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CN114903900A - 用于治疗外周疾病的pde9抑制剂 - Google Patents

用于治疗外周疾病的pde9抑制剂 Download PDF

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CN114903900A
CN114903900A CN202210219655.2A CN202210219655A CN114903900A CN 114903900 A CN114903900 A CN 114903900A CN 202210219655 A CN202210219655 A CN 202210219655A CN 114903900 A CN114903900 A CN 114903900A
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aryl
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CN202210219655.2A
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N·斯文斯特鲁普
A·I·帕拉基科瓦
J·麦克阿瑟
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H Lundbeck AS
Enliven Therapeutics Inc
Original Assignee
H Lundbeck AS
Imara Inc
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Abstract

本发明涉及PDE9抑制剂、其合成及其用于治疗良性前列腺增生、β地中海贫血和镰状细胞疾病的用途。

Description

用于治疗外周疾病的PDE9抑制剂
本申请是申请日为2017年6月30日、申请号为201780039133.1、发明名称为“用于治疗外周疾病的PDE9抑制剂”的申请的分案申请。
相关申请的引用
本申请要求2016年7月6日提交的美国临时申请号62/359,080和2017年1月20日提交的美国临时申请号62/448,414的优先权，其每一篇的内容通过引用的方式以其整体并入本文。
发明领域
本发明涉及环单磷酸鸟苷(cGMP)特异性9型磷酸二酯酶抑制剂(下文称为PDE9抑制剂)。
发明背景
磷酸二酯酶(PDE)是降解环核苷酸并因此调节遍及整个身体的第二信使的细胞水平的酶家族。PDE代表有吸引力的药物靶标，这已分别被进入临床试验和市场的多个化合物所证明。PDE由21个基因编码，这些基因在功能上被分成11个家族，这些家族在动力学性质、底物选择性、表达、定位模式、激活、调节因子和抑制剂敏感性方面有所不同。PDE的功能是降解环单磷酸核苷、环单磷酸腺苷(cAMP)和/或环单磷酸鸟苷(cGMP)，它们是参与众多至关重要的过程(包括控制神经传递和平滑肌收缩和舒张)的重要细胞内调质。
PDE9是cGMP特异性(cAMP的Km是cGMP的1000多倍)，并且已被假设为调整cGMP水平的关键物质，因为在这一核苷酸的PDE之间其具有最低的Km。PDE9在整个脑部以低水平表达，具有调整基底cGMP的潜能。
在外周，PDE9表达在前列腺、肠、肾和造血细胞中最高，能够在各种非CNS适应症中发挥治疗潜力。
良性前列腺增生(Benign prostate hyperplasia，BPH)是老年男性群体最常见的状况之一，并代表了主要的健康问题(Ueckert S et al.,Expert Rev ClinPharmacol.2013May；6(3):323-32)。BPH导致在前列腺的尿道周区域形成大的结节，这可导致尿路梗阻。BPH主要是基质增殖过程的结果，并且前列腺增大的重要成因是由平滑肌增殖造成的。目前对BPH的药物治疗包括α1肾上腺素能阻滞剂、5-α-还原酶抑制剂，以及最近的PDE5抑制剂他达拉非(tadalafil)。已知PDE5抑制剂经由增加的cGMP水平来介导平滑肌松弛。cGMP特异性PDE9在前列腺中以高水平表达，并且PDE9抑制因此可以对BPH提供潜在的抗增殖益处。
PDE9广泛分布在人下尿路的尿路上皮中，并且PDE9抑制在下尿路功能障碍上皮(lower urinary tract dysfunctional epithelium，LUDE)疾病中可能是有益的(Nagasaki et al.,BJU Int.2012Mar；109(6):934-40)。功能障碍的下尿路上皮能影响女性的膀胱、尿道、阴唇或阴道口以及男性的前列腺管和尿道(Parsons LC et al.,2002)。
已表明在鼠科动物的阴茎海绵体中存在PDE9的表达，并且已证明长期PDE9抑制导致放大的NO-cGMP介导的海绵体响应并因此开放了在勃起功能障碍中的潜在益处(DaSilvaet al.,Int J Impot Res.2013 Mar-Apr；25(2):69-73)。目前经批准的用于勃起功能障碍的治疗是PDE5抑制剂类型，增加在供应阴茎的阴茎海绵体的血管内层的平滑肌细胞中的cGMP。
已表明cGMP PDE抑制增强肌肉微脉管血液流动和对胰岛素的葡萄糖摄入响应(Genders et al.,Am J Physiol Endocrinol Metab.2011 Aug；301(2):E342-50)。靶向在肌肉和血管中表达的cGMP特异性PDE9可以为增强肌肉胰岛素敏感性提供有前景的途径，并因此有益于治疗2型糖尿病。
PDE9抑制可以代表对镰状细胞疾病(Sickle Cell Disease，SCD)(一种遗传病症，导致血管闭塞性过程，引起许多SCD患者死亡)的新型一线治疗。SCD疾病因血红蛋白(HBB)基因中的点突变产生异常的镰状血红蛋白(HbS)而引起的，该镰状血红蛋白聚合并形成僵硬且粘性的镰状红细胞。镰状红细胞导致慢性炎症、增多的细胞粘附、氧化应激和内皮功能障碍，在血管闭塞性过程中达到顶峰。
迄今为止尚不能治愈SCD。治疗选择包括输血和用抗癌剂羟基脲治疗。输血通过增加循环中正常的、非镰状红细胞的数量来矫正贫血。定期输血的疗法能帮助高风险的儿童预防中风复发。羟基脲(HU)已被批准用于治疗SCD并显示降低疼痛危象和住院治疗的频率。HU改善SCD症状的假说机理是双重的：a)增加非镰状胎血红蛋白的生产；和b)减少细胞粘附。具体地说，HU a)经由cGMP信号传导增加非镰状胎血红蛋白的生产，已表明这导致增加的红细胞存活；和b)增加氧化氮和cGMP水平，从而减少粘附并增加存活。总的来说，迄今为止的证据支持以下观点：羟基脲对SCD具有益处的两种机理都是经由增加的cGMP介导的。
不幸的是，HU的耐受性通常很差，并且其广泛使用受到以下限制：对于其对生育和繁殖的潜在影响的担忧；其血液毒性引起的实现和维持有效剂量的挑战；和每月监测的要求(Heeney et al.,Pediatr Clin North Am.,55(2):483-501(2008))。事实上，估计每4名成年患者只有1名(甚至可能更少)用该药物治疗(Stettler et al.,JAMA.,313:1671-2(2015))。此外，由于这些挑战，许多患者被给予亚有效剂量的HU。因此，迫切需要能够全面安全地用于预防所有年龄的患者的SCD疾病并发症的新型、安全和有效的治疗。
此外，PDE9抑制剂可以用于治疗地中海贫血病症，例如β地中海贫血，一组遗传性血液病，导致血红蛋白β链的合成很少或没有。β地中海贫血的症状包括贫血、身体许多部位缺氧、肺动脉高压、血栓形成事件、感染、内分泌功能障碍和腿部溃疡。常规疗法包括定期输注红细胞。然而，重复的输送导致铁过载和许多副作用(de Dreuzy et al.,Biomed J.,vol.39(1):24-38(2016))。非常需要新的疗法。
WO 2012/040230公开了具有咪唑并三嗪酮骨架的PDE9抑制剂，用作药物治疗PDE9相关疾病，包括CNS和神经退行性病症。
WO 2008/139293和WO 2010/084438均公开了为PDE9抑制剂的氨基-杂环化合物及其用于治疗神经退行性病症和认知障碍的用途。
发明概述
对于外周疾病良性前列腺增生(BPH)、尿路功能障碍上皮疾病、勃起功能障碍、2型糖尿病、β地中海贫血和镰状细胞疾病(SCD)的改进治疗具有持续的需求，就此目的而言，使用PDE9抑制剂可能是非常有用的。因为PDE9在整个脑部在具有潜在的基底cGMP处表达，并因此信号传导级联显示调节突触传导，用于治疗外周疾病的PDE9抑制剂具有低血脑屏障穿透作用(BBB穿透作用)以避免潜在的中枢介导的副作用是重要的。
本发明提供了新型PDE9抑制剂，已表明其具有低血脑屏障穿透作用并因此可以特别用于治疗外周疾病，如良性前列腺增生(BPH)、尿路功能障碍上皮疾病、勃起功能障碍、2型糖尿病和镰状细胞疾病(SCD)。而且，本发明的PDE9抑制剂相比于PDE1抑制剂，是显著更强的PDE9抑制剂。这种PDE抑制选择性是重要的，因为PDE1在心脏和睾丸中表达，并且对这些PDE1同种型的抑制被认为是心血管和生殖系统副作用的潜在原因。
一方面，本发明提供了一种增加受试者的细胞或血浆中的环单磷酸鸟苷(cGMP)水平的方法，包括施用具有咪唑并吡嗪酮骨架或咪唑并三嗪酮骨架的9型磷酸二酯酶(PDE9)抑制剂。
在上述方法的一个实施方案中，所述cGMP水平增加了至少约50％、约100％、约150％、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍或约25倍。
另一方面，本发明提供了一种增加受试者的胎血红蛋白(HbF)阳性细胞数的方法，包括施用具有咪唑并吡嗪酮骨架或咪唑并三嗪酮骨架的PDE9抑制剂。
在上述方法的一个实施方案中，所述HbF阳性红细胞数增加了至少约50％、约100％、约150％、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍或约25倍。
另一方面，本发明提供了一种降低受试者的镰状红细胞百分比(镰状RBC％)、瘀滞百分比(瘀滞％)、总胆红素或总白细胞计数的方法，包括施用具有咪唑并吡嗪酮骨架或咪唑并三嗪酮骨架的PDE9抑制剂。
在上述方法的一个实施方案中，镰状RBC％、瘀滞％、总胆红素或总白细胞计数减少了至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或约70％。
另一方面，本发明提供了一种降低受试者的白细胞增多或中性粒细胞水平的方法，包括施用具有咪唑并吡嗪酮骨架或咪唑并三嗪酮骨架的PDE9抑制剂。
在上述方法的一个实施方案中，所述中性粒细胞水平降低了至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或约70％。
另一方面，本发明提供了一种降低受试者的中性粒细胞与内皮细胞结合的方法，包括施用具有咪唑并吡嗪酮骨架或咪唑并三嗪酮骨架的PDE9抑制剂。
另一方面，本发明提供了一种治疗受试者的β地中海贫血的方法，包括施用具有咪唑并吡嗪酮骨架或咪唑并三嗪酮骨架的PDE9抑制剂。
在前述所有方面的方法的一个实施方案中，受试者患有镰状细胞疾病。
在前述所有方面的方法的一个实施方案中，PDE9抑制剂对于三种PDE9同种型中的任一种的IC50为小于约400nM、小于约300nM、小于约200nM、小于约100nM、小于约80nM、小于约50nM或小于约25nM。
在前述所有方面的方法的一个实施方案中，PDE9抑制剂没有血脑屏障穿透或具有低血脑屏障穿透。
在进一步的一个实施方案中，PDE9抑制剂的脑/血浆比可以小于约0.50、约0.40、约0.30、约0.20、约0.10、约0.05、约0.04、约0.03、约0.02或约0.01。
在进一步的一个实施方案中，在施用PDE9抑制剂后30分钟或120分钟测量PDE9抑制剂的脑/血浆比。
在前述所有方面的方法的一个实施方案中，所述方法还包括施用至少一种其他活性剂。
在一个实施方案中，PDE9抑制剂和其他活性剂同时或顺序施用。
在一个实施方案中，其他活性剂是羟基脲(HU)。
在一个实施方案中，PDE9抑制剂与HU之间的比率在1:500至500:1之间，在1:100至100:1之间，在1:50至50:1之间，在1:20至20:1之间，在1:5到5:1之间，或为1:1。
在前述所有方面的方法的一个实施方案中，具有咪唑并吡嗪酮骨架的PDE9抑制剂具有式(I)的结构：
Figure BDA0003536571230000051
其中R2与R1或R3成环，
其中R1、R2和R3为：
R1当与R2成环时为
Figure BDA0003536571230000061
其中R7选自H、-CH3、-C2H5和-C3H7，
其中*表示成环点，以及
R1当不成环时选自：
H和
Figure BDA0003536571230000062
其中R7选自H、-CH3、-C2H5和-C3H7，
R2是选自以下的化合物：
Figure BDA0003536571230000063
和
Figure BDA0003536571230000064
其中R8和R12独立地选自H、-CH3、-C2H5和–C3H7
其中*表示成环点，以及
R3当与R2成环时为：
Figure BDA0003536571230000065
其中*表示成环点，且
其中R9选自H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、支链的C3-C6烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、C6-C10芳基、取代的C6-C10芳基、C3-C9杂芳基、取代的C3-C9杂芳基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、支链的C3-C6烷氧基、C3-C6环烷氧基、取代的C3-C6环烷氧基、C6-C10芳氧基、取代的C6-C10芳氧基、C3-C9杂芳氧基、取代的C3-C9杂芳氧基；以及
R3当不成环时为：
Figure BDA0003536571230000066
其中
R10选自H、-CH3和-C2H5；且
R11选自C6-C10芳基、取代的C6-C10芳基、C3-C9杂芳基、取代的C3-C9杂芳基；
R4选自氢、-CH3、-C2H5、-C3H7、-CF3、-CN、F和Cl；
R5选自C6-C10芳基、取代的C6-C10芳基、C3-C9杂芳基、取代的C3-C9杂芳基、C3-C6杂环基、取代的C3-C6杂环基、C3-C6环烷基和取代的C3-C6环烷基；
R6选自氢、F、Cl、CN、-CH3、-C2H5、-C3H7和-CF3；
A不存在或为-CH2-。
在一个实施方案中，所述化合物选自：
Figure BDA0003536571230000071
(化合物P1)，
Figure BDA0003536571230000072
(化合物P2)，和
Figure BDA0003536571230000073
(化合物P3)，为外消旋形式和对映异构体富集或纯形式。
在一个实施方案中，PDE9抑制剂是化合物P3的对映异构体。
在一个实施方案中，PDE9抑制剂是6-[(3S,4S)-4-甲基-1-(嘧啶-2-基甲基)吡咯烷-3-基]-3-四氢吡喃-4-基-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(化合物P3.1)。
在前述所有方面的方法的一个实施方案中，具有咪唑并三嗪酮骨架的PDE9抑制剂具有式(II)的结构：
Figure BDA0003536571230000081
其中R2与R1或R3成环，
其中R1、R2和R3为：
R1当与R2成环时为
Figure BDA0003536571230000082
其中R6选自H、-CH3、-C2H5和-C3H7，
其中*表示成环点，以及
R1当不成环时选自：
H和
Figure BDA0003536571230000083
其中R6选自H、-CH3、-C2H5和-C3H7，
R2是选自以下的化合物：
Figure BDA0003536571230000084
和
Figure BDA0003536571230000085
其中R7和R11独立地选自H、-CH3、-C2H5和–C3H7
其中*表示成环点，以及
R3当与R2成环时为：
Figure BDA0003536571230000086
其中*表示成环点，且
其中R8选自H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、支链的C3-C6烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、C6-C10芳基、取代的C6-C10芳基、C3-C9杂芳基、取代的C3-C9杂芳基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、支链的C3-C6烷氧基、C3-C6环烷氧基、取代的C3-C6环烷氧基、C6-C10芳氧基、取代的C6-C10芳氧基、C3-C9杂芳氧基、取代的C3-C9杂芳氧基；且
R3当不成环时为：
Figure BDA0003536571230000091
其中
R9选自H、-CH3和-C2H5；且
R10选自C6-C10芳基、取代的C6-C10芳基、C3-C9杂芳基、取代的C3-C9杂芳基；
R4选自C6-C10芳基、取代的C6-C10芳基、C3-C9杂芳基、取代的C3-C9杂芳基、C3-C6杂环基、取代的C3-C6杂环基、C3-C6环烷基和取代的C3-C6环烷基；
R5选自氢、F、Cl、CN、-CH3、-C2H5、-C3H7和-CF3；
A不存在或为-CH2-。
在一个实施方案中，PDE9抑制剂是
Figure BDA0003536571230000092
(化合物P4)。
在前述所有方面的方法的一个实施方案中，口服施用PDE9抑制剂。
在前述所有方面的方法的一个实施方案中，每日施用PDE9抑制剂。
在前述所有方面的方法的一个实施方案中，以约0.3mg/kg至约500mg/kg施用PDE9抑制剂。
在一个实施方案中，以约0.3mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约30mg/kg、约50mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg或约250mg/kg施用PDE9抑制剂。
在前述所有方面的方法的一个实施方案中，施用PDE9抑制剂1至7天。
在前述所有方面的方法的一个实施方案中，施用PDE9抑制剂至少7天。
本发明涵盖以下化合物：
Figure BDA0003536571230000101
化合物(P1)
Figure BDA0003536571230000102
化合物(P2)
Figure BDA0003536571230000103
化合物(P3)、化合物P3的外消旋物和对映异构体纯变体，
Figure BDA0003536571230000104
化合物(P4)
本发明的另一方面涉及P1、P2、P3和P4的合成。本发明的又一方面涉及化合物P3的对映选择合成，包括中间体化合物rac-35至(S,S)-35的转化。
本发明的另一方面包括使用本发明的PDE9抑制剂例如治疗β地中海贫血和/或镰状细胞疾病的方法。
附图简要说明
图1是证明本发明的PDE9抑制剂和羟基脲(HU)通过不同机制起作用的图。缩写：cGMP＝环单磷酸鸟苷；GMP＝单磷酸鸟苷；GTP＝鸟苷-5'-三磷酸酯；HbF＝胎血红蛋白；NO＝一氧化氮；PKG＝蛋白激酶G；PDE9＝磷酸二酯酶9；RBC＝红细胞；WBC＝白细胞。它是根据Almeida et al.,Blood,vol.120(14):2879(2012)修改的。
图2是显示在K562细胞中，化合物P3.1 vs.羟基脲对cGMP浓度的影响的图。缩写：cGMP＝环单磷酸鸟苷；SD＝标准差。
图3是显示化合物P3.1 vs.羟基脲对HbF阳性K562细胞百分比的影响的图。缩写：HbF＝胎血红蛋白；SD＝标准差。
图4是显示在来自SCD受试者的CD34+来源的红细胞中，化合物P3.1 vs.羟基脲对HbF产生的影响的图。缩写：HbF＝胎血红蛋白；MFI＝平均荧光强度。
图5A是显示在Berkeley镰状细胞转基因小鼠中，化合物P3.1 vs.羟基脲对HbF阳性和镰状红细胞的百分比的影响的图。缩写：HbF＝胎血红蛋白；RBC＝红细胞；SD＝标准差。
图5B是显示在Berkeley镰状细胞转基因小鼠中，化合物P3.1和羟基脲对中性粒细胞水平的影响的图。
图5C是显示通过溶媒、化合物P3.1或HU处理的Berkeley镰状细胞转基因小鼠的脾重量的图。
图5D是显示通过溶媒、化合物P3.1或HU处理的Berkeley镰状细胞转基因小鼠的胆红素水平。
图6是显示在HbSS-Townes小鼠中，化合物P3.1 vs.羟基脲vs.化合物P3.1与羟基脲的组合对微脉管瘀滞的影响的图。缩写：SD＝标准差；瘀滞％＝再氧合后1小时和4小时计数的静态(无流动)小静脉的数量除以在缺氧之前选择用于分析的流动小静脉的数量乘以100。
图7A是显示在HbSS-Townes小鼠中，化合物P3.1 vs.羟基脲vs.化合物P3.1与羟基脲的组合对HbF阳性和镰状红细胞的百分比的影响的图。缩写：HbF＝胎血红蛋白；RBC＝红细胞；SD＝标准差。
图7B是显示在化合物P3.1、HU或化合物P3.1与HU的组合处理后，HbSS-Townes小鼠中的闭塞血管％的图。
图8A和图8B是显示在C57Bl/6J小鼠的脑和眼中，化合物P3.1 vs.AF27873的浓度的图。缩写：Conc.＝浓度。
图9A和图9B是显示化合物P3.1降低中性粒细胞对TNF-α活化的人内皮细胞的粘附的微通道测定的结果。
图10A、10B和10C是显示化合物P3.1降低中性粒细胞和RBC对TNF-α活化的人内皮细胞的粘附的另一微通道测定的结果。
发明详述
I.本发明的化合物
本发明的一个方面提供了可以用于治疗镰状细胞疾病(SCD)的PDE9抑制化合物或PDE9抑制剂。已显示本发明的PDE9抑制剂具有低血脑屏障穿透，因此可以特别用于治疗外周疾病，如良性前列腺增生(BPH)、尿路功能障碍上皮疾病、勃起功能障碍、2型糖尿病和镰状细胞疾病(SCD)。此外，本发明的PDE9抑制剂相比于PDE1抑制剂，是显著更强的PDE9抑制剂。这种PDE抑制选择性是重要的，因为PDE1在心脏和睾丸中表达，并且对这些PDE1同种型的抑制被认为是心血管和生殖系统副作用的潜在原因。
PDE9抑制剂
在本发明的上下文中，如果达到三种PDE9同种型任一种的IC50水平所需的量为10微摩尔或更少，优选少于9微摩尔，如8微摩尔或更少，如7微摩尔或更少，如6微摩尔或更少，如5微摩尔或更少，如4微摩尔或更少，如3微摩尔或更少，更优选2微摩尔或更少，如1微摩尔或更少，特别是500nM或更少，则化合物被认为是PDE9抑制剂。在优选的实施方式中，达到PDE9的IC50水平所需的PDE9抑制剂的所需量为400nM或更少，如300nM或更少，200nM或更少，100nM或更少，或甚至80nM或更少，如50nM或更少，例如25nM或更少。
在本申请的全文中，符号IC50和IC50可互换使用。
在一些实施方式中，本发明的PDE9抑制剂具有低血脑屏障穿透或没有血脑屏障穿透。例如，本发明的PDE9抑制剂在脑中的浓度与其在血浆中的浓度的比率(脑/血浆比)可以小于约0.50、约0.40、约0.30、约0.20、约0.10、约0.05、约0.04、约0.03、约0.02或约0.01。可以在施用PDE9抑制剂后30分钟或120分钟测量脑/血浆比。
异构形式
当本发明的化合物含有一个或多个手性中心时，除非另有规定，对任何化合物的提及将涵盖对映异构体纯或非对映异构体纯的化合物以及以任何比率存在的对映异构体或非对映异构体的混合物。
在一个实施方式中，用于治疗镰状细胞疾病的本发明的PDE9抑制化合物包含咪唑并吡嗪酮骨架。它们可以具有结构(I)(也称为式(I)的化合物)，及其互变异构体和药学上接受的酸加成盐及其多晶型物
Figure BDA0003536571230000131
其中R2与R1或R3成环，
其中R1、R2和R3为：
R1当与R2成环时为
Figure BDA0003536571230000132
其中R7选自H、-CH3、-C2H5和-C3H7，
其中*表示成环点，以及
R1当不成环时选自：
H和
Figure BDA0003536571230000133
其中R7选自H、-CH3、-C2H5和-C3H7，
R2是选自以下的化合物：
Figure BDA0003536571230000134
和
Figure BDA0003536571230000135
其中R8和R12独立地选自H、-CH3、-C2H5和–C3H7
其中*表示成环点，以及
R3当与R2成环时为：
Figure BDA0003536571230000141
其中*表示成环点，且
其中R9选自H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、支链的C3-C6烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、C6-C10芳基、取代的C6-C10芳基、C3-C9杂芳基、取代的C3-C9杂芳基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、支链的C3-C6烷氧基、C3-C6环烷氧基、取代的C3-C6环烷氧基、C6-C10芳氧基、取代的C6-C10芳氧基、C3-C9杂芳氧基、取代的C3-C9杂芳氧基；以及
R3当不成环时为：
Figure BDA0003536571230000142
其中
R10选自H、-CH3和-C2H5；且
R11选自C6-C10芳基、取代的C6-C10芳基、C3-C9杂芳基、取代的C3-C9杂芳基；
R4选自氢、-CH3、-C2H5、-C3H7、-CF3、-CN、F和Cl；
