ES2951646T3

ES2951646T3 - Métodos y composiciones relacionados con péptidos y proteínas con elementos C-terminales

Info

Publication number: ES2951646T3
Application number: ES09711840T
Authority: ES
Inventors: Erkki Ruoslahti; Tambet Teesalu; Kazuki Sugahara
Original assignee: Burnham Institute For Medical Res; Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Current assignee: Burnham Institute For Medical Res; Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Priority date: 2008-02-21
Filing date: 2009-02-20
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2029-02-20
Also published as: WO2009105671A2; BRPI0907363A2; US11260133B2; CN102016058A; EP2250278B1; AU2009215426A1; EP2250278A2; EP2250278A4; AU2009215426B2; CA2713872A1; US20090226372A1; JP2011514160A; US20230173097A1; WO2009105671A3

Abstract

Se describen composiciones y métodos útiles para dirigir e internalizar moléculas en células de interés y para la penetración de moléculas en tejidos de interés. Las composiciones y métodos se basan en secuencias peptídicas que son internalizadas selectivamente por una célula, penetran en el tejido o ambas cosas. La internalización y penetración en el tejido descritas son útiles para administrar agentes terapéuticos y detectables a células y tejidos de interés. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones relacionados con péptidos y proteínas con elementos C-terminales

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere de manera general a los campos de la medicina molecular, más específicamente, a péptidos penetrantes en células y tejidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los péptidos que se internalizan en las células se denominan habitualmente péptidos penetrantes en células. Existen dos clases principales de dichos péptidos: los hidrofóbicos y los catiónicos (Zorko y Langel, 2005). Entre los péptidos catiónicos, utilizados habitualmente para introducir ácidos nucleicos y proteínas en células, se incluyen los péptidos penetrantes en células prototípicos Tat y penetratina (Meade y Dowdy, 2007; Derossi et al., 1998). Una proteína del virus herpes, VP22, es capaz tanto de entrar y salir de las células como de transportar una carga consigo (Elliott y O'Hare, 1997; Brewis et al., 2003). Una limitación importante de dichos péptidos como vehículos de transporte es que no son selectivos; entran en todas las células. Puede utilizarse un sistema de transporte activable que sea más específico para un tipo celular o tejido.

Los vehículos de transporte penetrantes en células son importantes por varias razones. En primer lugar, la internalización puede mejorar la dianización ya que la internalización del péptido y su carga en las células hace que el reconocimiento resulte más eficaz (Christian et al., 2003; Laakkonen et al., 2004; Weissleder et al., 1995). En segundo lugar, los elementos de dianización penetrantes en células pueden introducir cargas en el citoplasma, lo que resulta crucial, por ejemplo, en el transporte de terapéuticos basados en ácidos nucleicos. En tercer lugar, las propiedades de penetración en células, en combinación con las capacidades de salida, pueden potenciar la extravasación y la expansión en tejidos.

La penetración en tejidos es una grave limitación en el transporte de las composiciones a las células. La comparación de la distribución de los péptidos marcados con fluoresceína con la de las partículas de óxido de hierro recubiertas con el mismo péptido muestra que las partículas se mantienen próximas a los vasos sanguíneos tumorales, mientras que el péptido fluorescente alcanza todas las zonas del tumor. La "permeabilidad" frecuentemente citada de los vasos tumorales aparentemente no mitiga sustancialmente este problema. Además, los tratamientos antiangiogénicos que provocan la "normalización" de la vasculatura tumoral (Jain, 2005) crean la necesidad de dianizar tumores cuya vasculatura no es permeable. De esta manera, es importante encontrar nuevos modos de mejorar la entrada de diversas composiciones en el espacio extravascular. Es conocido que varias proteínas se traslocan a través del endotelio de los vasos sanguíneos, incluyendo la barrera hematoencefálica. Un ejemplo principal es la transferrina, que es transportada a través de la barrera hematoencefálica por el receptor de transferrina. Se ha utilizado este sistema para llevar otras cargas hasta el interior del cerebro (Li et al., 2002; Fenart y Cecchelli, 2003). Las señales de péptidos para la transcitosis endotelial que pueden mediar en la traslocación de las composiciones desde la circulación hasta el interior de tejidos resultan útiles.

De esta manera, existe una necesidad de nuevas estrategias terapéuticas para dianizar selectivamente diversos tipos de células y para internalizar proteínas y péptidos en dichas células y la penetración en los tejidos por proteínas y péptidos. La presente invención satisface dicha necesidad de proporcionar péptidos que pueden dianizarse selectivamente, e internalizarse selectivamente por diversos tipos de células y/o que pueden penetrar en tejidos. Se proporcionan también las ventajas relacionadas.

El documento n.° US 2006/0153775 A1 describe composiciones que comprenden un monómero, multímero o polímero de la secuencia de aminoácidos TKPPR expuesta al extremo C-terminal de la composición y posibles usos de las mismas.

Laakkonen et al., "Antitumor activity of a homing peptide that targets tumor lymphatics and tumor cells", PNAS, vol.

101, n.° 25, 2004, páginas 9381 a 9386, dan a conocer el péptido cíclico LyP-1 con la secuencia CGNKRTRGC.

El documento n.° WO 2009/126349 A2 describe péptidos cíclicos que presentan la secuencia CRGD[K/R]GP[D/E]C. Da a conocer, además, que los péptidos son cortados por una proteasa, exponiendo RGDK o RGDR en el extremo C-terminal del péptido cortado, y que la internalización de los péptidos es dependiente de la exposición C-terminal de la secuencia RGDK/R.

Pipkorn et al., "Delivery of substances and their target-specific topical activation", Biochimica et Biophysica Acta -Biomembranes, vol. 1758, n.° 5, 2006, páginas 606 a 610, dan a conocer un constructo que presenta la estructura general Carga-NLS (señal de localización nuclear, por sus siglas en inglés)-CBCS (sitio de corte de la catepsina B, por sus siglas en inglés)-PPC (péptido penetrante en células). Describe que el constructo resulta internalizado en las células, presumiblemente mediante la secuencia KWKK expuesta en el extremo C-terminal del constructo.

Pero et al., "Combination treatment with Grb7 peptide and Doxorubicin or Trastuzumab (Herceptin) results in cooperative cell growth inhibition in breast cancer cells", British Journal of Cancer, vol. 96, n.° 10, 2007, páginas 1520 a 1525, describe péptidos que presentan la secuencia KWWK expuesta en el extremo C-terminal.

El documento n.° WO 02/31109 A2 da a conocer péptidos que presentan la secuencia RXXR, RXXK o KXXR expuesta en el extremo C-terminal que actúan como intermediarios en la internalización en las células.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método de formación de un conjugado de CendR, en el que el método comprende:

(a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula, penetración en los tejidos o ambos, en la que la secuencia de aminoácidos comprende:

(i) un elemento CendR, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28), en el que el elemento CendR se encuentra en un extremo C-terminal del conjugado y presenta un grupo carboxilo C-terminal, o

(ii) un elemento CendR activable que comprende un elemento CendR y un grupo de bloqueo, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (Se C ID n.° 27), o RVt Rp PR (SEC ID n.° 28) y

(b) causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente a una proteína o péptido, preferentemente a una proteína o péptido circular, que comprende la secuencia de aminoácidos, en la que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR,

en el que el conjugado de CendR comprende la proteína o péptido y la composición de cargo acoplada o asociada,

en el que el elemento CendR activable se forma mediante acoplamiento covalente del grupo de bloqueo con el elemento CendR mediante un enlace escindible,

en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo y el elemento CendR se selecciona para que sea escindible por una proteasa,

en el que la escisión del enlace del elemento CendR activable expone el elemento CendR en el extremo C-terminal del conjugado,

en el que la escisión del enlace hace que el elemento CendR sea capaz de internalización en una célula.

La presente invención se refiere, además, a un conjugado de CendR producido mediante el método según la invención, en la que el método comprende:

(a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula, la penetración en tejidos, o ambos, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28), en la que el elemento CendR se encuentra en el extremo C-terminal del conjugado y presenta un grupo carboxilo C-terminal.

La presente invención se refiere, además, a un método in vitro de identificación de una célula, preferentemente en un ensayo, que pueda internalizar un elemento CendR, en el que el método comprende:

(a) exponer una célula a una secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos comprende:

(i) un elemento CendR, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28), en la que el elemento CendR se encuentra en un extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos y presenta un grupo carboxilo C-terminal, o

(ii) un elemento CendR activable que comprende un elemento CendR y un grupo de bloqueo, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (Se C ID n.° 27), o RVt Rp PR (SEC ID n.° 28),

en la que la secuencia de aminoácidos preferentemente se acopla con una proteína o péptido, más preferentemente con una proteína o péptido circular, y

(b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado,

en el que la escisión del enlace del elemento CendR activable expone el elemento CendR en el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos,

La presente invención se refiere, además, a un método in vitro de identificación de una célula de cáncer, preferentemente en un ensayo, como candidato para la terapia a base de CendR, en el que el método comprende:

(a) exponer la célula de cáncer a una secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos comprende:

(b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado por la célula de cáncer, en la que un elemento CendR internalizado identifica la célula de cáncer como candidato para la terapia a base de CendR,

La presente invención se refiere, además, a un método para producir un elemento CendR activable que puede activarse en proximidad a una célula de interés, preferentemente una célula en un sujeto, en el que el método comprende formar un elemento CendR activable en el que se acopla un grupo bloqueante con un elemento CendR mediante un enlace escindible, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28) y

en el que el enlace escindible se selecciona para que sea escindible por un enzima presente en proximidad a la célula de interés,

La presente invención se refiere, además, a un método de formación de un elemento CendR activable, en el que el método comprende:

(a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula, la penetración en tejidos, o ambos, en la que la secuencia comprende la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28),

(b) causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con la secuencia de aminoácidos formando un elemento CendR activable,

en el que el grupo de bloqueo se selecciona del grupo que consiste en una nanopartícula, compuesto, fracción o molécula,

en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo y la secuencia de aminoácidos se selecciona para que sea escindible,

en el que el grupo de bloqueo acoplado covalentemente con la secuencia de aminoácidos reduce o evita la internalización de la secuencia de aminoácidos en una célula, la penetración en tejidos de la secuencia de aminoácidos, o ambos,

en el que el elemento CendR activable comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada y el grupo de bloqueo,

en el que el grupo de bloqueo se acopla con el grupo carboxilo terminal de la secuencia de aminoácidos, con el aminoácido C-terminal de la secuencia de aminoácidos o con un aminoácido diferente del aminoácido C-terminal de la secuencia de aminoácidos,

en el que la escisión del enlace del elemento CendR activable expone la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28) en el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos, en el que la escisión del enlace hace que la secuencia de aminoácidos sea capaz de internalización en una célula.

La presente invención se refiere, además, a un elemento CendR activable producido mediante el método según la invención, en el que el método comprende seleccionar una secuencia de aminoácidos para la intemalización en una célula, la penetración en tejidos, o ambos, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPp R (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (^sE^cID n.° 28), en la que el elemento CendR se encuentra en el extremo C-terminal del conjugado y presenta un grupo carboxilo C-terminal.

La presente invención se refiere, además, a un método in vitro de identificación de un tejido en el que puede penetrar un elemento CendR, en el que el método comprende:

(a) exponer un tejido a una secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos comprende:

(b) determinar si el elemento CendR ha penetrado en el tejido,

en el que el acoplamiento mediante enlace del grupo de bloqueo con el elemento CendR se selecciona para que sea escindible por una proteasa,

La presente invención se refiere, además, a un método in vitro de identificación de un tumor como candidato para la terapia a base de CendR, en el que el método comprende:

(a) exponer el tumor o una célula del tumor a una secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos comprende:

(ii) un elemento CendR activable que comprende un elemento CendR y un grupo de bloqueo, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (S^eC ID n.° 27), o RV^tR^pPR (SEC ID n.° 28) y

(b) determinar si el elemento CendR ha penetrado en el tumor o ha sido internalizado por la célula, en el que el elemento CendR que ha penetrado o ha sido internalizado identifica el tumor como candidato para la terapia a base de CendR,

BREVE SUMARIO DE LA EXPOSICIÓN

Los productos y métodos descritos en el sumario de la exposición, a continuación, no están cubiertos por la invención reivindicada.

Se dan a conocer elementos CendR, y proteínas y péptidos que comprenden elementos CendR. Se dan a conocer, además, conjugados de CendR que comprenden una composición de carga acoplada covalentemente, o asociada no covalentemente, con una proteína o péptido que comprende un elemento CendR. Se dan a conocer, además, conjugados de CendR que comprenden una composición de carga acoplada covalentemente, o asociada no covalentemente, con una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR. La composición de carga puede acoplarse o asociarse a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR.

Se dan a conocer, además, elementos CendR activables, y proteínas y péptidos que comprenden elementos CendR activables. Se dan a conocer, además, conjugados de CendR activables que comprenden una composición de carga acoplada covalentemente, o asociada no covalentemente, con una proteína o péptido que comprende un elemento CendR activable. Se dan a conocer, además, conjugados de CendR activables que comprenden una composición de carga acoplada covalentemente, o asociada no covalentemente, con una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR activable. La composición de carga puede acoplarse o asociarse a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR activable.

Se dan a conocer, además, conjugados de CendR preparados mediante el método que comprende causar que una composición de carga esté acoplada covalentemente, o asociada no covalentemente, a una proteína o péptido que comprende un elemento CendR, en el que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. Se dan a conocer, además, conjugados de CendR preparados mediante un método que comprende causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente a una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento C-terminal, en el que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. Se dan a conocer, además, conjugados de CendR preparados mediante un método que comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula y/o la penetración en un tejido, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento C-terminal y (b) causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente con una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la composición de carga se acopla o se asocia con la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. en el que el conjugado de CendR comprende la proteína o péptido y la composición de carga acoplada o asociada.

Se dan a conocer, además, elementos CendR activables preparados mediante el método que comprende provocar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con un elemento CendR, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo y el elemento CendR es escindible. Se da a conocer, además, un elemento CendR activable preparado mediante un método que comprende causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con una secuencia de aminoácidos, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el elemento CendR es escindible. Se da a conocer, además, un elemento CendR activable preparado mediante un método que comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula y/o la penetración en un tejido, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, y (b) causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con el elemento CendR, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el elemento CendR es escindible. El grupo de bloqueo acoplado covalentemente con el elemento CendR reduce o evita la internalización en la célula y/o la penetración en tejidos. El grupo de bloqueo acoplado covalentemente con el elemento CendR puede reducir o evitar la internalización en la célula y/o la penetración en tejidos en comparación con el mismo elemento CendR sin ningún grupo de bloqueo. El elemento CendR activable puede comprender la secuencia de aminoácidos seleccionada y el grupo de bloqueo,

La proteína o péptido puede internalizarse en la célula y/o puede penetrar en tejido en el caso de que el elemento CendR esté presente en la proteína o péptido, pero no en el caso de que no esté presente el elemento CendR en la proteína o péptido. La proteína o péptido puede internalizarse en la célula y/o puede penetrar en el tejido en el caso de que la secuencia de aminoácidos seleccionada se encuentre presente en la proteína o péptido, pero no en el caso de que el aminoácido seleccionado no se encuentre presente en la proteína o péptido. El elemento CendR puede internalizarse en la célula y/o puede penetrar en tejido sin estar asociado a la composición de carga. La secuencia de aminoácidos seleccionada puede internalizarse en la célula y/o puede penetrar en tejido sin estar asociada a la composición de carga. El elemento CendR puede ser el único elemento de internalización funcional en la proteína o péptido; el elemento CendR puede ser el único elemento funcional de penetración en tejido en la proteína o péptido, o ambos. La secuencia de aminoácidos seleccionada puede ser el único elemento de internalización funcional en la proteína o péptido; la secuencia de aminoácidos seleccionada puede ser el único elemento funcional de penetración en tejido en la proteína o péptido, o ambos. El elemento CendR puede ser el único elemento de internalización funcional en el conjugado de CendR; el elemento CendR puede ser el único elemento funcional de penetración en tejido en el conjugado de CendR, o ambos. La secuencia de aminoácidos seleccionada puede ser el único elemento funcional de internalización en el conjugado de CendR, la secuencia de aminoácidos seleccionada puede ser el único elemento funcional de penetración en tejidos en el conjugado de CendR, o ambos.

El elemento CendR puede ser un elemento CendR activable. El elemento CendR puede ser un elemento CendR activable por proteasa. La proteína o péptido puede ser circular (cíclico) o puede contener un bucle. El elemento CendR puede encontrarse en el extremo C-terminal de la proteína o péptido. El elemento CendR puede comprender un grupo carboxilo terminal. Puede acoplarse un grupo de bloqueo al grupo carboxilo terminal. El enlace que acopla el grupo de bloqueo con el grupo carboxilo terminal puede seleccionarse para que sea escindible por una proteína presente en proximidad a la célula de interés. El grupo de bloqueo puede acoplarse con el aminoácido C-terminal del elemento CendR. El grupo de bloqueo puede acoplarse con un aminoácido del elemento CendR diferente del aminoácido C-terminal del elemento CendR.

Puede acoplarse covalentemente o asociarse no covalentemente una composición de carga con una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR. La composición de carga puede acoplarse o asociarse a la proteína o péptido, por ejemplo, en el lado N-terminal del elemento CendR. La composición de carga puede ser, por ejemplo, una nanopartícula o una molécula, o un complejo de moléculas con aplicaciones terapéuticas o diagnósticas. Entre las composiciones de carga terapéuticas que pueden dianizarse con elementos CendR se incluyen, aunque sin limitación, una nanopartícula, una molécula, un complejo de moléculas, un agente antiangiogénico, un agente proangiogénico, un agente quimioterapéutico de cáncer, un agente citotóxico, un agente prosupervivencia celular, un agente de diferenciación celular, un agente neuroprotector, un agente inmunomodulador, un agente antiinflamatorio, un agente antiartrítico, un agente antivírico o una combinación de los mismos. Entre las composiciones de carga diagnósticas que pueden dianizarse con elementos CendR se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, una nanopartícula, una molécula, un complejo de moléculas, un agente de obtención de imágenes de resonancia magnética (RM), un agente de radioimagen, un agente de obtención de imágenes ópticas, una etiqueta molecular (tal como biotina), un fluoróforo, una etiqueta de epítopo (que puede, por ejemplo, detectarse utilizando un ensayo molecular específico) o una combinación de los mismos. La composición de carga puede comprender una secuencia de reconocimiento. La composición de carga puede reconocer selectivamente un tumor u otro tejido diana. La composición de carga puede reconocer selectivamente la vasculatura tumoral u otro tejido diana.

Se dan a conocer, además, métodos de formación de un conjugado de CendR, en donde el método que comprende causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente a una proteína o péptido que comprende un elemento CendR, en el que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. Se dan a conocer, además, métodos de formación de un conjugado de CendR, en el que el método comprende causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente a una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, en el que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. Se dan a conocer, además, métodos de formación de un conjugado de CendR, en donde el método comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula y/o la penetración en un tejido, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, y (b) causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente con una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la composición de carga se acopla o se asocia con la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. El conjugado de CendR puede comprender la proteína o péptido y la composición de carga acoplada o asociada.

Se dan a conocer, además, métodos de transporte de una composición de carga hasta el interior de una célula, en donde el método comprende exponer la célula a un conjugado de CendR, en el que el elemento CendR comprende una composición de carga acoplada covalentemente o asociada no covalentemente con un elemento CendR, en el que el elemento CendR a continuación puede entrar en la célula, transportando de esta manera la composición de carga hasta el interior de la célula. Se dan a conocer, además, métodos de transporte de una composición de carga hasta el interior de una célula, en donde el método comprende exponer la célula a un conjugado de CendR, en el que el elemento CendR comprende una composición de carga acoplada covalentemente o asociada no covalentemente con una proteína o péptido que comprende un elemento CendR, en el que el conjugado de CendR a continuación puede entrar en la célula, transportando de esta manera la composición de carga hasta el interior de la célula. Se dan a conocer, además, métodos de transporte de una composición de carga hasta el interior de una célula, en donde el método comprende: (a) acoplar un elemento CendR con la composición de carga, formando de esta manera un conjugado de CendR, y (b) exponer la célula al conjugado de CendR, en el que el conjugado de CendR a continuación puede entrar en la célula, transportando de esta manera la composición de carga hasta el interior de la célula.

Se dan a conocer, además, métodos de identificación de una célula que puede internalizar un elemento CendR, en el que el método comprende: (a) exponer una célula a un elemento CendR y (b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado. Se dan a conocer, además, métodos de identificación de una célula de cáncer como candidata para la terapia a base de CendR, en el que el método comprende: (a) exponer la célula de cáncer a un elemento CendR, y (b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado por la célula de cáncer, en el que un elemento CendR internalizado identifica la célula de cáncer como candidata para la terapia a base de CendR. La célula puede encontrarse en un ensayo. El elemento CendR puede acoplarse con una proteína o péptido. El elemento CendR puede ser un elemento CendR activable. El elemento CendR activable puede activarse antes de la exposición a la célula. El elemento CendR activable puede ser un elemento CendR activable por proteasa. La proteína o péptido puede ser circular. El elemento CendR puede encontrarse en el extremo C-terminal de la proteína o péptido.

Se dan a conocer, además, métodos de identificación de un tejido en el que puede penetrar un elemento CendR, en el que el método comprende: (a) exponer el tejido a un elemento CendR, y (b) determinar si el elemento CendR ha penetrado en el tejido. Se dan a conocer, además, métodos de identificación de un tumor como candidato para la terapia a base de CendR, en el que el método comprende: (a) exponer la célula del tumor a un elemento CendR, y (b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado por la célula en el que un elemento CendR internalizado identifica el tumor como candidato para la terapia a base de CendR. Se dan a conocer, además, métodos de identificación de un tumor como candidato para la terapia a base de CendR, en el que el método comprende: (a) exponer el tumor a un elemento CendR, y (b) determinar si el elemento CendR ha penetrado en el tumor, en el que un elemento CendR que ha penetrado identifica el tumor como candidato para la terapia a base de CendR. El tumor puede encontrarse en un ensayo. El elemento CendR puede acoplarse con una proteína o péptido. El elemento CendR puede ser un elemento CendR activable. El elemento CendR activable puede activarse antes de la exposición al tumor. El elemento CendR activable puede ser un elemento CendR activable por proteasa. La proteína o péptido puede ser circular. El elemento CendR puede encontrarse en el extremo C-terminal de la proteína o péptido.

Se dan a conocer, además, métodos para producir un elemento CendR activable que puede activarse en proximidad a una célula de interés, en el que el método comprende formar un elemento CendR activable en el que se acopla un grupo bloqueante con un elemento CendR mediante un enlace escindible, en el que el enlace escindible es escindido por un enzima presente en proximidad a la célula de interés. La célula puede encontrarse en un/a sujeto. Puede identificarse el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés. Puede identificarse el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés antes de formar el elemento CendR activable. El enlace escindible puede seleccionarse basándose en el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés. El enlace escindible puede seleccionarse antes de formar el elemento CendR activable. El elemento CendR puede comprender un grupo carboxilo terminal, en el que el grupo de bloqueo se acopla con el grupo carboxilo terminal.

Se dan a conocer, además, métodos de formación de un elemento CendR activable, en el que el método comprende causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con un elemento CendR, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo y el elemento CendR es escindible. Se dan a conocer, además, métodos de formación de un elemento CendR activable, en el que el método comprende causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con una secuencia de aminoácidos, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el elemento CendR es escindible. Se dan a conocer, además, métodos de formación de un elemento CendR activable, en el que el método comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula y/o la penetración en un tejido, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, y (b) causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con el elemento CendR, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el elemento CendR es escindible. El grupo de bloqueo acoplado covalentemente con el elemento CendR reduce o evita la internalización en la célula y/o la penetración en tejidos. El grupo de bloqueo acoplado covalentemente con el elemento CendR puede reducir o evitar la internalización en la célula y/o la penetración en tejidos en comparación con el mismo elemento CendR sin ningún grupo de bloqueo. El elemento CendR activable puede comprender la secuencia de aminoácidos seleccionada y el grupo de bloqueo, La célula puede encontrarse en un/a sujeto. Puede identificarse el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés. Puede identificarse el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés antes de formar el elemento CendR activable. El enlace escindible puede seleccionarse basándose en el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés. El enlace escindible puede seleccionarse antes de formar el elemento CendR activable. El elemento CendR puede comprender un grupo carboxilo terminal, en el que el grupo de bloqueo se acopla con el grupo carboxilo terminal. Puede acoplarse covalentemente o asociarse no covalentemente una composición de carga con una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada. La composición de carga puede acoplarse o asociarse a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR.

Se da a conocer en la presente memoria un método de formación de un conjugado de CendR, en donde el método comprende seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento C-terminal y causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente con una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos seleccionada se encuentra en el extremo C-terminal de la proteína o péptido, en el que el conjugado de CendR comprende la proteína o péptido y la composición de carga acoplada o asociada.

Se da a conocer un método de preparación de un conjugado de CendR que comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento C-terminal, (b) causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente con una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos seleccionada se encuentra en el extremo C-terminal de la proteína o péptido, en el que el conjugado de CendR comprende la proteína o péptido y la composición de carga acoplada o asociada.

Se da a conocer, además, un método de transporte de una composición de carga hasta el interior de una célula, en el que el método comprende: (a) acoplar un elemento CendR con la composición de carga, formando de esta manera un conjugado de CendR, y (b) exponer la célula al conjugado de CendR, en el que el conjugado de CendR a continuación puede entrar en la célula, transportando de esta manera la composición de carga hasta el interior de la célula.

Se da a conocer, además, un método para causar que una composición de carga penetre en el tejido, en el que el método comprende: (a) acoplar un elemento CendR con la composición de carga, formando de esta manera un conjugado de CendR, y (b) exponer el tejido al conjugado de CendR, en el que el conjugado de CendR a continuación puede entrar y salir de células en el tejido, causando de esta manera la penetración en el tejido de la composición de carga.

Se da a conocer, además, un método de transporte de una composición de carga hasta el interior de una célula, en el que el método comprende: (a) acoplar un elemento CendR activable con la composición de carga, formando de esta manera un conjugado de CendR, y (b) exponer la célula al conjugado de CendR, en el que el agente de escisión activa el elemento CendR activable del conjugado de CendR, en el que el conjugado de CendR a continuación puede entrar en la célula, transportando de esta manera la composición de carga hasta el interior de la célula.

Se da a conocer, además, un método para causar que una composición de carga penetre en el tejido, en el que el método comprende: (a) acoplar un elemento CendR activable con la composición de carga, formando de esta manera un conjugado de CendR, y (b) exponer el tejido al conjugado de CendR, de manera que el agente de escisión activa el elemento CendR activable del conjugado de CendR, en el que el conjugado de CendR a continuación puede entrar y salir de células en el tejido, causando de esta manera la penetración en el tejido de la composición de carga.

Se da a conocer, además, un método de identificación de una célula que puede internalizar un elemento CendR, en el que el método comprende: (a) exponer una célula a un elemento CendR y (b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado. La célula puede encontrarse en un ensayo, por ejemplo. El elemento CendR puede acoplarse con una composición de carga, tal como, por ejemplo, una proteína o péptido, formando de esta manera un conjugado de CendR.

Se da a conocer, además, un método de identificación de una célula que puede internalizar un elemento CendR activable, en el que el método comprende: (a) exponer una célula a un elemento CendR activable y (b) determinar si el elemento CendR activable ha sido internalizado. El elemento CendR activable puede desbloquearse antes de la exposición a la célula, aunque ello no es necesario. Lo anterior puede utilizarse para someter a ensayo la capacidad de bloqueo del bloqueante, por ejemplo. El elemento CendR activable también puede ser un elemento CendR activado por proteasa.

Se da a conocer, además, un método de identificación de una célula de cáncer como candidato para una terapia a base de CendR, en el que el método comprende: (a) exponer la célula de cáncer a un elemento CendR y (b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado por la célula de cáncer, en la que un elemento CendR internalizado identifica la célula de cáncer como candidata para la terapia a base de CendR. La célula puede encontrarse en un ensayo, o puede encontrarse en un/a sujeto, por ejemplo. El elemento CendR puede acoplarse con una composición de carga, tal como, por ejemplo, una proteína o péptido, formando de esta manera un conjugado de CendR.

Se da a conocer, además, un método de identificación de un tumor como candidato para una terapia a base de CendR, en el que el método comprende: (a) exponer el tejido del tumor a un elemento CendR y (b) determinar si el elemento CendR ha pasado por el tejido o ha sido internalizado por células en el tejido, en el que un elemento CendR que ha pasado o ha sido internalizado identifica el tumor como candidato para la terapia a base de CendR.

Se da a conocer, además, un método para producir un elemento CendR activable que puede activarse en proximidad a una célula de interés, en el que el método comprende formar un elemento CendR activable en el que se acopla un grupo bloqueante con un elemento CendR mediante un enlace escindible, en el que el enlace escindible es escindido por un enzima presente en proximidad a la célula de interés. Lo anterior puede comprender, además, previamente a la formación del elemento CendR activable, identificar el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés. Lo anterior puede comprender, además, previamente a la formación del elemento CendR activable, seleccionar el enlace escindible basándose en el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés.

Se da a conocer, además, un método de formación de un elemento CendR activable, en el que el método comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento C-terminal, en el que el elemento C-terminal comprende un grupo carboxilo terminal y (b) causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con el grupo carboxilo terminal de la secuencia de aminoácidos seleccionada, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el grupo carboxilo terminal es escindible, en el que el elemento CendR activable comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada y el grupo de bloqueo, Lo anterior puede comprender, además, antes de la etapa (b), seleccionar el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el grupo carboxilo terminal para que sea escindible por una proteasa presente en proximidad a la célula de interés.

Se da a conocer, además, un elemento CendR activable preparado mediante un método que comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento C-terminal, en el que el elemento C-terminal comprende un grupo carboxilo terminal y (b) causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con el grupo carboxilo terminal de la secuencia de aminoácidos seleccionada, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el grupo carboxilo terminal es escindible, en el que el elemento CendR activable comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada y el grupo de bloqueo, El método puede comprender además antes de la etapa (b) seleccionar el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el grupo carboxilo terminal para que sea escindible por una proteasa presente en proximidad a la célula de interés.

Se proporcionan ventajas adicionales del método y composiciones dados a conocer en parte en la descripción siguiente y en parte se entenderá a partir de la descripción, o puede aprenderse mediante la práctica del método y composiciones dados a conocer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los dibujos adjuntos, que se incorporan y constituyen una parte de la presente especificación, ilustran varias realizaciones del método y composiciones dados a conocer y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios del método y composiciones dados a conocer. Las realizaciones que no están cubiertas por las reivindicaciones se proporcionan únicamente como referencia.

Las figuras 1A, 1B y 1C muestran la identificación de péptidos de internalización. Fig. 1A: para la expresión del fago T7, se expresan péptidos como fusión C-terminal con la proteína de cápside mayor GP10. Fig. 1B: 3 rondas de selección ex vivo de cuatro bibliotecas diferentes (CX7C, X7, RXXRXXX (SEC ID n.° 19) y RXXR(NP)PRXXX (SEC ID n.° 20)) se llevaron a cabo en células PPC1, dando como resultado grupos de fagos con una capacidad de reconocimiento 500 a 2.500 veces superior a fagos de control que exponen 7 residuos de glicina (G7) consecutivos. Fig. 1C: La secuenciación de 20 clones fágicos aleatorios por biblioteca reveló la presencia dominante de péptidos con terminación C-terminal de un residuo de arginina, independientemente de la configuración inicial de la biblioteca y la temperatura utilizada durante la interacción del fago con las células. Las secuencias corresponden a las SEC ID n.° 52-61, 132, 72-75, 133, 76, 134, 77-78, 135-144 y 62-71 desde la parte superior izquierda de la table a la parte inferior derecha para la sección correspondiente a 4 °C. Las secuencias corresponden a las SEC ID n.° 82-91, 102 111, 145-154 y 92-101 desde la parte superior izquierda de la tabla a la parte inferior derecha para la sección correspondiente a 37 °C lavado ácido.

