ES2576114T3 - Nanoporos MSP y procedimientos relacionados - Google Patents

Abstract

Porina de Mycobacterium Smegmatis (Msp) que tiene un vestíbulo y una zona de constricción que definen un túnel, en la que la Msp comprende una MspA mutante que comprende una mutación en las posiciones 90, 91 y 93, en la que la mutación en la posición 90 es D90N, la mutación en la posición 91 es D91N, y la mutación en la posición 93 es D93N.

Description

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DESCRIPCION

Nanoporos MSP y procedimientos relacionados REFERENCIA CRUZADA A LA SOLICITUD DE RELACIONADA

[0001] La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° de Serie 61/098.938, presentada el 22 de septiembre, 2008.

DECLARACION DE DERECHOS DE LICENCIA DEL GOBIERNO

[0002] La presente invencion se realizo con el apoyo del Gobierno bajo la subvencion numero 5R21HG004145 otorgada por el Instituto Nacional de Salud. El Gobierno tiene ciertos derechos en la invencion.

ANTECEDENTES

[0003] Las tecnologfas de secuenciacion de ADN establecidas requieren grandes cantidades de ADN y varios etapas largas para construir solo varias decenas de bases de la secuencia completa. Esta informacion debe entonces montarse en estilo "shotgun", un esfuerzo que depende no linealmente del tamano del genoma y de la longitud de los fragmentos de los que se construye el genoma completo. Estas etapas son caras y consumen mucho tiempo, especialmente cuando se secuencian los genomas de mairnferos. Butler, T ("Nanopore analysis of nucleic acids" Tesis (Ph.D.) Universidad de Washington, 2007, Dissertation Abstracts International, Vol. 68, num. 5B 2007, pagina 2889) describe una porina mutante MspA D90s/D91 S/D93N.

DESCRIPCION RESUMIDA

[0004] La presente invencion se define de acuerdo con las reivindicaciones. Por lo tanto, la invencion proporciona una porina de Mycobacterium smegmatis (Msp) que tiene un vestfbulo y una zona de constriccion que definen un tunel, en el que la Msp comprende una MspA mutante que comprende una mutacion en las posiciones 90, 91 y 93, en la que la mutacion en la posicion 90 es D90N, la mutacion en la posicion 91 es D91N, y la mutacion en la posicion 93 es D93N. En algunas realizaciones, la Msp comprende al menos un aminoacido con carga positiva adicional en comparacion con el vestfbulo de una Msp de tipo salvaje, tal como una mutacion en la posicion 118, en la que la mutacion en la posicion 118 es D118R, y opcionalmente una mutacion en la posicion 139, en la que la mutacion en la posicion 139 es E139K o E139R. En algunas realizaciones, la Msp comprende mutaciones en las posiciones 118, 139 y 134, en la que la mutacion en la posicion 118 es D118R, la mutacion en la posicion 134 es D134R, y la mutacion en la posicion 139 es E139K.

[0005] La presente invencion tambien proporciona el uso de una Msp de la invencion, para detectar la presencia de un analito.

[0006] La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para detectar la presencia de un analito, que comprende: aplicar un campo electrico suficiente para trasladar un analito de un primer medio lfquido conductor a un segundo medio lfquido conductor en comunicacion de lfquidos a traves de una Msp de la invencion; y medir una corriente de iones, en la que la aparicion de un bloqueo en el patron de corriente de iones indica la presencia del analito en el primer medio lfquido conductor. En algunas realizaciones, dicho primer medio lfquido conductor se mantiene en tierra, y se aplica una tension positiva al segundo medio lfquido conductor. En algunas realizaciones, el bloqueo o bloqueos en el patron de corriente de iones se caracterizan por: (a) reduccion de la corriente de iones hasta entre el 80% y el 50% del nivel de no bloqueado; o (b) reduccion de la corriente de iones hasta menos del 50% del nivel no bloqueado. En algunas realizaciones, el procedimiento se lleva a cabo a 180mV o mas.

[0007] La presente invencion tambien proporciona un aparato para usar en el procedimiento de la invencion, que comprende una Msp de la invencion, en el que el tunel de la Msp se encuentra entre un primer medio lfquido conductor y un segundo medio lfquido conductor; en el que al menos un medio lfquido conductor comprende un analito, y en el que el sistema es operativo para detectar el analito.

[0008] En algunas realizaciones de la invencion, el analito es un polfmero, por ejemplo acido nucleico. En realizaciones de la invencion en el que el analito es un polfmero que comprende mas de una unidad, el procedimiento de la invencion puede comprender ademas: identificar una o mas unidades del polfmero en un procedimiento que comprende medir la corriente de iones o proporcionar un patron de corriente que comprende un bloqueo para cada unidad de polfmero; y comparar uno o mas bloqueos en cada patron de corriente con (i) uno o mas bloqueos en el patron de corriente o (ii) uno o mas bloqueos en un patron de corriente obtenido usando un polfmero que tiene unidades conocidas. En algunas realizaciones, el uso, el procedimiento o aparato de la invencion es para la secuenciacion de acidos nucleicos. El acido nucleico puede ser ADN, por ejemplo ADN monocatenario, o ARN.

[0009] La presente invencion tambien proporciona un acido nucleico que codifica una Msp de la invencion.

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[0010] La presente invencion tambien proporciona un vector que comprende un acido nucleico que codifica una Msp de la invencion. El vector comprende opcionalmente un promotor unido operativamente a dicho acido nucleico que codifica una Msp de la invencion.

[0011] La presente invencion tambien proporciona una bacteria Mycobacterium smegmatis mutante capaz de la expresion de Msp, comprendiendo la bacteria: (a) una delecion de una MspA de tipo salvaje; (b) una delecion de una MspC de tipo salvaje; (c) una delecion de una MspD de tipo salvaje; (e) un vector como se describe anteriormente. En algunas realizaciones, la bacteria Mycobacterium smegmatis mutante es la cepa ML16 de Mycobacterium smegmatis. La invencion proporciona tambien una porina de Mycobacterium smegmatis obtenible a partir de la bacteria Mycobacterium smegmatis mutante descrita anteriormente.

[0012] Tambien se proporciona un procedimiento que comprende aplicar un campo electrico a una porina de porina de Mycobacterium smegmatis (Msp) que tiene un vestfbulo y una zona de constriccion que definen un tunel, en el que la porina de Msp se encuentra entre un primer medio lfquido conductor y un segundo medio lfquido conductor.

[0013] Tambien se proporciona un procedimiento de modificacion de la conductancia a traves del tunel de una porina de Msp que comprende eliminar, anadir, o sustituir al menos un aminoacido en el vestfbulo o en la zona de constriccion de una porina de Msp de tipo salvaje.

[0014] Tambien se proporciona un sistema que comprende una porina de Msp que tiene un vestfbulo y una zona de constriccion que definen un tunel, en el que el tunel se encuentra entre un primer medio lfquido y un segundo medio lfquido, en el que al menos un medio lfquido comprende un analito, y en el que el sistema es operativo para detectar una propiedad del analito.

[0015] Tambien se proporciona un sistema que comprende una porina de Msp que tiene un vestfbulo y una zona de constriccion que definen un tunel, en el que el tunel se encuentra en una bicapa lipidica entre un primer medio lfquido y un segundo medio lfquido, y en el que el unico punto de la comunicacion de lfquidos entre el primer y el segundo medio lfquido se produce en el tunel.

[0016] Tambien se proporcionan porinas Msp mutantes. Por ejemplo, se proporciona una porina de porina de Mycobacterium smegmatis A (MspA) que comprende un vestfbulo y una zona de constriccion que definen un tunel, y al menos un primer monomero de MspA mutante que comprende una mutacion en la posicion 93 y una mutacion en la posicion 90, posicion 91, o ambas posiciones 90 y 91. Tambien se proporciona una porina de MspA mutante que comprende un vestfbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diametro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constriccion que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a sobre 3 nm y un diametro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en la que el vestfbulo y la zona de constriccion juntos definen un tunel, y que comprende ademas al menos un primer monomero de MspA mutante paralogo u homologo. Tambien se proporciona un mutante de MspA paralogo u homologo que comprende un vestfbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diametro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constriccion que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y un diametro desde aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en la que el vestfbulo y la zona de constriccion juntos definen un tunel.

[0017] Se describen procedimientos de preparacion de porinas Msp mutantes. Por ejemplo, en el presente documento se proporciona un procedimiento de fabricacion de una porina de MspA mutante, que comprende modificar un monomero de MspA de tipo salvaje en la posicion 93 y en la posicion 90, posicion 91, o en ambas posiciones 90 y 91. Tambien se proporciona un procedimiento de fabricacion de una porina de MspA mutante que tiene un vestfbulo y una zona de constriccion que definen un tunel, que comprende la eliminar, anadir o sustituir cualquier aminoacido en el vestfbulo o en la zona de constriccion de monomero de MspA de tipo salvaje paralogo u homologo, de manera que la porina de MspA mutante resultante es capaz de trasladar un analito a traves del tunel despues de la aplicacion de un campo electrico.

[0018] Tambien se proporciona un procedimiento que comprende trasladar un analito a traves de un tunel de una porina de porina de Mycobacterium smegmatis (Msp) sin el empleo de un campo electrico.

[0019] En el presente documento se proporcionan secuencias de acido nucleico. Opcionalmente, una secuencia de acido nucleico puede comprender una primera y segunda secuencia de nucleotidos, en el que la primera secuencia de nucleotidos codifica una primera secuencia de monomero de Msp y la segunda secuencia de nucleotidos codifica una segunda secuencia de monomero de Msp. La secuencia de acido nucleico puede comprender ademas una tercera secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos enlazadora. Opcionalmente, la secuencia de acido nucleico comprende ademas un tercer o mas secuencia de nucleotidos que codifica una tercera o mas secuencia de monomero de Msp. Por ejemplo, la secuencia de acido nucleico puede comprender ademas una tercera, cuarta, quinta, sexta, septima y octava secuencia de nucleotidos. La primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima y octava secuencia de nucleotidos codifican una primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima y octava secuencia de monomero de Msp, y la secuencia de acido nucleico comprende ademas una

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noveno secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos de enlace. Tambien se proporcionan porinas Msp que comprenden dos o mas Msp de cadena unica.

[0020] Tambien se proporcionan polipeptidos codificados por los acidos nucleicos descritos en el presente documento. Tambien se proporcionan vectores que comprenden los polipeptidos descritos en el presente documento. Tambien se proporcionan celulas cultivadas transfectadas con cualquier vector descrito en el presente documento, o progenie de las mismas, en el que la celula es capaz de expresar una porina de Msp o un monomero de porina de Msp. Tambien se proporciona una cepa de Mycobacterium smegmatis que comprende cualquier vector descrito en el presente documento.

[0021] Tambien se proporciona una cepa bacteriana mutante capaz de expresion inducible de monomero de Msp, comprendiendo la cepa bacteriana: (a) una delecion de una MspA de tipo salvaje; (B) una delecion de una MspC de tipo salvaje; (c) una delecion de una MspD de tipo salvaje; y (d) un vector que comprende un promotor inducible unido operativamente a una secuencia de acido nucleico de monomero de Msp.

[0022] Tambien se proporciona un procedimiento de produccion de una porina de Msp de una cadena, comprendiendo el procedimiento: (a) transformar una cepa bacteriana mutante con un vector que comprende una secuencia de acido nucleico capaz de codificar una una porina de Msp de una cadena; y opcionalmente (b) purificar la porina de Msp de una cadena de la bacteria. La cepa mutante puede incluir deleciones de una MspA de tipo salvaje, una MspB de tipo salvaje, una MspC de tipo salvaje, y una MspD de tipo salvaje, y un vector que comprende un promotor inducible unido operativamente a una secuencia de acido nucleico de Msp. La cepa mutante puede ser transformada con un vector que comprende una secuencia de acido nucleico capaz de codificar una porina de Msp de una cadena.

[0023] Se proporcionan ademas procedimientos de uso de porinas Mps, tales como una porina de Msp de una cadena. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender crear una bicapa lipidica que tiene una primera cara y una segunda cara, anadir una porina de Msp, tal como una porina de Msp de una cadena purificada, a la primera cara de la bicapa lipidica, aplicar un voltaje positivo a la segunda cara de la bicapa, trasladar una secuencia de acido nucleico experimental o secuencia de polipeptidos a traves de la porina de Msp, medir la corriente de bloqueo de la secuencia de traslado pasada a traves de la porina de Msp, y comparar la corriente de bloqueo experimental con un patronm de bloqueo de corriente y determinar la secuencia experimental.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0024] Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas concomitantes resultaran mas facilmente apreciadas, ya que los mismos se entenderan mejor por referencia a la siguiente descripcion detallada, cuando se toma conjuntamente con los dibujos adjuntos.

La FIGURA 1 muestra la estructura y distribucion de carga de porina de MspA de tipo salvaje (WTMspA). A pH 8, se espera que los residuos acidos esten predominantemente con carga negativa y los residuos basicos esten con carga positiva. Los lugares y las identidades de la mutacion se indican con flechas y etiquetas. Vease Faller y otros, Science, 303: 1189 (2004).

La FIGURA 2 muestra los resultados de ensayos de actividad formadora de tunel y conductancia de un solo tunel para porinas WTMspA, mutante D90N/D91N/D93N (MIMspA, tambien llamada M1-NNN), y mutante D90N/D91N/D93N/D118R/E139K/D134R (M2MspA, tambien llamada M2-NNN). Los paneles de la izquierda muestran la conductancia en la bicapa con el tiempo cuando una porina de MspA esta presente en la solucion (1 M KCl, 20°C) que bana la bicapa. Aumentos graduales en la conductancia se interpretan como inserciones de porinas MspA en la bicapa. A la derecha estan los histogramas de los tamanos de estas etapas de conductancia. Los histogramas de porina WTMspA, M1MspA, y M2MspA resumen 40 inserciones de 3 experimentos repetidos, 144 inserciones de 3 experimentos repetidos, y 169 inserciones de 5 experimentos repetidos, respectivamente.

Las FIGURAS 3A y 3B muestran el comportamiento espontaneo de bloqueo de porinas WTMspA. La FIGURA 3A es un diagrama esquematico de experimentos. La FIGURA 3B muestra senales de corriente ionica representativas observadas para porinas WTMspA a 60 mV (izquierda) y 100 mV (derecha) sin ADN presente. Los intervalos de flujo de corriente negativa corresponden a la inversion de la tension aplicada, que a menudo se requena para restablecer el nivel de corriente ionica no bloqueado.

La FIGURA 4 muestra la expresion de monomeros de MspA mutantes en un gel electroforetico. Se anadio extracto crudo (13 |il) a cada carril. El gel se tino con azul de Coomassie. Carril 1: marcador de masa de protema; Carril 2: WTMspA; Carril 3: sin MspA; Carril 4: mutante M1MspA; Carril 5: mutante D90N/D91N/D93N/D118R; Carril 6: mutante D90N/D91N/D93N/D118R/E139R; Carril 7: mutante D90N/D91N/D93N/D118R/E139K; Carril 8: mutante M2MspA. Los mutantes en los carriles 5-7 se construyeron, extrajeron y estudiaron para garantizar que la expresion y la actividad de formacion de tunel se manteman para cada sustitucion sucesiva de aminoacidos. Los diagramas por encima del gel muestran esquematicamente la ubicacion aproximada y la polaridad de los aminoacidos mutados en este experimento.

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Las FIGURAS 5A-5C muestran la deteccion de construcciones de ssADN en horquilla con porinas MIMspA. La FIGURA 5A es un diagrama esquematico de experimented. La FIGURA 5B muestra la senal de corriente ionica representativa observada para porinas MIMspA en ausencia de ADN y presencia de 8 |iM de ADN en horquilla hp08 M (SEQ ID NO: 4) a 180 y 140 mV. La FIGURA 5C muestra bloqueos numerados de trazas en la FIgUrA 5B a escalas de tiempo mas amplios.

La FIGURA 6 muestra las caractensticas de bloqueos profundos de las construcciones de horquilla en la porina MIMspA. Las coordenadas de cada punto proporcionan la duracion y la corriente media de 1 bloqueo profundo. Los datos en negro y gris se adquirieron a 140 y 180 mV, respectivamente. El modo del log-io de los tiempos de permanencia del bloqueo profundo, fo, se indica para cada conjunto de datos. Los diagramas de la derecha muestran la secuencia de cada construccion de horquilla: hp08 (5' GcTGTTGC TCTCTC GCAACAGC A50 3') (SEQ ID NO: 4), hp10 (5' GCTCTGTTGC TCTCTC GCAACAGAGC A50 3') (SEQ ID NO: 5), y hp12 (5' GCTGTCTGTTGC TCTCTC GCAACAGACAGC A50-3') (SEQ ID NO: 6).

La FIGURA 7 es un grafico que muestra las distribuciones de los tiempos del bloqueo parcial para hp08 (SEQ ID NO: 4) en la porina M1MspA. Las distribuciones estan bien ajustados por exponenciales individuales. Los bloqueos parciales a 180 mV tienen una constante de tiempo que es un factor de ~ 3 mas largo que a 140 mV.

La FIGURA 8 proporciona una vision detallada de las distribuciones del tiempo de permanencia de los bloqueos profundos de las construcciones de horquilla en la porina M1MspA. Los paneles de la izquierda muestran los histogramas de tiempo con intervalos espaciados logantmicamente (representaciones en escalera) y las correspondientes estimaciones de la densidad Kernel suavizado de la distribucion de probabilidad del log-10 de los tiempos de permanencia (x). El maximo de estas estimaciones de densidad suavizadas, fD, se utilizo para parametrizar las distribuciones del tiempo de permanencia. Las lmeas verticales muestran los valores de fD. Los paneles de la derecha muestran las curvas de probabilidad de supervivencia derivadas de los datos de tiempo de permanencia (lmeas continuas) y exponenciales de descomposicion individual, con constantes de tiempo establecidas a los valores de fD de cada conjunto de datos (lmeas de puntos). Los datos se desvfan claramente del comportamiento exponencial simple. Sin embargo, es razonable hacer comparaciones cualitativas entre el valor fD y constantes de tiempo exponenciales utilizadas en otras investigaciones (Kasianowicz et al, Proc Natl Acad Sci USA, 93: 13 770 (1996)), ya que ambos parametros reflejan aspectos similares de las distribuciones del tiempo de permanencia.

Las FIGURAS 9A-9G muestran los datos adquiridos a partir de experimentos de sonda transbicapa. La FIGURA 9A muestra la animacion de conFIGURAciones moleculares: (1) un poro no bloqueado; (2) un ssADN enroscado con neutravidina (nA) que detiene el traslado del complejo nA-ssADN; (3) ADN diana hibridado con nA-ssADN que se disocia a voltaje negativo; y (4) el complejo nA-ssADN que sale del poro a una tension que depende de la hibridacion del ADN diana. La FIGURA 9B es una serie con el tiempo de la tension aplicada. Un bloqueo de corriente provoca un cambio de la tension de captura de 180 mV a una tension de manteniemiento de 40 mV despues de un retraso de ~ 200 ms. La tension de mantenimiento se mantiene durante 5 segundos para permitir la hibridacion, y a continuacion se realiza una rampa negativa. Las FIGURAS 9C y 9D muestran cada una series con el tiempo de la corriente que demuestran una salida de nA-ssADN a voltajes negativos y positivos, respectivamente. Los grandes picos de corriente se producen debido a cambios de voltaje instantaneos y al cierre espontaneo de los poros a grandes voltajes negativos. Las FIGURAS 9E-9G son histogramas de voltaje de salida (Vsalida). La FIGURA 9E muestra un experimento en el que la sonda, 5'-C6As4-CTCTATTCTTATCTC-3 '(SEQ ID NO: 7, era complementaria a las moleculas de ssADN diana, 5'-GAGATAAGAATAGAG-3' (SEQ ID NO: 9). La FIGURA 9F muestra el mismo poro que en la FIGURA 9E, pero con una sonda, 5'-C6A54-cAcACACACACACAC-3 '(SEQ ID NO: 8), que no es complementaria al ADN diana. La FIGURA 9G muestra los resultados de un control separado utilizando la misma sonda (SEQ ID NO: 7) que en la FIGURA 9E, pero sin ADN diana presente en el compartimiento trans. Se observa un numero significativo de sucesos de Vsalida negativos solo en la FIGURA 9E, donde la sonda (SEQ ID NO: 7) es complementaria a la diana. La aparicion poco frecuente de sucesos de Vsalida negativo en las FIGURAS 9F y 9G descartan la posibilidad de que una mayona de Vsalida negativo en la FIGURA sea causada por una asociacion no espedfica de sonda-diana o por la union de la sonda al poro.

Las FIGURAS 10A-10C comparan los bloqueos de homopolfmeros de dT50 (SEQ ID NO: 32) para porinas M1MspA y M2MspA. La FIGURA 10A es un diagrama esquematico de experimentos. La FIGURA 10B muestra senales representativas de corriente ionica observadas para la porina M1MspA con 8 |iM de dT50 (izquierda) y la porina M2MspA con 2 |iM de dT50 (derecha). La FIGURA 10C muestra los bloqueos numerados de trazas en la FIGURA 10B a escalas de tiempo mas amplias.

La FIGURA 11 muestra caractensticas estadfsticas de bloqueos de dT50 (SEQ ID NO: 32) en la porina M2MspA. Comparacion de la estructura media al inicio y al final de los bloqueos. La FIGURA fue creada mediante la superposicion de los sucesos en un archivo de datos alineados al inicio del suceso (izquierda) y al final del suceso (derecha). Se muestra la tendencia de los bloqueos para terminar con una breve desviacion hacia abajo de la corriente ionica, junto con el aumento de esta tendencia con voltaje.

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La FIGURA 12A muestra los histogramas de los niveles de corriente de bloqueo en la porina MIMspA bloqueada por construcciones de ADN. Las construcciones de ADN de arriba a abajo: 3'-A47AAC-hp-5' (SEQ ID NO: 14); 3-A47ACA hp-5' (SEQ ID NO: 33); 3'-A,7CAA-hp-5 '(SEQ ID NO: 13); 3'-C50-hp-5' (SEQ ID NO: 16); 3'-A50-hp-5' (SEQ ID NO: 10). La FIGURA 12B muestra un grafico de los niveles de corriente escalados a la diferencia entre los niveles de poli-C (= 1,0) y poli-A (=0.0) frente a la posicion C sola. Un ajuste gaussiano sugiere que la posicion de reconocimiento para una C sola es 1,7 ± 0,8 nucleotidos (nt) desde el extremo de la horquilla.

La FIGURA 13 muestra una serie de histogramas de corriente de ADN que bloquea la porina M1-NNN MspA (tambien llamada M1MspA). La construcciones de ADN de arriba a abajo: 3'-C50-hp-5' (SEQ ID NO: 16); 3'-A50-hp-5' (SEQ ID NO: 10); 3'-T47TTT-hp-5' (SEQ ID NO: 17); 3'-A47AAT-hp-5' (SEQ ID NO: 34); 3'-A4747ATA-hp-5' (SEQ ID NO: 35); 3'-A47TAA-hp-5' (SEQ ID NO: 36); 3'-C47CCA-hp-5' (SEQ ID NO: 37); 3'-C47CAC-hp-5' (SEQ ID NO: 38); 3'- C47ACC-hp-5' (SEQ ID NO: 39). Cada construccion o mezcla se muestra a la izquierda. El conjunto de sucesos en cada histograma se muestra a la derecha. Panel superior: "mezcla de Calibracion" (poli-A-hp y poli-C-hp). Paneles 25: poli-T-hp y bases T solas en un fondo de poli-A. Tres paneles inferiores: bases A solas en un fondo de poli-A. Poli- A-hp se incluye en la mezcla de referencia (pequeno pico a 19,5%). Todos los datos son con aplicacion de 180 mV.

La FIGURA 14 demuestra que la cola de ADN no afecta a las propiedades de reconocimiento. La leyenda es como para la FIGURA 13. Dos colas heterogeneas ('ran1' (SEQ ID NO: 51), 'ran2 '(SEQ ID NO: 52), cada una de 47 bases) estan unidas a trinucleotidos y la horquilla. El panel central muestra el histograma de corriente que resulta cuando una mezcla de ADN A50-hp (SEQ ID N°: 10) y ADN ran1-C3-hp se aplica al poro, un punto de referencia para los otros paneles. Los niveles de corriente son identicos a los de las colas de A50 o C50. Todos los datos son con una aplicacion de 180 mV.

Las FIGURAS 15A y 15B muestran los datos de caracterizacion de la porina M2-qqn, otra porina de MspA mutante. La FIGURA 15A presenta el nivel de expresion de este mutante. Todas las protemas se expresaron en M. smegmatis ML16. Se cargaron 10 |il de extracto crudo de octilpolioxietileno al 0,5% en cada pocillo. Carril 1: WTMspA; Carril 2: Fondo (pMS2, vector vado); Carril 3: M2-QQN (pML866). La FIGURA 15B muestra trazas de corriente de la porina M2-QQN en una bicapa lipidica de difitanoilfosfatidilcolina que se registraron en KCl 1 M. Se anadieron aproximadamente 70 pg de protema a la camara de la bicapa. Aproximadamente 100 poros de cuatro membranas se analizaron en experimentos de bicapa lipfdica. La conductancia principal de la porina M2-QQN es de 2,4 nanosegundos (ns).

La FIGURA 16 muestra histogramas de corriente de bloqueo con tres porinas MspA mutantes diferentes expuestas a mezclas de ADN en horquilla de hp-T50 (SEQ ID NO: 17), hp-C50 (SEQ ID NO: 16), y hp-A50 (SEQ ID NO: 10). En cada caso, las corrientes se normalizan a la corriente de estado abierto, mostrada a la derecha para cada mutante. hp-C50 y hp-A50 se utilizaron como una mezcla, y T50 se utilizo por separado.

La FIGURA 17 es un grafico que muestra la probabilidad de supervivencia de los bloqueos profundos de corriente de dos porinas MspA mutantes. Se muestra la probabilidad de sucesos que duran mas de t. Los drculos indican la porina M2-QQN, y las cruces indican la porina M2-NNN. Los voltajes aplicados a traves de las bicapas fueron 100, 120, y 140 mV. Se normalizan los datos para el numero total de sucesos en cada registro.

La FIGURA 18 muestra un alineamiento de monomeros de MspA, MspB, MspC y MspD de M. smegmatis. El primer codon ATG o GTG de los marcos de lectura abierta se tomaron como el supuesto codon de inicio. La numeracion de la protema comienza con el primer aminoacido de la parte madura. La secuencia de aminoacidos del monomero de MspA es SEQ ID NO: 28, la secuencia de aminoacidos del monomero de MspB es SEQ ID NO: 29, la secuencia de aminoacidos del monomero MspC es SEQ ID NO: 30, y la secuencia de aminoacidos del monomero MspD es SEQ ID NO: 31.

La FIGURA 19 es una imagen de un gel que muestra la eliminacion de cada uno de los genes de porina en el mutante cuadruple de porina ML59 de M. smegmatis.

La FIGURA 20 muestra una transferencia Western que demuestra la expresion de la porina de Msp en porinas mutantes de M. smegmatis y M. smegmatis. El carril 1 es una dilucion 1:10 de extracto de protema para la M. smegmatis de tipo salvaje, carril 2 es el mutante MN01 (AmspA), carril 3 es el mutante ML10 (AmspAC), carril 4 es el mutante ML16 (AmspACD), y el carril 5 es el mutante ML180 (AmspABCD).

Las FIGURAS 21A y 21B muestran mapas de los plasmidos para la construccion de un mutante cuadruple de porina. Hyg: gen de resistencia a higromicina; ColE1: origen de la replicacion de E. coli. La FIGURA 21A es el mapa de plasmido de integracion para la expresion de MspA. Se requieren AmiC, A, D, S para la expresion inducible por acetamida de MspA. attP: sitio de union a cromosoma del fago L5; int: L5 integrasa; FRT: sitio de Flp recombinasa. La FIGURA 21B es el mapa del plasmido para el vector de delecion MspB. MspBup, MspBdown: regiones aguas arriba y aguas abajo de MspB; loxP: Cre sitio de recombinacion; SacB: levansucrasa; XylE: catecol-2,3-dioxigenasa; Gfp2+: protema fluorescente verde; tsPAL5000: origen sensible a la temperatura de la replicacion para micobacterias.

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La FIGURA 22 es una imagen de un gel tenido con azul de Coomassie que muestra la expresion inducible de monomeros de MspA en M. smegmatis.

La FIGURA 23 es una imagen que demuestra el crecimiento del mutante cuadruple de Msp ML705 en placas de agar Middlebrook 7H10.

La FIGURA 24 es un grafico que muestra la tasa de crecimiento de ML705 en medio lfquido rico.

La FIGURA 25 es una imagen de una transferencia Western que demuestra la expresion de monomeros de MspA en el mutante cuadruple ML705 tras la induccion con acetamida. El carril 1 es de M. smegmatis de tipo salvaje, el carril 2 es la cepa mutante cuadruple ML705con acetamida, el carril 3 es la cepa mutante de msp cuadruple ML705 sin acetamida, y el carril 4 es la cepa mutante triple ML16. Las protemas se detectaron utilizando un anticuerpo policlonal para MspA.

