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ES2978883T3 - Secuenciación de analitos con nanoporos - Google Patents

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ES2978883T3
ES2978883T3 ES11748022T ES11748022T ES2978883T3 ES 2978883 T3 ES2978883 T3 ES 2978883T3 ES 11748022 T ES11748022 T ES 11748022T ES 11748022 T ES11748022 T ES 11748022T ES 2978883 T3 ES2978883 T3 ES 2978883T3
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ES
Spain
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analyte
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nanopore
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ionic current
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ES11748022T
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English (en)
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Jens H Gundlach
Ian M Derrington
Marcus D Collins
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University of Washington
Original Assignee
University of Washington
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Publication date
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Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos y sistemas relacionados con la secuenciación de unidades de analitos mediante nanoporos. En general, se utilizan construcciones de detención para modificar un analito de manera que el analito modificado se detenga en la apertura de un nanoporo. Durante dicha pausa, se obtiene un nivel de corriente iónica que corresponde a una unidad del analito. Después de alterar el analito modificado de manera que avance a través de la apertura, otra construcción de detención detiene nuevamente el analito, lo que permite obtener un segundo nivel de corriente iónica que representa una segunda unidad del analito. Este proceso puede repetirse hasta que se secuencie cada unidad del analito. También se describen sistemas para realizar dichos métodos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Secuenciación de analitos con nanoporos
ANTECEDENTES
[0001] La información codificada en el ADN es de suma importancia para la medicina y las ciencias biológicas. El mapeo del genoma humano está revolucionando la comprensión de los trastornos genéticos y la predicción de enfermedades, y ayudará en el desarrollo de terapias. La capacidad de secuenciar ADN de forma rápida y económica es esencial tanto para la medicina individualizada como para la investigación científica. Para alcanzar estos objetivos es necesario el desarrollo de nuevas técnicas de secuenciación más allá de la secuenciación de Sanger original. Aún más preferidas son las nuevas técnicas de secuenciación que pueden aplicarse a polímeros además de a los ácidos nucleicos.
[0002] El documento US 2009/298072 menciona un proceso para secuenciar ADN monocatenario empleando un nanoporo y nucleótidos modificados. El documento US 2007/190542 menciona un procedimiento para emplear una estructura de nanoporos de una manera que permite la detección de las posiciones de sondas de ácido nucleico que se hibridan sobre una molécula de ácido nucleico monocatenaria. Hongbo P. et al. Nanotechnology, IOP, Bristol, GB vol. 20, núm. 18, 6 de mayo de 2009, página 185101 se refiere a la translocación inversa del<a>D<n>a través de un nanoporo de estado sólido mediante "pinzas magnéticas". El documento WO 2008/076406 menciona el uso de imanes en procedimientos y aparatos para medir analitos usando matrices FET a gran escala.
DESCRIPCIÓN RESUMIDA
[0003] La presente invención se define según las reivindicaciones. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona un procedimiento de acuerdo con la reivindicación independiente 1 de secuenciar dos o más unidades de un analito modificado con al menos una primera construcción de detención y una segunda construcción de detención, que comprende: (a) proporcionar un nanoporo colocado entre un ladocisque comprende un primer medio líquido conductor y el analito modificado y un ladotransque comprende un segundo medio líquido conductor, en el que el nanoporo proporciona comunicación líquida entre el ladocisy el ladotrans;(b) provocar que la primera construcción de detención del analito modificado detenga temporalmente la translocación del analito modificado al entrar la primera construcción de detención en el nanoporo, produciendo así un primer nivel de corriente iónica que representa una primera unidad; (c) alterar la primera construcción de detención del analito modificado, permitiendo la alteración que el analito modificado avance hacia el ladotrans;(d) provocar que la segunda construcción de detención del analito modificado detenga temporalmente la translocación del analito modificado al entrar la segunda construcción de detención en la abertura, produciendo así un segundo nivel de corriente iónica que representa una segunda unidad; y (e) comparar el primer nivel de corriente iónica y el segundo nivel de corriente iónica con un nivel de corriente iónica conocido de una unidad conocida, identificando así la primera y segunda unidades del analito.
[0004] La presente invención también proporciona un sistema según la reivindicación 11, que comprende: un nanoporo de proteína colocado entre un lado cis que comprende un primer medio líquido conductor y un lado trans que comprende un segundo medio líquido conductor, en el que el nanoporo de proteína está dispuesto en una membrana artificial que abarca la abertura de un orificio, en el que la membrana comprende un ácido micólico y tiene un voltaje de ruptura mayor que 1,0 V cuando el voltaje aplicado a través de la membrana aumenta en rampa a aproximadamente 100 mV/s en presencia de una solución de KC1 1,0 M preparada con agua desionizada, tamponada a pH 8,0 ± 0,05 con HEPES 10 mM, y en el que el nanoporo de proteína proporciona comunicación líquida entre el lado cis y el lado trans; un dispositivo de adquisición de datos operable para detectar una corriente iónica a través del nanoporo de proteína; y un analito de ácido nucleico en el primer medio líquido, en el que el analito de ácido nucleico comprende una primera construcción de detención y una segunda construcción de detención, en el que la primera construcción de detención está configurada para detener temporalmente el avance del analito de ácido nucleico hacia el lado trans después de la entrada del analito de ácido nucleico en el nanoporo de proteína durante un tiempo suficiente para detectar un primer nivel de corriente iónica y a continuación permite que el analito de ácido nucleico avance hacia el lado trans.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0005] Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas inherentes de la presente invención se entenderán más fácilmente a medida que se comprendan mejor con referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se toma en conjunto con los dibujos adjuntos.
La FIGURA 1 representa la estructura cristalina de una MspA. La vista transversal a través de la estructura de M1-NNN-MspA utilizando un modelo de relleno de espacio muestra las clases de aminoácidos: los rojos tienen carga positiva; los azules tienen carga negativa; los morados son polares; los amarillos son hidrófobos-alifáticos; los naranjas son hidrófobos-aromáticos. Ver Science 303:1189 (2004).
Las FIGURAS 2A, 2B, 2C y 2D representan la translocación del ADN a través del nanoporo MspA. El boceto muestra la translocación del ADN a través de MspA y la corriente residual resultante. FIGURA 2A: El voltaje positivo atrae el ADN en forma de horquilla cargado negativamente hacia el interior del poro. FIGURA 2B: El ADN pasa a través del poro hasta que el dúplex en forma de horquilla más ancho evita una mayor translocación. FIGURA 2C: Después de unos milisegundos, la horquilla se disocia permitiendo una translocación completa. FIGURA 2D: El rastro de corriente resultante asociado con el boceto anterior muestra que el ADN en horquilla presente en el poro permite una corriente residual,Ires,hasta que el dúplex en horquilla se disocia.
Las FIGURAS 3A y 3B proporcionan histogramas de ejemplo de las corrientes iónicas residuales promediadas,<Ires>que se muestran para diferentes colas monocatenarias de "homopolímero" de una horquilla (hp) de 14 pares de bases. Los datos se tomaron a (a) 180 mV y (b) 140 mV. Las translocaciones incluidas en la FIGURA 3A tienen duraciones superiores a 1 milisegundo y revelan niveles de corriente distinguibles y bien resueltos. En los siguientes ejemplos se proporciona el promedio de la media gaussiana ajustada de varios experimentos. Hubo al menos 4 repeticiones experimentales con cada uno de los ADN en horquilla. La reducción de los anchos a 140 mV se debe al aumento del tiempo promedio, ya que los tiempos de disociación son casi 30 veces más largos que los tiempos de disociación a 180 mV. Se puede encontrar información adicional en la Tabla A.
Las FIGURAS 4A, 4B, 4C y 4D proporcionan histogramas de corriente residual debido a sustituciones de un solo nucleótido en una cola en horquilla que de otro modo sería poli-dA. FIGURA 4A: Para fines de comparación, la FIGURA 4A resume la media gaussiana promediada y el ancho deIresde las colas en horquilla de homopolímero a 180 mV (con los valores de ajuste que se describen a continuación en los ejemplos). Los colores negro, azul, rojo y verde se utilizan para ayudar a separar los efectos enIresdebidos a dA, dG, dC y dT, respectivamente. La corriente residual cambia notablemente con la posición, x, de un solo nucleótido dNx, dentro de una cola en horquilla (hp) de homopolímero que de otro modo sería poli-dA. FIGURA 4B: Cuando la sustitución de nucleótidos es adyacente al extremo de la doble cadena, x =1,la corriente residual se desvía para parecerse a los valores del homopolímero asociados con el nucleótido sustituido. La sustitución dT<1>se parece más a IdT. FIGURA 4C: En x =2,la sustitución de nucleótidos también provoca que la corriente residual se acerque más al homopolímero asociado al nucleótido sustituido. La sustitución dC<2>es la más cercana a IdC. FIGURA 4D: Con cualquier sustitución en x =3, Ireses sólo ligeramente diferente deIdA,lo que sugiere que MspA es principalmente sensible a los dos nt después del dúplex en horquilla. Una sustitución de dGx en x =1, 2o3no influye significativamente en la corriente, tal como se puede esperar dada la relativa cercanía deIdGeIdA.
Las FIGURAS 5A, 5B y 5C representan demostraciones de secuenciación de nanoporos con dúplex interrumpidos (DI) utilizando MspA. El ADN sintetizado que simulaba el ADN analito se convirtió para que tuviera dúplex entre los nucleótidos que transportaban información. Cada uno de estos dúplex debe fundirse secuencialmente o disociarse a medida que el ADN pasa a través del poro, lo que permite que la corriente residual determine la secuencia. Se empleó ADN elegido para representar diferentes secuencias de analitos: 3-ATGC-5' [SEQ ID NO: 1] (FIGURA 5A); 3-TACG-5' [SEQ ID<n>O: 2] (FIGURA 5B) y la secuencia "ciega" que se determinó que era 3-GTCAC-5' [SEQ ID NO: 3] (FIGURA 5C). Se muestran trazas de ejemplo de corrientes residuales a la izquierda de cada una de las FIGURAS 5A, 5B y 5C. Cada etapa en la corriente residual es representativa de tres nucleótidos dentro de la constricción de MspA sostenida por un dúplex de ADN de 14 pb. Para cada una de estas etapas, se muestra un histograma de cada nivel a la derecha de cada una de las FIGURAS 5A, 5B y 5C para N translocaciones. Estos resultados se generan a partir de 3 o más experimentos a 140 mV. A voltajes más altos, el número de translocaciones aumenta (consulte las tablas en las FIGURAS 10-12), pero el nivel de especificidad disminuye (ver Tablas A y B y las tablas en las FIGURAS 10-12) debido a la reducción del tiempo promedio.
Las FIGURAS 6A, 6B, 6C y 6D son histogramas representativos de la corriente residual promedio, <Ires>, para inserciones de un nucleótido dN en colas de horquilla de homopolímero en la posición x lejos del dúplex de horquilla, indicado dNx. Las líneas discontinuas verticales indican la media gaussiana de las corrientes residuales de homopolímero indicadas. Los recuentos de cada histograma vienen dados por N. Cabe indicar que el efecto de la referencia del homopolímero sobre el efecto de la sustitución de nucleótidos.
Las FIGURAS 7A, 7B y 7C presentan datos de ejemplos de secuenciación DI para el ADN analito, 3'ATGC5' [SEQ ID NO: 1] (columna izquierda) 3' TACG 5' [SEQ ID NO: 2] (columna central) y a Dn ciego determinado como 3' GTCAC 5' [SEQ ID NO: 3] (columna derecha) a un voltaje aplicado de 140 mV. Cada grupo de figuras contiene: (a) un ejemplo de traza de corriente que contiene 4 (o 5) niveles, (b) histogramas para cada una de las corrientes promedio para cada nivel de múltiples eventos con 4 (o 5) niveles y (c) una representación de la densidad que indica la transición entre los niveles de corriente para los múltiples eventos en los histogramas. La corriente de poro desbloqueada fue de 237,0 ± 1,0 pA (media ± s.e.m). Se realizaron tres o más experimentos individuales con cada DI-DNA.
Las FIGURAS 8A, 8B y 8C representan datos en un formato similar a las FIGURAS 7A, 7B y 7C, pero para un voltaje aplicado de 160 mV. La corriente de poro desbloqueada fue de 294,7 ± 0,8 pA (media ± s.e.m).
Las FIGURAS 9A, 9B y 9C representan datos en un formato similar a las FIGURAS 8A, 8B y 8C pero para un voltaje aplicado de 180 mV. La corriente de poro desbloqueada fue de 325,1 ± 1,8 pA (media ± s.e.m). A mayor voltaje, resulta más difícil distinguir niveles únicos en las trazas de corriente debido al menor promedio temporal de los niveles de corriente.
Las FIGURAS 10-12 se describen arriba en la leyenda de FIGURAS 5A, 5B y 5C y en los ejemplos siguientes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0006] En el presente documento se proporcionan procedimientos y sistemas para secuenciar unidades de un analito. En general, la secuenciación puede tener lugar de la siguiente manera. En el estado nativo, las unidades del analito pueden translocarse a través de una abertura de un nanoporo. La translocación del analito a través del poro puede ser demasiado rápida para resolver la composición de las unidades del analito. Se utilizan construcciones de detención para modificar el analito de manera que el analito modificado ya no pueda pasar a través de la abertura. Cada construcción de detención permite que el analito modificado se detenga temporalmente en la abertura, de modo que se pueda detectar un nivel de corriente iónica y asociarlo con una unidad particular. A continuación, se puede alterar la construcción de detención para proporcionar un analito modificado que ahora sea capaz de avanzar a través de la abertura. El analito modificado comprende al menos una segunda construcción de detención que provoca una segunda detención temporal del analito modificado en la abertura de modo que se pueda detectar el siguiente nivel de corriente iónica que esté asociado con la siguiente unidad. La alteración de la segunda construcción de detención permite que el analito modificado avance nuevamente a través de la abertura. El proceso puede repetirse para tantas construcciones de detención como haya en el analito modificado, de manera que se secuencia cada unidad del analito.
[0007] En consecuencia, algunas realizaciones proporcionan un procedimiento para secuenciar dos o más unidades de un analito modificado con al menos una primera construcción de detención y una segunda construcción de detención, que comprende: (a) proporcionar un nanoporo colocado entre un ladocisque comprende un primer medio líquido conductor y el analito modificado y un ladotransque comprende un segundo medio líquido conductor, en la que el nanoporo comprende una abertura que proporciona comunicación líquida entre el ladocisy el ladotrans; (b) provocar que la primera construcción de detención del analito modificado detenga temporalmente el analito modificado al entrar en la abertura, produciendo de este modo un primer nivel de corriente iónica, en el que el primer nivel de corriente iónica representa una primera unidad, que puede ser la primera unidad en el analito modificado; (c) alterar la primera construcción de detención del analito modificado, permitiendo la alteración que el analito modificado avance hacia el ladotrans;(d) provocar que la segunda construcción de detención del analito modificado detenga temporalmente el analito modificado al entrar en la abertura, produciendo así un segundo nivel de corriente iónica que representa una segunda unidad; y (e) comparar los primeros niveles de corriente iónica y el segundo nivel de corriente iónica con un nivel de corriente iónica conocido de una unidad conocida, secuenciando así dos o más unidades del analito. Este o cualquier otro procedimiento del presente documento puede repetirse según sea necesario para secuenciar una tercera, cuarta, quinta, etc., unidad en el analito modificado mediante el uso de una tercera, cuarta, quinta, etc., construcción de detención en el analito modificado.
[0008] En algunas realizaciones, el analito modificado comprende un ácido nucleico modificado, un péptido modificado o una proteína modificada. En algunas realizaciones, el analito modificado comprende un ácido nucleico modificado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico modificado comprende un ADN modificado, un ARN modificado, un PNA modificado o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el analito modificado comprende un enlazador que une el analito a una construcción de detención. El analito modificado puede definirse además como un ácido nucleico modificado que comprende un enlazador que une el ácido nucleico a una construcción de detención. En algunas realizaciones, el analito modificado comprende un resto inorgánico que tiene un peso molecular de 1 MDa o menos. En otras realizaciones, el analito modificado comprende un resto orgánico que tiene un peso molecular de 1 MDa o menos.
[0009] De manera opcional, al menos una construcción de detención es una construcción de detención de inserción. En algunas realizaciones, la construcción de detención de inserción es un ácido nucleico dúplex. En otras realizaciones, al menos una construcción de detención es una construcción de detención colgante. Cada construcción de detección puede ser idéntica o diferente. En algunas realizaciones, dos o más de las construcciones de detención son diferentes. En algunas realizaciones, el analito modificado comprende una cola de inicio de translocación. De manera opcional, el analito modificado es un ADNss modificado con al menos dos construcciones de detención de inserción, cada una definida además como un ADN dúplex, donde cada dúplex puede ser igual o diferente, y donde cada unidad es un único nucleótido (por ejemplo, C) o una nucleótido de repetición (por ejemplo, CCC).
[0010] Los procedimientos descritos en el presente documento pueden usarse para identificar unidades repetidas en un analito, tales como nucleótidos repetidos. En algunas realizaciones, una construcción de detención detiene temporalmente el analito modificado para permitir que el nivel de corriente iónica determine la identidad de una unidad y otra construcción de detención detiene temporalmente el analito modificado para producir un nivel de corriente iónica que difiere de cualquier nivel de corriente iónica específica de la unidad y es definido como un nivel separador. En algunas realizaciones, el nivel separador distingue unidades secuenciales del analito. En algunas realizaciones, el nivel separador distingue unidades secuenciales y repetidas del analito. En algunas realizaciones, periódicamente el nivel separador se diseña para producir un nivel de corriente iónica diferente para proporcionar una suma de control. De manera opcional, se utilizan al menos dos niveles separadores para proporcionar un código binario para representar unidades del analito. De manera opcional, al menos un nivel separador proporciona un bit de paridad.
[0011] La fidelidad de la secuenciación se puede mejorar cuando uno o más analitos modificados se secuencian varias veces para producir múltiples patrones de corriente que permitan lecturas promedio y de consenso.
[0012] La aplicación de un campo eléctrico puede provocar que el analito modificado entre en la abertura o provoque de otro modo el movimiento de un analito modificado, tal como mover un analito modificado a través de una abertura de un nanoporo después de la alteración. En algunas realizaciones, la presión física provoca que el analito modificado entre en la abertura o de otro modo provoque el movimiento de un analito modificado. En algunas realizaciones, se une una perla magnética al analito modificado en el ladotrans,y la alteración es causada por una fuerza magnética que provoca que el analito modificado entre o avance a través de la abertura o de otro modo provoque el movimiento del analito modificado. Por ejemplo, la perla magnética no pasa a través del poro, pero puede usarse una vez que una cola de iniciación de translocación ha atravesado el poro.