R5选自C6-C10芳基、取代的C6-C10芳基、C3-C9杂芳基、取代的C3-C9杂芳基、C3-C6杂环基、取代的C3-C6杂环基、C3-C6环烷基和取代的C3-C6环烷基；
R6选自氢、F、Cl、CN、-CH3、-C2H5、-C3H7和-CF3；
A不存在或为-CH2-。
式(I)的PDE9抑制化合物的非限制性实例公开在WO 2013/053690中，其内容通过引用的方式以其整体并入本文。
例如，具有咪唑并吡嗪酮骨架的PDE9抑制剂可以选自：
Figure BDA0003536571230000143
(化合物P1)，
Figure BDA0003536571230000151
(化合物P2)，和
Figure BDA0003536571230000152
(化合物P3)，为外消旋形式和对映异构体富集或纯形式。
在另一个实施方式中，用于治疗镰状细胞疾病的本发明的PDE9抑制化合物包含咪唑并三嗪酮骨架。它们可以具有结构(II)(也称为式(II)化合物)，及其互变异构体和药学上接受的酸加成盐及其多晶型物
Figure BDA0003536571230000153
其中R2与R1或R3成环，
其中R1、R2和R3为：
R1当与R2成环时为
Figure BDA0003536571230000154
其中R6选自H、-CH3、-C2H5和-C3H7，
其中*表示成环点，以及
R1当不成环时选自：
H和
Figure BDA0003536571230000161
其中R6选自H、-CH3、-C2H5和-C3H7，
R2是选自以下的化合物：
Figure BDA0003536571230000162
和
Figure BDA0003536571230000163
其中R7和R11独立地选自H、-CH3、-C2H5和–C3H7
其中*表示成环点，以及
R3当与R2成环时为：
Figure BDA0003536571230000164
其中*表示成环点，且
其中R8选自H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、支链的C3-C6烷基、C3-C6环烷基、取代的C3-C6环烷基、C6-C10芳基、取代的C6-C10芳基、C3-C9杂芳基、取代的C3-C9杂芳基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、支链的C3-C6烷氧基、C3-C6环烷氧基、取代的C3-C6环烷氧基、C6-C10芳氧基、取代的C6-C10芳氧基、C3-C9杂芳氧基、取代的C3-C9杂芳氧基；且
R3当不成环时为：
Figure BDA0003536571230000165
其中
R9选自H、-CH3和-C2H5；且
R10选自C6-C10芳基、取代的C6-C10芳基、C3-C9杂芳基、取代的C3-C9杂芳基；
R4选自C6-C10芳基、取代的C6-C10芳基、C3-C9杂芳基、取代的C3-C9杂芳基、C3-C6杂环基、取代的C3-C6杂环基、C3-C6环烷基和取代的C3-C6环烷基；
R5选自氢、F、Cl、CN、-CH3、-C2H5、-C3H7和-CF3；
A不存在或为-CH2-。
式(II)的PDE9抑制剂的非限制性实例公开在WO 2013/110768中，其内容通过引用的方式以其整体并入本文。
例如，具有咪唑并三嗪酮骨架的PDE9抑制剂可以是
Figure BDA0003536571230000171
(化合物P4)。
本发明的非限制性实施方式
使用下列符号：本发明的实施方式被描述为Ei，其中i是表示实施方式编号的整数。详细说明先前列出的实施方式Ei的具体实施方式的实施方式Ei’被描述为Ei’(Ei)，例如E2(E1)表示“在实施方式E1的实施方式E2中”。
当一个实施方式是两个实施方式的组合时，符号类似地为Ei”(Ei和Ei’)，例如E3(E2和E1)表示“在E2和E1任一实施方式的实施方式E3中”。
当一个实施方式是多于两个实施方式的组合时，符号类似地为Ei”’(Ei、Ei’和Ei”)，例如E4(E1、E2和E3)表示“在E1、E2和E3任一实施方式的实施方式E4中”。
本发明的实施方式包括但不限于以下实施方式。
在第一实施方式E1中，本发明涉及具有以下结构的化合物：
Figure BDA0003536571230000172
(化合物P1)，
Figure BDA0003536571230000181
(化合物P2)，和
Figure BDA0003536571230000182
(化合物P3)，为外消旋形式和对映异构体富集或纯形式。
在实施方式E2(E1)中，当通过手性HPLC(柱：Chiralpak IA,250x 4.6mm x 5um；流动相：Hex/EtOH/DEA＝70:30:0.2；流速为1.0mL/min)分离P3的外消旋混合物时，化合物P3的对映异构体纯变体是第一洗脱(eluding)化合物(P3对映异构体1)。
E3(E1和E2)：E1和E2任一实施方式的化合物，用作药物。
E4：E1和E2任一实施方式的化合物或以下化合物，用于治疗良性前列腺增生或镰状细胞疾病：
Figure BDA0003536571230000183
(化合物P4)。
E5：一种药物组合物，其包含治疗有效量的E1和E2的任何化合物或化合物P4，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
E6(E5)：该药物用于治疗良性前列腺增生或镰状细胞疾病。
E7：化合物P4或E1和E2的任何化合物用于制备用于治疗良性前列腺增生或镰状细胞疾病的药物的用途。
E8：一种治疗患有良性前列腺增生或镰状细胞疾病的受试者的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的化合物P4或E1和E2的任何化合物。
E9：一种化合物，选自：3-(4-氟苯基)-6-((3-(吡啶-4-基氧基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8(7H)-酮(P1)、6-[3-(吡啶-3-基氧基)-氮杂环丁烷-1-基甲基]-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P2)、6-((3S,4S)-4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3，对映异构体1或P3.1)和6-((3R,4R)-4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3，对映异构体2)。
E10(E9)：化合物6-((3S,4S)-4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3，对映异构体1)。
E11(E9)：化合物6-((3R,4R)-4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3，对映异构体2)。
E12(E9、E10和E11)：E9至E11任一实施方式的化合物，用作药物。
E13：选自以下的化合物：3-(4-氟苯基)-6-((3-(吡啶-4-基氧基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8(7H)-酮(P1)、6-[3-(吡啶-3-基氧基)-氮杂环丁烷-1-基甲基]-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P2)、6-((3S,4S)-4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3，对映异构体1)、6-((3R,4R)-4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3，对映异构体2)和2-[3-(4-氟-苯氧基)-氮杂环丁烷-1-基甲基]-7-(四氢-吡喃-4-基)-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(P4)，用于治疗良性前列腺增生或镰状细胞疾病。
E14：一种药物组合物，其包含治疗有效量的任何以下化合物以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂：3-(4-氟苯基)-6-((3-(吡啶-4-基氧基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8(7H)-酮(P1)、6-[3-(吡啶-3-基氧基)-氮杂环丁烷-1-基甲基]-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P2)、6-((3S,4S)-4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3，对映异构体1)、6-((3R,4R)-4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3，对映异构体2)和2-[3-(4-氟-苯氧基)-氮杂环丁烷-1-基甲基]-7-(四氢-吡喃-4-基)-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(P4)。
E15(E14)：该药物用于治疗良性前列腺增生或镰状细胞疾病。
E16：任何以下化合物用于制备用于治疗良性前列腺增生或镰状细胞疾病的药物的用途：3-(4-氟苯基)-6-((3-(吡啶-4-基氧基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8(7H)-酮(P1)、6-[3-(吡啶-3-基氧基)-氮杂环丁烷-1-基甲基]-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P2)、6-((3S,4S)-4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3，对映异构体1)、6-((3R,4R)-4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3，对映异构体2)和2-[3-(4-氟-苯氧基)-氮杂环丁烷-1-基甲基]-7-(四氢-吡喃-4-基)-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(P4)。
E17：一种治疗患有良性前列腺增生或镰状细胞疾病的受试者的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的任何以下化合物：3-(4-氟苯基)-6-((3-(吡啶-4-基氧基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8(7H)-酮(P1)、6-[3-(吡啶-3-基氧基)-氮杂环丁烷-1-基甲基]-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P2)、6-((3S,4S)-4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3，对映异构体1)、6-((3R,4R)-4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3，对映异构体2)和2-[3-(4-氟-苯氧基)-氮杂环丁烷-1-基甲基]-7-(四氢-吡喃-4-基)-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(P4)。
表1列出了本发明的化合物实施例以及相应的IC50值(nM)，该IC50值(nM)是如“PDE9抑制测定”部分中所述测定的。进一步地，列出了化合物在血浆和脑中的浓度，该浓度是如“血脑屏障穿透”部分中所述测定的。每个化合物均构成本发明的独立的实施方式：
表1：本发明的化合物实施例、IC50值和血浆/脑浓度
Figure BDA0003536571230000211
II.药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的任何本发明化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。本发明还提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本文公开的具体化合物之一以及药学上可接受的载体或稀释剂。
药学上可接受的盐
本发明还包含化合物的盐，通常为药学上可接受的盐。这样的盐包括药学上可接受的酸加成盐。酸加成盐包括无机酸以及有机酸的盐。
合适的无机酸的代表性实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硫酸、氨基磺酸、硝酸等。合适的有机酸的代表性实例包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、柠檬酸、富马酸、乙醇酸、衣康酸、乳酸、甲磺酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水杨酸、琥珀酸、甲烷磺酸、乙磺酸、酒石酸、抗坏血酸、双羟萘酸、亚甲基双水杨酸(bismethylene salicylic)、乙二磺酸、葡糖酸、柠康酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、EDTA、羟基乙酸、对氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、茶碱乙酸以及8-卤代茶碱(例如8-溴茶碱)等。药学上可接受的无机酸或有机酸加成盐的更多实例包括在以下文献中列出的药学上可接受的盐中：Berge,S.M.et al.,J.Pharm.Sci.1977,66,2，该文献的内容通过引用的方式并入本文。
而且，本发明的化合物可以以未溶剂化的形式以及与药学上可接受的溶剂(如水、乙醇等)溶剂化的形式存在。一般地，就本发明的目的来说，溶剂化形式被认为等同于未溶剂化的形式。
本发明的化合物可以以单剂量或多剂量单独地施用或与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂联合地施用。根据常规技术如在以下文献中描述的那些技术可以将根据本发明的药物组合物与药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂一起配制：Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22nd Edition,Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,2013。
药物组合物可以被具体配制成用于通过任何合适的途径施用，如口服、直肠、鼻、肺部、局部(包括口腔和舌下)、经皮、脑池内、腹膜内、阴道和肠胃外(包括皮下、肌内、鞘内、静脉内和皮肤内)途径。可以理解，途径取决于待治疗的受试者的一般健康和年龄、待治疗的状况的性质和活性成分。
用于口服施用的药物组合物包括固体剂型如胶囊剂、片剂、糖衣丸、丸剂、锭剂、粉剂和颗粒剂。适当时，组合物可以被制备成具有包衣如肠溶包衣，或者其可以根据本领域已知的方法被配制成提供活性成分的控释如缓释或延释。用于口服施用的液体剂型包括溶液、乳剂、混悬液、糖浆剂和酏剂。
用于肠胃外施用的药物组合物包括无菌可注射的水溶液和非水溶液、分散液、混悬液或乳剂以及在使用前在无菌可注射的溶液或分散液中重构的无菌粉剂。其他合适的施用形式包括但不限于栓剂、喷雾剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、吸入剂、皮肤贴剂和植入物。
典型的口服剂量为每天约0.001至约100mg/kg体重。典型的口服剂量也可以为每天约0.01至约50mg/kg体重。典型的口服剂量还可以为每天约0.05至约10mg/kg体重。口服剂量一般以一次或多次剂量(通常为每天一至三次剂量)施用。确切的剂量将取决于施用频率和方式；被治疗的受试者的性别、年龄、体重和一般健康；被治疗的状况的性质和严重程度；以及待治疗的任何伴发疾病和其他对本领域技术人员来说是显然的因素。
通过本领域技术人员已知的方法也可以使制剂呈现为单位剂型。出于举例说明的目的，典型的用于口服施用的单位剂型可以含有约0.01至约1000mg、约0.05至约500mg或约0.5mg至约200mg。
对于肠胃外途径如静脉内、鞘内、肌内及类似的施用，典型的剂量大约为口服施用所用剂量的一半。
本发明还提供了用于制备药物组合物的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的化合物和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂混合。在本发明的一个实施方案中，在前述方法中使用的化合物是本文实验部分中公开的具体化合物之一。
本发明的化合物通常作为游离物质或作为其药学上可接受的盐使用。以常规的方式通过用摩尔当量的药学上可接受的酸来处理本发明化合物的溶液或悬浮液来制备这样的盐。合适的有机酸和无机酸的代表性实例在上文描述。
对于肠胃外施用，可以使用本发明化合物在无菌水溶液、丙二醇水溶液、维生素E水溶液或芝麻油或花生油中的溶液。这样的水溶液在必要时应当进行适当的缓冲，并且液体稀释剂应当首先用足够的盐水或葡萄糖来使其等渗。水溶液特别适合用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。使用本领域技术人员已知的标准技术可以容易地将本发明化合物并入到已知的无菌水介质中。
适合的药物载体包括惰性固体稀释剂或填充剂、无菌水溶液和各种有机溶剂。固体载体的实例包括乳糖、石膏粉、蔗糖、环糊精、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶、硬脂酸镁、硬脂酸和纤维素的低级烷基醚。液体载体的实例包括但不限于糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯和水。类似地，载体或稀释剂可以包括单独的或与蜡混合的本领域中已知的任何缓释物质，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。通过将本发明的化合物和药学上可接受的载体组合而形成的药物组合物则容易地以适合所公开的施用途径的各种剂型施用。通过制药领域中已知的方法可以方便地使制剂以单位剂型呈现。
适合口服施用的本发明制剂可以呈现为独立单元，如胶囊或片剂，其各自含有预定量的活性成分以及任选的适合的赋形剂。而且，可口服利用的制剂可以为粉剂或颗粒剂、在水或非水液体中的溶液或混悬液、或者水包油或油包水型液体乳剂的形式。
如果使用固体载体用于口服施用，则制剂可以被压片、以粉末或微丸形式置于硬明胶胶囊中，或者其可以为糖锭或锭剂的形式。固体载体的量可以变化很大，但将在每剂量单位约25mg至约1g的范围内。如果使用液体载体，则制剂可以为糖浆、乳剂、软明胶胶囊或无菌可注射液体如水或非水液体混悬液或溶液的形式。
本发明的药物组合物可以通过本领域的常规方法来制备。例如，片剂可以通过将活性成分与常用佐剂和/或稀释剂混合，并随后在常规压片机中压制混合物以制备片剂来制备。佐剂或稀释剂的实例包括：玉米淀粉、马铃薯淀粉、滑石、硬脂酸镁、明胶、乳糖、胶等。可以使用任何其他的常用于这样的目的的佐剂或添加剂，如着色剂、调味剂、防腐剂等，条件是它们与活性成分相容。
药物组合物可包含按重量计至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的本发明的PDE9抑制剂。
在一个实施方式中，包含本发明的化合物的药物组合物与另外的活性剂如HU组合使用。本发明的化合物和另外的活性剂可以同时、顺序或以任何顺序施用。本发明的化合物和另外的活性剂可以以不同的剂量、不同的给药频率或通过不同的途径施用，只要是合适的。
如本文所用，术语“同时施用”没有特别限制，并且意指本发明的化合物和另外的活性剂基本上同时施用，例如，作为混合物或以紧密相连的顺序。
如本文所用，术语“顺序施用”不受特别限制，并且意指本发明的化合物和另外的活性剂不是在同一时间施用，而是一个接一个地或以组的形式以在施用之间具有特定的时间间隔的方式施用。在本发明的化合物和另外的活性剂各自的施用之间的时间间隔可以相同或不同，并且可以选择，例如，2分钟至96小时，1至7天，或一个星期、两个星期或三个星期。通常，施用之间的时间间隔可以在几分钟至几小时的范围内，例如在2分钟至72小时、30分钟至24小时或1至12小时的范围内。进一步的实例包括24至96小时、12至36小时、8至24小时和6至12小时的时间间隔。
本发明的化合物与另外的活性剂的摩尔比没有特别限制。例如，当本发明的化合物和一种另外的活性剂在组合物中组合时，它们的摩尔比可以在1:500至500:1，或1:100至100:1，或1:50至50:1，或1:20至20:1，或1:5至5:1的范围内，或为1:1。当本发明的化合物和两种或更多种其他活性剂在组合物中组合时，使用相似的摩尔比。本发明的化合物占组合物的预定摩尔重量百分比可以为约1％至10％，或约10％至约20％，或约20％至约30％，或约30％至40％％，或约40％至50％，或约50％至60％，或约60％至70％，或约70％至80％，或约80％至90％，或约90％至99％。
III.使用本发明的化合物的方法
PDE9在人造血系统(包括中性粒细胞、红系网织红细胞和红白血病细胞)中特异性表达。此外，与健康个体相比，SCD患者在网织红细胞和中性粒细胞中表现出明显且显著的PDE9表达升高(Almeida et al.,Br J Haematol.2008 Sep；142(5):836-44)。证据另外证明了PDE9与细胞粘附之间的联系，因为药理学PDE9抑制改善了SCD中性粒细胞的增加的粘附性能(Miguel et al.,Inflamm Res.2011 Jul；60(7):633-42)。已显示PDE9抑制降低细胞粘附的机制是由cGMP增加和内皮粘附分子表达降低介导的。重要的是，在SCD的动物模型中，PDE9抑制剂介导的细胞粘附降低具有增加细胞存活的功能效应。除了证明与HU相当的细胞粘附降低外，PDE9抑制导致非镰状胎血红蛋白(HbF)产生增加，这降低了红细胞(RBC)内异常血红蛋白(HbS)的细胞浓度，导致较少的异常血红蛋白聚合及其相关后遗症。增加HbF在治疗SCD中的重要性可通过大型研究(如镰状细胞疾病的合作研究)以及美国以外的各种患者群体的研究(表明HbF属于该疾病的最重要的修饰物(Alsultan et al.,Am JHematol.,88(6):531-2(2013)))以及显示HbF修饰物改善了其他血液学参数的数据(Akinsheye，Blood，118(1)：19-27(2011))的结果来证明。最后，Almeida及其同事们证明，在SCD小鼠模型中，用HU结合PDE9抑制的治疗导致HU的cGMP升高作用的额外有益增长(Almeida et al.,Blood.2012 Oct 4；120(14):2879-88)。总的来说，PDE9抑制可以调节胎血红蛋白产生的表达以及降低细胞粘附，这两种机制都是治疗SCD的关键。
图1是显示本发明的PDE9抑制剂和羟基脲(HU)通过不同机制起作用的图。HU增加一氧化氮(NO)水平，其激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)以产生cGMP。本发明的PDE9抑制剂通过抑制PDE9酶活性阻断了cGMP的降解，从而提高cGMP水平。在红系细胞谱系中，cGMP结合蛋白激酶G(PKG)，并发出胎γ球蛋白的合成信号，并最终产生HbF。在PDE9表达为高的造血细胞中，PDE9活性的直接抑制增加了cGMP水平，其促进白细胞粘附减少(根据Almeida etal.,Blood,vol.120(14):2879-88(2012)修改的图)。
本发明的一个方面提供了使用本发明的PDE9抑制剂和包含本发明的PDE9抑制剂的药物组合物的方法。
本发明的PDE9抑制剂可以用于治疗镰状细胞疾病或与镰状细胞疾病相关的任何疾病和/或症状，如贫血、镰状血红蛋白C病(SC)、β地中海贫血(β+地中海贫血(beta-plusthalassemia)和β0地中海贫血(beta-zero thalassemia))、血管闭塞性危象、疼痛发作(镰状细胞危象)、脾脏阻断危机(splenic sequestration crisis)、急性胸部综合征、再生障碍性危象、溶血性危象、长期疼痛、细菌感染和中风。
在一个实施方式中，本发明的PDE9抑制剂用于治疗受试者的β地中海贫血和/或增加受试者的血红蛋白水平。
在另一个实施方式中，本发明的PDE9抑制剂用于增加受试者的细胞或血浆中的cGMP水平，其中该受试者患有镰状细胞疾病。细胞可以是但不限于红细胞和/或白细胞。cGMP水平可以增加了至少50％、100％、150％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或25倍。
在另一个实施方式中，本发明的PDE9抑制剂用于增加受试者的胎血红蛋白(HbF)阳性红细胞数，其中该受试者患有镰状细胞疾病。HbF阳性红细胞数增加了至少50％、100％、150％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或25倍。
在另一个实施方式中，本发明的PDE9抑制剂用于降低受试者的镰状红细胞百分比(镰状RBC％)、瘀滞百分比(瘀滞％)、总胆红素或总白细胞计数，其中该受试者患有镰状细胞疾病。镰状RBC％、瘀滞％、总胆红素、总白细胞计数或脾重量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。
cGMP水平可以用本领域任何合适的方法测量，如酶免疫测定。
如本文所用，HbF阳性细胞是指具有HbF的红细胞。可以用本领域任何合适的方法(例如电泳和/或比色法)测量血液样品的HbF阳性细胞。