Las FIGURAS 26A-26D muestran la estructura y actividad de tunel del dfmero de nanoporos de MspA de una cadena. La FIGURA 26A es una imagen del modelo molecular del dfmero de nanoporos de MspA de una cadena. La FIGURA 26B muestra el esquema de la construccion del gen del de nanoporos de MspA de una cadena (scMspA). La region de aminoacidos enlazadora (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 3) esta ampliada. Tambien se muestra la secuencia de ADN del enlazador de aminoacidos: (5 'GGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTG

GCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGC-3') (SEQ ID 19 NO). La FIGUrA 26C es una imagen de una transferencia Western que demuestra la expresion del dfmero de nanoporos de scMspA en M. smegmatis. El carril 1 es el marcador de masa molecular (M), el carril 2 es M. smegmatis de tipo salvaje (WT Msmeg), el carril 3 es la cepa ML16 sin la construccion genica de scMspA (ML16), el carril 4 es la cepa ML16 con una construccion genica de MspA de tipo salvaje (WTMspA), y el carril 5 es la cepa ML16 con la construccion genica de dfmeros de nanoporos de scMspA (scMspA). La FIGURA 26D muestra una traza de corriente para el dfmero de nanoporos de scMspA.

La FIGURA 27 muestra un esquema de transporte de ssADN dC58 (SEQ ID NO: 40) a traves de la porina de MspA de tipo salvaje. El transporte de ADN se compone de los siguientes pasos: a) inicio de la simulacion; b) y c) conformaciones de ADN antes y despues del rapido avance; y d) el ADN se adhiere a la superficie de la porina de MspA.

La FIGURA 28 es un grafico que muestra la corriente ionica acumulada del transporte de ssADN dC58 (SEQ ID NO: 40) de la FIGURA 27. El transporte se realizo bajo un margen transmembrana de 1,2V.

La FIGURA 29 muestra el diseno de la secuencia de octameros de nanoporos de MspA de una cadena (scMspA). El octamero dr scMspA consiste en: un monomero de gen de MspA de tipo salvaje, un monomero de MspA1, un monomero de MspA2, un monomero de MspA3, un monomero de MspA4, un monomero de MspA5, un monomero de MspA6, y un monomero de MspA7. Los sitios de restriccion PacI y HindIII flanquean la secuencia de octameros de nanoporos de scMspA. X1-X14 son sitios de restriccion unicos que flanquean las secuencias monomericas individuales. Las lmeas negras que conectan cada monomero representan el enlazador (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 3).

La FIGURA 30 muestra la zona de constriccion (la caja rectangular) de un monomero de MspA de tipo salvaje y una variedad de monomeros de MspA paralogos y homologos.

La FIGURA 31 muestra histogramas de los niveles de corriente de bloqueo en M1MspA bloqueadas por construcciones de ADN. La construcciones de ADN de arriba a abajo: 3'-A40AAAAAAAAAA-hp-5' (SEQ ID NO: 10); 3'-A40CCCCAAAAAA-hp-5' (SEQ ID NO: 11); 3'-A40AAACCCCAAA-hp-5' (SEQ ID NO: 12); 3'-A40AAAAAAACAA-hp- 5' (SEQ ID NO: 13); 3'-A40AAAAAAAAAC-hp-5' (SEQ ID NO: 14); 3'-A40AAAAAACCCC-hp-5' (SEQ ID NO: 15); 3'- C4040CCCCCCCCCC-hp-5' (SEQ ID NO: 16); 3'-T40TTTTTTTTTT-hp-5' (SEQ ID NO: 17); 3'-A40AAAAAAAGGG-hp- 5' (SEQ ID NO: 18).

DESCRIPCION DETALLADA

[0025] La presente invencion se define segun las reivindicaciones.

[0026] El presente documento porporciona un procedimiento que comprende aplicar un campo electrico a una porina de porinas de Mycobacterium smegmatis (Msp) que tiene un vestfbulo y una zona de constriccion que definen un tunel, en el que la porina de Msp se encuentra entre un primer medio lfquido conductor y un segundo medio lfquido conductor. Opcionalmente, el primer y segundo medio lfquido conductor son los mismos. Opcionalmente, el primer y segundo medio lfquido conductor son diferentes. La porina de Msp puede ser cualquier porina de Msp descrita en el presente documento. Por ejemplo, la porina de Msp se puede seleccionar del grupo que consiste en una porina de MspA de tipo salvaje, una porina de MspA mutante, una porina de MspA de tipo salvaje paraloga u homologa, y una porina de MspA mutante paraloga u homologa.

[0027] En cualquier realizacion en el presente documento, una porina de Msp puede comprender ademas un motor molecular. El motor molecular puede ser capaz de mover un analito en o a traves de un tunel con una velocidad de

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traslado (traslado) o una velocidad de traslado promedio que es menor que la velocidad de traslado o la velocidad de traslado promedio a la que el analito se traslada por electroforesis en o a traves del tunel en ausencia del motor molecular. En consecuencia, en cualquier realizacion en el presente documento que comprende la aplicacion de un campo electrico, el campo electrico puede ser suficiente para hacer que el analito se traslade por electroforesis a traves del tunel.

[0028] Cualquier medio lfquido descrito en el presente documento, tal como un medio lfquido conductor, puede comprender un analito. El analito puede ser cualquier analito aqu descrito. Las realizaciones en la presente memoria pueden comprender ademas la deteccion del analito, tal como en un procedimiento que comprende medir una corriente ionica, ya que el analito interacciona con un tunel de porinas de Msp para proporcionar un patron de corriente, en el que la aparicion de un bloqueo en el patron de corriente indica la presencia del analito.

[0029] Opcionalmente, una porina de Msp es una porina de MspA mutante o una porina homologa o paraloga de MspA mutante, y el analito tiene una velocidad de traslado o una velocidad de traslado promedio a traves del tunel de porinas que es menor que, o es mayor que, la velocidad de traslado o la velocidad de traslado promedio del analito a traves del tunel de una porina de MspA de tipo salvaje o una porina paraloga u homologa de MspA de tipo salvaje.

[0030] En cualquier realizacion en el presente documento, un analito puede tener una velocidad de traslado o una velocidad de traslado promedio a traves de un tunel de menos de 0,5 nm/|is. Opcionalmente, un analito puede tener una velocidad de traslado o una velocidad de traslado promedio a traves de un tunel de menos de 0,05 nm/|is.

[0031] Cualquier porina de Msp descrita en el presente documento puede estar comprendido en una bicapa lip^dica. En tales realizaciones o cualquier otra realizacion en el presente documento, la porina de Msp puede tener una cara cis y una cara trans. Opcionalmente, un analito por electroforesis o de otra manera se traslada desde la cara cis traves de un tunel a la cara trans. Opcionalmente, un analito por electroforesis o de otra manera se traslada desde la cara trans a traves de un tunel a la cara cis. Opcionalmente, un analito por electroforesis o de otra manera es inducido desde la cara cis o la cara trans en un tunel y se mantiene en el tunel o a continuacion, se retrae hacia la cara cis o la cara trans, respectivamente.

[0032] Cualquier realizacion en el presente documento puede comprender ademas la identificacion de un analito. Tales procedimientos pueden comprender comparar el patron de corriente obtenido con respecto a un analito desconocido al patron de corriente conocido obtenido usando un analito conocido bajo las mismas condiciones.

[0033] En cualquier realizacion en el presente documento, un analito puede ser un nucleotido, un acido nucleico, un aminoacido, un peptido, una protema, un polfmero, un farmaco, un ion, un contaminante, un objeto nanoscopico, o un agente de guerra biologica. Opcionalmente, un analito es un polfmero, tal como una protema, un peptido, o un acido nucleico. Opcionalmente, el polfmero es un acido nucleico. Opcionalmente, un acido nucleico tiene una velocidad de traslado o una velocidad de traslado promedio a traves de un tunel de menos de 1 nucleotido/^s. Opcionalmente, un acido nucleico tiene una velocidad de traslado o una velocidad de traslado promedio a traves del tunel de menos de 0,1 nucleotido/^s. Un acido nucleico puede ser ssADN, dsADN, ARN, o una combinacion de los mismos.

[0034] Las realizaciones en el presente documento pueden comprender distinguir al menos una primera unidad dentro de un polfmero de al menos una segunda unidad dentro del polfmero. Distinguir puede comprender la medicion de la corriente de iones producida como la primera y segunda unidades trasladadas por separo a traves de un tunel para producir un primer y un segundo patron de corriente, respectivamente, donde el primer y segundo patrones de corriente difieren entre sf.

[0035] Las realizaciones en el presente documento pueden comprender, ademas, secuenciar un polfmero. La secuenciacion puede comprender la medicion de la corriente de iones o de senales opticas, ya que cada unidad del polfmero se traslada por separado a traves del tunel para proporcionar un patron de corriente que esta asociado con cada unidad, y la comparacion de cada patron de corriente con el patron de corriente de una unidad conocida obtenida bajo la mismas condiciones, de manera que se secuencia el polfmero.

[0036] Cualquier realizacion en el presente documento puede comprender ademas la determinacion de la concentracion, el tamano, el peso molecular, la forma o la orientacion de un analito, o cualquier combinacion de los mismos. Cualquier medio lfquido descrito en el presente documento, tal como un medio lfquido conductor, puede comprender una pluralidad de analitos. Cualquier analito descrito en el presente documento puede comprender una microesfera optica o una microesfera magnetica.

[0037] Cualquier porina de Msp descrita en el presente documento puede definirse ademas como una porina de MspA mutante. Una porina de MspA mutante puede comprender un vestfbulo y una zona de constriccion que definen un tunel, y al menos un primer monomero de MspA mutante que comprende una mutacion en la posicion 93, 91, 90, o cualquier combinacion de los mismos. Un porina de MspA mutante puede comprender una mutacion en las posiciones 93 y 91; las posiciones 93 y 90; las posiciones 91 y 90; o posiciones 93, 90, y 91. Una MspA mutante de

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la invencion comprende una mutacion en las posiciones 90, 91 y 93, en el que la mutacion en la posicion 90 es D90N, la mutacion en la posicion 91 es D91N, y la mutacion en la posicion 93 es D93N. Opcionalmente, una porina de MspA mutante comprende una o mas mutaciones en cualquiera de las siguientes posiciones de aminoacidos: 88, 105, 108, 118, 134, o 139, o cualquier otra mutacion descrita en el presente documento.

[0038] En cualquier realizacion en el presente documento, el diametro de una porina de MspA mutante o un paralogo u homologo de MspA mutante puede ser menor que el diametro de la zona de constriccion de una correspondiente porina de MspA de tipo salvaje o un paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje. Una porina de MspA mutante o paralogo u homologo de MspA mutante pueden tener una mutacion en el vestfoulo o en la zona de constriccion que permite que un analito se traslade, por electroforesis o de otra manera, a traves del tunel de la porina de MspA mutante o paralogo u homologo de MspA mutante con una velocidad de traslado o una velocidad de traslado promedio que es menor que la velocidad de traslado o la velocidad de traslado promedio a la que el analito se traslada a traves del tunel de una porina de Msp de tipo salvaje o un paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje.

[0039] Una porina de Msp mutante, tal como una porina de MspA mutante o una porina homologa o paraloga de MspA mutante, puede comprender una zona de constriccion neutral. Una porina de Msp mutante, tal como una porina de MspA mutante o una porina homologa o paraloga de MspA mutante, puede comprender una conductancia a traves del tunel que es superior, por ejemplo, dos veces mayor, que la conductancia a traves del tunel de su correspondiente de porina de Msp de tipo salvaje. Una porina de Msp mutante, tal como una porina de MspA mutante o una porina homologa o paraloga de MspA mutante, puede comprender una conductancia a traves del tunel que es menor que la conductancia a traves del tunel de su correspondiente porina de Msp de tipo salvaje.

[0040] Cualquier porina de Msp descrita en el presente documento puede comprender un vestfbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diametro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constriccion que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y un diametro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en el que el vestfbulo y la zona de constriccion juntos definen un tunel. Tambien se proporciona en el presente documento una porina de MspA mutante que comprende un vestfbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diametro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constriccion que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y un diametro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en el que el vestfbulo y la zona de constriccion juntos definen un tunel, y que comprende ademas al menos un paralogo u homologo del primer monomero de MspA mutante.

[0041] El diametro de la zona de constriccion de una porina de Msp mutante, tal como una porina de MspA mutante u homologo o paralogo de MspA mutante, puede ser menor que el diametro de la zona de restriccion de su correspondiente porina de Msp de tipo salvaje, tal como una porina de MspA de tipo salvaje o un paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje. Una porina de Msp mutante, tal como una porina de MspA mutante o un paralogo u homologo de MspA mutante, puede comprender una mutacion en el vestfbulo o en la zona de constriccion que permite que un analito se traslade, por electroforesis o de otra manera, a traves del tunel de la porina con una velocidad de traslado o una velocidad de traslado promedio que es menor que la velocidad de traslado o la velocidad de traslado promedio a la que el analito se traslada a traves del tunel de su correspondiente porina de Msp de tipo salvajen, (por ejemplo, porina de MspA de tipo salvajen, paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje).

[0042] Opcionalmente, una porina de Msp esta codificada en su totalidad o en parte por una secuencia de acido nucleico que codifica una porina parcial o completa de Msp de una cadena, en el que la secuencia de acido nucleico comprende: (a) una primera y segunda secuencia de nucleotidos, en la que el primera secuencia de nucleotidos codifica una primera secuencia de monomero de Msp y la segunda secuencia de nucleotidos codifica una segunda secuencia de monomero de Msp; y (b) una tercera secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos enlazadora. Las secuencias de monomero pueden ser cualquier secuencia de monomero descrita en el presente documento. Opcionalmente, la primera y segunda secuencias de monomero de Msp se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un monomero de MspA de tipo salvaje, un monomero de MspB de tipo salvaje, un monomero de MspC de tipo salvaje, un monomero de MspD de tipo salvaje, y los mutantes de los mismos. Opcionalmente, la primera secuencia de monomero de Msp comprende un monomero de MspA de tipo salvaje o un mutante de la misma. Opcionalmente, la primera secuencia de monomero de Msp comprende un monomero de MspA mutante.

[0043] En cualquier realizacion en el presente documento, una porina de Msp puede estar codificada en su totalidad o en parte por una secuencia de acido nucleico que codifica una porina parcial o completa de Msp de una cadena, en la que la secuencia de acido nucleico comprende: (a) una primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima, y octava secuencia de nucleotidos o cualquier subconjunto de las mismas, en lasa que la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima y octava secuencia de nucleotidos codifican una primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima y octava secuencia de monomero de Msp, respectivamente; y (b) una novena secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos enlazadora. Por lo tanto, la porina puede comprender una o mas porinas parciales de Msp de una cadena que se hibridan, dimerizan, trimerizan, o similares

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con otros monomeros de Msp u otros porinas parciales de Msp de una cadena. Como alternativa, la porina completa de Msp de una cadena puede formar una porina sin asociar con otros elementos de Msp. En cualquier realizacion en el presente documento, por ejemplo, una porina de Msp puede ser codificada por una secuencia de acido nucleico que codifica una porina de Msp de una cadena, en la que la secuencia de acido nucleico comprende: (a) una primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima y octava secuencia de nucleotidos, en la que la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima y octava secuencia de nucleotidos codifican una primera, segunda, tercera cuarta, quinta, sexta, septima y octava secuencia de monomero de Msp, respectivamente; y (b) una novena secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos enlazadora. Cada monomero de Msp puede comprender un monomero de MspA de tipo salvaje o un mutante del mismo. Opcionalmente, al menos un monomero de Msp comprende un monomero de MspA de tipo salvaje o un mutante del mismo. Por lo tanto, la porina puede ser codificada en su totalidad.

[0044] En cualquier realizacion en el presente documento, un monomero de Msp puede ser un paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje, tal como MspA/Msmeg0965, MspB/Msmeg0520, MspC/Msmeg5483, MspD/Msmeg6057, MppA, PorMI, PorM2, PorMI, Mmcs4296, Mmcs4297, Mmcs3857, Mmcs4382, Mmcs4383, Mjls3843, Mjls3857, Mjls3931 Mjls4674, Mjls4675, Mjls4677, Map3123c, Mav3943, Mvan1836, Mvan4117, Mvan4839, Mvan4840, Mvan5016, Mvan5017, Mvan5768, MUL_2391, Mflv1734, Mflv1735, Mflv2295, Mflv1891, MCH4691c, MCH4689c, MCH4690c, MAB1080, MAB1081, MAB2800, RHA1 ro08561, RHA1 ro04074 y RHA1 ro03127.

[0045] Tambien se proporciona en el presente documento un procedimiento de modificacion de la conductancia a traves del tunel de una porina de Msp que comprende eliminar, anadir, o sustituir al menos un aminoacido en el vestibulo o la zona de constriccion de una porina de Msp de tipo salvaje. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender el aumento de la conductancia. El procedimiento puede comprender la disminucion de la conductancia.

[0046] Tambien se proporciona un procedimiento que comprende el traslado de un analito a traves de un tunel de una porina de Msp sin el empleo de un campo electrico. En este o cualquier otra realizacion en el presente documento, una porina de Msp puede comprender ademas un motor molecular. La porina de Msp puede ser cualquier porina de Msp descrita en el presente documento, tal como una porina de MspA de tipo salvaje, una porina de MspA mutante, una porina paraloga u homologa de MspA de tipo salvaje y una porina paraloga u homologa de MspA mutante. La porina de Msp puede ser codificada por una secuencia de acido nucleico que codifica una porina de Msp de una cadena.

[0047] Tambien se proporciona un sistema que comprende una porina de Msp que tiene un vestibulo y una zona de constriccion que definen un tunel, en el que el tunel se encuentra entre un primer medio lfquido y un segundo medio lfquido, en el que al menos un medio lfquido comprende un analito, y en el que el sistema es operativo para detectar una propiedad del analito. Un sistema puede ser operativo para detectar una caractenstica de cualquier analito que comprende someter una porina de Msp a un campo electrico de manera que el analito interacciona con la porina de Msp. Un sistema puede ser operativo para detectar una propiedad del analito que comprende someter la porina de Msp a un campo electrico de manera que el analito se traslada por electroforesis a traves del tunel de la porina de Msp. Tambien se proporciona un sistema que comprende una porina de Msp que tiene un vestfbulo y una zona de constriccion que definen un tunel, en el que el tunel se encuentra en una bicapa lipidica entre un primer medio lfquido y un segundo medio lfquido, y en el que el unico punto de comunicacion de lfquidos entre el primer y segundo medios lfquidos se produce en el tunel. Ademas, cualquier porina de Msp descrita en el presente documento puede estar comprendida en cualquier sistema que se describe en el presente documento.

[0048] El primer y segundo medios lfquidos pueden ser el mismo o diferentes, y, o bien uno o ambos pueden comprender uno o mas de una sal, un detergente o un tampon. De hecho, cualquier medio lfquido que se describe en el presente documento puede comprender uno o mas de una sal, un detergente o un tampon. Opcionalmente, al menos un medio lfquido es conductor. Opcionalmente, al menos un medio lfquido no es conductor. Cualquier medio lfquido descrito en el presente documento puede comprender una sustancia que altera la viscosidad o una sustancia que altera la velocidad. Los medios lfquidos pueden comprender cualquier analito descrito en el presente documento. Una propiedad de un analito puede ser una propiedad electrica, qmmica o ffsica.

[0049] Una porina de Msp puede estar comprendida en una bicapa lipidica en un sistema o cualquier otra realizacion descrita en el presente documento. Un sistema puede comprender una pluralidad de porinas de Msp.

[0050] Un sistema puede comprender cualquier porina de Msp descrita en el presente documento, tal como una porina de MspA de tipo salvaje, una porina de MspA mutante, una porina paraloga u homologa de MspA de tipo salvaje, o una porina paraloga u homologo de MspA mutante. Opcionalmente, la porina de Msp se define ademas como una porina de MspA mutante. Un sistema puede comprender una porina de Msp mutante que comprende un vestfbulo y una zona de constriccion que definen un tunel, y al menos un primer monomero de MspA mutante que comprende una mutacion en la posicion 93 y una mutacion en la posicion 90, posicion 91, o en ambas posiciones 90 y 91. Una porina de Msp mutante comprendida en un sistema puede comprender un vestfbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diametro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constriccion que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y una diametro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en la que el vestfbulo y la zona de constriccion juntos definen un

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tunel. Una porina de MspA mutante puede comprender ademas al menos un primer monomero paralogo u homologo de MspA mutante. Una porina de Msp comprendida en un sistema puede ser codificada por una secuencia de acido nucleico que codifica una porina de Msp de una cadena.

[0051] Una porina de Msp comprendida en un sistema puede comprender ademas un motor molecular. El motor molecular en un sistema o cualquier otra realizacion en el presente documento puede ser capaz de mover un analito en o por un tunel con una velocidad de traslado o una velocidad de traslado promedio que es menor que la velocidad de traslado o la velocidad de traslado promedio a la que el analito se traslada en o a traves del tunel en ausencia del motor molecular.

[0052] Cualquier sistema descrito en el presente documento puede comprender ademas un amplificador de “patch- clamp” o un dispositivo de adquisicion de datos. Un sistema puede comprender ademas uno o mas dispositivos de regulacion de la temperatura en comunicacion con el primer medio Uquido, el segundo medio Uquido, o ambos.

[0053] Cualquier sistema descrito en el presente documento puede ser operativo para trasladar un analito a traves de un tunel de porinas de Msp ya sea por electroforesis o de otra manera.

[0054] Tambien se proporciona una porina de Msp que comprende un vestfbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diametro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constriccion que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y un diametro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en la que el vestibulo y la zona de constriccion juntos definen un tunel. Tambien se proporciona una porina de Msp mutante que comprende un vestibulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diametro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constriccion que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y un diametro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en el que el vestibulo y la zona de constriccion juntos definen un tunel. Tambien se proporciona una porina de MspA mutante que comprende un vestfbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diametro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constriccion que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y un diametro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en el que el vestibulo y la zona de constriccion juntos definen un tunel. Tambien se proporciona una porina paraloga u homologa de MspA mutante que comprende un vestibulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diametro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constriccion que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y una diametro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en el que el vestibulo y la zona de constriccion juntos definen un tunel. Cualquier paralogo u homologo de MspA mutante descrito en el presente documento puede comprender ademas al menos un primer monomero paralogo u homologo de MspA mutante. Tambien se proporciona una porina de MspA mutante que comprende un vestfbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diametro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constriccion que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y un diametro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en el que el vestfbulo y la zona de constriccion juntos definen un tunel, y que comprende ademas al menos un primer monomero paralogo u homologo de MspA mutante. Cualquiera de estas porinas puede emplearse en cualquier realizacion en el presente documento.

[0055] Tambien se proporciona una porina de MspA mutante que comprende un vestfbulo y una zona de constriccion que definen un tunel, y al menos un primer monomero de MspA mutante que comprende una mutacion en la posicion 93 y una mutacion en la posicion 90, posicion 91, o en ambas posiciones 90 y 91. Esta porina de MspA mutante, y cualquier otra porina de Msp mutante o porina de MspA descrita en el presente documento, pueden emplearse con cualquier realizacion descrita en el presente documento. La porina de MspA mutante puede comprender una mutacion en las posiciones 93 y 90. La porina de MspA mutante puede comprender una mutacion en las posiciones 93 y 91. La porina de MspA mutante puede comprender una mutacion en las posiciones 93, 91, y 90. La porina de MspA mutante puede comprender cualquier otra mutacion descrita en el presente documento. La MspA mutante de la invencion comprende una mutacion en las posiciones 90, 91 y 93, en la que la mutacion en la posicion 90 es D90N, la mutacion en la posicion 91 es D91N, y la mutacion en la posicion 93 es D93N.

[0056] El diametro de la zona de constriccion de la porina de MspA mutante puede ser menor que el diametro de la zona de constriccion de una correspondiente porina de MspA de tipo salvaje. La porina de MspA puede tener una mutacion en el vestfbulo o en la zona de constriccion que permite que un analito se traslade, por electroforesis o de otra manera, a traves del tunel de mutante con una velocidad de traslado o una velocidad de traslado promedio que es menor que la velocidad de traslado o la velocidad de traslado promedio a la que el analito se traslada a traves del tunel de una porina de Msp de tipo salvaje. La porina de MspA puede tener una mutacion en el vestfbulo o en la zona de constriccion que permite que un analito se traslade, por ejemplo, por electroforesis, a traves del tunel con una velocidad de traslado promedio de menos de 0,5 nm/|is o menos de 0,05 nm/|is. El analito puede seleccionarse del grupo que consiste en un nucleotido, un acido nucleico, un aminoacido, un peptido, una protema, un polfmero, un farmaco, un ion, un agente de guerra biologica, un contaminante, un objeto nanoscopico, o una combinacion o grupo de los mismos. Opcionalmente, el analito se define ademas como un acido nucleico. El acido nucleico puede trasladarse, por electroforesis o de otra manera, a traves del tunel con una velocidad de traslado promedio de menos de 1 nucleotido/|is, o menos de 0,1 nucleotido/^s. Un acido nucleico se puede definir ademas como ssADN, dsADN,

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ARN, o una combinacion de los mismos.

[0057] Un analito en cualquier realizacion en el presente documento puede comprender ademas una miroesfera magnetica. Una miroesfera magnetica puede definirse ademas como una miroesfera magnetica recubierta con estreptavidina. Un analito puede comprender ademas una microesfera optica. Cualquier analito descrito en el presente documento puede ser un ion o puede ser neutro. Un analito puede comprender biotina.

[0058] Cualquier porina de Msp descrita en el presente documento, tal como una porina de MspA mutante, puede comprender 2-15 monomeros de Msp que son los mismos o diferentes. Opcionalmente, una porina de Msp, tal como una porina de MspA mutante, comprende 7-9 monomeros de Msp que son los mismos o diferentes. Opcionalmente, se selecciona al menos un segundo monomero del grupo que consiste en un monomero de MspA de tipo salvaje, un segundo monomero de MspA mutante, un monomero paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje, y un monomero paralogo u homologo de MspA mutante, en la que el segundo monomero de MspA mutante puede ser el mismo o diferente que el primer monomero de MspA mutante. Opcionalmente, el segundo monomero es un monomero paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje. Un monomero paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje puede ser un monomero de MspB de tipo salvaje. Un monomero de MspA puede comprender una o mas mutaciones en cualquiera de las siguientes posiciones de aminoacidos: 88, 105, l08, 118, 134, o 139. Un monomero de MspA puede comprender una o mas de las siguientes mutaciones: L88W, D90K/N/Q/R, D91N/Q, D93N, I105W, N108W, D118R, D134R o E139K. Un monomero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90N/D91N/D93N. Un monomero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K. Un monomero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90Q/D91Q/D93N. Un monomero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90Q/D91Q/D93N/D118R/D134R/E139K. Un monomero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90 (K,R)/D91N/D93N. Un monomero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: (L88, I105)W/D91Q/D93N. Un monomero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: I105W/N108W. Ademas, un monomero de MspA puede comprender cualquier otra mutacion descrita en el presente documento.

[0059] En cualquier realizacion en el presente documento, una porina de Msp mutante, tal como una porina de MspA mutante o un paralogo u homologo de MspA mutante, puede comprender al menos un aminoacido adicional con carga positiva en comparacion con el vestibulo o la zona de constriccion de una porina de Msp de tipo salvaje, respectivamente; al menos un aminoacido adicional con carga negativa en comparacion con el vestfbulo o la zona de restriccion de una porina de MspA de tipo salvaje, respectivamente; al menos un aminoacido menos cargado positivamente en comparacion con el vestfbulo o la zona de restriccion de una porina de MspA de tipo salvaje, respectivamente; o al menos un aminoacido menos cargado negativamente en comparacion con el vestfbulo o la zona de la constriccion de una porina de MspA detipo salvaje, respectivamente.

[0060] Opcionalmente, cada aminoacido cargado positivamente en el vestfbulo y la zona de constriccion de una porina de Msp de tipo salvaje esta sustituido por un aminoacido cargado negativamente, y cada aminoacido cargado negativamente es el mismo o diferente; o cada aminoacido cargado negativamente en el vestfbulo y la zona de constriccion de una porina de Msp de tipo salvaje esta sustituida por un aminoacido cargado positivamente, y cada aminoacido cargado positivamente es el mismo o diferente.

[0061] Opcionalmente, el vestfbulo o la zona de la constriccion de una porina de Msp mutante comprende un mayor numero de residuos cargados positivamente que el del vestfbulo o la zona de constriccion de una porina de Msp de tipo salvaje, respectivamente; o el vestfbulo o la zona de constriccion comprende un mayor numero de residuos cargados negativamente que el del vestfbulo o la zona de constriccion de una porina de Msp de tipo salvaje, respectivamente; o al menos un aminoacido cargado positivamente en el vestfbulo o la zona de restriccion de una porina de Msp de tipo salvajea, tal como porina de MspA de tipo salvaje o porina paraloga u homologa de MspA de tipo salvaje, se elimina o se sustituye por un aminoacido con carga negativa; o al menos un aminoacido con carga negativa en el vestfbulo o la zona de constriccion de una porina de Msp de tipo salvaje se elimina o se sustituye por un aminoacido cargado positivamente.

[0062] Al menos un aminoacido en el vestfbulo o en la zona de restriccion de una porina de Msp de tipo salvaje, tales como porina de MspA de tipo salvaje o porina paraloga u homologa de MspA de tipo salvaje, puede ser sustituido por un aminoacido que tiene una cadena lateral estericamente mas grande; un aminoacido que tiene una cadena lateral estericamente mas pequena; un aminoacido que tiene una cadena lateral mas polar; un aminoacido que tiene una cadena lateral menos polar; o un aminoacido que tiene una cadena lateral mas hidrofobo; un aminoacido que tiene una cadena lateral menos hidrofoba.