[0013] En algunas realizaciones, la alteración es provocada por un pulso de voltaje, una rampa de voltaje, un pulso de luz o un pulso de fuerza mecánica. La alteración puede definirse además como disociación de la construcción de detención. La alteración puede definirse además como un cambio conformacional de la construcción de detención.
[0014] Algunos procedimientos pueden comprender además cambiar la velocidad del analito modificado cuando entra en la abertura o cambiar la sensibilidad de secuenciación ajustando el pH del primer o segundo medio líquido conductor. Algunos procedimientos pueden comprender además cambiar la velocidad del analito modificado cuando entra en la abertura o cambiar la sensibilidad de secuenciación ajustando la fuerza iónica del primer o segundo medio líquido conductor. Algunos procedimientos pueden comprender además cambiar la velocidad del analito modificado cuando entra en la abertura o cambiar la sensibilidad de secuenciación ajustando el tipo de ion del primer o segundo medio líquido conductor. Algunos procedimientos pueden comprender además cambiar la velocidad del analito modificado cuando entra en la abertura o cambiar la sensibilidad de secuenciación ajustando la temperatura del primer o segundo medio líquido conductor. Algunos procedimientos pueden comprender además cambiar la velocidad del analito modificado cuando entra en la abertura o cambiar la sensibilidad de secuenciación ajustando la viscosidad del primer o segundo medio líquido conductor. Algunos procedimientos pueden comprender además cambiar la velocidad del analito modificado cuando entra en la abertura o cambiar la sensibilidad de secuenciación empleando reactivos de unión de dúplex.
[0015] Algunas realizaciones comprenden además obtener el analito modificado.
[0016] Un nanoporo puede comprender un material en estado sólido, tal como nitruro de silicio, nitruro de silicio modificado, silicio, óxido de silicio o grafeno, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, un nanoporo es una proteína que forma un túnel al insertarse en una bicapa, membrana, película delgada u orificio de estado sólido. En algunas realizaciones, el nanoporo está comprendido en una bicapa lipídica. En algunas realizaciones, el nanoporo está comprendido en una membrana artificial que comprende un ácido micólico. El nanoporo puede ser una porina deMycobacterium smegmatis(Msp) que tiene un vestíbulo y una zona de constricción que definen el túnel. La porina Msp puede ser una porina MspA mutante. En algunas realizaciones, los aminoácidos en las posiciones 90, 91 y 93 de la porina MspA mutante se sustituyen cada uno por asparagina. Algunas realizaciones pueden comprender alterar la velocidad del analito modificado o la sensibilidad de secuenciación eliminando, añadiendo o reemplazando al menos un aminoácido de una porina Msp. El nanoporo puede ser a-hemolisina o una variante de la misma. Algunas realizaciones pueden comprender alterar la velocidad del analito modificado o la sensibilidad de secuenciación eliminando, añadiendo o reemplazando al menos un aminoácido de a-hemolisina o una variante de la misma.
[0017] También se proporciona un procedimiento para secuenciar dos o más nucleótidos de un ácido nucleico, que comprende: (a) proporcionar un ácido nucleico que comprende al menos dos nucleótidos desconocidos o un conjunto de nucleótidos repetidos desconocidos, cada uno definido como Xn, en el que n = 1 -1.000.000 y en el que cada X y cada n pueden ser iguales o diferentes; colocar una primera construcción de detención de inserción y una segunda construcción de detención de inserción en el ácido nucleico, comprendiendo cada una un ácido nucleico dúplex y cada una adyacente a un Xn, para proporcionar un ácido nucleico modificado; (c) proporcionar una porina MspA mutante situada entre un ladocisque comprende un primer medio líquido conductor y el ácido nucleico modificado y un ladotransque comprende un segundo medio líquido conductor; (d) provocar que una primera construcción de detención de inserción detenga temporalmente el ácido nucleico modificado al entrar en un túnel de la porina MspA mutante, produciendo de este modo un primer nivel de corriente iónica, en el que el primer nivel de corriente iónica representa un primer Xn; (e) alterar la primera construcción de detención del inserción, permitiendo la alteración que el ácido nucleico modificado avance hacia el ladotrans;(f) provocar que la segunda construcción de detención de inserción del ácido nucleico modificado se detenga temporalmente al entrar en la abertura, produciendo de este modo un segundo nivel de corriente iónica que representa un segundo Xn; y (g) comparar el primer nivel de corriente iónica y el segundo nivel de corriente iónica con un nivel de corriente iónica de un Xn conocido, secuenciando así dos o más nucleótidos del ácido nucleico. En algunas realizaciones, una construcción de detención de inserción detiene temporalmente el ácido nucleico modificado para permitir que el nivel de corriente iónica determine la identidad de un nucleótido y otra construcción de detención de inserción detiene temporalmente el ácido nucleico modificado para producir un nivel de corriente iónica que difiere de cualquier nivel de corriente irónica específico de nucleótido y se define como un nivel separador. En algunas realizaciones, el nivel de separador distingue nucleótidos secuenciales del ácido nucleico. En algunas realizaciones, el nivel de separador distingue nucleótidos secuenciales y repetidos del ácido nucleico. En algunas realizaciones, periódicamente el nivel del separador se diseña para producir un nivel de corriente iónica diferente para proporcionar una suma de control. De manera opcional, se utilizan al menos dos niveles de separador para proporcionar un código binario para representar unidades del analito. De manera opcional, al menos un nivel de separador proporciona un bit de paridad.
[0018] Se proporciona además un procedimiento para correlacionar un nivel de corriente iónica con una unidad conocida de un analito, que comprende: (a) proporcionar un nanoporo colocado entre un ladocisque comprende un primer medio líquido conductor y un analito modificado con dos o más construcciones de detención y que contiene todas las unidades de interés conocidas, y un ladotransque comprende un segundo medio líquido conductor, en el que el nanoporo comprende una abertura que proporciona comunicación líquida entre el ladocisy el ladotrans;(b) provocar que una primera construcción de detención del analito modificado detenga temporalmente el analito modificado al entrar en la abertura, produciendo de este modo un nivel de corriente iónica, en el que el nivel de corriente iónica representa una primera unidad conocida del analito; (c) alterar la primera construcción de detención del analito modificado, permitiendo la alteración que el analito modificado avance hacia el ladotrans;(d) provocar que la segunda construcción de detención del analito modificado detenga temporalmente el analito modificado al entrar en la abertura, produciendo así un segundo nivel de corriente iónica que representa una segunda unidad; y (e) calibrar el nanoporo con un analito modificado conocido que contiene todas las unidades y los correspondientes niveles de corriente iónica de interés y, de manera opcional, obtener un nivel separador, correlacionando así cada nivel de corriente iónica con una unidad conocida de un analito. Este o cualquier otro procedimiento puede repetirse para secuenciar una tercera, cuarta, quinta, etc., unidad conocida en el analito modificado mediante el uso de una tercera, cuarta, quinta, etc., construcción de detención. En algunas realizaciones, cada construcción de detención es la misma y en algunas realizaciones, cada construcción de detención es diferente.
[0019] Se proporciona además un procedimiento para ralentizar o aumentar la velocidad a la que un analito modificado se transloca a través de una abertura de un nanoporo, que comprende: (a) proporcionar un nanoporo colocado entre un ladocisque comprende un primer medio líquido conductor y un analito modificado y un ladotransque comprende un segundo medio líquido conductor; (b) provocar que una construcción de detención del analito modificado detenga temporalmente el analito modificado al entrar en la abertura, produciendo así uno o más niveles de corriente iónica, en donde cada nivel de corriente iónica es distinguible; y (c) alterar al menos una primera construcción de detención del analito modificado, permitiendo la alteración que el analito modificado avance hacia el ladotrans;en el que el analito modificado tiene una velocidad de translocación promedio a través de la abertura que es menor que la velocidad de translocación promedio a la que el analito se transloca a través del túnel en ausencia de modificación y alteración.
[0020] También se proporcionan en el presente documento sistemas, tales como un sistema que comprende un nanoporo que tiene una abertura, en el que el nanoporo está colocado entre un primer medio líquido conductor y un segundo medio líquido conductor, en el que al menos un medio líquido comprende un analito modificado, tal como un ácido nucleico modificado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico modificado se define además como un ADN modificado y cada construcción de detención del ADN modificado es un ADN dúplex que contiene el mismo número de nucleótidos y cada ADN dúplex es idéntico. En algunas realizaciones, el sistema es operativo para provocar que un complejo de detención del ácido nucleico modificado se disocia al entrar en la abertura. Un sistema puede ser operativo para secuenciar el ácido nucleico modificado. Un nanoporo comprendido en un sistema puede estar comprendido en una bicapa, una membrana, una película delgada o un orificio de estado sólido. En algunas realizaciones, el nanoporo se define además como una porina deMycobacterium smegmatis(Msp) o a-hemolisina o una variante de las mismas. Los sistemas pueden comprender además un amplificador de parche de membrana (“patch clamp”), parches de membrana ópticos, un dispositivo de adquisición de datos o uno o más dispositivos reguladores de temperatura en comunicación con el primer medio líquido, el segundo medio líquido o cualquier combinación de los mismos. Con respecto a los parches de membrana ópticos, la corriente puede traducirse a fluorescencia que puede leerse y correlacionarse de manera similar a la corriente.
[0021] Se pueden preparar sistemas para permitir lecturas paralelas en múltiples nanoporos, tales como miles o millones de nanoporos. En consecuencia, los componentes de cualquier sistema pueden duplicarse funcionalmente para multiplicar el rendimiento de secuenciación. Cualquier sistema también puede adaptarse con microfluidos o automatización.
[0022] En algunas realizaciones , los niveles de corriente de iones para unidades de un analito, aunque tienen que ser distintos entre sí, no tienen que ser conocidos a priori. Dado que los niveles de corriente pueden variar de un experimento a otro, primero se puede ejecutar una construcción de calibración. Por ejemplo, para la secuenciación de ADN, se ejecutaría un analito modificado de construcción que contenga los cuatro nucleótidos y, de manera opcional, nucleótidos no estándar (modificados), tales como C metilado (mC). Usando los procedimientos descritos en el presente documento, cada unidad del analito modificado genera un nivel de corriente único e identificativo (por ejemplo, la amplitud o características de cada nivel de corriente iónica es única para cada tipo de unidad de analito). Cada uno de dichos niveles de corriente se mantiene hasta que el analito modificado avanza una unidad. La secuencia del analito se mapea directamente en el registro de la corriente iónica.
[0023] En algunas realizaciones, un ácido nucleico bicatenario puede exponerse a una primera enzima que corta selectivamente en una posición de cada enésimo nucleótido de una cadena del ácido nucleico para exponer cada enésimo nucleótido de la otra cadena para afectar la corriente iónica. El ácido nucleico resultante puede considerarse un ácido nucleico modificado que tiene una pluralidad de dúplex, donde cada dúplex se considera una construcción de detención. Se puede provocar que un dúplex se detenga temporalmente al entrar en una abertura de un nanoporo para producir un nivel de corriente iónica, en el que cada nivel de corriente iónica representa un nucleótido expuesto. A continuación, se puede disociar un dúplex para proporcionar un ácido nucleico alterado, que, a continuación, puede avanzar a través de la abertura hasta que un siguiente dúplex detenga temporalmente el movimiento para permitir que se detecte otro nivel de corriente iónica que esté asociado con una siguiente unidad. A continuación, cada nivel de corriente iónica puede compararse con un nivel de corriente iónico conocido de un nucleótido conocido y una terminación bicatenaria conocida, secuenciando así cada enésimo nucleótido. Un segundo ácido nucleico bicatenario que es idéntico al primero puede exponerse a continuación a una segunda (o la misma) enzima que corta selectivamente una posición de cada enésimo nucleótido para exponer cada enésimo nucleótido, pero con una posición inicial diferente (enésimo+i, donde i es un desplazamiento constante). Puede ejecutarse el mismo procedimiento que el anterior para el segundo ácido nucleico. Este procedimiento se puede repetir con al menos n ácidos nucleicos mellados (y posiblemente n/2 ácidos nucleicos mellados ya que también se puede identificar el par de bases terminales) según sea necesario de manera que se secuencia cada nucleótido.
[0024] Un "analito" se refiere a una molécula que tiene una secuencia de dos o más unidades, donde cada unidad puede ser igual o diferente. Una unidad de un analito tiene un tamaño que puede translocarse a través de la abertura de un nanoporo, de modo que la unidad entre por un lado de la abertura y se mueva a través y salga por el otro lado. Normalmente, un analito es soluble o parcialmente soluble en al menos un medio líquido conductor que está en contacto con un nanoporo. Los ejemplos no limitantes incluyen ácidos nucleicos, péptidos y proteínas, así como una variedad de polímeros de hidrocarburos (por ejemplo, polietileno, poliestireno) y polímeros de hidrocarburos funcionalizados, en los que la cadena principal del polímero comprende una cadena de carbonos (por ejemplo, cloruro de polivinilo, polimetacrilatos). Una unidad puede ser un resto unitario (por ejemplo, un único nucleótido, T) o pueden ser restos múltiples que se repiten o varían (por ejemplo, un trinucleótido TTT o un trinucleótido TGC). En algunas realizaciones, un analito es un ácido nucleico que tiene unidades que varían de 1 a 1.000.000 nucleótidos de longitud. Los analitos también incluyen polímeros, tales como copolímeros, copolímeros de bloque y polímeros ramificados, tales como polímeros en estrella y dendrímeros. Los analitos pueden comprender nanopartículas. En las realizaciones del presente documento se puede emplear una mezcla de analitos. Un analito puede modificarse mediante una construcción de detención para producir un "analito modificado", que se describe a continuación. Un analito modificado puede alterarse, tal como se describe en el presente documento.
[0025] Una "construcción de detención" es una entidad utilizada para modificar un analito de modo que el analito modificado ya no pase a través de la abertura de un nanoporo. Debido a una o más propiedades de la construcción de detención (por ejemplo, orientación, tamaño o carga), la construcción de detención provoca que el analito modificado se detenga temporalmente en la abertura de un nanoporo durante la translocación. Las construcciones de detención pueden insertarse entre una o más unidades de un analito ("construcción de detención de inserción") o pueden usarse para modificar las propias unidades ("construcción de detención colgante"). Por tanto, la construcción de detención puede ubicarse adyacente a la unidad a secuenciar, o puede cubrir (es decir, enmascarar) la unidad, tal como se describe a continuación. Una construcción de detención también puede reemplazar una unidad, donde la construcción de detención se correlaciona con la unidad. Las construcciones de detención pueden ser moléculas individuales o combinaciones de moléculas (por ejemplo, ADN dúplex). Una construcción de detención puede ser una proteína. Una construcción de detención puede comprender una nanopartícula. Tal como se usa en el presente documento, una "nanopartícula" se refiere a una partícula que tiene una o más dimensiones del orden de 100 nm o menos. A continuación, se describen construcciones de detención adicionales.
[0026] La construcción de detención también se puede alterar, o alterar la abertura de un nanoporo, o ambas cosas, de modo que la translocación continúe haciendo avanzar el analito modificado una unidad. La alteración puede tener lugar por diversos medios. En algunas realizaciones, la alteración se induce mediante la aplicación de un estímulo, tal como voltaje (por ejemplo, pulsos de voltaje o rampas de voltaje), irradiación (por ejemplo, pulsos de luz), cambios en la temperatura (por ejemplo, pulsos de temperatura) o movimiento físico (por ejemplo, ultrasonido, uso de perlas magnéticas para generar un pulso de fuerza). En algunas realizaciones, la alteración implica la disociación de parte o de la totalidad de la construcción de detención, tal como la disociación de una cadena de un ácido nucleico bicatenario. La alteración puede implicar un cambio conformacional, tal como un cambio de forma u orientación. Un cambio conformacional puede implicar una inversión quiral. Como ejemplo de un cambio conformacional, una construcción de detención puede ser una proteína que cambia de forma tras la aplicación de un estímulo. La alteración puede implicar un cambio en la orientación, tal como un cambio de orientación causado por la irradiación de la construcción de detención. Una construcción de detención puede provocar que cambie la forma o la carga de la abertura de un nanoporo. Por el contrario, la fuerza proporcionada por la abertura de un nanoporo puede provocar la alteración de una construcción de detención, tal como un cambio de tamaño. Una construcción de detención también puede implicar cualquier combinación de estos aspectos (por ejemplo, la construcción de detención puede cambiar de forma al igual que cambia la forma de la abertura; la fuerza proporcionada por la abertura de un nanoporo puede provocar un cambio en la forma y orientación de una construcción de detención).
[0027] Las construcciones de detención de inserción están ubicadas adyacentes a una unidad y consisten en restos emparejados que pueden disociarse entre sí o alterarse de otro modo. La construcción de detención de inserción provoca que el analito modificado se detenga temporalmente en la abertura, permitiendo así detectar un nivel de corriente iónica que está asociado con la unidad adyacente. Después de que se ha detectado el nivel de corriente iónica, la alteración de la construcción de detención de inserción provoca un cambio (por ejemplo, uno de los pares se disocia) de modo que el resto del analito modificado puede avanzar hacia el ladotrans.La alteración de una siguiente construcción de detención permite la generación de un siguiente nivel de corriente iónica que puede detectarse, y así sucesivamente.
[0028] Las construcciones de detención de inserción pueden consistir en pares de unión que pueden disociarse. Los pares de unión tienen afinidad entre sí. Los ejemplos no limitantes de construcciones de detención de inserción que son pares de unión incluyen ácidos nucleicos, tales como ácidos nucleicos dúplex (por ejemplo, ADN dúplex) que pueden insertarse entre unidades de un analito, tales como unidades de nucleótidos, para producir un analito modificado. El ácido nucleico dúplex puede provocar que el analito modificado se detenga tempralmente en una abertura de un nanoporo debido al tamaño del dúplex, tras lo cual la disociación provoca que una cadena del dúplex se disocie de manera que el resto del analito modificado pueda avanzar hacia el ladotrans.El ácido nucleico dúplex puede contener, en algunas realizaciones, de 1 a 100 pares de bases. Una construcción de detención de inserción puede tener aproximadamente la misma longitud que un ácido nucleico dúplex de 1 a 100 pares de bases. Otros pares de unión conocidos que pueden emplearse incluyen proteínas de unión a ADN monocatenario, ARN, PNA y combinaciones de ARN, PNA y ADN. En algunas realizaciones, uno o más nucleótidos forman una construcción de detención de inserción. Por ejemplo, se pueden insertar uno o más nucleótidos entre unidades de un analito para proporcionar un analito modificado, y los nucleótidos libres comprendidos en un medio líquido en contacto con el analito modificado pueden unirse a los nucleótidosin situy a continuación disociarse más tarde.
