ES2983006T3 - Método para la síntesis de profármacos bifuncionales monoprotegidos y conjugados anticuerpo-fármaco a base de los mismos así como un método para preparar conjugados anticuerpo-fármaco - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para la síntesis de compuestos útiles en la preparación de conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), a saber, profármacos bifuncionales diméricos monoprotegidos basados en análogos de duocarmicina. En un aspecto adicional, se proporcionan compuestos obtenidos mediante el método de acuerdo con la presente invención. El profármaco bifuncional monoprotegido se utiliza para preparar conjugados de anticuerpo-fármaco compuestos por una fracción de anticuerpo y el profármaco bifuncional monoprotegido. Se proporcionan los conjugados de compuesto de anticuerpo así obtenidos. Además, se proporciona un método para preparar un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto por dos fracciones de anticuerpo idénticas o dos diferentes, así como el conjugado de compuesto de anticuerpo que contiene dos fracciones de anticuerpo diferentes en consecuencia. Estos conjugados se pueden utilizar en composiciones farmacéuticas, en particular, para su uso en el tratamiento de tumores, por ejemplo, para su uso en terapia con ADC. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la síntesis de profármacos bifuncionales monoprotegidos y conjugados anticuerpo-fármaco a base de los mismos así como un método para preparar conjugados anticuerpo-fármaco

La presente invención se refiere a un método para la síntesis de compuestos útiles en la preparación de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés), en concreto, profármacos bifuncionales diméricos monoprotegidos a base de análogos de duocarmicina. En un aspecto adicional, se proporcionan compuestos obtenidos mediante el método de acuerdo con la presente invención. El profármaco bifuncional monoprotegido se usa para preparar conjugados anticuerpo-fármaco compuestos por un resto de anticuerpo y el profármaco bifuncional monoprotegido. Se proporcionan conjugados anticuerpo-compuesto obtenidos de este modo. Además, se proporciona un método de preparación de un conjugado anticuerpo-fármaco compuesto por dos restos de anticuerpo idénticos o dos diferentes, así como el conjugado anticuerpo-compuesto que contiene dos restos de anticuerpo diferentes en consecuencia. Estos conjugados pueden usarse en composiciones farmacéuticas, en particular, para su uso en el tratamiento de tumores, por ejemplo, para su uso en terapia con ADC.

Técnica anterior

Las diversas formas de cáncer requieren conceptos de terapia individuales. En respuesta a la complejidad de una enfermedad tumoral, la mayoría de los métodos de tratamiento aplicados clínicamente en la actualidad representan combinaciones de diferentes enfoques terapéuticos. La extirpación quirúrgica puede ser el método de elección en caso de tumores accesibles quirúrgicamente y claramente definidos. Sin embargo, si el tumor es de más difícil acceso o afecta a estructuras vitales, el tratamiento con radiación es el método de elección, así como el tratamiento con quimioterapia. En un estadio más avanzado, en el que ya se han desarrollado metástasis o al menos existe riesgo de metástasis, por lo general se realiza quimioterapia de inmediato. Además, en la terapia de tumores se usan métodos de terapia hormonal, inmunoterapia y terapia con inhibidores de la angiogénesis e inhibidores de cinasas.

En realidad, la quimioterapia es actualmente el método de tratamiento más importante en caso de metástasis o en caso de tumores sistémicos, aunque con frecuencia se asocia a efectos secundarios graves tales como trastornos del cuadro sanguíneo, inmunodeficiencia, mucositis, fiebre, náuseas y vómitos. Es decir, la mayoría de los agentes quimioterápicos se distribuyen por todo el cuerpo a través de la circulación sanguínea para que puedan llegar a todas las células. Sin embargo, los agentes quimioterápicos actúan sobre las células humanas de forma sistémica en general, es decir, previenen la proliferación celular o actúan como citotóxicos, es decir, pueden provocar la muerte de las células. Normalmente, los agentes quimioterápicos no distinguen entre células cancerosas y células normales. La diferencia es que las células tumorales son tipos celulares de proliferación rápida, mientras que las células normales son células de proliferación lenta. Sin embargo, puesto que también se ven afectadas las células no tumorales de rápido crecimiento de la persona tratada, en particular, las de la médula ósea, las raíces del cabello y las células del epitelio intestinal, se producen efectos secundarios graves. Un ejemplo de agentes citotóxicos utilizados en quimioterapia incluye agentes alquilantes. Los agentes alquilantes son una clase numéricamente significativa y estructuralmente muy diversa de sustancias extremadamente reactivas. En algunos casos, después de una activación previa del medicamento o profármaco en un carbocatión, el compuesto activo reacciona como electrófilo, en particular, con los ácidos nucleicos, formando enlaces covalentes. Por lo tanto, se produce entrecruzamiento del ADN, pares de bases anómalos o roturas de cadenas que impiden la replicación y, en última instancia, conducen a la muerte celular. Son ejemplos típicos de fármacos alquilantes ciclofosfamida, pero también el cisplatino. Un grupo de agentes alquilantes particularmente eficaces incluye el antibiótico natural CC1065, un derivado de ciclopropilpirroloindol (CPI), las duocarmicinas y los derivados del ciclopropilbenzoindol (CBI), la yatekemicina, así como derivados y análogos de esta clase de profármacos naturales. Debido a la necesidad de tratamientos quimioterápicos, a los fuertes efectos secundarios de una gran parte de los fármacos utilizados clínicamente y a la aparición de resistencias a muchos agentes quimioterápicos conocidos, es necesario un desarrollo continuo en el campo de los agentes quimioterápicos.

Para reducir los efectos secundarios de la quimioterapia, se han desarrollado nuevos conceptos que aprovechan las propiedades genotípicas y fenotípicas de las células tumorales y permiten una activación dirigida de profármacos reversibles directamente en el sitio de acción. Esta activación dirigida se encuentra en el llamado concepto ADEPT (terapia con profármacos enzimáticos dirigidos por anticuerpos, por sus siglas en inglés). En este caso, se usan congregados anticuerpo-enzima, que convierte directamente el tumor en una transformación del profármaco no tóxico en fármaco y consigue una mayor selectividad. Este enfoque de terapia binaria consta de dos etapas. En primer lugar, se aplica una determinada cantidad de un conjugado anticuerpo-enzima que después se distribuye por todo el organismo mediante circulación sanguínea.

El conjugado se une a antígenos específicos en las superficies de las células tumorales o es degradado o excretado por el cuerpo. Si ya no puede detectarse el congregado anticuerpo-enzima no unido, la aplicación del profármaco tiene lugar en la segunda etapa. El profármaco normalmente no tóxico también se distribuye por todo el organismo y se vuelve tóxico selectivamente en el tejido tumoral gracias a la enzima, que por lo general sólo está presente en la superficie del tumor en forma del congregado enzima-anticuerpo. El fármaco liberado desarrolla su efecto tóxico después de penetrar la membrana celular, mientras que la enzima permanece activa en el lado externo de la célula tumoral y puede activar moléculas de profármaco adicionales. En la medida de lo posible, en el curso de este enfoque no debería producirse una escisión de los profármacos por parte de un sistema enzimático específico del cuerpo, puesto que de lo contrario la actividad de la terapia se vería reducida o anulada. Estas ventajas de los profármacos previamente conocidos tienen, sin embargo, una diferencia demasiado pequeña en la citotoxicidad entre el profármaco y el fármaco generado a partir del mismo, así como una citotoxicidad demasiado baja para el propio fármaco formado.

Como directriz: Los valores de QIC50 del profármaco en presencia de la enzima deben ser superiores a 1000 y la citotoxicidad del fármaco subyacente debe tener un valor de QIC50 inferior a 10 nM.

Ya se han realizado estudios clínicos para el concepto de ADEPT. Se ha demostrado que el concepto de ADEPT es adecuado para la terapia tumoral selectiva, pero todavía es necesario mejorar en diversos puntos con el fin de permitir una terapia selectiva y eficiente.

