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ES2992127T3 - Nanopartículas lipídicas cargadas de ARNm mejoradas y sus procesos de fabricación - Google Patents

Nanopartículas lipídicas cargadas de ARNm mejoradas y sus procesos de fabricación Download PDF

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ES2992127T3
ES2992127T3 ES20745451T ES20745451T ES2992127T3 ES 2992127 T3 ES2992127 T3 ES 2992127T3 ES 20745451 T ES20745451 T ES 20745451T ES 20745451 T ES20745451 T ES 20745451T ES 2992127 T3 ES2992127 T3 ES 2992127T3
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lipid
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lipids
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English (en)
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Shrirang Karve
Ashish Sarode
Frank Derosa
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Original Assignee
Translate Bio Inc
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Abstract

La presente invención proporciona una formulación de nanopartículas lipídicas mejorada que encapsula ARNm que comprende DEPE como lípido auxiliar. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nanopartículas lipídicas cargadas de ARNm mejoradas y sus procesos de fabricación
CAMPO DE INVENCIÓN
La invención se refiere a la administración de ARNm mediada por lí pidos; y a los compuestos lipídicos y composiciones que comprenden dichos compuestos. En particular, esta invención se refiere a los métodos y usos de tales compuestos y composiciones, y a los procesos para producir tales compuestos y composiciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La terapia basada en ARN mensajero (TRM) se está convirtiendo en un enfoque cada vez más importante para el tratamiento o la prevención de una variedad de enfermedades. La TRM implica la administración de ARN mensajero (ARNm) a un sujeto que necesita la terapia con el fin de proporcionar la producción de la proteína codificada por el ARNm dentro del cuerpo del sujeto. Las nanopartículas lipídicas se pueden utilizar para encapsular el ARNm para la administración eficazin vivodel ARNm.
Se ha hecho un gran esfuerzo para identificar nuevos métodos y composiciones que puedan mejorar la administración intracelular y/o la expresión de ARNm usando nanopartículas lipídicas, que pueden adaptarse a un proceso de fabricación escalable y rentable. Al mismo tiempo, es importante que cualquier mejora de la administración intracelular y/o expresión del ARNm también mantenga o mejore la seguridad y tolerabilidad de las composiciones asociadas con la administración de ARNm mediada por lípidos.
Se ha observado que las nanopartículas lipídicas multicomponente que comprenden uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares que encapsulan un ARNm son particularmente eficaces para lograr la administración y expresión del ARNmin vivo.Un enfoque particular de la investigación reciente ha sido en el descubrimiento de nuevos lípidos catiónicos para la administración de ARNm. Los otros componentes de las nanopartículas lipídicas multicomponente han recibido poca o ninguna atención. Hay una necesidad continua de mejorar la administración de nanopartículas lipídicas de ARNm para lograr la administración intracelular y/o la expresión del ARNm. Al mismo tiempo, es deseable que las nuevas formulaciones de nanopartículas lipídicas mantengan o mejoren la seguridad y la tolerabilidad. El documento WO 2016/205691 divulga composiciones que comprenden 2,5-piperazindionas sustituidas con alquilenil y su uso en composiciones para suministrar un agente a un sujeto o célula.
El documento EP 3315125 divulga formulaciones que comprenden lípidos catiónicos en combinación con otros componentes lipídicos tales como colesterol, colípidos fusogénicos y PEG-lípidos para formar nanopartículas lipídicas para facilitar la absorción celular de ácidos nucleicos.
El documento WO 2020/097384 divulga compuestos lipídicos de aminoácidos cíclicos y su uso como componentes de los vehículos de administración liposomal para la administración de ARNm.
El documento WO 2020/097511 divulga métodos de administración de ARNm en un ojo de un sujeto para dar lugar a la expresión de la proteína codificada por el ARNm en el ojo.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Los inventores han observado sorprendentemente que la administración y/o la expresión de ARNmin vivose puede mejorar drásticamente optimizando el componente lipídico auxiliar de los liposomas multicomponente que encapsulan el ARNm. En particular, la presente invención se basa en el descubrimiento de que la presencia de 1,2-dierucoil-snglicero-3-fosfoetanolamina (DEPE) como lípido auxiliar en formulaciones de nanopartículas lipídicas encapsuladoras de ARNm que comprenden uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares pueden aumentar la administración y/o expresión de ARNmin vivomás de dos veces en relación con los liposomas convencionales que comprenden dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) como uno de los lípidos auxiliares. Las nanopartículas lipídicas que contenían DEPE fueron nanopartículas lipídicas comparables que contenían DOPE en términos de seguridad y tolerabilidad (según lo evaluado por marcadores de toxicidad hepática como ALT y AST).
En consecuencia, la invención proporciona una composición que comprende nanopartículas lipídicas para la administración de ARNm a un sujeto que lo necesita, en donde la nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares que encapsulan el ARNm, en donde el uno o más lípidos auxiliares comprenden 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE) y más del 70 % de las nanopartículas lipídicas en la composición tienen un tamaño que varía de 75 nm a 150 nm. La DEPE en la nanopartícula lipídica proporciona la expresión mejorada del ARNm cuando se administra a un sujeto.
En las realizaciones de la invención, la DEPE 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE) está estructuralmente representada por la siguiente estructura:
o por la siguiente estructura:
En las realizaciones de la invención, la expresión mejorada del ARNm es mayor en comparación con la expresión del mismo ARNm en una segunda composición que comprende nanopartículas lipídicas que tienen los mismos componentes lipídicos y cantidades, excepto que las nanopartículas lipídicas de la segunda composición incluyen uno o más lípidos auxiliares diferentes y no incluyen DEPE. En ciertas realizaciones, la expresión mejorada se incrementa dos veces o más respecto a la segunda composición de nanopartículas lipídicas. En algunas realizaciones, los diferentes uno o más lípidos auxiliares en la segunda nanopartícula lipídica comprenden dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DLOPE), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE), y/o una combinación de los mismos.
En ciertas realizaciones, la DEPE en la nanopartícula lipídica está presente en una concentración de al menos 0,5 por ciento molar de lípidos totales en la nanopartícula lipídica, por ejemplo en una concentración de entre 0,5 por ciento molar y 50 por ciento molar, en particular a una concentración de entre 10 por ciento molar y 45 por ciento molar. Más normalmente, la DEPE en la nanopartícula lipídica está presente en una concentración de entre 25 molar por ciento y 35 molar por ciento de los lípidos totales en la nanopartícula lipídica.
En ciertas realizaciones, el uno o más lípidos catiónicos son o comprenden CKK-E12.
En ciertas realizaciones, el uno o más lípidos catiónicos son o comprenden ICE (éster de colesterol e imidazol). En ciertas realizaciones, el uno o más lípidos catiónicos son o comprenden un lípido catiónico de la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
en donde cada R1 y R2 es independientemente H o alifático C1-C6; cadames independientemente un número entero que tiene un valor de 1 a 4; cada A es independientemente un enlace covalente o arileno; cada L1 es independientemente un grupo éster, tioéster, disulfuro o anhídrido; cada L2 es independientemente alifático C2-C10; cada X1 es independientemente H u OH; y cada R3 es independientemente alifático C6-C20. En una realización específica, el uno o más lípidos catiónicos son o comprenden el siguiente compuesto:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra realización específica, el uno o más lípidos catiónicos son o comprenden el siguiente compuesto:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra realización específica, el uno o más lípidos catiónicos son o comprenden el siguiente compuesto:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En ciertas realizaciones, el uno o más lípidos modificados con PEG son o comprenden una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) alquilo de C6-C20 de longitud.
En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica que encapsula el ARNm e incluye DEPE como un lípido auxiliar también incluye un lípido catiónico que comprende cadena(s) alquilo de C6-C20. En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende de una a cuatro cadenas alquilo de C8-C16 de longitud. En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende de una a cuatro cadenas alquilo de C10-C16 de longitud. En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende de una a cuatro cadenas alquilo cada una de C10-C14 de longitud. En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende de una a cuatro cadenas alquilo cada una de C10 de longitud. En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende de una a cuatro cadenas alquilo cada una de C12 de longitud. En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende de una a cuatro cadenas alquilo cada una de C16 de longitud.
En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica que encapsula el ARNm e incluye DEPE como un lípido auxiliar también incluye un lípido catiónico que comprende de una a cuatro cadenas alifáticas cada una de C6-C20 de longitud. En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende de una a cuatro cadenas alifáticas de C8-C16 de longitud. En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende de una a cuatro cadenas alifáticas de C10-C14 de longitud. En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende de una a cuatro cadenas alifáticas cada una de C10 de longitud. En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende de una a cuatro cadenas alifáticas cada una de C12 de longitud. En algunas realizaciones, el lípido catiónico comprende cadenas alifáticas cada una de C16 de longitud.
En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica que encapsula el ARNm e incluye DEPE como un lípido auxiliar también incluye uno o más lípidos catiónicos que son o comprenden un lipidoide. En algunas realizaciones, el lipidoide comprende cuatro cadenas alifáticas. En algunas realizaciones, cada una de las cuatro cadenas alifáticas lipidoides es independientemente de C6-C20 de longitud. En algunas realizaciones, cada una de las cuatro cadenas alifáticas lipidoides es independientemente de C8-C16 de longitud. En algunas realizaciones, cada una de las cuatro cadenas alifáticas lipidoides es independientemente de C10-C14 de longitud. En algunas realizaciones, cada una de las cuatro cadenas alifáticas lipidoides es independientemente de C10 o C12 de longitud. En algunas realizaciones, las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C6 de longitud. En algunas realizaciones, las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C8 de longitud. En algunas realizaciones, las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C10 de longitud. En algunas realizaciones, las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C12 de longitud. En algunas realizaciones, las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C14 de longitud. En algunas realizaciones, las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C16 de longitud. En algunas realizaciones, las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C18 de longitud. En algunas realizaciones, las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C20 de longitud. En algunas realizaciones, al menos dos de las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C6 de longitud. En algunas realizaciones, al menos dos de las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C8 de longitud. En algunas realizaciones, al menos dos de las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C10 de longitud. En algunas realizaciones, al menos dos de las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C12 de longitud. En algunas realizaciones, al menos dos de las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C14 de longitud. En algunas realizaciones, al menos dos de las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C16 de longitud. En algunas realizaciones, al menos dos de las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C18 de longitud. En algunas realizaciones, al menos dos de las cuatro cadenas alifáticas lipidoides son de C20 de longitud.
En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica que encapsula el ARNm e incluye DEPE como un lípido auxiliar también incluye un lipidoide que comprende cadena(s) alquilo de C6-C20 de longitud. En algunas realizaciones, el lipidoide comprende cadena(s) alquilo de C8-C16 de longitud. En algunas realizaciones, el lipidoide comprende cadena(s) alquilo de C10-C14 de longitud. En algunas realizaciones, el lipidoide comprende cadena(s) alquilo de C10 de longitud. En algunas realizaciones, el lipidoide comprende cadena(s) alquilo de C12 de longitud. En algunas realizaciones, el lipidoide comprende cadena(s) alquilo de C16 de longitud.
En ciertas realizaciones, la nanopartícula lipídica comprende además uno o más esteroles. En algunas realizaciones, el uno o más esteroles son o comprenden un lípido a base de colesterol, por ejemplo, colesterol o colesterol PEGilado.
En alguna realización, la nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG, uno o más lípidos no catiónicos y uno o más lípidos a base de colesterol que encapsulan el ARNm. Por ejemplo, en una realización típica de la invención, los componentes lipídicos de la nanopartícula lipídica comprenden cuatro tipos de lípidos que incluyen un lípido catiónico (p. ej., CKK-E12, Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3), un lípido modificado con PEG (p. ej., DMG-PEG2K), un lípido no catiónico (DEPE) y un lípido a base de colesterol (p. ej., colesterol). En algunas realizaciones, la relación entre lípido(s) catiónico(s) y lípido(s) no catiónico(s) y lípido(s) a base de colesterol y lípido(s) modificado(s) con PEG en la nanopartícula lipídica puede estar entre aproximadamente 30-60:25-35:20-30:1-15.
En alguna realización, los componentes lipídicos de la nanopartícula lipídica comprenden un lípido catiónico (p. ej., ICE), un lípido modificado con PEG (p. ej., DMG-PEG2K), un lípido no catiónico (DEPE). En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) y lípido(s) no catiónico(s) y lípido(s) modificado(s) con PEG puede estar entre aproximadamente 50-60:45-30:5-10.
El ARNm administrado por las nanopartículas lipídicas de la presente invención es un ARNm que codifica una proteína que se traduce en la proteína terapéuticain vivo.En ciertas realizaciones, el ARNm que codifica una proteína codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunas realizaciones, el polipéptido terapéutico es una cadena ligera de anticuerpos o una cadena pesada de anticuerpos. En algunas realizaciones, el polipéptido terapéutico es un polipéptido ausente o deficiente en el sujeto. En ciertas realizaciones, el ARNm que codifica una proteína codifica un péptido. En algunas realizaciones, el péptido es un antígeno.
En algunas realizaciones, un ARNm codifica una proteína que se traduce en una proteína terapéutica o péptidoin vivo.En algunas realizaciones, el ARNm que codifica la proteína o péptido se administra sistémicamente. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el hígado a las 6 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el hígado a las 12 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el hígado a las 18 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el hígado a las 24 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el hígado a las 36 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el hígado a las 48 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el hígado a las 72 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el suero a las 6 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el suero a las 12 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el suero a las 18 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el suero a las 24 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el suero a las 36 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el suero a las 48 horas o más después de la administración. En algunas realizaciones, la proteína o péptido traducido es detectable en el hígado a las 72 horas o más después de la administración.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende nanopartículas lipídicas que encapsulan un ARNm, uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares, en donde el uno o más lípidos auxiliares comprenden 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE), en donde más del 70 % de las nanopartículas lipídicas en la composición tienen un tamaño que varía de 75 nm a 150 nm, para su uso en un método de tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un sujeto, en donde el ARNm codifica un péptido, polipéptido o proteína que es adecuado para tratar o prevenir la enfermedad o trastorno en el sujeto. En una realización, el ARNm codifica un polipéptido o proteína que está ausente o deficiente en el sujeto, en donde la enfermedad o trastorno es una deficiencia en dicho polipéptido o proteína. En otra realización, el ARNm codifica una cadena ligera de anticuerpos o una cadena pesada de anticuerpos y el sujeto padece una enfermedad o trastorno que se puede tratar mediante la administración de un anticuerpo que comprende dicha cadena ligera o dicha cadena pesada al sujeto. En una realización posterior, el ARNm codifica un péptido, polipéptido o proteína, en donde dicho péptido, polipéptido o proteína es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en dicho sujeto con el fin de tratar o prevenir la enfermedad o trastorno.
Los inventores también observaron que el uso de DEPE como un lípido auxiliar hace posible formular formulaciones multicomponente que no forman liposomas estables cuando se utiliza DOPE como uno de los lípidos auxiliares. En otro aspecto aún más, la invención proporciona por lo tanto un método para preparar una nanopartícula lipídica que encapsula un ARNm, comprendiendo dicho método (a) proporcionar una mezcla de uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares, en donde el uno o más lípidos auxiliares está compuesto por 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE), y b) formar una nanopartícula lipídica a partir de la mezcla proporcionada en la etapa a), en donde más del 70 % de las nanopartículas lipídicas en la composición tienen un tamaño que varía de 75 nm a 150 nm y el método comprende además encapsular el ARNm en la nanopartícula lipídica, en donde la encapsulación puede tener lugar antes o después de la formación de la nanopartícula lipídica en la etapa (b). Las nanopartículas lipídicas resultantes que encapsulan el ARNm son estables. En una realización, el método de preparación de una nanopartícula lipídica de acuerdo con la invención excluye específicamente el uso de uno o más lípidos auxiliares seleccionados de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DLOPE), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE) y combinaciones de los mismos. En una realización, la DEPE está presente en la mezcla a una concentración de entre 10 por ciento molar y 50 por ciento molar. En una realización, el uno o más lípidos modificados con PEG en la mezcla comprenden una cadena de poli(etilen) glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) alquilo de C6-C20 de longitud. En una realización, la mezcla de uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares comprende además uno o más esteroles, como un lípido a base de colesterol. En una realización, un lípido a base de colesterol es colesterol y/o colesterol PEGilado. En una realización, el ARNm codifica un péptido, polipéptido o proteína terapéutico. En algunas realizaciones, el ARNm se encapsula en una nanopartícula lipídica preformada. En algunas realizaciones, el método para preparar una nanopartícula lipídica de acuerdo con la invención comprende además someter la nanopartícula lipídica a filtración de flujo tangencial (FFT) antes y/o después de la encapsulación del ARNm. En algunas realizaciones, el método comprende además la formulación de la nanopartícula lipídica en una solución de trehalosa.
Sin querer quedar vinculados por ninguna teoría en particular, los inventores creen que los derivados de la DEPE, en particular los derivados de la DEPE con diferentes longitudes o composición de la cadena lipídica, proporcionan las mismas ventajas que se describen en el presente documento para la DEPE. Para mayor comodidad, el resumen anterior y la descripción detallada de la invención hacen referencia únicamente a la DEPE. Sin embargo, debe entenderse que las variaciones menores de las cadenas lipídicas de la DEPE no afectan sus propiedades superiores y que dichos derivados de la DEPE están expresamente comprendidos dentro de la invención.
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas a la presente. Otras características, objetos y ventajas de la invención reivindicada son evidentes en la descripción detallada y los dibujos que siguen. La descripción detallada y el dibujo indican las realizaciones de la invención reivindicada y se dan solo a modo de ilustración.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
LaFigura 1muestra una representación gráfica de ejemplo de la expresión de la proteína EPO en las NPL con ARNm que comprenden DEPE y otros lípidos auxiliares.
LaFigura 2muestra una representación gráfica de ejemplo del nivel post-dosis de ALT y AST en suero para las NPL con ARNm que comprenden DEPE y otros lípidos auxiliares.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Las siguientes realizaciones y aspectos de las mismas se describen e ilustran junto con sistemas, composiciones y métodos que tienen por objeto ser de ejemplo e ilustrativos, no limitantes en su alcance.
Definiciones
La presente invención proporciona composiciones que comprenden nanopartículas lipídicas para la administración de ARNm a un sujeto que lo necesita, las nanopartículas lipídicas comprenden uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares que encapsulan el ARNm, en donde el uno o más lípidos auxiliares comprenden 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE) y más de 70 % de las nanopartículas lipídicas en la composición tienen un tamaño que varía de 75 nm a 150 nm.
Para que la presente invención sea más fácilmente comprendida, ciertos términos se definen primero a continuación. A lo largo de la memoria descriptiva se establecen definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos.
