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ES2971969T3 - Inhibidores de PDE9 con cadena principal de imidazopirazinona para el tratamiento de enfermedades periféricas - Google Patents

Inhibidores de PDE9 con cadena principal de imidazopirazinona para el tratamiento de enfermedades periféricas Download PDF

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ES2971969T3
ES2971969T3 ES20217833T ES20217833T ES2971969T3 ES 2971969 T3 ES2971969 T3 ES 2971969T3 ES 20217833 T ES20217833 T ES 20217833T ES 20217833 T ES20217833 T ES 20217833T ES 2971969 T3 ES2971969 T3 ES 2971969T3
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Niels Svenstrup
Kate Wen
Yazhou Wang
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H Lundbeck AS
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H Lundbeck AS
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Abstract

La presente invención se refiere a inhibidores de PDE9 y su uso para el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata y la anemia de células falciformes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores de PDE9 con cadena principal de imidazopirazinona para el tratamiento de enfermedades periféricas
La presente solicitud reivindica la prioridad para la Solicitud de Patente Provisional danesa n.° PA201500393, presentada el 7 de julio de 2015, titulada Inhibidores de PDE9 con cadena principal de imidazo triazinona y cadena principal de imidazo pirazinona para el tratamiento de enfermedades periféricas, la Solicitud de Patente Provisional danesa n.° PA201500407, presentada el 10 de julio de 2015, titulada Inhibidores de PDE9 con cadena principal de imidazo triazinona y cadena principal de imidazo pirazinona para el tratamiento de enfermedades periféricas, y la Solicitud de Patente Provisional danesa n.° PA201600209, presentada el 7 de abril de 2016, titulada Inhibidores de PDE9 con cadena principal de imidazo triazinona y cadena principal de imidazo pirazinona para el tratamiento de enfermedades periféricas.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a inhibidores de fosfodiesterasa tipo 9 específicos de guanilato monofosfato cíclico (GMPc) (en lo sucesivo denominado inhibidor de PDE9) de la forma (3S,4S)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-il-metilpirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona, y a su uso como medicamento para el tratamiento de enfermedades periféricas como se define en las reivindicaciones. Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende (3S,4S)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las fosfodiesterasas (PDE) son una familia de enzimas que degradan nucleótidos cíclicos y que regulan así los niveles celulares de segundos mensajeros en todo el cuerpo. Las PDE representan dianas farmacológicas atractivas, como los demuestran varios compuestos que se han introducido en pruebas clínicas y en el mercado, respectivamente. Las PDE están codificadas por 21 genes que se separan funcionalmente en 11 familias que difieren con respecto a las propiedades cinéticas, selectividad del sustrato, expresión, patrón de ubicación, activación, factores de regulación, y sensibilidad a los inhibidores. La función de las PDE es la degradación de los nucleótidos monofosfatos cíclicos adenosín monofosfato (AMPc) y/o guanosín monofosfato (GMPc) cíclicos, que son mediadores intracelulares importantes implicados en numerosos procesos vitales que incluyen el control de la neurotransmisión, y la contracción y relajación del músculo liso.
PDE9 es específica de GMPc (Km de AMPc es >1000x para GMPc), y se plantea la hipótesis de que es un actor clave en la regulación de los niveles de GMPc, ya que tiene la Km más baja entre las PDE para este nucleótido. PDE9 se expresa en todo el cerebro a niveles bajos, con el potencial para regular GMPc basal.
En la periferia, los máximos de expresión de PDE9 en próstata, intestino, riñón y células hematopoyéticas se abren al potencial terapéutico en diversas indicaciones periféricas.
La hiperplasia benigna de próstata (HBP) es uno de las afecciones más prevalentes en la población masculina que envejece, y representa un problema de salud importante (Ueckert S et al., Expert Rev Clin Pharmacol. mayo 2013;6(3):323-32). La HBP da como resultado la formación de grandes nódulos en la región periuretral de la próstata, lo que podría provocar la obstrucción de las vías urinarias. La HBP es predominantemente el resultado de un proceso proliferativo estromal, y un componente significativo del agrandamiento prostático resulta de la proliferación del músculo liso. El tratamiento farmacológico actual de la HBP incluye bloqueadores adrenérgicos a1, inhibidores de la 5-a-reductasa, y más recientemente, el inhibidor de PDE5 tadalafilo. Se sabe que los inhibidores de PDE5 median la relajación del músculo liso a través de niveles aumentados de GMPc. La PDE9 específica de GMPc se expresa a niveles elevados en la próstata, y por tanto, la inhibición de PDE9 puede ofrecer posibles beneficios antiproliferativos para la HBP.
La PDE9 se distribuye ampliamente en el epitelio urotelial de las vías urinarias inferiores humanas, y la inhibición de PDE9 puede ser beneficiosa en la enfermedad del epitelio disfuncional de las vías urinarias inferiores (LUDE) (Nagasaki et al., BJU Int.2012 Mar;109(6):934-40). El epitelio disfuncional de las vías urinarias inferiores puede afectar a la vejiga, la uretra, los labios o el orificio vaginal en las mujeres, y los conductos prostáticos y la uretra en los hombres (Parsons LC et al., 2002).
Se ha demostrado la expresión de PDE9 en el cuerpo cavernoso murino, y se demostró que la inhibición crónica de PDE9 da como resultado respuestas cavernosas mediadas por NO-GMPc amplificadas, y por tanto se abre a un posible beneficio en la disfunción eréctil (DaSilva et al., Int J Impot Res. 2013 Mar-Abr;25(2):69-73). El tratamiento actualmente aprobado para la disfunción eréctil es la clase de inhibidores de PDE5, que aumenta GMPc en las células del músculo liso que recubren los vasos sanguíneos que irrigan el cuerpo cavernoso del pene.
Se ha demostrado que la inhibición de PDE específica de GMPc mejora la circulación sanguínea microvascular muscular y la respuesta de captación de glucosa a la insulina (Genders et al., Am J Physiol Endocrinol Metab. 2011 Ago;301(2):E342-50). El direccionamiento de PDE9 específica de GMPc, que se expresa en músculos y vasos sanguíneos, puede proporcionar una vía prometedora para mejorar la sensibilidad a la insulina muscular, y por tanto ser beneficiosa para el tratamiento de la diabetes tipo 2.
La inhibición de PDE9 puede representar un tratamiento nuevo y de primera línea para la anemia drepanocítica (ADC), un trastorno genético que conduce a procesos vasooclusivos responsables de gran parte de la mortalidad en pacientes con ADC. La enfermedad de ADC es el resultado de una mutación puntual en el gen de la hemoglobina (HBB) que produce hemoglobina falciforme anómala (HbS), que se polimeriza y crea glóbulos rojos falciformes rígidos y pegajosos. Los glóbulos rojos falciformes dan como resultado inflamación crónica, adhesión celular elevada, estrés oxidativo, disfunción endotelial que culmina en procesos vasooclusivos.
Hasta la fecha, no existe cura para la ADC. Las opciones de tratamiento incluyen transfusión de sangre y tratamiento con el agente anticanceroso hidroxiurea. Las transfusiones de sangre corrigen la anemia aumentando el número de glóbulos rojos normales no falciformes en circulación. La terapia de transfusión regular puede ayudar a prevenir accidentes cerebrovasculares recurrentes en niños con alto riesgo. La hidroxiurea se ha aprobado para el tratamiento de la ADC, y se ha demostrado que reduce la frecuencia de las crisis dolorosas y la hospitalización. El mecanismo por el cual se supone que la hidroxiurea mejora los síntomas de la ADC es doble; a) aumento en la producción de hemoglobina fetal no falciforme, y b) disminución de la adhesión celular. Específicamente, la hidroxiurea a) aumenta la producción de hemoglobina fetal no falciforme a través de la señalización de GMPc, que se ha demostrado que da como resultado un aumento de la supervivencia de los glóbulos rojos y b) aumenta los niveles de óxido nítrico y GMPc, disminuyendo así la adhesión y aumentando la supervivencia. En resumen, las pruebas hasta la fecha apoyan la noción de que ambos mecanismos por los cuales la hidroxiurea promueve los beneficios en la ADC están mediados por un aumento de GMPc.
La PDE9 se expresa específicamente en el sistema hematopoyético humano, que incluye neutrófilos, reticulocitos, células eritroides y eritroleucémicas. Además, los pacientes con ADC presentan un aumento marcado y significativo en la expresión de PDE9 en reticulocitos y neutrófilos (Almeida et al., Br J Haematol. 2008 Sep; 142(5):836-44). Además, la evidencia demuestra un vínculo entre la PDE9 y la adhesión celular, puesto que la inhibición de PDE9 da como resultado la reversión del aumento de las propiedades adhesivas de los neutrófilos de la ADC (Miguel et al., Inflamm Res. 2011 Jul;60(7):633-42). Se ha demostrado que el mecanismo por el cual la inhibición de PDE9 disminuye la adhesión celular está mediado por el aumento de GMPc y la disminución de la expresión de moléculas de adhesión endotelial. Es importante destacar que, en un modelo animal de ADC, la disminución de la adhesión celular mediada por el inhibidor de PDE9 tuvo el efecto funcional de una supervivencia celular aumentada. Además de demostrar efectos sobre la disminución de la adhesión celular comparables a los de la hidroxiurea, la inhibición de la PDE9 da como resultado un aumento de la producción de hemoglobina fetal no falciforme. Finalmente, Almeida y colegas demostraron que el tratamiento con hidroxiurea, combinado con la inhibición de PDE9, en un modelo de ratón de ADC, conduce a un beneficio adicional del inhibidor de PDE9 en la amplificación de los efectos de elevación de GMPc de la hidroxiurea (Almeida et al., Blood. 2012 Oct 4;120(14):2879-88). En conclusión, la inhibición de PDE9 puede modular tanto la expresión de la producción de hemoglobina fetal como la disminución de la adhesión celular, siendo ambos mecanismos clave para el tratamiento de la ADC.
El documento WO 2013/053690 describe inhibidores de PDE9 con cadena principal de imidazopirazinona para uso como medicamento, tal como en el tratamiento de pacientes que padecen deterioros cognitivos, en particular deterioros cognitivos que se relacionan con enfermedades neurodegenerativas tales como demencia cortical (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) o demencia subcortical, por ejemplo demencia asociada al SIDA.
El documento WO 2013/110768 describe inhibidores de PDE9 con cadena principal de imidazotriazinona para uso como medicamento, tal como en el tratamiento de pacientes que padecen deterioros cognitivos, en particular deterioros cognitivos que se relacionan con enfermedades neurodegenerativas tales como demencia cortical (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) o demencia subcortical, por ejemplo demencia asociada al SIDA.
El documento WO 2012/040230 describe inhibidores de PDE9 con cadena principal de imidazotriazinona para uso como medicamento en el tratamiento de enfermedades asociadas con PDE9, incluyendo trastornos del SNC y neurodegenerativos.
Los documentos WO 2008/139293 y WO 2010/084438 describen compuestos amino-heterocíclicos que son inhibidores de PDE9 y su uso en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y cognitivos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Existe la necesidad constante de un tratamiento mejorado de las enfermedades periféricas hiperplasia benigna de próstata (HBP), enfermedad del epitelio disfuncional de las vías urinarias, disfunción eréctil, diabetes tipo 2 y anemia drepanocítica (ADC), y para ese fin, el uso de inhibidores de PDE9 puede ser muy útil. Dado que PDE9 se expresa en todo el cerebro, mostrándose que el GMPc basal potencial y de este modo las cascadas de señalización regulan la transmisión sináptica, es evidentemente importante que los inhibidores de PDE9 para el tratamiento de enfermedades periféricas tengan una baja penetración en la barrera hematoencefálica (penetración en la BHE) para evitar los posibles efectos secundarios mediados de manera central.
La presente descripción e invención proporciona nuevos inhibidores de PDE9 que se ha demostrado que tienen baja penetración en la barrera hematoencefálica, y por tanto pueden ser particularmente útiles para el tratamiento de enfermedades periféricas tales como hiperplasia benigna de próstata (HBP), enfermedad del epitelio disfuncional de las vías urinarias, disfunción eréctil, diabetes tipo 2 y anemia drepanocítica (ADC). Además, los inhibidores de PDE9 de la presente descripción e invención son inhibidores de PDE9 significativamente más potentes que los inhibidores de PDE1, lo que es importante ya que PDE1 se expresa en el corazón y los testículos, y se piensa que la inhibición de estas isoformas de PDE1 es una posible causa de efectos secundarios cardiovasculares y reproductivos.
Los siguientes compuestos están abarcados por la presente descripción:
(P1)
to (P2)
Compuesto (P4).
El siguiente compuesto está abarcado por la presente invención:
Compuesto (P3), racemato y variantes enantioméricamente puras del compuesto P3.
Se describe aquí una síntesis de P1, P2, P3 y P4. También se describe aquí la síntesis enantioselectiva del compuesto P3, que comprende la conversión del compuesto intermedio rac-35 en (S,S)-35.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 muestra la estereoquímica absoluta del enantiómero 2 del compuesto P3 monohidratado.
Las Figs. 2A-2B son una micrografía óptica del lote cristalino (Fig. 2A) y el cristal usado para la recogida de datos (Fig. 2B).
La Fig. 3 es un diagrama de barras y esferas del enantiómero 2 del compuesto P3 monohidratado.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Ejemplos de la descripción
Se aplica la siguiente notación: un ejemplo de la descripción se identifica como Ei, en el que i es un número entero que indica el número del ejemplo. Un ejemplo Ei' que especifica un ejemplo específico de un ejemplo Ei enumerado anteriormente se identifica como Ei'(Ei), por ejemplo E2(E1) significa "en un ejemplo E2 del ejemplo E1".
Cuando una realización es una combinación de dos ejemplos, la notación es de manera similar Ei"(Ei y Ei'); por ejemplo, E3(E2 y E1) significa "en un ejemplo E3 de cualquiera de los ejemplos E2 y E1".
Cuando un ejemplo es una combinación de más de dos ejemplos, la notación es similarmente Ei"'(Ei, Ei' y Ei"); por ejemplo, E4(E1, E2 y E3) significa "en un ejemplo E4 de cualquiera de los ejemplos E1, E2 y E3"
En un primer ejemplo E1, la presente descripción se refiere a compuestos que tienen la siguiente estructura
(compuesto P3) en una forma racémica y en una forma enantioméricamente enriquecida o pura.
