ES2319624T3

ES2319624T3 - Peptidos que se dirigen al conjunto de vasos linfaticos del tumor y procedimientos de utilizacion de los mismos.

Info

Publication number: ES2319624T3
Application number: ES02795599T
Authority: ES
Inventors: Pirjo Laakkonen; Kimmo Porkka; Jason A. Hoffman; Erkki Ruoslahti
Original assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Current assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Priority date: 2001-11-08
Filing date: 2002-11-05
Publication date: 2009-05-11
Anticipated expiration: 2022-11-05
Also published as: DE60230822D1; AU2002360350A1; EP1581790B1; EP1581790A4; AU2002360350A8; WO2003040693A3; JP2005514348A; WO2003040693A2; ATE419861T1; EP1581790A2

Abstract

Péptido aislado, que comprende la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2).

Description

Péptidos que se dirigen al conjunto de vasos linfáticos del tumor y procedimientos de utilización de los mismos.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a los campos de la medicina molecular y de administración de fármacos y, más en particular, a moléculas que se dirigen selectivamente al conjunto de vasos linfáticos de tumores específicos.

Información sobre los antecedentes

La metástasis, difusión del cáncer desde un punto primario a un punto secundario con frecuencia en otro órgano, contribuye de manera significativa a la mortalidad de pacientes de cáncer. La metástasis se produce generalmente, por ejemplo, en el cáncer de mama y en las etapas media y última del cáncer de hueso. Muy a menudo, es necesaria la quimioterapia generalizada para gobernar la metástasis del cáncer o para disminuir la probabilidad de que se produzca la metástasis. Sin embargo, pueden producirse efectos secundarios indeseables tales como náuseas, vómitos, neuropatía, pérdida y caída del cabello graves en el recuento de células sanguíneas en el tratamiento generalizado con un agente quimioterapéutico y de manera significativa el impacto de la calidad de vida del paciente. Además, dichos efectos secundarios indeseables con frecuencia limitan la cantidad de un tratamiento que puede administrarse de manera segura, reduciendo de este modo los índices de supervivencia de pacientes con cáncer.

Los cánceres se metastatizan a través del conjunto de vasos del tumor, que es variado tanto en sus composiciones celulares como moleculares, que presentan variación en el tipo de células que recubren los recipientes, como en su complemento de receptores de la superficie de la célula. Los vasos sanguíneos son un tipo de conjunto de vasos del tumor y los vasos sanguíneos arquetípicos están recubiertos completamente con células endoteliales. Los vasos sanguíneos del tumor también pueden estar en mosaico o recubiertas con células endoteliales y tumorales, mientras que otros vasos están formados enteramente por células tumorales. Los vasos linfáticos, que también se producen en varios tipos de tumor, son un segundo tipo de vasos tumorales. El conjunto de vasos linfáticos es una vía importante para la difusión del cáncer y los experimentos con animales han demostrado una correlación positiva entre la metástasis y el número de vasos linfáticos en y en torno a un tumor.

A la vista de los efectos secundarios indeseables que limitan la quimioterapia generalizada convencional diseñada para reducir o prevenir la metástasis, hay necesidad de moléculas que hagan diana selectivamente en el conjunto de vasos linfáticos del tumor y que sean adecuadas, por ejemplo, para agentes que se dirigen selectivamente a extirpar los vasos linfáticos del tumor, reduciendo de este modo el riesgo de metástasis tumoral. El documento WO 00/42973 da a conocer un conjugado proapóptico que comprende un péptido microbiano y un péptido que presenta la secuencia de aminoácidos CNGRC, NGRAHA o CNGRCVSGCARGC que se dirige al sistema vascular angiógeno.

La presente invención satisface dicha necesidad proporcionando además moléculas que se dirigen de manera selectiva en los vasos linfáticos del tumor, por ejemplo, para el cáncer de mama y el conjunto de vasos linfáticos del osteosarcoma. Se proporcionan también ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un péptido aislado que contiene la secuencia de aminoácidos GNKRTRG
(SEC. ID. nº: 2). La invención proporciona además un péptido aislado que contiene la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). Un péptido de la invención puede ser, por ejemplo, cíclico o si no limitado por la configuración y puede tener varias longitudes, por ejemplo, una longitud inferior a 100 restos, una longitud inferior a 50 restos, una longitud inferior a 20 restos o una longitud inferior a 15 restos.

La presente invención proporciona asimismo un conjugado que contiene un fragmento unido a una molécula que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor en el que dicha molécula autodirigida comprende un péptido tal como se definió anteriormente. En una forma de realización, el conjugado contiene una molécula que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor aparte de al conjunto de vasos sanguíneos del melanoma.

En una forma de realización, la parte del péptido del conjugado tiene una longitud de como máximo 200 restos. En otra forma de realización, la porción de péptido del conjugado tiene una longitud de por lo menos 50 restos.

Una molécula autodirigida útil en un conjugado de la invención es, un péptido autodirigido o que contiene la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). Si se desea dicho péptido puede ser cíclico o si no limitado por la configuración. Una molécula autodirigida útil en un conjugado de la invención también puede ser, por ejemplo, un péptido autodirigido que contiene la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). En las formas de realización específicas dicho péptido autodirigido es cíclico o si no limitado por la configuración. Una variedad de fragmentos es útil en un conjugado de la invención incluyendo, sin limitación, agentes terapéuticos, agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, agentes citotóxicos, agentes anti-linfangiógenos, marcadores detectables y
fago.

Si se desea, un conjugado de la invención puede contener muchas moléculas autodirigidas como se describió anteriormente, cada una de las cuales se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor. En una forma de realización, un conjugado de la invención contiene por lo menos dos moléculas autodirigidas que cada una se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor. En formas de realización adicionales, un conjugado de la invención contiene por lo menos 10 moléculas autodirigidas, o por lo menos 100 moléculas autodirigidas, que cada una se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor. En otra forma de realización, la invención proporciona un conjugado que contiene un fago unido a por lo menos 100 moléculas autodirigidas, cada una de las cuales se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor. En una forma de realización adicional, la invención proporciona un conjugado en el que un fago u otra partícula que se una a por lo menos 100, 200, 300, 400 ó 500 moléculas idénticas o diferentes autodirigidas cada una de las cuales se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor.

Un conjugado de la invención puede contener, por ejemplo, un fragmento unido a por lo menos dos moléculas autodirigidas, cada una de las cuales se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos tumorales y que cada una independientemente incluye la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2).

En una forma de realización adicional, la invención proporciona un conjugado que contiene un fragmento unido por lo menos a diez moléculas que se dirigen que cada una se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor y que cada una independientemente incluye la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). Aún en otra forma de realización, la invención proporciona un conjugado que contiene un fragmento unido a por lo menos 100 moléculas que se dirigen que cada una se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor y que cada una incluye independientemente la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). Los grupos útiles en un conjugado de la invención que contienen múltiples moléculas que se dirigen incluyen, pero no están limitadas a, fragmentos de fago.

La presente invención proporciona asimismo un procedimiento para dirigir un fragmento al conjunto de restos linfáticos del tumor en un individuo administrando al individuo un conjugado que contiene un fragmento unido a una molécula autodirigida como se describió anteriormente, que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor, dirigiendo de este modo el fragmento en el conjunto de vasos linfáticos del tumor. Una variedad de fragmentos son útiles en un procedimiento de la invención incluyendo, por ejemplo, agentes terapéuticos, agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, agentes citotóxicos, agentes antilinfangiógenos, marcadores detectables y
fagos.

La presente invención proporciona asimismo un procedimiento de vasculatura linfática del tumor por detección por imagen en un individuo administrando al individuo un conjugado que contiene un marcador detectable unido a una molécula autodirigida como se describió anteriormente, que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor, y que detecta el conjugado, detectando por imagen de este modo el conjunto de vasos linfáticos tumorales. Un marcador detectable útil en un procedimiento de diagnóstico por imagen de la invención puede ser, por ejemplo, un radionúclido o una molécula fluorescente. Ejemplos de radionúclidos útiles como marcadores detectables incluyen, pero no se limitan a, indio-111, tecnecio-99, carbono-11 y carbono-13.

La invención proporciona asimismo un procedimiento de reducir o inhibir la metástasis tumoral en un individuo administrando al individuo un conjugado que contiene un fragmento unido a una molécula autodirigida como se describió anteriormente, que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor, reduciendo de este modo o inhibiendo la metástasis del tumor.

Una variedad de fragmentos son útiles en un procedimiento de la invención para reducir o inhibir la metástasis tumoral. Dichos fragmentos incluyen, sin limitación, agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, agentes citotóxicos y agente antilinfangiógenos.

La presente invención proporciona además un procedimiento para reducir el número de vasos linfáticos tumorales en un individuo administrando al individuo un conjugado que contiene un fragmento unido a una molécula autodirigida como se describió anteriormente, que se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor, reduciendo de este modo el número de vasos linfáticos del tumor en el paciente. Una variedad de restos puede ser útil en un procedimiento de la invención para reducir el número de vasos linfáticos del tumor incluyendo, sin limitación, agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, agentes citotóxicos y agentes antilinfangiógenos.

La presente invención proporciona además un procedimiento para tratar el cáncer en un individuo administrando al individuo un conjugado que contiene un fragmento unido a una molécula autodirigida como se describió anteriormente que se dirige de manera selectiva con el conjunto de vasos linfáticos tumorales. Una variedad de fragmentos pueden ser útiles en un procedimiento de la invención para tratar el cáncer en un individuo incluyendo, pero sin limitarse a, agente quimioterapéuticos contra el cáncer, agentes citotóxicos y agentes antilinfangiógenos.

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Breve descripción de los dibujos

La presente patente o presentación de aplicación contiene por lo menos una fotografía en color. Las copias de esta patente o publicación de la aplicación de la patente con las fotografías en color son proporcionadas por la Patent & Trademark Office en solicitud y pago de los derechos necesarios.

La Figura 1 presenta una fijación ex vivo y dirección a la diana in vivo del fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). (A) Unión del fago T7 recombinante que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1), CGEKRTRGC (SEC. ID. nº: 3) o CGNKRTRGV (SEC. ID. nº: 4) a las suspensiones de células tumorales de carcionoma de mama MDA-MB-435 primario preparadas a partir de 435 xenotrasplantes de carcinoma de mama. (B) Correlación de la unión ex vivo del fago que presenta a CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) con el número de copias de péptido presentadas. (C) Dirección a la diana in vivo del fago con CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) al carcinoma de mama MDA-MB-435 y xenotrasplantes de osteosarcoma KRIB. (D) Dirección a la diana in vivo para tejidos normales (tejido normal de riñón, pulmón, bazo, piel o mama). (E) Interiorización del fago con CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) por células del tumor de carcinoma de mama MDA-MB-435.

La Figura 2 presenta la interiorización in vitro y la localización nuclear del péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) conjugado con fluoresceína en células 435. (A) CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) conjugado con fluoresceína (verde). Los núcleos se observan por tinción con DAPI (azul). (B) Péptido de referencia conjugado con fluoresceína.

La Figura 3 presenta la localización del péptido fluorescente CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) en tumores después de la inyección intravenosa. (A-C) Tinción del péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) fluorescente (verde). (D-F) Tinción de lectina de tomate detectada con Alexa 594 conjugada con estreptavidina (rojo). (G-I) Péptido y tinción del vaso sanguíneo presente en el mismo campo microscópico.