Aminoácido.Como se utiliza en el presente documento, el término "aminoácido", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que puede ser incorporada en una cadena de polipéptido. En algunas realizaciones, un aminoácido tiene la estructura general H2N-C(H)(R)-COOH. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido de origen natural. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas realizaciones, un aminoácido es un d-aminoácido; en algunas realizaciones, un aminoácido es un l-aminoácido. "Aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte l-aminoácidos estándar que se encuentran comúnmente en péptidos naturales. "Aminoácido no estándar" se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se utiliza en el presente documento, "aminoácido sintético" abarca aminoácidos modificados químicamente, incluyendo, pero sin limitarse a, sales, derivados de aminoácidos (tales como amidas), y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo los aminoácidos carboxi y/o amino terminales en los péptidos, pueden modificarse mediante metilación, amidación, acetilación, grupos protectores, y/o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la vida media circulante del péptido sin afectar negativamente su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace de disulfuro. Los aminoácidos pueden comprender una o más modificaciones postraduccionales, tales como asociación con una o más entidades químicas (por ejemplo, grupos metilo, grupos acetato, grupos acetilo, grupos fosfato, restos de formilo, grupos isoprenoides, grupos sulfato, restos de polietilenglicol, restos lipídicos, restos de hidratos de carbono, restos de biotina, etc.). El término "aminoácido" se utiliza indistintamente con "resto de aminoácido", y puede referirse a un aminoácido libre y/o a un resto de aminoácido de un péptido. Será evidente por el contexto en el que se utiliza el término si se refiere a un aminoácido libre o a un resto de un péptido.
Animal:Como se utiliza en el presente documento, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a seres humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado vacuno, un primate y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgénico, animal genéticamente modificado, y/o un clon.
Alrededor de o aproximadamente:Como se utiliza en el presente documento, el término "alrededor de" o "aproximadamente", aplicado a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En determinadas realizaciones, el término "alrededor de" o "aproximadamente" se refiere a un intervalo de valores que entran dentro del 25 % , 20 % , 19 % , 18 % , 17 % , 16 % , 15 % , 14 % , 13 % , 12 % , 11 % , 10 % , 9 % , 8 % , 7 % , 6 % , 5 % , 4 % , 3 % , 2 % , 1 % o menos en cualquier dirección (superior a o inferior a) del valor de referencia establecido, a menos que se establezca lo contrario o sea evidente de otro modo a partir del contexto (excepto donde dicho número superara el 100 % de un posible valor).
Combinar:Tal como se utiliza en el presente documento, el término "combinar" se utiliza indistintamente con mezclar o juntar. La combinación se refiere a juntar partículas NPL discretas que tienen propiedades distintas en la misma solución, por ejemplo, combinando una NPL-ARNm y una NPL vacía, para obtener una composición de NPL-ARNm. En algunas realizaciones, la combinación de las dos NPL se realiza en una proporción específica de los componentes que se combinan. En algunas realizaciones, la composición resultante obtenida de la combinación tiene una propiedad distinta de cualquiera o ambos de sus componentes.
Administración:Como se utiliza en el presente documento, el término "administración" abarca tanto la administración local como sistémica. Por ejemplo, la administración de ARNm abarca situaciones en las que un ARNm se administra a un tejido diana y la proteína o péptido codificado se expresa y se retiene dentro del tejido diana (también conocido como "distribución local" o "administración local"), y situaciones en las que un ARNm se administra a un tejido diana y la proteína o péptido codificado se expresa y segrega en el sistema circulatorio del paciente (p. ej., suero) y se distribuye sistémicamente y es absorbido por otros tejidos (también conocido como "distribución sistémica" o "administración sistémica).
Eficacia:Como se utiliza en el presente documento, el término "eficacia", o equivalentes gramaticales, se refiere a una mejora de un criterio de valoración biológicamente relevante, en relación con la administración de ARNm que codifica una proteína o péptido relevante. En algunas realizaciones, el criterio de valoración biológico está protegiendo contra una exposición a cloruro de amonio en ciertos momentos después de la administración.
Encapsulación:Como se utiliza en el presente documento, el término "encapsulación", o equivalente gramatical, se refiere al proceso de confinamiento de una molécula de ARNm individual dentro de una nanopartícula.
Expresión:Como se utiliza en el presente documento, "expresión" de un ARNm se refiere a la traducción de un ARNm en un péptido (p. ej., un antígeno), polipéptido o proteína (p. ej., una enzima) y también puede incluir, como lo indica el contexto, la modificación post-traducción del péptido, polipéptido o proteína completamente ensamblada (p. ej., enzima). En esta solicitud, los términos "expresión" y "producción", y equivalente gramatical, se utilizan indistintamente.
Mejorar, aumentar, o reducir:Como se utiliza en el presente documento, los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir", o equivalentes gramaticales, indican valores que son relativos a una medición basal, como una medición en el mismo individuo antes de iniciar el tratamiento descrito en el presente documento, o una medición en una muestra de control o sujeto (o múltiples muestras de control o sujetos) en ausencia del tratamiento descrito en el presente documento. Una "muestra de control" es una muestra sometida a las mismas condiciones que una muestra de prueba, excepto para el artículo de prueba. Un "sujeto de control" es un sujeto que padece la misma forma de enfermedad que el sujeto que está siendo tratado, que tiene aproximadamente la misma edad que el sujeto que está siendo tratado.
Impurezas:Como se utiliza en el presente documento, el término "impurezas" se refiere a sustancias dentro de una cantidad confinada de líquido, gas o sólido, que difieren de la composición química del material o compuesto diana. A las impurezas también se las alude como contaminantes.
In vitro:Como se utiliza en el presente documento, la expresión”in vitro”se refiere a acontecimientos que ocurren en un ambiente artificial, p. ej., en un tubo de ensayo o vaso de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo pluricelular.
In vivo:Como se utiliza en el presente documento, la expresión”in vivo”se refiere a acontecimientos que ocurren dentro de un organismo pluricelular, tal como un ser humano y un animal no humano. En el contexto de los sistemas basados en células, el término puede utilizarse para referirse a acontecimientos que se producen dentro de una célula viva (a diferencia de, por ejemplo, los sistemasin vitro).
Aislado:Como se utiliza en el presente documento, el término "aislado" se refiere a una sustancia y/o entidad que ha sido (1) separada de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociada cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) que ha sido producida, preparada y/o fabricada por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden estar separadas aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o más de aproximadamente 99 % de los demás componentes con los que estaban inicialmente asociadas. En algunas realizaciones, los agentes aislados son aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o más de aproximadamente 99 % puros. Como se utiliza en el presente documento, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Como se utiliza en el presente documento, el cálculo del porcentaje de pureza de sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir excipientes (p. ej., tampón, disolvente, agua, etc.).
Distribución o administración local.Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "distribución local", "administración local" o equivalente gramatical, se refieren al administración o distribución específica del tejido. Normalmente, la distribución o administración local requiere que un péptido o proteína (p. ej., enzima) codificada por los ARNm se traduzca y se exprese intracelularmente o con secreción limitada que evite entrar en el sistema de circulación del paciente.
ARN mensajero (ARNm):Como se utiliza en el presente documento, la expresión "ARN mensajero (ARNm)" se refiere a un polinucleótido que codifica al menos un péptido, polipéptido o proteína. El ARNm tal como se utiliza en el presente documento abarca tanto el ARN modificado como el no modificado. El ARNm puede contener una o más regiones codificantes y no codificantes. El ARNm puede ser purificado de fuentes naturales, producido usando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificado, sintetizado químicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moléculas químicamente sintetizadas, el ARNm puede incluir análogos de nucleósidos como análogos que tienen bases o azúcares modificados químicamente, modificaciones de la cadena principal, etc. Una secuencia de ARNm se presenta en la dirección 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, un ARNm es o comprende nucleósidos naturales (p. ej., adenosina, guanosina, citidina, uridina); análogos de nucleósidos (p. ej., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, pseudouridina y 5-metilcitidina); bases químicamente modificadas; bases biológicamente modificadas (p. ej., bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (p. ej., 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfatos modificados (p. ej., fosforotioatos y enlaces 5'-W-fosforamidita).
Ácido nucleico:Como se utiliza en el presente documento, la expresión "ácido nucleico", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora o se puede incorporar en una cadena polinucleotídica. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o se puede incorporar en una cadena polinucleotídica mediante un enlace de fosfodiéster. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (p. ej., nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a una cadena de polinucleótidos que comprende residuos de ácido nucleico individuales. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" abarca ARN así como ADN y/o ADNc de cadena sencilla y/o de doble cadena. Además, la expresión "ácido nucleico", y los términos "ADN", "ARN" y/o términos similares incluyen análogos de ácido nucleico, es decir, análogos que tienen otra cadena principal diferente a la de fosfodiéster.
Paciente:Como se utiliza en el presente documento, el término "paciente" o "sujeto" se refiere a cualquier organismo al que se pueda administrar una composición proporcionada, por ejemplo, para fines experimentales, diagnósticos, profilácticos, fines cosméticos y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (p. ej., mamíferos como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y/o humanos). En algunas realizaciones, un paciente es un ser humano. Un ser humano incluye formas pre- y posnatales.
Farmacéuticamente aceptable:La expresión "farmacéuticamente aceptable", como se utiliza en el presente documento, se refiere a sustancias que, dentro del alcance de un juicio médico sólido, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, en consonancia con una relación beneficio/riesgo razonable.
Sal farmacéuticamente aceptable:Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, S. M. Berge et al. describen sales farmacéuticamente aceptables con detalle en J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen aquellas derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos adecuados. Ejemplos de sales de adición de ácido no tóxicas farmacéuticamente aceptables son sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico, o con ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico, o usando otros métodos usados en la técnica, tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, alcanforato, alcanforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalino-térreos, amonio y N+(alquilo C1-4)4. Las sales representativas de metales alcalinos o alcalino-térreos incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, y similares. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando convenga, cationes amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos formados usando contraiones, tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato y arilsulfonato. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales formadas a partir de la cuaternización de una amina usando un electrófilo apropiado, p. ej., un haluro de alquilo, para formar una sal de amino alquilada cuaternizada.
Potencia:Como se utiliza en el presente documento, el término "potencia", o equivalentes gramaticales, se refiere al nivel de expresión de proteína(s) o péptido(s) que el ARNm codifica y/o el efecto biológico resultante.
Sal:Como se utiliza en el presente documento, el término "sal" se refiere a un compuesto iónico que hace o puede resultar de una reacción de neutralización entre un ácido y una base.
Distribución o administración sistémica.Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "distribución sistémica", "administración sistémica" o equivalente gramatical se refieren a un mecanismo o enfoque de administración o distribución que afecta a todo el cuerpo o a todo un organismo. Normalmente, la distribución o administración sistémica se logra a través del sistema de circulación del cuerpo, p. ej., el torrente sanguíneo. En comparación con la definición de "distribución o administración local".
Sujeto:Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un humano o a cualquier animal no humano (p. ej., ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado vacuno, cerdos, oveja, caballo o primate). Un ser humano incluye formas pre- y posnatales. En muchas realizaciones, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, que se refiere a un ser humano que se presenta a un proveedor médico para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad. El término "sujeto" se utiliza en el presente documento de forma indistinta con "individuo" o "paciente". Un sujeto puede sufrir o ser susceptible a una enfermedad o trastorno, pero puede mostrar o no síntomas de la enfermedad o trastorno.
Sustancialmente:Como se utiliza en el presente documento, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de exhibir una extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Alguien con conocimientos normales en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, o nunca, llegan a su fin y/o transcurren hasta su plenitud o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se utiliza en el presente documento para expresar la posible falta de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.
Tejidos diana:Como se utiliza en el presente documento, la expresión "tejidos diana" se refiere a cualquier tejido que esté afectado por una enfermedad a tratar. En algunas realizaciones, los tejidos diana incluyen aquellos tejidos que presentan patología, síntoma o característica asociada a la enfermedad.
Índice terapéutico:Como se utiliza en el presente documento, "índice terapéutico" es la proporción de la concentración de un fármaco en la sangre en la que se vuelve tóxico, y la concentración en la que es efectivo. Cuanto mayor sea el índice terapéutico, más seguro es el fármaco.
Tratar:Como se utiliza en el presente documento, el término "tratar", "tratamiento" o "tratando" se refiere a cualquier método usado para aliviar, mejorar, mitigar, inhibir, prevenir, retrasar la aparición, reducir la gravedad, y/o reducir la incidencia, de forma parcial o completa, de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno, y/o afección particular. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad, y/o que muestra sólo signos tempranos de la enfermedad, con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la enfermedad.
Rendimiento:Como se utiliza en el presente documento, el término "rendimiento" se refiere al porcentaje de ARNm recuperado después de la encapsulación en comparación con el ARNm total como material de partida. En algunas realizaciones, el término "recuperación" se utiliza indistintamente con el término "rendimiento".
Alifático:Como se utiliza en el presente documento, el término alifático se refiere a hidrocarburos de C1-C40, e incluye hidrocarburos tanto saturados como insaturados. Un alifático puede ser lineal, ramificado, o cíclico. Por ejemplo, alifáticos C1-C20 pueden incluir alquilos C1-C20 (p. ej., alquilos C1-C20 saturados lineales o ramificados), alquenilos C2-C20 (p. ej., dienilos C4-C20 lineales o ramificados, trienilos C6-C20 lineales o ramificados y similares), y alquinilos C2-C20 (p. ej., alquinilos C2-C20 lineales o ramificados). Alifáticos C1-C20 pueden incluir alifáticos cíclicos C3-C20 (p. ej., cicloalquilos C3-C20, cicloalquenilos C4-C20, o cicloalquinilos C8-C20). En ciertas realizaciones, el alifático puede comprender uno o más alifáticos cíclicos y/o uno o más heteroátomos, tales como oxígeno, nitrógeno o azufre, y puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes, tales como alquilo, halo, alcoxilo, hidroxi, amino, arilo, éter, éster o amida. Un grupo alifático no está sustituido o está sustituido con uno o más grupos sustituyentes como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un alifático puede ser sustituido con uno o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, o 6 sustituyentes seleccionados independientemente) de halógeno, -COR', -CO2H, -CO2R', -CN, -OH, -OR', -OCOR', -OCO2R', -NH2, -NHR', -N(R')2, -SR' o -SO2R', en donde cada aparición deR'es independientemente alifático C1-C20 (p. ej., alquilo C1-C20, alquilo C1-C15, alquilo C1-C10 o alquilo C1-C3). En realizaciones,R'es independientemente un alquilo no sustituido (p. ej., alquilo C1-C20, alquilo C1-C15, alquilo C1-C10 o alquilo C1-C3 no sustituido). En algunas realizaciones,R'es independientemente alquilo C1-C3 opcionalmente no sustituido. En realizaciones, el alifático no está sustituido. En realizaciones, el alifático no incluye ningún heteroátomo.
Alquilo:Como se utiliza en el presente documento, el término "alquilo" significa grupos hidrocarbonados acíclicos lineales y ramificados, p. ej., "alquilo C1-C20" se refiere a grupos alquilo que tienen 1-20 carbonos. Un grupo alquilo puede ser lineal o ramificado. Ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo terc-pentilhexilo, isohexilo, etc. Otros grupos alquilo serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica dado el beneficio de la presente descripción. Un grupo alquilo puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos sustituyentes como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un grupo alquilo puede estar sustituido con uno o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, o 6 sustituyentes<independientemente seleccionados) de halógeno, -COR', -CO>2<H, -CO>2<R', -CN,>-O<h>, -O<r>',<-OCOR', -OCO>2<R', -NH>2<, ->NHR', -N(R')2, -SR' o -SO2R', en donde cada aparición deR'es independientemente alifático C1-C20 (p. ej., alquilo C1-C20, alquilo C1-C15, alquilo C1-C10 o alquilo C1-C3). En realizaciones,R'es independientemente un alquilo no sustituido (p. ej., alquilo C1-C20, alquilo C1-C15, alquilo C1-C10 o alquilo C1-C3 no sustituido). En algunas realizaciones,R'es independientemente alquilo C1-C3 opcionalmente no sustituido. En las realizaciones, el alquilo está sustituido (p. ej., con 1, 2, 3, 4, 5, o 6 grupos sustituyentes como se describe en el presente documento). En realizaciones, un grupo alquilo está sustituido con un grupo -OH, y también puede denominarse en el presente documento como un grupo "hidroxialquilo", en el que el prefijo denota el grupo -OH, y "alquilo" es como se describe en el presente documento.
Alquenilo:Como se utiliza en el presente documento, "alquenilo" significa cualquier cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono insaturados que pueden aparecer en cualquier punto estable a lo largo de la cadena; p, ej., "alquenilo C2-C20" se refiere a un grupo alquenilo que tiene 2-20 carbonos. Por ejemplo, un grupo alquenilo incluye prop-2-enilo, but-2-enilo, but-3-enilo, 2-metilprop-2-enilo, hex-2-enilo, hex-5-enilo, 2,3-dimetilbutil-2-enilo, y similares. En realizaciones, el alquenilo comprende 1,2 o 3 dobles enlaces carbono-carbono. En realizaciones, el alquenilo comprende un único doble enlace carbono-carbono. En las realizaciones, están conjugados múltiples enlaces dobles (p. ej., 2 o 3). Un grupo alquenilo puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos sustituyentes como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un grupo alquenilo puede estar sustituido con uno o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, o 6 sustituyentes seleccionados independientemente) de halógeno, -COR', -CO2H, -CO2R', -CN, -OH, -OR', -OCOR', -OCO2R', -NH2, -NHR', -N(R')2, -SR' o -SO2R', en donde cada aparición deR'es independientemente alifático C1-C20 (p. ej., alquilo C1-C20, alquilo C1-C15, alquilo C1-C10 o alquilo C1-C3). En realizaciones,R'es independientemente un alquilo no sustituido (p. ej., alquilo C1-C20, alquilo C1-C15, alquilo C1-C10 o alquilo C1-C3 no sustituido). En algunas realizaciones,R'es independientemente alquilo C1-C3 opcionalmente no sustituido. En realizaciones, el alquenilo no está sustituido. En realizaciones, el alquenilo se sustituye (p. ej., con 1,2, 3, 4, 5, o 6 grupos sustituyentes como se describe en el presente documento). En realizaciones, un grupo alquenilo está sustituido con un grupo -OH, y también puede denominarse en el presente documento como un grupo "hidroxialquenilo", en el que el prefijo indica el grupo -OH, y "alquenilo" es como se describe en el presente documento.
Alquinilo:Como se utiliza en el presente documento, "alquinilo" significa cualquier cadena hidrocarbonada de configuración lineal o ramificada, que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono que se encuentran en cualquier punto estable a lo largo de la cadena; por ejemplo, "alquinilo C2-C20" se refiere a un grupo alquinilo que tiene 2-20 carbonos. Ejemplos de un grupo alquinilo incluyen prop-2-inilo, but-2-inilo, but-3-inilo, pent-2-inilo, 3-metilpent-4-inilo, hex-2-inilo, hex-5-inilo, etc. En realizaciones, un alquinilo comprende un triple enlace carbono-carbono. Un grupo alquinilo puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos sustituyentes como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un grupo alquilo puede estar sustituido con uno o más (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, o 6 sustituyentes<seleccionados independientemente) de halógeno, -COR', -CO>2<H, -CO>2<R', -CN,>-O<h>, -O<r>',<-OCOR', -OCO>2<R', -NH>2<, ->NHR', -N(R')2, -SR' o -SO2R', en donde cada aparición deR'es independientemente alifático C1-C20, por ejemplo alquilo C1-C20, alquilo C1-C15, alquilo C1-C10 o alquilo C1-C3). En realizaciones,R'es independientemente un alquilo no sustituido (p. ej., alquilo C1-C20, alquilo C1-C15, alquilo C1-C10 o alquilo C1-C3 no sustituido). En algunas realizaciones,R'es independientemente alquilo C1-C3 opcionalmente no sustituido. En realizaciones, el alquinilo no está sustituido. En las realizaciones, el alquilo se sustituye (p. ej., con 1,2, 3, 4, 5, o 6 grupos sustituyentes como se describe en el presente documento).