En un ejemplo E2(E1), la variante enantioméricamente pura del compuesto P3 es el primer compuesto que eluye cuando la mezcla racémica de P3 se separa mediante HPLC quiral (columna: Chiralpak IA, 250 x 4,6 mm x 5 um; fase móvil Hex/EtOH/DEA = 70:30:0,2) con un caudal de 1,0 ml/min (enantiómero 1 de P3).
E3(E1 y E2): Un compuesto de cualquiera de E1 y E2 para uso como medicamento.
E4: Un compuesto de cualquiera de E1 y E2, o el compuesto
(compuesto P4) para uso en el tratamiento de hiperplasia benigna de próstata o anemia drepanocítica.
E5: Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los compuestos de E1 y E2 o el compuesto P4, y uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
E6(E5): La sustancia farmacéutica es para el tratamiento de hiperplasia benigna de próstata o anemia drepanocítica. E7: Uso del compuesto P4 o cualquiera de los compuestos de E1 y E2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hiperplasia benigna de próstata o anemia drepanocítica.
E8: Un método de tratamiento de un sujeto que padece hiperplasia benigna de próstata o anemia drepanocítica, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto P4 o cualquiera de los compuestos de E1 y E2 a un sujeto que lo necesita E9: Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 3-(4-fluorofenil)-6-((3-(piridin-4-iloxi)azetidin-1-il)metil)imidazo[1,5-a]pirazin-8(7H)-ona (P1), 6-[3-(piridin-3-iloxi)-azetidin-1-ilmetil]-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P2), (3S,4S)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P3, enantiómero 1), y (3R,4R)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-ilmetilpirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P3, enantiómero 2).
E10(E9) El compuesto (3S,4S)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P3, enantiómero 1).
E11 (E9) El compuesto (3R,4R)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P3, enantiómero 2).
E12 (E9, E10 y E11) Un compuesto de cualquiera de E9 a E11 para el uso como medicamento.
E13: Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 3-(4-fluorofenil)-6-((3-(piridin-4-iloxi)azetidin-1-il)metil)imidazo[1,5-a]pirazin-8(7H)-ona (P1), 6-[3-(piridin-3-iloxi)-azetidin-1-ilmetil]-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P2), (3S,4S)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P3, enantiómero 1), (3R,4R)-6-(4-metil-1-pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidropiran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P3, enantiómero 2), y 2-[3-(4-fluoro-fenoxi)-azetidin-1-ilmetil]-7-(tetrahidropiran-4-il)-3H-imidazo[5,1-f][1,2,4]triazin-4-ona (P4), para uso en el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata o la anemia drepanocítica.
E14: Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los compuestos 3-(4-fluorofenil)-6-((3-(piridin-4-iloxi)azetidin-1-il)metil)imidazo[1,5-a]pirazin-8(7H)-ona (P1), 6-[3-(piridin-3-iloxi)-azetidin-1 -ilmetil]-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P2), (3S,4S)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P3, enantiómero 1), (3R,4R)-6-(4-metil-1-pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P3, enantiómero 2), y 2-[3-(4-fluoro-fenoxi)-azetidin-1-ilmetil]-7-(tetrahidro-piran-4-il)-3H-imidazo[5,1-f][1,2,4]triazin-4-ona (P4), y uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
E15(E14): La sustancia farmacéutica es para el tratamiento de hiperplasia benigna de próstata o anemia drepanocítica. E16: Uso de cualquiera de los compuestos 3-(4-fluorofenil)-6-((3-(piridin-4-iloxi)azetidin-1-il)metil)imidazo[1,5-a]pirazin-8(7H)-ona (P1), 6-[3-(piridin-3-iloxi)-azetidin-1-ilmetil]-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P2), (3S,4S)-6-(4-metil-1-pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P3, enantiómero 1), (3R,4R)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P3, enantiómero 2), y 2-[3-(4-fluoro-fenoxi)-azetidin-1-ilmetil]-7-(tetrahidro-piran-4-il)-3H-imidazo[5,1-f][1,2,4]triazin-4-ona (P4), para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hiperplasia benigna de próstata o la anemia drepanocítica.
E17: Un método para tratar a un sujeto que padece hiperplasia benigna de próstata o anemia drepanocítica, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los compuestos 3-(4-fluorofenil)-6-((3-(piridin-4-iloxi)azetidin-1-il)metil)imidazo[1,5-a]pirazin-8(7H)-ona (P1), 6-[3-(piridin-3-iloxi)-azetidin-1-ilmetil]-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P2), (3S,4S)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P3, enantiómero 1), (3R,4R)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-ilmetilpirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona (P3, enantiómero 2), y 2-[3-(4-fluoro-fenoxi)-azetidin-1-ilmetil]-7-(tetrahidro-piran-4-il)-3H-imidazo[5,1-f][1,2,4]triazin-4-ona (P4), a un sujeto que lo necesita.
Inhibidores de PDE9
En el contexto de la presente invención, se considera que un compuesto es un inhibidor de PDE9 si la cantidad requerida para alcanzar el nivel de IC<50>de cualquiera de las tres isoformas de PDE9 es 10 micromolar o menos, preferiblemente menos de 9 micromolar, tal como 8 micromolar o menos, tal como 7 micromolar o menos, tal como 6 micromolar o menos, tal como 5 micromolar o menos, tal como 4 micromolar o menos, tal como 3 micromolar o menos, más preferiblemente 2 micromolar o menos, tal como 1 micromolar o menos, en particular 500 nM o menos. En realizaciones preferidas, la cantidad requerida de inhibidor de PDE9 requerida para alcanzar el nivel de IC<50>de PDE9 es 400nM o menos, tal como 300 nM o menos, 200nM o menos, 100 nM o menos, o incluso 80 nM o menos, tal como 50 nM o menos, por ejemplo 25 nM o menos.
En toda esta solicitud, las notaciones IC<50>e IC50 se usan de manera intercambiable.
Formas isoméricas
Cuando los compuestos de la presente descripción e invención contienen uno o más centros quirales, la referencia a cualquiera de los compuestos cubrirá, a menos que se especifique lo contrario, el compuesto enantiomérica o diastereoméricamente puro así como las mezclas de enantiómeros o diastereómeros en cualquier relación.
Sales farmacéuticamente aceptables
La presente invención también comprende sales del compuesto, normalmente, sales farmacéuticamente aceptables. Tales sales incluyen sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables. Las sales de adición de ácidos incluyen sales de ácidos inorgánicos así como ácidos orgánicos.
Los ejemplos representativos de ácidos inorgánicos adecuados incluyen ácidos clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, fosfórico, sulfúrico, sulfámico, nítrico y similares.
Los ejemplos representativos de ácidos orgánicos adecuados incluyen ácidos fórmico, acético, tricloroacético, trifluoroacético, propiónico, benzoico, cinámico, cítrico, fumárico, glicólico, itacónico, láctico, metanosulfónico, maleico, málico, malónico, mandélico, oxálico, pícrico, pirúvico, salicílico, succínico, metanosulfónico, etanosulfónico, tartárico, ascórbico, pamoico, bismetilenosalicílico, etanodisulfónico, glucónico, citracónico, aspártico, estearico, palmítico, EDTA, glicólico, p-aminobenzoico, glutámico, bencenosulfónico, p-toluenosulfónico, ácidos teofilinacéticos, así como las 8-haloteofilinas, por ejemplo 8-bromoteofilina y similares. Ejemplos adicionales de sales de adición de ácidos inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente aceptables incluyen las sales farmacéuticamente aceptable enumeradas en Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci. 1977, 66, 2.
Además, los compuestos de la presente invención pueden existir tanto en forma no solvatada como solvatada con disolventes farmacéuticamente aceptables tales como agua, etanol y similares. En general, las formas solvatadas se consideran equivalentes a las formas no solvatadas para los fines de esta invención.
Composición farmacéutica
La presente descripción e invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los compuestos de la presente descripción e invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La presente descripción e invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los compuestos específicos descritos en la Sección Experimental aquí, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Los compuestos de la descripción e invención pueden administrarse solos o en combinación con vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables, en una dosis únicas o múltiples. Las composiciones farmacéuticas según la descripción e invención pueden formularse con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables así como cualesquiera otros adyuvantes y excipientes según técnicas convencionales, tales como las descritas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22a edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2013.
Las composiciones farmacéuticas de la descripción e invención pueden formularse específicamente para la administración por cualquier vía adecuada, tal como las vías oral, rectal, nasal, pulmonar, tópica (incluyendo bucal y sublingual), transdérmica, intracisternal, intraperitoneal, vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intratecal, intravenosa e intradérmica). Se apreciará que la vía dependerá del estado general y la edad del sujeto que se va a tratar, la naturaleza de la afección que se va a tratar y el principio activo.
Las composiciones farmacéuticas para administración oral incluyen formas de dosificación sólidas tales como cápsulas, comprimidos, grageas, píldoras, pastillas para chupar, polvos y gránulos. Cuando sea apropiado, las composiciones pueden prepararse con revestimientos, tales como revestimientos entéricos, o pueden formularse de manera que proporcionen liberación controlada del principio activo, tal como liberación sostenida o prolongada, según métodos bien conocidos en la técnica. Las formas de dosificación líquidas para la administración oral incluyen disoluciones, emulsiones, suspensiones, jarabes y elixires.
Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones inyectables acuosas y no acuosas estériles, así como polvos estériles que van a reconstituirse en disoluciones o dispersiones inyectables estériles antes de su uso. Otras formas de administración adecuadas incluyen, pero no se limitan a, supositorios, pulverizaciones, pomadas, cremas, geles, inhalantes, parches dérmicos, e implantes.
Las dosificaciones orales típicas oscilan de alrededor de 0,001 a alrededor de 100 mg/kg de peso corporal por día. Las dosificaciones orales típicas también oscilan de alrededor de 0,01 a alrededor de 50 mg/kg de peso corporal por día. Las dosificaciones orales típicas oscilan adicionalmente de alrededor de 0,05 a alrededor de 10 mg/kg de peso corporal por día. Las dosificaciones orales se administran habitualmente en una o más dosificaciones, normalmente de una a tres dosificaciones por día. La dosificación exacta dependerá de la frecuencia y modo de administración, el género, edad, peso y estado general del sujeto tratado, la naturaleza y gravedad de la afección tratada y cualesquiera enfermedades concomitantes a tratar, y otros factores evidentes para los expertos en la técnica.
Las formulaciones también pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Con fines ilustrativos, una forma de dosificación unitaria típica para administración oral puede contener de alrededor de 0,01 a alrededor de 1000 mg, de alrededor de 0,05 a alrededor de 500 mg, o de alrededor de 0,5 mg a alrededor de 200 mg.
Para vías parenterales tales como la administración intravenosa, intratecal, intramuscular y similar, las dosis típicas son del orden de la mitad de la dosis empleada para administración oral.
La presente descripción e invención también proporciona un procedimiento para obtener una composición farmacéutica, que comprende mezclar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención y al menos un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En una realización, de la presente descripción e invención, el compuesto utilizado en el procedimiento mencionado anteriormente es uno de los compuestos específicos descritos en la Sección Experimental aquí.
Los compuestos de esta descripción e invención se utilizan generalmente como la sustancia libre o como una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. Tales sales se preparan de una manera convencional tratando una disolución o suspensión de un compuesto de la presente descripción e invención con un equivalente molar de un ácido farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos representativos de ácidos orgánicos e inorgánicos adecuados se describieron anteriormente.
Para administración parenteral, pueden emplearse disoluciones de los compuestos de la presente descripción e invención en disolución acuosa estéril, propilenglicol acuoso, vitamina E acuosa o aceite de sésamo o cacahuete. Tales disoluciones acuosas deben amortiguarse de manera adecuada si es necesario, y el diluyente líquido debe en primer lugar volverse isotónico con suficiente disolución salina o glucosa. Las disoluciones acuosas son particularmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Los compuestos de la presente descripción e invención pueden incorporarse fácilmente en medios acuosos estériles conocidos usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica.
Los vehículos farmacéuticos adecuados incluyen diluyentes sólidos inertes o cargas, disoluciones acuosas estériles y diversos disolventes orgánicos. Los ejemplos de vehículos sólidos incluyen lactosa, terra alba, sacarosa, ciclodextrina, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio, ácido esteárico, y éteres de alquilo inferior de celulosa. Los ejemplos de vehículos líquidos incluyen, pero no se limitan a, jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, fosfolípidos, ácidos grasos, aminas de ácidos grasos, polioxietileno y agua. De manera similar, el vehículo o diluyente puede incluir cualquier material de liberación sostenida conocido en la técnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o mezclado con una cera. Las composiciones farmacéuticas formadas combinando los compuestos de la presente descripción e invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran entonces fácilmente en una variedad de formas de dosificación adecuadas para las vías de administración descritas. Las formulaciones pueden presentarse de manera conveniente en una forma de dosificación unitaria mediante métodos conocidos en la técnica de la farmacia.
Las formulaciones de la presente descripción e invención adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades discretas, tales como cápsulas o comprimidos, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del principio activo, y opcionalmente un excipiente adecuado. Además, las formulaciones disponibles por vía oral pueden estar en forma de un polvo o gránulos, una disolución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite.
Si un vehículo sólido se usa para administración oral, la preparación puede prepararse en forma de comprimidos, colocarse en una cápsula de gelatina dura en forma de polvo o pelete, o puede estar en forma de trocisco o pastilla para chupar. La cantidad de vehículo sólido variará ampliamente, pero oscilará de alrededor de 25 mg a alrededor de 1 g por unidad de dosificación. Si se usa un vehículo líquido, la preparación puede estar en forma de un jarabe, emulsión, cápsula de gelatina blanda o líquido inyectable estéril, tal como una suspensión o disolución líquida acuosa o no acuosa.
Las composiciones farmacéuticas de la descripción e invención pueden prepararse mediante métodos convencionales en la técnica. Por ejemplo, los comprimidos se pueden preparar mezclando el principio activo con adyuvantes y/o diluyentes habituales, y comprimiendo posteriormente la mezcla en una prensa de comprimidos convencional para preparar los comprimidos. Los ejemplos de adyuvantes o diluyentes comprenden: almidón de maíz, almidón de patata, talco, estearato de magnesio, gelatina, lactosa, gomas, y similares. Cualesquiera otros adyuvantes o aditivos habitualmente usados para tales fines, tales como colorantes, aromatizantes, conservantes etc., pueden usarse siempre que sean compatibles con los principios activos.
