y lubricantes (p. ej., talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio), y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma de dosificación puede comprender agentes tamponadores.

Es posible emplear composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina blandas o duras mediante el uso de excipientes tales como lactosa o galactosa, así como también polietilenglicoles de peso molecular alto y similares. Se pueden preparar formas de dosificación sólida de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos muy conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. Opcionalmente pueden contener agentes opacificantes y también pueden tener una composición tal que liberen el o los ingredientes activos únicamente, o preferentemente, en una parte determinada del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que pueden emplearse incluyen sustancias poliméricas y ceras. Es posible emplear composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina blandas o duras mediante el uso de excipientes tales como lactosa o galactosa, así como también polietilenglicoles de peso molecular alto y similares.

Las formas de dosificación para la administración tópica y/o transdérmica de una composición pueden incluir ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhaladores y/o parches. Por lo general, se mezcla un ingrediente activo en condiciones estériles con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier conservante y/o tampón necesario, según se necesite. De manera adicional, la presente divulgación contempla el uso de parches transdérmicos, que a menudo poseen la ventaja adicional de proporcionar un suministro controlado de un compuesto al organismo. Tales formas de dosificación se pueden preparar, por ejemplo, mediante disolución y/o dispersión del compuesto en el medio adecuado. De manera alternativa o adicional, es posible controlar la velocidad ya sea proporcionando una membrana de control de la velocidad y/o dispersando el compuesto en un gel y/o una matriz de polímero.

Los dispositivos adecuados para su uso en el suministro de composiciones farmacéuticas intradérmicas descritas en el presente documento incluyen dispositivos de aguja corta, tales como los que se describen en las Patentes de Estados Unidos Núm. 4,886,499; 5,190,521; 5,328,483; 5,527,288; 4,270,537; 5,015,235; 5,141,496; y 5,417,662. Las composiciones intradérmicas pueden administrarse mediante dispositivos que limitan la longitud de penetración eficaz de una aguja en la piel, tales como los que se describen en la publicación PCT WO 99/34850 y los equivalentes funcionales de los mismos. Son adecuados los dispositivos de inyección a chorro que suministran las composiciones líquidas a la dermis a través de un inyector a chorro de líquidos y/o a través de una aguja que perfora la capa córnea y produce un chorro que alcanza la dermis. Los dispositivos de inyección a chorro se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Núm.

5,480,381; 5,599,302; 5,334,144; 5,993,412; 5,649,912; 5,569,189; 5,704,911; 5,383,851; 5,893,397; 5,466,220; 5,339,163; 5,312,335; 5,503,627; 5,064,413; 5,520,639; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 4,940,460; y las Publicaciones PCT WO 97/37705 y WO 97/13537. Son adecuados los dispositivos balísticos de administración de polvo/partículas que utilizan gas comprimido para acelerar la vacuna en forma de polvo a través de las capas externas de la piel hacia la dermis. De manera alternativa o adicional, se pueden utilizar jeringas convencionales en el método de mantoux clásico de administración intradérmica.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen, pero sin limitarse a, preparaciones líquidas y/o semilíquidas tales como linimentos, lociones, emulsiones de aceite en agua y/o agua en aceite, tales como cremas, ungüentos y/o pastas, y/o soluciones y/o suspensiones. Las formulaciones que pueden ser administradas por vía tópica pueden, por ejemplo, comprender de aproximadamente 1% a aproximadamente 10% (p/p) de ingrediente activo, aunque la concentración del ingrediente activo puede ser tan alta como lo permita el límite de solubilidad del ingrediente activo en el disolvente. Las formulaciones para la administración tópica pueden comprender adicionalmente uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento.

Una composición farmacéutica se puede preparar, envasar y/o comercializar en una formulación adecuada para la administración pulmonar a través de la cavidad bucal. Tal formulación puede comprender partículas secas que comprendan el ingrediente activo. Tales composiciones se encuentran convenientemente en forma de polvos secos para su administración mediante el uso de un dispositivo que comprende un depósito de polvo seco al cual puede dirigirse una corriente de propelente para dispersar el polvo y/o el uso de un recipiente de dispensación de disolvente/polvo autoimpulsante, tal como un dispositivo que comprende el ingrediente activo disuelto y/o suspendido en un propelente de punto de ebullición bajo en un recipiente hermético. Las composiciones de polvo seco pueden incluir un diluyente de polvo fino sólido tal como azúcar, y se proporcionan de manera conveniente en una forma de dosis unitaria.

Los propelentes de punto de ebullición bajo incluyen generalmente propelentes líquidos que tienen un punto de ebullición por debajo de 18,33°C (65°F) a presión atmosférica. Por lo general, el propelente puede constituir de 50% a 99,9% (p/p) de la composición, y el ingrediente activo puede constituir de 0,1% a 20% (p/p) de la composición. Un propelente puede comprender adicionalmente ingredientes adicionales, tales como un tensioactivo no iónico líquido y/o aniónico sólido y/o un diluyente sólido (que puede tener un tamaño de partícula del mismo orden que las partículas que comprenden el ingrediente activo).

Las composiciones farmacéuticas formuladas para el suministro pulmonar pueden proporcionar un ingrediente activo en forma de gotitas de una solución y/o suspensión. Tales formulaciones se pueden preparar, envasar y/o comercializar como suspensiones y/o soluciones alcohólicas diluidas y/o acuosas, opcionalmente estériles, que comprendan el ingrediente activo y pueden administrarse de manera conveniente mediante el uso de cualquier dispositivo de nebulización y/o atomización. Tales formulaciones pueden comprender adicionalmente uno o más ingredientes adicionales, incluyendo, pero sin limitarse a, un agente saborizante, tal como sacarina sódica, un aceite volátil, un agente tamponador, un agente tensioactivo y/o un conservante tal como metilhidroxibenzoato. Las gotitas proporcionadas mediante esta vía de administración pueden tener un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 200 nm.

Las formulaciones descritas en el presente documento por ser útiles para el suministro pulmonar son útiles para el suministro intranasal de una composición farmacéutica. Otra formulación adecuada para la administración intranasal es un polvo grueso que comprende el ingrediente activo y que tiene una partícula promedio de aproximadamente 0,2 pm a 500 pm. Tal formulación se administra de la manera en que se realiza la inhalación, es decir, mediante inhalación rápida a través de la vía nasal de un recipiente del polvo colocado próximo a la nariz.

Las formulaciones adecuadas para la administración nasal pueden, por ejemplo, comprender desde aproximadamente un mínimo de 0,1% (p/p) hasta un máximo de 100% (p/p) de ingrediente activo, y pueden comprender uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento. Una composición farmacéutica se puede preparar, envasar y/o comercializar en una formulación adecuada para la administración bucal. Tales formulaciones pueden, por ejemplo, tener la forma de comprimidos y/o pastillas elaboradas mediante el uso de métodos convencionales, y pueden contener, por ejemplo, de 0,1% a 20% (p/p) de ingrediente activo, comprendiendo el remanente una composición oral soluble y/o degradable y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento. De manera alternativa, las formulaciones adecuadas para la administración bucal pueden comprender un polvo y/o una solución y/o una suspensión que se pueden utilizar en aerosol y/o atomizar, que comprendan el ingrediente activo. Tales formulaciones en polvo, que se pueden utilizar en aerosol y/o atomizar, cuando se dispersan, pueden tener un tamaño de gotita y/o partícula promedio en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm y pueden comprender adicionalmente uno o más de cualquiera de los ingredientes adicionales descritos en el presente documento.