[0029] En algunas realizaciones, se pueden emplear elastómeros dieléctricos, materiales fotomecánicos o polímeros sensibles a la temperatura como construcciones de detención de inserción. Estas clases son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n° 7.625.764, y J Mech Physics Solids 57:1103 (2009).
[0030] Además de los pares de unión, también se pueden emplear moléculas unidas mediante enlaces fotolíticos de modo que la irradiación fotoescinda una molécula de la otra. Dichos enlaces fotolíticos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes incluyen psoralenos y derivados, colorantes fotoescindibles utilizados en estrategias de secuenciación de ADN, el compuesto químico éster 1-(4,5-dimetoxi-2-nitro-fenil)etílico (Photochem Photobio 81:953 (2005)), y aminoácidos fotorreactivos, tales como la L-fotoleucina.
[0031] Otras construcciones de detención de inserción incluyen péptidos, proteínas, nanopartículas y polielectrolitos (por ejemplo, sulfato de dextrano y poli(ácido acrílico)).
[0032] Las construcciones de detención colgantes cubren unidades y consisten en restos colgantes que pueden modificarse como se describe anteriormente. Las construcciones de detención colgantes normalmente modifican unidades consecutivas. Una construcción de detención colgante provoca que el analito modificado se detenga temperalmente en la abertura de un nanoporo. Después de la alteración de la construcción de detención colgante, la unidad previamente cubierta por la construcción de detención colgante queda expuesta. Debido a que otra construcción de detención colgante está ubicada adyacente a la unidad ahora expuesta, la unidad ahora expuesta se detiene temporalmente en la abertura de manera que se pueda detectar un nivel de corriente iónica. La alteración de una siguiente construcción de detención colgante permite la generación de un siguiente nivel de corriente iónica que puede detectarse, y así sucesivamente.
[0033] Los ejemplos no limitantes de construcciones de detención colgantes incluyen los mismos ejemplos y clases de construcciones que las construcciones de detención de inserción descritas anteriormente. Por ejemplo, una construcción de detención colgante puede, junto con una unidad de un analito, formar un par de unión. Una construcción de detención colgante puede, junto con una unidad de un analito, constituir elastómeros dieléctricos, materiales fotomecánicos o polímeros sensibles a la temperatura. Una construcción de detención colgante se puede unir a la unidad mediante un enlace fotolítico. Una construcción de detención colgante puede comprender un péptido, proteína, nanopartícula o polielectrolito. En algunas realizaciones, un nucleótido es una construcción de detención colgante. Por ejemplo, los nucleótidos libres comprendidos en un medio líquido en contacto con el analito pueden unirse a una unidad de nucleótidos in situ y a continuación disociarse.
[0034] Un analito modificado con una construcción de detención proporciona un "analito modificado". Un analito modificado no procede con la translocación a través de una abertura de un nanoporo debido a una propiedad de la construcción de detención (por ejemplo, orientación, tamaño o carga) a menos que se altere el analito modificado. Aunque un analito modificado normalmente comprenderá construcciones de detención de inserción o construcciones de detención colgantes, un analito modificado también puede comprender ambos tipos. Cada construcción de detención de inserción puede ser igual o diferente dentro del mismo analito modificado. Cada construcción de detención colgante puede ser igual o diferente dentro del mismo analito modificado.
[0035] Los analitos modificados se pueden obtener de diversas formas, incluida la obtención de un analito y la solicitud a una entidad comercial para preparar el analito modificado. Los esquemas de modificación del ADN se desarrollaron inicialmente con la esperanza de secuenciar el ADN que se transloca libremente y que se expande en muchos nucleótidos del mismo tipo para producir firmas de corriente suficientemente largas. Esta modificación normalmente se logra mediante la aplicación cíclica de enzimas de ligadura y restricción de ADN. Melleret al.postularon una estrategia de secuenciación mediante nanoporos ópticos en la que cada nucleótido se convierte en un código binario específico formado por dos oligos de 12 unidades utilizando dicho esquema de modificación del ADN ("New High Throughput Technologies for DNA Sequencing and Genomics", ed. K. Mitchelson (Elsevier, Oxford, Reino Unido), págs. 245-264.;Clin Chem 53:1996 (2007);Nano Lett. 10:2237 (2010)). Un proceso automatizado y masivamente paralelo (ver la Patente de Estados Unidos n° 6,723,513 y WO 2006/092582) requiere ~24 horas para la conversión de un genoma humano completo en una mezcla de<a>D<n>que consiste en fragmentos, cada uno de los cuales corresponde a un segmento de 24 pb del genoma original (Nat Biotechnol 26:1146 (2008)). Por ejemplo, LingVitae Corp. (Oslo, Noruega) puede preparar ácidos nucleicos modificados que tienen construcciones de detención de inserción que son ácidos nucleicos dúplex de su elección. La conversión de ADN requerida para la secuenciación DI es menos exigente porque cada ADN insertado podría ser idéntico e independiente de los nucleótidos del analito. En comparación con los procedimientos de secuenciación propuestos anteriormente que implican ADN convertido, la secuenciación DI no requiere hardware adicional, tal como detección de fluorescencia o conversión a códigos binarios. Actualmente se está trabajando para desarrollar una conversión económica y de bajo error de segmentos largos del genoma original con un tiempo de conversión reducido (Nano Lett 10:2237 (2010))). Se puede lograr una mayor reducción del coste y la velocidad de conversión mediante una paralelización masiva, comparable a las tecnologías de secuenciación por ligadura que dependen de reacciones de ligadura.
[0036] Un enlazador puede unir una construcción de detención a un analito para proporcionar un analito modificado. Generalmente, un enlazador es una molécula divalente que no tiene otra actividad específica que la de unir una construcción de detención a un analito o conservar una distancia mínima u otra relación espacial entre dichas especies. Sin embargo, se puede seleccionar un enlazador para influir en alguna propiedad de las especies enlazadas, tal como la conformación tridimensional, la carga neta o la hidrofobicidad. Los enlazadores adecuados se conocen en la técnica e incluyen enlazadores que forman enlaces entre una construcción de detención y el analito seleccionado entre enlaces covalentes (por ejemplo, enlaces disulfuro o carbono-carbono), enlaces de hidrógeno (por ejemplo, emparejamiento de bases de Watson-Crick o Hoogstein), enlaces iónicos u otros enlaces inducidos electrostáticamente.
[0037] Un "nanoporo" se refiere a un poro que tiene una abertura con un diámetro en su punto más estrecho de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 2 nm. Por ejemplo, un nanoporo puede ser un nanoporo de estado sólido, un nanoporo de grafeno, un nanoporo de elastómero, o puede ser una proteína de origen natural o recombinante que forma un túnel al insertarse en una membrana de película delgada bicapa (por ejemplo, una membrana descrita en el presente documento), o abertura de estado sólido, también denominada en el presente documento poro de proteína o nanoporo de proteína (por ejemplo, un poro transmembrana). Si la proteína se inserta en la membrana, entonces es una proteína formadora de túneles. Los procedimientos para determinar si una proteína es una proteína formadora de túneles son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar si una porina Msp forma un túnel determinando si la proteína se inserta en una bicapa, tal como se describe en la Solicitud PCT, WO 2010/034018, y Proc Natl Acad Sci 105:20647 (2008)). Normalmente, la formación de túneles se detecta observando un cambio discreto en la conductividad. Ver, por ejemplo, Mol Microbiol 33:933 (1999)). Una abertura suele estar en comunicación líquida o gaseosa con los ladoscisytransde la membrana o nanoporo. Un nanoporo puede comprender un material en estado sólido, tal como nitruro de silicio, nitruro de silicio modificado, silicio, óxido de silicio o grafeno, o una combinación de los mismos (por ejemplo, se puede preparar un nanoporo fabricando primero una abertura de SiN, poniendo una lámina de grafeno encima y a continuación fabricando un nanoporo en el grafeno). Los ejemplos no limitantes de nanoporos de proteínas incluyen a-hemolisina y variantes de la misma (definida a continuación), una porina deMycobacterium smegmatis(Msp) (definida a continuación) u OmpATb. "La alteración que permite que el analito modificado avance hacia el ladotrans":esta frase se refiere al acto de alteración de una construcción de detención de un analito modificado que permite que el analito modificado avance hacia el ladotransde modo que (a) todo el resto del analito modificado puede translocarse a través de la abertura si ninguna construcción de detención adicional detiene temporalmente la translocación, o (b) otra construcción de detención encuentra la abertura y se provoca que se altere, permitiendo así que otra unidad del analito modificado genere un nivel de corriente iónica.
[0038] A medida que un analito modificado interactúa con una abertura de un nanoporo, la corriente a través de la abertura cambia. Cuando una construcción de detención impide temporalmente que una unidad del analito modificado se transloque a través de la abertura, se produce un nivel de corriente iónica. Es decir, los niveles de corriente iónica están correlacionados o representan unidades de un analito. Para un analito de ADN con construcciones de detención de ADN dúplex, analizado con M1-NNN-MspA, el análisis simple como se describe en este documento reveló que los niveles de corriente promedio separados por 2 pA y que duraban más de 1,5 ms podrían identificar unidades de una secuencia de ADN del analito. Los expertos en la técnica son capaces de establecer niveles de corriente iónica de otras unidades de analito. Los niveles de corriente iónica suelen ser una corriente iónica promedio. En algunas realizaciones, la amplitud de la corriente iónica a través del poro se puede convertir en un sistema óptico fluorescente como es bien conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, J Amer Chem Soc 13:1652 (2009)).
[0039] Cuando una construcción de detención detiene temporalmente un analito modificado para permitir que el nivel de corriente iónica determine la identidad de una unidad y otra construcción de detención detiene temporalmente el analito modificado para producir un nivel de corriente iónica que difiere de cualquier nivel de corriente iónica específica de la unidad, este último nivel de corriente iónica se define como nivel separador. Un nivel separador puede distinguir unidades secuenciales del analito. Un nivel separador distingue unidades secuenciales y repetidas del analito. Se puede diseñar un nivel separador para producir un nivel de corriente iónica diferente para proporcionar una suma de control. De manera opcional, se utilizan al menos dos niveles separadores para proporcionar un código binario para representar unidades del analito. De manera opcional, se utiliza al menos un nivel separador para proporcionar esencialmente un bit de paridad.
[0040] Una cola de iniciación de translocación es cualquier polímero cargado lineal que se puede agregar a un analito modificado para iniciar la translocación a través de la abertura de un nanoporo. Por tanto, la cola debe tener un diámetro menor que la abertura. La cola puede estar situada en cualquier extremo de un analito modificado o en ambos extremos. Ejemplos no limitantes de colas incluyen polinucleótidos, tales como ADN monocatenario. Otras colas incluyen ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN o<a>R<n>) de residuos heteropoliméricos, homopoliméricos, a-básicos y/o básicos. En algunas realizaciones, la cola es poliadenina, tal como poli-dAm, en la que m oscila de 1 a 100 [SEQ ID NO: 53]. Una cola puede comprender poli(ácido acrílico). Otros poli(ácidos) pueden incluir grupos ácidos-COOH , -SO<3>H o -PO<3>H<2>. Las colas también pueden incluir poli-L lisina cargada u otros aminoácidos cargados.
[0041] Los reactivos de unión de dúplex sirven para mejorar la formación de un ácido nucleico dúplex. Dichos reactivos aumentan la frecuencia de generación de dúplex exitosos que, cuando se utilizan dúplex como construcciones de detención, pueden mejorar la sensibilidad de secuenciación. Los ejemplos no limitantes incluyen cationes divalentes tales como Mg2+, proteínas y productos químicos de unión a surcos de ADN mayores y menores, reactivos de reticulación de ADN entre cadenas e intercaladores de ADN.
[0042] Un " medio líquido" incluye medios líquidos acuosos, orgánico-acuosos y sólo orgánicos. Los medios orgánicos incluyen, por ejemplo, metanol, etanol, dimetilsulfóxido y mezclas de los mismos. Los líquidos empleables en los procedimientos descritos en el presente documento son bien conocidos en la técnica. Las descripciones y ejemplos de dichos medios, incluidos los medios líquidos conductores, se proporcionan en la Patente de Estados Unidos n° 7,189,503, por ejemplo. A dichos medios se les pueden añadir sales, detergentes o tampones. Tales agentes pueden emplearse para alterar el pH o la fuerza iónica del medio líquido. En los medios líquidos se pueden incluir sustancias que alteran la viscosidad, tales como glicerol o diversos polímeros (por ejemplo, polivinilpirrolidona, polietilenglicol, alcohol polivinílico, polímeros de celulosa) y mezclas de los mismos. Los procedimientos para medir la viscosidad son bien conocidos en la técnica. Cualquier agente que pueda agregarse a un medio líquido también puede cambiar la velocidad del analito modificado que se está estudiando. Por tanto, un agente que altera la velocidad puede ser una sal, un detergente, un tampón, una sustancia que altera la viscosidad o cualquier otro agente agregado a un medio líquido que aumenta o disminuye la velocidad de un analito o analito modificado.
[0043] El primer y segundo medio líquido empleados en cualquier realización pueden ser iguales o diferentes, y uno o ambos pueden comprender uno o más de una sal, un detergente o un tampón. De hecho, cualquier medio líquido descrito en el presente documento puede comprender uno o más de una sal, un detergente o un tampón. De manera opcional, al menos un medio líquido es conductor. De manera opcional, al menos un medio líquido no es conductor. Los medios líquidos pueden comprender cualquier analito descrito en el presente documento.
[0044] Tal como se usa en el presente documento, un "aminoácido" se refiere a cualquiera de los 20 aminoácidos naturales que se encuentran en proteínas, D-estereoisómeros de los aminoácidos naturales (por ejemplo, D-treonina), aminoácidos no naturales y aminoácidos químicamente modificados. Cada uno de estos tipos de aminoácidos no es mutuamente excluyente. Los a-aminoácidos comprenden un átomo de carbono al que está unido un grupo amino, un grupo carboxilo, un átomo de hidrógeno y un grupo distintivo denominado "cadena lateral". Las cadenas laterales de aminoácidos naturales son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, hidrógeno (por ejemplo, como en glicina), alquilo (por ejemplo, como en alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina), alquilo sustituido (por ejemplo, como en treonina, serina, metionina, cisteína, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, arginina y lisina), arilalquilo (por ejemplo, como en fenilalanina y triptófano), arilalquilo sustituido (por ejemplo, como en tirosina) y heteroarilalquilo. (por ejemplo, como en la histidina).
[0045] Se utilizan las siguientes abreviaturas para los 20 aminoácidos naturales: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).
[0046] Los aminoácidos no naturales (es decir, aquellos que no se encuentran de forma natural en las proteínas) también se conocen en la técnica, tal como se establece, por ejemplo, en Mol Cell Biol 9:2574 (1989)); J Amer Chem Soc 112:4011-4030 (1990); J Amer Chem Soc 56:1280-1283 (1991)); J Amer Chem Soc 113:9276-9286 (1991)); y todas las referencias citadas en los mismos. Los aminoácidos p y y son conocidos en la técnica y también se contemplan en el presente documento como aminoácidos no naturales. La siguiente tabla muestra ejemplos no limitantes de aminoácidos no naturales que se contemplan en el presente documento.
T l 1. Amin i n n r l m l
[0047] Tal como se usa en el presente documento, un "aminoácido modificado químicamente " se refiere a un aminoácido cuya cadena lateral ha sido modificada químicamente. Por ejemplo, se puede modificar una cadena lateral para que comprenda un resto de señalización, tal como un fluoróforo o un radiomarcador. Una cadena lateral puede modificarse para comprender un nuevo grupo funcional, tal como un grupo tiol, ácido carboxílico o amino. Los aminoácidos modificados postraduccionalmente también se incluyen en la definición de aminoácidos modificados químicamente.
[0048] Los aminoácidos y, más específicamente, sus cadenas laterales, pueden caracterizarse por su característica o características químicas. Por ejemplo, las cadenas laterales de aminoácidos pueden tener carga positiva, carga negativa o neutras. El pH de una solución afecta la naturaleza cargada de ciertas cadenas laterales, tal como saben los expertos en la técnica. Ejemplos no limitantes de cadenas laterales que pueden estar cargadas positivamente incluyen histidina, arginina y lisina. Ejemplos no limitantes de cadenas laterales que pueden estar cargadas negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Los ejemplos no limitantes de cadenas laterales que pueden caracterizarse como neutras incluyen glicina, alanina, fenilalanina, valina, leucina, isoleucina, cisteína, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, metionina, prolina y triptófano.
[0049] También se pueden usar cadenas laterales estéricas para caracterizar un aminoácido. Las tablas de diámetros de átomos pueden ayudar a determinar si una cadena lateral es más grande que otra. Los modelos informáticos también pueden ayudar con esta determinación.
[0050] Los aminoácidos pueden caracterizarse por la polaridad de sus cadenas laterales. Las cadenas laterales polares, que normalmente son más hidrófilas que las cadenas laterales no polares, incluyen, por ejemplo, las de serina, treonina, tirosina, cisteína, asparagina y glutamina. Las cadenas laterales no polares, que normalmente son más hidrófobas que las cadenas laterales polares, incluyen, por ejemplo, las de glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, metionina, fenilalanina y triptófano. Se puede determinar la polaridad de una cadena lateral usando técnicas convencionales conocidas en la técnica que implican determinaciones de electronegatividad atómica y evaluaciones estructurales tridimensionales de cadenas laterales. También se pueden comparar hidrofobicidades/hidrofilicidades de cadenas laterales usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como comparar el coeficiente de partición octanol/agua de cada aminoácido. Véase Sangster, en: "Octanol-Water Partition Coefficient: Fundamentals and Physical Chemistry", Wiley Series in Solution Chemistry, Chichester: John Wiley & Sons Ltd., 2:178 (1997).
[0051] Tal como se utiliza en el presente documento, un "péptido" se refiere a dos o más aminoácidos unidos entre sí por un enlace amida (es decir, un "enlace peptídico"). Los péptidos comprenden hasta o incluyen 50 aminoácidos. Los péptidos pueden ser lineales o cíclicos. Los péptidos pueden ser a, p, y, 8 o superiores, o mixtos. Los péptidos pueden comprender cualquier mezcla de aminoácidos, tal como se definen en el presente documento, tal como, que comprende cualquier combinación de D, L, a, p, y, 8 aminoácidos o aminoácidos superiores.
[0052] Tal como se utiliza en el presente documento, una "proteína" se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene 5 l o más aminoácidos.