[0063] En cualquier realizacion en el presente documento, al menos un aminoacido en el vestfbulo o en la zona de constriccion de una porina de Msp mutante puede comprender un aminoacido no natural o un aminoacido modificado qmmicamente.

[0064] Cualquier porina de Msp descrita en el presente documento puede comprender una o mas deleciones, adiciones o sustituciones en bucles periplasmicos.

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[0065] Tal como se describe en el presente documento, cualquier porina de Msp, como una porina de MspA mutante, puede comprender ademas un motor molecular. Cualquier motor molecular descrito en el presente documento puede ser capaz de mover un analito en o a traves del tunel con una velocidad de traslado o una velocidad de traslado promedio que es menor que la velocidad de traslado o la velocidad de traslado promedio a la que el analito se traslda en o a traves del tunel en ausencia del motor molecular. En cualquier realizacion en el presente documento, el motor molecular puede ser una enzima, tal como una polimerasa, una exonucleasa, o un fragmento de Klenow.

[0066] Tambien se proporcionan procedimientos para producir porinas de Msp descritas en el presente documento. En consecuencia, se proporciona un procedimiento de produccion de una porina de MspA mutante que comprende al menos un monomero de MspA mutante, comprendiendo el procedimiento modificar un monomero de MspA de tipo salvaje en la posicion 93 y en la posicion 90, posicion 91, o en ambas posiciones 90 y 91. El procedimiento puede comprender modificar un monomero de MspA de tipo salvaje en las posiciones 93 y 90. El procedimiento puede comprender modificar un monomero de MspA de tipo salvaje en las posiciones 93 y 91. El procedimiento puede comprender modificar un monomero de MspA de tipo salvaje en las posiciones 93, 91, y 90. El procedimiento puede comprender ademar o alternativamente modificar un monomero de MspA de tipo salvaje en una o mas de las siguientes posiciones de aminoacidos: 88, 105, 108, 118, 134, o 139, o realizar cualquier otra modificacion descrita en el presente documento. Un porina de MspA mutante producida por los procedimientos descritos en el presente documento puede comprender cualquier mutacion o propiedad de porina descrita en el presente documento. Por ejemplo, una MspA mutante puede comprender una zona de constriccion neutra. Una porina de MspA mutante puede comprender ademas al menos un monomero de Msp, tal como un monomero de MspA de tipo salvaje, un monomero de MspA mutante, un paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje, o un segundo monomero paralogo u homologo de MspA mutante. La porina de MspA mutante puede tener una conductancia a traves del tunel que es mas alta, por ejemplo, dos veces mayor, que la conductancia a traves del tunel de su correspondiente porina de MspA de tipo salvaje.

[0067] Cualquier porina de Msp mutante descrita en el presente documento, tal como una porina de MspA mutante o porina paralogau homologa de MspA mutante, puede comprender uno o mas monomeros de MspB mutante, MspC mutante, o MspD mutante, o una combinacion de los mismos.

[0068] Tambien se proporciona un procedimiento de fabricacion de una porina de MspA mutante que tiene un vestibulo y una zona de constriccion que definen un tunel, que comprende la supresion, adicion o sustitucion de cualquier aminoacido en el vestfbulo o en la zona de constriccion de un monomero paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje, de manera que la porina de MspA mutante resultante es capaz de trasladar un analito a traves del tunel despues de la aplicacion de un campo electrico. La porina de MspA mutante puede ser de cualquier tipo descrito en el presente documento.

[0069] Tambien se proporcionan secuencias de acido nucleico que codifican porinas de Msp descritas en el presente documento. Por ejemplo, se proporciona una secuencia de acido nucleico que codifica una porina de MspA mutante o un paralogo u homologo de MspA mutante. Tambien se contemplan vectores que comprenden secuencias de acido nucleico descritas en el presente documento, tal como un vector que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una porina de MspA mutante o un homologo o paralogo de MspA mutante. Cualquier vector descrito en el presente documento puede comprender ademas una secuencia de promotor. Cualquier vector descrito en el presente documento puede comprender ademas un promotor constitutivo. Un promotor constitutivo puede comprender un promotor psmyc. Un promotor puede comprender un promotor inducible. Un promotor inducible puede comprender un promotor inducible por acetamida.

[0070] Tambien se proporcionan celulas cultivadas transfectadas con cualquier vector descrito en el presente documento, o progenie de las mismas en las que la celula es capaz de expresar una porina de Msp, tal como una porina de MspA mutante o un paralogo u homologo de MspA mutante.

[0071] Tambien se proporciona una cepa de Mycobacterium smegmatis que comprende cualquier vector descrito en el presente documento. Tambien se contempla una cepa de Mycobacterium smegmatis libre de porinas endogenas, y puede comprender, ademas, cualquier vector descrito en el presente documento. Por "libre" se entiende que una porina endogena no se puede detectar en una inmunotransferencia utilizando un antisuero espedfico de Msp apropiado, o que comprende menos del 1% de porinas endogenas.

[0072] Tambien se proporciona un vector que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un monomero de Msp de tipo salvaje, en el que la secuencia de acido nucleico esta operativamente controlada por un promotor inducible. El vector puede ser un vector de integracion. Tambien se proporciona una celula cultivada transfectada con este vector, o progenie de la misma, en la que la celula es capaz de expresar una porina de Msp de tipo salvaje. Tambien se contempla una cepa de Mycobacterium smegmatis que comprende este vector.

[0073] Tambien se proporcionan secuencias de acidos nucleicos que codifican una porina parcial o completa de Msp de una cadena descrita en el presente documento. La secuencia de acido nucleico puede comprender, por ejemplo: (a) una primera y segunda secuencia de nucleotidos, en el que la primera secuencia de nucleotidos codifica una

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primera secuencia de monomero de Msp y la segunda secuencia de nucleotidos codifica una segunda secuencia de monomero de Msp; y (b) una tercera secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos enlazadora. La primera y segunda secuencias de monomero de Msp pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en un monomero de MspA de tipo salvaje, un monomero de MspA mutante, un monomero paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje, y un monomero paralogo u homologo de MspA mutante. La primera secuencia de monomero de Msp puede comprender un monomero de MspA de tipo salvaje o un mutante del mismo. Opcionalmente, la primera secuencia de monomero de Msp comprende un monomero de MspA mutante. La primera secuencia de monomero de Msp puede comprender una o mas de las mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitucion de A a P en el aminoacido 138, una sustitucion de E a A o K en el aminoacido 139, una sustitucion de D a K o R o Q en el aminoacido 90; una sustitucion de D a N o Q en el aminoacido 91, una sustitucion de D a N en el aminoacido 93, una sustitucion de L a W en el aminoacido 88, una sustitucion de I a W en el aminoacido 105, una sustitucion de N a W en el aminoacido 108, una sustitucion de D a R en el aminoacido 118, y una sustitucion de D a R en el aminoacido 134. De hecho, cualquier monomero de Msp descrito en el presente documento puede comprender cualquiera de estas sustituciones.

[0074] Opcionalmente, el monomero de MspA mutante comprende una sustitucion de A a P en el aminoacido 138, una sustitucion de E a A en el aminoacido 139, o una combinacion de los mismos; una sustitucion de D a K o R en el aminoacido 90, una sustitucion de D a N en el aminoacido 91, una sustitucion de D a N en el aminoacido 93, o cualquier combinacion de los mismos; una sustitucion de D a Q en el aminoacido 90, una sustitucion de D a Q en el aminoacido 91, una sustitucion de D a N en el aminoacido 93, o cualquier combinacion de los mismos; una sustitucion de L a W en el aminoacido 88, una sustitucion de I a W en el aminoacido 105, una sustitucion de D a Q en el aminoacido 91, una sustitucion de D a N en el aminoacido 93, o cualquier combinacion de los mismos; una sustitucion de I a W en el aminoacido 105, una sustitucion de N a W en el aminoacido 108, o una combinacion de los mismos; o una sustitucion de D a R en el aminoacido 118, una sustitucion de E a K en el aminoacido 139, una sustitucion de D a R en el aminoacido 134, o cualquier combinacion de los mismos.

[0075] Cualquier porina de Msp puede comprender una primera, segunda, o mas secuencias de monomero de Msp que comprende un paralogo de MspA de tipo salvaje o mutante del mismo, en el que el paralogo o mutante de la misma es un monomero de MspB de tipo salvaje o un mutante del mismo. Una o mas secuencias de monomero de Msp pueden comprender SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o una combinacion de los mismos. Opcionalmente, la segunda secuencia de monomero de Msp comprende un monomero de MspB mutante. Opcionalmente, la primera secuencia de monomero de Msp comprende un monomero de MspA de tipo salvaje o un mutante del mismo y la segunda secuencia de monomero de Msp comprende un monomero de MspB de tipo salvaje o un mutante del mismo. Opcionalmente, la primera secuencia de monomero de Msp comprende la SEQ ID NO: 1 y la segunda secuencia de monomero de Msp comprende la SEQ ID NO: 2.

[0076] Las secuencias de aminoacidos enlazadoras se describen en el presente documento. En cualquier realizacion en el presente documento, una secuencia de aminoacidos enlazadora puede comprender, por ejemplo, de 10 a 20 aminoacidos. Por ejemplo, una secuencia de aminoacidos enlazadora comprende 15 aminoacidos. Opcionalmente, la secuencia de aminoacidos enlazadora comprende una secuencia de peptido (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 3).

[0077] Se contemplan los polipeptidos codificados por cualquier secuencia de acido nucleico descrita en el presente documento.

[0078] Tambien se proporciona una secuencia de acido nucleico que codifica una porina parcial o completa de Msp de una cadena, en la que la secuencia de acido nucleico comprende: (a) una primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima, y octava secuencia de nucleotidos o cualquier subconjunto de las mismas, en la que la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima y octava secuencia de nucleotidos codifica una primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima, y octava secuencia de monomero de Msp, respectivamente; y (b) una secuencia de nucleotidos que codifica una novena secuencia de aminoacidos enlazadora. La primera y segunda secuencias de monomero de Msp pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en un monomero de Msp de tipo salvaje, un monomero de Msp mutante, un monomero paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje, y un monomero paralogo u homologo de MspA mutante. Cada monomero de Msp puede comprender un monomero de MspA de tipo salvaje o un mutante del mismo. Opcionalmente, al menos un monomero de Msp comprende un monomero de MspA de tipo salvaje o un mutante del mismo. Opcionalmente, al menos un monomero de Msp comprende un monomero de MspA mutante. La secuencia de monomero de Msp mutante puede comprender cualquier mutacion descrita en el presente documento. Por ejemplo, una o mas de las mutaciones se pueden seleccionar del grupo que consiste en una sustitucion de A a P en el aminoacido 138, una sustitucion de E a A o K en el aminoacido 139, una sustitucion de D a K o R o Q en el aminoacido 90; una sustitucion de D a N o Q en el aminoacido 91, una sustitucion de D a N en el aminoacido 93, una sustitucion de L a W en el aminoacido 88, una sustitucion de I a W en el aminoacido 105, una sustitucion de N a W en el aminoacido 108, una sustitucion de D a R en el aminoacido 118, y una sustitucion de D a R en el aminoacido 134. Cada secuencia de monomero de Msp puede comprender SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, al menos una secuencia de monomero de Msp comprende la SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, al menos una secuencia de monomero de Msp comprende un paralogo de MspA de tipo salvaje o mutante del mismo, en el que el paralogo de MspA o mutante del mismo es un monomero de MspB de

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tipo salvaje o un mutante del mismo. Opcionalmente, al menos una secuencia de monomero de Msp comprende la SEQ ID NO: 2. Opcionalmente, al menos una secuencia de monomero de Msp comprende un monomero de MspB mutante. Opcionalmente, al menos una secuencia de monomero de Msp comprende un monomero de MspA de tipo salvaje o un mutante del mismo y al menos una secuencia de monomero de Msp comprende un monomero de MspB de tipo salvaje MSPB o un mutante del mismo. Opcionalmente, al menos una secuencia de monomero de Msp comprende la SEQ ID NO: 1 y al menos una secuencia de monomero de Msp comprende la SEQ ID NO: 2. Tambien se proporciona un polipeptido codificado por cualquiera de las secuencias de acidos nucleicos anteriores. Tambien se proporciona un vector que comprende cualquiera de las secuencias de acidos nucleicos anteriores. El vector puede comprender ademas una secuencia de promotor. El promotor puede comprender un promotor constitutivo. El promotor constitutivo puede comprender promotor psmyc. El promotor puede comprender un promotor inducible. El promotor inducible puede comprender un promotor inducible por acetamida.

[0079] Tambien se proporciona una cepa bacteriana mutante capaz de la expresion de Msp inducible, comprendiendo la cepa bacteriana: (a) una delecion de MspA de tipo salvaje; (b) una delecion de MspC de tipo salvaje; (c) una delecion de MspD de tipo salvaje; y (d) un vector que comprende un promotor inducible unido operativamente a una secuencia de acido nucleico de monomero de Msp. La cepa bacteriana puede comprender, ademas, la cepa ML16 de M. smegmatis. El acido nucleico de Msp puede codificar un monomero de MspA de tipo salvaje o un monomero paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje. El acido nucleico de Msp puede codificar un monomero de Msp seleccionado del grupo que consiste en un monomero de MspA de tipo salvaje, un monomero de MspC de tipo salvaje, y un monomero de MspD de tipo salvaje. Opcionalmente, el acido nucleico de Msp codifica el monomero de MspA de tipo salvaje. El promotor inducible puede comprender un promotor inducible por acetamida. La cepa bacteriana puede comprender ademas una delecion de una MspB de tipo salvaje. La cepa bacteriana puede comprender ademas un vector tal como se describe en el presente documento, tal como un vector que comprende un promotor constitutivo unido operativamente a una secuencia de acido nucleico que codifica una porina o monomero de Msp. La Msp puede ser una porina o monomero de MspA de tipo salvaje o una porina o monomero paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje. La porina o monomero de Msp puede seleccionarse del grupo que consiste en una porina o monomero de MspA de tipo salvaje, porina o monomero de MspB de tipo salvaje, porina o monomero de MspC de tipo salvaje, y porina o monomero de MspD de tipo salvaje. Opcionalmente, la porina o monomero de Msp es una porina o monomero de MspA de tipo salvaje.

[0080] La cepa bacteriana puede comprender ademas un vector que comprende un acido nucleico que codifica una porina parcial o completa de Msp de una cadena, en el que el acido nucleico comprende: (a) una primera y segunda secuencia de nucleotidos, en el que la primera secuencia de nucleotidos codifica un primer monomero de Msp y la segunda secuencia de nucleotidos codifica una segunda secuencia de monomero Msp; y (b) una tercera secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos enlazadora. La cepa bacteriana puede comprender ademas un vector que comprende un acido nucleico que codifica porina parcial o completa de Msp de una cadena, en el que el acido nucleico comprende: (a) una primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima y octava secuencia de nucleotidos o cualquier subconjunto de la misma, en la que la primera, segunda tercera, cuarta, quinta, sexta, septima, y octava secuencia de nucleotidos codifican una primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima, y octava secuencia de monomero de Msp, respectivamente; y (b) una secuencia de nucleotidos que codifica una novena secuencia de aminoacidos enlazadora.

[0081] Tambien se proporciona un procedimiento de produccion de una porina parcial o completa de Msp de una cadena, comprendiendo el procedimiento: (a) transformar una cepa bacteriana tal como se describe en el presente documento con un vector que comprende una secuencia de acido nucleico capaz de codificar una porina parcial o completa de Msp de una cadena; y (b) purificar la porina parcial o completa de Msp de una cadena de las bacterias. El vector puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica una porina parcial o completa de Msp de una cadena, en el que la secuencia de acido nucleico comprende: (a) una primera y segunda secuencia de nucleotidos, en la que la primera secuencia de nucleotidos codifica una primera secuencia de monomero de Msp y la segundo secuencia de nucleotidos codifica una segunda secuencia de monomero de Msp; y (b) una tercera secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos enlazadora. El vector puede comprender una secuencia de acido nucleico que codifica una porina parcial o completa de Msp de una cadena, en el que la secuencia de acido nucleico comprende: (a) una primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima, y octava secuencia de nucleotidos o cualquier subconjunto de las mismss, en la que la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima y octava secuencia de nucleotidos codifican una primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, septima, y octava secuencia de monomero de Msp, respectivamente; y (b) una novena secuencia de nucleotidos que codifica un enlazador de aminoacidos. Las secuencias de monomero de Msp pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en un monomero de MspA de tipo salvaje, un monomero de MspA mutante, un monomero paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje, y un monomero paralogo u homologo de MspA mutante. Por ejemplo, las secuencias de monomero de Msp son monomeros de MspA de tipo salvaje.

[0082] Una "porina de Mycobacterium smegmatis (Msp)" o "porina de Msp" se refiere a un complejo multimerico que comprende dos o mas monomeros de Msp. Un monomero de Msp esta codificado por un gen en Mycobacterium smegmatis. Mycobacterium smegmatis tiene cuatro genes de Msp identificados, indicados como MspA, MspB, MspC y MspD. Un porina de Msp puede, por ejemplo, estar constituido por monomeros de MspA de tipo salvaje, monomeros de MspA mutantes, monomeros paralogos u homologos de MspA de tipo salvaje, o monomeros

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paralogos u homologos de MspA mutante. Opcionalmente, una porina de Msp es una de Msp de una cadena o es un multimero de varias porinas de Msp de una cadena. Una porina de Msp de una cadena puede, por ejemplo comprender un multfmero formado por dos o mas monomeros de Msp (por ejemplo, ocho monomeros) conectados por uno o mas peptidos de aminoacidos enlazadores. Una porina parcial de Msp de una cadena se refiere a un complejo multimerico de una cadena que debe dimerizar, trimerizan, o similar para formar una porina. Una porina completa de Msp de una cadena se refiere a un complejo multimerico de una cadena que forma una porina sin la necesidad de dimerizar, trimerizar o similares para formar una porina.

[0083] La porina de Msp de cualquier realizacion en el presente documento puede ser cualquier porina de Msp descrita en el presente documento, tal como una porina de MspA de tipo salvaje, una porina de MspA mutante, una porina paraloga u homologa de MspA de tipo salvaje, o una porina paraloga u homologa de MspA mutante. La porina de Msp puede ser codificada por una secuencia de acido nucleico que codifica una porina de Msp de una cadena. Cualquier porina de Msp del presente documento puede comprender cualquier monomero de Msp descrito en el presente documento, tal como un monomero de Msp mutante.

[0084] Los nutrientes pasan a traves de porinas de tipo salvaje en micobacterias. Las porinas de MspA de tipo salvaje, porinas de MspB de tipo salvaje, porinas de MspC de tipo salvaje, y porinas de MspD de tipo salvaje son ejemplos de porinas formadoras de tunel de tipo salvaje. Una porina de Msp puede definirse adicionalmente como cualquier porina de Msp descrita en el presente documento, incluyendo porinas paralogas, homologas, mutantes y de una sola cadena.

[0085] Una "porina de MspA mutante" es un complejo multimerico que tiene al menos o como maximo 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, o 99 por ciento o mas de identidad, o cualquier intervalo derivable en el mismo, pero menos del 100%, a su correspondiente porina de MspA de tipo salvaje y retiene la capacidad de formacion de tunel. Una porina de MspA mutante puede ser una protema recombinante. Opcionalmente, una porina de MspA mutante es una que tiene una mutacion en la zona de constriccion o en el vestibulo de una porina de MspA de tipo salvaje. Opcionalmente, puede aparecer una mutacion en el borde o en el exterior de los bucles periplasmicos de una porina de MspA de tipo salvaje. Una porina de MspA mutante se puede emplear en cualquier realizacion descrita en el presente documento.

[0086] Los ejemplos paralogos y homologos de MspA de tipo salvaje se proporcionan en la Tabla 1. Se proporcionan paralogos de MspA de tipo salvaje, que incluyen la MspB de tipo salvaje, MspC de tipo salvaje y MspD de tipo salvaje. Un "paralogo", tal como se define en el presente documento, es un gen de la misma especie bacteriana que tiene estructura y funcion similares. Un "homologo", tal como se define en el presente documento, es un gen de otra especie bacteriana que tiene una estructura similar y origen evolutivo. A modo de ejemplo, se proporcionan homologos de MspA de tipo salvaje, que incluyen MppA, PorMI, PorM2, PorMI y Mmcs4296.

[0087] Una "porina paraloga u homologa de MspA mutante" es un complejo multimerico que tiene al menos o como maximo 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, o 99 por ciento o mas de identidad, o cualquier intervalo derivable en el mismo, pero menos de 100%, a su correspondiente porina paraloga u homologa de MspA de tipo salvaje y retiene la capacidad de formacion de tunel. Una porina paraloga u homologa de MspA mutante puede ser una protema recombinante. Opcionalmente, una porina paraloga u homologa de MspA mutante es una que tiene una mutacion en la zona de constriccion o en el vestfbulo de la porina paraloga u homologa de MspA de tipo salvaje. Opcionalmente, puede aparecer una mutacion en el borde o en el exterior de los bucles periplasmicos de una porina paraloga u homologa de MspA de tipo salvaje. Cualquier porina paraloga u homologa de MspA mutante se puede emplear en cualquier realizacion descrita en el presente documento y puede comprender mutacion descrita en el presente documento.

[0088] Una porina de Msp puede comprender dos o mas monomeros de Msp. Un "monomero de Msp" es un monomero de protema que es un monomero de MspA de tipo salvaje, un monomero de MspA mutante, un monomero paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje, o un monomero paralogo u homologo de MspA mutante, y retiene la capacidad de formacion de tunel cuando esta asociado con uno o mas de otros monomeros de Msp. Cualquier porina de Msp descrita en el presente documento puede comprender una o mas de cualquier monomero de Msp tal como se describe en el presente documento. Cualquier porina de Msp puede comprender, por ejemplo, 215 monomeros de Msp, en la que cada monomero puede ser el mismo o diferente.

[0089] Un "monomero de MspA mutante" se refiere a un monomero de Msp que tiene al menos o como maximo 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, o 99 por ciento o mas de identidad, o cualquier intervalo derivable en el mismo, pero menos de 100%, a un monomero de MspA de tipo salvaje, y retiene la capacidad de formacion de tunel cuando esta asociado con uno o mas de otros monomeros de Msp. Opcionalmente, un monomero de MspA mutante se define ademas como que comprende una mutacion en la parte de la secuencia que contribuye a la formacion del vestfbulo o la zona de la constriccion de una porina formadora de tunel totalmente formada. El monomero de Msp mutante puede ser una protema recombinante, por ejemplo. Un monomero de MspA mutante puede comprender cualquier mutacion descrita en el presente documento.

[0090] Un "monomero paralogo u homologo de MspA mutante" se refiere a un monomero paralogo u homologo de

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MspA que tiene al menos o como maximo 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, o 99 por ciento o mas de identidad, o cualquier intervalo derivable en el mismo, pero menos del 100%, a un monomero paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje, y retiene la capacidad de formacion de tunel. Opcionalmente, un monomero paralogo u homologo de MspA mutante se define ademas como que comprende una mutacion en la parte de la secuencia que contribuye a la formacion del vestibulo y/o la zona de la constriccion de una porina formadora de tunel totalmente formada. El monomero paralogo u homologo de MspA mutante puede ser una protema recombinante, por ejemplo. Cualquier monomero paralogo u homologo de MspA mutante se puede emplear opcionalmente en cualquier realizacion en el presente documento.

[0091] Una porina de Msp puede expresarse como una combinacion de dos o mas monomeros de MspA de tipo salvaje, monomeros de MspA mutantes, monomeros paralogos u homologos de MspA de tipo salvaje, o monomeros paralogos u homologos de MspA. Por tanto, una porina de Msp puede ser o comprender un dfmero, un tnmero, un tetramero, un pentamero, un hexamero, una septamero, un octamero, un nonamero, etc. Por ejemplo, una porina de Msp puede comprender una combinacion de monomeros de MspA de tipo salvaje y monomeros de MspB de tipo salvaje. Una porina de Msp puede comprender 1-15 monomeros, donde cada monomero es igual o diferente. De hecho, cualquier porina de Msp descrita en el presente documento puede comprender al menos o como maximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 monomeros, o cualquier intervalo derivable en el mismo, donde cada monomero es igual o diferente. Por ejemplo, una porina de Msp puede comprender uno o mas monomeros de MspA mutante que son los mismos o diferentes. Como otro ejemplo, una porina de Msp puede comprender al menos un monomero de MspA mutante y al menos un monomero paralogo u homologo de MspA.

[0092] Tal como se define anteriormente, una porina de Msp de una cadena comprende dos o mas monomeros de Msp conectados por uno o mas peptidos de aminoacido enlazadores. Una porina de Msp de una cadena que comprende dos monomeros de Msp, en el que los monomeros de Msp estan unidos por una secuencia de aminoacidos enlazadora, puede denominarse como un dfmero de porinas de Msp de una cadena. Una porina de Msp de una cadena que comprende ocho monomeros de Msp, en la que los monomeros de Msp estan unidos por una secuencia de aminoacidos enlazadora, puede denominarse como un octamero de porinas de Msp de una cadena. Una porina de Msp de una cadena puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o mas monomeros de Msp, o cualquier intervalo derivable en el mismo, unidos por secuencias de aminoacidos enlazadoras. Opcionalmente, una porina de Msp de una cadena puede comprender, por ejemplo, dos o mas dfmeros de porina de Msp de una cadena, dos o mas tnmeros de porina de Msp de una cadena, dos o mas cuadnmeros de porina de Msp de una cadena, dos o mas pentfmeros de porina de Msp de una cadena, uno o mas hexfmeros de porina de Msp de una cadena, uno o mas septfmeros de porina de Msp de una cadena, uno o mas octameros de porina de Msp de una cadena, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, una porina de Msp de una cadena puede comprender un dfmero de porina de Msp de una cadena y dos tnmeros de porina de Msp de una cadena. A modo de otro ejemplo, una porina de Msp de una cadena puede comprender un cuadnmero de porina de Msp de una cadena y dos dfmeros de porina de Msp de una cadena.

[0093] Una porina de Msp de una cadena de tipo salvaje se compone de monomeros de Msp de tipo salvaje. Opcionalmente, estan presentes una o mas mutaciones en una porina de Msp de una cadena en el vestfbulo o en la zona de la constriccion de una porina de Msp de una cadena. La porina de Msp de una cadena, por ejemplo, tiene al menos una mutacion en la secuencia de aminoacidos para el bucle periplasmico, vestibulo, o zona de constriccion (por ejemplo, delecion, sustitucion o adicion) en comparacion con una Msp de una cadena de tipo salvaje. Un multfmero de las cadenas individuales tambien puede formar una porina, donde cada cadena individual incluye dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, o mas monomeros de Msp.

[0094] En el presente documento se proporcionan secuencias de acidos nucleicos que codifican secuencias de monomero de Msp y mutantes de las mismas. Para las secuencias de monomero de MspA mutante indicadas a continuacion, la secuencia de MspA de referencia es la secuencia del monomero de MspA de tipo salvaje madura (SEQ ID NO: 1). Cada secuencia de nucleotidos en las secuencias de acido nucleico proporcionadas en el presente documento puede comprender, por ejemplo, una secuencia de monomero de MspA mutante. Los ejemplos no limitantes de secuencias de MspA mutantes se proporcionan en la Tabla 7. Opcionalmente, la MspA mutante comprende una sustitucion de A a P en el aminoacido 138, una una sustitucion de E a A en el aminoacido 139, o una combinacion de los mismos. Opcionalmente, la MspA mutante comprende una sustitucion de D a K o R en el aminoacido 90, una sustitucion de D a N en el aminoacido 91, una sustitucion de D a N en el aminoacido 93, o cualquier combinacion de los mismos. Opcionalmente, la MspA mutante comprende una sustitucion de D a Q en el aminoacido 90, una sustitucion de D a Q en el aminoacido 91, una sustitucion de D a N en el aminoacido 93, o cualquier combinacion de los mismos. Opcionalmente, la MspA mutante comprende una sustitucion de L a W en el aminoacido 88, una sustitucion de I a W en el aminoacido 105, una sustitucion de D a Q en el aminoacido 91, una sustitucion de D a N en el aminoacido 93, o cualquier combinacion de los mismos. Opcionalmente, la MspA mutante comprende una sustitucion de I a W en el aminoacido 105, una sustitucion de N a W en el aminoacido 108, o una combinacion de los mismos. Opcionalmente, la MspA mutante comprende una sustitucion de D a R en el aminoacido 118, una sustitucion de E a K en el aminoacido 139, una sustitucion de D a R en el aminoacido 134, o cualquier combinacion de los mismos. Para las secuencias de monomero de MspB mutante indicadas a continuacion, la secuencia de MspB de referencia es la secuencia del monomero de MspB de tipo salvaje madura (SEQ ID NO: 2). Opcionalmente, la MspB mutante comprende una sustitucion de D a K o R en el aminoacido 90, una sustitucion de D

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a N en el aminoacido 91, una sustitucion de D a N en el aminoacido 93, o cualquier combinacion de los mismos.

[0095] Las secuencias de monomeros de Msp tipo salvaje descritas en el presente documento se dan a conocer en el GenBank, que se encuentran en la World Wide Web en pubmed.gov.