Las figuras 2A y 2B muestran que el fago T7 que muestra una arginina C-terminal se une y resulta internalizado por células PPC1. Fig. 2A: la unión del fago T7 a las células de cáncer de próstata depende de la exposición de una arginina C-terminal sobre las partículas de fago. Se incubaron las células PPC1 con bacteriófago T7 que exponía derivados de G7 (gráfico superior) o péptido RPARPAR (SEC ID n.° 2) (gráfico inferior) a 4 °C y el fago unido se cuantificó mediante ensayo de placas. La unión se expresa como factor respecto a la no unión del fago de control G7. Fig. 2B: el fago que expone arginina C-terminal resulta internalizado en células PPC1 en cultivo (flecha, internalización nuclear; cabeza de flecha, internalización citoplasmática). Se incubó un panel de clones de fago T7 a 37 °C con células PPC1 cultivadas sobre cubreobjetos recubiertos con colágeno, se tiñeron con anticuerpo anti-T7 y se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal.

La figura 3 muestra que los puntos cuánticos con RPARPAR (SEC ID n.° 2) resultan internalizados por las células PPC1. Se cultivaron células de carcinoma prostático PPC1 sobre cubreobjetos recubiertos con colágeno incubados con puntos cuánticos con estreptavidina recubiertos con péptidos biotinilados, seguido de fijación, contratinción de los núcleos celulares con DAPI y obtención de imágenes confocales. Los puntos Q recubiertos con péptido RPARPAR (SEC ID n.° 2) con extremo C-terminal libre fueron robustamente internalizados (puntos de color pálido) (a), mientras que los puntos Q recubiertos con un extremo C-termina bloqueado con amida no se unieron a ls células ni resultaron internalizados (b). Inserción: representación esquemática de puntos Q: los puntos cuánticos utilizados en el presente estudio presentan un diámetro de aproximadamente 20 nm y pueden recubrirse con 5 a 10 péptidos por partícula.

La figura 4 muestra que la tripsina activa la unión del fago RP ARP ARA (SEC ID n.° 3) a las células PPC1. Se incubaron 5x108 partículas fágicas con los volúmenes indicados de tripsina al 2,5 % a 37 °C durante 20 minutos, seguido de la incubación de los fagos con 1x106 células PPC1 a 4 °C durante 3 horas. La unión se expresa como factor respecto al fago de control G7 no ligante (la internalización del cual no resulta afectada por el tratamiento con tripsina).

La figura 5 muestra el reconocimiento tumoral e internalización del fago iRGD y del péptido iRGD. a. El péptido iRGD reconoce los tumores pancreáticos. Se inyectaron aproximadamente 200 |jg de péptido iRGD marcado con fluorescamina en un ratón con adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) por la vena de la cola y se dejó que circulase durante 4,5 horas. Se recolectaron los órganos y se observaron bajo luz UV (panel superior). El panel inferior muestra la imagen de campo brillante correspondiente. b. El fago iRGD fue ampliamente internalizado en las células tumorales humanas. El fago T7 que expone péptidos iRGD (panel principal) o péptidos de control CG7C (ventana superior derecha) se incubaron con células PPC1 cultivadas sobre cubreobjetos recubiertos con colágeno-I durante 2 horas a 37 °C, se tiñeron con anticuerpo anti-T7 y un marcador de membrana plasmática y se obtuvieron imágenes con un microscopio confocal. Observar que el fago iRGD (puntos de color pálido) se internalizan extensivamente en las células tumorales, mientras que el fago de control no lo hace.

La figura 6 muestra CendR en el transporte intracelular específico. Se lleva un péptido de reconocimiento que contiene un motivo CendR latente a la superficie de una célula diana mediante la unión a un receptor específico, tal como una integrina; posteriormente el péptido es escindido por una proteína de superficie celular o pericelular específica, exponiendo el motivo CendR (arginina C-terminal), y es transportado al receptor CendR ubicuo y endocitado. Un péptido con un motivo CendR expuesto interactúa directamente con el receptor de CendR y resulta internalizado. La ruta de CendR puede permitir el transporte intracelular altamente específico de agentes diagnósticos y terapéuticos de todos los tipos, incluyendo nanopartículas.

La figura 7 muestra una representación esquemática de cribados de CendR para la entrada activada por proteasa y para señales de salida. (A) Para el cribado de entrada proteolítica, el elemento CendR (RPARPAR, sEc ID n.° 2) es enmascarado con hexapéptido aleatorio y residuos de alanina C-terminal. Los fagos que se encuentran intracelularmente han sido procesados proteolíticamente para exponer el elemento CendR. (B) Para identificar las señales de salida, se construye una biblioteca fágica con elemento CendR expuesto precedido por péptido aleatorio. La ruta por defecto para el fago es la internalización y solo los fagos en los que el péptido aleatorio codifica una señal de salida son extracelulares.

Las figuras 8A y 8B muestran que iRGD presenta un elemento CendR que presenta una K (lisina) C-terminal en lugar de R (arginina) C-terminal, y que este elemento CendR se comporta como otros CendR que presentan una arginina C-terminal. iRGD contiene un elemento CendR. Fig. 8A: se prepararon versiones truncadas de fago iRGD y se sometieron a ensayo para la internalización en células de cáncer de próstata humano PPC1. Fago portador de CRGDKG (SEC ID n.° 21), CRGDK (SEC ID n.° 22), CR (SEC ID n.° 163) presentan una mayor capacidad de internalización en células PPC1 que el fago iRGD nativo. Las secuencias son, de izquierda a derecha, SEC ID n.° 155, SEC ID n.° 4, SEC ID n.° 157, SEC ID n.° 158, SEC ID n.° 159, SEC ID n.° 160, SEC ID n.° 21, SEC ID n.° 22, SEC ID n.° 161, SEC ID n.° 162, SEC ID n.° 163. Fig. 8B: se preincubaron células PPC1 con o sin diversas concentraciones de fago inactivado por UV portador de iRGD, CRGDK (SEC ID n.° 22), CR (SEC ID n.° 163), o RPAR (SEC ID n.° 164), seguido de la incubación adicional con fago CRGDK vivo o un fago de control (NC5). Observar que la internalización de fago CRGDK (SEC ID n.° 22) resultó inhibida por el fago RPAR de una manera dependiente de la dosis, indicando que CRGDK (SEC ID n.° 22) actúa como un CendR.

La figura 9 muestra que iRGD es capaz de extenderse hasta el interior de los tejidos tumorales. El fago iRGD (a) y su fago de control KGD (b) fueron inyectados en ratones transgénicos portadores de adenocarcinoma ductal pancreático espontáneo y se dejaron circular durante 15 minutos. A continuación, se perfundieron los ratones con PBS que contenía BSA al 1 % y se recolectaron los tumores. Se tiñeron secciones criogénicas de los tumores con un anticuerpo antifago T7, un anticuerpo anti-CD31 y DAPI. Observar que el fago iRGD resulta extensivamente incorporado por las células tumorales que forman los ductos del tumor pancreático, mientras que el fago KGD se mantiene en el interior de algunos vasos sanguíneos y prácticamente no se observaron señales en los ductos tumorales, mostrando que el fago iRGD es capaz de extravasar y extenderse hacia el interior del tejido tumoral. La tinción se observa en la coloración brillante en ambos paneles de la figura 9.

Las figuras 10A y 10B muestran la identificación de los péptidos CendR utilizando la exposición fágica. Se utilizó un panel de bibliotecas peptídicas (CX7C, X7 y RXXRXXX (SEC ID n.° 19)) para la selección ex vivo en suspensiones celulares derivadas de tumores de xenoinjerto ortotópico de PPC-1. (Fig. 10A) Tras tres rondas de selección, los grupos de fagos se unieron a las células tumorales en suspensiones 500 a 1.300 veces más que el fago heptapéptido poliglicina (G7) de control. (Fig. 10B) Secuencias peptídicas representativas recuperadas tras tres rondas de selección de fago. Los péptidos que terminan en arginina C-terminal comprenden 97 % de todas las inserciones de fago secuenciadas. Las secuencias corresponden a las SEC ID n.° 52 a n.° 81 de parte superior izquierda de la table a parte inferior derecha para la sección correspondiente a 4 °C. Las secuencias corresponden a las SEC ID n.° 82 a 111 desde la parte superior izquierda de la tabla a la parte inferior derecha para la sección correspondiente a 37 °C lavado ácido.

Las figuras 11A-11C muestran las características estructurales de la internalización de CendR. Fig. 11A: interacción de fagos G6R y RPARPAR (SEC ID n.° 2) con las células PPC-1. Las células se incubaron con fago a 4 °C para evaluar la unión superficial ("ligadas") o a 37 °C seguido de un lavado a pH bajo para evaluar la incorporación de fago ("internalizadas"). RPARPAR (SEC ID n.° 2) - puntos q funcionalizados inhibieron tanto la unión como la internalización de fago RPARPAR, mientras que los puntos q G7 no presentaron ningún efecto. El fago G6R no resultó internalizado; su unión a las células PPC-1 resultó bloqueada por el exceso de puntos q RPARPAR (SEC ID n.° 2). La unión se expresa como factor del fago de control que expone heptapéptido poliglicina (G7). Fig. 11B: unión de fago derivado RPARPAR (SEC ID n.° 2) a las células PPC-1 a 4 °C. Los datos son representativos de 4 experimentos de unión independientes. De izquierda a derecha, las secuencias corresponden a las SEC ID n.° 112 a 125, excepto la primera y la novena secuencias, que son SEC ID n.° 2 y SEC ID n.° 3, respectivamente. Se llevaron a cabo análisis estadísticos mediante pruebas t de Student (fig. 11A). n=3: las barras de error indican las desviaciones estándar; un solo asterisco: p≤0,05; dos asteriscos: p≤0,01. Barras de escala: 20 μm. Fig. 11C (paneles c-g) Microscopía confocal de células PPC-1 incubadas durante 2 horas a 37 °C con fago que expone péptido (puntos de color brillante, c-e) o puntos q recubiertos con péptido (puntos de color brillante, f y g): RPARPAR (SEC ID n.° 2) T7 (c), G6R T7 (d), RPARPARA (SEC ID n.° 2) T7 (e), RPARPAR (SEC ID n.° 2) puntos q (f) y RPARPAR-NH₂(SeC ID n.° 2) puntos q (g). En las micrografías, las cabezas de flecha apuntan a fago unido en superficie y puntos q; las flechas apuntan a partículas internalizadas.

Las figuras 12A y 12A muestran la unión e incorporación celular de péptidos RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27) y RVTRPPR (SEC ID n° 28) Fig 12A: ruta compartida Los fagos que exponían los tres péptidos en tándem RXXR (SEC ID n.° 25) se unieron a las células PPC-1 a 4 °C en un grado similar. La unión resultó inhibida mediante la preincubación de las células con puntos q funcionalizados con RPARPAR (SEC ID n.° 2): Los puntos q recubiertos con péptido de control hepatglicina (G7) no presentaron ningún efecto sobre la unión de los fagos. Se llevó a cabo un análisis estadístico mediante pruebas t de Student (c). n=3: las barras de error indican las desviaciones estándar; un solo asterisco: p≤0,05; dos asteriscos: p≤0,01. Fig. 12B (paneles b-i): evaluación mediante inmunofluorescencia confocal de la inmunorreactividad de los fagos (puntos de color brillante) en células PPC-1 cultivadas durante 1 hora en presencia de 109 ufp de los fagos siguientes: (b) RPARPAR (SEC ID n.° 2), (c) RGERPPR (SEC ID n.° 27), (d) RVTRPPR (SEC ID n.° 28), (e) G7 de control, (f) RPARPAR (SEC ID n.° 2) en presencia de 20 |jM de péptido rPa RPAR libre (SEC ID n.° 2), (g) fago RPARPAR (SEc ID n.° 2) en presencia de 200 jM de péptido RPARPAR libre (SEC ID n.° 2), (h) fago RpARpAR (SEC ID n.° 2) en la presencia de 2 mM de péptido RpArPAR libre (SEC ID n.° 2), (i) fago RGERRPR (SEC ID n.° 27) en presencia de 200 jM de péptido RPARPAR libre (SEC ID n.° 2). Los óvalos en forma de huevo representan la contratinción nuclear con DAPI. Barras de escala: 20 jm .

La figura 13 muestra la internalización (puntos de color pálido) de puntos q RPARPAR (SEC ID n.° 2) por células PPC-1: Efecto de la modificación del péptido. Se incubaron células PPC-1 durante 2 horas con puntos q funcionalizados con los péptidos siguientes: (a) RPARPAR (SEC ID n.° 2), (b) RPARPARA (SEC ID n.° 3), (c) RPARPAR-NH₂(SEC ID n.° 2), (d) D-rparpar, (e) D-rparpara, y (f) G7. Las células se tiñeron con tinción nuclear DAPI y se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal. Barras de escala: 50 jm .

La figura 14 muestra que la escisión con tripsina potencia la unión del fago RPARPARA (SEC ID n.° 3) a las células PPC-1. Se trataron 109 ufp de fago RPARPARA (SEC ID n.° 3) con las cantidades indicadas de tripsina a 37 °C, seguido de ensayo de unión fágica a 4 °C. Los datos son representativos de 4 experimentos de unión diferentes.

Las figuras 15A a 15D muestran que el fago CendR se une a muchos tipos de células. Fig. 15A: unión del fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) a las células en cultivo a 4 °C in vitro. Fig. 15B: unión de fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) a suspensiones de células primarias de órganos de ratón a 4 °C ex vivo. Figs. 15C y 15D: distribución en los tejidos de fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) inyectado por vía intravenosa, tras 20 minutos de tiempo de circulación. Fig. 15C: se cuantificó el fago mediane titulación; la unión a tejidos se expresa como factor respecto al fago G7. Se llevó a cabo un análisis estadístico mediante pruebas t de Student (c). n=3: las barras de error indican las desviaciones estándar; dos asteriscos: p≤0,01; tres asteriscos: p≤0,001. Fig. 15D (paneles d y e): localización de inmunofluorescencia del fago T7 (colores pálidos) en secciones de pulmón de ratones inyectados por vía intravenosa con fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) (d) o fago G7 (e). Se observa inmunorreactividad generalizada en los pulmones de los ratones inyectados con RPARPAR (SEC ID n.° 2) (cabezas de flecha en d) pero no en G7 (se observa marcaje ocasional en los vasos, flechas en e). Barras de escala: 50 jm .

Las figuras 16A y 16B muestran la dinámica de la unión e internalización del fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) a las células PPC-1. Fig. 16A: a 4 °C, la unión de fagos a la suspensión de células PPC-1 en cultivo alcanza una meseta a los 20 minutos. Para el estudio de curso temporal, se incubaron suspensiones celulares de células PPC-1 en cultivo con 109 ufp de fago, seguido de una separación en una etapa de las células respecto del fago no unido mediante centrifugación en almohadillas de aceite de silicona (1,03 g/ml) y titulación. Fig. 16B (paneles b y c): internalización de puntos q de RPARPAR (SEC ID n.° 2) funcionalizados por células PPC-1 vivas a 37 °C, (b) tras 15 minutos de la adición de puntos q, se observó marcaje (manchas de color pálido) a lo largo de la membrana plasmática. (c) A la hora, la mayoría de los puntos q se habían internalizado. Los núcleos se tiñeron con la tinción nuclear intravital Hoechst 342. n=3; las barras de error indican las desviaciones estándar. Barras de escala: 20 jm .

Las figuras 17A, 17B y 17C muestran que el fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) resulta internalizado por las células PPC-1 mediante una ruta no convencional. Fig. 17A: efecto de los inhibidores de endocitosis sobre la internalización del fago RPARPAR (SEC ID n.° 2). Se incubaron los fagos con células PPC-1 en presencia de los inhibidores indicados durante 90 minutos a 37 °C, seguido del lavado ácido y titulación para cuantificar el fago internalizado. El análisis estadístico realizado mediante ANOVA mostró que ninguno de los inhibidores inhibió significativamente la internalización. n=3; las barras de error indican las desviaciones estándar. Fig. 17B: imágenes confocales de células PPC-1 incubadas durante 60 minutos en presencia de 109 ufp de fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) y doble tinción para fago T7 y marcadores de compartimiento subcelular (LAMP-1, caveolina-1, calnexina y EEA-1). Los núcleos se tiñeron con DAPI. Fig. 17C: imágenes confocales de células PPC-1 incubadas durante 180 minutos en presencia de 109 ufp de fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) y 10 jg/m l de subunidad B de la toxina del cólera. Se detectó fago mediante anticuerpo secundario marcado con Alexa-546 y la subunidad B de la toxina del cólera se marcó con pigmento Alexa-488. La colocalización está representada por los puntos brillantes (flechas) inmediatamente fuera del núcleo. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Barras de escala: 10 jm .

Las figuras 18A a 18C muestran la identificación y validación de NRP-1 como el receptor de CendR. Fig. 18A: cromatografía de afinidad de proteínas que interactúan con el péptido RPARPAR (SEC ID n.° 2). Se extrajo tejido tumoral de PPC-1 con un tampón de glucopiranósido 200 mM y el extracto se incubó con perlas recubiertas con RPARPAR (SEC ID n.° 2), seguido de lavados extensivos y elución con péptido RPARPAR (SEC ID n.° 2) libre 2 mM. Observar la aparición de una banda de 130 kDa, identificada mediante espectroscopia de masas como NRP-1, empezando desde la fracción 3 del eluido. Panel superior; gel teñido con plata; panel inferior: una inmunotransferencia con anticuerpo anti-NRP-1. Fig. 18B: unión de fago RPARPAR (SEC ID n° 2) a células de melanoma M21 transfectadas transitoriamente con NRP-1 de tipo salvaje (NRP-1), NRP-1 triple mutante NS346A-E348A-T349A (NRP-1 mutante) o plásmido pcDNA3.1 parental (Vector) y a células M21 no transfectadas. Fig. 18C: (c, d) Imágenes de inmunofluorescencia confocal de NRP-1 y fago T7 RPARPAR (SEC ID n.° 2) en células PPC-1 incubadas con fago a 37 °C durante 40 minutos (c) y 3 horas (d). El fago y NRP-1 se colocalizan ampliamente, aunque aparentemente se produce una reducción progresiva del solapamiento (cabezas de flecha en y d) y la aparición de estructuras positivas para solo fago (flechas, d). (e) Inmunotención y obtención de imágenes confocales de fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) y NRP-1 en células M21 transfectadas transitoriamente con NRP-1. Se incubó el fago RPARPAR (S^eC ID n.° 2) con células cultivadas sobre cubreobjetos recubiertos con fibronectina durante 3 horas a 37 °C. Solo las células expresantes de NRP-1 se unen e internalizan el fago (flechas), mientras que las células negativas (no visibles) no lo hacen. (f) El fago RPARPARA (SEC ID n.° 3) no resulta internalizado por las células M21 positivas para N^rP-1. El análisis estadístico se llevó a cabo mediante ANOVA (b); n=3; las barras de error indican desviaciones estándar. Barras de escala: 10 μm.

Las figuras 19A y 19B muestran la unión de fago que expone RPARPAR (SEC ID n.° 2) y péptidos ligandos de NRP-1 conocidos a las células PPC-1. Fig. 19A: los ligandos de NRP-1 conocidos causan la unión de fagos a las células PPC-1. Los fagos que exponen ligandos peptídicos que es conocido que interactúan con la subunidad b1 de NRP-1 (tabla en a) se unen a las células en un grado similar a RPARPAR (SEC ID n.° 2) mientras que VEGF-C7 con alanina C-terminal añadida (VEGF-C7-A) es inactiva. En la tabla, de parte superior a inferior, las secuencias corresponden a las SEC ID n.° 126 a n.° 130. Fig. 19B (paneles b-g): evaluación mediante inmunofluorescencia confocal de la inmunorreactividad de los fagos en células PPC-1 cultivadas durante 1 hora en presencia de 109 ufp de los fagos indicados. Flechas: fagos internalizados; cabezas de flecha: fago asociado a membrana plasmática. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Inserciones: competición de la unión de fago por péptido RPARPAR (SEC ID n.° 2) libre 0,5 mM (añadido a las células 10 minutos añade de añadir el fago). Barras de escala: 20 μm.

Las figuras 20A a 20C muestran péptido CendR dependiente de uroquinasa. Fig. 20A: diseño de un péptido CendR activable por uPA (uCendR). Se combinó el sitio de consenso de uPA SGRSA (aminoácidos 5 a 9 de la SEC ID n.° 34) (Ke S.H. et al. (1997)) con un elemento CendR solapante. En el péptido intacto, el elemento CendR es inactivo, ya que no se encuentra expuesto en el extremo C-terminal. La escisión por uPA conduce a la exposición C-terminal del elemento CendR (uCendR-X), la unión celular y la internalización. Fig. 20B: unión a células PPC-1 de fagos que exponen el péptido uCendR y un péptido correspondiente al producto post-corte (uCendR-X) a las células PPC-1. Antes de añadir los fagos a las células, se trataron con 50 UI de uPA, 25 μg de tripsina cristalina, 50 UI de trombina o 25 μg de colagenasa de tipo I. Fig. 20C (paneles c-e): microscopía de fluorescencia de células PPC-1 incubadas con uPA-C₆ndR-puntos q. Los puntos q de uCendR no tratados no resultaron internalizados (c), mientras que el tratamiento de uPA induce la internalización de los puntos q (d, cabezas de flecha). La amilorida inhibió la incorporación (e). El análisis estadístico se llevó a cabo mediante ANOVA (b); n=3; las barras de error indican desviaciones estándar; tres asteriscos, p≤0,001. Barras de escala: 20 μm.

La figura 21 muestra la ruta de internalización de CendR. El motivo de internalización identificado (motivo CendR) que está activo al situarlo en el extremo C-terminal de la proteína. Los péptidos que contienen el motivo CendR en una posición diferente del extremo C-terminal (péptidos CendR crípticos) no resultan internalizados; sin embargo, su unión a neuropilina-1 y la internalización puede ser inducidos por el corte proteolítico. La ruta de CendR conduce a la incorporación de nanopartículas biológicas y sintéticas (bacteriófagos y puntos cuánticos). La ruta de CendR también puede ser relevante a la interacción de las células con otros agentes biológicos, tales como los virus y otras células.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

en el que el conjugado de CendR comprende la proteína o péptido y la composición de cargo acoplada o asociada, en el que el elemento CendR activable se forma mediante acoplamiento covalente del grupo de bloqueo con el elemento CendR mediante un enlace escindible,

La presente invención se refiere, además, a un conjugado de CendR producido mediante el método según la invención, en el que el método comprende:

(ii) un elemento CendR activable que comprende un elemento CendR y un grupo de bloqueo, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (S^eC ID n.° 27), o RV^tR^pPR (SEC ID n.° 28),

(b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado,

La presente invención se refiere, además, a un método para producir un elemento CendR activable que puede activarse en proximidad a una célula de interés, preferentemente una célula en un sujeto, en el que el método comprende formar un elemento CendR activable en el que se acopla un grupo de bloqueo con un elemento CendR mediante un enlace escindible, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28) y

La presente invención se refiere, además, a un elemento CendR activable producido mediante el método según la invención, en el que el método comprende seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula, la penetración en tejidos, o ambos, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (s Ec ID n.° 28), en la que el elemento CendR se encuentra en el extremo C-terminal del conjugado y presenta un grupo carboxilo C-terminal.

(b) determinar si el elemento CendR ha penetrado en el tejido,

El método y composiciones dados a conocer pueden entenderse más fácilmente en referencia a la descripción detallada siguiente de realizaciones particulares y el Ejemplo incluido en las mismas y a las figuras y la descripción y anterior y posterior a las mismas.

Antes de que los presentes compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos se den a conocer y describan, debe entenderse que no se encuentran limitados a métodos sintéticos específicos o a métodos de biotecnología recombinante específicos, a menos que se especifique lo contrario, o a reactivos particulares, a menos que se especifique lo contrario, como tales pueden evidentemente variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito exclusivo de describir realizaciones particulares y que no pretende ser limitativa.

A. Definiciones

Tal como se utiliza en la especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un” o “una” y “el” o “ la” incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un portador farmacéutico" incluye mezclas de dos o más de tales portadores, y similares.

Los intervalos pueden expresarse en la presente memoria como entre "aproximadamente" un valor particular y/o "aproximadamente" otro valor particular. En el caso de que se exprese dicho intervalo, otra realización incluye entre un valor particular y/o otro valor particular. De manera similar, en el caso de que se expresen valores en forma de aproximaciones, mediante la utilización del antecedente "aproximadamente" se entenderá que el valor particular forma otra realización. Se entenderá, además, que los extremos de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación al otro extremo como independientemente del otro extremo. También se entiende que se dan a conocer varios valores en la presente memoria y que cada valor también se da a conocer en la presente memoria como "aproximadamente" ese valor particular además del valor mismo. Por ejemplo, si se da a conocer el valor "10", también se está dando a conocer el valor "aproximadamente 10". Se entiende, además, que al dar a conocer un valor "inferior o igual" a "el valor", también se da a conocer "superior o igual al valor" y posibles intervalos entre los valores, según entenderá adecuadamente el experto en la materia. Por ejemplo, en el caso de que se dé a conocer el valor "10", también se dará a conocer "menor o igual a 10", así como "mayor o igual a 10". También se entenderá que en toda la solicitud, se proporcionan datos en varios formatos diferentes, y que estos datos representan extremos finales e iniciales, e intervalos para cualquier combinación de los puntos de datos. Por ejemplo, en el caso de que se dé a conocer un punto de datos particular "10" y un punto de datos particular "15", se entiende que también se han dado a conocer mayor o igual a, menor a, menor o igual a, e igual a 10 y a 15, además de entre 10 y 15. Se entiende, además, que cada unidad entre dos unidades particulares también se ha dado a conocer. Por ejemplo, en el caso de que se den a conocer 10 y 15, entonces también se están dando a conocer 11, 12, 13 y 14.

En la presente especificación y en las reivindicaciones siguientes, se hace referencia a varios términos que se definirán con los significados siguientes:

"opcional" u "opcionalmente" se refiere a que el evento o circunstancia indicado seguidamente puede ocurrir o no ocurrir, y que la descripción incluye casos en que dicho evento o circunstancia ocurre y casos en que no

Debe entenderse que el método y composiciones dados a conocer no se encuentran limitados a métodos sintéticos específicos, a técnicas analíticas específicas o a reactivos particulares, a menos que se especifique lo contrario y, de esta manera, pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito exclusivo de describir realizaciones particulares y que no pretende ser limitativa.

B. Parte general

En la presente memoria se da a conocer, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, una nueva plataforma tecnológica que permite el transporte intracelular, la salida y la penetración en tejido de las composiciones. El transporte puede ser general y puede estar dirigido a células o tejidos de interés, tales como tumores. La internalización de composiciones (incluyendo nanopartículas, fármacos, marcadores detectables y otros compuestos) y sus cargas en las células diana y la penetración en tejido diana puede incrementar la eficiencia del transporte dirigido, aunque la internalización específica de tipo celular y la penetración específica de tipo de tejido no ha podido conseguirse anteriormente. Además, la capacidad de las composiciones de penetrar en el espacio extravascular es un factor limitante importante de la eficacia de dianización de las composiciones in vivo. Se ha identificado un motivo peptídico simple, con un elemento C-terminal como característica definitoria, que señaliza una internalización altamente eficiente del fago y los péptidos libres en las células ((la figura 9 es un ejemplo). Este fenómeno de internalización se ha denominado "regla del extremo de C" o "CendR", por sus siglas en inglés. La proteolitis que descubre un elemento C-terminal puede servir de conmutador que induce la señal de internalización. Pueden internalizarse diversas composiciones mediante este mecanismo. Por ejemplo, puede producirse la acumulación mediada por péptido de reconocimiento en un sitio diana con proteolisis específica de tipo celular que expone un elemento C-terminal que genera sistemas de reconocimiento altamente específicos con internalización inducida por la diana. La ruta de CendR también puede utilizarse para la salida de composiciones de interés al exterior de las células y su extensión en los tejidos. El elemento C-terminal puede causar la traslocación a través de las paredes vasculares (y puede extenderse hacia el interior del tejido tumoral a partir de una inyección intravenosa, por ejemplo) y también puede extenderse a otras barreras, tales como las membranas mucosas y la barrera hematoencefálica. Tal como se utiliza en la presente memoria, "penetración en tejidos" y "penetración en un tejido" se refieren al paso hacia el interior o a través de un tejido más allá o a través de la capa externa o de una primera capa de células o a través de una membrana del tejido. Dicho paso o penetración a través del tejido (que también puede denominarse extravasación y penetración en tejido) puede ser una función tanto de una función tanto de internalización como de salida celulares. A lo largo de toda la presente solicitud, en donde se utiliza la expresión "penetración en tejidos" se entiende que dicha penetración también se extiende a otras barreras y membranas que se encuentran en todo el cuerpo, tales como la barrera hematoencefálica.

Al contrario que los péptidos penetrantes en células conocidos, el elemento internalizante dado a conocer es dependiente de la posición: es inactivo cuando está presente en posiciones diferentes del extremo C-terminal del péptido. El péptido latente puede activarse mediante escisión por, por ejemplo, un enzima proteolítico adecuado, exponiendo, por ejemplo, una arginina, lisina o lisina-glicina C-terminales. A lo largo de toda la solicitud, en donde se utiliza la expresión "elemento CendR" o "elemento C-terminal", se utiliza para referirse a una arginina C-terminal, una lisina C-terminal o una pareja lisina-glicina C-terminal, en donde la glicina se encuentra en la posición C-terminal más distante. En otras palabras, en el caso de que una lisina se encuentre en el extremo C-terminal, el elemento CendR puede seguir siendo funcional con una glicina en el lado C-terminal de la lisina. Sin embargo, no resulta necesario que se encuentre la glicina en el extremo para que el residuo de lisina sea funcional como elemento C-terminal, de manera que la lisina puede estar presente sin glicina y todavía ser funcional. Sin embargo, el inverso no es cierto, en el sentido que la glicina no puede funcionar como elemento C-terminal sin la presencia de lisina en posición contigua. La arginina no requiere ni lisina ni glicina para funcionar como elemento C-terminal, con la condición de que se mantenga en la posición más C-terminal. Dichos elementos CendR pueden denominarse elementos CendR de tipo 1.

La expresión "elemento CendR" o "elemento C-terminal" también puede utilizarse para referirse a una histidina C-terminal y secuencias de aminoácidos que presentan la secuencia X1X2X3X4, en donde X1 puede ser R, K o H, en donde X4 puede ser R, K, H o KG y en donde X2 y X3 pueden ser, cada uno independientemente, cualquier aminoácido. Dichos elementos CendR pueden denominarse elementos CendR de tipo 2. Los aminoácidos X2 y X3 pueden seleccionarse con fines específicos. Por ejemplo, X2, X3 o ambos pueden seleccionarse para formar la totalidad o una parte de una secuencia de reconocimiento de proteasa. Lo anterior resultaría útil, por ejemplo, para especificar o permitir el corte de un péptido que posee el elemento CendR como elemento CendR críptico o latente que resulta activado por la escisión después del aminoácido X4. Se muestran ejemplos de dichas opciones de aminoácido en las Tablas 1 y 4. También pueden seleccionarse los aminoácidos X1, X2 y X3, por ejemplo, para reclutar proteínas adicionales a las moléculas de NRP-1 en la superficie celular. Lo anterior puede aplicarse, por ejemplo, a modular la selectividad e internalización y/o la potencia de penetración en tejidos de los elementos CendR (y los conjugados, proteínas y péptidos que contienen elementos CendR). Opcionalmente, determinados aminoácidos también pueden excluirse de la utilización para X2, X3 o ambos. Por ejemplo, si se desea, G y D pueden excluirse del uso simultáneo como X2 y X3, respectivamente. Algunos elementos CendR de tipo 2 también pueden describirse como R/K/HXXR/K/H (SEC ID n,° 50) y R/K/HXXKG (SEC ID n.° 51).