Otro enfoque en el contexto del tratamiento dirigido de tumores malignos es la monoterapia con profármacos. En ese caso, se desea la presencia de enzimas sobreexpresadas en tumores que sean capaces de escindir un profármaco correspondiente con la liberación del fármaco correspondiente. Un ejemplo de esta posible enzima es la p-D-glucuronidasa, que podría detectarse en concentraciones elevadas en áreas necróticas del tejido tumoral. Como alternativa, también pueden usarse conjugados de fármacos y ligandos específicos de tumores para el direccionamiento selectivo en la terapia contra el cáncer. Uno de los problemas donde se desea mejorar es la provisión de profármacos nuevos y eficaces que tengan una alta diferencia de citotoxicidad entre el profármaco y el fármaco correspondiente, una alta citotoxicidad del fármaco y una mediana de tiempo plasmático corta en el fármaco. Además, existe la necesidad de nuevos tipos de profármacos bifuncionales a base de análogos de duocarmicina para la terapia con ADC (conjugados anticuerpo-fármaco).

Los ADC son una clase importante de fármacos biofarmacéuticos muy potentes diseñados como terapia diana para el tratamiento de sujetos que padecen, por ejemplo, cáncer. En los ADC, los anticuerpos están unidos al principio activo biológico también llamado carga útil o profármaco/fármaco. El fármaco puede estar en forma de un profármaco que se convierte en el principio activo en la célula diana o puede estar presente en forma de un fármaco eficaz después de unirse a la diana.

Con los ADC, las capacidades de direccionamiento de los anticuerpos monoclonales se combinan con la actividad citotóxica de los agentes activos o las preformas de dichos agentes activos. Debido a la especificidad de los anticuerpos monoclonales, es posible dirigirse directamente a las células cancerosas. Por lo tanto, es posible un tratamiento más eficaz de las células cancerosas con efectos secundarios menos graves, en concreto, sobre las células sanas.

Aunque ya se comercializan algunos productos de ADC, se espera un gran potencial para los productos farmacéuticos de ADC. Existen enlazadores escindibles y no escindibles para unir el resto de anticuerpo al agente antineoplásico o principio activo o precursor del mismo. Sin embargo, la unión puede afectar a la toxicidad del principio activo.

Se han descrito diversas realizaciones en la técnica para unir el resto de anticuerpo u otros compañeros de unión a la carga útil, en particular, a los componentes de CBI.

Por ejemplo, el documento WO 2009/017394 describe análogos de CC-1065 sustituidos y sus conjugados. Se describen otros compuestos bifuncionales, por ejemplo, en el documento DE 102015 118490 que identifica nuevos profármacos y fármacos bifuncionales a base de análogos de CC-1065.

Sin embargo, los compuestos bifuncionales que se describen en la técnica están unidos a entidades de unión, como anticuerpos simétricamente, es decir, en ambas subunidades de CBI del compuesto bifuncional. Sin embargo, es deseable proporcionar profármacos bifuncionales que tengan diferentes grupos funcionales en ambos lados de conjugación de las dos subunidades.

Breve descripción de la presente invención

El objetivo de la presente invención es proporcionar nuevos profármacos bifuncionales a base de análogos de duocarmicina para la terapia con ADC que permitan una derivatización heterogénea adecuada para la terapia con ADC.

En consecuencia, la presente invención describe la síntesis de dichos análogos para la terapia con ADC. Se ha reconocido que es posible una conjugación del anticuerpo en una subunidad del profármaco bifuncional, por lo tanto, consiguiéndose la unión con al menos uno de los dos grupos OH, mientras que el otro grupo OH, que es esencial para la ciclación de Winstein necesaria para la conversión del profármaco en el fármaco activo, está disponible para otros fines. Por lo tanto, es posible proporcionar un profármaco bifuncional que comprende el resto necesario que permite la ciclación de Winstein posterior mientras que en el segundo grupo OH de la segunda subunidad, el anticuerpo o cualquier resto de unión se une al profármaco bifuncional. Además, se puede prever proporcionar profármacos bifuncionales heterogéneos que se conjuguen de manera diferente con grupos funcionales, por lo tanto, permitiendo la ciclación de Winstein de las dos subunidades de CBI en puntos temporales diferentes.

Los compuestos de acuerdo con la presente invención no requieren la introducción de ningún grupo funcional adicional en la carga útil o fármaco para la unión, por ejemplo, del anticuerpo. Contrariamente a lo que enseña el documento DE 102015 118490, la unión del resto de unión, como el anticuerpo, no es en el resto enlazador sino en al menos una de las dos subunidades del profármaco.

Todos los compuestos descritos en la técnica anterior tienen el mismo grupo funcional en ambos lados de conjugación y, por lo tanto, tendrían los mismos mecanismos moleculares de escisión y reclutamiento de células cancerosas. La presente invención ahora permite la modificación independiente y diferente de los dos grupos OH de las dos subunidades, cuyas escisiones son necesarias para la activación y transformación del profármaco en el fármaco activo. Por lo tanto, en un primer aspecto, se proporciona un método para la síntesis de un compuesto de fórmula general I

en donde

R es H o un alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido, un grupo alcoxi C<1>-C<4>opcionalmente sustituido, un grupo arilo opcionalmente sustituido, un grupo heteroarilo opcionalmente sustituido, un grupo alquil C<1>-C<4>carboxi alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido, Hal, CN, un grupo alquilsulfonilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido, un grupo arilsulfonilo opcionalmente sustituido o un grupo NRz como se define a continuación;

R<1>es H o un grupo alquilo C<1>-C<4>o un grupo alcoxi C<1>-C<4>;

X<1>es un grupo protector;

L es un grupo conector para enlace covalente por el que L tiene la estructura general Z-Y-Z';

Z y Z' se seleccionan independientemente entre sí de C=O, OC=O, SO<2>, NRz, NR<2>C=O, C=ONRz, en donde cada Rz se selecciona independientemente entre sí de H, grupo alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido o grupo acilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido;

en donde Y es un alquilo C<1>-C<10>opcionalmente sustituido, un grupo de estructura (VIII)

en donde o y p se seleccionan independientemente entre sí de un número entero de 1 a 20, por lo que o y p pueden ser el mismo número entero o un número entero diferente, X<3>es i) N, S u O, o ii) un grupo arilo o un grupo heteroarilo, en donde [C(Ra)<2>]O y [C(Ra)<2>]p están presentes en la metaposición de dicho grupo arilo o de dicho grupo heteroarilo,

cada R<a>se selecciona independientemente entre sí de H o un grupo alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido o un grupo acilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido; que comprende la etapa de hacer reaccionar un compuesto de fórmula II

en donde R, Ri y Hal se definen como anteriormente y X<2>es un grupo protector que puede ser idéntico o diferente de X<1>anterior,

con un agente desprotector para desproteger el grupo X<2>del compuesto de fórmula II;

posteriormente, hacer reaccionar el compuesto de fórmula II desprotegido con un compuesto de fórmula III

en donde los sustituyentes Hal, R<1>, X<1>y R se definen como anteriormente y L es un grupo conector como se ha definido anteriormente, R<3>se selecciona de Hal, en particular, Cl y Br, y OH en presencia de un agente de acoplamiento y una base para obtener un compuesto de fórmula I;

en donde el compuesto de fórmula III se obtiene haciendo reaccionar un compuesto de IV

en donde X1, X4, R, R1 y Hal se definen como anteriormente, X4 es un grupo protector como se define para X1 y X1 y X4 son diferentes entre sí, con un compuesto de fórmula general VII

VII R5 - L - R6

con L siendo Z - Y - Z' y en donde Z, Y y Z' se definen como anteriormente y R5 y R6 se seleccionan independientemente entre sí de un halógeno, como Cl o Br, o un grupo OH.

por lo que en una primera etapa el compuesto de fórmula IV se desprotege en el grupo X4 haciendo reaccionar el mismo con un agente desprotector y, posteriormente, el compuesto de fórmula IV se hace reaccionar con el compuesto de fórmula VII en presencia de una base para obtener el compuesto de fórmula III.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona compuestos que permiten el acoplamiento del resto de unión, como el resto de anticuerpo a través del grupo OH libre en una subunidad del compuesto bifuncional mientras que el otro grupo OH de los segundos subgrupos está protegido.

En otro aspecto, se describe un método para preparar un ADC usando el compuesto de fórmula I de acuerdo con la presente invención. Además, se describe dicho conjugado anticuerpo-compuesto obtenible mediante el método de acuerdo con la presente invención

Por otra parte, se describe un método para preparar un conjugado de ADC compuesto por dos restos de anticuerpo idénticos o dos diferentes y un compuesto de acuerdo con la fórmula I, así como dicho ADC obtenible mediante este método que contiene dos restos de anticuerpo diferentes.

