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CN105801676B - 一种突变MspA蛋白单体及其表达基因和应用 - Google Patents

一种突变MspA蛋白单体及其表达基因和应用 Download PDF

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CN105801676B CN201610228541.9A CN201610228541A CN105801676B CN 105801676 B CN105801676 B CN 105801676B CN 201610228541 A CN201610228541 A CN 201610228541A CN 105801676 B CN105801676 B CN 105801676B
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Abstract

本发明公开了一种突变MspA蛋白单体及其表达基因和应用，所述蛋白单体是由野生型MspA蛋白突变所得，所述野生型MspA蛋白包含序列表SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列，所述突变发生在所述序列表SEQ ID NO:1中的88位到116位的区域内的一个或多个氨基酸；所述蛋白单体能够形成八聚体的纳米孔。相对于现有技术，本发明所提供的突变MspA蛋白单体，能够形成八聚体纳米通道，可明显地改善野生型MspA蛋白纳米孔在外加高偏置电压下产生的自发阻塞效应，且增大对分析物的捕获率，并且一定程度阻滞分析物通过其孔道，降低过孔速率，增加检测精度。

Description

一种突变MspA蛋白单体及其表达基因和应用
技术领域
本发明涉及一种突变MspA蛋白单体及其表达基因和应用，属于纳米传感技术领域。
背景技术
传统的测序技术主要是依赖于扩增技术来产生大量的核酸，并且需要对标记的化学物质的荧光信号进行检测，因此不仅速度缓慢，而且价格昂贵。而纳米孔测序是通过将DNA分子电泳通过一个薄而小的纳米孔内，由于不同碱基理化性质的差异，其对孔的电流阻塞效应不同，通过对阻塞电流的分辨而得知DNA分子内碱基的序列信息。因此，基于纳米孔的测序方法具有相当大的优势，包括(1)非标记，(2)不需要扩增，(3)高通量，(4)成本低廉，(5)样本需求量小，(6)读长长。
根据材料的性质，纳米孔分为生物纳米孔和固态纳米孔，两者各有优劣。固态纳米孔具有更易保存、化学稳定性好、尺寸大小可控等方面的优势。除此之外，在不同溶液的不同浓度下固态纳米孔可以使用更长的时间，而生物纳米孔能够提供原子精度的结构和遗传信息的潜力。
常用做生物纳米孔的蛋白质除了金黄色葡萄球菌的α-溶血素之外，耻垢分支杆菌中的孔蛋白(MspA)显示出了更好的应用前景。MspA孔蛋白是由八个MspA单体互相紧密连接形成的旋转对称的酒杯状八聚体，每个单体由184个氨基酸组成，其中134个氨基酸残基球状结构域装配成杯身,而另外50个氨基酸残基环形成杯柄和底座[Faller M.,et al.Thestructure of a mycobacterial outer-membrane channel.Science,2004,303(5661):1189-1192.]。
MspA孔蛋白有一个大约宽1.2nm，长0.6nm的短窄的颈缩区，使得不同核苷酸通过该通道能产生更易分辨的特征阻塞电流[Derrington I.M.,et al.Nanopore DNAsequencing with MspA.Proceedings of the National Academy of Sciences,2010,107(37):16060-16065.]。在外加电场的驱动下DNA分子从纳米孔中易位，于是就形成了电流阻塞信号。由于野生型MspA的颈缩区富集了带负电荷的氨基酸，通常情况下带负电的DNA分子难以通过，且会在高外加电压下出现自发阻塞堵孔效应。
2008年Butler等[Butler,T.Z.,et al.Proceedings of the National Academyof Sciences,2008,105(52):20647-20652.]通过将处于MspA纳米孔通道收缩区的90、91、93号带负电荷氨基酸突变为中性氨基酸，得到了MspA突变体M1MspA(D90N/D91N/D93N/)。其表达水平及通道形成活性与野生型MspA蛋白没有差异，且消除了收缩区的负电荷，很好地改善了野生型MspA在高于180mV偏置电压下会产生自发阻塞效应的现象，从而使得带负电的ssDNA可在外加偏置电压驱动下通过该通道实现单分子检测。另外，他们将处于通道前庭区的118、134、139号带负电荷的氨基酸突变为带正电荷的氨基酸，得到MspA的突变体M2MspA(D90N/D91N/D93N/D118R/E139K/D134R)，由于减小了前庭区对ssDNA的静电斥力，并有效地阻止了ssDNA从前庭区逸出，其对ssDNA的捕获率提高了近20倍，ssDNA易位产生的电流阻塞事件的持续时间比在M1MspA中增长了近百倍，且驱动ssDNA分子过孔所需施加的偏置电压只为之前的一半。