Compuestos de la invención
La tabla 1 enumera los compuestos de la descripción y los compuestos de la invención y los correspondientes valores de IC50 (nM), determinados como se describe en la sección “Ensayo de inhibición de PDE9”. Además, se enumeran la concentración de compuestos en plasma y cerebro, determinados como se describe en la sección “Penetración de la barrera hematoencefálica”. Cada uno de los compuestos constituye una realización individual de la presente descripción e invención:
Tabla 1: Compuestos de la descripción e invención, valores de IC50, concentración en plasma/cerebro
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Síntesis de los Compuestos
Los compuestos de referencia de la presente descripción y los compuestos de la invención se pueden sintetizar como se describe a continuación.
Esquemas de resumen:
Esquema 2 (Compuesto de Referencia (P1)):
Esquema 3 (Compuesto de referencia (P2)):
Esquema 4 (Compuesto (P3)):
Procedimientos sintéticos:
Lista de abreviaturas
ac acuoso
NBS N-bromosuccinimida
Boc terc-Butoxicarbonilo
°C grados Celsius
CDI W,W-carbonildiimidazol
5<h>desplazamiento químico, en partes por millón, campo abajo de tetrametilsilano
DCM diclorometano
DEAD azodicarboxilato de dietilo
Dppf bis(difenilfosfino)ferroceno
DIPEA N,N-diisopropiletilamina
DMF N,N-dimetilformamida
eq equivalente
ESI ionización por electropulverización
Et etilo
EtOAc acetato de etilo
9 gramo(s)
HPLC cromatografía de líquidos de alta resolución
h horas
Hz hercio
Jconstante de acoplamiento (en espectrometría de RMN)
LCMS cromatografía de líquidos-espectrometría de masas
LiHMDS bis(trimetilsilil)amiduro de litio
Umicro
m multiplete (espectral); metro(s); mili
M+ ion molecular original
Me metilo
MeCN acetonitrilo
MeOH metanol
MHz megahercio
Min minuto(s)
ml mililitro
MS espectrometría de masas
MTBE Metil-terc-butil éter
N normal (equivalentes por litro)
NaOH hidróxido de sodio
NBS N-Bromosuccinimida
Nm nanometro(s)
RMN resonancia magnética nuclear
PE éter de petróleo p.e.: 60 ~ 90°C
rt temperatura ambiente
s singlete (espectral)
t triplete (espectral)
T temperatura
TEA trietilamina
TFA ácido trifluoroacético
THF tetrahidrofurano
TLC cromatografía de capa fina
TMS tetrametilsilano
TMS-CI cloruro de trimetilsililo
Tol tolueno
Métodos experimentales generales
Los espectros de RMN 1H se registraron en dispositivos Bruker Avance III 400 MHz y Bruker Fourier 300 MHz, y se usó TMS como patrón interno.
La LCMS se realizó en un espectrómetro de masas de tipo cuadrupolo en un dispositivo Agilent LC/MSD serie 1200 (columna: ODS 2000 (50 x 4,6 mm, 5 pm) que funciona en modo de ionización ES (+) o (-); T = 30°C; caudal = 1,5 ml/min; longitud de onda detectada: 214 nm.
Síntesis de 6-cloro-p¡razin-2-¡lam¡na (9)
Una disolución de compuesto 8 (450,0 g, 3,02 mol) en conc. q. NH<3>ac. conc. (3,0 l) se agitó a 135°C durante la noche en una vasija a presión cerrada herméticamente de 10 litros. La TLC y LC/MS mostraron una conversión completa del material de partida. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente, y se filtró para proporcionar un sólido blanco. El sólido se lavó con agua (200 ml x 3), y después se secó para proporcionar el compuesto 9 (312 g, rendimiento 80%) como un sólido.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): 57,82 (s, 1 H), 7,12 (s, 1 H), 6,93 (s, 2H). MS Calculado: 129 MS Encontrado: 130 ([M+H]+).
Síntesis de 6-cloro-5-vodo-piraz¡n-2-¡lam¡na (10)
A una mezcla del compuesto 9 (312,0 g, 2,4 mol) y K<2>CO<3>(664,0 g, 4,8 mol) en MeOH (1,0 l) se añadió gota a gota ICI (704,0 g, 4,3 mol en 1,0 l de DCM) durante 2 horas a 0°C. La mezcla de reacción se agitó entonces a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se paralizó con disolución acuosa de Na2SO3 (2 M, 1,5 l). La mezcla se extrajo con DCM (1,0 l x 3). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron, y se concentraron. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (PE/EA = de 10/1 a 4/1) para proporcionar el compuesto 10 (460 g, rendimiento 75%) como un sólido.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): 57,68 (s, 1H), 7,07 (s, 2H). MS Calculado: 255 MS Encontrado: 256 ([M+H]+).
Síntesis de 5-am¡no-3-cloro-p¡raz¡n-2-carbonitr¡lo (11)
Una mezcla del compuesto 10 (460,0 g, 1,8 mol) y CuCN (177,0 g, 1,98 mol) se agitó en DMF (2,0 l) en un baño de aceite a 150°C durante 2 horas. La LC/MS mostró una conversión completa del material de partida. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente, y se vertió en EtOAc (1,5 l). A la mezcla resultante se añadió lentamente NH<3>(1,0 l) ac. conc., y después se extrajo con EtOAc (1,0 l x 2). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con H<2>O (1,5 l x 5) y salmuera (1,5 l), y se secaron sobre Na<2>SO<4>anhidro. La fase orgánica se filtró y se concentró para proporcionar el compuesto 11 (232 g, rendimiento 84%) como un sólido.
1HNMR (400 MHz, DMSO-a<6>): 58,12 (s, 2H), 7,88 (s, 1H). MS Calculado: 154; MS Encontrado: 155 ([M+H]+).
Síntesis de 5-am¡no-3-metox¡-p¡raz¡n-2-carbonitr¡lo (12)
Se añadió terc-butóxido de potasio (168,0 g, 1,5 mol) en porciones en metanol (1,5 l) en un matraz de fondo redondo. La suspensión se sometió a reflujo durante una hora. Después, el compuesto 11 (232,0 g, 1,5 mol) se añadió bajo una atmósfera de N<2>. La suspensión resultante se sometió a reflujo durante 1,5 horas. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró a vacío y se diluyó con agua (<2 , 0>l), después se extrajo con EtOAc (2,0 l x 5). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4, se filtraron, y se concentraron para proporcionar 12 (170 g, rendimiento 75%) como un sólido.
1HNMR (300 MHz, DMSO-Ó<6>): 57,69 (s, 2H), 7,51 (s, 1H), 3,89 (s, 3H). MS Calculado: 150; MS Encontrado: 151 ([M+H]+).
Síntesis de éster fórc-butílico del ác¡do (5-c¡ano-6-metox¡-p¡raz¡n-2-¡l)-carbám¡co (13)
Se añadió 4-dimetilaminopiridina (1,0 g, 0,01 mol) a una mezcla del compuesto 12 (120,0 g, 0,8 mol) en DCM (1,5 l) a temperatura ambiente. Después, se añadió gota a gota dicarbonato de di-terc-butilo (327 g, 1,5 mol) en DCM (1,0 l) a 10-20°C durante 2 horas. Después, la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La suspensión se disolvió, y la disolución de reacción se diluyó con 2 l de agua. La fase de DCM se separó y se secó con sulfato de sodio, se filtró, y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (PE/EtOAc= 10:1) para proporcionar 13 (150 g, rendimiento 75%).
1HNMR (300 MHz, DMSO-Ó<6>): 5 10,78 (s, 1H), 8,70 (s, 1H), 3,97 (s, 3H), 1,49 (s, 9H). MS Calculado: 250; MS Encontrado: 251 ([M+H]+).
Síntesis de éster terc-butílico del ác¡do (5-am¡nomet¡l-6-metox¡-p¡raz¡n-2-¡l)-carbám¡co (14)
Se añadió Ni Raney (10,0 g) a una mezcla del compuesto 13 (30,0 g, 120 mmol) en NH<3>concentrado en MeOH (500 ml) a temperatura ambiente. La suspensión se agitó a temperatura ambiente bajo 1 atm de H<2>durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con una mezcla de DCM/MeOH (1:1). La mezcla de reacción se filtró, y el filtrado y se concentró a vacío. El residuo se trituró con PE/EtOAc = 2/1 para proporcionar 14 (23 g, rendimiento 75%) como un sólido.1
1HNMR (300 MHz, DMSO-Ó<6>): 58,46 (s, 1 H), 3,87 (s, 3H), 3,70 (s, 2H), 3,17 (s, 3H), 1,47 (s, 9H). MS Calculado: 254; MS Encontrado: 255 ([M+H]+).
Síntesis de éster terc-butílico del ácido 5-r(4-fluoro-benzoMamino)-metM1-6-metoxi-pirazin-2-il-carbámico (15)
A una disolución del compuesto 14 (4,52 g, 17,86 mmol) en DCM (200 ml) se añadió TEA (5,41 g, 58,53 mmol), después se añadió gota a gota cloruro de 4-fluorobenzoílo (3,4 g, 21,42 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La TLC detectó que la reacción estaba terminada. La reacción se paralizó con agua (100 ml). La fase orgánica se separó, y la fase acuosa se extrajo con DCM (200 ml x 2). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 anhidro, se filtraron, y se concentraron a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice para proporcionar 15 (5,77 g, rendimiento 85,9%) como un sólido.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6):59,89 (s, 1 H), 8,81 (t,J= 5,6 Hz, 1 H), 8,46 (s, 1 H), 7,94 (m, 2 H), 7,29 (m, 2 H), 4,49 (d,J= 5,6 Hz, 2 H), 3,90 (s, 3 H), 1,47 (s, 9 H). MS Calculado: 376; MS Encontrado: 377 ([M+H]+).
Síntesis de N-(5-am¡no-3-metox¡-p¡raz¡n-2-¡l-met¡l)-4-fluoro-benzam¡da (16)
El compuesto 15 (5,77 g, 15,33 mmol) se disolvió en DCM (25 ml). Se añadió TFA (25 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La TLC detectó que la reacción estaba terminada. Se eliminó el disolvente. El residuo se diluyó con DCM (100 ml) y disolución acuosa saturada de NaHCOs (100 ml). La fase orgánica se separó, y la fase acuosa se extrajo con DCM (100 ml x 2). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 anhidro, se filtraron, y se concentraron a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluido con PE/EtOAc = 6:1 a 1:1) para proporcionar 16 (3,9 g, rendimiento 92,2%) como un sólido.
1HNMR (300 MHz, CDCta):57,90-7,85 (m, 2 H), 7,46 (s, 1 H), 7,40 (t,J= 6,0 Hz, 1 H), 7,11 (m, 2 H), 4,60 (d, J = 6,0 Hz, 2 H), 4,37 (s, 2 H), 3,93 (s, 3 H). MS Calculado: 276; MS Encontrado: 277 ([M+H]+).
Síntesis de 4-fluoro-N-(5-vodo-3-metox¡-p¡raz¡n-2-¡l-met¡0-benzam¡da (17)
El compuesto 16 (3,9 g, 14,1 mmol) se disolvió en THF anhidro (100 ml). Se añadieron CuI (2,7 g, 14,1 mmol), después nitrito de isoamilo (4,9 g, 42,3 mmol) y CH<2>I<2>(3,8 g, 14,1 mmol) bajo una atmósfera de N<2>. La mezcla de reacción se calentó a 75°C durante 3 horas. La reacción se enfrió entonces hasta temperatura ambiente y se filtró. El filtrado se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluido con PE/EtOAc 5:1) para proporcionar 17 (2,0 g, rendimiento 37%) como un sólido.
1HNMR (400 MHz, CDCta):58,34 (s, 1 H), 7,88 (m, 2 H), 7,36 (t,J= 4,4 Hz, 1 H), 7,14 (m, 2 H), 4,66 (d,J= 4,4 Hz, 2 H), 4,04 (s, 3 H). MS Calculado: 387; MS Encontrado: 388 ([M+H]+).
Síntesis de 3-(4-fluoro-fen¡0-6-vodo-8-metox¡-¡m¡dazoH.5-alp¡raz¡na (18)
El compuesto 17 (1,6 g, 4,13 mmol) se suspendió en MeCNCHsCN (50 ml). Se añadieron POCI<3>(6,3 g, 41,3 mmol) y TEA (1,25 g, 12,39 mmol) bajo una atmósfera de gas N<2>, y la mezcla de reacción se calentó a 85°C durante 6 horas. El disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se diluyó con DCM (100 ml) y agua con hielo (30 ml). Después se añadió una disolución acuosa saturada de Na2CO3 (100 ml). La fase orgánica se separó, y la fase acuosa se extrajo con DCM (100 ml x 2). Las fases orgánicas combinadas se secaron, se filtraron, y se concentraron a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluido con PE/EtOAc = 20:1 a 3:1) para proporcionar 18 (1,5 g, rendimiento 97,8%) como un sólido.
1HNMR (300 MHz, CDCta):58,01 (s, 1 H), 7,82 (s, 1 H), 7,77-7,72 (m, 2 H), 7,28-7,23 (m, 2 H), 4,11 (s, 3 H). MS Calculado: 369; MS Encontrado: 370 ([M+H]+).
Síntesis de éster metílico del ácido 3-(4-fluoro-fen¡0-8-metox¡-¡m¡dazoH .5-alp¡raz¡n-6-carboxílico (19)
A una disolución de mezcla de 18 (4,11 g, 11,13 mmol), CuI (640 mg, 3,34 mmol) y Pd(dppf)<2>Cl<2>(930 mg, 1,11 mmol) en MeOH (100 ml) se añadió TEA (14 ml). La mezcla de reacción se calentó hasta 85°C bajo una atmósfera de CO (3,0 MPa) durante 16 horas. La mezcla de reacción se dejó enfriar hasta temperatura ambiente, y se concentró a vacío para obtener el producto bruto. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluido con PE/EtOAc = 1:1) para proporcionar 19 (2,3 g, rendimiento 75%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, CDCta):58,59 (s, 1 H), 7,87 (s, 1 H), 7,78 (m, 2 H), 7,28 (m, 2 H), 4,21 (s, 3 H), 3,96 (s, 3 H). MS Calculado: 301; MS Encontrado: 302 ([M+H]+).
