ES2951520T3 - Síntesis e intermedios de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la síntesis y a los intermedios para la preparación de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3- dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5-il)ciclopropanocarboxamida (Compuesto 1). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Síntesis e intermedios de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a compuestos intermedios y procesos para preparar compuestos intermedios que pueden utilizarse en la síntesis de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] RTFQ es un canal de aniones mediado por cAMP/ATP que se expresa en una variedad de tipos de células, incluyendo absorción y células epiteliales secretoras, donde se regula el flujo de aniones a través de la membrana, así como la actividad de otros canales de iones y proteínas. En las células epiteliales, el funcionamiento normal de la RTFQ es crítica para el mantenimiento de transporte de electrolitos en todo el cuerpo, incluyendo las vías respiratorias y el tejido digestivo. RTFQ se compone de aproximadamente 1480 aminoácidos que codifican una proteína compuesta de una repetición en tándem de dominios de transmembrana, cada uno con seis hélices de transmembrana y un dominio de unión a nucleótidos. Los dos dominios de transmembrana están unidos por un (R)- dominio grande, polar, regulador con múltiples sitios de fosforilación que regulan la actividad del canal y el tráfico celular.

[0003] El gen que codifica RTFQ se ha identificado y secuenciado (véase Gregory, RJ et al (1990) Nature 347: 382­ 386; Rich, DP et al (1990) Nature 347: 358-362), (Riordan, JR et al (1989) Science 245: 1066-1073). Un defecto en este gen causa mutaciones en RTFQ que resultan en la fibrosis quística (“FQ”), la enfermedad genética fatal más común en seres humanos. La fibrosis quística afecta a aproximadamente uno de cada 2.500 recién nacidos en los Estados Unidos. Dentro de la población general de Estados Unidos, hasta 10 millones de personas llevan una sola copia del gen defectuoso sin efectos aparentes de enfermedad. Por el contrario, individuos con dos copias del gen de la FQ asociada sufren los efectos debilitantes y mortales de la FQ, incluyendo la enfermedad pulmonar crónica.

[0004] En los pacientes con fibrosis quística, las mutaciones en RTFQ endógenamente expresada en el epitelio respiratorio producen reducción de la secreción de aniones apicales, causando un desequilibrio en el transporte de iones y fluidos. La disminución resultante en el transporte de aniones contribuye a mejorar la acumulación de moco en el pulmón y las infecciones microbianas acompañantes que en última instancia causan la muerte en pacientes con FQ. Además de las enfermedades respiratorias, los pacientes con FQ típicamente padecen problemas gastrointestinales e insuficiencia pancreática que, si no se trata, da como resultado la muerte. Además, la mayoría de los hombres con fibrosis quística son infértiles y la fertilidad disminuye en las mujeres con fibrosis quística. En contraste con los efectos graves de dos copias del gen de FQ asociada, los individuos con una sola copia del gen FQ asociado exhiben una mayor resistencia al cólera y a la deshidratación resultante de la diarrea - quizás para explicar la relativamente alta frecuencia del gen de la FQ en la población.

[0005] El análisis de secuencia del gen RTFQ de cromosomas FQ ha revelado una variedad de mutaciones causantes de enfermedad (Cutting, GR et al (1990) Nature 346: 366-369; Dean, M. et al (1990) Cell 61: 863-870; y Kerem, B-S et al (1989) Science 245: 1073-1080; Kerem, BS et al (1990) Proc Natl Acad Sei EE.UU. 87: 8.447- 8.451). Flasta la fecha, más de 1000 mutaciones causantes de enfermedad en el gen de la FQ se han identificado según lo informado por la literatura científica y médica. La mutación más frecuente es una deleción de fenilalanina en la posición 508 de la secuencia de ácido RTFQ amino, y se conoce comúnmente como AF508-RTFQ. Esta mutación se produce en aproximadamente el 70 por ciento de los casos de fibrosis quística y se asocia con una enfermedad severa. Otras mutaciones incluyen la R117H y G551D.

[0006] La eliminación del residuo 508 en AF508-RTFQ impide que la proteína naciente se pliegue correctamente. Esto da como resultado la incapacidad de la proteína mutante para salir del ER, y el tráfico a la membrana plasmática. Como resultado, el número de canales presentes en la membrana es mucho menor que el observado en células que expresan RTFQ de tipo salvaje. Además de un tráfico deficiente, la mutación resulta en un canal defectuoso. En conjunto, el número reducido de canales en la membrana y la compuerta defectuosa llevan a la reducción de transporte de aniones a través de los epitelios que conduce a transporte defectuoso de iones y fluidos. (Quinton, P. M. (1990), AFASEB J. 4: 2709-2727). Los estudios han demostrado, sin embargo, que los números reducidos de F508-RTFQ en la membrana son funcionales, aunque menos que los de tipo salvaje RTFQ. (. 0526 a 528; Denning et al, supra; Pasyk y Foskett (1995), J. Cell Biochem 270: 12347-50.). Además de AF508-RTFQ, otra enfermedad que causa mutaciones en RTFQ que resultan en el tráfico defectuoso, síntesis, y/o compuerta de canal podría regularse hacia arriba y hacia abajo para alterar la secreción de aniones y modificar la progresión y/o gravedad de la enfermedad.

[0007] A pesar de que RTFQ transporta una variedad de moléculas, además de aniones, es evidente que esta función (el transporte de aniones) representa un elemento en un importante mecanismo de transporte de iones y agua a través del epitelio. Los otros elementos incluyen el canal epitelial de Na+, ENac, Na+/2CIVK+ cotransportador, bomba Na+-K+-ATPasa y los canales de K+ de membrana basolateral, que son responsables de la absorción de cloruro en la célula.

[0008] Estos elementos trabajan juntos para conseguir el transporte direccional a través del epitelio a través de su expresión selectiva y la localización dentro de la célula, absorción de cloruro tiene lugar mediante la actividad coordinada de ENaC y RTFQ presentes en la membrana apical y la bomba Na+-K+-ATPasa y los canales de Clexpresados en la superficie basolateral de la célula. El transporte activo secundario de cloruro desde el lado luminal conduce a la acumulación de cloruro intracelular, que después puede dejar pasivamente la célula a través de canales de Cl', dando como resultado un transporte vectorial. La disposición de Na+/2CI /K+ cotransportador, bomba Na+-K+-ATPasa y canales de K+ de membrana basolateral en la superficie basolateral y RTFQ en el lado luminal de coordina la secreción de cloruro a través de RTFQ en el lado luminal. Dado que el agua probablemente nunca se transporta activamente, su flujo a través de los epitelios depende de pequeños gradientes osmóticos transepiteliales generados por el flujo a granel de sodio y cloruro.

[0009] Como se discutió anteriormente, se cree que la eliminación de residuos 508 en AF508-RTFQ impide que la proteína naciente se pliegue correctamente, lo que resulta en la incapacidad de esta proteína mutante para salir de la sala de emergencia, y el tráfico a la membrana plasmática. Como resultado, cantidades insuficientes de la proteína madura están presentes en la membrana plasmática y el transporte de cloruro dentro de los tejidos epiteliales se reduce significativamente. De hecho, este fenómeno celular del procesamiento defectuoso retículo endoplásmico (ER) de unión a transportadores de ATP de casete (ABC) por la maquinaria ER, se ha demostrado que es la base subyacente no solo para la enfermedad de FQ, pero para una amplia gama de otros aislados y enfermedades hereditarias. Las dos formas de que la maquinaria ER pueda funcionar mal es ya sea por pérdida de acoplamiento a la exportación ER de las proteínas que conducen a degradación, ya sea por la acumulación ER de estas proteínas defectuosas/plegadas incorrectamente [Aridor M, et al., Nature Med., 5(7), pp 745-751 (1999); Shastry, B.S., et al., Neurochem. Internacional, 43, pp 1-7 (2003); Rutishauser, J., et al, Swiss Med Wkly, 132, pp 211-222 (2002); Morello, JP et al, TIPS, 21, pp 466- 469 (2000).; Bross P„ et al., Mut Humano., 14, pp. 186-198 (1999)].

[0010] ((R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida se describe en la solicitud de patente publicada de EE.UU. US20090131492 como un modulador de la actividad de RTFQ y por tanto útiles en el tratamiento de enfermedades mediadas por RTFQ como la fibrosis quística. Sin embargo, hay una necesidad de formas sólidas estables de dicho Compuesto que se pueden utilizar fácilmente en composiciones farmacéuticas adecuadas para uso como agentes terapéuticos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0011] La presente invención se describe en las reivindicaciones anexas y se refiere a un procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula:

que comprende las etapas de hacer reaccionar el compuesto de fórmula:

con un compuesto de fórmula:

en presencia de Pd(OAc)₂ para formar un compuesto de fórmula:

y haciendo reaccionar el compuesto de fórmula:

en presencia de (MeCN)₂PdCl2 para formar un compuesto de fórmula:

[0012] En ciertas formas de realización, la preparación del compuesto de fórmula:

comprende las etapas de hacer reaccionar un compuesto de fórmula:

con perclorato de cinc dihidratado y un compuesto de fórmula:

seguido de una reducción con hidrógeno y Pt(S)/C, y formando a continuación el compuesto de fórmula:

[0013] En ciertas formas de realización, el compuesto

se prepara haciendo reaccionar un compuesto de fórmula:

con N-bromosuccinimida en EtOAc para formar un compuesto de Fórmula:

La presente invención también se refiere a un compuesto seleccionado de:

o una sal del mismo.

[0015] En ciertas formas de realización, el compuesto es:

o una sal del mismo.

[0016] Tales procesos y compuestos son útiles en la síntesis de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida (en adelante "Compuesto 1") y formas sólidas del mismo. El Compuesto 1 tiene la estructura siguiente:

[0017] El compuesto 1 y composiciones farmacéuticamente aceptables del mismo son útiles para tratar o disminuir la gravedad de enfermedades mediadas por RTFQ, tales como, por ejemplo, fibrosis quística. El compuesto 1 está en una forma sustancialmente amorfa tal como se describe y se caracteriza en el presente documento. Las propiedades de un sólido correspondiente a su eficacia como un fármaco pueden depender de la forma del sólido. Por ejemplo, en una sustancia de fármaco, la variación en la forma sólida puede conducir a diferencias en las propiedades tales como punto de fusión, velocidad de disolución, la absorción oral, la biodisponibilidad, los resultados de toxicología y resultados de los ensayos clínicos.

[0013] Los procesos descritos aquí pueden ser utilizados para preparar las composiciones de esta invención que comprende una forma amorfa sustancialmente sólida del Compuesto 1 que se describen en el presente documento, o ambos. Las cantidades y las características de los componentes utilizados en los procesos se describen en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0019]

La Figura 1 es un patrón de difracción de polvo de rayos X del Compuesto 1.

La Figura 2 es una traza de calorimetría diferencial de barrido (DSC) del Compuesto 1.

La Figura 3 es parcela de análisis termogravimétrico (TGA) del Compuesto 1.

La Figura 4 es un patrón de difracción de polvo de rayos X calculado a partir de un único cristal de Forma A de Compuesto 1.

La Figura 5 es un patrón de difracción de polvo de rayos X real de la Forma A de Compuesto 1 preparado por la técnica de suspensión (2 semanas) con DCM como disolvente.

La Figura 6 es una traza de calorimetría diferencial de barrido (DSC) de la Forma A de Compuesto 1.

La Figura 7 es un patrón de difracción de polvo de rayos X real de Forma A de Compuesto 1 preparado por el método de evaporación rápida a partir de acetonitrilo.

La Figura 8 es un patrón de difracción de polvo de rayos X real de Forma A de Compuesto 1 preparado por el método de lucha contra disolvente usando EtOAc y heptano.

La Figura 9 es una imagen conformacional de la Forma A de Compuesto 1 basada en el análisis de cristal único de rayos X.

La Figura 10 es una imagen conformacional que muestra el orden de apilamiento de la Forma A de Compuesto 1.

La Figura 11 es un espectro de estado sólido 13C RMN (spinning 15,0 kHz) de la Forma A de Compuesto 1.

La Figura 12 es un espectro de estado sólido 19F RMN (spinning 12,5 kFIz) de la Forma A de Compuesto 1.

La Figura 13 es un patrón de difracción de polvo de rayos X de la Forma A de Compuesto 1 amorfa a partir del método de evaporación rotatoria de evaporación rápida.

La Figura 14 es una traza de calorimetría diferencial de barrido modulada (MDSC) de la Forma A de Compuesto 1 amorfa preparada por el método de evaporación rotatorio de evaporación rápida.

La Figura 15 es un gráfico de análisis termogravimétrico (TGA) de la Forma A de Compuesto 1 amorfa preparada por el método de evaporación rotatorio de evaporación rápida.

La Figura 16 es un patrón de difracción de polvo de rayos X de la Forma A de Compuesto 1 amorfa preparada por métodos de secado por pulverización.

La Figura 17 es una traza de calorimetría diferencial de barrido modulada (MDSC) de la forma amorfa de Compuesto 1 preparada por métodos secados por pulverización.

La Figura 18 es un espectro de 13C RMN de estado sólido (spinning 15,0 kHz) de la forma amorfa de Compuesto

La Figura 19 es un espectro estado sólido 19F de RMN (spinning 12,5 kHz) de la forma amorfa de Compuesto 1.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Definiciones

[0020] Tal como se usa en el presente documento, se aplicarán las siguientes definiciones a menos que se indique lo contrario.

[0021] EI término "RTFQ" como se usa en el presente documento significa regulador de conductancia de transmembrana de fibrosis quística o una mutación capaz de actividad reguladora, incluyendo, pero no limitado a AF508 RTFQ y G551 D RTFQ (véase, por ejemplo, http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/, para mutaciones de RTFQ).

[0022] Tal como se utiliza aquí, el término "amorfo" se refiere a formas sólidas que consisten en disposiciones desordenadas de moléculas y no poseen una red cristalina distinguible.

[0023] Como se usa aquí, "cristalino" se refiere a Compuestos o composiciones en las que las unidades estructurales están dispuestas en patrones o retículas geométricas fijas, de manera que los sólidos cristalinos tienen orden de escala larga rígida. Las unidades estructurales que constituyen la estructura cristalina pueden ser átomos, moléculas, o iones. Los sólidos cristalinos muestran puntos de fusión definidos.

[0024] El término "modulación", como se usa en este documento significa aumentar o disminuir, por ejemplo, actividad, en una cantidad medible.

[0025] El término "químicamente estable", como se usa aquí, significa que la forma sólida de Compuesto 1 no se descompone en uno o más Compuestos químicos diferentes cuando se someten a condiciones especificadas, por ejemplo, 40°C/75% de humedad relativa, durante un período de tiempo específico, p.ej. 1 día, 2 días, 3 días, 1 semana, 2 semanas o más. En algunas formas de realización, menos de 25% de la forma sólida del Compuesto 1 se descompone, en algunas formas de realización, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 1%, menos de aproximadamente 0,5% de la forma de Compuesto 1 se descompone en las condiciones especificadas. En algunas formas de realización, ninguna cantidad detectable de la forma sólida de Compuesto 1 se descompone.

[0026] El término "físicamente estable", como se usa aquí, significa que la forma sólida de Compuesto 1 no cambia en una o más formas físicas diferentes del Compuesto 1 (por ejemplo, formas sólidas diferentes tal como se mide mediante XRPD, DSC, etc.) cuando se somete a condiciones específicas, por ejemplo, 40°C/75% de humedad relativa, durante un período de tiempo específico, p.ej. 1 día, 2 días, 3 días, 1 semana, 2 semanas o más. En algunas formas de realización, menos de 25% de la forma sólida del Compuesto 1 se transforma en una o más formas físicas diferentes cuando se someten a condiciones especificadas. En algunas formas de realización, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 1%, menos de aproximadamente 0,5% de la forma sólida del Compuesto 1 se transforma en una o más formas físicas diferentes del Compuesto 1 cuando se sometieron a condiciones especificadas. En algunas formas de realización, ninguna cantidad detectable de la forma sólida del Compuesto 1 cambia en una o más formas sólidas físicamente diferentes del Compuesto 1.

[0027] Tal como se usa en el presente documento, la frase "Compuesto 1 sustancialmente amorfo" se usa de manera intercambiable con las frases "Compuesto 1 amorfo", "Compuesto 1 amorfo sustancialmente libre de Compuesto 1 cristalino," y "sustancialmente amorfo (R)-1 -(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-ilo)-N-(1 -(2,3- dihidroxipropilo)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropano-2-ilo)-1H-indol-5-ilo)ciclopropanocarboxamida". En algunas formas de realización, el Compuesto 1 sustancialmente amorfo tiene menos de aproximadamente 30% de Compuesto 1 cristalino, por ejemplo, menos de aproximadamente 30% de Compuesto 1 cristalino, por ejemplo, menos de aproximadamente 25% de Compuesto 1 cristalino, menos de aproximadamente 20% de Compuesto 1 cristalino, menos de aproximadamente 15% de Compuesto 1 cristalino, menos de aproximadamente 10% de Compuesto 1 cristalino, menos de aproximadamente 5% de Compuesto 1 cristalino, menos de aproximadamente 2% de Compuesto 1 cristalino.

[0028] Tal como se usa aquí, la expresión "Forma A de Compuesto 1 sustancialmente cristalina" se usa indistintamente con las expresiones "Forma A de Compuesto 1" y "Forma A de Compuesto 1 cristalino sustancialmente libre del Compuesto 1 amorfo". En algunas formas de realización, Forma A de Compuesto 1 sustancialmente cristalina tiene menos de aproximadamente 30% de Compuesto 1 amorfo o en otras formas sólidas, por ejemplo, menos de aproximadamente 30% de Compuesto 1 amorfo o en otras formas sólidas, por ejemplo, menos de aproximadamente 25% de Compuesto 1 amorfo o en otras formas sólidas, menos de aproximadamente 20% de Compuesto 1 amorfo o en otras formas sólidas, menos de aproximadamente 15% de Compuesto 1 amorfo o en otras formas sólidas, menos de aproximadamente 10% de Compuesto 1 amorfo o en otras formas sólidas, menos de aproximadamente 5% Compuesto 1 amorfo u otras formas sólidas, menos de aproximadamente 2% de Compuesto 1 amorfo u otras formas sólidas. En algunas formas de realización, Forma A de Compuesto 1 sustancialmente cristalina tiene menos de aproximadamente 1% de Compuesto 1 amorfo u otras formas sólidas.

[0029] EI término "sustancialmente libre" (como en la frase "sustancialmente libre de la forma X") cuando se refiere a una forma sólida designada del Compuesto 1 (por ejemplo, una forma amorfa o cristalina descrita en este documento) significa que hay menos de 20% (en peso) de la forma designada o co-forma (por ejemplo, una forma cristalina o amorfa del Compuesto 1) presente, más preferentemente, no es inferior a 10% (en peso) de la forma designada presente, más preferentemente, no es inferior a 5% (en peso) de la forma designada presente, y lo más preferiblemente, hay menos de 1% (en peso) de la forma designada presente.

[0030] EI término "sustancialmente puro" cuando se refiere a una forma sólida designada del Compuesto 1 (por ejemplo, una forma de sólido amorfo o cristalino se describe en el presente documento) significa que la forma sólida designada contiene menos de 20% (en peso) de componentes residuales tales como forma o co-forma de cristalina alternativa polimórfica o isomórfica del Compuesto 1. Se prefiere que una forma sólida sustancialmente pura del Compuesto 1 contiene menos de 10% (en peso) de formas cristalinas polimórficas o isomórficas alternativas de Compuesto 1, más preferiblemente menos de 5% (en peso) de formas cristalinas polimórficas o isomórficas alternativas de Compuesto 1, y lo más preferiblemente menos de 1% (en peso) de formas cristalinas polimórficas o isomórficas alternativas de Compuesto 1.