如本文所用，镰状红细胞(Sickle red blood cell，sickled red blood cell)是指具有新月形或镰刀形状的红细胞。可以用本领域任何合适的方法测量血液样品的镰状红细胞％。
如本文所用，瘀滞或微脉管瘀滞是血液或淋巴液流动通过脉管严重缓慢或完全停止。瘀滞％是静态(无流动)小静脉的数量除以流动小静脉的数量乘以100。瘀滞可以用本领域任何合适的方法测量。
如本文所用，总胆红素是指未缀合的胆红素和缀合的胆红素。可以使用本领域任何合适的方法测量血液样品的总胆红素水平。
如本文所用，总白细胞计数(total leucocyte count或total white blood cellcount)是测量体内白细胞数量的血液测试。其可以使用本领域任何合适的方法从血液样品中测量。
本发明的另一方面提供了使用本发明的PDE9抑制剂与至少一种其他活性剂的组合的方法。它们可以同时或顺序施用。它们可以作为混合物存在以用于同时施用，或者可以各自存在于单独的容器中以用于顺序施用。
如本文所用，术语“同时施用”没有特别限制，并且意指本发明的PDE9抑制剂和至少一种其他活性剂基本上同时施用，例如，作为混合物或以立即相连的顺序。
如本文所用，术语“顺序施用”不受特别限制，并且意指本发明的PDE9抑制剂和至少一种其他活性剂不是在同一时间施用，而是一个接一个地或以组的形式施用，在施用之间具有特定的时间间隔。在本发明的PDE9抑制剂和至少一种其他活性剂各自的施用之间的时间间隔可以相同或不同，并且可以选择，例如，2分钟至96小时，1至7天，或一个星期、两个星期或三个星期。通常，施用之间的时间间隔可以在几分钟至几小时的范围内，例如在2分钟至72小时、30分钟至24小时或1至12小时的范围内。进一步的实例包括24至96小时、12至36小时、8至24小时和6至12小时的时间间隔。
本发明的PDE9抑制剂与至少一种其他活性剂的摩尔比没有特别限制。例如，当本发明的PDE9抑制剂和一种其他活性剂在组合物中组合时，它们的摩尔比可以在1:500至500:1，或1:100至100:1，或1:50至50:1，或1:20至20:1，或1:5至5:1的范围内，或为1:1。当本发明的PDE9抑制剂和两种或更多种其他活性剂在组合物中组合时，使用相似的摩尔比。本发明的PDE9抑制剂占组合物的预定摩尔重量百分比可以为约1％至10％，或约10％至约20％，或约20％至约30％，或约30％至40％％，或约40％至50％，或约50％至60％，或约60％至70％，或约70％至80％，或约80％至90％，或约90％至99％。
其他活性剂可以是本发明的不同PDE9抑制剂或HU。其他活性剂也可以是抗生素(如青霉素)、非甾体抗炎药(NSAIDS)(如双氯芬酸或萘普生)、止痛药(如阿片类药物)或叶酸。
本发明的又一方面提供了使用本发明的PDE9抑制剂与至少一种其他疗法组合的方法，所述其他疗法例如但不限于输血、骨髓移植或基因疗法。
IV.试剂盒和装置
本发明提供了各种用于方便和/或有效地实施本发明的方法的试剂盒和装置。通常，试剂盒将包含足够量和/或数量的组分以允许使用者对受试者进行多次治疗和/或进行多次实验。
在一个实施方式中，本发明提供用于治疗镰状细胞疾病的试剂盒，其包含本发明的PDE9抑制剂化合物或本发明的PDE9抑制剂化合物的组合，任选地与任何其他活性剂组合，所述其他活性剂如HU、抗生素(如青霉素)、非甾体抗炎药(NSAIDS)(如双氯芬酸或萘普生)、止痛药(如阿片类药物)或叶酸。
试剂盒可以进一步包含包装和说明书和/或递送剂以形成制剂组合物。递送剂可以包括盐水、缓冲溶液或本文公开的任何递送剂。可以改变每种组分的量以能够获得一致的、可再现的较高浓度的盐水或简单的缓冲制剂。还可以改变组分，以便在一段时间内和/或在各种条件下增加PDE9抑制剂化合物在缓冲溶液中的稳定性。
本发明提供了可以并入本发明的PDE9抑制剂化合物的装置。这些装置含有稳定的制剂，可用于立即递送给有此需要的受试者，如患有镰状细胞疾病或β地中海贫血的人类患者。
装置的非限制性实例包括泵、导管、针、透皮贴剂、加压嗅觉器官递送装置、离子电渗疗法装置、多层微流体装置。所述装置可以用于根据单次、多次或分次给药方案递送本发明的PDE9抑制剂化合物。该装置可以用于跨生物组织、皮内、皮下或肌内递送本发明的PDE9抑制剂化合物。适用于递送PDE9抑制剂化合物的装置的更多实例包括但不限于国际公开WO2014036555中公开的用于膀胱内药物递送的医疗装置；美国公开号20080108697中公开的I型玻璃制成的玻璃瓶；美国公开号20140308336中公开的包含由可降解聚合物和活性剂制成的膜的药物洗脱装置；美国专利号5716988中公开的具有注射微泵的输注装置或含有药学上稳定的活性剂制品的容器；国际公开WO2015023557中公开的包括贮存器和与贮存器流体连通的通道构件的可植入装置；如美国公开号20090220612中公开的具有一层或多层的基于中空纤维的生物相容性药物递送装置；国际公开WO2013170069中公开的具有界定贮存器的壳体的细长的柔性装置，该贮存器含有固体或半固体形式的药物；美国专利号7326421中公开的生物可再吸收植入装置，其每一篇的内容通过引用的方式以其整体并入本文。
V.定义
如本文所用的冠词“一个(种)(a/an)”应被理解为意指“至少一个(种)”，除非有相反的明确指示。
如本文所用的短语“和/或”应被理解为意指如此联合的要素中的“任一者或两者”，即要素在一些情况下连带地(conjunctively)存在，而在其他情况下分别地(disjunctively)存在。除了由“和/或”子句具体确定的要素外可以任选地存在其他要素，无论与具体确定的那些要素相关还是无关，除非有相反的明确指示。因此，作为非限制性实例，当结合诸如“包含”的开放式语言使用时，提及“A和/或B”在一个实施方案中可以是指A而没有B(任选地包括除了B以外的要素)；在另一实施方案中是指B而没有A(任选地包括除了A以外的要素)；在又一实施方案中是指A和B两者(任选地包括其他要素)。
如本文所用，“或”应被理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含若干要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地包括另外未列出的项目。仅有相反明确指示的术语，诸如“……中的仅一个”或“……中的刚好一个”或者当在权利要求中使用时的“由...组成”，是指包含若干要素或要素列表中的刚好一个要素。
一般来说，如本文所用的术语“或”当在前面有诸如“任一”、“……中的一个”、“……中的仅一个”或“……中的刚好一个”的排他性术语时应当仅被解释为表示排他性选择(即，“一个或另一个但不是两个”)。“基本上由……组成”当用在权利要求中时应具有其如用在专利法领域中的普通含义。
如本文所用，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应被理解为意指选自要素列表中的要素的任何一个或多个的至少一个要素，但不必须包括要素列表内具体列出的每一个要素的至少一个，并且不排除要素列表中的要素的任意组合。这一定义还允许可以任选地存在除了短语“至少一个”所指的要素列表内具体确定的要素以外的要素，无论与具体确定的那些要素相关还是无关。
因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B的至少一个”或等同地，“A和/或B的至少一个”)在一个实施方案中可以是指至少一个、任选地包括多于一个A，而不存在B(以及任选地包括除了B以外的要素)；在另一实施方案中是指至少一个、任选地包括多于一个B，而不存在A(以及任选地包括除了A以外的要素)；在又一实施方案中是指至少一个、任选地包括多于一个A，以及至少一个、任选地包括多于一个B(以及任选地包括其他要素)；等等。
如本文所用，诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”等的所有过渡性短语要被理解为开放式的，即意指包括但不限于。
只有过渡性短语“由……组成”和“基本上由……组成”才分别是封闭式或半封闭式的过渡性短语，如美国专利局专利审查程序手册中所提出的那样。
如本文所用，“受试者”或“患者”是指任何哺乳动物(例如，人)，如可能易患疾病或病症(例如，肿瘤发生或癌症)的哺乳动物。实例包括人、非人灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、犬、猫或啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠或豚鼠。在各种实施方案中，受试者是指已经是或将是治疗、观察或实验的对象的受试者。例如，受试者可以是诊断患有癌症或以其他方式已知患有癌症的受试者或基于受试者中已知的癌症选择用于治疗、观察或实验的受试者。
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”是指疾病或病症或其至少一种体征或症状的改善。“治疗”可以指减少疾病或病症的进展，如通过例如至少一种体征或症状的稳定化所确定的，或进展速度降低，如通过至少一种体征或症状的进展速度降低所确定的。在另一实施方案中，“治疗”是指延迟疾病或病症的发作。
如本文所用，“预防(prevention/preventing)”是指降低获得或具有给定疾病或病症的体征或症状的风险，即预防性治疗。
如本文所用的短语“治疗有效量”意指化合物、物质或包含本教导的化合物的组合物有效产生所需的治疗效果的量。因此，治疗有效量治疗或预防疾病或病症，例如改善病症的至少一种体征或症状。在各种实施方案中，所述疾病或病症是癌症。
不在两个字母或符号之间的短划线(“–”)用于指示取代基的连接点。例如，–CONH2是通过碳原子(C)连接的。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且该描述包括其中事件或情况发生的情况以及其中事件或情况不发生的情况。例如，“任选取代的芳基”涵盖如本文定义的“芳基”和“取代的芳基”。本领域普通技术人员将会理解的是，对于含有一个或多个取代基的任何基团，这类基团并不旨在引入空间上不能实现、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
如本文所用的术语“烷基”是指饱和的直链或支链烃，如1-22、1-8、1-6或1-4个碳原子的直链或支链基团，在本文中分别被称为(C1-C22)烷基、(C1-C8)烷基、(C1-C6)烷基和(C1-C4)烷基。示例性烷基基团包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基和辛基。
如本文所用的术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键(例如，如“＝”所示)的不饱和直链或支链烃，如2-22、2-8、2-6或2-4个碳原子的直链或支链基团，在本文中分别被称为(C2-C22)烯基、(C2-C8)烯基、(C2-C6)烯基和(C2-C4)烯基。示例性烯基基团包括但不限于乙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基和4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基。
如本文所用的术语“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键(例如，如“≡”所示)的不饱和直链或支链烃，如2-22、2-8、2-6、2-4个碳原子的直链或支链基团，在本文中分别被称为(C2-C22)炔基、(C2-C8)炔基、(C2-C6)炔基和(C2-C4)炔基。示例性炔基基团包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、甲基丙炔基、4-甲基-1-丁炔基、4-丙基-2-戊炔基和4-丁基-2-己炔基。
如本文所用的“环烷基”是指饱和或不饱和的单环、双环、其他多环或桥环烃基团。环烷基基团可具有3-22、3-12或3-8个环碳，在本文中分别被称为(C3-C22)环烷基、(C3-C12)环烷基或(C3-C8)环烷基。环烷基基团也可具有一个或多个碳-碳双键或碳-碳三键。
示例性单环环烷基基团包括但不限于环戊烷(环戊基)、环戊烯(环戊烯基)、环己烷(环己基)、环己烯(环己烯基)、环庚烷(环庚基)、环庚烯(环庚烯基)、环辛烷(环辛基)、环辛烯(环辛烯基)、环壬烷(环壬基)、环壬烯(环壬烯基)、环癸烷(环癸基)、环癸烯(环癸烯基)、环十一烷(环十一烷基)、环十一烯(环十一烯基)、环十二烷(环十二烷基)和环十二烯(环十二烯基)。包括双环、多环和桥环基团的其他示例性环烷基基团包括但不限于双环丁烷(双环丁基)、双环戊烷(双环戊基)、双环己烷(双环己基)、双环庚烷(双环庚基，包括双环[2,2,1]庚烷(双环[2,2,1]庚基)和双环[3,2,0]庚烷(双环[3,2,0]庚基))、双环辛烷(双环辛基，包括八氢并环戊二烯(八氢并环戊二烯基)、双环[3,2,1]辛烷(双环[3,2,1]辛基)和双环[2,2,2]辛烷(双环[2,2,2]辛基))和金刚烷(金刚烷基)。环烷基基团可与其他饱和或不饱和的环烷基、芳基或杂环基基团稠合。
如本文所用的术语“芳基”是指单、双或其他多碳环芳族环体系。芳基可具有6-22、6-18、6-14或6-10个碳，在本文中分别被称为(C6-C22)芳基、(C6-C18)芳基、(C6-C14)芳基或(C6-C10)芳基。芳基基团可任选地与一个或多个选自芳基、环烷基和杂环基的环稠合。如本文所用的术语“双环芳基”是指与另一芳族或非芳族碳环或杂环稠合的芳基基团。示例性芳基基团包括但不限于苯基、甲苯基、蒽基、芴基、茚基、薁基和萘基以及苯并稠合的碳环部分，如5,6,7,8-四氢萘基。示例性芳基基团还包括但不限于单环芳族环体系，其中环包含6个碳原子，在本文中被称为“(C6)芳基”或苯基。苯基基团也可与环己烷或环戊烷环稠合以形成另一芳基。
如本文所用的术语“芳基烷基”是指具有至少一个芳基取代基的烷基基团(例如，-芳基-烷基-)。示例性芳基烷基基团包括但不限于具有单环芳族环体系的芳基烷基，其中环包含6个碳原子，在本文中被称为“(C6)芳基烷基”。如本文所用的术语“苄基”是指基团–CH2–苯基。
术语“杂烷基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子置换的如本文所述的烷基基团。合适的杂原子包括氧、硫、氮、磷等。杂烷基基团的实例包括但不限于烷氧基、氨基、硫酯等。
术语“杂烯基”和“杂炔基”是指这样的不饱和脂族基团，其长度和可能的取代类似于上文所述的杂烷基，但分别含有至少一个双键或三键。
术语“杂环”是指含有至少一个杂原子作为环原子(在一些情况下1至3个杂原子作为环原子)且其余环原子为碳原子的环状基团。合适的杂原子包括氧、硫、氮、磷等。在一些情况下，杂环可以是3至10元环结构或3至7元环，其环结构包括一至四个杂原子。术语“杂环”可以包括杂芳基基团、饱和杂环(例如，环杂烷基)基团或它们的组合。杂环可以是饱和分子，或者可以包含一个或多个双键。在一些情况下，杂环是氮杂环，其中至少一个环包含至少一个氮环原子。杂环可以与其他环稠合以形成多环杂环。因此，杂环也包括双环、三环和四环基团，其中任何上述杂环环与一个或两个独立地选自芳基、环烷基和杂环的环稠合。杂环也可以与螺环基团稠合。
杂环包括例如噻吩、苯并噻吩、噻蒽、呋喃、四氢呋喃、吡喃、异苯并呋喃、色烯、呫吨、吩噁噻、吡咯、二氢吡咯、吡咯烷、咪唑、吡唑、吡嗪、异噻唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、三唑、四唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩吡嗪、吩噻嗪、呋咱、吩噁嗪、吡咯烷、氧杂环戊烷、硫杂环戊烷、噁唑、噁嗪、哌啶、高哌啶(六亚甲基亚胺)、哌嗪(例如，N-甲基哌嗪)、吗啉、内酯、内酰胺如氮杂环丁酮和吡咯烷酮、磺内酰胺、磺内酯、它们的其他饱和和/或不饱和衍生物等。
在一些情况下，杂环可以经由杂原子环原子(例如，氮)与化合物键合。在一些情况下，杂环可以经由碳环原子与化合物键合。在一些情况下，杂环是吡啶、咪唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吖啶、吖啶-9-胺、联吡啶、萘啶、喹啉、异喹啉、苯并喹啉、苯并异喹啉、菲啶-1,9-二胺等。
如本文所用的术语“杂芳族”或“杂芳基”是指含有一个或多个诸如氮、氧和硫的杂原子(例如1-3个杂原子)的单环、双环或多环芳族环体系。杂芳基也可与非芳族环稠合。在各种实施方案中，除另有说明外，如本文所用的术语“杂芳族”或“杂芳基”表示稳定的5至7元单环、稳定的9至10元稠合双环或稳定的12至14元稠合三环杂环体系，其含有芳族环，所述芳族环含有至少一个选自N、O和S的杂原子。在一些实施方案中，至少一个氮在芳族环中。
杂芳族化合物或杂芳基可包括但不限于单环芳族环，其中环包含2-5个碳原子和1-3个杂原子，在本文中被称为“(C2-C5)杂芳基”。单环杂芳族(或杂芳基)的例示性实例包括但不限于吡啶(吡啶基)、哒嗪(哒嗪基)、嘧啶(嘧啶基)、吡嗪(吡嗪基)、三嗪(三嗪基)、吡咯(吡咯基)、吡唑(吡唑基)、咪唑(咪唑基)、(1,2,3)-和(1,2,4)-三唑((1,2,3)-和(1,2,4)-三唑基)、吡嗪(吡嗪基)、嘧啶(嘧啶基)、四唑(四唑基)、呋喃(呋喃基)、噻吩(噻吩基)、异噁唑(异噁唑基)、噻唑(噻唑基)、异噁唑(异噁唑基)和噁唑(噁唑基)。
如本文所用的术语“双环杂芳族”或“双环杂芳基”是指与另一芳族或非芳族碳环或杂环稠合的杂芳基基团。示例性双环杂芳族或杂芳基包括但不限于5,6-或6,6-稠合体系，其中一个或两个环含有杂原子。术语“双环杂芳族”或“双环杂芳基”还涵盖稠合芳族体系的还原或部分还原形式，其中一个或两个环含有环杂原子。环体系可以含有最多三个独立地选自氧、氮和硫的杂原子。
示例性双环杂芳族化合物(或杂芳基)包括但不限于喹唑啉(喹唑啉基)、苯并噁唑(苯并噁唑基)、苯并噻吩(苯并噻吩基)、苯并噁唑(苯并噁唑基)、苯并异噁唑(苯并异噁唑基)、苯并咪唑(苯并咪唑基)、苯并噻唑(苯并噻唑基)、苯并呋喃(苯并呋喃基)、苯并异噻唑(苯并异噻唑基)、吲哚(吲哚基)、吲唑(吲唑基)、吲嗪(吲嗪基)、喹啉(喹啉基)、异喹啉(异喹啉基)、萘啶(萘啶基)、酞嗪(酞嗪基)、酞嗪(酞嗪基)、蝶啶(蝶啶基)、嘌呤(嘌呤基)、苯并三唑(苯并三唑基)和苯并呋喃(苯并呋喃基)。在一些实施方案中，双环杂芳族(或双环杂芳基)选自喹唑啉(喹唑啉基)、苯并咪唑(苯并咪唑基)、苯并噻唑(苯并噻唑基)、吲哚(吲哚基)、喹啉(喹啉基)、异喹啉(异喹啉基)和酞嗪(酞嗪基)。在某些实施方案中，双环杂芳族(或双环杂芳基)是喹啉(喹啉基)或异喹啉(异喹啉基)。
如本文所用的术语“三环杂芳族”或“三环杂芳基”是指与另一芳族或非芳族碳环或杂环稠合的双环杂芳基基团。术语“三环杂芳族”或“三环杂芳基”也涵盖稠合芳族体系的还原或部分还原形式，其中一个或两个环含有环杂原子。三环杂芳族(三环杂芳基)中的每个环可以含有最多三个独立地选自氧、氮和硫的杂原子。
示例性三环杂芳族化合物(或杂芳基)包括但不限于吖啶(吖啶基)、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(9H-吡啶并[3,4-b]吲哚基)、菲啶(菲啶基)、吡啶并[1,2-a]苯并咪唑(吡啶并[1,2-a]苯并咪唑基)和吡啶并[1,2-b]吲唑(吡啶并[1,2-b]吲唑基)。
如本文所用的术语“烷氧基”是指与氧连接的烷基基团(-O-烷基-)。“烷氧基”基团还包括与氧连接的烯基基团(“烯氧基”)或与氧连接的炔基基团(“炔氧基”)基团。示例性烷氧基基团包括但不限于带有1-22、1-8或1-6个碳原子的烷基、烯基或炔基基团的基团，在本文中分别被称为(C1-C22)烷氧基、(C1-C8)烷氧基或(C1-C6)烷氧基。示例性烷氧基基团包括但不限于甲氧基和乙氧基。
如本文所用的术语“环烷氧基”是指与氧连接的环烷基基团。
如本文所用的术语“芳基氧基”或“芳氧基”是指与氧原子连接的芳基基团。示例性芳基氧基基团包括但不限于具有单环芳族环体系的芳基氧基，其中环包含6个碳原子，在本文中被称为“(C6)芳基氧基”。如本文所用的术语“芳基烷氧基”是指与氧原子连接的芳基烷基基团。示例性芳烷基基团是苄氧基基团。
如本文所用的术语“胺”或“氨基”是指未取代的和取代的胺，例如NRaRbRb’，其中Ra、Rb和Rb’独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、氨基甲酸酯基、环烷基、卤代烷基、杂芳基、杂环基和氢，并且Ra、Rb和Rb’中的至少一个不是氢。胺或氨基可通过氮与母体分子基团连接。胺或氨基也可以是环状的，例如Ra、Rb和Rb’中的任何两个可以连接在一起和/或与N连接形成3至12元环(例如，吗啉代或哌啶基)。术语氨基还包括任何氨基基团的相应季铵盐。示例性胺包括烷基胺，其中RaRb或Rb’中的至少一个是烷基基团；或环烷基胺，其中Ra、Rb或Rb’中的至少一个是环烷基基团。
如本文所用的术语“氨”是指NH3。
如本文所用的术语“醛”或“甲酰基”是指-CHO。
如本文所用的术语“酰基”是指与烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基连接的羰基基团。示例性酰基基团包括但不限于乙酰基、甲酰基、丙酰基、苯甲酰基等。
如本文所用的术语“酰胺”是指形式–NRcC(O)(Rd)–或–C(O)NRcRe，其中Rc、Rd和Re各自独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、卤代烷基、杂芳基、杂环基和氢。酰胺可通过碳、氮、Rc、Rd或Re与另一基团连接。酰胺也可以是环状的，例如Rc和Re可以连接形成3至12元环，如3至10元环或者5或6元环。术语“酰胺”涵盖诸如磺酰胺、脲、脲基、氨基甲酸酯基、氨基甲酸的基团以及它们的环状形式。术语“酰胺”还涵盖与羧基基团连接的酰胺基团，例如-酰胺-COOH或诸如–酰胺–COONa的盐。
如本文所用的术语“芳硫基”是指与硫原子连接的芳基基团。示例性芳硫基基团包括但不限于具有单环芳族环体系的芳硫基，其中环包含6个碳原子，在本文中被称为“(C6)芳硫基”。
如本文所用的术语“芳基磺酰基”是指与磺酰基基团连接的芳基基团，例如–S(O)2–芳基–。示例性芳基磺酰基基团包括但不限于具有单环芳族环体系的芳基磺酰基，其中环包含6个碳原子，在本文中被称为“(C6)芳基磺酰基”。
如本文所用的术语“氨基甲酸酯基”是指形式–RfOC(O)N(Rg)–、–RfOC(O)N(Rg)Rh–或–OC(O)NRgRh，其中Rf、Rg和Rh各自独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、卤代烷基、杂芳基、杂环基和氢。示例性氨基甲酸酯基包括但不限于芳基氨基甲酸酯基或杂芳基氨基甲酸酯基(例如，其中Rf、Rg和Rh中的至少一个独立地选自芳基或杂芳基，如吡啶基、哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基)。
如本文所用的术语“羰基”是指–C(O)–。
如本文所用的术语“羧基”或“羧酸盐”是指Rj–COOH或其相应的羧酸盐(例如，Rj–COONa)，其中Rj可独立地选自烷氧基、芳基氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、氨基、芳基、芳基烷基、环烷基、醚、卤代烷基、杂芳基和杂环基。示例性羧基包括但不限于其中Rj是烷基的烷基羧基，如–O–C(O)–烷基。示例性羧基还包括芳基或杂芳基羧基，例如其中Rj是芳基，如苯基和甲苯基，或杂芳基基团如吡啶、哒嗪、嘧啶和吡嗪。术语羧基还包括“羧基羰基”，例如与羰基基团连接的羧基基团，例如–C(O)–COOH或诸如–C(O)–COONa的盐。
如本文所用的术语“二羧酸”是指含有至少两个羧酸基团的基团，如饱和及不饱和烃二羧酸及其盐。示例性二羧酸包括烷基二羧酸。二羧酸包括但不限于琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、壬二酸、马来酸、邻苯二甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙二酸、富马酸、(+)/(-)-苹果酸、(+)/(-)酒石酸、间苯二甲酸和对苯二甲酸。二羧酸进一步包括其羧酸衍生物，如酸酐、酰亚胺、酰肼(例如，琥珀酸酐和琥珀酰亚胺)。
如本文所用的术语“氰基”是指–CN。
术语“酯”是指结构–C(O)O–、–C(O)O–Ri–、–RjC(O)O–Ri–或–RjC(O)O–，其中O不与氢结合，并且Ri和Rj可独立地选自烷氧基、芳基氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、氨基、芳基、芳基烷基、环烷基、醚、卤代烷基、杂芳基和杂环基。Ri可以是氢，但Rj不能是氢。酯可以是环状的，例如碳原子和Rj、氧原子和Ri或者Ri和Rj可以连接形成3至12元环。示例性酯包括但不限于其中Ri或Rj中的至少一个是烷基的烷基酯，如–O–C(O)–烷基、–C(O)–O–烷基–和–烷基–C(O)–O–烷基–。示例性酯还包括芳基或杂芳基酯，例如其中Ri或Rj中的至少一个是芳基基团，如苯基或甲苯基；或杂芳基基团，如吡啶、哒嗪、嘧啶或吡嗪，如烟酸酯。示例性酯还包括具有结构–RjC(O)O–的逆酯，其中氧与母体分子结合。示例性逆酯包括琥珀酸酯、D-精氨酸酯、L-精氨酸酯、L-赖氨酸酯和D-赖氨酸酯。酯还包括羧酸酐和酰卤。
术语“醚”是指结构–RkO–Rl–，其中Rk和Rl可独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环基和醚。醚可通过Rk或Rl与母体分子基团连接。示例性醚包括但不限于烷氧基烷基和烷氧基芳基基团。醚还包括聚醚，例如，其中Rk和Rl中的一个或两个是醚。