Arilo:El término "arilo", usado solo o como parte de un resto más grande como en "aralquilo", se refiere a un sistema anular carbocíclico monocíclico, bicíclico o tricíclico, que tiene un total de seis a catorce miembros anulares, en el que dicho sistema anular tiene un único punto de unión al resto de la molécula, al menos un anillo en el sistema es aromático, y en el que cada anillo en el sistema contiene 4 a 7 miembros anulares. En realizaciones, un grupo arilo tiene 6 átomos de carbono anulares ("arilo C6", p. ej., fenilo). En algunas realizaciones, un grupo arilo tiene 10 átomos de carbono anulares ("arilo C10", p. ej., naftilo, tal como 1 -naftilo y 2-naftilo). En algunas realizaciones, un grupo arilo tiene 14 átomos de carbono anulares ("arilo C14", p. ej., antracilo). "Arilo" también incluye sistemas anulares en los que el anillo de arilo, como se define anteriormente, está condensado con uno o más grupos carbociclilo o heterociclilo, en los que el radical o punto de unión está en el anillo de arilo, y en tales casos, el número de átomos de carbono continúa para designar el número de átomos de carbono en el sistema anular de arilo. Los arilos de ejemplo incluyen fenilo, naftilo, y antraceno.
Arileno:El término "arileno", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo arilo que es divalente (es decir, que tiene dos puntos de unión a la molécula). Los arilenos de ejemplo incluyen fenileno (p. ej., fenileno no sustituido o fenileno sustituido).
Nanopartículas lipídicas (NPL)
La presente invención proporciona, entre otros, una composición para un ARNm terapéutico donde el ARNm es encapsulado en nanopartículas lipídicas para la captación celular eficiente y el procesamientoin vivo.
Las nanopartículas lipídicas se pueden formular en combinación con uno o más ácidos nucleicos adicionales, portadores, ligandos dirigidos o reactivos estabilizadores, o en composiciones farmacológicas donde se mezcla con excipientes adecuados. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición. Una nanopartícula lipídica particular se selecciona basándose en su capacidad para facilitar la transfección de un ácido nucleico a una célula diana.
En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos, uno o más lípidos a base de colesterol y uno o más lípidos modificados con PEG, en donde uno o más lípidos no catiónicos comprenden 1,2-Dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE). En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica comprende no más de cuatro componentes lipídicos distintos. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica comprende no más de tres componentes lipidíeos distintos. En algunas realizaciones, un componente lipídico distinto es un lípido catiónico a base de esteroles. Los componentes lipídicos de una nanopartícula lipídica adecuada comprenden un lípido catiónico (p. ej., CKK-E12, Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3), un lípido no catiónico (DEPE), un lípido a base de colesterol (p. ej., colesterol) y un lípido modificado con PEG (DMG-PEG2K). Como alternativa, los componentes lipídicos de una nanopartícula lipídica adecuada comprenden un lípido catiónico a base de esteroles (p. ej., ICE), un lípido no catiónico (DEPE) y un lípido modificado con PEG (p. ej., DMG-PEG2K).
En algunas realizaciones, la DEPE en la nanopartícula lipídica proporciona una expresión mejorada del ARNm que codifica una proteína o un péptido, en particular en comparación con una nanopartícula lipídica que contiene DOPE que es de otra manera idéntica en composición (en términos de componentes lipídicos y relación molar de los componentes lipídicos individuales) a la nanopartícula lipídica que contiene DEPE. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína que codifica el ARNm administrado por una nanopartícula lipídica que contiene DEPE se mejora al menos dos veces respecto a una nanopartícula lipídica que contiene DOPE. La expresión mejorada del ARNm se puede determinar administrando una nanopartícula lipídica que contiene DEPE y una nanopartícula lipídica formulada idénticamente con un lípido auxiliar diferente (p. ej., la DOPE) para probar en animales (p. ej., un ratón), por ejemplo, mediante inyección en la vena de cola, y seguimiento de la expresión del ARNm en uno o más puntos temporales (p. ej., 4, 6, 8, 12, 18 o 24 horas después de la administración).
En algunas realizaciones, el ARNm codifica una proteína que se traduce en la proteína terapéuticain vivo.En algunas realizaciones, el ARNm que codifica una proteína codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunas realizaciones, el polipéptido terapéutico es una cadena ligera de anticuerpos o una cadena pesada de anticuerpos. En algunas realizaciones, el polipéptido terapéutico está ausente o es deficiente en el sujeto al cual se administra el ARNm. En algunas realizaciones, el ARNm que codifica una proteína codifica un péptido. En algunas realizaciones, el péptido es un antígeno.
En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que contienen DEPE de la invención son seguras y tolerables cuando se administran a un sujeto. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas que contienen DEPE de la invención no producen ninguna toxicidad hepática perceptible cuando se administran al sujeto. Los marcadores adecuados para evaluar la toxicidad hepática son ALT y AST.
Lípidos catiónicos
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "lípidos catiónicos" se refiere a cualquiera de un número de especies de lípidos que tienen una carga positiva neta a un pH seleccionado, como el pH fisiológico.
Los lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional de Patente w O 2010/144740. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico, (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino) butanoato, que tiene una estructura compuesta de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la presente invención incluyen los lípidos catiónicos ionizables, como se describe en la Publicación Internacional de Patente WO 2013/149140. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico de una de las siguientes fórmulas:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R1y R2se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo C<1>-C<20>variablemente saturado o insaturado, opcionalmente sustituido y un acilo C<6>-C<20>variablemente saturado o insaturado, opcionalmente sustituido; en donde L<1>y L<2>se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un alquilo C<1>-C<30>opcionalmente sustituido, un alquenilo C<1>-C<30>variablemente insaturado, opcionalmente sustituido y un alquinilo C<1>-C<30>opcionalmente sustituido; en donde m y o se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en cero y cualquier número entero positivo (p. ej., donde m es tres); y en donde n es cero o cualquier número entero positivo (p. ej., donde n es uno). En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen el lípido catiónico (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-15,18-dien-1-amina ("HGT5000"), que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen el lípido catiónico (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-4,15,18-trien-l-amina ("HGT5001"), que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen el lípido catiónico y (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)tetracosa-5,15,18-trien- 1 -amina ("HGT5002"), que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos como aminoalcoholes lipidoides en la Publicación Internacional de Patente WO 2010/053572. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
En algunas realizaciones, los lipidoides utilizados en las composiciones y métodos de la invención incluidos se sintetizan haciendo reaccionar aminas comercializadas con acrilatos lipófilos, acrilamidas o epóxidos. En algunas realizaciones, los lipidoides se derivan de la amina 86 (N,N-bis(2-hidroxietil)etilendiamina) y la amina 87 (N-(3-aminopropil)dietanamina). Los lipidoides tienen varias ventajas como una nueva clase potencial de reactivos de administración de ácido nucleico: i) la química utilizada para sintetizar los lipidoides es simple y económica, ii) ya se ha desarrollado una biblioteca de diversidad estructural, iii) se podría establecer una correlación entre la estructura y la función de los sistemas de administración a partir de los grandes conjuntos de datos acumulados al examinar la biblioteca de lipidoides. La simplicidad de estas reacciones permitió construir una biblioteca estructuralmente diversa de lipidoides variando los tipos de aminas, y las longitudes y tipos (acrilamida/acrilato/epóxido) de colas (o cadenas con un brazo de carbono).
En algunas realizaciones, los lipidoides comprenden aproximadamente 2-20 cadenas de brazo de carbono. En algunas realizaciones, los lipidoides comprenden aproximadamente 5-18 cadenas de brazo de carbono. En algunas realizaciones, los lipidoides comprenden aproximadamente 10-16 cadenas de brazo de carbono. En algunas realizaciones los lipidoides comprenden aproximadamente 10-14 cadenas de brazo de carbono. En algunas realizaciones, los lipidoides comprenden aproximadamente 10-12 cadenas de brazo de carbono. En algunas realizaciones, los lipidoides comprenden aproximadamente 10 cadenas de brazo de carbono. En algunas realizaciones, los lipidoides comprenden aproximadamente 12 cadenas de brazo de carbono. En algunas realizaciones, los lipidoides comprenden aproximadamente 14 cadenas de brazo de carbono. En algunas realizaciones, los lipidoides comprenden aproximadamente 16 cadenas de brazo de carbono.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional de Patente WO 2016/118725. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional de Patente WO 2016/118724. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen un lípido catiónico con la fórmula de 14,25-ditridecil 15,18,21,24-tetraaza-octatriacontano, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en las Publicaciones Internacionales de Patente WO 2013/063468 y WO 2016/205691. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico de la siguiente fórmula:
o sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que cada aparición de RL es independientemente alquenilo de C6-C40 opcionalmente sustituido. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional de Patente WO 2015/184256. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico de la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que cada X es independientemente O o S; cada Y es independientemente O o S; cada m es independientemente 0 a 20; cada n es independientemente 1 a 6; cada R<a>es independientemente hidrógeno, alquilo C1-50 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-50 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-50 opcionalmente sustituido, carbociclilo C3-10 opcionalmente sustituido, heterociclilo de 3-14 miembros opcionalmente sustituido, arilo C6-14 opcionalmente sustituido, heteroarilo de 5-14 miembros opcionalmente sustituido, o halógeno; y cada R<b>es independientemente hidrógeno, alquilo C1-50 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-50 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-50 opcionalmente sustituido, carbociclilo C3-10 opcionalmente sustituido, heterociclilo de 3-14 miembros opcionalmente sustituido, arilo C6-14 opcionalmente sustituido, heteroarilo de 5 a 14 miembros opcionalmente sustituido, o halógeno. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico, "Target 23", que tiene una estructura compuesta de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional de Patente WO 2016/004202. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, las composiciones y los métodos | de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la presente invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en la solicitud provisional de patente de e E. UU. Número de serie 62/758.179. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico de la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada R1 y R2 es independientemente H o alifático C1-C6; cadames independientemente un número entero que tiene un valor de 1 a 4; cada A es independientemente un enlace covalente o arileno; cada L1 es independientemente un grupo éster, tioéster, disulfuro o anhídrido; cada L2 es independientemente alifático C2-C10; cada X1 es independientemente H u OH; y cada R3 es independientemente alifático C6-C20. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico de la siguiente fórmula:
(Compuesto 1)
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico de la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico de la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la presente invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en in J. McClellan, M. C. King, Cell 2010, 141, 210-217 y en Whitehead et al., Nature Communications (2014) 5:4277. En ciertas realizaciones, los lípidos catiónicos de las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional de Patente WO 2015/199952. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional de Patente WO 2017/004143. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional de Patente WO 2017/075531. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico de la siguiente fórmula:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde uno de L1o L2es -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)<x>, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NR<a>C(=O)-, -C(=O)NR<a>-, NR<a>C(=O)NR<a>-, -OC(=O)NR<a>-, o -NR<a>C(=O)O-; y el otro de L1o L2es -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)<x>, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NR<a>C(=O)-, -C(=O)NR<a_>, NR<a>C(=O)NRa-, - OC(=O)NR<a>- o -NR<a>C(=O)O- o un enlace directo; G1y G2son cada uno de ellos independientemente alquileno C<1>-C<12>no sustituido, alquenileno C<1>-C<12>; G3es un alquileno C<1>-C<24>, alquenileno C<1>-C<24>, cicloalquileno C<3>-C<8>, cicloalquenileno C<3>-C<8>; R<a>es H o alquilo C<1>-C<12>; R1y R2son cada uno de ellos independientemente alquilo C<6>-C<24>o alquenilo C<6>-C<24>R3es H, OR5, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4o - NR5C(=O)R4; R4es alquilo C<1>-C<12>; R5es H o alquilo C<1>-C<6>; y x es 0, 1 o 2.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional de Patente WO 2017/117528. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene la estructura de compuesto:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional de Patente WO 2017/049245. En algunas realizaciones, los lípidos catiónicos de las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un compuesto de una de las siguientes fórmulas:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. Para cualquiera de estas cuatro fórmulas, R4se selecciona independientemente de -(CH<2>)<n>Q y -(CH<2>)<n>CHQR; Q se selecciona del grupo que consiste en -OR, -OH, -O(CH2)<n>N(R)2, -OC(O)R, -CX<3>, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, - N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)<2>, -N(H)C(O)N(H)(R), - N(R)C(S)N(R)<2>, -N(H)C(S)N(R)<2>, -N(H)C(S)N(H)(R), y un heterociclo; y n es 1,2, o 3. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los lípidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional de Patente WO 2017/173054 y WO 2015/095340. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la presente invención incluyen los lípidos catiónicos escindibles, como se describe en la Publicación Internacional de Patente WO 2012/170889. En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico de la siguiente fórmula:
en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en imidazol, guanidinio, amino, imina, enamina, un alquilamino opcionalmente sustituido (p. ej., un alquilamino como dimetilamino) y piridilo; en donde R2 se selecciona del grupo que consiste en una de las dos fórmulas siguientes:
y en donde R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en un alquilo C6-C20 variablemente saturado o insaturado, opcionalmente sustituido y un acilo C6-C20 variablemente saturado o insaturado, opcionalmente sustituido; y donde n es cero o cualquier número entero positivo (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más). En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico, "HGT4001", que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico, "HGT4002", que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico, "HGT4003", que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico, "HGT4004", que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico "HGT4005", que tiene una estructura de compuesto de:
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otros lípidos catiónicos adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la presente invención incluyen los lípidos catiónicos escindibles como se describe en la solicitud provisional de EE. UU. n.° 62/672.194, presentada el 16 de mayo de 2018. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que es cualquiera de las fórmulas generales o cualquiera de las estructuras (1a)-(21a) y (1 b)-(21 b) y (22)(237) descritas en la solicitud provisional de EE. UU. n.° 62/672.194. En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que tiene una estructura de acuerdo con la Fórmula (I'),
en donde:
R<X>es independientemente -H, -L1-R1, o -L<5A>-L<5B>-B';
cada uno de L1, L2y L3es independientemente un enlace covalente, -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)S-, o -C(O)NR<L>-;
cada L<4A>y L<5A>es independientemente -C(O)-, -C(O)O-, o -C(O)NR<L>-;
cada L<4B>y L<5B>es independientemente alquileno C<1>-C<20>; alquenileno C<2>-C<20>o alquinileno C<2>-C<20>;
cada B y B' es NR4R5o un heteroarilo que contiene nitrógeno de 5 a 10 miembros;
cada R1, R2y R3es independientemente alquilo C<6>-C<30>, alquenilo C<6>-C<30>o alquinilo C<6>-C<30>;
cada R4y R5es independientemente hidrógeno, alquilo C<1>-C<10>; alquenilo C<2>-C<10>; o alquinilo C<2>-C<10>; y cada R<L>es independientemente hidrógeno, alquilo C<1>-C<20>, alquenilo C<2>-C<20>, o alquinilo C<2>-C<20>.
En ciertas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen un lípido catiónico que es el Compuesto (139) de 62/672.194, que tiene una estructura de compuesto de:
En algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención incluyen el lípido catiónico, cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio ("DOTMA"). (Feigner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); patente de EE. UU. n.° 4.897.355). Otros lípidos catiónicos adecuados para las composiciones y métodos de la presente invención incluyen, por ejemplo, 5-carboxiespermilglicindioctadecilamida ("DOGS"); 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermin-carboxamida)etil]-N,N-dimetil-l-propanaminio ("DOSPA") (Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989), Patente de los Estados Unidos n.° 5.171.678; Patente de los Estados Unidos n.° 5.334.761); I,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano ("DODAP"); l,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano ("DOTAP").
Lípidos catiónicos a modo de ejemplo adicionales adecuados para las composiciones y métodos de la presente invención también incluyen: I,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano ("DSDMA"); 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano ("DODMA"); 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano ("DLinDMA"); 1,2-dilinoleniloxi-N ,N-dimetil-3-aminopropano ("DLenDMA"); cloruro de N-dioleil-N,N-dimetilamonio ("DODAC"); bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio ("DDAB"); bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil amonio ("DMRIE"); 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano ("CLinDMA"); 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil-1-(cis,cis-9',I-2'-octadecadienoxi)propano ("CpLinDMA"); N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina ("Dm OBA"); 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano ("DOcarbDAP"); 2,3-dilinoleoiloxi-N,N-dimetilpropilamina ("DLinDAP"); I,2-N,N'-dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano ("DLincarbDAP"); 1,2-dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano ("DLinCDAP"); 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano ("DLin-K-DMA"); 2-((8-[(3P)-colest-5-en-3-iloxi]octil)oxi)-N, N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]propano-1-amina ("octil-CLinDMA"); (2R)-2-((8-[(3beta)-colest-5-en-3-Noxi]octN)oxi)-N,N-dimetN-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]propan-1-amina ("octil-CLinDMA (2R)"); (2S)-2-((8-[(3P)-colest-5-en-3-iloxi]octil)oxi)-N, N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1-amina ("octil-CLinDMA (2S)"); 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano ("DLin-K-XTC2-DMA"); y 2-(2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-1,3-dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamina ("DLin-KC2-DMA") (véase el documento de patente WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28: 172-176 (2010)). (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); Publicación de Patente Internacional WO 2005/121348). En algunas realizaciones, uno o más de los lípidos catiónicos comprenden al menos uno de un resto de imidazol, dialquilamino, o guanidinio.
En algunas realizaciones, uno o más lípidos catiónicos adecuados para las composiciones y métodos de la presente invención incluyen 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano ("XTC"); (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1, 3]dioxol-5-amina ("ALNY-100") y/o 4,7,13-tris(3-oxo-3-(undecilamino)propil)-N1,N16-diundecil-4,7,10,13-tetraazahexadecano-1,16-diamida ("NC98-5").