[0031] Tal como se utiliza aquí, una "dispersión" se refiere a un sistema disperso en la que se distribuye una sustancia, la fase dispersa, en unidades discretas, a través de una segunda sustancia (la fase continua o vehículo). El tamaño de la fase dispersa puede variar (por ejemplo, partículas coloidales de dimensión nanométrica, a varios micrómetros de tamaño) considerablemente. En general, las fases dispersas pueden ser sólidas, líquidas o gases. En el caso de una dispersión sólida, las fases dispersa y continua son sólidos. En aplicaciones farmacéuticas, una dispersión sólida puede incluir un fármaco cristalino (fase dispersa), en un polímero amorfo (fase continua), o alternativamente, un fármaco amorfo (fase dispersa) en un polímero amorfo (fase continuos). En algunos aspectos una dispersión sólida amorfa incluye el polímero que constituye la fase dispersa, y el fármaco constituye la fase continua. En algunos aspectos, la dispersión incluye Compuesto 1 amorfo o el Compuesto 1 sustancialmente amorfo.

[0032] El término "dispersión sólida amorfa" se refiere en general a una dispersión sólida de dos o más componentes, por lo general un fármaco y el polímero, pero que posiblemente contiene otros componentes tales como tensioactivos u otros excipientes farmacéuticos, donde el Compuesto 1 es amorfo o sustancialmente amorfo (por ejemplo, sustancialmente libre de Compuesto 1 cristalino), y la estabilidad física y/o disolución y/o solubilidad del fármaco amorfo se ve reforzada por los otros componentes.

[0033] Tal como se usa en el presente documento, los términos "cerca de" y "aproximadamente", cuando se usa en relación con las dosis, cantidades, o porcentaje en peso de los ingredientes de una composición o una forma de dosificación, significan una dosis, la cantidad o porcentaje en peso que es reconocido por expertos en la técnica para proporcionar un efecto farmacológico equivalente al obtenido a partir de la dosis especificada, cantidad o porcentaje en peso. Específicamente el término "cerca de" o "aproximadamente" significa un error aceptable para un valor particular como se determina por un experto normal en la técnica, que depende en parte de cómo se mide o determina el valor. En ciertas formas de realización, el término "cerca de" o "aproximadamente" significa dentro de 1, 2, 3, o 4 desviaciones estándar. En ciertas formas de realización, el término "cerca de" o "aproximadamente" significa dentro de 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, o 0,05% de un valor o intervalo dado.

[0034] Las abreviaturas "MTBE" y "DCM" significan éter de metilo t-butilo y diclorometano, respectivamente.

[0035] La abreviatura "XFSPD" significa difracción en polvo de rayos X.

[0036] La abreviatura "DSC" significa calorimetría diferencial de barrido.

[0037] La abreviatura "TGA" significa análisis termogravimétrico.

[0038] A menos que se indique lo contrario, las estructuras representadas en este documento también pretenden incluir todas las formas isómeras (por ejemplo, formas enantioméricas, diastereoméricas, y geométricas (o conformacionales)) de la estructura; por ejemplo, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico, isómeros de doble enlace (Z) y (E), e isómeros conformacionales (Z) y (E). Por lo tanto, los isómeros estereoquímicos individuales, así como las mezclas enantioméricas, diastereoméricas, y geométricas (o conformacionales) de los presentes Compuestos están dentro del alcance de la invención. Todas las formas tautómeras del Compuesto 1 se incluyen en el presente documento. Por ejemplo, el Compuesto 1 puede existir como tautómeros, los cuales se incluyen en el presente documento:

[0039] Además, a menos que se indique otra cosa, también se pretende que las estructuras representadas en el presente documento incluyan compuestos que difieren sólo en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, el compuesto 1, en el que uno o más átomos de hidrógeno están deuterio o tritio reemplazados, o uno o más átomos de carbono se sustituyen por un carbono 13C o 14C enriquecido están dentro del alcance de esta invención. Tales compuestos son útiles, por ejemplo, como herramientas de análisis, sondas en ensayos biológicos, o compuestos con un mejor perfil terapéutico.

[0040] La presente invención se expone en las reivindicaciones adjuntas y se refiere a procesos para preparar compuestos intermedios y compuestos intermedios que son útiles en la síntesis de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida ("Compuesto 1").

[0041] (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida puede ser caracterizado como la Forma cristalina A.

[0042] La Forma A se caracteriza por uno o más picos a 19,3 a 19,7 grados, 21,5 a 21,9 grados, y 16,9 a 17,3 grados en un gráfico de difracción de polvo de rayos X obtenido usando radiación alfa Cu K. La Forma A se caracteriza por uno o más picos a aproximadamente 19,5, 21,7, y 17,1 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico a 20,2 a 20,6 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico a aproximadamente 20,4 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico a 18,6 a 19,0 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico a aproximadamente 18,8 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico a 24,5 a 24,9 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico a aproximadamente 24,7 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico en 9,8 a 10,2 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico a aproximadamente 10,0 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico en 4,8 a 5,2 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico a aproximadamente 5,0 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico a 24,0 a 24,4 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico a aproximadamente 24,2 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico a 18,3 a 18,7 grados. La Forma A se caracteriza además por un pico a aproximadamente 18,5 grados.

[0043] La Forma A se caracteriza por un patrón de difracción sustancialmente similar a la de la Figura 4. La forma A se caracteriza por un patrón de difracción sustancialmente similar a la de la Figura 5.

[0044] Una forma de cristal de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida que tiene un sistema monoclínico cristal, un grupo espacial C2, y las siguientes dimensiones de la celda unidad: a = 21,0952 (16) A, a = 90°, b = 6,6287 (5) A, p = 95,867 (6)°, c = 17,7917 (15) A, y y = 90°.

[0045] Una composición farmacéutica que comprende la forma A y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional. El agente terapéutico adicional se puede seleccionar de un agente mucolítico, broncodilatador, un agente antibiótico, un agente antiinfeccioso, un agente antinflamatorio, un potenciador RTFQ, o un agente nutricional.

[0046] Forma A puede ser preparada tras un proceso de suspensión que comprende (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida en un disolvente para una cantidad eficaz de tiempo. El disolvente puede ser acetato de etilo, diclorometano, MTBE, acetato de isopropilo, agua/etanol, agua/acetonitrilo, agua/metanol o agua/alcohol isopropílico. La cantidad eficaz de tiempo puede ser de 24 horas a 2 semanas. La cantidad eficaz de tiempo puede ser de 24 horas a 1 semana. La cantidad eficaz de tiempo puede ser de 24 horas a 72 horas.

[0047] Forma A puede ser preparada tras un proceso de disolución de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida en un disolvente y evaporando el disolvente. El disolvente puede ser acetona, acetonitrilo, metanol o alcohol isopropílico.

[0048] Forma A puede ser preparada tras un proceso de disolución de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida da en un primer disolvente y la adición de un segundo disolvente en el que (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida no es soluble. El primer disolvente puede ser acetato de etilo, etanol, alcohol isopropílico, o acetona. El segundo disolvente puede ser heptano o agua. La adición del segundo disolvente puede ser realizada mientras se agitaba la solución del primer disolvente y (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida.

[0049] Un sólido sustancialmente amorfo (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida. La (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida amorfa puede comprender menos de aproximadamente 5% cristalino (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida.

[0050] Una composición farmacéutica que comprende (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida amorfa y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra forma de realización, la composición farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional. En otro aspecto, el agente terapéutico adicional se puede seleccionar de un agente mucolítico, broncodilatador, un antibiótico, un agente anti- infeccioso, un agente antinflamatorio, un potenciador RTFQ, o un agente nutricional.

[0051] La (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida amorfa puede ser preparada tras un proceso que comprende la disolución de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida en un disolvente adecuado y eliminando el disolvente por evaporación rotatoria. El disolvente es metanol.

[0052] Una dispersión sólida que comprende (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida amorfa y un polímero. El polímero puede ser hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). El polímero pude ser acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS).

[0053] El polímero podrá estar presente en una cantidad de 10% en peso a 80% en peso. En otro aspecto, el polímero está presente en una cantidad de 30% en peso a 60% en peso. El polímero puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 49,5% en peso.

[0054] La (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida está presente en una cantidad de 10% en peso a 80% en peso. En otro aspecto, la (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida está presente en una cantidad de 30% en peso a 60% en peso. En otro aspecto, la (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida está presente en una cantidad de aproximadamente 50% en peso.

[0055] La dispersión sólida comprende además un tensioactivo. El agente tensioactivo puede ser laurilsulfato de sodio. El tensioactivo puede estar presente en una cantidad de 0,1% en peso a 5% en peso. El agente surfactante puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,5% en peso.

[0056] El polímero puede ser acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa (FIPMCAS) en la cantidad de 49,5% en peso, el tensioactivo puede ser sulfato de laurilo de sodio en la cantidad de 0,5% en peso, y la (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida está presente en la cantidad de 50% en peso.

[0057] Una composición farmacéutica que puede comprender la dispersión sólida y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender además un agente terapéutico adicional. El agente terapéutico adicional se puede seleccionar de un agente mucolítico, broncodilatador, un antibiótico, un agente antiinfeccioso, un agente antinflamatorio, un potenciador RTFQ, o un agente nutricional.

[0058] (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida amorfa puede ser preparada por un procedimiento que comprende la pulverización a secado (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida.

[0059] El procedimiento puede comprender la combinación de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida y un disolvente adecuado y después el secado por pulverización de la mezcla para obtener (R)-1 -(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1 -(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1 -hidroxi-2-metilpropan-2-il)- 1 H-indol-5-il)ciclopropanocarboxamida amorfa.

El disolvente puede ser un alcohol. El disolvente puede ser metanol.

[0060] El procedimiento puede comprender: a) formar una mezcla que comprende (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida, un polímero, y un disolvente; y b) secar por pulverización la mezcla para formar una dispersión sólida.

[0061] El polímero puede ser acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS). El polímero puede estar en una cantidad de 10% en peso a 80% en peso de la dispersión sólida. El polímero puede estar en una cantidad de aproximadamente 49,5% en peso de la dispersión sólida. El disolvente puede ser metanol. La mezcla puede comprender además un tensioactivo. El surfactante puede ser laurilsulfato de sodio (SLS). El surfactante puede estar en una cantidad de 0,1% en peso a 5% en peso de la dispersión sólida. El surfactante puede estar en en una cantidad de aproximadamente 0,5% en peso de la dispersión sólida.

[0062] El polímero puede ser succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS) en la cantidad de aproximadamente 49,5% en peso de la dispersión sólida, el disolvente puede ser metanol, y la mezcla puede comprender además sulfato de laurilo de sodio en una cantidad de aproximadamente 0,5% en peso de la dispersión sólida.

[0063] Forma A, (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida amorfa, o la dispersión sólida de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida son útiles en un método de tratamiento de una enfermedad mediada por RTFQ en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la Forma A, (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida amorfa, o la dispersión sólida de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida amorfa.

[0064] La enfermedad mediada por RTFQ puede ser seleccionada de fibrosis quística, el asma, EPOC inducida por humo, bronquitis crónica, rinosinusitis, estreñimiento, pancreatitis, insuficiencia pancreática, la infertilidad masculina causada por ausencia bilateral congénita de los vasos deferentes (CBAVD), enfermedad leve pulmonar, pancreatitis idiopática, aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA), enfermedad del hígado, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, deficiencias de la coagulación-fibrinolisis, deficiencia de proteína C, angioedema hereditaria de Tipo 1, deficiencias de procesamiento de lípidos, la hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia de Tipo 1, abetalipoproteinemia, enfermedades de almacenamiento lisosomal, enfermedad de células l/pseudo-Hurler, mucopolisacaridosis, Sandhof/Tay-Sachs, Crigler-Najjar de Tipo II, poliendocrinopatía/hiperinsulinemia, Diabetes mellitus, enanismo de Laron, deficiéncia de mieloperoxidasa, hipoparatiroidismo primario, melanoma , glucanosis CDG de tipo 1, el hipertiroidismo congénito, la osteogénesis imperfecta, hipofibrinogenemia hereditaria, deficiencia de ACT, diabetes insípida (Dl), neurohipófisis Dl, Dl nefrogénica, síndrome de Charcot-Marie Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedades neurodegenerativas, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, plasia supranuclear, enfermedad de Pick, varios trastornos neurológicos de poliglutamina, enfermedad de Huntington, la ataxia de espinocerebelosa de tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, palidoluisiano dentatorubal, distrofia miotónica, encefalopatías espongiformes, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob hereditaria (debido al defecto de procesamiento de proteína priónica), la enfermedad de Fabry, síndrome de Gerstmann-Stráussler Scheinker, EPOC, enfermedad del ojo seco, enfermedad de Sjogren, la osteoporosis, la osteopenia, síndrome de Gorham, canalopatías cloruro, miotonía congénita (formas Thomson y Becker), el síndrome de Bartter tipo III, enfermedad de Dent, hiperekplexia, epilepsia, hiperekplexia, enfermedad de almacenamiento lisosomal, el síndrome de Angelman, discinesia ciliar primaria (DCP), trastornos heredados de la estructura y/o función de los cilios, PCD con situs inverso (también conocido como síndrome de Kartagener), PCD sin situs inverso, o aplasia ciliar. En otra realización, la enfermedad mediada RTFQ es la fibrosis quística. En otra realización, el sujeto tiene receptor de transmembrana de la fibrosis quística (RTFQ) con una mutación AF508. El sujeto puede ter receptor de transmembrana de la fibrosis quística (RTFQ) con una mutación R117H. El sujeto puede ter receptor de transmembrana de la fibrosis quística (RTFQ) con una mutación G551 D.

[0065] El método puede comprender la administración de un agente terapéutico adicional. El agente terapéutico se puede seleccionar de un agente mucolítico, broncodilatador, un antibiótico, un agente antiinfeccioso, un agente antinflamatorio, un potenciador RTFQ, o un agente nutricional.

[0066] Un kit que comprende la forma A, (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida amorfa, o la dispersión sólida de (R)-1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioxol-5-il)-N-(1 -(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-2-(1-hidroxi-2-metilpropan-2-il)-1H-indol-5il)-ciclopropanocarboxamida, y las instrucciones para su uso se divulgan en el presente documento.

Métodos de preparación de la Forma A del Compuesto 1 y Forma Amorfa

[0067] El Compuesto 1 puede prepararse acoplando una fracción de cloruro de ácido con una fracción de amina de acuerdo con los esquemas 1-4. La presente invención se refiere a procesos de preparación de compuestos intermedios según el Esquema 3 y a compuestos intermedios según los Esquemas 3 y 4, que son útiles en la síntesis del Compuesto 1.

Esquema 1. Síntesis de la fracción de cloruro de ácido

Esquema 2. Síntesis alternativa de la fracción de cloruro de ácido.

Esquema 3. Síntesis de la fracción amina.

Esquema 4. Formación del Compuesto 1.

Métodos de formación del Compuesto 1 Forma A

[0068] La forma A puede prepararse suspendiendo el Compuesto 1 en un disolvente apropiado durante un tiempo efectivo. El disolvente adecuado puede ser acetato de etilo, diclorometano, MTBE, acetato de isopropilo, varias proporciones de soluciones de agua/etanol, varias proporciones de soluciones de agua/acetonitrilo, varias proporciones de soluciones de agua/metanol o varias proporciones de soluciones de agua/alcohol isopropílico. Por ejemplo, varias proporciones de soluciones agua/etanol incluyen agua/etanol 1:9 (vol/vol), agua/etanol 1:1 (vol/vol), y agua/etanol 9:1 (vol/vol). Varias proporciones de agua/acetonitrilo Las soluciones incluyen agua/acetonitrilo 1:9 (vol/vol), agua/acetonitrilo 1:1 (vol/vol), y agua/acetonitrilo 9:1 (vol/vol). Varias proporciones de soluciones de agua/metanol incluyen agua/metanol 1:9 (vol/vol), agua/metanol 1:1 (vol/vol), y agua/metanol 9:1 (vol/vol). Varias proporciones de soluciones de agua/alcohol isopropílico incluyen agua/alcohol isopropílico 1:9 (vol/vol), agua/alcohol isopropílico 1:1 (vol/vol), y agua/alcohol isopropílico 9:1 (vol/vol).

[0069] Generalmente, aproximadamente 40 mg del Compuesto 1 se disuelven en aproximadamente 1,5 ml de un disolvente apropiado (concentración objetivo a 26,7 mg/ml) a temperatura ambiente durante una cantidad efectiva de tiempo. La cantidad efectiva de tiempo puede ser de unas 24 horas a unas 2 semanas. La cantidad efectiva de tiempo puede ser de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 1 semana. La cantidad efectiva de tiempo puede ser de unas 24 horas a unas 72 horas. A continuación, se recogen los sólidos.

[0070] La forma A puede prepararse disolviendo el Compuesto 1 en un disolvente apropiado y evaporando a continuación el disolvente. El disolvente apropiado puede ser aquel en el que el Compuesto 1 tenga una solubilidad superior a 20 mg/ml. Por ejemplo, estos disolventes incluyen acetonitrilo, metanol, etanol, alcohol isopropílico, acetona y similares.

[0071] Generalmente, el Compuesto 1 se disuelve en un disolvente apropiado, se filtra y luego se deja para evaporación lenta o evaporación rápida. Un ejemplo de evaporación lenta es cubrir un recipiente, como un vial, que contiene la solución del Compuesto 1 con parafilm con un agujero. Un ejemplo de evaporación rápida es dejar destapado un recipiente, como un vial, que contiene la solución del Compuesto 1. A continuación, se recogen los sólidos.

[0072] La forma A puede prepararse mediante un proceso que comprende la disolución del Compuesto 1 en un primer disolvente y la adición de un segundo disolvente en el que el Compuesto 1 es poco soluble (solubilidad < 1 mg/ml). Por ejemplo, el primer disolvente puede ser un disolvente en el que el Compuesto 1 tenga una solubilidad superior a 20 mg/ml, por ejemplo, acetato de etilo, etanol, alcohol isopropílico o acetona. El segundo disolvente puede ser, por ejemplo, heptano o agua.

[0073] Generalmente, el Compuesto 1 se disuelve en el primer disolvente y se filtra para eliminar cualquier cristal semilla. El segundo disolvente se añade lentamente mientras se agita. Los sólidos se precipitan y se recogen por filtración.

Métodos de preparación del compuesto amorfo 1

[0074] Partiendo del Compuesto 1 o de la Forma A del Compuesto 1, la forma amorfa del Compuesto 1 puede prepararse por evaporación rotatoria o por métodos de secado por pulverización.

[0075] Disolviendo el Compuesto 1 en un disolvente apropiado como el metanol y evaporando rotativamente el metanol para dejar una espuma se produce la forma amorfa del Compuesto 1. Puede utilizarse un baño de agua caliente para acelerar la evaporación.

[0076] La forma amorfa del Compuesto 1 también puede prepararse a partir de la Forma A del Compuesto 1 utilizando métodos de secado por pulverización. El secado por pulverización es un proceso que convierte un alimento líquido en partículas secas. Opcionalmente, puede utilizarse un proceso de secado secundario, como el secado en lecho fluidizado o el secado al vacío, para reducir los disolventes residuales a niveles farmacéuticamente aceptables. Normalmente, el secado por pulverización implica poner en contacto una suspensión o solución líquida muy dispersa y un volumen suficiente de aire caliente para producir la evaporación y el secado de las gotitas líquidas. El preparado que se va a secar por pulverización puede ser cualquier solución, suspensión gruesa, suspensión, dispersión coloidal o pasta que pueda atomizarse utilizando el aparato de secado por pulverización seleccionado. En un procedimiento estándar, el preparado se pulveriza en una corriente de aire caliente filtrado que evapora el disolvente y transporta el producto seco a un colector (por ejemplo, un ciclón). El aire usado se expulsa con el disolvente o, alternativamente, se envía a un condensador para capturar y reciclar el disolvente. Para llevar a cabo el secado por pulverización pueden utilizarse aparatos de tipo comercial. Por ejemplo, los secadores por pulverización comerciales son fabricados por Buchi Ltd. Y Niro (por ejemplo, la línea PSD de secadores por pulverización fabricados por Niro) (véase, US 2004/0105820; US 2003/0144257).