Entre los ejemplos de elementos CendR se incluyen XXR/K/H, XXR/K, XXR/H, XXK/H, XXR, XXK, XXH, XXKG, RXXR/K/H, RXXR/K, RXXR/H, RXXK/H, RXXR, RXXK, RXXH, RXXKG, KXXR/K/H, KXXR/K, KXXR/H, KXXK/H, KXXR, KXXK, KXXH, KXXKG, HXXR/K/H, HXXR/K, HXXR/H, HXXK/H, HXXR, HXXK, HXXH, HXXKG, R/K/HXXR, R/KXXR, R/HXXR, K/HXXR, RXXR, KXXR, HXXR, R/K/HXXK, R/KXXK, R/HXXK, K/HXXK, RXXK, KXXK, HXXK, R/K/HXXH, R/KXXH, R/HXXH, K/HXXH, RXXH, KXXH, HXXH, R/K/HXXKG, R/KXXKG, R/HXXKG, K/HXXKG, RXXKG, KXXKG y HXXKG.

Dicho sistema de intemalización controlable por proteasa puede resultar útil en la preparación de composiciones con funciones, tales como la incorporación específica de tipo celular y/o específica de tipo tisular, y la capacidad de extender las composiciones en los tejidos. Además, dicha regla puede ser relevante para una multitud de procesos biológicos, incluyendo la infección vírica y la fagocitosis. Debido a que los virus pueden utilizar naturalmente la ruta de CendR para infectar las células, los péptidos y/o conjugados de CendR pueden resultar útiles para interferir en el procedimiento de infección vírica.

En un ejemplo, los péptidos CendR pueden utilizarse en nanomedicina. Uno de los objetivos principales de la nanomedicina es diseñar dispositivos que superen los fármacos simples mediante la realización de múltiples funciones en el diagnóstico, monitorización y tratamiento de las enfermedades. Pueden aplicarse nuevas tecnologías para resolver algunos de los problemas principales en los usos médicos de las nanopartículas multifuncionales. Un objetivo importante de la nanotecnología médica es desarrollar nanodispositivos capaces de monitorizar enfermedades en tejidos, incluyendo el interior de las células. Dicho dispositivo puede implicar una nanopartícula que, después de muestrear el interior de una célula, vuelva para informar sobre los hallazgos. Lo anterior requiere la capacidad de salir de las células. Varias proteínas citoplasmáticas que carecen de una secuencia de señal para la secreción, no obstante, son secretadas de la célula. Un ejemplo importante de una proteína celular que se comporta de esta manera es el FGF básico (Backhaus et al., 2004). La proteína VP22 también sale de las células de una manera no convencional. La dotación de las nanopartículas con señales de salida para células no diana puede reducir la toxicidad no específica de las partículas. Las bibliotecas de fagos penetrantes en tejidos pueden utilizarse para identificar señales moleculares que estimulan la salida de las nanopartículas de las células.

1. Elementos CendR y sus usos.

Se da a conocer en la presente memoria, aunque no está cubierto en la invención reivindicada, un método de formación de un conjugado de CendR, en donde el método comprende seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula y/o la penetración en tejidos, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento C-terminal y causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente con una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos seleccionada se encuentra en el extremo C-terminal de la proteína o péptido, en el que el conjugado de CendR comprende la proteína o péptido y la composición de carga acoplada o asociada.

Tal como se ha definido en la presente memoria, un elemento C-terminal es una arginina, una lisina o lisina-glicina (para un elemento CendR de tipo 1), o una histidina, o una secuencia de aminoácidos que presenta la secuencia X1X2X3X4, en la que X1 puede ser R, K o H, en donde X4 puede ser R, K, H o KG, y en donde X2 y X3 pueden ser, cada uno independientemente, cualquier aminoácido (para un elemento CendR de tipo 2).

Tal como se utiliza en la presente memoria, "seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula" se refiere a seleccionar, identificar, diseñar o de otro modo categorizar una secuencia de aminoácidos con la intención específica de conseguir la entrada en una célula de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos. De esta manera, por ejemplo, seleccionar una secuencia de aminoácidos para algún propósito o capacidad diferente de conseguir la entrada en la célula de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos y, en ausencia de una intención de conseguir la entrada en la célula de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos, no constituye "seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en la célula". La selección de una secuencia de aminoácidos con algún propósito o capacidad, así como para conseguir la entrada en la célula de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos sí constituye "seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en la célula". De esta manera, la presencia de metas o propósitos adicionales no altera que la selección de una secuencia de aminoácidos por lo menos con la intención específica de conseguir la entrada en la célula de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos constituye "seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en la célula".

Tal como se utiliza en la presente memoria, "seleccionar una secuencia de aminoácidos para la penetración en tejidos" se refiere a seleccionar, identificar, diseñar o de otro modo categorizar una secuencia de aminoácidos con la intención específica de conseguir la entrada en un tejido (es decir, la penetración en un tejido) de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos. De esta manera, por ejemplo, seleccionar una secuencia de aminoácidos para algún propósito o capacidad diferente de conseguir la entrada en la célula de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos y, en ausencia de una intención de conseguir la entrada en la célula de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos, no constituye "seleccionar una secuencia de aminoácidos para la penetración en un tejido". La selección de una secuencia de aminoácidos con algún propósito o capacidad, así como para conseguir la entrada en la célula de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos sí constituye "seleccionar una secuencia de aminoácidos para la penetración en un tejido". De esta manera, la presencia de metas o propósitos adicionales no altera que la selección de una secuencia de aminoácidos por lo menos con la intención específica de conseguir la entrada en un tejido de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos constituye "seleccionar una secuencia de aminoácidos para la penetración en un tejido".

Tal como se utiliza en la presente memoria, "seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula y/o la penetración en un tejido" se refiere a seleccionar, identificar, diseñar o de otro modo categorizar una secuencia de aminoácidos con la intención específica de conseguir la entrada en una célula o tejido, o ambos, de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos. De esta manera, por ejemplo, seleccionar una secuencia de aminoácidos para algún propósito o capacidad diferente de conseguir la entrada en la célula o en un tejido, o ambos, de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos y, en ausencia de una intención de conseguir la entrada en la célula o en un tejido, o en ambos, de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos, no constituye "seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en la célula y/o la penetración en un tejido". La selección de una secuencia de aminoácidos con algún propósito o capacidad, así como para conseguir la entrada en la célula o en un tejido, o en ambos, de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos sí constituye "seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en la célula y/o la penetración en un tejido". De esta manera, la presencia de metas o propósitos adicionales no altera que la selección de una secuencia de aminoácidos por lo menos con la intención específica de conseguir la entrada en la célula, en un tejido, o en ambos, de una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos constituye "seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en la célula y/o la penetración en un tejido".

Tal como se utiliza en la presente memoria, "causar que una composición de carga esté acoplada covalentemente o asociada no covalentemente" con otro elemento se refiere a cualquier acción que resulta en una composición de carga que no está acoplada covalentemente o asociada no covalentemente, con que dicho otro elemento adquiera o se transforme en el estado de estar acoplado covalentemente o asociado no covalentemente con dicho otro elemento. A título de ejemplo, el acoplamiento covalente de una composición de carga a otra composición de carga constituye "causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente" a otra composición de carga. A título de otro ejemplo, una composición de carga que empieza como un concepto no existente y después se sintetiza como parte de una composición que incluye el elemento al que debe acoplarse o asociarse la composición de carga constituye "causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente" al elemento. Por ejemplo, la síntesis de un péptido que incluye tanto una secuencia de aminoácidos de interés como una secuencia de aminoácidos que comprende un elemento C-terminal constituye causar que una composición de carga (la secuencia de aminoácidos de interés) se acople covalentemente o se asocie covalentemente a la secuencia de aminoácidos que comprende un elemento C-terminal. Sin embargo, y en general, la síntesis de una proteína o péptido que incluye naturalmente tanto la secuencia de aminoácidos de interés como la secuencia de aminoácidos que comprende un elemento C-terminal puede excluirse como procedimiento de "causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente" a la secuencia de aminoácidos que comprende un elemento C-terminal.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "elemento CendR" se refiere a una secuencia de aminoácidos que presenta una arginina, lisina o secuencia lisina-glicina (para un elemento CendR de tipo 1) C-terminal, o una histidina C-terminal, o una secuencia de aminoácidos C-terminal que presenta la secuencia X1X2X3X4, en la que X1 puede ser R, K o H, X4 puede ser R, K, H o KG, y X2 y X3 pueden ser, cada uno independientemente, cualquier aminoácido (para un elemento CendR de tipo 2). Algunos elementos CendR de tipo 2 también pueden describirse como R/K/HXXR/K/H (SEC ID n,° 50) y R/K/HXXKG (SEC ID n.° 51). También pueden seleccionarse los aminoácidos X1, X2 y X3, por ejemplo, para reclutar proteínas adicionales a las moléculas de NRP-1 en la superficie celular. Lo anterior puede aplicarse, por ejemplo, a modular la selectividad e internalización y/o la potencia de penetración en tejidos de los elementos CendR (y los conjugados, proteínas y péptidos que contienen elementos CendR). Un elemento CendR puede, por ejemplo, comprender una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta un elemento C-terminal, que comprende una proteína o péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta un elemento C-terminal, o que consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta un elemento C-terminal. Opcionalmente, determinados aminoácidos también pueden excluirse de la utilización para X2, X3 o ambos en los elementos CendR de la forma X1X2X3X4. Por ejemplo, si se desea, G y D pueden excluirse del uso simultáneo como X2 y X3, respectivamente.

Un elemento CendR que puede internalizarse en una célula puede denominarse elemento CendR de internalización. Un elemento CendR que puede penetrar en un tejido puede denominarse elemento CendR penetrante. Un elemento CendR que puede internalizarse en una célula y que puede penetrar en un tejido puede denominarse elemento CendR de intemalización y penetrante. A menos que el contexto indique claramente lo contrario, la referencia a "elemento CendR" se refiere a cualquiera de ellos, individualmente, colectivamente o en cualquier combinación.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "conjugado de CendR" se refiere a una composición de carga con una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un elemento CendR en el que la secuencia de aminoácidos se encuentra en el extremo C-terminal de la proteína o péptido.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "elemento CendR activable" se refiere a un elemento CendR que presenta una molécula, fracción, nanopartícula, compuesto u otra composición acoplado covalentemente al elemento CendR, de manera que el grupo carboxilo terminal del elemento C-terminal, en el que la molécula, fracción, nanopartícula, compuesto u otra composición puede bloquear la internalización y/o la penetración en tejidos del conjugado de CendR y en donde la molécula, fracción, nanopartícula, compuesto u otra composición puede eliminarse (exponiendo el grupo carboxi-terminal, por ejemplo). Por ejemplo, el elemento CendR activable puede encontrarse en el extremo C-terminal del péptido y puede evitar que el elemento CendR resulte internalizado y/o que penetre en el tejido. La molécula, nanopartícula, fracción, compuesto u otra composición acoplada covalentemente con el elemento CendR puede denominarse "grupo de bloqueo". Por ejemplo, el grupo de bloqueo puede acoplarse con el grupo carboxi terminal de la arginina o lisina C-terminal u otro aminoácido C-terminal del elemento CendR, con el aminoácido C-terminal del elemento CendR, o con un aminoácido del elemento CendR diferente del aminoácido C-terminal. El grupo de bloqueo también puede acoplarse o asociarse a una parte de un conjugado de CendR diferente del elemento CendR siempre que pueda evitar que el elemento CendR resulte internalizado y/o penetre en el tejido.

Un elemento CendR activable puede bloquearse evitando su internalización en la célula, evitando su penetración en un tejido, o ambos. Generalmente, un elemento CendR activable se bloqueará tanto respecto a la internalización en la célula como respecto a la penetración en tejidos. Dichos elementos CendR activables pueden denominarse elementos CendR de internalización y penetrantes activables. Sin embargo, algunos elementos CendR activables podrían bloquearse únicamente respecto a la penetración en tejidos o únicamente respecto a la internalización en células. Dichos elementos CendR activables pueden denominarse elementos CendR de internalización activable (para los elementos CendR que se bloquean únicamente respecto a la internalización en la célula) o como elementos CendR penetrantes activables (para los elementos CendR que se bloquean únicamente respecto a la penetración en tejidos). Generalmente, los elementos CendR que son activables serán elementos CendR de internalización activables. De manera similar, los elementos CendR penetrantes que son activables generalmente serán elementos CendR de penetración activables. Los elementos CendR de internalización y penetrantes que son activables serán elementos CendR de internalización y penetrantes activables. La eliminación del grupo de bloqueo permitirá que el elemento CendR sea internalizado en la célula, penetre en tejido o ambos.

Un "elemento CendR activable por proteasa" (o "elemento CendR activado por proteasa") se refiere a un elemento CendR activable en el que el grupo de bloqueo se acopla con el elemento CendR mediante un enlace peptídico y en el que el enlace peptídico puede ser escindido por una proteasa. La escisión de dicho enlace peptídico en un elemento CendR activable por proteasa provoca que el elemento CendR sea capaz de internalización en la célula y/o de penetración en tejidos. En un ejemplo, el grupo de bloqueo puede acoplarse con el elemento CendR mediante un enlace escindible o lábil. El enlace escindible puede escindirse mediante, por ejempo, un enzima o un compuesto químico. El enlace de escisión o de "labilización" en un elemento CendR activable provoca que el elemento CendR sea capaz de internalización en la célula y/o de penetración en tejidos. Dicha escisión o "labilización" puede denominarse activación del elemento CendR. Un elemento CendR activable por proteasa es una forma de elemento CendR activable. Los aminoácidos X2 y X3 de un elemento CendR de la forma X1X2X3X4 pueden seleccionarse con fines específicos. Por ejemplo, X2, X3 o ambos pueden seleccionarse para formar la totalidad o una parte de una secuencia de reconocimiento de proteasa. Lo anterior resultaría útil, por ejemplo, para especificar o permitir el corte de un péptido que posee el elemento CendR como elemento CendR críptico o latente que resulta activado por la escisión después del aminoácido X4. Se muestran ejemplos de dichas opciones de aminoácido en las Tablas 1 y 4. Una clase útil de elementos CendR puede consistir en elementos CendR no bloqueados y elementos CendR activables, en donde la clase excluye los elementos CendR bloqueados que no son activables.

Entre las proteasas útiles se incluyen enzimas que escinden el lado C-terminal de los residuos básicos (los residuos C-terminales de los elementos CendR pueden ser residuos básicos) y los enzimas que reconocen la secuencia en el lado C-terminal de su sitio de escisión (permitiendo de esta manera la libre elección de la secuencia C-terminal del producto de escisión). Entre los ejemplos de proteasas útiles se incluyen, por ejemplo, las serina-proteasas (incluyendo, por ejemplo, los activadores de plasmina y de plasminógeno), las proproteína convertasas (ver, por ejemplo, Duckert et al., Prediction of proprotein convertase cleavage sites Protein engineering Design and Selection 17(1):107-112 (2004)), las furinas y las carboxipeptidasas. Las serina-proteasas resultan particularmente útiles para los elementos CendR y conjugados de CendR dirigidos a células de cáncer y tumores. Entre los enzimas que escinden en el lado C-terminal de los residuos básicos se incluyen la Arg-C proteasa (que escinde en el lado C-terminal de los residuos de arginina; Keil, Specificity of Proteolysis (Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York) (1992)), la clostripaína (que escinde en el lado C-terminal de los residuos de arginina; Keil, 1992), la enteroquinasa (que escinde después de la secuencia -Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-; SEC ID n.° 131), el factor Xa (que escinde después de la secuencia -Gly-Arg-; Fujikawa et al., Activation of bovine factor X (Stuart factor): conversion of factor Xa alpha to factor Xa beta, Proc. Natl. Acad. Sci. 72: 3359-3363 (1975)) Lys-C (que escinde en el lado C-terminal de los residuos de lisina; Keil, 1992), la trombina (que escinde en el lado C-terminal de los residuos de arginina; Keil, 1992), la tryipsina (que escinde en el lado C-terminal de los residuos de arginina y lisina; Keil, 1992), las serina proteasas, las proproteína convertasas (tales como PC1, PC₂, PC₃, PC4, PC5, PC₆, PC7, PC₈, furina, Pace, PACE4, proteasa del sitio 1, S1P, SKI, NARC-1, PCSK1, PCSK₂, PCSK3, PCSK4, PCSK5, PCSK6, PCSK7, PCSK8 y PCSK9), la plasmina y los activadores del plasminógeno. Entre los ejemplos de enzimas que reconocen la secuencia en el lado C-terminal de su sitio de escisión se incluyen la Asp-N endopeptidasa (que escinde en el lado N-terminal del ácido aspártico; Keil, 1992) y las carboxipeptidasas, tales como la carboxipeptidasa A (que escinde los residuos C-terminales, excepto la prolina, la lisina y la arginina).

También se señalan ejemplos de proteasas en Hook, Proteolytic and cellular mechanisms in prohormone and proprotein processing, R₉Landes Company, Austin, Texas, EE. Uu . (1998); Hooper et al., Biochem. J. 321: 265-279 (1997); Werb, Cell 91: 439-442 (1997); Wolfsberg et al., J. Cell Biol. 131: 275-278 (1995); Murakami and Etlinger, Biochem. Biophys. Res. Comm. 146: 1249-1259 (1987); Berg et al., Biochem. J. 307: 313-326 (1995); Smyth y Trapani, Immunology Today 16: 202-206 (1995); Talanian et al., J. Biol. Chem. 272: 9677-9682 (1997); y Thornberry et al., J. Biol. Chem. 272: 17907-17911 (1997).

Tabla 4. Reglas de escisión

Reglas de excepción: Las reglas de escisión anteriormente indicadas no son aplicables, es decir, no ocurre escisión, con las composiciones siguientes de sitios de escisión:

Algunas formas útiles de elementos CendR activables pueden ser, o pueden encontrarse en, proteínas o péptidos circulares. El elemento CendR sería latente en dichas estructuras circulares debido a que el elemento CendR no se encontraría en un extremo C-terminal libre. Las proteínas y péptidos circulares pueden formarse de una diversidad de maneras conocidas de la técnica, tales como mediante enlaces de cisteína, mediante enlaces covalentes, mediante la reacción de grupos activos, y mediante conectores. Los enlaces de cisteína son un modo útil de circularizar proteínas y péptidos. Debe entenderse que el enlace circularizante no necesita estar en el extremo C-terminal del elemento CendR. Al situar el enlace circularizante lejos del extremo C-terminal del elemento CendR, la elección de enlace circularizante y la elección de enlace escindible del elemento CendR latente pueden hacerse por separado. Por ejemplo, el enlace circularizante puede ser un enlace de cisteína, mientras que el enlace escindible del elemento CendR latente puede ser un enlace peptídico (en donde el enlace peptídico puede encontrarse, por ejemplo, en el sitio de escisión de una diana proteasa).

El elemento CendR en una proteína, péptido, secuencia de aminoácidos o conjugado de CendR dado a conocer generalmente debe encontrarse en un extremo C-terminal libre o en el lado N-terminal del sitio de escisión en un elemento CendR activable.

En algunas formas, el péptido o proteína del conjugado de CendR puede internalizarse en la célula en el caso de que se encuentre presente la secuencia de aminoácidos (el elemento CendR) seleccionado dentro del péptido o proteína, aunque no en el caso de que la secuencia de aminoácidos seleccionada no se encuentre presente en el péptido o proteína. Lo anterior puede utilizarse para detectar si una proteína o péptido comprende un elemento CendR, por ejemplo. El elemento CendR puede internalizarse en la célula sin estar asociado a ningún otro elemento excepto a su propia secuencia, por ejemplo. El elemento CendR puede ser el único elemento de internalización funcional en la proteína o péptido o el conjugado de CendR, o puede haber uno o más elementos de internalización funcionales adicionales. En algunas formas, el conjugado de CendR puede internalizarse en la célula en el caso de que se encuentre presente la secuencia de aminoácidos (el elemento CendR) seleccionado en el conjugado de CendR, aunque no en el caso de que la secuencia de aminoácidos seleccionada no se encuentre presente en el conjugado de CendR.

De manera similar, en algunas formas, el péptido o proteína del conjugado de CendR puede penetrar en tejidos en el caso de que se encuentre presente la secuencia de aminoácidos (el elemento CendR) seleccionado dentro del péptido o proteína, aunque no en el caso de que la secuencia de aminoácidos seleccionada no se encuentre presente en el péptido o proteína. Lo anterior puede utilizarse para detectar si una proteína o péptido comprende un elemento CendR, por ejemplo. El elemento CendR puede penetrar en tejidos sin estar asociado a ningún otro elemento excepto a su propia secuencia, por ejemplo. El elemento CendR puede ser el único elemento de penetración en tejidos funcional en la proteína o péptido o el conjugado de CendR, o puede haber uno o más elementos de penetración en tejidos funcionales adicionales. En algunas formas, el conjugado de CendR puede penetrar en tejidos en el caso de que se encuentre presente la secuencia de aminoácidos (el elemento CendR) seleccionado en el conjugado de CendR, aunque no en el caso de que la secuencia de aminoácidos seleccionada no se encuentre presente en el conjugado de CendR.

De manera similar, en algunas formas, el péptido o proteína del conjugado de CendR puede internalizarse en la célula y penetrar en tejidos en el caso de que se encuentre presente la secuencia de aminoácidos (el elemento CendR) seleccionado dentro del péptido o proteína, aunque no en el caso de que la secuencia de aminoácidos seleccionada no se encuentre presente en el péptido o proteína. Lo anterior puede utilizarse para detectar si una proteína o péptido comprende un elemento CendR, por ejemplo. El elemento CendR puede internalizarse en la célula y penetrar en tejidos sin estar asociado a ningún otro elemento excepto a su propia secuencia, por ejemplo. El elemento CendR puede ser el único elemento de internalización y penetración en tejidos funcional en la proteína o péptido o el conjugado de CendR, o puede haber uno o más elementos de internalización y/o penetración en tejidos funcionales adicionales. En algunas formas, el conjugado de CendR puede internalizarse en la célula y penetrar en tejidos en el caso de que se encuentre presente la secuencia de aminoácidos (el elemento CendR) seleccionado en el conjugado de CendR, aunque no en el caso de que la secuencia de aminoácidos seleccionada no se encuentre presente en el conjugado de CendR.

El término "internalización" se refiere al paso a través de una membrana plasmática u otra barrera biológica. El término "penetración" se refiere al paso hacia el interior y a través de una célula, tejido u otra barrera biológica. La penetración generalmente implica e incluye la internalización. Los elementos CendR dados a conocer generalmente estimulan y permiten tanto la internalización (tal como la internalización en una célula) como la penetración (tal como la penetración en un tejido). La referencia a la internalización o a la penetración debe entenderse que se refiere tanto a la internalización como a la penetración a menos que el contexto indique lo contrario (tal como un comentario y descripción separados o diferentes de la internalización en la célula y la penetración en un tejido por separado; el presente párrafo es un ejemplo de este caso).

La expresión "internalización en la célula" pretende referirse a que el elemento CendR es capaz de penetrar en la membrana plasmática, resultando internalizado de esta manera en la célula. Dicha internalización puede ocurrir, con una eficiencia de, por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % para un elemento CendR dado y una célula dada.

Puede producirse un conjugado de CendR, por ejemplo, mediante un método que comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula y/o la penetración en un tejido, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una arginina o lisina (u otra secuencia de elemento CendR) C-terminal, (b) causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente con una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos seleccionada se encuentra en el extremo C-terminal de la proteína o péptido, en el que el conjugado de CendR comprende la proteína o péptido y la composición de carga acoplada o asociada.

Se da a conocer, además, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, un método de transporte de una composición de carga hasta el interior de la célula, en el que el método comprende: (a) acoplar un elemento CendR con la composición de carga, formando de esta manera un conjugado de CendR, y (b) exponer la célula al conjugado de CendR, en el que el conjugado de CendR a continuación puede entrar en la célula, transportando de esta manera la composición de carga hasta el interior de la célula.

Se da a conocer, además, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, un método para causar que una composición de carga penetre, en el que el método comprende: (a) acoplar un elemento CendR con la composición de carga, formando de esta manera un conjugado de CendR, y (b) exponer el tejido al conjugado de CendR, en el que el conjugado de CendR a continuación puede entrar y salir de células en el tejido, causando de esta manera la penetración en el tejido de la composición de carga. El paso o penetración a través del tejido (que también puede denominarse extravasación y penetración en el tejido) puede ser una función tanto de una función tanto de internalización como de salida celulares. Los elementos CendR y conjugados de CendR dados a conocer son capaces de penetrar en tejidos porque son capaces tanto de internalización de entrada como de salida en las células.

Se da a conocer, además, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, un método de transporte de una composición de carga hasta el interior de la célula, en el que el método comprende: (a) acoplar un elemento CendR activable con la composición de carga, formando de esta manera un conjugado de CendR, y (b) exponer la célula al conjugado de CendR, en el que el agente de escisión activa el elemento CendR activable del conjugado de CendR, en el que el conjugado de CendR a continuación puede entrar en la célula, transportando de esta manera la composición de carga hasta el interior de la célula.

Se da a conocer, además, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, un método para causar que una composición de carga penetre, en el que el método comprende: (a) acoplar un elemento CendR activable con la composición de carga, formando de esta manera un conjugado de CendR, y (b) exponer el tejido al conjugado de CendR, de manera que el agente de escisión activa el elemento CendR activable del conjugado de CendR, en el que el conjugado de CendR a continuación puede entrar y salir de células en el tejido, causando de esta manera la penetración en el tejido de la composición de carga.

Se da a conocer, además, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, un método de identificación de una célula que puede internalizar un elemento CendR, en el que el método comprende: (a) exponer una célula a un elemento CendR y (b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado. La célula puede encontrarse en un ensayo, por ejemplo. El elemento CendR puede acoplarse con una proteína o péptido, formando de esta manera un conjugado de CendR.

Se da a conocer, además, aunque no cubierto por la invención reivindicada, un método de identificación de una célula que puede internalizar un elemento CendR activable, en el que el método comprende: (a) exponer una célula a un elemento CendR activable y (b) determinar si el elemento CendR activable ha sido internalizado. El elemento CendR activable puede desbloquearse antes de la exposición a la célula, aunque ello no es necesario. Lo anterior puede utilizarse para someter a ensayo la capacidad de bloqueo del elemento activable, por ejemplo. El elemento CendR activable también puede ser un elemento CendR activable por proteasa, que se activa en la presencia de una proteasa que escindirá el elemento activable.

Se da a conocer, además, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, un método de identificación de una célula de cáncer como candidato a la terapia a base de CendR, en el que el método comprende: (a) exponer la célula de cáncer a un elemento CendR y (b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado por la célula de cáncer, en la que un elemento CendR internalizado identifica la célula de cáncer como candidata para la terapia a base de CendR. La célula puede encontrarse en un ensayo, o puede encontrarse en un/a sujeto, por ejemplo. El elemento CendR puede acoplarse con una composición de carga, tal como, por ejemplo, una proteína, péptido, o nanopartícula, formando de esta manera un conjugado de CendR. Tal como se utiliza en la presente memoria, la terapia a base de CendR se refiere al tratamiento de un sujeto que implica un elemento CendR o un conjugado de CendR.

Se da a conocer, además, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, un método de identificación de un tumor como candidato a la terapia a base de CendR, en el que el método comprende: (a) exponer el tejido del tumor a un elemento CendR y (b) determinar si el elemento CendR ha pasado por el tejido o ha sido internalizado por células en el tejido, en el que un elemento CendR que ha pasado o ha sido internalizado identifica el tumor como candidato para la terapia a base de CendR.

Se da a conocer, además, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, un método para producir un elemento CendR activable que puede activarse en proximidad a una célula de interés, en el que el método comprende formar un elemento CendR activable en el que se acopla un grupo bloqueante con un elemento CendR mediante un enlace escindible, en el que el enlace escindible es escindido por un enzima presente en proximidad a la célula de interés. Lo anterior puede comprender, además, previamente a la formación del elemento CendR activable, identificar el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés. Lo anterior puede comprender, además, previamente a la formación del elemento CendR activable, seleccionar el enlace escindible basándose en el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés.

Se da a conocer, además, aunque no cubierto por la invención reivindicada, un método de formación de un elemento CendR activable, en el que el método comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, en el que el elemento CendR (tal como una arginina, lisina o lisina-glicina C-terminal u otra secuencia de elemento CendR) comprende un grupo carboxilo terminal y (b) causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con el grupo carboxilo terminal de la secuencia de aminoácidos seleccionada, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el grupo carboxilo terminal es escindible, en el que el elemento CendR activable comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada y el grupo de bloqueo. Lo anterior puede comprender, además, antes de la etapa (b), seleccionar el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el grupo carboxilo terminal para que sea escindible por una proteasa presente en proximidad a la célula de interés.

Se da a conocer, además, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, un elemento CendR activable preparado mediante un método que comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, en el que el elemento CendR comprende un grupo carboxilo terminal y (b) causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con el grupo carboxilo terminal de la secuencia de aminoácidos seleccionada, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el grupo carboxilo terminal es escindible, en el que el elemento CendR activable comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada y el grupo de bloqueo. El método puede comprender, además, antes de la etapa (b), seleccionar el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el grupo carboxilo terminal para que sea escindible por una proteasa presente en proximidad a la célula/tipo celular/tejido de interés.

Se dan a conocer, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, elementos CendR y proteínas y péptidos que comprenden elementos CendR. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, conjugados de CendR que comprenden una composición de carga acoplada covalentemente, o asociada no covalentemente, con una proteína o péptido que comprende un elemento CendR. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, conjugados de CendR que comprenden una composición de carga acoplada covalentemente, o asociada no covalentemente, con una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR. La composición de carga puede acoplarse o asociarse a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR.

Se dan a conocer, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, elementos CendR activables y proteínas y péptidos que comprenden elementos CendR activables. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, conjugados de CendR activables que comprenden una composición de carga acoplada covalentemente, o asociada no covalentemente, con una proteína o péptido que comprende un elemento CendR activable. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, conjugados de CendR activables que comprenden una composición de carga acoplada covalentemente, o asociada no covalentemente, con una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR activable. La composición de carga puede acoplarse o asociarse a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR activable.

Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, conjugados de CendR preparados mediante el método que comprende causar que una composición de carga esté acoplada covalentemente, o asociada no covalentemente, a una proteína o péptido que comprende un elemento CendR, en el que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, conjugados de CendR preparados mediante un método que comprende causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente a una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento C-terminal, en el que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, conjugados de CendR preparados mediante un método que comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula y/o la penetración en un tejido, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento C-terminal y (b) causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente a una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. El conjugado de CendR puede comprender la proteína o péptido y la composición de carga acoplada o asociada.

Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, elementos CendR activables preparados mediante el método que comprende causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con un elemento CendR, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo y el elemento CendR es escindible. Se da a conocer, además, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, un elemento CendR activable preparado mediante un método que comprende causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con una secuencia de aminoácidos, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el elemento CendR es escindible. Se da a conocer, además, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, un elemento CendR activable preparado mediante un método que comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula y/o la penetración en un tejido, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, y (b) causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con el elemento CendR, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el elemento CendR es escindible. El grupo de bloqueo acoplado covalentemente con el elemento CendR reduce o evita la internalización en la célula y/o la penetración en tejidos. El grupo de bloqueo acoplado covalentemente con el elemento CendR puede reducir o evitar la internalización en la célula y/o la penetración en tejidos en comparación con el mismo elemento CendR sin ningún grupo de bloqueo. El elemento CendR activable puede comprender la secuencia de aminoácidos seleccionada y el grupo de bloqueo.

La proteína o péptido puede internalizarse en la célula y/o puede penetrar en tejidos en el caso de que el elemento CendR esté presente en la proteína o péptido, pero no en el caso de que no esté presente el elemento CendR en la proteína o péptido. La proteína o péptido puede internalizarse en la célula y/o puede penetrar en el tejido en el caso de que la secuencia de aminoácidos seleccionada se encuentre presente en la proteína o péptido, pero no en el caso de que la secuencia de aminoácidos seleccionada no se encuentre presente en la proteína o péptido. El elemento CendR puede internalizarse en la célula y/o puede penetrar en tejidos sin estar asociado a la composición de carga. La secuencia de aminoácidos seleccionada puede internalizarse en la célula y/o puede penetrar en tejidos sin estar asociada a la composición de carga. El elemento CendR puede ser el único elemento de internalización funcional en la proteína o péptido; el elemento CendR puede ser el único elemento funcional de penetración en tejido en la proteína o péptido, o ambos. La secuencia de aminoácidos seleccionada puede ser el único elemento de internalización funcional en la proteína o péptido; la secuencia de aminoácidos seleccionada puede ser el único elemento funcional de penetración en tejido en la proteína o péptido, o ambos. El elemento CendR puede ser el único elemento de internalización funcional en el conjugado de CendR; el elemento CendR puede ser el único elemento funcional de penetración en tejido en el conjugado de CendR, o ambos. La secuencia de aminoácidos seleccionada puede ser el único elemento funcional de internalización en el conjugado de CendR, la secuencia de aminoácidos seleccionada puede ser el único elemento funcional de penetración en tejidos en el conjugado de CendR, o ambos.