En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención incluyen uno o más lípidos catiónicos que constituyen al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, o 70 %, medido en peso, del contenido total de lípidos en la composición que comprende nanopartículas lipídicas. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención incluyen uno o más lípidos catiónicos que constituyen al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, o 70 %, medido como % en moles, del contenido total de lípidos en la composición que comprende nanopartículas lipídicas. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención incluyen uno o más lípidos catiónicos que constituyen aproximadamente 30-70 % (p. ej., aproximadamente 30-65 %, aproximadamente 30-60 %, aproximadamente 30-55 %, aproximadamente 30-50 %, aproximadamente 30-45 %, aproximadamente 30-40 %, aproximadamente 35-50 %, aproximadamente 35-45 %, o aproximadamente 35-40 %), medido en peso, del contenido lipídico total en la composición que comprende nanopartículas. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención incluyen uno o más lípidos catiónicos que constituyen aproximadamente 30-70 % (p. ej., aproximadamente 30-65 %, aproximadamente 30-60 %, aproximadamente 30-55 %, aproximadamente 30-50 %, aproximadamente 30-45 %, aproximadamente 30-40 %, aproximadamente 35-50 %, aproximadamente 35-45 %, o aproximadamente 35-40 %), medido como % en moles, del contenido total de lípidos en la composición, que comprende nanopartículas lipídicas.
En algunas realizaciones, los lípidos catiónicos a base de esteroles pueden usarse en lugar o además de los lípidos catiónicos descritos en el presente documento. Los lípidos catiónicos a base de esteroles adecuados son los lípidos catiónicos a base de esteroles dialquilamino-, imidazol- y guanidinio. Por ejemplo, ciertas realizaciones se refieren a una composición que comprende uno o más lípidos catiónicos a base de esteroles que comprenden un imidazol, por ejemplo, el éster de colesterol e imidazol o lípido "ICE" (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(1H-imidazol-4-il)propanoato, representado por la estructura (i) a continuación. En ciertas realizaciones, una nanopartícula lipídica para la administración de ARN (p. ej., ARNm) que codifica una proteína funcional puede comprender uno o más lípidos catiónicos a base de imidazol, por ejemplo, el éster de colesterol e imidazol o lípido "ICE" (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(1H-imidazol-4-il)propanoato, representado por la siguiente estructura:
En algunas realizaciones, el porcentaje de lípidos catiónicos en una nanopartícula lipídica puede ser superior al 10 %, superior al 20 %, superior al 30 %, superior al 40 %, superior al 50 %, superior al 60 %, o superior al 70 %. En algunas realizaciones, el o los lípidos catiónicos constituyen aproximadamente 30-50 % (p. ej., aproximadamente 30-45 %, aproximadamente 30-40 %, aproximadamente 35-50 %, aproximadamente 35-45 %, o aproximadamente 35-40 %) de la nanopartícula lipídica en peso. En algunas realizaciones, el lípido catiónico (p. ej., lípido ICE) constituye aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, o aproximadamente 50 % de la nanopartícula lipídica por relación molar.
Lípidos no catiónicos
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "lípido no catiónico" se refiere a cualquier lípido neutral, zwitteriónico o aniónico, al que también se hace referencia en el presente como un "lípido auxiliar". Como se utiliza en el presente documento, la expresión "lípido aniónico" se refiere a cualquiera de varias especies de lípidos que llevan una carga negativa neta a un pH seleccionado, tal como un pH fisiológico.
La invención se refiere a las NPL-ARNm que comprenden uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares no catiónicos, en donde el uno o más lípidos auxiliares comprenden 1,2-Dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE) y más del 70 % de la nanopartícula lipídica en la composición tiene un tamaño que varía de 75 nm a 150 nm. En algunas realizaciones, la DEPE es el único lípido auxiliar no catiónico en la NPL-ARNm. En otras realizaciones, la porción de lípido auxiliar de la NPL-ARNm comprende DEPE y colesterol.
Otros lípidos no catiónicos o lípidos auxiliares que pueden incluirse en una NPL-ARNm incluyen, pero no se limitan a, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), 1 -palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE), dioleoilfosfatidiletanolamina 4-(N-maleimidometil)- ciclohexano-I-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), fosfatidilserina, esfingolípidos, cerebrósidos, gangliósidos, 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, l-estearoil-2-oleoilfosfatidietanolamina (SOPE), o una mezcla de los mismos.
En algunas realizaciones, el lípido no catiónico puede comprender una relación molar de aproximadamente 5 % a aproximadamente 90 %, o de aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 % del lípido total presente en una nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, un lípido no catiónico es un lípido neutro, es decir, un lípido que no lleva una carga neta en las condiciones bajo las cuales se formula y/o administra la composición. En algunas realizaciones, el porcentaje de lípidos no catiónicos en una nanopartícula lipídica puede superior al 5 %, superior al 10 %, superior al 20 %, superior al 30 %, superior al 40 %.
Lípidos a base de colesterol
En algunas realizaciones, una composición que comprende nanopartículas lipídicas para la administración de ARNm comprende uno o más lípidos a base de colesterol. Por ejemplo, un lípido a base de colesterol adecuado para practicar la invención es el colesterol. Otros lípidos adecuados a base de colesterol incluyen, por ejemplo, DC-Col (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino-propil)piperazina (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); Patente de los Estados Unidos n.° 5.744.335), o éster de colesterol e imidazol (ICE).
En algunas realizaciones, un lípido a base de colesterol puede estar presente en una proporción molar (% en moles) de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 30 %, o de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 20 % de los lípidos totales presentes en una nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, el porcentaje de lípido a base de colesterol en la nanopartícula lipídica puede superior a aproximadamente 5 % en moles, superior a aproximadamente 10 % en moles, superior a aproximadamente 20 % en moles, superior a aproximadamente 30 % en moles, o superior a aproximadamente 40 % en moles. En algunas realizaciones, el porcentaje de lípido a base de colesterol en la nanopartícula lipídica puede ser no más de aproximadamente 5 % en moles, no más de aproximadamente 10 % en moles, no más de aproximadamente 20 % en moles, no más de aproximadamente 30 % en moles, o no más de aproximadamente 40 % en moles.
En algunas realizaciones, un lípido a base de colesterol puede estar presente en una proporción de peso (% en peso) de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 30 %, o de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 20 % de los lípidos totales presentes en una nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, el porcentaje de lípido a base de colesterol en la nanopartícula lipídica puede superior a aproximadamente 5 % en peso, superior a aproximadamente 10 % en peso, superior a aproximadamente 20 % en peso, superior a aproximadamente 30 % en peso, o superior a aproximadamente 40 % en peso. En algunas realizaciones, el porcentaje de lípido a base de colesterol en la nanopartícula lipídica puede ser no más de aproximadamente 5 % en peso, no más de aproximadamente 10 % en peso, no más de aproximadamente 20 % en peso, no más de aproximadamente 30 % en peso, o no más de aproximadamente 40 % en peso.
Lípidos PEGilados
Un lípido PEGilado o modificado con PEG adecuado para practicar la invención es 1,2-dimiristoil-rac-glicero-3-metoxipolietilenglicol-2000 (DMG-PEG2K). Por ejemplo, el uso de fosfolípidos modificados con polietilenglicol (PEG) y lípidos derivados tales como ceramidas derivatizadas (PEG-CER), incluyendo N-octanil-esfingosina-l-[Succinil(metoxi polietilenglicol)-2000] (C8 PEG-2000 ceramida) también está contemplado en la presente invención. Los lípidos modificados con PEG contemplados incluyen, pero no se limitan a, una cadena de polietilenglicol de hasta 2 kDa, hasta 3 kDa, hasta 4 kDa o hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) alquilo de C<6>-C<20>de longitud. En algunas realizaciones, un lípido modificado con PEG o PEGilado es colesterol PEGilado o PEG-2K. En algunas realizaciones, los lípidos intercambiables particularmente útiles son PEG-ceramidas que tienen cadenas acilo más cortas (p. ej., C<14>o C<18>). La adición de tales componentes puede prevenir la agregación de complejos y también puede proporcionar un medio para aumentar la vida útil de la circulación y aumentar la administración de la composición de lípido-ácido nucleico a los tejidos diana, (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237), o pueden ser seleccionados para intercambiar rápidamente fuera de la formulaciónin v ivo(véase Patente de los Estados Unidos n.° 5.885.613). Los lípidos intercambiables particularmente útiles son las PEG-ceramidas que tienen cadenas de acilo más cortas (p. ej., C<14>o C<18>). Los fosfolípidos modificados con PEG y los lípidos derivados de la presente invención pueden comprender una proporción molar de aproximadamente el 0 % a aproximadamente el 20 % , de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 20 % , de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 15 % , de aproximadamente el 4 % a aproximadamente el 10 % , o aproximadamente el 2 % del total de lípidos presentes en la nanopartícula lipídica.
Los fosfolípidos modificados con PEG y los lípidos derivados pueden constituir no más del 0,5 % , 1 % , 1,5 % , 2 % , 2,5 % , 3 % , 3,5 % , 4 % , 4,5 % o 5 % de los lípidos totales en una nanopartícula lipídica en peso o en moles. En algunas realizaciones, los lípidos modificados con PEG pueden constituir aproximadamente el 5 % o menos de los lípidos totales en una nanopartícula lipídica en peso o en concentración molar. En algunas realizaciones, los lípidos modificados con PEG pueden constituir aproximadamente el 4 % o menos de los lípidos totales en una nanopartícula lipídica en peso o en concentración molar. En algunas realizaciones, los lípidos modificados con PEG constituyen normalmente el 3 % o menos de los lípidos totales en una nanopartícula lipídica en peso o en concentración molar. En algunas realizaciones, los lípidos modificados con PEG constituyen normalmente el 2 % o menos de los lípidos totales en una nanopartícula lipídica en peso o en concentración molar. En algunas realizaciones, los lípidos modificados con PEG constituyen normalmente el 1 % o menos de los lípidos totales en una nanopartícula lipídica en peso o en concentración molar. En algunas realizaciones, los lípidos modificados con PEG constituyen aproximadamente el 1 5 % , aproximadamente el 1-4 % , aproximadamente el 1-3 % , o aproximadamente el 1-2 % , de los lípidos totales en una nanopartícula lipídica en peso o en concentración molar. En algunas realizaciones, los lípidos modificados con PEG constituyen aproximadamente el 0,01-3 % (p. ej., aproximadamente el 0,01-2,5 % , 0,01-2 % , 0 ,01-1,5 % , 0,01 -1 % ) de los lípidos totales en una nanopartícula lipídica en peso o en concentración molar.
Relaciones molares entre lípidos
Según diversas realizaciones, la selección de lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y/o lípidos modificados con PEG comprendidos por la nanopartícula lipídica, así como la relación molar relativa de tales lípidos entre sí, se basa en las características del o de los lípidos seleccionados, la naturaleza de las células diana previstas, las características del ARNm que se va a administrar. Otras consideraciones incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena alquilo, así como el tamaño, la carga, el pH, el pKa, la fusogenicidad y la tolerabilidad del lípido o lípidos seleccionados. Por lo tanto, las relaciones molares pueden ajustarse en consecuencia. Los lípidos no catiónicos comprenden 1,2-Dierucoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE).
Varias combinaciones de lípidos, es decir, lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos, lípidos modificados con PEG y opcionalmente colesterol, que pueden usarse para preparar, y que están compuestos por, nanopartículas lipídicas preformadas se describen en la bibliografía y en el presente documento. Por ejemplo, una solución lipídica adecuada puede contener C K K -E 12, DEPE, colesterol y DMG-PEG2K; C12-200, DEPE, colesterol y DMG-PEG2K; HGT5000, DEPE, colesterol, y DMG-PEG2K; HGT5001, DEPE, colesterol, y DM G-PEG2K; o ICE, DEPE y DM G-PEG2K. En la técnica se describen combinaciones adicionales de lípidos, p. ej., las solicitudes PCT/U S17/61100, presentada el 10 de noviembre de 2017, publicada como WO 2018/089790; titulada "Novel ICE-based Lipid Nanoparticle Formulation for Delivery of mRNA"; PCT/U S18/21292, presentada el 7 de marzo de 2018, publicada como WO 2018/165257, titulada "PolyAnionic Delivery of Nucleic Acids"; PCT/US18/36920, presentada el 11 de junio de 2018, titulada "Poly (Phosphoesters) for Delivery of Nucleic Acids"; la solicitud provisional de EE. UU. 62/676.147, presentada el 24 de mayo de 2018; titulada "Thioester Cationic Lipids"; la solicitud provisional de EE. UU. 62/677.821, presentada el 30 de mayo de 2018 titulada "Cationic Lipids Comprising a Steroidal Moiety"; la solicitud provisional de EE. UU. 62/677.809, presentada el 30 de mayo de 2018, titulada "Macrocyclic Lipids"; la solicitud provisional de EE. UU. 62/677.818, presentada el 30 de mayo de 2018, titulada "Vitamin K Cationic Lipids"; la solicitud provisional de EE. UU. 62/677.828, presentada el 30 de mayo de 2018, titulada "Vitamin D Cationic Lipids"; la solicitud provisional de EE. UU. 62/677.851, presentada el 30 de mayo de 2018, titulada "Vitamin A Cationic Lipids"; la solicitud provisional de EE. UU. 62/677.855, presentada el 30 de mayo de 2018, titulada "Vitamin E Cationic Lipids".
En varias realizaciones, los lípidos catiónicos (p. ej., C K K -E 12, Compuesto 1, Compuesto 2, Compuesto 3, C12-200, ICE y/o HGT4003) constituyen aproximadamente el 30-60 % (p. ej., aproximadamente el 30-55 % , aproximadamente el 30-50 % , aproximadamente el 30-45 % , aproximadamente el 30-40 % , aproximadamente el 35-50 % , aproximadamente el 35-45 % , o aproximadamente el 35-40 % ) de la nanopartícula en relación molar. En algunas realizaciones, el porcentaje de lípidos catiónicos (p. ej., C K K -E 12, Compuesto 1, Compuesto 2 o Compuesto 3), C 12 -200, ICE, y/o HGT4003) es o es superior a aproximadamente el 30 % , aproximadamente el 35 % , aproximadamente el 40 % , aproximadamente el 45 % , aproximadamente el 50 % , aproximadamente el 55 % , o aproximadamente el 60 % de la nanopartícula lipídica en relación molar.
En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) y lípido(s) no catiónicos y lípido(s) a base de colesterol y lípido(s) modificado(s) con PEG puede estar entre aproximadamente 30-60:25-35:20-30:1-15, respectivamente. En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) y lípido(s) no catiónicos y lípido(s) a base de colesterol y lípido(s) modificado(s) con PEG es alrededor de 40:30:20:10, respectivamente. En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) y lípido(s) no catiónicos y lípido(s) a base de colesterol y lípido(s) modificado(s) con PEG es alrededor de 40:30:25:5, respectivamente. En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) y lípido(s) no catiónicos y lípido(s) a base de colesterol y lípido(s) modificado(s) con PEG es alrededor de 40:32:25:3, respectivamente. En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) y lípido(s) no catiónicos y lípido(s) a base de colesterol y lípido(s) modificado(s) con PEG es alrededor de 50:25:20:5. En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) a base de esterol y lípido(s) no catiónicos y lípido(s) modificado(s) con PEG es 50:45:5. En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) a base de esterol y lípido(s) no catiónicos y lípido(s) modificado(s) con PEG es 50:40:10. En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) a base de esterol y lípido(s) no catiónicos y lípido(s) modificado(s) con PEG es 55:40:5. En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) a base de esterol y lípido(s) no catiónicos y lípido(s) modificado(s) con PEG es 55:35:10. En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) a base de esterol y lípido(s) no catiónicos y lípido(s) modificado(s) con PEG es 60:35:5. En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) a base de esterol y lípido(s) no catiónicos y lípido(s) modificado(s) con PEG es 60:30:10.
En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica adecuada para la presente invención comprende ICE y DEPE en una relación molar ICE:DEPE de >1:1. En algunas realizaciones, la relación molar ICE:DEPE es <2,5:1. En algunas realizaciones, la relación molar ICE:DEPE está entre 1:1 y 2,5:1. En algunas realizaciones, la relación molar ICE:DEPE es de alrededor de 1,5:1. En algunas realizaciones, la relación molar ICE:DEPE es de alrededor de 1,7:1. En algunas realizaciones, la relación molar ICE:DEPE es de alrededor de 2:1. En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica adecuada para la presente invención comprende ICE y DMG-PEG-2K en una relación molar ICE:DMG-PEG-2K de >10:1. En algunas realizaciones, la relación molar ICE:DMG-PEG-2K es <16:1. En algunas realizaciones, la relación molar ICE:DMG-PEG-2K es alrededor de 12:1. En algunas realizaciones, la relación molar ICE:DMG-PEG-2K es alrededor de 14:1. En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica adecuada para la presente invención comprende DEPE y DMG-PEG-2K en una relación molar DEPE: DMG-PEG-2K de >5:1. En algunas realizaciones, la relación molar DEPE: DMG-PEG-2K es <11:1. En algunas realizaciones, la relación molar DEPE: DMG-PEG-2K es alrededor de 7:1. En algunas realizaciones, la relación molar DEPE: DMG-PEG-2K es alrededor de 10:1.
En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica adecuada para la presente invención comprende ICE, DEPE y DMG-PEG-2K en una relación molar ICE:DEPE:DMG-PEG-2K de 50:45:5. En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica adecuada para la presente invención comprende ICE, DEPE y DMG-PEG-2K en una relación molar ICE:DEPE:DMG-PEG-2K de 50:40:10. En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica adecuada para la presente invención comprende ICE, DEPE y DMG-PEG-2K en una relación molar ICE:DEPE:DMG-PEG-2K de 55:40:5. En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica adecuada para la presente invención comprende ICE, DEPE y DMG-PEG-2K en una relación molar ICE:DEPE:DMG-PEG-2K de 55:35:10. En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica adecuada para la presente invención comprende ICE, DEPE y DMG-PEG-2K en una relación molar ICE:DEPE:DMG-PEG-2K de 60:35:5. En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica adecuada para la presente invención comprende ICE, DEPE y DMG-PEG-2K en una relación molar ICE:DEPE:DMG-PEG-2K de 60:30:10.
Polímeros
En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica adecuada se formula usando un polímero como portador, solo o en combinación con otros portadores incluyendo varios lípidos descritos en el presente documento. Los polímeros adecuados pueden incluir, por ejemplo, poliacrilatos, polialquilocianoacrilatos, polilactida, copolímeros de polilactidapoliglicólidos, policaprolactonas, dextrano, albúmina, gelatina, alginato, colágeno, quitosano, ciclodextrinas, protamina, protamina PEGilada, PLL, PLL pegilada y polietilenimina (PEI). Cuando la PEI está presente, puede ser una PEI ramificada de un peso molecular que varía de 10 y 40 kDa, p. ej., una PEI ramificada de 25 kDa (Sigma n.° 408727).
ARN mensajero (ARNm)
La presente invención puede utilizarse para encapsular cualquier ARNm. El ARNm es reconocido normalmente como el tipo de ARN que transporta la información del ADN al ribosoma. Normalmente, en los organismos eucariotas, el procesamiento del ARNm comprende la adición de una "caperuza" en el extremo 5', y una "cola" en el extremo 3'. Una caperuza típica es una caperuza de 7-metilguanosina, que es una guanosina que está unida a través de un enlace 5'-5'-trifosfato al primer nucleótido transcrito. La presencia de la caperuza es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La adición de una cola es normalmente un acontecimiento de poliadenilación por el cual se agrega un resto de poliadenililo al extremo 3' de la molécula de ARNm. La presencia de esta "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación por parte de la exonucleasa. El ARN mensajero es traducido por los ribosomas en una serie de aminoácidos que componen una proteína.