如本文所用的术语“卤代”或“卤素”或“卤”或“卤化物”是指F、Cl、Br或I。
如本文所用的术语“卤代烷基”是指被一个或多个卤素原子取代的烷基基团。“卤代烷基”还涵盖被一个或多个卤素原子取代的烯基或炔基基团。
如本文所用的术语“羟基(hydroxy/hydroxyl)”是指–OH。
如本文所用的术语“羟基烷基”是指与烷基基团连接的羟基。
如本文所用的术语“羟基芳基”是指与芳基基团连接的羟基。
如本文所用的术语“酮”是指结构–C(O)–Rm(如乙酰基–C(O)CH3)或–Rm–C(O)–Rn–。酮可通过Rm或Rn与另一基团连接。Rm或Rn可以是烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基或芳基，或者Rm或Rn可连接形成例如3至12元环。
如本文所用的术语“单酯”是指二羧酸的类似物，其中羧酸中的一个被官能化为酯，另一个羧酸是游离羧酸或羧酸的盐。单酯的实例包括但不限于琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、壬二酸、草酸和马来酸的单酯。
如本文所用的术语“硝基”是指–NO2。
如本文所用的术语“硝酸根”是指NO3 -。
如本文所用的术语“全氟烷基”是指其中所有的氢原子均已被氟原子置换的烷基基团。示例性全氟烷基基团包括但不限于C1-C5全氟烷基，如三氟甲基。
如本文所用的术语“全氟环烷基”是指其中所有的氢原子均已被氟原子置换的环烷基基团。
如本文所用的术语“全氟烷氧基”是指其中所有的氢原子均已被氟原子置换的烷氧基基团。
如本文所用的术语“磷酸根”是指结构–OP(O)O2 2-、–RoOP(O)O2 2-、–OP(O)(ORq)O–或–RoOP(O)(ORp)O–，其中Ro、Rp和Rq各自独立地可以是烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环基或氢。
如本文所用的术语“硫化物”是指结构–RqS–，其中Rq可以是烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、卤代烷基、杂芳基、杂环基。硫化物可以是环状的，例如，形成3至12元环。如本文所用的术语“烷基硫化物”是指与硫原子连接的烷基基团。
如本文所用的术语“亚磺酰基”是指结构–S(O)O–、–RrS(O)O–、–RrS(O)ORs–或–S(O)ORs–，其中Rr和Rs可以是烷基、烯基、芳基、芳基烷基、环烷基、卤代烷基、杂芳基、杂环基、羟基。示例性亚磺酰基基团包括但不限于烷基亚磺酰基，其中Rr或Rs中的至少一个是烷基、烯基或炔基。
如本文所用的术语“磺酰胺”是指结构–(Rt)–N–S(O)2–Rv–或–Rt(Ru)N–S(O)2–Rv，其中Rt、Ru和Rv可以是例如氢、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基和杂环基。示例性磺酰胺包括烷基磺酰胺(例如，其中Rv是烷基)、芳基磺酰胺(例如，其中Rv是芳基)、环烷基磺酰胺(例如，其中Rv是环烷基)和杂环基磺酰胺(例如，其中Rv是杂环基)。
如本文所用的术语“磺酸盐/酯”是指磺酸的盐或酯。术语“磺酸”是指RwSO3H，其中Rw是烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基或杂环基(例如，烷基磺酰基)。如本文所用的术语“磺酰基”是指结构RxSO2–，其中Rx可以是烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基和杂环基(例如，烷基磺酰基)。如本文所用的术语“烷基磺酰基”是指与磺酰基基团连接的烷基基团。“烷基磺酰基”基团可任选地含有烯基或炔基基团。
如本文所用的术语“磺酸根”是指RwSO3 -，其中Rw是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环基、羟基、烷氧基、芳氧基或芳烷氧基，其中烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基或芳烷氧基中的每一者任选地被取代。非限制性实例包括三氟甲磺酸根(也称为三氟甲烷磺酸根，CF3SO3 -)、苯磺酸根、甲苯磺酸根(tosylate)(也称为甲苯磺酸根(toluenesulfonate))等。
术语“硫酮”是指结构–Ry–C(S)–Rz–。酮可通过Ry或Rz与另一基团连接。Ry或Rz可以是烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基或芳基，或者Ry或Rz可连接形成环，例如3至12元环。
上述基团中的每一者可以是任选取代的。如本文所用，术语“取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基，“可允许的”是就本领域普通技术人员已知的价态的化学规则而言的。可以理解，“取代的”还包括取代产生稳定的化合物，例如其不会自发地经历转化，如通过重排、环化、消除等进行转化。在一些情况下，“取代的”通常可以是指用如本文所述的取代基置换氢。然而，如本文所用的“取代的”不涵盖置换和/或改变识别分子的官能团，例如使得“取代的”官能团通过取代变成不同的官能团。例如，“取代的苯基基团”必须仍然包含苯基部分，并且在此定义中不能通过取代被改性而变成例如吡啶环。
在广泛的方面，可允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族的取代基。例示性取代基包括例如本文中描述的那些。对于适当的有机化合物，可允许的取代基可以是一个或多个，并且是相同或不同的。为了本教导的目的，诸如氮的杂原子可以具有氢取代基和/或满足杂原子价态的本文所述的有机化合物的任何可允许的取代基。
在各种实施方案中，取代基选自烷氧基、芳基氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、氨基、芳基、芳基烷基、氨基甲酸酯基、羧基、氰基、环烷基、酯、醚、甲酰基、卤素、卤代烷基、杂芳基、杂环基、羟基、酮、硝基、磷酸根、硫化物、亚磺酰基、磺酰基、磺酸、磺酰胺和硫酮，其每一者任选地被一个或多个合适的取代基取代。在一些实施方案中，取代基选自烷氧基、芳基氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、氨基、芳基、芳基烷基、氨基甲酸酯基、羧基、环烷基、酯、醚、甲酰基、卤代烷基、杂芳基、杂环基、酮、磷酸根、硫化物、亚磺酰基、磺酰基、磺酸、磺酰胺和硫酮，其中烷氧基、芳基氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、氨基、芳基、芳基烷基、氨基甲酸酯基、羧基、环烷基、酯、醚、甲酰基、卤代烷基、杂芳基、杂环基、酮、磷酸根、硫化物、亚磺酰基、磺酰基、磺酸、磺酰胺和硫酮中的每一者可进一步被一个或多个合适的取代基取代。
取代基的实例包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、膦酸根、次膦酸根、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、亚磺酰氨基、酮、醛、硫酮、酯、杂环基、–CN、芳基、芳基氧基、全卤代烷氧基、芳烷氧基、杂芳基、杂芳基氧基、杂芳基烷基、杂芳烷氧基、叠氮基、烷硫基、氧代、酰基烷基、羧基酯、羧酰氨基、酰氧基、氨基烷基、烷基氨基芳基、烷基芳基、烷基氨基烷基、烷氧基芳基、芳基氨基、芳烷基氨基、烷基磺酰基、羧酰氨基烷基芳基、羧酰氨基芳基、羟基烷基、卤代烷基、烷基氨基烷基羧基、氨基羧酰氨基烷基、氰基、烷氧基烷基、全卤代烷基、芳基烷基氧基烷基等。在一些实施方案中，取代基选自氰基、卤素、羟基和硝基。
作为非限制性实例，在各种实施方案中，在本文中被称为胺或氨基的NRaRbRb’中的Ra、Rb和Rb’之一选自烷基、烯基、炔基、环烷基和杂环基时，所述烷基、烯基、炔基、环烷基和杂环基中的每一者独立地可任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自烷氧基、芳基氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、氨基、芳基、芳基烷基、氨基甲酸酯基、羧基、环烷基、酯、醚、甲酰基、卤代烷基、杂芳基、杂环基、酮、磷酸根、硫化物、亚磺酰基、磺酰基、磺酸、磺酰胺和硫酮，其中所述烷氧基、芳基氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、氨基、芳基、芳基烷基、氨基甲酸酯基、羧基、环烷基、酯、醚、甲酰基、卤代烷基、杂芳基、杂环基、酮、磷酸根、硫化物、亚磺酰基、磺酰基、磺酸、磺酰胺和硫酮中的每一者可进一步被一个或多个合适的取代基取代。在一些实施方案中，当胺是烷基胺或环烷基胺时，烷基或环烷基可被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自烷氧基、芳基氧基、烷基、烯基、炔基、酰胺、氨基、芳基、芳基烷基、氨基甲酸酯基、羧基、氰基、环烷基、酯、醚、甲酰基、卤素、卤代烷基、杂芳基、杂环基、羟基、酮、硝基、磷酸根、硫化物、亚磺酰基、磺酰基、磺酸、磺酰胺和硫酮。在某些实施方案中，当胺是烷基胺或环烷基胺时，烷基或环烷基可被一个或多个各自独立地选自氨基、羧基、氰基和羟基的取代基取代。例如，烷基胺或环烷基胺中的烷基或环烷基用氨基基团取代，形成二胺。
如本文所用，“合适的取代基”是指不使本发明的化合物或可用于制备它们的中间体的合成或药学功用失效的基团。合适取代基的实例包括但不限于：(C1-C22)、(C1-C8)、(C1-C6)或(C1-C4)烷基、烯基或炔基；(C6-C22)、(C6-C18)、(C6-C14)或(C6-C10)芳基；(C2-C21)、(C2-C17)、(C2-C13)或(C2-C9)杂芳基；(C3-C22)、(C3-C12)或(C3-C8)环烷基；(C1-C22)、(C1-C8)、(C1-C6)或(C1-C4)烷氧基；(C6-C22)、(C6-C18)、(C6-C14)或(C6-C10)芳基氧基；-CN；-OH；氧代；卤代；羧基；氨基，如–NH((C1-C22)、(C1-C8)、(C1-C6)或(C1-C4)烷基)、–N((C1-C22)、(C1-C8)、(C1-C6)或(C1-C4)烷基)2、–NH((C6)芳基)或–N((C6-C10)芳基)2；甲酰基；酮，如–CO((C1-C22)、(C1-C8)、(C1-C6)或(C1-C4)烷基)、–CO(((C6-C10)芳基)酯，如–CO2((C1-C22)、(C1-C8)、(C1-C6)或(C1-C4)烷基)和–CO2((C6-C10)芳基)。本领域技术人员基于本发明的化合物的稳定性和药理学活性及合成活性可以很容易地选择合适的取代基。
除非另有规定，化学基团包括其相应的一价、二价、三价和四价基团。例如，甲基包括一价甲基(–CH3)、二价甲基(–CH2–，亚甲基(methylyl))、三价甲基
Figure BDA0003536571230000411
和四价甲基
Figure BDA0003536571230000412
除非另有规定，在说明书和权利要求中使用的表示成分的量、反应条件及其他性质或参数的所有数字要被理解为在所有情况下均被术语“约”修饰的。因此，除非另外指出，应当理解的是，以下说明书及所附权利要求中列出的数字参数是近似值。最起码且不试图限制与权利要求的范围等同的原则的应用，数字参数的读取应根据报告的有效数字的数目并应用普通的舍入技术来进行。例如，术语“约”可涵盖术语“约”修饰的数字的数值的±10％、±5％、±2％、±1％、±0.5％或±0.1％的变化。在各种实施方案中，术语“约”涵盖数字的数值的±5％、±2％、±1％或±0.5％的变化。在一些实施方案中，术语“约”涵盖数字的数值的±5％、±2％或±1％的变化。在某些实施方案中，术语“约”涵盖数字的数值的±5％的变化。在某些实施方案中，术语“约”涵盖数字的数值的±2％的变化。在某些实施方案中，术语“约”涵盖数字的数值的±1％的变化。
本文的所有数值范围包括所叙述的数值范围内的所有数值和所有数值的范围。作为非限制性实例，(C1-C6)烷基也包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、(C1-C2)、(C1-C3)、(C1-C4)、(C1-C5)、(C2-C3)、(C2-C4)、(C2-C5)、(C2-C6)、(C3-C4)、(C3-C5)、(C3-C6)、(C4-C5)、(C4-C6)和(C5-C6)烷基中的任一者。
进一步地，虽然陈述本公开的宽范围的数字范围和参数是如上所讨论的近似值，但实施例部分中列出的数值则是尽可能精确地报道的。然而，应当理解，这类数值固有地含有由测量设备和/或测量技术导致的某些误差。
缩写和术语列表
1H-NMR：质子核磁共振波谱法
ADME：吸收、分布、代谢和排泄
AE：不良事件
AUC0-24：在给药后0至24小时的浓度-时间曲线下面积
BBB：血脑屏障
Cmax：最大血浆浓度
cGMP：环单磷酸鸟苷
DMSO：二甲基亚砜
DSFC：背部皮肤褶皱室(dorsal skin-fold chamber)
F细胞：具有胎血红蛋白的血细胞
FIH：人类首次(first in human)
FTIR：傅里叶变换红外光谱法
GC：气相色谱法
HBB：血红蛋白亚基β
HbF：胎血红蛋白
HBG：γ-球蛋白基因
HbS：镰状血红蛋白
hERG：人类ether-à-go-go相关基因
HPLC：高效液相色谱法
HU：羟基脲
IC：抑制浓度
IC50：半数最小抑制浓度
ICAM-1：细胞间粘附分子-1
ICH：国际协调会议(International Conference on Harmonisation)
ICP-MS：电感耦合等离子体质谱法
IV：静脉内
MAD：多递增剂量
MTD：最大耐受剂量
NO：一氧化氮
NOAEL：未观察到不良作用水平
PD：药物动力学
PDE9：磷酸二酯-9
PEG：聚乙二醇
PIC：胶囊中的粉末(Powder in capsule)
PK：药物代谢动力学
PKG：蛋白激酶G
RBC：红细胞
RH：相对湿度
SCD：镰状细胞疾病
SD：标准差
SEM：平均值的标准误差
sGC：可溶性鸟苷酸环化酶
t1/2：半衰期
TK：毒代动力学
Tmax：最大浓度的时间
VOC：血管闭塞性危象
WBC：白细胞
w/w％：重量/重量百分比
实施例
应理解，以下实施例旨在说明而非限制本发明。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，在阅读本公开之后，本领域技术人员将清楚前述描述和实施例的各种其他实施例和修改，并且旨在将所有这样的实施例或修改包括在所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物和专利均通过引用整体并入本文。
实施例1.PDE9抑制剂的合成
可以使用WO 2013/053690和/或WO 2013/110768中公开的方法制备本发明的化合物。化合物P1、P2、P3和P4可以如下所述地合成。
总方案：
Figure BDA0003536571230000451
方案1：
Figure BDA0003536571230000452
方案2(化合物(P1))：
Figure BDA0003536571230000461
方案3(化合物(P2)):
Figure BDA0003536571230000462
方案4(化合物(P3))：
Figure BDA0003536571230000471
方案5(化合物(P4))：
Figure BDA0003536571230000472
合成步骤：
缩写列表
aq 水
NBS N-溴代丁二酰亚胺
Boc 叔丁氧羰基
℃ 摄氏度
CDI N,N-羰基二咪唑
δH 相对于四甲基硅烷在低场的化学位移，单位为百万分之一
DCM 二氯甲烷
DEAD 偶氮二甲酸二乙酯
Dppf 双(二苯基膦)二茂铁
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DMF N,N-二甲基甲酰胺
eq 当量
ESI 电喷雾电离
Et 乙基
EtOAc 乙酸乙酯
g 克
HPLC 高效液相色谱法
h 小时
Hz 赫兹
J 耦合常数(在NMR波谱中)
LCMS 液相色谱法-质谱法联用
LiHMDS 双(三甲基硅烷基)酰胺锂
μ 微
m 多重峰(光谱)；米；毫
M+ 母分子离子
Me 甲基
MeCN 乙腈
MeOH 甲醇
MHz 兆赫兹
min 分钟
mL 毫升
MS 质谱法
MTBE 甲基叔丁基醚
N 当量浓度(当量每升)
NaOH 氢氧化钠
NBS N-溴代丁二酰亚胺
nm 纳米
NMR 核磁共振
PE 石油醚，沸点：60～90oC
RT 室温
s 单峰(波谱)
t 三重峰(波谱)
T 温度
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱法
TMS 四甲基硅烷
TMS-Cl 三甲基氯硅烷
Tol 甲苯
一般实验方法
在Bruker Avance III 400MHz和Bruker Fourier 300MHz上记录1H NMR谱图，并使用TMS作为内标。
LCMS在Agilent LC/MSD 1200系列(柱：ODS 2000(50×4.6mm，5μm)上在四极杆质谱仪上进行，以ES(+)或(-)电离模式操作；T＝30℃；流速＝1.5mL/min；检测波长：214nm。
6-氯-吡嗪-2-基胺(9)的合成
Figure BDA0003536571230000491
将化合物8(450.0g，3.02mol)在浓NH3水溶液(3.0L)中的溶液在10L密封压力容器中于135℃下搅拌过夜。TLC和LC/MS显示起始原料完全转化。将反应混合物冷却至室温，并过滤，得到白色固体。将该固体用水(200mL x 3)洗涤，然后干燥，得到为固体的化合物9(312g，收率为80％)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.82(s,1H),7.12(s,1H),6.93(s,2H)。MS计算值：129MS实测值：130([M+H]+)。
6-氯-5-碘-吡嗪-2-基胺(10)的合成
Figure BDA0003536571230000501
在0℃下历经2小时向化合物9(312.0g，2.4mol)和K2CO3(664.0g，4.8mol)在MeOH(1.0L)中的混合物滴加ICl(704.0g，4.3mol在1.0L DCM中)。然后将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应用Na2SO3水溶液(2M，1.5L)淬灭。将混合物用DCM(1.0L x 3)萃取。合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。粗产物经硅胶柱色谱法(PE/EA＝10/1至4/1)纯化，得到为固体的化合物10(460g，收率为75％)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.68(s,1H),7.07(s,2H)。MS计算值：255MS实测值：256([M+H]+)。
5-氨基-3-氯-吡嗪-2-甲腈(11)的合成
Figure BDA0003536571230000502
将化合物10(460.0g，1.8mol)和CuCN(177.0g，1.98mol)在DMF(2.0L)中的混合物在油浴上于150℃下搅拌2小时。LC/MS显示起始原料完全转化。将反应混合物冷却至室温，并倒入至EtOAc(1.5L)中。向得到的混合物中缓慢加入浓NH3水溶液(1.0L)，然后将其用EtOAc(1.0L x 2)萃取。将合并的有机相用H2O(1.5L x 5)和盐水(1.5L)洗涤，并经无水Na2SO4干燥。将有机相过滤并浓缩，得到为固体的化合物11(232g，收率为84％)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.12(s,2H),7.88(s,1H)。MS计算值：154；MS实测值：155([M+H]+)。
5-氨基-3-甲氧基-吡嗪-2-甲腈(12)的合成
Figure BDA0003536571230000511
在圆底烧瓶中将叔丁醇钾(168.0g，1.5mol)分份加入到甲醇(1.5L)中。将混悬液回流1小时。然后在N2气氛下加入化合物11(232.0g，1.5mol)。将得到的悬浮液回流1.5小时。冷却至室温后，将反应混合物在真空下浓缩，并用水(2.0L)稀释，然后用EtOAc(2.0L x5)萃取。将合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到为固体的12(170g，收率为75％)。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ7.69(s,2H),7.51(s,1H),3.89(s,3H)。MS计算值：150；MS实测值：151([M+H]+)。
(5-氰基-6-甲氧基-吡嗪-2-基)-氨基甲酸叔丁酯(13)的合成
Figure BDA0003536571230000512
在室温下将4-二甲基氨基吡啶(1.0g，0.01mol)加入至化合物12(120.0g，0.8mol)在DCM(1.5L)中的混合物中。然后在10-20℃下2小时内滴加含二碳酸二叔丁酯(327g，1.5mol)的DCM(1.0L)。然后将反应在室温下搅拌过夜。使混悬液溶解，然后将反应溶液用2L水稀释。分离DCM相，并用硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。残余物经硅胶柱色谱法(PE/EtOAc＝10:1)纯化，得到13(150g，收率为75％)。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ10.78(s,1H),8.70(s,1H),3.97(s,3H),1.49(s,9H)。MS计算值：250；MS实测值：251([M+H]+)。
(5-氨基甲基-6-甲氧基-吡嗪-2-基)-氨基甲酸叔丁酯(14)的合成
Figure BDA0003536571230000513
在室温下将Raney Ni(10.0g)加入至化合物13(30.0g，120mmol)在浓NH3的MeOH(500mL)溶液中的混合物。将混悬液在室温、1atm H2下搅拌过夜。将反应混合物用DCM/MeOH(1:1)的混合物稀释。将反应混合物过滤，并将滤液在真空中浓缩。将残余物用PE/EtOAc＝2/1研磨，得到为固体的14(23g，收率为75％)。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.46(s,1H),3.87(s,3H),3.70(s,2H),3.17(s,3H),1.47(s,9H)。MS计算值：254；MS实测值：255([M+H]+)。
5-[(4-氟-苯甲酰基氨基)-甲基]-6-甲氧基-吡嗪-2-基-氨基甲酸叔丁酯(15)的合成
Figure BDA0003536571230000521
向化合物14(4.52g，17.86mmol)在DCM(200mL)中的溶液中加入TEA(5.41g，58.53mmol)，然后滴加4-氟苯甲酰氯(3.4g，21.42mmol)。将得到的反应混合物在室温下搅拌2小时。TLC检测反应完全。将反应用水(100mL)淬灭。分离有机相，并将水相用DCM(200mL×2)萃取。将合并的有机相经无水MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。残余物经硅胶柱色谱法纯化，得到为固体的15(5.77g，收率为85.9％)。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.89(s,1H),8.81(t,J＝5.6Hz,1H),8.46(s,1H),7.94(m,2H),7.29(m,2H),4.49(d,J＝5.6Hz,2H),3.90(s,3H),1.47(s,9H)。MS计算值：376；MS实测值：377([M+H]+)。
N-(5-氨基-3-甲氧基-吡嗪-2-基甲基)-4-氟-苯甲酰胺(16)的合成
Figure BDA0003536571230000522
将化合物15(5.77g，15.33mmol)溶解于DCM(25mL)。加入TFA(25mL)。将反应在室温下搅拌过夜。TLC检测反应完全。除去溶剂。将残余物用DCM(100mL)和饱和NaHCO3水溶液(100mL)稀释。分离有机相，并将水相用DCM(100mL×2)萃取。合并的有机相经无水MgSO4干燥，过滤并在真空中浓缩。残余物经硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc＝6:1至1:1洗脱)纯化，得到为固体的16(3.9g，收率为92.2％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):δ7.90-7.85(m,2H),7.46(s,1H),7.40(t,J＝6.0Hz,1H),7.11(m,2H),4.60(d,J＝6.0Hz,2H),4.37(s,2H),3.93(s,3H)。MS计算值：276；MS实测值：277([M+H]+)。
4-氟-N-(5-碘-3-甲氧基-吡嗪-2-基甲基)-苯甲酰胺(17)的合成
Figure BDA0003536571230000531