[0096] Por ejemplo, las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de un monomero de MspA de tipo salvaje se puede encontrar en GenBank Accession Nos. AJ001442 y CAB56052, respectivamente. Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de un monomero de MspB de tipo salvaje se pueden encontrar, por ejemplo, en GenBank Accession Nos. NC_008596.1 (desde el nucleotido 600.086 a 600.730) y YP_884932.1, respectivamente. Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de un monomero de MspC de tipo salvaje se pueden encontrar, por ejemplo, en GenBank Accession Nos. AJ299735 y CAC82509, respectivamente. Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de un monomero de MspD de tipo salvaje se pueden encontrar, por ejemplo, en GenBank Accession Nos. AJ300774 y CAC83628, respectivamente. De este modo se proporcionan las secuencias de nucleotidos de los monomeros MspA, MspB, MspC y MspD que comprenden una secuencia de nucleotidos de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 por ciento o mas, o cualquier intervalo derivable en el mismo, identica a la secuencia de nucleotidos de los numeros de acceso de GenBank de nucleotidos mencionados anteriormente. Tambien se proporcionan secuencias de aminoacidos de los monomeros MspA, MspB, MspC y MspD (FIGURA 18) que comprenden una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 por ciento o mas, o cualquier intervalo derivable en el mismo, identica a las secuencias de los numeros de acceso de GenBank de aminoacidos mencionados anteriormentes.

[0097] Tambien se proporcionan secuencias de aminoacidos de monomeros paralogos y homologos de MspA, que comprenden una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 por ciento o mas, o cualquier intervalo derivable en el mismo, a un monomero paralogo u homologo de MspA de tipo salvaje. Los monomeros paralogos y homologos de MspA de tipo salvaje son conocidos en la tecnica. La Tabla 1 proporciona una lista no limitante de dichos paralogos y homologos:

Tabla 1. MspA de tipo salvaje y monomeros paralogos y homologos de MspA de tipo salvaje

Protema#

Organismo Identidad/Simlitud con MspA (%) Longitud (aa) Referencia

MspA/Msmeg0965

M. smegmatis 100/100 211 gb|ABK74363.1|, (Stahl et al., 2001)*

MspB/Msmeg0520

M. smegmatis 94/95 215 gb|ABK73437.1|, (Stahl et al., 2001)*

MspC/Msmeg5483

M. smegmatis 93/95 215 gb|ABK74976.1|, (Stahl et al., 2001)*

MspD/Msmeg6057

M. smegmatis 82/89 207 gb|ABK72453.1|, (Stahl et al., 2001)*

MppA

M. phlei 100/100 211 AJ812030, (Dorner et al., 2004)**

PorMI

M. fortuitum 95/96 211 emb|CAI54228.1|

PorM2

M. fortuitum 91/93 215 emb|CAL29811.1|

PorMI

M. peregrinum 94/96 211 emb|CAI54230.1|

Mmcs4296

Mycobacterium sp. MCS 85/91 216 gb|ABG10401.1|

Mmcs4297

Mycobacterium sp. MCS 85/91 216 gb|ABG10402.1|

Mmcs3857

Mycobacterium sp. MCS 30/44 235 gb|ABG09962.1|

Mmcs4382

Mycobacterium sp. MCS 85/91 216 gb|ABL93573.1|

Mmcs4383

Mycobacterium sp. MCS 85/91 216 gb|ABL93574.1|

Mjls3843

Mycobacterium sp. JLS 26/40 235 gb|ABN99619.1|

Mjls3857

Mycobacterium sp. JLS 26/40 235 gb|ABG09962.1|

Mjls3931

Mycobacterium sp. JLS 26/40 235 gb|ABL93123.1|

Mjls4674

Mycobacterium sp. JLS 85/89 216 gb|ABO00440.1|

Mjls4675

Mycobacterium sp. JLS 83/89 216 gb|ABO00441.1|

Mjls4677

Mycobacterium sp. JLS 84/89 216 gb|ABO00443.1|

Map3123c

M. avium paratuberculosis 24/39 220 gb|AAS05671.1|

Mav3943

M. avium 24/39 227 gb|ABK66660.1|

Mvan1836

M. vanbaalenii PYR-1 82/88 209 gb|ABM12657.1|

Mvan4117

M. vanbaalenii PYR-1 32/43 239 gb|ABM14894.1|

Mvan4839

M. vanbaalenii PYR-1 83/88 209 gb|ABM15612.1|

Mvan4840

M. vanbaalenii PYR-1 83/89 209 gb|ABM15613.1|

Mvan5016

M. vanbaalenii PYR-1 30/41 238 gb|ABM15788.1|

Mvan5017

M. vanbaalenii PYR-1 25/35 227 gb|ABM15789.1|

Mvan5768

M. vanbaalenii PYR-1 21/32 216 gb|ABM16533.1|

MUL_2391

M. ulcerans Agy99 21/34 233 gb|ABL04749.1|

Mflv1734

M. gilvum PYR-GCK 21/32 225 gb|ABP44214.1|

Mflv1735

M. gilvum PYR-GCK 32/41 226 gb|ABP44215.1|

Mflv2295

M. gilvum PYR-GCK 26/40 250 gb|ABP44773.1|

Mflv1891

M. gilvum PYR-GCK 84/90 217 gb|ABP44371.1|

MCH4691c

M. chelonae 70/80 223 gb|ACV04474.1|

MCH4689c

M. chelonae 66/78 223 gb|ACV04472.1|

MCH4690c

M. chelonae 72/81 217 gb|ACV04473.1|

MAB1080

M. abscessus 69/79 223 emb|CAM61170.1|

MAB1081

M. abscessus 68/78 222 emb|CAM61171.1|

MAB2800

M. abscessus 27/44 246 emb|CAM62879.1|

RHA1 ro08561

Rhodococcus jostii RHA1 34/51 233 gb|ABG99605.1|

n.d.

Rhodococcus opacus B4 34/51 233 gbj|BAH52196.11

RHA1 ro04074

Rhodococcus sp. RHA1 34/50 233 gb|ABG95871.1|

RHA1 ro03127

Rhodococcus sp. RHA1 34/50 233 gb|ABG94930.1|

n.d.

Rhodococcus erythropolis PR4 35/50 229 gbj|BAH30938.1|

Solo se incluyeron las protemas con similitudes significativas de aminoacidos con respecto a la longitud completa. Los datos fueron obtenidos mediante el algoritmo PSI-Blast (matriz BLOSUM62) usando la base de datos GenBank NIH en la World Wide Web en ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi. n.d.: "no determinado" * Stahl et al, Mol. Microbiol. 40: 451 (2001) ** Dorner et al, Biochim. Biophys. Acta. 1667: 47-55 (2004)

[0098] Los peptidos, polipeptidos, monomeros, multimeros, protemas, etc. descritos en el presente documento pueden modificarse y variarse adicionalmente, siempre que la funcion deseada se mantenga o mejore. Se entiende que una manera de definir cualquier modificacion y derivado conocido o los que pudieran surgir, de los genes y las 5 protemas descritas en el presente documento es a traves de la definicion de las modificaciones y derivados en

terminos de identidad a secuencias espedficas conocidas. Se describen espedficamente polipeptidos que tienen al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por ciento de identidad a una MspA de tipo salvaje y paralogos u homologos de MspA de tipo salvaje (por

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ejemplo, MspB de tipo salvaje, MspC de tipo salvaje, MspD de tipo salvaje, MppA, PorMI, Mmcs4296), y los mutantes proporcionados en el presente documento.

[0099] Los expertos en la tecnica entienden facilmente como determinar la identidad de dos polipeptidos. Por ejemplo, la identidad puede calcularse despues de alinear las dos secuencias de manera que la identidad se encuentra en su nivel mas alto. Por ejemplo, para determinar el "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoacidos o de dos acidos nucleicos, las secuencias se alinean para propositos de comparacion optima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoacidos o de acido nucleico para una optima alineacion con una segunda secuencia de aminoacidos o acido nucleico). Los residuos de aminoacidos o nucleotidos en las posiciones de aminoacidos o posiciones de nucleotidos correspondientes se comparan a continuacion. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo residuo de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = numero de posiciones identicas/numero total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una realizacion, las dos secuencias tienen la misma longitud.

[0100] Existen varios procedimientos para determinar el porcentaje de identidad. Se puede determinar el porcentaje de identidad de la manera siguiente. Se compara una secuencia de acido nucleico o aminoacido diana con la secuencia de acido nucleico o de aminoacidos identificada utilizando el programa de BLAST 2 Sequences (B12seq) de la version independiente de BLASTZ que contiene BLASTN version 2.0.14 y BLASTP version 2.0.14. Esta version independiente de BLASTZ se puede obtener del sitio web del Centro Nacional de Informacion sobre Biotecnologfa del gobierno de Estados Unidos (World Wide Web en ncbi.nlm.nih.gov). Las instrucciones que explican como utilizar el programa B12seq se pueden encontrar en el archivo “readme” que acompana a BLASTZ.

[0101] B12seq lleva a cabo una comparacion entre dos secuencias utilizando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se utiliza para comparar secuencias de acido nucleico, mientras que BLASTP se utiliza para comparar secuencias de aminoacidos. Para comparar dos secuencias de acidos nucleicos, las opciones se pueden establecer de la siguiente manera: -i se ajusta a un archivo que contiene la primera secuencia de acido nucleico que se compara (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se ajusta a un archivo que contiene la segunda secuencia de acido nucleico a comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se ajusta a blastn; -o se ajusta a cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); -q se ajusta a -1; -r se ajusta a 2; y todas las demas opciones se dejan en su conFIGURAcion por defecto. El siguiente comando generara un archivo de salida que contiene una comparacion entre dos secuencias: C:\B12seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1-r 2. Si la secuencia diana comparte homologfa de secuencia con cualquier porcion de la secuencia identificada, entonces el archivo de salida designado presentara esas regiones de homologfa como secuencias alineadas. Si la secuencia diana no comparte homologfa con ninguna porcion de la secuencia identificada, entonces el archivo de salida designado no presentara secuencias alineadas.

[0102] Una vez alineado, se determina la longitud contando el numero de nucleotidos consecutivos de la secuencia diana presentada en alineacion con la secuencia de la secuencia identificada empezando con cualquier posicion coincidente y terminando con cualquier otra posicion coincidente. Una posicion coincidente es cualquier posicion en la que un nucleotido identica se presenta tanto en la secuencia diana como la secuencia identificada. Los huecos que se presentan en la secuencia diana no se cuentan, ya que los huecos no son nucleotidos. Del mismo modo, los huecos presentados en la secuencia identificada no se cuentan, ya que los nucleotidos de la secuencia diana se cuentan, ni los nucleotidos de la secuencia identificada.

[0103] El porcentaje de identidad sobre una longitud particular se puede determinar contando el numero de posiciones coincidentes sobre esa longitud y dividiendo ese numero por la longitud seguido por la multiplicacio del valor resultante por 100. Por ejemplo, si (1) una secuencia diana de 50 nucleotidos se compara con la secuencia de codificacion de MspA de tipo salvaje (2) el programa B12seq presenta 45 nucleotidos de la secuencia diana alineados con una region de la secuencia de codificacion de MspA de tipo salvaje donde el primer y ultimo nucleotidos de esa region de 45 nucleotidos son coincidencias, y (3) el numero de coincidencias sobre esos 45 nucleotidos alineados es 40, entonces la secuencia diana de 50 nucleotidos contiene una longitud de 45 y un porcentaje de identidad sobre esa longitud de 89 (es decir, 40/45 x 100 = 89).

[0104] Otra forma de calcular la identidad se puede realizar mediante algoritmos publicados. El alineamiento optimo de secuencias para comparacion puede realizarse mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineacion de identidad de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la busqueda del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones informaticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspeccion.

[0105] Los mismos tipos de identidad pueden obtenerse para acidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos descritos en Zuker, Science 244: 48-52 (1989); Jaeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7706-10 (1989); Jaeger

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et al., Methods Enzymol. 183: 281-306 (1989).

[0106] Se entiende que cualquiera de los procedimientos se puede utilizar normalmente y que en ciertos casos los resultados de estos diversos procedimientos pueden ser diferentes, pero el experto en la materia entiende si la identidad se encuentra con al menos uno de estos procedimientos, se dina que las secuencias tienen la identidad indicada y se describen en el presente documento.

[0107] Los acidos nucleicos que codifican secuencias de protemas descritos en el presente documento, asf como variantes y fragmentos de los mismos, estan tambien descritas. Estas secuencias incluyen todas las secuencias degeneradas relacionadas con una secuencia de protema espedfica, es decir, todos los acidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica una secuencia de protema particular, asf como todos los acidos nucleicos, incluyendo los acidos nucleicos degenerados, que codifican las variantes descritas y derivados de las secuencias de protemas. Por lo tanto, mientras que cada secuencia de acido nucleico enparticular puede no estar descrita en el presente documento, se entiende que todas y cada una de las secuencias esta de hecho descrita y dada conocer en el presente documento a traves de las secuencias de protemas descritas.

[0108] Los fragmentos y secuencias parciales de una porina o monomero de Msp pueden ser utiles en los procedimientos descritos en el presente documento. Al igual que con todos los peptidos, polipeptidos y protemas, incluyendo fragmentos de los mismos, se entiende que las modificaciones adicionales en la secuencia de aminoacidos de los polipeptidos de Msp descritos en el presente documento pueden aparecer sin alterar la naturaleza o funcion de los peptidos, polipeptidos y protemas. Se entendera que la unica limitacion en estas es practica, deben comprender los elementos funcionales necesarios (por ejemplo, capacidad de formacion de tunel) para usar en la realizacion pertinente. Tales modificaciones incluyen sustituciones de aminoacidos conservadoras y se discuten en mayor detalle a continuacion.

[0109] Los procedimientos para determinar si una protema es una protema formadora de tuneles son bien conocidos en la tecnica. Se puede determinar si una Msp forma un tunel mediante la determinacion de si la protema se inserta en una bicapa, tal como se describe en el Ejemplo 2 a continuacion: si la protema se inserta en la bicapa, a continuacion, la porina es una protema formadora de tuneles. Tfpicamente, la formacion de tuneles se detecta mediante la observacion de un cambio discreto en la conductividad. Vease, por ejemplo, FIGURA 2, Ejemplo 2, y Niederweis et al., Mol. Microbiol. 33: 933 (1999). Las bicapas se describen en el presente documento.

[0110] Como se sugirio anteriormente, una porina de Msp tfpicamente sera capaz de ser insertada en una bicapa lipidica o pelmula delgada de otro tipo, que son conocidas en la tecnica. Un ejemplo de insercion de una porina de MspA mutante en una bicapa lipfdica se explica en el presente documento; esta tecnica se puede aplicar tambien a otras porinas de Msp. Ademas, la patente de Estados Unidos N° 6.746.594 describe una variedad de bicapas lipfdicas y pelmulas delgadas, incluyendo materiales inorganicos, que se pueden emplear con respecto a las porinas de Msp descritas en el presente documento. Los procedimientos, aparatos y tecnicas que se describen en la patente de Estados Unidos N° 6.267.872, tambien se pueden emplear con respecto a las porinas de Msp descritas en el presente documento.

[0111] Ademas, mas de una porina de Msp puede estar comprendida en una bicapa lipidica. Por ejemplo, 2 3, 4, 5, 10, 20, 200, 2000, o mas pueden estar comprendidas en una bicapa lipidica. Opcionalmente, cualquiera de 2 a 1010 porinas de Msp se puede emplear en los procedimientos descritos en el presente documento. Dicha pluralidad de porinas de Msp pueden estar en forma de grupos de porinas de Msp. Los grupos pueden estar ensamblados al azar o pueden adoptar un patron. Como se usa en el presente documento, un "grupo" se refiere moleculas que se agrupan juntas y se mueven como una unidad, pero no estan unidas covalentemente entre sf.

[0112] Opcionalmente, las porinas de Msp no son reguladas (“gate”) espontaneamente. "Regular" o "gating" se refiere al cambio espontaneo de la conductancia electrica a traves del tunel de la protema que es generalmente temporal (por ejemplo, una duracion de tan solo 1 a 10 milisegundos hasta un segundo). Los sucesos de regulacion de larga duracion a menudo pueden invertirse mediante el cambio de la polaridad. Bajo la mayona de circunstancias, la probabilidad de regulacion aumenta con la aplicacion de voltajes mas altos. La regulacion y el grado de conductancia a traves del cambio de tunel son muy variables entre porinas de Msp, dependiendo de, por ejemplo, la formacion del vestfbulo y la zona de constriccion, asf como de las propiedades del medio lfquido en el que se sumerge la protema. Tfpicamente, la protema se hace menos conductora durante la regulacion, y la conductancia puede parar permanentemente (es decir, el tunel puede cerrar de forma permanente) como resultado, de manera que el proceso es irreversible. Opcionalmente, la regulacion se refiere a la conductancia a traves del tunel de una protema que cambia espontaneamente a menos del 75% de su de corriente en estado abierto.

[0113] Varias condiciones, tales como la luz y el medio lfquido que contacta con una porina de Msp, incluyendo su pH, composicion del tampon, composicion detergente, y la temperatura, pueden afectar el comportamiento de una porina de Msp, particularmente con respecto a su conductancia a traves del tunel como, asf como el movimiento de un analito con respecto al tunel, ya sea temporal o permanentemente.

[0114] De especial relevancia es la geometna de los tuneles de porina de Msp, en particular la porina de MspA. La

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geometna de la porina de Msp puede proporcionar una mejor resolucion espacial. Ademas, la porina de MspA de tipo salvaje es muy robusta y retiene la actividad de formacion de tunel despues de la exposicion a cualquier pH y despues de la extraccion a temperaturas extremas (por ejemplo, hasta 100°C durante un maximo de 30 minutos y una incubacion hasta 80°C durante hasta 15 minutos). Los polipeptidos pueden ser analizados por su actividad deseada usando los ensayos in vitro descritos en el presente documento.

[0115] En cuanto a la porina de MspA en particular, opcionalmente, la porina de MspA es un octamero que consiste en ocho monomeros de MspA de 184 aminoacidos. Una o mas mutaciones pueden tener lugar en uno o mas de los monomeros de MspA en los aminoacidos de una porina de MspA de tipo salvaje para producir una porina de MspA mutante. Ademas, una porina de MspA puede tener menos o mas de ocho monomeros, uno o mas de los cuales puede comprender una mutacion.

[0116] Ademas, la porina de MspA de tipo salvaje comprende un bucle periplasmico que consiste en trece aminoacidos y esta directamente adyacente a la zona de constriccion. Vease Huff et al., J. Biol. Chem. 284: 10223 (2009). Las porinas de tipo salvaje MspB, C, y D tambien contienen un bucle periplasmico. Una o mas mutaciones pueden aparecer en el bucle periplasmico de una porina de Msp de tipo salvaje para generar una porina de Msp mutante. Por ejemplo, pueden aparecer deleciones de hasta los trece aminoacidos en el bucle periplasmico de la porina de MspA de tipo salvaje. Tfpicamente, las deleciones en el bucle periplasmico no afectan a la capacidad de formacion de tunel de una porina de Msp.

[0117] Una porina de Msp o monomero Msp tambien se pueden modificar qmmica o biologicamente. Por ejemplo, se puede modificar una porina de Msp o monomero Msp con productos qmmicos para producir puentes disulfuro, tal como es conocido por los expertos en la tecnica.

[0118] Una porina de Msp puede comprender un sitio de union a nucleotidos. Como se usa en el presente documento, un "sitio de union a nucleotidos" se refiere a un sitio en una porina de Msp donde un nucleotido permanece en contacto con, o reside en, un aminoacido durante un penodo de tiempo que es mas largo que lo atribuible al movimiento de difusion, tal como mayor de un picosegundo o un nanosegundo. Se pueden emplear calculos de dinamica molecular para evaluar estos tiempos de reposo temporales.

[0119] Un "vestfbulo" se refiere a la porcion en forma de cono del interior de una porina de Msp cuyo diametro disminuye generalmente desde un extremo al otro a lo largo de un eje central, donde la porcion mas estrecha del vestfbulo esta conectada a la zona de constriccion. Un vestfbulo tambien puede denominarse como una "copa". Ver la FIGURA 1 para un ejemplo del vestfbulo de una porina MspA de tipo salvaje. El vestfbulo y la zona de constriccion definen conjuntamente el tunel de una porina de mSp.

[0120] Cuando se hace referencia a un diametro del vestfbulo, se entiende que debido a que el vestfbulo tiene forma

de cono, el diametro cambia a lo largo de la trayectoria de un eje central, en el que el diametro es mayor en un extremo que el extremo opuesto. El diametro puede variar de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 6 nm. Opcionalmente, el diametro es de aproximadamente, al menos aproximadamente, o como maximo de

aproximadamente 2, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2,

4.3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, o 6,0 nm, o cualquier intervalo derivable

en el mismo. La longitud del eje central puede variar de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 6 nm. Opcionalmente, la longitud es de aproximadamente, al menos aproximadamente, o como maximo de

aproximadamente 2, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2,

4.3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, o 6,0 nm, o cualquier intervalo derivable en el mismo. Cuando se hace referencia a "diametro" en el presente documento, se puede determinar un diametro mediante la medicion de distancias de centro a centro o distancias de superficie a superficie atomica.

[0121] Una "zona de constriccion" se refiere a la porcion mas estrecha del tunel de una porina de Msp, en terminos de diametro, que se conecta a los vestfbulos. La zona de constriccion de una porina de MspA de tipo salvaje se muestra en la FIGURA 1 (marcada como "constriccion interior"). La longitud de la zona de constriccion puede variar de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 2 nm. Opcionalmente, la longitud es de aproximadamente, como maximo, aproximadamente, o al menos aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o 3 nm, o cualquier intervalo derivable en el mismo. El diametro de la zona de constriccion puede variar de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 2 nm. Opcionalmente, el diametro es de aproximadamente, como maximo, aproximadamente, o al menos aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o 3 nm, o cualquier intervalo derivable en el mismo.

[0122] Una "zona de constriccion neutra" se refiere a una zona de constriccion que comprende cadenas laterales de aminoacidos que acumulativamente exhiben una carga electrica no neta cuando se sumerge en una solucion acuosa. El pH del medio lfquido (por ejemplo, una solucion acuosa tamponada) en contacto con la zona de constriccion puede afectar si la zona de constriccion se caracteriza como neutra o no.

[0123] Un "tunel" se refiere a la parte central, vacfa de una Msp que se define por el vestfbulo y la zona de constriccion, a traves del cual puede pasar un gas, lfquido, ion, o analito.

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[0124] Tal como se usa en el presente documento, "cis" se refiere a la cara de un tunel de Msp a traves de la cual un analito entra en el tunel o a lo largo de la cara en la cual se mueven los analitos.

[0125] Tal como se usa en el presente documento, "trans" se refiere a la cara de un tunel de Msp a traves de la cual un analito (o fragmentos de los mismos) sale del tunel o o a lo largo de la cara en la cual no se mueven los analitos.

[0126] Tal como se usa en el presente documento, "trasladar o trasladar electroforeticamente un analito," y las variantes gramaticales del mismo, se refiere a la aplicacion de un campo electrico a una porina de Msp que esta en contacto con una o mas soluciones (por ejemplo, sumergida en una solucion), de tal manera que la corriente fluye a traves del tunel de la porina de Msp. El campo electrico mueve un analito de tal manera que interactua con el tunel. Por "interactua", se entiende que el analito se mueve en y, opcionalmente, a traves del tunel, donde "a traves del tunel de Msp" (o "traslada" o “traslada”) significa entrar por una cara del tunel y pasar a y salir de la otra cara del tunel.

[0127] Se contempla espedficamente que cualquier analito descrito en el presente documento puede trasladarse a traves de un tunel de porina de Msp, ya sea por electroforesis o no, en cualquier realizacion descrita en el presente documento. En este sentido, se contempla espedficamente que cualquier realizacion del presente documento que comprende el traslado puede referirse al traslado electroforetico o el traslado no electroforetico, a menos que se indique espedficamente. Opcionalmente, se contemplan procedimientos que no emplean traslado electroforetica.

[0128] Un "medio lfquido" incluye medios lfquidos acuosos, organico-acuosos y solo organicos. Los medios organicos incluyen, por ejemplo, metanol, etanol, dimetilsulfoxido, y mezclas de los mismos. Los lfquidos empleables en procedimientos descritos aqrn son bien conocidos en la tecnica. Las descripciones y ejemplos de tales medios, incluyendo medios lfquidos conductores, se proporcionan en la patente de Estados Unidos N° 7.189.503, por ejemplo.

[0129] Las sales, detergentes, o tampones pueden anadirse a tales medios. Tales agentes se pueden emplear para alterar el pH o la fuerza ionica del medio lfquido. Las sustancias que alteran la viscosidad, tales como glicerol o varios polfmeros (por ejemplo, polivinilpirrolidona, polietilenglicol, alcohol polivimlico, polfmeros de celulosa), y mezclas de los mismos, se pueden incluir en medios lfquidos. Los procedimientos de medicion de la viscosidad son bien conocidos en la tecnica. Cualquier agente que puede anadirse a un medio lfquido tambien puede alterar la velocidad de un analito que se esta estudiando. Por tanto, un agente que altera la velocidad puede ser una sal, un detergente, un tampon, una sustancia que altera la viscosidad, o cualquier otro agente anadido a un medio lfquido que aumenta o disminuye la velocidad de un analito.

[0130] Tfpicamente, un analito empleado en el presente documento es soluble o parcialmente soluble en al menos un medio lfquido que esta en contacto con una Msp descrita en el presente documento. Cualquier analito se puede usar en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, un nucleotido, un acido nucleico, un aminoacido, un peptido, una protema, un polfmero, un farmaco, un ion, un agente de guerra biologica, un contaminante, un objeto nanoscopico, o cualquier otra molecula que comprende uno de estos analitos o una combinacion de los mismos. Un analito puede ser un grupo de moleculas, en que el grupo en su conjunto se considera un analito. Tfpicamente, el tamano de un analito no sera tan grande de manera que no pueda entrar en un tunel de una Msp: en otras palabras, un analito tfpico sera mas pequeno en tamano que la apertura de un tunel de una Msp. Sin embargo, un analito que tiene un tamano mas grande que la apertura de un tunel puede emplearse, y puede determinarse usando procedimientos descritos en el presente documento que el tamano del analito es demasiado grande para entrar en el tunel. Opcionalmente, el peso molecular del analito esta a menos de un millon de Da. Opcionalmente, el peso molecular del analito es de aproximadamente, como maximo aproximadamente, o al menos aproximadamente

1.000. 000, 950.000, 900.000, 850.000, 800.000, 750.000, 700.000, 650.000, 600.000, 550.000, 500.000, 450.000,

400.000, 350.000, 300.000, 250.000 , 200.000, 150.000, 100.000, 75.000, 50.000, 25.000, 20.000, 15.000, 10.000, 7.500, 5.000, 2.500, 2.000, 1.500, 1.000, o 500 Da o menos, o cualquier intervalo derivable en el mismo.

[0131] Las modificaciones de las protemas incluyen modificaciones en las secuencias de aminoacidos. Las modificaciones en la secuencia de aminoacidos pueden surgir de forma natural como variaciones alelicas (por ejemplo, debido al polimorfismo genetico), pueden surgir debido a la influencia del medio ambiente (por ejemplo, debido a la exposicion a la radiacion ultravioleta), o pueden producirse por intervencion humana (por ejemplo, por mutagenesis de secuencias de ADN clonadas), tales como mutantes de punto inducido, delecion, insercion, y sustitucion. Estas modificaciones pueden dar como resultado cambios en la secuencia de aminoacidos, proporcionar mutaciones silenciosas, modificar un sitio de restriccion o proporcionar otras mutaciones espedficas. Las modificaciones en la secuencia de aminoacidos normalmente se encuentran en una o mas de tres clases: modificaciones por sustitucion, insercion o delecion. Las inserciones incluyen fusiones amino y/o terminales asf como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoacidos individuales o multiples. Las inserciones normalmente seran inserciones mas pequenas que las fusiones de amino o carboxi terminales, por ejemplo, del orden de uno a cuatro residuos. Las deleciones se caracterizan por la eliminacion de uno o mas residuos de aminoacidos de la secuencia de la protema. Normalmente, no mas de aproximadamente de 2 a 6 residuos se eliminan en cualquier sitio dentro de la molecula de protema. Las sustituciones de aminoacidos son tfpicamente residuos individuales, pero

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pueden aparecer en un numero de localizaciones diferentes a la vez; las inserciones normalmente seran del orden de aproximadamente de 1 a 10 residuos de aminoacidos; y las deleciones oscilaran aproximadamente de 1 a 30 residuos. Las deleciones o inserciones preferiblemente se hacen en pares adyacentes, es decir, una delecion de 2 residuos o insercion de 2 residuos. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinacion de los mismos pueden combinarse para llegar a una construccion final. Las mutaciones pueden colocar o no la secuencia fuera del marco de lectura y pueden crear o no regiones complementarias que puedan producir una estructura secundaria de ARNm. Las modificaciones de sustitucion son aquellas en las que al menos un residuo se ha eliminado y un residuo diferente se ha insertado en su lugar.