Los ARNm pueden sintetizarse de acuerdo con cualquiera de una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, los ARNm según la presente invención pueden sintetizarse mediante transcripciónin vitro(TIV). Brevemente, la TIV se realiza normalmente con un molde de ADN lineal o circular que contiene un promotor, un conjunto de trifosfatos de ribonucleótidos, un sistema tampón que puede incluir DTT e iones magnesio, y una ARN polimerasa adecuada (p. ej., ARN polimerasa T3, T7 o SP6), ADNasa I, pirofosfatasa y/o inhibidor de ARNasa. Las condiciones exactas variarán según la aplicación específica.
En algunas realizaciones, el ARNm sintetizadoin vitropuede purificarse antes de la formulación y encapsulación para eliminar las impurezas indeseables incluyendo varias enzimas y otros reactivos utilizados durante la síntesis de ARNm.
La presente invención puede utilizarse para formular y encapsular ARNm de una variedad de longitudes. En algunas realizaciones, la presente invención se puede utilizar para formular y encapsular ARNm sintetizadoin vitrode o superior a aproximadamente 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb, 5 kb 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, o 20 kb de longitud. En algunas realizaciones, la presente invención se puede usar para formular y encapsular ARNm sintetizadoin vitroque varían de aproximadamente 1-20 kb, aproximadamente 1-15 kb, aproximadamente 1-10 kb, aproximadamente 5-20 kb, aproximadamente 5-15 kb, aproximadamente 5-12 kb, aproximadamente 5-10 kb, aproximadamente 8-20 kb, o aproximadamente 8-15 kb de longitud.
La presente invención se puede utilizar para formular y encapsular el ARNm que no está modificado o el ARNm que contiene una o más modificaciones que normalmente mejoran la estabilidad. En algunas realizaciones, las modificaciones se seleccionan de nucleótidos modificados, esqueletos de fosfato de azúcar modificados, y región no traducida en 5' y/o 3'.
En algunas realizaciones, las modificaciones del ARNm pueden incluir modificaciones de los nucleótidos del ARN. Un ARNm modificado de acuerdo con la invención puede incluir, por ejemplo, modificaciones del esqueleto, modificaciones del azúcar o modificaciones de la base. En algunas realizaciones, los ARNm pueden sintetizarse a partir de nucleótidos naturales y/o análogos de nucleótidos (nucleótidos modificados), incluyendo, entre otros, purinas (adenina (A), guanina (G)) o pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracilo (U)), y como análogos de nucleótidos modificados o derivados de purinas y pirimidinas, tales como, por ejemplo, 1-metil-adenina, 2-metil-adenina, 2-metiltio-N-6-isopentenil-adenina, N6-metil-adenina, N6-isopentenil-adenina, 2-tio-citosina, 3-metil-citosina, 4-acetil-citosina, 5-metil-citosina, 2,6-diaminopurina, 1-metil-guanina, 2-metil-guanina, 2,2-dimetil-guanina, 7-metil-guanina, inosina, 1-metil-inosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidro-uracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-(carboxihidroximetil)-uracilo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, 5-metil-2-tio-uracilo, 5-metil-uracilo, éster metílico del ácido N-uracilo-5-oxiacético, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, 5'-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxi-uracilo, éster metílico del ácido uracilo-5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético (v), 1-metil-pseudouracilo, queosina, beta-D-manosil-queosina, wibutoxosina, y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina, pseudouridina, 5-metilcitidina e inosina. La preparación de tales análogos es conocida por una persona experta en la materia, p. ej., de las patentes de EE. UU. n.° 4.373.071, la patente de EE. UU. n.° 4.401.796, la patente de EE. UU. n.° 4.415.732, la patente de EE. UU. n.° 4.458.066, la patente de EE. UU. n.° 4.500.707, la patente de EE. UU. n.° 4.668.777, la patente de EE. UU. n.° 4.973.679, la patente de EE. UU. n.° 5.047.524, la patente de EE. UU. n.° 5.132.418, la patente de EE. UU. n.25.153.319, la patente de EE. UU. n.25.262.530 y 5.700.642.
Normalmente, la síntesis de ARNm incluye la adición de una "caperuza" en el extremo 5', y una "cola" en el extremo 3'. La presencia de la caperuza es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La presencia de una "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación por parte de la exonucleasa.
Por tanto, en algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de caperuza en 5'. Una caperuza en 5' se añade normalmente de la siguiente manera: en primer lugar, una fosfatasa terminal de ARN elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleótido 5', dejando dos fosfatos terminales; a continuación, se añade guanosina trifosfato (GTP) a los fosfatos terminales mediante una guanilil transferasa, produciendo un enlace 5'5'5 trifosfato; y el 7-nitrógeno de la guanina se metila mediante una metiltransferasa. La 2'-O-metilación también puede ocurrir en la primera base y/o segunda base después de los residuos de trifosfato de 7-metil guanosina. Ejemplos de estructuras de caperuza incluyen, pero no se limitan a, m7GpppNp-ARN, m7GpppNmp-ARN y m7GpppNmpNmp-ARN (donde m indica residuos de 2'-Ometil).
En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una región no traducida en 5' y/o 3'. En algunas realizaciones, una región no traducida en 5' incluye uno o más elementos que afectan la estabilidad o traducción de un ARNm, por ejemplo un elemento sensible al hierro. En algunas realizaciones, una región no traducida en 5' puede tener entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, una región no traducida en 3' incluye una o más de una señal de poliadenilación, un sitio de unión para proteínas que afectan la estabilidad de la ubicación de un ARNm en una célula, o uno o más sitios de unión para los miARN. En algunas realizaciones, una región no traducida en 3' puede tener una longitud de entre 50 y 500 nucleótidos o más.
Mientras que el ARNm provisto de reacciones de transcripciónin vitropuede ser deseable en algunas realizaciones, otras fuentes de ARNm se contemplan, incluyendo el ARNm producido a partir de bacterias, hongos, plantas y/o animales.
La presente invención puede utilizarse para formular y encapsular ARNm que codifican una variedad de proteínas. Entre los ejemplos no limitativos de ARNm adecuados para la presente invención se incluyen los ARNm que codifican la motoneurona espinal 1 (SMN), la alfa-galactosidasa (GLA), la argininosuccinato sintetasa (ASS1), la ornitina transcarbamilasa (OTC), el factor IX (FIX), la fenilalanina hidroxilasa (PAH), la eritropoyetina (EPO), el receptor de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR) y la luciferasa luciérnaga (FFL). A continuación se enumeran las secuencias de ejemplo de ARNm como se divulgan en el presente documento:
Formación de nanopartículas lipídicas (NPL)
También se proporciona un método para preparar una nanopartícula lipídica que encapsula un ARNm, comprendiendo dicho método (a) proporcionar una mezcla de uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares, en donde el uno o más lípidos auxiliares está compuesto por 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE), y b) formar una nanopartícula lipídica a partir de la mezcla proporcionada en la etapa a), en donde más del 70 % de las nanopartículas lipídicas en la composición tienen un tamaño que varía de 75 nm a 150 nm y el método comprende además encapsular el ARNm en la nanopartícula lipídica, en donde la encapsulación puede tener lugar antes o después de la formación de la nanopartícula lipídica en la etapa (b). La nanopartícula lipídica resultante que encapsula el ARNm es estable (p. ej., mantiene la misma encapsulación del ARNm antes y después de la congelación-descongelación, o se mantiene dentro del 10 % de la misma encapsulación del ARNm antes y después de la congelación). En una realización, el método de preparación de una nanopartícula lipídica de acuerdo con la invención excluye específicamente el uso de uno o más lípidos auxiliares seleccionados de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DLOPE), 1 -palmitoil-2-oleoil-snglicero-3-fosfoetanolamina (POPE) y combinaciones de los mismos.
Varios procesos de encapsulación se describen en la solicitud de EE. UU. publicada n.° US 2011/0244026, solicitud de EE. UU. publicada n.° US 2016/0038432, solicitud de EE. UU. publicada n.° US 2018/0153822, solicitud de EE. UU. publicada n.° US 2018/0125989 y solicitud provisional de EE. UU. n.° 62/877.597, presentada el 23 de julio de 2019 y pueden usarse para practicar la presente invención. Como se utiliza en el presente documento, el Proceso A se refiere a un método convencional de encapsular el ARNm mezclando el ARNm con una mezcla de lípidos, sin antes preformar los lípidos en nanopartículas lipídicas, como se describe en el documento US 2016/0038432. Como se utiliza en el presente documento, el Proceso B o "Remix" se refiere a un proceso de encapsulación del ARN mensajero (ARNm) mezclando nanopartículas lipídicas preformadas con ARNm, como se describe en el documento US 2018/0153822. "Step Down Remix" o "Step Up Remix" son procesos mejorados que se basan en el proceso "Remix", como se describe en la solicitud provisional de EE. UU. 63/021.319. "Step Down Remix" implica mezclar una suspensión de nanopartículas lipídicas vacías preformadas, con lotes de una solución de ARNm que se añaden secuencialmente. Cada adición de lote de solución de ARNm da como resultado una mezcla intermedia con una relación molar diferente entre lípido catiónico y ARNm ("N/P"), comenzando con una alta relación N/P, y disminuyendo hasta una relación N/P más baja en la formulación final. En "Step Up Remix", una suspensión de nanopartículas lipídicas vacías preformadas se añade en lotes a una solución de ARNm, comenzando con una relación equimolar entre lípido catiónico y ARNm. Por ejemplo, se añaden cuatro lotes de nanopartículas lipídicas vacías preformadas hasta alcanzar una relación de 4 (lípido catiónico) a 1 (ARNm).
En una realización, la DEPE está presente en la mezcla a una concentración de entre 10 por ciento molar y 50 por ciento molar. Más normalmente, la DEPE en la mezcla está presente en una concentración de entre 25 molar por ciento y 35 por ciento molar por ciento de los lípidos totales en la mezcla. En una realización, el uno o más lípidos modificados con PEG en la mezcla comprenden una cadena de poli(etilen) glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) alquilo de C<6>-C<20>de longitud. En una realización, la mezcla de uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares comprende además uno o más esteroles, como un lípido a base de colesterol. En una realización, un lípido a base de colesterol es colesterol y/o colesterol PEGilado. En algunas realizaciones, la proporción entre lípido(s) catiónico(s) y lípido(s) auxiliar(es) y lípido(s) a base de colesterol y lípido(s) modificado(s) con PEG puede estar entre aproximadamente 30-60:25-35:20-30:1-15, respectivamente.
En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas preformadas vacías se forman mezclando lípidos disueltos en etanol con una solución acuosa (solución lipídica). En algunas realizaciones, los lípidos contienen uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos no catiónicos y uno o más lípidos con PEG. En algunas realizaciones, los lípidos también contienen uno o más lípidos de colesterol. En algunas realizaciones, los lípidos están presentes en la solución madre etanólica. Las nanopartículas lipídicas preformadas se forman por la mezcla de esos lípidos. Normalmente, en algunas realizaciones, una solución lipídica que contiene lípidos disueltos, y una solución acuosa o tampón se mezclan en una solución de tal manera que los lípidos pueden formar nanopartículas sin ARNm (es decir, nanopartículas lipídicas preformadas vacías).
Solución lipídica
De acuerdo con la presente invención, una solución lipídica contiene una mezcla de lípidos adecuados para formar nanopartículas lipídicas para encapsular el ARNm. En algunas realizaciones, una solución lipídica adecuada es a base de etanol. Por ejemplo, una solución lipídica adecuada puede contener una mezcla de lípidos deseados disueltos en etanol puro (es decir, 100 % de etanol). En otra realización, una solución lipídica adecuada es a base de alcohol isopropílico. En otra realización, una solución lipídica adecuada es a base de dimetilsulfóxido. En otra realización, una solución lipídica adecuada es una mezcla de disolventes adecuados incluyendo, pero no limitado a, etanol, alcohol isopropílico y dimetilsulfóxido.
Una solución lipídica adecuada puede contener una mezcla de lípidos deseados en diversas concentraciones. Por ejemplo, una solución lipídica adecuada puede contener una mezcla de lípidos deseados a una concentración total de aproximadamente 0,01 mg/ml, 0,02 mg/ml, 0,03 mg/ml, 0,04mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,06 mg/ml, 0,07 mg/ml, 0,08 mg/ml, 0,09 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1,0 mg/ml, 2,0 mg/ml, 3,0 mg/ml, 4,0 mg/ml, 5,0 mg/ml, 6,0 mg/ml, 7,0 mg/ml, 8,0 mg/ml, 9,0 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, o 100 mg/ml. En algunas realizaciones, una solución lipídica adecuada puede contener una mezcla de lípidos deseados a una concentración total que varía de aproximadamente 0,1-100 mg/ml, 0,5-90 mg/ml, 1,0-80 mg/ml, 1,0-70 mg/ml, 1,0-60 mg/ml, 1,0-50 mg/ml, 1,0-40 mg/ml, 1,0-30 mg/ml, 1,0-20 mg/ml, 1,0-15 mg/ml, 1,0-10 mg/ml, 1,0-9 mg/ml, 1,0-8 mg/ml, 1,0-7 mg/ml, 1,0-6 mg/ml, o 1,0-5 mg/ml. En algunas realizaciones, una solución lipídica adecuada puede contener una mezcla de lípidos deseados a una concentración total de aproximadamente 100 mg/ml, 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/ml, 60 mg/ml, 50 mg/ml, 40 mg/ml, 30 mg/ml, 20 mg/ml o 10 mg/ml.
Los lípidos deseados se pueden mezclar en cualquier proporción adecuada para encapsular ARNm. Una solución lipídica adecuada contiene una mezcla de lípidos deseados que incluyen uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos auxiliares (p. ej., lípidos no catiónicos y/o lípidos de colesterol) y uno o más lípidos pegilados, en donde uno o más lípidos auxiliares comprenden 1,2-Dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE).
En algunas realizaciones, una formulación vacía (es decir, ausencia de ARNm) de nanopartículas lipídicas preformadas utilizada en la fabricación de la formulación de nanopartículas lipídicas de la invención se puede congelar de manera estable en aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20%, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, o aproximadamente 50 % de solución de trehalosa. En algunas realizaciones, la adición de ARNm a nanopartículas lipídicas vacías puede dar como resultado una formulación final que no requiere ninguna purificación o procesamiento posterior y puede ser almacenada de forma estable en forma congelada.
Formación de NPL-ARNm
Como se utiliza en el presente documento, un proceso para la formación de nanopartículas lipídicas cargadas de ARNm (NPL-ARNm) se utiliza indistintamente con la expresión ''encapsulación de ARNm" o variantes gramaticales de la misma. En algunas realizaciones, las NPL-ARNm se forman mezclando una solución de ARNm con una solución lipídica, en donde la solución de ARNm y/o la solución lipídica se calientan a una temperatura predeterminada superior a la temperatura ambiente antes de la mezcla (véase la solicitud de patente de EE. UU. n.° de serie 14/790.562 titulada "Encapsulation of messenger RNA", presentada el 2 de julio de 2015 y su solicitud provisional de patente de EE. UU. n.° de serie 62/020.163, presentada el 2 de julio de 2014).
Normalmente, los lípidos deseados se pueden mezclar en cualquier proporción adecuada para la formación de las NPL-ARNm. Una solución lipídica adecuada contiene una mezcla de lípidos deseados que incluyen uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos auxiliares (p. ej., lípidos no catiónicos y/o lípidos de colesterol) y uno o más lípidos pegilados, en donde uno o más lípidos auxiliares comprenden 1,2-Dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE).
En algunas realizaciones, una solución de ARNm y una solución preformada de la nanopartícula lipídica se mezclan en una solución tal que el ARNm se encapsula en la nanopartícula lipídica. Tal solución también se conoce como una solución de formulación o encapsulación. Un proceso para encapsular ARNm mezclando nanopartículas lipídicas preformadas con ARNm ha sido descrito anteriormente en una invención anterior presentada como PCT/US17/61113 el 11-10-2017, publicada como WO2018/089801; y al mismo tiempo se presentó la solicitud de patente de EE. UU. n.° de serie 15/809.68, ambas tituladas "Improved Process of Preparing mRNA-Loaded Lipid Nanoparticles".
Una formulación o solución de encapsulación adecuada incluye un disolvente como el etanol. Por ejemplo, una formulación o solución de encapsulación adecuada incluye aproximadamente 10 % de etanol, aproximadamente 15 % de etanol, aproximadamente 20 % de etanol, aproximadamente 25 % de etanol, aproximadamente 30 % de etanol, aproximadamente 35 % de etanol, o aproximadamente 40 % de etanol. En algunas realizaciones, una formulación o solución de encapsulación adecuada incluye un disolvente como el alcohol isopropílico. Por ejemplo, una formulación o solución de encapsulación adecuada incluye aproximadamente 10 % de alcohol isopropílico, aproximadamente 15 % de alcohol isopropílico, aproximadamente 20 % de alcohol isopropílico, aproximadamente 25 % de alcohol isopropílico, aproximadamente 30 % de alcohol isopropílico, aproximadamente 35 % de alcohol isopropílico o aproximadamente 40 % de alcohol isopropílico.
En algunas realizaciones, una formulación adecuada o solución de encapsulación incluye un disolvente como dimetil sulfóxido. Por ejemplo, una formulación o solución de encapsulación adecuada incluye aproximadamente 10 % de sulfóxido de dimetilo, aproximadamente 15 % de sulfóxido de dimetilo, aproximadamente 20 % de sulfóxido de dimetilo, aproximadamente 25 % de sulfóxido de dimetilo, aproximadamente 30 % de sulfóxido de dimetilo, aproximadamente 35 % de sulfóxido de dimetilo, o aproximadamente 40 % de sulfóxido de dimetilo.
En algunas realizaciones, una formulación adecuada o solución de encapsulación también puede contener un agente tampón o sal. Un agente tampón de ejemplo puede incluir HEPES, sulfato de amonio, bicarbonato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio, fosfato de potasio y fosfato de sodio. La sal de ejemplo puede incluir cloruro de sodio, cloruro de magnesio y cloruro de potasio. En algunas realizaciones, una formulación vacía de nanopartículas lipídicas preformadas utilizada en la fabricación de esta nueva formulación de nanopartículas se puede congelar de manera estable en solución de trehalosa al 10 %.
En algunas realizaciones, etanol, tampón de citrato y otros agentes desestabilizantes están ausentes durante la adición de ARNm y, por lo tanto, la formulación no requiere ningún procesamiento posterior. En algunas realizaciones, la formulación de nanopartículas lipídicas preparada por este nuevo proceso comprende nanopartículas lipídicas preformadas en solución de trehalosa. La falta de agentes desestabilizadores y la estabilidad de la solución trehalosa aumentan la facilidad de escalar la formulación y la producción de nanopartículas lipídicas encapsuladas del ARNm.