Síntesis de r3-(4-fluoro-fen¡0-8-metox¡-¡m¡dazoH.5-alp¡raz¡n-6-¡n-metanol (20)
Una mezcla de CaCl<2>anhidro en polvo (4,23 g, 38,15 mmol) y NaBH4 (2,86 g, 76,3 mmol) en THF (100 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió una disolución del compuesto 19 (2,3 g, 7,63 mmol) en THF (25 ml), y después se añadió MeOH (25 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se paralizó con agua (50 ml). Después de eliminar el disolvente orgánico a presión reducida, la disolución resultante se disolvió en EtOAc (200 ml) y agua (50 ml). La fase acuosa separada se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Después, las fases orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluido con PE/EtOAc = 2:1) para proporcionar 20 (1,93, rendimiento 93%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, CDCis):57,81 (s, 1 H), 7,79-7,74 (m, 3H), 7,25-7,22 (m, 2H), 4,56 (d,J= 4,4 Hz, 2H), 4,11 (s, 3H), 2,41 (t,J= 4,4 Hz, 1H). MS Calculado: 273; MS Encontrado: 274([M+H]+).
Síntesis de 6-clorometM-3-(4-fluoro-fenM)-8-metox¡-¡m¡dazoH ,5-alpirazina (21)
A una disolución de 20 (1,88 g, 6,88 mmol) en diclorometano (100 ml) se añadió gota a gota cloruro de tionilo (4,5 ml) mientras se enfriaba en un baño de agua con hielo. Después de la adición, la mezcla se agitó durante otras 2 horas. La mezcla de reacción se paralizó con agua con hielo, se lavó con salmuera (20 ml), se secó sobre Na2SO4, y se concentró a vacío para proporcionar 21 (2,01 g, rendimiento 100%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, CDCh): 57,87 (s, 1 H), 7,83-7,79 (m, 3 H), 7,30-7,27 (m, 2 H), 4,50 (s, 2 H), 4,12 (s, 3 H). MS Calculado: 291; MS Encontrado: 292([M+H]+).
Síntesis de 6-cloromet¡l-3-(4-fluoro-fen¡l)-7H-¡m¡dazoH .5-alpiraz¡n-8-ona (22)
A una disolución de 21 (1,87 g, 6,41 mmol) en MeOH (50 ml) se añadió HCl acuoso 6 N, y la disolución resultante se agitó a 70°C durante una hora. La mezcla se concentró para proporcionar el producto 22 (1,60 g, rendimiento 90%) como un sólido blanco.
1H RMN (300 MHz, DMSO-d6):511,29 (s, 1 H), 8,07 (s, 1 H), 7,83-7,87 (m, 2 H), 7,74 (s, 1 H), 7,46-7,50 (m, 2 H), 4,59 (s, 2 H). MS Calculado.: 277; MS Encontrado: 278([M+H]+).
Síntesis de sal de hidrocloruro de 4-(azet¡d¡n-3-ilox¡)-p¡r¡d¡na (5)
A una disolución de 3-hidroxiazetidin-1-carboxilato de terc-butilo 1 (4,55 g, 26,3 mmol) en THF (100 ml) se añadió piridin-4-ol (2,0 g, 21,0 mmol), PPhs (6,89 g, 26,3 mmol) y DEAD (4,57 g, 26,3 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a 70°C durante la noche. La TLC indicó que la reacción estaba terminada. La mezcla de reacción se concentró a vacío. El aceite resultante se disolvió en una disolución acuosa de HCl 1,0 M (, 20 ml), y se extrajo con DCM (50 ml x 3), Las fases orgánicas combinadas se lavaron con disolución de HCl (ac.) (0,5 M, 150 ml). Las fracciones acuosas se combinaron y se basificaron hasta pH=12 usando NaOH (1,0 M), y se extrajeron con DCM (100 ml x 3) . Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice para proporcionar 4 (2,81 g, rendimiento 53%) como un sólido.
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6):58,41 (d,J= 6,0 Hz, 2 H), 6,88 (d,J= 6,0 Hz, 2 H), 5,07-5,09 (m, 1 H), 4,32-4,33 (m, 2 H), 3,80-3,82 (m, 2 H), 1,39 (s, 9 H). MS Calculado: 250; MS Encontrado: 251 ([M+H]+).
A una disolución de 4 (2,81 g, 11,2 mmol) en Et<2>Ü (100 ml) se añadió HCl en Et<2>Ü (20 ml). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La TLC indicó que la reacción estaba terminada. La mezcla de reacción se filtró, y el sólido se secó para proporcionar 5 (1,82 g, rendimiento 87%).
1HNMR (300 MHz, DMSO-d6):59,58 (s, 2 H), 8,77-8,79 (m, 2 H), 7,48-7,49 (m, 2 H), 5,40-5,45 (m, 1 H), 4,49-4,51 (m, 2 H), 4,07-4,11 (m, 2 H). MS Calculado: 150; MS Encontrado: 151 ([M+H]+).
Síntesis del compuesto de referencia 3-(4-fluorofen¡l)-6-((3-(p¡r¡d¡n-4-¡lox¡)azet¡d¡n-1-¡l)met¡l)¡m¡dazori.5-alpirazin-8(7H)-ona (P1)
A una mezcla del compuesto 22 (1,5 g, 5,4 mmol) y 5 (1,31 g, 7,0 mmol) en MeCN (100 ml) se añadió DIPEA (6,96 g, 5,4 mmol). La mezcla de reacción se calentó y se sometió a reflujo durante la noche. El disolvente se eliminó a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice en fase inversa (eluido mediante 5%-95% de MeCN en agua) para proporcionar el producto deseado P1 (1,28 g, rendimiento 62%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, DMSÜ-Ó6): 510,7 (s, 1H), 8,37 (d,J= 6,0 Hz, 2H), 7,85 (s, 1H), 7,85-7,82 (m, 2H), 7,42 (m, 2H), 7,34 (s, 1H), 6,86 (d,J= 6,0 Hz, 2H), 4,93 (m, 1H), 3,88-3,77 (m, 2H), 3,42 (s, 2H), 3,18-3,14 (m, 2H). MS Calculado:391; MS encontrado: 392 ([M+H]+).
Síntesis de éster fórc-butílico del ácido (6-metox¡-5-(r(tetrah¡dro-p¡ran-4-carbon¡l)-am¡nol-met¡l)-p¡raz¡n-2-¡l)-carbámico (23)
A una disolución del compuesto 14 (28,4 g, 0,11 mol) en DCM (200 ml) se añadió TEA (49 ml, 0,34 mol), después se añadió gota a gota cloruro de tetrahidropiran-4-carbonilo (17,5 g, 0,13 mol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La TLC indicó que la reacción estaba terminada. La reacción se paralizó con agua (100 ml). La fase orgánica se separó, y la fase acuosa se extrajo con DCM (200 ml x 2). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SÜ4 anhidro, se filtraron y se concentraron a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (PE/EA = 5/1 a 1/3) para proporcionar 23 (31 g, rendimiento 75%) como un sólido.
1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 59,89 (s, 1H), 8,47 (s, 1 H), 8,10-8,07 (t,J= 5,2 Hz, 1 H), 4,29-4,28 (d,J= 5,2 Hz, 2H), 3,87 (s, 3H), 3,85-3,82 (m, 2H), 3,32-3,25 (m, 2H), 2,45-2,43 (m, 1H), 1,60-1,55 (m, 4H), 1,48 (s, 9H). MS Calculado: 366; MS Encontrado: 367 ([M+H]+).
Síntesis de (5-am¡no-3-metox¡-p¡raz¡n-2-¡lmetil)-am¡da del ácido tetrahidro-piran-4-carboxílico (24)
El compuesto 23 (19,0 g, 0,08 mol) se disolvió en DCM (100 ml). Se añadió TFA (100 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La TLC indicó que la reacción estaba terminada. Se eliminó el disolvente. El residuo se diluyó con DCM (100 ml) y disolución acuosa saturada de NaHCOs (100 ml). La fase acuosa se extrajo con DCM (100 ml x 2). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (PE/EA = 6/1 a 1/1) para proporcionar 24 (19 g, rendimiento 85%) como un sólido.
1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 57,87 (t,J= 4,8 Hz, 1H), 7,36 (s, 1H), 6,26 (s a, 2H), 4,16 (d,J= 4,8 Hz, 2H), 3,86 3,82 (m, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,30-3,24 (m, 2H), 2,41 (m, 1H), 1,59-1,54 (m, 4H). MS Calculado: 266; MS Encontrado: 267 ([M+H]+).
Síntesis de (5-vodo-3-metox¡-p¡raz¡n-2-¡lmetil)-am¡da del ácido tetrahidropiran-4-carboxílico (25)
A una mezcla del compuesto 24 (15,5g, 58,4 mmol), CH<2>I<2>(23,5, 87,6 mmol) y nitrito de isoamilo (23,9 g, 204 mmol) en THF (600 ml) se añadió Cul (11,3 g, 39,6 mmol) bajo una atmósfera de N<2>. La mezcla de reacción se agitó a 80°C durante 7 horas. Se filtró el precipitado. El filtrado se concentró y se purificó mediante cromatografía en columna (MeOH/DCM = 1/20) para obtener el producto bruto, después se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice en fase inversa (eluido mediante 5%-95% de MeCN en agua) para proporcionar el producto deseado, el compuesto 25 (4,5 g, rendimiento 20%) como un sólido.
1H RMN (DMSO-Ó6, 300 MHz): 58,41 (s, 1H), 8,16 (t,J= 5,4 Hz, 1H), 4,28 (d,J= 5,4 Hz, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,87-3,81 (m, 2H), 3,30-3,24 (m, 2H), 2,49 (m, 1H), 1,60-1,56 (m, 4H). MS Calculado: 377 MS Encontrado: 378 ([M+H]+).Síntesis de 6-vodo-8-metoxi-3-(tetrah¡dro-p¡ran-4-¡l)-¡m¡dazoH .5-alpirazina (26)
A una disolución del compuesto 25 (4,5 g, 16,9 mmol) en MeCN (100 ml) se añadió POCl3 (18 g, 118 mmol). La reacción se agitó a reflujo durante la noche bajo una atmósfera de N<2>. El disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se trató con agua con hielo (30 ml) y DCM (150 ml). El pH se ajustó a 7-8 mediante una disolución saturada de Na2CO3. La fase acuosa separada se extrajo con DCM (100 ml x 4). Las fases orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para proporcionar el compuesto deseado 26 (4,2 g, rendimiento 99%) como un sólido.
1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 58,46 (s, 1H), 7,64 (s, 1H), 3,98 (s, 3H), 3,94 (m, 2H), 3,53-3,47 (m, 3H), 1,81-1,77 (m, 4H). MS Calculado: 359; MS Encontrado: 360 ([M+H]+).
Síntesis de éster metílico del ácido 8-metox¡-3-(tetrah¡dro-p¡ran-4-¡0-¡m¡dazori.5-a1p¡raz¡n-6-carboxílico (27)
A una suspensión del compuesto 26 (4,2 g, 11,7 mmol) en MeOH (100 ml) se añadió Cul (0,7 g, 3,0 mmol), Pd(dppf)<2>Cl<2>(1,0 g, 1,17 mmol) y TEA (16 ml). La mezcla de reacción se agitó en un baño de aceite ajustado a 85°C durante 16 horas bajo una atmósfera de CO (3 MPa). El precipitado se filtró, y el filtrado se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (eluido en EtOAc/PE = 2/1 hasta MeOH/DCM = 1/20) para proporcionar el compuesto deseado 27 (2,7g, rendimiento 80%) como un sólido.
1H RMN (CDCl<3>, 400 MHz): 58,32 (s, 1H), 7,70 (s, 1H), 4,17 (s, 3H), 4,14 (m, 2H), 3,98 (s, 3H), 3,66 - 3,60 (m, 2H), 3,31 - 3,26 (m, 1H), 2,17 -2,13 (m, 2H), 1,93 (m, 2H). MS Calculado: 291; MS Encontrado: 292 ([M+H]+).
Síntesis de r8-metox¡-3-(tetrah¡dro-p¡ran-4-¡0-¡m¡dazoH .5-alp¡raz¡n-6-¡l1-metanol (28)
Una mezcla de CaCl<2>anhidro en polvo (2,4 g, 21,5 mmol) y NaBH4 (1,6 g, 42,9 mmol) se agitó en THF (100 ml) durante 1 hora a ta. Se añadió una disolución del compuesto 27 (2,4 g, 4,29 mmol) en THF (25 ml), y después se añadió MeOH (25 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se paralizó con agua (50 ml). Después de eliminar el disolvente orgánico a presión reducida, el residuo se repartió entre EtOAc (200 ml) y agua (50 ml). La fase acuosa separada se extrajo con EtOAc (100 x 3 ml). Después, las fases orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluido mediante DCM/MeOH = 100/1 a 30/1) para proporcionar el producto deseado, compuesto 28, como un sólido (1,87, rendimiento 80%).
1H RMN (CDCl3, 400 MHz): 57,65 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 4,58(s, 2H), 4,13 (d,J =12,0 Hz, 2H), 4,07 (s, 3H), 3,60 (dd,J= 10,4 Hz, 10,8 Hz, 2H), 3,24-3,17 (m, 1H), 2,60 (m, 1H), 2,18 -2,06 (m, 2H ), 1,90 (d,J=12,8 Hz, 2H). MS Calculado: 263; MS Encontrado: 264 ([M+H]+).
A una disolución del compuesto 28 (1,9 g, 7,11 mmol) en DCM (100 ml) se le añadió SOCl<2>(5 ml) a 0°C, después la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La TLC y la LC-MS mostraron que el material de partida se había consumido. La disolución de mezcla se concentró entonces, y el residuo se disolvió en disolución de HCl (ac.) (6 N, 20 ml). La reacción de la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se concentró entonces a presión reducida para proporcionar el producto deseado, compuesto 29 (1,90 g, rendimiento 95%) como un sólido.
1H RMN (DMSO-d6, 300 MHz): 511,49 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 8,00 (s, 1H), 4,55 (s, 2H), 3,97 (dd,J= 2,4 Hz, 2,8 Hz, 2H), 3,53-3,43 (m, 3H), 1,95-1,81 (m, 4H). MS Calculado: 267 MS Encontrado: 268 ([M+H]+).
Síntesis de h¡drocloruro de 3-(azet¡d¡n-3-¡lox¡)-p¡r¡d¡na (7)
El compuesto 7 se preparó mediante un procedimiento similar al empleado para la preparación de la amina 5.
