ES2940632T3 - Inmunomoduladores - Google Patents

Abstract

La presente divulgación proporciona nuevos péptidos macrocíclicos que inhiben la interacción proteína/proteína PD-1/PD-L1 y PD-L1/CD80 y, por lo tanto, son útiles para la mejora de diversas enfermedades, incluido el cáncer y las enfermedades infecciosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunomoduladores

Campo de la invención

La presente divulgación proporciona nuevos péptidos macrocíclicos que inhiben la interacción proteína/proteína PD-1/PD-L1 y CD80/PD-L1, y por tanto son útiles para la mejora de diversas enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades infecciosas.

Antecedentes de la invención

La proteína Muerte programada 1 (PD-1) es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28, que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en linfocitos B activados, linfocitos T, y células mieloides (Agata et al., supra; Okazaki et al., Curr. Opin. Immunol., 14:779-782 (2002); Bennett et al., J. Immunol., 170:711-718 (2003)).

La proteína PD-1 es una proteína transmembrana de tipo I de 55 kDa que es parte de la superfamilia de genes Ig (Agata et al., Int. Immunol., 8:765-772 (1996)). PD-1 contiene un motivo inhibidor de tirosina del inmunorreceptor proximal de membrana (ITIM) y un motivo de interruptor basado en tirosina distal de membrana (ITSM) (Thomas, M.L., J. Exp. Med., 181:1953-1956 (1995); Vivier, E. et al., Immunol. Today, 18:286-291 (1997)). Aunque estructuralmente similar a CTLA-4, PD-1 carece del motivo MYPPY que es crítico para unión a CD80 CD86 (B7-2). Se han identificado dos ligandos para PD-1, PD-L1 (B7-H1) y PD-L2 (b7-DC). La activación de linfocitos T que expresan PD-1 se ha mostrado que se regula negativamente tras interacción con células que expresan PD-L1 o PD-L2 (Freeman et al., J. Exp. Med., 192:1027-1034 (2000); Latchman et al., Nat. Immunol., 2:261-268 (2001); Carter et al., Eur. J. Immunol., 32:634-643 (2002)). Tanto PD-L1 como PD-L2 son miembros de la familia de proteínas B7 que se unen a PD-1, pero no se unen a otros miembros de la familia de CD28. El ligando PD-L1 es abundante en diversos cánceres humanos (Dong et al., Nat. Med., 8:787-789 (2002)). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución de linfocitos infiltrantes de tumores, una disminución en la proliferación mediada por receptores de linfocitos T, y evasión inmunitaria por células cancerosas (Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004)). La supresión inmunitaria puede invertirse inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando la interacción de PD-1 con PD-L2 también se bloquea (Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003)).

También se ha mostrado que PD-L1 que interacciona con CD80 (Butte MJ et al., Immunity;27:111-122 (2007)). La interacción PD-L1/CD80 en expresión de células inmunes se ha mostrado que es inhibidora. Se ha demostrado que el bloqueo de esta interacción elimina esta interacción inhibidora (Paterson AM, et al., J Immunol., 187:1097-1105 (2011); Yang J, et al. J Immunol. 1 de agosto;187(3): 1113-9 (2011)).

Cuando los linfocitos T que expresan PD-1, entran en contacto con células que expresan sus ligandos, las actividades funcionales en respuesta a estímulos antigénicos, incluyendo la proliferación, secreción de citoquinas, y citotoxicidad, se reducen. Las interacciones PD-1/PD-L1 o PD-L2 regulan negativamente las respuestas inmunitarias durante la resolución de una infección o tumor, o durante el desarrollo de autotolerancia (Keir, M.E. et al., Annu. Rev. Immunol., 26:Epub (2008)). La estimulación antigénica crónica, tal como la que se produce durante la enfermedad tumoral o infecciones crónicas, da como resultado linfocitos T que expresan niveles elevados de PD-1 y son disfuncionales con respecto a la actividad hacia el antígeno crónico (revisado en Kim et al., Curr. Opin. Imm. (2010)). Esto se denomina "agotamiento de linfocitos T". Los linfocitos B también muestran la supresión y el "agotamiento" de PD-1/PD-ligando.