Una composición farmacéutica se puede preparar, envasar y/o comercializar en una formulación adecuada para la administración oftálmica. Tales formulaciones pueden, por ejemplo, encontrarse en forma de gotas para los ojos que incluyen, por ejemplo, una solución y/o suspensión de 0,1/1,0% (p/p) del ingrediente activo en un excipiente líquido acuoso u oleoso. Tales gotas pueden comprender adicionalmente agentes tamponadores, sales y/u uno o más de otros ingredientes adicionales cualesquiera descritos en el presente documento. Otras formulaciones que se pueden administrar por vía oftálmica que son útiles incluyen aquellas que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina y/o en una preparación de liposomas. También se contemplan gotas para los oídos y/o gotas para los ojos dentro del alcance de la presente divulgación.

Métodos de producción de polipéptidos en células

La presente divulgación proporciona métodos de producción de un polipéptido de interés en una célula de mamífero. Los métodos de producción de polipéptidos implican la puesta en contacto de una célula con una formulación de la divulgación que comprende una LNP que incluye un ARNm que codifica el polipéptido de interés. A partir de la puesta en contacto de la célula con la nanopartícula lipídica, el ARNm puede absorberse y traducirse en la célula para producir el polipéptido de interés.

En general, la etapa de puesta en contacto de una célula de mamífero con una LNP que incluye un ARNm que codifica un polipéptido de interés puede realizarsein vivo, e x vivo,en cultivo oin vitro.La cantidad de nanopartícula lipídica que se pone en contacto con una célula, y/o la cantidad de ARNm en esta, pueden depender del tipo de célula o tejido que participa del contacto, el medio de administración, las características fisioquímicas de la nanopartícula lipídica y el ARNm (p. ej., tamaño, carga y composición química) allí contenido, y otros factores. En general, una cantidad eficaz de la nanopartícula lipídica permitirá una producción eficiente de polipéptidos en la célula. Las mediciones de la eficiencia pueden incluir la traducción de polipéptidos (indicada por la expresión de polipéptidos), el nivel de degradación de ARNm e indicadores de la respuesta inmunitaria.

La etapa de puesta en contacto de una LNP que incluye un ARNm con una célula puede implicar o provocar la transfección. Un fosfolípido incluido en el componente lipídico de una LNP puede facilitar la transfección y/o aumentar la eficiencia de la transfección, por ejemplo, mediante la interacción y/o fusión con una membrana celular o intracelular. La transfección puede permitir la traducción del ARNm dentro de la célula.

En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas descritas en el presente documento se pueden utilizar con fines terapéuticos. Por ejemplo, un ARNm incluido en una LNP puede codificar un polipéptido terapéutico (p. ej., en una región traducible) y producir el polipéptido terapéutico a partir de la puesta en contacto y/o entrada (p. ej., transfección) en una célula. En otras realizaciones, un ARNm incluido en una LNP puede codificar un polipéptido que puede mejorar o aumentar la inmunidad de un sujeto. En algunas realizaciones, un ARNm puede codificar un factor de estimulación de colonias de granulocitos o trastuzumab.

En algunas realizaciones, un ARNm incluido en una LNP puede codificar un polipéptido recombinante que puede remplazar uno o más polipéptidos que pueden estar sustancialmente ausentes en una célula puesta en contacto con la nanopartícula lipídica. Los uno o más polipéptidos sustancialmente ausentes pueden faltar debido a una mutación genética del gen codificante o una vía reguladora del mismo. De manera alternativa, un polipéptido recombinante producido mediante la traducción del ARNm puede suscitar antagonismo sobre la actividad de una proteína endógena presente en, sobre la superficie de, o secretada por la célula. Un polipéptido recombinante antagonista puede ser conveniente para combatir los efectos perjudiciales provocados por las actividades de la proteína endógena, tales como localización o actividades alteradas provocadas mediante mutación. En otra alternativa, un polipéptido recombinante producido mediante la traducción del ARNm puede suscitar antagonismo directamente o indirectamente sobre la actividad de un radical biológico presente en, sobre la superficie de, o secretado por la célula. Los radicales biológicos sobre los que se ha suscitado antagonismo pueden incluir, pero sin limitarse a, lípidos (p. ej., colesterol), lipoproteínas (p. ej., lipoproteína de baja densidad), ácidos nucleicos, carbohidratos y toxinas de molécula pequeña. Los polipéptidos recombinantes producidos mediante traducción del ARNm se pueden modificar genéticamente cambiar la localización dentro de la célula, tal como dentro de un compartimiento específico tal como el núcleo, o se pueden modificar genéticamente para que sean secretados desde la célula o para que sean traslocados a la membrana plasmática de la célula.

En algunas realizaciones, poner en contacto una célula con una LNP que incluye un ARNm puede reducir la respuesta inmunitaria innata de una célula a un ácido nucleico exógeno. Una célula puede ponerse en contacto con una primera nanopartícula lipídica que incluye una primera cantidad de un primer ARNm exógeno que incluye una región traducible y se puede determinar el nivel de la respuesta inmunitaria innata de la célula al primer ARNm exógeno. Posteriormente, la célula puede ponerse en contacto con una segunda composición que incluye una segunda cantidad del primer ARNm exógeno, siendo la segunda cantidad una cantidad menor del primer ARNm exógeno en comparación con la primera cantidad. De manera alternativa, la segunda composición puede incluir una primera cantidad de un segundo ARNm exógeno que es diferente del primer ARNm exógeno. Las etapas de puesta en contacto de la célula con la primera y segunda composiciones pueden repetirse una o más veces. De manera adicional, se puede determinar opcionalmente la eficiencia de la producción de polipéptidos (p. ej., traducción) en la célula, y la célula puede volver a ponerse en contacto con la primera y/o segunda composiciones de manera repetitiva hasta que se logre una eficiencia en la producción de proteínas diana.

Métodos de suministro de agentes terapéuticos a células y órganos

La presente divulgación proporciona métodos de suministro de un agente terapéutico y/o profiláctico, tal como un ácido nucleico, a una célula o un órgano de mamífero. El suministro de un agente terapéutico y/o profiláctico a una célula implica administrar una formulación de la divulgación que comprende una LNP que incluye el agente terapéutico y/o profiláctico, tal como un ácido nucleico, a un sujeto, donde la administración de la composición implica poner en contacto a la célula con la composición. En algunas realizaciones, una proteína, un agente citotóxico, un ion radiactivo, un agente quimioterapéutico o un ácido nucleico (tal como un ARN, p. ej., ARNm) se puede suministrar a una célula o un órgano. En el caso de que el agente terapéutico y/o profiláctico sea un ARNm, a partir de la puesta en contacto de una célula con la nanopartícula lipídica, un ARNm traducible puede traducirse en la célula para producir un polipéptido de interés. Sin embargo, también se pueden suministrar a las células ARNm no traducibles sustancialmente. Los ARNm no traducibles sustancialmente pueden ser útiles como vacunas y/o pueden secuestrar componentes de la traducción de una célula para reducir la expresión de otras especies en la célula.

En algunas realizaciones, una LNP puede dirigirse a un tipo o una clase de células particular (p. ej., células de un órgano particular o sistema del mismo). En algunas realizaciones, una LNP que incluye un agente terapéutico y/o profiláctico de interés se puede suministrar específicamente al hígado, riñón, bazo, fémur o pulmón de mamífero. El suministro específico de una clase particular de células, un órgano o un sistema o grupo de los mismos implica que una proporción más alta de nanopartículas lipídicas que incluyen un agente terapéutico y/o profiláctico se suministran en el destino (p. ej., tejido) de interés con respecto a otros destinos, p. ej., a partir de la administración de una LNP a un mamífero. En algunas realizaciones, el suministro específico puede dar como resultado un aumento de más de 2 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces o 20 veces de la cantidad de agente terapéutico y/o profiláctico cada gramo de tejido del destino objetivo (p. ej., tejido de interés, tal como hígado) en comparación con otro destino (p. ej., bazo). En algunas realizaciones, el tejido de interés se selecciona del grupo que consiste en hígado, riñones, pulmones, bazo, fémur, endotelio vascular en los vasos sanguíneos (p. ej., a nivel intracoronario o intrafemoral) o los riñones y tejido tumoral (p. ej., a través de la inyección intratumoral).