[0077] El secado por atomización emplea típicamente cargas sólidas de material de aproximadamente del 3% a aproximadamente del 30% en peso, (es decir, fármaco y excipientes), por ejemplo aproximadamente del 4% a aproximadamente del 20% en peso, preferentemente al menos aproximadamente del 10%. En general, el límite superior de las cargas sólidas se rige por la viscosidad de (por ejemplo, la capacidad de bombeo) la solución resultante y la solubilidad de los componentes en la solución. En general, la viscosidad de la solución puede determinar el tamaño de la partícula en el producto en polvo resultante.

[0078] Las técnicas y métodos para el secado por pulverización pueden encontrarse en Perry's Chemical Engineering Handbook, 6th Ed., R. H. Perry, D. W. Green & J. O. Maloney, eds.), McGraw-Hill book co. (1984); y Marshall "Atomization and Spray-Drying" 50, Chem. Eng. Prog. Monogr. Series 2 (1954). En general, el secado por pulverización se lleva a cabo con una temperatura de entrada de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 200 °C, por ejemplo, de aproximadamente 95 °C a aproximadamente 185 °C, de aproximadamente 110 °C a aproximadamente 182 °C, de aproximadamente 96 °C a aproximadamente 180 °C, por ejemplo, aproximadamente 145 °C. El secado por pulverización se lleva a cabo generalmente con una temperatura de salida de unos 30 °C a unos 90 °C, por ejemplo, de unos 40 °C a unos 80 °C, de unos 45 °C a unos 80 °C, por ejemplo, unos 75 °C. El caudal de atomización es generalmente de unos 4 kg/h a unos 12 kg/h, por ejemplo, de unos 4,3 kg/h a unos 10,5 kg/h, por ejemplo, unos 6 kg/h o unos 10,5 kg/h. El caudal de alimentación suele ser de unos 3 kg/h a unos 10 kg/h, por ejemplo, de unos 3,5 kg/h a unos 9,0 kg/h, por ejemplo, unos 8 kg/h o unos 7,1 kg/h. La relación de atomización es generalmente de aproximadamente 0,3 a 1,7, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 a 1,5, por ejemplo, aproximadamente 0,8 o aproximadamente 1,5.

[0079] La eliminación del disolvente puede requerir una etapa de secado posterior, como el secado en bandeja, el secado en lecho fluido (por ejemplo, desde aproximadamente temperatura ambiente hasta aproximadamente 100 °C), el secado al vacío, el secado por microondas, el secado en tambor rotatorio o el secado al vacío bicónico (por ejemplo, desde aproximadamente temperatura ambiente hasta aproximadamente 200 °C).

[0080] La dispersión sólida puede secarse en lecho fluido.

[0081] En un proceso, el disolvente incluye un disolvente volátil, por ejemplo un disolvente que tenga un punto de ebullición inferior a unos 100 °C. El disolvente puede incluir una mezcla de disolventes, por ejemplo una mezcla de disolventes volátiles o una mezcla de disolventes volátiles y no volátiles. Cuando se utilizan mezclas de disolventes, la mezcla puede incluir uno o más disolventes no volátiles, por ejemplo, cuando el disolvente no volátil está presente en la mezcla a menos de aproximadamente el 15%, por ejemplo, menos de aproximadamente el 12%, menos de aproximadamente el 10%, menos de aproximadamente el 8%, menos de aproximadamente el 5%, menos de aproximadamente el 3% o menos de aproximadamente el 2%.

[0082] Los disolventes preferidos son aquellos en los que el Compuesto 1 tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 10 mg/ml, (por ejemplo, al menos aproximadamente 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, o mayor). Los disolventes más preferidos incluyen aquellos en los que el Compuesto 1 tiene una solubilidad de al menos unos 20 mg/ml.

[0083] Los disolventes ejemplares que podrían probarse incluyen acetona, ciclohexano, diclorometano, N,N-^{dimetilacetamida (DMA), N,N-dimetilformamida} (D^mF), ^{1,3- dimetil-2-imidazolidinona (DMI), dimetilsulfóxido (DMSO),} dioxano, acetato de etilo, éter etílico, ácido acético glacial (HAc), metiletilcetona (MEK), N-metil-2-pirrolidinona (NMP), metil terc-butil éter (MTBE), tetrahidrofurano (THF), pentano, acetonitrilo, metanol, etanol, alcohol isopropílico, acetato de isopropilo y tolueno. Algunos ejemplos de co-solventes son acetona/DMSO, acetona/DMF, acetona/agua, MEK/agua, THF/agua, dioxano/agua. En un sistema de dos disolventes, los disolventes pueden estar presentes en una proporción de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 99,9%. El agua puede ser un co-disolvente con la acetona donde el agua está presente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 15%, por ejemplo de aproximadamente 9% a aproximadamente 11%, por ejemplo, aproximadamente 10%. El agua puede ser un codisolvente con MEK donde el agua está presente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 15%, por ejemplo, aproximadamente 9% a aproximadamente 11%, por ejemplo, aproximadamente 10%. La solución disolvente puede incluir tres disolventes. Por ejemplo, la acetona y el agua pueden mezclarse con un tercer disolvente como DMA, DMF, DMI, DMSO o HAc. En los casos en que el Compuesto amorfo 1 es un componente de una dispersión amorfa sólida, los disolventes preferidos disuelven tanto el Compuesto 1 como el polímero. Los disolventes adecuados incluyen los descritos anteriormente, por ejemplo, MEK, acetona, agua, metanol y mezclas de los mismos.

[0084] El tamaño de las partículas y el intervalo de temperatura de secado pueden modificarse para preparar una dispersión sólida óptima. Como pueden apreciar los expertos, un tamaño de partícula pequeño mejoraría la eliminación del disolvente. Sin embargo, los solicitantes han descubierto que las partículas más pequeñas pueden dar lugar a partículas esponjosas que, en algunas circunstancias, no proporcionan dispersiones sólidas óptimas para el procesamiento posterior, como el tableteado. A temperaturas más altas, puede producirse cristalización o degradación química del Compuesto 1. A temperaturas más bajas, es posible que no se elimine una cantidad suficiente de disolvente. Los métodos aquí descritos proporcionan un tamaño de partícula óptimo y una temperatura de secado óptima.

[0085] En general, el tamaño de partícula es tal que D10 (μm) es inferior a aproximadamente 5, por ejemplo, inferior a aproximadamente 4,5, inferior a aproximadamente 4,0, o inferior a aproximadamente 3,5, D50 (μm) es generalmente inferior a aproximadamente 17, por ejemplo, inferior a aproximadamente 16, inferior a aproximadamente 15, inferior a aproximadamente 14, inferior a aproximadamente 13, y D90 (μm) es generalmente inferior a aproximadamente 175, por ejemplo, menos de aproximadamente 170, menos de aproximadamente 170, menos de aproximadamente 150, menos de aproximadamente 125, menos de aproximadamente 100, menos de aproximadamente 90, menos de aproximadamente 80, menos de aproximadamente 70, menos de aproximadamente 60 o menos de aproximadamente 50. En general, la densidad aparente de las partículas secadas por pulverización es de aproximadamente 0,08 g/cc a aproximadamente 0,20 g/cc, por ejemplo, de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 0,15 g/cc, por ejemplo, aproximadamente 0,11 g/cc o aproximadamente 0,14 g/cc. La densidad batida de las partículas secadas por atomización oscila generalmente entre 0,08 g/cc a aproximadamente 0,20 g/cc, por ej. de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 0,15 g/cc, por ej., aproximadamente 0,11 g/cc o aproximadamente 0,14 g/cc, para 10 batidas; 0,10 g/cc a aproximadamente 0,25 g/cc, por ej., de aproximadamente 0,11 a aproximadamente 0,21 g/cc, por ej., aproximadamente 0,15 g/cc, aproximadamente 0,19 g/cc, o aproximadamente 0,21 g/cc para 500 batidas; 0,15 g/cc a aproximadamente 0,27 g/cc, por ej., de aproximadamente 0,18 a aproximadamente 0,24 g/cc, por ej., aproximadamente 0,18 g/cc, aproximadamente 0,19 g/cc, aproximadamente 0,20 g/cc, o aproximadamente 0,24 g/cc para 1250 batidas; and 0,15 g/cc a aproximadamente 0,27 g/cc, por ej., de aproximadamente 0,18 a aproximadamente 0,24 g/cc, por ej., aproximadamente 0,18 g/cc, aproximadamente 0,21 g/cc, aproximadamente 0,23 g/cc, o aproximadamente 0,24 g/cc para 2500 batidas.

Polímeros

[0086] También se incluyen en el presente documento dispersiones sólidas que incluyen el Compuesto 1 amorfo y un polímero (o portador de estado sólido). Por ejemplo, el Compuesto 1 está presente como un compuesto amorfo como componente de una dispersión amorfa sólida. La dispersión sólida amorfa, generalmente incluye el Compuesto 1 y un polímero. Los polímeros ejemplares incluyen polímeros celulósicos como HPMC o HPMCAS y polímeros que contienen pirrolidona como PVP/VA. La dispersión sólida amorfa puede incluir uno o más excipientes adicionales, como un tensioactivo.

[0087] Un polímero puede ser capaz de disolverse en medios acuosos. La solubilidad de los polímeros puede ser independiente o dependiente del pH. Estos últimos incluyen uno o más polímeros entéricos. El término "polímero entérico" se refiere a un polímero que es preferentemente soluble en el medio menos ácido del intestino en relación con el medio más ácido del estómago, por ejemplo, un polímero que es insoluble en medios acuosos ácidos pero soluble cuando el pH es superior a 5-6. Un polímero adecuado debe ser química y biológicamente inerte. Para mejorar la estabilidad física de las dispersiones sólidas, la temperatura de transición vítrea (Tg) del polímero debe ser lo más alta posible. Por ejemplo, los polímeros preferidos tienen una temperatura de transición vítrea al menos igual o superior a la temperatura de transición vítrea del fármaco (es decir, el Compuesto 1). Otros polímeros preferidos tienen una temperatura de transición vítrea que está entre unos 10 y unos 15 °C del fármaco (es decir, el Compuesto 1). Ejemplos de temperaturas de transición vítrea adecuadas de los polímeros incluyen al menos unos 90 °C, al menos unos 95 °C, al menos unos 100 °C, al menos unos 105 °C, al menos unos 110 °C, al menos unos 115 °C, al menos unos 120 °C, al menos unos 125 °C, al menos unos 130 °C, al menos unos 135 °C, al menos unos 140 °C, al menos unos 145 °C, al menos unos 150 °C, al menos unos 155 °C, al menos unos 160 °C, al menos unos 165 °C, al menos unos 170 °C, o al menos unos 175 °C (medidas en condiciones secas). Sin querer atarse a la teoría, se cree que el mecanismo subyacente es que un polímero con una Tg más alta generalmente tiene una movilidad molecular más baja a temperatura ambiente, lo que puede ser un factor crucial para estabilizar la estabilidad física de la dispersión sólida amorfa.

[0088] Además, la higroscopicidad de los polímeros debe ser tan baja, por ejemplo, inferior a aproximadamente el 10%. A efectos de comparación en esta aplicación, la higroscopicidad de un polímero o composición se caracteriza a aproximadamente un 60% de humedad relativa. El polímero puede tener menos de un 10% de absorción de agua, por ejemplo menos de un 9%, menos de un 8%, menos de un 7%, menos de un 6%, menos de un 5%, menos de un 4%, menos de un 3% o menos de un 2% de absorción de agua. La higroscopicidad también puede afectar a la estabilidad física de las dispersiones sólidas. Generalmente, la humedad adsorbida en los polímeros puede reducir en gran medida la Tg de los polímeros, así como las dispersiones sólidas resultantes, lo que reducirá aún más la estabilidad física de las dispersiones sólidas como se ha descrito anteriormente.

[0089] El polímero puede ser uno o más polímero(s) soluble(s) en agua o polímero(s) parcialmente soluble(s) en agua. Los polímeros hidrosolubles o parcialmente hidrosolubles incluyen, entre otros, derivados de la celulosa (por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC)) o etilcelulosa; polivinilpirrolidonas (PVP); polietilenglicoles (PEG); alcoholes polivinílicos (PVA); acrilatos, como el polimetacrilato (por ejemplo, Eudragit Eudragit® E); ciclodextrinas (por ejemplo, p-ciclodextina) y copolímeros y derivados de los mismos, incluido, por ejemplo, PVP-VA (polivinilpirolidona-acetato de vinilo).

[0090] El polímero puede ser hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), como HPMC E50, HPMCE15, o HPMC60SH50).

[0091] Como se discute aquí, el polímero puede ser un polímero entérico dependiente del pH. Tales polímeros entéricos dependientes del pH incluyen, pero no se limitan a, derivados de celulosa (por ejemplo, ftalato de acetato de celulosa (CAP)), ftalatos de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), succinato de hidroxipropilmetilacetato de celulosa (HPMCAS), carboximetilcelulosa (CMC) o una sal de la misma (por ejemplo, una sal sódica como (CMC-Na)); acetato trimelitado de celulosa (CAT), acetato ftalato de hidroxipropilcelulosa (HPCAP), acetato ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAP) y acetato ftalato de metilcelulosa (MCAP), o polimetacrilatos (por ejemplo, Eudragit® S). El polímero puede ser hidroxipropilmetilcelulosa acetato succinato (HPMCAS). El polímero puede ser hidroxipropilmetilcelulosa acetato succinato grado HG (HPMCAS-HG).

[0092] El polímero puede ser un copolímero de polivinilpirrolidona, por ejemplo, un copolímero de avinilpirrolidona/acetato de vinilo (PVP/VA).

[0093] Cuando el Compuesto 1 forma una dispersión sólida con un polímero, por ejemplo con un polímero HPMC, HPMCAS o PVP/VA, la cantidad de polímero en relación con el peso total de la dispersión sólida puede oscilar entre aproximadamente el 0,1% y el 99% en peso. A menos que se especifique lo contrario, los porcentajes de fármaco, polímero y otros excitantes descritos dentro de una dispersión se dan en porcentajes en peso. La cantidad de polímero es típicamente de al menos un 20%, y preferiblemente de al menos un 30%, por ejemplo, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, o aproximadamente del 50% (por ejemplo, 49,5%). La cantidad es típicamente de aproximadamente del 99% o menos, y preferiblemente de aproximadamente del 80% o menos, por ejemplo aproximadamente del 75% o menos, aproximadamente del 70% o menos, aproximadamente del 65% o menos, aproximadamente del 60% o menos, o aproximadamente del 55% o menos. El polímero puede estar en una cantidad de hasta aproximadamente el 50% del peso total de la dispersión (e incluso más específicamente, entre aproximadamente el 40% y el 50%, como aproximadamente el 49%, aproximadamente el 49,5% o aproximadamente el 50%). HPMC y HPMCAS están disponibles en diversos grados de ShinEtsu, por ejemplo, HPMCAS está disponible en diversas variedades, como AS-LF, AS-MF, AS-HF, AS-LG, AS-MG, AS-HG. Cada uno de estos grados varía con el porcentaje de sustitución de acetato y succinato.

[0094] El Compuesto 1 y el polímero pueden estar presentes en cantidades aproximadamente iguales, por ejemplo, cada uno de los polímeros y el fármaco constituyen aproximadamente la mitad del peso porcentual de la dispersión. Por ejemplo, el polímero está presente en un 49,5% y el fármaco en un 50%.

[0095] El Compuesto 1 y el polímero combinados pueden representar del 1% al 20% p/p de contenido sólido total de la dispersión no sólida antes del secado por pulverización. El Compuesto 1 y el polímero combinados pueden representar del 5% al 15% p/p de contenido sólido total de la dispersión no sólida antes del secado por pulverización. El Compuesto 1 y el polímero combinados pueden representar aproximadamente del 11 % p/p de contenido sólido total de la dispersión no sólida antes del secado por pulverización.

[0096] La dispersión puede incluir además otros ingredientes menores, como un tensioactivo (por ejemplo, SLS). El tensioactivo puede estar presente en menos del 10% de la dispersión, por ejemplo, menos del 9%, menos del 8%, menos del 7%, menos del 6%, menos del 5%, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2%, del 1% o del 0,5%.

[0097] Si está presente, el polímero debe estar presente en una cantidad eficaz para estabilizar la dispersión sólida. Estabilizar incluye inhibir o prevenir la cristalización del Compuesto 1. Dicha estabilización inhibiría la conversión del Compuesto 1 de forma amorfa a cristalina. Por ejemplo, el polímero impediría que al menos una parte (por ejemplo, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 55%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, o más) del Compuesto 1 se convirtiera de una forma amorfa a una forma cristalina. La estabilización puede medirse, por ejemplo, midiendo la temperatura de transición vítrea de la dispersión sólida, midiendo la velocidad de relajación del material amorfo, o midiendo la solubilidad o biodisponibilidad del Compuesto 1.

[0098] Los polímeros adecuados para su uso en combinación con el Compuesto 1, por ejemplo para formar una dispersión sólida tal como una dispersión sólida amorfa, deben tener una o más de las siguientes propiedades:

[0099] La temperatura de transición vítrea del polímero debe tener una temperatura no inferior a unos 10-15 °C inferior a la temperatura de transición vítrea del Compuesto 1. Preferiblemente, la temperatura de transición vítrea del polímero es superior a la temperatura de transición vítrea del Compuesto 1, y en general al menos 50°C superior a la temperatura de almacenamiento deseada del producto farmacológico. Por ejemplo, al menos unos 100 °C, al menos unos 105 °C, al menos unos 110 °C, al menos unos 120 °C, al menos unos 130 °C, al menos unos 140 °C, al menos unos 150 °C, al menos unos 160 °C, o superior.

[0100] El polímero debe ser relativamente no higroscópico. Por ejemplo, el polímero debe, cuando se almacena en condiciones estándar, absorber menos de un 10% de agua, por ejemplo, menos de un 9%, menos de un 8%, menos de un 7%, menos de un 6%, o menos de un 5%, menos de un 4%, o menos de un 3% de agua. Preferiblemente, el polímero, cuando se almacena en condiciones estándar, estará sustancialmente libre de agua absorbida.

[0101] El polímero debe tener una solubilidad similar o mejor en disolventes adecuados para procesos de secado por pulverización en relación con la del Compuesto 1. El polímero puede disolverse en uno o varios de los mismos disolventes o sistemas de disolventes que el Compuesto 1. Se prefiere que el polímero sea soluble en al menos un disolvente que no contenga hidróxidos, como cloruro de metileno, acetona o una combinación de los mismos.

[0102] El polímero, cuando se combina con el Compuesto 1, por ejemplo en una dispersión sólida o en una suspensión líquida, debe aumentar la solubilidad del Compuesto 1 en medios acuosos y fisiológicamente relativos, ya sea en relación con la solubilidad del Compuesto 1 en ausencia de polímero o en relación con la solubilidad del Compuesto 1 cuando se combina con un polímero de referencia. Por ejemplo, el polímero podría aumentar la solubilidad del Compuesto 1 amorfo reduciendo la cantidad de Compuesto 1 amorfo que se convierte en Compuesto 1 cristalino, ya sea a partir de una dispersión amorfa sólida o de una suspensión líquida.

[0103] El polímero debe disminuir la velocidad de relajación de la sustancia amorfa.

[0104] El polímero debe aumentar la estabilidad física y/o química del Compuesto 1.