Se ha demostrado que el bloqueo de la ligadura PD-1/PD-L1 con anticuerpos contra PD-L1 restaura y aumenta la activación de las linfocitos T en muchos sistemas. Los pacientes con cáncer avanzado se benefician de la terapia con un anticuerpo monoclonal contra PD-L1 (Brahmer et al., New Engl. J. Med. (2012)). Modelos animales preclínicos de tumores e infecciones crónicas han demostrado que el bloqueo de la ruta PD-1/PD-L1 mediante anticuerpos monoclonales puede mejorar la respuesta inmunitaria y dar como resultado el rechazo del tumor o el control de la infección. La inmunoterapia antitumoral a través del bloqueo PD-1/PD-L1 puede aumentar la respuesta inmunitaria terapéutica a varios tumores histológicamente distintos (Dong, H. et al., "B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity", J. Mol. Med., 81(5):281-287 (2003); Dong, H. et al., "Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion", Nat. Med., 8(8):793-800 (2002)).

La interferencia con la interacción PD-1/PD-L1 provoca una mayor actividad de linfocitos T en sistemas con infección crónica. El bloqueo de PD-L1 causó un aclaramiento viral mejorado y una inmunidad restaurada en ratones con infección por virus de coriomeningitis linfocítica crónica (Barber, D.L. et al., "Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection", Nature, 439(7077):682-687 (2006)). Los ratones humanizados infectados con VIH-1 muestran una protección mejorada contra la viremia y el agotamiento vírico de linfocitos T CD4+ (Palmer et al., J. Immunol. (2013)). El bloqueo de PD-1/PD-L1 a través de anticuerpos monoclonales contra PD-L1 puede restaurar la funcionalidad específica de antígeno in vitro en linfocitos T de pacientes con VIH (Day, Nature (2006); Petrovas, J. Exp. Med. (2006); Trautman, Nature Med. (2006); D'Souza, J. Immunol. (2007); Zhang, Blood (2007); Kaufmann, Nature Imm. (2007); Kasu, J. Immunol. (2010); Porichis, Blood (2011)), Pacientes con VHC (Golden-Mason, J. Virol. (2007); Jeung, J. Leuk. Biol. (2007); Urbani, J. Hepatol. (2008); Nakamoto, PLoSPath. (2009); Nakamoto, Gastroenterology (2008)) y pacientes con VHB (Boni, J. Virol. (2007); Fisicaro, Gastro. (2010); Fisicaro et al., Gastroenterology (2012); Boni et al., Gastro. (2012); Penna et al., J. Hep. (2012); Raziorrough, Hepatology (2009); ^{Liang, World J. Gastro. (2010); Zhang, Gastro. (}2008^)).

También se ha demostrado que el bloqueo de la interacción PD-L1/CD80 estimula la inmunidad (Yang J., et al., J Immunol. 1 de agosto;187(3):1113-9 (2011)). Se ha demostrado que la estimulación inmune resultante del bloqueo de la interacción PD-L1/CD80 mejora mediante un bloqueo combinado de otras interacciones PD-1/PD-L1 o PD-1/PD-L2.

Se supone que las alteraciones en los fenotipos de las células inmunitarias son un factor importante en el choque séptico (Hotchkiss, et al., Nat Rev Immunol (2013)). Estas incluyen niveles incrementados de p D-1 y PD-L1 (Guignant, et al, Crit. Care (2011)), Las células de pacientes con choque séptico con niveles incrementados de PD-1 y PD-L1 exhiben un nivel incrementado de apoptosis de linfocitos T. Anticuerpos dirigidos a PD-L1, pueden reducir el nivel de apoptosis de células inmunes (Zhang et al, Crit. Care (2011)). Además, los ratones que carecen de expresión de PD-1 son más resistentes a los síntomas de choque séptico que los ratones de tipo natural. Yang J., et al. J Immunol. 1 de agosto;187(3):1113-9 (2011)). Los estudios han revelado que el bloqueo de interacciones de los anticuerpos contra PD-L1 puede suprimir las respuestas inmunitarias inapropiadas y mejorar los signos de la enfermedad.