Datos analíticos para 7: 1H RMN ((DMSO-d6, 400 MHz): 59,73 (a d, 2H), 8,55 (d,J =2,4 Hz, 2H), 8,47 (d,J= 4,4 Hz, 2H), 7,88-7,75 (m, 2H), 5,28 (t,J= 5,6 Hz, 1H), 4,50-4,43 (m, 2H), 4,08-4,00 (m, 2H). MS Calculado: 150, MS Encontrado: 151 ([M+H]+).
Síntesis del compuesto de referencia 6-r3-(p¡ríd¡n-3-¡lox0-azet¡d¡n-1-¡lmet¡l1-3-(tetrah¡drop¡ran-4-¡0-7H-imidazoH .5-alp¡razin-8-ona (P2)
A una mezcla del compuesto 30 (550 mg, 2,05 mmol) y 7 (500 mg, 2,67 mmol) en MeCN (200 ml) se añadió DIPEA (2,7 g, 20,5 mmol). La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante la noche. El disolvente se eliminó a vacío. El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice en fase inversa (eluido mediante 5%-95% de MeCN en agua) para proporcionar el producto deseado P2 (360 mg, rendimiento 46%) como un sólido.
1H RMN (CDCl3, 300 MHz): 58,26 (d,J= 4,0 Hz 1H), 8,22 (s, 1H), 8,20 (d,J= 2,8 Hz, 1 H), 7,91 (s, 1H), 7,24-7,21 (m, 1H), 7,07 (d,J= 2,8 Hz, 1 H), 6,79 (s,1 H), 4,86 (m, 1H), 4,13 (m, 2H), 3,89 (t,J= 7,6 Hz, 2H), 3,57 (m, 2H), 3,50 (s, 2H), 3,28 (dd,J= 2,4 Hz, 6,8 Hz, 2H), 3,10-30,6 (m, 1H), 2,14-2,08 (m, 2H), 1,87 (m, 2H). MS Calculado:381; MS Encontrado: 382 ([M+H]+).
Síntesis de éster metílico del ácido 3H-¡m¡dazol-4-carboxílico (32)
A una disolución del compuesto 31 (25 g, 0,22 mol) en MeOH (300 ml) se añadió H<2>SO<4>(24 ml). La mezcla se agitó a reflujo durante 18 horas. El pH de la disolución de reacción se ajustó entonces a ~7. La mezcla de reacción se concentróa vacío.El residuo se disolvió en 100 ml de MeOH, y se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La disolución de la mezcla se filtró, y el filtrado se concentró para proporcionar el producto bruto 32 (28 g, rendimiento 100%) como un sólido, que se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe):57,80 (s, 2H), 3,57 (s, 3H).
Síntesis de éster metílico del ácido 3H-¡m¡dazol-4-carboxílico (33)
A una disolución del compuesto 32 (22 g, 0,18 mol) en MeCN (500 ml) se añadió NBS (66 g, 0,37 mol). La mezcla se agitó a 70°C durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentróa vacío.El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyendo con PE/EtOAc = 5:1 a 1:1) para proporcionar el compuesto 33 (20 g, rendimiento 40%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe):514,35 (a, 1 H), 3,81 (s, 3H).
Síntesis de éster etílico del ácido trans-1-benc¡l-4-met¡l-p¡rrol¡d¡n-3-carboxíl¡co racémico (35)
A una disolución de 34 (69 g, 0,29 mol) en tolueno se añadió éster etílico del ácido but-2-enoico (50 g, 0,44 mol) y TFA (25 ml, 0,32 mol). La disolución resultante se agitó a 50°C bajo N<2>durante la noche. A la mezcla de reacción se añadió disolución acuosa saturada de NaHCOs (300 ml), y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (500 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (300 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentrarona vacío.El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (PE/EA= 20:1 a 6:1) para proporcionar el productotransracémico deseado 35 (41 g, rendimiento 57%) como un aceite.
Síntesis de éster etílico del ácido (S.S)-frans-1-bencil-4-metil-pirrolidin-3-carboxílico (S,S)-(35)
A una disolución de Rac-35 (37 g, 0,15 mol) en 4-metil-2-pentanona se añadió ácido (-)-dibenzoil-L-tartárico (34,78 g, 0,65eq.), y la mezcla de reacción resultante se calentó hasta 72°C durante 1 h, tras lo cual se dejó enfriar hasta TA, en la que se mantuvo durante 4 h. El sólido resultante se separó por filtración, y el filtrado se lavó con carbonato de sodio ac. conc. (55 ml). La fase acuosa se extrajo con 4-metil-2-pentanona (15 ml), y las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (40 ml). A continuación, la fase orgánica se trató con ácido (+)-dibenzoil-D-tartárico (32,16 g) y se calentó a 72°C durante 1 h. La mezcla de reacción se enfrió hasta TA, y se mantuvo a esta temperatura durante 4 h. El sólido se separó por filtración y se secó en el filtro. El sólido se recristalizó entonces añadiendo una mezcla de MTBE-MeOH (2:1,270 ml), calentando hasta 70°C durante 1 h, y permitiendo que el producto precipitara a TA durante 4 h. El sólido resultante se separó por filtración, se lavó con MTBE, y se secó. Dos recristalizaciones más, siguiendo el mismo procedimiento, proporcionaron el producto puro como una sal del ácido (+)-dibenzoil-D-tartárico (> 98% ee con respecto a la base libre aislada).
La base libre se liberó mediante el siguiente procedimiento: el sólido filtrado se repartió entre MTBE (250 ml) y carbonato de sodio ac. conc. (250 ml), y la fase acuosa se extrajo con MTBE (125 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (250 ml) y salmuera (50 ml), y se evaporaron para proporcionar el producto como un aceite transparente (13,79 g, 0,056 mol) como un aceite transparente.
Síntesis de éster 1-ferc-butílico y éster 3-metilíco del ácido frans-4-metil-pirrolidin-1.3-dicarboxílico racémico rac-(36)
A una disolución de 35 (41 g, 0,17 mol) y Boc<2>O (43 g, 0,20 mol) en EtOH (500 ml) se añadió Pd/C (5%, 10,0 g). La mezcla de reacción se agitó a 50°C durante 48 horas bajo una atmósfera de H<2>(50 Psi). La mezcla de reacción se filtró y se concentróa vacío.El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (PE/EA=20/1) para proporcionar el compuestotransracémico deseado 36 (20 g, rendimiento 46%) como un aceite.
Síntesis de éster 1-terc-butílico del ácido (S.S)-frans-4-metil-pirrolidin-1.3-dicarboxílico (S.S)-(37) a través de éster 1-terc-butílico y éster 3-metílico del ácido (S.S)-frans-4-metil-pirrolidin-1.3-dicarboxílico (S,S)-(36)
Una disolución de (S,S)-35 (12,80 g, 51,8 mmol) y B<0>C<2>O (13,57 g, 1,2 eq) en EtOH (150 ml) se colocó en un autoclave bajo una atmósfera protectora de N2, y se añadió Pd/C (5%, 2,56 g). La mezcla de reacción se hidrogenó con agitación a 45-50°C a 15-20 bar de presión de H<2>hasta que no se absorbió más hidrógeno (48 h). La mezcla de reacción se enfrió hasta TA y se filtró, y el filtro se lavó con EtOH (50 ml). El filtrado se evaporó a <45°C hasta alrededor de 25 ml. Se añadieron agua (10 ml) y disolución de NaOH (2 ml), y la mezcla de reacción resultante se agitó a TA durante 2 h (El análisis de GC mostró la desaparición total del material de partida en este momento). Se añadió agua (125 ml), y la mezcla resultante se extrajo con MTBE (2 x 50 ml). La fase acuosa se trató con disolución de HCl 2 N para lograr un valor de pH de 3-4 (aprox. 25 ml), y la disolución resultante se extrajo con MTBE (2 x 150 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (50 ml) y se evaporaron hasta alrededor de 20 ml. Se añadió nheptano (40 ml), y la mezcla de reacción resultante se dejó a 0°C durante 2 h, después de lo cual el sólido se separó por filtración y se secó para proporcionar el producto (S,S)-37 como un sólido (9,48 g, 41,7 mmol). El ee en esta etapa se determinó al 97,5%. Este material tenía propiedades de RMN y LC/MS idénticas arac-37descrito a continuación.
Síntesis de éster 1-terc-butílico del ácido (S.S)-fr'ans-4-metil-pirrolidin-1.3-dicarboxílico (S.S)-(37) a través de éster 1-fórc-butílico y éster 3-metílico del ácido (S.S)-trans-4-met¡l-p¡rrol¡d¡n-1,3-d¡carboxíl¡co (S,S)-(36)
Una disolución de (S,S)-35 (12,80 g, 51,8 mmol) y Boc<2>O (13,57 g, 1,2 eq) en EtOH (150 ml) se colocó en un autoclave bajo una atmósfera protectora de N2, y se añadió Pd/C (5%, 2,56 g). La mezcla de reacción se hidrogenó con agitación a 45-50°C a 15-20 bar de presión de H<2>hasta que no se absorbió más hidrógeno (48 h). La mezcla de reacción se enfrió hasta TA y se filtró, y el filtro se lavó con EtOH (50 ml). El filtrado se evaporó a <45°C hasta alrededor de 25 ml. Se añadieron agua (10 ml) y disolución de NaOH (2 ml), y la mezcla de reacción resultante se agitó a TA durante 2 h (El análisis de GC mostró la desaparición total del material de partida en este momento). Se añadió agua (125 ml), y la mezcla resultante se extrajo con MTBE (2 x 50 ml). La fase acuosa se trató con disolución de HCl 2 N para lograr un valor de pH de 3-4 (aprox. 25 ml), y la disolución resultante se extrajo con MTBE (2 x 150 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (50 ml) y se evaporaron hasta alrededor de 20 ml. Se añadió nheptano (40 ml), y la mezcla de reacción resultante se dejó a 0°C durante 2 h, después de lo cual el sólido se separó por filtración y se secó para proporcionar el producto (S,S)-37 como un sólido (9,48 g, 41,7 mmol). El ee en esta etapa se determinó al 97,5%. Este material tenía propiedades de RMN y LC/MS idénticas a rac-37 descrito a continuación.
Síntesis de éster 1-terc-butílico del ácido frans-4-metil-pirrolidin-1.3-dicarboxílico racémico (37)
Una disolución del compuesto 36 (10,0 g, 39,1 mmol), NaOH (3,10 g, 78,2 mmol) en metanol/H<2>O (50/5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se concentró y se extrajo con EA (150 ml). La fase acuosa se acidificó mediante HCl 2 M a 0°C a pH ~5, y se extrajo con EtOAc (150 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron, y se concentraron para proporcionar el compuesto 37 (8,0 g, 90%) como un aceite.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe):512,43 (s, 1 H), 3,55-3,51 (m, 2H), 3,47-3,27 (m, 1 H), 2,85-2,78 (m, 1H), 2,63-2,57 (m, 1H), 2,34-2,28 (m, 1H), 1,55 (s, 9H), 1,03 (d,J= 4,8 Hz, 3H).
Síntesis de éster terc-butílico del ácido (S.S)-trans-3-acet¡l-4-met¡l-p¡rrol¡d¡n-1-carboxíl¡co (S.S)-(39) a través de éster fórc-butílico del ácido (S.S)-frans-3-(metoxi-metil-carbamoil)-4-metil-pirrolidin-1-carboxílico (S.S)-(38)
A una disolución de (S,S)-37 (5,0 g, 22,0 mmol) en DCM (50 ml) se añadió CDI (4,25 g, 1,2 eq.) durante 10 min mientras se mantenía la temperatura por debajo de 5°C todo el tiempo. La mezcla de reacción se agitó durante 1 h, después de lo cual se añadió hidrocloruro de W,0-dimetilhidroxilamina (3,0 g, 1,4 eq.) en pequeñas porciones a lo largo de alrededor de 10 min, manteniendo la temperatura por debajo de 5°C. La reacción se dejó calentar entonces hasta temperatura ambiente, y se agitó durante 12 h, en las que el material de partida se había consumido completamente. Se añadió agua (50 ml), las fases se separaron, y la fase ac. se extrajo con DCM (35 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (50 ml) y se concentraron hasta alrededor de 5 ml. Se añadió THF (20 ml), y la disolución resultante se evaporó hasta sequedad y se secó a alto vacío. Se añadió THF seco (50 ml), la disolución se enfrió hasta 0°C, y se añadió gota a gota MeMgCl (3 M, 11,35 ml, 1,5 eq) bajo una atmósfera de N<2>durante de 30 min, asegurándose de mantener la temperatura por debajo de 5°C. Después, la mezcla de reacción se calentó hasta TA, y se agitó durante 2 h (en este momento la amida de Weinreb se había convertido completamente). Se añadió gota a gota cloruro de amonio ac. saturado (50 ml) por debajo de 25°C para paralizar la reacción, y la mezcla de reacción resultante se extrajo con EtOAc (2 x 50 ml), y los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (50 ml) y se evaporaron hasta alrededor de 5 ml. Se añadió THF (25 ml), y la disolución resultante se evaporó hasta sequedad a vacío para proporcionar el producto (S,S)-39 como un aceite (4,91 g, 21,6 mmol) en alrededor de 98% de ee. Todas las propiedades espectrales eran idénticas a las de rac-39.
Síntesis de éster fórc-butílico del ácido frans-3-fmetox¡-met¡l-carbamo¡n-4-met¡l-p¡rrol¡d¡n-1-carboxíl¡co racémico (38)
A una disolución de 37 (8,0 g, 34,9 mmol) y O,N-dimetil-hidroxilamina (4,0 g, 41,9 mmol) en DCM (50 ml) se añadió CDI (6,8 g, 41,9 mmol). La reacción de la mezcla se agitó a 20°C durante 18 horas. A la disolución de la mezcla se añadió agua (100 ml), y se extrajo con DCM (100 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (30 ml), se secaron, y se concentrarona vacío.El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (PE/EtOAc=20/1) para proporcionar el compuestotransracémico 38 (8,0 g, rendimiento 84%) como un aceite.
1H RMN (400 MHz, DMSO-ofe):53,68 (s, 3H), 3,60-3,48 (m, 2H), 3,20-3,05 (m, 5H), 2,84-2,73 (m, 1H), 2,40-2,32 (m, 1H), 1,39 (s, 9H), 0,96 (d,J= 4,8 Hz, 3H).