[0105] El polímero debería mejorar la fabricabilidad del Compuesto 1.

[0106] El polímero debe mejorar una o más de las propiedades de manipulación, administración o almacenamiento del Compuesto 1.

[0107] El polímero no debe interactuar desfavorablemente con otros componentes farmacéuticos, por ejemplo excipientes.

[0108] La idoneidad de un polímero candidato (u otro componente) puede probarse utilizando los métodos de secado por pulverización (u otros métodos) aquí descritos para formar una composición amorfa. La composición candidata puede compararse en términos de estabilidad, resistencia a la formación de cristales u otras propiedades, y compararse con una preparación de referencia, por ejemplo, una preparación de Compuesto 1 amorfo puro o de Compuesto 1 cristalino. Por ejemplo, una composición candidata podría ensayarse para determinar si inhibe el tiempo hasta el inicio de la cristalización mediada por disolvente, o el porcentaje de conversión en un momento dado en condiciones controladas, en al menos un 50 %, 75 %, 100 % o 110 %, así como la preparación de referencia, o una composición candidata podría ensayarse para determinar si ha mejorado la biodisponibilidad o solubilidad en relación con el Compuesto 1 cristalino.

Tensioactivos

[0109] Una dispersión sólida u otra composición puede incluir un tensioactivo. Un tensioactivo o una mezcla de tensioactivos disminuiría generalmente la tensión interfacial entre la dispersión sólida y un medio acuoso. Un tensioactivo o una mezcla de tensioactivos adecuados también pueden mejorar la solubilidad acuosa y la biodisponibilidad del Compuesto 1 a partir de una dispersión sólida. Los tensioactivos incluyen, entre otros, ésteres de ácidos grasos de sorbitán (p. ej., Spans®), ésteres de ácidos grasos de sorbitán polioxietilenados (p. ej., Tweens®), lauril sulfato sódico (SLS), dodecilbencenosulfonato sódico (SDBS), dioctil sulfosuccinato sódico (Docusate), sal sódica de ácido dioxicólico (DOSS), monoestearato de sorbitán, tristearato de sorbitán, bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB), N-lauroilsarcosina sódica, oleato sódico, miristato sódico, estearato sódico, palmitato sódico, Gelucire 44/14, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), vitamina E d-alfa tocoferil polietilenglicol 1000 succinato (TPGS), lecitina, MW 677- 692, ácido glutánico monosódico monohidratado, Labrasol, glicéridos caprílico/cáprico PEG 8, Transcutol, éter monoetílico de dietilenglicol, Solutol HS-15, polietilenglicol/hidroxiestearato, ácido taurocólico, Pluronic F68, Pluronic F108 y Pluronic F127 (o cualquier otro copolímero de polioxietilenopolioxipropileno (Pluronics®) o glicéridos poliglicolizados saturados (Gelucirs®)). Ejemplos específicos de dichos tensioactivos incluyen, entre otros, Span 65, Span 25, Tween 20, Capryol 90, Pluronic F108, lauril sulfato sódico (SLS), TPGS de vitamina E, plurónicos y copolímeros. En general, se prefiere el SLS.

[0110] La cantidad de tensioactivo (por ejemplo, SLS) en relación con el peso total de la dispersión sólida puede estar comprendida entre el 0,1 y el 15%. Preferiblemente, es de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10%, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5%, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 a 4%, de aproximadamente 0,5 a 3%, de aproximadamente 0,5 a 2%, de aproximadamente 0,5 a 1%, o de aproximadamente 0,5%.

[0111] La cantidad de tensioactivo en relación con el peso total de la dispersión sólida puede ser al menos de aproximadamente el 0,1%, preferiblemente de aproximadamente el 0,5%. El tensioactivo puede estar presente en una cantidad no superior a aproximadamente el 15%, y preferiblemente no superior a aproximadamente el 12%, aproximadamente el 11%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 9%, aproximadamente el 8%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 6%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 2% o aproximadamente el 1%. Se prefiere un tensioactivo en una cantidad aproximada del 0,5% en peso.

[0112] Los tensioactivos candidatos (u otros componentes) pueden someterse a pruebas de idoneidad de manera similar a la descrita para las pruebas de polímeros.

Usos, Formulación y Administración

Composiciones farmacéuticamente aceptables

[0113] En el presente documento se describen composiciones farmacéuticamente aceptables, en las que estas composiciones comprenden la Forma A del Compuesto 1 o el Compuesto 1 amorfo como se describe en el presente documento, y opcionalmente comprenden un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones opcionalmente comprenden además uno o más agentes terapéuticos adicionales.

[0114] Como se ha descrito anteriormente, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden comprender además un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, que, como se usa aquí, incluye todos y cada uno de los disolventes, diluyentes u otro vehículo líquido, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según convenga a la forma de dosificación particular deseada. Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) divulga diversos portadores utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticamente aceptables y técnicas conocidas para la preparación de las mismas. Excepto en la medida en que cualquier medio portador convencional sea incompatible con los compuestos descritos en el presente documento, como por ejemplo produciendo cualquier efecto biológico indeseable o interactuando de otro modo de manera perjudicial con cualquier otro componente(s) de la composición farmacéuticamente aceptable, su uso se describe en el presente documento. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como soportes farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, como la albúmina sérica humana, sustancias tampón como fosfatos, glicina, ácido sórbico o sorbato potásico, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, grasa de lana, azúcares como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones como el almidón de maíz y la fécula de patata; celulosa y sus derivados como la carboximetilcelulosa sódica, la etilcelulosa y el acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talo; excipientes como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón; aceite de cártamo; aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles como propilenglicol o polietilenglicol; ésteres como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponadores como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico, y soluciones tampón de fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes liberadores, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, según el juicio del formulador.

Usos de los Compuestos y Composiciones Farmacéuticamente Aceptables

[0115] Una composición que comprende una forma en estado sólido de la Forma A del Compuesto 1 o del Compuesto 1 amorfo descrito en el presente documento es útil en un método de tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno implicado por una deficiencia de la actividad RTFQ, comprendiendo el método la administración de la composición que comprende una forma en estado sólido de la Forma A del Compuesto 1 o del Compuesto 1 amorfo a un sujeto, preferiblemente un mamífero, que lo necesite.

[0116] Una "enfermedad mediada por RTFQ", tal como se utiliza en el presente documento, es una enfermedad seleccionada entre la fibrosis quística, el asma, la EPOC inducida por el humo, la bronquitis crónica, la rinosinusitis, el estreñimiento, la pancreatitis, la insuficiencia pancreática, infertilidad masculina causada por ausencia bilateral congénita de los conductos deferentes (CBAVD), enfermedad pulmonar leve, pancreatitis idiopática, aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA), enfermedad hepática, enfisema hereditario, hemocromatosis hereditaria, deficiencias de la coagulación-fibrinólisis, deficiencia de proteína C, angioedema hereditario de tipo 1, deficiencias del procesamiento de lípidos, hipercolesterolemia familiar, quilomicronemia de tipo 1, abetalipoproteinemia, enfermedades de almacenamiento lisosómico, enfermedad de células I/pseudo Hurler, mucopolisacaridosis, Sandhof/Tay-Sachs, Crigler-Najjar tipo II, polendocrinopatía/hiperinsulemia, Diabetes mellitus, enanismo de Laron, deficiencia de myleoperoxidasa, hipoparatiroidismo primario, melanoma, glicanosis CDG tipo 1, hipertiroidismo congénito, osteogénesis imperfecta, hipofibrinogenemia hereditaria, deficiencia de ACT, Diabetes insípida (Dl), Dl neurofisaria, Dl neprogénica, síndrome de Charcot-Marie Tooth, enfermedad de Perlizaeus-Merzbacher, enfermedades neurodegenerativas, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, plasia supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, varios trastornos neurológicos poliglutamínicos, Huntington, ataxia espinocerebular tipo I, atrofia muscular espinal y bulbar, palidoluysiana dentatorubal, distrofia miotónica, encefalopatías espongiformes, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob hereditaria (debida a un defecto de procesamiento de la proteína priónica), enfermedad de Fabry, síndrome de Straussler-Scheinker, EPOC, enfermedad del ojo seco, enfermedad de Sjogren, osteoporosis, osteopenia, síndrome de Gorham, canalopatías de cloruro, miotonía congénita (formas de Thomson y Becker), síndrome de Bartter tipo III, enfermedad de Dent, hiperekplexia, epilepsia, hiperekplexia, enfermedad por almacenamiento lisosómico, síndrome de Angelman, discinesia ciliar primaria (DCP), trastornos hereditarios de la estructura y/o función de los cilios, DCP con situs inversus o aplasia ciliar.

[0117] Una composición que comprende la Forma A del Compuesto 1 o el Compuesto 1 amorfo aquí descrito es útil en un método de tratamiento de una enfermedad mediada por RTFQ en un humano que comprende el paso de administrar a dicho humano una cantidad eficaz de la composición que comprende la Forma A del Compuesto 1 o el Compuesto 1 amorfo.

[0118] Una composición que comprende la Forma A del Compuesto 1 o el Compuesto 1 amorfo aquí descrito es útil en un método de tratamiento de la fibrosis quística en un humano que comprende el paso de administrar a dicho humano la composición que comprende la Forma A del Compuesto 1 o el Compuesto 1 amorfo.

[0119] Una "cantidad eficaz" de la Forma A del Compuesto 1 o del Compuesto 1 amorfo o de una composición farmacéuticamente aceptable del mismo puede ser aquella cantidad eficaz para tratar o disminuir la gravedad de cualquiera de las enfermedades recitadas anteriormente.

[0120] La Forma A del Compuesto 1 o el Compuesto 1 amorfo o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo puede administrarse utilizando cualquier cantidad y cualquier vía de administración eficaz para tratar o disminuir la gravedad de una o más de las enfermedades recitadas anteriormente.

[0121] La Forma A del Compuesto 1 o Compuesto 1 amorfo descrito en el presente documento o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo es útil para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en pacientes que presentan actividad RTFQ residual en la membrana apical de los epitelios respiratorios y no respiratorios. La presencia de actividad RTFQ residual en la superficie epitelial puede detectarse fácilmente utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, técnicas electrofisiológicas, bioquímicas o histoquímicas estándar. Tales métodos identifican la actividad RTFQ mediante técnicas electrofisiológicas in vivo o ex vivo, la medición de las concentraciones de Cl- en sudor o saliva, o técnicas bioquímicas o histoquímicas ex vivo para controlar la densidad de la superficie celular. Utilizando estos métodos, se puede detectar fácilmente la actividad RTFQ residual en pacientes heterocigotos u homocigotos para una variedad de mutaciones diferentes, incluyendo pacientes homocigotos o heterocigotos para la mutación más común, AF508, así como otras mutaciones como la mutación G551D, o la mutación R117H.

[0122] La Forma A del Compuesto 1 o Compuesto 1 amorfo descrito en el presente documento o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo es útil para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en pacientes dentro de ciertos genotipos que presentan actividad RTFQ residual, por ejemplo, mutaciones de clase III (regulación o compuerta alterada), mutaciones de clase IV (conductancia alterada), o mutaciones de clase V (síntesis reducida) (Lee R. Choo-Kang, Pamela L., Zeitlin, Type I, II, III, IV, and V cystic fibrosis Tansmembrane Conductance Regulance Defects and Opportunities of Therapy; Current Opinion in Pulmonary Medicine 6:521 - 529, 2000). Otros genotipos de pacientes que presentan actividad RTFQ residual son los pacientes homocigotos para una de estas clases o heterocigotos con cualquier otra clase de mutaciones, incluidas las mutaciones de clase I, las mutaciones de clase II o una mutación que carece de clasificación.

[0123] Forma A del Compuesto 1 o Compuesto 1 amorfo descrito en el presente documento o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo es útil para tratar o disminuir la gravedad de la fibrosis quística en pacientes dentro de ciertos fenotipos clínicos, por ejemplo, un fenotipo clínico de moderado a leve que típicamente se correlaciona con la cantidad de actividad RTFQ residual en la membrana apical de los epitelios. Tales fenotipos incluyen pacientes que presentan insuficiencia pancreática o pacientes diagnosticados de pancreatitis idiopática y ausencia bilateral congénita de los conductos deferentes, o enfermedad pulmonar leve.

[0124] La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la infección, el agente en particular, su modo de administración y similares. Los compuestos aquí descritos se formulan preferentemente en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y uniformizar la dosificación. La expresión "forma de unidad de dosificación", tal como se utiliza aquí, se refiere a una unidad físicamente discreta de agente apropiado para el paciente a tratar. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los compuestos y composiciones descritos en este documento será decidido por el médico tratante dentro del ámbito del buen juicio médico. La dosis efectiva específica para cualquier paciente u organismo dependerá de una variedad de factores, incluyendo el trastorno a tratar y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el compuesto específico empleado, y factores similares bien conocidos en las artes médicas. El término "paciente" o "sujeto", tal y como se utiliza aquí, significa un animal, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un ser humano.

[0125] Las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden administrarse a seres humanos y otros animales por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como polvos, pomadas o gotas), bucal, como aerosol oral o nasal, o similar, dependiendo de la gravedad de la infección que se esté tratando. Los compuestos pueden administrarse por vía oral o parenteral a niveles de dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg y, preferentemente, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, del peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado.

[0126] La cantidad de dosificación de la Forma A del Compuesto 1 o Compuesto 1 amorfo en la forma de unidad de dosificación puede ser de 100 mg a 1.000 mg. La cantidad de dosificación de la Forma A del Compuesto 1 o Compuesto 1 amorfo puede ser de 200 mg a 900 mg. La cantidad de dosificación de la Forma A del Compuesto 1 o Compuesto 1 amorfo puede ser de 300 mg a 800 mg. La cantidad de dosificación de la Forma A del Compuesto 1 o Compuesto 1 amorfo puede ser de 400 mg a 700 mg. La cantidad de dosificación de la Forma A del Compuesto 1 o Compuesto 1 amorfo puede ser de 500 mg a 600 mg.

[0127] Las preparaciones inyectables, por ejemplo, las suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles pueden formularse según la técnica conocida utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la solución de Ringer, el U.S.P. y la solución isotónica de cloruro sódico. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como disolvente o medio de suspensión. Para ello, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido, incluidos los mono o diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables se utilizan ácidos grasos como el ácido oleico.

[0128] Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro que retenga bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que puedan disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.

[0129] Las composiciones para la administración rectal o vaginal son preferentemente supositorios que pueden prepararse mezclando los compuestos descritos en el presente documento con excipientes o portadores no irritantes adecuados, como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios, que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a temperatura corporal y, por tanto, se funden en el recto o la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.

[0130] Las formas farmacéuticas sólidas para administración oral incluyen cápsulas, tabletas, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas farmacéuticas sólidas, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente o portador inerte, farmacéuticamente aceptable, como citrato sódico o fosfato dicálcico y/o a) cargas o extensores como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y acacia, c) humectantes como glicerol, d) agentes desintegradores como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato sódico, e) agentes retardadores de la disolución como la parafina, f) aceleradores de la absorción como los compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes como, por ejemplo, el alcohol cetílico y el monoestearato de glicerol, h) absorbentes como el caolín y la arcilla bentonita, e i) lubricantes como el talo, el estearato de calcio, el estearato de magnesio, los polietilenglicoles sólidos, el lauril sulfato de sodio y sus mezclas. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma farmacéutica también puede contener agentes tamponadores.

[0131] Las composiciones sólidas de tipo similar también pueden emplearse como relleno en cápsulas de gelatina blandas y duras utilizando excipientes como la lactosa o el azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas farmacéuticas sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y envolturas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en el arte de la formulación farmacéutica. Opcionalmente, pueden contener agentes opacificantes y también pueden tener una composición tal que liberen el principio o principios activos sólo, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de forma retardada. Ejemplos de composiciones de incrustación que pueden utilizarse incluyen sustancias poliméricas y ceras. Las composiciones sólidas de tipo similar también pueden emplearse como relleno en cápsulas de gelatina blanda y dura utilizando excipientes como la lactosa o el azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

[0132] Los compuestos activos también pueden estar en forma micro encapsulada con uno o más excipientes, como se señaló anteriormente. Las formas farmacéuticas sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y envolturas tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos que controlan la liberación y otros recubrimientos bien conocidos en el arte de la formulación farmacéutica. En tales formas farmacéuticas sólidas, el compuesto activo puede mezclarse con al menos un diluyente inerte, como sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas farmacéuticas también pueden contener, como es habitual, sustancias adicionales distintas de los diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes y otros coadyuvantes, como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponadores. Opcionalmente, pueden contener agentes opacificantes y también pueden tener una composición tal que liberen el principio o principios activos sólo, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de forma retardada. Ejemplos de composiciones de incrustación que pueden utilizarse incluyen sustancias poliméricas y ceras.

[0133] También se apreciará que la Forma A del Compuesto 1 o el Compuesto 1 amorfo descritos en el presente documento o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo pueden emplearse en terapias de combinación, es decir, la Forma A del Compuesto 1 o el Compuesto 1 amorfo pueden administrarse concurrentemente con, antes de, o después de, otra u otras terapias o procedimientos médicos deseados. La combinación particular de terapias (terapéuticas o procedimientos) a emplear en un régimen combinado tendrá en cuenta la compatibilidad de las terapéuticas y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado a conseguir. También se apreciará que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un compuesto inventivo puede administrarse simultáneamente con otro agente utilizado para tratar el mismo trastorno), o pueden lograr efectos diferentes (por ejemplo, el control de cualquier efecto adverso). En el presente documento, los agentes terapéuticos adicionales que se administran normalmente para tratar o prevenir una enfermedad o afección concreta se denominan "apropiados para la enfermedad o afección tratada".

[0134] El agente adicional puede seleccionarse entre un agente mucolítico, un broncodialador, un antibiótico, un agente antiinfeccioso, un agente antiinflamatorio, un modulador de RTFQ distinto de un compuesto descrito en el presente documento o un agente nutricional.

[0135] El agente adicional puede ser el ácido 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioxol-5-il)-ciclopropanocarboxamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoico. El agente adicional puede ser N-(5-hidroxi-2,4-ditert-butil-fenil)-4-oxo-1H-quinolina-3-carboxamida. El agente adicional puede seleccionarse de la Tabla 1:

Tabla 1

[0136] El agente adicional puede ser cualquier combinación de los agentes anteriores. Por ejemplo, la composición puede comprender el Compuesto 1, ácido 3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioxol-5-il)-ciclopropanocarboxamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoico, y N-(5-hidroxi-2,4-ditert-butil-fenil)-4-oxo-lH-quinolina-3-carboxamida. En otro ejemplo, la composición puede comprender el Compuesto 1, N-(5-hidroxi-2,4-diterc-butil-fenil)-4-oxo-lH-quinolina-3-carboxamida, y cualquiera de los compuestos de la Tabla 1, es decir, los compuestos 1 a 14 de la Tabla 1, o cualquier combinación de los mismos.

[0137] El agente terapéutico adicional puede ser un antibiótico. Entre los antibióticos ejemplares útiles aquí se incluyen la tobramicina, incluido el polvo inhalado de tobramicina (TIP), la azitromicina, el aztreonam, incluida la forma aerosolizada de aztreonam, la amikacina, incluidas las formulaciones liposomales de la misma, la ciprofloxacina, incluidas las formulaciones de la misma adecuadas para la administración por inhalación, la levoflaxacina, incluidas las formulaciones aerosolizadas de la misma, y las combinaciones de dos antibióticos, por ejemplo, fosfomicina y tobramicina.

[0138] El agente adicional puede ser un mucolito. Algunos ejemplos de mucolitos útiles incluyen Pulmozyme®.

[0139] El agente adicional puede ser un broncodilatador. Algunos broncodilatadores ejemplares son el albuterol, el sulfato de metaprotenerol, el acetato de pirbuterol, el salmeterol o el sulfato de tetrabulina.