[0053] El término "ácido nucleico" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma monocatenaria o bicatenaria y, a menos que se limite de otra manera, abarca análogos conocidos de nucleótidos naturales que se hibridan a ácidos nucleicos de manera similar a los nucleótidos naturales, tales como ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y ADN fosforotioato. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular incluye la secuencia complementaria de la misma. Los nucleótidos incluyen, pero sin limitación, ATP, dATP, CTP, dCTP, GTP, dGTP, UTP, TTP, dUTP, 5-metil-CTP, 5-metil-dCTP, ITP, dITP, 2-amino-adenosina-TP, 2-aminodesoxiadenosina-TP, 2-tiotimidina trifosfato, pirrolo-pirimidina trifosfato y 2-tiocitidina, así como los alfa-tiotrifosfatos para todos los anteriores, y 2'-O-metil-ribonucleótido trifosfatos para todas las bases anteriores. Las bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, 5-Br-UTP, 5-Br-dUTP, 5-F-UTP, 5-F-dUTP, 5-propinil dCTP y 5-propinil-dUTP.
[0054] Los "motores moleculares" son bien conocidos en la técnica y se refieren a una molécula (por ejemplo, una enzima) que interactúa físicamente con un analito, tal como un polímero (por ejemplo, un polinucleótido), y es capaz de mover físicamente el analito con respecto a una ubicación fija, tal como la abertura de un nanoporo (por ejemplo, un túnel de una porina Msp). Aunque no pretenden ceñirse a la teoría, los motores moleculares utilizan energía química para generar fuerza mecánica. En algunas realizaciones, un motor molecular puede interactuar con cada unidad (o "mer") de un polímero de manera secuencial. Los ejemplos no limitantes de motores moleculares incluyen ADN polimerasas, ARN polimerasas, helicasas, ribosomas y exonucleasas. También se conocen motores no enzimáticos, tales como motores de virus que empaquetan ADN. Véase Nature 413: 748 (2001). Una variedad de motores moleculares y propiedades deseables de dichos motores se describen en la patente de Estados Unidos No. 7,238,485.
[0055] Un motor molecular puede estar dispuesto en el ladociso el ladotransde una membrana y, de manera opcional, se puede inmovilizar, tal como se ha descrito por la patente '485. Los procedimientos para incorporar un motor molecular en un nanoporo se pueden realizar usando, por ejemplo, los procedimientos descritos en la patente '485. Los sistemas y aparatos descritos en la patente '485 pueden emplearse con respecto a una membrana que comprende un nanoporo descrito en el presente documento también. Los motores moleculares también se describen en, por ejemplo, J Amer Chem Soc 130: 818 (2008); Nature Nanotech 2: 718 (2007); y ACS Nano 3: 1457 (2009). Los motores moleculares, como se describen en el documento WO 2010/034018 también se pueden emplear en el contexto de los nanoporos y membranas descritos en el presente documento.
[0056] Las microesferas que se pueden emplear incluyen microesferas magnéticas. Por ejemplo, se pueden usar microesferas magnéticas recubiertas de estreptavidina para aplicar una fuerza opuesta a las fuerzas electrostáticas que tiran de un analito modificado a través de la abertura de un nanoporo. Por ejemplo, se une una microesfera magnética al ADN biotinilado y se aplica una fuerza comparable a la fuerza impulsora electrostática (~10 pN) utilizando un fuerte gradiente de campo magnético. Véase Biophys J 82: 3314 (2002). De esta manera, la lectura de la corriente de bloqueo no se vería afectada, pero las fuerzas en el ADN podrían controlarse de forma independiente. A continuación, decenas o cientos de lecturas completas e independientes de cada ADN podrían correlacionarse y ensamblarse para reconstruir una secuencia precisa de ADN. En algunas realizaciones, la microesfera magnética no pasa a través del poro, pero se puede usar una vez que una cola de iniciación de translocación ha atravesado el poro.
[0057] Tal como se usa en el presente documento,"cis"se refiere al lado de una abertura de nanoporo a través de la cual un analito o analito modificado entra en la abertura o a través de cuya cara se mueve el analito o analito modificado.
[0058] Tal como se usa en el presente documento,"trans"se refiere al lado de una abertura de nanoporo a través de la cual un analito o analito modificado (o fragmentos del mismo) sale de la abertura o a través de cuya cara el analito o analito modificado no se mueve.
[0059] Tal como se usa en el presente documento, "translocación" y variantes gramaticales significa entrar en un lado de una abertura de un nanoporo y moverse hacia y fuera del otro lado de la abertura. Se contempla específicamente que cualquier realización en el presente documento que comprenda translocación puede referirse a translocación electroforética o translocación no electroforética, a menos que se indique específicamente. Un campo eléctrico puede mover un analito o un analito modificado. Por "interactúa", se entiende que el analito o analito modificado se mueve dentro y, de manera opcional, a través de la abertura, donde "a través de la abertura" (o "se transloca") significa entrar en un lado de la abertura y moverse hacia y fuera del otro lado de la abertura. De manera opcional, se contemplan procedimientos que no emplean translocación electroforética. En algunas realizaciones, la presión física provoca que un analito modificado interactúe con, entre o se transloque (después de la alteración) a través de la abertura. En algunas realizaciones, se une una perla magnética a un analito o analito modificado en el ladotrans,y la fuerza magnética provoca que el analito modificado interactúe con, entre o se transloque (después de la alteración) a través de la abertura.
[0060] Una "porina deMycobacterium smegmatis(Msp)" o "porina Msp" se refiere a un complejo multímero compuesto de dos o más monómeros de Msp. Un monómero de Msp es codificado por un gen deMycobacterium smegmatis. Mycobacterium smegmatistiene cuatro genes Msp identificados, denominados MspA, MspB, MspC y MspD. Una porina Msp puede estar compuesta, por ejemplo, por monómeros de MspA de tipo salvaje, monómeros de MspA mutantes, monómeros homólogos o parálogos de MspA de tipo salvaje, o monómeros homólogos o parálogos de MspA mutantes. De manera opcional, una porina Msp es una porina Msp monocatenaria o es un multímero de varias porinas Msp monocatenarias. Una porina Msp monocatenaria puede comprender, por ejemplo, un multímero formado por dos o más monómeros Msp (por ejemplo, ocho monómeros) conectados por uno o más péptidos enlazadores de aminoácidos. Una porina Msp monocatenaria parcial se refiere a un complejo multímero monocatenario que debe dimerizarse, trimerizarse o similar para formar una porina. Una porina Msp monocatenaria completa se refiere a un complejo multímero monocatenario que forma una porina sin necesidad de dimerizar, trimerizar o similares para formar una porina. Las porinas Msp son conocidas en la técnica al igual que los procedimientos para producir porinas Msp mutantes. La solicitud internacional WO2010/034018 describe muchas de estas porinas y procedimientos para producir estas porinas.
[0061] Un "vestíbulo" se refiere a la parte en forma de cono del interior de una porina Msp cuyo diámetro disminuye generalmente desde un extremo al otro a lo largo de un eje central, donde la parte más estrecha del vestíbulo está conectada a la zona de constricción. Un vestíbulo también puede denominarse "copa". Véase la FIGURA 1 del documento WO 2010/034018 para ver un ejemplo del vestíbulo de una porina MspA de tipo salvaje. El vestíbulo y la zona de constricción juntos definen el túnel de una porina Msp.
[0062] Cuando se hace referencia a un diámetro del vestíbulo de una porina Msp, se entiende que debido a que el vestíbulo tiene forma de cono, el diámetro cambia a lo largo de la trayectoria de un eje central, en el que el diámetro es mayor en un extremo que en el extremo opuesto. El diámetro puede oscilar de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 6 nm. De manera opcional, el diámetro es de aproximadamente, al menos aproximadamente, o como máximo aproximadamente 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4.0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0 nm, o cualquier intervalo derivable en el mismo. La longitud del eje central puede oscilar de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 6 nm. De manera opcional, la longitud es de aproximadamente, al menos aproximadamente o como máximo aproximadamente 2, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0 nm, o cualquier intervalo derivable en el mismo. Cuando se hace referencia en el presente documento a "diámetro", se puede determinar un diámetro midiendo distancias de centro a centro o distancias atómicas de superficie a superficie.
[0063] Una "zona de constricción" se refiere a la parte más estrecha del túnel de una porina Msp, en términos de diámetro, que está conectada al vestíbulo. La zona de constricción de una porina MspA de tipo salvaje se muestra en la Figura 1 del documento WO 2010/034018 (marcado como "constricción interior'). La longitud de la zona de constricción puede oscilar de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 2 nm. De manera opcional, la longitud es de aproximadamente, como máximo aproximadamente, o al menos aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1.0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, o 3 nm, o cualquier intervalo derivable en el mismo. El diámetro de la zona de constricción puede variar de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 2 nm. De manera opcional, el diámetro es de aproximadamente, como máximo aproximadamente o al menos aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, o 3 nm, o cualquier intervalo derivable en el mismo.
[0064] Una "zona de constricción neutra" se refiere a una zona de constricción que comprende cadenas laterales de aminoácidos que acumulativamente no presentan carga eléctrica neta cuando se sumergen en una solución acuosa. El pH del medio líquido (por ejemplo, una solución acuosa tamponada) en contacto con la zona de constricción puede afectar si la zona de constricción se caracteriza como neutra o no.
[0065] Un "túnel" se refiere a la parte central vacía de una porina Msp que está definida por el vestíbulo y la zona de constricción, a través de la cual puede pasar un gas, líquido, ion o analito. Un túnel es un ejemplo de abertura de un nanoporo.
[0066] Una "porina MspA mutante" es un complejo multímero que tiene al menos o como máximo un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento o más de identidad, o cualquier intervalo derivable en el mismo, pero menos de 100 %, a su correspondiente porina MspA de tipo salvaje y conserva la capacidad de formación de túneles. Una porina MspA mutante puede ser una proteína recombinante. De manera opcional, una porina MspA mutante es aquella que tiene una mutación en la zona de constricción o el vestíbulo de una porina MspA de tipo salvaje. De manera opcional, puede aparecer una mutación en el borde o el exterior de los bucles periplásmicos de una porina MspA de tipo salvaje. Se puede emplear una porina MspA mutante en cualquier realización descrita en el presente documento.
[0067] Con respecto a la porina MspA en particular, de manera opcional, la porina MspA es un octámero que consiste en ocho monómeros de MspA de 184 aminoácidos. Pueden tener lugar una o más mutaciones en uno o más de los monómeros de aminoácidos MspA de una porina MspA de tipo salvaje para producir una porina MspA mutante. Además, una porina MspA puede tener menos o más de ocho monómeros, uno o más de los cuales pueden comprender una mutación.
[0068] La porina MspA de tipo salvaje comprende un bucle periplásmico que consiste en trece aminoácidos y está directamente adyacente a la zona de constricción. Ver J. Biol. Chem. 284:10223 (2009). Las porinas Msp B, C y D de tipo salvaje también contienen un bucle periplásmico. Pueden aparecer una o más mutaciones en el bucle periplásmico de una porina Msp de tipo salvaje para generar una porina Msp mutante. Por ejemplo, pueden producirse deleciones de hasta los trece aminoácidos en el bucle periplásmico de la porina MspA de tipo salvaje. Normalmente, las deleciones en el bucle periplásmico no afectan la capacidad de formación de túneles de una porina Msp.
[0069] Una porina Msp o un monómero de Msp también puede modificarse química o biológicamente. Por ejemplo, se puede modificar una porina Msp o un monómero de Msp con productos químicos para producir puentes disulfuro, tal como saben los expertos en la técnica.
[0070] Una porina Msp puede comprender un sitio de unión de nucleótidos. Tal como se usa en el presente documento, un "sitio de unión de nucleótidos" se refiere a un sitio en una porina Msp donde un nucleótido permanece en contacto con, o reside en, un aminoácido durante un período de tiempo que es más largo que el atribuible al movimiento de difusión, tal como mayor de un picosegundo o un nanosegundo. Se pueden emplear cálculos de dinámica molecular para evaluar estos tiempos de descanso temporales.
[0071] Pueden producirse una o más mutaciones en una porina Msp en el vestíbulo o en la zona de constricción de la proteína. De manera opcional, una porina Msp mutante tiene al menos una diferencia en su secuencia de aminoácidos del bucle periplásmico, vestíbulo o zona de constricción (por ejemplo, deleción, sustitución, adición) en comparación con la porina Msp de tipo salvaje. En el presente documento se describen mutaciones opcionales.
[0072] La porina Msp de cualquier realización en el presente documento puede ser cualquier porina Msp descrita en el presente documento, tal como una porina MspA de tipo salvaje, una porina MspA mutante, una porina paráloga o homóloga de MspA de tipo salvaje, o una porina paráloga o homóloga de MspA mutante. La porina Msp puede estar codificada por una secuencia de ácido nucleico que codifica una porina Msp monocatenaria. Cualquier porina Msp aquí puede comprender cualquier monómero de Msp descrito en este documento, tal como un monómero de Msp mutante.
[0073] Los nutrientes pasan a través de porinas de tipo salvaje en micobacterias. Las porinas MspA de tipo salvaje, las porinas MspB de tipo salvaje, las porinas MspC de tipo salvaje y las porinas MspD de tipo salvaje son ejemplos de porinas formadoras de túneles de tipo salvaje. Una porina Msp puede definirse además como cualquier porina Msp descrita en el presente documento, incluidos parálogos, homólogos, mutantes y porinas monocatenarias.
[0074] En la Tabla 2 se proporcionan ejemplos de parálogos y homólogos de MspA de tipo salvaje. Se proporcionan parálogos de MspA de tipo salvaje, que incluyen MspB de tipo salvaje, MspC de tipo salvaje y MspD de tipo salvaje. Un "parálogo", tal como se define en el presente documento, es un gen de la misma especie bacteriana que tiene una estructura y función similares. Un "homólogo", tal como se define en el presente documento, es un gen de otra especie bacteriana que tiene una estructura y un origen evolutivo similares. A modo de ejemplo, se proporcionan homólogos de MspA de tipo salvaje, que incluyen MppA, PorM1, PorM2, PorM1 y Mmcs4296.
Tabla 2.
[0075] Solo se incluyeron proteínas con similitudes significativas de aminoácidos en toda la longitud de la proteína. Los datos se obtuvieron mediante el algoritmo PSI-Blast (matriz BLOSUM62) utilizando la base de datos NIH GenBank en la web ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi.
[0076] Una "porina paráloga u homóloga de MspA mutante" es un complejo multímero que tiene al menos o como máximo un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento o más de identidad, o cualquier intervalo derivable en los mismos, pero menos del 100%, con su correspondiente porina paráloga u homóloga de MspA de tipo salvaje y conserva la capacidad de formación de túneles. Una porina paráloga u homóloga de MspA mutante puede ser una proteína recombinante. De manera opcional, una porina paráloga u homóloga de MspA mutante es una que tiene una mutación en la zona de constricción o el vestíbulo de la porina paráloga u homóloga de MspA de tipo salvaje. De manera opcional, puede aparecer una mutación en el borde o el exterior de los bucles periplásmicos de una porina paráloga o homóloga de MspA de tipo salvaje. Cualquier porina paráloga u homóloga de MspA mutante se puede emplear en cualquier realización descrita en el presente documento, y puede comprender cualquier mutación descrita en el presente documento.
[0077] Una porina Msp puede comprender dos o más monómeros de Msp. Un "monómero de Msp" es un monómero de proteína que es un monómero de MspA de tipo salvaje, un monómero de MspA mutante, un monómero parálogo u homólogo de MspA de tipo salvaje, o un monómero parálogo u homólogo de MspA mutante, y retiene la capacidad de formación de túneles cuando se asocia con uno o más monómeros de Msp. Cualquier porina Msp descrita en el presente documento puede comprender uno o más de cualquier monómero de Msp tal como se describe en el presente documento. Cualquier porina Msp puede comprender, por ejemplo, de 2 a 15 monómeros Msp, donde cada monómero puede ser igual o diferente.
[0078] Un "monómero de MspA mutante" se refiere a un monómero de Msp que tiene al menos o como máximo un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento o más de identidad, o cualquier intervalo derivable en los mismos, pero menos del 100 %, con un monómero de MspA de tipo salvaje, y conserva la capacidad de formación de túneles cuando se asocia con uno o más monómeros de Msp. De manera opcional, un monómero de MspA mutante se define además como que comprende una mutación en esa parte de la secuencia que contribuye a la formación del vestíbulo o la zona de constricción de una porina formadora de túneles completamente formada. El monómero Msp mutante puede ser, por ejemplo, una proteína recombinante. Un monómero de MspA mutante puede comprender cualquier mutación descrita en el presente documento.
[0079] En cualquier realización del presente documento, un monómero de Msp puede ser un parálogo u homólogo de MspA de tipo salvaje, tal como MspA/Msmeg0965, MspB/Msmeg0520, MspC/Msmeg5483, MspD/Msmeg6057, MppA, PorM1, PorM2, PorM1, Mmcs4296, Mmcs4297, Mmcs3857, Mmcs4382, Mmcs4383, Mjls3843, Mjls3857, Mjls3931 Mjls4674, Mjls4675, Mjls4677, Map3123c, Mav3943, Mvan1836, Mvan4117, Mvan4839, 840, Mvan5016, Mvan5017, Mvan5768, MUL_2391, Mflv1734, Mflv1735, Mflv2295, Mflv1891, MCH4691c, MCH4689c , MCH4690c, MAB1080, MAB1081, MAB2800, RHA1 ro08561, RHA1 ro04074 y RHA1 ro03127.
[0080] Un "monómero parálogo u homólogo de MspA mutante" se refiere a un monómero parálogo u homólogo de MspA que tiene al menos o como máximo 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 por ciento o más de identidad, o cualquier intervalo derivable en los mismos, pero menos del 100%, con un monómero parálogo u homólogo de MspA de tipo salvaje, y conserva la capacidad de formación de túneles. De manera opcional, un monómero parálogo u homólogo de MspA mutante se define además como que comprende una mutación en esa parte de la secuencia que contribuye a la formación del vestíbulo y/o la zona de constricción de una porina formadora de túneles completamente formada. El monómero parálogo u homólogo de MspA mutante puede ser, por ejemplo, una proteína recombinante. De manera opcional se puede emplear cualquier monómero parálogo u homólogo de MspA mutante en cualquier realización del presente documento.