[0132] Las modificaciones, incluyendo las sustituciones de aminoacidos espedficos, se realizan por procedimientos conocidos. A modo de ejemplo, las modificaciones se realizan mediante mutagenesis espedficas de sitio de nucleotidos en el ADN que codifica la protema, produciendo de este modo ADN que codifica la modificacion, y a continuacion expresando el ADN en cultivo de celulas recombinantes. Las tecnicas para realizar mutaciones de sustitucion en sitios predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo mutagenesis del cebador M13 y la mutagenesis por PCR.

[0133] Una o mas mutaciones en una porina de Msp pueden aparecer en el vestfbulo o en la zona de constriccion de la protema. Opcionalmente, una porina de Msp mutante tiene al menos una diferencia en su secuencia de aminoacidos en el bucle periplasmico, vestfbulo, o zona de constriccion (por ejemplo, delecion, sustitucion, adicion) en comparacion con la porina de Msp de tipo salvaje.

[0134] Tal como se usa en el presente documento, un "aminoacido" se refiere a cualquiera de los 20 aminoacidos de origen natural encontrados en las protemas, D-estereoisomeros de los aminoacidos de origen natural (por ejemplo, D-treonina), aminoacidos no naturales, y aminoacidos modificados qmmicamente. Cada uno de estos tipos de aminoacidos no es mutuamente excluyentes. Los a-aminoacidos comprenden un atomo de carbono al que esta unido un grupo amino, un grupo carboxilo, un atomo de hidrogeno y un grupo distinto referido como una "cadena lateral". Las cadenas laterales de aminoacidos de origen natural son bien conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, hidrogeno (por ejemplo, como en glicina), alquilo (por ejemplo, como en alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina), alquilo sustituido (por ejemplo, como en treonina, serina, metionina, cistema, acido aspartico, asparagina, acido glutamico, glutamina, arginina y lisina), arilalquilo (por ejemplo, como en fenilalanina y triptofano), arilalquilo sustituido (por ejemplo, como en tirosina), y heteroarilalquilo (por ejemplo, como en histidina).

[0135] Las siguientes abreviaturas se usan para los 20 aminoacidos de origen natural: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), acido aspartico (Asp; D), arginina (Arg; R), cistema (Cys; C), acido glutamico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

[0136] Tambien son conocidos aminoacidos no naturales (es decir, aquellos que no se encuentran de forma natural en las protemas) en la tecnica, como se establece en, por ejemplo, Williams et al., Mol. Cell Biol. 9: 2574 (1989); Evans et al., J. Amer. Chem. Soc. 112: 4.011 a 4030 (1990); Pu et al., J. Amer. Chem. Soc. 56: 1280-1283 (1991); Williams et al., J. Amer. Chem. Soc. 113: 9.276-9.286 (1991); y todas las referencias citadas en los mismos. Los p- y y-aminoacidos son conocidos en la tecnica y tambien se contemplan en el presente documento como aminoacidos no naturales. La siguiente tabla muestra ejemplos no limitativos de aminoacidos no naturales que se contemplan en el presente documento.

Tabla 2. Aminoacidos no naturales de ejemplo

Abreviatura

Aminoacido Abreviatura Aminoacido

Aad

acido 2-aminoadfpico EtAsn N-Etilasparagina

Baad

acido 3-aminoadfpico Hyl Hidroxilisina

Bala

p-alanina, acido p-amino- propionico AHyl alo-Hidroxilisina

Abu

acido 2-Aminobutirrico 3Hyp 3-Hidroxiprolina

4Abu

acido 4-aminobutmco, acido piperidmico 4Hyp 4-Hidroxiprolina

Acp

acido 6-aminocaproico Ide Isodesmosina

Ahe

acido 2-aminoheptanoico AIle alo-lsoleucina

Aib

acido 2-aminoisobutmco MeGly N-Methilglicina, sarcosina

Baib

acido 3-aminoisobutmco Melle N-Metilisoleucina

Apm

acido 2-aminopimelico MeLys 6-N-Metil lisina

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Dbu

acido 2,4-diaminobutmco MeVal N-Metilvalina

Des

Desmosina Nva Norvalina

Dpm

acido 2,2'-diaminopimelico Nle Norleucina

Dpr

acido 2,3- diaminopropionico Orn Ornitina

EtGly

N-Etilglicina

[0137] Tal como se usa en el presente documento, un "aminoacido modificado qmmicamente" se refiere a un aminoacido cuya cadena lateral ha sido modificada qmmicamente. Por ejemplo, una cadena lateral puede ser modificada para comprender un grupo de senalizacion, tal como un fluoroforo o un radiomarcador. Una cadena lateral puede modificarse para comprender un nuevo grupo funcional, tal como un grupo tiol, acido carboxflico, o amino. Los aminoacidos modificados despues de la traduccion tambien se incluyen en la definicion de aminoacidos modificados qmmicamente.

[0138] Los aminoacidos, y, mas espedficamente, sus cadenas laterales, se puede caracterizar por su caractenstica o caractensticas qmmicas. Por ejemplo, las cadenas laterales de aminoacidos pueden estar cargadas positivamente, negativamente o ser neutras. El pH de una solucion afecta a la naturaleza cargada de ciertas cadenas laterales, tal como se conoce por los expertos en la tecnica. Los ejemplos no limitantes de cadenas laterales que pueden estar cargadas positivamente incluyen histidina, arginina y lisina. Los ejemplos no limitantes de cadenas laterales que pueden estar cargadas negativamente incluyen acido aspartico y acido glutamico. Los ejemplos no limitantes de cadenas laterales que pueden ser caracterizadas como neutras incluyen glicina, alanina, fenilalanina, valina, leucina, isoleucina, cistema, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, metionina, prolina y triptofano.

[0139] El nivel esterico de cadenas laterales tambien se puede usar para caracterizar un aminoacido. Las tablas de diametros de los atomos pueden ayudar en la determinacion de si una cadena lateral es mas grande que otra. Los modelos informaticos tambien pueden ayudar con esta determinacion.

[0140] Los aminoacidos se pueden caracterizar por la polaridad de sus cadenas laterales. Las cadenas laterales polares, que son tfpicamente mas hidrofilas que las cadenas laterales no polares, incluyen, por ejemplo, las de serina, treonina, tirosina, cistema, asparagina y glutamina. Las cadenas laterales no polares, que son tfpicamente mas hidrofobas que las cadenas laterales polares, incluyen, por ejemplo, las de glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, metionina, fenilalanina y triptofano. Se puede determinar la polaridad de una cadena lateral usando tecnicas convencionales conocidas en el sector que implica determinaciones de electronegatividad del atomo y evaluaciones estructurales tridimensionales de cadenas laterales. Tambien se puede comparar la hidrofobicidad/hidrofilia de las cadenas laterales usando tecnicas convencionales conocidas en el sector, tales como la comparacion del coeficiente de distribucion en octanol/agua de cada aminoacido. Vease Sangster, en: Octanol- Water partition coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, la serie Wiley en Solution Chemistry, Chichester: John Wiley & Sons Ltd., 2: 178 paginas (1997).

[0141] La siguiente tabla proporciona ejemplos no limitativos de propiedades de los aminoacidos que pueden ayudar a un experto en la materia a determinar como seleccionar los aminoacidos para las modificaciones de una porina o monomero de Msp tal como se describe en el presente documento.

Tabla 3. Propiedades de aminoacidos

Aminoacido

Porcentaje de residuos escondidosa (%) Volumen promediob (A3) Volumen de van der Waalsc (A3) Area superficial accesible (A2) Clasificacion de las polaridades e los aminoacidos®

alanina

38 (12) 92 67 67 9 (7)

arginina

0 225 148 196 15 (19)

asparagina

10 (2) 135 96 113 16 (16)

acido aspartico

14,5 (3) 125 91 106 19 (18)

cistema

47 (3) 106 86 104 7 (8)

glutamina

6,3 (2,2) 161 114 144 17 (14)

acido glutamico

20 (2) 155 109 138 18 (17)

glicina

37 (10) 66 48 11 (9)

histidina

19 (1,2) 167 118 151 10 (13)

isoleucina

65 (12) 169 124 140 1 (2)

leucina

41 (10) 168 124 137 3 (1)

lisina

4.2 (0,1) 171 135 167 20 (15)

metionina

50 (2) 171 124 160 5 (5)

fenilalanina

48 (5) 203 135 175 2 (4)

prolina

24 (3) 129 90 105 13 (-)

serina

24 (8) 99 73 80 14 (12)

treonina

25 (5,5) 122 93 102 12 (11)

triptofano

23 (1,5) 240 163 217 6 (6)

tirosina

13 (2,2) 203 141 187 8 (10)

valina

56 (15) 142 105 117 4 (3)

a Esta columna representa la tendencia de un aminoacido a estar escondido (definido como <5% de los residuos de disposicion al doisolvente) en el interior de una protema y se basa en las estructuras de nueve protemas (total de ~ 2000 residuos individuales estudiados, con 587 (29%) de estos escondidos). Los valores indican la frecuencia en que cada aminoacido se encontro escondido, en relacion con el numero total de residuos de este aminoacido que se encuentra en las protemas. Los valores entre parentesis indican el numero de residuos escondidos de este aminoacido que se encuentran en relacion con todos los residuos escondidos en las protemas. Los datos de Schien, Biotechnology 8: 308 (1990); para otros procedimientos de calculo con resultados similares, vease Janin, Nature 277: 491 (1979); y Rose et al, Science 229: 834 (1985)

b Volumen promedio (Vr) de los residuos escondidos, calculados a partir del area superficial de la cadena lateral. Richards, Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 6: 151 (1977); Baumann, Protein Eng. 2: 329 (1989). c Los datos de Darby NJ y Creighton T.E. Protein structure En el foco (Ed. D. Rickwood), p. 4. IRL Press, Oxford, Reino Unido (1993).

d Area superficial accesible total (ASA) de la cadena lateral de aminoacido para el residuo X en un tripeptido Gly- X-Gly con la cadena principal en una conformacion extendida. Miller et al., J. Mol. Biol. 196: 641 (1987) e Valores mostrados representan la clasificacion promedio de aminoacidos de acuerdo con la frecuencia de su aparicion en cada clasificacion de secuencia de 38 escalas de hidrofobicidad publicados. Trinquier y Sanejouand, Protein Eng. 11: 153 (1998). Aunque la mayona de estas escalas de hidrofobicidad se derivan de medidas experimentales de comportamiento qmmico o propiedades fisicoqmmicas (por ejemplo, solubilidad en agua, la distribucion entre agua y disolvente organico, la migracion cromatografica, o efectos sobre la tension superficial) de aminoacidos aislados, se incluyen varios escalas de hidrofobicidad “operativas” en base a las caractensticas de entorno conocidas de aminoacidos en las protemas, tales como su accesibilidad al disolvente o su inclinacion a ocupar el nucleo de protemas (en base a la posicion de los residuos en las estructuras terciarias como se observa por cristalograffa de rayos X o RMN). Las clasificaciones mas bajas representan los aminoacidos mas hidrofobos, y los valores mas altos representan los aminoacidos mas hidrofilos. Con fines comparativos, la escala de hidrofobicidad de Radzicka y Wolfenden, Biochem. 27: 1664 (1988) se muestra entre parentesis. Esa escala se deriva de la posibilidad de hidratacion medido de aminoacidos que se basa en sus energfas libres de transferencia desde la fase de vapor a ciclohexano, 1-octanol y solucion acuosa neutra.

[0142] Alternativamente, se puede considerar el mdice hidropatico de los aminoacidos. A cada aminoacido se le ha

asignado un mdice hidropatico sobre la base de su hidrofobicidad y/o caractensticas de carga, estos son: isoleucina

(+4,5); valina (4,2); leucina (3,8); fenilalanina (2,8); cistema/cistina (2,5); metionina (1,9); alanina (1,8); glicina (-0,4);

5 treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina

(-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y/o arginina (-4,5). La importancia del mdice hidropatico de los

aminoacidos para conferir una funcion biologica interactiva a una protema se entiende generalmente en la tecnica.

Se sabe que ciertos aminoacidos pueden ser sustituidos por otros aminoacidos que tienen un mdice hidropatico y/o

puntuacion similar y/o todavfa conservan una actividad biologica similar. Al hacer cambios basados en el mdice

10 hidropatico, la sustitucion de aminoacidos cuyos indices hidropaticos puede estar dentro de ±2; dentro de ±1, o dentro de ±0,5.

[0143] Tambien se entiende en la tecnica que la sustitucion de aminoacidos similares puede realizarse eficazmente sobre la base de la hidrofilicidad. Como se detalla en la patente de Estados Unidos 4.554.101, se han asignado los

15 siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoacidos: arginina (+3,0); lisina (3,0); aspartato (3,0 ± 1); glutamato (3,0 ± 1); serina (0,3); asparagina (+0,2); glutamina (0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cistema (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-

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2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4). Al hacer cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, se contempla que en la sustitucion de aminoacidos los valores de hidrofilicidad pueden estar dentro de ±2, dentro de ±1, o dentro de ±0,5.

[0144] Cualquier porina o monomero de Msp mutante puede comprender una sustitucion de aminoacido conservativa en comparacion con un porina o monomero de Msp de tipo salvaje. Cualquier mutacion de sustitucion es conservativa en que mfnimamente altera las propiedades bioqufmicas de la protefna. Ejemplos no limitativos de mutaciones que se introducen para sustituir residuos de aminoacidos conservadores incluyen: residuos de carga positiva (por ejemplo, H, K, y R) sustituidos por residuos de carga positiva; residuos de carga negativa (por ejemplo, D y E) sustituidos por residuos de carga negativa; residuos polares neutros (por ejemplo, C, G, N, Q, S, T, e Y) sustituidos por residuos polares neutros; y los residuos no polares neutros (por ejemplo, A, F, I, L, M, P, V, y W) sustituidos por residuos no polares neutros. Las sustituciones conservativas pueden realizarse de acuerdo con la siguiente Tabla 4. Las sustituciones no conservativas pueden realizarse tambien (por ejemplo, prolina por glicina).

Tabla 4. Ejemplos de sustituciones de aminoacidos

Aminoacido

Sustituciones

Ala

Ser, Gly, Cys

Arg

Lys, Gln, Met, Ile

Asn

Gln, His, Glu, Asp

Asp

Glu, Asn, Gln

Cys

Ser, Met, Thr

Gln

Asn, Lys, Glu, Asp

Glu

Asp, Asn, Gln

Gly

Pro, Ala

His

Asn, Gln

lie

Leu, Val, Met

Leu

Ile, Val, Met

Lys

Arg, Gln, Met, Ile

Met

Leu, Ile, Val

Phe

Met, Leu, Tyr, Trp, His

Ser

Thr, Met, Cys

Thr

Ser, Met, Val

Trp

Tyr, Phe

Tyr

Trp, Phe, His

Val

Ile, Leu, Met

[0145] Tal como se usa en el presente documento, un "peptido" se refiere a dos o mas aminoacidos unidos entre si por un enlace amida (es decir, un "enlace peptfdico"). Los peptidos comprenden o incluyen hasta 50 aminoacidos. Los peptidos pueden ser lineales o cfclicos. Los peptidos pueden ser a, p, y, 8, o superior, o mixto. Los peptidos pueden comprender cualquier mezcla de aminoacidos tal como se define en el presente documento, tales como que comprende cualquier combinacion de aminoacidos D, L, a, p, y, 8, o superior.

[0146] Tal como se usa en el presente documento, una "protefna" se refiere a una secuencia de aminoacidos que tiene 51 o mas aminoacidos.

[0147] Tal como se usa en el presente documento, un "polfmero" se refiere a una molecula que comprende dos o mas unidades lineales (tambien conocidas como un "mers"), donde cada unidad puede ser la misma o diferente. Los ejemplos no limitantes de polfmeros incluyen acidos nucleicos, peptidos y protefnas, asf como una variedad de polfmeros de hidrocarburos (por ejemplo, polietileno, poliestireno) y polfmeros de hidrocarburos funcionalizados, en los que la cadena principal del polfmero comprende una cadena de carbono (por ejemplo, cloruro de polivinilo, polimetacrilatos). Los polfmeros incluyen copolfmeros, copolfmeros de bloque y polfmeros ramificados, tales como

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poKmeros en estrella y dendnmeros.

[0148] Los procedimientos de secuenciacion utilizando porinas de Msp se describen en el presente documento. Ademas, los procedimientos de secuenciacion se pueden realizar en procedimientos analogos a los descritos en la patente de Estados Unidos N° 7.189.503. Vease tambien la patente de Estados Unidos N° 6.015.714. Puede llevarse a cabo mas de una lectura en dichos procedimientos de secuenciacion para mejorar la precision. Los procedimientos de analisis de las caractensticas de los polfmeros (por ejemplo, tamano, longitud, concentracion, identidad) y la identificacion de unidades discretas (o "mers") de los polfmeros se discuten en la patente '503 tambien, y se pueden emplear con respecto a las presentes porinas de Msp. De hecho, una porina de Msp se puede emplear con respecto a cualquier procedimiento descrito en la patente '503.

[0149] En la actualidad, se estan explorando varios tipos de senales observables como mecanismos de lectura en la secuenciacion de nanoporos y deteccion de analitos. El procedimiento de lectura originalmente propuesto, mas directo, y mas explorado se basa en una "corriente de bloqueo ionica", o "corriente de copaso" determinada unicamente por la identidad de un nucleotido o de otro analito que ocupa la constriccion mas estrecha en el poro. Este procedimiento se conoce como "secuenciacion de nanoporos de la corriente de bloqueo" o BCNS. La deteccion y caracterizacion de la corriente de bloqueo de acidos nucleicos se ha demostrado tanto en la a-hemolisina de poro de protema (a-HL) como en nanoporos de estado solido. Se ha observado que la deteccion y caracterizacion de la corriente de bloqueo proporciona una gran cantidad de informacion acerca de la estructura del ADN de paso, o que se retiene en, un nanoporo en varios contextos.

[0150] En general, un "bloqueo" se evidencia por un cambio en la corriente de iones que se distingue claramente de las fluctuaciones de ruido y por lo general se asocia con la presencia de una molecula de analito en la abertura central del poro. La fuerza de bloqueo dependera del tipo de analito que esta presente. Mas particularmente, un "bloqueo" se refiere a un intervalo en el que la corriente ionica cae por debajo de un umbral de aproximadamente 5100% del nivel de corriente no bloqueado, se mantiene ah durante al menos 1,0 |is, y vuelve espontaneamente al nivel no bloqueado. Por ejemplo, la corriente ionica puede caer por debajo de un umbral de aproximadamente, al menos aproximadamente, o como maximo alproximadamente de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50 %, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100%, o cualquier intervalo derivable en el mismo. Los bloqueos se rechazan si la senal no bloqueada inmediatamente anterior o siguiente tiene una corriente media que se desvfa del nivel no bloqueado tfpic en mas de dos veces el ruido rms de la senal no bloqueada. "Bloqueos profundos" son identificados como intervalos en los que la corriente ionica cae <50% del nivel no bloqueado. Los intervalos donde la corriente se mantiene entre 80% y 50% del nivel de no bloqueado se identifican como "bloqueos parciales."

[0151] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "sujeto" se refiere a un organismo mairnfero vivo, tal como un humano, mono, vaca, oveja, cabra, perros, gato, raton, rata, cobaya, o especies transgenicas de los mismos. Opcionalmente, el paciente o sujeto es un primate. Los ejemplos no limitantes de los sujetos humanos son adultos, jovenes, bebes y fetos.

[0152] El termino "acido nucleico" se refiere a un polfmero de desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos en forma monocatenaria o bicatenaria, y a menos que se limite de otro modo, abarca analogos conocidos de nucleotidos naturales que se hibridan con acidos nucleicos de manera similar a nucleotidos de origen natural, tales como acidos nucleicos peptfdicos (PNA) y ADN fosforotioato. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de acido nucleico particular incluye la secuencia complementaria de la misma. Los nucleotidos incluyen, pero no se limitan a, ATP, dATP, CTP, dCTP, GTP, dGTP, UTP, TTP, dUTP, 5-metil-CTP, 5-metil-dCTP, ITP, dITP, 2-amino-adenosina- TP, 2-amino-desoxiadenosina-TP, trifosfato de 2-tiotimidina, trifosfato de pirrolo-pirimidina, y 2-tiocitidina, asf como los alfatiotrifosfatos de todos los anteriores, y trifosfatos de 2'-O-metil-ribonucleotido para todas las bases anteriores. Las bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, 5-Br-UTP, 5-Br-dUTP, 5-F-UTP, 5-F-dUTP, 5-propinil dCTP, y 5-propinil-dUTP.

[0153] Tal como se usa en el presente documento, un "farmaco" se refiere a cualquier sustancia que pueda alterar un proceso biologico de un sujeto. Los medicamentos pueden ser disenados o utilizados para o en el diagnostico, tratamiento o prevencion de una enfermedad, trastorno, smdrome, u otra afeccion de salud de un sujeto. Los farmacos pueden ser de recreativos por naturaleza, es decir, utilizados simplemente para alterar un proceso biologico y no utilizarse para o en el diagnostico, tratamiento o prevencion de una enfermedad, trastorno, smdrome, u otra afeccion de salud de un sujeto. Los productos biologicos, que son sustancias producidas por mecanismos biologicos relacionados con la tecnologfa del ADN recombinante, tambien se incluyen en el termino "farmaco". Los farmacos incluyen, por ejemplo, antibacterianos, antiinflamatorios, anticoagulantes, antivirales, antihipertensivos, antidepresivos, antimicrobianos, analgesicos, anestesicos, beta bloqueantes, bisfosfonatos, agentes quimioterapeuticos, agentes de contraste, medicamentos para la fertilidad, alucinogenos, hormonas, narcoticos, opiaceos, sedantes, estatinas, esteroides y vasodilatadores. Ejemplos de farmacos no limitativos tambien se pueden encontrar en el fndice Merck. Los farmacos antibacterianos utilizados en el tratamiento de la tuberculosis, por ejemplo, incluyen isoniazida, rifampicina, pirazinamida y etambutol.

[0154] Los procedimientos que emplean un medicamento como un analito pueden comprender ademas el cribado de

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farmacos. Por ejemplo, la absorcion de un farmaco en una celula o un organismo puede ser investigada utilizando una porina de Msp mediante la observacion de bloqueos de corrientes de iones. Las zonas de constriccion y/o vestibulos espedficos de una porina de Msp con diferentes tamanos, propiedades electrostaticas, y propiedades qmmicas pueden ser construidos para imitar estrechamente el mecanismo deseado para farmacos para entrar o salir de una celula u organismo. Estos procedimientos podnan acelerar en gran medida el cribado de farmacos, asf como el diseno de farmacos. Tales estudios se han realizado con otras porinas, tal como se ha descrito por Pagel et al, J. Bacteriology 189: 8593 (2007).

[0155] Tal como se usa en el presente documento, un "agente de guerra biologica" se refiere a cualquier organismo o cualquier componente de origen natural, biodisenado o sintetizado de cualquiera de dichos microorganismos capaz de causar la muerte o enfermedad en las plantas o animales (incluyendo seres humanos) o la degradacion de los alimentos o suministro de agua, o la degradacion del medio ambiente. Los ejemplos no limitantes incluyen virus Ebola, virus de Marburg, Bacillus anthracis, Variola major, Variola minor, antrax y la ricina.

[0156] Tal como se usa en el presente documento, un "contaminante" se refiere a un material que contamina el aire, el agua o el suelo. Ejemplos de contaminantes no limitantes incluyen fertilizantes, pesticidas, insecticidas, detergentes, hidrocarburos de petroleo, humo, y sustancias que contienen metales pesados, tales como las que contienen zinc, cobre, o mercurio (por ejemplo, el metilmercurio).

[0157] Un analito puede ser un "objeto nanoscopico", que es un objeto que es menor de 100 nm en dos de sus dimensiones.

[0158] Las microesferas que se pueden emplear incluyen microesferas magneticas y microesferas opticas. Por ejemplo, se pueden usar microesferas magneticas recubiertas con estreptavidina para aplicar una fuerza opuesta a las fuerzas electrostaticas que tiran del ADN a traves del tunel de una porina de Msp. En esta ultima tecnica una perla magnetica se une al ADN biotinilado, y una fuerza comparable a la fuerza de conduccion electrostatica (~ 10 pN) se aplicana usando un fuerte gradiente de campo magnetico. Ver Gosse y Creoquette, Biophys. J. 82: 3314 (2002). De esta manera, la lectura del bloqueo de corriente no se vena afectada, pero las fuerzas sobre el ADN podnan ser controladas independientemente. Decenas o cientos de lecturas completas independientes de cada ADN podnan entonces correlacionarse y ensamblarse para reconstruir una secuencia de ADN exacta.

[0159] Las microesferas opticas manipulados por "pinzas opticas" tambien se conocen en la tecnica, y tales procedimientos pueden ser aplicados a las porinas de Msp descritas en el presente documento. Las pinzas opticas son una herramienta comun utilizada para ejercer una fuerza sobre un objeto nanoscopico. Un analito se une en un extremo de la microesfera, mientras que el otro extremo puede ser insertado en el tunel de la porina. La posicion y la fuerza de la microesfera se controlan y se miden con las pinzas opticas. Tales procedimientos controlan el paso del analito en el tunel y permiten un mayor control de la lectura del analito, tal como la lectura de las unidades de un polfmero. Vease, por ejemplo, Trepagnier et al., Nano Lett. 7: 2824 (2007) para una descripcion de tales procedimientos en el contexto de nanoporos artificiales. La patente de Estados Unidos No. 5.795.782, tambien describe el uso de pinzas opticas.

[0160] La transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia (FRET), una tecnica bien conocida, se puede emplear en los procedimientos de analisis descritos en el presente documento. Por ejemplo, una molecula aceptora FRET o una molecula donadora FRET fluorescentes pueden incorporarse en una porina de Msp. El analito se marca entonces con un emparejamiento donante FRET o aceptor FRET. Cuando el donante FRET de emparejamiento esta dentro de la distancia Forster para el aceptor de FRET, es probable que se produzca la transferencia de energfa. La senal resultante podna ser utilizada para fines de analisis en lugar de o ademas de los procedimientos que utilizan la corriente de iones como se describe en el presente documento. En consecuencia, los procedimientos de deteccion, identificacion, o secuenciacion pueden comprender la tecnologfa de FRET.

[0161] Otros procedimientos opticos que se pueden emplear incluyen la introduccion de moleculas opticamente activas en el interior de una porina de Msp (tal como el vestfbulo o la zona de constriccion). La luz externa se aplicana para afectar el interior de la protema: tales procedimientos podnan usarse para afectar a la velocidad de traslado de un analito o podnan permitir la entrada o salida del analito del tunel, ofreciendo el paso controlado del analito. Alternativamente, los pulsos opticos enfocados sobre el poro se podnan utilizar para calentar el poro para afectar la forma en que interactua con el analito. Dicho control podna ser muy rapido ya que el calor de un pequeno volumen de un centro de coordinacion se disipana rapidamente. Los procedimientos de control de la velocidad de traslado de un analito pueden por lo tanto emplear dichas moleculas opticamente activas o pulsos opticos.

[0162] La manipulacion de la velocidad de traslado tambien puede llevarse a cabo uniendo un objeto a un extremo de un analito, y el otro extremo del analito entonces interactua con la porina de Msp. El objeto puede ser una microesfera (por ejemplo, una microesfera de poliestireno), una celula, una molecula grande, tal como estreptavidina, neutravidina, ADN, etc., o un objeto nanoscopico. El objeto podna entonces someterse a un flujo de fluido p podna ser objeto de arrastre viscoso pasiva.

[0163] Los "motores moleculares" son bien conocidos en la tecnica y se refieren a una molecula (por ejemplo, una

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enzima) que interactua ffsicamente con un analito, tal como un poUmero (por ejemplo, un polinucleotido), y es capaz de mover ffsicamente el analito con respecto a una ubicacion fija, tal como el vestibulo, zona de constriccion, o tunel de una porina de Msp. Aunque no se pretende estar limitado por la teona, los motores moleculares utilizan energfa qmmica para generar fuerza mecanica. Un motor molecular puede interactuar con cada unidad (o "mer") de un polfmero de una manera secuencial. Los ejemplos no limitantes de los motores moleculares incluyen ADN polimerasas, ARN polimerasas, helicasas, ribosomas, y exonucleasas. Tambien se conocen motores no enzimaticos, tales como motores de virus que empaquetan el ADN. Ver Smith y otros, Nature 413: 748 (2001). Una variedad de motores moleculares y las propiedades deseables de tales motores se describen en la patente de Estados Unidos N° 7.238.485.

[0164] Un motor molecular puede estar dispuesto en la cara cis o la cara trans de una porina de Msp y, opcionalmente, se puede inmovilizar, tal como se ha descrito en la patente '485. Los procedimientos de incorporacion de un motor molecular en una porina de Msp pueden realizarse usando procedimientos descritos en la patente '485. Los sistemas y aparatos descritos en la patente '485 se pueden emplear con respecto a una porina de Msp descrita en el presente documento tambien. De hecho, cualquier realizacion descrita en la patente '485 se puede emplear utilizando una porina de Msp, tal como se describe en el presente documento. Los motores moleculares tambien se describen en, por ejemplo, Cockroft et al., J. Amer. Chem. Soc. 130: 818 (2008); Benner et al., Nature Nanotech. 2: 718 (2007); Gyarfas y col, ACS Nano 3: 1457 (2009).