Por último, se describen composiciones farmacéuticas que contienen el ADC de acuerdo con la presente invención, así como el uso del ADC de acuerdo con la presente invención para el tratamiento de tumores, por ejemplo, para su uso en terapia ADEPT o en terapia con ADC.

Breve descripción de los dibujos

Esquema 1:El esquema 1 muestra las reacciones del método de acuerdo con la presente invención para llegar a un compuesto de fórmula general I.

Descripción detallada de la presente invención

Los presentes inventores pretenden proporcionar un método para la síntesis de nuevos intermedios y profármacos para compuestos adecuados en la terapia contra el cáncer.

En un primer aspecto, se proporciona un método para la síntesis de un compuesto de fórmula general I

en donde Hal es F, Cl, Br o I;

R es H o un alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido, un grupo alcoxi C<1>-C<4>opcionalmente sustituido, un grupo arilo opcionalmente sustituido, un grupo heteroarilo opcionalmente sustituido, un grupo alquil C<1>-C<4>carboxi alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido, Hal, CN, un grupo alquilsulfonilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido, un grupo arilsulfonilo opcionalmente sustituido o un grupo NRz como se define a continuación;

R<1>es H o un grupo alquilo C<1>-C<4>o un grupo alcoxi C<1>-C<4>;

X<1>es un grupo protector;

L es un grupo conector para enlace covalente por el que L tiene la estructura general Z-Y-Z';

Z y Z' se seleccionan independientemente entre sí de C=O, OC=O, SO<2>, NRz, NR<2>C=O, C=ONRz, en donde cada Rz se selecciona independientemente entre sí de H, grupo alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido o grupo acilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido;

en donde Y es un alquilo C<1>-C<10>opcionalmente sustituido, un grupo de estructura (VIII)

en donde o y p se seleccionan independientemente entre sí de un número entero de<1>a<2 0>, por lo que o y p pueden ser el mismo número entero o un número entero diferente, X<3>es i) N, S u O, o ii) un grupo arilo o un grupo heteroarilo, en donde [C(Ra)<2>]O y [C(Ra)<2>]p están presentes en la metaposición de dicho grupo arilo o de dicho grupo heteroarilo,

cada Ra se selecciona independientemente entre sí de H o un grupo alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido o un grupo acilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido;

que comprende la etapa de hacer reaccionar un compuesto de fórmula II

en donde R, R<1>y Hal se definen como anteriormente y X<2>es un grupo protector que puede ser idéntico o diferente de X<1>anterior,

con un agente desprotector para desproteger el grupo X<2>del compuesto de fórmula II;

posteriormente, hacer reaccionar el compuesto de fórmula II desprotegido con un compuesto de fórmula III

en donde los sustituyentes Hal, R<1>, X<1>y R se definen como anteriormente y L es un grupo conector como se ha definido anteriormente, R<3>se selecciona de Hal, en particular, Cl y Br, y OH en presencia de un agente de acoplamiento y una base para obtener un compuesto de fórmula I, en donde el compuesto de fórmula III se obtiene haciendo reaccionar un compuesto de IV

en donde X<1>, R, R<1>y Hal se definen como anteriormente, X<4>es un grupo protector como se define para X<1>y X<1>y X<4>son diferentes entre sí, con un compuesto de fórmula general VII

VII R<5>-L-R<6>

con L teniendo la estructura general Z - Y - Z'

en donde Z, Y y Z' se definen como anteriormente y R<5>y R6 se seleccionan independientemente entre sí de un halógeno, como Cl o Br, o un grupo OH,

por lo que en una primera etapa el compuesto de fórmula IV se desprotege en el grupo X<4>haciendo reaccionar el mismo con un agente desprotector y, posteriormente,

el compuesto de fórmula IV se hace reaccionar con el compuesto de fórmula VII en presencia de una base para obtener el compuesto de fórmula III.

La presente invención ahora permite la modificación independiente y diferente de los dos grupos OH en la posición 5' del benzoindol de las dos subunidades de profármacos bifuncionales a base de CBI. La escisión de al menos uno de dichos dos grupos OH es necesaria para la activación y transformación de dicha subunidad en un fármaco activo.

El ADC que puede prepararse usando la presente invención, por ejemplo, se compone de un resto de anticuerpo y el compuesto de fórmula I de acuerdo con la presente invención o un compuesto que está desprotegido, ya sea en donde X<1>es H o en donde el resto X<1>está desprotegido, por ejemplo, cuando X<1>es un tetraacetil-beta-D-galactósido, el X<1>desprotegido es beta-D-galactósido.

El anticuerpo unido puede escindirse en primer lugar a través de grupos lábiles al pH a pH bajo dentro de los lisosomas y posteriormente tiene lugar un primer reordenamiento en la unidad de CBI tóxica. En una segunda etapa, el reordenamiento de la segunda unidad de CBI tóxica puede desencadenarse mediante escisión enzimática de la unidad X<1>, por ejemplo, una unidad de galactosa basada en la actividad p-galactosidasa en los lisosomas, pero también en otros componentes celulares, tales como el retículo endoplásmico, provocando de este modo citotoxicidad. Una activación de dos etapas, en concreto, una primera fase tóxica seguida de una segunda fase tóxica, podría ser ventajosa al proporcionar una eficacia mejor o más prolongada o con pocos o menos efectos secundarios.

El compuesto de acuerdo con la fórmula I permite unir un anticuerpo a un único grupo OH fenólico o a ambos grupos. Por ejemplo, si ambos grupos OH están conjugados con un anticuerpo, la presente invención permite la conjugación de diferentes anticuerpos en cada lado. Esto tendría la ventaja de que se podrían usar dos tumores diferentes, específicamente epítopos, lo que aumentaría adicionalmente la especificidad de la terapia con ADC.

El método de acuerdo con la presente invención se muestra en el esquema 1 esbozando las etapas en consecuencia. En concreto, un compuesto (13) de acuerdo con la fórmula IV en donde X<1>es un galactósido protegido, es concreto, protegido con grupos acetilo, X<4>es Boc, R es H y R<1>es H mientras que Hal es Cl se obtiene haciendo reaccionar el compuesto 11 con el compuesto 12, por lo tanto, dando como resultado el compuesto 13 de estructura III con los dos grupos protectores X<1>y X<4>. El compuesto 13 se hace reaccionar con el compuesto 14 que ejemplifica la estructura VII en donde R<5>y R6 son Cl, Z y Z' son C=O e Y es un grupo propilo.

El compuesto 15 obtenido es un ejemplo de fórmula III con R y R<1>siendo H, Hal es Cl y L con Z y Z' siendo C=O e Y siendo (CH2)3, R<3>siendo OH y X<1>es tetra-acetil-beta-D-galactósido.

El compuesto 15 correspondiente a la estructura de fórmula III después se hace reaccionar con el compuesto 11 correspondiente a la estructura II con R y R<1>= H, X<2>= Boc y Hal = Cl, primero desprotegiendo 11 con BF3OEt2 en CH<2>Cl<2>y, posteriormente, haciendo reaccionar el compuesto desprotegido 11 con el compuesto 15 en presencia de una base y un agente de acoplamiento, en este caso DIPEA y PyBroP para llegar a un compuesto de fórmula general I con X<1>siendo tetra-acetil-beta-D-galactósido, R y R<1>son H, Hal es Cl y L es Z y Z' siendo C=O e Y es (CH2)3.

En particular, los presentes inventores reconocieron que es posible hacer reaccionar el compuesto 15 con el compuesto 11 selectivamente para obtener el compuesto 16 con altos rendimientos.