2012年Bhattacharya等[Bhattacharya S.,et al.Molecular Dynamics Studyof MspA Arginine-Mutants Predicts Slow DNA Translocations and Ion CurrentBlockades Indicative of DNA Sequence.ACS nano,2012,6(8):6960-6968.]则通过全原子分子动力学(MD)模拟了在M1MspA蛋白基础上进一步在通道颈缩区进行精氨酸突变的三种MspA突变体：L88R-NNN、L88R/T83R/S116R-NNN和L88R/A96R/S116R-NNN。由于突变后替换的精氨酸上的胺基可以和DNA骨架上的磷酸基形成盐桥，且精氨酸的侧链会和胞嘧啶碱基叠加到一起，从而短暂地阻滞了DNA通过通道，增大了DNA的捕获率，并大大降低了DNA的过孔速度。然而这项研究仅仅停留在模拟阶段，未通过真正的蛋白质工程实验进行验证。
综上所述，野生型MspA不适宜直接用于分析物检测，需要预先对其颈缩区及附加的氨基酸进行相应结构和功能性突变才可真正应用表征。而现有MspA蛋白突变技术中，只是分别对前庭区和颈缩区的特定氨基酸进行相应替换，虽然一定程度上增加了对分析物的捕获率，但是，实际表征过程中对分析物过孔速度控制，主要还是通过使用phi29 DNA聚合酶等马达分子来实现[Derrington,I.M.,et al.,Subangstrom single-moleculemeasurements of motor proteins using a nanopore.Nature biotechnology,2015.33(10):p.1073-1076.]，不仅步骤繁琐，而且成本较高。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明通过设计和构建所述的突变MspA蛋白单体来改变其聚合体的空间结构、净电荷、与分析物成键或基团反应能力，从而改善野生型MspA蛋白纳米孔在外加高偏置电压下产生的自发阻塞效应，且增大对分析物的捕获率，并且一定程度阻滞分析物通过其孔道，降低过孔速率，增加检测精度。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供了一种突变MspA蛋白单体，所述蛋白单体是由野生型MspA蛋白突变所得，所述野生型MspA蛋白包含序列表SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列，所述突变发生在所述序列表SEQ ID NO:1中的88位到116位的区域内的一个或多个氨基酸；所述蛋白单体能够形成八聚体的纳米孔。
所述一个或多个氨基酸突变改变蛋白单体的(1)空间结构；(2)净电荷；(3)与分析物成键或基团反应能力。
所述蛋白单体在两亲性分子形成的双层结构上可自组装形成八聚体纳米孔通道；
所述的两亲性分子，可以是磷脂或其他聚合物。
作为优选，所述蛋白单体包含序列表SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列。
作为另一种优选，所述突变为：所述一个或多个氨基酸突变增加或降低净正电荷。
作为进一步优选，所述增加净正电荷为：通过引入一个或多个带正电的氨基酸和/或中和一个或多个负电荷而增加；或者通过用一个或多个不带电的氨基酸取代一个或多个带负电的氨基酸；或者通过在一个或多个带负电的氨基酸附近引入一个或多个带正电的氨基酸进行中和。
本发明还提供了编码上述突变MspA蛋白单体的基因。
作为优选，所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:9所示。
本发明还提供了所述基因的重组载体、表达盒或重组菌。
所述重组载体也可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
在本发明中，所述重组表达载体具体为在表达质粒的双酶切位点间正向插入序列表SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示DNA片段后得到的重组质粒。
最后，发明提供了所述突变MspA蛋白单体用于表征目标分析物的应用。
作为优选，所述表征过程如下：
(1)一个或者多个所述蛋白单体形成同聚或异聚的八聚体纳米孔；
(2)使所述目标分析物与上述纳米孔接触，使得目标分析物移动穿过所述纳米孔；
(3)在分析物相对于所述纳米孔孔移动时获取一个或多个测量值，其中所述测量值表示所述目标分析物一个或多个特征并由此表征所述目标分析物。
作为另一种优选，所述目标分析物为以下一种物质或多种物质所形成的复合物：(1)金属离子；(2)无机盐；(3)聚合物；(4)氨基酸；(5)肽；(6)多肽；(7)蛋白质；(8)核苷酸；(9)寡核苷酸；(10)多核苷酸；(11)染料；(12)漂白剂；(13)药物；(14)诊断剂；(15)毒品；(16)爆炸性污染物；(17)环境污染物。