[0165] Un motor molecular se emplea tfpicamente para regular la tasa o velocidad de traslado a la que un analito interactua con una porina de Msp. Cualquier protema Msp descrita en el presente documento puede comprender un motor molecular. Opcionalmente, se emplea un motor molecular para disminuir la velocidad a la que un analito entra en un tunel de porina de Msp o para disminuir la velocidad de traslado a la que un analito se traslada a traves de un tunel de porina de Msp. Opcionalmente, la velocidad de traslado o la velocidad de traslado promedio es menor de 0,5 nm/|is. Opcionalmente, la velocidad de traslado o la velocidad de traslado promedio es menor de 0,05 nm/|is. Opcionalmente, la velocidad de traslado o velocidad de traslado promedio es menor de 1 nucleotido/^s. Opcionalmente, la velocidad de traslado o la velocidad de traslado promedio es menor de 0,1 de nucleotidos/^s. Opcionalmente, la velocidad de movimiento de un analito oscila desde mas de 0 Hz a 2000 Hz. Aqm, la velocidad se refiere al numero de subunidades (o "mers") de un polfmero regular que avanza en un segundo (Hz). Opcionalmente, el intervalo es entre aproximadamente 50-1500 Hz, 100-1500 Hz, o 350 a 1500 Hz. Opcionalmente, la velocidad de movimiento es de aproximadamente, como maximo, aproximadamente, o al menos aproximadamente 25, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 , 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, o 2000 Hz , o cualquier intervalo derivable en el mismo. La velocidad puede controlarse emdiante el uso de un motor molecular que se mueve un analito a una velocidad sustancialmente constante, al menos para un periodo de tiempo durante una caracterizacion. Ademas, el intervalo de velocidad de movimiento puede depender del motor molecular. Por ejemplo, para una ARN polimerasa, un intervalo puede ser de 350 a 1500 Hz; para una ADN polimerasa, un intervalo puede ser de 75 a 1500 Hz; y para ribosomas, helicasas, y exonucleasas, un intervalo puede ser 50-1500 Hz.

[0166] Las tecnicas de registro y de deteccion que se pueden emplear en los procedimientos descritos en el presente documento. Ademas, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.795.782 y 7.189.503, tambien describen procedimientos de registro e instrumentacion que se pueden emplear con respecto a las porinas de Msp, asf como procedimientos para optimizar las lecturas de conductancia. La patente de Estados Unidos No. 6.746.594, describe un soporte para pelmulas delgadas que contienen nanoporos y procedimientos para el uso de tales soportes que pueden ser empleados con respecto a las porinas de Msp descritas en el presente documento.

[0167] Ademas se proporcionan vectores que comprenden cualquiera de los acidos nucleicos descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, un vector puede comprender moleculas de acido nucleico que codifican un nanoporo de Msp de una cadena (por ejemplo, un dfmero de Msp de una cadena o un octamero de Msp de una cadena), en el que la molecula de acido nucleico esta unida operativamente a una secuencia de control de la expresion. Los esqueletos de vectores adecuados incluyen, por ejemplo, los utilizados habitualmente en la tecnica, tales como plasmidos, cromosomas artificiales, BAC, o PAC. Numerosos vectores y sistemas de expresion estan disponibles comercialmente de compares, tales como Novagen (Madison, WI), Clonetech (Pal Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA), y Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, CA). Los vectores contienen tipicamente una o mas regiones reguladoras. Las regiones reguladoras incluyen, sin limitacion, secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta, sitios de reconocimiento de protemas, elementos inducibles, secuencias de union a protemas, regiones 5' y 3' no traducidas (UTRs), sitios de inicio transcripcional, secuencias de terminacion, secuencias de poliadenilacion, e intrones.

[0168] En otro aspecto, se proporciona una celula cultivada que se transfecta con un vector que comprende los acidos nucleicos descritos en el presente documento. A este respecto, una celula se transfecta con exito con un vector cuando la maquinaria de transcripcion de la celula intacta tiene acceso a la plantilla de acido nucleico para la produccion de ARNm. Los protocolos para facilitar la transfeccion de vectores en celulas son bien conocidos en la tecnica.

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[0169] En el presente documento se proporciona la progenie de una celula cultivada que fue transfectada de forma estable con el vector tal como se ha descrito anteriormente. Dicha progenie contendra copias del vector sin haber sufrido el protocolo de transfeccion y son capaces de transcribir los acidos nucleicos contenidos en el vector bajo el control de una secuencia de control de expresion. Las tecnicas que utilizan celulas cultivadas transfectadas con vectores de expresion para producir cantidades de polipeptidos son bien conocidas en el sector. Vease, por ejemplo, Wang, H., et al, J. Virology 81: 12.785 (2007).

[0170] Tambien se proporciona en el presente documento una cepa bacteriana mutante capaz de expresion de Msp inducible. La cepa bacteriana mutante comprende una delecion de una MspA de tipo salvaje, una delecion de una Mspc de tipo salvaje, una delecion de una MspD de tipo salvaje, y un vector que comprende un promotor inducible unido operativamente a una secuencia de acido nucleico de monomero de Msp. Opcionalmente, la cepa bacteriana mutante comprende una cepa de M. smegmatis ML16. Opcionalmente, la secuencia de acido nucleico de monomero de Msp codifica un monomero de Msp seleccionado del grupo que consiste en un monomero de MspA de tipo salvaje, un monomero de MspC de tipo salvaje, un monomero de MspD de tipo salvaje, y monomeros mutantes de los mismos. Opcionalmente, el promotor inducible comprende un promotor inducible por acetamida.

[0171] De manera opcional, la cepa bacteriana mutante comprende ademas una delecion de una MspB de tipo salvaje. La cepa bacteriana mutante que comprende una delecion de una MspB de tipo salvaje puede comprender ademas un vector con un promotor constitutivo unido operativamente a una secuencia de acido nucleico que codifica una porina o monomero de Msp. Opcionalmente, la porina o monomero de Msp se selecciona del grupo que consiste en una MspA de tipo salvaje, una MspC de tipo salvaje, una MspD de tipo salvaje, y mutantes de las mismas. Opcionalmente, el vector comprende cualquiera de los acidos nucleicos descritos en el presente documento.

[0172] Tambien se proporciona un procedimiento de produccion de una porina completa o parcial de Msp de una cadena. El procedimiento comprende la transformacion de una cepa bacteriana mutante. La cepa mutante comprende una delecion de una MspA de tipo salvaje, una MspB de tipo salvaje, una MspC de tipo salvaje, una MspD de tipo salvaje, y un vector que comprende un promotor inducible unido operativamente a una secuencia de acido nucleico de monomero de Msp. La cepa mutante se transforma con un vector que comprende una secuencia de acido nucleico capaz de codificar una porina de Msp de una cadena. La porina de Msp de una cadena se purifica a continuacion a partir de la bacteria. Opcionalmente, la porina de Msp de una cadena comprende una porina de MspA de una cadena. Opcionalmente, el vector comprende cualquiera de los acidos nucleicos descritos en el presente documento.

[0173] Tambien se proporciona un procedimiento de secuenciacion de acidos nucleicos o polipeptidos utilizando una porina de Msp de una cadena. El procedimiento comprende la creacion de una bicapa lipidica que comprende una primera y segunda cara, la adicion de una porina de Msp purificada a la primera cara de la bicapa lipfdica, la aplicacion de un voltaje positivo a la segunda cara de la bicapa lipfdica, el traslado de una secuencia de acido nucleico o polipeptido experimental a traves de la porina de Msp de una cadena, la comparacion de la corriente de bloqueo experimental con un patron de corriente de bloqueo, y la determinacion de la secuencia experimental. Opcionalmente, la porina de Msp de una cadena comprende un monomero de MspA de tipo salvaje o un monomero mutante del mismo. Opcionalmente, el monomero de Msp comprende un monomero paralogo u homologo de MspA seleccionado de la Tabla 1.

[0174] El uso del termino "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o" a menos que se indique expresamente para referirse a alternativas solamente o las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la divulgacion apoya una definicion que se refiere solo a alternativas y "y/o".

[0175] A lo largo de esta solicitud, el termino "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la desviacion estandar del error para el dispositivo o procedimiento que se emplea para determinar el valor. En cualquier realizacion descrita en el contexto de un valor numerico que se utiliza en conjuncion con el termino "aproximadamente", se contempla espedficamente que el termino aproximadamente puede omitirse.

[0176] Siguiendo la antigua ley de patentes, las palabras "un" y "una", cuando se utiliza junto con la palabra "comprende" en las reivindicaciones o la memoria, se refiere a uno o mas, a menos que se indique espedficamente.

[0177] Se dan a conocer materiales, composiciones, y componentes que se pueden utilizar para, se pueden utilizar en conjuncion con, se pueden utilizar en la preparacion de, o son productos de los procedimientos y composiciones descritos. Estos y otros materiales se describen en el presente documento, y se entiende que cuando se dan a conocer combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc., de estos materiales, que aunque la referencia espedfica de cada una de varias combinaciones individuales y colectivas y permutaciones de estos compuestos puede no estar descrita de forma explfcita, cada uno se contempla espedficamente y descrita en el presente documento. Por ejemplo, si se da a conocer y se describe un procedimiento y se dan a conocer una serie de modificaciones que se pueden realizar a una serie de moleculas que incluye el procedimiento, todas y cada combinacion y permutacion del procedimiento, y las modificaciones que son posibles se contemplan espedficamente a menos que se indique espedficamente lo contrario. Del mismo modo, cualquier subconjunto o

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combinacion de estas tambien se contemplan y se describen espedficamente. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta descripcion incluyendo, pero no limitado a, los pasos en los procedimientos que utilizan las composiciones descritas. Por lo tanto, si hay una gran variedad de pasos adicionales que se pueden realizar, se entiende que cada uno de estas etapas adicionales se puede realizar con cualquier etapa de procedimiento espedficas o combinacion de etapas de procedimiento de los procedimientos descritos, y que cada una de tales combinaciones o subconjuntos de combinaciones se contemplan espedficamente y deben considerarse como descritas. Por tanto, se contempla que cualquier realizacion descrita en esta memoria se puede implementar en relacion con cualquier procedimiento, compuesto, protema, porina, peptido, polipeptido, multimero, monomero, acido nucleico, vector, cepa, celulas cultivadas, sistema, o composicion, etc.., que se describen en el presente documento, y viceversa. Por ejemplo, cualquier protema descrita en el presente documento se puede emplear en cualquier procedimiento descrito en el presente documento.

[0178] Los siguientes ejemplos se proporcionan con el proposito de ilustrar, no limitar, el material descrito en el presente documento.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Materiales y procedimientos para los Ejemplos 1-7

[0179] Se sintetizaron oligonucleotidos ssADN homogeneos dAso, dCso, y dTso (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16 y SeQ ID NO: 17, respectivamente) y las construcciones de horquilla hp08 (5 'GcTgTTGC TCTCTC GCAACAGC A50 3 ') (SEQ ID NO: 4), hp10 (5' GCTCTGTTGC TCTCTC GCAACAGAGC A50 3') (SEQ ID NO: 5), y HP12 (5' GCTGTCTGTTGC TCTCTC GCAACAGACAGC A50 3 ') (SEQ ID NO: 6) por Integrated DNA Technologies, (IDT; Coralville, IA).

[0180] Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento. Todas las cepas bacterianas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 5. Las micobacterias se cultivaron a 37°C en un medio lfquido Middlebrook 7H9 (Difco) suplementado con 0,2% de glicerol, 0,05% de Tween 80® o sobre agar Middlebrook 7H10 (Difco) suplementado con 0,2% de glicerol. Se utilizo Escherichia coli DH5a para todos los experimentos de clonacion y se cultivo rutinariamente en medio Luria-Bertani (LB) a 37°C. Se utilizo higromicina en concentraciones de 200 |ig/ml para E. coli y 50 |ig/ml para M. smegmatis.

Tabla 5. Cepas y plasmidos

Cepa/plasmido

Cepa parental y genotipo pertinente

Cepa

E. coli DH5a

recA1, endA1, gyrA96, thi; relA1, hsdR17(rK, mK+), supE44,

M. smegmatis ML16

980AlacZAM15, AlacZ(YA-argF)UE169

Ml15, AmspA::FRT, AmspC::FRT, AmspD::FRT, attB::loxp, FRT

Plasmido

origen ClE1, origen PAL5000 origin, HygR

pMS2

pMN016

Psmyc-mspA, origen ColE1, origen PAL5000, HygR

pMN035

psmyc-rv1698, origen ColE1, origen PAL5000, HygR

pML904

derivado pMN016, mspA D90N/D91N/D93N (mlmspA)

pML840

derivado pML904, mspA D90N/D91N/D93N/D118R

pML841

derivado pML840, mspA D90N/D91N/D93N/D118R/E139R

pML843

derivado pML840, mspA D90N/D91N/D93N/D118R/E139K

pML844

derivado pML843 mspA, D90N/D91N/D93N/D118R/E139K/D134R (m2mspA)

La anotacion HygR indica resistencia a higromicina. MspA, MspC y MspD son genes de porinas de M. smegmatis.

[0181] Mutagenesis dirigida de sitio de MspA. Los monomeros mutantes MIMspA y M2MspA se construyeron de una manera gradual por mutagenesis dirigida de sitio utilizando la reaccion en cadena combinada (CCR) como se describe por Bi y Stambrook, Nucl. Acids Res. 25: 2949 (1997). El plasmido pMN016 porta una fusion transcripcional psmyc-mspA (Stephan et al, Mol Microbiol 58: 714 (2005)) y se utilizo como una plantilla. Se utilizaron los oligonucleotidos psmyc1 y pMS-seq1 como cebadores directo e inverso, respectivamente, y un cebador de mutagenesis apropiado (Tabla 6) en el CCR. Se introdujeron tres mutaciones posteriores en mspA para construir el gen mlmspA. Otras tres mutaciones se introdujeron en mlmspA para producir m2mspA. Todos los plasmidos se verificaron mediante secuenciacion de todo el gen de mspA antes de que se transformaron en el triple mutante de porina de M. smegmatis ML16 (Stephan et al, Mol Microbiol 58: 714 (2005)) para la produccion de protemas.

Tabla 6. Oligonucleotidos.

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Oligonucleotido

Secuencia (direccion 5’ a 3’) Objetivo

Psmyc1

CGACCAGCACGGCATACATC (SEQ ID NO:41) Amplificacion y secuenciacion

pMS-SEQ1

CGTTCTCGGCTCGATGATCC (SEQ ID NO:42) Amplificacion y secuenciacion

MspA909193NFP

CCTGATCAACAACGGTAACATCACCGC (SEQ ID NO:43) Clonacion de pML904

MspA_118R

CTGGGCACGCCTGGGCAACGG (SEQ ID NO:44) Clonacion de pML840

MspA_139R

TCCGGCGCCCGCGGTGGCGTG (SEQ ID NO:45) Clonacion de pML841

MspA_139K

GGCGCCAAGGGTGGCGTGG (SEQ ID NO:46) Clonacion de pML843

MspA_134R

CGTTCTCGGTCCGCGTCTCC (SEQ ID NO:47) Clonacion de pML844

Los codones que se han alterado para introducir las mutaciones MspA estan subrayados.

[0182] Experimented de tunel individuales. Se produjeron bicapas lip^dicas con difitanoil-PA y difitanoil-PC preparados en proporcion igual o desigual y se formaron a traves de una apertura horizontal, de diametro de ~ 20 pm, en Teflon tal como se ha descrito (Akeson et al, Biophys J. 77: 3227 ( 1999)). Se anadieron porinas de MspA a una cara de la bicapa (cara cis) a una concentracion de ~ 2,5 ng/mL. La cara cis se puso en tierra, y se aplico una tension positiva a la cara trans de la bicapa. Se empleo un amplificador patch-clamp Axopatch-IB (Axon Instruments) para aplicar tension a traves de la bicapa y medir la corriente ionica que fluye a traves del poro. La senal analogica se filtro a paso bajo a 50 kHz con un filtro Bessel de 4 polos. La senal filtrada amplificada se digitalizo a 250 kHz. La adquisicion de datos se controlo con software personalizado desarrollado en LabWindows/CVI (National Instruments). Todos los experimentos se realizaron a 21 ± 2°C en 1 M KCl, 10 mM Hepes/KOH tamponado a pH 8.

[0183] Analisis de datos. El analisis de datos se llevo a cabo con el software personalizado desarrollado en Matlab (The MathWorks, Natick, MA). Los bloqueos se identificaron como los intervalos donde la corriente ionica cafa por debajo de un umbral de 80% del nivel de corriente no bloqueada, se mantuvo aMt durante al menos 12 ps, y volvio de forma espontanea al nivel no bloqueado. Los bloqueos se rechazaron si la senal no bloqueada inmediatamente anterior o siguiente tema una corriente media que se desviaba del nivel no bloqueado tfpico en mas de dos veces la el ruido rms de la senal no bloqueada. Los bloqueos tambien fueron rechazados si se produdan en menos de 26 ps de otro bloqueo. Los bloqueos profundos fueron identificados como intervalos en los que la corriente ionica cafa <50% del nivel no bloqueado. Los intervalos donde la corriente se mantuvo entre 80% y 50% del nivel no bloqueado se identificaron como bloqueos parciales. Cada suceso se parametrizo por los tiempos de permanencia y las corrientes promedio de sus subintervalos parciales y profundos constituyentes.

[0184] Los valores de tD utilizados para parametrizar las distribuciones del tiempo de permanencia del bloqueo profundo de horquilla se estimaron como el pico de la distribucion de densidad de probabilidad del log-10 de los tiempos de permanencia (FIGURA 8). Esta distribucion se estimo con el estimador de densidad de Kernel suavizado Matlab utilizando una funcion kernel normal y una anchura de 0,15. Los datos de bicapa trans se analizaron mediante la deteccion de cambios abruptos en la conductancia de menos de 1 ns a mas de 1 ns. La tension a la que se produjeron estos cambios se registro y se resumio en los histogramas que se muestran en las FIGURAs 9E-9G.

[0185] En todos los experimentos, los poros estaban orientados de tal manera que la "entrada" (FIGURA 1) fue expuesta al compartimento cis del aparato.

[0186] Todos los datos de horquilla mostrados en las FIGURAs 5-8 se derivaron de los datos tomados en la misma porina de larga vida M1MspA. Los datos de homopolfmero presentados en el Ejemplo 5 se obtuvieron con diferentes porinas de larga vida M1MspA que los datos de la horquilla, aunque se considera una concordancia cuantitativa entre amplios conjuntos de datos de horquilla tomados en los dos poros.

Ejemplo 2: Caracteristicas de bloqueo de porinas de MspA de tipo salvaje (WTMspA) con y sin analito

[0187] Purificacion de porinas MspA. Las porinas de MspA se extrajeron selectivamente de M. smegmatis y se purificaron por el posterior intercambio anionico y cromatograffa de filtracion en gel tal como se ha descrito (Heinz y Niederweis, Anal Biochem 285: 113 (2000); Heinz et al, Methods Mol Biol 228: 139 (2003)).

[0188] De acuerdo con los resultados anteriores (Niederweis et al, Mol Microbiol 33: 933 (1999)), la protema purificada demostro una alta actividad de formacion de tunel con una conductancia mas frecuente de 4,9 nS en 1,0 M KCl a ~ 20°C (FIGURA 2). El compartimento cis se mantuvo en tierra y de tension positiva se aplico al compartimiento trans (FIGURA 3A). Por encima de ~ 60 mV, la porina WTMspA demostro bloqueos frecuentes, espontaneos, de la corriente ionica en ausencia de ssADN (FIGURA 3). Algunos bloqueos espontaneos fueron

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transitorios, y otros requirieron la inversion de la tension para restablecer el nivel de corriente no bloqueado. A pesar de este comportamiento, quedaron intervalos de senal constante y sin obstrucciones durante decenas de segundos de duracion para tensiones de hasta ~ 100 mV (FIGURA 3). La adicion de ~ 2-8 |iM dCso (SEQ ID NO: 48) ssADN al compartimento cis no condujo a una mejora notable o alteracion de estas caractensticas del bloqueo. Por encima de ~ 100 mV los bloqueos espontaneos fueron tan frecuentes que los experimentos de deteccion de ssADN eran poco practicos.

[0189] Una explicacion para la aparente ausencia de interacciones de ssADN con la porina WTMspA es la alta densidad de carga negativa en el poro (FIGURA 1). La interaccion electrostatica con el interior del tunel cargado negativamente probablemente inhibe la entrada de ADN en el poro. Para abordar esta cuestion se sustituyeron residuos de aspartato en la zona de constriccion por asparaginas (FIGURA 1). La porina de MspA mutante D90N/D91N/D93N (M1MspA) resultante se discute en el Ejemplo 3.

Ejemplo 3: Caractensticas del bloqueo de la porina de MspA mutante M1MspA con y sin analito Experimental.

[0190] Como se ha indicado en el Ejemplo 2, las interacciones electrostaticas entre ssADNA y el tunel de la porina WTMspA pueden afectar el traslado de ssADN a traves del poro. La MspA mutante D90N/D91N/D93N (M1MspA, tambien conocida como M1-NNN) fue disenada para probar esta teona. La porina M1MspA se expreso y se purifico a partir del M. smegmatis cepa ML16 que carece de porinas mas endogenos (Stephan et al, Mol Microbiol 58: 714 (2005)). Los niveles de expresion de la porina M1MspA (FIGURA 4) y su actividad de formacion de tunel fueron similares a la porina WTMspA, mientras que la conductancia se redujo en un factor de 2 a 3 (FIGURA 2). Ademas, la frecuencia de bloqueos espontaneos se redujo drasticamente en la porina M1MspA, por lo que es posible llevar a cabo experimentos de deteccion de ADN en tensiones de hasta y por encima de 180 mV (FIGURA 5).

[0191] Se utilizaron construcciones horquilla de ssADN para investigar la interaccion del ADN con la porina M1MspA. Cada construccion tema un poli-dA de 50-nt que colgaba del extremo 3', una region duplex dsADN de longitud variable (8, 10, y 12 pb para las construcciones hp08 (SEQ ID NO: 4), HP10 (SEQ ID NO: 5 ), y hop12 (SEQ ID NO: 6), respectivamente), y un bucle de 6-nt (FIGURA 6). A 180 mV, la adicion de ~ 8 |iM de ssADN hp08 al compartimento cis causo el aumento de la velocidad de bloqueos corriente ionica transitoria de 0,1-0,6 bloqueos por segundo a 20-50 bloqueos por segundo (FIGURA 5). La velocidades de bloqueo fueron proporcionales a la concentracion de ADN y fueron fuertemente dependientes de la tension, disminuyendo ~ 3 veces para una disminucion de 20 mV en la tension aplicada. Los bloqueos largos para estar bien separados eran bloqueos parciales, donde la corriente ionica se redujo a entre 80% y 50% del nivel no bloqueado o bloqueos profundos donde la corriente ionica se redujo a menos del 50% del nivel no bloqueado (FIGURa 5C). Los bloqueos que exhiben subsegmentos tanto parciales como profundos eran muy raros. Los bloqueos parciales duraron decenas a cientos de microsegundos y sus tiempos de permanencia aumentaron con el aumento de tension (FIGURAS 5C y 7). Los bloqueos profundos duraron de cientos de microsegundos a cientos de milisegundos y sus tiempos de permanencia disminuyeron con el aumento de tension (FIGURAs 6 y 7). No se observaron estas tendencias en los experimentos con las tres horquillas.

Analisis.

[0192] En analogfa con senales similares observadas con aHL (Butler et al, Biophys J. 93: 3229-40 (2007)), los bloqueos parciales se interpretan como la entrada de ADN en el vestfbulo de porinas M1MspA sin enroscado del segmento de una cadena a traves de la constriccion del tunel. Para este mecanismo, se espera una reduccion moderada de la corriente ionica. Sin querer limitarse por la teona, el aumento en el tiempo de permanencia con el voltaje (FIGURA 7) muy probablemente es el resultado de un aumento de barrera electrostatica frente al escape de una molecula de ADN desde el vestfbulo de nuevo al compartimento cis. Esta explicacion para el aumento del tiempo de permanencia se puede entender dentro de un marco cinetico donde la descomposicion del polfmero del vestfbulo se produce a traves de los dos procesos de primer orden de escape contra el gradiente de voltaje aplicado y el enroscado de un extremo a traves de la constriccion. La vida util es entonces el inverso de la suma de las constantes de velocidad para estos procesos. Este tiempo de vida se incrementara con el voltaje si (i) la constante de velocidad de escape disminuye con la tension y (ii) su disminucion domina cualquier cambio en la constante de velocidad de enroscado.

[0193] Para los bloqueos profundos, la clara disminucion de tiempos de permanencia con el aumento de la tension es inconsistente con cualquier proceso que implique un escape del ADN de nuevo al compartimento cis. Tanto el grado de reduccion de la corriente ionica como la dependencia del voltaje de los tiempos de permanencia son consistentes con un proceso en el que el segmento de polidA monocatenario es impulsado a traves de la constriccion de ~ 1 nm de diametro hasta que el duplex de ADN de ~ 2,2 nm de diametro alcanza la constriccion y detiene el traslado (FIGURA 5A). La construccion de horquilla se mantiene en esta conFIGURAcion de rosca hasta que cualquier de descomposicion del duplex de ADN (Vercoutere et al, Nat Biotech 19: 248-52 (2001); Sauer-Budge et al, Phys Rev. Lett 90: 238 101 (2003); Mathe et al, Biophys J. 87: 3205-12 (2004)) o un reordenamiento conformacional de la zona de constriccion de la porina M1MspA permite que se complete el traslado. Sin estar ligado

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por la teona, el mecanismo de descomposicion de finalizacion de el traslado parece mas plausible porque el paso de una helice de ADN de doble cadena requerina una constriccion con aproximadamente doble de diametro, lo que altera los enlaces de hidrogeno del barril betal que flanquea la constriccion (Faller et al., Science 303: 1189 (2004)) y, potencialmente se exponen las regiones hidrofobas de la protema y la bicapa interior al agua.

[0194] Los bloqueos profundos de horquilla en la porina de MIMspA teman distribuciones muy amplias del tiempo de permanencia que no fueron bien descritos por exponenciales simples o sumas de exponenciales (FIGURA 8). Para parametrizar las distribuciones, se utilizo el modo del logaritmo de los tiempos de permanencia de bloqueo profundo, fp, que corresponde en la FIGURA 6 al tiempo de permanencia con la mayor densidad de bloqueos (FIGURA 8). Para todas las tensiones, hp08 tema el fp mas corto. Por debajo de 160 mV, hp10 y hp12 teman un fp similar. Sin embargo, por encima de 160 mV hp10 tema un fp consistentemente mas largo que hp12. Estas observaciones son algo diferentes que las de aHL, donde las distribuciones del tiempo de permanencia de bloqueo de horquilla se modelaron con exponenciales individuales y horquillas con mayores energfas libres estandar de formacion produdan consistemente bloqueos profundos mas largos (Vercoutere y otros, Nat Biotechnol 19: 248 (2001); Mathe et al, Biophys J. 87: 3205 (2004)). Suponiendo que los bloqueos profundos son producidos por el traslado con disociacion del duplex como el paso limitante de la velocidad, entonces este proceso es 10-100 veces mas lento en la porina M1MspA que en aHL (Mathe et al, Biophys J. 87:.. 3205 (2004 )). Curiosamente, los bloqueos de hp10 persistieron mas que los bloqueos de hop12. En seis experimentos repetidos con hp10 a 180 mV, se observaron un nivel de corriente no bloqueada promedio de 340 ± 7 pA y un fp promedio de 9 ± 1 ms (media ± SEM).

Ejemplo 4: Deteccion transbicapa con la porina de M1MspA

Teona.

[0195] Para obtener una prueba directa de que el ApN se traslada a traves de MspA, se empleo la tecnica de deteccion de transbicapa ilustrada en la FIGURa 9 y por primera vez por Nakane et al. (Nakane et al, Biophys J. 87: 615 (2004)). Una molecula de sonda de ssApN con un complejo de anclaje voluminoso en un extremo es impulsado por electroforesis en el nanoporo. Los extremos de ssApN libres se enroscan a traves de los poros en el compartimiento trans hasta que el ancla detiene el traslado. Si el compartimiento trans contiene moleculas cortas diana de ssApN que son complementarias al extremo de la sonda de ssApN, entonces la sonda y la diana se pueden hibridar. Si se produce la hibridacion, la sonda es bloqueada en una conFIGURAcion de enroscado hasta que la aplicacion de un voltaje suficientemente negativa hace que la sonda se disocie de la diana y sale del compartimento cis. Si la hibridacion no se produce por razones estocasticas o porque el extremo de la sonda no es complementario a la diana, o si no hay moleculas diana en el compartimento trans, entonces no es necesario un voltaje negativo para la sonda para salir de nuevo al compartimento cis. La aparicion de bloqueos que solo se eliminan por voltaje suficientemente negativo es una evidencia de que la sonda de ssApN se ha enroscado a traves del nanoporo al compartimiento trans y se ha hibridado con el ApN diana.

Experimental.