Síntesis de éster terc-butílico del ácido frans-3-acet¡l-4-met¡l-p¡rrol¡d¡n-1-carboxíl¡co racémico (39)
A una disolución de 38 (8,0 g, 29,4 mmol) en THF (60 ml) se añadió MeMgBr (3,0 M, 13 ml, 38,2 mmol) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se paralizó con disolución acuosa saturada de NH4Cl (200 ml), y se extrajo con EtOAc (300 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron y se concentrarona vacío.El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (PE/EtOAc=10/1) para proporcionar el compuestotransracémico deseado 39 (6,0 g, rendimiento 94%) como un aceite.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe):53,66-3,51 (m, 1 H), 3,49-3,39 (m, 1H), 3,34-3,24 (m, 1 H), 2,88-2,79 (m, 2H), 2,34-2,30 (m, 1 H), 2,15 (s, 3H), 1,36 (s, 9H), 1,02-1,00 (m, 3H).
Síntesis de éster terc-butílico del ácido frans-3-(2-bromo-acet¡n-4-met¡l-p¡rrol¡d¡n-1-carboxílico racémico (40)
Se añadió una disolución de LiHMDS (1 M en THF, 40 ml, 40 mmol) a la disolución de 39 (6,0 g, 26,4 mmol) en THF (100 ml) bajo una atmósfera de N<2>a -78°C. La mezcla de reacción se agitó a esta temperatura durante una hora. Después, se añadió gota a gota TMSCI (10 ml, 26,4 mmol) a -78°C, y la temperatura de reacción se elevó hasta 0°C. Después de una hora, se añadió PhMe3NBrs (11,0 g, 29,1 mmol) a 0°C. La reacción de mezcla se agitó durante otra hora, después se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se paralizó con agua (200 ml), y se extrajo con EtOAc (250 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron y se concentrarona vacío.El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (PE/EtOAc=10/1) para proporcionar el compuestotransracémico deseado 40 (4,5 g, rendimiento 56%) como un aceite.
1H RMN (400 MHz, CDCh):54,05 (s, 2H), 3,69-3,50 (m, 2H), 3,36-3,30 (m, 1H), 3,04-2,86 (m, 2H), 2,51-2,43 (m, 1H), 1,39 (s, 9H), 1,10-1,05 (m, 3H).
Síntesis de éster fórc-butílico del ácido (S.S)-fr'ans-3-(2-bromo-acetiO-4-metil-pirrolidin-1-carboxílico (S.S)-(40)
Una disolución de LiHMDS (1 M en THF, 21,12 ml, 21,12 mmol) se añadió gota a gota a una disolución de (S,S)-39 (3,96 g, 17,4 mmol) en THF (50 ml) bajo una atmósfera de N<2>a -78°C. La mezcla de reacción se agitó a esta temperatura durante una hora. Después, se añadió gota a gota TMSBr (6,43 g, 42 mmol) a -78°C, y se dejó calentar la temperatura de reacción hasta 0°C. Después de una hora, se añadió NBS (2,76 g, 15,5 mmol) en pequeñas porciones a 0°C. La TLC mostró que todo el material de partida se había consumido. Se añadió agua gota a gota (20 ml), manteniendo la temperatura a TA, y la mezcla de reacción resultante se agitó durante 30 min. Las fases se separaron, y la fase ac. se extrajo con MTBE (2 x 15 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron y se concentrarona vacío.El residuo se volvió a disolver en MTBE (25 ml), se lavó con agua (3 x 10 ml) y salmuera (10 ml), y se concentró a vacío para proporcionar el producto como un aceite que pudo purificarse mediante cromatografía ultrarrápida (PE/EtOAc=10/1) para proporcionar el compuesto deseado (S,S)-40 (6,4 g, 20,9 mmol) como un aceite.
Síntesis de éster metílico del ácido trans-2.5-d¡bromo-3-r2-n-terc-butox¡carbon¡l-4-met¡l-p¡rrol¡d¡n-3-¡n-2-oxoet¡l1-3H-im¡dazol-4-carboxíl¡co (41)
A una disolución de 33 (4,1 g, 14,7 mmol) en DMF (30 ml) se añadió K<2>CO<3>(5,8 g, 42,5 mmol). Después de agitar durante 15 minutos, el compuesto 40 (4,5 g, 14,7 mmol) se añadió a la mezcla de reacción. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (200 ml), se lavó con salmuera (200 ml x 2). Después, la fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró, y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (PE/EtOAc=10/0~3/1) para proporcionar el compuestotransracémico 41 (3,0 g, rendimiento 40%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe):55,41 (s, 2H), 3,78 (s, 3H), 3,68-3,66 (m, 1H), 3,48-3,45 (m, 1H), 3,34-3,31 (m, 1H), 3,20-3,25 (m, 1H), 2,92-2,87 (m, 1H), 2,50-2,46 (m, 1H), 1,36 (s, 9H), 1,07 (m, 3H).
Síntesis de éster metílico del ácido (S.S)-trans-2.5-d¡bromo-3-r2-(1-terc-butox¡carbon¡l-4-met¡l-p¡rrol¡d¡n-3-il)-2-oxo-et¡l1-3H-¡m¡dazol-4-carboxíl¡co (S.S)-(41)
A una disolución de 33 (2,78 g, 9,79 mmol) en NMP (30 ml) se añadió Na2CÜ3 (3,11 g, 26,2 mmol). Después de agitar durante 15 minutos, el compuesto (S,S)-40 (4,5 g, 14,7 mmol) se añadió a la mezcla de reacción. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (200 ml), se lavó con salmuera (200 ml x 2). Después, la fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró, y se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (PE/EtOAc=10/0-3/1) para proporcionar el producto como un sólido bruto, que se recristalizó en 2-propanol/n-heptano para proporcionar (S,S)-41 (3,03 g, rendimiento 40%) como un sólido. El ee del material en esta etapa se determinó que era por encima del 99%. Todos los datos espectrales eran idénticos a los derac-41.
Síntesis de éster terc-butílico del ácido trans-3-(1.3-dibromo-8-oxo-7.8-dihidro-imidazon.5-alpirazin-6-i0-4-metil-pirrolidin-1-carboxílico racémico (42)
A una disolución de 41 (3,0 g, 5,89 mmol) en MeOH (150 ml) se añadió NHaOAc (9,07 g, 117,8 mmol). La mezcla de reacción se calentó hasta 130°C en una vasija a presión durante 15 horas. La mezcla de reacción se filtró y se concentró para obtener el producto bruto. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (DCM/MeOH= 100/1 ~10/1) para proporcionar el compuestotransracémico 42 (2,2 g, rendimiento 80%) como un aceite.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe):510,98 (s a, 1H), 7,10 (s, 1H), 3,63-3,54 (m, 2H), 3,39-3,34 (m, 1H), 2,84-2,77 (m, 2H), 2,50 (m, 1 H), 1,41 (s, 9H), 0,96 (m, 3H).
Síntesis de éster terc-butílico del ácido (S.S)-trans-3-(1 ■3-d¡bromo-8-oxo-7.8-dih¡dro-¡m¡dazori .5-alp¡raz¡n-6-¡0-4-met¡l-p¡rrol¡d¡n-1-carboxílico (S,S)-(42)
A una disolución de (S,S)-41 (3,03 g, 5,9 mmol) en 2-propanol (20 ml) se añadió NH4OAc (9,18 g, 118 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 105-110°C durante 12 h, después de lo cual se vertió en agua (60 ml) con agitación y se dejó durante dos h. La mezcla de reacción se filtró y se concentró para obtener el producto bruto. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (DCM/MeOH=100/1 ~10/1), y se evaporó para proporcionar (S,S)-42 (2,1 g, 4,4 mmol) como un sólido. Se determinó que el material tenía un ee del 99,3%, y propiedades espectrales similares a las de rac-42.
Síntesis de éster terc-butílico del ácido trans-3-r1-bromo-3-(3.6-dihidro-2H-piran-4-il)-8-oxo-7.8-dihidro-
A una mezcla del compuesto 42 (2,2 g, 4,62 mmol) y 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-3,6-dihidro-2H-pirano (1,1g, 5,08 mmol) en THF (200 ml) se añadió fosfato de potasio (2,7 g, 13,86 mmol). La mezcla de reacción se desgasificó purgando con N<2>durante 5 min, antes de que se añadieran Pd2(dba)3 (0,8 g, 0,92 mmol) y Xanthphos (1,0 g, 1,84 mmol) a la mezcla. La suspensión resultante se desgasificó con N<2>durante 10 minutos. Después, la reacción de la mezcla se calentó hasta 80°C bajo una atmósfera de N2 durante 15 horas. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (250 ml), y el precipitado se separó por filtración. El filtrado se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyendo con EtOAc) para proporcionar 43 (1,3 g, rendimiento 60%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, DMSO-ofe)-510,80 (m, 1H), 7,34 (s, 1H), 6,42 (s, 1H), 4,30-4,29 (m, 2H), 3,92-3,80 (m, 2H), 3,63 3,33 (m, 4H), 2,87-2,71 (m, 2H), 2,50 (m, 1H), 1,41 (s, 9H), 0,95 (m, 3H).
Síntesis de éster fórc-butílico del ácido (S.S)-frans-3-H-bromo-3-(3.6-dihidro-2H-piran-4-i0-8-oxo-7.8-
A una mezcla del compuesto (S,S)-42 (2,11 g, 4,42 mmol) y 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-3,6-dihidro-2H-pirano (0,975g, 4,64 mmol) en 1,4-dioxano (40 ml) y agua (10 ml) se añadió fosfato de potasio (2,57 g, 12,2 mmol). La mezcla de reacción se desgasificó purgando con N<2>durante 5 min, antes de que se añadieran Pd2(dba)3 (0,8 g, 0,9 mmol) y Xanthphos (1,0 g, 1,8 mmol) a la mezcla. La suspensión resultante se desgasificó con N<2>durante 10 minutos. Después, la reacción de la mezcla se calentó hasta 80°C bajo una atmósfera de N2 durante 15 horas. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (250 ml), y el sólido se eliminó mediante filtración a través de Celite. El filtrado se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyendo en EtOAc) para proporcionar 43 (1,4 g, 2,92 mmol) como un sólido. El material tiene un ee por encima del 99% en esta etapa.
Síntesis de éster fórc-butílico del ácido frans-3-metil-4-r8-oxo-3-(tetrahidro-piran-4-i0-7.8-dihidro-imidazoH .5-
A una disolución de 43 (1,3 g, 2,73 mmol) en DMF (100 ml) y metanol (30 ml) se añadió Pd al 10%/C (0,8 g). El matraz se cargó con hidrógeno (50 psi), y la mezcla se agitó a 50°C durante la noche. Después de enfriar, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite. El filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyendo con<d>C<m>/CH<3>OH<= 1>00/1 -20/1) para proporcionar el compuesto 44 (0,99 g, rendimiento 90%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, CDCh):510,80 (a d, 1H), 7,86 (s, 1H), 6,79 (s, 1H), 4,13-4,10 (m, 2H), 3,83-3,79 (m, 3H), 3,63 3,49 (m, 2H), 3,13-3,03 (m, 2H), 2,77-2,75 (m, 2H), 2,54-2,53 (m, 1H), 2,11-2,06 (m, 2H), 1,80-1,85 (m, 2H), 1,48 (m, 9H), 1,12 (d,J= 6,4 Hz, 3H).
Síntesis de éster terc-butílico del ácido (S.S)-frans-3-metil-4-r8-oxo-3-(tetrahidro-piran-4-i0-7.8-dihidroimidazoH ■5-alp¡raz¡n-6-¡l1-p¡rrolid¡n-1-carboxíl¡co (S,S)-(44)
Una disolución de (S,S)-43 (1,15 g, 2,41 mmol) en metanol (50 ml) se colocó en un autoclave bajo una atmósfera protectora de N2, y se añadió Pd al 10%/C (0,8 g) bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se hidrogenó con agitación a 45-50°C a 10-15 bar de presión de H<2>hasta que no se absorbió más hidrógeno (24 h. Después de enfriar, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite. El filtrado se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyendo con DCM/CH3OH=100/1-20/1) para proporcionar compuesto 44 (0,97 g, 2,41 mmol) como un sólido. Se determinó que el ee era superior al 99%.
Síntesis de trans-6-(4-met¡l-p¡rrol¡d¡n-3-¡0-3-(tetrah¡dro-p¡ran-4-¡l)-7H-¡m¡dazon .5-alp¡razin-8-ona racémica (45)
A una disolución del compuesto 44 (0,99 g, 2,49 mmol) en CH<2>Cl<2>(20 ml) se añadió una disolución de HCl/Et<2>O (20 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se concentróa vacíopara proporcionar el hidrocloruro del compuestotransracémico 45 (0,75 g, rendimiento 100%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, DMSO-ofe):511,47 (s, 1H), 9,93 (s, 2H), 8,41 (s, 1H), 7,92 (s, 1H), 3,98-3,95 (m, 2H), 3,85-3,80 (m, 1 H), 3,58-3,44 (m, 3H), 2,97-2,88 (m, 2H), 2,60-2,50 (m, 3H), 1,98-1,78 (m, 4H), 1,08 (m, 3H).
Síntesis de (S.S)-fr'ans-6-(4-met¡l-p¡rrol¡d¡n-3-¡0-3-(tetrah¡dro-p¡ran-4-¡0-7H-¡m¡dazoH.5-alp¡raz¡n-8-ona (S.S)-(45)
A una disolución del compuesto (S,S)-44 (800 mg, 2,0 mmol) se añadió una disolución fría (0°C) de HCl en MeOH (1,5 M, 10 ml), y la mezcla de reacción resultante se agitó mientras se dejaba que alcanzara la temperatura ambiente. Después de agitar durante 2 h, la reacción se concentróa vacíopara proporcionar hidrocloruro de (S,S)-45 (0,60 g, 2,0 mmol) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, DMSO-ofe):511,47 (s, 1H), 9,93 (s, 2H), 8,41 (s, 1 H), 7,92 (s, 1H), 3,98-3,95 (m, 2H), 3,85-3,80 (m, 1 H), 3,58-3,44 (m, 3H), 2,97-2,88 (m, 2H), 2,60-2,50 (m, 3H), 1,98-1,78 (m, 4H), 1,08 (m, 3H).