[0140] El agente adicional puede ser eficaz para restaurar el líquido de la superficie de las vías respiratorias pulmonares. Estos agentes mejoran el movimiento de la sal dentro y fuera de las células, lo que permite que la mucosidad de las vías respiratorias pulmonares esté más hidratada y, por tanto, se elimine más fácilmente. Ejemplos de tales agentes incluyen solución salina hipertónica, denufosol tetrasódico ([[(3S, SR)-5-(4-amino-2-oxopirimidin-1-il)-3-hidroxioxolan-2-il]metoxihidroxifosforil] [[[(2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-dioxopirimidin-1-il)-3, 4-dihidroxioxolan-2-il]metoxihidroxifosforil]oxihidroxifosforil] fosfato de hidrógeno), o bronchitol (formulación inhalada de manitol).

[0141] El agente adicional puede ser un agente antiinflamatorio, es decir, un agente que puede reducir la inflamación en los pulmones. Ejemplos de tales agentes útiles aquí incluyen ibuprofeno, ácido docosahexanoico (DHA), sildenafilo, glutatión inhalado, pioglitazona, hidroxicloroquina o simavastatina.

[0142] El agente adicional puede ser un modulador RTFQ distinto del Compuesto 1 Forma I, es decir, un agente que tiene el efecto de modular la actividad RTFQ. Algunos ejemplos de estos agentes son el ataluren ("PTC124®"; ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-3-il]benzoico), sinapultida, lancovutida, depelestat (un inhibidor recombinante humano de la elastasa de neutrófilos), cobiprostona (7-{(2R, 4aR, 5R, 7aR)-2-[(3S)-1,1-difluoro-3-metilpentilo]-2-hidroxi-6-oxooctahidrociclopenta[b]pirano-5-il}heptanoico), y N-(5-hidroxi-2,4-ditert-butil-fenil)-4-oxo-1H-quinolina-3-carboxamida.

[0143] El agente adicional puede ser un agente nutricional. Algunos agentes nutricionales ejemplares son la pancrelipasa (sustitución de enzimas pancreáticas), como Pancrease®, Pancreacarb®, Ultrase® o Creon®, Liprotomase® (antes Trizytek®), Aquadeks® o la inhalación de glutatión. El agente nutricional adicional puede ser la pancrelipasa.

[0144] El agente adicional puede ser un compuesto seleccionado entre gentamicina, curcumina, ciclofosfamida, 4-fenilbutirato, miglustat, felodipino, nimodipino, Filoxina B, geniesteína, Apigenina, moduladores de AMPc/GMPc como rolipram, sildenafilo, milrinona, tadalafilo, amrinona, isoproterenol, albuterol y almeterol, deoxisperguabn, inhibidores de HSP 90, inhibidores de HSP 70, inhibidores de proteosomas como epoxomicina, lactacistina, etc.

[0145] El agente adicional puede ser un compuesto divulgado en los documentos WO 2004028480, WO 2004110352, WO 2005094374, WO 2005120497, o WO 2006101740.

[0146] El agente adicional puede ser un derivado de benzo(c)quinolizinio que muestre actividad moduladora de RTFQ o un derivado de benzopirano que muestre actividad moduladora de RTFQ.

[0147] El agente adicional puede ser un compuesto divulgado en los documentos US7202262, US6992096, US20060148864, US20060148863, US20060035943, US20050164973, W02006110483, W02006044456, W02006044682, W02006044505, W02006044503, W02006044502, o W02004091502.

[0148] El agente adicional puede ser un compuesto divulgado en los documentos W02004080972, W02004111014, W02005035514, W02005049018, W02006099256, WO2006127588, o W02007044560.

[0149] Estas combinaciones son útiles para tratar las enfermedades aquí descritas, incluida la fibrosis quística. Estas combinaciones también son útiles en los kits aquí descritos.

[0150] La cantidad de agente terapéutico adicional presente en las composiciones aquí descritas no será superior a la cantidad que normalmente se administraría en una composición que comprendiera ese agente terapéutico como único agente activo. Preferiblemente, la cantidad de agente terapéutico adicional en las composiciones actualmente divulgadas oscilará entre el 50% y el 100% de la cantidad normalmente presente en una composición que comprenda dicho agente como único agente terapéuticamente activo.

[0151] Compuesto 1 Forma A y la forma amorfa descritas en el presente documento o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo también pueden incorporarse a composiciones para el recubrimiento de un dispositivo médico implantable, como prótesis, válvulas artificiales, injertos vasculares, stents y catéteres. En consecuencia, una composición para el recubrimiento de un dispositivo implantable puede comprender la Forma A del Compuesto 1 y/o la forma amorfa descrita en el presente documento o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, y en las clases y subclases del presente documento, y un soporte adecuado para el recubrimiento de dicho dispositivo implantable. Un dispositivo implantable puede recubrirse con una composición que comprenda la Forma A del Compuesto 1 y/o la forma amorfa descrita en el presente documento o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, y un soporte adecuado para recubrir dicho dispositivo implantable. Los recubrimientos adecuados y la preparación general de dispositivos implantables recubiertos se describen en las patentes de EEUU 6.099.562; 5.886.026; y 5.304.121. Los recubrimientos son típicamente materiales poliméricos biocompatibles como un polímero hidrogel, polimetildisiloxano, policaprolactona, polietilenglicol, ácido poliláctico, etilvinilacetato y mezclas de los mismos. Opcionalmente, los revestimientos pueden recubrirse con una capa superior adecuada de fluorosilicona, polisacáridos, polietilenglicol, fosfolípidos o combinaciones de los mismos para conferir a la composición características de liberación controlada.

[0152] Para que la invención aquí descrita pueda comprenderse mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos de esta invención en modo alguno.

EJEMPLOS

Métodos y materiales

Calorimetría diferencial de barrido modulada (MDSC) y calorimetría diferencial de barrido (DSC)

[0153] La calorimetría diferencial de barrido modulada (MDSC) se utilizó para probar la temperatura de transición vítrea de la forma amorfa y de la dispersión secada por pulverización de un compuesto. Se utilizó la calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar el punto de fusión de los materiales cristalinos y discriminar entre los distintos polimorfos. Los datos se recogieron utilizando un calorímetro diferencial de barrido TA DSC Q2000 (TA Instruments, New Castle, DE). El instrumento se calibró con indio. Se pesaron muestras de aproximadamente 1-5 mg en recipientes herméticos de aluminio engarzados con tapas con un orificio. Para la MDSC, las muestras se escanearon de -20 °C a 220 °C a una velocidad de calentamiento de 2 °C/minuto con una modulación de /- 1 °C cada 60 segundos. Para el DSC, las muestras se exploraron de 25 °C a 220 °C a una velocidad de calentamiento de 10 °C/min. Los datos se recogieron con el software Thermal Advantage Q Series™ (versión: 2.7.0.380) y analizado por el software Universal Analysis (versión: 4.4A, construcción: 4.4.0.5) (TA Instruments, New Castle, DE).

XRPD (difracción de rayos X en polvo)

[0154] La difracción de rayos X en polvo se utilizó para caracterizar la forma física de los lotes producidos hasta la fecha y para caracterizar los diferentes polimorfos identificados. Los datos XRPD de un compuesto se recogieron en un difractómetro de rayos X en polvo PAnalytical X'pert Pro (Almelo, Países Bajos). El patrón XRPD se registró a temperatura ambiente con radiación de cobre (1,54060 A). Los rayos X se generaron utilizando un tubo sellado de Cu a 45 kV, 40 mA con un filtro de supresión Kp de níquel. La óptica del haz incidente estaba compuesta por una rendija de divergencia variable para garantizar una longitud iluminada constante en la muestra y en el lado del haz difractado; se utilizó un detector lineal rápido de estado sólido con una longitud activa de 2,12 grados 2 theta medida en modo de barrido. La muestra de polvo se empaquetó en la zona indentada de un soporte de Silicio de fondo cero y se realizó un centrifugado para obtener mejores estadísticas. Se midió una exploración simétrica de 4-40 grados 2 theta con un tamaño de paso de 0,017 grados y un tiempo de paso de exploración de 15,5 segundos. El software de recogida de datos es X'pert Data Collector (versión 2.2e). El software de análisis de datos es X'pert Data Viewer (versión 1.2d) o X'pert Highscore (versión: 2.2c).

Análisis termogravimétrico (TGA)

[0155] El TGA se utilizó para investigar la presencia de disolventes residuales en los lotes caracterizados e identificar la temperatura a la que se produce la descomposición de la muestra. Los datos TGA se recogieron en un analizador termogravimétrico t A Q500 (TA Instruments, New Castle, DE). Se escaneó una muestra con un peso aproximado de 2-5 mg desde 25 °C hasta 300 °C a una velocidad de calentamiento de 10 °C/min. Los datos se recogieron con el software Thermal Advantage Q Series™ (versión 2.5.0.255) y se analizaron con el software Universal Analysis (versión 4.4A, build 4.4.0.5) (TA Instruments, New Castle, DE).

Determinación de la estructura monocristalina de la forma A del Compuesto 1

[0156] Los datos de difracción se adquirieron en un difractómetro Bruker Apex II equipado con una fuente Cu Ka de tubo sellado y un detector CCD Apex II. La estructura se resolvió y refinó utilizando el programa SHELX (Sheldrick,G.M,Acta Cryst., (2008) A64, 112-122). Basándose en las estadísticas de intensidades y en las ausencias sistemáticas, la estructura se resolvió y refinó en el grupo espacial C2. La configuración absoluta se determinó mediante difracción anómala. El parámetro de Flack se refinó a 0,00 (18), lo que indica que el modelo representa el enantiómero correcto^)].

RMN de estado sólido

[0157] La RMN de estado sólido se llevó a cabo en un espectrómetro Bruker-Biospin de 400 MHz de paso ancho equipado con una sonda Bruker-Biospin HFX de 4 mm. Las muestras se introdujeron en rotores de ZrO₂ de 4 mm y se centrifugaron en condiciones de Magic Angle Spinning (MAS) con una velocidad de centrifugación de 12,5 kHz. El tiempo de relajación protónica se midió primero utilizando el experimento de relajación de recuperación de saturación 1H MAS T1 con el fin de establecer el retardo de reciclado adecuado del experimento MAS de polarización cruzada (CP) de 13C. El tiempo de contacto CP del experimento CPMAS de carbono se fijó en 2 ms. Se empleó un pulso de protones CP con rampa lineal (del 50% al 100%). La coincidencia Hartmann-Hahn se optimizó con la muestra de referencia externa (glicina). El espectro MAS de flúor se registró con desacoplamiento de protones. Se utilizó la secuencia de desacoplamiento TPPM15 con una intensidad de campo de aproximadamente 100 kHz tanto para las adquisiciones de 13C como de 19F.

[0158] Vitride® (bis(2-metoxietoxi)hidruro de aluminio sódico [o NaAlH₂(OCH₂CH₂OCH3)₂], solución al 65% en peso en tolueno) se adquirió a Aldrich Chemicals.

[0159] El ácido 2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-5-carboxílico se adquirió a Saltigo (filial de Lanxess Corporation).

[0160] En cualquier parte de la presente solicitud en la que el nombre de un compuesto pueda no describir correctamente la estructura del compuesto, la estructura sustituye al nombre y es la que rige.

Síntesis del Compuesto 1

Fracción ácida

Síntesis de (2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)-metanol.

[0162] El ácido 2,2-difluoro-l,3-benzodioxol-5-carboxílico comercial (1,0 eq) se disuelve en tolueno (10 vol). Se añade Vitride® (2 eq) mediante un embudo de adición a una velocidad que permita mantener la temperatura entre 15 y 25 °C. Al final de la adición, se aumenta la temperatura a 40 °C durante 2 h y, a continuación, se añade 10% (p/p) aq. Se añade cuidadosamente NaOH (4,0 eq) a través de un embudo de adición manteniendo la temperatura a 40-50 °C. Tras agitar durante 30 minutos más, se dejan separar las capas a 40 °C. La fase orgánica se enfría a 20 °C, se lava con agua (2x1,5 vol), se seca (Na₂SO₄), se filtra y se concentra para obtener (2,2-difluoro-l,3-benzodioxol-5-il)-metanol crudo que se utiliza directamente en el paso siguiente.

Síntesis de 5-clorometil-2,2-difluoro-1,3-benzodioxol.

[0163]

[0164] Se disuelve (2,2 -difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)-metanol (1,0 eq) en MTBE (5 vol). Se añade una cantidad catalítica de DMAP (1 mol %) y SOCl2 (1,2 eq) a través de un embudo de adición. El SOCb se añade a un ritmo que permita mantener la temperatura del reactor entre 15 y 25 °C. Se aumenta la temperatura a 30 °C durante 1 hora y luego se enfría a 20 °C, después se añade agua (4 vol) mediante un embudo de adición manteniendo la temperatura a menos de 30 °C. Tras agitar durante 30 minutos más, se dejan separar las capas. Se agita la capa orgánica y se añade un 10% (p/v) de solución acuosa a la capa orgánica. Se añade NaOH (4,4 vol). Tras agitar de 15 a 20 minutos, se dejan separar las capas. La fase orgánica se seca (Na₂SO₄), se filtra y se concentra para obtener 5-clorometil-2,2-difluoro-1,3-benzodioxol crudo que se utiliza directamente en el siguiente paso.

Síntesis de (2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)-acetonitrilo.

[0165]

[0166] Se añade una solución de 5-clorometil-2,2-difluoro-l,3-benzodioxol (1 eq) en DMSO (1,25 vol) a una suspensión de NaCN (1,4 eq) en DMSO (3 vol) manteniendo la temperatura entre 30-40 °C. La mezcla se agita durante 1 hora y, a continuación, se añade agua (6 vol) seguida de MTBE (4 vol). Tras agitar durante 30 minutos, se separan las capas. La capa acuosa se extrae con MTBE (1,8 vol). Las capas orgánicas combinadas se lavan con agua (1,8 vol), se secan (Na₂SO₄), se filtran y se concentran para obtener (2,2-difluoro-l,3-benzodioxol-5-il)-acetonitrilo crudo (95%) que se utiliza directamente en el paso siguiente. RMN 1H (500 MHz, DMSO) ó 7.44 (br s, 1H), 7.43 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.22 (dd, J= 8.2, 1.8 Hz, 1H), 4.07 (s, 2H).

Síntesis de (2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)-etilacetato-acetonitrilo

[0167]

[0168] Se purgó un reactor con nitrógeno y se cargó con 900 ml de tolueno. El disolvente se desgasificó mediante chorro de nitrógeno durante no menos de 16 h. A continuación, se cargó en el reactor Na3P04 (155,7 g, 949,5 mmol), seguido de bis(dibencilideneacetona) paladio (0) (7,28 g, 12,66 mmol). Se cargó una solución al 10% p/p de tercbutilfosfina en hexanos (51,23 g, 25,32 mmol) durante 10 min a 23 °C desde un embudo de adición purgado con nitrógeno. La mezcla se dejó agitar durante 50 min, momento en el que se añadió 5-bromo-2,2-difluoro-l,3-benzodioxol (75 g, 316,5 mmol) durante 1 min. Después de agitar otros 50 min, la mezcla se cargó con cianoacetato de etilo (71,6 g, 633,0 mmol) durante 5 min seguido de agua (4,5 ml) en una porción. La mezcla se calentó a 70 °C durante 40 min y se analizó por HPLC cada 1 - 2 h para determinar el porcentaje de conversión del reactivo en el producto. Una vez observada la conversión completa (normalmente el 100% de conversión tras 5 - 8 h), la mezcla se enfrió a 20 - 25 °C y se filtró a través de una almohadilla de celita. La almohadilla de celita se enjuagó con tolueno (2 X 450 ml) y los orgánicos combinados se concentraron a 300 ml al vacío a 60 - 65 °C. El concentrado se cargó con 225mL de DMSO y se concentró al vacío a 70 - 80 °C hasta que cesó la destilación activa del disolvente. La solución se enfrió a 20 - 25 °C y se diluyó a 900 ml con DMSO para preparar el paso 2. RMN 1H (500 MHz, CDCb) 87.16 - 7.10 (m, 2H), 7.03 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 4.63 (s, 1H), 4.19 (m, 2H), 1.23 (t, J= 7.1 Hz, 3H).

Síntesis de (2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)-acetonitrilo.

[0169]

[0170] La solución DMSO de (2,2-difluoro-l,3-benzodioxol-5-il)-1-etilacetato-acetonitrilo anterior se cargó con 3 N HCl (617,3 ml, 1,85 mol) durante 20 min mientras se mantenía una temperatura interna < 40 °C. A continuación, la mezcla se calentó a 75°C durante 1 h y se analizó por HPLC cada 1 - 2 h para determinar el % de conversión. Cuando se observó una conversión > 99% (normalmente después de 5 - 6 h), la reacción se enfrió a 20 - 25 °C y se extrajo con MTBE (2 X 525 ml), con tiempo suficiente para permitir la separación completa de fases durante las extracciones. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con NaCl al 5% (2 X 375 ml). A continuación, la solución se transfirió a un equipo apropiado para una destilación al vacío de 1,5 - 2,5 Torr que estaba equipado con un matraz receptor refrigerado. La solución se concentró al vacío a < 60°C para eliminar los disolventes. A continuación, se destiló (2,2-Difluoro-l,3-benzodioxol-5-il)-acetonitrilo del aceite resultante a 125 - 130 °C (temperatura del horno) y 1,5 - 2,0 Torr. El (2,2- difluoro-l,3-benzodioxol-5-il)-acetonitrilo se aisló como un aceite claro en un 66% de rendimiento a partir de 5-bromo-2,2-difluoro-l,3-benzodioxol (2 pasos) y con una pureza HPLC del 91,5% AUC (corresponde a un ensayo p/p del 95%). RMN 1H (500 MHz, DMSO) 87.44 (br s, 1H), 7.43 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.22 (dd, J= 8.2, 1.8 Hz, 1H), 4.07 (s, 2H).

Síntesis de (2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)-ciclopropanocarbonitrilo.

[0171]

[0172] Se calienta a 70 °C durante 1 h una mezcla de (2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)-acetonitrilo (1,0 eq), KOH acuoso al 50 % en peso (5,0 eq) 1 -bromo-2-cloroetano (1,5 eq) y Oct4NBr (0,02 eq). La mezcla de reacción se enfría y se trabaja con MTBE y agua. La fase orgánica se lava con agua y salmuera y luego se elimina el disolvente para obtener (2,2-difluoro-1,3- benzodioxol-5-il)-ciclopropanocarbonitrilo. RMN 1H (500 MHz, DMSO) 87.43 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.40 (d, J= 1.9 Hz, 1H), 7.30 (dd, J= 8.4, 1.9 Hz, 1H), 1.75 (m, 2H), 1.53 (m, 2H).

Síntesis del ácido 1-(2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)-ciclopropanocarboxílico.

[0173]

[0174] El (2,2 -difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)-ciclopropanocarbonitrilo se hidroliza utilizando NaOH 6 M (8 equiv) en etanol (5 vol) a 80 °C durante la noche. La mezcla se enfría a temperatura ambiente y el etanol se evapora al vacío. El residuo se lleva a agua y MTBE, se añade 1 M HCl y se separan las capas. A continuación, la capa de MTBE se trató con diciclohexilamina (0,97 equiv). La suspensión se enfría a 0 °C, se filtra y se lava con heptano para dar la sal DCHA correspondiente. La sal se introduce en MTBE y ácido cítrico al 10% y se agita hasta que se disuelven todos los sólidos. Las capas se separan y la capa de MTBE se lavó con agua y salmuera. El cambio de disolvente a heptano seguido de filtración da ácido 1-(2,2-difluoro-l,3- benzodioxol-5-il)-ciclopropanocarboxílico tras secarse en estufa de vacío a 50 °C durante la noche. ESI-MS m/z calc. 242,04, hallado 241,58 (M+l)+; RMN 1H (500 MHz, DMSO) ó 12,40 (s, 1H), 7,40 (d, J= 1,6 Hz, 1H), 7,30 (d, J= 8,3 Hz, 1H), 7,17 (dd, J= 8,3, 1,7 Hz, 1H), 1,46 (m, 2H), 1,17 (m,2H).