将化合物16(3.9g，14.1mmol)溶解于无水THF(100mL)。在N2气氛下加入CuI(2.7g，14.1mmol)，然后加入亚硝酸异戊酯(4.9g，42.3mmol)和CH2I2(3.8g，14.1mmol)。将反应混合物在75℃下加热3小时。然后使反应冷却至室温，并过滤。将滤液在真空中浓缩。残余物经硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc 5:1洗脱)纯化，得到为固体的17(2.0g，收率为37％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.34(s,1H),7.88(m,2H),7.36(t,J＝4.4Hz,1H),7.14(m,2H),4.66(d,J＝4.4Hz,2H),4.04(s,3H)。MS计算值：387；MS实测值：388([M+H]+)。
3-(4-氟-苯基)-6-碘-8-甲氧基-咪唑并[1,5-a]吡嗪(18)的合成
Figure BDA0003536571230000532
将化合物17(1.6g，4.13mmol)混悬于MeCNCH3CN(50mL)。在N2气氛下加入POCl3(6.3g，41.3mmol)和TEA(1.25g，12.39mmol)，并将反应混合物在85℃下加热6小时。减压除去溶剂。将残余物用DCM(100mL)和冰水(30mL)稀释。然后加入饱和Na2CO3水溶液(100mL)。分离有机相，并将水相用DCM(100mL×2)萃取。将合并的有机相干燥，过滤并在真空中浓缩。残余物经硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc＝20:1至3:1洗脱)纯化，得到为固体的18(1.5g，收率为97.8％)。
1HNMR(300MHz,CDCl3):δ8.01(s,1H),7.82(s,1H),7.77-7.72(m,2H),7.28-7.23(m,2H),4.11(s,3H)。MS计算值：369；MS实测值：370([M+H]+)。
3-(4-氟-苯基)-8-甲氧基-咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-羧酸甲酯(19)的合成
Figure BDA0003536571230000541
向18(4.11g，11.13mmol)、CuI(640mg，3.34mmol)和Pd(dppf)2Cl2(930mg，1.11mmol)在MeOH(100mL)中的混合物溶液中加入TEA(14mL)。在CO气氛(3.0MPa)下将反应混合物加热至85℃，持续16小时。使反应混合物冷却至室温，并在真空中浓缩，得到粗产物。残余物经硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc＝1:1洗脱)纯化，得到19(2.3g，收率为75％)，为固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.59(s,1H),7.87(s,1H),7.78(m,2H),7.28(m,2H),4.21(s,3H),3.96(s,3H)。MS计算值：301；MS实测值：302([M+H]+)。
[3-(4-氟-苯基)-8-甲氧基-咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基]-甲醇(20)的合成
Figure BDA0003536571230000542
将粉末状的无水CaCl2(4.23g，38.15mmol)和NaBH4(2.86g，76.3mmol)在THF(100mL)中的混合物在室温下搅拌1小时。加入化合物19(2.3g，7.63mmol)在THF(25mL)中的溶液，然后加入MeOH(25mL)。将反应混合物在室温下搅拌1.5小时。将混合物反应用水(50mL)淬灭。减压除去有机溶剂后，将得到的溶液溶解于EtOAc(200mL)和水(50mL)中。将分离的水相用EtOAc(3x 100mL)萃取。然后将合并的有机相减压浓缩。残余物经硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc＝2:1洗脱)纯化，得到期望的产物化合物20(1.93，收率为93％)，为固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.81(s,1H),7.79-7.74(m,3H),7.25-7.22(m,2H),4.56(d,J＝4.4Hz,2H),4.11(s,3H),2.41(t,J＝4.4Hz,1H)。MS计算值：273；MS实测值：274([M+H]+)。
6-氯甲基-3-(4-氟-苯基)-8-甲氧基-咪唑并[1,5-a]吡嗪(21)的合成
Figure BDA0003536571230000551
在冰水浴上冷却的同时向20(1.88g，6.88mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液滴加亚硫酰氯(4.5mL)。加入完成后，将混合物再搅拌2小时。将反应混合物用冰水淬灭，用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩，得到为固体的21(2.01g，收率为100％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.87(s,1H),7.83-7.79(m,3H),7.30-7.27(m,2H),4.50(s,2H),4.12(s,3H)。MS计算值：291；MS实测值：292([M+H]+)。
6-氯甲基-3-(4-氟-苯基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(22)的合成
Figure BDA0003536571230000561
向21(1.87g，6.41mmol)在MeOH(50mL)中的溶液加入6N HCl水溶液，并将得到的溶液在70℃下搅拌1小时。将混合物浓缩，得到产物22(1.60g，收率为90％)，为白色固体。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ11.29(s,1H),8.07(s,1H),7.83-7.87(m,2H),7.74(s,1H),7.46-7.50(m,2H),4.59(s,2H)。MS计算值：277；MS实测值：278([M+H]+)。
4-(氮杂环丁烷-3-基氧基)-吡啶盐酸盐(5)的合成
Figure BDA0003536571230000562
向3-羟基氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯1(4.55g，26.3mmol)在THF(100mL)中的溶液加入吡啶-4-醇(2.0g，21.0mmol)、PPh3(6.89g，26.3mmol)和DEAD(4.57g，26.3mmol)。将得到的反应混合物在70℃下搅拌过夜。TLC表明反应完全。将反应混合物在真空下浓缩。将得到的油溶解于1.0M HCl水溶液(，20mL)，并用DCM(50mL×3)萃取。将合并的有机相用HCl(aq)溶液(0.5M，150mL)洗涤。合并水溶液部分并用NaOH(1.0M)碱化至pH≈12，并用DCM(100mL×3)萃取。合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。残余物经硅胶柱色谱法纯化，得到4(2.81g，收率为53％)，为固体。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.41(d,J＝6.0Hz,2H),6.88(d,J＝6.0Hz,2H),5.07-5.09(m,1H),4.32-4.33(m,2H),3.80-3.82(m,2H),1.39(s,9H)。MS计算值：250；MS实测值：251([M+H]+)。
向4(2.81g，11.2mmol)在Et2O(100mL)中的溶液加入HCl的Et2O溶液(20mL)。将得到的反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC表明反应完全。过滤反应混合物，并干燥固体，得到5(1.82g，收率为87％)。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ9.58(s,2H),8.77-8.79(m,2H),7.48-7.49(m,2H),5.40-5.45(m,1H),4.49-4.51(m,2H),4.07-4.11(m,2H)。MS计算值：150；MS实测值：151([M+H]+)。
3-(4-氟苯基)-6-((3-(吡啶-4-基氧基)氮杂环丁烷-1-基)甲基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-8(7H)-酮(P1)的合成
Figure BDA0003536571230000571
向化合物22(1.5g，5.4mmol)和5(1.31g，7.0mmol)在MeCN(100mL)中的混合物加入DIPEA(6.96g，5.4mmol)。将反应混合物加热并回流过夜。在真空中除去溶剂。残余物经反相硅胶快速柱色谱法(用5％～95％的MeCN水溶液洗脱)纯化，得到期望的产物P1(1.28g，收率为62％)，为固体。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.7(s,1H),8.37(d,J＝6.0Hz,2H),7.85(s,1H),7.85-7.82(m,2H),7.42(m,2H),7.34(s,1H),6.86(d,J＝6.0Hz,2H),4.93(m,1H),3.88-3.77(m,2H),3.42(s,2H),3.18-3.14(m,2H)。MS计算值：391；MS实测值：392([M+H]+)。
(6-甲氧基-5-{[(四氢-吡喃-4-羰基)-氨基]-甲基}-吡嗪-2-基)-氨基甲酸叔丁酯(23)的合成
Figure BDA0003536571230000572
向化合物14(28.4g，0.11mol)在DCM(200mL)中的溶液加入TEA(49mL，0.34mol)，然后滴加四氢吡喃-4-甲酰氯(17.5g，0.13mol)。将得到的反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC表明反应完全。将反应用水(100mL)淬灭。分离有机相，并将水相用DCM(200mL x 2)萃取。合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。残余物经硅胶柱色谱法(PE/EA＝5/1至1/3)纯化，得到为固体的23(31g，收率为75％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ9.89(s,1H),8.47(s,1H),8.10-8.07(t,J＝5.2Hz,1H),4.29-4.28(d,J＝5.2Hz,2H),3.87(s,3H),3.85-3.82(m,2H),3.32-3.25(m,2H),2.45-2.43(m,1H),1.60-1.55(m,4H),1.48(s,9H)。MS计算值：366；MS实测值：367([M+H]+)。
四氢-吡喃-4-羧酸(5-氨基-3-甲氧基-吡嗪-2-基甲基)-酰胺(24)的合成
Figure BDA0003536571230000581
将化合物23(19.0g，0.08mol)溶解于DCM(100mL)。加入TFA(100mL)。将反应在室温下搅拌过夜。TLC表明反应完全。除去溶剂。将残余物用DCM(100mL)和饱和NaHCO3水溶液(100mL)稀释。将水相用DCM(100mL x 2)萃取。合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。残余物经硅胶柱色谱法(PE/EA＝6/1至1/1)纯化，得到为固体的24(19g，收率为85％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ7.87(t,J＝4.8Hz,1H),7.36(s,1H),6.26(br.s,2H),4.16(d,J＝4.8Hz,2H),3.86-3.82(m,2H),3.80(s,3H),3.30-3.24(m,2H),2.41(m,1H),1.59-1.54(m,4H)。MS计算值：266；MS实测值：267([M+H]+)。
四氢吡喃-4-羧酸(5-碘-3-甲氧基-吡嗪-2-基甲基)-酰胺(25)的合成
Figure BDA0003536571230000582
在N2气氛下向化合物24(15.5g，58.4mmol)、CH2I2(23.5，87.6mmol)和亚硝酸异戊酯(23.9g，204mmol)在THF(600mL)中的混合物加入CuI(11.3g，39.6mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌7小时。过滤沉淀物。将滤液浓缩，并经柱色谱法(MeOH/DCM＝1/20)纯化，得到粗产物，然后通过反相硅胶快速柱色谱法(用5％～95％MeCN的水溶液洗脱)纯化，得到期望的产物化合物25(4.5g，收率为20％)，为固体。
1H NMR(DMSO-d6,300MHz):δ8.41(s,1H),8.16(t,J＝5.4Hz,1H),4.28(d,J＝5.4Hz,2H),3.92(s,3H),3.87-3.81(m,2H),3.30-3.24(m,2H),2.49(m,1H),1.60-1.56(m,4H)。MS计算值：377MS实测值：378([M+H]+)。
6-碘-8-甲氧基-3-(四氢-吡喃-4-基)-咪唑并[1,5-a]吡嗪(26)的合成
Figure BDA0003536571230000591
向化合物25(4.5g，16.9mmol)在MeCN(100mL)中的溶液加入POCl3(18g，118mmol)。在N2气氛下将反应在回流下搅拌过夜。减压除去溶剂。将残留物用冰水(30mL)和DCM(150mL)处理。用饱和Na2CO3溶液将pH调解至7～8。将分离的水相用DCM(100mL x 4)萃取。将合并的有机相减压浓缩，得到期望的26(4.2g，收率为99％)，为固体。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ8.46(s,1H),7.64(s,1H),3.98(s,3H),3.94(m,2H),3.53-3.47(m,3H),1.81-1.77(m,4H)。MS计算值：359；MS实测值：360([M+H]+)。
8-甲氧基-3-(四氢-吡喃-4-基)-咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-羧酸甲酯(27)的合成
Figure BDA0003536571230000592
向化合物26(4.2g，11.7mmol)在MeOH(100mL)中的混悬液加入CuI(0.7g，3.0mmol)、Pd(dppf)2Cl2(1.0g，1.17mmol)和TEA(16mL)。在CO气氛(3MPa)下将反应混合物在设定为85℃的油浴上搅拌16小时。滤出沉淀物，并将滤液减压蒸发。残余物经柱色谱法(用EtOAc/PE＝2/1至MeOH/DCM＝1/20洗脱)纯化，得到期望的27(2.7g，收率为80％)，为固体。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.32(s,1H),7.70(s,1H),4.17(s,3H),4.14(m,2H),3.98(s,3H),3.66-3.60(m,2H),3.31-3.26(m,1H),2.17-2.13(m,2H),1.93(m,2H)。MS计算值：291；MS实测值：292([M+H]+)。
[8-甲氧基-3-(四氢-吡喃-4-基)-咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基]-甲醇(28)的合成
Figure BDA0003536571230000601
在室温下在THF(100mL)中将粉末状无水CaCl2(2.4g，21.5mmol)和NaBH4(1.6g，42.9mmol)的混合物搅拌1小时。加入化合物27(2.4g，4.29mmol)在THF(25mL)中的溶液，然后加入MeOH(25mL)。将反应混合物在室温下搅拌1.5小时。将混合物反应用水(50mL)淬灭。减压除去有机溶剂后，使残余物在EtOAc(200mL)和水(50mL)之间分配。将分离的水相用EtOAc(100x 3mL)萃取。然后将合并的有机相减压浓缩。残余物经硅胶柱色谱法(用DCM/MeOH＝100/1至30/1洗脱)纯化，得到期望的产物化合物28，为白色固体(1.87，收率为80％)。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ7.65(s,1H),7.43(s,1H),4.58(s,2H),4.13(d,J＝12.0Hz,2H),4.07(s,3H),3.60(dd,J＝10.4Hz,10.8Hz,2H),3.24-3.17(m,1H),2.60(m,1H),2.18-2.06(m,2H),1.90(d,J＝12.8Hz,2H)。MS计算值：263；MS实测值：264([M+H]+)。
6-氯甲基-3-(四氢吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(30)的合成
Figure BDA0003536571230000602
在0℃下向化合物28(1.9g，7.11mmol)在DCM(100mL)中的溶液加入SOCl2(5mL)，然后将反应混合物在室温下搅拌5小时。TLC和LC-MS显示起始原料已被消耗。然后浓缩混合物溶液，并将残余物溶解于HCl(aq.)溶液(6N，20mL)。将混合物反应在室温下搅拌10分钟。然后减压浓缩反应混合物，得到期望的产物化合物29(1.90g，收率为95％)，为固体。
1H NMR(DMSO-d6,300MHz):δ11.49(s,1H),8.28(s,1H),8.00(s,1H),4.55(s,2H),3.97(dd,J＝2.4Hz,2.8Hz,2H),3.53-3.43(m,3H),1.95-1.81(m,4H)。MS计算值：267MS实测值：268([M+H]+)。
3-(氮杂环丁烷-3-基氧基)-吡啶盐酸盐(7)的合成
Figure BDA0003536571230000611
以与制备胺5所用的步骤类似的步骤制备化合物7。
7的分析数据：1H NMR((DMSO-d6,400MHz):δ9.73(br d,2H),8.55(d,J＝2.4Hz,2H),8.47(d,J＝4.4Hz,2H),7.88-7.75(m,2H),5.28(t,J＝5.6Hz,1H),4.50-4.43(m,2H),4.08-4.00(m,2H)。MS计算值：150，MS实测值：151([M+H]+)。
6-[3-(吡啶-3-基氧基)-氮杂环丁烷-1-基甲基]-3-(四氢吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P2)的合成
Figure BDA0003536571230000612
向化合物30(550mg，2.05mmol)和7(500mg，2.67mmol)在MeCN(200mL)中的混合物加入DIPEA(2.7g，20.5mmol)。将反应混合物回流过夜。在真空中除去溶剂。粗产物通过反相硅胶快速柱色谱法(用5％～95％MeCN的水溶液洗脱)纯化，得到期望的产物P2(360mg，收率为46％)，为固体。
1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.26(d,J＝4.0Hz 1H),8.22(s,1H),8.20(d,J＝2.8Hz,1H),7.91(s,1H),7.24-7.21(m,1H),7.07(d,J＝2.8Hz,1H),6.79(s,1H),4.86(m,1H),4.13(m,2H),3.89(t,J＝7.6Hz,2H),3.57(m,2H),3.50(s,2H),3.28(dd,J＝2.4Hz,6.8Hz,2H),3.10-30.6(m,1H),2.14-2.08(m,2H),1.87(m,2H)。MS计算值：381；MS实测值：382([M+H]+)。
3H-咪唑-4-羧酸甲酯(32)的合成
Figure BDA0003536571230000621
向化合物31(25g，0.22mol)在MeOH(300mL)中的溶液加入H2SO4(24mL)。将混合物在回流下搅拌18小时。然后将反应溶液的pH调节至～7。在真空中浓缩反应混合物。将残余物溶解于100ml MeOH中并在室温下搅拌15分钟。过滤混合物溶液，并将滤液浓缩，得到为固体的粗产物32(28g，收率为100％)，其不经进一步纯化用于下一步骤。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.80(s,2H),3.57(s,3H)。
3H-咪唑-4-羧酸甲酯(33)的合成
Figure BDA0003536571230000622
向化合物32(22g，0.18mol)在MeCN(500mL)中的溶液加入NBS(66g，0.37mol)。将混合物在70℃下搅拌4小时。在真空中浓缩反应混合物。粗产物经硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc＝5:1至1:1洗脱)纯化，得到为固体的化合物33(20g，收率为40％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ14.35(br,1H),3.81(s,3H)。
外消旋反式-1-苄基-4-甲基-吡咯烷-3-羧酸乙酯(35)的合成
Figure BDA0003536571230000631
向34(69g，0.29mol)的甲苯溶液加入丁-2-烯酸乙酯(50g，0.44mol)和TFA(25mL，0.32mol)。在N2下将得到的溶液在50℃下搅拌过夜。向反应混合物加入饱和NaHCO3水溶液(300mL)，并将水相用EtOAc(500mL x 3)萃取。将合并的有机层用盐水(300mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。粗产物经快速色谱法(PE/EA＝20:1至6:1)纯化，得到期望的外消旋反式产物35(41g，收率为57％)，为油状物。
(S,S)-反式-1-苄基-4-甲基-吡咯烷-3-羧酸乙酯(S,S)-(35)的合成
Figure BDA0003536571230000632
向Rac-35(37g，0.15mol)的4-甲基-2-戊酮溶液中加入(-)-二苯甲酰基-L-酒石酸(34.78g，0.65eq.)，并将得到的反应混合物加热至72℃持续1小时，之后使其冷却至RT，并在RT下保持4小时。将得到的固体滤出，并将滤液用浓碳酸钠水溶液(55mL)洗涤。将水相用4-甲基-2-戊酮(15mL)萃取，并将合并的有机相用盐水(40mL)洗涤。然后将有机相用(+)-二苯甲酰基-D-酒石酸(32.16g)处理，并加热至72℃持续1小时。将反应混合物冷却至RT，并在该温度下维持4小时。将固体滤出并在滤器上干燥。然后通过加入MTBE-MeOH的混合物(2:1，270mL)使固体重结晶，加热至70℃持续1小时，并使产物在室温下沉淀4小时。将得到的固体滤出，用MTBE洗涤并干燥。按照相同的步骤再进行两次重结晶，得到纯产物，为(+)-二苯甲酰基-D-酒石酸盐(基于分离的游离碱为>98％ee)。
通过以下步骤释放游离碱：使滤出的固体在MTBE(250mL)和浓碳酸钠水溶液(250mL)之间分配，并将水相用MTBE(125mL)萃取。将合并的有机相用水(250mL)和盐水(50mL)洗涤，并蒸发，得到产物，为澄清油状物(13.79g，0.056mol)。
外消旋反式-4-甲基-吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁酯3-甲酯rac-(36)的合成
Figure BDA0003536571230000641
向35(41g，0.17mol)和Boc2O(43g，0.20mol)在EtOH(500mL)中的溶液加入Pd/C(5％，10.0g)。在H2气氛(50Psi)下将反应混合物在50℃下搅拌48小时。过滤反应混合物，并在真空中浓缩。粗产物经快速色谱法(PE/EA＝20/1)纯化，得到期望的外消旋反式36(20g，收率为46％)，为油状物。
经由(S,S)-反式-4-甲基-吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁酯3-甲酯(S,S)-(36)合成(S,S)-反式-4-甲基-吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁酯(S,S)-(37)
Figure BDA0003536571230000642
在N2-保护气氛下将(S,S)-35(12.80g，51.8mmol)和Boc2O(13.57g，1.2eq)在EtOH(150mL)中的溶液置于高压釜中，并加入Pd/C(5％，2.56g)。在搅拌下使反应混合物在45-50℃、15-20Bar H2压力下氢化，直到不再吸收氢气(48小时)。将反应混合物冷却至RT，并过滤，并将滤液用EtOH(50mL)洗涤。使滤液在<45℃下蒸发至大约25mL。加入水(10mL)和NaOH溶液(2mL)，并将得到的反应混合物在RT下搅拌2小时(GC分析显示此时起始原料完全消失)。加入水(125mL)，并将得到的混合物用MTBE(2x 50mL)萃取。将水相用2N HCl溶液处理以实现pH值为3-4(大约25mL)，并将得到的溶液用MTBE(2x 150mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(50mL)洗涤，并蒸发至大约20mL。加入正庚烷(40mL)，并使得到的反应混合物在0℃下放置2小时，之后滤出固体并干燥，得到为固体的产物(S,S)-37(9.48g，41.7mmol)。在该步骤，ee经测定为97.5％。这一物质与下面描述的rac-37具有相同的NMR和LC/MS特性。