[0081] Una porina Msp se puede expresar como una combinación de dos o más monómeros de MspA de tipo salvaje, monómeros de MspA mutantes, monómeros homólogos o parálogos de MspA de tipo salvaje, o monómeros homólogos o parálogos de MspA mutantes. Por tanto, una porina Msp puede ser o comprender un dímero, un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un septámero, un octámero, un nonámero, etc. Por ejemplo, una porina Msp puede comprender una combinación monómeros de MspA de tipo salvaje y monómeros de MspB de tipo salvaje. Una porina Msp puede comprender de 1 a 15 monómeros, donde cada monómero es igual o diferente. De hecho, cualquier porina Msp descrita en el presente documento puede comprender al menos o como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 monómeros, o cualquier intervalo derivable en los mismos, donde cada monómero es igual o diferente. Por ejemplo, una porina Msp puede comprender uno o más monómeros de MspA mutantes que son iguales o diferentes. Como otro ejemplo, una porina Msp puede comprender al menos un monómero de MspA mutante y al menos un monómero parálogo u homólogo de MspA.
[0082] Tal como se definió anteriormente, una porina Msp monocatenaria comprende dos o más monómeros de Msp conectados por uno o más péptidos enlazadores de aminoácidos. Una porina Msp monocatenaria que comprende dos monómeros Msp, en la que los monómeros Msp están unidos mediante una secuencia enlazadora de aminoácidos, puede denominarse dímero de porina Msp monocatenaria. Una porina Msp monocatenaria que comprende ocho monómeros de Msp, en la que los monómeros de Msp están unidos mediante una secuencia enlazadora de aminoácidos, puede denominarse octámero de porina Msp monocatenaria. Una porina Msp monocatenaria puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más monómeros Msp, o cualquier intervalo derivable de los mismos, unidos por secuencias enlazadoras de aminoácidos. De manera opcional, una porina Msp de cadena sencilla puede comprender, por ejemplo, dos o más dímeros de porina Msp de cadena sencilla, dos o más trímeros de porina Msp de cadena sencilla, dos o más cuadrímeros de porina Msp de cadena sencilla, dos o más pentímeros de porina Msp de cadena sencilla, uno o más hexímeros de porina Msp de cadena sencilla, uno o más septímeros de porina Msp de cadena sencilla, uno o más octámeros de porina Msp de cadena sencilla, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, una porina Msp monocatenaria puede comprender un dímero de porina Msp monocatenaria y dos trímeros de porina Msp monocatenaria. A modo de otro ejemplo, una porina Msp monocatenaria puede comprender un cuadrímero de porina Msp monocatenaria y dos dímeros de porina Msp monocatenaria.
[0083] Una porina Msp monocatenaria de tipo salvaje está compuesta de monómeros de Msp de tipo salvaje. De manera opcional, una o más mutaciones en una porina Msp monocatenaria están presentes en el vestíbulo o en la zona de constricción de la porina Msp monocatenaria. La porina Msp monocatenaria mutante, por ejemplo, tiene al menos una mutación en la secuencia de aminoácidos para el bucle periplásmico, el vestíbulo o la zona de constricción (por ejemplo, deleción, sustitución o adición) en comparación con una porina monocatenaria de tipo salvaje. msp. Un multímero de cadenas sencillas también puede formar una porina, en la que cada cadena sencilla incluye dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más monómeros de Msp.
[0084] En la Tabla 3 se proporcionan ejemplos no limitantes de secuencias de MspA mutante. De manera opcional, la MspA mutante comprende una sustitución de A por P en el aminoácido 138, una sustitución de E por A en el aminoácido 139, o una combinación de las mismas. De manera opcional, la MspA mutante comprende una sustitución de D por K o R en el aminoácido 90, una sustitución de D por N en el aminoácido 91, una sustitución de D por N en el aminoácido 93, o cualquier combinación de las mismas. De manera opcional, la MspA mutante comprende una sustitución de D por Q en el aminoácido 90, una sustitución de D por Q en el aminoácido 91, una sustitución de D por N en el aminoácido 93, o cualquier combinación de las mismas. De manera opcional, la MspA mutante comprende una sustitución de L por W en el aminoácido 88, una sustitución de I por W en el aminoácido 105, una sustitución de D por Q en el aminoácido 91, una sustitución de D por N en aminoácido 93, o cualquier combinación de las mismas. De manera opcional, la MspA mutante comprende una sustitución de I a W en el aminoácido 105, una sustitución de N a W en el aminoácido 108 o una combinación de las mismas. De manera opcional, la MspA mutante comprende una sustitución de D por R en el aminoácido 118, una sustitución de E por K en el aminoácido 139, una sustitución de D por R en el aminoácido 134, o cualquier combinación de las mismas. Para las secuencias de monómeros de MspB mutantes enumeradas a continuación, la secuencia de MspB de referencia es la secuencia de monómeros de MspB madura de tipo salvaje que se conoce en la técnica. De manera opcional, la MspB mutante comprende una sustitución de D por K o R en el aminoácido 90, una sustitución de D por N en el aminoácido 91, una sustitución de D por N en el aminoácido 93, o cualquier combinación de las mismas.
Tabla 3: Mutantes de Ms a
[0085] Un monómero de MspA puede comprender una o más mutaciones en cualquiera de las siguientes posiciones de aminoácidos: 88, 105, 108, 118, 134 o 139. Un monómero de MspA puede comprender una o más de las siguientes mutaciones: L88W, D90K/N/Q/R, D91N/Q, D93N, I105W, N108W, D118R, D134R o E139K. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90N/D91N/D93N. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90Q/D91Q/D93N. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90Q/D91Q/D93N/D118R/D134R/E139K. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90(K,R)/D91N/D93N. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: (L88, I105)W/D91Q/D93N. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: I105W/N108W. Además, un monómero de MspA puede comprender cualquier otra mutación descrita en el presente documento.
[0086] En cualquier realización del presente documento, una porina Msp mutante, tal como una porina MspA mutante o un parálogo u homólogo de MspA mutante, puede comprender al menos un aminoácido cargado positivamente adicional en comparación con el vestíbulo o la zona de constricción de una porina Msp de tipo salvaje, respectivamente; al menos un aminoácido cargado negativamente adicional en comparación con el vestíbulo o la zona de constricción de una porina MspA de tipo salvaje, respectivamente; al menos un aminoácido menos cargado positivamente en comparación con el vestíbulo o la zona de constricción de una porina MspA de tipo salvaje, respectivamente; o al menos un aminoácido menos cargado negativamente en comparación con el vestíbulo o la zona de constricción de una porina MspA de tipo salvaje, respectivamente.
[0087] De manera opcional, cada aminoácido cargado positivamente en el vestíbulo y la zona de constricción de una porina Msp de tipo salvaje se reemplaza por un aminoácido cargado negativamente, y cada aminoácido cargado negativamente es igual o diferente; o cada aminoácido cargado negativamente en el vestíbulo y la zona de constricción de una porina Msp de tipo salvaje se reemplaza por un aminoácido cargado positivamente, y cada aminoácido cargado positivamente es igual o diferente.
[0088] De manera opcional, el vestíbulo o la zona de constricción de una porina Msp mutante comprende un mayor número de residuos cargados positivamente que el del vestíbulo o la zona de constricción de una porina Msp de tipo salvaje, respectivamente; o el vestíbulo o la zona de constricción comprende un mayor número de residuos cargados negativamente que el del vestíbulo o la zona de constricción de una porina Msp de tipo salvaje, respectivamente; o al menos un aminoácido cargado positivamente en el vestíbulo o la zona de constricción de una porina Msp de tipo salvaje, tal como porina MspA de tipo salvaje o una porina paráloga u homóloga de MspA de tipo salvaje, se elimina o se reemplaza por un aminoácido cargado negativamente; o al menos un aminoácido cargado negativamente en el vestíbulo o la zona de constricción de una porina Msp de tipo salvaje se elimina o se reemplaza por un aminoácido cargado positivamente.
[0089] Al menos un aminoácido en el vestíbulo o la zona de constricción de una porina Msp de tipo salvaje, tal como una porina MspA de tipo salvaje o una porina paráloga u homóloga de MspA de tipo salvaje, puede sustituirse por un aminoácido que tiene una cadena lateral estéricamente más grande; un aminoácido que tiene una cadena lateral estéricamente más pequeña; un aminoácido que tiene una cadena lateral más polar; un aminoácido que tiene una cadena lateral menos polar; o un aminoácido que tiene una cadena lateral más hidrófoba; un aminoácido que tiene una cadena lateral menos hidrófoba.
[0090] En cualquier realización del presente documento, al menos un aminoácido en el vestíbulo o la zona de constricción de una porina Msp mutante puede comprender un aminoácido no natural o un aminoácido químicamente modificado.
[0091] Una porina Msp mutante, tal como una porina MspA mutante o una porina paráloga u homóloga de MspA mutante, puede comprender una zona de constricción neutra. Una porina Msp mutante, tal como una porina MspA mutante o una porina paráloga o homóloga de MspA mutante, puede comprender una conductancia a través del túnel que es mayor, tal como dos veces mayor, que la conductancia a través del túnel de su correspondiente porina Msp tipo salvaje. Una porina Msp mutante, tal como una porina MspA mutante o una porina paráloga u homóloga de MspA mutante, puede comprender una conductancia a través del túnel que es menor que la conductancia a través del túnel de su porina Msp de tipo salvaje correspondiente.
[0092] Cualquier porina Msp analizada en el presente documento puede comprender un vestíbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diámetro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constricción que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y un diámetro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en el que el vestíbulo y la zona de constricción definen juntos un túnel. También se proporciona en el presente documento una porina MspA mutante que comprende un vestíbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diámetro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constricción que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y un diámetro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en el que el vestíbulo y la zona de constricción juntos definen un túnel, y que comprende además al menos un primer monómero parálogo u homólogo de MspA mutante.
[0093] El diámetro de la zona de constricción de una porina Msp mutante, tal como una porina MspA mutante o un parálogo u homólogo de MspA mutante, puede ser menor que el diámetro de la zona de constricción de su correspondiente porina Msp de tipo salvaje, tal como una porina MspA de tipo salvaje o parálogo u homólogo de MspA de tipo salvaje. Una porina Msp mutante, tal como una porina MspA mutante o un parálogo u homólogo de MspA mutante, puede comprender una mutación en el vestíbulo o en la zona de constricción que permite que un analito o un analito modificado tenga una velocidad o una velocidad promedio a medida que interactúa con el túnel que es menor que la velocidad o velocidad promedio a la que el analito o un analito modificado interactúa con el túnel de su correspondiente porina Msp de tipo salvaje (por ejemplo, porina MspA de tipo salvaje, parálogo u homólogo de MspA de tipo salvaje).
[0094] Las secuencias de monómeros de Msp de tipo salvaje analizadas en el presente documento se describen en GenBank, ubicado en la web pubmed.gov. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de un monómero de MspA de tipo salvaje se pueden encontrar en los números de acceso de GenBank AJ001442 y CAB56052, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de un monómero de MspB de tipo salvaje se pueden encontrar, por ejemplo, en los números de acceso de GenBank NC_008596.1 (del nucleótido 600086 al 600730) y YP_884932.1, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de un monómero de MspC de tipo salvaje se pueden encontrar, por ejemplo, en los números de acceso de GenBank AJ299735 y CAC82509, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de un monómero de MspD de tipo salvaje se pueden encontrar, por ejemplo, en los números de acceso de GenBank AJ300774 y CAC83628, respectivamente. Así se proporcionan las secuencias de nucleótidos de los monómeros de MspA, MspB, MspC y MspD que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 por ciento o más, o cualquier intervalo derivable en la misma, idéntica a la secuencia de nucleótidos de los números de acceso de GenBank de nucleótidos antes mencionados. Las secuencias de aminoácidos de los monómeros de MspA, MspB, MspC y MspD se pueden encontrar en la Figura 18 del documento WO 2010/034018 que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 por ciento o más, o cualquier intervalo derivable en la misma, idéntica a las secuencias de los números de acceso de GenBank de aminoácidos antes mencionados.
[0095] También se proporcionan secuencias de aminoácidos de parálogos de MspA y monómeros homólogos que comprenden una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 por ciento o más, o cualquier intervalo derivable en la misma a un monómero parálogo u homólogo de MspA de tipo salvaje. Los monómeros parálogos y homólogos de MspA de tipo salvaje son bien conocidos en la técnica. Ver Tabla 2.
[0096] El poro de a-hemolisina está formado por siete subunidades idénticas (heptamérica). La secuencia de polinucleótidos que codifica una subunidad de a-hemolisina se muestra en la SEQ ID NO: 1 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2010/0196203. La secuencia de aminoácidos de longitud completa de una subunidad de a-hemolisina se muestra en la SEQ ID NO: 2 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2010/0196203. Los primeros 26 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 corresponden al péptido señal. La secuencia de aminoácidos de una subunidad madura de a-hemolisina sin el péptido señal se muestra en SEQ ID NO: 3 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2010/0196203. La SEQ ID NO: 3 tiene un residuo de metionina en la posición 1 en lugar del péptido señal de 26 aminoácidos que está presente en SEQ ID NO: 2.
[0097] Una variante es un poro heptamérico en el que una o más de las siete subunidades tiene una secuencia de aminoácidos que varía de la de SEQ ID NO: 2 o 3 y que conserva la actividad del poro. 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de las subunidades en una a-hemolisina mutante pueden tener una secuencia de aminoácidos que varía de la de SEQ ID NO: 2 o 3. Las siete subunidades dentro de un poro mutante típicamente son idénticas, pero pueden ser diferentes.
[0098] El mutante puede ser una variante natural que es expresada por un organismo, por ejemplo por una bacteriaStaphylococcus.Las variantes también incluyen variantes no naturales producidas mediante tecnología recombinante. En toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 3, una variante puede ser al menos 50 % homóloga a esa secuencia basándose en la identidad de aminoácidos. El polipéptido de subunidad puede ser al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % homólogo basándose en la identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 3 sobre la secuencia completa.
[0099] Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 3, por ejemplo, se puede realizar una única sustitución de aminoácido o se pueden realizar dos o más sustituciones. En algunas realizaciones, se reemplaza la lisina en la posición 34 en SEQ ID NO: 2 y en la posición 9 en SEQ ID NO: 3 por cisteína (es decir, K34C o K9C). Otro ejemplo de una sustitución no conservadora que se puede realizar es la sustitución del residuo de asparagina en la posición 43 de SEQ ID NO: 2 o en la posición 18 de SEQ ID NO: 3 por cisteína (es decir, N43C o N17C). La inclusión de estos residuos de cisteína en SEQ ID NO: 2 o 3 proporciona puntos de unión de tiol en las posiciones relevantes. Se podrían realizar cambios similares en todas las demás posiciones y en múltiples posiciones de la misma subunidad.
[0100] En algunas realizaciones, uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 3 pueden eliminarse alternativa o adicionalmente. Se pueden eliminar hasta el 50 % de los residuos, ya sea como una región contigua o como múltiples regiones más pequeñas distribuidas a lo largo de la cadena de aminoácidos.
[0101] Las variantes pueden incluir subunidades formadas de fragmentos de SEQ ID NO: 2 o 3. Dichos fragmentos conservan su capacidad para insertarse en una bicapa. Los fragmentos pueden tener al menos 100, tal como 150, 200 o 250 aminoácidos de longitud. Dichos fragmentos pueden usarse para producir poros quiméricos. Un fragmento puede comprender el dominio barril p de SEQ ID NO: 2 o 3.
[0102] Las variantes incluyen proteínas quiméricas que comprenden fragmentos o partes de SEQ ID NO: 2 o 3. Las proteínas quiméricas se forman a partir de subunidades que comprenden cada una fragmentos o partes de SEQ ID NO: 2 o 3. La parte del barril p de las proteínas quiméricas está típicamente formada por los fragmentos o partes de SEQ ID NO: 2 o 3.
[0103] Uno o más residuos de aminoácidos pueden insertarse alternativa o adicionalmente en, o en uno u otro o ambos extremos de, las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 2 o 3. La inserción de uno, dos o más aminoácidos adicionales al extremo C terminal de la secuencia peptídica es menos probable que perturbe la estructura y/o función de la proteína, y estas adiciones podrían ser sustanciales, pero pueden usarse secuencias peptídicas de hasta 10, 20, 50, 100 o 500 aminoácidos o más. Las adiciones en el extremo N terminal del monómero también podrían ser sustanciales, añadiéndose uno, dos o más residuos adicionales, pero también añadiéndose 10, 20, 50, 500 o más residuos. También se pueden añadir secuencias adicionales a la proteína en la región transmembrana, entre los residuos de aminoácidos 119 y 139 de SEQ ID NO: 3. De manera más precisa, se pueden agregar secuencias adicionales entre los residuos 127 y 130 de SEQ ID NO: 3, a continuación de la eliminación de los residuos 128 y 129. Se pueden realizar adiciones en las posiciones equivalentes en SEQ ID NO: 2. Una proteína portadora puede fusionarse a una secuencia de aminoácidos según la presente invención.
[0104] En el presente documento se describen otras mutaciones opcionales.
[0105] A continuación se describen descripciones de sustituciones opcionales adicionales que pueden realizarse con respecto a porinas Msp, monómeros de Msp, a-hemolisinas y otras proteínas proporcionadas en el presente documento.
[0106] A continuación se describen descripciones de sustituciones opcionales adicionales que pueden realizarse con respecto a porinas Msp, monómeros de Msp y a-hemolisina y variantes de las mismas, y otras proteínas proporcionadas en el presente documento.
[0107] Las modificaciones de proteínas descritas en el presente documento incluyen modificaciones de secuencia de aminoácidos. Las modificaciones en la secuencia de aminoácidos pueden surgir de forma natural como variaciones alélicas (por ejemplo, debido a polimorfismo genético), pueden surgir debido a la influencia ambiental (por ejemplo, debido a la exposición a la radiación ultravioleta) o pueden ser producidas por intervención humana (por ejemplo, por mutagénesis de secuencias de ADN clonadas), tales como mutantes inducidos puntuales, por deleción, por inserción y por sustitución. Estas modificaciones pueden dar como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, proporcionar mutaciones silenciosas, modificar un sitio de restricción o proporcionar otras mutaciones específicas. Las modificaciones de la secuencia de aminoácidos normalmente se clasifican en una o más de tres clases: modificaciones de sustitución, de inserción o de deleción. Las inserciones incluyen fusiones amino y/o terminales así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Las inserciones normalmente serán inserciones más pequeñas que las de fusiones amino o carboxilo terminales, por ejemplo, del orden de uno a cuatro residuos. Las deleciones se caracterizan por la eliminación de uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de proteínas. Normalmente, no se eliminan más de aproximadamente 2 a 6 residuos en cualquier sitio dentro de la molécula de proteína. Las sustituciones de aminoácidos suelen ser de residuos únicos, pero pueden aparecer en varios lugares diferentes a la vez; las inserciones normalmente serán del orden de aproximadamente de 1 a 10 residuos de aminoácidos; y las eliminaciones oscilarán aproximadamente de 1 a 30 residuos. Las eliminaciones o inserciones se pueden realizar en pares adyacentes, es decir, una eliminación de 2 residuos o una inserción de 2 residuos. Se pueden combinar sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas para llegar a una construcción final. Las mutaciones pueden o no colocar la secuencia fuera del marco de lectura y pueden crear o no regiones complementarias que podrían producir una estructura de ARNm secundaria. Las modificaciones sustitutivas son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo y se ha insertado un residuo diferente en su lugar.