本发明所得突变MspA蛋白单体，通过同时改造对目标分析物识别起关键作用的颈缩区及其附近区域的特定氨基酸，不仅考虑了电荷相互作用的影响，同时利用功能基团相互作用，更大程度地阻滞了分析物过孔速度，摆脱了对额外试剂的依赖。
技术效果：相对于现有技术，本发明所提供的突变MspA蛋白单体，能够形成八聚体纳米通道，可明显地改善野生型MspA蛋白纳米孔在外加高偏置电压下产生的自发阻塞效应，且增大对分析物的捕获率，并且一定程度阻滞分析物通过其孔道，降低过孔速率，增加检测精度。
附图说明
图1是重组克隆子菌落PCR结果。M：DL2000 marker；1-6：pET32a-Mutant mspa质粒；其中3、5菌落有明显的条带；
图2是阳性克隆双酶切验证结果。M：λHind III marker；1:pBX2-mspa/BamH I+Hind III；2：pBX2-Mutant mspa/BamH I+Hind III；3：pET32a-tev-mspa/BamH I+HindIII；4：pET32a-tev-Mutant mspa/BamH I+Hind III；
图3是融合蛋白小试SDS-PAGE分析图：M：Protein Marker；1：诱导前总蛋白；2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀；
图4是镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图：M：Protein marker；1：上样；2：流出；3：20mM Imidazole洗脱组分；4-6：50mM Imidazole洗脱组分；7-9：500mM Imidazole洗脱组分；
图5是第二次镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图：M：Protein marker；1：500mM Imidazole洗脱组分；2：20mM Imidazole洗脱组分；3-5：流出；6切后；7切前。
图6是凝胶过滤层析纯化SDS-PAGE分析图：M：Protein marker；1-10：收集组分(2ml/tube)；
图7是蛋白最终纯化SDS-PAGE分析图：M：Prestained Marker；1：目的蛋白；
图8是融合蛋白Western Blot分析图：M：Prestained Marker；1：TEV酶切前；2：TEV酶切后；
图9是BSA蛋白标准曲线图。
图10是膜片钳检测系统示意图；
图11是Poly(dT)100过突变体MspA纳米孔示意图，其中：Cis为正面(即突变MspA蛋白纳米孔冠部入口朝向的方向)，Trans为反面(即突变MspA蛋白纳米孔根部出口朝向的方向)；
图12是Poly(dT)100过突变体MspA纳米孔电流轨迹和典型事件图；
图13是Poly(dT)100过孔事件的散点图及过孔持续时间柱状图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求范围。
实施例1
(1)突变体基因片段的构建
在突变体MspA基因片段上游顺序加上BamH I酶切位点(G/GATCC)和TEV蛋白酶识别位点(GAAAATCTGTACTTCCAAGGC)，下游加上终止密码子(TAA)和Hind III酶切位点(A/AGCTT)，构建的DNA序列如序列表SEQ ID NO:10所示，合成此序列。
(2)突变重组载体的构建及鉴定：
将含有BamH I、Hind III酶切位点和TEV蛋白酶识别位点的突变体基因以及载体pET32a质粒用BamH I和Hind III酶进行双酶切处理，之后利用T4DNA连接酶将回收的突变体基因与含有对应粘性末端的pET32a进行连接反应，16℃12h。将构建好的载体Ca2+转入E.coli DH5a中，并对克隆子进行菌落PCR验证(参见图1，泳道M：DL2000 marker；1-6：pET32a-Mutant mspa质粒。其中3、5菌落有明显的条带)。验证阳性结果提取质粒，双酶切验证(参见图2,泳道M：λHind III marker；1:pBX2-mspa/BamH I+Hind III；2：pBX2-Mutantmspa/BamH I+Hind III；3：pET32a-tev-mspa/BamH I+Hind III；4：pET32a-tev-Mutantmspa/BamH I+Hind III)。将验证菌株Ca2+转入E.coli BL21(DE3)中进行表达。
(3)突变体蛋白的表达与纯化
1.转化
取1μl重组的pET32a质粒转化BL21(DE3)菌株(所述质粒包含SEQ ID NO:6所述核苷酸序列)，42℃热击90s，冰上静置2min后涂平板(100μg/mL氨苄青霉素)，37℃恒温箱培养过夜。4g LB Borth Agar(上海生工)用100mL dd H2O溶解，高温高压蒸汽灭菌。
2.小试培养选择最佳的诱导条件