Además de mejorar las respuestas inmunológicas a los antígenos crónicos, también se ha demostrado que el bloqueo de la ruta PD-1/PD-L1 mejora las respuestas a la vacunación, incluida la vacunación terapéutica en el contexto de infección crónica (Ha, S.J. et al., "Enhancing therapeutic vaccination by blocking PD-1-mediated inhibitory signals during chronic infection", J. Exp. Med., 205(3):543-555 (2008); Finnefrock, A.C. et al., "PD-1 blockade in rhesus macaques: impact on chronic infection and prophylactic vaccination", J. Immunol., 182(2):980-987 (2009); Song, M.-Y. et al., "Enhancement of vaccine-induced primary and memory CD8+ t-cell responses by soluble PD-1", J. Immunother., 34(3):297-306 (2011)).

El documento WO 2014/151634 desvela inhibidores macrocíclicos de las interacciones proteína/proteína PD-1/PD-L1 y CD80(B7-1)/PD-L1.

Presentación de la invención

Las moléculas descritas en este documento demuestran la capacidad de bloquear la interacción de PD-L1 con PD-1, tanto en sistemas bioquímicos como en sistemas experimentales basados en células. Estos resultados son consistentes con un potencial para la administración terapéutica para mejorar la inmunidad en cáncer o infección crónica, incluyendo la vacuna terapéutica.

Los péptidos macrocíclicos descritos en este documento son capaces de inhibir la interacción de PD-L1 con PD-1 y con CD80. Estos compuestos han demostrado una unión altamente eficaz a PD-L1, bloqueo de la interacción de PD-L1 con PD-1 o CD80, y son capaces de promover una mayor actividad funcional de linfocitos T, haciéndolos así candidatos para formulaciones parenterales, orales, pulmonares, nasales, bucales y de liberación sostenida.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) que se selecciona de:

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o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

El alcance de la invención se define por medio de las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a compuestos y composiciones farmacéuticas de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del organismo humano o animal.

En otra realización, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso en inhibición de crecimiento, proliferación, o metástasis de células cancerosas en un sujeto que lo necesita. Debe entenderse que dicha inhibición puede ser directa o indirecta. En otra realización, el cáncer se selecciona entre melanoma, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón no microcítico escamoso (CPNM), CPNM no escamoso, cáncer colorrectal, cáncer de próstata resistente a la castración, cáncer de ovario, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de páncreas, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinomas del esófago, del tracto gastrointestinal y de mama, y neoplasia maligna hematológica.

En otra realización la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula (I) o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto que lo necesita. En otra realización, la enfermedad infecciosa está causada por un virus. En otra realización el virus se selecciona entre HIV, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, herpes virus, e influenza.

En otra realización la presente divulgación proporciona uno o más péptidos macrocíclicos descritos en el presente documento para su uso en el tratamiento de choque séptico en un sujeto que lo necesita.

Según la presente divulgación, hemos descubierto péptidos que se unen específicamente a PD-L1 y son capaces de inhibir la interacción de PD-L1 con PD-1 y CD80. Estos péptidos macrocíclicos exhiben eficacia inmunomoduladora in vitro, lo que los convierte en candidatos terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades, incluidas el cáncer y las enfermedades infecciosas.

Los términos "unión específica" o "unión específica" se refieren a la interacción entre una proteína y una molécula de unión, tales como un compuesto o ligando. La interacción depende de la presencia de una estructura particular (es decir, un sitio de unión a enzimas, un determinante antigénico o epítopo) de la proteína que se reconoce por la molécula de unión. Por ejemplo, si un compuesto tiene una unión específica para el sitio de unión a proteínas "A", la presencia del compuesto en una reacción que contiene una proteína que incluye el sitio de unión A, y un péptido marcado que se une específicamente al sitio de unión a la proteína A reducirá la cantidad de péptido marcado unido a la proteína. Por el contrario, la unión no específica de un compuesto a la proteína no da como resultado un desplazamiento dependiente de la concentración del péptido marcado de la proteína.

Las definiciones proporcionadas en este documento se aplican, sin limitación, a los términos usados en la presente memoria descriptiva, a no ser que se limite de otra forma en los casos específicos.

El término "tratar" se refiere a: (i) prevenir que una enfermedad, trastorno, o afección que ocurre en un paciente que puede estar predispuesto a la enfermedad, trastorno y/o afección, pero al que aún no se le ha diagnosticado que la tenga; (ii) inhibir la enfermedad, trastorno o afección, es decir, detener su desarrollo; y (iii) aliviar la enfermedad, trastorno o afección, es decir, provocar la regresión de la enfermedad, trastorno, y/o afección y/o síntomas asociados con la enfermedad, trastorno y/o afección.