En otro ejemplo de suministro dirigido o específico, se puede incluir en una LNP un ARNm que codifica un compañero de unión a proteínas (p. ej., un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, una proteína de armazón o un péptido) o un receptor en la superficie de una célula. De manera adicional o alternativa, se puede utilizar un ARNm para dirigir la síntesis y localización extracelular de lípidos, carbohidratos, u otros radicales biológicos. De manera alternativa, se pueden seleccionar otros agentes terapéuticos y/o profilácticos o elementos (p. ej., lípidos o ligandos) de una LNP en función de su afinidad por receptores particulares (p. ej., receptores de lipoproteínas de densidad baja) de forma tal que una LNP pueda interactuar más fácilmente con una población de células diana que incluye los receptores. En algunas realizaciones, los ligandos pueden incluir, pero sin limitarse a, miembros de un par de unión específica, anticuerpos, anticuerpos monoclonales, fragmentos Fv, fragmentos Fv monocatenarios (scFv), fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos camelizados y fragmentos de los mismos, anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos, y versiones multivalentes de los mismos; reactivos de unión multivalente que incluyen anticuerpos mono o biespecíficos tales como fragmentos Fv estabilizados con disulfuro, scFv en tándem, dianticuerpos, trianticuerpos, o tetraanticuerpos; y aptámeros, receptores y proteínas de fusión.

En algunas realizaciones, un ligando puede ser un anticuerpo unido a la superficie, que puede permitir el ajuste de la especificidad de direccionamiento celular. Esto es especialmente útil ya que se pueden generar anticuerpos altamente específicos contra un epítopo de interés para el sitio de direccionamiento deseado. En algunas realizaciones, se expresan múltiples anticuerpos en la superficie de una célula, y cada anticuerpo puede tener una especificidad diferente con respecto a una diana deseada. Tales estrategias pueden aumentar la avidez y especificidad de las interacciones de direccionamiento.

Un experto en la técnica biológica, p. ej., puede seleccionar un ligando, basándose en la localización o función deseadas de la célula. En algunas realizaciones, un ligando del receptor de estrógeno, tal como tamoxifeno, puede dirigir células a células de cáncer de mama dependientes de estrógeno que tienen una mayor cantidad de receptores de estrógeno en la superficie celular. Otros ejemplos no limitantes de interacciones ligando/receptor incluyen CCR1 (p. ej., para el tratamiento de tejidos de articulaciones inflamadas o el cerebro en la artritis reumatoide y/o la esclerosis múltiple), CCR7, CCR8 (p. ej., para el direccionamiento hacia el tejido de los ganglios linfáticos), CCR6, CCR9, CCR 10 (p. ej., para dirigirse al tejido intestinal), CCR4, CCR 10 (p. ej., para dirigirse a la piel), CXCR4 (p. ej., para una transmigración mejorada general), HCELL (p. ej., para el tratamiento de la inflamación y trastornos inflamatorios, médula ósea), Alpha4beta7 (p. ej., para el direccionamiento hacia la mucosa intestinal) y VLA-4NCAM-1 (p. ej., para el direccionamiento al endotelio). En general, se puede emplear cualquier receptor implicado en el direccionamiento (p. ej., metástasis del cáncer) para el uso en los métodos y las composiciones que se describen en el presente documento.

Las células diana pueden incluir, pero sin limitarse a, hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células de la musculatura lisa vascular, cardiomiocitos, células de músculo esquelético, células beta, células pituitarias, células de revestimiento sinovial, células de los ovarios, células de los testículos, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.

En algunas realizaciones, una LNP puede dirigirse a los hepatocitos. Se ha demostrado que las apolipoproteínas tales como la apoliproteína E (apoE) se asocian en el organismo a nanopartículas lipídicas que contienen lípidos neutros o casi neutros, y se sabe que se asocian a receptores tales como receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDLR, por sus siglas en inglés) que se encuentran en la superficie de los hepatocitos. Por lo tanto, una LNP que incluye un componente lipídico con una carga neutra o casi neutra que se administra a un sujeto puede adquirir apoE en el organismo de un sujeto y puede suministrar posteriormente un agente terapéutico y/o profiláctico (p. ej., un ARN) a hepatocitos que incluyen LDLR de manera dirigida.

Métodos de tratamiento de enfermedades y trastornos

Las nanopartículas lipídicas pueden ser útiles para tratar una enfermedad, un trastorno o una afección. En particular, tales composiciones pueden ser útiles para tratar una enfermedad, un trastorno o una afección que se caractericen por una actividad de proteínas o polipéptidos anómala o ausente. En algunas realizaciones, se puede administrar o suministrar a una célula una formulación de la divulgación que comprenda una LNP que incluya un ARNm que codifique un polipéptido ausente o anómalo. La traducción posterior del ARNm puede producir el polipéptido, para reducir o eliminar de ese modo un problema provocado por la ausencia de, o la actividad anómala provocada por, el polipéptido. Dado que la traducción se puede producir rápidamente, los métodos y las composiciones pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, trastornos, o afecciones de carácter agudo tales como la sepsis, la apoplejía y el infarto de miocardio. Un agente terapéutico y/o profiláctico incluido en una LNP también puede ser capaz de alterar la velocidad de transcripción de una especie determinada, lo cual afecta a la expresión génica.

Las enfermedades, los trastornos y/o las afecciones que se caracterizan por una actividad disfuncional o anómala de las proteínas o los polipéptidos para los cuales se puede administrar una composición incluyen, pero sin limitarse a, enfermedades raras, enfermedades infecciosas (como vacunas y como agentes terapéuticos), cáncer y enfermedades proliferativas, enfermedades genéticas (p. ej., fibrosis quística), enfermedades autoinmunitarias, diabetes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardio y renovasculares y enfermedades metabólicas. Múltiples enfermedades, trastornos y/o afecciones se pueden caracterizar por la ausencia de actividad proteica (o una disminución sustancial de esta de forma tal que no se produzca una función de proteína adecuada). Es posible que esas proteínas no estén presentes, o puedan ser esencialmente no funcionales. Un ejemplo específico de una proteína disfuncional consiste en las variantes por mutación de cambio de sentido del gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), que producen una variante de proteína disfuncional de la proteína CFTR, lo cual provoca la fibrosis quística. La presente divulgación proporciona un método para tratar tales enfermedades, trastornos y/o afecciones en un sujeto mediante la administración de una LNP que incluye un ARN y un componente lipídico que incluye un lípido de acuerdo con la Fórmula (I), un fosfolípido (opcionalmente insaturado), un lípido PEG y un lípido estructural, en donde el ARN puede ser un ARNm que codifique un polipéptido que suscite antagonismo sobre, o supere de otro modo una actividad de proteína anómala presente en la célula del sujeto.