[0108] Las modificaciones, incluidas las sustituciones de aminoácidos específicas, se realizan mediante procedimientos conocidos. A modo de ejemplo, se realizan modificaciones mediante mutagénesis específica de sitio de nucleótidos en el ADN que codifica la proteína, produciendo de este modo ADN que codifica la modificación y posteriormente expresando el ADN en un cultivo celular recombinante. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados del ADN que tienen una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagénesis con cebador M13 y mutagénesis por PCR.
[0109] Los péptidos, polipéptidos, monómeros, multímeros, proteínas, etc. descritos en el presente documento se pueden modificar y variar adicionalmente siempre que se mantenga o mejore la función deseada. Se entiende que una forma de definir cualesquiera modificaciones y derivados conocidos o aquellos que puedan surgir, de los genes y proteínas divulgados en el presente documento, es mediante la definición de las modificaciones y derivados en términos de identidad con secuencias conocidas específicas. Se describen específicamente polipéptidos que tienen al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90. 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por ciento de identidad con una MspA de tipo salvaje y con parálogos u homólogos de MspA de tipo salvaje (por ejemplo, MspB de tipo salvaje, MspC de tipo salvaje, MspD de tipo salvaje, MppA, PorM1, Mmcs4296) y mutantes proporcionados en el presente documento, así como a-hemolisina y variantes de las mismas.
[0110] Los expertos en la técnica entienden fácilmente cómo determinar la identidad de dos polipéptidos. Por ejemplo, la identidad se puede calcular después de alinear las dos secuencias para que la identidad esté en su nivel más alto. Por ejemplo, para determinar el "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para una óptima alineación con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos). A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud.
[0111] Existen varios procedimientos para determinar el porcentaje de identidad. Se puede determinar el porcentaje de identidad de la siguiente manera. Una secuencia diana de ácidos nucleicos o aminoácidos se compara con la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos identificada utilizando el programa BLAST 2 Sequences (Bl2seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene BLASTN versión 2.0.14 y BLASTP versión 2.0.14. Esta versión independiente de BLASTZ se puede obtener en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica del gobierno de EE. UU. (World Wide Web en ncbi.nlm.nih.gov). Las instrucciones que explican cómo utilizar el programa Bl2seq se pueden encontrar en el archivo Léame que acompaña a BLASTZ.
[0112] Bl2seq realiza una comparación entre dos secuencias usando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se utiliza para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP se utiliza para comparar secuencias de aminoácidos. Para comparar dos secuencias de ácido nucleico, las opciones se pueden configurar de la siguiente manera: -i se establece en un archivo que contiene la primera secuencia de ácido nucleico que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se establece en un archivo que contiene la segunda secuencia de ácido nucleico que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se configura en blastn; -o se establece en cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); -q se fija en -1; -r se fija en 2; y todas las demás opciones se dejan en su configuración predeterminada. El siguiente comando generará un archivo de salida que contiene una comparación entre dos secuencias: C:\Bl2seq -ic:\seq1.txt -jc:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1-r 2 Si la secuencia objetivo comparte homología con cualquier parte de la secuencia identificada, entonces el archivo de salida designado presentará esas regiones de homología como secuencias alineadas. Si la secuencia objetivo no comparte homología con ninguna parte de la secuencia identificada, entonces el archivo de salida designado no presentará secuencias alineadas.
[0113] Una vez alineada, se determina una longitud contando el número de nucleótidos consecutivos de la secuencia diana presentada en alineación con la secuencia de la secuencia identificada comenzando con cualquier posición coincidente y terminando con cualquier otra posición coincidente. Una posición coincidente es cualquier posición en la que se presenta un nucleótido idéntico tanto en la secuencia diana como en la identificada. Los huecos presentados en la secuencia diana no se cuentan ya que los huecos no son nucleótidos. Asimismo, los huecos presentados en la secuencia identificada no se cuentan ya que se cuentan los nucleótidos de la secuencia diana, no los nucleótidos de la secuencia identificada.
[0114] El porcentaje de identidad en una longitud particular se puede determinar contando el número de posiciones coincidentes en esa longitud y dividiendo ese número por la longitud seguido de multiplicar el valor resultante por 100. Por ejemplo, si (1) una secuencia diana de 50 nucleótidos se compara con la secuencia que codifica MspA de tipo salvaje (2) el programa Bl2seq presenta 45 nucleótidos de la secuencia diana alineados con una región de la secuencia que codifica MspA de tipo salvaje donde el primer y el último nucleótido de esa región de 45 nucleótidos coinciden, y (3) el número de coincidencias sobre esos 45 nucleótidos alineados es 40, entonces la secuencia diana de 50 nucleótidos contiene una longitud de 45 y un porcentaje de identidad sobre esa longitud de 89 (es decir, 40/45 x 100 = 89).
[0115] Otra forma de calcular la identidad se puede realizar mediante algoritmos publicados. La alineación óptima de secuencias para comparación puede realizarse mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman, Adv Appl Math 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de identidad de Needleman y Wunsch, J Mol Biol 48:443 (1970), mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc Natl Acad. Sci USA. 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.
[0116] Los mismos tipos de identidad se pueden obtener para ácidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos divulgados en Science 244:48-52 (1989); Proc Natl Acad Sci USA 86:7706-10 (1989)); y Methods Enzymol 183:281-306 (1989). Se entiende que normalmente se puede utilizar cualquiera de los procedimientos y que en ciertos casos los resultados de estos diversos procedimientos pueden diferir, pero el experto entiende que si se encuentra identidad con al menos uno de estos procedimientos, se diría que las secuencias tienen la identidad indicada y que se divulgará en el presente documento.
[0117] También se describen los ácidos nucleicos que codifican secuencias de proteínas descritas en el presente documento, así como variantes y fragmentos de los mismos. Estas secuencias incluyen todas las secuencias degeneradas relacionadas con una secuencia de proteína específica, es decir, todos los ácidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica una secuencia proteica particular, así como todos los ácidos nucleicos, incluidos los ácidos nucleicos degenerados, que codifican las variantes y derivados divulgados de las secuencias de proteínas. Por lo tanto, si bien es posible que no se escriba en el presente documento cada secuencia de ácido nucleico particular, se entiende que todas y cada una de las secuencias de hecho se divulgan y describen en el presente documento a través de las secuencias de proteínas divulgadas.
[0118] Los fragmentos y secuencias parciales de proteínas pueden ser útiles en los procedimientos descritos en el presente documento. Como ocurre con todos los péptidos y proteínas, incluidos fragmentos de los mismos, se entiende que pueden aparecer modificaciones adicionales en las secuencias de aminoácidos de las proteínas descritas en el presente documento que no alteran la naturaleza o función de los péptidos y proteínas. Se entenderá que la única limitación de estas es práctica, deben comprender los elementos funcionales necesarios (por ejemplo, capacidad de formación de túneles) para su uso en la realización relevante. Dichas modificaciones incluyen sustituciones conservadoras de aminoácidos y se analizan con mayor detalle a continuación.
[0119] La siguiente tabla proporciona ejemplos no limitantes de propiedades de aminoácidos que pueden ayudar a un experto en la técnica a determinar cómo seleccionar aminoácidos para modificaciones de proteínas (por ejemplo, poros de proteínas), tal como se describe en el presente documento.
Tabla 4. Pro iedades de los aminoácidos
_____ _____
[0120] Alternativamente, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a sus características de hidrofobicidad y/o carga, estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y/o arginina (-4,5). La importancia del índice hidropático de aminoácidos a la hora de conferir una función biológica interactiva a una proteína se comprende generalmente en la técnica. Se sabe que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice y/o puntuación hidropática similar y/o aún conservar una actividad biológica similar. Al realizar cambios basados en el índice hidropático, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos pueden estar dentro de ± 2; dentro de ± 1 , o dentro de ± 0,5.
[0121] También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede realizar eficazmente sobre la base de la hidrofilicidad. Tal como se detalla en la Patente de Estados Unidos 4,554,101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Al realizar cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, se contempla la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad pueden estar dentro de ± 2, dentro de ± 1, o aquellos dentro de ± 0,5.
[0122] Cualquier proteína mutante puede comprender una sustitución de aminoácido conservadora en comparación con una porina o monómero de Msp de tipo salvaje. Cualquier mutación de sustitución es conservadora porque altera mínimamente las propiedades bioquímicas de la proteína. Los ejemplos no limitantes de mutaciones que se introducen para sustituir residuos de aminoácidos conservadores incluyen: residuos cargados positivamente (por ejemplo, H, K y R) sustituidos por residuos cargados positivamente; residuos cargados negativamente (por ejemplo, D y E) sustituidos por residuos cargados negativamente; residuos polares neutros (por ejemplo, C, G, N, Q, S, T e Y) sustituidos por residuos polares neutros; y residuos neutros no polares (por ejemplo, A, F, I, L, M, P, V y W) sustituidos por residuos neutros no polares. Se pueden realizar sustituciones conservadoras de acuerdo con la siguiente Tabla 5. También se pueden realizar sustituciones no conservadoras (por ejemplo, prolina por glicina).
T l : i i n min i m l
[0123] Normalmente, un nanoporo podrá insertarse en una bicapa lipídica u otra película delgada, y estas técnicas son bien conocidas en la técnica, tal como se explica en el presente documento. Además, la Patente de Estados Unidos N° 6.746.594 describe una variedad de bicapas lipídicas y películas delgadas, que incluyen materiales inorgánicos, que pueden emplearse con respecto a los nanoporos descritos en el presente documento. Los procedimientos, aparatos y técnicas descritos en la Patente de Estados Unidos N° 6.267.872 también se pueden emplear con respecto a los nanoporos descritos en el presente documento.
[0124] Una membrana lipídica opcional que se puede emplear en algunas realizaciones es una membrana artificial que comprende un ácido micólico. Los ácidos micólicos son ácidos grasos p-hidroxi ramificados en a de alto peso molecular que son componentes de las envolturas celulares de todas las micobacterias. Los ácidos micólicos contienen un grupo de cabeza de ácido carboxílico con dos colas hidrofóbicas de longitud desigual. Los ácidos micólicos tienen la estructura básica R2CH(OH)CHR1COOH, donde Ri es un alcano lineal C<20>-C<24>y R2 es una estructura más compleja de 30 a 60 átomos de carbono que puede contener varias cantidades de dobles enlaces de carbono-carbono, anillos de ciclopropano, ramificaciones metilo o funciones oxigenadas, tales como grupos carbonilo, ácido carboxílico y metoxi. La estructura de los ácidos micólicos varía según las familias y especies.
[0125] En la envoltura celular de las micobacterias, los ácidos micólicos están presentes como lípidos libres, tales como dimicolato de trehalosa (TDM) o factor cuerda y monomicolato de trehalosa (TMM). También pueden estar esterificados en las unidades penta-arabinofuranosilo terminales de arabinogalactano, un polisacárido unido a peptidoglicano. En el presente documento, un ácido micólico puede definirse además como cualquiera de estas variantes. En algunas realizaciones, un ácido micólico se define además como un ácido micólico modificado con trehalosa que puede ser natural o sintético, que se conoce en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 4.307.229, 4.720.456, 5.006.514 y 5.049.664. La presencia de estos ácidos grasos de cadena larga es en gran medida responsable de la alta hidrofobicidad y la muy baja permeabilidad de la envoltura celular de las micobacterias. Se han descrito ácidos micólicos en especies bacterianas distintas de Mycobacterium, por ejemplo, Corynebacterium y Nocardia. En consecuencia, se distinguen tres categorías principales de ácidos micólicos (The Merck Index, 1989), a saber:
i) ácidos corinomicólicos (longitud de cadena de acilo C<28>-C<40>)
ii) ácidos nocardomicólicos (longitud de cadena de acilo C<40>-C<60>) y
iii) ácidos micólicos micobacterianos (longitud de cadena de acilo C<60>-C<90>).
[0126] Una descripción detallada de las estructuras de MA, motivos y variaciones se proporciona en Prog. Lipid Res 37:143 (1998). MA puede adquirirse, por ejemplo en Sigma Aldrich, o prepararse como se conoce en la técnica. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n° 6.171.830. En algunas realizaciones, los ácidos micólicos se derivan deM. tuberculosis.
[0127] La definición de ácidos micólicos también incluye ácidos micólicos modificados. Por consiguiente, las membranas artificiales pueden comprender uno o más ácidos micólicos modificados. Por ejemplo, los ácidos micólicos pueden modificarse reticulando ácidos micólicos. Se pueden fabricar membranas artificiales de ácido micólico para que sean más parecidas a geles y estables mediante polimerización de grupos terminales o mediante reticulación de grupos internos de ácidos micólicos. Para preparar ácidos micólicos modificados se pueden emplear procedimientos de reticulación similares a los procedimientos de reticulación de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPhPC) u otros lípidos, tal como se conoce en la técnica. Ver, por ejemplo, A. Singh y J.M. Schnur, "Polymerizable Phospholipids" en Phospholipids Handbook, C. Cevc, ed., Marcel Dekker Inc., NY, págs. 233-287 (1993).). Una membrana puede comprender uno o más tipos de ácidos micólicos (es decir, mezclas de ácidos micólicos). En algunas realizaciones, una membrana comprende aproximadamente, al menos aproximadamente o como máximo aproximadamente 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o más ácidos micólicos, o cualquier intervalo derivable de los mismos. En algunas realizaciones, una membrana comprende 100 % de ácidos micólicos. Las membranas artificiales que comprenden un ácido micólico también pueden comprender lípidos distintos del ácido micólico, incluidos lípidos sintéticos y naturales. La patente de Estados Unidos. n° 7.514.267 describe una variedad de lípidos.
[0128] Tal como se usa en el presente documento, una "membrana sin soporte" es una membrana que abarca la abertura de un orificio sin soporte en ninguno de los lados a lo largo de la superficie de la membrana. La membrana tiene líquido, gas o vacío en uno o ambos lados, pero no está en contacto con un sólido (sustrato) en ninguno de los lados. Tal como se usa en el presente documento, una "membrana ligada" es una membrana en la que los grupos de cabeza de ácidos micólicos están unidos o ligados a un sustrato (por ejemplo, plástico, vidrio, astilla, microesfera). Los procedimientos para unir lípidos a sustratos para formar membranas ligadas son bien conocidos en la técnica mediante la modificación química de grupos de cabeza, y tales procedimientos pueden usarse para modificar y unir de manera similar grupos de cabeza de ácidos micólicos. Por "artificial" se entiende que las membranas no se producen de forma natural, sino que son creadas por el hombre.
[0129] En cualquier realización del presente documento, una membrana artificial que comprende un ácido micólico puede no estar soportada o ligada. Un ácido micólico puede definirse además como un ácido micólico modificado. Un ácido micólico modificado puede ser un ácido micólico reticulado. Un ácido micólico puede definirse además como un ácido micólico no modificado. En algunas realizaciones, una membrana tiene un grosor promedio que oscila de aproximadamente 5 a aproximadamente 22 nm. Los procedimientos para medir el grosor de membranas son bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, una membrana tiene un voltaje de ruptura promedio de aproximadamente 2,0 V cuando el voltaje aplicado a través de la membrana aumenta en rampa a aproximadamente 100 mV/s en presencia de una solución de KCl 1,0 M preparada con agua desionizada, tamponada a pH 8,0 ± 0,05 con HEPES de 10 mM. En algunas realizaciones, una membrana tiene la capacidad de soportar voltajes superiores a 1 V durante más de varias horas en presencia de una solución de KCl 1,0 M preparada con agua desionizada, tamponada a pH 8,0 ± 0,05 con HEPES 10 mM. En algunas realizaciones, una membrana tiene la capacidad de soportar voltajes superiores a 1 V durante al menos aproximadamente 2, 3, 4 o 5 o más horas, o cualquier intervalo derivable en los mismos, en presencia de una solución de KCl 1,0 M preparada con agua desionizada, tamponada a pH 8,0 ± 0,05 con HEPES 10 mM. En algunas realizaciones, una membrana tiene resistencia a la ruptura cuando se eliminan los tampones en los ladoscisotrans.Se puede formar y reformar una membrana cuando se expone a un tampón de pH 2 a pH 9 presentado en su ladoc is. En algunas realizaciones, se puede formar y reformar una membrana a temperaturas superiores a 55 °C.
[0130] También se proporciona un procedimiento para fabricar una membrana artificial sin soporte que comprende un ácido micólico, que comprende: (a) pretratar un orificio de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 500 |jm de diámetro con una o más capas de una mezcla de ácidos micólicos-hexano y eliminar el hexano para proporcionar ácidos micólicos secos; (b) aplicar un disolvente hidrocarbonado a los ácidos micólicos secos seguido de calentamiento para promover la incorporación del disolvente hidrocarbonado para proporcionar una composición de disolvente hidrocarbonado-ácido micólico; (c) colocar el orificio entre un primer medio líquido conductor y un segundo medio líquido conductor; (d) aplicar la composición de disolvente hidrocarbonado y ácidos micólicos al orificio mientras se controla una corriente iónica a través del orificio hasta que la resistencia del orificio aumenta por encima de 1 TQ, seguido de forzar uno de los medios líquidos conductores a través del orificio desde el ladotranspara eliminar el bloqueo de corriente iónica, según sea necesario; y (e) colocar una burbuja de aire sobre el orificio seguido de la retracción de la burbuja de aire, donde la formación de la membrana se indica mediante el aumento de la resistencia del orificio por encima de 1 TQ, y donde la formación de la membrana bicapa se indica si se puede formar un nanoporo dentro de la membrana. El disolvente hidrocarbonado puede ser hexadecano o hexadeceno o cualquier otro disolvente hidrocarbonado que pueda incorporarse a la membrana. El tipo de disolvente hidrocarbonado empleado depende de la temperatura a la que se quiera preparar la membrana.
[0131] En algunas realizaciones, una pluralidad de nanoporos están comprendidos en una membrana artificial que comprende un ácido micólico. Por ejemplo, en una membrana pueden estar comprendidos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 200, 2000 o más.
[0132] De manera opcional, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 200, 2000 o más nanoporos están comprendidos en una membrana, bicapa o película delgada. De hecho, en las realizaciones descritas en el presente documento se pueden emplear de 2 a 1010 nanoporos. Dicha pluralidad de nanoporos puede estar en forma de grupos de nanoporos. Los grupos pueden ensamblarse al azar o adoptar un patrón. Tal como se usa en el presente documento, un "grupo" se refiere a moléculas que están agrupadas y se mueven como una unidad, pero que no están unidas de manera covalente entre sí.