La unión de péptidos macrocíclicos a PD-L1 puede medirse, por ejemplo, por métodos tales como fluorescencia homogénea de resolución temporal (HTRF), Resonancia de plasmón superficial (SPR), calorimetría de titulación isotérmica (ITC), espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), y similares. Además, la unión de los péptidos macrocíclicos a PD-L1 expresada en la superficie de las células puede medirse como se describe en este documento en ensayos de unión celular.

La administración de un agente terapéutico descrito en este documento incluye, sin limitación, administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de agente terapéutico. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en este documento se refiere, sin limitación, a una cantidad de un agente terapéutico para tratar o prevenir una afección tratable mediante la administración de una composición de los inhibidores de unión a PD-1/PD-L1 descritos en este documento. Esta cantidad es la cantidad suficiente para presentar un efecto terapéutico o preventivo o mejorador. El efecto puede incluir, por ejemplo, y sin limitación, el tratamiento o la prevención de las dolencias relacionadas en el presente documento. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del tamaño y la salud del sujeto, la naturaleza y la extensión de la dolencia que se está tratando, recomendaciones del médico tratante, y la terapéutica o combinación de la terapéutica seleccionada para la administración. Por tanto, no es útil especificar una cantidad efectiva exacta por adelantado.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación para su uso en la inhibición del crecimiento de células tumorales en un sujeto. Tal como se demuestra en el presente documento, los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación son capaces de unirse a PD-L1, interrumpiendo la interacción entre PD-L1 y PD-1, compitiendo con la unión de PD-L1 con anticuerpos monoclonales anti-PD-1 que se sabe que bloquean la interacción con PD-1, mejoran la secreción de IFNy de células T específicas de CMV, y mejoran la secreción de IFNg de células T específicas de VIH. Como resultado, los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación son útiles para modificar una respuesta inmune, tratar enfermedades tales como cáncer o enfermedades infecciosas, estimulando una respuesta autoinmune protectora para estimular respuestas inmunes específicas de antígeno (por ejemplo, mediante la administración conjunta de péptidos bloqueadores de PD-L1 con un antígeno de interés).

Con el fin de que se pueda entender más fácilmente la presente divulgación, se definen previamente determinados términos. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

Los términos "ligando de muerte programada 1", "ligando de muerte celular programada 1", "proteína PD-L1", "PD-L1", "PDL1", "PDCDL1", "hPD-L1", "hPD-LI", "CD274" y "B7-H1" se usan intercambiablemente, e incluyen variantes, isoformas, homólogos de especie de PD-L1 humana, y análogos que tienen al menos un epítopo común con PD-L1. La secuencia completa de PD-L1 puede encontrarse en el n.° de acceso GENBANK® NP_054862.

Los términos "muerte programada 1", "muerte celular programada 1", "proteína PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1" y "hPD-I" se usan de forma indistinta e incluyen variantes, isoformas, homólogos de especie de PD-1 humana, y análogos que tienen al menos un epítopo común con PD-1. La secuencia completa de PD-1 puede encontrarse en el n.° de acceso GENBANK® U64863.

Los términos "antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos", "CTLA-4", "CTLA4", "antígeno CTLA-4" y "CD152" (véase, p. ej., Murata, Am. J. Pathol., 155:453-460 (1999)) se usan intercambiablemente, e incluyen variantes, isotermas, homólogos de especie de CTLA-4 humano, y análogos que tienen al menos un epítopo como CTLA-4 (véase, p. ej., Balzano, Int. J. Cancer Suppl., 7:28-32 (1992)). La secuencia de ácidos nucleicos completa de CTLA-4 puede encontrarse con el n.° de acceso GENBANK® L15006.