Síntesis de trans-6-(4-metil-1 -p¡r¡m¡d¡n-2-¡lmet¡l-p¡rrol¡d¡n-3-¡l)-3-(tetrah¡dro-p¡ran-4-¡l)-7H-¡m¡dazoU ,5-alpirazin-8-ona racémica (P3)
A una disolución del compuesto 45 (0,75 g, 2,49 mmol), 2-clorometil-pirimidina (0,49 g, 2,99 mmol) en DMF (10 ml) y CH<3>CN (30 ml) se añadió K<2>CO<3>(1,7 g, 12,5 mmol). La mezcla se agitó a 45°C durante 48 horas. La mezcla de reacción se filtró, se concentróa vacío.El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna (elución en gradiente de DCM hasta 15% de MeOH en DCM) para proporcionar el compuestotransracémico P3 (580 mg, rendimiento 59%) como un sólido.
1H RMN (400MHz, CDsOD):58,85 (d,J= 4,8 Hz, 2H), 7,79 (s, 1H), 7,42 (t,J= 4,8 Hz, 1H), 7,36 (s, 1H), 4,11-4,04 (m, 3H), 3,93 (d,J= 15,2 Hz, 1H), 3,684-3,62 (m, 2H), 3,41-3,32 (m, 2H), 3,16-3,13 (m, 1H), 2,85-2,80 (m, 2H), 2,44 2,40 (m, 1H), 2,28-2,23 (m, 1H), 2,04-1,86 (m, 4H), 1,17 (d,J= 6,4 Hz, 3H). MS Calculado: 394,5; MS Encontrado: 395,8 ([M+H]+).
La mezcla racémica de P3 (1,4 g) se separó mediante HPLC quiral (columna: Chiralpak IA, 250 x 4,6 mm x 5um; fase móvil Hex/EtOH/DEA = 70:30:0,2) con un caudal de 1,0 ml/min, para producir el enantiómero 1 de P3 ((3S,4S)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona, o 6-[(3S,4S)-4-metil-1 -(pirimidin-2-ilmetil)pirrolidin-3-il]-3-tetrahidropiran-4-il-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona) (0,52 g, RT= 9,98 min) y el enantiómero 2 de P3 ((3R,4R)-6-(4-metil-1-pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona, opuesto al enantiómero 1 de P3) (0,49 g, RT= 12,6 min).
Síntesis de (S.S)-frans-6-(4-met¡l-1-p¡r¡m¡d¡n-2-¡lmet¡l-p¡rrol¡d¡n-3-¡l)-3-(tetrah¡dro-p¡ran-4-¡l)-7H-¡m¡dazori.5-alpirazin-8-ona (S,S)-(P3)
A una disolución del compuesto (S,S)-45 (0,60 g, 2,0 mmol) y 2-clorometil-pirimidina (0,40 g, 2,40 mmol) en DCM (15 ml) se añadió DIPEA (3,1 g, 24 mmol), y la mezcla se agitó a TA durante 24 h (en este momento todo el material de partida se había convertido). La mezcla de reacción se enfrió hasta 5°C, y se añadió agua desionizada (10 ml). El pH de la fase acuosa se ajustó a pH 6,0 con adición de ácido clorhídrico conc. (alrededor de 1 ml) mientras se mantenía la temperatura de la mezcla < 25°C. Se dejó que las fases se separaran, y la fase orgánica se lavó con salmuera (3 x 5 ml) (estos lavados se descartaron). La fase acuosa se extrajo con diclorometano (10 ml), y la fase orgánica de esta extracción se lavó con salmuera (3 x 5 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio (3 g) durante 1 hora, se filtraron y se evaporaron. El residuo resultante se sometió a cromatografía en columna (como se describió para rac-(P3)) para proporcionar (S,S)-P3 (580 mg, rendimiento 59%) como un sólido después de la evaporación. Este material tiene un ee por encima de 99%, y es idéntico de todas las maneras al enantiómero 1 de P3 (descrito anteriormente).
Síntesis de óx¡do de (am¡nooxQ(d¡fen¡0fosf¡na (B)
A una suspensión de hidrocloruro de hidroxilamina (73,5 g, 1,05 mol) en diclorometano (500 ml) se le añadió DIPEA (136 g, 1,05 mol) durante 15 minutos a - 30°C bajo una atmósfera de nitrógeno. Se formó un precipitado blanco tras la adición. Después de agitar durante una hora a esa temperatura, se añadió una disolución de cloruro difenilfosfínico A (50 g, 0,2 mol) en diclorometano (100 ml) durante 60 minutos. La reacción de la mezcla se calentó hasta 0°C durante 1 hora con agitación. La reacción se paralizó añadiendo agua (200 ml) durante 10 minutos. Después de agitar la mezcla durante 0,5 horas, el precipitado se recogió mediante filtración y se lavó con agua (100 ml x 2). Después, el sólido se secó a presión reducida para proporcionar un producto bruto. El producto bruto se trituró en EtOH para proporcionar el compuesto B (27 g, rendimiento 56%) como un sólido blanco.
1HNMR (400 MHz, CD3OD): 577,91-7,79 (m, 5H), 7,62-7,50 (m, 7H).
MS Calculado: 233; MS Encontrado: 234 ([M+H]+).
Síntesis de éster metílico del ácido 3-am¡no-3H-¡m¡dazol-4-carboxílico (46)
A una disolución del compuesto éster metílico del ácido 3H-imidazol-4-carboxílico 32 (30,0 g, 0,24 mol) en THF (1,0 l) se añadió gota a gota LiHMDS (239 ml, 10M en THF, 2,4 mol) durante 2 horas a -78°C. La mezcla de reacción se agitó entonces a -78°C durante otras dos horas, y se dejó calentar hasta -10°C. El compuesto B (60,0 g, 0,26 mol) se añadió a esta temperatura. Después, la reacción de la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después de paralizar con agua (250 ml), la mezcla de reacción se concentró. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (DCM/MeOH= 20/1) para proporcionar el compuesto 46 (24 g, rendimiento 73%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, DMSO-Ó6):57,82 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 6,20 (s, 2H), 3,79 (s, 3H). MS Calculado: 382; MS Encontrado: 383 ([M+H]+). MS Calculado: 141; MS Encontrado: 142 ([M+H]+).
Síntesis de éster metílico del ácido 3-(2-bencMoxi-acetMamino)-3H-imidazol-4-carboxílico (47)
A una disolución del compuesto 46 (4,9 g, 30 mmol), ácido benciloxi-acético (5,8 g, 30 mmol) y DIPEA (18,6 ml, 90 mmol) en DMF (100 ml) se añadió HATU (15,8 g, 36 mmol) mientras se enfriaba en un baño de agua con hielo. Después, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después de eliminar el disolvente, el residuo se purificó mediante cromatografía en una columna sobre gel de sílice (eluido con PE/EtOAc = 10:1 a 2:1) para proporcionar el compuesto 47 (6,1 g, rendimiento 61%) como un aceite.
1H RMN (400 MHz, CDCl3):59,93 (s a, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,39-7,33 (m, 5H), 4,70 (s, 2H), 4,23 (s, 2H), 3,83 (s, 3H). MS Calculado: 289; MS Encontrado: 300 ([M+H]+).
Síntesis de am¡da del ác¡do 3-(2-benc¡lox¡-acet¡lam¡no)-3H-¡m¡dazol-4-carboxíl¡co (48)
El compuesto 47 (30,0 g, 100 mmol) y amoniaco ac. conc. (300 ml) se combinaron en un tubo sellado, y se calentó hasta 70°C bajo radiación de microondas durante 2 horas. La mezcla resultante se concentró a vacío para proporcionar el compuesto 48 (26,3 g, rendimiento 96%) como un sólido. MS Calculado: 274; MS Encontrado: 275 ([M+h ]+).
Síntesis de 2-benc¡lox¡met¡l-3H-¡m¡dazor5.1-fin.2.41tr¡az¡n-4-ona (49)
A una disolución del compuesto 48 (28,0 g, 100 mmol) en EtOH (240 ml) se añadió gota a gota una disolución de KOH (19,8 g, 300 mmol) en agua (200 ml). La disolución resultante se calentó a reflujo durante 3 horas. Después de eliminar el disolvente orgánico a vacío, la mezcla se vertió en agua con hielo, y el pH se ajustó a 7,0 con disolución de HCI 1 M ac. La suspensión se separó por filtración y se secó para proporcionar el compuesto 49 (11,3 g, rendimiento 44,1%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, DMSO-<0 6>):512,05 (s, 1H), 8,45 (s, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,39-7,29 (m, 5H), 4,59 (s, 2H), 4,36 (s, 2H). MS Calculado: 256; MS Encontrado: 257 ([M+H]+).
Síntesis de 2-benc¡lox¡met¡l-7-vodo-3H-¡m¡dazor5.1-fin.2.41tr¡az¡n-4-ona (50)
A una disolución del compuesto 49 (10,0 g, 38,2 mmol) en THF (240 ml) se añadió gota a gota n-BuLi (46 ml) a -78°C, y la reacción se agitó por debajo de -70°C durante una hora. Se añadió gota a gota yodo (39,3 g, 153 mmol) en THF<( 1 2 0>ml) a esta temperatura, y después la temperatura de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente lentamente. La reacción se paralizó con disolución acuosa saturada de Na<2>SO<3>(120 ml), y entonces se extrajo con EtOAc (150 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na<2>SO<4>, se filtraron, y se concentraron a vacío para obtener el producto bruto. El residuo se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice columna (eluido con PE/EtOAc = 10:1 a 2:1) para proporcionar el compuesto 50 (4,75 g, rendimiento 32,5%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d<6>):512,16 (s a, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,42-7,29 (m, 5H), 4,62 (s, 2H), 4,40 (s, 2H). MS Calculado: 382; MS Encontrado: 383 ([M+H]+).
Síntesis de 2-benc¡lox¡met¡l-7-(3.6-d¡h¡dro-2H-p¡ran-4-¡l)-3H-¡m¡dazor5.1-firi.2.41tr¡az¡n-4-ona (51)
A una disolución del compuesto 50 (4,75 g, 10,0 mmol) en dioxano (80 ml) se añadió gota a gota una disolución de Cs2CO3 (9,88 g, 30 mmol) en agua (12 ml), seguido de Pd(PPh3)4 (2,36 g, 2,00 mmol) y 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-3,6-dihidro-2H-pirano (3,86 g, 18,0 mmol). La mezcla de reacción se desgasificó purgando con N<2>durante 15 min. Después, la mezcla se calentó a reflujo durante 16 horas. Después de eliminar el disolvente a vacío, el residuo se purificó mediante cromatografía en una columna en gel de sílice (eluido con PE/EtOAc = 10:1 a 1:5) para proporcionar el compuesto 51 (2,1 mg, rendimiento 76%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d<6>):512,10 (s a, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,39-7,30 (m, 5H), 7,25 (s, 1H), 4,62 (s, 2H), 4,41 (s, 2H), 4,27 (d,J= 2,8 Hz, 2H), 3,82 (t,J= 5,2 Hz, 2 H), 2,63 (m, 2H). MS Calculado: 338; MS Encontrado: 339 ([M+H]+).
Síntesis de 2-h¡drox¡met¡l-7-(tetrah¡dro-p¡ran-4-¡l)-3H-¡m¡dazor5,1 -fin,2,41tr¡az¡n-4-ona (52)
A una disolución del compuesto 51 (1,8 g, 5,0 mmol) en MeOH (70 ml) se añadió Pd(OH)<2>(al 20% sobre carbono (humedecido con aprox. 50% de agua), 400 mg). El matraz de reacción se cargó con hidrógeno (50 psi), y la mezcla se agitó en un baño de aceite calentado hasta 70°C hasta que LC/MS mostró que el material de partida se había consumido. La suspensión se filtró a través de Celite, el filtro se lavó con MeOH (100 ml x 2), y las fases orgánicas combinadas se concentraron a vacío para proporcionar el compuesto 52 (1,0 g, rendimiento 79%) como un sólido.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d<6>):511,65 (s, 1H), 7,68 (s, 1H), 4,30 (s, 2H), 3,96-3,92 (m, 2H), 3,51-3,17 (m, 3H), 1,88 1,81 (m, 4H) . MS Calculado: 250; MS Encontrado: 251 ([M+H]+).
Síntesis de 2-cloromet¡l-7-(tetrah¡drop¡ran-4-¡l)-3H-¡m¡dazor5.1-firi.2,41tr¡az¡n-4-ona (53)
A una disolución del compuesto 52 (1,0 g, 4 mmol) en CH<2>G<2>(50 ml) se añadió gota a gota SOCl<2>(15 ml) mientras se enfriaba en un baño de agua con hielo. La mezcla resultante se agitó entonces a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró a vacío para proporcionar el compuesto 53 (1,07 g, rendimiento 100%) como un sólido.
<1>H RMN (400 MHz, DMSO-d<6>):512,50 (s a, 1H), 8,02 (s, 1H), 4,57 (s, 2H), 3,95 (m, 2 H), 3,57-3,48 (m, 3H), 1,91 1,81 (m, 4H). MS Calculado: 268; MS Encontrado: 269 ([M+H]+).
Síntesis de éster terc-butíl¡co del ác¡do 3-(4-fluoro-benc¡lox¡)-azet¡d¡n-1-carboxíl¡co (2)
A una disolución del compuesto éster terc-butílico del ácido 3-hidroxi-azetidin-1-carboxílico 1 (5,30 g, 30 mmol) en DMF (60 ml) se añadió NaH (1,80 g, 45 mmol) mientras se enfriaba en un baño de agua con hielo. La suspensión se agitó entonces a esta temperatura durante una hora, seguido de la adición de 1-clorometil-4-fluoro-benceno (8,94 g, 60 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se vertió en agua (200 ml), y se extrajo con EtOAc (150 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na<2>SO<4>, se filtraron, y se concentraron a vacío para obtener el producto bruto. El residuo se purificó mediante cromatografía en una columna de gel de sílice (eluido con PE/EtOAc = 10:1 a 2:1) para proporcionar el compuesto 2 (7,90 g, rendimiento 94%) como un aceite.
1H RMN (300 MHz, DMSO-d<6>):57,41-7,37 (m, 2H), 7,21-7,14 (m, 2H), 4,40 (s, 2H), 4,33-4,29 (m, 1H), 4,02-3,97 (m, 2H), 3,68-3,66 (m, 2H), 1,37 (s, 9H). MS Calcd.: 281; MS Encontrado: 282 ([M+H]+).