En una realización de la presente invención, el grupo protector de X<1>y X<2>se selecciona independientemente entre sí de ferc-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo, tosilo, nosilo, trimetilsililo, dimetiltercbutilsililo, una unidad de hidrato de carbono, como, una furanosa, una piranosa, un mono, di o trisacárido protegido, incluyendo un galactósido, como beta-D-galactósido, ácido beta-D-glucurónico, beta-D-glucósido, alfa-D-manósido, fucosa, un resto que contiene carbamato, un resto que contiene acetal o un resto que contiene éter escindible por oxidación.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos naturales o recombinantes y también a fragmentos de anticuerpos. En una realización de la presente invención, los anticuerpos son anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpos. El experto conoce bien los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos adecuados y la producción de los mismos. Si es necesario, el anticuerpo o fragmentos de anticuerpo se modifican permitiendo la unión, pero también la escisión de los mismos a través del grupo OH de benzolindol. Además, el anticuerpo o fragmentos de anticuerpo pueden contener una región enlazadora adecuada que permita la unión, pero también la escisión de los mismos a través del grupo benzoindol. Se conocen ejemplos de los mismos en la técnica, por ejemplo, el documento WO 2017/072295 A1.

Con la expresión "conjugado anticuerpo-compuesto", se entiende el conjugado del anticuerpo con el compuesto de acuerdo con la presente invención. El compuesto puede ser un profármaco o fármaco. En consecuencia, una realización del conjugado anticuerpo-compuesto de acuerdo con la presente invención es un conjugado anticuerpofármaco (ADC).

El término "sustituido" en particular con respecto a alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alilsulfonilo, arilsulfonilo, alcoxi y acilo como se usan en el presente documento se refieren a que dichos grupos están sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados de OH, =O, =S, =NRh, =N-ORh, Sh, NH<2>, NO<2>, NO, N<3>, CF<3>, CN, OCN, SCN, NCO, NCS, C(O)NH<2>, C(O)H, C(O)OH, Halógeno, Rh, SRh, S(O)Rh, S(O)ORh, S(O)<2>Rh, S(O)2ORh, OS(O)Rh, OS(O)ORh, OS(O)2Rh, OS(O)2ORh, OP(O)(ORh)(ORi), P(O)(ORh)(ORi), ORh, NHRi, N(Rh)Ri, N(Rh)(Ri)Rj, Si(Rh)(Ri)Rj, Si(Rh)(Ri)(Rj), C(O)Rh, C(O)ORh, C(O)N(Ri)Rh, OC(O)Rh, OC(O)ORh, OC(O)N(Rh)Ri, N(Ri)C(O)Rh, N(Ri)C(O)ORh, N(R)i)C(O)N(R)j)Rh y tioderivados de estos sustituyentes o una forma protonada o desprotonada de estos sustituyentes por lo que Rh, Ri y Rj se seleccionan independientemente entre sí de H y alquilo C<1-15>opcionalmente sustituido, heteroalquilo C<1-15>, cicloalquilo C<3-15>, heterocicloalquilo C3-15h, arilo C<4-15>o heteroarilo C<4-15>o una combinación de los mismos por lo que dos o más de Rh, Ri y Rj están opcionalmente unidos entre sí, por lo tanto, formando un cicloalquil alilo o heterocilo.

El término "alquilo", como se usa en el presente documento, a menos que se identifique otra cosa, se refiere a un hidrocarburo lineal o ramificado, saturado o insaturado, preferentemente, el grupo alquilo comprende de 1 a 12, tal como de 1 a 10 átomos de carbono, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 átomos de carbono, preferentemente de 1 a 8 átomos de carbono, tal como de 1 a 6 o de 1 a 4 átomos de carbono. Son ejemplos de grupos alquilo metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, octilo, decilo, isopropilo, sec-butilo, isobutilo, tere-butilo, isopentilo, venilo, alilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutenilo, pentinilo, etc.

El término "arilo" o "anillo aromático" se refiere a un monorradical de un hidrocarburo cíclico aromático. Preferentemente, el grupo arilo contiene de 3 a 14 (por ejemplo, de 5 a 10, tal como 5, 6 o 10) átomos de carbono, más preferentemente de 6 a 10 átomos de carbono. Estos se pueden disponer en un anillo, por ejemplo, fenilo, o dos o más anillos condensados (por ejemplo, naftilo). Preferentemente, arilo se refiere a un anillo monocíclico que contiene 6 átomos de carbono o un sistema de anillo bicíclico aromático que contiene 10 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el arilo está sin sustituir. En algunas realizaciones, el arilo está sustituido.

El término "cicloalquilo", como se usa en el presente documento se refiere a un cicloalquilo no aromático, saturado o insaturado, que comprende 1, 2 o más anillos. Los ejemplos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclopentadienilo, ciclohexonilo, etc.

El término "heteroalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a hidrocarburos saturados o insaturados, lineales o ramificados, en los que al menos uno de los carbonos está sustituido con un heteroátomo. Los heteroátomos se seleccionan preferentemente de S, N, O y P.

El término "heteroarilo" se refiere a monorradicales aromáticos compuestos por uno o más sistemas de anillos aromáticos condensados. En los mismos, al menos uno de los átomos de carbono está sustituido con un heteroátomo. Los heteroátomos adecuados incluyen O, N, S o P.

El término "acilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo funcional con la fórmula general Rac-CH = O - en donde Rac se refiere a un radical hidrocarburo opcionalmente sustituido, en particular, una cadena hidrocarbonada que tiene átomos de carbono C<1>- Cs.

El término "alquilsulfonilo" o "arilsulfonilo" se refiere a grupos alquilo o arilo que contienen un resto SO<2>.

Como se usa en el presente documento y en toda la descripción, el término "halógeno" o "halo" o "Hal" significa fluoro, cloro, bromo o yodo.

El grupo protector puede tener o ser un grupo funcional. El grupo funcional de X<1>puede ser un sustrato escindible, el sustrato escindible como se usa en el presente documento se refiere a una estructura que es escindible en condiciones adecuadas, en concreto, como se identifica a continuación por medio de la digestión enzimática u otra escisión física o química. Es decir, en caso de que el sustituyente X<1>sea un grupo funcional en forma de sustrato, la escisión de dicho sustrato puede realizarse en la célula en compartimentos específicos, como los lisosomas u otros compartimentos celulares que convierten el profármaco en el fármaco activo en consecuencia. El grupo funcional incluye unidades de hidratos de carbono, como furanosa y piranosa o una fucosa. Además, el grupo funcional es un disacárido o trisacárido. En una realización de la presente invención, el grupo funcional es un galactósido escindible por galactosidasa.

En un aspecto de la presente invención, el sustituyente Hal es Cl(cloro) y/o R<1>es H y/o en donde cada R es H.

En otra realización de la presente invención, el grupo protector X<2>es terc-butiloxicarbonilo y X<1>es tetra-acetil-beta-Dgalactósido. Además, en una realización de la presente invención, el grupo protector X<2>es ferc-butiloxicarbonilo.

Los grupos protectores X<1>, X<2>y X<4>como se definen en el presente documento pueden seleccionarse independientemente entre sí de grupos funcionales mono, di o trisacáridos u oligosacáridos protegidos, en particular, hexosa, pentosa o heptosa que opcionalmente representan desoxiderivados o aminoderivados de los mismos. Estos sustituyentes pueden estar sustituidos además con sustituyentes de halógeno, alquilo C<1-8>, acilo C<1-8>, heteroalquilo C<1>-8, cicloalquilo C<3-7>, heterocicloalquilo C<3-7>, arilo C<4-12>o heteroarilo C<4-12>, grupos amino o amido. Por supuesto, pueden ser posibles otros sustituyentes adecuados como sustituyentes lábiles seleccionados de semiacetal y acetal, grupos bencilo y grupos bencilo sustituidos.

En una realización adicional, el método es un método en donde la base presente para hacer reaccionar el compuesto de fórmula II con el compuesto de fórmula III se selecciona de diisopropiletilamina (DIPEA), trietilamina o piridina.

Por supuesto, pueden usarse otras bases adecuadas de acuerdo con la presente invención, el experto conoce bien una base adecuada en consecuencia.

Además, el agente de acoplamiento puede seleccionarse de agentes de acoplamiento conocidos incluyendo agentes de fosfonio. Los agentes de fosfonio adecuados incluyen compuestos conocidos como PyCloP, PyBroP, PyBoP, PyAoP.

En otra realización, en el método de la presente invención, el resto L tiene una estructura general VI en donde n es un número entero de 1 a 10. En una realización, n es un número entero de 1 a 5, como 1, 2, 3, 4 y 5, en particular, 3.

Como se analizó con respecto al esquema 1 anterior, el compuesto de acuerdo con la fórmula general IV que contiene el grupo protector X<4>, por ejemplo, en forma de Boc, se desprotege mediante métodos conocidos, por ejemplo, mediante el uso de un ácido de Lewis.