Solución de ARNm
El ARNm puede suministrarse en una solución para mezclarse con una solución lipídica de modo que el ARNm pueda encapsularse en nanopartículas lipídicas. Una solución adecuada de ARNm puede ser cualquier solución acuosa que contenga ARNm que se encapsule en diversas concentraciones inferiores a 1 mg/ml. Por ejemplo, una solución adecuada de ARNm puede contener un ARNm en una concentración de aproximadamente 0,01 mg/ml, 0,02 mg/ml, 0,03 mg/ml, 0,04 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,06 mg/ml, 0,07 mg/ml, 0,08 mg/ml, 0,09 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,15 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml o 1,0 mg/ml.
Normalmente, una solución de ARNm adecuada también puede contener un agente tampón y/o sal. Generalmente, los agentes tampón pueden incluir HEPES, sulfato de amonio, bicarbonato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio, fosfato de potasio y fosfato de sodio. En algunas realizaciones, la concentración adecuada del agente tampón puede variar de aproximadamente 0,1 mm a 100 mm, de 0,5 mm a 90 mm, de 1,0 mm a 80 mm, de 2 mm a 70 mm, de 3 mm a 60 mm, de 4 mm a 50 mm, de 5 mm a 40 mm, de 6 mm a 30 mm, de 7 mm a 20 mm, de 8 mm a 15 mm, o de 9 a 12 mm. En algunas realizaciones, la concentración adecuada del agente tampón es o superior a aproximadamente 0,1 mm, 0,5 mm, 1 mm, 2 mm, 4 mm, 6 mm, 8 mm, 10 mm, 15 mm, 20 mm, 25 mm, 30 mm, 35 mm, 40 mm, 45 mm, 0 50 mm.
Las sales de ejemplo pueden incluir cloruro de sodio, cloruro de magnesio y cloruro de potasio. En algunas realizaciones, la concentración adecuada de sales en una solución de ARNm puede variar de aproximadamente 1 mm a 500 mm, de 5 mm a 400 mm, de 10 mm a 350 mm, de 15 mm a 300 mm, de 20 mm a 250 mm, de 30 mm a 200 mm, de 40 mm a 190 mm, de 50 mm a 180 mm, de 50 mm a 170 mm, de 50 mm a 160 mm, de 50 mm a 150 mm, o de 50 mm a 100 mm. La concentración de sal en una solución adecuada de ARNm es o superior a aproximadamente 1 mm, 5 mm, 10 mm, 20 mm, 30 mm, 40 mm, 50 mm, 60 mm, 70 mm, 80 mm, 90 mm, o 100 mm.
En algunas realizaciones, una solución adecuada de ARNm puede tener un pH que varía de aproximadamente 3,5 6,5, 3,5-6,0, 3,5-5,5, 3,5-5,0, 3,5-4,5, 4,0-5,5, 4,0-5,0, 4,0-4,9, 4,0-4,8, 4,0-4,7, 4,0-4,6, o 4,0-4,5. En algunas realizaciones, una solución adecuada de ARNm puede tener un pH de o no superior a aproximadamente 3,5, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,1,6,3 y 6,5.
Se pueden utilizar varios métodos para preparar una solución de ARNm adecuada para la presente invención. En algunas realizaciones, el ARNm puede ser disuelto directamente en una solución tampón descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, se puede generar una solución de ARNm mezclando una solución madre de ARNm con una solución de tampón antes de mezclar con una solución lipídica para encapsulación. En algunas realizaciones, se puede generar una solución de ARNm mezclando una solución madre de ARNm con una solución de tampón inmediatamente antes de mezclar con una solución lipídica para encapsulación. En algunas realizaciones, una solución madre de ARNm adecuada puede contener ARNm en agua a una concentración igual o superior a 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml, 1,5 mg/ml o 1,6 mg/ml, 2,0 mg/ml, 2,5 mg/ml, 3,0 mg/ml, 3,5 mg/ml, 4,0 mg/ml, 4,5 mg/ml o 5,0 mg/ml.
En algunas realizaciones, una solución madre de ARNm se mezcla con una solución de tampón utilizando una bomba. Las bombas de ejemplo incluyen pero no se limitan a las bombas de engranajes, bombas peristálticas y bombas centrífugas.
Normalmente, la solución de tampón se mezcla a una velocidad mayor que la de la solución madre de ARNm. Por ejemplo, la solución de tampón se puede mezclar a una velocidad de al menos 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, o 20x mayor que la tasa de la solución madre de ARNm. En algunas realizaciones, un proceso de acuerdo con la presente invención incluye una etapa de generar primero una solución de ARNm mediante la mezcla de un tampón de citrato con una solución madre de ARNm. En ciertas realizaciones, un tampón de citrato adecuado contiene aproximadamente 10 mm de citrato, aproximadamente 150 mm de NaCl, pH de aproximadamente 4,5. En algunas realizaciones, una solución madre adecuada de ARNm contiene el ARNm en una concentración igual o superior a aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, o aproximadamente 100 mg/ml.
En algunas realizaciones, el tampón de citrato se mezcla a una velocidad de flujo que oscila entre aproximadamente 100-300 ml/minuto, 300-600 ml/minuto, 600-1200 ml/minuto, 1200-2400 ml/minuto, 2400-3600 ml/minuto, 3600-4800 ml/minuto, o 4800-6000 ml/minuto. En algunas realizaciones, el tampón de citrato se mezcla a una velocidad de flujo de aproximadamente 220 ml/minuto, aproximadamente 600 ml/minuto, aproximadamente 1200 ml/minuto, aproximadamente 2400 ml/minuto, aproximadamente 3600 ml/minuto, aproximadamente 4800 ml/minuto, o aproximadamente 6000 ml/minuto.
En algunas realizaciones, la solución madre de ARNm se mezcla a una velocidad de flujo que varía entre aproximadamente 10-30 ml/minuto, aproximadamente 30-60 ml/minuto, aproximadamente 60-120 ml/minuto, aproximadamente 120-240 ml/minuto, aproximadamente 240-360 ml/minuto, aproximadamente 360-480 ml/minuto, o aproximadamente 480-600 ml/minuto. En algunas realizaciones, la solución madre de ARNm se mezcla a una velocidad de flujo de aproximadamente 20 ml/minuto, aproximadamente 40 ml/minuto, aproximadamente 60 ml/minuto, aproximadamente 80 ml/minuto, aproximadamente 100 ml/minuto, aproximadamente 200 ml/minuto, aproximadamente 300 ml/minuto, aproximadamente 400 ml/minuto, aproximadamente 500 ml/minuto, o aproximadamente 600 ml/minuto.
En algunas realizaciones, una solución tampón se mezcla a una velocidad de flujo que varía entre aproximadamente 100-6000 ml/minuto (p. ej., aproximadamente 100-300 ml/minuto, 300-600 ml/minuto, 600-1200 ml/minuto, 1200-2400 ml/minuto, 2400-3600 ml/minuto, 3600-4800 ml/minuto, 4800-6000 ml/minuto o 60-420 ml/minuto). En algunas realizaciones, una solución tampón se mezcla a una velocidad de flujo de aproximadamente 60 ml/minuto, 100 ml/minuto, 140 ml/minuto, 180 ml/minuto, 220 ml/minuto, 260 ml/minuto, 300 ml/minuto, 340 ml/minuto, 380 ml/minuto, 420 ml/minuto, 480 ml/minuto, 540 ml/minuto, 600 ml/minuto, 1200 ml/minuto, 2400 ml/minuto, 3600 ml/minuto, 4800 ml/minuto, o 6000 ml/minuto.
En algunas realizaciones, una solución madre de ARNm se mezcla a una velocidad de flujo que varía entre aproximadamente 10-600 ml/minuto (p. ej., aproximadamente 5-50 ml/minuto, aproximadamente 10-30 ml/minuto, aproximadamente 30-60 ml/minuto, aproximadamente 60-120 ml/minuto, aproximadamente 120-240 ml/minuto, aproximadamente 240-360 ml/minuto, aproximadamente 360-480 ml/minuto, o aproximadamente 480-600 ml/minuto). En algunas realizaciones, una solución madre de ARNm se mezcla a una velocidad de flujo de aproximadamente 5 ml/minuto, 10 ml/minuto, 15 ml/minuto, 20 ml/minuto, 25 ml/minuto, 30 ml/minuto, 35 ml/minuto, 40 ml/minuto, 45 ml/minuto, 50 ml/minuto, 60 ml/minuto, 80 ml/minuto, 100 ml/minuto, 200 ml/minuto, 300 ml/minuto, 400 ml/minuto, 500 ml/minuto, o 600 ml/minuto.
En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas preformadas y el ARNm se mezclan usando un sistema de bomba. En algunas realizaciones, el sistema de bomba comprende una bomba de flujo sin pulsos. En algunas realizaciones, el sistema de bomba es una bomba de engranajes. En algunas realizaciones, una bomba adecuada es una bomba peristáltica. En algunas realizaciones, una bomba adecuada es una bomba centrífuga. En algunas realizaciones, el proceso que utiliza un sistema de bomba se realiza a gran escala. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el proceso incluye el uso de bombas como se describe en el presente documento para mezclar una solución de al menos aproximadamente 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 500 mg, o 1000 mg de ARNm con una solución de nanopartículas lipídicas preformadas, para producir ARNm encapsulado en nanopartículas lipídicas. En algunas realizaciones, el proceso de mezcla de ARNm con nanopartículas lipídicas preformadas proporciona una composición de acuerdo con la presente invención que contiene al menos aproximadamente 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 500 mg o 1000 mg de ARNm encapsulado.
En algunas realizaciones, la solución que comprende nanopartículas lipídicas preformadas se mezcla en un flujo que varía de aproximadamente 25-75 ml/minuto, aproximadamente 75-200 ml/minuto, aproximadamente 200-350 ml/minuto, aproximadamente 350-500 ml/minuto, aproximadamente 500-650 ml/minuto, aproximadamente 650-850 ml/minuto, o aproximadamente 850-1000 ml/minuto. En algunas realizaciones, la solución que comprende nanopartículas lipídicas preformadas se mezcla a una velocidad de flujo de aproximadamente 50 ml/minuto, aproximadamente 100 ml/minuto, aproximadamente 150 ml/minuto, aproximadamente 200 ml/minuto, aproximadamente 250 ml/minuto, aproximadamente 300 ml/minuto, aproximadamente 350 ml/minuto, aproximadamente 400 ml/minuto, aproximadamente 450 ml/minuto, aproximadamente 500 ml/minuto, aproximadamente 550 ml/minuto, aproximadamente 600 ml/minuto, aproximadamente 650 ml/minuto, aproximadamente 700 ml/minuto, aproximadamente 750 ml/minuto, aproximadamente 800 ml/minuto, aproximadamente 850 ml/minuto, aproximadamente 900 ml/minuto, aproximadamente 950 ml/minuto, o aproximadamente 1000 ml/minuto.
En algunas realizaciones, el ARNm se mezcla en una solución a un flujo que varía de aproximadamente 25-75 ml/minuto, aproximadamente 75-200 ml/minuto, aproximadamente 200-350 ml/minuto, aproximadamente 350-500 ml/minuto, aproximadamente 500-650 ml/minuto, aproximadamente 650-850 ml/minuto, o aproximadamente 850-1000 ml/minuto. En algunas realizaciones, el ARNm se mezcla en una solución a una velocidad de flujo de aproximadamente 50 ml/minuto, aproximadamente 100 ml/minuto, aproximadamente 150 ml/minuto, aproximadamente 200 ml/minuto, aproximadamente 250 ml/minuto, aproximadamente 300 ml/minuto, aproximadamente 350 ml/minuto, aproximadamente 400 ml/minuto, aproximadamente 450 ml/minuto, aproximadamente 500 ml/minuto, aproximadamente 550 ml/minuto, aproximadamente 600 ml/minuto, aproximadamente 650 ml/minuto, aproximadamente 700 ml/minuto, aproximadamente 750 ml/minuto, aproximadamente 800 ml/minuto, aproximadamente 850 ml/minuto, aproximadamente 900 ml/minuto, aproximadamente 950 ml/minuto, o aproximadamente 1000 ml/minuto.
En algunas realizaciones, se realiza una etapa de combinación de nanopartículas lipídicas encapsulando ARNm con partículas lipídicas preformadas usando un sistema de bomba. Dicha combinación puede realizarse utilizando una bomba. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas encapsuladas de ARNm se mezclan con nanopartículas lipídicas preformadas a una velocidad de flujo que varía de aproximadamente 25-75 ml/minuto, aproximadamente 75 200 ml/minuto, aproximadamente 200-350 ml/minuto, aproximadamente 350-500 ml/minuto, aproximadamente 500 650 ml/minuto, aproximadamente 650-850 ml/minuto, o aproximadamente 850-1000 ml/minuto. En algunas realizaciones, el ARNm se mezcla en una solución a una velocidad de flujo de aproximadamente 50 ml/minuto, aproximadamente 100 ml/minuto, aproximadamente 150 ml/minuto, aproximadamente 200 ml/minuto, aproximadamente 250 ml/minuto, aproximadamente 300 ml/minuto, aproximadamente 350 ml/minuto, aproximadamente 400 ml/minuto, aproximadamente 450 ml/minuto, aproximadamente 500 ml/minuto, aproximadamente 550 ml/minuto, aproximadamente 600 ml/minuto, aproximadamente 650 ml/minuto, aproximadamente 700 ml/minuto, aproximadamente 750 ml/minuto, aproximadamente 800 ml/minuto, aproximadamente 850 ml/minuto, aproximadamente 900 ml/minuto, aproximadamente 950 ml/minuto, o aproximadamente 1000 ml/minuto.
En algunas realizaciones, la mezcla de nanopartículas lipídicas y ARNm se realiza en ausencia de cualquier bomba.
En algunas realizaciones, el proceso de acuerdo con la presente invención incluye una etapa de calentamiento de una o más de las soluciones (es decir, aplicar calor de una fuente de calor a la solución) a una temperatura (o mantener a una temperatura) mayor que la temperatura ambiente, siendo la una o más soluciones la solución que comprende las nanopartículas lipídicas preformadas, la solución que comprende ARNm y la solución mezclada que comprende ARNm encapsulado en la nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, el proceso incluye la etapa de calentar una o ambas de la solución de ARNm y la solución preformada de nanopartícula lipídica, antes de la etapa de mezcla. En algunas realizaciones, el proceso incluye el calentamiento de una o más de las soluciones que comprenden las nanopartículas lipídicas preformadas, la solución que comprende el ARNm y la solución que comprende el ARNm encapsulado en la nanopartícula lipídica, durante la etapa de mezcla. En algunas realizaciones, el proceso incluye la etapa de calentar el ARNm encapsulado en la nanopartícula lipídica después de la etapa de mezcla. En algunas realizaciones, la temperatura a la que se calienta una o varias de las soluciones (o a la que se mantiene una o más de las soluciones) es o es superior a aproximadamente 30 °C, 37 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C o 70 °C. En algunas realizaciones, la temperatura a la que se calienta una o más de las soluciones varía de aproximadamente 25-70 °C, aproximadamente 30-70 °C, aproximadamente 35-70 °C, aproximadamente 40-70 °C, aproximadamente 45-70 °C, aproximadamente 50-70 °C, o aproximadamente 60-70 °C. En algunas realizaciones, la temperatura superior a la temperatura ambiente a la que se calienta una o más de las soluciones es de aproximadamente 65 °C.
En algunas realizaciones, el proceso de acuerdo con la presente invención incluye mantener a temperatura ambiente (es decir, no aplicar calor de una fuente de calor a la solución) una o más de las soluciones que comprenden las nanopartículas lipídicas preformadas, la solución que comprende el ARNm y la solución mezclada que comprende el ARNm encapsulado en la nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, el proceso incluye la etapa de mantener a temperatura ambiente una o ambas de la solución de ARNm y la solución preformada de la nanopartícula lipídica, antes de la etapa de mezcla. En algunas realizaciones, el proceso incluye mantener a temperatura ambiente una o más de las soluciones que comprenden las nanopartículas lipídicas preformadas, la solución que comprende el ARNm y la solución que comprende ARNm encapsulado en la nanopartícula lipídica, durante la etapa de mezcla. En algunas realizaciones, el proceso incluye la etapa de mantener el ARNm encapsulado en la nanopartícula lipídica a temperatura ambiente después de la etapa de mezcla. En algunas realizaciones, la temperatura ambiente a la que se mantiene una o más de las soluciones es o es inferior a aproximadamente 35 °C, 30 °C, 25 °C, 20 °C o 16 °C. En algunas realizaciones, la temperatura ambiente a la que se mantiene una o más de las soluciones varía de aproximadamente 15-35 °C, aproximadamente 15-30 °C, aproximadamente 15-25 °C, aproximadamente 15-20 °C, aproximadamente 20-35 °C, aproximadamente 25-35 °C, aproximadamente 30-35 °C, aproximadamente 20-30 °C, aproximadamente 25-30 °C o aproximadamente 20-25 °C. En algunas realizaciones, la temperatura ambiente a la que se mantiene una o más de las soluciones es de 20-25 °C.
En algunas realizaciones, el proceso de acuerdo con la presente invención incluye realizar a temperatura ambiente la etapa de mezclar la solución que comprende nanopartículas lipídicas preformadas y la solución que comprende ARNm para formar nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm.
De acuerdo con la presente invención, más del 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de las nanopartículas lipídicas purificadas tienen un tamaño inferior a 150 nm (p. ej., menos de aproximadamente 145 nm, aproximadamente 140 nm, aproximadamente 135 nm, aproximadamente 130 nm, aproximadamente 125 nm, aproximadamente 120 nm, aproximadamente 115 nm, aproximadamente 110 nm, aproximadamente 105 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 95 nm, aproximadamente 90 nm, aproximadamente 85 nm, o aproximadamente 80 nm). De acuerdo con la presente invención, sustancialmente todas las nanopartículas lipídicas purificadas tienen un tamaño inferior a 150 nm (p. ej., menos de aproximadamente 145 nm, aproximadamente 140 nm, aproximadamente 135 nm, aproximadamente 130 nm, aproximadamente 125 nm, aproximadamente 120 nm, aproximadamente 115 nm, aproximadamente 110 nm, aproximadamente 105 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 95 nm, aproximadamente 90 nm, aproximadamente 85 nm, aproximadamente 80 nm). De acuerdo con la presente invención, más del 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de las nanopartículas lipídicas purificadas tienen un tamaño que varía de 75-150 nm. De acuerdo con la presente invención, sustancialmente todas las nanopartículas lipídicas purificadas tienen un tamaño que varía de 75-150 nm. En algunas realizaciones, más del 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de las nanopartículas lipídicas purificadas tienen un tamaño que varía de 80-150 nm. En algunas realizaciones, sustancialmente todas las nanopartículas lipídicas purificadas tienen un tamaño que varía de 80-150 nm.