La Figura 4 presenta la distinta localización de los marcadores de vasos linfáticos y de los marcadores de vasos sanguíneos. Los vasos linfáticos se observan en secciones de tumor 435 utilizando anti-LYVE1 de conejo y Alexa 594 anti-conejo de cabra y aparece de rojo en las fotomicrografías. Los vasos sanguíneos se marcaron con lectina de tomate conjugada con fluoresceína y aparecen deverdes en las fotomicrografías.

La Figura 5 muestra la localización conjunta del péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) conjugado con fluoresceína con los marcadores linfáticos VEGFR-3 y LYVE-1. CGNKRTRGC conjugado con fluoresceína (A,C,E) (SEC. ID. nº: 1; verde) y el marcador linfático VEGFR-3 (rojo). (G) CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1; verde) conjugado con fluoresceína y el marcador linfático LYVE-1 (rojo). (B, D, F, H) SEC. ID. nº: 1 conjugada con fluoresceína (verde) y tinción nuclear con DAPI (azul).

La Figura 6 presenta la dirección a la diana del fago con CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) a tumores de xenotrasplante MDA-MB-435 o al cerebro después de la inyección intravenosa o subcutánea.

La Figura 7 presenta las células MDA-MB-435 incubadas con CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) o con el péptido de referencia (CGEKRTRGC; SEC. ID. nº: 3). Después de la tinción con azul de tripano, se hizo el recuento del número total de células y se determinó el porcentaje de células teñidos con azul de tripano.

La Figura 8 muestra el efecto de la inyección del péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) sobre el crecimiento de xenotrasplantes de carcinoma de mama humano MDA-MB-435 in vivo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere, en parte, al descubrimiento de moléculas que dirigen a la diana de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor, por ejemplo, el conjunto de vasos linfáticos de los tumores de cáncer de mama y osteosarcomas, preferentemente al conjunto de vasos linfáticos normales. Una molécula autodirigida de la invención puede también dirigirse a la diana de manera selectiva, por ejemplo, al conjunto de vasos linfáticos de carcinomas escamosos. Como se da a conocer en la presente memoria, el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) fue identificado por una combinación de la selección ex vivo e in vivo como dirigiéndose a la diana de manera selectiva a los vasos linfáticos de varios tumores preferentemente a los vasos linfáticos de varios tejidos normales. Como se muestra en la Figura 1A, aproximadamente se unen 5.000 veces más fagos que presentan CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) que el fago T7 de referencia no recombinante a suspensiones de células de tumor preparadas a partir de xenotrasplantes de tumor de mama MDA-MB-435. El fago con CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) se unen también a las suspensiones de células de tumor preparadas a partir de xenotrasplantes de osteosarcoma humano KRIB pero no a células de melanoma C8161 o de leucemia humana HL-60 (véase el Ejemplo I).

Como se da a conocer con más detalle en la presente memoria en el Ejemplo 2, el fago con CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) que se dirige selectivamente al tumor de mama MDA-MB-435 y a los osteosarcomas KRIB in vivo. Como se muestra en la Figura 1C, el valor medio del fago del fago que presenta a CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) fue aproximadamente 60 veces mayor que el del fago no recombinante recuperado de los tumores de mama 435 y fue 15 veces mayor que el del fago T7 de referencia no recombinante recuperado de osteosarcomas KRIB. Además, el fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) no se dirigió a la diana en los tumores obtenidos con una estirpe celular de melanoma (C8161) o de leucemia (HL-60), o a una variedad de tejidos normales incluyendo los de riñón, pulmón, bazo y piel y presentaban afinidad mínima para el tejido de mama normal (véase las Figuras 1C y 1D).

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Como se demuestra en el Ejemplo 3, el péptido autodirigido, SEC. ID. nº: 1, fue interiorizado por las células. En particular, después de la inyección del fago con SEC. ID. nº: 1 en la vena de la cola de un ratón que lleva un xenotrasplante de tumor de mama MDA-MB-435, diez a veinte veces más de fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) se recuperaron de las muestras de tumor tratadas con detergente NP-40, que lisa las células, que las de las muestras sin tratar, lo que indica que el fago que lleva la SEC. ID. nº: 1 ha sido interiorizado (véase la Figura 1E). La interiorización del fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) fue confirmada por la interiorización del péptido SEC. ID. nº: 1 marcado con fluoresceína en células 435 cultivadas, lo que indica que las células de tumor comparten el receptor para el péptido de SEC. ID. nº: 1 con las células linfáticas del vaso. Como se muestra en las Figuras 2A y B, la SEC. ID. nº: 1 conjugada con fluoresceína fue interiorizada y trasladada al núcleo de células 435, mientras que no existía interiorización detectable de un péptido de referencia, que, como la SEC. ID. nº: 1, contenía tres restos básicos. Además, la SEC. ID. nº: 1 conjugada con fluoresceína también estaba interiorizada y transportada dentro de los núcleos in vivo como se muestra en la Figura 5.

Como se da a conocer con más detalle en la presente memoria, en la inyección en la vena de la cola de ratones lampiños que llevan un tumor de mama MDA-MB-435, tanto el fago que presenta la CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) como el péptido con la SEC. ID. nº: 1 conjugado con fluoresceína localizado en estructuras similares a las de los vasos y algunas células individuales dentro del xenotrasplante de cáncer de mama (véase el Ejemplo 4). Los vasos en los que el fago o el péptido conjugado con fluoresceína localizado eran negativos para los marcadores CD31 y Meca-32, que son expresados por las células endoteliales de los vasos sanguíneos con preferencia a las células endoteliales linfáticas, lo que indica que las estructuras similares a las de los vasos dirigidas por el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) no eran vasos sanguíneos. Como se da a conocer con más detalle en la presente memoria en la Figura 5, el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) conjugado con fluoresceína se localizó conjuntamente con los marcadores linfáticos VEGFR-3 y LYVE-1 en tejido de tumor 435. Sin embargo, el fago que lleva la SEC. ID. nº: 1 no se dirige a la diana en los xenotrasplantes de melanoma C8161, aun cuando estos xenotrasplantes contengan como mucho los vasos VEGFR-3/positivos a LYVE-1/negativos a la lectina del tomate como los tumores de 435. En conjunto, estos resultados indican que el péptido SEC. ID. nº: 1 se dirige a la diana selectivamente en los vasos linfáticos positivos a VEGFR-3 y LYVE-1 de varios tumores diferentes. Combinado con los datos que demuestran que las células 435 y KRIB cultivadas se unen al fago que lleva la SEC. ID. nº: 1 y a la SEC. ID. nº: 1 del péptido marcado con fluoresceína interiorizado, estos resultados indican que el péptido CGNDRTRGC (SEC. ID. nº: 1) reconoce una molécula diana del vaso linfático presente en las células tumorales así como las células del vaso linfático de los mismos tumores. Como se da a conocer en la presente memoria, esta molécula diana no se expresa de manera significativa en los vasos linfáticos de tejidos normales.

Los resultados dados a conocer en la presente memoria indican además que el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) tiene actividad citotóxica en el cultivo celular e in vivo. Como se muestra en la Figura 7, se observó citotoxicidad aumentada de manera significativa en células MDA-MB-435 cultivadas incubadas con el péptido SEC. ID. nº: 1 en comparación con las células incubadas con el péptido de referencia. Además, cuando se trataron xenotrasplantes de células de carcinoma de mama humana MDA-MB-435 se trataron mediante inyección intravenosa del péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) dos veces a la semana, disminuyeron los volúmenes del tumor. Como se muestra en la Figura 8, el crecimiento del tumor ralentizó de manera significativa en los ratones tratados con el péptido con la SEC. ID. nº: 1, mientras que el volumen del tumor continuó aumentando rápidamente en los ratones no tratados con el péptido. Estos resultados demuestran que el péptido CGNDRTRGC (SEC. ID. nº: 1) tiene actividad citotóxica tanto en el cultivo celular como in vivo e indican además que este péptido así como los péptidos relacionados estructuralmente y los peptidomiméticos, y las moléculas que se unen al mismo receptor pueden ser útiles para ralentizar o prevenir el crecimiento del tumor in vivo.

Basándose en estos descubrimientos, la presente invención proporciona moléculas y conjugados autodirigidos útiles, por ejemplo, para reducir o prevenir la metástasis del tumor en individuos con cáncer que tienen un tumor primario. Los conjugados de la invención pueden administrarse, por ejemplo, a un individuo con cáncer de mama u óseo premetastásico o a un individuo con cáncer de mama u óseo metastásico en la etapa inicial o última. Los conjugados de la invención también pueden ser útiles, por ejemplo, para el diagnóstico por imagen del conjunto de vasos linfáticos del tumor, tal como el cáncer de mama o el conjunto de vasos linfáticos del osteosarcoma.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un péptido aislado que contiene la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). La invención proporciona además un péptido aislado que contiene la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). Un péptido de la invención puede ser, por ejemplo, cíclico o si no limitado por la configuración y puede tener varias longitudes, por ejemplo, una longitud inferior a 100 restos, una longitud inferior a 50 restos, una longitud inferior a 20 restos o una longitud inferior a 15 restos. En una forma de realización, un péptido de la invención que contiene la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2) o CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) presenta actividad citotóxica. Se entiende que un péptido que contiene, por ejemplo, la secuencia SEC. ID. nº: 1 o la SEC. ID. nº: 2 de aminoácidos incluye los aminoácidos especificados en una secuencia contigua en la que los aminoácidos especificados no están separados por otros aminoácidos.

Los péptidos de la invención se proporcionan en forma aislada. Tal como se utiliza en la presente memoria con referencia a un péptido de la invención, el término "aislado" significa un péptido que está en una forma que está relativamente libre de materiales tales como polipéptidos, lípidos, ácidos nucleicos contaminantes y otros materiales celulares que normalmente está asociados con el péptido en una célula o que está asociado con el péptido en un banco o en una preparación en bruto.

Los péptidos de la invención, incluyendo los péptidos bifuncionales, multivalentes y autodirigidos expuestos a continuación pueden tener varias longitudes. Un péptido de la invención puede tener, por ejemplo, una longitud relativamente corta inferior a ocho, nueve, diez, 12, 15, 20, 25, 30, 35 ó 40 restos. Un péptido de la invención puede ser también útil en el contexto de una secuencia significativamente más larga. Por ejemplo, como se expuso en la presente memoria, el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) conservó la capacidad para dirigirse a la diana cuando se condensó con una proteína de recubrimiento del fago, lo que confirma que un péptido de la invención puede presentar actividad de dirección a la diana selectiva cuando se impregna en una secuencia de proteína mayor. De este modo, un péptido de la invención puede tener, por ejemplo, una longitud de hasta 50, 100, 150 ó 200 restos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "residuo" se refiere a los aminoácidos o análogos del mismo.