Es decir, la desprotección de compuestos que contienen un grupo protector puede conseguirse usando un ácido de Lewis o un ácido de Broenstedt. El experto conoce bien los ácidos adecuados. Como alternativa, el grupo protector, como un grupo carboxibencilo (grupo cbz) puede desprotegerse usando H<2>en presencia de un catalizador, como un catalizador que contiene Pd.

Después, la estructura IV se deja reaccionar desprotegida con un compuesto de fórmula general VII.

En la fórmula general VII, las definiciones de Z y Z' así como de Y son las identificadas anteriormente, por ejemplo, la estructura Z - Y - Z' es L como se define con respecto a la estructura general VI.

R<5>y R6 son grupos salientes, por ejemplo, un halógeno que incluye Cl y Br o un grupo hidroxilo como parte de un grupo carboxilo.

La base puede ser una base como se ha definido anteriormente, como diisopropilamina (DIPEA), trietilamina o piridina. El experto conoce bien las bases adecuadas útiles para esta reacción.

En un aspecto adicional, se describe un compuesto de fórmula I que puede obtenerse mediante un método de acuerdo con la presente invención.

Los compuestos se caracterizan por tener un grupo hidroxilo libre en un grupo benzoindol del compuesto bifuncional de fórmula general I, mientras que el sustituyente correspondiente en el segundo resto del grupo benzoindol se protege a través de un grupo protector.

El compuesto de fórmula I abarca compuestos en donde X<1>en sí mismo está en una forma protegida o desprotegida, por ejemplo, en el caso de mono, di o trisacáridos u oligosacáridos, los sacáridos están protegidos o desprotegidos. Por ejemplo, en el caso del grupo protector tetra-acetil-beta-D-galactósido, los sustituyentes tetraacetilo pueden estar ausentes, por lo tanto, X<1>es el beta-D-galactósido libre en consecuencia.

Los compuestos de fórmula I descritos anteriormente son adecuados para la preparación de, por ejemplo, conjugados anticuerpo-compuesto en donde hay presente al menos un grupo funcional incluyendo anticuerpos o un resto de unión en general. El resto de unión como se define en el presente documento incluye el anticuerpo o fragmentos de anticuerpo que permiten la unión específica a un compañero de unión. En general, un resto de unión puede incluir cualquier ligando que permita la unión a un compañero de unión dando como resultado un par de unión que incluye pares de unión como ligando-receptor, unión a un epítopo específico del cáncer y unión a un epítopo específico de células senescentes.

Además, el grupo protector puede ser un grupo funcional en forma de un sustrato que puede liberarse tras digestión enzimática, por ejemplo, escisión proteolítica, oxidativa o reductora mediante enzimas incluyendo plasmina, catepsina, catepsina B, beta-glucuronidasa, galactosidasa, manosidasa, glucosidasa, neuramidasa, sacarosidasa, maltasa, fructosidasa, glicosilasa, antígeno prostático específico, activador de plasminógeno de tipo urocinasa (u-PA), metaloproteinasa, citocromo P450 u otras enzimas utilizadas en la terapia con productos enzimáticos como ADEPT.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para preparar un conjugado anticuerpo-fármaco compuesto por un resto de anticuerpo y un compuesto de acuerdo con la fórmula I como se prepara en el presente documento, que comprende la etapa de acoplar el resto de anticuerpo al compuesto de acuerdo con la fórmula I a través del grupo OH libre en la posición 5 del grupo benzoindol de fórmula I.

El método incluye la preparación del compuesto de fórmula I de acuerdo con la presente invención como material de partida en donde en uno de los dos restos hay presente un grupo OH libre en la posición 5 del grupo benzoindol de fórmula I mientras que el otro grupo OH en la posición 5 del segundo grupo benzoindol del segundo resto está protegido con un grupo protector, por ejemplo, un grupo funcional, mientras que dicho grupo protector en sí puede estar protegido o desprotegido.

Además, se describe el conjugado anticuerpo-compuesto que puede obtenerse mediante el método de acuerdo con la presente invención. En un aspecto, este conjugado anticuerpo-compuesto es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC).

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para preparar un ADC compuesto por dos restos de anticuerpo idénticos o dos diferentes y un compuesto de acuerdo con la fórmula I, en donde X<1>está ausente o presente, que comprende la etapa de proporcionar un conjugado anticuerpo-compuesto de acuerdo con la presente invención, opcionalmente desproteger el grupo X<1>con un agente desprotector como se describe en el presente documento y acoplar un segundo resto de anticuerpo al conjugado anticuerpo-fármaco de acuerdo con la presente invención a través del grupo OH desprotegido en la posición 5 del grupo benzoindol de fórmula I o si X<1>está presente a través del grupo protector X<1>desprotegido. Por ejemplo, en el caso de que X<1>sea un galactósido, el segundo resto de anticuerpo se une a través del galactósido desprotegido.

El conjugado anticuerpo-compuesto que puede obtenerse mediante el método de acuerdo con la presente invención contiene dos restos de anticuerpo diferentes.

En un aspecto adicional, también se describe la composición farmacéutica que contiene los conjugados anticuerpocompuesto de acuerdo con la presente invención.

La composición farmacéutica para su uso como se divulga en el presente documento, comprende además al menos un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, los compuestos de acuerdo con la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o hidrato de los mismos puede incluirse en un portador farmacéuticamente aceptable.

Como se usan en el presente documento y en toda la descripción, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento. Los portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes (cargas, agentes formadores de volumen, por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina), disgregantes (por ejemplo, glicolato de almidón de sodio, croscarmelosa de sodio), aglutinantes (por ejemplo, PVP, HPMC), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio), sustancias de deslizamiento (por ejemplo, SiO<2>coloidal), disolventes/cosolventes (por ejemplo, vehículo acuoso, Propilenglicol, o glicerol), agentes tamponantes (por ejemplo, citrato, gluconatos, lactatos), conservantes (por ejemplo, benzoato de Na, parabenos (Me, Pr y Bu), BKC), antioxidantes (por ejemplo, BHT, BHA, ácido ascórbico), agentes humectantes (por ejemplo, polisorbatos, ésteres de sorbitano), agentes antiespumantes (por ejemplo, simeticona), agentes espesantes (por ejemplo, metilcelulosa o hidroxietilcelulosa), agentes edulcorantes (por ejemplo, sorbitol, sacarina, aspartamo, acesulfamo), agentes aromatizantes (por ejemplo, menta, aceites de limón, caramelo, etc.), humectantes (por ejemplo, propileno, glicol, glicerol, sorbitol). El experto en la materia será capaz de elegir fácilmente portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados, dependiendo, por ejemplo, de la formulación y la vía de administración de la composición farmacéutica.

Una lista no exhaustiva de portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables de ejemplo incluye liposomas (biodegradables); microesferas hechas del polímero biodegradable ácido poli(D,L)-láctico-coglicólico (PLGA), microesferas de albúmina; polímeros sintéticos (solubles); nanofibras, complejos proteína-ADN; conjugados de proteínas; eritrocitos; o virosomas. Diversas formas farmacéuticas basadas en portadores comprenden nanopartículas lipídicas sólidas (SLN, por sus siglas en inglés), nanopartículas poliméricas, nanopartículas cerámicas, nanopartículas de hidrogel, nanopartículas peptídicas copolimerizadas, nanocristales y nanosuspensiones, nanocristales, nanotubos y nanocables, nanoportadores funcionalizados, nanoesferas, nanocápsulas, liposomas, emulsiones lipídicas, microtúbulos/microcilindros lipídicos, microburbujas de lípidos, lipoesferas, lipopoliplexos, micelas lipídicas inversas, dendrímeros, etosomas, cápsulas ultrafinas multicompuestas, acuosomas, farmacosomas, coloidosomas, niosomas, discomas, proniosomas, microesferas, microemulsiones y micelas poliméricas. Se describen otros excipientes farmacéuticamente aceptables, entre otros, en"Remington's Pharmaceutical Sciences",15.a Ed., Mack Publishing Co., Nueva Jersey (1991) y Baueret al., Pharmazeutische Technologie,<5>.a Ed., Govi-Verlag Frankfurt (1997).