El elemento CendR puede ser un elemento CendR activable. El elemento CendR puede ser un elemento CendR activable por proteasa. La proteína o péptido puede ser circular o puede contener un bucle. El elemento CendR puede encontrarse en el extremo C-terminal de la proteína o péptido. El elemento CendR puede comprender un grupo carboxilo terminal. Puede acoplarse un grupo de bloqueo al grupo carboxilo terminal. El enlace que acopla el grupo de bloqueo con el grupo carboxilo terminal puede seleccionarse para que sea escindible por una proteína presente en proximidad a la célula de interés. El grupo de bloqueo puede acoplarse con el aminoácido C-terminal del elemento CendR. El grupo de bloqueo puede acoplarse con un aminoácido del elemento CendR diferente del aminoácido C-terminal del elemento CendR.

Puede acoplarse covalentemente o asociarse no covalentemente una composición de carga con una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos puede comprender un elemento CendR. La composición de carga puede acoplarse o asociarse a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. La composición de carga puede ser, por ejemplo, una nanopartícula o una molécula, o un complejo de moléculas con aplicaciones terapéuticas o diagnósticas. Entre las composiciones de carga terapéuticas que pueden dianizarse con elementos CendR se incluyen, aunque sin limitación, una nanopartícula, una molécula, un complejo de moléculas, un agente antiangiogénico, un agente proangiogénico, un agente quimioterapéutico de cáncer, un agente citotóxico, un agente prosupervivencia celular, un agente de diferenciación celular, un agente neuroprotector, un agente inmunomodulador, un agente antiinflamatorio, un agente antiartrítico, un agente antivírico o una combinación de los mismos. Entre las composiciones de carga diagnósticas que pueden dianizarse con elementos CendR se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, una nanopartícula, una molécula, un complejo de moléculas, un agente de obtención de imágenes de resonancia magnética (RM), un agente de radioimagen, un agente de obtención de imágenes ópticas, una etiqueta molecular (tal como biotina), un fluoróforo, una etiqueta de epítopo (que puede, por ejemplo, detectarse utilizando un ensayo molecular específico) o una combinación de los mismos.

Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de formación de un conjugado de CendR, en donde el método comprende causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente a una proteína o péptido que comprende un elemento CendR, en el que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de formación de un conjugado de CendR, en el que el método comprende causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente a una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, en el que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de formación de un conjugado de CendR, en donde el método comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula y/o la penetración en un tejido, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, y (b) causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente a una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR. El conjugado de CendR puede comprender la proteína o péptido y la composición de carga acoplada o asociada.

Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de transporte de una composición de carga hasta el interior de una célula, en donde el método comprende exponer la célula a un conjugado de CendR, en el que el elemento CendR comprende una composición de carga acoplada covalentemente o asociada no covalentemente a un elemento CendR en el que el elemento CendR a continuación puede entrar en la célula, transportando de esta manera la composición de carga hasta el interior de la célula. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de transporte de una composición de carga hasta el interior de una célula, en donde el método comprende exponer la célula a un conjugado de CendR, en el que el elemento CendR comprende una composición de carga acoplada covalentemente o asociada no covalentemente con una proteína o péptido que comprende un elemento CendR, en el que el conjugado de CendR a continuación puede entrar en la célula, transportando de esta manera la composición de carga hasta el interior de la célula. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de transporte de una composición de carga hasta el interior de una célula, en donde el método comprende: (a) acoplar un elemento CendR con la composición de carga, formando de esta manera un conjugado de CendR, y (b) exponer la célula al conjugado de CendR, en el que el conjugado de CendR a continuación puede entrar en la célula, transportando de esta manera la composición de carga hasta el interior de la célula.

Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de identificación de una célula que puede internalizar un elemento CendR, en el que el método comprende: (a) exponer una célula a un elemento CendR y (b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de identificación de una célula de cáncer como candidata para la terapia a base de CendR, en el que el método comprende: (a) exponer la célula de cáncer a un elemento CendR, y (b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado por la célula de cáncer, en el que un elemento CendR internalizado identifica la célula de cáncer como candidata para la terapia a base de CendR. La célula puede encontrarse en un ensayo. El elemento CendR puede acoplarse con una proteína o péptido. El elemento CendR puede ser un elemento CendR activable. El elemento CendR activable puede activarse antes de la exposición a la célula. El elemento CendR activable puede ser un elemento CendR activable por proteasa. La proteína o péptido puede ser circular. El elemento CendR puede encontrarse en el extremo C-terminal de la proteína o péptido.

Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de identificación de un tejido en el que puede penetrar un elemento CendR, en el que el método comprende: (a) exponer el tejido a un elemento CendR, y (b) determinar si el elemento CendR ha penetrado en el tejido. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de identificación de un tumor como candidato para la terapia a base de CendR, en el que el método comprende: (a) exponer la célula del tumor a un elemento CendR, y (b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado por la célula, en el que un elemento CendR internalizado identifica el tumor como candidato para la terapia a base de CendR. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de identificación de un tumor como candidato para la terapia a base de CendR, en el que el método comprende: (a) exponer el tumor a un elemento CendR, y (b) determinar si el elemento CendR ha penetrado en el tumor, en el que un elemento CendR que ha penetrado identifica el tumor como candidato para la terapia a base de CendR. El tumor puede encontrarse en un ensayo. El elemento CendR puede acoplarse con una proteína o péptido. El elemento CendR puede ser un elemento CendR activable. El elemento CendR activable puede activarse antes de la exposición al tumor. El elemento CendR activable puede ser un elemento CendR activable por proteasa. La proteína o péptido puede ser circular. El elemento CendR puede encontrarse en el extremo C-terminal de la proteína o péptido.

Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos para producir un elemento CendR activable que puede activarse en proximidad a una célula de interés, en el que el método comprende formar un elemento CendR activable en el que se acopla un grupo de bloqueo con un elemento CendR mediante un enlace escindible, en el que el enlace escindible es escindido por un enzima presente en proximidad a la célula de interés. La célula puede encontrarse en un/a sujeto. Puede identificarse el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés. Puede identificarse el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés antes de formar el elemento CendR activable. El enlace escindible puede seleccionarse basándose en el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés. El enlace escindible puede seleccionarse antes de formar el elemento CendR activable. El elemento CendR puede comprender un grupo carboxilo terminal, en el que el grupo de bloqueo se acopla con el grupo carboxilo terminal.

Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de formación e un elemento CendR activable, en el que el método comprende causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con un elemento CendR, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo y el elemento CendR es escindible. Se dan a conocer, además, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos de formación de un elemento CendR activable, en el que el método comprende causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con una secuencia de aminoácidos, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el elemento CendR es escindible. Se da a conocer, además, aunque no está cubierto por la invención reivindicada, métodos de formación de un elemento CendR activable, en el que el método comprende: (a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula y/o la penetración en un tejido, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, y (b) causar que un grupo de bloqueo se acople covalentemente con el elemento CendR, en el que el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el elemento CendR es escindible. El grupo de bloqueo acoplado covalentemente con el elemento CendR reduce o evita la internalización en la célula y/o la penetración en tejidos. El grupo de bloqueo acoplado covalentemente con el elemento CendR puede reducir o evitar la internalización en la célula y/o la penetración en tejidos en comparación con el mismo elemento CendR sin ningún grupo de bloqueo El elemento CendR activable puede comprender la secuencia de aminoácidos seleccionada y el grupo de bloqueo, La célula puede encontrarse en un/a sujeto. Puede identificarse el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés. Puede identificarse el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés antes de formar el elemento CendR activable. El enlace escindible puede seleccionarse basándose en el enzima que se encuentra presente en proximidad a la célula de interés. El enlace escindible puede seleccionarse antes de formar el elemento CendR activable. El elemento CendR puede comprender un grupo carboxilo terminal, en el que el grupo de bloqueo se acopla con el grupo carboxilo terminal. Puede acoplarse covalentemente o asociarse no covalentemente una composición de carga con una proteína o péptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada. La composición de carga puede acoplarse o asociarse a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR.

El elemento CendR puede presentar una longitud de hasta 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 1000 o 2000 residuos. En realizaciones particulares que no están cubiertas por la invención reivindicada, un elemento CendR puede presentar una longitud de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o 200 residuos. En realizaciones adicionales que no están cubiertas por la invención reivindicada, un elemento CendR puede presentar una longitud de 2 a 200 residuos, 2 a 100 residuos, 2 a 90 residuos, 2 a 80 residuos, 2 a 70 residuos, 2 a 60 residuos, 2 a 50 residuos, 2 a 40 residuos, 2 a 30 residuos, 2 a 20 residuos, 2 a 15 residuos, 2 a 10 residuos, 3 a 200 residuos, 3 a 100 residuos, 3 a 90 residuos, 3 a 80 residuos, 3 a 70 residuos, 3 a 60 residuos, 3 a 50 residuos, 3 a 40 residuos, 3 a 30 residuos, 3 a 20 residuos, 3 a 15 residuos, 3 a 10 residuos, 4 a 200 residuos, 4 a 100 residuos, 4 a 90 residuos, 4 a 80 residuos, 4 a 70 residuos, 4 a 60 residuos, 4 a 50 residuos, 4 a 40 residuos, 4 a 30 residuos, 4 a 20 residuos, 4 a 15 residuos, 4 a 10 residuos, 5 a 200 residuos, 5 a 100 residuos, 5 a 90 residuos, 5 a 80 residuos, 5 a 70 residuos, 5 a 60 residuos, 5 a 50 residuos, 5 a 40 residuos, 5 a 30 residuos, 5 a 20 residuos, 5 a 15 residuos, 5 a 10 residuos, 10 a 200 residuos, 10 a 100 residuos, 10 a 90 residuos, 10 a 80 residuos, 10 a 70 residuos, 10 a 60 residuos, 10 a 50 residuos, 10 a 40 residuos, 10 a 30 residuos, 10 a 20 residuos, 20 a 200 residuos, 20 a 100 residuos, 20 a 90 residuos, 20 a 80 residuos, 20 a 70 residuos, 20 a 60 residuos, 20 a 50 residuos, 20 a 40 residuos o 20 a 30 residuos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "residuo" se refiere a un aminoácido o análogo de aminoácido.

La parte de proteína o péptido de un conjugado de CendR puede presentar una longitud de hasta 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 1000 o 2000 residuos. En realizaciones particulares, la parte de proteína o péptido de un conjugado de CendR puede presentar una longitud de por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o 200 residuos. En realizaciones adicionales, la parte de proteína o péptido de un conjugado de CendR puede presentar una longitud de 2 a 200 residuos, 2 a 100 residuos, 2 a 90 residuos, 2 a 80 residuos, 2 a 70 residuos, 2 a 60 residuos, 2 a 50 residuos, 2 a 40 residuos, 2 a 30 residuos, 2 a 20 residuos, 2 a 15 residuos, 2 a 10 residuos, 3 a 200 residuos, 3 a 100 residuos, 3 a 90 residuos, 3 a 80 residuos, 3 a 70 residuos, 3 a 60 residuos, 3 a 50 residuos, 3 a 40 residuos, 3 a 30 residuos, 3 a 20 residuos, 3 a 15 residuos, 3 a 10 residuos, 4 a 200 residuos, 4 a 100 residuos, 4 a 90 residuos, 4 a 80 residuos, 4 a 70 residuos, 4 a 60 residuos, 4 a 50 residuos, 4 a 40 residuos, 4 a 30 residuos, 4 a 20 residuos, 4 a 15 residuos, 4 a 10 residuos, 5 a 200 residuos, 5 a 100 residuos, 5 a 90 residuos, 5 a 80 residuos, 5 a 70 residuos, 5 a 60 residuos, 5 a 50 residuos, 5 a 40 residuos, 5 a 30 residuos, 5 a 20 residuos, 5 a 15 residuos, 5 a 10 residuos, 10 a 200 residuos, 10 a 100 residuos, 10 a 90 residuos, 10 a 80 residuos, 10 a 70 residuos, 10 a 60 residuos, 10 a 50 residuos, 10 a 40 residuos, 10 a 30 residuos, 10 a 20 residuos, 20 a 200 residuos, 20 a 100 residuos, 20 a 90 residuos, 20 a 80 residuos, 20 a 70 residuos, 20 a 60 residuos, 20 a 50 residuos, 20 a 40 residuos o 20 a 30 residuos.

El conjugado de CendR puede presentar una longitud de hasta 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 1000 o 2000 residuos. En realizaciones particulares, el conjugado de CendR puede presentar una longitud de por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o 200 residuos. En realizaciones adicionales, un conjugado de CendR puede presentar una longitud de 5 a 200 residuos, 5 a 100 residuos, 5 a 90 residuos, 5 a 80 residuos, 5 a 70 residuos, 5 a 60 residuos, 5 a 50 residuos, 5 a 40 residuos, 5 a 30 residuos, 5 a 20 residuos, 5 a 15 residuos, 5 a 10 residuos, 10 a 200 residuos, 10 a 100 residuos, 10 a 90 residuos, 10 a 80 residuos, 10 a 70 residuos, 10 a 60 residuos, 10 a 50 residuos, 10 a 40 residuos, 10 a 30 residuos, 10 a 20 residuos, 20 a 200 residuos, 20 a 100 residuos, 20 a 90 residuos, 20 a 80 residuos, 20 a 70 residuos, 20 a 60 residuos, 20 a 50 residuos, 20 a 40 residuos o 20 a 30 residuos.

Se entiende que existen numerosos análogos de aminoácido y de péptido que pueden incorporarse en los conjugados de CendR dados a conocer. Por ejemplo, existen numerosos D-aminoácidos o aminoácidos que pueden utilizarse. Se dan a conocer estereoisómeros opuestos de los péptidos naturales, así como estereoisómeros de análogos de péptidos. Dichos aminoácidos pueden incorporarse fácilmente en cadenas polipeptídicas mediante la carga de moléculas de ARNt con el aminoácido de elección y constructos de ingeniería genética que utilizan, por ejemplo, codones amber, para insertar el análogo de aminoácido en una cadena peptídica de un modo específico de sitio (Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Enginerring Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba y Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994)).

Pueden producirse moléculas que son similares a péptidos, pero que no están conectados mediante un enlace peptídico natural. Por ejemplo, entre los enlaces para aminoácidos o análogos de aminoácidos pueden incluirse CH²NH--, --CH²S--, --CH²--CH²--, --CH=CH— (cis y trans), --COCH²--, -- CH(OH)CH²-- y --CHH²SO- (pueden encontrarse estos y otros en Spatola, A. F., en: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York p 267 (1983); Spatola A F Vega Data (March 1983) Vol. 1, n.° 3, Peptide Backbone Modifications (revisión general; Morley, Trends Pharm Sci (1980) páginas 463 a 468; Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (-C H ²NH--, CH²CH²--); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (--CH H²--S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (--CH--CH--, cis y trans); Almquist et al. J. Med. Chem.

23:1392-1398 (1980) (--COCH²--); Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (--COCH²--); Szelke et al. European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH²--); Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (--C(OH)CH²--); y Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (--CH²--S--). Un enlace no peptídico particularmente preferente es --CH²NH--. Se entiende que los análogos peptídicos pueden presentar más de un átomo entre los átomos del enlace, tal como b-alanina, ácido g-aminobutírico, y similares.

Los análogos de aminoácidos y análogos peptídicos con frecuencia poseen propiedades mejoradas o deseables, tales como, una producción más económica, una mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas mejoradas (semivida, absorción, potencia, eficacia, etc.), una especificidad alterada (p. ej., un amplio espectro de actividades biológicas), una menor antigenicidad, y otras.

Los D-aminoácidos pueden utilizarse para generar péptidos más estables, debido a que los D-aminoácidos no resultan reconocidos por peptidasas, y similares. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso por un D-aminoácido del mismo tipo (p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) puede utilizarse para generar péptidos más estables. Pueden utilizarse residuos de cisteína para ciclizar o unir dos o más péptidos entre sí. Lo anterior puede resultar beneficioso para restringir péptidos a conformaciones particulares. (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)).

Se dan a conocer, aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, conjugados de CendR polifuncionales que, además del elemento CendR, contienen, por ejemplo, un péptido de reconocimiento fusionado con un segundo péptido que posee una función diferente. Dichos conjugados polifuncionales poseen por lo menos dos funciones conferidas por partes diferentes de la molécula de longitud completa y pueden mostrar, por ejemplo, actividad antiangiogénica o actividad proapoptótica además de la actividad de reconocimiento selectivo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "péptido" se utiliza en términos generales para referirse a péptidos, proteínas, fragmentos de proteínas y similares. El término "péptido-mimético", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula de tipo peptídico que posee la actividad del péptido en el que se basa estructuralmente. Entre dichos peptidomiméticos se incluyen péptidos modificados químicamente, moléculas similares a péptidos que contienen aminoácidos no naturales y peptoides, y poseen una actividad tal como la del peptidomimético del que se derivan (ver, por ejemplo, Goodman y Ro, Peptidomimetics for Drug Design, en: "Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery", vol. 1 (ed. M. E. Wolff; John Wiley & Sons 1995, páginas 803 a 861).

Tal como se da a conocer en la presente memoria, la expresión "composición de carga" se refiere a cualquier composición de materia que pueda utilizarse junto con el elemento CendR. Por ejemplo, una composición de carga puede ser una molécula, un conjugado, una asociación de moléculas, una composición o una mezcla. El experto en la materia puede determinar qué carga puede acoplarse con un conjugado de CendR. Los conjugados de CendR dados a conocer en la presente memoria pueden comprender el elemento CendR acoplado o asociado a la composición de carga. Entre los ejemplos de composiciones de carga se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, agentes antiangiogénicos, agentes proangiogénicos, agentes quimioterapéuticos del cáncer, agentes citotóxicos, agentes antinflamatorios, agentes antiartríticos, polipéptidos, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, nanopartículas, micropartículas, fluoróforos, fluoresceína, rodamina, un radionucleido, indio-111, tecnecio-99, carbono-11, carbono-13 o una combinación de los mismos. Estas composiciones de carga asociadas a un elemento CendR en un conjugado de CendR pueden ser fracciones. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "fracción" se utiliza en términos generales para referirse a un material físico, químico o biológico que generalmente confiere una función biológicamente útil a una composición de carga unida. Una fracción puede ser cualquier material natural o no natural, incluyendo, aunque sin limitación, un material biológico, tal como una célula, fago u otro virus; un compuesto químico orgánico, tal como una molécula pequeña, una nanopartícula, un radionucleido, una molécula de ácido nucleico u oligonucleótido, un polipéptido o un péptido. Por ejemplo, las fracciones que afectan a la diana, tal como fracciones con efecto terapéutico, o que facilitan la detección, visualización u obtención de imágenes de la diana, tal como moléculas fluorescentes o radionucleidos.

Pueden combinarse, unirse y/o acoplarse de cualquier modo adecuado componentes de los conjugados de CendR dados a conocer. Por ejemplo, pueden asociarse fracciones y moléculas de reconocimiento de modo covalente y no covalente, directa o indirectamente, con o sin una fracción de conector.

En algunas realizaciones, un conjugado de CendR puede comprender un agente quimioterapéutico contra el cáncer. Por ejemplo, la composición de carga de un conjugado de CendR puede ser un agente quimioterapéutico contra el cáncer. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "agente quimioterapéutico contra el cáncer" es un agente químico que inhibe la proliferación, crecimiento, periodo de vida o actividad metastásica de las células de cáncer. Dicho agente quimioterapéutico contra el cáncer puede ser, aunque sin limitación, un taxano, tal como docetaxel; una antraciclina, tal como doxorrubicina; un agente alquilante; un alcaloide vinca; un antimetabolito; un agente de platino, tal como cisplatino o carboplatino; un esteroide, tal como metotrexato; un antibiótico, tal como adriamicina; una isofamida; o un modulador selectivo de receptor de estrógeno; un anticuerpo tal como trastuzumab

Un conjugado de CendR puede comprender un agente terapéutico. Por ejemplo, una composición de carga del conjugado de CendR puede ser un agente terapéutico. Los agentes terapéuticos útiles pueden ser, por ejemplo, un agente citotóxico, que, tal como se utiliza en la presente memoria, puede ser cualquier molécula que estimule directa o indirectamente la muerte celular. Entre los agentes citotóxicos útiles se incluyen, aunque sin limitación, moléculas pequeñas, polipéptidos, péptidos, peptidomiméticos, moléculas de ácido nucleico, células y virus. A modo de ejemplos no limitativos, entre los agentes citotóxicos útiles se incluyen moléculas pequeñas citotóxicas, tales como doxorrubicinaa, docetaxel o trastuzumab; péptidos antimicrobianos, tales como los indicados más abjo; polipéptidos proapoptóticos, tales como caspasas y toxinas, por ejemplo, caspasa-8; cadena A de la toxina diftérica, exotoxina A de Pseudomonas, toxina del cólera, toxinas de fusión de ligando, tales como DAB389EGF, toxina de Ricinus communis (ricina) y células citotóxicas, tales como las células T citotóxicas. Ver, por ejemplo, Martin et al., Cancer Res. 60:3218-3224 (2000); Kreitman y Pastan, Blood 90:252-259 (1997); Allam et al., Cancer Res. 57:2615-2618 (1997); y Osborne y Coronado-Heinsohn, Cancer J. Sci. Am. 2:175 (1996). El experto en la materia entenderá que estos y otros agentes citotóxicos indicados en la presente memoria o conocidos de la técnica pueden resultar útiles en los conjugados y métodos dados a conocer.

En algunas formas, el agente terapéutico puede ser un polipéptido terapéutico. Tal como se utiliza en la presente memoria, un polipéptido terapéutico puede ser cualquier polipéptido con una función biológicamente útil. Los polipéptidos terapéuticos útiles comprenden, aunque sin limitación, citoquinas, anticuerpos, polipéptidos citotóxicos, polipéptidos proapoptóticos y polipéptidos antiangiogénicos. A modo de ejemplos no limitativos, los polipéptidos terapéuticos útiles pueden ser una citoquina, tal como el factor a de necrosis tumoral (TNF-a), el factor p de necrosis tumoral (TNF-p), el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en inglés), el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF, por sus siglas en inglés), interferón-a (IFN-a); interferón gamma (IFN-y), interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-3 (IL-3), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-7 (IL-7), interleuquina-10 (IL-10), interleuquina-12 (IL-12), linfotactina (LTN) o quimioquina 1 de células dendríticas (DC-CK1); un anticuerpo anti-HER2 fragmento del mismo, un polipéptido citotóxico, incluyendo una toxina o caspasa, por ejemplo, la cadena A de la toxina diftérica, la eoxotoxina A de Pseudomonas, la toxina del cólera, una toxina de fusión a ligando, tal como DAB389EGF o la ricina; o un polipéptido antiangiogénico, tal como angiostatina, endostatina, trombospondina, factor 4 de plaquetas, anastelina, o uno de los indicados adicionalmente en la presente memoria o conocidos de la técnica. Se entiende que estos y otros polipéptidos con actividad biológica pueden ser un "polipéptido terapéutico".

Un agente terapéutico útil en los conjugados de CendR dados a conocer puede ser un agente antiangiogénico. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "agente antiangiogénico" se refiere a una molécula que reduce o impide la angiogénesis, que es el crecimiento y desarrollo de vasos sanguíneos. Los conjugados pueden utilizarse para tratar o diagnosticar cualquier enfermedad, afección o trastorno asociado a la angiogénesis. Por ejemplo, la degeneración macular y las complicaciones vasculares diabéticas pueden diagnosticarse y/o tratarse. Puede prepararse una diversidad de agentes antiangiogénicos mediante métodos rutinarios. Entre dichos agentes antiangiogénicos se incluyen, aunque sin limitación, moléculas pequeñas; proteínas, tales como formas negativas dominantes de factores angiogénicos, factores de transcripción y anticuerpos; péptidos, y moléculas de ácido nucleico, incluyendo ribozimas, oligonucleótido antisentido y moléculas de ácido nucleico codificantes, por ejemplo, de formas negativas dominantes de factores angiogénicos y receptores, factores de transcripción, y anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Ver, por ejemplo, Hagedom y Bikfalvi, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 34:89-110 (2000), y Kirsch et al., J. Neurooncol. 50:149-163 (2000).

Entre algunos otros ejemplos de agentes terapéuticos útiles se incluyen mostazas nitrogenadas, nitrosoureas, etilenimina, sulfonatos de alcano, tetrazina, compuestos de platino, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabolitos, análogos de folato, antraciclinas, taxanos, alcaloides vinca, inhibidores de topoisomerasa y agentes hormonales. Son fármacos quimioterapéuticos ejemplares, actinomicina-D, Alkerán, Ara-C, anastrozol, asparaginasa, BiCNU, bicalutamida, bleomicina, busulfán, capecitabina, carboplatino, carboplatinum, carmustina, CCNU, clorambucilo, clomafazina, colofosfamida, cisplatino, cladribina, CPT-11, ciclofosfamida, citarabina, citosina arabinósido, citoxán, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, dexrazoxano, docetaxel, doxorrubicina, DTIC, epirrubicina, estramustina, etilenimina, etopósido, floxuridina, fludarabina, fluorouracilo, flutamida, fotemustina, gemcitabina, herceptina, hexametilamina, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecán, lomustina, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, novembiehina,oxaliplatino, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, fenesterina, plicamicina, prednimustina, procarbazina, rituximab, esteroides, estreptozocina, STI-571, estreptozocina, tamoxifeno, temozolomida, tenipósido, tetrazina, tioguanina, tiotepa, tomudex, topotecán, treosulfán, trimetrexato, trofosfamida, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, VP-16 y Xeloda. Agentes alquilantes, tales como tiotepa y sulfonatos de alquilo, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; nitroureas, tales como canustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibióticos, tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromoinicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirubicina, esorubicina, idambicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas peplomicina potfiromicina puromicina quelamicina rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina y zorubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina y trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina y tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina y 5-FU; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, rnepitiostano y testolactona; antiadrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano y trilostano; reabastecedores de ácido fólico, tales como ácido frolínico, aceglatona, glucósido aldofosfamida, ácido aminolevulínico, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfomitina, acetato de eliptinio, etoglúcido, nitrato de galio, hidroxiurea, lentinano, lonidamina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidamol, nitracrina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, ácido podofilínico, 2-etilhidrazida, procarbazina, ^pS^k.RTM, razoxano, sizofrano, espirogermanio, ácido tenuazónico, triazicuona, 2,2',2"-triclorotrietilamina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromán, gacitosina, arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, taxoides, p. ej., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia), gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, metotrexato, análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino, vinblastina, platino, etopósido (VP-16), ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, navelbina, novantrona, tenipósido, daunomicina, aminopterina, Xeloda, ibandronato, CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico, esperamicinas, capecitabina y sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables. Se incluyen, además, agentes antihormonales que actúan regulando o inhibiendo la acción hormonal sobre los tumores, tales como los antiestrógenos, incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, onapristona y toremifeno (Fareston) y antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprólido y goserelina, y sales, ácido o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables.

El conjugado de CendR puede comprender, además, un agente detectable. Dicho agente detectable puede ser la composición de carga del conjugado de CendR, puede comprender una parte de la composición de carga del conjugado de CendR, o puede ser un componente del conjugado de CendR separado de la molécula o fracción. Una diversidad de agentes detectables resulta útil en los métodos dados a conocer. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "agente detectable" se refiere a cualquier molécula que pueda detectarse. Entre los agentes detectables útiles se incluyen fracciones que pueden administrarse in vivo y posteriormente detectarse. Entre los agentes detectables útiles en los conjugados y métodos de captación de imágenes dados a conocer se incluyen, aunque sin limitación, marcajes radioactivos y moléculas fluorescentes. El agente detectable puede ser, por ejemplo, cualquier fracción que facilite la detección, directa o indirectamente, preferentemente mediante una técnica de visualización no invasiva y/o in vivo. Por ejemplo, un agente detectable puede detectarse mediante cualquier técnica de captación de imagen conocida, incluyendo, por ejemplo, una técnica radiológica. Entre los agentes detectables pueden incluirse, por ejemplo, un agente de contraste, p. ej., en el que el agente de contraste es iónico o no iónico. En algunas realizaciones, por ejemplo, el agente detectable comprende un compuesto de tántalo y/o un compuesto de bario, p. ej., sulfato de bario. En algunas realizaciones, el agente detectable comprende yodo, tal como yodo radioactivo. En algunas realizaciones, por ejemplo, el agente detectable comprende un ácido yódico orgánico, tal como ácido yodocarboxílico, triyodofenol, yodoformo y/o tetrayodoetileno. En algunas realizaciones, el agente detectable comprende un agente detectable no radioactivo, p. ej., un isótopo no radioactivo. Por ejemplo, puede utilizarse Gd como agente detectable no radioactivo en determinadas realizaciones. Entre los agentes detectables pueden incluirse, además, isótopos radioactivos, enzimas, fluoróforos y puntos cuánticos (Qdot®). Por ejemplo, la fracción de detección puede ser un enzima, biotina, metal o etiqueta epitópica. Otros marcadores detectables conocidos o recién descubiertos se encuentran contemplados para el uso con los conjugados proporcionados.

Los conjugados de CendR dados a conocer pueden administrarse in vivo en un portador farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéuticamente aceptable" pretende referirse a un material que no resulta deseable biológicamente o de otro modo, es decir, el material puede administrarse en un sujeto, junto con el ácido nucleico o vector, sin causar ningún efecto biológico no deseable o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los demás componentes de la composición farmacéutica en la que se encuentran contenidos. El portador se selecciona naturalmente para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el/la sujeto, tal como sería bien conocido por el experto en la materia. Los materiales pueden encontrarse en solución, en suspensión (por ejemplo, incorporarlos en micropartículas, liposomas o células).

Los conjugados de CendR pueden utilizarse terapéuticamente en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19a ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Normalmente se utiliza una cantidad adecuada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para convertirse en formulación isotónica. Entre los ejemplos del portador farmacéuticamente aceptable se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferentemente de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8, y más preferentemente de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 7,5. Entre los portadores adicionales se incluyen preparaciones de liberación sostenida, tales como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, en los que las matrices se encuentran en la forma de artículos conformados, p. ej., películas, liposomas o micropartículas. Resultará evidente para el/la experto/a en la materia que determinados portadores pueden resultar más preferentes dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y la concentración de composición que se administra.

Una preparación farmacéutica puede incluir, como ingrediente activo, una composición que comprende por lo menos un epítopo de una proteína o polipéptido diana, en donde por lo menos un epítopo es capaz de inducir anticuerpos capaces de unirse a la región de tallo de la hemaglutinina. Alternativamente, una composición farmacéutica puede incluir, como ingrediente activo, una composición que comprende por lo menos una parte inmunitaria de un anticuerpo que es para la unión a por lo menos un epítopo de la región de tallo de la hemaglutinina.

La preparación puede administrarse en el/la sujeto u organismo per se, o en una composición farmacéutica en la que se mezcla con portadores o excipientes adecuados.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos indicados en la presente memoria con otros componentes químicos, tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto en un/a sujeto u organismo.

En la presente memoria, la expresión "ingrediente activo" se refiere a la preparación responsable del efecto biológico. Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable", que pueden utilizarse intercambiablemente para referirse a un portador o un diluyente que no causa una irritación significativa en un sujeto u organismo y que no anula la actividad biológica y propiedades del compuesto administrado. Se incluye un adyuvante bajo dichas expresiones.