[0196] Las moleculas sonda se construyeron comprendiendo moleculas ssApN de 75-nt de largo que fueron unidos a un anclaje de neutravidina (nA) en su extremo 5' biotinilado y teman una secuencia complementaria de 15 nt de longitud heterogenea en su extremo 3'. nA se obtuvo de Invitrogen (Carlsbad, CA). Se sintetizaron dos construcciones de ssApN biotinilados en 5' diferentes, 5'-bt-dC6dA54 d (CTcTaTTCTTATCTC)-3' (SEQ Ip NO: 7) y 5'-bt-dC6dA54 d(CACACACACACACAC)-3' (SEQ Ip NO: 8), por IpT. nA y las construcciones de ssApN se mezclaron a una concentracion de 50 |iM en una proporcion 1:1 en el tampon experimental 1M KCl y se almacenaron a -20°C hasta inmediatamente antes de su uso. El ApN diana de 15 nt de longitud, 3'- GAGATAAGAATAGAG-5' (SEQ Ip NO: 9) se sintetizo por IpT, se suspendio en el tampon experimental, y se almaceno a -20°C hasta inmediatamente antes de su uso. El compartimiento trans se precargo con ~ 100 |iM de ApN diana y el compartimento cis se lleno con tampon exento de ApN. pespues de formar una bicapa, el compartimento cis se perfundio para eliminar cualquier ApN diana que se difunde a traves de la abertura. Una vez se establecio una porina de M1MspA estable, se anadieron los complejos nA-ssApN al compartimiento trans hasta una concentracion final de ~ 1 |iM. Se utilizo un software de control experimental personalizado desarrollado en LabWindows para controlar continuamente la corriente y aplicar los voltajes apropiados.

[0197] Se observaron bloqueos de corriente profundos indefinidos cuando las moleculas de la sonda fueron conducidas al poro del compartimento cis con 180 mV. Para los experimentos de transbicapa, moleculas de la sonda fueron capturadas con 180 mV. pespues de un breve retardo para asegurar que el ssApN se habfa enroscado lo maximo posible a traves de la porina de M1MspA, el voltaje se redujo a 40 mV y se mantuvo a ese nivel durante 5 s para permitir que uno de los ssApN diana de 15 nt de longitud se hibride al extremo complementario de la sonda. A continuacion, la tension se redujo en rampa hasta una velocidad de 130 mV/s. Para cada suceso, el voltaje de salida de la sonda, Vsalida, fue identificado como la tension a la que se observo un aumento grande y abrupto en la conductancia con la rampa (FIGURAS 9C y 9p).

[0198] Los datos transbicapa se analizaron mediante la deteccion de cambios abruptos en la conductancia de <1 a >

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1 ns. La tension a la que se produjeron estos cambios se registro y se resumio en los histogramas que se muestran en la las FIGURAs 9E-9G. Ver Materiales y Procedimientos en el Ejemplo 1 para obtener mas informacion sobre el analisis de datos.

Analisis.

[0199] Los histogramas de Vsalida de experimentos con tres diferentes combinaciones de sonda/diana se muestran en la FIGURA 9. Cuando el ADN de sonda es complementario al ADN diana (FIGURA 9E) un numero significativo de Vsalida son negativos, lo que indica hibridacion de la sonda/diana. En seis experimentos repetidos con moleculas de sonda/diana complementarias, se observaron poblaciones similares de Vsalida negativo. En cinco experimentos repetidos donde el extremo 3' de ssADN no era complementario a las moleculas diana (FIGURA 9F) y en un experimento sin ADN diana (FIGURA 9G), los valores de Vsalida negativos rara vez se observaron. En dos diferentes nanoporos se utilizaron las combinaciones de sonda/diana complementarias y no complementarias. Los datos de uno de esos poros se muestran en las FIGURAs 10E y 10F. Estos datos proporcionan una evidencia clara y directa de que ssADN puede enroscarse a traves de la porina MIMspA, lo que confirma la hipotesis de que los bloqueos profundos observados en la FIGURA 5 estan en efecto causados por el traslado de ssADN a traves de la porina de MIMspA.

Ejemplo 5: La porina de MspA mutante M1MspA y ssADN lineal, homogeneo

[0200] Tambien se investigo la interaccion entre la porina de MIMspA y 50 unidades de ssADN homogeneas lineales. A 180 mV, la adicion de ~ 8 |iM de dT50 en el compartimento cis causo ~ 5 bloqueos por segundo (FIGURA 10), un aumento en un factor de ~ 20 sobre la velocidad de bloqueo en ausencia de dT50 (SEQ ID NO: 32). La mayona de estos bloqueos eran mas cortas que 30 |is, que es demasiado breve para resolver la estructura interna o estimar la profundidad del bloqueo. Los experimentos con dA0 (SEQ ID NO: 49) y dC50 (SEQ ID NO: 48) dieron resultados similares. La corta duracion de los bloqueos observados sugieren que el traslado de estas 50 unidades de ssADN homogeneas lineales es tipicamente inferior a 30 |is. Los bloqueos son tambien coherentes con las pequenas desviaciones de los polfmeros en el vestfbulo que terminan con el escape de nuevo en el compartimento cis. Aunque tanto el traslado como el escape se producen probablemente en los experimentos con 50 unidades de ssADN lineales, las estimaciones de la frecuencia relativa de los dos procesos no eran posibles.

Ejemplo 6: Caracteristicas de bloqueo de la porina de MspA mutante M2MspA con y sin analito

[0201] A fin de examinar el efecto de las cargas en la porina de MspA en sus capacidades de analisis de ADN, se realizaron tres mutaciones adicionales a la porina M1MspA y se sustituyeron residuos cargados negativamente en el vestfbulo y alrededor de la entrada por residuos de carga positiva (FIGURA 1). La porina mutante resultante D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K (M2MspA) demostro niveles de expresion (FIGURA 4) y la actividad de formacion de tunel similares a la porina WTMspA (FIGURA 2).

[0202] Al igual que la porina de M1MspA, la porina de M2MspA presentaba una conductancia mas pequena que la porina WTMspA (FIGURA 2) y exhibio bloqueos espontaneos mmimos para tensiones de hasta y por encima de 180 mV. A 180 mV, la adicion de 2 |iM dT50 (SEQ ID NO: 32) al compartimento cis condujo a velocidades de bloqueo de ~ 25 bloqueos por segundo (FIGURA 10B.). Un bloqueo parcial de ~ 100 |is terminando con un pico claro descendente era un patron comun de bloqueo (FIGURA 10C). Las duraciones de bloqueo parcial y su tendencia a terminar con un pico descendente aumentaron la tension (FIGURA 11). Estas tendencias son consistentes con un proceso en el que un polfmero entra en el vestfbulo y se mantiene allf, produciendo un bloqueo parcial hasta que un extremo entra en la constriccion de campo alto y se inicia el traslado. Este mecanismo ha explicado con precision un patron de bloqueo parcial a profundo similar al observado con aHL (Butler et al, Biophys J. 93: 3229 (2007)). La corta duracion de los picos descendentes sugiere que el traslado de 50 unidades de ssADN lineales a traves de la porina de M2MspA es mas corta que ~ 30 |is. Los bloqueos parciales que no terminan con picos descendentes se interpretan como que escapan de nuevo al compartimento cis o como traslado que es mas corta que ~ 10 |is, lo cual es demasiado breve para ser observado en estos experimentos.

Ejemplo 7: Comparacion de las porinas mutantes de MspA M1 y M2 y todas las propiedades

[0203] Una similitud importante entre las porinas M1MspA y M2MspA es que el traslado de 50 unidades de ssADN lineales parece ser demasiado rapida para producir bloqueos profundos con estructura resoluble. Sin estar ligado por la teona, esta observacion sugiere que la constriccion, que es la misma para ambos mutantes, es la region que determina principalmente la velocidad de una molecula de ADN monocatenario lineal que se traslada a traves de la porina de MspA. La comparacion de velocidades de traslado de MspA de ~ 2-10 bases/^s de las porinas M1MspA y M2MspA con las velocidades de traslado de ~ 0,5-1 bases/^s observadas con aHL (Meller et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 97: 1079 (2000); Butler et al, Biophys J. 93: 3229 (2007)) apoya la nocion de que los detalles de la geometna del tunel y la composicion juegan un papel principal en la determinacion de la velocidad de traslado.

[0204] En el caso de la porina de MspA y aHL, la gran diferencia en la velocidad de traslado podna resultar de la

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anchura de las regiones de tunel que flanquean las constricciones. Si la interaccion entre el ADN y las paredes del tunel ralentiza el paso de ADN (Slonkina y Kolomeisky, J. Phys Chem. 118: 7112-8 (2003)), entonces se esperana un traslado mas lento en aHL donde las 10-20 bases que estan altamente confinadas en la region de constriccion y transmembrana se ven obligadas a interactuar con las paredes del tunel. En la porina de MspA, solo 2-4 bases en la constriccion se ven obligadas a estar en contacto con la protema. La distribucion de carga dentro de la constriccion es otra diferencia significativa entre aHL alfa y las porinas mutantes de MspA M1 y M2. La constriccion aHL esta formada por las cadenas laterales de E111, K147, y M113 (Song et al, Science 274:. 1859 (1996)), que fuerzan la estructura de ssADN de carga negativa en muy estrecha proximidad con siete residuos cargados positivamente y siete cargados negativamente. La falta de residuos cargados en la constriccion de las porinas de MspA mutantes M1 y M2 tambien podna ser responsable de las velocidades de traslado mas rapidas en comparacion con aHL.

[0205] Una comparacion adicional de las caractensticas de bloqueo de homopolfmero entre las dos porinas de MspA mutantes da una idea de como la disposicion de los residuos cargados en el tunel influye en sus interacciones con el ADN. Las velocidades de bloqueo de la porina M2MspA eran ~ 20 veces mas altas que las velocidades de la porina M1MspA para una concentracion dada de ssADN (FIGURA 10B). La porina M2MspA tambien demostro bloqueos facilmente observables hasta ~ 80 mV, mientras que casi no hubo bloqueos visibles para la porina M1MspA por debajo de ~ 140 mV. Por ultimo, los bloqueos parciales de la porina M2MspA eran al menos ~ 100 veces mas largos que para la porina M1MspA (FIGURA 9C). Estas tendencias son consistentes con un modelo electrostatico sencillo en el que los residuos cargados positivamente en las porinas M2MspA facilitan la entrada de ssADN en el vestfbulo e inhiben el escape de las moleculas de ssADN del vestfbulo de nuevo al compartimento cis. Estas observaciones demuestran que la colocacion adecuada de los residuos cargados ofrece un medio sencillo para adaptar sustancialmente la interaccion entre la porina de MspA y el ADN.

Ejemplo 8: La porina M1MspA reconoce un nucleotido unico en un ADN mantenido en el poro por una seccion de horquilla (hp)

[0206] Los experimentos con la porina M1MspA y (i) una cadena de ADN poli-A con una sola C incrustado dentro y (ii) una sola T incrustada en un fondo de poli-A) se desarrollaron como se describe en el Ejemplo 3. Como se senalo anteriormente, la horquilla mantiene la construccion de ADN en la zona de constriccion de la porina de MspA durante el tiempo suficiente para obtener las firmas de corriente muy bien definidas.

[0207] Una sola C incrustada en una construccion de horquilla de ADN poli-A. La FIGURA 12A muestra el histograma de corriente debido a una unica C en la posicion 1, 2, y 3 despues de la horquilla, asf como una mezcla de poli-A y poli-C. Los histogramas de corriente para cada sitio son muy diferentes y muestran que el "sitio de reconocimiento" esta cerca de la posicion 2. Para una descripcion mas cuantitativa, el pico de las distribuciones de corriente se escalo mediante la diferencia de corriente encontrada para poli-C y poli-A (FIGURA 12B). Un ajuste de Gauss revela que la posicion de reconocimiento de la porina de MspA para una sola C es de 1,7 nucleotidos (nt) de distancia de donde se encuentra la horquilla. La longitud del sitio de reconocimiento (longitud de la zona de constriccion) es comparable a la anchura gaussiana (1,6 nt) ~ 5-6 A de largo.

[0208] Una sola T incrustada en una construccion de horquilla de ADN poli-A. Los experimentos utilizando una unica T en ADN poli-A se llevaron a cabo en una manera similar, centrandose unicamente en las tres primeras posiciones adyacentes a la horquilla (FIGURA 13, paneles 2-4). La especificidad es igualmente impresionante, pero en este caso muestra la sensibilidad mas grande cerca de la posicion 1. La ubicacion de la unica T se puede resolver mucho mejor que una posicion. Sin estar ligado por la teona, los inventores especulan que la diferencia en el reconocimiento de la posicion en comparacion con una C en poli-A es de hecho causada por el propio ADN que contribuye con el medio electrostatico que forma la constriccion. Los datos con una unica A en un fondo de C se muestra en los tres paneles inferiores de la FIGURA 13. Si bien la A sola produce firmas de bloqueo de corriente que solo estan separados debilmente del fondo de poli-C, las distribuciones de corriente son lo suficientemente estrechas como para separa la A sola. La posicion optima de A en la cadena de poli-C parece estar cerca de la posicion 2, es decir, similar a una C sola en una cadena A.

[0209] La composicion de la cola de ADN mas alla de la posicion 3 no afecta a las propiedades de reconocimiento de bases. El ADN poli-A forma estructura secundaria, y las diferencias entre los datos de fondo de C en poli A y fonde de A en poli C podnan ser debidas a la interrupcion de la estructura secundaria (rigidez) de la cola de poli-A. Las mediciones se llevaron a cabo con una secuencia heterogenea 47 bases despues de las tres primeras posiciones ocupadas por trinucleotidos A o C. Se encontraron que los niveles de corriente eran indistinguibles de los nieles de corriente de colas A50 y C50, lo que indica que la estructura secundaria o composicion de la cola no afecta el bloqueo de corriente (FIGURA 14).

[0210] Otra serie de experimentos se llevaron a cabo (1) para evaluar la capacidad de la porina M1MspA de distinguir diferentes nucleotidos y (2) evaluar la ubicacion y longitud de la region a la que es sensible la porina (resolucion espacial). En estos experimentos, se utilizaron diversas construcciones de ADN con una cadena de 50 nucleotidos de ssADN unida a una seccion de horquilla de 14 pares de bases para prevenir el traslado inmediato. Los datos se resumen en la FIGURA 31. dA50 (SEQ ID NO: 49) y dC50 (SEQ ID NO: 48) produjeron corrientes de bloqueo significativamente diferentes. A continuacion, se ensayaron una serie de construcciones, y el sitio de

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reconocimiento se aislo de las primeros cuatro bases siguientes a la horquilla. Estas construcciones teman secuencias de ssADN de dC4dA46 (SEQ ID NO: 15), dAadC4dA43 (SEQ ID NO: 12), y dAadC4dA40 (SEQ ID NO: 11) despues de la horquilla. dC4dA46 muestra una distribucion de corriente bloqueo casi identica a dCso, mientras que dA3dC4dA43 y dA6dC4dA4o bloquean como dAso. Esto estrecho el sitio de reconocimiento para estar con los primeros 3 nucleotidos despues de la horquilla. A continuacion, las construcciones se ensayaron con un solo dC en varias posiciones en un fondo de poli-dA. Hp-dC-idA49 (dC en la posicion 1) (SEQ ID NO: 14) bloqueo la corriente a un nivel intermedio entre los valores de poli-dA y poli-dC. La construccion dA2dC3dA47 (dC en la posicion 3) (SEQ ID NO: 50) bloqueo la corriente intermedia entre poli-dA y poli-dC, pero cercana a poli-dA. Poli-dTso (SEQ ID NO: 32) bloqueo con la corriente mas pequena, y hp-dG3dA47 (SEQ ID NO: 18) produce una corriente intermediae entre poli-dC y poli- dA. En un mutante diferente (D90/91Q + D93n + D118/134R + E139K), se midieron las corrientes de bloqueo para poli-dC, poli-dA, y poli-dT y eran distinguibles entre sr Estos datos demuestran que la porina M1MspA tiene capacidades de reconocimiento y que el sitio de reconocimiento es corto. Ademas, el sitio de reconocimiento parece estar ubicado en la zona de constriccion, suponiendo que la horquilla se detiene a la derecha de la cara cis de la zona de constriccion.

Ejemplo 9 Construccion y caracterizacion de porinas de MspA mutantes MspA M1-QQN y M2-QQN

[0211] En otra serie de experimentos disenados para reducir el traslado del ADN a traves del tunel de porina de MspA, se realizaron dos mutantes adicionales. Una, llamada M1-QQN, se hizo de una manera similar a M1-NNN (o M1MspA) anterior mediante la sustitucion de los aminoacidos en las posiciones 90 y 91 del monomero de MspA de tipo salvaje por glutamina y el aminoacido en la posicion 90 por asparagina. Con M2-QQN, el tamano de poro de constriccion se redujo mediante la introduccion de glutamina mas voluminosa en las posiciones 90 y 91 en el fondo del mutante M2MspA (vease el Ejemplo 6; D90Q + D91Q + D93N + D118R + E139K + D134R). Se expreso en el mutante de M. smegmatis ML16 descrito en los Ejemplos 1 y 3 anteriores. La cantidad de la porina M2-QQN en extractos de detergente fue tan alta como la de la porina WTMspA (FIGURA 15A), indicando que las nuevas mutaciones no afectaban a la expresion de los poros. Los experimentos de bicapa lipidica mostraron que la porina M2-QQN forma poros abiertos estables como la porina WTMspA (FIGURA 15B). La actividad de formacion de poros es similar a la de la porina WTMspA. La conductancia de un solo tunel de porina M2-QQN (2,4 nS) fue mayor que la de su origen M2 (1,4 ns).

[0212] Los mutantes QQN tambien distinguen entre las bases A, C, y T. Cualitativamente similares a las porinas mutantes M1MspA (tambien llamadas mutantes M1-NNN), los mutantes QQN muestran niveles de corriente bien separados utilizando hebras de homopolfmero-hp pero las separaciones relativas entre los niveles son diferentes en la porina M1-QQN. Para cada poro, los datos se recogieron con el ADN en horquilla con colas A50, T50 y C50 (SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 48, respectivamente). Las corrientes de bloqueo se representaron como una fraccion de la corriente de poros abierta no bloqueada (FIGURA 16). En cada caso de poli-T bloquea mas que poli-C y poli-C bloquea mas que poli-A. Cada pico esta bien separado de los otros. En la porina QQN, los niveles de corriente promedio de poli-A y poli-C estan menos separados que en la porina M1-NNN, pero poli-T esta mas separada de poli-C que en la porina M1-NNN. Sorprendentemente, el nivel relativo de bloqueo de poli-T en las dos porinas mutantes qQn es claramente diferente. Estos dos mutantes difieren solo en sustituciones de dominio del borde lejos de la constriccion. Sin estar ligado por la teona, esto puede ser debido a las interacciones entre el dominio del borde y la horquilla de anclaje.

[0213] Las porinas mutantes QQN parecen ralentizar el traslado de ADN a traves de MspA. La principal motivacion para construir los mutantes QQN era ralentizar el paso del ADN. El traslado de un segmento heterogeneo de ssADN de 100 nt (sin horquilla de anclaje) se registro junto con la duracion de los estados de bloqueo profundos. La representacion de supervivencia (FIGURA 17) muestra la fraccion de sucesos de bloqueo que duran mas que el tiempo t. Durante los primeros ~ 100 |is el mutante NNN se descompone significativamente mas rapido que los mutantes con la zona de constriccion de QQN. Estos datos son consistentes con una mayor barrera para el traslado a traves de QQN.

Ejemplo 10: Construccion de un mutante cuadruple de Msp por delecion de M. smegmatis

[0214] Para la preparacion de la porina de MspA, se extrajeron selectivamente protemas de la cepa mutante de M. smegmatis ML16, que contiene solo uno (MspB) de los cuatro genes Msp (los otros son MspA, MspC, y MspD). El procedimiento explota la estabilidad termica extrema de MspA por ebullicion de celulas de M. smegmatis en 0,5% de n-octilpolioxietileno (OPOE), un detergente no ionico, y se obtiene la porina de MspA con muy poca contaminacion por otras protemas (Heinz y Niederweis, Anal. Biochem 285: 113-20 (2000)). Sin embargo, la expresion de fondo de MspB es todavfa detectable en inmunotransferencias utilizando un antisuero espedfico de Msp (Stephan et al, Mol Microbiol 58: 714-30 (2005)), lo que indica que oligomeros mixtos de MspA/MspB podnan formar y contribuir a la heterogeneidad del poro observada en los experimentos de reconstitucion de los poros. Por lo tanto, uno de los objetivos era construir una cepa de M. smegmatis libre de porinas endogenas. Dado que M. smegmatis requiere la actividad de porina para la supervivencia, se integro un casete de expresion de MspA flanqueado por loxP en el sitio cromosomico attB para el micobacteriofago L5 de la porina mutante triple ML16.

[0215] Esto restauro la expresion de monomero de MspA en la cepa ML56 a la mitad del nivel de tipo salvaje. A

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continuacion, el gen MspB fue reemplazado por un gen hyg flanqueado por FRT utilizando el vector suicida pMN247 en una estrategia de dos etapas como se ha descrito (Stephan et al, Gene 343:. 181-190 (2004)). Despues de la escision del gen hyg por la Flp recombinasa, se obtuvo la cepa mutante cuadruple de porina ML59 (AMspA AMspB AMspC AMspD attB::loxP-MspA-loxP). La delecion del gen MspB se confirmo por hibridacion de transferencia de Southern. La PCR demostro la ausencia de cada uno de los cuatro genes Msp originales (FIGURA 19). La escision del casete loxP-MspA-loxP dio lugar a clones pequenos, viables, uno de los cuales (ML180) fue examinado con mas detalle. Las protemas se extrajeron de celulas ML180 utilizando el mismo procedimiento de alta temperatura y el analisis Western demostro que las celulas ML180 no expresaron protemas de porina Msp ni hubo sucesos de reconstitucion en experimentos de bicapa lipfdica despues de la adicion de 20 |ig de protema (FIGURA 20). En conjunto, estos resultados demuestran que se ha creado una porina mutante de M. smegmatis que carece de las cuatro porinas Msp. Sin embargo, no fue posible detectar la expresion de monomero de MspA usando vectores de expresion de MspA, muy probablemente debido a mutaciones secundarias desconocidas. Por lo tanto, esta cepa de M. smegmatis no se puede utilizar para la expresion de poros de MspA disenados para el traslado del ADN.

Ejemplo 11: Construccion del mutante cuadruple de Msp ML705 de M. smegmatis por delecion utilizando la expresion inducible de MspA

[0216] Para el aislamiento de porinas MspA de tipo salvaje y mutantes, se utiliza actualmente la cepa M16 de M. smegmatis ML16 (AMspA, AMspC, AMspD). Sin embargo, la expresion de base de MspB complica la interpretacion de los experimentos de traslado. Por lo tanto, la construccion de una cepa de M. smegmatis que carece de los cuatro genes Msp es necesaria para mejorar los experimentos de un solo poro. Para ello, el gen MspA, bajo el control del promotor inducible por acetamida, se integro en el sitio attB de L5 de M. smegmatis ML16 dando lugar a la eliminacion del gen de MspB por intercambio alelico. Por lo tanto, en presencia de acetamida, MspA se expreso de rescatar el crecimiento del mutante cuadruple de M. smegmatis.

[0217] Para lograr esto, se construyo el plasmido de integracion pML967, que contiene el gen MspA bajo el control del promotor inducible por acetamida (FlGuRA 21A). El vector de delecion MspB, pML1611 (FIGURA 21B), tambien se construyo y contiene los dos genes indicadores gfp y xylE como marcadores para la integracion y la sustitucion alelica.

[0218] Se obtuvo la cepa ML341 (ML16, attP::pML967) despues de la integracion del plasmido de expresion de monomero de MspA pML967 en M. smegmatis ML16. El gen de resistencia a higromicina fue extrafdo de esta cepa por una expresion temporal de la Flp recombinasa del plasmido pML2005 como se ha descrito previamente (Song et al., Mycobacteria protocols (2008)) dando lugar a la cepa ML343 (ML341, attP::pace-MspA). Para examinar la funcionalidad del monomero de gen MspA integrado, se extrajo MspA con un detergente de celulas no inducidas e inducidas. La FIGURA 22 muestra que MspA se expresa en el 20% de los niveles de tipo salvaje de la construccion integrada despues de la adicion de acetamida al 2%. Este nivel de monomero de MspA es suficiente para permitir la supervivencia de M. smegmatis. Hubo poca expresion fondo de porinas de Msp en celulas no inducidas (FIGURA 22) lo que demuestra que el sistema de expresion esta regulado.

[0219] A continuacion, el vector de delecion de MspB pML1611 se transformo en ML343. Los transformantes se sembraron en placas de agar Middlebrook 7H10 que contienen 10% de sacarosa para la seleccion directa de dobles candidatos cruzados. Se obtuvieron varias colonias, que mostraron la presencia de GFP mediante fluorescencia verde tras irradiacion con luz azul y la ausencia de XylE. La PCR de la colonia de uno de los clones confirmo la ausencia del gen MspB y la construccion de un mutante cuadruple Msp viable. Esta cepa se denomino ML378. La cepa ML378 se transformo con el plasmido pCreSacB1 para eliminar el casete de expresion de gfp-hyg. Tras la seleccion del contador subsiguiente, se obtuvieron varios clones y se examinaron mediante PCR de colonias. Una de los ocho porina mutantes cuadruples sin marcar de M. smegmatis se denomino ML705 y se caracterizo adicionalmente.

[0220] Para examinar si monomeros de MspA complementan el fenotipo del mutante cuadruple, el plasmido de expresion de MspA pMN016 se transformo en ML705. La FIGURA 24 muestra que el crecimiento de ML705 en placas de agar 7H10 se redujo drasticamente; sin embargo, la expresion de MspA de pMN016 restauro completamente el crecimiento de ML705 a niveles de tipo salvaje (FIGURa 23). Estos resultados demostraron que ninguna mutacion secundaria causo el defecto de crecimiento y que los monomeros de MspA se pueden expresar para producir porinas de MspA en el mutante cuadruple de Msp ML705.

[0221] El crecimiento del mutante cuadruple de porina ML705 en medio Middlebrook 7H9 fue mucho mas lento que el M. smegmatis de tipo salvaje y significativamente mas lento que el de la porina mutante triple ML16 (FIGURA 24). La adicion de acetamida al 2% para inducir la expresion del monomero del gen de MspA en el sitio de L5 y la expresion de MspA en el plasmido pMN016 restauro la velocidad de crecimiento a los niveles de tipo salvaje (FIGURA 24). El crecimiento de ML705 en las placas y en cultivos lfquidos fue mas lenta que la de la triple mutante indicando que ML705 tema menos porinas en la membrana externa que el mutante triple de Msp ML16. Esta suposicion se confirmo en una transferencia Western (FIGURA 25). La cantidad del monomero de MspA es menor que el 5% de la comparada con M. smegmatis de tipo salvaje (wt), y 50% menos que la del mutante triple. La FIGURA 25 tambien demuestra que se puede inducir MspA hasta 25% del tipo salvaje cuando se anade acetamida

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[0222] Los experimented descritos anteriormente demuestran que un mutante cuadruple Msp (M1705) se ha construido, que se puede cultivar en presencia de acetamida para producir temporalmente monomeros de MspA de tipo salvaje. La cepa ML705 puede entonces ser transformada con un plasmido que contiene un casete de expresion para monomeros de MspA de tipo salvaje o mutantes, o porinas de Msp de una cadena de tipo salvaje o mutantes. La produccion de monomeros MspA de stipo salvaje cortarse mediante el lavado de celulas de transferencia a un medio sin acetamida. Esto da lugar a la produccion de monomeros de MspA de tipo salvaje o mutantes o porinas de Msp de una cadena de tipo salvaje o mutantes con menos contaminacion por MspA de tipo salvaje. Por lo tanto, ML705 es adecuado para la produccion de porinas MspA de tipo salvaje y mutadas para todos los objetivos.

Ejemplo 12: Construccion de un dimero de porinas de MspA de una cadena

[0223] El ADN de una sola hebra no es rotacionalmente simetrico. Por lo tanto, sena beneficioso tener un poro asimetrico para los propositos de secuenciacion. Para combinar las capacidades de secuenciacion superiores de porinas de MspA con una mayor capacidad de adaptacion de las propiedades del vestteulo y la constriccion a la secuenciacion del ADN, se construye un nanoporo de MspA de una cadena. Los extremos de la cadena de MspA estan muy juntas en el dfmero de porinas de MspA (FIGURA 26A) y podnan estar conectados por un enlazador peptfdico corto. Para probar esta idea, el monomero de gen MspA se fusiono junto con el monomero de gen MspB, que codifica una protema con solo dos alteraciones (A138P, E139A) en comparacion con el monomero de MspA de tipo salvaje (Stahl et al., Mol. Microbiol. 40: 451 (2001)). El peptido (GGGgS)3 (SEQ ID NO: 3), a menudo utilizado para enlazar protemas (Huston et al, Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879 (1988)), se utilizo para conectar el extremo C- terminal del monomero de MspA al N-terminal del monomero de MspB que carece de peptido senal (FIGURA 26B). El dfmero de porinas MspA-MspB resultante se coloco bajo el control del promotor psmyc constitutivo en el plasmido pML870 y despues se expreso en M. smegmatis ML16. La protema se purifico usando el procedimiento de extraccion de calor estandar. Aunque el nivel de expresion del dfmero de porinas de MspA de una cadena era menor que la de la porina de MspA de tipo salvaje (FIGURa 26C), la actividad tunel de ambas porinas era similar (FIGURA 26D). El analisis de los registros de corriente mostro que la conductancia de un unico tunel del poro formado por el dfmero de MspA fue de 2,6 ns. Este resultado muestra que el segmento enlazador no afecta al plegado o funcion de poros de Msp.