La divulgación proporciona métodos que implican la administración de nanopartículas lipídicas que incluyen uno o más agentes terapéuticos y/o profilácticos, tales como un ácido nucleico, y composiciones farmacéuticas que las incluyen. Los términos terapéutico y profiláctico se pueden utilizar de manera intercambiable en el presente documento con respecto a elementos y realizaciones de la presente divulgación. Las composiciones terapéuticas, o composiciones de obtención de imágenes, de diagnóstico o profilácticas de las mismas, pueden administrarse a un sujeto mediante el uso de cualquier cantidad razonable y cualquier vía de administración eficaz para prevenir, tratar, diagnosticar u obtener imágenes de una enfermedad, un trastorno y/o una afección, y/o cualquier otro propósito. La cantidad específica administrada a un sujeto determinado puede variar dependiendo de la especie, edad y estado general del sujeto; el propósito de la administración; la composición particular; el modo de administración; y similares. Las composiciones de acuerdo con la presente divulgación se pueden formular en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Sin embargo, se comprenderá que el uso total diario de una composición de la presente divulgación será decidido por un médico a cargo dentro del alcance de la opinión médica bien fundada. El nivel de dosis con eficacia terapéutica, con eficacia profiláctica o adecuado de otro modo (p. ej., para la obtención de imágenes) para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la gravedad e identidad de un trastorno en tratamiento, si lo hubiera; los uno o más agentes terapéuticos y/o profilácticos empleados; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción de la composición farmacéutica específica empleada; la duración del tratamiento; los fármacos utilizados combinados o simultáneamente con la composición farmacéutica específica empleada; y factores similares muy conocidos en el campo de la medicina.

Se puede administrar una LNP que incluya uno o más agentes terapéuticos y/o profilácticos, tales como un ácido nucleico, por cualquier vía. En algunas realizaciones, las composiciones, que incluyen composiciones profilácticas, de diagnóstico o de obtención de imágenes que incluyen una o más nanopartículas lipídicas descritas en el presente documento, se administran mediante una o más de una variedad de vías, que incluyen la vía oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, subcutánea, intraventricular, trans o intradérmica, interdérmica, rectal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (p. ej., mediante polvos, ungüentos, cremas, geles, lociones y/o gotas), mucosa, nasal, bucal, entérica, intravítrea, intratumoral, sublingual, intranasal; mediante instilación intratraqueal, instilación bronquial y/o inhalación; como una pulverización y/o polvo oral, pulverización nasal y/o aerosol, y/o a través de un catéter en la vena porta. En algunas realizaciones, se puede administrar una composición por vía intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraarterial, intratumoral, subcutánea o por inhalación. Sin embargo, la presente divulgación comprende el suministro o la administración de composiciones descritas en el presente documento mediante cualquier vía apropiada teniendo en cuenta los posibles avances en las ciencias del suministro de fármacos. En general, la vía de administración más adecuada dependerá de una variedad de factores que incluyen la naturaleza de la nanopartícula lipídica que incluye uno o más agentes terapéuticos y/o profilácticos (p. ej., su estabilidad en diversos entornos corporales tal como el torrente sanguíneo y el tracto gastrointestinal), el estado del paciente (p. ej., si el paciente puede tolerar vías de administración particulares), etc.

En ciertas realizaciones, las composiciones de acuerdo con la presente divulgación se pueden administrar a niveles de dosificación suficientes para suministrar de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 0,25 mg/kg, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 0,25 mg/kg, de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 0,25 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 0,25 mg/kg, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 0,25 mg/kg, o de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 0,25 mg/kg de un agente terapéutico y/o profiláctico (p. ej., un ARNm) a una dosis determinada, donde una dosis de 1 mg/kg (mpk) proporciona 1 mg de un agente terapéutico y/o profiláctico por cada kilogramo de peso corporal del sujeto. En algunas realizaciones, se puede administrar una dosis de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de un agente terapéutico y/o profiláctico (p. ej., un ARNm) de una LNP. En otras realizaciones, se puede administrar una dosis de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 2,5 mg/kg de un agente terapéutico y/o profiláctico. En ciertas realizaciones, se puede administrar una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg. En otras realizaciones, se puede administrar una dosis de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 0,25 mg/kg. Se puede administrar una dosis una o más veces por día, en la misma cantidad o una cantidad diferente, para obtener un nivel deseado de expresión de ARNm y/o efecto terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de obtención de imágenes. La dosificación deseada se puede suministrar, por ejemplo, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, en días alternos, cada tres días, una vez a la semana, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. En ciertas realizaciones, es posible suministrar la dosificación deseada en administraciones múltiples (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones). En algunas realizaciones, se puede administrar una dosis única, por ejemplo, antes o después de un procedimiento quirúrgico o en el caso de una enfermedad, trastorno o afección agudos.

Las nanopartículas lipídicas que incluyen uno o más agentes terapéuticos y/o profilácticos, tales como un ácido nucleico, se pueden utilizar combinadas con uno o más agentes terapéuticos, profilácticos, de diagnóstico distintos o para la obtención de imágenes. No se pretende que “combinado con” implique que los agentes deban administrarse al mismo tiempo y/o formularse para el suministro conjunto, si bien estos métodos de suministro se encuentran dentro del alcance de la presente divulgación. En algunas realizaciones, se pueden administrar combinadas una o más nanopartículas lipídicas que incluyen uno o más agentes terapéuticos y/o profilácticos diferentes. Las composiciones se pueden administrar simultáneamente a, antes de, o después de, otro u otros productos terapéuticos o procedimientos médicos deseados. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o según un programa determinado para dicho agente. En algunas realizaciones, la presente divulgación comprende el suministro de composiciones, o composiciones para la obtención de imágenes, de diagnóstico o profilácticas de las mismas combinadas con agentes que mejoren su biodisponibilidad, reduzcan y/o modifiquen su metabolismo, inhiban su excreción y/o modifiquen su distribución dentro del organismo.

Se entenderá adicionalmente que los agentes con actividad terapéutica, profiláctica, de diagnóstico o para la obtención de imágenes utilizados combinados se pueden administrar juntos en una única composición o administrar por separado en composiciones diferentes. En general, se espera que los agentes utilizados combinados se utilicen a niveles que no superen los niveles a los cuales estos se utilizan individualmente. En algunas realizaciones, los niveles utilizados en las combinaciones pueden ser inferiores a los utilizados individualmente.

La combinación particular de terapias (agentes terapéuticos o procedimientos) para su empleo en un régimen combinado tendrá en cuenta la compatibilidad de los productos terapéuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado que se pretenda alcanzar. También se entenderá que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, se puede administrar una composición útil para tratar el cáncer simultáneamente con un agente quimioterapéutico), o pueden lograr efectos diferentes (p. ej., control de cualquier efecto adverso, tales como reacciones relacionadas con la infusión).

Una LNP se puede utilizar combinada con un agente para aumentar la eficacia y/o ventana terapéutica de la composición. Tal agente puede ser, por ejemplo, un compuesto antiinflamatorio, un esteroide (p. ej., un corticosteroide), una estatina, un estradiol, un inhibidor de BTK, un agonista de S1P1, un modulador de los receptores de glucocorticoides (GRM, por sus siglas en inglés) o una antihistamina. En algunas realizaciones, una LNP se puede utilizar combinada con dexametasona, metotrexato, acetaminofeno, un bloqueador del receptor de H1 o un bloqueador del receptor de H2. En algunas realizaciones, un método de tratamiento de un sujeto que lo necesite o de suministro de un agente terapéutico y/o profiláctico a un sujeto (p. ej., un mamífero) puede implicar un tratamiento previo del sujeto con uno o más agentes antes de administrar una LNP. En algunas realizaciones, un sujeto se puede tratar previamente con una cantidad útil (p. ej., 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, o cualquier otra cantidad útil) de dexametasona, metotrexato, acetaminofeno, un bloqueador del receptor de H1 o un bloqueador del receptor de H2. El tratamiento previo se puede producir 24 o menos horas (p. ej., 24 horas, 20 horas, 16 horas, 12 horas, 8 horas, 4 horas, 2 horas, 1 hora, 50 minutos, 40 minutos, 30 minutos, 20 minutos o 10 minutos) antes de la administración de la nanopartícula lipídica y se puede producir una, dos o más veces, por ejemplo, en cantidades de dosificación en aumento.

Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar mediante el simple uso de experimentación de rutina, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de acuerdo con la divulgación descrita en el presente documento. No se pretende que el alcance de la presente divulgación se limite a la Descripción anterior, sino de acuerdo a lo que se indicará en las reivindicaciones adjuntas.

En las reivindicaciones, los artículos tales como “un”, “uno”, “una” y “el/la” pueden significar uno o más de uno, a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen “o” entre uno o más miembros de un grupo se consideran cumplidas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes o se emplean en un producto o procedimiento dado, o son relevantes de otro modo para estos, a menos que se indique lo contrario o que resulte evidente de otro modo a partir del contexto. La divulgación incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en, o es relevante de otro modo para un producto o procedimiento determinados. La divulgación incluye realizaciones donde más de uno o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son relevantes de otro modo para un producto o procedimiento determinados.

Cabe destacar también que se pretende que el término “que comprende” sea inclusiva y permita, pero no exija, la inclusión de elementos o etapas adicionales. Cuando el término “que comprende” se utiliza en el presente documento, también están incluidos y divulgados por lo tanto los términos “que consiste esencialmente en” y “que consiste en”. En toda la descripción, cuando se describen composiciones que tienen, incluyen o comprenden componentes específicos, se considera que las composiciones también consisten esencialmente, o consisten en, los componentes mencionados. De manera similar, cuando se describe que los métodos o procedimientos tienen, incluyen o comprenden etapas de procedimiento específicas, los procedimientos también pueden consistir esencialmente en, o consistir en, las etapas de procesamiento mencionadas. Adicionalmente, se debe comprender que el orden de las etapas o el orden para realizar determinadas acciones no es importante siempre y cuando la invención siga siendo realizable. Además, se pueden llevar a cabo dos o más etapas o acciones de manera simultánea.

Cuando se proporcionan intervalos se incluyen los extremos. Además, se debe comprender que, a menos que se indique de otro modo o sea evidente de otro modo a partir del contexto y la comprensión de un experto en la técnica, los valores que se expresan como intervalos pueden adoptar cualquier valor o subintervalo específico dentro de los intervalos establecidos en las diferentes realizaciones de la divulgación, hasta una décima parte de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Además, se ha de comprender que cualquier realización particular de la presente divulgación que esté incluida dentro de la técnica anterior puede excluirse explícitamente de una o más cualesquiera de las reivindicaciones. Dado que tales realizaciones se consideran conocidas por un experto en la técnica, pueden excluirse, aunque la exclusión no se indique explícitamente en el presente documento.

Habiendo descrito la divulgación, se ofrecen los siguientes ejemplos a modo ilustrativo y no limitante.

Ejemplos

Ejemplo 1: Estudios de carga post-hoc

Se prepararon experimentos iniciales para dilucidar el efecto de carga post hoc (PHL). Por ejemplo, los experimentos describen la adición de ARNm a vesículas preformadas dentro de la sección anterior del procedimiento (es decir, inmediatamente después de la precipitación lipídica, ~1 ms a 1.800.000 ms después). Por ejemplo, véanse las Figuras 1-5.

La Figura 1 es una gráfica que muestra que se observa una encapsulación del ARNm comparable o mayor cuando el ARNm se introduce en tiempos de permanencia de la LNP más largos. La encapsulación se evaluó mediante el ensayo de fluorescencia Ribogreen.

La Figura 2 es una gráfica que muestra que se observa una encapsulación del ARNm comparable o significativamente mayor cuando el ARNm se introduce en tiempos de permanencia de la LNP más largos con respecto a los controles (línea punteada). La encapsulación se evaluó mediante el ensayo de intercambio iónico (AEX).

La Figura 3 son imágenes de crio-EM que demuestran que se observa morfología de partícula comparable con un modo de procedimiento de carga post-hoc (“PHL”) con respecto a un procedimiento convencional en donde el ARNm se incluye durante una formación de partícula inicial (“Convencional”).

La Figura 4 es un análisis de dispersión de rayos x de ángulo pequeño (SAXS) que demuestra las características estructurales de aumento (q = ~1,3 nm-1, espaciado D calculado de 5-6 nm) en el lote de procedimiento de carga post-hoc con respecto al procedimiento de lote convencional.

La Figura 5 es un gráfico que demuestra el funcionamiento in vivo de un procedimiento de PHL frente a un procedimiento Convencional que muestra una respuesta a la primera dosis mayor (3 semanas después de la sensibilización) para una PHL en un contexto de vacuna profiláctica y que demuestra IgG total comparable observada después de un refuerzo a las 2 semanas. Las entradas A-D reflejan versiones alternativas del procedimiento convencional como una comparación.

Ejemplo 2: Aplicación “de cabecera” o “mezcla en el campo” de carga Post-Hoc

En segundo lugar, el concepto de PHL se aplicó a la realización “de cabecera” o “mezcla en el campo”, que implica una demora temporal más significativa entre la formación de partículas y la encapsulación de ARNm, (es decir, de meses a años). En resumen, las LNP vacías se procesan en ausencia de ARNm, se almacenan y se mezclan con la carga de ARNm antes del uso. Se desarrolló un procedimiento de LNP vacía escalable. Inicialmente, el tamaño de partícula fue un parámetro crítico para la mezcla eficiente y la encapsulación de ARNm en el procedimiento de mezcla en el campo, mediante el cual las LNP de diámetro pequeño (<100 nm) dieron como resultado la encapsulación de ARNm mejorada durante el procedimiento de mezcla en el campo. Se desarrolló un procedimiento de nanoprecipitación escalable y continuo en un esfuerzo por controlar la polidispersidad y el diámetro de las LNP. La maduración de las partículas (es decir, crecimiento por coalescencia) se determinó como un factor crítico para impulsar la homogeneidad e índices de polidispersidad estrechos. El diseño experimental para la optimización de las condiciones de nanoprecipitación anteriores, mediante el cual se variaron la temperatura y el % de etanol (razón de mezcla) con un tiempo de permanencia total fijo antes de una segunda etapa de goteo con etanol (dilución de acetato) tuvo como objetivo etanol al 12,5%. La maduración de partículas se detuvo a etanol < 15%. La modulación de la temperatura y % de etanol del procedimiento permitió un control del tamaño de partícula y la disminución de la polidispersidad. Por ejemplo, véanse las Figuras 6-35.

La Figura 6 es una gráfica que demuestra el efecto que tuvo el diámetro inicial de una dispersión de LNP en la encapsulación de ARNm y que muestra que los lotes de LNP con menor diámetro dieron como resultado una encapsulación de ARNm mayor.

La Figura 7 es un ajuste de modelo que demuestra que el contenido de etanol y la temperatura son parámetros críticos que afectan al índice de polidispersidad (PDI) de la LNP mediante caracterización de dispersión de luz dinámica (DLS) donde el ajuste de modelo permitió el cálculo de un intervalo ventajoso de condiciones del procedimiento para favorecer un bajo PDI (p. ej., etanol al 30%, 40°C).