La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos, y macromoléculas solubles producida por las células anteriores o el hígado (incluidos péptidos macrocíclicos, citoquinas, y complemento) que da como resultado un daño selectivo sobre, la destrucción de o la eliminación en el cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados por patógenos, células cancerosas o, en los casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Un "evento adverso" (AE) como se usa en este documento es desfavorable y generalmente no intencionado, incluso indeseable, signo (incluido un hallazgo anormal de laboratorio), síntoma, enfermedad asociada con el uso de un tratamiento médico. Por ejemplo, un evento adverso puede estar asociado con la activación del sistema inmunitario o la expansión de las células del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos T) en respuesta a un tratamiento. Un tratamiento médico puede tener uno o más EA asociados y cada AE puede tener el mismo nivel de gravedad o diferente. La referencia a métodos capaces de "alterar los eventos adversos" significa un régimen de tratamiento que disminuye la incidencia y/o severidad de uno o más EA asociados con el uso de un régimen de tratamiento diferente.

Como se usa en este documento, la "enfermedad hiperproliferativa" se refiere a condiciones en las que el crecimiento celular aumenta a niveles normales. Por ejemplo, las enfermedades o trastornos hiperproliferativos incluyen enfermedades malignas (por.ejemplo., cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer biliar) y enfermedades no malignas (por ejemplo, ateroesclerosis, hiperplasia benigna, hipertrofia prostática benigna).

Como se usa en este documento, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" significa dentro de un rango de error aceptable para el valor particular determinado por un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, es decir, de las limitaciones del sistema de medida. Por ejemplo, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente " puede significar dentro de una o más de una desviación estándar según la práctica en la técnica. Como alternativa, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" puede significar un intervalo de hasta el 20 %. Además, particularmente con respecto a los sistemas o procesos biológicos, las expresiones pueden significar hasta un orden de magnitud o hasta 5 veces de un valor. Cuando se proporcionan valores particulares en la solicitud y reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, se debe suponer que el significado de "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" está dentro de un rango de error aceptable para ese valor particular.

Como se describe en este documento, cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación o intervalo de número entero se entiende que incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado y, cuando sea adecuado, fracciones del mismo (tal como una décima y una centésima de un número entero), salvo que se indique otra cosa.

Ensayos competitivos

La presente divulgación también se refiere a péptidos macrocíclicos que son capaces de competir con la unión de un anticuerpo anti-PD-LI de referencia (MDX-1105) en al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, y al menos aproximadamente 100 %. Dichos péptidos macrocíclicos pueden compartir homología estructural con uno o más péptidos macrocíclicos descritos en este documento, incluyendo mutante, sustitución conservadora, sustitución funcional, y formas de deleción, siempre que se unan específicamente a PD-L1. Por ejemplo, si un péptido macrocíclico se une sustancialmente a la misma región de PD-L1 que un anticuerpo anti-PD-L1 de referencia, el péptido macrocíclico debe unirse a un epítopo de PD-L1 que al menos se superpone con el epítopo de PD-L1 al que se une el anticuerpo monoclonal anti-PD-L1. La región superpuesta puede variar desde un residuo de aminoácido hasta varios cientos de residuos de aminoácido. El péptido macrocíclico debe entonces competir con y/o bloquear la unión del anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 a PD-L1 y así disminuir la unión del anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 a PD-L1, probablemente en al menos 50 % en un ensayo de competición.

Los anticuerpos anti-PD-L1 que pueden usarse como anticuerpos de referencia para fines de ensayos competitivos se conocen en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse los siguientes anticuerpos representativos anti-PD-L1: MDX-1105 (BMS); L01X-C (Serono), L1X3 (Serono), MSB-0010718C (Serono), y PD-L1 Probody (CytomX), y los anticuerpos PD-L1 desvelados en el documento del solicitante WO 2007/005874.

Os anticuerpos Anti-PD-1 que pueden usarse como anticuerpos de referencia para fines de ensayos de competición se conocen en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse los siguientes anticuerpos representativos anti-PD-1: nivolumab (BMS); 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3 y 5F4 desvelado cada uno en el documento de patente de Estados Unidos del propietario n.° 8.008.449 (BMS), MK-3475 (Merck, desvelado en el documento de patente de Estados Unidos n.° 8.168.757), y los anticuerpos desvelados en la patente de Estados Unidos n.° 7.488.802.