La composición farmacéutica de la invención generalmente se diseñará para vías y métodos de administración específicos, para dosificaciones y frecuencias específicas de administración, para tratamientos específicos de enfermedades específicas, con intervalos de biodisponibilidad y persistencia, entre otras cosas. Los materiales de la composición se formulan preferentemente en concentraciones que sean aceptables para el sitio de administración.

Por lo tanto, las formulaciones y composiciones pueden diseñarse de acuerdo con la invención para su suministro mediante cualquier vía de administración adecuada. En el contexto de la presente invención, las vías de administración incluyen:

• vías tópicas (tales como epicutánea, inhalatoria, nasal, oftálmica, auricular / auditiva, vaginal, mucosa) y aerosoles;

• vías enterales (tales como oral, gastrointestinal, sublingual, sublabial, bucal, rectal); y

• vías parenterales (tales como intravenosa, intraarterial, intraósea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular, epidural, intratecal, subcutánea, intraperitoneal, extra-amniótica, intraarticular, intracardíaca, intradérmica, intralesional, intrauterina, intravesical, intravítrea, transdérmica, intranasal, transmucosa, intrasinovial, intraluminal).

En algunas realizaciones la administración puede ser una vía parenteral, en particular, intravenosa o intramuscular.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica, como se divulga en el presente documento, se administra a un sujeto que lo necesite en una cantidad eficaz para tratar el cáncer. El sujeto es, preferentemente, un mamífero.

Como se usa en el presente documento y en toda la descripción, el término "Sujeto" significa eucariotas, como animales, incluyendo mamíferos de sangre caliente tales como seres humanos y primates; aves; animales domésticos o de granja tale como gatos, perros, ovejas, cabras, ganado bovino, caballos y cerdos; animales de laboratorio tales como ratones, ratas y cobayas; peces; reptiles; animales de zoológico y silvestres; y similares. El sujeto es, preferentemente, un mamífero, más preferentemente un ser humano.

Como se usa en el presente documento y en toda la descripción, la expresión "cantidad eficaz" en el contexto de una composición o forma farmacéutica para la administración a un sujeto se refiere a una cantidad de la composición o forma farmacéutica suficiente para proporcionar un beneficio en el tratamiento del cáncer, para retrasar o minimizar los síntomas asociados al cáncer, o para curar o mejorar el cáncer. En particular, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéuticoin vivo.Utilizada en relación con una cantidad de un compuesto de la invención, la expresión abarca preferentemente una cantidad no tóxica que mejora la terapia global, reduce o impide los síntomas o las causas de la enfermedad, o potencia la eficacia terapéutica o las sinergias con otro agente terapéutico.

Las cantidades eficaces dependerán, por supuesto, del sujeto particular que se está tratando; la gravedad de una afección, enfermedad o trastorno; los parámetros individuales del paciente, incluyendo la edad, el estado físico, el tamaño y el peso; la duración del tratamiento; la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay); la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional de la salud. Estos factores son bien conocidos por los expertos en la materia y pueden abordarse simplemente con la experimentación de rutina. Generalmente se prefiere usar una dosis máxima, es decir, la dosis segura más alta de acuerdo con el buen criterio médico. Los expertos en la materia entenderán, sin embargo, que un paciente puede insistir en una dosis más baja o tolerable por razones médicas, por razones psicológicas o prácticamente por cualquier otra razón.

En un aspecto adicional, se describe el uso del compuesto de acuerdo con la presente invención para el tratamiento de trastornos o enfermedades asociados a la senescencia.

Como se usan en el presente documento, los trastornos o enfermedades asociados a la senescencia incluyen trastornos o enfermedades asociados a, o provocados por, la senescencia celular, incluyendo enfermedades y trastornos relacionados con la edad. Una enfermedad o trastorno asociado a la senescencia también puede denominarse enfermedad o trastorno asociado a células senescentes. Una característica destacada del envejecimiento es la pérdida gradual de función o degeneración que se produce a nivel molecular, celular, tisular y orgánico. La degeneración relacionada con la edad da lugar a patologías bien reconocidas tales como sarcopenia, ateroesclerosis e insuficiencia cardíaca, osteoporosis, insuficiencia pulmonar, insuficiencia renal, neurodegeneración (incluyendo la degeneración macular, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson) y muchas otras.

Las enfermedades y trastornos asociados a la senescencia incluyen, pero sin limitación, enfermedades y trastornos cardiovasculares, enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades y trastornos autoinmunitarios, enfermedades y trastornos pulmonares, enfermedades y trastornos oculares, enfermedades y trastornos metabólicos, enfermedades y trastornos neurológicos (por ejemplo, enfermedades y trastornos neurodegenerativos); enfermedades y trastornos relacionados con la edad inducidos por la senescencia; afecciones cutáneas; enfermedades relacionada con la edad; enfermedades y trastornos dermatológicos; y enfermedades y trastornos relacionados con trasplantes.

Preferentemente, el sujeto es un mamífero, preferentemente un ser humano.

En una realización preferida de la invención, la enfermedad o trastorno asociado a la senescencia es un trastorno proliferativo, tal como cáncer o leucemia, incluyendo el linfoma. En otra realización preferida, la enfermedad o trastorno asociado a la senescencia es una enfermedad cardiovascular. Una realización adicional de la invención de la enfermedad o trastorno asociado a la senescencia es una enfermedad o trastorno inflamatorio o autoinmunitario.

Otra realización se refiere a enfermedades o trastornos neurológicos como enfermedad o trastorno asociado a la senescencia. Otras enfermedades o trastornos asociados a la senescencia incluyen enfermedades y trastornos oftálmicos, así como enfermedades metabólicas y enfermedades o trastornos pulmonares.

Otras enfermedades o trastornos asociados a la senescencia se refieren a trastornos relacionados con la edad, así como a enfermedades o trastornos dermatológicos y a enfermedades o afecciones relacionadas con la esperanza de vida y la edad. Por otra parte, la presente solicitud, en concreto, el uso del compuesto de acuerdo con la presente invención en donde X<1>es, por ejemplo, un galactósido, se refiere a enfermedades o trastornos que se correlacionan con o se asocian a una actividad p-galactosidasa elevada.

Por otra parte, se describe el uso del compuesto de acuerdo con la presente invención para el tratamiento de tumores, en particular, en mamíferos, el uso es particularmente posible en la terapia ADEPT.

Además, la presente invención se refiere al uso del compuesto de acuerdo con la fórmula I para la preparación de un conjugado anticuerpo-fármaco.

La presente invención se describirá con más detalle a modo de ejemplos sin limitarse a los mismos.

Ejemplos

Procedimientos experimentales

Métodos generales

A menos que se indique otra cosa, los experimentos se realizaron al aire. Los reactivos se obtuvieron de proveedores comerciales y se usaron sin purificación. Se obtuvieron CH<2>Cl<2>anhidro (grado analítico, Fischer Scientific) y THF (AnalR NORMAPUR, VWR) mediante la adición de tamices moleculares secos de 3 A secados en horno de vacío (Vacutherm 6025 de Heraeus Instruments) a un frasco irrigado con argón. Se usó DMF (grado de síntesis de péptidos, Fischer Scientific) en todo momento. Los espectros de RMN se registraron en espectrómetros Mercury-300, Unity-300, Inova-500 e Inova-600 de Varian y en un espectrómetro AMX-300 de Bruker. Los desplazamientos químicos se informan en partes por millón (ppm) de alta a baja frecuencia usando el pico de disolvente residual como patrón interno (DMSO = 2,50 ppm).