En la presente memoria, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a la composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo. Entre los ejemplos, aunque sin limitación, de excipientes se incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Las técnicas para la formulación y administración de fármacos pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición.

Entre las vías de administración adecuadas pueden incluirse, por ejemplo, la administración oral, rectal, transmucosal, especialmente transnasal, intestinal o parenteral, incluyendo las inyecciones intramuscular, subcutánea o intramedular, así como la inyección intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular. Alternativamente, puede administrarse una preparación de una manera local en lugar de sistémica. Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos de la técnica, p. ej., mediante procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de grageas, levigaicón, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Las composiciones farmacéuticas para la utilización en los métodos dados a conocer de esta manera pueden formularse de manera convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y agentes auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en las preparaciones, que pueden utilizarse farmacéuticamente. La formulación adecuada es dependiente de la vía de administración seleccionada.

Para la inyección, los ingredientes activos pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para la administración transmucosal, en la formulación se utilizan penetrantes adecuados a la barrera que debe permearse. Dichos penetrantes son generalmente conocidos de la técnica.

Para la administración oral, los compuestos pueden formularse fácilmente mediante la combinación de los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos de la técnica. Dichos portadores permiten que los compuestos se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lodos, suspensiones y similares, para la ingestión oral por un paciente. Pueden prepararse preparaciones farmacológicas para el uso mediante la utilización de un excipiente sólido, opcionalmente triturando la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos tras añadir agentes auxiliares adecuados si se desea, obteniendo comprimidos o núcleos de gragea. Los excipientes adecuados son, en particular, agentes de carga, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sucrosa, manitl o sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa sódica y/o polímeros fisiológicamente aceptables, tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona entrecruzada, agar o ácido algínico, o una sal del mismo, tal como alginato sódico.

Se proporcionan núcleos de gragea con recubrimientos adecuados. Con este propósito, pueden utilizarse soluciones de azúcar concentradas que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Pueden añadirse tintes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de gragea para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.

Entre las composiciones farmacéuticas, que pueden utilizarse oralmente, se incluyen cápsulas de ajuste a presión realizadas en gelatina, así como cápsulas selladas blandas realizadas en gelatina y un plastificador, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener los ingredientes activos en mezcla con agente de carga, tal como lactosa; ligantes, tal como almidones; lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En cápsulas blandas, los ingredientes activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para la administración oral deben encontrarse en dosis adecuadas para la vía de administración seleccionada.

Para la administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

Para la administración mediante inhalación nasal, los ingredientes activos para la utilización en los métodos dados a conocer pueden administrarse convenientemente en la forma de una presentación pulverizada de spray desde un paquete presurizado o un nebulizador con la utilización de un propelente adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de administración puede determinarse mediante la provisión de una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina, para la utilización en un dispensador pueden formularse con un contenido de una mezcla de polvos del compuesto y una base de polvos adecuada, tal como lactosa o almidón.

Las preparaciones indicadas en la presente memoria pueden formularse para la administración parenteral, p. ej., mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de administración unitaria, p. ej., en ampollas o en envases multidosis, opcionalmente con un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

Entre las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral se incluyen soluciones acuosas de las preparaciones activas en forma soluble en agua. Además, pueden prepararse suspensiones de los ingredientes activos en forma de suspensiones de inyección aceitosas o acuosas apropiadas. Entre los solventes o vehículos lipofílicos adecuados se incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo o ésteres sintéticos de ácido graso, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener, además, estabilizadores adecuados o agentes que incrementen la solubilidad de los ingredientes activos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Alternativamente, el ingrediente activo puede encontrarse en forma de polvos para la reconstitución con un vehículo adecuado, p. ej., solución acuosa libre de pirógenos estéril, antes de la utilización.

Las preparaciones también pueden formularse en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, p. ej., que contengan bases supositorias convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Entre las composiciones farmacéuticas para el uso en los métodos dados a conocer se incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el propósito deseado. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad de ingredientes activos eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de enfermedad o para prolongar la superficie del sujeto bajo tratamiento.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz se encuentra perfectamente comprendida dentro de los conocimientos del experto en la materia, especialmente a la luz de la exposición detallada proporcionada en la presente memoria.

Para cualquier preparación utilizada en los métodos dados a conocer, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro y de cultivo celular. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir una concentración o título de anticuerpos circulantes deseado. Dicha información puede utilizarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos.

La toxicidad y eficacia terapéutica de los ingredientes activos indicados en la presente memoria pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares in vitro, en cultivos celulares o en animales de experimentación. Los datos obtenidos a partir de dichos ensayos in vitro y de cultivo celular y estudios animales pueden utilizarse para la formulación de un intervalo de dosis para el uso en seres humanos La dosis puede variar dependiendo de la forma de administración utilizada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y las dosis pueden ser seleccionadas por el médico individual en vista del estado del/de la paciente (ver, p. ej., Fingl et al., en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, capítulo 1, página 1. (1975)).

La cantidad e intervalo de dosis pueden ajustarse individualmente para proporcionar plasma de anticuerpos que resulten suficientes para evitar o reducir la entrada vírica (concentración eficaz mínima, CEM). La CEM variará para cada preparación, aunque puede estimarse a partir de datos in vitro. Las dosis necesarias para conseguir la CEM dependerán de las características individuales y la vía de administración. Pueden utilizarse ensayos de unión para determinar las concentraciones plasmáticas.

También pueden determinarse intervalos de dosis mediante la utilización del valor de CEM. Las preparaciones deben administrarse utilizando un régimen que mantenga niveles plasmáticos superiores a CEM durante 10 % a 90 % del tiempo, preferentemente entre 30 % y 90 %, y lo más preferentemente, entre 50 % y 90 %.

Según la gravedad y respuesta de la afección bajo tratamiento, la administración de la dosis puede ser de una vez o en una pluralidad de administraciones, con un curso de tratamiento que dure entre varios días y varias semanas, o hasta conseguir la curación o disminución del estado de enfermedad.

La cantidad de una composición que debe administrarse evidentemente dependerá del sujeto bajo tratamiento, de la gravedad de la enfermedad, del modo de administración, del juicio del/de la médico/a prescritor, etc.

Entre los ácidos grasos (p. ej., lípidos) que pueden conjugarse con los conjugados dados a conocer se incluyen los que permiten la incorporación eficiente del péptido en liposomas. Generalmente, el ácido graso es un lípido polar. De esta manera, el ácido graso puede ser un fosfolípido. Los conjugados proporcionados pueden comprender fosfolípido natural o sintético. Los fosfolípidos pueden seleccionarse de fosfolípidos que contienen ácidos grasos monosustituidos o disustituidos saturados o insaturados, y combinaciones de los mismos. Estos fosfolípidos pueden ser, por ejemplo, dioleoílfosfatidilcolina, dioleoílfosfatidilserina,dioleoílfosfatidiletanolamina, dioleoílfosfatidilglicerol, ácido dioleαlfosfatídico, palmitoíloleoilfosfatidilcolina, palmitoíloleoilfosfatidilserina, palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina, palmitoiloleoilfofatidilglicerol, ácido palmitoiloleoilfosfatídico, palmitelaidoiloleoilfosfatidilcolina, palmitelaidoiloleoilfosfatidilserina, palmitelaidoiloleoilfosfatidiletanolamina, palmitelaidoiloleoilfosfatidilglicerol, ácido palmitelaidoiloleoilfosfatídico, miristoleαloleoilfosfatidilcolina, miristoleoíloleoilfosfatidilserina, miristoleoíloleoilfosfatidiletanoamina, miristoleoíloleoilfosfatidilglicerol, ácido miristoleαloleoilfosfatídico, dilinoleoilfosfatidilcolina, dilinoleoilfosfatidilserina, dilinoleoilfosfatidiletanolamina, dilinoleoilfosfatidilglicerol, ácido dilinoleoilfosfatídico, palmiticlinoleoilfosfatidilcolina, palmiticlinoleoilfosfatidilserina, palmiticlinoleoilfosfatidiletanolamina, palmiticlinoleoilfosfatidilglicerol o ácido palmiticlinoleoilfosfatídico. Dichos fosfolípidos también pueden ser derivados monoacilados de fosfatidilcolina (lisofosfatidilcolina), fosfatidilserina (lisofosfatidilserina), fosfatidiletanolamina (lisofosfatidiletanolamina), fosfatidilglicerol (lisofosfatidilglicerol) y ácido fosfatídico (ácido lisofosfatídico). La cadena monoacilo en dichos derivados lisofosfatidilo pueden ser palmitαlo, oleαlo, palmitoleαlo, linoleαlmiristoílo o miristoleoílo. Los fosfolípidos también pueden ser sintéticos. Los fosfolípidos sintéticos están fácilmente disponibles comercialmente de diversos proveedores, tales como AVANTI Polar Lipidos (Albaster, Ala.), Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.). Dichos compuestos sintéticos pueden ser variados y pueden presentar variaciones en sus cadenas laterales de ácido graso no observadas en fosfolípidos naturales. El ácido graso puede presentar cadenas laterales de ácido graso insaturado con longitudes de cadena de C14, C16, C18 o C₂₀en ^pS, en PC o en ambos. Los fosfolípidos sintéticos pueden presentar dioleoílo (18:1)-PS; palmitαl (16:0)-oleαlo (18:1)-PS, dimiristoílo (14:0)-PS; dipalmitoleαl (16:1)-PC, dipalmitαl (16:0)-PC, dioleoíl (18:1)-PC, palmitoíl (16:0)-oleoílo (18:1)-PC y miristαl (14:0)-oleoílo (18:1)-PC como constituyentes. De esta manera, a título de ejemplo, los conjugados proporcionados pueden comprender palmitoílo 16:0.

La composición de carga puede ser una micropartícula o una nanopartícula, tal como una nanoesfera, nanocubierta, nanogusano, nanocubierta generadora de calor y similar. Tal como se utiliza en la presente memoria, "nanocubierta" es una nanopartícula con una sección nuclear dieléctrica o semiconductora discreta circundada por una o más capas de cubierta conductoras. La patente US n.° 6.530.944 enseña métodos de preparación y utilización de nanocubiertas metálicas. Las nanocubiertas pueden formarse con, por ejemplo, un núcleo de un material dieléctrico o inserta, tal como silicio, recubierto con un material tal como un metal altamente conductor que puede excitarse utilizando radiación, tal como luz del infrarrojo cercano (aproximadamente 800 a 1300 nm). Tras la excitación, las nanocubiertas emiten calor. La hipertermia resultante puede mater la célula o células o tejido circundante. El diámetro combinado de la cubierta y el núcleo de las nanocubiertas está comprendido entre decenas y centenares de nanómetros. La luz del infrarrojo cerano resulta ventajosa por su capacidad de penetrar en los tejidos. También pueden utilizarse otros tipos de radiación, dependiendo de la selección del recubrimiento de las nanopartículas y de las células diana. Entre los ejemplos se incluyen rayos X, campos magnéticos, campos eléctricos y ultrasonidos. También pueden utilizarse las partículas para mejorar la captación de imágenes, especialmente utilizando métodos de captación de imágenes de fotones difusos de infrarrojos. Las moléculas diana pueden ser anticuerpos o fragmentos de los mismos, ligandos de receptores específicos u otras proteínas de unión específica a la superficie de las células que deben dianizarse.

La composición de carga puede unirse covalentemente o asociarse no covalentemente a, por ejemplo, la proteína, péptido, secuencias de aminoácidos o elemento CendR dado a conocer La composición de carga puede unirse, por ejemplo, al extremo aminoterminal de la proteína, péptido, secuencia de aminoácidos o elemento CendR dado a conocer; a un aminoácido interno de la proteína, péptido, secuencia de aminoácidos o elemento CendR dado a conocer; al extremo carboxiterminal de la proteína, péptido, secuencia de aminoácidos o elemento CendR dado a conocer; a la proteína, péptido o secuencia de aminoácidos en el lado N-terminal del elemento CendR; mediante un conector a la proteína, péptido, secuencia de aminoácidos o elemento CendR dado a con una combinación. Los conjugados de CendR dados a conocer pueden comprender, además, un conector que conecta la composición de carga y la proteína, péptido, secuencia de aminoácidos o elemento CendR dado a conocer. La proteína, péptido, secuencia de aminoácidos o elemento CendR dado a conocer también puede conjugarse con una molécula de recubrimiento, tal como albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) (ver Tkachenko et al., (2003) J Am Chem Soc, 125, 4700-4701) que puede utilizarse para recubrir nanopartículas, nanogusanos, nanocubiertas y similares con la proteína, péptido, secuencia de aminoácidos o elemento CendR.

Los entrecruzantes de proteína que pueden utilizarse para entrecruzar la composición de carga con el péptido dado a conocer son conocidos de la técnica y se definen basándose en su utilidad y estructura, y entre ellos se incluyen DSS (disuccinimidilsuberato), DSP (ditiobis(succinimidilpropionato)), DTSSP (3,3'-ditiobis(sulfosuccinimidilpropionato)), SULFO BSOCOES (bis[2-(sulfosuccinimidooxicarboniloxi)etil]sulfona), BSOCOES (bis[2-(succinimdooxicarboniloxi)etil]sulfona), SULFO DST (disulfosuccinimdiltartrato), DST (disuccinimdiltartrato), SULFo EGS (etilén-glicolbis(succinimidilsuccinato)), EGS (etilén-glicolbis(sulfosuccinimidilsuccinato)), DPDPB (1,2-di[3'-(2'-piridilditio)propionamido]butano), BSSS (bis(sulfosuccinimdil)suberato), SMPB (succinimidil-4-(pmaleimidofenil)butirato), SULFO SMPB (sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato), MBS (éster de 3-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida), SULFO MBS (éster de 3-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida), SIAB (N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato), SULFO SIAB (N-sulfosuccinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato), SMCC (succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), SULFO SMCC (sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), NHS LC SPDP (succinimidil-6-[3-(2-piridilditio)propionamido)hexanoato), SULFO NHS Lc SPDP (sulfosuccinimidil-6-[3-(2-piridilditio)propionamido)hexanoato), Sp DP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), NHS BROMOACETato (N-hidroxisuccinimidilbromoacetato), NHS yodoacetato (N-hidroxisuccinimidilyodoacetato), MPBH (hidrocloruro de hidrazida de ácido 4-(N-maleimidofenil)butírico), MCCH (hidrocloruro de hidrazida de ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxílico), MBH (hidrocloruro de hidrazida de ácido m-maleimidobenzoico), SULFO EMCS (N-(epsilón-maleimidocaproiloxi)sulfosuccinimida), EMCS (N-(epsilónmaleimidocaproiloxi)succinimida), PMPI (N-(p-maleimidofenil)isocianato), KMUH (hidrazida de ácido N-(kappamaleimidoundecanoico), LC SMCC (succinimidil-4-(N-maleimidometil)-cyclohexano-1-carboxi(6-amidocaproato)), SULFO GMBS (éster de N-(gamma-maleimidobutiriloxi)sulfosuccinimida), SMPH (succinimidil-6-(betamaleimidopropionamidohexanoato)), SULFO KMUS (éster de N-(kappa-maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida), GMBS (N-(gamma-maleimidobutiriloxi)succinimida), DMP (hidrocloruro de dimetilpimelimidato), DMS (hidrocloruro de dimetilsuberimidato), MHBH (reactivo de Wood) (hidrocloruro de metil-p-hidroxibencimidato, al 98 %), DMA (hidrocloruro de dimetiladipimidato).

Se dan a conocer, aunque no están cubiertas por la invención reivindicada, moléculas de reconocimiento acopladas con un elemento CendR con el fin de transportar selectivamente el elemento CendR a una célula dada, formando de esta manera un conjugado de CendR de reconocimiento. Puede utilizarse una diversidad de moléculas de reconocimiento en las composiciones, conjugados y métodos dados a conocer. Entre dichas moléculas de reconocimiento se incluyen, aunque sin limitación, péptidos dados a conocer en la presente memoria. Los compuestos, composiciones, conjugados y métodos dados a conocer pueden incluir o utilizar las moléculas de reconocimiento dadas a conocer en diversas formas, incluyendo péptidos y peptidomiméticos tales como los dados a conocer. Para facilitar la expresión, en muchos sitios en la presente memoria se recitará el uso o inclusión de péptidos. Se entiende que, en tales casos, se considera que las moléculas de reconocimiento en diversas formas también pueden utilizarse o incluirse de maneras iguales o similares a las utilizadas para los péptidos, y de esta manera, dicho uso e inclusión se encuentran contempladas se dan a conocer específicamente.

La expresión "molécula de reconocimiento" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier molécula que reconozca selectivamente in vivo los tumores u otros tejidos específicos con preferencia al tejido normal. De manera similar, la expresión "péptido de reconocimiento" o "peptidomimético de reconocimiento" se refiere a un péptido que reconoce selectivamente in vivo para regenerar tejido, heridas o tumores con preferencia al tejido normal. Se entiende que una molécula de reconocimiento que reconoce selectivamente in vivo para la regeneración de tejido, heridas o tumores, o que puede mostrar un reconocimiento preferente para la regeneración de tejidos, heridas o tumores.

La expresión "reconoce selectivamente" se refiere a que, in vivo, la molécula de reconocimiento se une a la diana con preferencia a una no diana. Por ejemplo, la molécula de reconocimiento puede unirse a tumores con preferencia a la unión a no tumores. El reconocimiento selectivo de, por ejemplo, células tumorales, generalmente se caracteriza por como mínimo una localización dentro de las células tumorales superior en dos veces a la localización en varios tipos de tejido de células no tumorales. Una molécula de reconocimiento puede caracterizarse por una localización 5 veces, 10 veces, 20 veces o más superior en células cancerosas, con preferencia a la localización en la mayoría o todas las células no cancerosas. De esta manera, se entiende que, en algunos casos, una molécula de reconocimiento reconoce, en parte, uno o más órganos normales además de reconocer los tumores. El reconocimiento selectivo también puede denominarse dianización

La unión en el contexto de una molécula de reconocimiento que reconoce y/o se une a su diana puede referirse a la unión tanto covalente como no covalente, por ejemplo, en donde una molécula de reconocimiento puede ligar, unirse 0, de otro modo, acoplarse con su diana mediante unión covalente y/o no covalente. La unión puede ser de alta afinidad o de baja afinidad, preferentemente es de alta afinidad. Entre los ejemplos de fuerzas de unión que pueden resultar útiles se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, enlaces covalentes, interacciones de dipolo, fuerzas electrostáticas, enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, enlaces iónicos y/o fuerzas de van der Waals. Dicha unión puede producirse además de la unión que ocurre con el elemento CendR.

El término "tratamiento" se refiere a la gestión médica del paciente con la intención de curar, mejorar, estabilizar o prevenir una enfermedad, afección patológica o trastorno. Dicho término incluye el tratamiento activo, es decir, el tratamiento dirigido específicamente a la mejora de una enfermedad, afección patológica o trastorno, e incluye además el tratamiento causal, es decir, el tratamiento dirigido a la eliminación de la causa de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociado. Además, dicho término incluye el tratamiento paliativo, es decir, el tratamiento diseñado para el alivio de los síntomas en lugar de la curación de la enfermedad, afección patológica o trastorno; el tratamiento preventivo, es decir, el tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o totalmente el desarrollo de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociado; y el tratamiento de apoyo, es decir, el tratamiento utilizado para complementar otra terapia específica dirigida a la mejora de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "sujeto" incluye, aunque sin limitación, animales, plantas, bacterias, virus, parásitos y cualquier otro organismo o entidad que posea un ácido nucleico. El sujeto puede ser un vertebrado, más específicamente, un mamífero (p. ej., un ser humano, caballo, cerdo, conejo, perro, oveja, cabra, primate no humano, vaca, gato, cobaya o roedor), un pez, un ave, un reptil o un anfibio. El sujeto puede ser un invertebrado, más específicamente un artrópodo (p. ej., insectos y crustáceos). El término no denota una edad o sexo particular. De esta manera, se pretende que estén cubiertos sujetos adultos y recién nacidos, así como fetos, sean masculinos o femeninos. El término "paciente" se refiere a un sujeto que sufre una enfermedad o trastorno. El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios. En el contexto de la endometriosis y las células de endometriosis, se entiende que el/la sujeto es un/a sujeto que presenta o puede presentar endometriosis y/o células de endometriosis.

Ejemplos

El ejemplo a continuación se proporciona con el fin de proporcionar al experto ordinario en la materia una exposición y descripción completas de cómo los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos dados a conocer en la presente memoria se preparan y se evalúan, y pretenden ser meramente ejemplares y no pretenden ser limitativos de la exposición. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números (p. ej., cantidades, temperaturas, etc.), aunque debe tenerse en cuenta que hay algunos errores y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso; las temperaturas son en °C o es la temperatura ambiente, y la presión es igual o es próxima a la atmosférica. Los ejemplos que no están cubiertos por las reivindicaciones se proporcionan únicamente como referencia.

A. Ejemplo 1: transporte de nanopartículas, fármacos y otras sustancias hacia el interior y exterior de las células

Se ha utilizado la exposición fágica para aislar varios péptidos altamente selectivos para la dianización vascular in vivo. El transporte de macromoléculuas y nanopartículas coloidales a las células generalmente se consigue mediante dianización de receptores y/o mediante la utilización de péptidos penetrantes en células.

1. Resultados

Se utilizó un panel de bibliotecas de péptidos expuestos en bacteriófago T7 para identificar los motivos de secuencia que conducen a la incorporación celular de las partículas fágicas por células de carcinoma prostático PPC1. Las partículas de fago T7 están compuestas de nucleocápside icosahédrica y fibras de cola; los péptidos expuestos se expresan en forma de fusiones C-terminales con la proteína de cubierta mayor GP10, habitualmente a una densidad de entre 200 y 415 péptidos/fago (fig. 1A). Para el cribado se utilizaron bibliotecas peptídicas convencionales de T7 (CX7C cíclica aleatoria y X7 lineal; X es un residuo aleatorio). También se diseñaron nuevas bibliotecas que incluían un motivo RXXR, que se han observado en otras moléculas, tales como el péptido iRGD (bibliotecas RXXRXXX y RXXR(NP)PRXXX). Tras 3 rondas de exposición, algunas bibliotecas seleccionadas se unieron a las suspensiones celulares 500 a 2500 veces más que los fagos que exponían un péptido de control de 7 glicinas (G7). La secuenciación de clones fágicos aleatorios tras tres rondas de selección demostró que, con independencia de la configuración inicial de la biblioteca, todas las bibliotecas convergían en la exposición de residuo arginina C-terminal (fig. 1C). Los fagos que exponían arginina C-terminal eran detectables en las células tras la incubación a 37 °C y el lavado ácido, indicando la internalización de los fagos en las células. La inmunotinción y captación de imágenes confocales de las células incubadas con clones fágicos individuales confirmaron la localización intracelular de las partículas fágicas (fig. 2B).

Para entender el papel de la arginina C-terminal en la internalización de los fagos, se prepararon dos juegos de fagos, que exponían: (1) GGGGGGR (SEC ID n° 1) y otras variantes del péptido de control G7 y (2) variantes de uno de los robustos péptidos de intemalización, RPARPAR (SEC ID n.° 2). Se estudió la unión de dichos fagos a las células PPC1 (fig. 2A) y a varias otras líneas de células tumorales humanas in vitro y en suspensiones de células preparadas a partir de órganos de ratón normal ex vivo. Estos experimentos demostraron que la arginina C-terminal resulta suficiente para inducir la unión fágica a una amplia diversidad de células. El fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) mostró una unión más fuerte que el fago GGGGGGR (SEC ID n.° 1). Concordando con la unión celular universal, los clones fágicos inyectados por vía intravenosa que exponían arginina C-terminal mostraron un enriquecimiento en los lechos vasculares con los que se encontraron inicialmente, el corazón y los pulmones.

1. La exposición de la arginina C-terminal conduce a la intemalización de las nanopartículas sintéticas.

A continuación, se estudió la aplicabilidad de la regla de extremo C a las nanopartículas sintéticas. El recubrimiento del péptido RPARPAR (SEC iD n.° 2) a puntos cuánticos (Q-dots™, Invitrogen) indujo una unión e internalización robustas de los puntos cuánticos por parte de las células PPC1 en cultivo (fig. 3, panel a). El bloqueo del extremo C-terminal del péptido RPARPAR (SEC ID n.° 2) con amida anuló la unión e internalización de los puntos cuánticos (fig.

3, panel b). Lo anterior concuerda con la noción de que la internalización de las partículas utiliza tanto los grupos guanto como los grupos carboxilo de la arginina terminal. La internalización de los puntos cuánticos con RPARPAR (SEC ID n.° 2) también resultó preinhibida por la preincubación de las células con un exceso de fago de exposición de RPARPAR (SEC ID n.° 2), lo que sugiere un proceso mediado por receptor saturable.

Los experimentos indicados en la presente memoria muestran que la exposición C-terminal de un residuo de arginina representa una señal simple (señal CendR) que induce una robusta incorporación de fagos (más generalmente, nanopartículas) en las células.

ii. Activación de composiciones de internalización latentes mediante escisión con proteasa.

Los datos muestran que CendR define un elemento simple dependiente de la posición para la incorporación de diversas composiciones. Una consecuencia interesante de la regla es que puede utilizarse para diseñar composiciones latentes, tales como nanopartículas latentes, que pueden activarse para producir nanopartículas internalizantes mediante escisión proteolítica. Muchas serina y cisteína proteasas exponen elementos C-terminales (tales como lisina, arginina o lisina-glicina) y resultan potencialmente adecuados para dicha activación por escisión. Además, las proteasas extracelulares con frecuencia se expresan de una manera altamente regulada que puede ser específica a un tipo celular, tejido o enfermedad. Lo anterior permite la activación proteolítica dirigida de incorporación de nanopartículas. Se utilizó tripsina, una serina proteasa de amplio espectro que escinde exclusivamente en el lado C-terminal de los residuos de arginina y lisina, para experimentos de prueba de concepto de la idea de conmutador de proteasa. El fago que expone el péptido RPARPAR (SEC ID n.° 3) mostraba poca unión celular (2,8 veces más que el fago que exponía G7) al incubarlo con células PPC1 sin tratamiento de tripsina, mientras que la incubación del fago con tripsina incrementó la unión en más de 100 veces (fig. 4).

iii. Reconocimiento selectivo de tejidos de las composiciones y regla de extremo C.

Varios péptidos de reconocimiento internalizantes identificados previamente contenían una arginina interna o C-terminal (Laakkonen et al., 2002a; Hoffman et al., 2003; Zhang et al., 2005; Jarvinen y Ruoslahti, 2007). CendR puede contribuir a la internalización celular de dichos péptidos de reconocimiento. Recientemente, se ha identificado una familia de péptidos de reconocimiento que poseen una fuerte selectividad in vivo en varios modelos tumorales. Uno de dichos péptidos, CRGDKGPDC (iRGD), SEC ID n.° 4 contiene el motivo RGD de unión a integrina, aunque es poco habitual entre los péptidos RGD en el aspecto de que resulta más fuertemente internalizado en las células que ningún otro péptido RGD, incluyendo el péptido RGD-4C utilizado previamente para la dianización tumoral (Arap et al., 1998). La figura 5 muestra un ejemplo del fuerte reconocimiento tumoral por el péptido iRGD.

Aparentemente la clave de la fuerte internalización es la secuencia RGDK (la K puede sustituirse por una R, tal como se muestra en la figura 8), que convierte al péptido en susceptible a una proteasa expresada en los tumores. La selectividad y fuerte internalización celular del péptido iRGD y partículas portadoras de iRGD puede aparecer como consecuencia de la combinación de: (1) la interacción con integrinas av sobre el endotelio angiogénico y las células tumorales, que resulta en una elevada concentración del péptido en el tumor, (2) la escisión por una o más proteasas extracelulares de origen tumoral todavía por definir que expone una arginina o lisina C-terminal (la presente en la secuencia RGD), (3) la consiguiente activación de la ruta de CendR que conduce a una internalización de las partículas que resulta más eficaz que la ruta de internalización utilizada por las integrinas. Los resultados que apoyan lo anterior muestran que la internalización del fago iRGD por parte de las células, del fago que expone el péptido iRGD, resulta reducida por la preincubación con fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) inactivado por UV (y no resulta afectado por el fago G7 de control). La figura 6 ilustra el concepto.

2. Diseño y métodos.

i. Identificación de uno o más receptores de superficie celular y proteínas y no proteínas intracelulares, y elucidación de la ruta de internalización para las nanopartículas recubiertas con péptidos que presentan arginina C-terminal.

La regla de extremo C es responsable de la unión e intemalización de diversas composiciones en múltiples tipos celulares. Estos procesos pueden inhibirse mediante la preincubación de las células con partículas no marcadas que exponen el elemento CendR, concordando con la dependencia de la incorporación respecto al receptor o receptores de superficie celular y las proteínas y no proteínas intracelulares (tales como ácidos nucleicos, lípidos y glucosaminoglicanos). La identificación y comprensión detallada de la regulación del receptor de CendR es un requisito previo importante para la aplicación racional de la ruta para el transporte. Puede identificarse y caracterizarse el receptor o receptores internalizantes para los péptidos CendR. El receptor/proteína intracelular/no proteína intracelular se enriquece mediante la precipitación de las moléculas que interactúan con los péptidos CendR. Las proteínas que copurifican con los péptidos CendR se fraccionan y se someten a análisis de espectroscopía de masas con el fin de identificar el receptor o receptores putativos y otras moléculas.

Se lleva a cabo una serie de experimentos para validar los candidatos como proteínas receptoras verdaderas. La interacción se confirma mediante el ensayo del receptor putativo purificado para la unión del fago CendR y la colocalización del fago CendR con el receptor en las células en cultivo. Para el análisis funcional, se modulan los niveles de expresión del receptor o receptores de CendR candidatos y se correlacionan con la incorproación de fago y puntos cuánticos recubiertos con péptido CendR.

Los estudios de colocalización con un panel de anticuerpos contra marcadores de compartimientos endocitóticos se utilizan para determinar las rutas de internalización y a continuación se somete a ensayo la sensibilidad de la incorporación de nanopartículas con CendR frente a inhibidores de las diversas rutas.

Identificación y validación de receptores. Con el fin de identificar el receptor de CendR, se llevan a cabo ensayos de precipitación de péptidos con extractos preparados a partir de la línea celular de carcinoma prostático PPC1. Se extrajeron 10x106 células PPC1 con un tampón que contenía glucopiranósido (sigma), Ca2+ y Mg2+ y un cóctel de inhibidores de proteasa para células de mamífero (Roche Biochemicals). El extracto se incuba con perlas de agarosa (Roche Biochemicals) que se han acoplado con RPARPAR (SEC ID n.° 2) y péptidos de control (RPARPAR con extremo C-terminal bloqueado y G7). Todos los péptidos fueron sintetizados por un/a especialista químico en péptidos asociado al laboratorio de los presentes inventores. Los péptidos se purificaron mediante HPLC hasta una pureza superior a 95 % y se confirmó su estructura mediante espectrometría de masas. Tras la incubación durante la noche, las personas se lavaron a fondo y se separaron en un gel de polacrilamida al 4-20 %. Tras la electroforesis, el gel se tiñó con plata y se recortaron las bandas de proteína presentes específicamente en muestras de precipitación de RPARPAR y se enviaron para el análisis de m A l DI-TOF.

También puede utilizarse una variación del ensayo de precipitación que incluye la etapa adicional de entrecruzamiento reversible del péptido al receptor mediante la utilización de ditiobis(succinimilpropionato) (DSP, reactivo de Lomant). Es una molécula homobifuncional y escindible con tiol que permea en la célula y que ha sido diseñada para unir los grupos de amino primario entre sí en tampones acuosos en un intervalo de pH de entre 6,5 y 8,5. El puente -S-S-resultante se cortó con beta-mercaptoetanol en tampón de carga de gel. Se preparó un juego dedicado de péptidos que presentaba cisteína aminoterminal adicional para la precipitación estabilizada por entrecruzamiento utilizando DSP.