Fracción de amina

Síntesis de 2-bromo-5-fluoro-4-ntroanilina.

[0175]

[0175] Se cargó un matraz con 3-fluoro-4-nitroanilina (1,0 equiv) seguido de acetato de etilo (10 vol) y se agitó para disolver todos los sólidos. Se añadió N-bromosuccinimida (1,0 equiv) en porciones para mantener una temperatura interna de 22 °C. Al final de la reacción, la mezcla de reacción se concentró al vacío en un rotavapor. El residuo se sumergió en agua destilada (5 vol) para disolver y eliminar la succinimida. (La succinimida también puede eliminarse mediante el procedimiento de trabajo con agua). El agua se decantó y el sólido se sumergió en 2-propanol (5 vol) durante una noche. La suspensión resultante se filtró y la torta húmeda se lavó con 2-propanol, se secó en estufa de vacío a 50 °C durante la noche con purga de N₂ hasta conseguir un peso constante. Se aisló un sólido de color tostado amarillento (rendimiento del 50%, AUC del 97,5%). Otras impurezas fueron un regioisómero bromado (1,4% AUC) y un aducto di-bromado (1,1% AUC). RMN 1H (500 MHz, DMSO) ó 8.19(1 H, d, J= 8.1 Hz), 7.06 (br. s, 2H), 6.64 (d, 1 H, J= 14.3 Hz).

Síntesis de la sal de tosilato de bencilglicolato-4-ammoniiim-2-bromo-5-fluoroanilina.

[0177]

[0178] Se cargó un matraz completamente seco bajo N₂ con lo siguiente: Tamices moleculares 4A activados en polvo (50 % en peso a base de 2-bromo-5-fluoro-4-nitroanilina), 2-bromo-5-fluoro-4-nitroanilina (1,0 equiv), perclorato de cinc dihidratado (20 mol%) y tolueno (8 vol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante NMT 30 min. Por último, se añadió (R)-bencil glicidil éter (2,0 equiv) en tolueno (2 vol) en corriente constante. La reacción se calentó a 80 °C (temperatura interna) y se agitó durante aproximadamente 7 horas o hasta que la 2-bromo-5-fluoro-4- nitroanilina fue <5%AUC.

[0179] La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se añadió Celite (50 % en peso), seguido de acetato de etilo (10 vol). La mezcla resultante se filtró para eliminar Celite y tamices y se lavó con acetato de etilo (2 vol). El filtrado se lavó con solución de cloruro amónico (4 vol, 20% p/v). La capa orgánica se lavó con solución de bicarbonato sódico (4 vol x 2,5% p/v). La capa orgánica se concentró in vacuo en un rotovap. La suspensión resultante se disolvió en acetato de isopropilo (10 vol) y esta solución se transfirió a un hidrogenador Buchi.

[0180] El hidrogenador se cargó con 5% en peso Pt(S)/C (1,5 mol%) y la mezcla se agitó bajo N₂ a 30 °C (temperatura interna). La reacción se enjuagó con N₂ seguido de hidrógeno. La presión del hidrogenador se ajustó a 1 Bar de hidrógeno y la mezcla se agitó rápidamente (>1200 rpm). Al final de la reacción, el catalizador se filtró a través de una almohadilla de Celite y se lavó con diclorometano (10 vol). El filtrado se concentró al vacío. Los restos de acetato de isopropilo se persiguieron con diclorometano (2 vol) y se concentraron en un rotavapor hasta sequedad.

[0181] El residuo resultante se disolvió en diclorometano (10 vol). Se añadió ácido p- toluenosulfónico monohidratado (1,2 equiv) y se agitó durante la noche. El producto se filtró, se lavó con diclorometano (2 vol) y se secó por succión. La torta húmeda se transfirió a bandejas de secado y a una estufa de vacío y se secó a 45 °C con purga de N₂ hasta alcanzar un peso constante. La sal de tosilato de bencilglicol-4-amonio-2-bromo-5-fluoroanilina se aisló como un sólido blanquecino.

[0182] Se determinó que la pureza quiral era >97%ee.

Síntesis de (3-cloro-3-metilbut-1-ynil)trimetilsilano.

[0183]

[0184] Se cargó alcohol propargílico (1,0 equiv) en un recipiente. Se añadió ácido clorhídrico acuoso (37%, 3,75 vol) y se inició la agitación. Durante la disolución del alcohol sólido se observa una modesta endoterma (5-6 °C). La mezcla resultante se agitó durante toda la noche (16 h), volviéndose lentamente de color rojo oscuro. Se carga un recipiente encamisado de 30 L con agua (5 vol) que se enfría a 10 °C. La mezcla de reacción se transfiere lentamente al agua mediante vacío, manteniendo la temperatura interna de la mezcla por debajo de 25 °C. Se añade hexanos (3 vol) y la mezcla resultante se agita durante 0,5 h. Las fases se sedimentaron y la fase acuosa (pH < 1) se drenó y desechó. La fase orgánica se concentró al vacío utilizando un evaporador rotatorio, obteniéndose el producto en forma de aceite rojo.

Síntesis de (4-(benciloxi)-3,3-dimetilbut-1-inoil)trimetilsilano.

[0185]

Método A

[0186] Todos los descriptores equivalentes y de volumen de esta parte se basan en una reacción de 250 g. Las virutas de magnesio (69,5 g, 2,86 mol, 2,0 equiv) se cargaron en un reactor de 4 cuellos de 3 l y se agitaron con un agitador magnético bajo nitrógeno durante 0,5 h. El reactor se sumergió en un baño de agua helada. Se añadió lentamente al reactor, con agitación, una solución de cloruro de propargilo (250 g, 1,43 mol, 1,0 equiv) en THF (1,8 l, 7,2 vol) hasta que se observó una exotermia inicial (~10 °C). La formación del reactivo de Grignard fue confirmada por IPC mediante espectroscopia RMN-1H. Una vez que disminuyó la exotermia, se añadió lentamente el resto de la solución, manteniendo la temperatura del lote <15 °C. La adición requirió ~3,5 h. La mezcla verde oscura resultante se decantó en una botella con tapón de 2 l.

[0187] Todos los descriptores equivalentes y de volumen de esta parte se basan en una reacción de 500 g. Se cargó un reactor de 22 l con una solución de clorometil éter bencílico (95%, 375 g, 2,31 mol, 0,8 equiv) en THF (1,5 l, 3 vol). El reactor se enfrió en un baño de agua helada. Se combinaron dos de los cuatro lotes de reactivo de Grignard preparados anteriormente y se añadieron lentamente a la solución de bencilclorometiléter mediante un embudo de adición, manteniendo la temperatura del lote por debajo de 25 °C. La adición requirió 1,5 h. La mezcla de reacción se agitó durante toda la noche (16 h).

[0188] Todos los descriptores equivalentes y de volumen de esta parte se basan en una reacción de 1 kg. Se preparó una solución de cloruro de amonio al 15% en un reactor encamisado de 30 l (1,5 kg en 8,5 kg de agua, 10 vol). La solución se enfrió a 5 °C. Las dos mezclas de reacción de Grignard anteriores se combinaron y luego se transfirieron a la solución de cloruro de amonio a través de un recipiente de cabecera. Se observó una exotermia en este enfriamiento, que se llevó a cabo a un ritmo tal que mantuvo la temperatura interna por debajo de 25 °C. Una vez finalizada la transferencia, la temperatura de la camisa del recipiente se fijó en 25 °C. Se añadió hexanos (8 l, 8 vol) y la mezcla se agitó durante 0,5 h. Tras la sedimentación de las fases, se drenó la fase acuosa (pH 9) y se desechó. La fase orgánica restante se lavó con agua (2 l, 2 vol). La fase orgánica se concentró in vacuo utilizando un rotavapor de 22 l, obteniéndose el producto bruto en forma de aceite anaranjado.

Método B

[0189] Se cargaron virutas de magnesio (106 g, 4,35 mol, 1,0 eq) en un reactor de 22 l y se suspendieron en THF (760 ml, 1 vol). El recipiente se enfrió en un baño de agua helada hasta que la temperatura del lote alcanzó los 2 °C. Se añadió lentamente al reactor una solución de cloruro de propargilo (760 g, 4,35 mol, 1,0 equiv) en THF (4,5 L, 6 vol). Después de añadir 100 ml, se detuvo la adición y se agitó la mezcla hasta que se observó una exoterma de 13 °C, indicando la iniciación del reactivo de Grignard. Una vez que la exoterma remitió, se añadieron lentamente otros 500 ml de la solución de cloruro de propargilo, manteniendo la temperatura del lote <20 °C. La formación del reactivo de Grignard fue confirmada por IPC mediante espectroscopia RMN-1H. El resto de la solución de cloruro de propargilo se añadió lentamente, manteniendo la temperatura del lote <20 °C. La adición requirió ~1,5 h. La solución verde oscura resultante se agitó durante 0,5 h. La formación del reactivo de Grignard fue confirmada por IPC mediante espectroscopia RMN-1H. El clorometil éter bencílico puro se cargó en el embudo de adición del reactor y se añadió gota a gota en el reactor, manteniendo la temperatura del lote por debajo de 25 °C. La adición requirió 1,0 h. La mezcla de reacción se agitó durante toda la noche. El trabajo acuoso y la concentración se llevaron a cabo utilizando el mismo procedimiento y cantidades relativas de materiales que en el Método A para dar el producto como un aceite naranja.

Síntesis de 4-benciloxi-3,3-dimetilbut-1-ino.

[0190]

[0191] Se cargó un reactor encamisado de 30 l con metanol (6 vol) que luego se enfrió a 5 °C. Se añadió hidróxido potásico (85%, 1,3 equiv) al reactor. Se observó una exotermia de 15-20 °C a medida que se disolvía el hidróxido de potasio. La temperatura de la camisa se fijó en 25 °C. Se añadió una solución de 4-benciloxi-3,3-dimetil-l-trimetilsililbutl-ino (1,0 equiv) en metanol (2 vol) y la mezcla resultante se agitó hasta la finalización de la reacción, monitorizada por HPLC. El tiempo de reacción típico a 25 °C es de 3-4 h. La mezcla de reacción se diluye con agua (8 vol) y se agita durante 0,5 h. Se añadió hexanos (6 vol) y la mezcla resultante se agitó durante 0,5 h. Se dejaron sedimentar las fases y, a continuación, se drenó y desechó la fase acuosa (pH 10-11). La fase orgánica se lavó con una solución de KOH (85%, 0,4 equiv) en agua (8 vol) seguida de agua (8 vol). A continuación, la fase orgánica se concentró utilizando un evaporador rotatorio, obteniéndose el material del título como un aceite amarillo anaranjado. La pureza típica de este material oscila en torno al 80%, con una única impureza presente. RMN 1H (400 MHz, CeDe) 57.28 (d, 2 H,J= 7.4 Hz), 7.18 (t, 2 H, J= 7.2 Hz), 7.10 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 4.35 (s, 2 H), 3.24 (s, 2 H), 1.91 (s, 1 H), 1.25 (s, 6 H).

Síntesis de 4-amino-2-(4-benciloxi-3,3-dimetilbut-1-ynil)-5-fluoroanilina bencilglicolada.

[0192]

[0193] La sal de tosilato de 4-amonio-2-bromo-5-flouroanilina benzilglicolada se liberó agitando el sólido en EtOAc (5 vol) y solución saturada de NaHCCb (5 vol) hasta conseguir una capa orgánica clara. Las capas resultantes se separaron y la capa orgánica se lavó con solución saturada de NaHCCb (5 vol) seguida de salmuera y se concentró al vacío para obtener la sal 4-amonio-2-bromo-5-flouroanilina tosilato de benciloglicolato como un aceite.

[0194] A continuación, se cargó un matraz con sal de tosilato de 4-amonio-2-bromo-5- flouroanilina benzilglicolada (base libre, 1,0 equiv), Pd(OAc) (4,0 mol%), dppb (6,0 mol%) y K₂CO₃ en polvo (3,0 equiv) y se agitó con acetonitrilo (6 vol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción resultante se desgasificó durante aproximadamente 30 min mediante burbujeo en N₂ con respiradero. A continuación, se añadió en corriente rápida 4-benciloxi-3,3-dimetilbut-lino (1,1 equiv) disuelto en acetonitrilo (2 vol), se calentó a 80 °C y se agitó hasta el consumo completo de la sal de tosilato de 4-amonio-2-bromo-5-flouroanilina. La suspensión de la reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró a través de una almohadilla de Celite y se lavó con acetonitrilo (2 vol). El filtrado se concentró in vacuo y el residuo se redisolvió en EtOAc (6 vol). La capa orgánica se lavó dos veces con solución de NH4CI (20% p/v, 4 vol) y salmuera (6 vol). La capa orgánica resultante se concentró para obtener aceite marrón y se utilizó tal cual en la siguiente reacción.

Síntesis de N-bencilglicolado-5-amino-2-(2-benciloxi-1,1-dimetiletil)-6-fluoroindol.

[0195]

[0196] El aceite crudo de 4-amino-2-(4-benciloxi-3,3-dimetilbut-1-acil)-5-fluoroanilina bencilglicolada se disolvió en acetonitrilo (6 vol) y se añadió (MeCN)₂PdCl2 (15 mol%) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se desgasificó utilizando N₂ con respiradero durante aproximadamente 30 min. A continuación, la mezcla de reacción se agitó a 80 °C bajo manto de N₂ durante toda la noche. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró a través de una almohadilla de Celite y se lavó la torta con acetonitrilo (1 vol). El filtrado resultante se concentró in vacuo y se redisolvió en EtOAc (5 vol). Se añadió Deloxane-II THP (5 % en peso basado en el rendimiento teórico de N-bencilglicolado-5-amino-2-(2-benciloxi-1,1-dimetiletil)-6-fluoroindol) y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, la mezcla se filtró a través de una almohadilla de sílice (filtro de 2,5 pulgadas de profundidad y 6 pulgadas de diámetro) y se lavó con EtOAc (4 vol). El filtrado se concentró hasta obtener un residuo marrón oscuro y se utilizó tal cual en la siguiente reacción.

[0197] Repurificación del N-bencilglicolado-5-amino-2-(2-benciloxi-1,1- dimetiletil)-6-fluoroindol crudo:

[0198] El N-bencilglicolado-5-amino-2-(2-benciloxi-1,1-dimetiletil)-6-fluoroindol crudo se disolvió en diclorometano (~1,5 vol) y se filtró a través de una almohadilla de sílice utilizando inicialmente EtOAc/heptano al 30%, donde se descartaron las impurezas. A continuación, la almohadilla de sílice se lavó con EtOAc/heptano al 50% para aislar el N-bencilglicolado-5-amino-2-(2-benciloxi-1,1- dimetiletil)-6-fluoroindol hasta que se observó un color tenue en el filtrado. Este filtrado se concentró al vacío para obtener un aceite marrón que cristalizó al reposar a temperatura ambiente. RMN 1H (400 MHz, DMSO) ó 7.38-7.34 (m, 4 H), 7.32-7.23 (m, 6 H), 7.21 (d, 1 H, J= 12.8 Hz), 6.77 (d, 1H, J= 9.0 Hz), 6.06 (s, 1 H), 5.13 (d, 1H, J= 4.9 Hz), 4.54 (s, 2 H), 4.46 (br. s, 2 H), 4.45 (s, 2 H), 4.33 (d, 1 H, J= 12.4 Hz), 4.09-4.04 (m, 2 H), 3.63 (d, 1H, J= 9.2 Hz), 3.56 (d, 1H, J= 9.2 Hz), 3.49 (dd, 1H, J= 9.8, 4.4 Hz), 3.43 (dd, 1H, J= 9.8, 5.7 Hz), 1.40 (s, 6 H).

Síntesis del Compuesto 1

Síntesis del Compuesto 1 protegido con bencilo.

[0199]

[0200] El ácido 1 -(2,2 -difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)-ciclopropanocarboxílico (1,3 equiv) se disolvió en tolueno (2,5 vol, a base de ácido 1-(2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)-ciclopropanocarboxílico) y la mezcla se calentó a 60 °C. Se añadió SOCl2 (1,7 equiv) a través del embudo de adición. La mezcla resultante se agitó durante 2 h. El tolueno y el exceso de SOCl2 se destilaron con rotavop. Se añadió tolueno adicional (2,5 vol, a base de ácido 1-(2,2- difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)-ciclopropanocarboxílico) y se destiló de nuevo. El cloruro ácido bruto se disolvió en diclorometano (2 vol) y se añadió mediante embudo de adición a una mezcla de N-bencilglicolado-5-amino-2-(2-benciloxi-1,1-dimetiletil)-6-fluoroindol (1,0 equiv), y trietilamina (2,0 equiv) en diclorometano (7 vol) manteniendo 0-3 °C (temperatura interna). La mezcla resultante se agitó a 0 °C durante 4 h y después se calentó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió agua destilada (5 vol) a la mezcla de reacción, se agitó durante 30 min NLT y se separaron las capas. La fase orgánica se lavó con K₂CO₃ al 20% en peso (4 vol x 2) seguido de un lavado con salmuera (4 vol) y se concentró para obtener el Compuesto 1 crudo protegido con bencilo como un aceite marrón espeso, que se purificó adicionalmente mediante filtración con almohadilla de sílice.

[0201] Filtración por almohadilla de gel de sílice: El Compuesto 1 protegido con bencilo crudo se disolvió en acetato de etilo (3 vol) en presencia de carbón activado Darco-G (10% en peso, basado en el rendimiento teórico del Compuesto 1 protegido con bencilo) y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A esta mezcla se añadió heptano (3 vol) y se filtró a través de una almohadilla de gel de sílice (2x peso de Compuesto 1 crudo protegido con bencilo). La almohadilla de sílice se lavó con acetato de etilo/heptano (1:1,6 vol) o hasta que se detectó poco color en el filtrado. El filtrado se concentró in vacuo para obtener el Compuesto 1 protegido con bencilo como aceite viscoso de color marrón rojizo, y se utilizó directamente en el siguiente paso.

[0202] Repurificación: El Compuesto 1 protegido con bencilo se redisolvió en diclorometano (1 vol, basado en el rendimiento teórico del Compuesto 1 protegido con bencilo) y se cargó en una almohadilla de gel de sílice (2x peso de Compuesto 1 protegido con bencilo crudo). La almohadilla de sílice se lavó con diclorometano (2 vol, según el rendimiento teórico del Compuesto 1 protegido con bencilo) y el filtrado se desechó. La almohadilla de sílice se lavó con acetato de etilo/heptano al 30% (5 vol) y el filtrado se concentró in vacuo para obtener el Compuesto 1 protegido con bencilo como aceite viscoso de color naranja rojizo, y se utilizó directamente en el siguiente paso.

Síntesis del Compuesto 1.

Método A

[0204] Un autoclave de 20 l se enjuagó tres veces con gas nitrógeno y luego se cargó con paladio sobre carbono (Evonik E 101 NN/W, 5% Pd, 60% húmedo, 200 g, 0,075 mol, 0,04 equiv). A continuación, el autoclave se enjuagó con nitrógeno tres veces. Se añadió al autoclave por succión una solución de Compuesto 1 crudo protegido con bencilo (1,3 kg, ~1,9 mol) en THF (8 l, 6 vol). Se tapó el recipiente y se enjuagó tres veces con gas nitrógeno. Con agitación suave, el recipiente se enjuagó tres veces con gas hidrógeno, evacuando a la atmósfera mediante dilución con nitrógeno. El autoclave se presurizó a 3 Bar con hidrógeno y la velocidad de agitación se aumentó a 800 rpm. Se observó una rápida absorción de hidrógeno (disolución). Una vez que la absorción disminuyó, el recipiente se calentó a 50 °C.