La Figura 8 es un ajuste de modelo que demuestra que el contenido de etanol y la temperatura son parámetros críticos que afectan el diámetro de LNP mediante caracterización de DLS, donde el ajuste de modelo permitió el cálculo de un intervalo ventajoso de condiciones del procedimiento para favorecer el control del tamaño de partícula en un intervalo favorable de encapsulación de ARNm mediante los procedimientos descritos en el presente documento (< 100 nm).

La Figura 9 es una gráfica que demuestra que el procedimiento para la generación de LNP vacías afectó a las características estructurales mediante el análisis de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS), lo que muestra que todas las condiciones del procedimiento dieron como resultado partículas con una característica pronunciada a q = 1,4 nm-1 (espaciado D calculado ~4 nm). El procedimiento A sin maduración generó una característica adicional a q = 0,45 (espaciado D calculado ~14 nm). Esta característica se asocia con una población de pequeñas estructuras liposomales o micelares en las muestras mediante análisis crio-TEM. Los Procedimientos B y C que incorporan un tiempo de maduración mostraron polidispersidad (mediante análisis de DLS) y homogeneidad estructural (mediante análisis crio-TEM) mejoradas en comparación con el Procedimiento A.

La Figura 10 es una gráfica que demuestra que el ARNm cargado mediante procedimientos descritos en el presente documento produjo partículas que muestran un alto grado de estructura, con una característica pronunciada a q = 1,3 nm-1 (espaciado D calculado~ 5nm). Los Procedimientos B y C, que aprovechan las condiciones del procedimiento óptimas que favorecen el tiempo de maduración y el bajo PDI, mostraron menor polidispersidad y homogeneidad estructural mejorada en comparación con el procedimiento A.

La Figura 11 son imágenes crio-EM que demuestran homogeneidad de partícula mejorada observada con el Procedimiento B (maduración mayor) con respecto al Procedimiento A (convencional) para lotes generados con procedimientos descritos en el presente documento.

La Figura 12 es un diagrama de flujo de procedimiento ilustrativo que demuestra un procedimiento de nanoprecipitación continua para la formación de LNP.

La Figura 13 es una gráfica que demuestra que la sacarosa presentó un efecto crioprotector para las dispersiones de LNP, lo que permite la conservación del diámetro de partícula después de la tensión de congelación/descongelación, y se determinó que la concentración de sacarosa ventajosa es >15% en peso. La Figura 14 es una gráfica que demuestra que la inclusión del excipiente crioprotector sacarosa permitió la encapsulación completa del ARNm mediante los procedimientos que se describen en el presente documento (Ensayo Ribogreen).

Las Figuras 15A y 15B son gráficas que demuestran una población primaria convencional de LNP caracterizada por análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) en estado líquido (~50 nm) (15A) y la conservación de la población de nanopartículas primaria después de someter la formulación (Acetato-sacarosa) a liofilización y reconstitución en agua destilada desionizada (15B).

La Figura 16 son gráficas que demuestran la superposición de distribución de partículas para formulaciones de LNP de producto líquidas y liofilizadas/reconstituidas.

La Figura 17 es una gráfica que demuestra que la expresión in vitro mayor se observó para la formulación liofilizada con pH 5,0 en comparación con pH 5,75.

La Figura 18 es una gráfica que demuestra que se determinó un pH ventajoso al variar los valores de pH de la solución de ARNm y LNP antes de la combinación en el procedimiento de mezcla en el campo. El control del tamaño de partícula se logró de manera ventajosa a pH < 6,0.

La Figura 19 es una gráfica que demuestra que se determinó un pH ventajoso al variar los valores de pH de la solución de ARNm y LNP antes de la combinación en los procedimientos descritos en el presente documento y la encapsulación mayor se logró a pH < 6,0 (Ensayo Ribogreen).

La Figura 20 es una gráfica que demuestra que se determinó un pH ventajoso al variar los valores de pH de la solución de ARNm y LNP antes de la combinación en los procedimientos descritos en el presente documento y la encapsulación mayor se logró a pH < 6,0 (Ensayo AEX).

La Figura 21 es una gráfica que demuestra que la sensibilidad de la fuerza iónica se evaluó mediante la variación de la concentración molar de NaCl dentro de la solución de LNP y ARNm juntos en los procedimientos descritos en el presente documento y las concentraciones ventajosas que favorecen la encapsulación de ARNm fueron <200 mM.

La Figura 22 es una gráfica que demuestra que se observa una baja variabilidad lote a lote en la encapsulación del ARNm con los procedimientos descritos en el presente documento y que las LNP cargadas con ARNm mostraron encapsulación de ARNm uniforme después de reposar durante 24 h.

La Figura 23 es una gráfica que demuestra el impacto de la velocidad de flujo de inyección en el tamaño de las partículas mediante medición de DLS donde una solución de ARNm se inyectó directamente en un vial que contenía una solución tamponada de LNP y el diámetro de partícula resultante fue sensible a la velocidad de inyección.

La Figura 24 es una gráfica que demuestra el impacto de la velocidad de flujo de inyección sobre la encapsulación del ARNm (Ensayo Ribogreen) donde una solución de ARNm se inyectó directamente en un vial que contenía una solución tamponada de LNP.

La Figura 25 es una gráfica que demuestra que las formulaciones de nanopartículas lipídicas de ARNm cargadas mediante un procedimiento descrito en el presente documento comprendían partículas que mostraban un alto grado de estructura, con una característica pronunciada a q = 1,3 nm-1 (espaciado D calculado ~5 nm) y que se observaron características estructurales comparables con diferente velocidad de flujo (muestra 9-14).

La Figura 26 es una gráfica que demuestra que la adición de niveles crecientes de producto conjugado de PEG-Lípido en la solución de LNP disminuyó el tamaño de partícula después de la mezcla con ARNm.

La Figura 27 es una gráfica que demuestra que la adición de niveles crecientes de producto conjugado de PEG-Lípido en la solución de LNP no afectó a la encapsulación de ARNm.

La Figura 28 es una gráfica que demuestra que las formulaciones de nanopartículas lipídicas de ARNm cargadas mediante un procedimiento descrito en el presente documento comprendían partículas que mostraban un alto grado de estructura, con una característica pronunciada a q = 1,3 nm-1 (espaciado D calculado ~5 nm) y que se observaron características estructurales comparables con % en moles de PEG-Lípido incluido en la etapa de mezcla.

La Figura 29 es una gráfica que demuestra que la adición de niveles crecientes de producto conjugado de PEG-Lípido en la solución de LNP disminuyó la sensibilidad a la velocidad de flujo de inyección en los procedimientos de mezcla descritos en el presente documento.

La Figura 30 es una gráfica que demuestra que la adición de niveles crecientes de producto conjugado de PEG-Lípido en la solución de LNP aumentó la encapsulación (ensayo Ribostar).

La Figura 31 es una gráfica que demuestra que la neutralización del producto mezclado dio como resultado la encapsulación de ARNm mayor (ensayo AEX) y la neutralización puede lograrse a través de la adición de una solución de fosfato de sodio concentrada a un valor de pH objetivo.

La Figura 32 es una gráfica que demuestra que un ensayo Ribogreen no pudo detectar sensibilidad a la neutralización de pH del producto mezclado y la neutralización se logró a través de la adición de una solución de fosfato de sodio concentrada a un valor de pH objetivo.

La Figura 33 es una gráfica que demuestra que la neutralización del producto mezclado dio como resultado un mayor diámetro de LNP (~10 nm) y la neutralización se logró a través de la adición de una solución de fosfato de sodio concentrada a un valor de pH objetivo.