El procedimiento puede modificarse para utilizar la expresión del receptor en la superficie celular. En una variación, se preincuban células vivas intactas con las perlas de péptido-agarosa, se elimina el exceso de perlas mediante lavado y las células se solubilizan y se lavan nuevamente las perlas. Lo anterior limita la unión a las proteínas de la superficie celular. Alternativamente, las células pueden biotinilarse en la superficie (Altin y Pagler, 1995) y el aislamiento inicial puede llevarse a cabo con péptido-agarosa y después las proteínas que contienen biotina pueden aislarse adicionalmente en estreptavidina-agarosa, antes de la electroforesis en gel.

También puede utilizarse una estrategia de clonación para el aislamiento de CendR. Las líneas celulares cultivadas rutinariamente (que se estima que son aproximadamente 30 líneas celulares diferentes) pueden someterse a ensayo para la internalización del péptido CendR. En el caso de que se identifique una línea celular no internalizante, se utilizan dichas células para transfectar una biblioteca de ADNc de células PPC1 y cribar para los transfectantes que han adquirido la capacidad de internalizar los puntos cuánticos recubiertos con péptido CendR. Las células positivas para internalización se identifican y aíslan mediante FACS. En el caso de que no se identifique ninguna línea celular negativa para CendR, dicha línea se genera mediante tratamiento de las células PCC1 con un péptido proapoptótico de acción intracelular. La primera elección es el péptido proapoptótico derivado de dominio BH3, que es conocido que suprime la actividad de las moléculas prosupervivencia Bcl-2, Bcl-x(L), Bcl-w, Mcl-1 y A1 (Dharap y Minko, 2003). Se seleccionan las células supervivientes hasta obtener una línea celular resistente al tratamiento. A continuación, dicha línea celular se somete a ensayo para la falta de internalización de CendR-punto cuántico. En el caso de que el defecto no esté en la etapa de CendR, se utiliza un tratamiento alternativo con dos compuestos proapoptóticos de acción independiente. El péptido antibacteriano D(KLAKLAK)₂(SEC ID n.° 5) utilizado anteriormente para la dianización tumoral (p. ej.., Arap et al., 2002) se utiliza como el segundo compuesto en el cribado alternativo.

Los receptores candidatos identificados mediante los métodos anteriores se validaron utilizando ensayos bioquímicos y celulares. La proteína receptora putativa purificada que estaba unida a los pocillos de plástico y que ligaba el fago de exposición de CendR (RPARPAR, SEC ID n.° 2) y los péptidos de control (RPARPARA (SEC ID n.° 3) y G7) se analizaron en formato de inmunoensayo. En el caso de que se confirmase la interacción, se determinó la evaluación del efecto de modulación del receptor sobre la incorporación del fago de CendR. Se formó una sublínea de la línea celular de carcinoma prostético PPC1 con una expresión regulada negativamente del receptor mediante la utilización de transfección estable con el vector pSilencer 2.0-U6 (Ambion) que controla la expresión constitutiva de ARNip (PPC1/R-). En el caso de que un receptor de CendR verdadero esté regulado negativamente, se observa una internalización suprimida del fago con CendR. Como control de la especificidad del efecto del ARNip, se generaron constructos de expresión insensibles a ARNip con un uso de codones alternativo. El rescate de CendR unido a las células PPC1/R: mediante la transfección de estos vectores de expresión se puede confirmar que el efecto de la inactivación de ARNip es específico del receptor y que no se debe a la participación de otros genes. La participación del receptor o receptores de CendR identificados en la internalización de algunos de los bien conocidos péptidos penetrantes en células también se sometió a ensayo (Tat, penetratina, pVec) con el fin de determinar la generalidad del sistema de CendR.

Elucidación de la ruta de internalización. Se utilizó la microscopía confocal para estudiar la localización de las nanopartículas de CendR internalizadas y un panel de marcadores de compartimiento subcelular. Las células PPC1 se incubaron con fagos y puntos cuánticos (Qdot™ 605 ITK-SA, Invitrogen) que exponían el péptido RPARPAR (SEC ID n.° 2) para diversos periodos de tiempo (10 min a 3 h) y se tiñeron las células con anticuerpos contra los marcadores para los endosomas (pAb anti-EEA1 y pAb anti-M6pR; Abcam); lisosomea (pAb anti-LAMP-1, caveolina (pAb anticaveolina 1; Abcam) y clatrina (mAb anticlatrina; Abcam). Las células se tiñeron doblemente para los marcadores de las diversas rutas de internalización y para el bacteriófago T7. IgG no inmune sirvió de control. Para el análisis funcional, se sometió a ensayo el efecto de los inhibidores específicos de ruta de internalización sobre la incorporación de las partículas de CendR y de control. Se detectaron puntos cuánticos mediante microscopía de fluorescencia. Los inhibidores utilizados fueron: baja temperatura (4 °C) como inhibidor general de la ruta endosómica; filipina, citocalasina D y nistatina (Sigma-Aldrich) para la incorporación mediada por caveolina, clorpromazina (Sigma-Aldrich) para la endocitosis dependiente de clatrina, amilorida (Sigma-Aldrich) para la macropinocitosis y cloroquina (Sigma-Aldrich) para el escape lisosómico.

La actividad de ARNip es una medida fiable y relevante de transporte citoplasmético. Se sintetizó un ARNip para EGFP, acoplado con el péptido CendR RPARPAR (SEC ID n.° 2) y se sometió a ensayo su efecto sobre las células PPC1 que expresaban tanto EGFP como DsRed. El control era ARNip normal. Las células tratadas se sometieron a ensayo para la expresión de EGFP y DsRed mediante fluorescencia e inmunotransferencia. El ARNip se unión a la superficie de las nanopartículas, construidas tal como se indica posteriormente.

Por lo tanto, se identifica el receptor o receptores que median en la incorporación celular de los péptidos CendR. También se identificó la ruta de endocitosis particular utilizada por dichos péptidos también y se comprobó si se había conseguido el transporte citoplasmético.

ii. Aμllicación de la exposición proteolítica de la arginina C-terminal para induucir la unión/intemaNzación de composiciones latentes in vivo.

El requisito para la exposición C-terminal del elemento CendR permite construir nanopartículas latentes (no internalizantes) que se activan mediante escisión proteolítica. El tratamiento de tripsina in vitro convierte un péptido CendR latente (RPARPARA, SEC ID n.° 3) en un potente péptido inductor de la internalización. En la presente memoria, se explora la utilidad de la internalización activada proteolíticamente de las composiciones para el transporte hasta el tumor.

La maquinaria de proteolisis extracelular es un sistema complejo de proteasas con patrones variables de expresión, especificidad y actividad, y en el que cada enzima esté regulada por receptores, correceptores e inhibidores. En un adulto sano, la proteolisis extracelular esté suprimida. Un desplazamiento hacia la proteolisis incrementada tiene lugar en afecciones patológicas que estén asociadas al remodelado tisular y la angiogénesis (p. ej., la invasión y crecimiento tumorales, las enfermedades neurodegenerativas, vasculares e inflamatorias). Muchos estudios han establecido un vínculo entre la tumorigénesis y la activación del sistema de serina proteasa extracelular de la plasmina y los activadores de plasminógeno. De los dos activadores del plasminógeno principales, el activador de tipo uroquinasa (uPA) y el activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA), uPA se considera que es més importante para la proteolisis pericelular y la invasión por las células tumorales. uPA se secreta a partir de las células en forma de pro-uPA de cadena sencilla proteolíticamente inactivo, que se convierte en el espacio pericelular en uPA de dos cadenas activo. En los tumores, el uPA activo esté presente en la superficie de las células tumorales invasivas, macrófagos y células endoteliales angiogénicas. La actividad de uPA esté regulada con precisión por un uego de moléculas funcionalmente relacionadas: receptor de superficie celular anclado por GPI de alta afinidad: uPAR, por sus siglas en inglés (Blasi y Carmeliet, 2002), correceptor - proteína relacionada con receptor de LDL/receptor de macroglobulina a2 (Conese et al., 1995), inhibidores de serpina - inhibidores de activador del plasminógeno de tipo 1-3 (Rijken, 1995). Dicho sistema actúa confinando la actividad de uPA al espacio pericelular inmediato. La asociación de la actividad de uPA con la tumorigénesis y neovascularización, y su fuerte selectividad de sustrato, lo convierte en un candidato atractivo para la dianización activada por proteasa in vivo. En efecto, la activación mediada por uPA de las toxinas bcterianas se ha aplicado con éxito en la terapia tumoral experimental (Liu et al 2001 Abi-Habib et al 2004) El uPA prefiere la arginina como residuo P1 y puede ser una proteasa adecuada para catalizar la exposición C-terminal de un elemento CendR enmascarado. Se forma fago T7 que expone un elemento CendR, seguido de un sitio de escisión de uPA de consenso y su internalización se estudia mediante células expresantes de uPA y a partir de la sensibilidad a la internalización a la inhibición farmacológica de la actividad de uPA. Entre los controles se incluyen fagos que exponen un péptido con un motivo de sustrato de uPA alternativo que se espera que conduzca a la exposición de la lisina C-terminal tras la escisión; este fago no debe ser internalizado. Dos otras proteasas: la furina y la trombina, las dos escinden proteínas y péptidos en el lado C-terminal de un residuo básico, potencialmente exponiendo un residuo C-terminal de arginina, se sometieron a ensayo para su capacidad de inducir la internalización. Una vez se ha demostrado que la internalización del fago uPA-C₆ndR depende de la actividad de uPA, se estudió el reconocimiento in vivo en ratones portadores de tumores xenoinjertados expresantes de uPA y en tejido placentario de ratones gestantes (la morfogénesis placentaria es un proceso modelo bien conocido de inducción fisiológica con uPA). También puede utilizarse la furina o la trombina para los estudios in vivo.

iii. Construcción de fago CendR sensible a uPA y estudios de dianización in vitro.

Se expuso un panel de fagos que exponían péptidos CendR enmascarados C-terminalmente y que se preveía que se verían desenmascarados por la escisión con uroquinasa, furina o trombina (Tabla 1). Los motivos sensibles a uPA que se utilizan se han utilizado con éxito para construir variantes de la toxina del ántrax sensibles a uPA (Liu et al., 2001). Para los motivos 1 a 4 en la Tabla 1, la escisión del fago de sustrato por la proteasa indicada se prevé que exponga el elemento CendR, conduciendo a la unión e internalización del fago. En contraste, la escisión del motivo 5 por uPA puede exponer una lisina C-terminal y no inducir la internalización. Además del fago de sustrato, se construyó un fago de control que mimetizaba el estado postescisión (Tabla 1, columna derecha). La furina es ubicua en las células de mamífero, con localización subcelular en la red trans-Golgi, los endosomas y la membrana plasmática; en los experimentos se esperaba que la ruta de CendR para los fagos sensibles a furina (fago 1 en la Tabla 1) se activase universalmente y que el fago sirviese de control positivo. La trombina no se encuentra presente en las células en cultivo y adicionalmente se utilizó trombina exógena para inducir la internalización de fagos que contenían un péptido escindible por trombina en los cultivos celulares (fago 2 en la Tabla 1). En tejidos tumorales, las células de cáncer normalmente expresan uPAR, mientras que las células estromales producen pro-uPA. Solo se conocen unas pocas líneas celulares que produzcan tanto pro-uPA como uPAR. Un ejemplo es la línea celular de carcinoma pulmonar de Lewis LL3, que produce ambas proteínas. Se estudió la internalización in vitro del panel de fagos de sustrato en las células LL3. Se coincubaron aproximadamente 106 células LL3 con 5x108 partículas fágicas durante 2 h a 37 °C; tras lavados extensivos con DMEM que contenía BSA al 1 %, se rescató y cuantificó el fago ligado. Como control, se inhibió la actividad de uPA mediante la incubación de las células con el inhibidor peptídico específico: upain-1 (CSWRGLENHRMC (SEC ID n.° 6); 100 |^j M; Hansen et al., 2005), o con hidrocloruro de amilorida 1 mM (un inhibidor competitivo menos específico de uPA). Dichos experimentos in vitro pueden demostrar la viabilidad de la activación mediada por uPA de las nanopartículas con CendR.

iv. Reconocimiento in vivo del fago CendR sensible a proteasa.

Se estudió el reconocimiento in vivo del fago CendR sensible a uPA mediante la utilización de dos dianas: (1) tumores implantados (modelo de LL3 subcutáneo y modelo de xenoinjerto ortotópico de carcinoma prostático PC₃) y (2) placenta de ratón post-mitad de gestación (días 10 a 14 postcoito). Es conocido que los tumores LL3 y PC₃presentan un sistema de uPA altamente activado. En la placenta, uPA se expresa tanto en células trofoblásticas como en células endoteliales deciduales. La placenta presenta varias características que facilitan la dianización: la vasculatura es normal y la presión intersticial elevada y el efecto de EPR, que son habituales en los tumors, están ausentes. Las nanopartículas (incluyendo los bacteriófagos) son rápidamente eliminados del torrente sanguíneo por el sistema reticuloendotelial (el hígado). En el caso de que se requirise una semivida prolongada del fago para ver el efecto de proteolisis, se utilizó un fago T7 mutante que evitase el hígado. Las mutaciones se encuentran en la proteína de fibra de la cola y provocan que el fago sea irreconocible por el hígado, c una semivida en sangre consecuentemente ampliada. Se ha construido y sometido a ensayo dicho fago (Sokoloff et al., 2003). Se inyectaron por vía intravenosa en ratones fagos CendR sensibles a uPA y fagos de control (G7) (109 a 1011 ufp) y tras diversos periodos de circulación (10 minutos a 2 horas), los animales se perfundieron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) y se recogieron muestras de tejido. Se homogeneizaron los tejidos, se lavaron con DMEM que contenía BSA al 1 % y se evaluaron las cantidades de fagos en órganos diana y de control (normalmente cerebro, pulmón, corazón, bazo, riñón y músculo esquelético) mediante titulación de los fagos vivos y mediante evaluación por q-PCR del número de copia del ADN fágico. Además, se utilizó la tinción con inmunoperoxidasa utilizando anticuerpo policlonal de conejo anti-T7 para determinar la distribución en los tejidos del fago. Varios péptidos que reconocen in vivo componentes de la matriz extracelular tumoral, vasos sanguíneos y linfáticos y células tumorales (Laakkonen et al., 2002a; Hoffmann et al., 2003; Brown y Ruoslahti, 2004; Pilch et al. 2006) han sido caracterizados anteriormente. El reconocimiento del fago CendR sensible a uPA se comparó cualitativa y cuantitativamente con fagos que exponían dichos péptidos de reconocimiento previamente identificados.

Es conocido que los tumores poseen una tendencia a incrementar la coagulación sanguínea. Se ha mostrado que las nanopartículas recubiertas con un péptido de reconocimiento, CREKA (SEC ID n.° 7) se unen a vasos tumorales y causan la coagulación sanguínea en ellos (Simberg et al., 2007). En ratones portadores de tumor MDA-MB-435 (utilizado en estudios originales de CREKA (SEC ID n° 7)) se inyectó fago de sustrato CendR trombina (fago 2, Tabla 1) o fago de control (G7) (109 a 1011 ufp) por vía intravenosa y se estudió el reconocimiento de los fagos tal como se ha indicado para el fago sensible a uPA, anteriormente. Las inmunorreactividades de fagos y trombina se estudian utilizando doble inmunohistoquímica con peroxidasa y fosfatasa alcalina como enzimas informadores. Para incrementar la coagulación, se coinyectaron fago CendR sensible a trombina y fago CREKA, seguido de la cuantificación del reconocimiento y la inmunolocalización.

Tabla 1. Fago escindible por proteasa y fago de control utilizados para estudios de dianización in vitro e in vivo. Los sitios de escisión en el fago de sustrato se indican mediante una flecha. Los residuos C-terminales expuestos proteolíticamente se muestran en negrita.

v. Cribado para nuevos péptidos escindibles con proteasa, específicos de tipo celular y de tejido e internalizados mediante la ruta de CendR

El repertorio de proteasas humanas, o degradoma, consiste en más de 460 proteasas (Puente et al., 2003). El perfil de actividad proteolítica es específico de tipo de tejido y de enfermedad. El perfilado in vivo de proteasas endógenas accesibles sistémicamente no puede llevarse a cabo utilizando las técnicas actuales. El elemento CendR puede utilizarse para dicho cribado. Las serina-proteasas comprenden aproximadamente 1/3 de las proteasas conocidas y en muchos casos su escisión expone el residuo C-terminal de arginina. Muchas cisteína-proteasas también prefieren la arginina como el residuo P1 y pueden ser dianas adecuadas para un cribado de CendR. Se conocen varias proteasas específicas de tejido y de tipo celular que son capaces de exponer una arginina C-terminal con la escisión. El sistema de uroquinasa/plasmina está activado en las células migratorias durante el desarrollo (p. ej., células gigantes trofoblásticas, células de la cresta neural) y en la invasión tumoral (Blasi y Carmeliet, 2002). Las calicreínas tisulares (una familia de 15 proteasas similares a quimotripsina estrechamente relacionadas) se expresa en un patrón específico de órgano y tipo celular; el patrón mejor conocido es la expresión específica prostática de hK3/Antígeno Específico Prostático. El perfilado de sustratos muestra que las calicreínas hK4, hK5, hK6, hK10 prefieren la arginina como el residuo P1, y que otras calicreínas importantes, tales como hK3, también toleran la arginina en esta posición (Debele et al., 2006). Los tripsinógenos se expresan fisiológicamente en el páncreas exocrino, aunque también se expresan ectópicamente en muchos tumores y desempeñan una función en la activación de las metaloproteinasas de la matriz (Nyberg et al., 2006). Inesperadamente, la escisión proteolítica de las proteínas de la cubierta vírica por la proteasa o proteasas del huésped es una etapa de activación fundamental para muchos virus; de hecho, el patrón de expresión de una proteína activadora frecuentemente determina el tropismo vírico a los tejidos (Klenk y Garten, 1994). La proteína de cubierta vírica normalmente se escinde en residuos básicos; esto puede representar el modo en que la naturaleza aplica el principio de CendR a la administración intracelular de partículas víricas. Además de una escisión por endoproteasa que exponga directamente los residuos C-terminales de arginina, puede contemplarse la activación de CendR mediante un recorte multietapa por carboxilpeptidasas o un procesamiento combinado por endoproteasa y carboxilpeptidasa. La necesidad de la expresión simultánea de más de una proteasa en la superficie celular o en proximidad a ella puede generar una enorme cantidad de variabilidad específica de tejido y el potencial de dianización selectiva.

Puede utilizarse un nuevo cribado fágico in vivo para aprovechar el potencial de la expresión de proteasas específica de tejido en la dianización. La exposición protelítica de péptidos que contienen un elemento de reconocimiento de proteasa adecuado dentro de la secuencia de biblioteca aleatoria puede llevar a la internalización celular de las partículas fágicas (fig. 7). La internalización concentra el fago en la diana, proporcionando la base para la selección de péptidos que son escindidos específicamente en la diana. De esta manera se llevan a cabo cribados tanto in vitro como in vivo para identificar nuevos péptidos CendR específicos de tumor.

Dichos péptidos pueden utilizarse para construir composiciones internalizantes que sean específicas para proteasas o combinaciones de proteasas en diversos tipos de tumor. Además, la dianización a base de proteasas puede combinarse con la dianización sináfica (basada en el acoplamiento molecular) para incrementar la especificidad y la eficacia; un péptido de reconocimeinto que se une a un receptor en el tejido diana se utiliza para concentrar un péptido quimérico o la composición (tal como una nanopartícula) decorada con dos péptidos en la diana, en donde la proteólisis basada en CendR seguidamente escinde el péptido y causa la internalización. El efecto combinado puede rendir una selectividad de dianización sin precedentes. El péptido iRGD indicado anteriormente puede ser un ejemplo de un péptido con dicha especificidad combinada.

vi. Construcción de bibliotecas.

Se construyeron dos tipos de bibliotecas de fago T7: (1) En un grupo de bibliotecas, a un único residuo de arginina sigue una secuencia peptídica aleatoria de señuelo). Si la secuencia aleatoria está destinada a formar un péptido cíclico, se inserta un residuo de cisteína en el lado N-terminal de la arginina y la parte aleatoria tiene la estructura XnC). (2) En el segundo grupo de bibliiotecas, a un motivo de reconocimiento conocido sigue un residuo de arginina y una secuencia aleatoria. El procesamiento proteolítico que expone la arginina como residuo C-terminal causa la internalización del fago y la acumulación en la diana. En el diseño n.° 2, el motivo de reconocimiento conocido está destinado a concentrar el fago en el tejido tumoral. Una opción para el motivo de reconocimiento es el péptido RGD-4C. Dicho péptido contiene 4 residuos de cisteína dentro de 9 residuos y forma una estructura fuertemente enrollada (Assa-Munt et al., 2001). Se ha mostrado que RGD-4C reconoce los vasos tumorales (Pasqualini et al., 1997; Arap et al., 1998), y debido a su estructura, es relativamente resistente a la escisión por proteasas. Lo anterior deja que sea la secuencia aleatoria añadida la que proporcione el sustrato de proteasa y las funciones de internalización. Otra opción es el péptido CLT1, un péptido de reconocimiento tumoral que reconoce las proteínas plasmáticas coaguladas en el estroma tumoral (Pilch et al., 2006). Dicho péptido no presenta ningún residuo de arginina (la secuencia es CGLIIQKNEC (SEC ID n.° 18), por lo que nuevamente cualquier internalización debería ser proporcionada por la secuencia aleatoria. Se utiliza la secuenciación del ADN de un conjunto aleatorio de 96 clones fágicos para evaluar la calidad de la biblioteca.

vii. Cribado de bibliotecas.

El cribado in vitro de exposición fágica se lleva a cabo en cultivos de células de carcinoma prostático (PPC1, PC₃) y de carcinoma de mama (MDA-MB-435). Se incubaron las células tumorales (106 células) con 1010 ufp de biblioteca fágica a 37 °C durante 2 horas, seguido de lavados extensivos con DMEM que contenía BSA al 1 % para eliminar el fago no unido. Se amplificaron los fagos en células de E. coli BLT5403 y se purificaron mediante precipitación con PEG-8000. Se llevaron a cabo cuatro rondas de selección. Para evitar la posible inactivación de los fagos internalizados, se llevó a cabo un rescate alternativo de los fagos mediante PCR y clonación inversa de insertos codificantes de péptido en los grupos de vector T7. Dicho esquema de selección resultó en el enriquecimiento de los fagos de exposición de los péptidos sensibles a proteasas extracelulares capaces de activar la incorporación de CendR. Se llevó a cabo el cribado in vivo mediante la inyección de 1010 fagos por vía intravenosa en ratones portadores de tumores xenoinjertados (de las líneas celulares indicadas anteriormente) y recolección de tejidos después de 10 min a 2 horas (para dejar que actuasen proteasas de diferente tiempo de eficacia sobre los péptidos). Se rescataron los fagos y se analizaron tal como se ha indicado para los cribados in vitro anteriormente indicados. Se utilizó, además, una combinación de cribados in vitro e in vivo.

Después de la última ronda de selección, se secuenciaron 96 clones fágicos aleatorios de la agrupación y se identificó cualquier motivo peptídico dominante. Las secuencias que exponían arginina C-terminal (debido a la presencia de un codón de parada después del residuo de arginina) se descartaron debido a que su selección en el cribado probablemente estaba causada por la arginina C-terminal ya expuesta. Según los resultados mostrados en la fig. 1C, dichos fagos representan un medio a dos tercios de todas las agrupaciones seleccionadas en los cribados in vitro. Lo anterior probablemente será muy inferior, a partir de los cribados in vivo, ya que los fagos con arginina C-terminal se unen a otros tejidos antes de alcanzar el tumor. De entre los clones fágicos remanentes, se analizan individualmente 3 clones representantes de cada motivo dominante. Los ensayos in vitro miden la unión celular y la sensibilidad de la unión a la baja temperatura y la macroglobulina a2 (inhibidores de proteasa generales), fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo (AEBSF, inhibidor de serina proteasa, Roche Biochemicals), pepstatina A (inhibidor de proteasa aspártica, Sigma), Z-Phe-Ala-FMK (inhibidor de cisteína proteasa, Enzyme Systems Products) y amastatina (inhibidor de aminopeptidasa, Sigma). Dichos ensayos pueden demostrar la activación dependiente de proteasa de la internalización de los fagos y definir el tipo o tipos de proteasa responsables de la activación. Además, se identifica la participación de la ruta de CendR en la unión e internalización de los péptidos seleccionados. Lo anterior se lleva a cabo utilizando dos enfoques: (1) competición de la unión e internalización de los fagos por fagos CendR inactivados por UV y (2) utilización de células PPC1 en las que el receptor de CendR identificado anteriormente se ha inactivado mediante la utilización de tecnología de ARNip.

Además de los estudios fágicos, se prepararon péptidos de sustrato marcados fluorescentemente para estudios de transferencia de energía de resonancia (RET, por sus siglas en inglés). La desactivación de RET ocurren cuando existe un solapamiento entre los espectros de absorción y emisión de dos fluoróforos en estrecha proximidad. El nivel de desactivación depende de la distancia entre las moléculas, así como del grado de solapamiento espectral. Con el fin de evaluar la escisión peptídica, se etiquetaron los péptidos en diferentes extremos con parejas de fluoróforo/inactivador conocidas (p. ej., DABCYL/EDANS o Abz/3-nitro-Tyr), se incubaron los péptidos con células y se midió el desplazamiento de la intensidad de fluorescencia. El panel de inhibidores de proteasa indicado anteriormente para los estudios fágicos se utilizó para identificar la familia de proteasas responsable de la escisión.

Los clones fágicos también se sometieron a ensayo para el reconocimiento tumoral in vivo. Se estimó la eficiencia del reconocimiento mediante titulación de los fagos en tumores y en tejidos normales. La presencia de fago en los tejidos se analizó utilizando anticuerpos anti-T7; este análisis proporciona información sobre el tipo celular al que está asociado el fago en los tejidos y sobre si resulta internalizado por las células.

Dichos cribados pueden proporcionar nuevas secuencias de CendR específicas tumorales. También pueden encontrarse secuencias mixtas en las que un péptido de reconocimiento se encuentra incluido dentro de una secuencia de CendR, o que coopera con una en un péptido quimérico. Los péptidos que se unen al tejido diana mediante dicho mecanismo combinado pueden ser vehículos particularmente buenos para el transporte intracelular selectivo de composiciones. La identificación de los sustratos escindibles por proteasa también puede utilizarse para identificar las proteasas responsables de la escisión. Dichas proteasas pueden demostrar ser funcionalmente importantes para la progresión de la enfermedad, y pueden ser dianas farmacológicas importantes por sí mismas.

viM. Aislamiento de péptidos que estimulan la salida de composiciones de las células y péptidos que causan la extravasación de nanopartículas

La extravasación y penetración en tejidos eficientes de diversas composiciones utilizan funciones tanto de internalización como de salida celular. La salida de composiciones respecto de las células puede depender del secuestro de las rutas secretorias celulares. Es probable que existan múltiples rutas que puedan aplicarse para la salida; algunas de estas rutas pueden ser específicas de tipo celular y tisular y potencialmente pueden proporcionar una capa adicional de selectividad para el transporte de fármacos. La regla de extremo C puede aplicarse al cribado para secuencias peptídicas que puedan mediar en la salida de las células. Con este fin, se crean bibliotecas de T7 que exponen péptidos aleatorios, seguido de un elemento CendR con una arginina C-terminal (bibliotecas XCendR). La arginina C-terminal causa una internalización celular indiscriminada del fago. Debido a que solo aquellos fagos que expongan un péptido con función de salida serán capaces de salir de las células, se crea un cribado para la función de salida. Existen varias posibles maneras de seleccionar los fagos capaces de salir de las células. El enfoque más directo es identificar el fago que aparece en el medio de cultivo de las células después de la unión e internalización iniciales de la biblioteca, y lavados para eliminar el fago no unido. Dicho sistema permite, además, seleccionar los fagos que son capaces de más de un ciclo de entrada/salida. En este cribado, se permite que el fago se una a una agrupación de células, seguido de un cultivo mixto de estas células con otra agrupación de las mismas células portadoras de una etiqueta de separación. Se recupera el fago a partir de la segunda agrupación de células. Dicho esquema es selectivo para los péptidos que son capaces de ciclos repetidos de entrada-salida y que, de esta manera, actúan como elementos de penetración en tejidos.

También se explora la posible existencia de señales de salida celular específicas de tipo celular. Se utiliza una variación del cribado indicado anteriormente para péptidos genéricos estimuladores de salida, excepto en que la selección se lleva a cabo utilizando dos líneas celulares diferentes. En un cribado para un elemento de salida específico para la línea celular A, se incuba con la biblioteca XCendR, eguido del cocultivo con la línea celular B, y el cultivo prolongado y recuperación de fago intracelular a partir de la línea celular B. Los péptidos seleccionados de esta manera son internalizantes universalmente; sin embargo, solo son capaces de salir de la línea celular A, pero no de B. Los péptidos de salida específicos de tipo celular pueden proporcionar una selectividad adicional para el transporte de cargas. Por ejemplo, los péptidos que inducen la salida de cargas a partir de células no cancerosas se utilizan para conseguir la extravasación, la penetración en tejidos y la dianización selectiva de las células tumorales.

La extravasación es la primera etapa en la penetración en tejidos de las nanopartículas. Incluye no solo la penetración de las células endoteliales y los pericitos, sino también de estructuras densas de la matriz extracelular (membranas basales y matrices ricas en colágeno). Los fagos portadores de motivos peptídicos estimuladores de la extravasación se aíslan mediante microdisección a partir de tejidos diana de ratones en los que se han inyectado bibliotecas XCendR.

Se construyó una biblioteca de fago T7 (biblioteca XCendR) para la identificación de péptidos inductores de salida celular. El péptido CendR C-terminal (RPARPAR, SEC ID n.° 2) está flanqueado en su lado N-terminal por una biblioteca de heptámeros aleatorios; el fago que expone dicha biblioteca se internaliza mediante la ruta de CendR. Por otra parte, un fago que expone un péptido con función de salida es capaz de salir de las células. A menos que los procesos de entrada/salida impliquen un procesamiento irreversible (p. ej., la proteolisis), el ciclo de entrada/salida puede repetirse varias veces.

La estrategia experimental de identificar secuencias peptídicas genéricas estimuladoras de la salida se describe de manera general en la fig. 7, panel B. La biblioteca se incubó en primer lugar a 4 °C con 5x106 células de carcinoma prostético PPC1 para unir el fago a la superficie celular (se utilizó la incubación a 4 °C para evitar los ciclos repetidos de internalización/salida el fago, con posible riesgo de inactivación del fago). Durante la primera ronda de selección, se utilizó el número de fagos de entrada, que es aproximadamente 20 veces la diversidad de la biblioteca (habitualmente de 1010 unidades formadoras de placa). Tras lavados extensivos con DMEM que contenía BSA al 1 % para eliminar el fago no unido, se incubaron las células a 37 °C durante diversos periodos de tiempo (para evitar que la muerte celular se convirtiese en un factor, se mantuvo el tiempo més corto posible) y se rescataron los fagos del sobrenadante de cultivo mediante infección de células de E. coli BLT5403. Dicha agrupación de fagos puede contener fagos que exponen una señal de salida y el cribado repetido puede enriquecer en esos fagos.

Con el fin de aislar los fagos capaces de otra entrada después de haber salido de una célula, se llevó a cabo la parte inicial del cribado tal como se ha indicado anteriormente, aunque después de la etapa de unión y lavado, se añadió un exceso de 10x de células PPC1 transfectadas establemente con GFP, seguido de la incubación a 37 °C durante 1 hora. Tras lavados extensivos, se aislaron las células GFP+ mediante FACS y se rescataron los fagos en estas células mediante infección de células de E. coli BLT5403 mediante clonación inversa basada en PCR en fagos T7. Durante cada ronda de selección, se evaluó el número de fagos recuperados mediante la titulación de los fagos infecciosos y mediante qPCR del ADN fégico. Se evaluaron individualmente los fagos portadores de motivo de salida candidatos mediante la utilización de la misma estrategia que durante la selección de bibliotecas. Este enfoque selecciona los fagos que son capaces de més de un ciclo de entrada/salida y puede llevar a la identificación de elementos peptídicos que permiten la salida celular de las nanopartículas.