La invención proporciona asimismo una proteína híbrida que contiene un péptido de la invención, fusionada a una proteína heteróloga. En una forma de realización, la invención proporciona una proteína híbrida que contiene un péptido autodirigido como se describió anteriormente, que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor fusionado a una proteína heteróloga. En una forma de realización, el péptido o peptidomimético autodirigido que se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor presenta actividad citotóxica. En otra forma de realización, la proteína heteróloga presenta actividad terapéutica. En una forma de realización adicional, la proteína heteróloga es un anticuerpo o un fragmento que se une al antígeno del mismo. En otras formas de realización, la invención proporciona una proteína híbrida en la que un péptido que contiene la secuencia CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) o GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2) se condensa con una proteína heteróloga. El término "heterólogo", tal como se utiliza en la presente memoria en relación con una proteína fusionada a un péptido de la invención, significa una proteína procedente de una fuente distinta del gen que codifica el péptido de la invención. Una proteína híbrida de la invención puede tener varias longitudes, por ejemplo, hasta 100, 200, 300, 400, 500 u 800 restos.

La invención proporciona asimismo un péptido bifuncional que contiene un péptido autodirigido como se describió anteriormente que se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor, tal como el conjunto de vasos linfáticos de los cánceres de mama o de osteosarcomas, condensado con un segundo péptido que tiene una función independiente. Dichos péptidos bifuncionales tienen por lo menos dos funciones proporcionadas por porciones diferentes del péptido y pueden, por ejemplo, presentar actividad anti-linfangiógena o actividad pro-apoptósica además de la actividad de dirigirse a la diana selectiva. Como ejemplos de péptidos bifuncionales, la invención proporciona CGNKRTRGC-GG-_{D}(KLAKLAK)_{2} y GNKRTRG-GG-_{D}(KLAKLAK)_{2}. En dichos péptidos, la porción de la CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) presenta actividad de dirección a la diana selectiva y actividad citotóxica, mientras que la parte _{D}(KLAKLAK)_{2} presenta actividad pro-apoptósica.

La presente invención proporciona además un péptido multivalente aislado que incluye por lo menos dos motivos que contienen cada uno independientemente la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). El péptido multivalente puede tener, por ejemplo, por lo menos tres, por lo menos cinco o por lo menos diez de dichos motivos que contienen cada uno independientemente la secuencia GNKRTRG de aminoácidos (SEC. ID. nº: 2). En las formas de realización específicas, el péptido multivalente tiene dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince o veinte motivos idénticos o diferentes de la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). En otra forma de realización, el péptido multivalente contiene motivos idénticos, que constan de la secuencia SEC. ID. nº: 2 de aminoácidos. En una forma de realización adicional, el péptido multivalente contiene motivos contiguos, que no están separados por ningún aminoácido que interviene. Incluso en formas de realización adicionales, el péptido multivalente es cíclico o si no está limitado por la configuración o tiene actividad citotóxica.

En un péptido multivalente aislado de la invención, en por lo menos un motivo puede existir, si se desea,
CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). En formas de realización específicas, un péptido multivalente de la invención tiene dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince o veinte motivos idénticos o no idénticos de la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). Dichos péptidos multivalentes pueden estar, si se desea, contiguos o además pueden ser, si se desea, cíclicos o si no limitados por la configuración.

De este modo, la invención proporciona péptidos, incluyendo péptidos bifuncionales y multivalentes y péptidos autodirigidos expuestos con más detalle a continuación. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "péptido" se utiliza ampliamente para significar péptidos, proteínas, fragmentos de proteínas y similares.

Un péptido aislado de la invención, o una molécula autodirigida de la invención como se expone con más detalle a continuación, puede ser cíclico, o si no estar limitado por la configuración. Tal como se utiliza en la presente memoria, una molécula "limitada por la configuración", tal como un péptido, es la que la estructura tridimensional se mantiene sustancialmente en una disposición espacial a lo largo del tiempo. Las moléculas limitadas por la configuración pueden presentar propiedades mejoradas tales como aumento de afinidad, estabilidad metabólica, permeabilidad de la membrana o solubilidad. Los procedimientos de limitación de la configuración son bien conocidos en la técnica e incluyen la ciclación.

En una forma de realización, un péptido de la invención o una molécula autodirigida tal como un péptido autodirigido, es cíclico. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "cíclico" se refiere a una molécula con componentes no adyacentes unida a otra mediante un enlace covalente o iónico o mediante una interacción equivalente de modo que se mantiene una estructura rígida o semirrígida tridimensional de la molécula.

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Tal como se utiliza en la presente memoria en relación con un péptido, el término cíclico se refiere a una estructura que incluye un enlace intramolecular entre dos aminoácidos o análogos de aminoácidos no adyacentes. La ciclación puede efectuarse mediante un enlace covalente o no covalente. Los enlaces intramoleculares incluyen, pero no se limitan a, enlaces eje central con eje central, cadena lateral con eje central y cadena lateral con cadena lateral. Un procedimiento preferido de ciclación es mediante la formación de un enlace disulfuro entre las cadenas laterales de los aminoácidos no adyacentes o de los análogos de aminoácido. Los restos capaces de formar un enlace disulfuro incluyen, por ejemplo, cisteína (Cys), penicilamina (Pen), \beta,\beta-pentametilen cisteína (Pmc), ácido \beta,\beta-pentametilen-\beta-mercaptopropiónico (Pmp) y equivalentes funcionales de los mismos (véase, también, la Tabla 1).

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Puede también ciclarse un péptido, por ejemplo, mediante un enlace lactama, que puede utilizar un grupo de cadena lateral de un aminoácido o un análogo del mismo para formar un enlace covalente con la amina N-terminal del resto amino-terminal. Ejemplos capaces de formar un enlace lactama incluyen el ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), lisina (Lys), ornitina (Orn), ácido \alpha,\beta-diaminopropiónico, ácido \gamma-amino-adípico (Adp) y ácido M-(aminometil)benzoico (Mamb). Además la ciclación puede efectuarse, por ejemplo, mediante la formación de un enlace lisinonorleucina entre restos de lisina (Lys) y leucina (Leu) o un enlace de ditirosina entre dos restos de tirosina (Tyr).

La presente invención proporciona también un péptido aislado autodirigido que comprende la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2) o la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor. En una forma de realización, el péptido autodirigido aislado se dirige al conjunto de vasos linfáticos del tumor aparte del conjunto de vasos del melanoma.

La presente invención proporciona además un conjugado que contiene un fragmento unido a una molécula autodirigida que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor en el que dicha molécula autodirigida comprende un péptido tal como se definió anteriormente. En una forma de realización, el conjugado contiene una molécula autodirigida que se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor aparte del conjunto de vasos del melanoma.

En una forma de realización adicional, el conjugado contiene una molécula autodirigida que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor y que presenta actividad citotóxica.

En un conjugado de la invención, la molécula que se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor es un péptido. En una forma de realización, la porción de péptido del conjugado tiene una longitud de por lo menos 200 restos. En otra forma de realización, la porción del péptido del conjugado tiene una longitud de por lo menos 50 restos. En otras formas de realización, el conjugado contiene una configuración cíclica o si no un péptido limitado por la configuración que se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor. Incluso en formas de realización adicionales, la parte del péptido del conjugado presenta actividad citotóxica.

Una molécula autodirigida útil en un conjugado de la invención puede ser un péptido autodirigido que contiene la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). Si se desea, dicho péptido puede ser cíclico o si no estar limitado por la configuración. Una molécula autodirigida útil en un conjugado de la invención puede ser también, un péptido autodirigido que contiene la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). En formas de realización específicas, dicho péptido autodirigido es cíclico o si no está limitado por la configuración. Varios fragmentos son útiles en un conjugado de la invención, incluyendo, sin limitación, agentes terapéuticos, agentes quimioterapéuticos del cáncer, agentes citotóxicos, agentes antilinfangióngenos, marcadores detectables y fagos.

Como se expuso en la presente memoria, el péptido con la SEC. ID. nº: 1 reconoce un "receptor" diana del vaso linfático que se expresa en algunas células del tumor así como en células del vaso linfático de los mismos tumores pero no se expresa de manera significativa en los vasos linfáticos de los tejidos normales. La unión de la SEC. ID. nº: 1 a este receptor diana forma la base para la actividad de dirección a la diana selectiva del péptido SEC. ID. nº: 1. Basándose en este descubrimiento, es evidente que las moléculas estructuralmente no relacionadas con la SEC. ID. nº: 1 pero que se unen al mismo receptor diana tienen también las mismas características de autodirección selectiva a los vasos sanguíneos linfáticos del tumor. Dichas moléculas pueden identificarse por la capacidad para unirse específicamente, o competir para unirse, al enlace receptor diana por la SEC. ID. nº: 1. De este modo, la invención proporciona una molécula que se une específicamente al receptor unido por el péptido SEC. ID. nº: 1, de modo que una molécula también está caracterizada por la capacidad para dirigirse selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor. En una forma de realización, la molécula es un péptido que puede tener, por ejemplo, una longitud de cómo máximo, 20, 50 ó 200 restos.

La invención proporciona asimismo un conjugado que contiene un fragmento unido a una molécula que se une específicamente al enlace del receptor por el péptido SEC. ID. nº: 1 y que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor. En dicho conjugado, la molécula puede ser, por ejemplo, un péptido y el fragmento puede ser cualquiera de los fragmentos dados a conocer en la presente memoria como útiles en los conjugados de la
invención.

La presente invención proporciona asimismo un procedimiento de dirigir un fragmento al conjunto de vasos linfáticos del tumor en un individuo administrando al individuo un conjugado que contiene un fragmento unido a una molécula autodirigida descrita anteriormente que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor, dirigiendo de este modo el fragmento al conjunto de vasos linfáticos del tumor. En una forma de realización, un procedimiento de dirigir un fragmento al conjunto de vasos linfáticos del tumor se pone en práctica con un conjugado que contiene una molécula autodirigida descrita anteriormente que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor aparte de al conjunto de vasos del melanoma. En una forma de realización adicional, un procedimiento de la invención se pone en práctica con un conjugado que contiene una molécula que se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del tumor y que presenta actividad citotóxica.

En un procedimiento de la invención, la molécula autodirigida es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). En otra forma de realización, la molécula que se dirige es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos CGNDRTRGC (SEC. ID. nº: 1). Varios fragmentos son útiles en un procedimiento de la invención incluyendo, por ejemplo, agentes terapéuticos, agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, agentes citotóxicos, agentes anti-linfangiógenos, marcadores detectables y fago.

Se entiende que una variedad de vías de administración son útiles en los procedimientos de la invención. Dichas vías incluyen tanto la administración generalizada como local, incluyendo, sin limitación, la administración oral, la inyección intravenosa, la inyección intraperitoneal, la inyección intramuscular, la inyección subcutánea, la difusión transdérmica o electroforesis, la inyección local, dispositivos de administración de liberación prolongada incluyendo los dispositivos de liberación prolongada implantados localmente que incluyen implantes bioerosionables y a base de depósito.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "molécula" se utiliza ampliamente para significar un compuesto químico orgánico polimérico o no polimérico tal como un fármaco con molécula pequeña. Una molécula de ácido nucleico tal como un ARN, un ADNc o un oligonucleótido; un péptido o peptidomimético; o una proteína tal como un anticuerpo o un receptor del factor de crecimiento o un fragmento del mismo tal como un fragmento Fv, Fd, o Fab de un anticuerpo que contiene el dominio de fijación del antígeno.