[0133] De manera opcional, los nanoporos no se controlan (“gate”) espontáneamente. "Controlar" o "control" se refiere al cambio espontáneo de conductancia eléctrica a través de la abertura de la proteína que normalmente es temporal (por ejemplo, que dura desde tan solo 1-10 milisegundos hasta un segundo). Los eventos de control de larga duración a menudo se pueden revertir cambiando la polaridad. En la mayoría de las circunstancias, la probabilidad de control aumenta con la aplicación de voltajes más altos. El control y el grado de conductancia a través del cambio de abertura son muy variables entre los nanoporos, dependiendo, por ejemplo, de la composición de la abertura (por ejemplo, el vestíbulo y la zona de constricción de las porinas Msp), así como de las propiedades del medio líquido en el que se sumerge la proteína. Normalmente, la proteína se vuelve menos conductora durante el control y, como resultado, la conductancia puede detenerse permanentemente (es decir, la abertura puede cerrarse permanentemente), de modo que el proceso es irreversible. De manera opcional, el control se refiere a la conductancia a través de la abertura de un nanoporo que cambia espontáneamente a menos del 75% de su corriente de estado abierto.
[0134] Diversas condiciones, tales como la luz y el medio líquido que entra en contacto con un nanoporo, incluido su pH, composición del tampón, composición de detergente y temperatura, pueden afectar el comportamiento del nanoporo, particularmente con respecto a su conductancia a través del túnel, así como el movimiento de un analito con respecto al túnel, ya sea temporal o permanentemente.
[0135] Como alternativa o además de "que comprende", cualquier realización en el presente documento puede decir "que consiste en". La frase transitoria "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en la reivindicación.
[0136] Cualquier realización del presente documento puede excluir de manera opcional cualquier otra realización del presente documento.
[0137] El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere solo a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalde una definición que se refiere solo a alternativas y "y/o."
[0138] A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la desviación estándar de error para el dispositivo o procedimiento que se emplea para determinar el valor. En cualquier realización analizada en el contexto de un valor numérico usado junto con el término "aproximadamente", se contempla específicamente que el término aproximadamente pueda omitirse.
[0139] Siguiendo la ley de patentes perfectamente establecida, las palabras "un" y "una", cuando se usan junto con la palabra "que comprende" en las reivindicaciones o memoria descriptiva, denotan una o más, a menos que se indique específicamente.
[0140] Se divulgan materiales, composiciones y componentes que se pueden usar para, se pueden usar junto con, se pueden usar en preparación para, o son productos de los procedimientos y composiciones divulgados. Estos y otros materiales se divulgan en el presente documento, y se entiende que cuando se divulgan combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, aunque la referencia específica de cada una de las diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estos compuestos puede no divulgarse explícitamente, cada uno de ellos se contempla y describe específicamente en el presente documento. Por ejemplo, si se divulga y analiza un procedimiento y se analizan varias modificaciones que se pueden realizar en varias moléculas, incluido el procedimiento, todas y cada una de las combinaciones y permutaciones del procedimiento, y las modificaciones que son posibles, se contemplan específicamente a menos que expresamente se indique lo contrario. Asimismo, también se contempla y divulga específicamente cualquier subconjunto o combinación de éstos. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta divulgación, incluidos, pero sin limitación a los mismos, etapas en los procedimientos que utilizan las composiciones divulgadas. Por lo tanto, si hay una variedad de etapas adicionales que se pueden realizar, se entiende que cada una de estas etapas adicionales se puede realizar con cualquier etapa de procedimiento específico o combinación de etapas de procedimiento de los procedimientos divulgados, y que cada una de dichas combinaciones o subconjunto de combinaciones se contempla específicamente y debe considerarse divulgada. Por lo tanto, se contempla que cualquier realización analizada en esta memoria descriptiva pueda implementarse con respecto a cualquier procedimiento, sistema o composición, etc., descrito en el presente documento, yviceversa.Por ejemplo, cualquier nanoporo descrito en el presente documento se puede emplear en cualquier procedimiento descrito en el presente documento.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Materiales y procedimientos para el ejemplo 1-7
[0141] A menos que se indique lo contrario, el nanoporo M1-NNN-MspA se usó en los ejemplos siguientes. La preparación de este nanoporo se describe en la Solicitud Provisional de Estados Unidos. N° de serie 61/098,938 y su solicitud PCT relacionada, WO 2010/034018. Ver también Proc Natl Acad Sci 105:20647 (2008)).
[0142] El ADN fue sintetizado por Integrated DNA Technologies, Inc. sin purificación adicional para el ADN en horquilla, o con purificación PAGE para parte del ADN. Las concentraciones de ADN oscilaron de ~10 |<j>M a 100 |<j>M. Para evitar la autodimerización, se preparó ADN en horquilla calentándolo a 90 C durante 1 minuto, enfriándolo en un congelador a -8 C durante un minuto adicional y a continuación devolviéndolo a temperatura ambiente antes de su uso.
[0143] Las secuencias de ADN en horquilla que examinan la sensibilidad de nucleótidos de MspA tenían la misma región dúplex de 14 bases y un bucle de 6 nt. 5' GCTGGCTCTGTTGC TCTCTC GCAACAGAGCCAGC <cola> 3' [SEQ ID NO: 4]. Los subrayados indican formación dúplex entre bases complementarias. Las secuencias de la cola de horquilla se presentan en las Tablas A y B. Si las corrientes residuales eran suficientemente similares a otras cadenas de ADN, se realizaron experimentos con concentraciones similares de poli-dA o poli-dC para proporcionar una calibración de corriente residual. Esta calibración redujo una variación experimental menor en los niveles de corriente debido a los potenciales de Nernst y la evaporación del tampón.
��
��
TABLA B: SECUENCIAS EN HORQUILLA
medía de medía de s.e.m. de
A Gauss Gauss Gauss DUPLEX COL
Seq# GC medía de ancho de ancho de # # Td # pb % Ires (pA) Ires (pA) Ires (pA) transloe exp
5’TCT GGCTCT (dA)50- 46 14 57 70.8 8.1 4.5 2616<4>GTT GCT CTC 3’
TCG CAA CAG AGC CAG A
5’CCT GGCTCT (dA)5g- 47 14 64 76.5 8.4 1.2 3417<4>GTT GCT CTC 3’
TCG CAA CAG AGC CAG G
5’ ACT GGC (dA)50- 48 14 57 63.6 1.9 0.6 3967<4>TCT GTT GCT 3’
CTC TCG CAA CAG AGC CAG
T
5’ GCC GGC (dA)50- 49 14 79 67.5 0.2 0.5 1819<3>TCT GGT GCT 3’
CTC TCG CAC CAG AGC CGG
C
5’ GCT GTC (dA)so- 50 12 58 66.0 1.5 2.3 3583<3>TGT TGC TCT 3’
CTC GCA ACA GAC AGC
5’ GCT CTG (dA)50- 51 10 60 67.6 1.5 2.0 5305 6 TTG CTC TCT 3’
CGC AAC AGA GC
5’ GCT GTT (dA)50- 52 8 63 68.4 1.9 1.9 4413 6 GCT CTC TCG 3'
CAA CAG C
[0144] El ADN utilizado en la secuenciación DI fue el siguiente:
3'ATGC5' [SEQ ID NO: 1]: 5' GCAACAGAGGCCAGC CCC GCAACAGAGCCAGC GGA GCAACAGAGCCAGC TTT GCAACAGAGGCCAGC AAA A<32>3' [SEQIDNO:5]
3'TACG5' [SEQ ID NO: 2]: GCAACAGAGGCCAGC GGA GCAACAGAGCCAGC CCC GCAACAGAGGCCAGC AAA GCAACAGAGGCCAGC TTT A<32>3' [SEQ ID NO: 6]
CIEGO: 5' GCAACAGAGCCAGC CCC GCAACAGAGCCAGC AAA GCAACAGAGCCAGC CCC GCAACAGAGCCAGC TTT GCAACAGAGCCAGC GGA A<15>3' [SEQ ID NO: 7].
[0145] Las regiones subrayadas formaron dúplex con oligonucleótidos de secuencia 5' GCTGGCTCTTGTTGC 3' [SEQ ID NO: 8]. Los oligonucleótidos y el ADN DI sintetizado se combinaron en una proporción molar >32:1, se hibridaron mediante calentamiento hasta 95 °C durante 5 minutos y a continuación se enfriaron gradualmente hasta 23 ± 1 °C.
[0146] Los poros se establecieron con procedimientos descritos previamente (Solicitud PCT, WO 2010/034018). De forma resumida, se formaron bicapas lipídicas a partir de 1,2-difitanoil-sn-glicerol-3-fosfocolina, 1,2-difitanoil-snglicero-3-fosfato (Avanti Polar Lipids, Inc.) o de mezclas iguales de los mismos. La bicapa abarcaba un orificio horizontal de ~20 micrones de diámetro en Teflon®. Se añadió M1-NNN-MspA a la parte hacia el suelo de la bicapa a una concentración de ~2,5 ng/ml. Un amplificador de parche de membrana (“patch clamp”) Axopatch ™-1B o 200B (Axon Instruments, ahora de Molecular Devices, Inc.) aplicó un voltaje a través de la bicapa y se midieron las corrientes iónicas. La señal analógica se filtró de paso bajo a 10, 50 o 100 kHz con un filtro Bessel de 4 polos y a continuación se digitalizó a cinco veces la frecuencia del filtro paso bajo. La adquisición de datos se controló con un software personalizado escrito en LabWindows ® /CVI (National Instruments). Para fines de visualización, las trazas de corriente residual se filtraron digitalmente a 2 kHz. Todos los experimentos se realizaron a 23 ± 1°C en KCl 1 M, HEPES/KOH 10 mM tamponado a pH 8. Los datos se analizaron con un software personalizado escrito en Matlab® (The Mathworks®) (ver Ejemplo 7 a continuación).
Ejemplo 2: Identificación de nucleótidos mediante MspA
[0147] Se realizaron experimentos de translocación con ADN que forma un dúplex en forma de horquilla de 14 pares de bases y tiene una 'cola' de ADNss de 50 nucleótidos (ver Tabla A). Cuando se aplica un voltaje a través del poro, la larga cola monocatenaria facilita la captura e inserción del ADN en la constricción del poro (FIGURAS 2A-2D). Con un voltaje impulsor de 180 mV, el dúplex en horquilla se disocia después de ~10 ms. Durante el tiempo que se mantiene la cola en forma de horquilla, la corriente iónica residual medida(Ie s )depende en gran medida de la composición de la sección de ADNss que reside en la constricción limitante del poro. Una vez que el dúplex se disocia, el ADN completa la translocación a la cámara de potencial inferior a velocidades superiores a 1 nt/ps.
[0148] En primer lugar, se determinaron las corrientes residuales características asociadas con las cuatro bases utilizando las colas en horquilla de ADN 'homopolímero' (dA<)50>[SEQ ID NO: 10], (dC<)50>[SEQ ID NO: 11], (dT<)50>[SEQ ID NO: 12], y (dG)<3>, (dA<)47>[SEQ ID NO: 13] mantenidos en M1-NNN-MspA. Cabe indicar que se usó (dG<)3>(dA<)47>[SEQ ID NO: 54], en lugar de (dG<)50>[SEQ ID NO: 14], debido a la formación de la tétrada de G. Para cada cola de polinucleótido, los histogramas de la corriente residual promedio revelan valores únicos a un voltaje aplicado de 180 mV (FIGURAS 3A, 3B). La media gaussiana (p) y el ancho medio (a) de las corrientes iónicas residuales causadas por colas de (dA<)50>[SEQ ID NO: 10] fue deIdA= 65,5 ± 1,5 pA (p±a, promediada para N = 7 experimentos con diferentes poros, n= 3257 translocaciones totales). Las colas (dG<)3>(dA<)47>[SEQ ID NO: 54], (dC<)50>[<s>E<q>ID NO: 11] y (dT<)50>[S<e>Q ID NO: 12] producen corrientes iónicas residuales deIdG= 59,4 ±1,2 pA (N = 5, n = 2938),Id c= 48,4 ± 1,1 pA (N = 7, n = 1830) yIdT= 41,9 ±1,2 pA (N = 4, n = 2407), respectivamente. A un voltaje más bajo de 140 mV, se observaron anchos gaussianos más estrechos y separaciones reducidas dentro de las distribuciones, conIdA= 43,6 ± 0,4 pA (n = 117),IdG= 37,5 ± 0,6 pA (n = 93),Id c= 29,2 ± 0,3 pA (n = 87), yIdT= 24,4 ± 0,5 pA (n = 169). Las purinas más voluminosas, dA y dG, tienen mayores corrientes residuales que las pirimidinas, dT y dC, lo que indica que la restricción estérica no es el determinante principal de los valores de corriente residual, tal como se ha observado en la a-hemolisina.
[0149] Las corrientes residuales debidas a las diferentes colas en horquilla de homopolímero están bien separadas y bien resueltas . Por ejemplo, la diferencia de corriente iónica residual entre poli-dA y poli-dC esIdA-Id c= 14,4 ± 0,5 pA en KCl 1 M utilizando un voltaje impulsor de 140 mV. MspA proporciona una separación mínima de 3,5 veces mayor de corrientes específicas de nucleótidos en comparación con la a-hemolisina.
Ejemplo 3: Exploración de la región de sensibilidad en M1-NNN-MspA
[0150] Se exploró la ubicación de nucleótidos dentro de la cola en forma de horquilla que influye en la corriente residual. Para esto, se usó una serie de ADN en horquilla con secciones (dC<)4>[SEQ ID NO: 55] en varias posiciones en una cola que de otro modo sería poli-dA. Cuando (dC<)4>[SEQ ID NO: 55] estaba adyacente al dúplex en horquilla, las corrientes eran idénticas aIdC.Cuando la sección (dC<)4>[SEQ ID NO: 55] estaba ubicada a más de tres bases de distancia del dúplex en horquilla, la corriente residual no se diferenciaba deIdA(Tabla A). Para probar la importancia aparente de los primeros tres nucleótidos adyacentes a la horquilla, se usaron colas con (dA<)3>o (dC)<3>, seguidas de dos heteropolímeros aleatorios diferentes. Se encontró que las corrientes residuales eran independientes de la sección heteromérica y no se podían distinguir deIdAoId c ,respectivamente (ver Tabla A). Dada la geometría de MspA, se espera que el dúplex en horquilla resida cerca de la constricción. Como menos de 4 nucleótidos influyen en la corriente residual, son los nucleótidos dentro y cerca de la constricción de MspA los que gobiernan las corrientes residuales.
Ejemplo 4: Reconocimiento de un solo nucleótido: un precursor de la secuenciación
[0151] Se requiere el reconocimiento y la identificación de sitios de nucleótidos individuales para la secuenciación de nanoporos. La sensibilidad de MspA a nucleótidos individuales se examinó realizando sustituciones de un solo nucleótido en la cola en horquilla del ADNss. La sustitución de un único nucleótido, dN en una cola en horquilla que de otro modo sería poli-dA, en las tres primeras posiciones contadas desde el dúplex, x =1,2,3,y se indica como dNx. Por ejemplo, un dC en la primera posición después del dúplex (x = 1) se llama dC-i. Las FIGURAS 4A-4D muestran los histogramas de laIres promediada.Con una sustitución de dC<2>,Iresestá cerca de la corriente asociada con polidC,Id c .Para una sustitución dC<1>, las corrientes iónicas medidas estuvieron entre las corrientes iónicas encontradas usando homopolímeros,IdAeId c .Se encontró que las sustituciones de dT<1>, dT<2>y dT<2>provocan una corriente iónica entreIdAeIdT,siendo la corriente para la sustitución dT<1>la más cercana aIdT.Un solo dG dentro de poli-dA no parece modular la corriente de manera apreciable de la corriente de un poli-dA puro, como podría esperarse de la relativa cercanía deIdAeIdG.La corriente residual tiende haciaIdAa medida que la sustitución del heteronucleótido se coloca más lejos del dúplex, lo que proporciona evidencia adicional de que la firma de la corriente residual se debe principalmente a los dos primeros nucleótidos después del dúplex, y en parte al tercer nucleótido. Consulte la Tabla A para obtener información adicional sobre estas colas en horquilla y sus valores de corriente residual asociados.
[0152] La referencia del homopolímero puede influir en el efecto que tiene una sustitución de heteronucleótido enIres.Este efecto se examinó utilizando una sustitución dA en una referencia de poli-dC (FIGURAS 6A-6D). La corriente residual se vio afectada por estas sustituciones en x = 1,2,3, pero las diferencias de corriente deIdcno fueron tan grandes como la influencia de las sustituciones dCx en poli-dA. De manera similar, se sustituyó un solo dA en la referencia de poli-dT y no produjo una influencia tan consistente enIresen comparación con una sustitución de dTx en la referencia de poli-dA. Estas observaciones no están bien descritas por un modelo de resistencia asociado con cada sustitución de nucleótidos. Sin embargo, la asimetría observada puede entenderse cualitativamente con los límites de velocidad del transporte de iones causados por barreras energéticas (Ejemplo 7 a continuación).
[0153] Estos resultados indican que la zona de constricción corta de MspA es de hecho responsable de la identificación de nucleótidos. En comparación con la a-hemolisina, MspA produce una densidad de corriente iónica mayor y más enfocada en su zona de constricción. La longitud de la constricción donde la corriente es más sensible a la identidad de los nucleótidos es aproximadamente la longitud de dos nucleótidos. Es posible que la especificidad de nucleótidos y la separación espacial puedan mejorarse con mutaciones adicionales en MspA, especialmente porque los datos presentados se tomaron utilizando M1-NNN-MspA, el primer mutante de MspA que permite la translocación de ADN. Debido a su importancia para la corriente residual, la constricción probablemente será un lugar prometedor para mutaciones en el sitio. Por tanto, se pueden emplear otros mutantes de MspA descritos en el presente documento, así como otras porinas Msp, para las realizaciones descritas en el presente documento.
Ejemplo 5: Efecto del extremo en horquilla sobre la corriente iónica
[0154] Dado que el dúplex en horquilla descansa cerca de la constricción de MspA, es posible que también afecte a la corriente iónica. Para explorar esto, se investigó el ADN en horquilla con varias longitudes de dúplex pero con las mismas bases terminales. Se encontró que las corrientes medidas dependían débilmente de la longitud del dúplex en horquilla, y que las longitudes del dúplex más largas inducíanIresmás bajas que las longitudes del dúplex más cortas (consulte la Tabla B). En experimentos posteriores, se conservó el dúplex original de 14 pb y solo se varió el pb terminal. Se encontró que la corriente residual depende en gran medida de este pb terminal (Tabla B), alterandoIreshasta ~20 %. Para comparar la influencia de la cola en horquilla, los experimentos presentados anteriormente se adquirieron con el mismo dúplex de 14 pb.