挑取表达菌株BL21(DE3)的单菌落于含2.5mL LB培养基(100μg/mL氨苄青霉素)试管中，37℃，220rpm摇床培养过夜。25g LB Borth粉末用1L dd H2O溶解，高温高压蒸汽灭菌。
将培养的菌液按1:100比例分别接种于2.5mL LB培养基中，添加100μg/mL氨苄青霉素，37℃，220rpm培养约3h。
当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，220rpm，分别20℃诱导过夜；37℃诱导4h，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。
4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，菌体用500μL PBS(PH7.4)缓冲液悬浮，超声破碎6min，超0.5s停1.5s，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μL包涵体溶解液(8M Urea，50mM Tris-HCl，150mM NaCl，PH8.0)溶解，分别取40μL样品和10μL5×protein loadingbuffer混匀，沸水浴10min。
SDS-PAGE检测，准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液(Tris 30g，甘氨酸144.0g，SDS 10g，定容至1L)，上样量10μL，浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min，凝胶电泳结束考染20min，脱色。结果显示，目的蛋白表达成功(参见图3，泳道M：Protein Marker；1：诱导前总蛋白；2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀)。
3.大量诱导
将活化过夜的菌液按1:100比例接种于4L的LB液体培养基中，100μg/mL氨苄青霉素，37℃，220rpm培养约3h，当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mM IPTG，20℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体。
4.融合蛋白纯化
4.1超声破碎菌体
将收集的细菌菌体用破碎Buffer(4M Urea，50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率400W，15min(超声2S，暂停6S为一个循环)。
超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，上清做下一步纯化。
4.2镍琼脂糖亲和层析
(1)取5mL Ni-IDA，用10倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。
(2)上柱，流速为2mL/min，收集穿透液。
(3)10倍柱床体积的Binding buffer清洗柱子，流速10mL/min。
(4)Wash Buffer洗杂，流速5mL/min，收集洗脱液。
(5)Elution Buffer洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液。
注：Binding Buffer(4M Urea，50mM Tris，300mM NaCl，pH＝8.0)
Wash buffer(4M Urea，50mM Tris，300mM NaCl，20/50Imidazole，pH＝8.0)
Elution Buffer(4M Urea，50mM Tris，300mM NaCl，500mM Imidazole，pH＝8.0)
(6)将收集到的组分进行SDS-PAGE检测，将纯度最好的组分透析到2M Urea，50mMTris，300mM NaCl，pH8.0中，加入TEV蛋白酶酶切，4℃过夜。
结果显示，经不同浓度咪唑洗脱后，洗脱液中含有目的蛋白(参见图4，泳道M：Protein marker；1：上样；2：流出；3：20mM Imidazole洗脱组分；4-6：50mM Imidazole洗脱组分；7-9：500mM Imidazole洗脱组分)。
4.3第二次镍琼脂糖亲和层析
将4.2中酶切过后样品过第二次镍柱，收集流出液，将收集到的组分进行SDS-PAGE检测。
结果显示，经不同浓度咪唑洗脱后，洗脱液中含有目的蛋白。(参见图5，泳道M：Protein marker；1：500mM Imidazole洗脱组分；2：20mM Imidazole洗脱组分；3-5：流出；6切后；7切前)。
4.4凝胶过滤层析
将4.3所得纯度较好的流出组分用10KDa超滤管超滤浓缩，用凝胶过滤层析进行精纯。填料：Sephacryl s-200；上样量：3mL；流速：1mL/min；每管收集体积：2mL；CV：150mL(16/75)；流动相:4M Urea，50mM Tris，300mM Nacl，pH8.0。将收集到的组分进行SDS-PAGE检测后，将聚体与单体组分分别透析到50mMTris，300mM Nacl，PH＝8.0中，过夜，0.45μm滤膜过滤浓缩分装，冻干，-80℃保存。