En la presente memoria, están ejemplificadas varias moléculas que se dirigen selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor pero que no se dirigen de manera detectable a los vasos linfáticos de varios tejidos normales tales como CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) y GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). Moléculas adicionales que se dirigen de manera selectiva a los vasos linfáticos del tumor pueden identificarse utilizando ensayo de adhesión al plástico in vivo acoplado, si se desea, con selección ex vivo, como se expone en los Ejemplos 1 y 2 (véase, también, la patente U.S. nº 5.622.699).

La expresión "molécula autodirigida" tal como se utiliza en la presente memoria, significa cualquier molécula que se dirige selectivamente in vivo al conjunto de vasos linfáticos de uno o más tumores con preferencia al conjunto de vasos linfáticos normales. Asimismo, la expresión "péptido autodirigido" significa un péptido que se dirige selectivamente in vivo al conjunto de vasos linfáticos de uno o más tumores con preferencia al conjunto de vasos linfáticos normales. Se entiende que una molécula autodirigida que se dirige selectivamente in vivo al conjunto de vasos linfáticos del tumor puede dirigirse al conjunto de vasos linfáticos de todos los tumores o puede presentar autodirección preferente para el conjunto de vasos linfáticos de un subconjunto de tipos de tumor.

La expresión "se dirige selectivamente" significa que, la molécula, péptido o peptidomimético autodirigido se une in vivo preferentemente al conjunto de vasos linfáticos del tumor, tal como el tumor de mama o el conjunto de vasos linfáticos del osteosarcoma, en comparación con el conjunto de vasos linfáticos no tumoral. La autodirección selectiva generalmente se caracteriza por lo menos por una localización dos veces mayor dentro del conjunto de vasos linfáticos del tumor, tal como el conjunto de vasos linfáticos del osteosarcoma en comparación con varios tipos de tejido del conjunto de vasos linfáticos no tumoral. Una molécula autodirigida puede caracterizarse por una localización preferencial de 5 veces, 10 veces, 20 veces o más en el conjunto de vasos linfáticos del tumor en comparación con varios tipos de tejido del conjunto de vasos linfáticos no tumoral o en comparación con la mayor parte o todo el conjunto de vasos linfáticos no tumoral. De este modo, se entiende que la molécula autodirigida puede dirigirse, en parte, al conjunto de vasos linfáticos de uno o más órganos normales, además de al conjunto de vasos linfáticos del tumor.

En otra forma de realización, la porción de péptido del conjugado tiene una longitud definida. La porción de péptido del conjugado puede tener, por ejemplo, una longitud de por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 150, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 ó 2.000 restos. Se entiende que la expresión "porción del péptido del conjugado" significa el número total de restos en el péptido autodirigido y en cualquier proteína, péptido contiguo, tal como una proteína terapéutica o un péptido pro-apoptósico.

Si se desea, un conjugado de la invención puede contener muchas moléculas autodirigidas que cada una se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor. En una forma de realización, un conjugado de la invención contiene por lo menos dos moléculas autodirigidas que pueden dirigirse selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor. En más formas de realización, un conjugado de la invención contiene por lo menos 10 moléculas autodirigidas, o por lo menos 100 moléculas autodirigidas, que cada una se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor. Incluso en una forma de realización adicional, la invención proporciona un conjugado que contiene un fago unido a por lo menos 100 moléculas autodirigidas que se dirigen cada una selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor.

Un conjugado de la invención puede contener, por ejemplo, un fragmento unido a por lo menos dos moléculas autodirigidas que se dirigen cada una selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor y que cada una incluye independientemente la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). En una forma de realización adicional, la invención proporciona un conjugado que contiene un fragmento unido a por lo menos diez moléculas autodirigidas que se dirigen cada una selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor y que cada una incluye independientemente la secuencia de aminoácido GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). Incluso en otra forma de realización adicional, la invención proporciona un conjugado que contiene un fragmento unido a por lo menos 100 moléculas autodirigidas que cada una se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor y que cada incluye independientemente la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). Los fragmentos útiles en un conjugado de la invención que contienen muchos péptidos autodirigidos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de fago.

De este modo, un conjugado de la invención que contiene muchas moléculas autodirigidas puede incluir, por ejemplo, dos o más, tres o más, cinco o más, diez o más, veinte o más, treinta o más, cuarenta o más, cincuenta o más, 100 o más, 200 o más, 300 o más, 400 o más, 500 o más o 100 o más moléculas autodirigidas. En una forma de realización, las moléculas autodirigidas presentan una secuencia de aminoácidos idéntica. En otra forma de realización, el conjugado incluye moléculas autodirigidas que presentan secuencias de aminoácidos no idénticas. Los restos útiles en un conjugado de la invención que incorporan muchas moléculas autodirigidas incluyen, sin limitación, fago, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y otros virus, células, liposomas, matrices poliméricas, matrices no poliméricas o partículas tales como partículas de oro, microdispositivos y nanodispositivos y materiales semiconductores a escala nano.

Un conjugado de la invención puede contener, por ejemplo, un liposoma u otra matriz polimérica unida a por lo menos dos moléculas autodirigidas que se une cada una selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor. Si se desea, el liposoma u otra matriz polimérica puede estar unida a por lo menos diez o por lo menos 100 moléculas autodirigidas que cada una se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor. Las moléculas autodirigidas útiles en dicho conjugado pueden incluir independientemente, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2) o la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). Los liposomas, por ejemplo, que están constituidos por fosfolípidos u otros lípidos, son vehículos inocuos, fisiológicamente aceptables y metabolizables que son relativamente sencillos de preparar y administrar (Gregoriadis, Liposome Technology, vol. 1 (CRC Press, Boca Ratón, FL (1984)). El liposoma u otra matriz polimérica además puede incluir otro componente si se desea, por ejemplo, un agente terapéutico, un agente quimioterapéutico contra el cáncer, un agente citotóxico o un agente antilinfangiógeno.

Un conjugado de la invención incluye un fragmento unido a una molécula autodirigida descrita anteriormente que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "fragmento" se utiliza ampliamente para significar un material físico, químico o biológico que puede estar unido a una molécula autodirigida de la invención y generalmente proporciona una función biológicamente útil a la molécula autodirigida. Un fragmento puede ser cualquier material natural o sintético incluyendo un material biológico, tal como una célula o fago; un material orgánico, tal como una molécula pequeña; un radionucleido; una molécula de ácido nucleico u oligonucleótido; un polipéptido; un péptido o peptidomimético. Los fragmentos útiles en la invención incluyen, sin limitación, agentes terapéuticos; agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, agentes citotóxicos, agentes proapoptósicos, agentes antilinfangiógenos, marcadores detectables y agentes de diagnóstico por la imagen; y etiquetas u otros soportes insolubles. Los fragmentos útiles en la invención incluyen además, por ejemplo, fago y otros virus, células, liposomas, matrices poliméricas, matrices no poliméricas o partículas tales como partículas de oro, microdispositivos y nanodispositivos y materiales semiconductores a nano-escala. Estos y otros fragmentos conocidos en la técnica pueden ser componentes de un conjugado de la invención, tal como se da a conocer en la presente memoria.

En una forma de realización, un fragmento útil en un conjugado de la invención es un agente antilinfangiógeno. Tal como se utiliza en la presente memoria la expresión "agente antilinfangiógeno" es una molécula que reduce o inhibe el crecimiento de vasos linfáticos. La estimulación de la serie de reacciones de transducción de señal del receptor-3 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-3) es suficiente para provocar específicamente linfangiogénesis in vivo, y la expresión de VEGFR-3 principalmente está limitada a los vasos linfáticos en el desarrollo posterior. Además, el ligando VEGFR-3, VEGF-C, es mitógeno para con las células linfáticas endoteliales y pueden provocar una respuesta linfangiogénica en la membrana corioalantoica aviar y en la piel de ratón (Karkkainen y Petrova, Oncogen 19:5598-5605 (2000); y Veikkola et al., EMBO J. 20:1223-1231 (2001)). De este modo, un agente anti-linfangiógeno puede ser, por ejemplo, un inhibidor de VEGFR-3, que es una molécula que inhibe la expresión de VEGFR-3, la actividad o la señalización.

Un inhibidor de VEGFR-3 puede ser selectivo para VEGFR-3 y puede presentar, por ejemplo, por lo menos una inhibición 10 veces mayor de la expresión VEGFR-3 o de la actividad en comparación con la expresión o actividad de otros receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR). Dicho inhibidor de VEGFR-3 selectivo puede presentar, por ejemplo, por lo menos una inhibición 20 veces, 50 veces o 100 veces mayor de la expresión o actividad de VEGFR-3 en comparación con la expresión o actividad de otros VEGFR. Se entiende que un inhibidor de VEGFR-3 no selectivo también puede ser útil en la invención. Dicho inhibidor de VEGFR-3 inhibe la expresión o actividad de uno o más de otros VEGFR como VEGFR-1 o VEGFR-2 u otras tirosina cinasas además de inhibir a VEGFR-3. Además se entiende que la inhibición de VEGFR-3 u otro agente antilinfangiógeno también puede presentar actividad adicional, por ejemplo, como agente antiangiógeno.

En la técnica, se conoce una variedad de agentes antilinfangiógenos que incluyen por ejemplo antagonistas de VEGFR-3, que se unen pero que no activan a VEGFR-3; receptores solubles u otros receptores de VEGFR-3 negativos dominantes tales como los receptores inactivos para cinasa; anticuerpos inhibidores anti-VEGFR-3; competidores de la unión del ligando VEGFR-3, por ejemplo, la unión a VEGF-C o VEGF-D; moléculas pequeñas; moléculas de ácido nucleico complementario; ribozimas; factores de transcripción o sus moléculas que codifican ácido nucleico; u otras moléculas que reducen la expresión de VEGFR-3; inhibidores selectivos de VEGFR-3 cinasa tales como los análogos de ATP; e inhibidores selectivos de la serie de reacciones de señalización de VEGFR-3. De este modo, se entiende que varios tipos de moléculas pueden funcionar como un agente antilinfangiógeno, incluyendo una pequeña molécula; una proteína, por ejemplo, un receptor dominante negativo, factor de transcripción o anticuerpo; un péptido o peptidomimético; una ribozima; o una molécula de ácido nucleico tal como un oligonucleótido complementario o una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor dominante negativo, un factor de transición o un anticuerpo.

En una forma de realización, un fragmento contenido en un conjugado de la invención es un agente terapéutico. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "agente terapéutico" significa una molécula que altera la actividad biológica en un tejido normal o patológico. Un agente terapéutico, por consiguiente, es potencialmente útil para el tratamiento de los estados de la enfermedad. Una variedad de agentes terapéuticos puede estar contenida en un conjugado de la invención. En otra forma de realización, un conjugado de la invención contiene un agente quimioterapéutico contra el cáncer. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "agente quimioterapéutico contra el cáncer" es un agente químico que inhibe la proliferación, crecimiento, duración o actividad metastásica de las células de cáncer. Dicho agente quimioterapéutico contra el cáncer puede ser, sin limitación, un taxano tal como docetaxel; una antraciclina tal como doxorrubicina; un agente de alquilación; un alcaloide de la vinca; un antimetabolito; un agente de platino tal como cisplationo o carboplatino; un modulador selectivo del receptor estrógeno; un anticuerpo tal como trastuzumab; un esteroide tal como metotrexato; un antibiótico tal como adriamicina; y un quimioterapéutico tal como isofamida.