La Figura 34 es una gráfica que demuestra que las formulaciones de nanopartículas lipídicas de ARNm cargadas mediante un procedimiento descrito en el presente documento comprendían partículas que mostraban un alto grado de estructura, con una característica pronunciada a q = 1,3 nm-1 (espaciado D calculado ~5 nm) y se observó una ligera disminución en 1,3 nm-1 con la neutralización, adicionalmente la neutralización del producto mezclado dio como resultado la reducción de una característica estructural a 0,3 nm-1 (espaciado D ~21 nm).

La Figura 35 es una gráfica que demuestra la potencia mayor de procedimientos de formulación mixta descritos en el presente documento (“Procedimiento PHL”) con respecto a control (“Procedimiento de Referencia”) que muestra las respuestas de células T específicas de antígeno mayores con los procedimientos de mezcla descritos en el presente documento en comparación con el modo de procedimiento convencional.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para producir una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP), comprendiendo el método: mezclar una solución lipídica que comprende un lípido ionizable con una solución tampón acuosa que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5, opcionalmente de aproximadamente 4,9 a aproximadamente 5,25, formando así una solución de nanopartículas lipídicas que comprende una nanopartícula lipídica; y añadir una solución de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico a la solución de nanopartículas lipídicas, formando así una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) que comprende la nanopartícula lipídica asociada con el ácido nucleico 2. El método de la reivindicación 1, en donde la nanopartícula lipídica de la solución de nanopartículas lipídicas tiene un diámetro promedio de menos de aproximadamente 150 nm, menos de aproximadamente 125 nm, menos de aproximadamente 100 nm, menos del aproximadamente 90 nm, menos de aproximadamente 80 nm, menos de aproximadamente 75 nm, menos de aproximadamente 70 nm, menos de aproximadamente 65 nm, menos de aproximadamente 60 nm, menos de aproximadamente 55 nm, menos de aproximadamente 50 nm, menos de aproximadamente 45 nm, menos de aproximadamente 40 nm, menos de aproximadamente 35 nm o menos de aproximadamente 30 nm, opcionalmente en donde la nanopartícula lipídica de la solución de nanopartículas lipídicas tiene un diámetro promedio de aproximadamente 25 nm a aproximadamente 125 nm, de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 110 nm, de aproximadamente 35 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 45 nm a aproximadamente 80 nm o de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 70 nm. 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la solución de nanopartículas lipídicas tiene un pH que es menor que el pKa del lípido ionizable. 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el tiempo de permanencia está presente entre la mezcla y la adición, en donde el tiempo de permanencia está en un intervalo de aproximadamente 1,0 milisegundo a aproximadamente 60 minutos, de aproximadamente 2,0 milisegundos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 3,0 milisegundos a aproximadamente 15 minutos, de aproximadamente 4,0 milisegundos a aproximadamente 10 minutos, de aproximadamente 5,0 milisegundos a aproximadamente 5 minutos, de aproximadamente 10,0 milisegundos a aproximadamente 2 minutos, de aproximadamente 100,0 milisegundos a aproximadamente 1,0 minutos, o de aproximadamente 1000 milisegundos a aproximadamente 1,0 minutos. 5. El método de la reivindicación 4, en donde el tiempo de permanencia está en un intervalo de aproximadamente 1000 milisegundos a aproximadamente 1,0 minutos. 6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el ácido nucleico es un ácido ribonucleico, opcionalmente en donde el ácido ribonucleico es al menos un ácido ribonucleico seleccionado del grupo que consiste en un ARN interferente pequeño (ARNip), ARN interferente asimétrico (ARNia), un microARN (miARN), un ARN de sustrato Dicer (ARNsd), un A R n en horquilla pequeño (ARNhp), un ARN mensajero (ARNm) y un ARN largo no codificante (ARNlnc), adicionalmente de manera opcional en donde el ácido nucleico es un ARN mensajero (ARNm). 7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la solución lipídica y/o la solución de nanopartículas lipídicas comprenden adicionalmente un primer disolvente orgánico. 8. El método de la reivindicación 7, en donde el primer disolvente orgánico es un alcohol; opcionalmente en donde el primer disolvente orgánico es etanol. 9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende adicionalmente procesar la formulación de nanopartículas lipídicas, opcionalmente en donde el procesamiento comprende al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste en filtrar, ajustar el pH, intercambiar el tampón, someter a diálisis, concentrar, congelar, liofilizar o envasar. 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la solución lipídica, la solución de nanopartículas lipídicas (LNP), y/o la formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) comprenden adicionalmente un agente de encapsulación, opcionalmente en donde el agente de encapsulación es i) un compuesto de Fórmula (EA-I):

(EA-I), o una sal del mismo, en donde, R<201>y R<202>se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<6>, alquenilo C<2>-C<6>y (C=NH)N(R<101>)<2>en donde cada R<101>se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<6>y alquenilo C<2>-C<6>; R<203>se selecciona del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<20>y alquenilo C<2>-C<20>; R<204>se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<20>, alquenilo C<2>-C<20>, C(O)(Oalquilo C<1>-C<20>), C(O)(Oalquenilo C<2>-C<20>), C(O)(NHalquilo C<1>-C<20>) y C(O)(NHalquenilo C<2>-C<20>); n1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10; ii) un compuesto de Fórmula (EA-II):

(EA-II), o una sal del mismo, en donde, X<101>es un enlace, NH u O; R<101>y R<102>se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<6>y alquenilo C<2>-C<6>. R<103>y R<104>se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<20>y alquenilo C<2>-C<20>; y n1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10; o iii) etil lauroil arginato o una sal del mismo. 11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la nanopartícula lipídica o la formulación de nanopartículas lipídicas comprenden adicionalmente un fosfolípido, un lípido PEG, un lípido estructural o cualquier combinación de los mismos. 12. El método de la reivindicación 11, en donde el lípido PEG: i) se selecciona entre una fosfatidiletanolamina modificada con PEG, un ácido fosfatídico modificado con PEG, una ceramida modificada con PEG, una dialquilamina modificada con PEG, un diacilglicerol modificado con PEG y un dialquilglicerol modificado con PEG; ii) un compuesto de Fórmula (PL-I):

(PL-I), o sales del mismo, en donde: R3 es -ORO; RO es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de oxígeno; r es un número entero entre 1 y 100, inclusive; L1 es alquileno C<1>-C<10>opcionalmente sustituido, en donde al menos un metileno del alquileno C<1>-C<10>opcionalmente sustituido se remplaza independientemente por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, O, N(RN), S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O o NR<n>C(O)N(Rn); D es un radical obtenido por química clic o un radical escindible en condiciones fisiológicas; m es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;

A tiene la fórmula: o cada caso de L2 es independientemente un enlace o alquileno C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, en donde una unidad de metileno del alquileno C<1>-C<6>opcionalmente sustituido se remplaza opcionalmente por O, N(RN), S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O o NRNC(O)N(RN); cada caso de R2 es independientemente alquilo C<1>-C<30>opcionalmente sustituido, alquenilo C<1>-C<30>opcionalmente sustituido o alquinilo C<1>-C<30>opcionalmente sustituido; opcionalmente en donde una o más unidades de metileno de R2 se remplazan independientemente por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, N(RN), O, S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), NRNC(O)N(RN), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=N RN), C(=N RN)N(RN), NRNC(=N RN), NRnC(=N R n)N(Rn), C(S), C(S)N (Rn), NRNC(S), NRNC(S)N (RN), S(O) , OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O)2, S(O)2O, OS(O)2O, N(RN)S(O), S(O)N(RN), N(RN)S(O)N(RN), OS(O)N(RN), N(RN)S(O)O, S(O)2, N(RN)S(O)2, S(O)2N(RN), N(RN)S(O)2N(RN), OS(O)2N(RN) o N(R<n>)S(O)<2>O; cada caso de R N es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, o un grupo protector de nitrógeno; el Anillo B es carbociclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y p es 1 o 2; iii) un compuesto de Fórmula (PL-II):