结果显示，流出组分里聚体与单体得到了较好的分离(参见图6，泳道M：Proteinmarker；1-9：收集组分(2ml/tube))。
(4)纯化蛋白的检测
1.SDS-PAGE检测
准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液，上样量10μL，浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min，凝胶电泳结束后进行考马斯亮蓝染色20min，脱色。
结果显示，目的融合蛋白成功得到了纯化。(参见图7，泳道M：Prestained Marker；1：目的蛋白)。
2.Western blot检测
(1)制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶：浓缩胶5％，分离胶8％。
(2)制样：上样量：1μg。
(3)电泳：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60min。
(4)转膜：湿转，250mA 90min。
(5)封闭：5％的脱脂奶粉，37℃缓慢振荡2h。
(6)孵育一抗：一抗为兔抗his标签，抗体(上海生工，编号：D110002)1:500稀释，37℃缓慢振荡60min。
(7)孵育二抗：二抗为羊抗兔，抗体(上海生工，编号：D110002)1:8000稀释，37℃缓慢振荡60min。
(8)显色：TMB显色。
结果显示，获得的蛋白确为目标MspA突变体蛋白(参见图8，泳道M：PrestainedMarker；1：TEV酶切前；2：TEV酶切后)。所得蛋白单体包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
3.蛋白浓度测定
用SK3071非干扰型蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，测定蛋白体积为20μl。以BSA为标准品测定标准曲线(参见图9)。
根据实际测量结果(表1)，带入标准曲线计算的融合蛋白浓度为0.54mg/ml。
表1：测得BSA蛋白和MspA突变体蛋白的质量
Figure BDA0000963983630000091
(5)表征DNA样品
将本发明提供的MspA蛋白突变体应用于DNA单分子检测，具体实施步骤如下：
1、试剂准备
(1)50mM Na3PO4缓冲液(500ml)：
称取9.503g Na3PO4·12H2O，超纯水定容至500ml。
(2)体积分数为0.1％的HCl溶液(500ml)
取0.5ml 36-38％盐酸溶液，用dd H20稀释定容至500ml。
(3)1M KCl，25mM Tris-HCl，PH 8.0(100ml)
分别称取KCl 7.45g，Tris 0.30285g，60ml超纯水溶解，PH计测PH值。10％HCl调PH至8.0。
(4)10mM Tris-HCl，100μM EDTA，PH 8.0(100ml)
分别称取Tris 0.12114g，EDTA 0.0037223g，60ml超纯水溶解，PH计测PH值。10％HCl调PH至8.0。
2、流体及磷脂刷清洗
(1)将流体池(美国Warner Instruments)拆开放入专用烧杯，加入Na3PO4洗液浸泡超声10min，用脱脂棉签擦拭清洗流体池内外部，此步骤重复3次。
(2)用体积分数为0.1％的HCl溶液依上述方法继续清洗，中和碱性物质。重复3次。
(3)用超纯水冲洗三遍。N2吹干，密封保存。
(4)同样方法清洗磷脂刷。
3、DPhPC癸烷溶液配制
取储存于1.5ml安剖瓶中的DPhPC氯仿溶液(25mg/ml)50μl，用N2吹干氯仿。加入50μl癸烷溶解DPhPC，最终溶液浓度为25mg/ml。
4、lipid bilayer制备
(1)组装好流体后，在流体池两侧各加入1ml KCl(1M，25mM Tris-HCl,pH 8.0)，连接好膜片钳200B(美国Molecular Devices)电极(检测系统示意图参见图10)。
(2)用000号的貂毛毛笔在流体池在流体池孔口位置刷涂适量DPhPC癸烷溶液，用自制带软管吸头的1ml注射器从流体的灌流孔中抽吸液体，使液面下降至孔口以下，然后缓慢注回液体没过孔口。在流体池两侧依此法反复升降液面几次，直至膜片钳电流示数为0pA。
(3)用膜片钳的Membrane Test功能检测膜电容Cm和膜电阻Rm以判定形成磷脂双层膜的大小和质量。
(5)加100mV电压，观察电流示数有无变化。加200、300mV电压，观察电流是否过载。
5、突变MspA纳米孔单通道组装
(1)若Rm持续大于1GΩ，且Cm约为50-120pF，加300mV可将膜击破，lipid bilayer即形成。此时加入1μl预先稀释好的MspA蛋白突变体溶液(1.08μg/ml),用200μl移液枪轻柔吹打，等待单通道形成。