Ejemplo 6: Secuenciación de nanoporos con dúplex interrumpido (DI)
[0155] La corriente iónica es excepcionalmente sensible a los nucleótidos de ADN monocatenario en la constricción de MspA. Si bien la velocidad de translocación de ssDNA sin obstáculos sigue siendo demasiado rápida para utilizar esta sensibilidad, la velocidad de translocación de ADN se puede controlar mediante regiones dúplex. La siguiente sección describe un procedimiento de secuenciación de ADN que utiliza secciones de ADN de doble cadena para retardar la translocación del ADN. Con los procesos de conversión bioquímica existentes, se pueden colocar eficazmente secciones cortas de ADN bicatenario entre los nucleótidos de un ADN analito. Cuando este ADN convertido pasa a través de MspA, cada sección dúplex detiene secuencialmente la translocación. Como el nucleótido del ADN del analito se mantiene en el orificio de confinamiento por la sección dúplex, la corriente iónica residual puede identificar el nucleótido analito. Después de que un dúplex de ADN se disocia, el ADN avanza rápidamente hasta que el siguiente dúplex de ADN detiene temporalmente la translocación, lo que permite determinar el siguiente nucleótido analito. Los inventores denominan a este procedimiento secuenciación de nanoporos con dúplex interrumpido (DI).
[0156] La secuenciación DI depende de la modificación del ADN analito para que tenga secciones bicatenarias entre cada nucleótido para producir ADN "convertido". Para explorar la viabilidad de la secuenciación DI, se utilizó un ADN sintetizado en el que cada nucleótido de un ADN analito hipotético fue seguido por una región dúplex de 14 pb. Las secciones dúplex tenían secuencias idénticas a las de las horquillas examinadas anteriormente y se formaron mediante hibridación de oligonucleótidos complementarios. En lugar de utilizar nucleótidos individuales entre cada sección dúplex, se eligieron trinucleótidos para comparar fácilmente las corrientes iónicas con los experimentos de horquilla de homopolímero bien caracterizados. Se añadió una cola poli-dA al extremo 3' de la secuencia sintetizada para iniciar el enhebrado del ADN en MspA. Por ejemplo, la secuencia del analito 3'-ATGC-5' [SEQ ID NO: 1] se convertiría en la secuencia DI analizable: 5'duplex-CCC-duplex-GGA-duplex-TTT-duplex-AAA-dA323' [SEQ ID NO: 9]. Estas secuencias sintetizadas que contienen las regiones de trinucleótidos también podrían ser el producto de la conversión de ADN (ver, por ejemplo, documento WO 2000/39333).
[0157] Utilizando M1-NNN-MspA, se examinaron las construcciones de ADN para determinar las secuencias de analitos 3'-ATGC-5'[SEQ ID NO: 1] y 3'-TACG-5' [SEQ ID NO: 2], conteniendo ambas los cuatro nucleótidos. Se observaron etapas discretas sucesivas en la corriente iónica para secuencias sintetizadas con corrientes residuales que se muestran en las FIGURAS 5A y 5B. Cada nivel era consistente con uno de los niveles observados en los experimentos de horquilla de homopolímero. Usando un algoritmo de detección de bordes (ver Ejemplo 7) en las translocaciones que tenían una corriente promedio de < 25 % de la corriente de poro abierto, se encontró que ~4 % de las translocaciones exhibían los cuatro niveles de corriente,IdA, Idc, IdTeIdGen el orden previsto. En las FIGURAS 5A y 5B, se muestran trazas de muestra de cuatro niveles registradas a 140 mV junto con histogramas de la corriente promedio de los niveles encontrados para muchas translocaciones. Se presentan datos adicionales para la secuenciación DI en otros voltajes en las FIGURAS 7A-7C, 8A-8C y 9A-9C. Una gran fracción de las translocaciones exhibieron tres o menos niveles distintos (ver las tablas de las FIGURAS 10-12). Los niveles encontrados en estas translocaciones también contenían los niveles de corriente del homopolímero con un orden consistente con la secuencia del analito pero faltando uno o más niveles. Sin estar ligados a ninguna teoría, los inventores creen que las translocaciones con menos de cuatro niveles se deben a regiones dúplex no hibridadas completamente o a duraciones de nivel que fueron demasiado cortas (<1 ms) para identificarse adecuadamente.
[0158] Con el algoritmo de detección de bordes ajustado analizando las secuencias DI 3'-ATGC-5' [SEQ ID NO: 1] y 3'-TACG-5' [SEQ ID NO: 2], se realizó una prueba ciega con ADN sintetizado derivado de una secuencia corta de composición y longitud desconocidas. Se determinó que ~3 % de las translocaciones exhibieron cinco niveles en las trazas de corriente correspondientes a 3'-GTCAC-5' [SEQ ID NO: 3], que a continuación se confirmó que era la secuencia desconocida. La FIGURA 5C muestra un ejemplo de la traza de corriente de la prueba ciega. Estos experimentos DI proporcionan la primera demostración de información de secuencia extraída de moléculas de ADN que pasan en serie a través de un nanoporo.
[0159] La secuenciación de nanoporos debe poder distinguir nucleótidos repetidos utilizando la corriente residual. Con la secuenciación DI en MspA, este requisito se puede cumplir mediante el uso de un "quinto nivel" (también llamado nivel de separador) que marca la progresión al siguiente nucleótido analito. El quinto nivel se puede realizar dividiendo el dúplex de interrupción con dos oligos complementarios separados. El primer dúplex resultante produce los niveles específicos de los nucleótidos analito y el segundo dúplex produce un nivel distinto. El quinto nivel distinto se puede realizar eligiendo el segundo dúplex para que tenga el extremo terminal 5' (dC) (ver Tabla B) que produce una corriente residual mayor que la corriente residual de un 5' que es (dG) (ver Tabla A). Con esta elección, la corriente residual alternaría entre ~77 pA y las corrientes específicas del nucleótido analito entre 42 pA y 66 pA usando un voltaje de 180 mV. El quinto nivel separaría el nivel de corriente de cada nucleótido analito y permitiría leer repeticiones de nucleótidos de cualquier longitud.
[0160] Si bien una translocación individual puede indicar la secuencia, las bases perdidas pueden requerir las estadísticas de múltiples translocaciones para mejorar la fidelidad de la secuenciación. El análisis estadístico de las duraciones del nivel de corriente puede proporcionar información adicional sobre la secuencia y los nucleótidos perdidos.
[0161] Existe la posibilidad de optimizar tanto la velocidad como la sensibilidad de la secuenciación DI alterando los parámetros operativos, tales como el pH y la fuerza iónica del tampón, usando reactivos de unión a dúplex, mejorando la hibridación de oligo y usando técnicas de análisis de datos más sofisticadas (ver, por ejemplo, BMC Bioinformatics B (Suplemento 7): S14 (2007).
Ejemplo 7: Procedimiento de análisis de translocación y modelo de barrera cualitativa
[0162] Todo el software se diseñó a medida en Matlab® (The Mathworks®). La translocación de ADN se identificó por primera vez utilizando umbrales de corriente y se normalizó mediante la corriente de poro abierto circundante, tal como se describe en la Solicitud PCT, WO 2010/034018. Se observaron variaciones menores en los niveles de corriente de poro abierto en varios experimentos y probablemente se debieron a cambios menores en las condiciones del tampón que influyen en la conductividad. Las fluctuaciones entre experimentos se minimizaron dividiendo la corriente residual para cada translocación por el nivel de corriente desbloqueado circundante. Para informar de los valores de corriente, estas corrientes normalizadas se multiplicaron por la corriente promedio de poro abierto 325,1 ± 1,8 pA (media ± s.e.m.) para un voltaje aplicado de 180 mV y 252,2 /- 3,0 para un voltaje aplicado de 140 mV. Se construyeron histogramas de corrientes residuales promediadas mediante translocación con un promedioIres< 0,5 * Ios y con una duración superior a 1 ms. Los histogramas se eligen de experimentos individuales que coinciden estrechamente con la corriente residual más frecuente cuando se promedian en múltiples experimentos, tal como se registra en las Tablas A y B.
[0163] A continuación , las corrientes residuales se filtraron gaussianamente a 4 kHz y se muestrearon a 20 kHz y se procesaron adicionalmente con un filtro de 20 puntos de mediana. Las transiciones entre niveles de corriente se identificaron con un software de detección de bordes personalizado que utiliza un umbral de gradiente para detectar transiciones entre niveles únicos. Los máximos locales del gradiente de corriente se utilizaron para localizar posibles transiciones. Para ser considerados únicos, los niveles dentro de las trazas de corriente residual debían satisfacer varias condiciones: las duraciones de los niveles debían ser superiores a 1,5 ms, la corriente promedio de cada nivel debía estar separada por más de 3,8 pA de los niveles circundantes y por más de 1,5 veces la suma cuadrática de la fluctuación de corriente de los niveles circundantes. Si no se cumplían estos requisitos, los niveles se combinaban hasta que los posibles niveles se determinaban como únicos. Se encontró que las trazas de corriente residual con cuatro (o cinco en el caso de la secuencia ciega 3'-GTCAC-5' [SEQ ID NO: 3]) seguían patrones como se observa en las FIGURAS 7A-7C, 8A-8C y 9A-9C. Los promedios de estos niveles se pueden encontrar en las tablas de las FIGURAS 10-12. La información para eventos con menos de 4 (o 5) eventos se resume en las tablas de las FIGURAS 10-12.
[0164] Los datos, mostrados en las FIGURAS 6A-6G, muestran el efecto de sustituir un nucleótido dNx en una posición x = 1,2,3 después del extremo dúplex de un ADN en horquilla. Los nucleótidos están sustituidos en colas de homopolímero poli-dA, poli-dC o poli-dT. Se observó que la presencia de una sustitución dCx a dTx en poli-dA provoca que la corriente residual cambie hacia el valor del homopolímero IdC e IdT, respectivamente. Las sustituciones de un nucleótido dA en homopolímeros poli-dC o poli-dT no alteran consistentemente la corriente. Es posible que un modelo cualitativo pueda describir estos datos.
[0165] Puede ser natural esperar que cada uno de estos nucleótidos actúe como una resistencia que impida el flujo iónico. Los datos no coinciden con esta descripción, tal como se ha observado en la a-hemolisina. En lugar de un modelo de resistencia, y sin estar ligados a ninguna teoría, los inventores postulan que cada uno de los residuos de aminoácidos dentro de la constricción combinados con los nucleótidos en la constricción de MspA forman una barrera única para la corriente iónica. La presencia de nucleótidos particulares, tales como dC, dT, puede inducir un límite de velocidad en el transporte de iones. A continuación se analiza cómo los datos son consistentes con este modelo.
[0166] La observación de queIdc < IdAsugiere que cualquier nucleótido dC presentará una barrera más alta que los nucleótidos dA para el transporte de iones. Cuando se coloca un solo dCx en poli-dA, la corriente residual se reduce mediante un límite de velocidad inducido por la barrera dCx. La reducción de la corriente debido a la inserción de dCx es más fuerte en x = 2, y algo menos fuerte en x = 1, probablemente porque estas ubicaciones colocarían la sustitución en la parte más estrecha de la constricción de MspA. Al examinar la influencia de una sustitución dAx en colas de poli-dC, se observa que la corriente no aumenta apreciablemente. Esto se debe a que los nucleótidos dC de alta barrera que rodean la sustitución dAx inducen un límite de velocidad para el transporte de iones, mientras que la barrera más pequeña presentada por el dA único no puede deshacer este límite de velocidad.
[0167] Se observa un efecto similar cuando la alta barrera causada por dT se coloca en una cola de poli-dA: la corriente se reduce considerablemente ya que la sustitución dTx está situada dentro de la constricción, particularmente en x = 1. ComoIdT< IdA, estas observaciones respaldan la posibilidad de que nucleótidos específicos induzcan límites de velocidad al flujo de iones. Otras implicaciones de este modelo indican que cuando se realiza la sustitución dA<1>en poli-dT, el dT en la segunda posición será el siguiente nucleótido disponible para inducir un límite de velocidad del transporte iónico. Como era de esperar, se observa que la sustitución de dT<2>en poli-dA induce una corriente de velocidad limitada con una distribución similar a la corriente debido a la sustitución de dA<1>en poli-dT. La diferencia en qué ubicación la sustitución dCx y d x es más influyente en poli-dA (x = 2 y x = 1, respectivamente) puede atribuirse a las interacciones específicas entre los nucleótidos con el poro y el extremo en horquilla.
[0168] También se proporciona un sistema que comprende una porina Msp que tiene un vestíbulo y una zona de constricción que definen un túnel, en el que el túnel está colocado entre un primer medio líquido y un segundo medio líquido, en el que al menos un medio líquido comprende un analito, y en el que el sistema es operativo para detectar una propiedad del analito. Un sistema puede ser operativo para detectar una propiedad de cualquier analito que comprende someter una porina Msp a un campo eléctrico de manera que el analito interactúe con la porina Msp. Un sistema puede ser operativo para detectar una propiedad del analito que comprende someter la porina Msp a un campo eléctrico de modo que el analito se transloque electroforéticamente a través del túnel de la porina Msp. También se proporciona un sistema que comprende una porina Msp que tiene un vestíbulo y una zona de constricción que definen un túnel, en el que el túnel está colocado en una bicapa lipídica entre un primer medio líquido y un segundo medio líquido, y en el que el único punto de comunicación líquida entre el primer y segundo medio líquido se produce en el túnel. Además, cualquier porina Msp descrita en el presente documento puede estar comprendida en cualquier sistema descrito en el presente documento.
[0169] Cualquier sistema descrito en el presente documento puede comprender además un amplificador de parche de membrana o un dispositivo de adquisición de datos. Un sistema puede comprender además uno o más dispositivos reguladores de temperatura en comunicación con el primer medio líquido, el segundo medio líquido o ambos.
[070] Cualquier sistema descrito en el presente documento puede ser operativo para translocar un analito a través de un túnel de porina Msp ya sea electroforéticamente o de otra manera.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para secuenciar dos o más unidades de un analito modificado con al menos una primera construcción de detención y una segunda construcción de detención, que comprende:
(a) proporcionar un nanoporo colocado entre un ladocisque comprende un primer medio líquido conductor y el analito modificado y un ladotransque comprende un segundo medio líquido conductor, en el que el nanoporo proporciona comunicación líquida entre el ladocisy el ladotrans;
(b) provocar que la primera construcción de detención del analito modificado detenga temporalmente la translocación del analito modificado al entrar la primera construcción de detención en el nanoporo, produciendo así un primer nivel de corriente iónica que representa una primera unidad;
(c) alterar la primera construcción de detención del analito modificado, permitiendo la alteración que el analito modificado avance hacia el ladotrans;
(d) provocar que la segunda construcción de detención del analito modificado detenga temporalmente la translocación del analito modificado al entrar la segunda construcción de detención en el nanoporo, produciendo así un segundo nivel de corriente iónica que representa una segunda unidad; y
(e) comparar el primer nivel de corriente iónica y el segundo nivel de corriente iónica con un nivel de corriente iónica conocido de una unidad conocida, identificando así la primera y segunda unidades del analito.
2. Procedimiento, según de la reivindicación 1, en el que el analito modificado comprende un ácido nucleico unido a una construcción de detención.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que al menos una construcción de detención es una construcción de detención de inserción o una construcción de detención colgante.
4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que la construcción de detención de inserción es un ácido nucleico dúplex.
5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la primera construcción de detención detiene temporalmente el analito modificado durante un período de tiempo suficiente para permitir que el nivel de corriente iónica determine la identidad de una unidad y una segunda construcción de detención de manera opcional secuencial a la primera construcción de detención detiene temporalmente el analito modificado para producir un nivel de corriente iónica que difiere de cualquier nivel de corriente iónica específica de la unidad y se define como un nivel de separador.
6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la aplicación de un campo eléctrico provoca que el analito modificado entre en el nanoporo o la presión física provoca que el analito modificado entre en el nanoporo.
7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se une una perla magnética al analito modificado en el ladotrans,y se provoca una alteración por una fuerza magnética que provoca que el analito modificado se mueva a través del nanoporo.
8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la alteración es provocada por un pulso de voltaje, una rampa de voltaje, un pulso de luz o un pulso de fuerza mecánica.
9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la alteración comprende la disociación de la construcción de detención o el cambio conformacional de la construcción de detención.
10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el nanoporo es una porina deMycobacterium smegmatis(Msp) o un mutante de la misma, o a-hemolisina o una variante de la misma.
11. Sistema que comprende:
un nanoporo de proteína colocado entre un lado cis que comprende un primer medio líquido conductor y un lado trans que comprende un segundo medio líquido conductor, en el que el nanoporo de proteína está dispuesto en una membrana artificial que abarca la abertura de un orificio, en el que la membrana comprende ácido micólico y tiene un voltaje de ruptura superior a 1,0 V cuando el voltaje aplicado a través de la membrana aumenta en rampa a aproximadamente 100 mV/s en presencia de una solución de KCl 1,0 M preparada con agua desionizada, tamponada a pH 8,0 ± 0,05 con HEPES 10 mM, y en el que el nanoporo de proteína proporciona comunicación líquida entre el lado cis y el lado trans;
un dispositivo de adquisición de datos operable para detectar una corriente iónica a través del nanoporo de proteína; y
un analito de ácido nucleico en el primer medio líquido, en el que el analito de ácido nucleico comprende una primera construcción de detención y una segunda construcción de detención, en el que la primera construcción de detención está configurada para detener temporalmente el avance del analito de ácido nucleico hacia el lado trans después de la entrada del analito de ácido nucleico en el nanoporo de proteína durante un tiempo suficiente para detectar un primer nivel de corriente iónica y a continuación permitir que el analito de ácido nucleico avance hacia el lado trans.
12. Sistema, según la reivindicación 11, en el que la segunda construcción de detención está configurada para detener temporalmente el avance del analito de ácido nucleico hacia el lado trans después de que la primera construcción de detención haya permitido que el analito de ácido nucleico avance durante un tiempo suficiente para detectar un segundo nivel de corriente iónica, y en el que uno de la primera construcción de detención y la segunda construcción de detención está colocado sobre el analito de ácido nucleico de manera que el primer nivel de corriente iónica o el segundo nivel de corriente iónica es un nivel separador que difiere de cualquier nivel de corriente iónica específico de unidad de ácido nucleico.
13. Sistema de la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que el nanoporo es una porina deMycobacterium smegmatis(Msp) o un mutante de la misma, o a-hemolisina o una variante de la misma.
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