R3 es -ORO; RO es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de oxígeno; r es un número entero de entre 1 y 100; R5 es alquilo C<10>-C<40>opcionalmente sustituido, alquenilo C<10>-C<40>opcionalmente sustituido o alquinilo C<10>-C<40>opcionalmente sustituido; y opcionalmente uno o más grupos metileno de R5 se remplazan por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, N(RN), O, S, C(O), C(O)N(RN), NRNC(O), NRNC(O)N(RN), C(O)O, OC(O), OC(O)O, OC(O)N(RN), NRNC(O)O, C(O)S, SC(O), C(=N RN), C(=NRN)N(RN), NRNC(=NRN), NRNC(=NRN)N(RN), C(S), C(S)N(RN), NRNC(S), NRNC(S)N(RN), S(O), OS(O), S(O)O, OS(O)O, OS(O)2, S(O)2O, OS(O)2O, N(RN)S(O), S(O)N(RN), N(RN)S(O)N(RN), OS(O)N(RN), N(RN)S(O)O, S(O)2, N(RN)S(O)2, S(O)<2>N(RN), N(RN)S(O)<2>N(RN), OS(O)<2>N(RN) o N(RN)S(O)<2>O; y cada caso de RN es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno; iv) un compuesto de Fórmula (PL-III):

o una sal del mismo, en donde s es un número entero entre 1 y 100, o v) el lípido PEG es:

13. El método de la reivindicación 11 o 12, en donde el lípido estructural se selecciona entre colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol, tomatidina, ácido ursólico, y alfatocoferol. 14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde el fosfolípido se selecciona entre 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-fosfocolina (DMPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-diundecanoil-sn-glicero-fosfocolina (DUPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-di-O-octadecenil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 Diéter PC), 1-oleoil-2-colesterilhemisuccinoil-sn-glicero-3-fosfocolina (OChemsPC), 1-hexadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (C16 Liso PC),1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16.0 PE), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinolenoil-snglicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-didocosahexaenoil-snglicero-3-fosfoetanolamina, sal de sodio de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) (DOPG), y esfingomielina. 15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en donde el lípido ionizable: i) comprende un aminolípido ionizable; ii) es un compuesto de Fórmula (IL-1):

Ri se selecciona del grupo que consiste en alquilo C<5>-C<30>, alquenilo C<5>-C<20>, -R*YR”, -YR” y -R ”M'R'; R<2>y R<3>se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<14>, alquenilo C<2>-C<14>, -R*YR”, -YR” y -R*OR”, o R<2>y R<3>, junto con el átomo al que están anclados, forman un heterociclo o carbociclo; R<4>se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un carbociclo C<3>-C<6>, -(CH<2>)nQ, -(CH<2>)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)<2>y alquilo C<1>-C<6>no sustituido, en donde Q se selecciona entre un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8, N(R)S(O)2R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR y -C(R)N(R)<2>C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente entre 1, 2, 3, 4 y 5; cada R<5>se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<3>, alquenilo C<2>-C<3>y H; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<3>, alquenilo C<2>-C<3>y H; M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”-C(O)O-, - C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)<2>-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo, en los que M” es un enlace, alquilo C<1>-C<13>o alquenilo C<2>-C<13>; R<7>se selecciona del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<3>, alquenilo C<2>-C<3>y H; R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo C<3>-C<6>y heterociclo; R<9>se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO<2>, alquilo C<1>-C<6>, -OR, -S(O)<2>R, -S(O)<2>N(R)<2>, alquenilo C<2>-C<6>, carbociclo C<3>-C<6>y heterociclo; cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<3>, alquenilo C<2>-C<3>y H; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<18>, alquenilo C<2>-C<18>, -R*YR”, -YR” y H; cada R” se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<3>-C<15>y alquenilo C<3>-C<15>; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<12>y alquenilo C<2>-C<12>; cada Y es independientemente un carbociclo C<3>-C<6>; cada X se selecciona independientemente del grupo que consiste en F, Cl, Br e I; y m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13; y en donde, cuando R<4>es -(CH<2>)nQ, -(CH<2>)nCHQR, -CHQR o -CQ(R)<2>, entonces (i) Q no es -N(R)<2>cuando n es 1, 2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es heterocicloalquilo de 5, 6 o 7 miembros cuando n es 1 o 2; iii) es un compuesto de Fórmula (IL-II):

3, 4 y 5; M1 es un enlace o M'; R<4>es hidrógeno, alquilo C<1>-C<3>no sustituido o -(CH<2>)nQ, en el que n es 2, 3 o 4, y Q es -OH, -NHC(S)N(R)<2>, -NHC(O)N(R)<2>, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloalquilo; M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)-M”- C(O)O-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y R<2>y R<3>se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<14>y alquenilo C<2>-C<14>; iv) es un compuesto de fórmula (IL-

o sales o isómeros del mismo, en donde,

t es 1 o 2; A<1>y A<2>se seleccionan cada uno independientemente entre CH o N; Z es CH<2>o está ausente en donde, cuando Z es CH<2>, cada una de las líneas discontinuas (1) y (2) representan un enlace sencillo; y, cuando Z está ausente, las líneas discontinuas (1) y (2) están ambas ausentes; R<1>, R<2>, R<3>, R<4>y R<5>se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C<5>-C<20>, alquenilo C<5>-C<20>, -R''MR'. -R*YR”, -YR” y -R*OR”; R<x1>y R<x2>son cada uno independientemente H o alquilo C<1>-C<3>; cada M se selecciona independientemente del grupo que consiste en-C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, - P(O)(OR')O-, -S(O)<2>-, -C(O)S-, -SC(O)-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; M* es alquilo C<1>-C<6>, W 1 y W2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -O- y -N(R6)-; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y alquilo C<1>-C<5>; X 1, X 2 y X 3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un enlace, -CH<2>-, -(CH<2>)<2>-, -CHR-, -CHY-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -(CH2)n-C(O)-, -C(O)-(CH2)n-, -(CH2)n- C(O)O-, -OC(O)-(CH2)n-, -(CH2)n-OC(O)-, -C(O)O-(CH<2>)n-, -CH(OH)-, -C(S)- y - CH(SH)-; cada Y es independientemente un carbociclo C<3>-C<6>; cada R* se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<12>y alquenilo C<2>--C<12>; cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<3>y un carbociclo C<3>-C<6>; cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-C<12>, alquenilo C<2>-C<12>y H; cada R ” se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<3>-C<12>, alquenilo C<3>-C<12>y -R*MR'; y n es un número entero de 1-6; en donde cuando el anillo

i) al menos uno de X 1, X 2 y X3 no es -CH<2>-; y/o ii) al menos uno de R<1>, R<2>, R<3>, R<4>y R<5>es -R”MR'; v) es

o una sal del mismo; o vi) se selecciona entre 3-(didodecilamino)-N1,N1,4-tridodecil-1-piperazinaetanamina (KL10), N1-[2-(didodecilamino)etil]-N1,N4,N4-tridodecil-1,4-piperazinadietanamina (K<l>22), 14,25-ditridecil-15,18,21,24-tetraaza-octatriacontano (KL25), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), 4-(dimetilamino)butanoato de heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (DLin-MC3-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA), 2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA), (2R)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2R)) y (2S)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2S)). 16. Una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) preparada mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15. 17. La formulación de nanopartículas lipídicas de la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un sujeto.