Se llevaron a cabo variaciones de la estrategia de cribado indicada anteriormente a fin de explorar posibles señales de salida específicas de tipo celular (fig. 7, panel B). Se exploraron las señales de salida de las suspensiones celulares preparadas a partir de órganos de ratón normales (hígado, riñón y próstata), células endoteliales vasculares humanas normales aisladas a partir de cordón umbilical (HUVEC, por sus siglas en inglés, BD Bioscience), líneas celulares de cáncer prostético (PC₃, Du145, ambas de ATCC) y una línea celular de carcinoma de mama (MDA-MB-435, ATCC). Con el fin de identificar los péptidos de salida específicos de tipo celular, se incubaron 5x106 células diana a 4 °C con 20x la diversidad de la biblioteca XCendR (normalmente 10 10 unidades formadoras de placa), seguido de lavados extensivos (4x) con DMEM que contenía BSA al 1 % para eliminar los fagos no unidos. A continuación, se cocultivaron las células diana a 37 °C durante 1 h con un exceso 10x de células PPC1 expresantes de GFP, que es conocido que presenta una elevada actividad de la ruta de CendR. DuRANTE esta etapa, las células PPC1 internalizaron el fago que salía de las células diana iniciales. Tras la incubación, se separaron las células PPC1, se sometieron a un lavado ácido (para eliminar el fago no unido a la superficie) y se rescataron los fagos intracelulares mediante infección y/o mediante clonación inversa basada en PCR a bacteriófagos T7. Los fagos resultantes deberían exponer los péptidos que entran/salen de las células diana pero solo eran capaces de entrar, no de salir, de las células PPC1. Se sometieron a ensayo otras combinaciones de diferentes tipos de células de la misma manera. La combinación de células endoteliales y células tumorales seré un motivo central de investigación, ya que los péptidos que son capaces de entrar y salir de lsa células endoteliales, pero que solo puedan entrar, pero no salir, de las células tumorales resultarían particularmente interesantes como péptidos de dianización tumoral.

Finalmente, se cribó la biblioteca XCendR in vivo con el fin de identificar los péptidos que impulsan la extravasación de los vasos sanguíneos. Fagos individuales con péptidos de salida de HUVEC/CendR para capacidad de extravasación. Debido a que se espera que la biblioteca con péptido CendR expuesto se una a todos los vasos sanguíneos in vivo, se llevaron a cabo cribados iniciales y se optimizó la tecnología utilizando órganos diana con los que se encuentra en primer lugar el fago después de la inyección en la vena de la cola: el corazón y los pulmones. A continuación, se inyectan los fagos en el ventrículo izquierdo del corazón (Brown y Ruoslahti, 2004) para evitar la incorporación preferente por el corazón y los pulmones. Para el cribado de extravascaión in vivo, se utiliza una biblioteca altamente concentrada que ha sido purificada utilizando la ultracentrifugación con cloruro de cesio (se ha encontrado que los fagos altamente purificados proporcionan mejores resultados de cribado que las preparaciones de fago no purificadas o precipitadas con PEG8000). Se inyectó la biblioteca a razón de 1011 ufp/ratón en un volumen total no superior a 200 μl (para evitar el estrés y daño vascular inducido por la presión). Tras la circulación del fago durante 3 horas para permitir la extravasación y la penetración en los tejidos, se congelaron instanténeamente los tejidos y se realizaron secciones de 30 μm. Las secciones de tejido se fijaron con metanol a -20 °C durante 1 min y se contratiñeron. Las estructuras vasculares se eliminan utilizando un sistema de microdisección PALM (Carl Zeiss GmbH, Alemania). Se ha determinado que dicho tratamiento es compatible con la supervivencia fégica. Las secciones de tejido con vasos eliminados se solubilizaron en detergente no iónico (NP40 al 1 % en medio LB de crecimiento bacteriano) y se rescataron los fagos. Tras varias rondas de selección, se seleccionó el fago candidato para la evaluación individual. Se evaluó la extravasación del fago individual mediante la utilización de qPCR multiplex con sondas Taqman y juegos de cebadores (instrumento BioRad IQ5) para cuantificar el número de copia de ADN de ambos clones fégicos. Como control interno para la qPCR, se coinyectó fago G7 con el fago auditado. También se estudió la distribución del fago extravasante candidato en fago en el tejido diana, mediante inmunotinción con anticuerpo anti-T7.

Tras la etapa de cribado de bibliotecas y la identificación/validación de los péptidos potencialmente extravasantes expuestos en fagos, se prepararon péptidos biotinilados sintéticos y se conjugaron con puntos cuánticos (Qdot™ 605 ITK-SA, Invitrogen). Se evaluó la internalización/salida de los puntos cuánticos en células vivas en tiempo real utilizando un microscopio confocal de disco giratorio. Se analizaron puntos cuánticos portadores de elementos de salida (y CendR) específicos de tipo celular utilizando el mismo sistema de obtención de imágenes: se utilizó un cultivo mixto de células portadoras de diferentes marcajes fluorescentes para estudiar la salida selectiva de tipo celular. Se utilizó un sistema de expresión lentivírico para expresar un panel de proteínas fluorescentes (GFP, YFP, DsRed y Venus) que pueden introducirse rápidamente en las células para generar sublíneas fluorescentes. Para la evaluación in vivo, se inyectan puntos cuánticos recubiertos con péptido por vía intravenosa, se recolectan los órganos tras 3 horas de circulación, se congelan instantáneamente y se tratan para la tinción de inmunofluorescencia. Se observaron los puntos cuánticos utilizando un juego de filtros TRITC; las mismas secciones también se tiñeron con un panel de marcadores específicos de tipo celular (CD31 para células endoteliales, antígeno de membrana epitelial/EMA para células tumorales, CD11b para macrófagos y podoplanina, y LYVE-1 para células endoteliales linfáticas) y anticuerpo secundario conjugado con pigmento Alexa488 (Invitrogen).

Dicha estrategia se diseñó para revelar señales de salida celular no convencionales, que es conocido que existen. Los cribados de exposición peptídica pueden revelar los péptidos que son capaces de utilizar dichas rutas para mediar en la salida de las células. Es un enfoque completamente nuevo y podría revelar señales que resultan extremadamente útiles para causar la extravasación y la transferencia de diversas composiciones de una célula a otra.

ix. Demostración de la validez del enfoque de la regla de extremo C inducido por proteasa mediante el diseño de una terapia experimental para el cáncer

Los resultados detallados anteriormente muestran que pueden transportarse específicamente dos tipos de nanopartículas: bacteriófagos y puntos cuánticos, hasta el interior de las células mediante la utilización de péptidos basados en la regla del extremo C para el transporte. Se utilizan nanopartículas de óxido de hierro de 50 nm recubiertas con dextrano y pegiladas como el andamiaje para construir un vehículo de transporte multifuncional. Otros han utilizado un andamiaje similar para el transporte de ARNip (Medarova et al., 2007). Un péptido de reconocimiento proporciona la función de dianización e internalización. El péptido iRGD se utiliza como el elemento de dianización en las nanopartículas debido a que este péptido combina la dianización específica en vasos tumorales y células tumorales con la internalización de la carga en las células diana. También pueden utilizarse otros péptidos individuales o quiméricos de reconocimiento más elemento CendR. De manera similar, pueden incorporarse en las nanopartícuulas cualesquiera péptidos que estimulen la extravasación y la extensión dentro de los tejidos.

El péptido de dianización adicionalmente porta un fluoróforo del infrarrojo próximo para la obtención de imágenes. La obtención de imágenes ópticas en ratones resulta preferente debido a que resulta más fácil y económico en animales pequeños que otros métodos de obtención de imágenes. Sin embargo, el núcleo de óxido de hierro proporciona la opción de utilizar RM, que es el método de elección en pacientes humanos/as. La carga se une a la superficie de la partícula. Puede utilizarse ARNip, que posee un enorme potencial en el tratamiento de muchas enfermedades, incluyendo el cáncer, debido a que resulta posible modular las denominadas dianas "no farmacológicas" (Uprichard, S.L., 2005; Dykxhoom et al., 2006). También puede utilizarse una función de escape endosómico para las partículas. Se ha encontrado una señal nuclear de las células que han sido tratadas con iRGD marcado con fluoresceína.

Se ha construido un vector de transporte de ARNip similar en un andamiaje de puntos cuánticos (Derfus et al., 2007). Basándose en el hecho de que el péptido iRGD es extraordinariamente eficaz en el transporte de fagos y péptidos fluorescentes hasta los tumores y en la comparación directa entre iRGD y el fago F3, las nanopartículas de iRGD pueden mostrar una actividad de reconocimiento e internalización muy incrementada.

Otra opción son los liposomas, que también han sido utilizados por otros para el transporte de ARNip (p. ej., Pirollo et al., 2007). En la literatura existen numerosos otros diseños de andamiaje para el transporte de ARNip (p. ej., Li y Huang, 2006; Bartlett et al., 2007). El andamiaje de las partículas no es importante; el sistema está construido basándose en la eficacia y especificidad de los elementos de reconocimiento/internalización/extravasaci'no.

Se han explorado in vivo diversos regímenes de administración de fármaco y se ha caracterizado la carga tumoral durante el tiempo. La distribución in vivo de las partículas durante el tiempo se ha estudiado mediante imágenes ópticas y mediante la medición de la magnetización de los tejidos. La diana para la supresión del ARNip es una proteína conocida como p32, gC1gR o HABP (Grebrehiwet et al., 2002; Rubinstein et al., 2004). Dicha proteína es principalmente una proteína mitocondrial, aunque también se expresa en la superficie celular bajo algunas circunstancias. La p32 es la diana de uno de los péptidos de reconocimiento tumoral. El péptido de reconocimiento, LyP-1, reconoce los vasos linfáticos y las células tumorales en algunos, aunque no en todos, los tumores (Laakkonen et al., 2002a, 2004). Se ha mostrado que una subpoblación de macrófagos tumorales también expresa p32 a niveles elevados. Además, se ha mostrado que la supresión de la expresión de p32 con ARNip desplaza el metabolismo de las células tumorales hacia la glucólisis, reduce el crecimiento celular y deteriora la tumorigenicidad in vivo. Mediante la utilización de dicha diana, se muestra la eficacia de las partículas en la supresión de la expresión de p32 en los tumores. Debido a que p32 se expresa a niveles relativamente elevados en el riñón y el páncreas (parte de su especificidad tumoral se deriva de la expresión en la superficie de las células, que según resultados anteriores está limitada a los tumores), también puede monitorizar la selectividad de la dianización mediante la medición de los niveles de p32 en estos órganos. Los estudios de tratamiento pueden revelar si p32 posee potencial en la terapia con ARNip de los tumores.

Andamiaje de nanopartículas. Se utilizan nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas recubiertas con dextrano y funcionalizadas con grupo amino (nanomag-D-SPIO 50 nm; Micromod Partikeltechnologie GmbH, Rostock, Alemania). Los "nanogusanos", partículas de óxido de hierro alargadas, pueden utilizarse en lugar de las nanoesferas. Los nanogusanos (NW) pueden llevar más carga hasta la diana (Park et al., 2008). La síntesis de nanogusanos es similar a la preparación habituual de nanoesferas (NS) magnéticas, que implica la reacción de sales de Fe(II) y Fe(III) en presencia de dextrano (Palmacci y Josephson, 1993). Para conseguir la morfología de tipo gusano, se incrementa la concentración de sales de hierro y se utiliza un peso molecular más alto del dextrano (20 kDa) que en la preparación de partículas esféricas. Los nanogusanos son partículas recubiertas con dextrano alargadas compuestas de un agregado lineal de 5 a 10 núcleos de IO (50 a 80 nm). También pueden prepararse nanosferas We, que son partículas recubiertas con dextrano esféricas que contienen 1 a 2 núcleos IO (25 a 35 nm). Pueden utilizarse liposomas, tales como liposomas dirigidos (Simberg et al., 2007). Además, pueden utilizarse micelas autoensamblantes.

Acoplamiento de PEG, péptidos y ARNip a las nanopartículas. Se ha encontrado que la semivida en circulación es altamente dependiente del número de grupos amina en superficie (grupos funcionales utilizados para la conjugación de los péptidos) y la carga superficial tanto para NW como NS (Park et al., 2007). A medida que se incrementa el número de grupos de amina superficiales yy, por lo tanto, la carga neta de las partículas, se reduce el tiempo de circulación, tal como también se ha informado en la literatura (Weissleder et al., 1995; Moghimi et al., 2001). Las aminas en superficie libres pueden atraer ciertas proteínas plasmáticas relacionadas con la opsonización; el mantenimiento de una carga superficial (potencial zeta) próxima a la neutra aparentemente resulta importante para conseguir una semivida en sangre prolongada. La unión de PEG a las nanopartículas aminadas incrementa el tiempo de circuulación, presumiblemente mediante la reducción de la unión de las proteínas plasmáticas implicadas en la opsonización (Moghimi et al., 2001). Las partículas pueden presentar modificaciones en superficie para la evitación del sistema reticuloendotelial (PEG), el reconocimiento e internalización (péptido iRGD), el escape endosómico (péptido sensible al pH; p. ej., Pirello et al., 2007), un fluoróforo, tal como Cy7 y la carga de ARNip, y posiblemente también un péptido estimulador de la extravasación. Para conseguir la totalidad de dichas funciones en una partícula, se llevan a cabo estudios de optimización para determinar qué proporción de los sitios de unión disponibles en la superifice de las partículas debería ocupar cualquiera de dichos elementos para proporcionar la mejor combinación de dianización//internalización y transporte de carga. También pueden explorarse las posibles ventajas de acoplar dichos compuestos en tándem, en lugar de individualmente. En un extremo, el péptido de reconocimiento/internalización, el péptido de salida endosómica, el péptido extravasante y el fluoróforo pueden sintetizarse todos en forma de un compuesto y acoplarse con las partículas mediante la fracción PEG. El otro extremo es el acoplamiento de todos ellos individualmente. Las partículas que incorporan péptidos aleatorios y ARNip de control se construyen y utilizan a modo de controles.

El péptido iRGD y otros péptidos de reconocimiento recientes altamente eficientes son péptidos cíclicos con un enlace disulfuro que resulta esencial para la actividad peptídica. Se han desarrollado reacciones químicas para resolver dicho problema: se utiliza la protección selectiva de grupos laterales para sintetizar péptidos cíclicos con una cisteína adicional que presenta un grupo sulfhidrilo libre. Ha resultado que dichos péptidos son estables sin aleatorización detectable del enlace disulfuro. También puede utilizarse una función maleimida como grupo de acoplamiento. Dichas reacciones químicas se utilizan para acoplar iRGD a las partículas. La carga de ARNip se acpla a las partículas mediante la utilización de un enlace disulfuro. Se ha mostrado en un estudio anterior que el ARNip unido a una nanopartícula mediante entrecruzantes disulfuro mostraba una eficiencia de silenciamiento mayor que en el caso de que estuviese unida a un enlace tioéter no reducible (Derfus et al., 2007). Lo anterior presumiblemente se debe a que el ARNip resulta liberado de la partícula en el medio intracelular reductor.

x. Incorporación de nanopartículas y actividades in vitro e in vivo.

La unión e incorporación por células en cultivo se estudió mediante microscopía de fluorescencia utilizando microscopía confocal para determinar la internalización y localización subcelular. El tiempo de circulación de las nanopartículas inyectadas por vía intravenosa se determinó mediante la medición de la fluorescencia en muestras de sangre recolectadas en diversos tiempos y mediante magnetometría de dispositivo superconductor de interferencia cuántica (SQUID, por sus siglas en inglés). SQUID proporciona una medida directa del número total de nanopartículas IO magnéticas en una muestra (en lugar del contenido de hierro total) y las mediciones son relevantes a las aplicaciones de obtención de imágenes de RM. También se utiliza SQUID para determinar las concentraciones de nanopartículas en tumores y en otras muestras de tejidos. El efecto del ARNip se monitorizó mediante inmunotransferencia de la proteína diana y de varias proteínas no diana para determinar la especificidad de cualquier supresión.

xi. Modelos tumorales y análisis de la dianización.

El modelo tumoral principal es un modelo de xenoinjerto ortotópico de cáncer de mama generado mediante implantación de células de cáncer MDA-MB-435 humano en la almohadilla grasa mamaria de ratones hembra desnudos. Se seleccionó dicho modelo debido a que el péptido iRGD y varios otros péptidos de reconocimiento disponibles como elementos de dianización alternativa reconocen eficazmente dicho tumor (CREKA, LyP-1). Además, dicho modo se ha utilizado ampliamente en el reconocimiento peptídico y en estudios de tratamiento tumoral (p. ej., Laakkonen et al., 2004).

Partiendo de concentraciones clínicamente relevantes (0,7 a 2,6 mg de Fe/kg de peso corporal), se inyectan por vía intravenosa nanopartículas portadoras de ARNip en un ratón por la vena de la cola y se obtienen imágenes ópticas del animal vivo bajo anestesia posteriormente tras 1, 8 y 24 horas. Se obtuvieron imágenes de los órganos recolectados en tiempos adecuados después de las inyecciones de nanopartículas y se sometieron a análisis SQUID para cuantificar el reconocimiento. Se determinó el efecto del ARNip mediante inmunotransferencia tal como se ha indicado anteriormente. Las nanopartículas multifuncionales se ha demostrado que dianizan selectivamente tumores y transportan un ARNip activo hacia el interior de los mismos.

Estudio de tratamiento tumoral. Se trataron ratones portadores de tumor de MDA-MB-435 (de 16 a 20 semanas de edad) con nanopartículas u otras composiciones adecuadas tal como se da a conocer en la presente memoria y se seleccionaron siguiendo los criterios comentados anteriormente. Los ratones (10 ratones en cada grupo) recibieron inyecciones intravenosas semanales. Se determinaron las dosis para las partículas con el ARNip específico y el ARNip de control, en las que se determinó el efecto del ARNip sobre el tumor y la toxicidad. Se determinó la dosis respecto a la toxicidad. La eficacia y la toxicidad de las nanopartículas dianizadas se estudiaron en regímenes que incrementaban la frecuencia de la administración de semanalmene a 2 a 3 veces a la semana. Es posible que los umbrales de eficacia y toxicidad sean más favorables con un incremento de la frecuencia y una dosis más baja en cada inyección (Kerbel y Kamen, 2004).

El tamaño de los tumores de MDA-MB-435 puede monitorizarse fácilmente mediante la medición de las dimensiones y mediante el pesado de la masa del tumor al final del experimento. Los ratones fueron eutanizados cuando sus tumores alcanzaron un tamaño que causaba en el ratón una molestia detectable. El personal en la instalación animal tomó decisiones respecto a la eutanasia de manera independiente de los/las investigadores/as implicados en el estudio (Arap et al., 2002). Esta organización permitió recoger datos de supervivencia para la comparación de los grupos. Los métodos de obtención de imágenes ópticas (y potencialmente de RM) comentados anteriormente ofrecen una alternativa a la medición del tamaño tumoral o la utilización de la supervivencia como punto final. La disponibilidad de la obtención de imágenes potencia y acelera la capacidad de someter a ensayo las variaciones en el diseño.

Como medida adicional de eficacia, se cualifican los vasos linfáticos y macrófagos (las células diana que son positivas para p32, además de las células tumorales). Los vasos linfáticos se analizaron con anti-LYVE-1 y los macrófagos, con tinción de CD11b. Se ha mostrado que las células positivas para p32 expresan dichos marcadores de linaje (Laakkonen et al., 2004; Fogal, Zhang, y Ruoslahti, Mitochondrial/ Cell surface protein p32/gC1qR as a molecular target in tumor cells and tumor stroma. Cancer Res. 68: 7210-7218 (2008)). También se evaluó la presencia de células tumorales en los vasos linfáticos y se evaluó macroscópica e histológicamente la presencia de los tumores a lo largo de los vasos linfáticos. Puede ser detectable una reducción sustancial del número de vasos linfáticos (Laakkonen et al., 2004). El examen microscópico también puede posibilitar la evaluación de la necrosis en los tumores, ya que la necrosis extensiva puede sesgar las mediciones del tamaño tumoral.

La información generada en la presente memoria puede hacer avanzar la tecnología de partículas dianizadas hasta el punto en que puedan desarrollarse compuestos para estudios clínicos. Las etapas que llevan a un reactivo diagnóstico o terapéutico incluyen lo siguiente: (1) Determinación de la capacidad de los péptidos de reconocimiento de unirse al receptor humano y optimización de los péptidos para la unión a la molécula de receptor humana y para las propiedades farmacocinéticas. (2) Desarrollo de composiciones dianizadas para la aplicación terapéutica; el ARNip de p32 propuesto en la present memoria como compuesto modelo puede aplicarse al uso terapéutico humano y también puede ajustarse para llevar otras cargas.

B. Ejemplo 2: regla de extremo C: intemalización dependiente de neuropilina-1 de péptidos y nanopartículas recubiertos con péptidos que exponen una arginina C-terminal.

La internalización selectiva de tipo celular de cargas es importante para muchos procesos biológicos y para el transporte dirigido de fármacos y agentes de obtención de imágenes. Se ha establecido que la internalización celular y la penetración en tejidos de nanopartículas puede conseguirse mediante el motivo peptídico R/KXXR/K (SEC ID n.° 23) expuesto C-terminalmente. A este fenómeno se le denomina regla del extremo C (CendR). Los péptidos que contienen el motivo R/KXXR/K (SEC ID n.° 23) en posiciones diferentes del extremo C-terminal no resultan internalizados; sin embargo, la incorporación de tales péptidos CendR latentes puede inducirse mediante escisión proteolítica. Los péptidos CendR pueden entrar en las células mediante un mecanismo que implica un componente crítico llamado neuropilina-1, que es un receptor multiligando conocido por sus funciones en la formación de patrones en los sistemas vascular y nervioso. La tecnología de CendR puede aplicarse al desarrollo de sistemas de transporte activados por proteasa específicos para tipos celulares o tejidos individuales. También puede interferir con procesos patológicos que implican el mecanismo de CendR, tal como la entrada de virus y otros microorganismos, y sus productos, en las células.

La dianización selectiva de agentes diagnósticos y terapéuticos en tejidos enfermos, especialmente tumores, sigue siendo un reto importante. Los tramos de aminoácidos catiónicos impulsan la transducción de proteínas endógenas y son importantes para la infección y extensión víricas. Entre los ejemplos de dichas proteínas se incluyen factores de transcripción homeodominio tales como Antennapedia (Joliot A. et al., 1991), la proteína VP22 del virus del herpes simplex 1 (Elliott, G. et al. 1997) y la proteína TAT transactivadora del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (Green, M. et al. 1988, Frankel, A. et al. 1988). Los péptidos penetrantes en células catiónicos cortos (PPC) derivados de dichas proteínas retienen la capacidad de internalizar un amplio abanico de cargas: péptidos y proteínas heterólogos, ácidos nucleicos y nanopartículas (Langel, Ülo, 2007). Sin embargo, las PPC no son selectivos; resultan incorporados por prácticamente todos los tipos celulares. La falta de selectividad limita gravemente la utilización de las PPC en aplicaciones clínicas. También se conocen péptidos internalizantes específicos de tejido que son capaces de transporte sináfico (basado en el acoplamiento) (Laakkonen P. et al., 2002b, Porkka, K. et al. 2002, Hoffman, J. A. et al. 2003, Jarvinen, T. A. et al. 2007). Los mecanismos de incorporación celular son poco conocidos para todas las PPC.

Un conmutador proteolítico con frecuencia modula la actividad de las proteínas en los procesos biológicos (Esmon, C.T., 1993; Barrettw et al., 1998, Sternlicht, M. D. et al.2001). Entre los ejemplos se incluyen la coagulación y fibrinolisis sanguíneas, la activación de factores de crecimiento y las hormonas peptídicas, la toma de decisiones de muertesupervivencia celular, y la migración y adhesión celulares. Inesperadamente, la entrada vírica en las células y la internalización de muchas toxinas bacterianas están reguladas por la activación proteolítica (Klenk H.D. et al., 1994, Gordon, V. M. et al., 1995); el patrón de expresión de una proteasa activadora frecuentemente es un factor determinante en la entrada en las células diana.

En la presente memoria se describe un sistema de internalización que puede ser activado mediante un conmutador proteolítico. El sistema se basa en un motivo de péptido internalizante, R/K/XXR/K (SEC ID n.° 24). Dicho motivo debe encontrarse presente en el extremo C-terminal de una cadena polipeptidica para que sea activa (de aquí el término "regla del extremo C", o CendR). El receptor internalizante se ha identificado como la neuropilina-1 (NRP-1). También se ha mostrado que, cuando está incluido en una secuencia proteica o peptídica, el motivo R/K/XXR/K (SEC ID n.° 24) críptico puede resultar expuesto por una proteasa, induciendo la incorporación celular. Los hallazgos ponen de manifiesto un conmutador de penetración celular que puede utilizarse para el transporte dirigido de fármacos y que puede ser operativo en una multitud de procesos biológicos, tales como la infección vírica. Sugahara, K.N. et al. (2008) describen un péptido compuesto que comprende tanto un elemento de dianización específica de tejido como un elemento CendR críptico. El elemento de dianización concentra el péptido en l adiana, en donde una proteasa tisular expone su elemento CendR, facilitando la internalización y penetración en el tejido.

1. Resultados

i. Identificación de un elemento de internalización C-terminal

La exposición C-terminal de bibliotecas peptídicas se utilizó sobre la superifcie del fago T7 (Hoffman J.A. et al., 2004) con el fin de identificar los péptidos que inducían la internalización celular de nanopartículas en las células derivadas de tumores xenoinjertados de carcinoma prostático humano PPC-1. Las bibliotecas peptídicas utilizadas para la selección eran la biblioteca X7 lineal, CX7C cíclica, así como la biblioteca RXXRXXX restringida (SED ID n.° 19) diseñada para incluir el motivo RXXR (SEC ID n.° 25), que también se encontraban presentes en algunos péptidos de reconocimiento internalizantes (X, aminoácido aleatorio; C, cisteína; R, arginina, fig. 10). Tras 3 rondas de selección, las agrupaciones de fagos seleccionados se unían a las células PPC-1 a un nivel 500 a 1.300 veces superior al fago de control que exponía el péptido de control de 7 glicinas (G7) (fig. 10A). La secuenciación de aislados fágicos aleatorios demostró que, con independencia de la configuración de biblioteca inicial, todas las bibliotecas habían convergido a la exposición de una arginina C-terminal, en la mayoría de casos en el contexto (R/K)XXR (SEC ID n.° 26) (fig. 10B). El fago T7 era sensible a las condiciones ácidas y al lavado ácido de las células en tampón de glicina (pH 2,5), lo que conducía a la liberación e inactivación del fago extracelular. Se recuperaron fagos que exponían (R/K)XXR (^sE^cID n.° 26) después de la incubación de las células a 37 °C y lavado con el tampón ácido, lo que indica la internalización. Un péptido indicaba que un residuo de lisina en el extremo C-terminal también podía producir un péptido activo.

Los estudios de unión con fagos individuales de agrupaciones seleccionadas mostraron que, aunque la presencia de arginina C-terminal (tal como en G6R) por sí sola resultaba suficiente para una unión fágica débil a las células PPC-1 (figs. 11A y 11C, panel D), podía observarse una unión e internalización robustas en presencia de un motivo RXXR (SEC ID n.° 25), tal como en RPARPAR (SEC ID n.° 2) (figs. 11A, 11B y 11C, panel c), RGERPPR (SEC ID n.° 27) y RVTRPPR (SEC ID n.° 28) (figs. 12A y 12B, paneles c y d). La estructura similar de los péptidos RXXR internalizantes (SEC ID n.° 25) y su capacidad para competir entre sí (figs. 12A y 12B, panel i) indicaba un mecanismo de unión compartido. Se utilizó el péptido RPARPAR (SEC ID n.° 2) como péptido CendR prototípico en estudios posteriores.

Se evaluaron las características estructurales de los péptidos internalizantes para definir la contribución de los residuos de arginina individuales a la unión del fago RPARPAR (SEC ID n.° 2). Indicaba que la arginina (o lisina) C-terminal resultaba crucial para la unión fágica, y que los otros dos aminoácidos básicos incrementaban la interacción de una manera dependiente de la dosis y de la posición (figs. 11A y 11B). La interacción con las células no implicaba otros elementos fágicos, ya que los puntos cuánticos (puntos q) funcionalizados por RPARPAR (SEC ID n.° 2) se unieron y resultaron internalizados de una manera indistinguible de las partículas fágicas (figura 11C, paneles f y g, y fig. 13, paneles a y f). Resulta interesante que un péptido que comprendía D-aminoácidos (D-rparpar) presentaba una capacidad muy reducida de inducir la incorporación de puntos cuánticos (fig. 13, panel d), señalando a la participación de un sitio de unión quiral. El enmascaramiento del elemento RXXR C-terminal (SEC ID n.° 25) con un aminoácido C-terminal adicional (tal como en RPARPARA (SEC ID n.° 3)) anuló la unión del fago a las células PPC-1 (fig. 11B); la unión del fago RPARPARA (SEC ID n.° 3) se restauró mediante tratamiento del péptido con tripsina (que escinde después de residuos básicos y presumiblemente expone una arginina C-terminal; fig. 14). La internalización de puntos cuánticos se evitó de manera similar mediante adición de una alanina al extremo C-terminal del péptido RPARPAR (SEC ID n.° 2) (fig. 13, panel b). La amidación del grupo carboxilo C-terminal también bloqueó la internalización de puntos cuánticos (fig. 11C, panel c). Estos hallazgos indican que la internalización ocurre en presencia de un aminoácido básico terminal con un grupo carboxilo libre. Colectivamente, el cribado de bibliotecas y los estudios de estructura-función definen el motivo CendR (R/K)XX(R/K) (SEC ID n.° 29) como inductor de la incorporación de péptidos y nanopartículas en las células PPC-1.

ii. Caracterización de la internalización de CendR

Con el fin de evaluar la conservación del mecanismo de internalización de CendR, se estudió la unión de RPARPAR (SEC ID n.° 2) y sus derivados a diferentes células diana: un panel de líneas celulares humanas en cultivo y células primarias derivadas de varios órganos de ratón normales (fig. 15). Las células tumorales de diferente origen unidas al fago RPARPAR, incluyendo células de cáncer prostático diferentes de PPC-1 (PC-3, Du-145), células de cáncer de mama (4T1) y de carcinoma pancreático (MIA PaCa-2, PDAC1.3), células de melanoma (B16F10) y células de cáncer humano MDA-MB-435. También se observó la unión de fago CendR en células endoteliales vasculares murinas (F2) y en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC, por sus siglas en inglés). Una excepción fueron las células de melanoma M21, que no se unieron al fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) más que al fago de control. Las células primarias derivadas de un panel de órganos de ratón normal también se unieron al fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) (fig.

15B). De acuerdo con la unión promiscua, el fago con RPARPAR inyectado por vía intravenosa se acumuló fuertemente en los lechos vasculares encontrados inicialmente: en los pulmones y, en menor grado, el corazón (fig.

15C). En los pulmones, se observó inmunorreactividad fágica en todo el tejido para el fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) (fig. 15D, panel d) y no para el fago control (fig. 15D, panel e), lo que indica que el fago CendR no solo se unió y resultó internalizado por las células que revisten los vasos, sino que también fue capaz de penetrar en el parenquima del tejido. De esta manera, el péptido RPARPAR (SEC ID n.° 2) es un péptido internalizante que es capaz de entrar en diversos tipos celulares y que, además, puede estimular la penetración en tejidos.

La unión del fago con RPARPAR (SEC ID n.° 2) a las células a 4 °C fue rápido, alcanzando una meseta en 20 minutos (fig. 16A). A 37 °C, el fagO RPARPAR (SEC ID n.° 2) y los puntos cuánticos mostraron una asociación a la membrana plasmática en 15 minutos y acumulación perinuclear en 1 hora después de la adición de las células (fig. 16B, paneles b y c). Dicha internalización de puntos cuánticos se observó en células vivas, no fijadas, excluyendo que la acumulación intracelular se debiese a un artefacto del procesamiento (fig. 16B, paneles b y c).