外消旋反式-4-甲基-吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁酯(37)的合成
Figure BDA0003536571230000651
将化合物36(10.0g，39.1mmol)、NaOH(3.10g，78.2mmol)在甲醇/H2O(50/5mL)中的溶液在室温下搅拌2小时。将反应混合物浓缩并用EA(150mL)萃取。在0℃下用2M HCl将水相酸化至pH～5，并用EtOAc(150mL x 3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到为油状物的化合物37(8.0g，90％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.43(s,1H),3.55-3.51(m,2H),3.47-3.27(m,1H),2.85-2.78(m,1H),2.63-2.57(m,1H),2.34-2.28(m,1H),1.55(s,9H),1.03(d,J＝4.8Hz,3H)。
经由(S,S)-反式-3-(甲氧基-甲基-氨基甲酰基)-4-甲基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(S,S)-(38)合成(S,S)-反式-3-乙酰基-4-甲基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(S,S)-(39)
Figure BDA0003536571230000652
在10分钟内向(S,S)-37(5.0g，22.0mmol)在DCM(50mL)中的溶液加入CDI(4.25g，1.2eq)，同时在整个过程中保持温度低于5℃。将反应混合物搅拌1小时，之后在大约10分钟内将N,O-二甲基羟胺盐酸盐(3.0g，1.4eq)分成小份加入，保持温度低于5℃。然后使反应加温至室温并搅拌12小时，此时起始原料已被完全消耗。加入水(50mL)，分离各相，并用DCM(35mL)萃取水相。将合并的有机相用水(50mL)洗涤，并浓缩至大约5mL。加入THF(20mL)，将得到的溶液蒸发至干，并在高真空中干燥。加入干燥的THF(50mL)，将溶液冷却至0℃，并在N2气氛下在30分钟内滴加MeMgCl(3M，11.35mL，1.5eq)，确保温度保持低于5℃。然后将反应混合物加热至RT并搅拌2小时(此时Weinreb酰胺已被完全转化)。在低于25℃的温度下滴加饱和氯化铵水溶液(50mL)以淬灭反应，并将得到的反应混合物用EtOAc(2x 50mL)萃取，将合并的有机萃取物用盐水(50mL)洗涤并蒸发至大约5mL。加入THF(25mL)，并将得到的溶液在真空中蒸发至干，给出为油状物的产物(S,S)-39(4.91g，21.6mmol)，为大约98％ee。所有的光谱特性均与rac-39的光谱特性相同。
外消旋反式-3-(甲氧基-甲基-氨基甲酰基)-4-甲基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(38)的合成
Figure BDA0003536571230000661
向37(8.0g，34.9mmol)和O,N-二甲基羟胺(4.0g，41.9mmol)在DCM(50mL)中的溶液加入CDI(6.8g，41.9mmol)。将混合物反应在20℃下搅拌18小时。向该混合物溶液加入水(100mL)，并用DCM(100mL x 3)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，干燥，并在真空中浓缩。粗产物经快速色谱法(PE/EtOAc＝20/1)纯化，得到为油状物的外消旋反式38(8.0g，收率为84％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.68(s,3H),3.60-3.48(m,2H),3.20-3.05(m,5H),2.84-2.73(m,1H),2.40-2.32(m,1H),1.39(s,9H),0.96(d,J＝4.8Hz,3H)。
外消旋反式-3-乙酰基-4-甲基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(39)的合成
Figure BDA0003536571230000662
在0℃下向38(8.0g，29.4mmol)在THF(60mL)中的溶液加入MeMgBr(3.0M，13mL，38.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将混合物反应用饱和NH4Cl水溶液(200mL)淬灭，并用EtOAc(300mL x 3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥，并在真空中浓缩。粗产物经快速色谱法(PE/EtOAc＝10/1)纯化，得到期望的外消旋反式39(6.0g，收率为94％)，为油状物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.66-3.51(m,1H),3.49-3.39(m,1H),3.34-3.24(m,1H),2.88-2.79(m,2H),2.34-2.30(m,1H),2.15(s,3H),1.36(s,9H),1.02-1.00(m,3H)。
外消旋反式-3-(2-溴-乙酰基)-4-甲基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(40)的合成
Figure BDA0003536571230000671
在N2气氛、-78℃下将LiHMDS溶液(1M在THF中，40mL，40mmol)加入至39(6.0g，26.4mmol)在THF(100mL)中的溶液。将反应混合物在该温度下搅拌1小时。然后在-78℃下滴加TMSCl(10mL，26.4mmol)，并使反应温度升高至0℃。1小时后，在0℃下加入PhMe3NBr3(11.0g，29.1mmol)。将混合物反应再搅拌1小时，然后在室温下搅拌过夜。将反应用水(200mL)淬灭，并用EtOAc(250mL x 3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥，并在真空中浓缩。粗产物经快速色谱法(PE/EtOAc＝10/1)纯化，得到期望的外消旋反式40(4.5g，收率为56％)，为油状物。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.05(s,2H),3.69-3.50(m,2H),3.36-3.30(m,1H),3.04-2.86(m,2H),2.51-2.43(m,1H),1.39(s,9H),1.10-1.05(m,3H)。
(S,S)-反式-3-(2-溴-乙酰基)-4-甲基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(S,S)-(40)的合成
Figure BDA0003536571230000672
在N2气氛、-78℃下将LiHMDS溶液(1M在THF中，21.12mL，21.12mmol)滴加到(S,S)-39(3.96g，17.4mmol)在THF(50mL)中的溶液。将反应混合物在该温度下搅拌1小时。然后在-78℃下滴加TMSBr(6.43g，42mmol)，并使反应温度升温至0℃。1小时后，在0℃下将NBS(2.76g，15.5mmol)分成小份加入。TLC显示所有的起始原料已被消耗。滴加水(20mL)，保持温度处于RT，并将得到的反应混合物搅拌30分钟。分离各相，并将水相用MTBE(2x 15mL)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，干燥，并在真空中浓缩。将残余物再溶解于MTBE(25mL)，用水(3x 10mL)和盐水(10mL)洗涤，并在真空中浓缩，得到为油状物的产物，其可经快速色谱法(PE/EtOAc＝10/1)纯化，得到期望的(S,S)-40(6.4g，20.9mmol)，为油状物。
外消旋反式-2,5-二溴-3-[2-(1-叔丁氧羰基-4-甲基-吡咯烷-3-基)-2-氧代-乙基]-3H-咪唑-4-羧酸甲酯(41)的合成
Figure BDA0003536571230000681
向33(4.1g，14.7mmol)在DMF(30mL)中的溶液加入K2CO3(5.8g，42.5mmol)。搅拌15分钟后，将化合物40(4.5g，14.7mmol)加入到反应混合物中。在室温下搅拌反应5小时。将反应混合物用EtOAc(200mL)稀释，用盐水(200mL x 2)洗涤。然后将有机相干燥(Na2SO4)，过滤，并在真空中浓缩。残余物经柱色谱法(PE/EtOAc＝10/0～3/1)纯化，得到为固体的外消旋反式41(3.0g，收率为40％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ5.41(s,2H),3.78(s,3H),3.68-3.66(m,1H),3.48-3.45(m,1H),3.34-3.31(m,1H),3.20-3.25(m,1H),2.92-2.87(m,1H),2.50-2.46(m,1H),1.36(s,9H),1.07(m,3H)。
(S,S)-反式-2,5-二溴-3-[2-(1-叔丁氧羰基-4-甲基-吡咯烷-3-基)-2-氧代-乙基]-3H-咪唑-4-羧酸甲酯(S,S)-(41)的合成
Figure BDA0003536571230000691
向33(2.78g，9.79mmol)在NMP(30mL)中的溶液加入Na2CO3(3.11g，26.2mmol)。搅拌15分钟后，将化合物(S,S)-40(4.5g，14.7mmol)加入到反应混合物中。在室温下搅拌反应5小时。将反应混合物用EtOAc(200mL)稀释，用盐水(200mL x 2)洗涤。然后将有机相干燥(Na2SO4)，过滤，并在真空中浓缩。残余物经柱色谱法(PE/EtOAc＝10/0～3/1)纯化，得到为粗固体的产物，将其从2-丙醇/正庚烷中重结晶，得到为固体的(S,S)-41(3.03g，收率为40％)。在该阶段该物质的ee经测定为大于99％。所有的光谱数据与rac-41的光谱数据相同。
外消旋反式-3-(1,3-二溴-8-氧代-7,8-二氢-咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)-4-甲基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(42)的合成
Figure BDA0003536571230000692
向41(3.0g，5.89mmol)在MeOH(150mL)中的溶液加入NH4OAc(9.07g，117.8mmol)。在压力容器中将反应混合物加热至130℃，持续15小时。将反应混合物过滤并浓缩，得到粗产物。残余物经柱色谱法(DCM/MeOH＝100/1～10/1)纯化，得到为固体的外消旋反式42(2.2g，收率为80％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.98(br.s,1H),7.10(s,1H),3.63-3.54(m,2H),3.39-3.34(m,1H),2.84-2.77(m,2H),2.50(m,1H),1.41(s,9H),0.96(m,3H)。
(S,S)-反式-3-(1,3-二溴-8-氧代-7,8-二氢-咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基)-4-甲基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(S,S)-(42)的合成
Figure BDA0003536571230000701
向(S,S)-41(3.03g，5.9mmol)在2-丙醇(20mL)中的溶液加入NH4OAc(9.18g，118mmol)。将反应混合物在105-110℃下加热12小时，之后在搅拌下将其倒入水(60mL)中，并放置2小时。将反应混合物过滤并浓缩，得到粗产物。残余物经柱色谱法(DCM/MeOH＝100/1～10/1)纯化并蒸发，得到为固体的(S,S)-42(2.1g，4.4mmol)。该物质经测定具有99.3％ee并具有与rac-42的光谱特性相似的光谱特性。
外消旋反式-3-[1-溴-3-(3,6-二氢-2H-吡喃-4-基)-8-氧代-7,8-二氢-咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基]-4-甲基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(43)的合成
Figure BDA0003536571230000702
向化合物42(2.2g，4.62mmol)和4-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂戊硼烷-2-基)-3,6-二氢-2H-吡喃(1.1g，5.08mmol)在THF(200mL)中的混合物加入磷酸钾(2.7g，13.86mmol)。通过用N2吹扫5min使反应混合物脱气，之后向该混合物加入Pd2(dba)3(0.8g，0.92mmol)和Xanthphos(1.0g，1.84mmol)。将得到的混悬液用N2脱气10分钟。然后在N2气氛下将混合物反应加热至80℃持续15小时。冷却至室温后，将反应混合物用EtOAc(250mL)稀释，并滤出沉淀物。浓缩滤液。粗残余物经硅胶柱色谱法(用EtOAc洗脱)纯化，得到为固体的43(1.3g，收率为60％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.80(m,1H),7.34(s,1H),6.42(s,1H),4.30-4.29(m,2H),3.92-3.80(m,2H),3.63-3.33(m,4H),2.87-2.71(m,2H),2.50(m,1H),1.41(s,9H),0.95(m,3H)。
(S,S)-反式-3-[1-溴-3-(3,6-二氢-2H-吡喃-4-基)-8-氧代-7,8-二氢-咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基]-4-甲基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(S,S)-(43)的合成
Figure BDA0003536571230000711
向化合物(S,S)-42(2.11g，4.42mmol)和4-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂戊硼烷-2-基)-3,6-二氢-2H-吡喃(0.975g，4.64mmol)在1,4-二氧六环(40mL)和水(10mL)中的混合物加入磷酸钾(2.57g，12.2mmol)。通过用N2吹扫5min使反应混合物脱气，之后向该混合物加入Pd2(dba)3(0.8g，0.9mmol)和Xanthphos(1.0g，1.8mmol)。将得到的混悬液用N2脱气10分钟。然后在N2气氛下将混合物反应加热至80℃持续15小时。冷却至室温后，将反应混合物用EtOAc(250mL)稀释，并通过硅藻土过滤除去固体。浓缩滤液。粗残余物经硅胶柱色谱法(用EtOAc洗脱)纯化，得到为固体的43(1.4g，2.92mmol)。在此阶段该物质具有大于99％的ee。
外消旋反式-3-甲基-4-[8-氧代-3-(四氢-吡喃-4-基)-7,8-二氢-咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基]-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(44)的合成
Figure BDA0003536571230000712
向43(1.3g，2.73mmol)在DMF(100mL)和甲醇(30mL)中的溶液加入10％Pd/C(0.8g)。使烧瓶充入氢气(50psi)，并将混合物在50℃下搅拌过夜。冷却后，将反应混合物通过硅藻土过滤。减压浓缩滤液。粗产物经硅胶柱色谱法(用DCM/CH3OH＝100/1-20/1洗脱)纯化，得到为固体的化合物44(0.99g，收率为90％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.80(br d,1H),7.86(s,1H),6.79(s,1H),4.13-4.10(m,2H),3.83-3.79(m,3H),3.63-3.49(m,2H),3.13-3.03(m,2H),2.77-2.75(m,2H),2.54-2.53(m,1H),2.11-2.06(m,2H),1.80-1.85(m,2H),1.48(m,9H),1.12(d,J＝6.4Hz,3H)。
(S,S)-反式-3-甲基-4-[8-氧代-3-(四氢-吡喃-4-基)-7,8-二氢-咪唑并[1,5-a]吡嗪-6-基]-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(S,S)-(44)的合成
Figure BDA0003536571230000721
在N2-保护性气氛下将(S,S)-43(1.15g，2.41mmol)在甲醇(50mL)中的溶液置于高压釜中，并在氮气气氛下加入10％Pd/C(0.8g)。在搅拌下使反应混合物在45-50℃、10-15Bar H2压力下氢化，直到不再吸收氢气(24小时)。冷却后，将反应混合物通过硅藻土过滤。减压浓缩滤液。粗产物经硅胶柱色谱法(用DCM/CH3OH＝100/1-20/1洗脱)纯化，得到为固体的化合物44(0.97g，2.41mmol)。ee经测定为大于99％。
外消旋反式-6-(4-甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(45)的合成
Figure BDA0003536571230000722
向化合物44(0.99g，2.49mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液加入HCl/Et2O溶液(20mL)。将得到的混合物在室温下搅拌2小时。在真空中浓缩反应，得到为固体的外消旋反式45盐酸盐(0.75g，收率为100％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.47(s,1H),9.93(s,2H),8.41(s,1H),7.92(s,1H),3.98-3.95(m,2H),3.85-3.80(m,1H),3.58-3.44(m,3H),2.97-2.88(m,2H),2.60-2.50(m,3H),1.98-1.78(m,4H),1.08(m,3H)。
(S,S)-反式-6-(4-甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(S,S)-(45)的合成
Figure BDA0003536571230000731
向化合物(S,S)-44(800mg，2.0mmol)的溶液中加入冷(0℃)的HCl的MeOH溶液(1.5M，10mL)中，并将得到的反应混合物搅拌，同时允许回到室温。搅拌2小时后，在真空中浓缩反应，得到为固体的(S,S)-45盐酸盐(0.60g，2.0mmol)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.47(s,1H),9.93(s,2H),8.41(s,1H),7.92(s,1H),3.98-3.95(m,2H),3.85-3.80(m,1H),3.58-3.44(m,3H),2.97-2.88(m,2H),2.60-2.50(m,3H),1.98-1.78(m,4H),1.08(m,3H)。
外消旋反式-6-(4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(P3)的合成
Figure BDA0003536571230000732
向化合物45(0.75g，2.49mmol)、2-氯甲基-嘧啶(0.49g，2.99mmol)在DMF(10mL)和CH3CN(30mL)中的溶液加入K2CO3(1.7g，12.5mmol)。将混合物在45℃下搅拌48小时。将反应混合物过滤，在真空中浓缩。残余物经快速柱色谱法(DCM到含15％MeOH的DCM溶液梯度洗脱)纯化，得到为固体的外消旋反式P3(580mg，收率为59％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.85(d,J＝4.8Hz,2H),7.79(s,1H),7.42(t,J＝4.8Hz,1H),7.36(s,1H),4.11-4.04(m,3H),3.93(d,J＝15.2Hz,1H),3.684-3.62(m,2H),3.41-3.32(m,2H),3.16-3.13(m,1H),2.85～2.80(m,2H),2.44-2.40(m,1H),2.28-2.23(m,1H),2.04-1.86(m,4H),1.17(d,J＝6.4Hz,3H)。MS计算值：394.5；MS实测值：395.8([M+H]+)。
通过手性HPLC(柱：Chiralpak IA，250x 4.6mm x 5um；流动相：Hex/EtOH/DEA＝70:30:0.2)以1.0mL/min的流速分离P3的外消旋混合物(1.4g)，得到P3对映异构体1(即化合物P3.1，(3S,4S)-6-(4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮)(0.52g，RT＝9.98min)和P3对映异构体2((3R,4R)-6-(4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮，与P3对映异构体1相对)(0.49g，RT＝12.6min)。
(S,S)-反式-6-(4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮(S,S)-(P3)的合成
Figure BDA0003536571230000741
向化合物(S,S)-45(0.60g，2.0mmol)和2-氯甲基-嘧啶(0.40g，2.40mmol)在DCM(15mL)中的溶液加入DIPEA(3.1g，24mmol)，并将混合物在RT下搅拌24小时(此时所有的起始原料都已被转化)。将反应混合物冷却至5℃，并加入去离子水(10mL)。通过添加浓盐酸(大约1mL)将水相的pH调节至pH6.0，同时保持混合物的温度为<25℃。使各相分离，并将有机相用盐水(3x 5mL)洗涤(将这些洗涤液丢弃)。将水相用二氯甲烷(10mL)萃取，并将来自该萃取的有机相用盐水(3x 5mL)洗涤。合并的有机相经硫酸钠(3g)干燥1小时，过滤并蒸发。对得到的残余物进行柱色谱法(如对rac-(P3)所述的)，得到(S,S)-P3(580mg，收率为59％)，蒸发后为固体。该物质具有大于99％的ee，并且在所有方面与P3对映异构体1(上文所述的)相同。
(氨基氧基)(二苯基)氧化膦(B)的合成
Figure BDA0003536571230000751
在-30℃、氮气气氛下在15分钟内向羟胺盐酸盐(73.5g，1.05mol)在二氯甲烷(500mL)中的混悬液加入DIPEA(136g，1.05mol)。加入后形成白色沉淀物。在该温度下搅拌1小时后，在60分钟内加入二苯基次膦酰氯A(50g，0.2mol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液。在搅拌下在1小时内将混合物反应加温至0℃。通过在10分钟内加入水(200mL)淬灭反应。搅拌混合物0.5小时后，通过过滤收集沉淀物，并用水(100mL x 2)洗涤。然后减压干燥固体，得到粗产物。将粗产物用EtOH研磨，得到化合物B(27g，收率为56％)，为白色固体。
1HNMR(400MHz,CD3OD):δ77.91-7.79(m,5H),7.62-7.50(m,7H)。
MS计算值：233；MS实测值：234([M+H]+)。
3-氨基-3H-咪唑-4-羧酸甲酯(46)的合成
Figure BDA0003536571230000752
在-78℃下在2小时内向化合物3H-咪唑-4-羧酸甲酯32(30.0g，0.24mol)在THF(1.0L)中的溶液滴加LiHMDS(239mL，10M在THF中，2.4mol)。然后将反应混合物在-78℃下再搅拌2小时，并使其加温至-10℃。在该温度下加入化合物B(60.0g，0.26mol)。然后将混合物反应在环境温度下搅拌过夜。在用水(250mL)淬灭后，浓缩反应混合物。粗产物经硅胶柱色谱法(DCM/MeOH＝20/1)纯化，得到为固体的化合物46(24g，收率为73％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.82(s,1H),7.51(s,1H),6.20(s,2H),3.79(s,3H)。MS计算值：382；MS实测值：383([M+H]+)。MS计算值：141；MS实测值：142([M+H]+)。
3-(2-苄氧基-乙酰基氨基)-3H-咪唑-4-羧酸甲酯(47)的合成
Figure BDA0003536571230000761