Un compuesto de taxano útil como agente quimioterapéutico contra el cáncer en un conjugado de la invención puede ser, por ejemplo, docetaxel (Taxotere; Aventis Pharmaceuticals, Inc.; Parsippany, NJ) o paclitaxel (Taxol; Bristol-Myers Squibb; Princeton, NJ). Véase, por ejemplo, Chan et al., J. Clin. Oncol. 17:2341-2354 (1999), y Paridaens et al., J. Clin. Oncol. 18:724 (2000).

Un agente quimioterapéutico contra el cáncer utilizando en un conjugado de la invención también puede ser una antraciclina tal como doxorrubicina, idarrubicina o daunorrubicina. La doxorrubicina es un agente quimioterapéutico contra el cáncer utilizado habitualmente y puede ser útil, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer de mama (Stewart y Ratain, en: "Cancer: Principles and practice of oncology" 5ª ed., cap. 19 (eds. DeVita, Jr., et al.; J.P. Lippincott 1997); Harris et al., en "Cancer: Principles and practice of oncology", supra, 1997). Además, la doxorrubicina tiene actividad antiangiogénica (Folkman, supra, 1997; Steiner, en "Angiogenesis: Key principles-Science, technology and medicine", págs. 449-454 (eds. Steiner et al.; Birkhauser Verlag, 1992)), que puede contribuir a su eficacia en el tratamiento del cáncer.

Un agente de alquilación tal como melfalán o clorambucilo asimismo puede ser un agente quimioterapéutico contra el cáncer útil en un conjugado de la invención. Asimismo, un alcaloide de las vincas tal como vindesina, vinblastina o vinorrelbina; o un antimetabolito tal como 5-fluorouracilo, 5-fluorouridina o un derivado del mismo puede ser un agente quimioterapéutico contra el cáncer útil en un conjugado de la invención.

Otro agente quimioterapéutico contra el cáncer útil en conjugados de la invención es un agente de platino. Dicho agente de platino puede ser, por ejemplo, cisplatino o carboplatino como se describe, por ejemplo, en Crown, Seminars in Oncol. 28:28-37 (2001). Otros agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, útiles en un conjugado de la invención incluyen, sin limitación, metotrexato, mitomicina-C, adriamicina, ifosfamida y ansamicinas.

Un agente quimioterapéutico contra el cáncer para el tratamiento del cáncer de mama y otros cánceres dependientes hormonalmente también puede ser un agente que antagoniza el efecto del estrógeno tal como un modulador del receptor de estrógeno selectivo o un antiestrógeno. El modulador del receptor del estrógeno selectivo, tamoxifeno, es un agente quimioterapéutico contra el cáncer que puede utilizarse en un conjugado de la invención para el tratamiento del cáncer de mama (Fisher et al., J. Natl. Cancer Instit. 90:1371-1388 (1998)).

Un agente terapéutico útil en un conjugado de la invención puede ser un anticuerpo tal como un anticuerpo monoclonal humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo del receptor 2 del factor de crecimiento antiepidérmico (HER2), trastuzumab (Herceptina; Genentech, San Francisco sur, CA) es un agente terapéutico utilizando en un conjugado de la invención para el tratamiento de HER2/neu que sobreexpresa los cánceres de mama (Burris et al., supra, 2001; White et al., Annu. Rev. Med. 52:125-141 (2001)).

En otra forma de realización, un fragmento útil en un conjugado de la invención es un agente citotóxico. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "agente citotóxico" se refiere a cualquier molécula que produzca la muerte celular por cualquier mecanismo. Ejemplos de agentes citotóxicos útiles en un conjugado de la invención son la doxorrubicina, docetaxel y trastuzumab y los péptidos antimicrobianos descritos en la presente memoria a continuación.

Un fragmento útil en un conjugado de la invención también puede ser un agente antiangiógeno. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "agente antiangiógeno" es una molécula que reduce o evita la angiogénesis, el crecimiento y el desarrollo de los vasos sanguíneos. Se ha demostrado que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es importante para la angiogénesis en muchos tipos de cáncer, incluyendo la angiogénesis del cáncer de mama in vivo (Borgstrom et al., Anticancer Res. 19:4213-4214 (1999)). Un agente antiangiógeno puede ser, por ejemplo, un inhibidor o anticuerpo neutralizante que inhiba un factor de crecimiento u otro factor importante para la angiogénesis. En una forma de realización, el agente antiangiógeno es un anticuerpo monoclonal que neutraliza a anti-VEGF (Borgstrom et al., supra, 1999). En otra forma de realización, el agente antiangiógeno es un esteroide o teratógeno. En una forma de realización adicional, el agente antiangiógeno es una proteína, péptido, o fragmento de péptido, tal como endostatina, anastelina, trombospondina, angioestatina, o un péptido kringle (anular) de angioestatina.

Un fragmento útil en un conjugado de la invención puede ser también un marcador detectable. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "marcador detectable" se refiere a cualquier molécula que puede administrarse in vivo y se detecta posteriormente. Ejemplos de marcadores detectables útiles en los conjugados y en los procedimientos de la invención incluyen radiomarcadores y moléculas fluorescentes. Ejemplos de radionucleidos incluyen el indio-111, tecnecio-99, carbono-11 y carbono-13. Las moléculas fluorescentes incluyen, sin limitación, fluoresceína, aloficocianina, ficoeritrina, rodamina y rojo de Texas.

La invención proporciona asimismo un conjugado en el que una molécula autodirigida descrita anteriormente que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor está unida a un péptido antimicrobiano, en el que el conjugado está interiorizado selectivamente por el conjunto de vasos linfáticos del tumor y presenta una gran toxicidad para el conjunto de vasos linfáticos del tumor, y en el que el péptido antimicrobiano tiene baja toxicidad de la célula de mamífero cuando no está unido a la molécula autodirigida. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "péptido antimicrobiano" significa un péptido natural o sintético que tiene actividad antimicrobiana, que es la capacidad para destruir o ralentizar el crecimiento de uno o más microbios y que tiene baja toxicidad para las células del mamífero cuando no está unido a una molécula autodirigida. Un péptido antimicrobiano, por ejemplo, puede destruir o ralentizar el crecimiento de una o más cepas de bacterias incluyendo una bacteria gram-positiva o gram-negativa, o un hongo o protozoo. De este modo, un péptido antimicrobiano puede tener, por ejemplo, actividad bacterioestática o bactericida contra, por ejemplo, una o más cepas de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa o Staphylococcus aureus. Aunque no se desea estar ligado por lo siguiente, un péptido antimicrobiano puede tener actividad biológica debido a la capacidad para formar canales iónicos a través de las bicapas de la membrana como consecuencia de la autoagregación.

Un péptido antimicrobiano es por lo general muy básico y puede tener una estructura lineal o cíclica. Como se expone con más detalle a continuación, un péptido antimicrobiano puede tener una estructura anfipática \alpha-helicoidal (véase la patente US nº 5.789.542; Javadpour et al., supra, 1996; Blondelle y Houghten, supra, 1992). Un péptido antimicrobiano también puede ser, por ejemplo, un péptido de la cadena \beta/formador de hoja como se describe en Mancheno et al., J. Peptide Res. 51:142-148 (1998).

Un péptido antimicrobiano puede ser un péptido natural o sintético. Los péptidos antimicrobianos naturales han sido aislados de fuentes biológicas tales como bacterias, insectos, anfibios y mamíferos y se cree que representan las proteínas de defensa inducible que pueden proteger el organismo del hospedador de la infección bacteriana. Los péptidos antimicrobianos naturales incluyen las gramicidinas, magaininas, melitinas, defensinas y cecropinas (véase, por ejemplo, Maloy y Kari, Biopolymers 37:105-122 (1995); Álvarez-Bravo et al., Biochem. J. 302:535-538 (1994); Bessalle et al., FEBS 274:151-155 (1990); y Blondelle y Houghten en Bristol (ed.), Annual Reports in Medicinal Chemistry páginas 159-168 Academic Press, San Diego). Como se expone con más detalle a continuación, un péptido antimicrobiano puede ser también un análogo de un péptido natural, especialmente el que conserva o aumenta la anfipatogenia.

Un péptido antimicrobiano incorporado dentro de un conjugado de la invención presenta baja toxicidad en la célula del mamífero cuando no está unido a una molécula autodirigida al tumor. La toxicidad de la célula del mamífero puede evaluarse fácilmente utilizando ensayos de rutina. Por ejemplo, la toxicidad de la célula de mamífero puede evaluarse por lisis de eritrocitos humanos in vitro como se describe en Javadpour et al., supra, 1996. Un péptido antimicrobiano con baja toxicidad de célula de mamífero no es lítico para los eritrocitos humanos o requiere concentraciones de más de 100 \muM para la actividad lítica, preferentemente concentraciones superiores a 200, 300, 500 ó 1.000 \muM.

En una forma de realización, la invención proporciona un conjugado en el que la porción del péptido antimicrobiano favorece la destrucción de las membranas mitocondriales cuando es interiorizada por las células eucarióticas. En particular, dicho péptido antimicrobiano destruye preferentemente las membranas mitocondriales en comparación con las membranas eucarióticas. Las membranas mitocondriales, como membranas de bacterias pero en contraste con las membranas del plasma eucarióticas tienen un gran contenido de fosfolípidos con carga negativa. Puede ensayarse la actividad de un péptido antimicrobiano en la destrucción de las membranas mitocondriales utilizando, por ejemplo, un ensayo de hinchamiento mitocondrial u otro ensayo bien conocido en la técnica. _{D}(KLAKLAK)_{2}, por ejemplo, es un péptido antimicrobiano que produce marcado hinchamiento mitocondrial a una concentración de 10 \muM, significativamente inferior a la concentración requerida para destruir las células eucarióticas. Un péptido antimicrobiano que produce significativo hinchamiento mitocondrial a, por ejemplo, 50 \muM, 40 \muM, 30 \muM, 20 \muM, 10 \muM o menos, se considera un péptido que favorece la destrucción de las membranas mitocondriales.

Una porción de péptido antimicrobiano puede incluir, por ejemplo, la secuencia (KLAKLAK)_{2} (SEC. ID. nº: 5), (KLAKKLA)_{2} (SEC. ID. nº: 6), (KAAKKAA)_{2} (SEC. ID. nº: 7) o (KLGKKLG)_{3} (SEC. ID. nº: 8), y, en una forma de realización, incluye la secuencia _{D}(KLAKLAK)_{2}. Un conjugado de la invención, que contiene una molécula autodirigida que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor unida a un péptido antimicrobiano puede tener, por ejemplo, la secuencia CGNKRTRGC-GC-_{D}(KLAKLAK)_{2} o GNKRTRG-GG-_{D}(KLAKLAK)_{2}.