También se estudió un panel de inhibidores de diversas rutas de endocitosis: incorporación dependiente de clatrina (cloropromazina), endocitosis caveolar (genisteína, nistatina) y macropinocitosis [5-(N-etil-N-isopropil)amilorida y wortmanina]. Ninguno de dichos inhibidores afectó a la incorporación de los péptidos CendR (fig. 17A). De manera similar, la cotinción del fago RPARPAR internalizado (SEC ID n.° 2) con un panel de marcadores de compartimiento subcelular no mostró ningún solapamiento claro en el patrón de tinción (fig. 17B). Resulta interesante que se produjo un solapamiento significativo en la distribución de la inmunorreactividad del fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) y la subunidad B de toxina del cólera marcada (fig. 17C). Aunque la ruta de endocitosis de la subunidad B de la toxina del cólera todavía no ha sido definida, sí indicaba que era independiente de la dinamina y que implicaba mecanismos tanto dependientes como independientes de clatrina (Torgersen M. et al., 2001).

iii. La internalización de CendR es independiente de NRP-1

El tratamiento con tripsina de las células PPC-1 antes de la unión resultó en una menor unión de las partículas fágicas RPARPAR (SEC ID n.° 2) (datos no mostrados), señalando a la participación de una proteína de superficie celular en la unión e internalización de RPARPAR (SEC ID n.° 2). La interacción con los glucosaminoglicanos de superficie celular participa en la internalización de la PPC catiónica (Tyagi M. et al., 2001, Sandgren, S. et al. 2002). Sin embargo, la digestión enzimática (heparinasa III y condroitinasa ABC) y la competición con heparina y condroitín sulfato no presentó ningún efecto sobre la unión del fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) a las células PPC-1 (datos no mostrados). Con el fin de identificar otras proteínas de interacción con RPARPAR (SEC ID n.° 2), se inmovilizaron sobre perlas de agarosa extractos de xenoinjerto tumoral PPC-1 fraccionado, mediante cromatografía de afinidad del péptido RPARPAR (SEC ID n.° 2). La elución con un tampón que contenía péptido RPARPAR libre (SEC ID n.° 2) liberó una proteína de 130 kDa identificada mediante espectroscopía de masas MALDI-TOF como NRP-1 (fig 18A)

Varias líneas de evidencia apoyan el papel de NRP-1 como el receptor CendR: Las células de melanoma M21, que no se unen a RPARPAR (SEC ID n.° 2) ni lo internalizan, expresaban cantidades traza de NRP-1. La expresión forzada de NRP-1 causó que dichas células fuesen capaces de unirse e internalizar RPARPAR (SEC ID n.° 2) (y no el fago RPARPARA (SEC ID n.° 3)) (fig. 18C, paneles e y f), mientras que las células transfectadas con un mutante de bolsillo de unión de NRP-1 (Vander Kooi C.W. et al., 2007) no confieren unión a RPARPAR (SEC ID n.° 2) (fig. 18B). Finalmente, la cotinción inmunofluorescente mostró que el fago RPARPAR (SEC ID n.° 2) y los puntos cuánticos se colocalizan con NRP-1 en la superficie celular y dentro de las células (fig. 18C, paneles c-e).

VEGF-165 se une a NRP-1 utilizando su secuencia similar a CendR C-terminal codificada por el exón 8 (CRCDKPRR (SEC ID n.° 30)) (Jia H. et al., 2006, Soker, S. et al. 1998). Varios otros péptidos, tales como A7R (ATWLPPR (SEC ID n.° 31)) (Starzec, A. et al. 2006), el péptido inmunomodulador tuftsina (t Kp R (SEC ID n.° 32)) y su variante tuftsina mejorada (Tk PPR (SEC ID n.° 33)) (von Wronski, M. A. et al. 2006) se unen al mismo sitio en Nr P-1 (Geretti, E et al.

2008). Los fagos T7 que exponían siente aminoácidos C-terminales de VEGF-165, tuftsina mejorada o A7R fueron incorporados por las células PPC-1, y la unión e internalización fue reducida al incluir RPARPAR (SEC ID n.° 2) no marcado en el tampón de unión o añadir un residuo de alanina al extremo C-terminal de VEGF-C7 (fig. 19). Estos estudios muestran que los péptidos CendR resultaron internalizados mediante una ruta que implica NRP-1 como componente crítico.

iv. Activación de un motivo CendR críptico mediante proteolisis

Una consecuencia prometedora de la regla de extremo C es la posibilidad de diseñar racionalmente péptidos internalizantes activados proteolíticamente (pro-C₆ndR). Tal como se ha mostrado anteriormente, el tratamiento del fago RP ARP ARA (SEC ID n.° 3) con tripsina incrementó la unión del fago a las células en más de 100 veces (fig. 14), indicando que puede utilizarse la proteolisis para desenmascarar los elementos CendR latentes. El degradoma humano contiene más de 550 proteasas (Puente X.S. et al., 2003), muchas de las cuales exponen los residuos C-terminales de arginina y lisina, y lo hacen en el contexto de una secuencia diana altamente definida. Dichas proteasas podrían utilizarse para conseguir la activación selectiva de células diana de pro-C₆ndR. El activador de tipo uroquinasa (uPA, por sus siglas en inglés) es un elemento crucial en las cascadas pericelulares de proteolisis que son importantes en el remodelado tisular durante el desarrollo y en afecciones patológicas, tales como la invasión y metástasis tumorales, la neovascularización y la inflamación (Andreasen P.A. et al., 2000, Waisman, 2003). La asociación de la actividad de uPA con los tumores, su fuerte selectividad de sustrato y su preferencia para la arginina como residuo P1, convierten a uPA en un candidato atractivo para la activación de pro-C₆ndR.

Se ha diseñado un péptido que incorpora el sitio de reconocimiento de uPA (Ke S.H. et al., 1997) y un elemento CendR latente (RPARSGRSÅGG^sV^a(SEC ID n.° 34), secuencia de CendR subrayada, fig. 20A). Los fagos que exponían péptido CendR escindible por uPA (uPa-C₆ndR) no se unían a las células PPC-1 más que el fago G7 de control; sin embargo, la unión se elevó en más de 100 veces mediante el pretratamiento con uPA antes de la unión celular (fig.

20B). Los puntos cuánticos recubiertos con RPARSGRSAGGSVA (SEC ID n.° 34) también resultaron internalizados de manera sensible a uPA (fig. 20C, paneles c-e). La exposición del fago uPA-C₆ndR a la tripsina incrementó en gran medida la unión, aunque el tratamiento del fago con colagenasa-I o trombina no tuvo ningún efecto. Aunque la trombina escinde después de un residuo básico, aparentemente no reconoció la secuencia del sustrato uPA en el péptido, mientras que la tripsina fue suficientemente promiscua para producir la escisión. Estos estudios muestran que puede desenmascararse un péptido CendR críptico y convertirlo en un péptido internalizante con proteasas. Además, puede utilizarse una proteasa con un patrón de expresión restringido para la activación específica de diana de la función internalizante de los péptidos CendR. La amilorida inhibió la incorporación (fig. 20C, panel e).

2. Comentario

Los estudios revelan una ruta de internalización celular previamente desconocida denominada CendR (fig. 21). Las características principales de CendR son: (i) motivo de reconocimiento R/KXXR/K (SEC ID n.° 23), (ii) exposición C-terminal del motivo para las actividades de unión e internalización, (iii) participación de NRP-1 en la unión e internalización, y (iv) conversión de motivos CendR crípticos en activos mediante procesamiento proteolítico.

Un grupo de péptidos de reconocimiento del corazón contiene un motivo CendR expuesto (Zhang L. et al., 2005), aunque el motivo CendR también puede ser críptico. Varios péptidos de reconocimiento tumoral con propiedades de penetración en las células contienen motivos CendR crípticos (Laakkonen P. et al., 2002b; Porkka, K. et al., 2002; Jarvinen, T. A. et al. 2007; Zhang, L. et al. 2006). Además del motivo CendR, dichos péptidos poseen una secuencia que se une a un receptor específico. Un péptido iRGD de unión a integrina descrito en (Sugahara K.N. et al., 2008) proporciona una explicación de por qué funcionan dichos péptidos; el elemento de reconocimiento específico concentra el péptido en la diana (tumor); una proteasa expone el motivo CendR y la consecuente unión de NRP-1 causa la incorporación celular del péptido (y su carga, si tiene).

Muchas de las PPC catiónicas contienen elementos CendR activos o crípticos (Langel, 2007). El dominio básico de la proteína TAT del VIH-1 con un motivo CendR inhibe la unión de VEGFA-165 a NRP-1 (Jia H. et al., 2001), aunque todavía no está claro cuál es el mecanismo de unión e incorporación de la PPC catiónica La diferencia más importante entre los péptidos PPC catiónicos y los péptidos CendR es que los PPC compuestos de D-aminoácidos son activos (Polyakov V. et al., 2000, Gammon, S. T. et al. 2003), mientras que los resultados en la presente memoria muestran que la incorporación de CendR es dependiente del reconocimiento específico de únicamente los L-péptidos. Además, muchos de los PPC pueden internalizar cargas ancladas C-terminalmente, en clara contradicción con el concepto central de CendR. Es posible que CendR sea una de entre varias rutas paralelas que podrían estar participando en la incorporación de los péptidos PPC catiónicos.

No se conoce todavía cuál es la significación fisiológica del sistema de internalización mediado por CendR, pero los elementos CendR están presentes en todo el proteoma y muchas serina y cisteína proteasas son capaces de activarlo (Barrett, Alan et al. 1998). Las proproteína convertasas y las proteasas membranales, tales como la matriptasa, podrían ser particularmente relevantes, ya que la escisión por estos enzimas expone una secuencia RXXR (SEC ID n.° 23) en el extremo C-terminal de diversas proteínas endógenas (hormonas peptídicas, factores de crecimiento, moléculas de adhesión y proteasas) (Thomas G., 2002; Uhland K., 2006). La habilitación de la función de correceptor de NRP-1, la activación de receptores y la incorporación celular de proteínas activas son posibles funciones de las secuencias de CendR fisiológicas.

Los virus y otros microorganismos aparentemente han secuestrado el mecanismo de CendR como facilitador de la infección. La escisión proteolítica de las proteínas de la cubierta vírica con exposición concomitante de los elementos CendR aparentemente es un tema recurrente en la infectividad de muchos patógenos víricos (Tabla 2).

Tabla 2. | Ejemplos de virus patogénicos humanos con elementos CendR de superficie

La escisión de las proteínas de superficie vírica por la proteasa de expresión ubicua furina es un factor contributivo importante para la expansión sistémica de varios virus, mientras que la infectividad de los virus que son sensibles a proteasas con un patrón de expresión restringido puede limitar la infección a los tejidos que expresan la proteasa apropiada. Este concepto está ejemplificado por el virus de la gripe (Steinhauer D.A. et al., 1999). Las hemaglutininas de los virus de mamífero localmente infecciosos y aviares-de la gripe avirulentos son escindidas en un único residuo de arginina; dicha escisión está restringida a tipos celulares limitados, tales como los de los tractos respiratorio y alimentario. En contraste, los virus aviares-de la gripe virulentos que causan infección sistémica resultan activados por la furina, exponiendo un elemento CendR polibásico. En la presente memoria se indica que la inhibición de la internalización mediada por CendR y penetración en los tejidos de los patógenos y sus productos puede proporcionar una nueva manera de combatir las enfermedades infecciosas.

La tecnología de CendR podría tener muchas otras aplicaciones biotecnológicas, por ejemplo, mejoras en el transporte de nanopartículas específicas de tipo celular. Las nanopartículas recubiertas con péptidos CendR preexpuestos serían incorporadas en los primeros lechos vasculares con los que se encuentren las partículas (corazón y pulmones, tras la inyección intravenosa de fagos con RPARPAR (SEC ID n.° 2)). Tal como muestran Sugahara et al., 2008, las secuencias de CendR crípticas podrían resultar útiles en el transporte de cargas hasta los tejidos periféricos. El plasma sanguíneo contiene concentraciones elevadas de inhibidores de proteasa generales (p. ej., la macroglobulina alfa-2) y específicos de enzima (p. ej., antiplasma alfa-2 y antitrombina). Lo anterior probablemente proporciona protección frente a la activación prematura de CendR en la sangre. Las proteasas activadas habitualmente están confinadas a la zona pericelular inmediata. Estas proteasas pueden activar péptidos CendR crípticos sobre las nanopartículas que han alcanzado un tejido diana mediante acumulación pasiva o mediante el transporte mediado por péptido de reconocimiento. Las proteasas específicas de tejido capaces de desenmascarar una secuencia de CendR críptica pueden potenciar adicionalmente la selectividad diana in vivo. La incorporación celular mediada por el elemento CendR activado proporciona un mecanismo para que el péptido procesado y su carga se acumulen en el tejido o célula diana. Otra importante conclusión de los estudios es que los elementos CendR podrían estimular la extensión de las nanopartículas en los tejidos, y que la internalización selectiva mediada por CendR y la penetración en tejidos pueden conseguirse mediante la combinación de elementos de reconocimiento CendR basados en acoplamiento y sensibles a proteasas. El péptido iRGD descrito en el informe adjunto (Sugahara et al., 2008) y posiblemente otros péptidos de reconocimiento vascular internalizantes con elementos CendR crípticos comentados en dicha referencia ilustran este paradigma. También se indica que, análogamente con el fago y otras nanopartículas estudiadas, diversos agentes infecciosos podrían utilizar el sistema CendR para facilitar su extensión a través de los tejidos.

3. Métodos

Procedimientos con animales. Toda la experimentación con animales se llevó a cabo utilizando ratones BALB/c desnudos (Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, IN) siguiendo los procedimientos aprobados por el Comité de investigación con animales de la Universidad de California, Santa Barbara.

Exposición fágica. Para la exposición fágica in vivo, se inyectaron en ratones por vía intravenosa 1010 unidades formadoras de placa (ufp) de fago T7 seguido de la perfusión del sistema circulatorio y la determinación del fago unido en los órganos diana, mediante titulación. Para los estudios de unión celular en células en cultivo (exposición in itro) y suspensiones celulares derivadas de órganos (exposición ex vivo), las células se incubaron con 109 ufp de fago a 4 °C, se lavaron, se lisaron y se cuantificaron mediante titulación. Se utilizó la incubación a 37 °C, seguida de un lavado de pH bajo (glicina-HCl, pH 2,5), para evaluar la cantidad de fago internalizado.

Marcaje de puntos cuánticos. Se utilizaron péptidos biotiniados para funcionalizar los puntos cuánticos de estreptavidina-605 ITK (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Inmunofluorescencia. Se fijaron células en cultivo y secciones de tejidos con paraformaldehído tamponado al 4 % o metanol frío (-20 °C) seguido de incubaciones con anticuerpos primarios y secundarios marcados con Alexa apropiados y tinción nuclear con pigmentos de ADN DAPI u Hoechst 342.

Cromatografía de afinidad. Los tumores de PPC-1 se lisaron en PBS que contenía n-octil-beta-D-glucopiranósido 200 mM, seguido de la incubación con perlas Sulfolink recubiertas con RPARPAR (SEC ID n.° 2) (Pierce, Rockford, IL) y elusión en tampón de lisis que contenía péptido RPARPAR libre 2 mM (SEC ID n.° 2). Los fragmentos de gel recortados del gel teñido con plata de fracciones eluidas se sometieron a espectrometría de masas MALDI-TOF en el Burnham Institute for Medical Research Proteomics Resource.

Ratones y tejidos. Toda la experimentación con animales se llevó a cabo siguiendo los procedimientos aprobados por el Comité de investigación con animales de la Universidad de California, Santa Barbara. Para las inyecciones tumorales y antes del sacrificio, los ratones fueron anestesiados con inyecciones intraperitoneales de xilazina (10 mg/kg) y ketamina (50 mg/kg). Se utilizaron ratones BALB/c atímicos desnudos (Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, IN) para los xenoinjertost umorales y los experimentos de exposición fágica in vivo y ex vivo. Se generaron xenoinjertos de tumor prostátito ortotópico mediante la inyección de 106 células PPC-1 (Zhang L. et al., 2006) en el lóbulo ventral de la próstata. Para el análisis histológico, los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4 %, se crioprotegieron en solución salina tamponada con fosfato que contenía sucrosa al 30 % y se realizaron secciones de 10 |jm.

Líneas celulares. Las líneas celulares PPC-1, PC-3, Du-145, 4T1, MIA PaCa-2, PDAC1.3, B16F10, M21 y MDA-MB-435 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero de feto bovino al 10 % y penicilina/estreptomicina. Se cultivaron células endoteliales de la vena umbilical humana siguiendo las instrucciones del proveedor.

Exposición fágica. Se utilizó el sistema de exposición fágica seleccionado de T7 para la construcción de bibliotecas fágicas (diversidad de bibliotecas - 108) y la clonación de fagos individuales siguiendo las instrucciones del proveedor (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ). Los fagos se purificaron mediante precipitación con PEG-8000 (Sigma, St. Louis, MO) seguido de la ultracentrifugación en gradiente de CsCh y diálisis. Se determinaron las secuencias de los péptidos expuestos a partir de ADN codificante de la región que contenía el inserto en el extremo C-terminal de la proteína de cubierta mayor de T7, gp10.

Para los ciclos de selección por afinidad ("biopanning") y estudios de unión fágica (Hoffman J.A. et al., 2004), se dejaron crecer células en cultivo hasta la confluencia y se recolectaron con tripsina, y los órganos de ratón se disociaron utilziando Medimachine (BD Biosciences, San Jose, CA). Para medir la unión de los fagos, se incubaron 106 células en tampón de unión (DMEM que contenía BSA al 1 %) con 109 ufp/ml de fago T7 durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron 4 veces con el tampón de unión, se lisaron en medio de crecimiento bacteriano LB que contenía NP-40 al 1 % y se titularon. Los ensayos de internalización fágica utilizaron el mismo procedimiento, excepto en que las células se incubaron con el fago a 37 °C y se utilizó un tampón ácido (cloruro sódico 500 mM, glicina 0,1 M, BSA al 1 %, pH 2,5) en lugar de tampón de unión en el segundo lavado.

Se utilizó la centrifugación en una almohadilla de aceite de silicona (1,03 g/ml) para separar los fagos no unidos de las células durante experimentos de curso temporal. Se añadieron inhibidores de la unión e internalización fágicas (heparina, condroitina, enzimas de eliminación Glycocalyx, inhibidores de endocitosis, péptidos libres, puntos cuánticos y fagos inactivados por UV) a las células 20 minutos antes de la incubación con los fagos. Los inhibidores de endocitosis utilizados en el presente estudio fueron los siguientes: nistatina (50 jg/ml), genisteína (100 jg/ml), clorpromazina (5 jg/ml), 5-(N-etil-N-isopropil)amilorida (100 jM ) y wortmanina (10 jM).

Se llevaron a cabo estudios de reconocimiento fágico in vivo en ratones mediante la inyección de 1010 ufp de fago T7 en la vena de la cola y 10 minutos a 1 hora después se perfundieron los ratones con DMEM por el ventrículo izquierdo del corazón. Se recogieron los órganos de interés, se homogeneizaron en NP40 al 1 % y se cuantificaron los fagos mediante titulación.

Síntesis de péptidos y marcaje de puntos cuánticos. Se sintetizaron los péptidos utilizando química de Fmoc/t-Bu en un sintetizador automatizado de péptidos asistido por microondas (Liberty, CEM Corporation). Los péptidos se purificaron mediante HPLC utilizando TFA al 0,1 % en mezclas de acetonitrilo-agua de pureza entre 90 % y 95 % mediante HPLC y se validaron mediante análisis de espectros de masas Q-TOF.

Los puntos cuánticos de estreptavidina ITK-605 (Invitrogen, Carlsbad, CA) se funcionalizaron con péptidos biotinilados mediante incubación con un exceso molar de 100 veces de péptido, seguido de la eliminación de los péptidos libres mediante diálisis.

Cromatografía de afinidad. Se homogeneizaron tumores PPC-1 ortotópicos en PBS que contenía n-octil-beta-D-glucopiranósido 400 mM, MgSO⁴1 mM, MnCh 1 mM, CaCh 1 mM y 1 tableta/5 ml de cóctel de inhibidores de proteasa libre de EDTA ((Sigma, St. Louis, MO). Tras 6 horas de extracción en una plataforma giratoria a 4 °C, se clarificó el lisado mediante centrifugación (20 minutos a 14.000 rpm en microcentrífuga refrigerada) y se cargó en una columna de afinidad preparada mediante acoplamiento con gel de acoplamiento Sulfolink del péptido RPARPAR etiquetado con cisteínas (SEC ID n.° 2) siguiendo las instrucciones del fabricante (Pierce, Rockford, IL). Tras la unión durante la noche, se lavó la columna con un tampón de lavado de columnas que contenía n-octil-beta-D-glucopiranósido 200 mM, aunque de otro modo idéntico al tampón de lisis, seguido de la elución con péptido RPARPAR libre 2 mM en el mismo tampón.

Se separaron muestras de las fracciones de lavado y de elución utilizando geles de poliacrilamida Tris al 4-20 %-glicina Novex (Invitrogen, Carlsbad, CA), se tiñeron con plata utilizando el kit Silver Snap (Pierce, Rockford, IL) y se sometieron a espectrometría de masas MALDI-TOF en el Burnham Institute for Medical Research Proteomics Facility.

Las muestras de cromatografía de afinidad se inmunotransfirieron se sondearon con anticuerpos, seguido de la detección quimioluminiscente de la unión.

Tinción de inmunofluorescencia. Las células en cultivo (2x105 células) se cultivaron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos en cubreobjetos recubiertos con colágeno I (BD Biosciences, San Jose, CA) durante la noche a 37 °C en 5 % de CO²y se incubaron con 108 ufp de fago T7. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % o metanol frío ( 20 °C) y se tiñeron con anticuerpos. Los núcleos se tiñeron con DAPI u Hoechst 542. Se generó un anticuerpo policlonal de conejo anti-T7 en el propio laboratorio tal como se ha indicado anteriormente (Laakkonen P. et al., 2002b) excepto en que se incluyó una etapa adicional de purificación del fago utilizando la centrifugación en CsCh. Otros anticuerpos primarios utilizados fueron anticuerpo monoclonal de rata anti-CD31 de ratón (BD Biosciences), anticuerpo de conejo anti-NRP-1, anticuerpos de ratón anti-Lamp-1 humano, anticuerpo de ratón anti-caveolina humana (Millipore, Temecula, CA), anticuerpo de ratón anti-NRP-1 (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA), anticuerpo de ratón anti-EEA-1 humano (BD Biosciences, San Jose, CA). Los anticuerpos secundarios, los anticuerpos de cabra Alexa594 de inmunoglobulinas de ratón, ratón y conejo y el anticuerpo de burro anticonejo Alexa488 eran de Invitrogen (Carlsbad, CA). Se examinaron las células y secciones de tejidos mediante microscopía confocal (Fluoview 500, Olympus America Inc., Center Valley, PA).

Constructos de ADN y transfección. El constructo de expresión del ADNc de NRP-1 de tipo salvaje en pcDNA3.1(+) fue proporcionado por el Dr. Michael Klagsbrun. Se utilizó la mutagénesis dirigida a sitio para generar la triple mutación del sitio de unión de VEGF-165 en el dominio b1 de NRP-1 (S346A-E348A-349A) mediante la sustitución de TCAAAAGAAACC (SEC ID n.° 48) (codificante de los aminoácidos SKET) por GCTAAAGCTGCT (SEC ID n.° 49) (codificante de AKAA).

Se transfectaron transitoriamente células de melanoma M21 con dichos constructos mediante la utilización de lipofectamina siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Tratamiento de proteasa de fagos y puntos cuánticos. Se trataron 109 partículas fágicas o 50 μl fagos de puntos cuánticos recubiertos con péptido con 50 UI de uPA, 25 μg de tripsina cristalina, 50 UI de trombina o 25 μg de colagenasa de tipo I (todos de Sigma, St. Louis, Mo).

Análisis estadístico. Los datos se analizaron mediante pruebas t de Student y análisis unidireccional de la varianza (ANOVA, por sus siglas en inglés), seguido de las pruebas posthoc adecuadas (Tabla 3).

Tabla 3 | Significancias estadísticas f

Referencias

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Debe señalarse que, tal como se utiliza en la presente especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un” y “una” o “el” y “la” incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a “un péptido” incluye una pluralidad de tales péptidos; la referencia a "el péptido" constituye una referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos conocidos por el experto en la materia, y de esta manera sucesivamente.

El término "opcional", u "opcionalmente", se refiere a que el evento, circunstancia o material indicado seguidamente puede no ocurrir o estar presente, y que la descripción incluye casos en que dicho evento, circunstancia o material ocurre o está presente y casos en que no ocurre o no está presente.

Los intervalos pueden expresarse en la presente memoria como entre "aproximadamente" un valor particular y/o "aproximadamente" otro valor particular. En el caso de que se exprese un intervalo de esta manera, también se contempla específicamente y se considera dado a conocer el intervalo entre un valor particular y/o el otro valor particular, a menos que el contexto indique específicamente lo contrario. De manera similar, en el caso de que se expresen valores en forma de aproximaciones, mediante la utilización del antecedente "aproximadamente" se entenderá que el valor particular forma otra realización contemplada específicamente que debe considerarse dada a conocer, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se entenderá, además, que los extremos de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro extremo como independientemente del otro extremo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Finalmente, debe entenderse que todos los valores individuales y subintervalos de valores contenidos dentro de un intervalo explícitamente dado a conocer también se encuentran contemplados específicamente y deben considerarse dados a conocer, a menos que el contexto indique específicamente lo contrario. Lo anteriormente expuesto es de aplicación con independencia de si en casos particulares algunas o la totalidad de dichas realizaciones se han dado a conocer explícitamente.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente memoria tienen el mismo significado según entienda comúnmente el experto en la materia a la que se refiere el método y composiciones dados a conocer. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los indicados en la presente memoria pueden utilizarse en la práctica o ensayo del presente método y composiciones, los métodos, dispositivos y materiales particularmente útiles son los indicados. No se hace ninguna admisión de que ninguna referencia constituya técnica anterior. El comentario de las referencias indica que sus autores declaran, y los solicitantes se reservan el derecho a impugnar la exactitud y pertinencia de los documentos citados. Se entenderá claramente que, aunque se hace referencia a varias publicaciones en la presente memoria, dicha referencia no constituye una admisión de que ninguno de dichos documentos forma parte de los conocimientos generales habituales de la técnica.

A lo largo de toda la descripción y reivindicaciones de la presente especificación, el término "comprende" y variaciones del término, tales como "comprendiendo" y "que comprende" se refieren a "que incluye, aunque sin limitación", y no pretenden excluir, por ejemplo, otros aditivos, componentes, números enteros o etapas.

Se entiende que el método y composiciones dados a conocer no se encuentran limitados a la metodología, protocolos y reactivos particulares indicados, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y que no pretende ser limitativa del alcance de la presente invención, que se encontrará limitada exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de formación de un conjugado de CendR, en el que el método comprende:

(a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la intemalización en una célula, penetración en los tejidos o ambos, en la que la secuencia de aminoácidos comprende:

(i) un elemento CendR, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28), en el que el elemento CendR se encuentra en un extremo C-terminal del conjugado y presenta un grupo carboxilo C-terminal, o (ii) un elemento CendR activable que comprende un elemento CendR y un grupo de bloqueo, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28) y

(b) causar que una composición de carga se acople covalentemente o se asocie no covalentemente a una proteína o péptido, preferentemente a una proteína o péptido circular, que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada, en la que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR,

2. El método según la reivindicación 1, en el que la proteína o péptido de la etapa (b) puede internalizarse en la célula y/o puede penetrar en el tejido en el caso de que la secuencia de aminoácidos seleccionada de la etapa (a) se encuentre presente en la proteína o péptido, pero no en el caso de que el aminoácido seleccionado no se encuentre presente en la proteína o péptido.

3. El método según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos seleccionada de la etapa (a) es el único elemento de internalización funcional en la proteína o péptido de la etapa (b), preferentemente en el conjugado de CendR.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composición de carga de la etapa (b) es un agente antiangiogénico, un agente proangiogénico, una nanopartícula, un agente quimioterapéutico del cáncer, un agente citotóxico, un agente antiinflamatorio o un agente antiartrítico, en el que la composición de carga de la etapa (b) preferentemente comprende una secuencia de reconocimiento, más preferentemente la composición de carga reconoce selectivamente un tumor, más preferentemente la vasculatura tumoral.

5. Un conjugado de CendR preparado mediante el método según las reivindicaciones 1 a 4, en el que el método comprende:

6. Un método in vitro de identificación de una célula, preferentemente en un ensayo, que pueda internalizar un elemento CendR, en el que el método comprende:

(ii) un elemento CendR activable que comprende un elemento CendR y un grupo de bloqueo, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28),

(b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado,

7. El método según la reivindicación 6, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR activable, preferentemente el elemento CendR activable se activa antes de la exposición a la célula.

8. Un método in vitro de identificación de una célula de cáncer, preferentemente en un ensayo, como candidato para la terapia a base de CendR, en el que el método comprende:

(b) determinar si el elemento CendR ha sido internalizado por la célula de cáncer, en la que un elemento CendR internalizado identifica la célula de cáncer como candidato para la terapia a base de CendR, en el que el elemento CendR activable se forma mediante acoplamiento covalente del grupo de bloqueo con el elemento CendR mediante un enlace escindible,

9. El método según la reivindicaión 8, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR activable.

10. Un método para producir un elemento CendR activable que puede activarse en proximidad a una célula de interés, preferentemente una célula en un sujeto, en el que el método comprende formar un elemento CendR activable en el que se acopla un grupo bloqueante con un elemento CendR mediante un enlace escindible, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28), y

11. El método según la reivindicación 10, en el que el enlace escindible se selecciona para que sea escindible por un enzima presente en proximidad a la célula de interés mediante, previamente a la formación del elemento CendR activable, identificación del enzima que está presente en proximidad a la célula de interés, y se selecciona el enlace escindible basándose en el enzima que está presente en proximidad a la célula de interés.

12. Un método de formación de un elemento CendR activable, en el que el método comprende:

(a) seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula, la penetración en tejidos, o ambos, en la que la secuencia comprende la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), R₉ERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28),

en el que la escisión del enlace del elemento CendR activable expone la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28) en el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos,

en el que la escisión del enlace hace que la secuencia de aminoácidos sea capaz de internalización en una célula.

13. El método según la reivindicación 12, que comprende, además, antes de la etapa (b), seleccionar el enlace que acopla el grupo de bloqueo con el grupo carboxilo terminal para que sea escindible por una proteasa presente en proximidad a la célula de interés.

14. El método según la reivindicación 12 o 13, en el que se acopla una composición de carga covalentemente o se asocia no covalentemente a una proteína o péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada, en el que la composición de carga se acopla o se asocia a la proteína o péptido en el lado N-terminal del elemento CendR.

15. El método según la reivindicación 13, en el que la proteasa se selecciona del grupo que consiste en serina proteasas, proproteína convertasas, furinas, carboxipeptidasas, clostripaína enteroquinasa, factor Xa, proteasa Lys-C, trombina y tripsina.

16. Un elemento CendR activable preparado mediante el método según las reivindicaciones 12 a 15, en el que el método comprende seleccionar una secuencia de aminoácidos para la internalización en una célula, la penetración en tejidos, o ambos, en el que la secuencia de aminoácidos comprende un elemento CendR, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28), en la que el elemento CendR se encuentra en el extremo C-terminal del conjugado y presenta un grupo carboxilo C-terminal.

17. Un método in vitro de identificación de un tejido en el que puede penetrar un elemento CendR, en el que el método comprende:

(ii) un elemento CendR activable que comprende un elemento CendR y un grupo de bloqueo, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n.° 27), o RVTRPPR (SEC ID n.° 28) y

(b) determinar si el elemento CendR ha penetrado en el tejido,

18. Un método in vitro de identificación de un tumor como candidato para una terapia a base de CendR, en el que el método comprende:

(i) un elemento CendR, en el que el elemento CendR presenta la secuencia RPARPAR (SEC ID n.° 2), RGERPPR (SEC ID n° 27) o RVTRPPR (SEC ID n° 28) en la que el elemento CendR se encuentra en un extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos y presenta un grupo carboxilo C-terminal, o