在冰水浴上冷却的同时向化合物46(4.9g，30mmol)、苄氧基-乙酸(5.8g，30mmol)和DIPEA(18.6ml，90mmol)在DMF(100mL)中的溶液加入HATU(15.8g，36mmol)。然后将混合物在环境温度下搅拌过夜。除去溶剂后，残余物经硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc＝10:1至2:1洗脱)纯化，得到为油状物的化合物47(6.1g，收率为61％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.93(br.s,1H),7.74(s,1H),7.67(s,1H),7.39-7.33(m,5H),4.70(s,2H),4.23(s,2H),3.83(s,3H)。MS计算值：289；MS实测值：300([M+H]+)。
3-(2-苄氧基-乙酰基氨基)-3H-咪唑-4-羧酸酰胺(48)的合成
Figure BDA0003536571230000762
将化合物47(30.0g，100mmol)和浓氨水(300mL)合并在密封的试管中，并在微波辐射下加热至70℃，持续2小时。将得到的混合物在真空中浓缩，得到为固体的化合物48(26.3g，收率为96％)。MS计算值：274；MS实测值：275([M+H]+)。
2-苄氧基甲基-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(49)的合成
Figure BDA0003536571230000763
向化合物48(28.0g，100mmol)在EtOH(240mL)中的溶液滴加KOH(19.8g，300mmol)在水(200mL)中的溶液。将得到的溶液加热至回流，持续3小时。在真空中除去有机溶剂后，将混合物倒入到冰水中，并用1M HCl水溶液将pH调解至7.0。将混悬液过滤并干燥，得到为固体的化合物49(11.3g，收率为44.1％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.05(s,1H),8.45(s,1H),7.74(s,1H),7.39-7.29(m,5H),4.59(s,2H),4.36(s,2H)。MS计算值：256；MS实测值：257([M+H]+)。
2-苄氧基甲基-7-碘-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(50)的合成
Figure BDA0003536571230000771
在-78℃下向化合物49(10.0g，38.2mmol)在THF(240mL)中的溶液滴加n-BuLi(46mL)，并将反应在低于-70℃的温度下搅拌1小时。在该温度下滴加碘(39.3g，153mmol)在THF(120mL)中的溶液，然后使反应温度缓慢升温至室温。将反应用饱和Na2SO3水溶液(120mL)淬灭，然后用EtOAc(150mL×3)萃取。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩，得到粗产物。残留物经硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc＝10:1至2:1洗脱)纯化，得到为固体的化合物50(4.75g，收率为32.5％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.16(br.s,1H),7.84(s,1H),7.42-7.29(m,5H),4.62(s,2H),4.40(s,2H)。MS计算值：382；MS实测值：383([M+H]+)。
2-苄氧基甲基-7-(3,6-二氢-2H-吡喃-4-基)-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(51)的合成
Figure BDA0003536571230000772
向化合物50(4.75g，10.0mmol)在二氧六环(80mL)中的溶液滴加Cs2CO3(9.88g，30mmol)在水(12mL)中的溶液，接着滴加Pd(PPh3)4(2.36g，2.00mmol)和4-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂戊硼烷-2-基)-3,6-二氢-2H-吡喃(3.86g，18.0mmol)。通过用N2吹扫15min使反应混合物脱气。然后将混合物加热至回流，持续16小时。在真空中除去溶剂后，残余物经硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc＝10:1至1:5洗脱)纯化，得到为固体的化合物51(2.1mg，收率为76％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.10(br.s,1H),7.78(s,1H),7.39-7.30(m,5H),7.25(s,1H),4.62(s,2H)，4.41(s,2H),4.27(d,J＝2.8Hz,2H),3.82(t,J＝5.2Hz,2H),2.63(m,2H)。MS计算值：338；MS实测值：339([M+H]+)。
2-羟基甲基-7-(四氢-吡喃-4-基)-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(52)的合成
Figure BDA0003536571230000781
向化合物51(1.8g，5.0mmol)在MeOH(70mL)中的溶液加入Pd(OH)2(20％，在碳上(用大约50％水润湿)，400mg)。将反应烧瓶充入氢气(50psi)，并将混合物在加热至70℃的油浴上搅拌，直到LC/MS显示起始原料已被消耗。通过硅藻土过滤混悬液，并将过滤器用MeOH(100mL×2)洗涤。将合并的有机相在真空中浓缩，得到为固体的化合物52(1.0g，收率为79％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.65(s,1H),7.68(s,1H),4.30(s,2H),3.96-3.92(m,2H),3.51-3.17(m,3H),1.88-1.81(m,4H)。MS计算值：250；MS实测值：251([M+H]+)。
2-氯甲基-7-(四氢吡喃-4-基)-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(53)的合成
Figure BDA0003536571230000782
在冰水浴上冷却的同时向化合物52(1.0g，4mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液滴加SOCl2(15mL)。然后将得到的混合物在环境温度下搅拌过夜。在真空中浓缩反应混合物，得到为固体的化合物53(1.07g，收率为100％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.50(br.s,1H),8.02(s,1H),4.57(s,2H),3.95(m,2H),3.57-3.48(m,3H),1.91-1.81(m,4H)。MS计算值：268；MS实测值：269([M+H]+)。
3-(4-氟-苄氧基)-氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(2)的合成
Figure BDA0003536571230000791
在冰水浴上冷却的同时向化合物3-羟基-氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯1(5.30g，30mmol)在DMF(60mL)中的溶液加入NaH(1.80g，45mmol)。然后将混悬液在该温度下搅拌1小时，接着加入1-氯甲基-4-氟-苯(8.94g，60mmol)。将得到的混合物在环境温度下搅拌过夜。将反应混合物倒入到水(200mL)中，并用EtOAc(150mL×3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩，得到粗产物。残余物经硅胶柱色谱法(用PE/EtOAc＝10:1至2:1洗脱)纯化，得到为油状物的化合物2(7.90g，收率为94％)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ7.41-7.37(m,2H),7.21-7.14(m,2H),4.40(s,2H),4.33-4.29(m,1H),4.02-3.97(m,2H),3.68-3.66(m,2H),1.37(s,9H)。MS计算值：281；MS实测值：282([M+H]+)。
3-(4-氟-苄氧基)-氮杂环丁烷(3)的合成
Figure BDA0003536571230000792
在冰水浴下向化合物2(2.68g，9.30mmol)在二氧六环(30mL)中的溶液加入HCl/二氧六环(4M，9.25mL)。然后将反应混合物在环境温度下搅拌过夜。在真空中浓缩反应溶液，得到化合物3的盐酸盐(1.2g，收率为71％)，为固体。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ7.36(m,2H),7.16(m,2H),4.35(s,2H),4.39(m,1H),3.47(t,J＝7.5Hz,2H),3.38(t,J＝7.2Hz,2H)。MS计算值：181；MS实测值：182([M+H]+)。
2-[3-(4-氟-苯氧基)-氮杂环丁烷-1-基甲基]-7-(四氢-吡喃-4-基)-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(P4)的合成
Figure BDA0003536571230000801
向化合物53(1.27mg，4.0mmol)和化合物3(1.8g，8.3mmol)在CH3CN(20mL)中的溶液加入DIPEA(2.61mL，20mmol)。将得到的溶液加热至70℃，持续2小时。TLC表明反应完全。在真空中浓缩反应。残余物经硅胶柱色谱法纯化(用DCM/MeOH 100:1至30:1洗脱)，得到期望的产物P4(1.23g，收率为74％)，为固体。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.70(br.s,1H),7.67(s,1H),7.37(m,2H),7.16(m,2H),4.38(s,2H),4.17(m,1H),3.95～3.92(m,2H),3.56(t,J＝8.0Hz,2H)，3.54～3.46(m,4H),3.37～3.35(m,1H),3.06～3.03(m,2H),1.86～1.80(m,4H)。MS计算值：413；MS实测值：414([M+H]+)。
实施例2.化合物P3.1的合成和配制
化合物P3.1是P3的对映异构体。化学名称：6-[(3S,4S)-4-甲基-1-(嘧啶-2-基甲基)吡咯烷-3-基]-3-四氢吡喃-4-基-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮或(3S,4S)-6-(4-甲基-1-嘧啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-3-(四氢-吡喃-4-基)-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮。
Figure BDA0003536571230000811
化合物P3.1
根据实施例1中的方法合成化合物P3.1。该合成包括Suzuki偶联、在钯催化剂存在下的还原、脱保护和烷基化以产生化合物P3.1。
对化合物P3.1完成稳定性研究。将化合物P3.1的样品等分到双壁聚乙烯袋中，将其打结，然后在铝袋中热密封。将样品在环境温度和40℃-45℃(无湿度对照)下储存，在3个月的时间内进行测试。
在研究期间，在室温或加速条件下该物质的外观或纯度没有变化，表明药物物质不易受加速温度条件的影响。
在另一个稳定性研究中，将化合物P3.1以约40mg/mL溶解在纯化水中，并在8天的时间内评估纯度。将样品在冷藏和环境条件下储存，并在T＝0、第2天和第8天进行测试。在研究过程中未观察到化合物纯度或溶液外观的显著变化。
在另一项稳定性研究中，研究设计包括在25℃±2℃/60％相对湿度(RH)±5％RH以及40℃±2℃/75％RH±5％RH下的样品储存。将样品储存在与用于包装化合物P3.1的袋中相当的袋中。该研究旨在评估化合物P3.1在加速温度下长达6个月和在25℃的规定储存温度下储存36个月的稳定性。
通过将化合物直接填充到不透明的白色明胶胶囊(胶囊中的粉，PIC)中来制备化合物P3.1包装。不添加粘合剂、填充剂或其他赋形剂。胶囊含有10至100mg的化合物P3.1。
在6个月至36个月的稳定性研究中监测包装。条件包括25℃/60％RH和40℃/75％RH(仅6个月)。测试包括外观、测定和相关物质，以及溶出度和水分分析。还包括5℃分支，但未进行测试，除非该研究表明产品在25℃分支下不稳定。
或者，通过将化合物P3.1与选择的赋形剂混合来制备剂型。可以使用的赋形剂总结在下表2中：
表2：提出的用于未来药物产品生产的赋形剂
Figure BDA0003536571230000821
实施例3.体外测试–PDE9和PDE1抑制试验
PDE9抑制试验
可以例如如下进行PDE9试验：该试验在60μL样品中进行，所述样品含有固定量的相关PDE酶(足以转化20-25％的环核苷酸底物)、缓冲液(50mM HEPES7.6；10mM MgCl2；0.02％吐温20)、0.1mg/ml BSA、225pCi的3H-标记的环核苷酸底物、最终浓度为5nM的氚标记的cAMP以及不同量的抑制剂。通过添加环核苷酸底物而引发反应，并且使反应在室温下进行1个小时，然后通过与15μL 8mg/mL硅酸钇SPA珠(Amersham)混合而终止。使该珠在暗处静置1个小时，然后将板置于Wallac 1450 Microbeta计数器中计数。测量的信号可被转化成相对于未被抑制的对照(100％)的活性，并且可以使用EXCEL的Xlfit扩展来计算IC50值。
在本发明中，该试验在60uL试验缓冲液(50mM HEPES pH 7.6；10mM MgCl2；0.02％吐温20)中进行，该试验缓冲液含有足以转化20-25％的10nM3H-cAMP的PDE9和不同量的抑制剂。孵育1小时后，通过添加15uL 8mg/mL硅酸钇SPA珠(Amersham)终止反应。使该珠在暗处静置1个小时，然后将板置于Wallac 1450 Microbeta计数器中计数。通过使用XLfit(IDBS)的非线性回归计算IC50值。
实验结果表明，测试的本发明化合物抑制PDE9酶，IC50值低于100nM。
PDE1抑制试验
可以如下进行PDE1试验：该试验在60μL样品中进行，所述样品含有固定量的PDE1酶(足以转化20-25％的环核苷酸底物)、缓冲液(50mM HEPES pH 7.6；10mM MgCl2；0.02％吐温20)、0.1mg/ml BSA、15nM氚标记的cAMP以及不同量的抑制剂。通过添加环核苷酸底物而引发反应，并且使反应在室温下进行1个小时，然后通过与20μL(0.2mg)硅酸钇SPA珠(PerkinElmer)混合而终止。使该珠在暗处静置1个小时，然后将板置于Wallac 1450Microbeta计数器中计数。
测量的信号被转化成相对于未被抑制的对照(100％)的活性，并且可以使用XlFit(型号205，IDBS)来计算IC50值。
实施例4.体外药理学-cGMP水平
在培养的K562细胞中化合物P3.1 vs.羟基脲对cGMP的影响
该研究评估了化合物P3.1和HU对培养的K562红白血病细胞产生cGMP的影响。包括羟基脲作为对照，因为它是目前FDA批准的用于该疾病的唯一治疗(Charache et al.,NEngl J Med.,332(20):1317-22.(1995))。提出的HU在SCD中的作用机制之一是它可以产生NO，并且NO第二信使(cGMP)的细胞内水平的调节可以代表用于扩增细胞内NO依赖性信号传导的有效和细胞特异性的方法。
将K562细胞在37℃下在
Figure BDA0003536571230000831
中培养，已向
Figure BDA0003536571230000832
中加入所需浓度的测试物质或二甲基亚砜(DMSO；阴性对照)。将铺板细胞在37℃保持16小时，在16小时结束时通过酶免疫测定法检测cGMP的量。
如图2所示，用化合物P3.1或HU处理产生cGMP水平的剂量依赖性和统计学上显著的增加。10μM的化合物P3.1引发了cGMP的最大增加(至12.61pg/mg，p>0.0001)。值得注意的是，用1μM化合物P3.1处理使cGMP的浓度增加到与100μM HU引起的值大约相同的值。
在培养的K562细胞中化合物P3.1 vs.羟基脲对HbF的影响
本研究评估了化合物P3.1和HU对培养的胎血红蛋白(HbF)阳性的K562红白血病细胞百分比的影响。将K562细胞在37℃下在
Figure BDA0003536571230000833
中培养，已向
Figure BDA0003536571230000834
中加入所需浓度的测试物质或DMSO(阴性对照)。将铺板细胞在37℃保持3天，在3天结束时通过流式细胞术检测细胞内HbF的存在。
用化合物P3.1或HU处理产生了HbF阳性细胞的统计学上显著的增加(图3)。与溶媒处理的细胞相比，化合物P3.1在1和3μM的浓度下分别引起HbF细胞统计学上显著地增加至68.7％和75.6％，在10μM时峰值增加至85.6％。相比之下，在10μM和更高(但不在1和3μM)的浓度下，HU引起了HbF阳性细胞的浓度依赖性和统计学上显著的增加，在100μM浓度下观察到最高百分比的HbF阳性细胞(92.6％)，其为化合物P3.1引发类似反应所需的浓度的10倍。在考查更宽的浓度范围的类似实验中观察到一致的结果。
在来自SCD受试者的CD34+来源的红细胞中，化合物P3.1 vs.羟基脲对HbF产生的影响
本研究评估了在5名患有SCD的受试者的红细胞(RBC)中，化合物P3.1和HU对HbF产生的影响。将来自经历输注的5名SCD受试者的血液来源的CD34+细胞在连续暴露于10μM化合物P3.1或30μM HU下培养5天，并测量HbF阳性细胞的百分比和细胞内HbF的量。
如图4所示，相对于对照处理的细胞，化合物P3.1显著增加了HbF阳性CD36+细胞的百分比和这些细胞内HbF的量，HbF阳性CD36+细胞的百分比从对照的平均值18.9％增加到平均值24.6％，这些细胞内HbF的量从对照的平均MFI 7,484增加到10,840(145％)。
羟基脲在来自5个受试者中的2个的培养物中引起了大于80％的细胞死亡，使得不能对它们进行评估。对于剩余3名受试者，相对于对照处理的细胞，HU没有显著增加HbF阳性CD36+细胞的百分比(平均值为23.9％)，但是它确实显著增加了表达的HbF的量，从对照的平均MFI 7,484增加到19,383(258％)。
实施例5.体内测试-血脑屏障穿透
在开始实验之前，将雄性CD小鼠(20-24g)成对置于笼中，自由获取食物和水，适应期为3-7天。在给药之前，使动物空腹过夜。在测试期间，使小鼠保持在单独的笼子中。在以10mg/kg的剂量皮下施用测试化合物之后的30分钟和2小时(每个时间点n＝3)评估脑-血浆分布。使用适当的溶媒来溶解每种测试化合物使给药体积为10ml/kg。在采样时，用异氟烷麻醉动物并通过心脏穿刺将体循环血液样品收集到含有肝素钠作为抗凝剂的血样采集容器(vacutainer)中。将血液在4℃下以3500rpm离心10分钟以获得血浆。断头后，剖出脑部，并转移至预先称重的容器中，之后进行组织重量测定。在-80℃下储存血浆和脑，直到采用LC-MS/MS进行定量生物分析。血浆样品的结果用ng/ml表示，脑样品的结果用ng/g表示。
实施例6.体内药理学
在Berkeley镰状细胞转基因小鼠中羟基脲vs.化合物P3.1对HbF阳性和镰状红细胞的影响
本研究评估了在镰状细胞疾病小鼠模型中，化合物P3.1和HU的长期给药(30天)对HbF和细胞镰变(cell sickling)的影响。将Berkeley镰状细胞转基因小鼠(Hbatm1PazHbbtm1Tow Tg(HBA-HBBs)41Paz/J)分成7至8只动物的组，并且通过强饲法每天一次用溶媒(PEG:水)、30mg/kg/天的化合物P3.1，或100mg/kg/天的HU给药30天。这种小鼠基因型模拟了在患有镰状细胞性贫血的人中发现的遗传、血液学和组织病理学特征，包括不可逆镰状RBC、贫血和多器官病变。第30天从经过治疗的动物收集血液，用于有限的常规血液学以及镰状和HbF阳性RBC和总胆红素的百分比的推导。终止时，取出脾并称重。
治疗30天后，相对于对照，化合物P3.1和HU均导致镰状RBC百分比的统计学上显著的降低以及HbF阳性RBC百分比的增加(图5A)。此外，两种化合物均导致总胆红素、总白细胞计数和脾重量的统计学上显著的降低。它们降低了中性粒细胞水平和白细胞增多(图5B)。这些变化与RBC计数、血红蛋白浓度或血细胞比容的任何明显改变不相关。图5C显示小鼠的脾重量，并证明化合物P3.1减轻了小鼠的脾肿大。图5D显示小鼠的胆红素水平，并证明化合物P3.1减轻了小鼠的网状细胞增多。
施用30mg/kg/天的化合物P3.1 30天的耐受性良好，没有相关的死亡或异常临床体征。除1例死亡与严重贫血相关外，施用100mg/kg HU的耐受性也是良好的。
在HbSS-Townes小鼠中化合物P3.1 vs.羟基脲vs.化合物P3.1与羟基脲的组合对微脉管瘀滞和HbF阳性和镰状红细胞的百分比的影响
在短暂缺氧和再氧合后，在HbSS-Townes转基因镰状小鼠中评估化合物P3.1减少血管闭塞的能力。该研究评估了在镰状细胞疾病小鼠模型Townes转基因镰状小鼠(Hbatm1 (HBA)Tow Hbbtm2(HBG1,HBB*)Tow/Hbbtm3(HBG1,HBB)Tow/J)中，重复(10天)口服给药化合物P3.1和HU对短暂缺氧和再氧合后镰状细胞疾病的微脉管瘀滞和其他血液学标志物的影响。将HbSS-Townes小鼠分成3只小鼠的组，然后通过饮用水口服给药10mg/kg/天的化合物P3.1、30mg/kg/天的化合物P3.1、HU(100mg/kg/天)或化合物P3.1和HU的组合(分别以30和100mg/kg/天的剂量)，持续10天。最后一组接受含有0.08％甲基纤维素的水，该溶媒用于制备测试物，并用作对照。在治疗的第7天，给小鼠植入背部皮肤褶皱室(DSFC)，并且在治疗的第10天，选择并绘制DSFC窗口中的20-23个流动的皮下小静脉。在小静脉选择和绘制后，将小鼠置于室中并暴露于低氧气氛(7％O2/93％N2)1小时，之后将它们放回室内空气中。在室内空气中再氧合1小时和4小时后，重新检查所有选定的小静脉，对静态(无流动)小静脉计数，并表示为瘀滞百分比。完成这些测量后，收集血液用于临床病理学，集中于与镰状细胞疾病相关的血液学测量。
与对照相比，30mg/kg/天的化合物P3.1和100mg/kg的HU在缺氧后1小时和4小时的时间点均产生统计学上显著的瘀滞减少。在10mg/kg/天时，化合物P3.1在1小时时间点但不在4小时时间点统计学上显著地减少了瘀滞。化合物P3.1和HU的组合显示了微脉管瘀滞的最有效的减少，其中在这两个时间点均观察到相对于对照的统计学上显著的5倍的瘀滞减少(图6)。
以30mg/kg/天给予化合物P3.1产生与由更高剂量100mg/kg/天的HU引起的血液学变化广泛相似的血液学变化，最显著的是降低镰状RBC的比例、增加HbF阳性红细胞数和减少总WBC数的能力。化合物P3.1和HU的组合在镰状红细胞和HbF细胞中产生的变化与单独给予引起的变化相似(图7A)，但导致其他血液学测量(总白细胞计数、血细胞比容、血红素和血红蛋白)与对照相比的减少比单独给予时略微更大。
如图7B所示，30mg/kg/天的化合物P3.1以及100mg/kg/天的HU有效地减少了由短暂缺氧和再氧合引起的血管闭塞，但是化合物P3.1和HU的组合引起了血管闭塞的最大减少。
化合物P3.1 vs.AF27873(Pfizer PDE9抑制剂)对C57Bl/6J小鼠的行为和生物分布的影响
该研究考查了化合物P3.1和PF-04447943(也称为AF27873，一种替代的PDE9抑制剂，由Pfizer最初开发用于阿尔茨海默病，目前开发用于SCD)在5天口服施用于C57Bl/6J小鼠后对自主活动和记忆的潜在影响。
还在血浆、脑和眼中评估了这两种化合物的暴露。将总共75只7-8周龄的雄性C57Bl/6J小鼠分成5组，每组15只雄性，并通过强饲法用溶媒、10或30mg/kg/天的化合物P3.1或10或30mg/kg/天的AF27873给药，每天一次，持续5天。在治疗期间，评估所有动物的场景性恐惧条件反射，并评估每组7只动物的子组的自主活动。在第5天，在给药后30分钟从每个治疗组的3只动物收集血浆、脑和眼组织，以测量测试物的浓度。
在本研究中无论施用的剂量水平为何(10或30mg/kg/天)，化合物P3.1对自主活动或记忆均无影响。相反，与溶媒对照相比，在用10mg/kg/天的AF27873治疗后的小鼠中观察到显著(p<0.05)更多的条件性木僵(conditioned freezing)。在用30mg/kg/天的AF27873治疗的小鼠中未观察到这种效应。
就分布而言，化合物P3.1和AF27873血浆浓度彼此相似，并且随着剂量的增加而增加(在10mg/kg/天时分别为3837和3217nM，并且在30mg/kg/天时分别为9913和13100nM)。相比之下，如图8A和图8B所示，在10和30mg/kg/天的剂量水平下，化合物P3.1的组织水平始终远低于AF27873在脑(低6或7倍)中和眼(低3倍)中的水平。
就分布而言，化合物P3.1和AF27873血浆浓度彼此相似，并且随着剂量的增加而增加(在10mg/kg/天时分别为3837和3217nM，并且在30mg/kg/天时分别为9913和13100nM)。相比之下，如图8A和图8B所示，在10和30mg/kg/天的剂量水平下，化合物P3.1的组织水平始终远低于AF27873在脑(低6或7倍)中和眼(低3倍)中的水平。