Los péptidos antimicrobianos generalmente tienen configuraciones de enrollamiento aleatorias en soluciones acuosas diluidas, aún a altos niveles de enrollamiento pueden ser producidas por disolventes que favorecen la hélice y medios anfipáticos tales como micelas, bicapas sintéticas o membranas celulares. Las estructuras en hélice \alpha son bien conocidas en la técnica, con una hélice \alpha ideal caracterizada por tener 3,6 restos por espira y una traducción de 1,5 \ring{A} por resto (5,4 \ring{A} por espira; véase Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties W.H. Freeman, Nueva York (1984)). En una estructura \alpha-helicoidal anfipática, los restos de aminoácido polares y no polares están alineados en una hélice anfipática, que es una hélice \alpha en la que los restos hidrófobos de aminoácidos están principalmente en una cara, con restos hidrófilos principalmente en la cara opuesta cuando el péptido se ve a lo largo del eje de la helicoidal.

Se han aislado péptidos antimicrobianos de secuencia que varía ampliamente, compartiendo una estructura \alpha-helicoidal anfipática como característica común (Saberwal et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:109-131 (1994)). Los análogos de los péptidos naturales con sustituciones de aminoácido previstas para aumentar la capacidad anfipática y para formar hélices por lo general tendrán actividad antimicrobiana aumentada. En general, los análogos con actividad antimicrobiana aumentada también han aumentado la citotoxicidad frente a las células de mamífero (Maloy et al., Biopolymers 37:105-122 (1995)).

Tal como se utiliza en la presente memoria haciendo referencia a un péptido antimicrobiano, la expresión "estructura anfipática \alpha-helicoidal" significa una hélice \alpha con una cara hidrófila que contiene varios restos polares a pH fisiológico y una cara hidrófoba que contiene restos no polares. Un resto polar puede ser, por ejemplo, un resto de lisina o arginina, mientras que un resto no polar puede ser, por ejemplo, un resto de leucina o alanina. Un péptido antimicrobiano que tiene una estructura \alpha-helicoidal anfipática generalmente tiene un número equivalente de restos polares y no polares dentro de un dominio anfipático y un número suficiente de restos básicos para proporcionar al péptido una carga positiva global a pH neutro (Saberwal et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:109-131 (1994)). Un experto en la materia entiende que los aminoácidos que favorecen la hélice tales como la leucina y la alanina pueden estar incluidos ventajosamente en un péptido antimicrobiano de la invención (véase, por ejemplo, Creighton, anteriormente, 1984). Los péptidos antimicrobianos sintéticos con una estructura anfipática de hélice \alpha son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente US nº 5.789.542 concedida a McLaughlin y Becker.

Un experto en materia de oncología médica entiende que éstos y otros agentes son agentes terapéuticos útiles, que pueden utilizarse por separado o conjuntamente en los conjugados y procedimientos de la invención. Además se entiende que un conjugado de la invención puede contener uno o más de dichos agentes terapéuticos y que, si se desea, los componentes adicionales pueden estar incluidos como parte del conjugado. Por ejemplo, en algunos casos, puede ser deseable utilizar un espaciador de oligopéptido entre la molécula autodirigida y el agente terapéutico (Fitzpatrick y Garnett, Anticancer Drug Des. 10:1-9 (1995)).

La invención también proporciona un procedimiento de diagnóstico por la imagen del conjunto de vasos linfáticos del tumor en un individuo administrando al individuo un conjugado que contiene un marcador detectable unido a una molécula autodirigida descrita anteriormente que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor y que detecta el conjugado, diagnosticando por imagen de este modo el conjunto de vasos linfáticos del tumor. En un procedimiento de la invención para detectar por la imagen el conjunto de vasos linfáticos del tumor, el péptido autodirigido puede ser, por ejemplo, cíclico o si no limitado por la configuración. En una forma de realización, la molécula autodirigida es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). En otra forma de realización, la molécula autodirigida es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). Un marcador detectable útil en un procedimiento de detección por la imagen de la invención puede ser, por ejemplo, una molécula de radionucleido o una fluorescente. Ejemplos de radionucleidos útiles como marcadores detectables incluyen, pero no se limitan a, indio-111, tecnecio-99, carbono-11 y carbono-13.

Los procedimientos de la invención para diagnosticar por la imagen el conjunto de vasos linfáticos del tumor puede ser útil para detectar la presencia del conjunto de vasos linfáticos del tumor asociado a una variedad de tumores. Después de la administración de un conjugado de la invención que contiene un marcador detectable, se observa el conjunto de vasos linfáticos del tumor. Si la detección por la imagen es positiva para la presencia de dichos linfáticos del tumor, puede evaluarse el tamaño y la cantidad en el tumor de infiltración linfática. Estos resultados proporcionan información valiosa al médico con respecto al desarrollo del cáncer y a la presencia o probabilidad de metástasis.

En un procedimiento de diagnóstico por la imagen del conjunto de vasos linfáticos del tumor, el conjugado administrado contiene un marcador detectable que permite la detección u observación del conjugado de vasos linfático en los tumores, por ejemplo en los tumores de mama o en osteosarcomas. Para el diagnóstico por la imagen in vivo de dicho conjunto de vasos linfáticos del tumor, una molécula autodirigida selectiva para el tumor deseado está unida a un marcador detectable que, durante la administración al individuo, es detectable externo al individuo. Dicho marcador detectable puede ser, por ejemplo, un radionucleido que emite rayos gamma tal como el indio-113, indio-115 o tecnecio-99; tras la administración a un individuo, el conjugado puede observarse utilizando un detector sólido de centelleo.

La presente invención proporciona también un procedimiento para reducir o inhibir la metástasis del tumor en un individuo. La metástasis es producida principalmente por el sistema linfático y la extensión de la implicación del ganglio linfático es un factor de pronóstico clave para la gravedad de la enfermedad. La linfangiogénesis y la cantidad de vasos linfáticos intratumorales en los tumores primarios se ha correlacionado con la metástasis del tumor en experimentos en animales, por ejemplo en el cáncer de mama. (Skobe et al., Nature Medicine 7(2):192-198 (2001)). El conjunto de vasos linfáticos intratumoral puede desempeñar una función importante en la metástasis de muchos tipos de tumor tales como de mama, colon, pulmón, tiroides, gástrico, cánceres de células escamosas, mesoteliomas, osteosarcomas y neuroblastomas.

Según la presente invención, la metástasis tumoral se reduce o inhibe administrando al individuo un conjugado que contiene un fragmento unido a una molécula autodirigida como se describe anteriormente que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor, reduciendo o inhibiendo de este modo la metástasis del tumor. En dicho procedimiento de la invención, la molécula autodirigida puede ser, por ejemplo, cíclica o si no limitada por la configuración. En una forma de realización la molécula autodirigida es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). En otra forma de realización, la molécula autodirigida es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). Una variedad de fragmentos son útiles en un procedimiento de la invención para reducir o inhibir la metástasis del tumor. Dichos fragmentos incluyen, sin limitación, agentes quimioterapéuticos cancerosos, agentes citotóxicos y agentes anti-linfangiógenos.

La presente invención proporciona además un procedimiento para reducir el número de vasos linfáticos del tumor en un individuo, administrando al individuo un conjugado que contiene un fragmento unido a una molécula autodirigida como se describió anteriormente que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor, reduciendo de este modo el número de vasos linfáticos del tumor en el individuo. En un procedimiento de la invención, la molécula autodirigida puede ser, por ejemplo, cíclica o si no limitada por la configuración. En una forma de realización, la molécula autodirigida es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). En otra forma de realización, la molécula autodirigida es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). Una variedad de restos puede ser útil en un procedimiento de la invención para reducir el número de vasos linfáticos del tumor incluyendo, sin limitación, agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, agentes citotóxicos y agentes anti-linfangiógenos.

Además, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento de cáncer en un individuo, administrando al individuo un conjugado que contiene un fragmento unido a una molécula autodirigida como se describió anteriormente que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor. En un procedimiento de la invención, la molécula autodirigida puede ser, por ejemplo, cíclica o si no limitada por la configuración. En una forma de realización, la molécula autodirigida es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2). En otra forma de realización, la molécula autodirigida es un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). Una variedad de fragmentos puede ser útil en un procedimiento de la invención para tratar el cáncer en un individuo, incluyendo, pero sin limitarse a, agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, agentes citotóxicos y agentes anti-linfangiógenos.

Como se dio a conocer anteriormente, la SEC. ID. nº: 1 del péptido se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor y además tiene actividad citotóxica. De este modo, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento de cáncer en un individuo, administrando al individuo una molécula autodirigida citotóxica que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor. En un procedimiento de la invención, la molécula autodirigida citotóxica, puede ser, por ejemplo, cíclica o si no limitada por la configuración. Además, una molécula autodirigida citotóxica útil en un procedimiento de la invención puede ser, un péptido citotóxico que contiene la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2), o un péptido citotóxico que contiene la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1).

Los ejemplos siguientes se pretenden que ilustren pero no limiten la presente invención.

Ejemplo 1 Identificación de péptidos que se unen a células MDA-MB-435 de carcinoma de mama in vitro

Este ejemplo describe la identificación de un péptido que se dirige selectivamente a tumores de xenotrasplante de carcinoma de mama con MDA-MB-435 utilizando selecciones ex vivo e in vivo.

Se realizaron varias selecciones ex vivo con suspensiones de células de tumor 435 preparadas a partir de xenotrasplantes de carcinoma de mama MDA-MB-435 desarrollados en ratones lampiños, como se describe a continuación. Se utilizó CD31 antiratón para eliminar la mezcla de célula tumoral de las células endoteliales de los vasos sanguíneos antes de recuperar el fago unido a la población de células negativas a CD31. En la tercera ronda ex vivo, el grupo del fago se unió a una suspensión de células tumorales aproximadamente 350 veces de la referencia, fago no recombinante. El grupo del fago preseleccionado ex vivo se sometió a continuación a una ronda de selección in vivo mediante inyección en la vena de la cola de un ratón lampiño que lleva un tumor MDA-MB-435. Se recuperaron los fagos a continuación del tejido del tumor del xenotrasplante recogido.

El fago seleccionado se enriqueció 30 veces con respecto al fago T7 no recombinante en el tumor. Se seleccionaron al azar cuarenta y ocho clones individuales del grupo seleccionado in vivo, y las inserciones se secuenciaron como se describe a continuación. Se ensayaron en clones individuales la capacidad para unir células 435 cultivadas así como las suspensiones celulares preparadas a partir de tumores de 435.

Como se muestra en la Figura 1A, el fago que presenta el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) se unió a suspensiones de células tumorales 435 primarias aproximadamente 5.000 veces mejor que el fago no recombinante. En cambio, el fago que presenta la permutación espontánea CGEKRTRGC (SEC. ID. nº: 3) o CGNKRTRGV (SEC. ID. nº: 4) no se unió a las suspensiones de la célula tumoral 435 (véase la Figura 1A). La adición del péptido sintético CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) inhibió la unión del fago que presenta la misma secuencia peptídica.

La unión del fago que presenta la CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) a la suspensión de células tumorales 435 se correlacionó con el número de copias del péptido presentado. Como se muestra en la Figura 1B, había una disminución progresiva en el fago que se une cuando el péptido se presentaba en las 415 copias, 10 copias o 1 copia. De este modo, la unión del fago que presenta la SEC. ID. nº: 1 a la suspensión de células tumorales 435 era específica. El fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) también se unió a las células 435 cultivadas durante uno a tres días, aunque la unión fue más débil que para las células aisladas procedentes de los tumores. De promedio, la unión a las células 435 cultivadas fue aproximadamente 50 veces mayor que la unión observada con la referencia, fago no recombinante.