(2)单通道形成后，可加入适量如序列列表中SEQ ID NO:11所示poly(dT)100，加60mV电压，观察并记录信号。
6.数据分析
用膜片钳自带的clamfit10.3软件查看原始数据后，用Event Detection里的Threshold Search功能自动化检索目标事件,具体过程为：将开孔电流设置为基线，70％的开孔电流设置为阈值，到0pA为最大振幅，连续监测直至电流下降到阈值和最大振幅之间即记录为一个目标事件，并同时记录此事件的电流振幅值△I和持续时间值△t。
7.结果与讨论
可以观察到突变体MspA纳米孔插入到DPhPC双分子层中，在+60mV电压下观察到约165pA的稳定开孔电流。在Tri端添加poly(dT)100分子后，观察到的相应的易位事件信号，且单个事件的持续时间在ms量级(如图12所示，其中A为Poly(dT)100过突变体MspA纳米孔的电流轨迹图；B为典型目标事件放大图)。提取目标事件的阻塞电流幅度I/Io和过孔持续时间Duration time后，统计分析并绘制散点图及柱状图，见图13，可得Poly(dT)100的平均过孔时间为1212±1μs,比在目前已有研究的突变MspA蛋白中的过孔时间(＜50μs)延长了至少20倍。
实施例2
所有方法与实施例1均相同，不同之处在于：采用包含SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的基因，最后制得包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白单体。利用所得蛋白单体进行目标分析物(蛋白质)检测，其能够形成八聚体纳米通道，可显著增大对蛋白质的捕获率，并且一定程度阻滞蛋白质通过其孔道，降低过孔速率，增加检测精度。
实施例3
所有方法与实施例1均相同，不同之处在于：采用包含SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的基因，最后制得包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的蛋白单体。利用所得蛋白单体进行目标分析物(氨基酸)检测，其能够形成八聚体纳米通道，可显著增大对氨基酸的捕获率，并且一定程度阻滞氨基酸通过其孔道，降低过孔速率，增加检测精度。
实施例4
所有方法与实施例1均相同，不同之处在于：采用包含SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的基因，最后制得包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的蛋白单体。利用所得蛋白单体进行目标分析物(多肽)检测，其能够形成八聚体纳米通道，可显著增大对多肽的捕获率，并且一定程度阻滞多肽通过其孔道，降低过孔速率，增加检测精度。
Figure IDA0000963983720000011
Figure IDA0000963983720000031
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Claims (6)

1.一种突变MspA蛋白单体，其特征在于，所述蛋白单体是由野生型MspA蛋白突变所得，所述野生型MspA蛋白由序列表SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列组成，所述突变发生在所述序列表SEQ ID NO:1中的88位到116位的区域内的一个或多个氨基酸；所述蛋白单体能够形成八聚体的纳米孔；所述突变为：所述一个或多个氨基酸突变增加或减少净正电荷；
所述蛋白单体由序列表SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列组成。
2.编码权利要求1所述突变MspA蛋白单体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示。
3.含有权利要求2所述基因的重组载体、表达盒或重组菌。
4.权利要求1所述突变MspA蛋白单体用于表征目标分析物的应用。
5.根据权利要求4所述突变MspA蛋白单体用于表征目标分析物的应用，其特征在于，所述表征过程如下：
(1)一个或者多个所述蛋白单体形成同聚或异聚的八聚体纳米孔；
(2)使所述目标分析物与上述纳米孔接触，使得目标分析物移动穿过所述纳米孔；
(3)在分析物相对于所述纳米孔孔移动时获取一个或多个测量值，其中所述测量值表示所述目标分析物一个或多个特征并由此表征所述目标分析物。
6.根据权利要求4所述突变MspA蛋白单体用于表征目标分析物的应用，其特征在于，所述目标分析物为以下一种物质或多种物质所形成的复合物：(1)金属离子；(2)无机盐；(3)聚合物；(4)氨基酸；(5)肽；(6)核苷酸；(7)染料；(8)漂白剂；(9)药物；(10)诊断剂；(11)毒品；(12)爆炸性污染物；(13)环境污染物。
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