因此，重复施用化合物P3.1(其与相对于循环血浆浓度非常低的脑浓度相关(血浆与脑的比率约为14))对自主活动或记忆没有影响，而用AF27873治疗(其导致高得多的眼和脑浓度(与化合物P3.1相比))与野生型动物中显著增加的条件性木僵反应相关。
总的来说，体外和体内数据支持了化合物P3.1用于治疗SCD的潜在功效。在体外，在红系细胞系K562中用浓度为1、3或10μM的化合物P3.1治疗在16小时时产生剂量依赖性和统计学上显著的cGMP水平增加，在72小时时产生剂量依赖性和统计学上显著的HbF阳性细胞数增加。与HU相比，化合物P3.1是高效的，1μM化合物P3.1将cGMP水平增加至与100μM HU后观察到的程度大致相同的程度，并且3μM化合物P3.1使HbF阳性细胞数增加至约与30或100μM HU观察到的程度大致相同的程度。重要的是，在从5个SCD受试者的血液来源的CD34+细胞离体培养的CD36+成熟RBC中，10μM化合物P3.1还显著增加了HbF水平和F细胞的百分比。相比之下，用30μM HU处理仅在5个平行CD34+细胞培养物中的3个中增加HbF水平和F细胞的百分比。此外，5个HU处理的CD34+细胞培养物中的2个显示出<80％的存活率并且不能进行分析。
在2种镰状细胞疾病小鼠模型Berkeley和Townes模型中，化合物P3.1的重复或长期施用还显著减少了疾病相关的病变。在Berkeley镰状细胞转基因小鼠模型(其模拟在患有镰状细胞性贫血的人中发现的遗传、血液学和组织病理学特征)中，每天一次口服施用30mg/kg的化合物P3.1持续30天产生了相对于阴性对照组镰状RBC百分比的统计学上显著的降低和HbF阳性RBC百分比的增加，两者的量级与重复施用100mg/kg/天HU产生的量级相当。类似于HU，相对于对照，化合物P3.1还显著降低了总胆红素水平以及白细胞计数和脾重量，对RBC计数、血红蛋白浓度或血细胞比容没有明显影响。每天口服施用30mg/kg化合物P3.1至Berkeley镰状小鼠30天和施用至Townes镰状小鼠10天的耐受性良好，无治疗相关的死亡或异常的临床体征。
类似地，在HbSS-Townes镰状细胞小鼠模型中，通过饮用水口服施用30mg/kg/天的化合物P3.1持续10天产生了与100mg/kg/天的HU引起的血液学变化广泛相似的血液学变化，最显著的是降低镰状RBC的比例、增加HbF阳性红细胞数和减少总WBC数的能力。关键的是，用化合物P3.1或HU治疗显著降低了在这些小鼠中在缺氧和再氧合后观察到的微脉管瘀滞的程度。值得注意的是，在用30mg/kg/天的化合物P3.1和100mg/kg/天的HU的组合治疗的小鼠中观察到微脉管瘀滞的最大减少，其中相对于对照，观察到瘀滞减少5倍。
如前所述，化合物P3.1不能有效地穿过血脑屏障，降低了用其他PDE9抑制剂观察到的CNS生物学调节的可能性。与此一致，在C57Bl/6J小鼠中，用10或30mg/kg/天的化合物P3.1治疗5天对自主活动或经典的恐惧条件反射(学习和记忆的动物模型)没有影响。相比之下，与溶媒对照相比，用10mg/kg/天的PF-04447943(也称为AF27873，一种PDE9抑制剂，由Pfizer最初开发用于治疗阿尔茨海默病(Huston et al.,Neuropharmacology,61(4):665-76(2011)；Schwam et al.,Curr Alzheimer Res.,11(5):413-21(2014))并且目前开发用于SCD)治疗5天显著增加了条件性恐惧。此外，虽然化合物P3.1和PF-04447943(AF27873)的血浆浓度彼此相似，但化合物P3.1的组织水平始终远低于AF27873在脑(低6至7倍)和眼(低3倍)中的水平。
实施例7.安全性药理学
化合物P3.1的安全性药理学评估包括体外hERG测定、大鼠的神经功能和呼吸研究以及比格犬(beagle dog)的心血管研究。
浓度直到10-5M的化合物P3.1的过度输注(Superfusion)对hERG介导的钾电流没有抑制作用。
在Han Wistar大鼠中，单次口服剂量为250、500和1000mg/kg的化合物P3.1对临床观察、居住笼观察(home cage observation)、手持观察(handheld observation)或体温没有影响。被认为与化合物P3.1相关的非不利发现包括250-mg/kg剂量下的感觉反应(接近反应(approach response))的短暂下降，以及500和1000mg/kg剂量下的体重/体重增加、运动活动(后肢抬起数(number of rears))和感觉反应(尾部夹痛反应)的降低。评估为与化合物P3.1相关的唯一不利发现是在给予≥500mg/kg化合物P3.1的动物中给药后0.5和24小时无可见的接近反应的发生率增加。
在大鼠中以多至500mg/kg的剂量单次口服施用化合物P3.1对评估的呼吸功能没有影响；在1000mg/kg的最高测试剂量下，观察到呼吸速率和潮气量的短暂增加，并且这些被评估为与化合物P3.1相关。在接受1000mg/kg化合物P3.1后约4.8小时发现一只雄性大鼠死亡；没有发现任何异常体征。死亡被认为与测试物有关。尸体检查和组织学检查未发现任何可能的死亡原因，并且这些水平下的血浆暴露超过500,000ng·h/mL(AUC0-24)，比预期的有效剂量高约48倍，假设在小鼠中有效剂量为30mg/kg/天。
在4只犬中进行的心血管研究中，在允许48小时的最小洗脱期后，根据交叉设计通过口服强饲法进行治疗。在有意识的犬中，剂量为10和25mg/kg的化合物P3.1对动脉血压、心率、体温、心脏传导时间、心室复极持续时间、QT变异性或ST段没有影响。在75mg/kg的最高剂量下，化合物P3.1诱导了心动过速以及轻微、渐进且延迟的血压降低和缩短的传导时间。
实施例8.动物的药物代谢动力学和药物代谢
化合物P3.1的PK评价包括吸收、分布、代谢和排泄(ADME)研究，以及CYP酶抑制的评估。
在小鼠和大鼠中，化合物P3.1容易口服吸收，最大浓度时间(Tmax)为30分钟至1小时，并且显示出高的口服生物利用度，大鼠和小鼠的Flast分别为63.4％和44.6％。化合物P3.1被快速清除，消除半衰期为≤3小时。
在大鼠的14天重复剂量毒理学研究中，化合物P3.1暴露在第1天和第14天在雄性中与剂量成比例地增加，在第1天在雌性中观察到低于成比例的增加，到第14天变为与剂量成比例的增加。有一些证据表明在雌性中暴露增加，并且在整个研究中没有证据表明累积。
在犬的14天重复剂量毒理学研究中，在第1天和第14天，平均暴露以广泛成比例的方式随剂量增加；唯一的例外是在第1天，其中在给予35或75mg/kg/天的雄性之间没有显著差异。由于个体之间存在较大差异，因此本研究无法评估累积的可能性。
在大鼠中IV给药后的血浆与脑化合物P3.1浓度的比较显示出低脑穿透，在所有评估的时间点(超出给药后4小时，此时化合物P3.1在脑中不再是可检测的)，血浆浓度比脑中的浓度高≥20倍。
基于与具有良好表征的蛋白质结合的药物的比较，化合物P3.1在测试的5种物种中显示出非常低的血浆蛋白质结合，小鼠的平均血浆结合分数(％)值为23.3％，大鼠为25.2％，犬为22.9％，猴为18.6％，人为31.4％。
化合物P3.1在人肝微粒体中在直到100μM的最高测试浓度下没有直接抑制7种关键CYP酶同种型的潜力，并且在人肝细胞中没有诱导CYP1A2或CYP2B6的潜力。
在评估化合物P3.1在小鼠、大鼠、犬、猴和人肝微粒体中的代谢稳定性(固有清除率)的研究中，化合物P3.1在所测试的物种中高度稳定，在肝微粒体中具有最小的固有清除率，无论是否存在NADPH。
在通过跨MDCK-MDR1细胞单层的双向渗透性测定评估MDR1外排转运蛋白参与化合物P3.1转运的研究中，发现化合物P3.1是强MDR1(人P-gp)外排转运蛋白底物，外排比为180。
在评估每天一次单独或组合口服施用化合物P3.1(250mg/kg/天)和HU(65mg/kg/天)7天时的毒代动力学(TK)的大鼠研究中，当单独或组合施用时，化合物P3.1和羟基脲的耐受性良好，在研究期间没有死亡或临床体征，并且各组之间在平均体重增加和食物摄入方面没有差异。当与化合物P3.1组合给予时，HU的最大浓度(Cmax)和全身暴露(在给药后0至24小时的浓度-时间曲线下面积[AUC0-24])比单独给予时低约65％，但当分别给予或与HU组合给予时，化合物P3.1的最大浓度(Cmax)和全身暴露是相似的。尽管有这一发现，但在Townes小鼠模型中，没有证据表明当与化合物P3.1组合时，HU在减少缺氧后闭塞的血管的百分比或红细胞镰变的百分比方面的活性降低。
在CD1小鼠和Sprague Dawley大鼠中单次口服和IV施用化合物P3.1的药物代谢动力学
在10mg/kg的单次口服剂量或3mg/kg的IV剂量给药后，在CD1小鼠和SpragueDawley大鼠中评估化合物P3.1的PK和生物利用度。在给药后2分钟(仅IV)、然后在8、15、30分钟和1、2、4、8和24小时取血液样品并分析关键的PK参数。在大鼠中，在24小时时取脑样品并分析化合物P3.1。为了评价化合物P3.1跨血脑屏障(BBB)的穿透，另外10只大鼠IV接受3mg/kg的化合物P3.1，并且在给药后15分钟、30分钟和1、2和4小时时从2只动物测定化合物P3.1的血浆和脑浓度。
在小鼠和大鼠中IV和口服给药化合物P3.1后的平均PK参数显示在表3中。化合物P3.1容易口服吸收，Tmax为30分钟至1小时，并且显示出高的口服生物利用度，大鼠和小鼠的Flast分别为63.4％和44.6％。在10mg/kg口服剂量后，将小鼠连续暴露于化合物P3.1，超过4小时，并将大鼠连续暴露超过8小时；到24小时时，在这两个物种中，血浆浓度低于定量下限(LLOQ)。在IV施用化合物P3.1后，在这两个物种中观察到类似的结果，到24小时时，血浆浓度低于LLOQ。这种清除率反映了这两种途径相对短的半衰期。总的来说，化合物P3.1被快速清除，消除半衰期为≤3小时。
表3：单剂量IV和口服施用化合物P3.1后的PK参数
Figure BDA0003536571230000921
缩写：AUC＝从时间0到最后一个时间点的浓度时间曲线下面积；Cl_obs＝观察到的清除率；t1/2＝半衰期；C0＝IV注射后的初始或外推药物浓度；Flast＝全身可得的剂量分数；IV＝静脉内；MRT＝平均停留时间；Vss＝稳态时的分布容积。
在大鼠中在IV给药后，血浆与脑化合物P3.1浓度的比较与低脑穿透一致，血浆浓度比脑中的浓度高至少20倍(表4)。
表4：3mg/kg单次IV剂量给药后的化合物P3.1的脑和血浆浓度
Figure BDA0003536571230000922
Figure BDA0003536571230000931
缩写：N/A＝不可得
在大鼠中进行的化合物P3.1和羟基脲的药物：药物相互作用研究
在Crl：WI(Han)品系的雄性大鼠中评价高剂量化合物P3.1(250mg/kg/天)和HU(65mg/kg/天)在每天一次单独或组合口服施用7天时的TK。从给药开始时每天观察动物，并定期记录体重和食物摄入。在第7天的6个时间点从每组动物的一个子组收集血液样品用于TK评价。
在研究期间没有死亡，也没有临床体征，并且在单独或组合给予化合物P3.1和HU的组之间平均体重增加和食物摄入是相似的。如表5所示，当与化合物P3.1组合给药时，HU的Cmax和AUC0-24比单独给药时低63％至65％，而当单独或与HU组合施用时，化合物P3.1的最大浓度和全身暴露相似。
表5：化合物P3.1和羟基脲的最大浓度和全身暴露
Figure BDA0003536571230000932
缩写：AUC0-24＝从时间0到24小时的浓度时间曲线下面积；Cmax＝最大浓度。
实施例9.毒理学
大鼠14天重复剂量研究
在大鼠的14天重复剂量毒性研究中，以0(溶媒)、50、200和400mg/kg/天的剂量口服施用(强饲)化合物P3.1。在400mg/kg/天的最高剂量下，在两种性别中均观察到临床体征，包括毛发直立、步态异常(仅雌性)、活动减少、部分闭眼、虚脱和呼吸缓慢，以及体重、体重增加和食物摄入的减少，和过早死亡。尸体检查和组织学检查未发现任何可能的死亡原因，并且这些水平下的血浆暴露超过354,000ng.h/mL(AUC0-24)，比预期的有效剂量高约>10倍，假设在小鼠中有效剂量为30mg/kg/天。
在雌性大鼠中200mg/kg/天的剂量水平导致间歇性临床体征，和对体重和食物摄入的短暂的不利影响，其在给药期结束前消退；然而，在单个雌性的心脏(慢性心肌炎)中观察显微镜检查结果。在雄性大鼠中该剂量水平的耐受性良好，仅导致非不利的临床病理学和微观变化(肾上腺的球状带的轻微肥大)。在这些数据的基础上，在雌性大鼠中，未观察到不良作用水平(NOAEL)被认为是50mg/kg/天，在雄性大鼠中被认为是200mg/kg/天。
如表6中所示，在第1天和第14天，在雄性中，暴露(AUC0-24)与剂量成比例地增加，在第1天在雌性中观察到低于成比例的增加，到第14天变为与剂量成比例的增加。然而，两种性别的最大浓度随剂量低于成比例地增加。有一些证据表明在雌性中暴露增加。在整个研究中没有明显的累积证据。
表6：在大鼠中化合物P3.1在第1天和第14天的暴露
Figure BDA0003536571230000941
Figure BDA0003536571230000951
缩写：AUC0-24＝从时间0到24小时的浓度时间曲线下面积；Cmax＝最大浓度。
比格犬14天重复剂量研究
在犬的GLP 14天重复剂量毒性研究中，化合物P3.1以0、10、35或75mg/kg/天的剂量口服施用。在给予35或75mg/kg/天的一些个体中，化合物P3.1与呕吐、液体/松软粪便、食物摄入减少和体重减轻有关，在给予75mg/kg/天的雄性中与对照相比具有统计学上显著的体重减轻。对所有剂量组的个体还注意到心率增加，尽管这些并不显著高于对照组。在任何剂量下均未观察到死亡。在雄性和雌性中，未观察到不良作用水平(NOAEL)被认为是35mg/kg/天。
如表7所示，在第1天和第14天，平均暴露(Cmax和AUC0-24)以广泛成比例的方式随剂量增加；唯一的例外是在第1天，其中在给予35或75mg/kg/天的雄性之间没有显著差异。
表7：在犬中在第1天和第14天化合物P3.1的暴露
Figure BDA0003536571230000952
缩写：AUC0-24＝从时间0到24小时的浓度时间曲线下面积；Cmax＝最大浓度。
大鼠生育力研究
在大鼠雌性生育力研究中，动物组通过口服强饲给予0、25、100或200mg/kg/d的化合物P3.1。未观察到与治疗相关的临床体征。施用化合物P3.1对早期胚胎发育没有不良作用，并且对着床前或着床后损失没有影响。没有表明化合物P3.1施用影响的肉眼可见的尸检发现结果。
基因毒性
化合物P3.1的基因毒性评价由细菌回复突变试验、染色体畸变研究和体内大鼠微核研究组成。在所有3种试验中，化合物P3.1均为阴性。
总的来说，这些研究支持了化合物P3.1的安全性。在非临床研究中：
化合物P3.1总体上在小鼠和大鼠中被快速吸收和消除，具有可接受的生物利用度，并且半衰期为约3小时。
化合物P3.1显示出跨物种(包括人)的非常低的血浆蛋白质结合。在大鼠中IV给药后就血浆vs.脑中的化合物P3.1浓度的比较中，化合物P3.1显示了低脑穿透，在评估的所有时间点，血浆浓度比脑中的浓度高≥20倍。
化合物P3.1具有跨物种(包括人)的高度稳定性，在肝微粒体中具有最小的固有清除率。此外，化合物P3.1显示出对人肝微粒体中的7种关键CYP酶同种型没有抑制活性，并且在人肝细胞中对CYP1A2或CYP2B6没有诱导作用。然而，化合物P3.1确实显示出诱导CYP3A4的潜能。
在直到250mg/kg的剂量下，化合物P3.1在大鼠的神经功能和呼吸研究中没有显著影响，或者在直到25mg/kg的剂量下，化合物P3.1在犬的心血管研究中没有显著影响。化合物P3.1在3个GLP基因毒性研究(包括细菌回复突变试验、染色体畸变试验和体内大鼠微核研究)中也是阴性的，并且在直到10-5M的浓度下，对人ether-à-go-go相关基因(hERG)介导的钾电流没有抑制作用。
在14天的重复剂量毒性研究中，在大鼠中，未观察到不良作用水平(NOAEL)对于雄性和雌性分别被认为是200和50mg/kg；在犬中，NOAEL在雄性和雌性中均为35mg/kg。
实施例10.健康成人志愿者中化合物P3.1的1a期单和多递增剂量研究
本研究为1a期、人类首次(FIH)、随机、双盲、安慰剂对照的2部分研究，以在健康成人受试者中评估口服施用的单(A部分)和多(B部分)递增剂量的化合物P3.1的安全性、耐受性和PK效应。A部分设计为大约5个队列，每个队列6个受试者，B部分设计为3个组，每组9个受试者。受试者以2:1随机分配到化合物P3.1或安慰剂。依次测试队列(剂量水平)，并且直到在3个单剂量队列中评估了至少24小时的安全性和PK数据之后才开始在B部分中开始给药。
对于研究药物的单剂量和多剂量施用，评估以下内容：安全性和耐受性，以及化合物P3.1的血浆PK曲线。此外，食物对化合物P3.1的单剂量PK曲线的影响在A部分中评估。
在A部分中，评估了以下单剂量的化合物P3.1或安慰剂：0.3mg/kg/天(mg/kg/d)(队列1)、1mg/kg/d(队列2)、3mg/kg/d(队列3)、10mg/kg/天(队列4)和30mg/kg/天(队列5)。可以招募第六队列以测试中间剂量水平。受试者在给药前一天进入临床研究单位，并在禁食过夜后第1天接受单口服剂量的研究药物；受试者保持限制在研究单位中，直到在第2天完成最后评估并且持续至剂量施用后至少24小时。
在第5天评估安全性随访。3mg/kg剂量队列中招募的受试者在研究药物施用后至少7天在禁食状态下返回临床，并且在标准高脂肪早餐后约1小时接受单剂量的研究药物(根据其最初随机结果)。
在B部分中，评估以下多剂量的化合物P3.1或安慰剂：1mg/kg(队列1)、3mg/kg(队列2)和10mg/kg(队列3)。受试者在给药前一天进入临床研究单位，并在第1天至第7天每天一次在餐后约1小时口服接受研究药物；受试者保持限制在研究单位中，直到在第8天完成最后评估并且持续至剂量施用后至少24小时。在第12天评估安全性随访。
实施例11.在患有镰状细胞疾病的成人患者中化合物P3.1的1b期、随机、双盲、安 慰剂对照研究
该研究是1b期、随机、双盲、安慰剂对照研究，以在确诊为SCD的成人受试者中评估化合物P3.1的安全性、耐受性、PK、PD和临床结果。总共招募36名受试者，目标是有32名受试者完成研究。符合条件的受试者以3:1随机接受10mg/kg(或者，如果更低的话，在先前研究中确定的最大耐受剂量(MTD))口服剂量的化合物P3.1或安慰剂QD，持续长达24周。在第一剂研究药物给药后，受试者留在临床地点24小时；受试者作为门诊病人返回该地点进行剩余的研究访视。除非根据可得的非临床(来自大鼠和犬毒性研究和大鼠生育力研究的6个月数据)和临床(第一个受试者已接受了8周的研究药物后，所有可得的安全性数据)数据确定继续给药是安全和适当的，否则没有受试者给药超过12周。
研究测量包括：化合物P3.1在患有SCD的成年受试者中的安全性和耐受性、血浆PK曲线、PD效应和临床结果影响。药效动力学(PD)效应通过总Hb、HbF、cGMP、网织红细胞计数、红细胞溶血指数和中性粒细胞计数相对于基线的变化来评估。对临床结果的影响通过以下评估：疼痛相对于基线的变化；SCD的身体、社会和情感影响；止痛药物的使用；和需要医疗或保健专业人员注意和/或住院治疗的SCD相关事件的发生，包括VOC和输注的次数和频率。
实施例12.在患有镰状细胞疾病的儿童和青少年受试者中化合物P3.1的2a期、随 机、双盲、安慰剂对照研究
本研究为2a期随机、双盲、安慰剂对照研究，以在确诊为SCD的儿童和青少年受试者(≥8岁且≤18岁)中评估化合物P3.1的安全性、耐受性、PK、PD和临床结果。总共招募60名受试者，目标是有54名受试者完成研究。在按顺序招募的2个给药队列的1个中，符合条件的受试者以2:1随机接受化合物P3.1或安慰剂，持续24周。队列1中的受试者每天一次以3mg/kg(或者，如果更低，则以1a期研究中确定的MTD的三分之一)接受化合物P3.1或安慰剂；队列2中的受试者每天一次以10mg/kg(或者，如果更低，则以先前研究中的MTD)接受化合物P3.1或安慰剂。在第一剂研究药物给药后，受试者留在临床地点24小时，并且作为门诊病人返回该地点进行剩余的研究访视。直到来自幼年大鼠毒性研究的数据可用于支持在儿童和青少年中给药之后，才开始在该研究中给药。在队列1中的前9名受试者已完成至少12周的治疗并且所有受试者的所有可得安全性数据已由SRC评估之后，才开始在队列2中给药。
研究测量包括：化合物P3.1在患有SCD的儿童和青少年中的安全性和耐受性、血浆PK曲线、PD效应和临床结果影响。PD效应通过总Hb、HbF、cGMP、网织红细胞计数、红细胞溶血指数和中性粒细胞计数相对于基线的变化来评估。对临床结果的影响通过以下评估：疼痛相对于基线的变化；SCD的身体、社会和情感影响；止痛药物的使用；和需要医疗或保健专业人员注意和/或住院治疗的SCD相关事件的发生，包括VOC和输注的次数和频率。
实施例13.TNFa活化的人细胞：在微通道试验中化合物P3.1减少中性粒细胞的粘 附
目的
该体外研究的目的是分析化合物P3.1对循环多形核中性粒细胞(PMN)和人内皮细胞的特性的影响。
在该研究中，研究了在流动条件下化合物P3.1对PMN与TNF-α活化的人内皮细胞单层粘附的影响。已经验证了体外动态试验模拟在炎性条件下(TNF-α活化)中性粒细胞募集到内皮细胞单层。在该测定中，对照和镰状PMN均粘附于内皮细胞，但程度不同，反映了体内条件。在该方法中使用人真皮微脉管内皮细胞系HMEC-1。并行测试化合物P3.1的潜在抑制作用，并与HU和其他PDE9抑制剂的作用比较。
在第一步中，通过用这些分子孵育来自健康志愿者(n＝3-6)(即供体或供体细胞)的血液样品来测试1uM化合物P3.1和10uM HU的作用。
方法
流动条件(新鲜血液)下的粘附、镰状细胞性贫血(SCA)PMN高度粘附于内皮细胞。据信这种增加的粘附引发或促成VOC。
在涂覆有在炎性条件下培养的内皮细胞单层的微通道(Venaflux,Cellix,Ireland)中，在模拟血液流动的流动条件下评估来自健康志愿者的PMN的粘附。用预先与化合物P3.1一起孵育或不与化合物P3.1一起孵育的新鲜全血进行粘附试验，以更接近人体内循环的生理条件，并研究不同血细胞与PMN之间的相互作用。结果如图9A和图9B所示。
在另一试验中，使用相同的方法，证实在微通道孔中与TNF-α活化的内皮的PMN和RBC结合的减少。来自5名健康正常志愿者(供体)的血液样品中的血小板、PMN和RBC用荧光染料标记。将血液样品与化合物P3.1一起孵育2小时或3小时，或与HU一起孵育3小时，然后将其在先前用TNF-α活化的内皮细胞涂覆的微通道上运行。在30分钟时定量结合细胞的％。结果如图10A、图10B和图10C所示。
结论
如图9A和图9B所示，未处理的供体细胞(图9A和图9B中的溶媒)证明了与TNF-α活化的内皮细胞涂覆的微通道的高结合水平(>150荧光单位)(图9A和图9B中的高结合供体)或与活化内皮细胞的低结合水平(<100荧光单位)(图9A和图9B中的低结合供体)。化合物P3.1处理对低结合供体没有影响。化合物P3.1处理的中性粒细胞降低了4个高结合供体中的3个的粘附，并且对一个高结合供体没有影响。HU处理降低了3个高结合供体中的2个的结合，并且对一个高结合供体没有影响。值得注意的是，HU处理显示出毒性，9个供体样品中的3个在HU处理下未存活。
PMN首先与内皮细胞结合。然后红细胞(RBC)与PMN结合，然后血小板与RBC结合。如图10B和10C所示，化合物P3.1减少了PMN和RBC与内皮细胞的粘附。有趣的是，用化合物P3.1或HU处理不影响血小板结合(图10A)，表明处理对P-选择素没有影响。

Claims (9)

1.一种药物组合物，其包含：
化合物P3.1：6-[(3S,4S)-4-甲基-1-(嘧啶-2-基甲基)吡咯烷-3-基]-3-四氢吡喃-4-基-7H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-8-酮；以及
羟基脲。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中化合物P3.1与羟基脲之间的摩尔比率在1:500至500:1之间，在1:100至100:1之间，在1:50至50:1之间，在1:20至20:1之间，在1:5到5:1之间，或为1:1。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中化合物P3.1以0.3mg/kg至500mg/kg施用。
4.如权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中化合物P3.1以约0.3mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约30mg/kg、约50mg/kg、约100mg/kg、约150mg/kg、约200mg/kg或约250mg/kg施用。
5.权利要求1至4中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗镰状细胞疾病的药物中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其中药物组合物为口服施用的。
7.如权利要求5或6所述的用途，其中药物组合物为每日施用的。
8.如权利要求5至7中任一项所述的用途，其中药物组合物施用1至7天。
9.如权利要求5至8中任一项所述的用途，其中药物组合物施用至少7天。
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