Estos resultados demuestran la unión específica del fago que presenta la SEC. ID. nº: 1 del péptido a las suspensiones de células tumorales preparadas a partir de xenotrasplante MDA-MB-435 de carcinoma de mama.

Un péptido presenta el banco de fagos con estructura general CX_{7}C, en la que C es cisteína y X es cualquier aminoácido, se construyó en el fago T7 esencialmente de la manera siguiente. En resumen, se hibridaron los oligonucleótidos complementarios que codifican la inserción del péptido aleatorio como codones NNK, y tenían salientes 5' Eco RI y 3' Hind III. El ADN bicatenario resultante se fosforiló con la T4 polinucleótido cinasa (Novagen; Madison, WI) y se ligaron en 1 \mug de las ramas del vector T7Select415-Ib. El producto ligado se añadió directamente a 50 \mul de extracto de relleno y se incubó durante dos horas, proporcionando 10^{8} pfu de recombinantes totales. Tras la ampliación de los recombinantes en 500 ml de cultivo líquido, la purificación de las partículas de fago y el secuenciado del ADN monocatenario del fago se realizó por métodos normalizados.

Los xenotrasplantes, las suspensiones de células tumorales y las selecciones ex vivo se realizaron esencialmente de la manera siguiente. Se inyectó por vía subcutánea a ratones Balb/lampiños con 1 \times 10^{6} células tumorales MDA-MB-435 para generar xenotrasplantes de carcinoma de mama. Se recogieron tumores de xenotrasplante de carcinoma de mama MDA-MB-435 humano 9 a 12 semanas después de la implantación, y se prepararon suspensiones de células tumorales utilizando colagenasa (0,5 mg/ml, Sigma).

Se incubaron suspensiones de células tumorales 435 con el banco CX_{7}C presentado al fago T7 (3,7 \times 10^{10} pfu) durante la noche a 4ºC. Se sometió la suspensión a lavados en serie con BSA al 1% en DME para eliminar el fago no ligado. Se eliminaron las células endoteliales de los vasos sanguíneos de la mezcla de células tumorales utilizando perlas magnéticas (Dynal; Lake Success, Nueva York) recubiertas con anticuerpo CD31 antiratón (MEC 13.3; Pharminogen; San Diego, California) según las instrucciones del fabricante. El fago unido a la población de células negativas a CD31 se recuperó añadiendo bacterias, y el fago recuperado se valoró y se amplió en el cultivo líquido.

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Ejemplo 2 Autodirección selectiva in vivo del péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1)

Este ejemplo demuestra que el fago que presenta a CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) se dirige selectivamente a tumores de osteosarcoma humano MDA-MB-435 y KRIB in vivo.

Se analizó la selectividad de autodirección in vivo de la manera siguiente. El fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) se inyectó en la vena de la cola de ratones lampiños que llevan un tumor MDA-MB-435, un osteosarcoma KRIB, un melanoma C8161 o un xenotransplante de células de leucemia HL-60. Posteriormente se recuperó el fago de los tumores respectivos, así como de varios tejidos normales (cerebro, riñón, hígado, bazo, piel y mama).

Como se muestra en la Figura 1C, el fago que presenta CGNRTRKGC (SEC. ID. nº: 1) hizo diana en los tumores 435 y KRIB in vivo. Aunque la intensidad de la autodirección varió, el valor del fago medio en el tejido tumoral fue aproximadamente 60 veces mayor que para el fago no recombinante en tumores de 435 y 15 veces mayor que para el fago no recombinante en osteosarcomas KRIB. En cambio, el fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) no hizo diana in vivo en xenotransplantes de melanoma C8161 o en xenotransplantes de leucemia humana HL-60. Además, el fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) no hizo diana en el tejido normal de cerebro, bazo, piel, riñón o pulmones. El fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) parecía que hacía diana débilmente en el tejido normal de mama (véase la Figura 1D).

La autodirección de un fago que presenta CGEKRTRGC (SEC. ID. nº: 3), en la que la asparagina-3 está sustituida por glutamato, en los tumores de 435 in vivo fue solo aproximadamente el 8% de el del fago CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) (véase la Figura 1C). Estos resultados de la autodirección in vivo, que reproducían los resultados de la unión presentada en las suspensiones de las células procedentes del tumor, indican que una asparagina o un residuo relacionado en la posición tres pueden contribuir a la actividad de la autodirección.

En resumen, estos resultados demuestran que la SEC. ID. nº: 1 del péptido presenta actividad de autodirección selectiva y se dirige al cáncer de mama y en los tumores de osteosarcoma preferentemente en tejidos normales.

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Ejemplo 3 Interiorización del fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. Nº: 1) por células

Este ejemplo demuestra que el fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) está interiorizado por las células.

Al aumentar el tiempo de inyección intravenosa del fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) para recuperar los tumores de 435 disminuyó la recuperación del fago. Para determinar si esta disminución o no era debida a la interiorización del fago por las células, los fagos se recuperaron lisando células tumorales 435 con una solución al 0,5% del detergente NP-40. Como se muestra en la Figura 1E, se recuperaron 10 a 20 veces más los fagos que presentan la SEC. ID. nº: 1 con detergente que sin detergente, lo que indica que los fagos eran interiorizados por las células tumorales.

Se utilizó el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) conjugado con fluoresceína para analizar con más detalle la interiorización celular y la localización subcelular. El péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) conjugado con fluoresceína y un péptido de referencia conjugado con fluoresceína que contenía tres restos básicos se sintetizaron según Wender et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97:13003 (2000). Los péptidos conjugados con fluoresceína se incubaron con células tumorales MDA-MB-435 cultivadas durante una a cinco horas a 37ºC. Como se muestra en la Figura 2A, el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) marcado con fluoresceína fue absorbido por las células 435 y trasladado dentro del núcleo celular. En cambio, no hubo absorción detectable por las células del péptido de referencia marcado con fluoresceína (véase la Figura 2B). Además, el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) conjugado con fluoresceína fue interiorizado y transportado al interior de los núcleos in vivo. Las células 435 cultivadas también interiorizaron el fago CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1), aunque el fago se acumuló en el citoplasma de las células.

Estos resultados demuestran que el fago que presenta CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) y un conjugado de fluoresceína SEC. ID. nº: 1 fueron interiorizados por las células.

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Ejemplo 4 Localización del péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) con marcadores linfáticos VEGFR-3 y LYVE-1

Este ejemplo demuestra que la SEC. ID. nº: 1 del péptido localiza el conjunto de vasos linfáticos.

A. La SEC. ID. nº: 1 del péptido localiza los vasos que son negativos para los marcadores de los vasos sanguíneos

La localización del fago que presenta la SEC. ID. nº: 1 fue analizada con el anticuerpo del fago anti-T7 después de la inyección intravenosa del fago que presenta la CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) en la vena de la cola de ratones lampiños que llevan un tumor con MDA-MB-435. El fago que presenta la CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) se localiza en estructuras vasiformes en algunas células individuales en los tumores 435. Los vasos en los que el fago estaba localizado eran negativos para Meca-32, marcador específico para los vasos sanguíneos y negativo también para CD31, que se expresa de manera más predominante en los vasos sanguíneos que en los vasos linfáticos. Se obtuvieron resultados similares mediante un ensayo sobrepuesto en el fago en el que los fagos se añadían en secciones de tejido congeladas, en lugar de inyectarse en los ratones.

Cuando el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) conjugado con fluoresceína se inyectó en la vena de la cola de ratones que llevan el tumor 435, el péptido conjugado con fluoresceína se localizó en estructuras vasiformes y en células individuales dentro del tumor. Estos vasos eran negativos para los marcadores de los vasos sanguíneos CD31 y Meca-32. Como se observa en las Figuras 3A-C, había una falta notable de localización conjunta del péptido conjugado con fluoresceína con los vasos sanguíneos marcados con lectina de tomate conjugada con biotina. Aun cuando partes del tumor contenían tanto el péptido como vasos sanguíneos, sus posiciones eran distintas (Figuras 3G-I). Estos datos indican que las estructuras vasiformes dirigidas por el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) no eran vasos sanguíneos.

Varios tejidos normales fueron estudiados para la localización del péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1). Se observó fluorescencia solamente en los túbulos renales, que puede ser resultado de la absorción del péptido en el filtrado glomerular. El péptido de referencia marcado con fluoresceína fue también detectado en la misma medida en los túbulos renales tras la inyección intravenosa, pero no se detectó en el tejido tumoral, lo que indica que la localización del péptido en los túbulos renales no era específica.

Se preparó antisuero anti-T7 inmunizando conejos blancos de Nueva Zelanda con 10^{10} pfu de fago T7 no recombinante (Novagen). Se realizó la inmunización inicial en adyuvante completo de Freund, mientras se administraban refuerzos en adyuvante incompleto de Freund. El valor del anticuerpo fue estimado por ELISA, y el antisuero se absorbió frente a BLT5615 bacteriano y lisados de hígado de ratón. Se detectaron fagos utilizando antisuero de fago anti-T7 (dilución 1:1.000) y anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con fluoresceína.

La detección de péptidos fluorescentes y de lectina de tomate conjugada con biotina se realizó de la manera siguiente. Se preparó el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) conjugado con fluoresceína como se describió anteriormente. Se inyectó el péptido (100 \mug en 200 \mul de PBS) en la vena de la cola de ratones que llevan tumores de carcinoma de mama con MDA-MB-435. Después de 10 minutos, se inyectó también en la vena de la cola lectina (100 \mug en 200 \mul de PBS; Vector; Burlingame, California) de lycopersicon esculentum (tomate) conjugada con biotina. Después de 5 minutos, se perfundió al ratón a través del corazón con paraformaldehído al 4%. Se extrajeron los tejidos y se congelaron en medio impregnado en O.C.T. (Tissue-Tek; Torrence, California). Se observaron los vasos sanguíneos detectando la lectina de tomate con Alexa 594 conjugada con estreptavidina (Molecular Probes; Eugene, Oregón). La tinción verde indicó la presencia del péptido SEC. ID. nº: 1, mientras que la tinción roja indicaba la presencia de lectina de tomate.

B. El péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) se dirige a los vasos linfáticos y en las células en el interior de los tumores

Los tumores de carcinoma de mama con MDA-MB-435 contienen vasos linfáticos que son positivos a los marcadores de las células endoteliales linfáticas. Para determinar si el CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) se dirigía a los vasos linfáticos del tumor con 435, se tiñeron secciones del tumor con los marcadores linfáticos VEGFR-3 y LYVE-1. Se observaron los vasos linfáticos utilizando un anticuerpo VEGFR-3 antiratón de rata o con anticuerpo anti-LYVE-1 de conejo producido como se describe a continuación.