[0205] Por razones de seguridad, el termostato se apagaba al final de cada jornada laboral. El recipiente se presurizó con hidrógeno hasta 4 bares y, a continuación, se aisló del depósito de hidrógeno.

[0206] Tras 2 días completos de reacción, se añadió más Pd / C (60 g, 0,023 mol, 0,01 equiv) a la mezcla. Para ello, se enjuagó tres veces con gas nitrógeno y, a continuación, se añadió el catalizador a través del puerto de adición de sólidos. La reanudación de la reacción se hizo como antes. Tras 4 días completos, la reacción se consideró completa mediante HPLC por la desaparición no sólo del material de partida sino también del pico correspondiente a un intermedio mono-bencilado.

[0207] La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de Celite. El recipiente y la torta de filtración se lavaron con THF (2 l, 1,5 vol). A continuación, la almohadilla de Celite se humedeció con agua y la torta se desechó adecuadamente. El filtrado combinado y el lavado con THF se concentraron mediante un evaporador rotatorio, obteniéndose el producto bruto en forma de aceite negro, 1 kg.

[0208] Los equivalentes y volúmenes de la siguiente purificación se basan en 1 kg de material bruto. El aceite negro crudo se disolvió en acetato de etilo-heptano 1:1. La mezcla se cargó en una almohadilla de gel de sílice (1,5 kg, 1,5 equiv. en peso) en un embudo fritado que se había saturado con 1:1 de acetato de etilo-heptano. La almohadilla de sílice se lavó primero con acetato de etilo-heptano 1:1 (6 l, 6 vol) y después con acetato de etilo puro (14 l, 14 vol). El eluyente se recogió en 4 fracciones que se analizaron por HPLC.

[0209] Los equivalentes y volúmenes de la siguiente purificación se basan en 0,6 kg de material bruto. La fracción 3 se concentró por evaporación rotatoria para dar una espuma marrón (600 g) y se redisolvió en MTBE (1,8 l, 3 vol). La solución de color marrón oscuro se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente, tiempo durante el cual se produjo la cristalización. Se añadió heptano (55 ml, 0,1 vol) y la mezcla se agitó durante la noche. La mezcla se filtró con un embudo Buchner y la torta del filtro se lavó con MTBE-heptano 3:1 (900 ml, 1,5 vol). La torta filtrante se secó al aire durante 1 h y después al vacío a temperatura ambiente durante 16 h, obteniéndose 253 g de VXc-661 como sólido blanquecino.

[0210] Los equivalentes y volúmenes para la siguiente purificación se basan en 1,4 kg de material bruto. Las fracciones 2 y 3 de la filtración en gel de sílice anterior, así como el material de una reacción anterior, se combinaron y concentraron para dar 1,4 kg de un aceite negro. La mezcla se volvió a someter a la filtración en gel de sílice (1,5 kg de gel de sílice, eluido con 3,5 l, 2,3 vol de acetato de etilo-heptano 1:1 y luego 9 l, 6 vol de acetato de etilo puro) descrita anteriormente, que al concentrarse dio un sólido espumoso de color canela (390 g).

[0211] Los equivalentes y volúmenes para la purificación siguiente se basan en 390 g de material bruto. El sólido de color canela era insoluble en MTBE, por lo que se disolvió en metanol (1,2 l, 3 vol). Utilizando un reactor Morton de 4 l equipado con un cabezal de destilación de largo recorrido, la mezcla se destiló hasta 2 vol. Se añadió MTBE (1,2 l, 3 vol) y la mezcla se destiló de nuevo hasta 2 vol. Se añadió una segunda porción de MTBE (1,6 L, 4 vol) y la mezcla se destiló de nuevo hasta 2 vol. Se añadió una tercera porción de MTBE (1,2 l, 3 vol) y la mezcla se destiló de nuevo hasta 3 vol. Se añadió una segunda porción de MTBE (1,6 l, 4 vol) y la mezcla se destiló de nuevo a 2 vol. Se añadió una tercera porción de MTBE (1,2 l, 3 vol) y la mezcla se destiló de nuevo a 3 vol. El análisis del destilado por CG reveló que estaba compuesto por ~6% de metanol. El termostato se ajustó a 48 °C (por debajo de la temperatura de ebullición del azeótropo MTBE-metanol, que es de 52 °C). La mezcla se enfrió a 20 °C durante 2 h, tiempo durante el cual se produjo una cristalización relativamente rápida. Tras agitar la mezcla durante 2 h, se añadió heptano (20 ml, 0,05 vol) y la mezcla se agitó durante toda la noche (16 h). La mezcla se filtró con un embudo Buchner y la torta del filtro se lavó con MTBE-heptano 3:1 (800 ml, 2 vol). La torta filtrante se secó al aire durante 1 h y después al vacío a temperatura ambiente durante 16 h, obteniéndose 130 g del Compuesto 1 como sólido blanquecino.

Método B

[0212] Se disolvió el Compuesto 1 protegido con bencilo y se lavó con THF (3 vol) para eliminar cualquier resto de disolvente residual. El Compuesto 1 protegido con bencilo se redisolvió en THF (4 vol) y se añadió al hidrogenador que contenía un 5% en peso de Pd/C (2,5 mol%, 60% húmedo, Degussa E5 E101 NNAV). La temperatura interna de la reacción se ajustó a 50 °C, y se enjuagó con N₂ (X5) seguido de hidrógeno (x3). La presión del hidrogenador se ajustó a 3 Bar de hidrógeno y la mezcla se agitó rápidamente (>1100 rpm). Al final de la reacción, el catalizador se filtró a través de una almohadilla de Celite y se lavó con THF (1 vol). El filtrado se concentró al vacío para obtener un residuo espumoso de color marrón. El residuo resultante se disolvió en MTBE (5 vol) y se añadieron una solución de HCl 0,5N (2 vol) y agua destilada (1 vol). La mezcla se agitó durante NLT 30 min y se separaron las capas resultantes. La fase orgánica se lavó con solución de K₂CO₃ al 10% (2 vol x2) seguida de un lavado con salmuera. La capa orgánica se añadió a un matraz que contenía gel de sílice (25% en peso), Deloxan-THP II (5% en peso, 75% húmedo) y Na2SO4, y se agitó durante la noche. La mezcla resultante se filtró a través de una almohadilla de Celite y se lavó con 10%THF/MTBE (3 vol). El filtrado se concentró in vacuo para obtener el Compuesto 1 crudo como espuma de color canela pálido.

Recuperación del Compuesto 1 a partir del licor madre: Opción A.

[0213] Filtración por almohadilla de gel de sílice: El licor madre se concentró in vacuo para obtener una espuma marrón, se disolvió en diclorometano (2 vol) y se filtró a través de una almohadilla de sílice (3x peso del Compuesto 1 crudo). La almohadilla de sílice se lavó con acetato de etilo/heptano (1:1, 13 vol) y el filtrado se desechó. La almohadilla de sílice se lavó con THF/acetato de etilo al 10% (10 vol) y el filtrado se concentró in vacuo para obtener el Compuesto 1 como espuma de color tostado pálido. Se siguió el procedimiento de cristalización anterior para aislar el resto del Compuesto 1.

Recuperación del Compuesto 1 a partir del licor madre: Opción B.

[0214] Cromatografía en columna de gel de sílice: Tras cromatografía sobre gel de sílice (50% de acetato de etilo/hexanos a 100% de acetato de etilo), se aisló el compuesto deseado en forma de espuma de color tostado pálido. Se siguió el procedimiento de cristalización anterior para aislar el resto del Compuesto 1.

[0215] La figura 1 muestra un patrón de difracción de polvo de rayos X del Compuesto 1. En la Figura 2 se muestra una traza DSC del Compuesto 1. La traza DSC de la Figura 2 indica que el Compuesto 1 no es una fase sólida pura. Existe un pico adicional a 119 °C en comparación con la Forma A del Compuesto 1 (véase la Figura 6). En la Figura 3 se muestra una traza TGA del Compuesto 1.

[0216] El Compuesto 1 también puede prepararse por una de las diversas rutas sintéticas divulgadas en la solicitud de patente US20090131492 publicada en los Estados Unidos.

Síntesis de la Forma A del Compuesto

Método de suspensión

[0217] Para EtOAc, MTBE, acetato de isopropilo o DCM, se añadieron aproximadamente 40 mg del Compuesto 1 a un vial junto con 1-2 ml de cualquiera de los disolventes anteriores. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 24 h a 2 semanas y la Forma A del Compuesto 1 se recogió centrifugando la suspensión (con filtro). La Figura 5 muestra un patrón XRPD de la Forma A del Compuesto 1 obtenido por este método con DCM como disolvente.

[0218] Para las soluciones EtOH/agua, se añadieron aproximadamente 40 mg del Compuesto 1 a tres viales separados. En el primer vial se añadieron 1,35 ml de EtOH y 0,15 ml de agua. En el segundo vial, se añadieron 0,75 ml de EtOH y 0,75 ml de agua. En el tercer vial se añadieron 0,15 ml de EtOH y 1,35 ml de agua. Los tres viales se agitaron a temperatura ambiente durante 24 h. A continuación, cada suspensión se centrifugó por separado (con filtro) para recoger la forma A del Compuesto 1.

[0219] Para las Soluciones de alcohol isopropílico/agua, se añadieron aproximadamente 40 mg del Compuesto 1 a tres viales separados. En el primer vial se añadieron 1,35 ml de alcohol isopropílico y 0,15 ml de agua. En el segundo vial, se añadieron 0,75 ml de alcohol isopropílico y 0,75 ml de agua. En el tercer vial se añadieron 0,15 ml de alcohol isopropílico y 1,35 ml de agua. Los tres viales se agitaron a temperatura ambiente durante 24 h. A continuación, cada suspensión se centrifugó por separado (con filtro) para recoger la forma A del Compuesto 1.

[0220] Para las Soluciones metanol/agua, se añadieron aproximadamente 40 mg del Compuesto 1 a un vial. Se añadieron 0,5 ml de metanol y 1 ml de agua y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. La suspensión se centrifugó (con filtro) para recoger el Compuesto 1 Forma A.

[0221] Para el acetonitrilo, se añadieron aproximadamente 50 mg del Compuesto 1 a un vial junto con 2,0 ml de acetonitrilo. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 24 h y la Forma A del Compuesto 1 se recogió por centrifugación (con filtro).

[0222] Para las soluciones de acetonitrilo/agua, se disolvieron aproximadamente 50 mg del Compuesto 1 en 2,5 ml de acetonitrilo para obtener una solución clara después de la sonicación. La solución se filtró y se retiró 1 ml a un vial. Se añadieron 2,25 ml de agua para obtener una suspensión turbia. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 24 h y la Forma A del Compuesto 1 se recogió por centrifugación (con filtro).

Método de evaporación lenta

[0223] Se disolvieron aproximadamente 55 mg del Compuesto 1 en 0,5 ml de acetona para dar una solución clara tras sonicación. La solución se filtró y se retiraron 0,2 ml a un vial. El vial se cubrió con parrafilm al que se le practicó un orificio y se dejó reposar. La forma A recristalizada del Compuesto 1 se recogió por filtración.

Método de evaporación rápida

[0224] Para el alcohol isopropílico, se disolvieron aproximadamente 43 mg del Compuesto 1 en 2,1 ml de alcohol isopropílico para dar una solución clara después de la sonicación. La solución se filtró en un vial y se dejó reposar al descubierto. La forma A recristalizada del Compuesto 1 se recogió por filtración.

[0225] Para el metanol, se disolvieron aproximadamente 58 mg del Compuesto 1 en 0,5 ml de metanol para dar una solución clara después de la sonicación. La solución se filtró y se retiraron 0,2 ml a un vial destapado y se dejó reposar. La forma A recristalizada del Compuesto 1 se recogió por filtración.

[0226] Para el acetonitrilo, se disolvieron aproximadamente 51 mg del Compuesto 1 en 2,5 ml de acetonitrilo para dar una solución clara después de la sonicación. La solución se filtró y la mitad de la solución se retiró a un vial destapado y se dejó reposar. La forma A recristalizada del Compuesto 1 se recogió por filtración. La Figura 7 muestra un patrón XRPD de la Forma A del Compuesto 1 preparado por este método.

Método antisolvente

[0227] Para EtOAc/heptano, se disolvieron aproximadamente 30 mg del Compuesto 1 en 1,5 ml de EtOAc para dar una solución clara después de sonicar. La solución se filtró y se añadieron 2,0 ml de heptano a la solución filtrada mientras se agitaba lentamente. La solución se agitó durante 10 minutos más y se dejó reposar. La forma A recristalizada del Compuesto 1 se recogió por filtración. La Figura 8 muestra un patrón XRPD de la Forma A del Compuesto 1 preparado por este método.

[0228] Para alcohol isopropílico/agua, se disolvieron aproximadamente 21 mg del Compuesto 1 en 1,0 ml de alcohol isopropílico para dar una solución clara después de sonicar. La solución se filtró para dar 0,8 ml de solución. Se añadieron 1,8 ml de agua mientras se agitaba lentamente. Se añadieron otros 0,2 ml de agua para obtener una suspensión turbia. Se dejó de agitar durante 5 minutos para obtener una solución clara. La solución se agitó durante 2 minutos más y se dejó reposar. La forma A recristalizada del Compuesto 1 se recogió por filtración.

[0229] Para etanol/agua, se disolvieron aproximadamente 40 mg del Compuesto 1 en 1,0 ml de etanol para dar una solución clara después de sonicar. La solución se filtró y se añadieron 1,0 ml de agua. La solución se agitó durante 1 día a temperatura ambiente. La forma A recristalizada del Compuesto 1 se recogió por filtración.

[0230] Para acetona/agua, se disolvieron aproximadamente 55 mg del Compuesto 1 en 0,5 ml de acetona para dar una solución clara después de sonicar. La solución se filtró y se retiraron 0,2 ml a un vial. Se añadieron 1,5 ml de agua y, a continuación, otros 0,5 ml de agua para obtener una suspensión turbia. La suspensión se agitó durante 1 día a temperatura ambiente. La forma A del Compuesto 1 se recogió por filtración.

[0231] La Tabla 2 a continuación resume las diversas técnicas para formar el Compuesto 1 Forma A.

Tabla 2.

[0232] En la Figura 4 se muestra un patrón de difracción de rayos X calculado a partir de una estructura monocristalina de la Forma A del Compuesto 1. La Tabla 3 enumera los picos calculados para la Figura 1.

Tabla 3.

[0233] En la Figura 5 se muestra un patrón real de difracción de rayos X de polvo de la Forma A del Compuesto 1. En la Tabla 4 se enumeran los picos reales de la Figura 5.

Tabla 4.

[0234] La traza DSC de la Forma A del Compuesto 1 se muestra en la Figura 6. El punto de fusión de la Forma A del Compuesto 1 se produce a unos 172-178 °C.

[0235] Se obtuvieron datos de cristal único para el Compuesto 1 Forma A, proporcionando detalles adicionales sobre la estructura cristalina, incluyendo el tamaño de la red y el empaquetamiento.

Preparación de cristales

[0236] Los cristales de la Forma A del Compuesto 1 se obtuvieron por evaporación lenta a partir de una solución concentrada de metanol (10 mg/ml). Se seleccionó un cristal incoloro de la Forma A del Compuesto 1 con unas dimensiones de 0,20 x 0,05 x 0,05 mm, se limpió con aceite mineral, se montó en un MicroMount y se centró en un difractómetro Bruker APEXll. Se obtuvieron tres lotes de 40 fotogramas separados en el espacio recíproco para obtener una matriz de orientación y los parámetros iniciales de la célula. Los parámetros finales de la célula se obtuvieron y refinaron a partir del conjunto completo de datos.

Experimental

[0237] Se obtuvo un conjunto de datos de difracción del espacio recíproco con una resolución de 0,83 Á utilizando pasos de 0,5° con una exposición de 30 s para cada fotograma. Los datos se recogieron a temperatura ambiente [295 (2) K], la integración de las intensidades y el refinamiento de los parámetros de la célula se realizaron con el software APEXlI. La observación del cristal tras la recogida de datos no mostró signos de descomposición.

Tabla 5. Datos cristalinos del Compuesto 1 Forma A

[0238] Geometría: Todas las esd (excepto la esd en el ángulo diedro entre dos planos l.s.) se estiman utilizando la matriz de covarianza completa. Las esds de celda se tienen en cuenta individualmente en la estimación de esds en distancias, ángulos y ángulos de torsión; las correlaciones entre esds en parámetros de celda sólo se utilizan cuando están definidas por la simetría del cristal. Se utiliza un tratamiento aproximado (isotrópico) de las esds de células para estimar las esds que implican planos 1.s.

Tabla 6. Parámetros de recogida de datos para el cristal de Forma A del Compuesto 1.

[0239] Recogida de datos: Apex II; refinamiento celular: Apex II; reducción de datos: Apex II; programa(s) utilizado(s) para resolver la estructura: SHELXS97 (Sheldrick, 1990); programa(s) utilizado(s) para refinar la estructura: SHELXL97 (Sheldrick, 1997); gráficos moleculares: Mercury; software utilizado para preparar el material para su publicación: publCIF.

Tabla 7. Parámetros de refinamiento para el cristal de la Forma A del Compuesto 1.

[0240] Refinamiento: Perfeccionamiento de F2 contra TODOS los reflejos. El factor R ponderado wR y la bondad del ajuste S se basan en F2, mientras que los factores R convencionales se basan en F, y F se fija en cero para F2 negativo. La expresión umbral de F2 > 2sigma(F2) sólo se utiliza para calcular los factores R(gt), etc. y no es relevante para la elección de las reflexiones para el refinamiento. Los factores R basados en F2 son estadísticamente aproximadamente el doble de grandes que los basados en F, y los factores R basados en TODOS los datos serán aún mayores.

[0241] Las imágenes conformacionales de la Forma A del Compuesto 1 basadas en el análisis de rayos X de cristal único se muestran en las Figuras 9 y 10. Los grupos -OH terminales están conectados mediante redes de enlaces de hidrógeno para formar un grupo tetramérico con cuatro moléculas adyacentes (Figura 10). El otro grupo hidroxilo actúa como donante de enlaces de hidrógeno para formar un enlace de hidrógeno con un grupo carbonilo de una molécula adyacente. La estructura cristalina revela un denso empaquetamiento de las moléculas. La Forma A del Compuesto 1 es monoclínica, grupo espacial C2, con las siguientes dimensiones de celda unitaria: a = 21,0952(16) A, b = 6,6287(5) A, c = 17,7917(15) A, p = 95,867(6)°, y = 90°.

[0242] En la Figura 11 se muestra un espectro de RMN 13C en estado sólido de la Forma A del Compuesto 1. La Tabla 8 muestra los desplazamientos químicos de los picos relevantes.

Tabla 8.

[0243] En la Figura 12 se muestra un espectro de RMN 19F en estado sólido de la Forma A del Compuesto 1. Los picos con un asterisco denotan bandas laterales giratorias. La Tabla 9 muestra los desplazamientos químicos de los picos relevantes.

Tabla 9.

Síntesis de la Forma Amorfa del Compuesto 1

Método de evaporación rotativa

[0244] La forma amorfa del Compuesto 1 también se consiguió mediante evaporación rotatoria. El Compuesto 1 (aproximadamente 10 g) se disolvió en 180 ml de MeOH y se evaporó por rotación en un baño a 50 °C hasta formar espuma. DSC (Figura 14) y XRPD (Figura 13) confirmaron la forma amorfa del Compuesto 1. La Figura 15 muestra una traza TGA de la forma amorfa del Compuesto 1 preparada por este método.