Todas las resonancias de 1H se informan con una precisión de 0,01 ppm. Las multiplicidades de las señales 1H se indican como: s = singulete; d = doblete; t = triplete; c = cuadruplete; sept = septuplete; m = multiplete; a = ancho; ap. = aparente; o combinaciones de los mismos. Las constantes de acoplamiento (J) se expresan en Hz y se informan con una precisión de 0,1 Hz. Cuando fue apropiado, se usaron promedios de las señales de los picos que muestran multiplicidad para calcular el valor de la constante de acoplamiento. Los espectros de RMN de 13C se registraron en el mismo espectrómetro con la resonancia central del pico de disolvente como patrón interno (DMSO = 39,52 ppm). Las resonancias de 13C se informan con una precisión de 0,01 ppm. Se usaron los experimentos DEPT, COSY, HSQC y HMBC para ayudar en la determinación estructural y la asignación espectral. Los compuestos totalmente caracterizados eran cromatográficamente homogéneos. La cromatografía en columna ultrarrápida se realizó en un sistema automatizado (Isolera One de Biotage) usando cartuchos ultrarrápidos Biotage SNAP KP-Sil (Sílice 55 A, 53 pm, 96,95 % entre 30-90 pm) o Interchim PF-15SIHP (Sílice esférica de alto rendimiento, 15 pm) como fase estacionaria. La TLC preparativa se realizó usando placas de gel de sílice GF UV254 de 20 * 20 cm y 2000 micrómetros (Analtech) o placas RP-<18>W/UV<254>de 5 * 20 cm de 250 micrómetros (Macherey-Nagel) y se purificaron cantidades más pequeñas (< 10 mg de material bruto) mediante en placas F<254>de TLC de Gel de sílice 60 (Merck, Alemania). La TLC se visualizó usando luz ultravioleta de onda corta y larga en combinación con tinciones de laboratorio convencionales (permanganato de potasio ácido, molibdato de amonio ácido y ninhidrina). Los espectros IEN-EM e IEN-EMAR se registraron en un espectrómetro Apex IV de Bruker Daltronik. Los espectros de EI-EM e EI-EMAR se registraron en un espectrómetro MAT 95 de Finnigan. Los puntos de fusión (Mp) se determinaron usando un aparato automatizado de punto de fusión EZ-Melt de Standford Research Systems y no se corrigen. Los espectros de IR se registraron en un espectrómetro FT/IR-4100 de Jasco. Todas las sustancias se aplicaron puras en una unidad ATR. Los espectros UV se registraron en un espectrómetro V-630 de Jasco. Las rotaciones ópticas se midieron en un polarímetroJASCOP-2000. Las mediciones se realizaron usando una lámpara de sodio (A 589 nm, línea D);

los valores se informaron en 10 grados cm2 g-1, la concentración (c) en g por 100 ml. La HPLC preparativa se realizó con un Kromasil 100 C18 (tamaño de partícula de 7,5 pm, 250 * 200 mm, Dr. Maisch GmbH) en un sistema HPLC Jasco con bomba binaria y detector UV. La HPLC analítica se realizó con un Kromasil 100 C18 (tamaño de partícula de 5,0 pm, 250 * 4 mm, Dr. Maisch GmbH) o una columna Chiralpak IA (tamaño de partícula de 5 pm, 250 * 4,6 mm, Daicel Corporation) en un sistema de HPLC Jasco con detector UV y DAD.

A menos que se indique otra cosa, las hidrogenaciones se realizaron a temperatura ambiente en un sistema ThalesNano Nanotechnology H-Cube (celda de carga de Pd/C al 10 % en peso) en modo de hidrógeno total con un caudal de 1,0 ml/min.

(S)-1-(clorometil)-5-hidroxi-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-carboxilato de tere-butilo (11)

A un matraz lleno de argón que contenía bencil éter de CBI11(200 mg, 0,472 mmol) y Pd/C (carga del 10 % en peso, 100 mg, 0,940 mmol) se le añadió THF seco (20 ml). El argón se reemplazó cuidadosamente por hidrógeno con un globo y la mezcla de reacción se calentó a 40 °C durante 10 h. La mezcla se filtró sobre celite y el residuo se lavó con EtOAc (3 x 50 ml). El filtrado combinado se concentró a presión reducida y se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (CH<2>Ch/EtOAc, 94:6) para producir el compuesto del título (113 mg, 0,340 mmol) en forma de un sólido de color blanco con un rendimiento del 72 %.

Rf0,45 (CH<2>Cl<2>/EtOAc, 92:8) 0,39 para el producto desclorado

Triacetato de (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(Acetoximetil)-6-(((S)-3-(tere-butoxicarbonil)-1-(clorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (13)

A un matraz cargado con naftol11(138 mg, 0,413 mmol), tetraacetil-p-D-galactosil-tricloracetimidato12(265 mg, 0,537 mmol) y tamices molecular de 3 A se le añadió CH<2>Cl<2>seco (21 ml) en atmósfera de argón. La mezcla se agitó durante 30 min y se añadió una solución de dietil eterato de trifluoruro de boro (26 pl, 0,21 mmol) en CH<2>Cl<2>seco (2,0 ml) a -10 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 3 h a -10 °C y se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna ultrarrápida (PET/EtOAc, 1:0 a 1:1) proporcionó el compuesto deseado (223 mg, 0,336 mmol) en forma de un sólido de color blanco con un rendimiento del 81 %.

,

Ácido 5-((S)-1-(clorometil)-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-triacetoxi-6-(acetoximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-5-oxo-pentanoico (15)

El tetraacetil-p-D-galactósido de CBI13(50 mg, 0,075 mmol) se recogió en CH<2>Cl<2>(3,0 ml) y se añadieron dos gotas de dietileterato de trifluoruro de boro a 0 °C. La mezcla de reacción se dejó calentar a ta y se agitó durante otras 2 h. Al finalizar, la mezcla se concentró a presión reducida y se disolvió en DMF de calidad peptídica (1 ml). La solución resultante se enfrió a 0 °C y se añadió lentamente a una solución recién preparada de dicloruro de glutarilo5(0,19 g, 1,1 mmol) en DMF de calidad peptídica (1 ml) a 0 °C. Después de la adición gota a gota de DIPEA (0,20 ml), la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos y se concentró a presión reducida. La cromatografía en columna ultrarrápida (ChteCh/MeOH, de 100:0 a 96:4) produjo el compuesto del título (41 mg, 0,061 mmol) en forma de un sólido de color pardo pálido con un rendimiento del 80 %.

Rr 0,74 (EtOAc)

Mp155 °C

RMN de 1H(500 MHz, DMSO-cfe): ó 8,29 (s, 1H), 7,91 (d,J= 8,4 Hz, 1H), 7,88 (d,J= 8,4 Hz, 1H), 7,56 (t ap.,J= 7,2 Hz, 1H), 7,41 (t ap.,J= 7,4 Hz, 1H), 5,57 (d,J= 6,5 Hz, 1H), 5,45-5,38 (m, 3H), 4,55 (dd,J= 7,5, 4,5 Hz, 1H), 4,34 (t ap.,J= 9,8 Hz, 1H), 4,26-4,14 (m, 3H), 4,07 (dd,J= 11,5, 7,8 Hz, 1H), 4,01 (dd,J= 10,9, 3,0 Hz, 1H), 3,88 (dd,J= 11,0, 7,4 Hz, 1H), 2,66-2,46 (m, 2H), 2,34 (t ap.,J= 7,4 Hz, 2H), 1,83 (m, 2H)

RMN de 13C(126 MHz, DMSO-cfe): ó 174,39, 170,69, 170,38, 170,12, 169,76, 169,56, 153,04, 141,77, 129,61, 127,74, 124,11, 122,99, 122,03, 121,97, 117,92, 101,43, 98,83, 70,92, 69,83, 68,53, 67,54, 61,84, 52,62, 47,73, 40,66, 34,24, 32,97, 20,59, 20,47, 20,43, 20,43, 19.57

EMAR(IEN)m/zcalculado para C32H35ClNO13 [M-H]-: 676,1797, encontrado 676,1797

Triacetato de (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(acetoximetil)-6-(((S)-1-(clorometil)-3-(5-((S)-1-(clorometil)-5-hidroxi-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-5-oxopentanoil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-iÍ)oxi)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (16)

La monoamida de CBI-tetraacetil-p-D-galactósido-pentadioato15(12 mg, 0,035 mmol) se recogió en CH<2>Cl<2>(2 ml) y se añadieron 3 gotas de dietileterato de trifluoruro de boro a 0 °C. La mezcla de reacción se dejó calentar a ta y la desprotección se controló mediante TLC. Después de 2 h, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el sólido en bruto se mantuvo a alto vacío durante 1 hora adicional. Se añadieron ácido5(20 mg, 0,030 mmol), tamices moleculares (3 A) y DMF (0,30 ml) a la solución en una atmósfera de argón. La mezcla resultante se enfrió a -20 °C y se añadieron secuencialmente PyBroP (16 mg, 0,035 mmol) y DIPEA (15 pl, 0,089 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo a -20 °C durante la noche y se dejó calentar hasta 0 °C al día siguiente. La reacción se agitó durante otras<8>h a esa temperatura y posteriormente se concentró a presión reducida. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (PET/EtOAc, 1:0 a 3:7) para proporcionar16en forma de un sólido de color pardo pálido (14 mg, 0,016 mmol) con un rendimiento del 44 %.