En algunas realizaciones, un proceso de acuerdo con la presente invención da como resultado una tasa de encapsulación superior a aproximadamente 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %. En algunas realizaciones, un proceso de acuerdo con la presente invención da como resultado más del 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de recuperación del ARNm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 20:1, 10:1 ,9 :1,8:1 ,7 :1 ,6:1,5 :1 ,4:1,3 :1 ,2 :1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, o 1:20. El proceso de combinación de las nanopartículas lipídicas es como se ha descrito anteriormente para mezclar nanopartículas lipídicas con ARNm. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 20:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 19:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 15:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 10:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 9:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 8:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 7:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 6:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 5:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 4:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 3:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 2:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:1. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:2. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:3. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:4. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:5. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:6. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:7. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:8. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:9. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:10. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:12. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:15. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm se combinan con las partículas lipídicas preformadas en la etapa (b) del proceso en una proporción de 1:20.
Purificación
En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas preformadas vacías o NPL-ARNm se purifican y/o concentran. Se pueden utilizar varios métodos de purificación. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas son purificadas por un proceso de filtración de flujo tangencial (FFT). En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas se purifican mediante filtración de flujo normal basada en la gravedad (NFF). En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas se purifican por cualquier otro proceso de filtración adecuado. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas se purifican por centrifugación. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas se purifican por métodos cromatográficos.
Formulación farmacéutica y usos terapéuticos
La composición que comprende NPL-ARNm puede formularse en un tampón deseado como, por ejemplo, PBS.
Un proceso de acuerdo con la presente invención da como resultado una composición de NPL-ARNm de mayor potencia y eficacia, permitiendo así dosis más bajas, desplazando así el índice terapéutico en una dirección positiva. En algunas realizaciones, el proceso de acuerdo con la presente invención da como resultado NPL-ARNm homogéneas que tienen tamaños de partícula pequeños (p. ej., menos de 150 nm).
Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición que comprende NPL-ARNm descritas en el presente documento. La mayoría de las nanopartículas lipídicas purificadas en una composición, es decir, más del 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de las nanopartículas lipídicas purificadas, tienen un tamaño de menos de 150 nm (p. ej., aproximadamente 145 nm, aproximadamente 140 nm, aproximadamente 135 nm, aproximadamente 130 nm, aproximadamente 125 nm, aproximadamente 120 nm, aproximadamente 115 nm, aproximadamente 110 nm, aproximadamente 105 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 95 nm, aproximadamente 90 nm, aproximadamente 85 nm, o aproximadamente 80 nm). De acuerdo con la presente invención, sustancialmente todas las NPL-ARNm tienen un tamaño de menos de 150 nm (p. ej., aproximadamente 145 nm, aproximadamente 140 nm, aproximadamente 135 nm, aproximadamente 130 nm, aproximadamente 125 nm, aproximadamente 120 nm, aproximadamente 115 nm, aproximadamente 110 nm, aproximadamente 105 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 95 nm, aproximadamente 90 nm, aproximadamente 85 nm, o aproximadamente 80 nm). Las nanopartículas lipídicas que tienen un tamaño inferior a 100 nm son particularmente adecuadas porque pueden penetrar a través de la fenestración del hígado y acceder a los hepatocitos. Del mismo modo, las nanopartículas lipídicas que tienen un tamaño de aproximadamente 100 nm o menos se nebulizan fácilmente y pueden penetrar profundamente en el pulmón cuando se administran a un sujeto usando nebulización.
Además, mediante un proceso de la presente invención se consiguen nanopartículas lipídicas más homogéneas con un intervalo estrecho del tamaño de partícula. Por ejemplo, más del 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de las nanopartículas lipídicas en una composición proporcionada por la presente invención tienen un tamaño que varía de aproximadamente 75-150 nm (p. ej., aproximadamente 75-145 nm, aproximadamente 75-140 nm, aproximadamente 75-135 nm, aproximadamente 75-130 nm, aproximadamente 75-125 nm, aproximadamente 75 120 nm, aproximadamente 75-115 nm, aproximadamente 75-110 nm, aproximadamente 75-105 nm, aproximadamente 75-100 nm, aproximadamente 75-95 nm, aproximadamente 75-90 nm, o 75-85 nm). De acuerdo con la presente invención, sustancialmente todas las nanopartículas lipídicas purificadas tienen un tamaño que varía de aproximadamente 75-150 nm (p. ej., aproximadamente 75-145 nm, aproximadamente 75-140 nm, aproximadamente 75-135 nm, aproximadamente 75-130 nm, aproximadamente 75-125 nm, aproximadamente 75-120 nm, aproximadamente 75-115 nm, aproximadamente 75-110 nm, aproximadamente 75-105 nm, aproximadamente 75-100 nm, aproximadamente 75-95 nm, aproximadamente 75-90 nm, o 75-85 nm).
En algunas realizaciones, la dispersión, o medida de la heterogeneidad en el tamaño de las moléculas (IPD), de nanopartículas lipídicas en una composición proporcionada por la presente invención es inferior a aproximadamente 0,23 (p. ej., inferior a aproximadamente, 0,23, 0,22, 0,21,0,20, 0,19, 0,18, 0,17, 0,16, 0,15, 0,14, 0,13, 0,12, 0,11,0,10, 0,09, o 0,08). En una realización particular, el IPD es inferior a aproximadamente 0,16.
En algunas realizaciones, una composición de acuerdo con la presente invención contiene al menos aproximadamente 1 mg, 5 mg, 10 mg, 100 mg, 500 mg, o 1000 mg de ARNm encapsulado. En algunas realizaciones, un proceso de acuerdo con la presente invención da como resultado más del 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de recuperación del ARNm.
En algunas realizaciones, el ARNm en la composición de la invención conserva una integridad superior al 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. En algunas realizaciones el ARNm tiene una integridad del 100 %.
En algunas realizaciones, una composición de acuerdo con la presente invención se formula para administrar dosis específicas de la composición a un sujeto. En algunas realizaciones, una composición de nanopartículas lipídicas de ARNm tal como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis de aproximadamente 5 mg/kg de ARNm o menos de 5 mg/kg de ARNm (es decir, menos de 4 mg/kg de ARNm, menos de 3 mg/kg, menos de 2 mg/kg, 1,0 mg/kg 0,6 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,016 mg/kg. 0,05 mg/kg y 0,016 mg/kg de ARNm). En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis inferior a 4 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis inferior a 3 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis inferior a 2 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis inferior a 1 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis inferior a 0,6 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis inferior a 0,5 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis inferior a 0,3 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis inferior a 0,2 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis inferior a 0,1 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis inferior a 0,0,08 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis inferior a 0,06 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula en una concentración de dosis inferior a 0. 0,05 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas lipídicas de ARNm como se describe en el presente documento se formula a una concentración de dosis inferior a 0,01 mg/kg de nanopartículas lipídicas de ARNm.
En ciertas realizaciones, la cantidad de ARNm requerida para efectuar un efecto terapéutico se reduce por lo menos en un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %. En ciertas realizaciones, la cantidad de un polinucleótido requerido para efectuar un efecto terapéutico se reduce por lo menos en dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, doce, quince, veinticinco veces o más.
En consecuencia, en ciertas realizaciones la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración a o el tratamiento de un sujeto humano. En algunas realizaciones, la composición terapéutica que comprende el ARNm purificado se utiliza para la administración en el pulmón de un sujeto o una célula pulmonar. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína endógena que puede ser deficiente o no funcional en un sujeto. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína endógena que puede ser deficiente o no funcional en un sujeto.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración a o el tratamiento del pulmón de un sujeto o una célula pulmonar. En ciertas realizaciones la presente invención es útil en un método para la producción de ARNm que codifica el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística, CFTR. El ARNm del CFTR se administra al pulmón de un sujeto necesitado en una composición terapéutica para el tratamiento de la fibrosis quística.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración a o tratamiento del hígado de un sujeto o una célula hepática. Dichos péptidos y polipéptidos de este tipo pueden incluir los asociados con un trastorno del ciclo de la urea, los asociados con un trastorno de almacenamiento lisosomal, con un trastorno de almacenamiento de glucógeno, los asociados con un trastorno del metabolismo de aminoácidos, los asociados con un metabolismo de lípidos o trastorno fibrótico, los asociados con acidemia metilmalónica o los asociados con cualquier otro trastorno metabólico para el cual la administración a o el tratamiento del hígado o de una célula hepática con ARNm de longitud completa enriquecido proporciona un beneficio terapéutico.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína asociada con un trastorno del ciclo de la urea. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína ornitina transcarbamilasa (OTC). En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína arginosuccinato sintetasa 1. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína carbamoil fosfato sintetasa I. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína arginosuccinato liasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína arginasa.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína asociada con un trastorno de almacenamiento lisosomal. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína alfa galactosidasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína glucocerebrosidasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína iduronato-2-sulfatasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína iduronidasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína N-acetilalfa-D-glucosaminidasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína heparán N-sulfatasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína galactosamina-6 sulfatasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína beta-galactosidasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína lisosomal lipasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína arilsulfatasa B (N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa). En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica el factor de transcripción EB (TFEB).
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína asociada con un trastorno de almacenamiento de glucógeno. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína alfa-glucosidasa ácida. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína glucosa-6-fosfatasa (G6PC). En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína glucógeno fosforilasa hepática. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína fosfoglicerato mutasa muscular. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la enzima desramificadora del glucógeno.
En ciertas realizaciones la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína asociada con el metabolismo de aminoácidos. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la enzima fenilalanina hidroxilasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la enzima glutaril-CoA deshidrogenasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la enzima propionil-CoA caboxilasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la enzima alanina-glioxilato aminotransferasa oxalasa.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína asociada con un metabolismo lipídico o trastorno fibrótico. En ciertas realizaciones la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un inhibidor de mTOR. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína ATPasa transportadora de fosfolípidos 8B1 (ATP8B1). En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica uno o más inhibidores de NF-kappa B, tal como uno o más de I-kappa B alfa, regulador del desarrollo relacionado con el interferón 1 (IFRD1) y sirtuina 1 (SIRT1). En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína PPAR-gamma o una variante activa.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína asociada con la acidemia metilmalónica. Por ejemplo, en ciertas realizaciones la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína metil malonil CoA mutasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína metilmalonil CoA epimerasa.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado para el cual la administración a o el tratamiento del hígado puede proporcionar beneficios terapéuticos. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína ATP7B, también conocida como proteína de la enfermedad de Wilson. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la enzima porfobilinógeno desaminasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una o enzimas de coagulación, como el factor VIII, el factor IX, el factor VII y el factor X. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína de la hemocromatosis humana (HFE).
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración a o tratamiento de las afecciones cardiovasculares de un sujeto o una célula cardiovascular. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína A del factor de crecimiento endotelial vascular. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína relaxina. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína morfogenética ósea-9. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína receptor proteína morfogenética ósea 2.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración a o el tratamiento del músculo de un sujeto o una célula muscular. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína distrofina. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína frataxina. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración a o tratamiento del músculo cardíaco de un sujeto o una célula muscular cardíaca. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína que modula uno o ambos de un canal de potasio y un canal de sodio en el tejido muscular o en una célula muscular. En ciertas realizaciones la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína que modula un canal Kv7.1 en el tejido muscular o en una célula muscular. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína que modula un canal Nav1.5 en el tejido muscular o en una célula muscular.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración a o tratamiento del sistema nervioso de un sujeto o una célula del sistema nervioso. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína de supervivencia de la motoneurona 1. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína de supervivencia de la motoneurona 2. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína frataxina. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína miembro D de la subfamilia de casete de unión a ATP 1 (ABCD1). En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína CLN3.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración a o el tratamiento de la sangre o la médula ósea de un sujeto o una célula sanguínea o la médula ósea. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína beta globina. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína tirosina cinasa de Bruton. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una o enzimas de coagulación, como el factor VIII, el factor IX, el factor VII y el factor X.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración a o el tratamiento del riñón de un sujeto o una célula renal. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína de la cadena alfa 5 del colágeno tipo IV (COL4A5).
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración a o el tratamiento del ojo de un sujeto o una célula ocular. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína del miembro 4 de la subfamilia A de casete de unión a ATP (ABCA4). En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína retinosquisina. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína de 65 kDa específica del epitelio pigmentario retiniano (RPE65). En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la proteína centrosomal de 290 kDa (CEP290).
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración a, o el tratamiento con una vacuna para, un sujeto o una célula de un sujeto. Por ejemplo, en ciertas realizaciones la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno de un agente infeccioso, como un virus. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno del virus de la gripe. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno del virus sincitial respiratorio. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno del virus de la rabia. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno del citomegalovirus. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno del rotavirus. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno de un virus de la hepatitis, como el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis B o el virus de la hepatitis C. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno del virus del papiloma humano. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno de un virus herpes simple, como el virus herpes simple 1 o el virus herpes simple 2. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno de un virus de inmunodeficiencia humana, como el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 o el virus de inmunodeficiencia humana tipo 2. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno de un metapneumovirus humano. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno de un virus de la parainfluenza humana, como el virus de la parainfluenza humana tipo 1, el virus de la parainfluenza humana tipo 2 o el virus de la parainfluenza humana tipo 3. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno del virus de la malaria. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno del virus del Zika. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno del virus de Chikungunya.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno asociado con un cáncer de un sujeto o identificado a partir de una célula cancerosa de un sujeto. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno determinado a partir de la propia célula cancerosa de un sujeto, es decir, para proporcionar una vacuna personalizada contra el cáncer. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un antígeno expresado a partir de un gen mutante KRAS.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un anticuerpo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico. En determinadas realizaciones, el anticuerpo puede ser parte de una proteína de fusión. En algunas realizaciones, dos NPL-ARNm separadas en la etapa (b) del proceso comprenden el ARNm que codifica una cadena ligera y una cadena pesada de un anticuerpo. En algunas realizaciones, la composición de NPL-ARNm de la invención puede comprender una combinación de NPL no idénticas que comprenden diferente composición lipídica, y que encapsulan el ARNm que codifica una cadena ligera o una cadena pesada de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un anticuerpo contra OX40. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un anticuerpo contra el VEGF. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un anticuerpo contra el factor de necrosis tisular alfa. En ciertas realizaciones la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un anticuerpo contra CD3. En ciertas realizaciones la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un anticuerpo contra CD19.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica un inmunomodulador. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la interleucina 12. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la interleucina 23. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica la interleucina 36 gamma. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una variante constitutivamente activa de una o más proteínas estimulador de genes de interferón (STING).
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una endonucleasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína endonucleasa de ADN guiada por el ARN, como la proteína Cas 9. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína meganucleasa. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica una proteína nucleasa de dedo de zinc.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica que comprende ARNm purificado que codifica para el tratamiento de una enfermedad ocular. En algunas realizaciones, el método se utiliza para producir una composición terapéutica que comprende el ARNm purificado que codifica retinosquisina.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas.
Los artículos de prueba de NPL-ARNm descritos en los ejemplos siguientes, a menos que se especifique lo contrario, contienen ARNm encapsulado en una mezcla de lípidos multicomponente de proporciones variables que emplean uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos auxiliares (p. ej., lípidos no catiónicos como DEPE o DOPE), uno o más lípidos pegilados, y opcionalmente uno o más esteroles, como el colesterol diseñado para encapsular ARNm.
Ejemplo 1. Preparación del ARNm
Transcripción in vitro del ARNm
A menos que se describa lo contrario, el ARNm se sintetizó mediante transcripciónin v itro(TIV) utilizando polimerasa T7 o polimerasa SP6. Brevemente, en la reacción de TIV de la polimerasa SP6, por cada gramo de ARN transcrito, se preparó una reacción que contiene 20 mg de un plásmido de ADN linealizado bicatenario con un promotor específico de ARN polimerasa,<a>R<n>polimerasa SP6, inhibidor de ARNasa, pirofosfatasa, NTP 5 mM, DTT 10 mM y un tampón de reacción (10x - Tris-HCl 250 mM, pH 7,5, espirmidina 20 mM, NaCl 50 mM) con agua libre de ARNasa y a continuación se incubó a 37C durante 60 min. La reacción se inactivó a continuación con la adición de ADNasa I y un tampón de ADNasa I (10x- Tris-HCl 100 mM, MgCl<2>5 mM y CaCl<2>25 mM, pH 7,6) para facilitar la digestión del molde ADN bicatenario como preparación para la purificación.
Adición de la caperuza en 5' del ARNm
A menos que se describa lo contrario, al ARNm transcrito por TIV se le añadió una caperuza en su extremo 5', ya sea mediante la inclusión de las estructuras de la caperuza como parte de la reacción de TIV o en una etapa enzimática posterior. Para la adición de la caperuza como parte de la reacción de TIV, se puede incorporar un análogo de la caperuza como la primera "base" en la hebra de ARN naciente. El análogo de la caperuza puede ser Cap 0, Cap1, Cap 2, m6 Am, o caperuzas no naturales. Como alternativa, el ARNm transcritoin v itro(TIV) sin la caperuza añadida y purificado puede modificarse enzimáticamente después de la TIV para incluir una caperuza, p. ej., mediante la adición de una estructura Cap 0 de 5' N7-metilguanilato usando guanilato transferasa y la adición de un grupo metilo en la posición 2' O del penúltimo nucleótido dando como resultado una estructura Cap 1 usando 2' O-metiltransferasa como se describe por Fechter, P; Brownlee, G.G. "Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249.
Adición de la cola en 3' del ARNm
A menos que se describa lo contrario, al ARNm transcrito por TIV se le añadió una cola en su extremo 3', ya sea mediante la inclusión de un molde de cola en el plásmido linealizado, que forma una cola en el ARNm como parte de la reacción de TIV, o en una etapa enzimática posterior. En el caso de la adición de una cola como parte de la reacción de TIV, la incorporación de una característica de adición de cola poli-T o similar en el molde de ADNp se realiza de manera que la cola de poliA o cola similar apropiada se forme en el ARNm como parte del proceso de TIV. Como alternativa, se puede añadir una cola de poli-A al extremo 3' del ARNm producido por TIV enzimáticamente después de la reacción de TIV, por ejemplo, utilizando poli-A polimerasa.
Ejemplo 2. Preparación de nanopartículas lipídicas (NPL) y encapsulación de ARNm
La preparación de NPL y la encapsulación de ARNm en NPL que comprenden el Compuesto 3 como el lípido catiónico se realizaron de acuerdo con el Proceso B. El Proceso B se describe más detalladamente en la solicitud de patente de EE. UU. publicada n.° US2018153822. Como se señaló anteriormente, las preparaciones de NPL eran mezclas de lípidos multicomponente que incluían uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos auxiliares (p. ej., lípidos no catiónicos como DEPE o DOPE), uno o más lípidos pegilados, y uno o más esteroles, como el colesterol diseñado para encapsular el ARNm obtenido como se describe en el Ejemplo 1.
Como se utiliza en el presente documento, el Proceso A se refiere a un proceso convencional en el que las NPL se forman a partir de una mezcla de lípidos multicomponente y el ARNm se encapsula en aquellas que forman NPL en una sola etapa.