A una disolución del compuesto 2 (2,68 g, 9,30 mmol) en dioxano (30 ml) se añadió HCl/dioxano (4 M, 9,25 ml) bajo un baño de agua con hielo. Después, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La disolución de reacción se concentró a vacío para proporcionar el hidrocloruro del compuesto 3 (1,2 g, rendimiento 71%) como un sólido.
1H RMN (300 MHz, DMSO-d<6>):57,36 (m, 2 H), 7,16 (m, 2 H), 4,35 (s, 2H), 4,39 (m, 1 H), 3,47 (t,J= 7,5 Hz, 2 H), 3,38 (t,J= 7,2 Hz, 2 H). MS Calculado: 181; MS Encontrado: 182 ([M+H]+).
Síntesis del compuesto de referencia 2-r3-(4-fluoro-fenox¡)-azet¡d¡n-1-¡lmet¡l1-7-(tetrah¡dro-p¡ran-4-¡l)-3H-¡m¡dazor5,1 -fin ,2,41tr¡az¡n-4-ona (P4)
A una disolución del compuesto 53 (1,27 mg, 4,0 mmol) y el compuesto 3 (1,8 g, 8,3 mmol) en CH<3>CN (20 ml) se añadió DIPEA (2,61 ml, 20 mmol). La disolución resultante se calentó hasta 70°C durante 2 horas. La TLC indicó que la reacción estaba terminada. La reacción se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluido con DCM/MeOH 100:1 a 30:1) para proporcionar el producto deseado P4 (1,23 g, rendimiento 74%) como un sólido.
<1>H RMN (400 MHz, DMSO-d<6>):511,70 (s a, 1H), 7,67 (s, 1 H), 7,37 (m, 2 H), 7,16 (m, 2H), 4,38 (s, 2H), 4,17 (m, 1H), 3,95-3,92 (m, 2H), 3,56 (t,J= 8,0 Hz, 2H), 3,54-3,46 (m, 4H), 3,37-3,35 (m, 1H), 3,06-3,03 (m, 2H), 1,86-1,80 (m, 4H). MS Calculado: 413; MS Encontrado: 414 ([M+H]+).
Ejemplo 2. Estructura cristalina por rayos X del enantiómero 2 de P3 (referencia)
La estructura por rayos X de monocristal del enantiómero 2 de P3 se determinó a 100 K en el sistema ortorrómbico, grupo espacialP2i2i2iusando un cristal cultivado. Existe una molécula de compuesto y una molécula de agua en la unidad asimétrica. El R1 [I>25(I)] final = 3,09%. La estereoquímica absoluta del compuesto es la de la Fig. 1.
Enantiómero 2 del P3 monohidratado
Detalles del instrumento y de la metodología
Se realizaron experimentos de cristalización para obtener cristales adecuados para determinar la estructura y configuración absoluta del enantiómero 2 de P3 por difracción de rayos X de monocristal.
Difracción de rayos X de polvo (XRPD)
Los patrones de difracción de rayos X de polvo se recogieron en un difractómetro Bruker D<8>usando radiación Cu Ka (40 kV, 40 mA), goniómetro 0 - 20, y divergencia de V4 y ranuras receptoras, un monocromato de Ge, y un detector Lynxeye. El rendimiento del instrumento se comprueba usando un patrón certificado de corindón (norma NIST 1976). El software usado para la recogida de datos fue DiffracPlusXRD Commander v2.6.1, y los datos se analizaron y se presentaron usando DiffracPlusEVA v15.0.0.0.
Las muestras se procesaron en condiciones ambientales como muestras de placa plana usando polvo tal como se recibió. La muestra se empaquetó suavemente en una cavidad cortada en una oblea de silicio pulida de fondo cero (510). La muestra se hizo girar en su propio plano durante el análisis. Los detalles de la recogida de datos son: Intervalo angular: 2 a 42° 20; Tamaño de paso: 0,05° 20; Tiempo de recogida: 0,5 s/paso.
Difracción de rayos X de monocristal (SCXRD)
Los datos se recogieron en un difractómetro con detector Atlas CCD de Oxford Diffraction Supernova Dual Source, Cu at Zero, equipado con un dispositivo de enfriamiento Oxford Cryosystems Cobra. Los datos se recogieron usando radiación CuKa. Normalmente, las estructuras se resolvieron usando los programas SHELXS o SHELXD, y se refinaron con el programa SHELXL como parte del paquete Bruker AXS SHELXTL (V6.10). A menos que se indique lo contrario, los átomos de hidrógeno unidos al carbono se colocaron geométricamente y se dejaron refinar con un parámetro de desplazamiento isotrópico de deslizamiento. Los átomos de hidrógeno unidos a un heteroátomo se ubicaron en una síntesis de Fourier diferente y se dejaron refinar libremente con un parámetro de desplazamiento isotrópico.
Microscopía de luz polarizada (PLM)
Las muestras se estudiaron en un microscopio de luz polarizada Nikon SMZ1500 con una cámara de vídeo digital conectada a una unidad de control DS Camera DS-L2 para la captura de imágenes. Se colocó una pequeña cantidad de cada muestra en un portaobjetos de vidrio, se montó en aceite de inmersión, separándose las partículas individuales lo mejor posible. La muestra se observó con el aumento apropiado y luz parcialmente polarizada, acoplada a un filtro de falso color A.
Examen de la cristalización
Una disolución del enantiómero 2 de P3 (5 mg) se sometió a ensayo en sistemas de disolventes seleccionados a 50°C. Las disoluciones se colocaron en el frigorífico a 4°C durante 48 horas. Las suspensiones se filtraron, y las aguas madres resultantes también se colocaron a 4°C. Cualquier cristal obtenido se evaluó mediante microscopía óptica. El material era soluble en la mayoría de los sistemas de disolventes evaluados, con la excepción de acetato de isopropilo y cumeno. Se obtuvieron cristales grandes en forma de prisma a 4°C a partir de una variedad de disolventes, incluyendo acetonitrilo, tetrahidrofurano y 1,4-dioxano. La estructura cristalina del enantiómero 2 de P3 se resolvió usando cristales obtenidos enfriando en acetonitrilo.
Determinación de la estructura de monocristal
Una muestra cristalina del enantiómero 2 de P3 se obtuvo disolviendo 5 mg del material suministrado en 50 gl de acetonitrilo y enfriando a 4°C. Los cristales obtenidos tenían morfología prismática. Se aisló un cristal de tamaño y calidad suficientes para el análisis por difracción de rayos X de monocristal, con dimensiones aproximadas de 0,25 x 0,15 x 0,11 mm. Las micrografías ópticas de los cristales recibidos y del monocristal usado para la recogida de datos se muestran en la Fig. 1.
La estructura se determinó a 100 K en el sistema ortorrómbico, grupo espacialP212121con el R1 (I>25(I)j final = 3,09%. El compuesto se identificó como un monohidrato del enantiómero 2 de P3, como se muestra en la Fig. 1 y la Fig. 3. La unidad asimétrica contiene una molécula completamente ordenada del enantiómero 2 de P3 y una molécula de agua. Los elipsoides de desplazamientos atómicos anisotrópicos para los átomos que no son de hidrógeno se muestran con un nivel de probabilidad del 50%. Los átomos de hidrógeno se muestran con un radio arbitrariamente pequeño.
Para la estereoquímica absoluta del enantiómero 2 de P3 mostrada en la Fig. 1, C12 y C13 (la numeración no son los números usados en los nombres IUPAC) están en la configuración R, el parámetro de Flack = -0,03 (4). Para la estructura invertida con C12 y C13 en la configuración S (enantiómero 1 de P3), el parámetro de Flack = 1,03 (4). La determinación de la estructura absoluta usando estadística bayesiana sobre diferencias de Bijvoet, revela que la probabilidad de que la estructura absoluta tal como se presenta sea correcta es<1>,<0 0 0>, mientras que las probabilidades de que la estructura absoluta sea un gemelo racémico o falsa son ambas 0,000. El equivalente de Flack y su incertidumbre se calculan mediante este programa en -0,02 (4). El cálculo se basó en 1806 pares Bijvoet con una cobertura del<10 0>%.
El análisis conformacional del enantiómero 2 de P3 muestra que el anillo de pirimidina es plano, el anillo de pirrolidina es una envoltura sobre el nitrógeno, y el anillo de tetrahidropirano es una silla.
Como el opuesto del enantiómero 2 de P3, el enantiómero 1 de P3 tiene una estructura de:
Ejemplo 3. PRUEBAS IN VITRO
Ensayo de inhibición de PDE9
Un ensayo de PDE9 se puede realizar, por ejemplo, de la forma siguiente: El ensayo se realiza en muestras de 60 ul que contienen una cantidad fija de la enzima PDE relevante (suficiente para convertir el 20-25% del sustrato de nucleótidos cíclicos), un amortiguador (HEPES 50 mM 7,6; MgCl<2>10 mM., Tween20 al 0,02%), BSA 0,1 mg/ml, 225 pCi de sustrato de nucleótidos cíclicos marcados con 3H, AMPc marcado con tritio hasta una concentración final de 5 nM, y cantidades variables de inhibidores. Las reacciones se inician mediante adición del sustrato de nucleótidos cíclicos, y se deja que las reacciones transcurran durante una hora a temperatura ambiente antes de terminarlas mezclándolas con 15 ul de perlas SPA de silicato de itrio 8 mg/ml (Amersham). Las perlas se dejan reposar durante una hora en la oscuridad antes de realizar el recuento de las placas en un contador Wallac 1450 Microbeta. La señal medida puede convertirse en actividad con respecto a un control no inhibido (100%), y los valores de IC<50>se pueden calcular usando la extensión Xlfit para EXCEL.
En el contexto de la presente invención, el ensayo se realiza en 60 ul de amortiguador de ensayo (HEPES 50 mM pH 7,6; MgCl<2>10 mM, Tween20 al 0,02%) que contiene suficiente PDE9 para convertir el 20-25% de 3H-AMPc 10 nM, y cantidades variables de inhibidores. Tras 1 hora de incubación, las reacciones se terminaron mediante adición de 15 ul de perlas SPA de silicato de itrio 8 mg/ml (Amersham). Se dejaron reposar las perlas durante una hora en la oscuridad antes de realizar el recuento de las placas en un contador Wallac 1450 Microbeta. Los valores de IC<50>se calcularon mediante regresión no lineal usando XLfit (IDBS).
Los resultados de los experimentos mostraron que los compuestos de la invención sometidos a prueba inhiben la enzima PDE9 con valores de IC<50>por debajo de 100 nM.
Ensayo de inhibición de PDE1
Se realizaron ensayos de PDE1 de la siguiente manera: los ensayos se realizaron en muestras de 60 pl que contenían una cantidad fija de la enzima1 PDE1 (suficiente para convertir el 20-25% del sustrato de nucleótido cíclico), un amortiguador (HEPES 50 mM pH 7,6; MgCl<2>10 mM, Tween20 al 0,02%), BSA 0,1 mg/ml, AMPc marcado con tritio 15 nM, y cantidades variables de inhibidores. Las reacciones se iniciaron mediante adición del sustrato de nucleótido cíclico, y las reacciones se dejaron transcurrir durante 1 h a temperatura ambiente antes de terminarlas mediante mezclamiento con perlas SPA de silicato de itrio (PerkinElmer) de 20 pl (0,2 mg). Las perlas se dejaron sedimentar durante 1 h en la oscuridad antes de contar las placas en un contador Wallac 1450 Microbeta.
Las señales medidas se convirtieron en actividad con respecto a un control no inhibido (100%), y los valores de IC<50>se calcularon usando XIFit (modelo 205, IDBS).
Ejemplo 4. PRUEBAS IN VIVO
Penetración de la barrera hematoencefálica
Ratones CD machos (20-24 g) se alojaron por parejas con acceso libre a comida y agua durante un periodo de aclimatación de 3-7 días antes del inicio de los experimentos. Antes de la dosificación, los animales se mantuvieron en ayunas durante la noche. Durante las pruebas, los ratones se mantuvieron en jaulas individuales. La distribución en cerebro con respecto a plasma se evaluó 30 minutos y 2 horas después de la administración subcutánea del compuesto de prueba a una dosis de 10 mg/kg (n=3 en cada punto de tiempo). El volumen de la dosis fue 10 ml/kg, usando vehículo apropiado para solubilizar cada compuesto de prueba. En el momento de la toma de muestras, los animales se anestesiaron con isoflurano, y se extrajo una muestra de sangre sistémica mediante punción cardíaca en recipientes al vacío que contenían heparina de sodio como anticoagulante. La sangre se centrifugó a 3500 rpm durante 10 minutos a 4°C para obtener plasma. Después de la decapitación, los cerebros se disecaron y se transfirieron a recipientes previamente pesados, seguido de la determinación del peso de los tejidos. El plasma y los cerebros se almacenaron a -80°C hasta el bioanálisis cuantitativo mediante LC-MS/MS. Los resultados se expresan como ng/ml para las muestras de plasma, y ng/g para las muestras de cerebro.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica oral que comprende el compuesto (3S,4S)-6-(4-metil-1-pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidro-piran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona y uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables, en la que el compuesto está presente en la composición desde 0,01 mg hasta 1000 mg por dosis.
2. La composición farmacéutica oral de la reivindicación 1, en la que el compuesto está presente en la composición de 0,05 mg a 500 mg por dosis.
3. La composición farmacéutica oral de la reivindicación 1, en la que el compuesto está presente en la composición de 0,05 a 200 mg por dosis.
4. La composición farmacéutica oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso en el tratamiento de la anemia drepanocítica.
5. La composición farmacéutica oral de la reivindicación 4 para uso según la reivindicación 4, en la que el compuesto se administra a un paciente en una a tres dosis por día.
6. Un compuesto (3S,4S)-6-(4-metil-1 -pirimidin-2-ilmetil-pirrolidin-3-il)-3-(tetrahidropiran-4-il)-7H-imidazo[1,5-a]pirazin-8-ona para uso en el tratamiento de la anemia drepanocítica, en el que el compuesto se administra por vía oral a un paciente que lo necesita desde 0,001 mg/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal por día.
7. El compuesto para uso según la reivindicación 6, en el que el compuesto se administra al paciente de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal por día.
8. El compuesto para uso según la reivindicación 6, en el que el compuesto se administra al paciente de 0,05 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal por día.
9. El compuesto para uso según las reivindicaciones 6 a 8, en el que el compuesto se administra al paciente en una a tres dosis por día.
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