Ejemplo 13: Construccion de una porina de MspA de una cadena

[0224] Para combinar las capacidades de secuenciacion superiores de MspA con una mayor capacidad de adaptacion de las propiedades del vestteulo y la constriccion a la secuenciacion del ADN, se construye unoctamero de porinas de MspA de una cadena que permite las propiedades optimas del vestteulo y la zona de restriccion para la secuenciacion de ADN. Los extremos de la cadena de MspA estan muy juntos en la porina de MspA y estan conectados por un enlazador peptfdico corto. El peptido (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 3) se utiliza para conectar el extremo carboxi-terminal del monomero de MspA anterior al extremo amino-terminal del siguiente monomero de MspA, que carece de peptido senal.

[0225] Para crear un vector que comprende la secuencia de porina de MspA, cada secuencia de monomero de MspA esta flanqueada por un sitio de restriccion unico, que permite la capacidad de mutar cualquier monomero individual. La secuencia de porina de MspA completa esta flanqueada por sitios de restriccion PacI y HindIII. Los sitios de restriccion entre las secuencias de monomero de MspA comprenden: BamHI, ClaI, EcoRV, HpaI, KpnI, MluI, NdeI, NheI, PstI, SacI, SpeI, XbaI, NotI y SphI (FIGURA 31.). Para crear la secuencia de porina de MspA, cada secuencia de MspA se ensambla por etapas para formar una MspA de una cadena dimerica, tetramerica y octamerica utilizando los sitios de restriccion unicos. Para evitar problemas de recombinacion en la creacion del multimero de MspA de una cadena, siete genes de MspA se sintetizan con diferentes usos de codones (SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27), es decir, los genes codifican la misma secuencia de aminoacido, sin embargo, la secuencia de ADN ha sido alterada de la secuencia de nucleotidos del gen nativo de MspA (SEQ ID NO: 20). Para crear la secuencia de porina de MspA, el primer monomero de Msp debe contener la secuencia lfder como se muestra en la FIGURA 18 (por ejemplo, los aminoacidos 1 a 27 de SEQ ID NO: 28)). Cada una de las siete secuencias de monomero de Msp despues de la primera secuencia de monomero de Msp puede comprender SEQ ID NO: 1 o una mutacion de la SEQ ID NO: 1 seleccionada de entre cualquiera de las mutaciones enumeradas en la Tabla 7. El vector de expresion pML2604 es el vector origen que comprende la secuencia de porin de MspA clonada en los sitios de restriccion PacI y HindIII. pML2604 se transforma en la porina mutante cuadruple y los niveles de expresion y el estado oligomerico de la porina de MspA se comprueban por transferencia Western de las protemas nativas y desnaturalizadas. La actividad del tunel de la porina de MspA se comprueba mediante experimentos de bicapa lipfdica

Tabla 7: Mutantes de MspA

Fila 1

Fila 2

MspA D90A

MspA T84C

MspA D91A

MspA I87C

MspA D90A/D91A

MspA D91C

MspA D90E

MspA D93C

MspA D91E

MspA A96C

MspA D90E/D91E

MspA P97C

MspA D90F

MspA G100C

MspA D91F

MspA N102C

MspA D90F/D91F

MspA P107C

MspA D90G

MspA G112C

MspA D91G

MspA V113C

MspA D90G/D91G

MspA S114C

MspA D90H

MspA D118C

MspA D91H

MspA N121C

MspA D90H/D91H

MspA E127C

MspA D90K

MspAF131C

MspA D91K

MspA D134C

MspA D90K/D91K

MspA S136C

MspA D90L

MspA A138C

MspA D91L

MspA E139C

MspA D90L/D91L

MspA G141C

MspA D90R

MspA V144C

MspA D91R

MspA H148C

MspA D90R/D91R

MspA T150C

MspA D90S

MspA A155C

MspA D91S

MspA R161C

MspA D90S/D91S

MspA R165C

MspA D90W

MspA S173C

MspA D91W

MspA T175C

MspA D90W/D91W

MspA E179C

MspA D90Y

MspA V184C

MspA D91Y

MspA N79C/D90K/D91N/P97C

MspA D90Y/D91Y

MspA K47S/D90K/D91N/P97C/D134C

MspA Q126C

MspA AA96-P98

MspA D90N

MspA AT95-F99

MspA D91N

MspA AI94-G100

MspA D93N

MspA AD93-L101

MspA D90N/D91N

MspA AG92-N102

MspA D90N/D91N/D93N

MspA N79R/D90N/D91N/D93N

MspA D90Q/D91N/D93N

MspA N79W/D90N/D91N/D93N

MspA D90Q/D91Q/D93N

MspA D90N/D91N/D93N/Q126R

MspA D90T/D91N/D93N

MspA D90N/D91N/D93N/TI30R

MspA D90T/D91T/D93N

MspA D90N/D91N/D93N/D134R

MspA D91E

MspA D90N/D91N/D93N/Q126W

MspA D90E

MspA D90N/D91N/D93N/T130W

MspA D90E/D91E

MspA D90N/D91N/D93N/D134W

MspA D90N/D91N/D93Q

MspA D90N/D91N/D93N/D118W/D134R/E139K

MspA D90N/D91N/G92Q/D93N

MspA D90N/D91N/D93N/D118F/D134R/E139K

MspA G1C

MspA D90N/D91N/D93N/D118H/D134R/E139K

MspA D3C

MspA D90N/D91N/D93N/D118Y/D134R/E139K

MspA E5C

MspA N79W/D90N/D91N/D93N/D118R/E139K

MspA D10C

MspA N79F/D90N/D91N/D93N/D118R/E139K

MspA D13C

MspA N79H/D90N/D91N/D93N/D118R/E139K

MspA R14C

MspA N79Y/D90N/D91N/D93N/D118R/E139K

MspA T17C

MspA D90N/D91K/D93N

MspA W21C

MspA D90N/D91R/D93N

MspA D22C

MspA D90N/D91W/D93N

MspA G27C

MspA D90N/D91W/D93N

MspA R33C

MspA D90N/D91T/D93N

MspA R38C

MspA D90N/D91L/D93N

MspA G44C

MspA D90N/D91H/D93N

MspA K47C

MspA D90N/D91S/D93N

MspA I49C

MspA D90N/D91N/D93N/D118R

MspA E57C

MspA D90N/D91N/D93N/D118R/E139R

MspA G60C

MspA D90N/D91N/D93N/D118R/E139K

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

MspA E63C

MspA D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K

MspA G69C

MspA D90Q/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K

MspA S73C

MspA D90Q/D91Q/D93N/D118R/D134R/E139K

MspA L74C

MspA D90T/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K

MspA V76C

MspA D90T/D91T/D93N/D118R/D04R/E09K

LISTADO DE SECUENCIAS

[0226]

<110> University of Washington University of Alabama Research Foundation Gundlach, Jens H.

Niederweis, Michael Butler, Thomas Z.

Pavlenok, Mikhail Troll, Mark

<120> Nanoporos MSP y procedimientos relacionados

<130> UWOTL-1-33161

<150> Estados Unidos 61/098.938

<151> 2008-09-22

<160> 52

<160> 52

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 184 <212> PRT

<213> Mycobacteria Smegmatis <400> 1

Gly

Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu

1

5 10 15

Thr

Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp

20 25 30

Arg

Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr

35 40 45

Ile

Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu

50 55 60

Gly

Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Q_ L_ 1- Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe

65

70 75 80

Ser

Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Ala

85 90 95

Pro

Pro

Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly

100 105 110

Val

Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu

Val

115 120 12 5

Ala

Thr Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Ala Glu Gly Gly Val Ala Val

130 135 140

Ser

Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu

145

150 155 160

Arg

Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr

165 170 175

S_ > 1-

Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn

180

<210> 2 <211> 184 <212> PRT

<213> Mycobacteria Smegmatis <400> 2

Gly

Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu

1

5 10 15

Thr

Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp

20 25 30

Arg

Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

35 40 45

Ile

Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu

50 55 60

Gly

Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Q. L_ 1- Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe

65

70 75 80

Ser

S_ > 1- Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Ala

85 90 95

Pro

Pro

Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly

100 105 110

Val

Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu

Val

115 120 12 5

Ala

Thr Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Pro Ala Gly Gly Val Ala Val

130 135 140

Ser

Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu

145

150 155 160

Arg

Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr

165 170 175

S_ > 1-

Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn

180

<210> 3 <211> 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido enlazador entre peptidos de MspA <400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

<210> 4 <211> 72 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 4

gctgttgctc tctcgcaaca gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aa 72

<210> 5 <211> 76 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 5

gctctgttgc tctctcgcaa cagagcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaa 76

<210> 6 <211> 80 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 6

gctgtctgtt gctctctcgc aacagacagc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 80

<210> 7 <211> 75 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleotidos <400> 7

ccccccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 ctctattctt atctc 75

<210> 8 <211> 75 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 8

ccccccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 cacacacaca cacac 75

<210> 9 <211> 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 9

gagataagaa tagag 15

<210> 10 <211> 50 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 10

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

50

<210> 11 <211> 50 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 11

aaaaaacccc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

50

50

50

50

50

<210> 12 <211> 50 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 12

aaaccccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

<210> 13 <211> 50 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 13

aacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

<210> 14 <211> 50 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 14

caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

<210> 15 <211> 50 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 15

ccccaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

<210> 16 <211> 50 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 16

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc

<210> 17 <211> 50 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 17

tttttttttt tttttttttt tttttttttt

<210> 18 <211> 50 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 18

gggaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

<210> 19 <211> 45 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 19

ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtagc

<210> 20 <211> 549 <212> ADN

<213> Mycobacteria Smegmatis <400> 20

ggcctggaca acgagctgag cctcgttgat tgggacacct tcctcaatgg tgtgttcccc ttccactccg gtcgcgccaa gtacatcgtg acgctggaac tcggctacca gatcggcttc agctacacca ccccgaacat cctgatcgac ctgaactcgg tcatcacccc gaacctgttc aacggccccg gcatccagga agtcgcaacg ggcgtggccg tgtcgaacgc ccacggcacc cgtccgttcg cccgcctgat cgcctcgacc tggaacatg

<210> 21 <211> 549 <212> ADN

<213> Mycobacteria Smegmatis <220>

<223> Gen de MspA Mutante <400> 21

ggcctagaca atgagcttag ccttgttgac tgggatacct ttctcaacgg tgtattcccg ttccattccg gccgcgctaa gtatatcgta acgctcgaac ttggctatca gataggcttt agctatacca caccgaatat cctcatcgat ctgaattcgg taatcacgcc gaatctgttt aacggtcccg gaatccaaga agtggcaact ggcgtagccg tctcgaatgc ccatggcacg cgtccattcg cgcgcctaat cgcgtcgaca tggaatatg

<210> 22

tttttttttt tttttttttt 50

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 50

ggcggtggcg gtagc 45

ggccaggacc gcaccctcac cgtgcagcag 60 ctggaccgca accgtcttac ccgtgagtgg 120 gccggccccg gtgccgacga gttcgagggc 180 ccgtggtcgc tgggtgtggg catcaacttc 240 gacggtgaca tcaccgctcc gccgttcggc 300 cccggtgtgt cgatctcggc agatctgggc 360 ttctcggtcg acgtctccgg cgccgagggt 420 gtgaccggtg cggccggcgg tgtgctgctg 480 ggtgactcgg tcaccaccta cggcgaaccc 540

549

ggccaagacc gaaccctgac cctccagcaa 60 ctggatcgca atcgtctaac ccgcgagtgg 120 gccggacccg gggccgatga gtttgaggga 180 ccgtggtcgc taggtgtcgg cattaacttt 240 gacggcgaca taaccgcgcc gcctttcggt 300 cccggggtgt ctatctcagc agacctgggg 360 ttctccgtcg atgtctcggg cgcggagggc 420 gtgacaggtg cagccggggg tgtactgcta 480 ggtgattcgg ttaccacata cggtgaacca 540

549

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<211> 549 <212> ADN

<213> Mycobacteria Smegmatis <220>

<223> Gen de MspA mutante <400> 22

ggactggata acgaactgag tctggtagat tgggacactt tcctgaatgg cgtgtttccc tttcactcag gtcgtgccaa atacattgtg accctggagc tcgggtacca aatcggtttc agttacacga cccccaacat tctgatagac ctcaactccg tcataacccc caacctcttc aatggccctg gcattcagga ggtcgctacg ggtgtggcgg tgtccaacgc gcacggtacc cggccgtttg cccggctgat tgcctccacc tggaacatg

<210> 23 <211> 549 <212> ADN

<213> Mycobacteria Smegmatis <220>

<223> Gen de MspA mutante <400> 23

ggccttgaca acgagctaag cctagttgac tgggatacct ttctcaatag cgtcttccca ttccactccg ggcgcgcaaa gtatatcgtc acgcttgaac taggctacca gattggcttc agctacacca ctccgaacat cctaatcgac ctgaactcgg tgatcacacc gaacctgttt aacggacccg ggatccagga agttgcaacc ggcgtcgccg tatcgaacgc ccacggcact cgtcccttcg cacgcctcat cgcatcgacg tggaacatg

<210> 24 <211> 549 <212> ADN

<213> Mycobacteria Smegmatis <220>

<223> Gen de MspA mutante <400> 24

gggctggata acgaactgag tctcctggat tgggacacat tccttaatgg ggtgttcccc ttccactcgg gtcgggccaa gtacatagtg acactggaac tcggttacca aatcgggttc agctacacaa cccctaacat actgatagac cttaactcag tcattacccc taacctattc aacggcccgg gcatacagga agtcgcgacg ggggtggcag tgtcaaacgc tcacgggacc cgcccgttcg cccgtctgat agcctcaacc tggaacatg

<210> 25 <211> 549 <212> ADN

<213> Mycobacteria Smegmatis <220>

gttcaggatc gcaatctcac agtgcaacag 60 ctcgaccgga accgacttac gcgtgaatgg 120 gcgggcccgg gtgcggacga attcgaaggc 180 ccttggtccc tgggcgtggg tatcaatttc 240 gatggtgata tcacggctcc cccgtttggc 300 cctggtgtct cgatttcggc cgatctcggc 360 ttttcggtgg acgtgtccgg tgccgaaggt 420 gtcaccggcg cggcgggcgg cgtgctcctg 480 ggggactccg tcacgaccta tggcgagccc 540

549

ggccaggacc gtaccctaac cctacagcag 60 ctggaccgca atcgtctgac ccgagagtgg 120 gccggtcccg gtgccgacga gttcgagttc 180 ccgtggtcgc ttggtgttgg cataaacttc 240 gacggggaca ttaccgcacc gccattcggg 300 cccggagtgt caatctccgc agatcagggt 360 ttctcagtcg acgtctcagg cgcagagggg 420 gtgacgggtg ccgccggtgg tgtcctgctc 480 ggtgactcgg taaccacgta cggggaaccg 540

549

ggacaggatc gcaatctcac ggtgcagcag 60 cttgaccgta accggcttac acgtgaatgg 120 gctggccctg gtgctgacga gttcgaaggc 180 ccctggtcac tgggggtggg aatcaacttc 240 gacggtgaca tcactgctcc tccgtttggc 300 cccggtgttt cgatatcggc ggatcttggc 360 ttctcggttg acgtttccgg ggccgagggt 420 gttaccgggg cggcaggcgg ggtgcttctg 480 ggcgactcag tcacaaccta cggcgagccc 540

549

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<223> Gen de MspA mutante

<400> 25 ggactcgata tgggatactt tttcattcag accctcgagc agttatacga

ctcaattccg aatggtcctg ggtgtagcgg cggccatttg tggaacatg

<210> 26 <211> 549 <212> ADN <213> Mycobacteria Smegmatis

<220>

<223> Gen de MspA mutante <400> 26

gggctagata atcagcttag tcttgtggac gggcaagatc gaacgctgac gctccaacaa 60

tgggatacgt ttctaaacgg cgtatttccg ctcgatcgga atcgactaac gcgcgaatgg 120

tttcattcgg gccgagctaa atatatagta gcaggaccgg gggcagatga atttgaagga 180

acactcgagc ttgggtatca aataggtttt ccttggtccc taggagtcgg gattaatttt 240

agttatacaa cacccaatat actcattgat gatggcgata taacggcgcc tccttttggt 300

ctcaattccg taattacgcc taatctcttt ccgggggtgt ctatatcagc cgacctcggg 360

aacggtccag gaattcaaga ggtggcgact ttttccgtgg atgtttcggg agcggaaggc 420

ggtgtagcag cgtccaatgc tcatggaacg gtcacaggcg cagcaacagg agtactccca 480

cggccatttg cgcggctaat tgcgtctaca ggcgattccg ttacgacata tggtgagcca 540

tggaatatg 549

<210> 27 <211> 549 <212> ADN <213> Mycobacteria Smegmatis

<220>

<223> Gen de MspA mutante <400> 27

ggacttgata acgaactaag tctggtagat ggtcaggatc gtaatcttac agttcaacag 60

tgggacactt tcctgaatgg cgtttttcct ctcgaccgga accgactgac gcgggaatgg 120

tttcactcag gccgtgcaaa atacaatgta gcgggtccgg gagcggacga attcgaaggg 180

accctagagc ttgggtacca aatgggtttc ccttggtccc tcggcgtagg tataaatttc 240

agttacacga cacccaacat tcttatagac gatggggata ttacggcacc cccctttggt 300

ctcaactccg taataacacc caacctcttc cctggagtct ctatttcagc cgatctcgga 360

aatggacctg gaattcagga ggttgctaca ttttctgtgg acgtgtcagg tgcagaagga 420

ggtgtcgcgg tctccaacgc gcacggtacg gtcacgggcg ctgcgggggg cgttctcctt 480

cggccctttg cgcggctcat tgcttccaca ggggactccg taacgactta tggacagcct 540

tggaatatg 549

<210> 28 <211> 211 <212> PRT <213> Mycobacteria Smegmatis

<220>

<223> Proteina de MspA <400> 28

Met Lys Ala Ile Ser Arg Val Leu Ile Ala Met Val Ala Ala Ile Ala

atgaactcag tctagtagac ggtcaagatc ggaatctgac agtccaacaa 60 ttctgaacgg cgtctttccg ctcgatcgga atcgactcac gcgcgaatgg 120 ggcgtgcgaa atatattgtc gcggggccgg gcgcggatga atttgaaggt 180 tggggtatca aattggtttt ccttggtccc ttggcgtcgg tattaatttt 240 cgcccaatat tctcatagat gatggcgata taacggcgcc cccatttggg 300

tgataacgcc caatctcttt cctggcgtct ccatttccgc cgacctcggt 360 gtattcaaga ggtggctacc ttttccgtgg atgtgtcggg tgcggaaggc 420 tatccaatgc gcatggtaca gtcacaggcg ccgcgggtgg cgtcctcctc 480 cacggctaat tgcgtccacg ggggattccg tgacgacgta tggtcagccg 540

549

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1

5 10 15

Ala

Leu Phe Thr Ser Thr Gly Thr Ser His Ala Gly Leu Asp Asn Glu

20 25 30

Leu

Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu Thr Val Gln Gln Trp

35 40 45

Asp

Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp Arg Asn Arg Leu Thr

50 55 60

Arg

Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr Ile Val Ala Gly Pro

65

70 75 80

Gly

Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu Gly S_ > 1- Gln Ile

Gly

85 90 95

Phe

Pro Q_ L_ 1- Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe Ser S_ > 1- Thr Thr Pro

100 105 110

Asn

Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Ala Pro Pro Phe Gly Leu

115 120 12 5

Asn

Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly Val Ser Ile Ser Ala

130 135 140

Asp

Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val Ala Thr Phe Ser Val

145

150 155 160

Asp

Val Ser Gly Ala Glu Gly Gly Val Ala Val Ser Asn Ala His Gly

165 170 175

Thr

Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu Arg Pro Phe Ala Arg

180 185 190

Leu

Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr Tyr Gly Glu Pro Trp

195 200 205

Asn

Met Asn

210

<210> 29 <211> 215 <212> PRT

<213> Mycobacteria Smegmatis <220>

<223> Proteina de MspB <400> 29

Met

Thr Ala Phe Lys Arg Val Leu Ile Ala Met Ile Ser Ala Leu Leu

1

5 10 15

Ala

Gly Thr Thr Gly Met Phe Val Ser Ala Gly Ala Ala His Ala Gly

20 25 30

Leu

Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu Thr

35 40 45

Val

Gln Gln Q_ L_ 1- Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp Arg

50 55 60

Asn

Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys S_ > 1- Ile

65

70 75 80

Val

Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu Gly

85 90 95

S_ > 1-

Gln Ile Gly Phe Pro Q_ L_ 1- Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe Ser

100 105 110

S_ > 1-

Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Ala Pro

115 120 12 5

Pro

Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly Val

130 135 140

Ser

Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val Ala

145

150 155 160

Thr

Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Pro Ala Gly Gly Val Ala Val Ser

165 170 175

Asn

Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu Arg

180 185 190

Pro

Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr S_ > 1-

195 200 205

Gly

Glu Pro Q_ L_ 1- Asn Met Asn

210 215

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 30 <211> 215 <212> PRT

<213> Mycobacteria Smegmatis <220>

<223> Proteina de MspC <400> 30

Met

Lys Ala Ile Ser Arg Val Leu Ile Ala Met Ile Ser Ala Leu Ala

1

5 10 15

Ala

Ala

Val Ala Gly Leu Phe Val Ser Ala Gly Thr Ser His Ala Gly

20 25 30

Leu

Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu Thr

35 40 45

Val

Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp Arg

50 55 60

Asn

Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr Ile

65

70 75 80

Val

Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu Gly

85 90 95

S_ > 1-

Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe Ser

100 105 110

S_ > 1-

Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asp Asp Gly Asp Ile Thr Gly Pro

115 120 12 5

Pro

Phe Gly Leu Glu Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly Val

130 135 140

Ser

Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val Ala

145

150 155 160

Thr

Phe Ser Val Asp Val Ser Gly Pro Ala Gly Gly Val Ala Val Ser

165 170 175

Asn

Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu Arg

180 185 190

Pro

Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr Tyr

195 200 205

Gly

Glu Pro Trp Asn Met Asn

210

215

<210> 31 <211> 207 <212> PRT

<213> Mycobacteria Smegmatis

<220>

<223> Proteina de MspD

<400> 31

Met

Arg Tyr Leu Val Met Met Phe Ala Leu Leu Val Ser Val Thr Leu

1

5 10 15

Val

Ser Pro Arg Pro Ala Asn Ala Val Asp Asn Gln Leu Ser

Val

Val

20 25 30

Asp

Gly Gln Gly Arg Thr Leu Thr Val Gln Gln Ala Glu Thr Phe Leu

35

40 45

Asn

Gly Val Phe Pro Leu Asp Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe

50 55 60

His

Ser Gly Arg Ala Thr Tyr His Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu

65

70 75 80

Phe

Glu Gly Thr Leu Glu Leu Gly Tyr Gln Val Gly Phe Pro Trp Ser

85 90 95

Leu

Gly Val Gly Ile Asn Phe Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile

100 105 110

Asp

Gly Gly Asp Ile Thr Gln Pro Pro Phe Gly Leu Asp Thr Ile Ile

115 120 12 5

Thr

Pro Asn Leu Phe Pro Gly Val Ser Ile Ser Ala Asp Leu Gly Asn

130 135 140

Gly

Pro Gly Ile Gln Glu Val Ala Thr Phe Ser Val Asp Val Lys

Gly

145

150 155 160

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ala

Lys Gly Ala Val Ala Val Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly

165 170 175

Ala

Ala

Gly Gly Val Leu Leu Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser

180 185 190

Thr

Gly Asp Ser Val Thr Thr Tyr Gly Glu Pro Q. L_ Asn Met Asn

195 200 205

<210>

32

<211>

50

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

32

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt

<210>

33

<211>

50

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

33

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaca

<210>

34

<211>

50

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

34

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaat

<210>

35

<211>

50

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

35

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaata

<210>

36

<211>

50

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

36

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaataa

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>

37

<211>

50

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

37

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc ccccccccca

<210>

38

<211>

50

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

38

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc ccccccccac

<210>

39

<211>

50

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

39

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccacc

<210>

40

<211>

58

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

40

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccc

<210> 41

<211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 41

cgaccagcac ggcatacatc

<210>

42

<211>

20

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<223> Oligonucleotidos <400> 42

cgttctcggc tcgatgatcc

<210> 43

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 43

cctgatcaac aacggtaaca tcaccgc

<210> 44

<211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 44

ctgggcacgc ctgggcaacg g

<210> 45

<211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 45

tccggcgccc gcggtggcgt g

<210> 46

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 46

ggcgccaagg gtggcgtgg

<210> 47

<211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Oligonucleotidos <400> 47

cgttctcggt ccgcgtctcc

<210> 48

<211> 50

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

48

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc

<210>

49

<211>

50

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

49

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

<210>

50

<211>

52

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

50

aacccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa

<210>

51

<211>

47

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

51

tacgcataca tcctaagaac tcagactacc tcccaataaa tccacac

<210>

52

<211>

47

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Oligonucleotidos

<400>

52

tcagactacc tcccaataaa tccgcagcaa tcctcacacc taataat

Claims (20)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Porina de Mycobacterium Smegmatis (Msp) que tiene un vestfoulo y una zona de constriccion que definen un tunel, en la que la Msp comprende una MspA mutante que comprende una mutacion en las posiciones 90, 91 y 93, en la que la mutacion en la posicion 90 es D90N, la mutacion en la posicion 91 es D91N, y la mutacion en la posicion 93 es D93N.
2. 2. Msp, segun la reivindicacion 1, que comprende al menos un aminoacido con carga positiva adicional en comparacion con el vestibulo de una Msp de tipo salvaje.
3. 3. Msp, segun la reivindicacion 2, que comprende la mutacion en la posicion 118, en la que la mutacion en la posicion 118 es D118R.
4. 4. Msp, segun la reivindicacion 3, que comprende la mutacion en la posicion 139, en la que la mutacion en la posicion 139 es E139K o E139R.
5. 5. Msp, segun la reivindicacion 4, que comprende las mutaciones en las posiciones 118, 139 y 134, en la que la mutacion en la posicion 118 es D118R, la mutacion en la posicion 134 es D134R, y la mutacion en la posicion 139 es E139K.
6. 6. Utilizacion de una Msp, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la deteccion de la presencia de un analito.
7. 7. Procedimiento para detectar la presencia de un analito, que comprende:

   aplicar un campo electrico suficiente para trasladar un analito de un primer medio lfquido conductor a un segundo medio lfquido conductor en comunicacion de lfquidos a traves de una Msp, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5 ; y

   medir una corriente de iones, en el que la aparicion de un bloqueo en el patron de corriente de iones indica la presencia del analito en el primer medio lfquido conductor.
8. 8. Procedimiento, segun la reivindicacion 7, en el que dicho primer medio lfquido conductor se mantiene en tierra, y se aplica una tension positiva al segundo medio lfquido conductor.
9. 9. Procedimiento, segun la reivindicacion 7 o la reivindicacion 8, en el que el bloqueo o bloqueos en el patron de corriente de iones se caracterizan por:

   (a) reduccion de la corriente de iones a entre 80% y 50% del nivel no bloqueado; o

   (b) reduccion de la corriente de iones a menos del 50% del nivel no bloqueado.
10. 10. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que el procedimiento se lleva a cabo a 180 mV o mas.
11. 11. Aparato para utilizar en el procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 7-10, que comprende una Msp, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el tunel de la Msp se encuentra entre un primer medio lfquido conductor y un segundo medio lfquido conductor; en el que al menos un medio lfquido conductor comprende un analito, y en el que el sistema es operativo para detectar el analito.
12. 12. Utilizacion, segun la reivindicacion 6, procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 7-10, o aparato, segun la reivindicacion 11, en los que el analito es un polfmero, por ejemplo acido nucleico.
13. 13. Procedimiento, segun la reivindicacion 12, en el que el analito es un polfmero que comprende mas de una unidad, que comprende ademas:

    identificar una o mas unidades de polfmero en un procedimiento que comprende medir la corriente de iones o proporcionar un patron de corriente que comprende un bloqueo para cada unidad de polfmero; y comparar uno o mas bloqueos en cada patron de corriente con (i) uno o mas bloqueos en el patron de corriente o (ii) uno o mas bloqueos en un patron de corriente obtenido usando un polfmero que tiene unidades conocidas.
14. 14. Utilizacion, procedimiento o aparato, segun la reivindicacion 12 o la reivindicacion 13, en el que el acido nucleico es ADN, por ejemplo ADN monocatenario, o ARN.
15. 15. Utilizacion, procedimiento o aparato, segun cualquiera de las reivindicaciones 12-14, para la secuenciacion de acidos nucleicos.
16. 16. Acido nucleico que codifica una Msp, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
17. 17. Vector que comprende un promotor unido operativamente a la secuencia de acidos nucleicos, segun la reivindicacion 16.
18. 18. Bacteria Mycobacterium Smegmatis mutante capaz de la expresion de Msp, comprendiendo la bacteria:

    (a) una delecion de una MspA de tipo salvaje;

    (b) una delecion de una MspC de tipo salvaje;

    5 (c) una delecion de una MspD de tipo salvaje;

    (d) un vector segun la reivindicacion 17.
19. 19. Bacteria Mycobacterium Smegmatis mutante, segun la reivindicacion 18, en la que la bacteria es la cepa M16 de Mycobacterium Smegmatis.

    10
20. 20. Porina de Mycobacterium Smegmatis obtenible de las bacterias Mycobacterium smegmatis mutantes de la reivindicacion 18 o la reivindicacion 19.