El proceso B se refiere a un proceso de encapsulación del ARNm mezclando las NPL preformadas con el ARNm. Las NPL preformadas se prepararon primero mezclando instantáneamente una mezcla lipídica multicomponente disuelta en un disolvente, como etanol con un tampón de citrato, en ausencia de ARNm. La mezcla de las dos corrientes dio lugar a la formación de nanopartículas lipídicas vacías, que era un proceso de autoensamblaje. La formulación resultante proporcionó nanopartículas lipídicas vacías en alcohol con tampón citrato, tampón que fue intercambiado (p. ej., por filtración de flujo tangencial (FFT)) para proporcionar nanopartículas lipídicas vacías en un tampón de solución de trehalosa de 10 % peso/volumen. A continuación, las nanopartículas lipídicas vacías y el ARNm en una solución acuosa se mezclaron para formar ARNm encapsulado dentro de las nanopartículas lipídicas.
Específicamente, para preparar nanopartículas lipídicas vacías, se utilizó DEPE o DOPE como el lípido auxiliar, junto con el Compuesto 3 como el lípido catiónico, DMG-PEG2K como el lípido modificado con PEG y colesterol en las proporciones descritas en laTabla 1-1.
Tabla 1-1. Formación de nanopartículas lipídicas con DEPE frente a DOPE
Sorprendentemente, se observó que estas mezclas de lípidos multicomponente con el Compuesto 3 como el lípido catiónico no se podían formular usando DOPE como el lípido auxiliar no catiónico, sino que formaban liposomas estables cuando la DEPE se usaba como el lípido auxiliar no catiónico en lugar de DOPE.
Ejemplo 3. Mejora de la producción in vivo de ARNm en una NPL con DEPE
Este ejemplo ilustra el aumento inesperado de la potencia del ARNm encapsulado en NPL usando una NPL que incluye DEPE como un lípido auxiliar.
El ARNm que codifica la EPO se sintetizó como se describe en el Ejemplo 1. Utilizando el Proceso B como se describe en el Ejemplo 2, el ARNm se encapsuló en NPL que comprendían diferentes lípidos auxiliares, pero que por lo demás eran los mismos (véasela Tabla 2-1a continuación). Específicamente, cada NPL que encapsulaba ARNm incluía un lípido auxiliar diferente pero el mismo lípido catiónico (Compuesto 1), el mismo lípido modificado con PEG (DMG-PEG2K), el mismo compuesto de esterol (colesterol), las mismas proporciones molares de esos lípidos, el mismo ARNm (ARNm de EPO), la misma relación N/P = 4 (es decir, la relación molar entre lípido catiónico y ARNm), la misma concentración de ARNm (0,2 mg/ml) y se prepararon de acuerdo con el mismo proceso (Proceso B). Las características de las NPL-ARNm resultantes se presentan en laTabla 2-1.
Tabla 2-1. Características de NPL-ARNm EPO
Cada uno de los cuatro artículos de prueba que comprendían ARNm encapsulado en una NPL con un lípido auxiliar diferente (1-4 en laTabla 2-1)se administró a ratones por vía intravenosa mediante inyección en la vena de la cola (n=5, ratones CD-1 de 6-8 semanas de edad) a una dosis de 1 mg/kg de ARNm en un volumen de dosis de 5 ml/kg. A las 6 horas después de la administración de la dosis, se recogió sangre total provisional mediante un cortador de cola. A las 24 horas después de la administración de la dosis, todos los animales fueron sacrificados seguido de toracotomía y extracción de sangre terminal. Los niveles de eritropoyetina humana (hEPO) en muestras de sueros se determinaron mediante el kit ELISA (R&D system n.° cat. DEP00) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Además, los niveles séricos de ALT y AST fueron medidos por ELISA de acuerdo con las técnicas convencionales. La expresión de la proteína EPO y los resultados de ALT/AST se proporcionan en laTabla 2-2y se representan gráficamente en laFigura 1y en laFigura 2,respectivamente.
Tabla 2-2. Plan experimental in vivo para el Ejemplo 3
Como se muestra en laTabla 2-2y en laFigura 1, las NPL-ARNm que comprenden DEPE como el lípido auxiliar proporcionaron una expresión de la proteínain vivonotablemente más alta en comparación con la expresión de la proteína de las NPL-ARNm que comprenden otros lípidos auxiliares, pero que por lo demás eran los mismos. Específicamente, a las seis horas después de la administración de la dosis, las NPL-ARNm que comprenden DEPE proporcionaron una expresión de la proteínain vivoque había mejorado en más del 100 %, es decir, más de dos veces, la expresión de la proteína de las NPL-ARNm que comprenden un lípido auxiliar distinto de la DEPE, por ejemplo, DOPE, DLOPE o POPE, en el mismo punto temporal. Del mismo modo, a las 24 horas después de la administración de la dosis, las NPL-ARNm que comprenden DEPE proporcionaron una expresión de la proteínain vivoque había mejorado en más del 100 %, es decir, más de dos veces la expresión de proteína de las NPL-ARNm que comprenden un lípido auxiliar distinto de la DEPE, por ejemplo, DOPE, DLOPE o POPE, en el mismo punto temporal.
Además, como también se muestra en laTabla 2-2y en laFigura 2, los niveles de ALT y AST a las 24 horas después de la administración de la dosis fueron sustancialmente similares para todas las NPL-ARNm independientemente del lípido auxiliar, lo que indica que las NPL-ARNm que comprenden DEPE como lípido auxiliar tienen una seguridad y tolerabilidad similares a las NPL-ARNm que comprenden un lípido auxiliar distinto de la DEPE, por ejemplo, DOPE, DLOPE o POPE, a la vez que es notablemente más potente.
Ejemplo 4. Preparación de nanopartículas lipídicas (NPL) utilizando DEPE o DOPE como lípidos auxiliares
Este ejemplo ilustra que el uso de DEPE como un lípido auxiliar en formulaciones de nanopartículas lipídicas que encapsulan ARNm (NPL-ARNm) puede proporcionar una mayor expresión de las proteínas a partir del ARNmin vivode hasta más de dos veces respecto a los liposomas convencionales que comprenden (DOPE) como un lípido auxiliar. También se observó que las NPL-ARNm con DEPE como un lípido auxiliar proporcionaron una mayor eficiencia de encapsulación en comparación con las mismas NPL-ARNm con DOPE como un lípido auxiliar. En particular, esta expresión mejorada y esta eficiencia de encapsulación mejorada se observó en una amplia variedad de NPL-ARNm que comprenden diferentes lípidos catiónicos.
En estos estudios, el ARNm que codifica la OTC fue encapsulado en NPL que comprenden DEPE o DOPA como lípidos auxiliares y varios lípidos catiónicos enumerados en la Tabla 3. Cada lípido catiónico descrito en la Tabla 3 incluía cuatro cadenas alquilo de C<10>, C<12>, C<14>o C<16>de longitud, como se indica en el número final de dos dígitos en la descripción de cada lípido. La relación molar de lípido catiónico:DMG-PEG2K:Colesterol:Lípido auxiliar era de aproximadamente 40:3:25:32. Para la porciónin vivode los estudios, se administró 1 mg/kg de cada NPL-ARNm formulada a ratones mediante inyección en la vena de la cola. A las 24 horas se sacrificaron ratones y se evaluó la expresiónin vivodel ARNm que codifica la OTC a partir del homogeneizado hepático de cada ratón. La expresión media de proteínas se proporciona en la tabla siguiente.
Tabla 3. Expresión de proteínas y eficiencia de encapsulación de NPL con DEPE frente a DOPE como lípido auxiliar
LaTabla3 demuestra que la eficiencia de encapsulación era mayor cuando se utilizaba DEPE como un lípido auxiliar, en comparación con DOPE. Además, fue sorprendente observar que las mezclas de lípidos multicomponente con algunos de los lipidoides como los lípidos catiónicos no podían ni siquiera formularse utilizando DOPE, ya que formaban liposomas estables cuando se usaba DEPE como el lípido auxiliar. LaTabla3 también demuestra que las NPL-ARNm que comprenden DEPE como el lípido auxiliar mostraron una expresión de la proteínain vivonotablemente más alta en comparación con la expresión de la proteína de NPL-ARNm que comprenden el lípido auxiliar DOPE, pero que por lo demás eran los mismos. Este fue el caso cuando se usaron varios lípidos catiónicos en NPL.
Ejemplo 5. Mejora de la expresión de proteínas in vivo mediante el uso de DEPE como lípido auxiliar en comparación con otros lípidos auxiliares
Este ejemplo ilustra que el uso de DEPE como un lípido auxiliar en una nanopartícula lipídica que encapsula ARNm (NPL-ARNm) puede aumentar la expresión del ARNmin vivocon respecto a las nanopartículas lipídicas que utilizan otros tipos de lípidos auxiliares, en una variedad de procesos de encapsulación utilizados para preparar las NPL-ARNm.
En estos estudios, el ARNm que codifica la OTC se encapsuló en NPL (N/P = 4) que comprenden DMG-PEG-2000 como lípido modificado con PEG, CDD-TE-4-E12 como lípido catiónico, colesterol y uno de varios lípidos auxiliares diferentes, incluyendo DEPE, en las proporciones molares de lípidos como se muestra en laTabla 4-1, Tabla 4-2, Tabla 4-3yTabla 4-4. Cada formulación de NPL-ARNm se preparó utilizando uno de los cuatro procesos de encapsulación diferentes: Proceso convencional, para las formulaciones descritas en laTabla 4-1, proceso Remix para las formulaciones descritas en laTabla 4-2, proceso Step-Up Remix para las formulaciones descritas en laTabla 4-3o proceso Step-Down Remix para las formulaciones descritas en laTabla 4-4. Las NPL-ARNm fueron evaluadas en cuanto al tamaño de NPL, polidispersidad y porcentaje de encapsulación, y los resultados de cada uno se presentan en las tablas siguientes. Para la porciónin vivode los estudios, se administró 1 mg/kg de cada NPL-ARNm formulada a ratones (n=5) mediante inyección en la vena de la cola. A las 24 horas se sacrificaron ratones y se evaluó la expresiónin vivodel ARNm que codifica la OTC a partir del homogeneizado hepático de cada ratón. La expresión media de proteínas se proporciona en las tablas siguientes.
Tabla 4-1. NPL-ARNm con diferentes lípidos auxiliares preparadas mediante encapsulación convencional
Tabla 4-2. NPL-ARNm con diferentes lípidos auxiliares preparadas mediante encapsulación Remix
Tabla 4-3. NPL-ARNm con diferentes lípidos auxiliares preparadas mediante encapsulación Step-Up Remix
Tabla 4-4. NPL-ARNm con diferentes lípidos auxiliares preparadas mediante encapsulación Step-Down Remix
LaTabla 4-1, Tabla 4-2, Tabla 4-3yTabla 4-4muestran cada una los niveles de expresión de proteínas después de 24 horas a partir del ARNm encapsulado en NPL y administrado a los grupos de ratones. Como se muestra, solo las NPL preparadas con los lípidos auxiliares DOPA o DEPE proporcionaron potencia en términos de expresión de proteínas mediante los diferentes procesos de encapsulación. Cabe señalar, que la expresiónin vivode proteínas era mayor cuando se utilizaba DEPE como un lípido auxiliar para preparar las NPL, independientemente del proceso de encapsulación utilizado para preparar las NPL-ARNm.
Como un experto en la materia podrá apreciar, esta potencia significativamente mayor pero con una seguridad y eficacia comparables de las NPL- ARNm que comprenden DEPE como lípidos auxiliares, ofrece ventajas significativas para la administración de ARNm como terapéutico.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende nanopartículas lipídicas para la administración de ARNm a un sujeto que lo necesite, comprendiendo las nanopartículas lipídicas uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares que encapsulan el ARNm, en donde el uno o más lípidos auxiliares comprenden 1,2-Dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE) y más del 70 % de las nanopartículas lipídicas en la composición tienen un tamaño que varía de 75 nm a 150 nm.
  2. 2. La composición de la reivindicación 1, en donde la administración de la composición al sujeto da como resultado una expresión mejorada del ARNm en comparación con la expresión del mismo ARNm en una segunda composición que comprende nanopartículas lipídicas que tienen los mismos componentes lipídicos y cantidades, excepto que las nanopartículas lipídicas de la segunda composición incluyen uno o más lípidos auxiliares diferentes y no incluyen DEPE, opcionalmente en donde: (a) los diferentes uno o más lípidos auxiliares comprenden dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-snglicero-3-fosfoetanolamina (DLOPE), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE) y/o una combinación de los mismos; y/o (b) la expresión se mejora al menos dos veces respecto a la segunda composición de nanopartículas lipídicas.
  3. 3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en donde: (a) la DEPE en las nanopartículas lipídicas está presente en una concentración de entre 10 por ciento molar y 50 por ciento molar; y/o (b) el uno o más lípidos catiónicos son o comprenden un lípido catiónico de la fórmula siguiente:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde cada R1 y R2 es independientemente H o alifático C<1>-C<6>; cadames independientemente un número entero que tiene un valor de 1 a 4; cada A es independientemente un enlace covalente o arileno; cada L1 es independientemente un grupo éster, tioéster, disulfuro o anhídrido; cada L2 es independientemente alifático C<2>-C<10>; cada X1 es independientemente H u OH; y cada R3 es independientemente alifático C<6>-C<20>, opcionalmente en donde cada R3 es independientemente alifático C<8>-C<16>; y/o (d) el uno o más lípidos modificados con PEG comprenden una cadena de poli(etilen) glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) alquilo de C<6>-C<20>de longitud.
  4. 4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las nanopartículas lipídicas comprenden además uno o más esteroles, opcionalmente en donde el uno o más esteroles comprenden un lípido a base de colesterol, opcionalmente en donde el lípido a base de colesterol es colesterol y/o colesterol PEGilado.
  5. 5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ARNm es un ARNm que codifica una proteína que se traduce en una proteína o péptido terapéuticoin vivo,opcionalmente en donde: (i) el ARNm que codifica la proteína o el péptido se administra sistémicamente y la proteína o péptido traducido es detectable en el hígado o el suero a las 24 horas o más después de la administración, opcionalmente en donde el polipéptido es un polipéptido terapéutico, opcionalmente en donde el polipéptido terapéutico es (a) una cadena ligera de anticuerpo o una cadena pesada de anticuerpo, o b) un polipéptido ausente o deficiente en el sujeto; o (ii) el ARNm que codifica una proteína codifica un péptido, opcionalmente en donde el péptido es un antígeno.
  6. 6. Una composición que comprende nanopartículas lipídicas que comprenden uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares que encapsulan un ARNm, en donde el uno o más lípidos auxiliares comprenden 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE) y más del 70 % de las nanopartículas lipídicas en la composición tienen un tamaño que varía de 75 nm a 150 nm, para su uso en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un sujeto, en donde el ARNm codifica un péptido, polipéptido o proteína que es adecuado para tratar o prevenir la enfermedad o trastorno en el sujeto.
  7. 7. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la administración de la composición al sujeto da como resultado una expresión mejorada del ARNm en comparación con la expresión del mismo ARNm de una segunda composición que comprende nanopartículas lipídicas que tienen los mismos componentes lipídicos y cantidades, excepto que las nanopartículas lipídicas de la segunda composición incluyen uno o más lípidos auxiliares diferentes y no incluyen DEPE, opcionalmente en donde: (a) los diferentes uno o más lípidos auxiliares comprenden dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-snglicero-3-fosfoetanolamina (DLOPE), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE) y/o una combinación de los mismos; y/o (b) la expresión se mejora al menos dos veces respecto a la segunda composición de nanopartículas lipídicas.
  8. 8. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde la DEPE en las nanopartículas lipídicas está presente a una concentración de entre 10 por ciento molar y 50 por ciento molar.
  9. 9. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, opcionalmente en donde: (a) el uno o más lípidos catiónicos son o comprenden CKK-E12; o (b) el uno o más lípidos catiónicos son o comprenden ICE (éster de colesterol e imidazol); o (c) el uno o más lípidos catiónicos son o comprenden un lípido catiónico de la fórmula siguiente:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada R1 y R2 es independientemente H o alifático C<1>-C<6>; cadames independientemente un número entero que tiene un valor de 1 a 4; cada A es independientemente un enlace covalente o arileno; cada L1 es independientemente un grupo éster, tioéster, disulfuro o anhídrido; cada L2 es independientemente alifático C<2>-C<10>; cada X1 es independientemente H u OH; y cada R3 es independientemente alifático C<6>-C<20>, opcionalmente en donde el uno o más lípidos catiónicos son o comprenden el Compuesto 1; y/o (d) el uno o más lípidos modificados con PEG son o comprenden una cadena de poli(etilen) glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) alquilo de C<6>-C<20>de longitud.
  10. 10. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en donde las nanopartículas lipídicas comprenden además uno o más esteroles, opcionalmente, en donde el uno o más esteroles comprenden un lípido a base de colesterol, opcionalmente en donde el lípido a base de colesterol es colesterol y/o colesterol PEGilado.
  11. 11. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en donde: (i) el ARNm codifica un polipéptido, en donde el polipéptido es: (a) una cadena ligera de anticuerpo o una cadena pesada de anticuerpo, o (b) está ausente o es deficiente en el sujeto; o (ii) el ARNm codifica un péptido, en donde el péptido es un antígeno.
  12. 12. Un método para preparar una composición que comprende nanopartículas lipídicas que encapsulan un ARNm, comprendiendo dicho método: (a) proporcionar una mezcla de uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos modificados con PEG y uno o más lípidos auxiliares, en donde el uno o más lípidos auxiliares comprenden 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE); y (b) formar una composición de nanopartículas lipídicas a partir de la mezcla proporcionada en la etapa a); en donde más del 70 % de las nanopartículas lipídicas en la composición tienen un tamaño que varía de 75 nm a 150 nm y el método comprende además encapsular el ARNm en las nanopartículas lipídicas, en donde la encapsulación se lleva a cabo antes o después de la formación de las nanopartículas lipídicas en la etapa (b).
  13. 13. El método de la reivindicación 12, en donde: (a) las nanopartículas lipídicas que encapsulan el ARNm son estables; y/o (b) el uno o más lípidos auxiliares no incluyen ninguno de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-snglicero3-fosfoetanolamina (DLOPE), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE), y/o una combinación de los mismos; y/o (c) la DEPE está presente en la mezcla a una concentración de entre 10 y 50 por ciento molar; y/o (d) el uno o más lípidos modificados con PEG en la mezcla comprenden una cadena de poli(etilen) glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) alquilo de C<6>-C<20>de longitud; y/o (e) la mezcla comprende además uno o más esteroles, en donde opcionalmente el uno o más esteroles comprenden un lípido a base de colesterol, en donde opcionalmente el lípido a base de colesterol es colesterol y/o colesterol PEGilado.
  14. 14. El método de las reivindicaciones 12 o 13, en donde: (a) el ARNm codifica un péptido, polipéptido o proteína terapéutico; y/o (b) el ARNm está encapsulado en nanopartículas lipídicas preformadas.
  15. 15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde el método comprende además (i) someter las nanopartículas lipídicas a filtración de flujo tangencial (FFT) antes y/o después de la encapsulación del ARNm; y/o (ii) formular las nanopartículas lipídicas en una solución de trehalosa.
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