Método de secado por pulverización

[0245] Se pesaron 9,95 g de acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa de grado HG (HPMCAS-HG) en un vaso de precipitados de 500 ml, junto con 50 mg de lauril sulfato sódico (SLS). Se mezcló MeOH (200 ml) con el sólido. El material se dejó agitar durante 4 h. Para asegurar la máxima disolución, tras 2 h de agitación se sonicó la solución durante 5 minutos y se dejó que siguiera agitándose durante las 2 h restantes. Una suspensión muy fina de HPMCAS permaneció en solución. Sin embargo, la observación visual determinó que no quedaban porciones gomosas en las paredes del recipiente ni pegadas al fondo tras inclinarlo.

[0246] La Forma A del Compuesto 1 (10 g) se vertió en el vaso de precipitados de 500 ml, y se dejó que el sistema siguiera agitándose. La solución se secó por atomización utilizando los siguientes parámetros:

[0247] Se recuperaron aproximadamente 16 g de la forma amorfa del Compuesto 1 (rendimiento del 80%). La forma amorfa del Compuesto 1 se confirmó mediante XRPD (Figura 16) y DSC (Figura 17).

[0248] En la Figura 18 se muestra un espectro de RMN 13C en estado sólido de la forma amorfa del Compuesto 1. En la Tabla 10 se indican los desplazamientos químicos de los picos correspondientes.

Tabla 10.

[0249] En la Figura 19 se muestra un espectro de RMN 19Fen estado sólido de la forma amorfa del Compuesto 1. Los picos con un asterisco denotan bandas laterales giratorias. La Tabla 11 muestra los desplazamientos químicos de los picos relevantes.

Tabla 11.

[0250] La Tabla 12 a continuación recita datos analíticos adicionales para el Compuesto 1.

Tabla 12.

ENSAYOS

Ensayos para detectar y medir las propiedades de corrección de AF508-RTFQ de los compuestos

Métodos ópticos de potencial de membrana para evaluar las propiedades de modulación AF508-RTFQ de los compuestos

[0251] El ensayo del potencial óptico de membrana utilizó sensores FRET sensibles al voltaje descritos por González y Tsien (Ver. González, J. E. y R. Y. Tsien (1995) "Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer in single cells" Biophys J 69(4): 1272-80, and Gonzalez, J. E. and R. Y. Tsien (1997) "Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescence resonance energy transfer" Chem Biol 4(4): 269-77) en combinación con instrumentación para medir los cambios de fluorescencia como el Voltage/Ion Probe Reader (VTPR) (Ver. Gonzalez, J. E., K. Oades, et al. (1999) "Cell-based assays and instrumentation for screening ion-channel targets" Drug Discov Today 4(9): 431-439).

[0252] Estos ensayos sensibles al voltaje se basan en el cambio en la transferencia de energía resonante de fluorescencia (FRET) entre el colorante soluble en membrana y sensible al voltaje, DiSBAC2(3), y un fosfolípido fluorescente, CC2-DMPE, que está unido a la lámina externa de la membrana plasmática y actúa como donante de FRET. Los cambios en el potencial de membrana (Vm) hacen que el DiSBAC2(3) cargado negativamente se redistribuya a través de la membrana plasmática y la cantidad de transferencia de energía del CC2-DMPE cambia en consecuencia. Los cambios en la emisión de fluorescencia se monitorizaron utilizando VTPR™ II, que es un manipulador de líquidos integrado y un detector fluorescente diseñado para realizar cribas celulares en placas de microtitulación de 96 o 384 pocillos.

1. Identificación de Compuestos Correctores

[0253] Para identificar moléculas pequeñas que corrijan el defecto de tráfico asociado con AF508-RTFQ; se desarrolló un formato de ensayo HTS de adición única. Las células se incubaron en medio libre de suero durante 16 h a 37 °C en presencia o ausencia (control negativo) del compuesto de ensayo. Como control positivo, se incubaron células en placas de 384 pocillos durante 16 horas a 27 °C para "corregir la temperatura" de AF508-RTFQ. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces con solución de Krebs Ringers y se cargaron con los colorantes sensibles al voltaje. Para activar AF508-RTFQ, se añadieron 10 pM de forskolina y el potenciador de RTFQ, genisteína (20 pM), junto con medio libre de Cl- a cada pocillo. La adición de medio libre de Cb promovió el eflujo de Cl- en respuesta a la activación de AF508-RTFQ y la despolarización de membrana resultante se monitorizó ópticamente utilizando los colorantes sensores de voltaje basados en FRET.

2. Identificación de Compuestos Potenciadores

[0254] Para identificar potenciadores de AF508-RTFQ, se desarrolló un formato de ensayo HTS de doble adición. Durante la primera adición, se añadió a cada pocillo un medio libre de CT con o sin compuesto de ensayo. Después de 22 s., se añadió una segunda adición de medio libre de CT que contenía 2-10 pM de forskolina para activar AF508-RTFQ. La concentración extracelular de CT tras ambas adiciones fue de 28 mM, lo que promovió el eflujo de CT en respuesta a la activación de AF508-RTFQ y la despolarización de membrana resultante se monitorizó ópticamente utilizando los colorantes sensores de voltaje basados en FRET.

3. Soluciones

4. Cultivo celular

[0256] Para las mediciones ópticas del potencial de membrana se utilizan fibroblastos de ratón NIH3T3 que expresan de forma estable AF508-RTFQ. Las células se mantienen a 37 °C con un 5 % de CO2 y un 90 % de humedad en medio Eagle modificado pore Dulbecco suplementado con 2 mM de glutamina, 10 % de suero bovino fetal, 1 X de NEAA, p-ME, 1 X de pen/strep y 25 mM de HEPES en matrazes de cultivo de 175 cm2. Para todos los ensayos ópticos, las células se sembraron a 30.000/pocillo en placas de 384 pocillos recubiertas de matrigel y se cultivaron durante 2 h a 37 °C antes de cultivarlas a 27 °C durante 24 h para el ensayo potenciador. Para los ensayos de corrección, las células se cultivan a 27 °C o 37 °C con y sin compuestos durante 16 - 24 horas.

Ensayos electrofisiológicos para evaluar las propiedades de modulación AF508-RTFQ de los compuestos

1. Uso del ensayo de cámara

[0257] Utilizando experimentos de cámara se realizaron en células epiteliales polarizadas que expresaban AF508-RTFQ para caracterizar aún más los moduladores AF508-RTFQ identificados en los ensayos ópticos. Las células epiteliales FRTAF508'^rtfq cultivadas en insertos de cultivo celular Costar Snapwell se montaron en una cámara Ussing (Physiologic Instruments, Inc., San Diego, CA), y las monocapas se cortocircuitaron continuamente utilizando un sistema de pinza de tensión (Departamento de Bioingeniería, Universidad de Iowa, IA, y, Physiologic Instruments, Inc., San Diego, CA). La resistencia transepitelial se midió aplicando un impulso de 2 mV. En estas condiciones, los epitelios FRT mostraron resistencias de 4 Kü/ cm2 o más. Las soluciones se mantuvieron a 27 °C y se burbujearon con aire. El potencial de offset del electrodo y la resistencia del fluido se corrigieron utilizando un inserto sin células. En estas condiciones, la corriente refleja el flujo de Cl- a través del AF508-RTFQ expresado en la membrana apical. El Isc se adquirió digitalmente utilizando una interfaz MP100A-CE y el software AcqKnowledge (v3.2.6; BIOPAC Systems, Santa Barbara, CA).

2. Identificación de Compuestos Correctores

[0258] El protocolo típico utiliza un gradiente de concentración de Cl- de la membrana basolateral a la apical. Para establecer este gradiente, se utilizó ringer normal en la membrana basolateral, mientras que el NaCl apical se sustituyó por gluconato sódico equimolar (valorado a pH 7,4 con NaOH) para dar un gran gradiente de concentración de Cl- a través del epitelio. Todos los experimentos se realizaron con monocapas intactas. Para activar completamente el AF508-RTFQ, se aplicaron forskolina (10 pM) y el inhibidor de la PDE, IBMX (100 pM), seguidos de la adición del potenciador del R^t F^q , genisteína (50 pM).

[0259] Como se ha observado en otros tipos celulares, la incubación a bajas temperaturas de células FRT que expresan de forma estable AF508-RTFQ aumenta la densidad funcional de RTFQ en la membrana plasmática. Para determinar la actividad de los compuestos correctores, las células se incubaron con 10 pM del compuesto de prueba durante 24 horas a 37°C y posteriormente se lavaron 3 veces antes de registrarlas. El Isc mediado por AMPc y genisteína en las células tratadas con compuestos se normalizó con respecto a los controles de 27°C y 37°C y se expresó como porcentaje de actividad. La preincubación de las células con el compuesto corrector aumentó significativamente el Isc mediado por AMPc y genisteína en comparación con los Controles a 37°C.

3. Identificación de Compuestos Potenciadores

[0260] El protocolo típico utiliza un gradiente de concentración de Cl- de la membrana basolateral a la apical. Para establecer este gradiente, se utilizó ringers normal en la membrana basolateral y se permeabilizó con nistatina (360 μg/ml), mientras que el NaCl apical se sustituyó por gluconato sódico equimolar (valorado a pH 7,4 con NaOH) para dar un gran gradiente de concentración de C^t a través del epitelio. Todos los experimentos se realizaron 30 min después de la permeabilización con nistatina. La forskolina (10 pM) y todos los compuestos de ensayo se añadieron a ambos lados de los insertos de cultivo celular. La eficacia de los potenciadores putativos AF508-RTFQ se comparó con la del potenciador conocido, la genisteína.

4. Soluciones

[0261]

Solución baso lateral (en NaCl {135), CaCIs (1,2), MgCfc (1-2), K?HPO ^(2,4), KHPOi (0,6), N-2-ácido mM): hidroxietilpmerazina-N'-E-ácido eianosulfónico (HEPES) (10) y dextrosa (10) .La solución se ajustó a pH 7,4 con NaOH.

Solución apical (en mM): Al igual que la solución basolaleral con NaCl reemplazado con Na Glu conato (135).

5. Cultura Celular

[0262] Las células epiteliales de rata Fisher (FRT) que expresan AF508-CFTR (FRTAF508'CFrR) se utilizaron para experimentos de cámara de Ussing para los moduladores putativos de AF508-CFTR identificados a partir de nuestros ensayos ópticos. Las células se cultivaron en insertos de cultivo celular Costar Snapwell y se cultivaron durante cinco días a 37 °C y 5% de CO₂ en medio Ham F-12 modificado por Coon, suplementado con 5% de suero fetal de ternera, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Antes de utilizarlas para caracterizar la actividad potenciadora de los compuestos, las células se incubaron a 27 °C durante 16 - 48 h para corregir la AF508-RTFQ. Para determinar la actividad de los compuestos correctores, las células se incubaron a 27 °C o 37 °C con y sin los compuestos durante 24 horas.

6. Grabaciones de células enteras

[0263] La corriente macroscópica AF508-RTFQ (Uf508) en células NIH3T3 corregidas por temperatura y compuesto de ensayo que expresan AF508-RTFQ de forma estable se monitorizó utilizando el parche perforado, registro de células enteras. Brevemente, las grabaciones de pinzamiento de voltaje de Ursos se realizaron a temperatura ambiente utilizando un amplificador de pinzamiento Axopatch 200B (Axon Instruments Inc., Foster City, CA). Todas las grabaciones se adquirieron con una frecuencia de muestreo de 10 kHz y un filtro de paso bajo de 1 kHz. Las pipetas tenían una resistencia de 5 - 6 MΩ cuando se llenaban con la solución intracelular. En estas condiciones de registro, el potencial de inversión calculado para el Cl-(Eci) a temperatura ambiente fue de -28 mV. Todas las grabaciones tenían una resistencia de sellado > 20 GQ y una resistencia en serie <15 MΩ. La generación de pulsos, la adquisición de datos y el análisis se realizaron utilizando un PC equipado con una interfaz A/D Digidata 1320 junto con Clampex 8 (Axon Instruments Inc.). El baño contenía < 250 μl de solución salina y se perfundía continuamente a una velocidad de 2 ml/min mediante un sistema de perfusión por gravedad.

7. Identificación de Compuestos Correctores

[0264] Para determinar la actividad de los compuestos correctores para aumentar la densidad de AF508-RTFQ funcional en la membrana plasmática, utilizamos las técnicas de registro de parche perforado descritas anteriormente para medir la densidad de corriente después de un tratamiento de 24 horas con los compuestos correctores. Para activar completamente la AF508-RTFQ, se añadieron a las células 10 μM de forskolina y 20 μM de genisteína. En nuestras condiciones de registro, la densidad de corriente tras 24 h de incubación a 27 °C fue superior a la observada tras 24 h de incubación a 37 °C. Estos resultados son coherentes con los efectos conocidos de la incubación a baja temperatura sobre la densidad de AF508-RTFQ en la membrana plasmática. Para determinar los efectos de los compuestos de corrección sobre la densidad de corriente CFTR, se incubaron las células con 10 μM del compuesto de prueba durante 24 horas a 37°C y se comparó la densidad de corriente con los Controles a 27°C y 37°C (% de actividad). Antes del registro, las células se lavaron 3 veces con medio de registro extracelular para eliminar cualquier resto de compuesto de ensayo. La preincubación con 10 μM de compuestos correctores aumentó significativamente la corriente dependiente de AMPc y genisteína en comparación con los Controles a 37°C.

8. Identificación de Compuestos Potenciadores

[0265] La capacidad de los potenciadores AF508-RTFQ para aumentar la corriente macroscópica AF508-RTFQ Cf (Iaf508) en células NIH3T3 que expresan de manera estable AF508-RTFQ también se investigó utilizando técnicas de registro de parche perforado. Los potenciadores identificados a partir de los ensayos ópticos evocaron un aumento dependiente de la dosis en I^af508 con una potencia y eficacia similares observadas en los ensayos ópticos. En todas las células examinadas, el potencial de inversión antes y durante la aplicación del potenciador fue de alrededor de -30 mV, que es el Eci calculado (-28 mV).

9. Soluciones

[0266]

Solución intracelular (en mM): Cs-aspartatc (90), de CsCI (50), MgCla (1), HEPES (10), y 240 mg/ml amfoleridna- B (pH ajustado a 7,35 con CsQH).

Solución extracelular (en mM); N-metilo-D-glucam na (NMDG)-CI (150), MgClj (2), CaCI? (2), HEPES (10) (pH ajustado a 7,35 con HGI).

10. Cultura Celular

[0267] Los fibroblastos de ratón NIH3T3 que expresan de forma estable AF508-RTFQ se utilizan para grabaciones de células enteras. Las células se mantienen a 37 °C con un 5 % de CO₂ y un 90 % de humedad en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 2 mM de glutamina, 10 % de suero bovino fetal, 1 X de NEAA, P-ME, 1 X de pen/strep y 25 mM de HEPES en frascos de cultivo de 175 cm2. Para los registros de células enteras, se sembraron 2.500 - 5.000 células en cubreobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina y se cultivaron durante 24 - 48 h a 27 °C antes de su uso para probar la actividad de los potenciadores; y se incubaron con o sin el compuesto corrector a 37 °C para medir la actividad de los correctores.

11. Grabaciones monocanal

[0268] Las actividades de canal único del AF508-RTFQ corregido por temperatura expresado establemente en células NIH3T3 y las actividades de los compuestos potenciadores se observaron utilizando un parche de membrana interiorexterior extirpado. Brevemente, los registros de pinzamiento de voltaje de la actividad monocanal se realizaron a temperatura ambiente con un amplificador de pinzamiento Axopatch 200B (Axon Instruments Inc.). Todas las grabaciones se adquirieron a una frecuencia de muestreo de 10 kHz y se filtraron a 400 Hz. Las pipetas de parche se fabricaron con vidrio Corning Kovar Sealing #7052 (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL) y tenían una resistencia de 5 - 8 MΩ cuando se llenaron con la solución extracelular. El AF508-RTFQ se activó tras la escisión, añadiendo 1 mM de Mg-ATP, y 75 nM de la proteína cinasa dependiente de AMPc, subunidad catalítica (PKA; Promega Corp. Madison, WI). Una vez estabilizada la actividad del canal, se perfundió el parche utilizando un sistema de microperfusión por gravedad. El flujo de entrada se colocó adyacente al parche, lo que produjo un intercambio completo de solución en 1-2 segundos. Para mantener la actividad de la AF508-RTFQ durante la perfusión rápida, se añadió a la solución del baño el inhibidor inespecífico de la fosfatasa F-(10 mM NaF). En estas condiciones de grabación, la actividad del canal se mantuvo constante durante toda la grabación del parche (hasta 60 minutos). Las corrientes producidas por cargas positivas que se desplazan de las soluciones intracelulares a las extracelulares (aniones que se desplazan en sentido contrario) se muestran como corrientes positivas. El potencial de pipeta (Vp) se mantuvo a 80 mV.

[0269] La actividad de los canales se analizó a partir de parches de membrana que contenían ≤ 2 canales activos. El número máximo de aperturas simultáneas determinaba el número de canales activos durante el transcurso de un experimento. Para determinar la amplitud de la corriente monocanal, los datos registrados durante 120 segundos de actividad AF508-RTFQ se filtraron "fuera de línea" a 100 Hz y luego se utilizaron para construir histogramas de amplitud de todos los puntos que se ajustaron con funciones multigaussianas utilizando el software Bio-Patch Analysis (Bio-Logic Comp. Francia). La corriente microscópica total y la probabilidad de apertura (P0) se determinaron a partir de 120 segundos de actividad del canal. La P0 se determinó utilizando el software Bio-Patch o a partir de la relación P0 = I/i(N), donde I = corriente media, i = amplitud de corriente de un solo canal y N = número de canales activos en el parche.

12. Soluciones

[0270]

Solución extrace lular (en mM): NMDG (150), ácido aspártlco (150), CaCI¿ (5), MgCl₂ (2), y HEPES (10) (pH ajustado a 7,35 con base Tris).

Solución intracelular (en mM): NMDG-CI (150), MgCIs (£}, EGTA (5), TES (10), y base Tris (14) (pH ajustado a 7,35 con HCl).

13. Cultura Celular

[0271] Los fibroblastos de ratón NIH3T3 que expresan de forma estable AF508-RTFQ se utilizan para registros de patch-clamp de membrana extirpada. Las células se mantienen a 37 °C con un 5 % de CO₂ y un 90 % de humedad en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 2 mM de glutamina, 10 % de suero bovino fetal, 1 X de NEAA, p-ME, 1 X de pen/strep y 25 mM de HEPES en frascos de cultivo de 175 cm2. Para el registro de un solo canal, se sembraron de 2.500 a 5.000 células en cubreobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina y se cultivaron durante 24-48 horas a 27 °C antes de su uso.

[0340] Utilizando los procedimientos descritos anteriormente, se ha medido la actividad, es decir, EC50, del Compuesto 1 y se muestra en la Tabla 13.

Tabla 13.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula:

que comprende las etapas de hacer reaccionar el compuesto de fórmula:

con un compuesto de fórmula:

en presencia de Pd(OAc)₂ para formar un compuesto de fórmula:

y haciendo reaccionar el compuesto de fórmula:

en presencia de (MeCN)₂PdCl2 para formar un compuesto de fórmula:

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en que la preparación del compuesto de fórmula:

comprende las etapas de hacer reaccionar un compuesto de fórmula:

con perclorato de cinc dihidratado y un compuesto de fórmula:

seguido de una reducción con hidrógeno y Pt(S)/C, y formando a continuación el compuesto de fórmula:

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en que el compuesto

se prepara haciendo reaccionar un compuesto de fórmula:

con N-bromosuccinimida en EtOAc para formar un compuesto de Fórmula:

4. Un compuesto seleccionado de:

o una sal del mismo.

5. El compuesto de la reivindicación 4, en que el compuesto es:

o una sal del mismo.