Como se muestra en la Figura 4, las estructuras vasiformes en el tumor se tiñeron con anticuerpos contra ambos marcadores linfáticos. Solamente un pequeño número de estos vasos eran vasos sanguíneos, como se muestra mediante la rara aparición de solapamiento de VEGFR-3 y el marcado de lectina y de tomate inyectada. En cambio, la SEC. ID. nº: 1 del péptido CGNKRTRGC conjugado con fluoresceína se localizó conjuntamente con la tinción de VEGFR-3 y LYVE-1 en tejido tumoral con 435 (véase la Figura 5). Además, el péptido conjugado con fluoresceína (SEC. ID. nº: 1) se acumuló en los núcleos revistiendo las estructuras vasiformes (Figura 5C). Estos resultados indican que la SEC. ID. nº: 1 del péptido se dirige de manera selectiva al conjunto de vasos linfáticos del
tumor.

El péptido con la CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) se acumuló también en las células individuales positivas a VEGFR-3 dentro del tumor y en las estructuras que se asemejan al modelo de tinción observado en los vasos linfáticos colapsados en tejidos humanos (Fukuda et al. The Prostate 44:332 (2000) y Ebata et al., Microvasc. Res. 61: 40 (2001)); estas estructuras eran sólo ocasionalmente positivas para VEGFR-3 o LYVE-1. Las células individuales positivas a VEGFR-3 no eran macrófagos, que pueden infiltrar tumores, como se puso en evidencia por una falta de localización conjunta de la SEC. ID. nº: 1 y el marcador F4/80 del macrófago. Las células individuales positivas a VEGFR-3 pueden estar implicadas en el desarrollo de células endoteliales linfáticas, por ejemplo, linfangioblastos (Schneider et al., Dev. Dyn. 216: 311 (1999) o en las células endoteliales que migran de un tipo mixto tal como las descritas por Wigle et al., Cell 98: 769 (1999).

El anticuerpo LYVE-1 fue producido por conejos blancos de Nueva Zelanda inmunizados con un péptido que codifica la mayoría de los 19 restos con terminal C de LYVE-1 de ratón (Prevo et al., J. Biol. Chem. 276:19420 (2001)) conjugados con hemocianina de lapa californiana (KLH; Pierce; Iselin, Nueva Jersey). La inmunización inicial se realizó en adyuvante completo de Freund, con refuerzos realizados en adyuvante incompleto de Freund. Se obtuvo anticuerpo específico después de la purificación por afinidad con el péptido acoplado a gel Sulfolink (Pierce). Los tejidos se procesaron durante quince minutos tras la inyección de péptido conjugado con fluoresceína utilizando anti-VEGFR-3 antiratón de rata y anti-LYVE-1 de conejo. Se utilizó anticuerpo anti-LYVE-1 a una dilución 1:500 en secciones cryo, seguido de detección con anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con Alexa 594 (Molecular Probes).

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Ejemplo 5 Autodirección in vivo del péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) que presenta al fago después de la inyección subcutánea

Este ejemplo demuestra la autodirección in vivo de la SEC. ID. nº: 1 que presenta el fago a células linfáticas de tumor MDA-MB-435 después de la inyección subcutánea.

La inyección subcutánea e intravenosa del fago se realizó de la manera siguiente. El fago con CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) (5 \times 10^{9} PFU) se inyectó por vía subcutánea (s.c.) aproximadamente 3 cm en un tumor con 435 o dentro de la vena de la cola (i.v.) de un ratón con tumor con 435. Tras 12 minutos, el ratón se perfundió a través del corazón con 20 ml de PBS, y se eliminaron el tumor y el órgano de referencia. Los fagos no ligados se eliminaron mediante varios lavados y los fagos ligados se recuperaron añadiendo bacterias y se valoraron.

Como se muestra en la Figura 6, se observó un enriquecimiento sorprendente del fago que lleva la SEC. ID. nº: 1 en el tumor con relación al fago no recombinante tras la inyección subcutánea. Como se muestra más en la Figura 6, un fondo significativamente menor del fago con la CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) estaba presente en el órgano de referencia tras la inyección subcutánea en comparación con el fondo resultante de la inyección intravenosa. Estos resultados demuestran más la especificidad del vaso linfático del péptido con CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) e indican que el fago que presenta la SEC. ID. nº: 1 y el péptido pueden acumularse en los vasos linfáticos de un tumor en minutos después de haber sido inyectados por vía intravenosa.

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Ejemplo 6 Actividad citotóxica del péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1)

Este ejemplo demuestra que la SEC. ID. nº: 1 del péptido tiene actividad citotóxica en el cultivo celular e in vivo.

Se incubaron células MDA-MB-435 cultivadas con un péptido de referencia (CGEKRTRGC; SEC. ID. nº: 3) o con CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) a 37ºC durante 1, 2 ó 4 horas. Después de la tinción con azul de tripano, que es absorbido por las células que están muertas o que se tiñen, se contó el número total de células y se determinó el porcentaje de células teñidas con azul de tripano. Como se muestra en la Figura 7, se observó un efecto citotóxico aumentado de manera significativa con la SEC. ID. nº: 1 del péptido en comparación con la SEC. ID. nº: 3 del péptido de referencia en los últimos puntos de tiempo. En particular, tras cuatro horas de incubación, por lo menos 7 veces más de absorción de azul de tripano era evidente en los cultivos de células incubados con la SEC. ID. nº: 1 del péptido en comparación con los cultivos incubados con el péptido de referencia. Estos resultados indican que la SEC. ID. nº: 1 del péptido presenta actividad citotóxica.

Se llevó a cabo un estudio del tratamiento del tumor utilizando xenotransplantes de células de carcinoma de mama humano con MDA-MB-435 preparados inyectando por vía subcutánea 1 \times 10^{6} en 200 \mul de PBS en ratones lampiños. Se trataron por vía intravenosa los ratones (cinco por grupo) dos veces a la semana con 67 nmoles del péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) o con PBS comenzando cuatro semanas después de la implantación del tumor. Se midieron los volúmenes del tumor una vez a la semana durante cuatro semanas. Como se muestra en la Figura 8, el volumen medio del tumor era por lo menos varias veces menor en los ratones administrados con la SEC. ID. nº: 1 del péptido que en los ratones administrados con PBS solo empezando después de dos semanas de tratamiento. Estos resultados demuestran que el péptido CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1) tiene actividad citotóxica in vivo e indican que este péptido y los péptidos que se unen al mismo receptor pueden ser útiles para ralentizar o prevenir el crecimiento del tumor in vivo.

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<110> The Burnham Institute

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Laakkonen, Pirjo

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Porkka, Kimmo

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Hoffman Jason A.

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Ruoslahti, Erkki

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<120> Péptidos que se dirigen al conjunto de vasos linfáticos del tumor y procedimientos de utilización de los mismos

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<130> FP-LJ 5423

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<150> US 10/007,792

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<151> 2001-11-08

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<160> 8

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<170> FastSEQ para Windows Version 4.0

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<210> 1

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Construcción sintética

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<400> 1

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2

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<210> 2

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Construcción sintética

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<400> 2

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\hskip1cm

3

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Construcción sintética

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<400> 3

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\hskip1cm

4

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<210> 4

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Construcción sintética

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<400> 4

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\hskip1cm

5

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<210> 5

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Construcción sintética

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<400> 5

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\hskip1cm

6

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<210> 6

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Construcción sintética

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<400> 6

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\hskip1cm

7

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<210> 7

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Construcción sintética

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<400> 7

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\hskip1cm

8

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<210> 8

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Construcción sintética

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<400> 8

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\hskip1cm

9

Claims

1. Péptido aislado, que comprende la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2).

2. Péptido aislado según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos CGNKRTRGC (SEC. ID. nº: 1).

3. Péptido aislado según la reivindicación 1 ó 2, que está limitado en su conformación.

4. Péptido aislado según la reivindicación 1 ó 2, que es cíclico.

5. Péptido aislado según la reivindicación 1 ó 4, que presenta una longitud inferior a 100 restos.

6. Péptido aislado según la reivindicación 5, que presenta una longitud inferior a 50 restos.

7. Péptido aislado según la reivindicación 6, que presenta una longitud inferior a 20 restos.

8. Péptido aislado según la reivindicación 7, que presenta una longitud inferior a 15 restos.

9. Conjugado, que comprende un fragmento unido a una molécula autodirigida que se dirige selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor, en el que dicha molécula autodirigida comprende un péptido según las reivindicaciones 1 a 8.

10. Conjugado según la reivindicación 9, en el que la porción peptídica de dicho conjugado presenta una longitud como máximo de 200 restos.

11. Conjugado según la reivindicación 10, en el que la porción peptídica de dicho conjugado presenta una longitud como máximo de 50 restos.

12. Conjugado según las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho fragmento es un agente terapéutico.

13. Conjugado según las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho fragmento es un agente de quimioterapia contra el cáncer.

14. Conjugado según las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho fragmento es un agente citotóxico.

15. Conjugado según las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho fragmento es un agente antilinfangiógeno.

16. Conjugado según las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho fragmento es un marcador detectable.

17. Conjugado según las reivindicaciones 9 a 11, que comprende por lo menos dos moléculas autodirigidas, dirigiéndose cada una de ellas selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor.

18. Conjugado según la reivindicación 17, que comprende por lo menos diez moléculas autodirigidas, dirigiéndose cada una de ellas selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor.

19. Conjugado según la reivindicación 18, que comprende por lo menos 100 moléculas autodirigidas, dirigiéndose cada una de ellas selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor.

20. Conjugado según las reivindicaciones 9 a 11, que comprende por lo menos dos moléculas autodirigidas, dirigiéndose cada una de ellas selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor, comprendiendo independientemente cada una de dichas moléculas autodirigidas la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2).

21. Conjugado según la reivindicación 20, que comprende por lo menos diez moléculas autodirigidas, dirigiéndose cada una de ellas selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor, comprendiendo independientemente cada una de dichas moléculas autodirigidas la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2).

22. Conjugado según la reivindicación 21, que comprende por lo menos 100 moléculas autodirigidas, dirigiéndose cada una de ellas selectivamente al conjunto de vasos linfáticos del tumor, comprendiendo independientemente cada una de dichas moléculas autodirigidas la secuencia de aminoácidos GNKRTRG (SEC. ID. nº: 2).

23. Conjugado según las reivindicaciones 9 a 11, 19 ó 22, en el que dicho fragmento es un fago.

24. Utilización del conjugado según las reivindicaciones 9 a 23 para la preparación de una composición farmacéutica destinada a dirigir un fragmento al conjunto de vasos linfáticos en un individuo.

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25. Utilización del conjugado según las reivindicaciones 9 a 11 ó 16, que comprende un marcador detectable unido a una molécula autodirigida para la preparación de una composición de diagnóstico destinada a obtener una imagen del conjunto de vasos linfáticos del tumor en un sujeto.

26. Utilización según la reivindicación 25, en la que dicho marcador detectable es un radionúclido.

27. Utilización según la reivindicación 26, en la que dicho radionúclido se selecciona de entre el grupo constituido por indio-111, tecnecio-99, carbono-11 y carbono-13.

28. Utilización del conjugado según las reivindicaciones 9 a 15 para la preparación de una composición farmacéutica destinada a reducir o inhibir la metástasis tumoral en un individuo.

29. Utilización del conjugado de las reivindicaciones 9 a 15 para la preparación de una composición farmacéutica destinada a reducir el número de vasos linfáticos del tumor en un individuo.

30. Utilización del conjugado de las reivindicaciones 9 a 15 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del cáncer en un individuo.