Rr 0,51 (EtOAc/PET, 2:1)

Mp155 °C

[a]20 = -41.5

Rotación ópticaD (c 0,27, CHCb)

RMN de 1H(600 MHz, DMSO-cfe): ó 10,31 (s, 1H), 8,33 (s a, 1H), 8,09 (d,J= 8,2 Hz, 1H), 8,02 (s a, 1H), 7,94 (d,J= 8,5 Hz, 1H), 7,89 (d,J= 8,4 Hz, 1H), 7,78 (d,J= 8,4 Hz, 1H), 7,56 (m, 1H), 7,49 (m, 1H), 7,42 (m, 1H), 7,32 (m, 1H), 5,56 (m, 1H), 5,43-5,41 (m, 2H), 5,40 (m, 1H), 4,54 (dd,J= 7,1, 4,8Hz, 1H), 4,38 (t ap.,J= 10,2 Hz, 1H), 4,33 (t ap.,J= 10,0 Hz, 1H), 4,27-4,21 (m, 2H), 4,20-4,13 (m, 3H), 4,10 (dd,J= 11,4, 7,7 Hz, 1H), 4,03 (dd,J= 11,1, 3,1 Hz, 1H), 3,99 (dd,J= 11,1, 3,0 Hz, 1H), 3,89 (dd,J= 11,1, 7,4 Hz, 1H), 3,79 (dd,J= 10,8, 8,3 Hz, 1H), 2,77-2,67 (m, 2H), 2,66-2,57 (m, 2H), 2,18 (s, 3H), 2,08 (s a, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,01-1,95 (m, 2H), 1,97 (s, 3H)RMN de 13C(126 MHz, DMSO-cfe): ó 170,62, 170,37, 169,94, 169,72, 169,35, 169,16, 154,03, 152,79, 141,81, 141,53, 129,77, 129,41, 127,44, 126,98, 123,82, 122,90, 122,71, 122,42, 122,30, 121,90, 121,78, 121,46, 117,75, 113,56, 101,50, 99,70, 98,78, 70,75, 69,75, 68,48, 67,38, 61,57, 52,58, 52,58 47,53, 47,53 40,74, 40,74, 34,39, 25,03, 20,48, 20,34, 20,34, 20,30, 19,15

EMBR(IEN) m/z calculado para C45H45CbN2NaO13 [M+Na]+: 915,3, encontrado 915,3 (100), C45H47CbN2O13 [M+H]+: 893,3, encontrado 893,2 (24)

EM<a>R<(IEN) m/z calculado para C45H45CbN2NaO13 [M+Na]+: 915,2269, encontrado 915,2263>

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para la síntesis de un compuesto de fórmula general I

   en donde Hal es F, Cl, Br o I; R es H o un alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido, un grupo alcoxi C<1>-C<4>opcionalmente sustituido, un grupo arilo opcionalmente sustituido, un grupo heteroarilo opcionalmente sustituido, un grupo alquil C<1>-C<4>carboxi alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido, Hal, CN, un grupo alquilsulfonilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido, un grupo arilsulfonilo opcionalmente sustituido o un grupo NRz como se define a continuación; R<1>es H o un grupo alquilo C<1>-C<4>o un grupo alcoxi C<1>-C<4>; X<1>es un grupo protector; L es un grupo conector para enlace covalente por el que L tiene la estructura general Z-Y-Z'; Z y Z' se seleccionan independientemente entre sí de C=O, OC=O, SO<2>, NRz, NR<2>C=O, C=ONRz, en donde cada Rz se selecciona independientemente entre sí de H, grupo alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido o grupo acilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido; en donde Y es un alquilo C<1>-C<10>opcionalmente sustituido, un grupo de estructura VIII:

   en donde o y p se seleccionan independientemente entre sí de un número entero de 1 a 20, por lo que o y p pueden ser el mismo número entero o un número entero diferente, X<3>es i) N, S u O, o ii) un grupo arilo o un grupo heteroarilo, en donde [C(Ra)<2>]O y [C(Ra)<2>]p están presentes en la metaposición de dicho grupo arilo o de dicho grupo heteroarilo, cada R<a>se selecciona independientemente entre sí de H o un grupo alquilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido o un grupo acilo C<1>-C<4>opcionalmente sustituido; que comprende la etapa de hacer reaccionar un compuesto de fórmula

   en donde R, R<1>y Hal se definen como anteriormente y X<2>es un grupo protector que puede ser idéntico o diferente de X<1>anterior, con un agente desprotector para desproteger el grupo X<2>del compuesto de fórmula II; posteriormente, hacer reaccionar el compuesto de fórmula II desprotegido con un compuesto de fórmula III

   en donde los sustituyentes Hal, Ri, Xi y R se definen como anteriormente y L es un grupo conector como se ha definido anteriormente, R<3>se selecciona de Hal, en particular, Cl y Br, y OH en presencia de un agente de acoplamiento y una base para obtener un compuesto de fórmula I; en donde el compuesto de fórmula III se obtiene haciendo reaccionar un compuesto de IV

   en donde X<1>, X<4>, R, R<1>y Hal se definen como anteriormente, X<4>es un grupo protector como se define para X<1>y X<1>y X<4>son diferentes entre sí, con un compuesto de fórmula general VII VII R<5>-L-R<6> con L siendo Z - Y - Z' y en donde Z, Y y Z' se definen como anteriormente y R<5>y R6 se seleccionan independientemente entre sí de un halógeno o un grupo OH. por lo que en una primera etapa el compuesto de fórmula IV se desprotege en el grupo X<4>haciendo reaccionar el mismo con un agente desprotector y, posteriormente, el compuesto de fórmula IV se hace reaccionar con el compuesto de fórmula VII en presencia de una base para obtener el compuesto de fórmula III.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde R<3>se selecciona de Cl o Br.
3. 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde R<5>y R6 se seleccionan independientemente entre sí de Cl o Br.
4. 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el grupo protector de X<1>y X<2>se selecciona independientemente entre sí de un grupo funcional que incluye ferc-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo, tosilo, nosilo, trimetilsililo, dimetiltercbutilsililo, un mono, di o trisacárido protegido, incluyendo un beta-D-galactósido, ácido beta-D-glucurónico, beta-D-glucósido, alfa-D-manósido, fucosa, un resto que contiene carbamato, un resto que contiene acetal o un resto que contiene éter escindible por oxidación.
5. 5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde Hal es Cl y/o R<1>es H, y/o en donde R es H.
6. 6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde X<2>es ferc-butiloxicarbonilo y X<1>es tetraacetil-beta-D-galactósido.
7. 7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la base se selecciona de diisopropiletilamina, trietilamina, piridina.
8. 8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente de acoplamiento es un agente de fosfonio.
9. 9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde L tiene la estructura general VI

   en donde n es un número entero de 1 a 10.
10. 10. Un método para preparar un conjugado anticuerpo-fármaco compuesto por un resto de anticuerpo y un compuesto de fórmula I, que comprende el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la síntesis del compuesto de fórmula general I y la etapa de acoplar el resto de anticuerpo al compuesto de acuerdo con la fórmula I a través del grupo OH libre en la posición 5 del grupo benzoindol de fórmula I, Opcionalmente, desproteger el grupo X1 o los grupos protectores presentes en X<1>.
11. 11. Un método para preparar un conjugado anticuerpo-fármaco compuesto por dos restos de anticuerpo idénticos o dos diferentes y un compuesto de acuerdo con la fórmula I como se define en el presente documento que comprende las etapas del método de acuerdo con la reivindicación 10, opcionalmente, desproteger el grupo X<1>con un agente desprotector o el grupo o grupos protectores presentes en X<1>, acoplar un segundo resto de anticuerpo a dicho conjugado anticuerpo-fármaco a través del grupo OH desprotegido en la posición 5 del grupo benzoindol de fórmula I, o si X<1>está presente a través del grupo protector X<1>desprotegido.
12. 12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde hay presentes dos restos de anticuerpos diferentes.