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de péptidos macrocíclicos de la presente divulgación, formulado junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) péptidos macrocíclicos, inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la divulgación. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la divulgación puede comprender una combinación de péptidos macrocíclicos (inmunoconjugados o biespecíficos) que se unen a diferentes epítopos en el antígeno diana o que tienen actividades complementarias.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia combinada puede incluir un péptido macrocíclico combinado con al menos otro agente antiinflamatorio o inmunosupresor. Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en la terapia de combinación se describen en mayor detalle a continuación en la sección sobre usos de los péptidos macrocíclicos de la divulgación.

Como se usa en este documento, "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, un péptido macrocíclico, inmunoconjugado o molécula biespecífica, se puede recubrir con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y de otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos de la divulgación pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" o "sal terapéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto original y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977)). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácidos incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos, tales como ácidos alifáticos monocarboxílicos y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de bases incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, W-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica de la divulgación también pueden incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como agentes conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse mediante procedimientos de esterilización, véase anteriormente, y mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol de ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma inyectable del fármaco se puede llevar a cabo mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones estériles inyectables o dispersiones. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la materia. Excepto en el caso de que cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la divulgación. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.

Normalmente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por microfiltración. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y el secado en frío (liofilización) que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir una solución del mismo previamente esterilizada por filtración.

La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material vehículo para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del sujeto a tratar, y el modo particular de administración. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material portador para producir una sola forma farmacéutica, en general, será la cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. En general, de entre un cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente 0,01 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, aproximadamente de aproximadamente 0,1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, más convenientemente de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento de ingrediente activo junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas con el tiempo o la dosis puede reducirse proporcionalmente o aumentarse según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de dosificación unitaria usada en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La memoria descriptiva para las formas de unidad de dosificación de la divulgación está dictada por y dependiente directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de tales un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Para la administración del péptido macrocíclico, la dosis varía entre aproximadamente 0,0001 y 100 mg/kg, y más habitualmente entre 0,01 y 5 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o estar en el intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento a modo de ejemplo implica la administración una vez al día, dos veces al día, quincenalmente, tri-semanalmente, semanalmente, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferentes para un péptido macrocíclico de la divulgación incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, con el macrociclo que se administra usando uno de los siguientes horarios de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, entonces cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más péptidos macrocíclicos con diferentes especificidades de unión, en ese caso, la dosis de cada compuesto administrado cae dentro de los rangos indicados. Los compuestos generalmente se administran en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica midiendo los niveles sanguíneos de péptido macrocíclico para el antígeno diana en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para conseguir una concentración plasmática de aproximadamente 1-1000.mu.g/ml y en algunos métodos aproximadamente 25-300.mu.g/ml.

Como alternativa, el péptido macrocíclico puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine, y hasta que el paciente muestre una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de eso, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente en particular, composición y modo de administración particular, sin que sean tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de varios factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente divulgación empleadas, el éster, la sal o la amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados junto con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, el peso, la afección, estado de salud general e historial médico previo del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Una "dosificación terapéuticamente eficaz" de un péptido macrocíclico de la divulgación puede resultar en una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad, o una prevención del empeoramiento o discapacidad debido a la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores, una "dosis terapéuticamente eficaz" inhibe el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente 40 %, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente el 60 %, y aún más preferentemente en al menos aproximadamente el 80 % en relación con sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral y/o VIH se puede evaluar en un sistema modelo animal de eficacia predictiva en tumores humanos o eficacia viral. Como alternativa, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para inhibir, dicha inhibición in vitro mediante ensayos conocidos por el profesional experto. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, disminuir la carga viral, o de lo contrario mejorar los síntomas en un sujeto. Una habilidad normal en la técnica sería capaz de determinar tales cantidades en función de factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto, y la composición particular de la ruta de administración seleccionada.

Una composición de la presente divulgación se puede administrar a través de una o más rutas de administración utilizando uno o más de diversos métodos conocidos en la técnica. Como apreciarán lo expertos en la materia, la vía y/o el modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para los péptidos macrocíclicos de la divulgación incluyen la intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La frase "administración parenteral" como se usa en el presente documento significa modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, habitualmente mediante inyección e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal e infusión.

Como alternativa, un péptido macrocíclico de la descripción se puede administrar a través de una ruta no parenteral, tal como una ruta de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasalmente, por vía oral, vaginal, por vía rectal, sublingualmente o tópicamente.

Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Biodegradable, pueden usarse polímeros biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o se conocen generalmente por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Robinson, J.R., ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1978).

Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferente, una composición terapéutica de la divulgación se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tales como los dispositivos desvelados en patentes de Estados Unidos n.° 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824, o 4.596.556. Ejemplos de implantes bien conocidos y módulos útiles en la presente divulgación incluyen: patente de Estados Unidos n.° 4.487.603, que desvela una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicamento a una tasa controlada; patente de Estados Unidos n.° 4.486.194, que desvela un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; patente de Estados Unidos n.° 4.447.233, que desvela una bomba de infusión de medicamento para suministrar medicamento a una tasa de infusión precisa; patente de Estados Unidos n.° 4.447.224, que desvela un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármaco; patente de Estados Unidos n.° 4.439.196, que desvela un sistema de administración osmótica de fármaco que tiene compartimentos multicámara; y patente de Estados Unidos n.° 4.475.196, que desvela un sistema de administración osmótica de fármaco. Muchos otros de estos implantes, sistemas de administración y módulos son conocidos por los expertos en la materia.

En ciertas realizaciones, los péptidos macrocíclicos de la divulgación pueden formularse para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHM) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos de la divulgación crucen la BBB (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 4.522.811, 5.374.548, y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más grupos que se transportan de manera selectiva en células u órganos específicos, potenciando de este modo el suministro dirigido de fármaco (véase, p. ej., Ranade, V.V., J. Clin. Pharmacol., 29:685 (1989)). Como residuos de direccionamiento ilustrativos se incluyen folato o biotina (véase, p. ej., la patente de Estados Unidos n.° 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 153:1038 (1988)); péptidos macrocíclicos (Bloeman, P.G. et al., F^e BS Lett., 357:140 (1995); Owais, M. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 39:180 (1995)); receptor de la proteína A del surfactante (Briscoe et al., Am. J. Physiol., 1233:134 (1995)); p120 (Schreier et al., J. Biol. Chem., 269:9090 (1994)); véase también Keinanen, K. et al., FEBS Lett., 346:123 (1994); Killion, J.J. et al., Immunomethods 4:273 (1994).

Usos y métodos de la divulgación

Como se usa en este documento, el término "sujeto" pretende incluir seres humanos y animales no humanos. Animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, marmota, anfibios y reptiles, aunque se prefieren los mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas y caballos. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que necesitan potenciación de una respuesta inmunitaria. Los métodos son particularmente adecuados para el tratamiento de pacientes humanos que tienen un trastorno que puede tratarse aumentando la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T. En una realización particular, los métodos son particularmente adecuados para el tratamiento de células cancerosas in vivo.

Cáncer

El bloqueo de PD-1 por péptidos macrocíclicos puede mejorar la respuesta inmune a las células cancerosas en el paciente. El ligando para PD-1, PD-L1, no se expresa en células humanas normales, pero es abundante en diversos cánceres humanos (Dong et al., Nat. Med., 8:787-789 (2002)). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución de linfocitos infiltrantes de tumores, una disminución en la proliferación mediada por receptores de linfocitos T, y evasión inmunitaria por células cancerosas (Dong et al., J. Mol. Med., 81:281-287 (2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54:307-314 (2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10:5094-5100 (2004)). La supresión inmunitaria puede invertirse inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1 y el efecto es aditivo cuando la interacción de PD-1 con PD-L2 también se bloquea (Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 99:12293-12297 (2002); Brown et al., J. Immunol., 170:1257-1266 (2003)). Si bien los estudios anteriores han demostrado que la proliferación de linfocitos T puede restaurarse inhibiendo la interacción de PD-1 a PD-L1, no ha habido informes de un efecto directo sobre el crecimiento tumoral del cáncer in vivo al bloquear la interacción PD-1/PD-L1. En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un tratamiento de un sujeto in vivo utilizando un péptido macrocíclico de manera que se inhibe el crecimiento de tumores cancerosos. Un péptido macrocíclico puede usarse solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Como alternativa, se puede usar un péptido macrocíclico junto con otros agentes inmunogénicos, tratamientos estándar contra el cáncer, u otros péptidos macrocíclicos, como se describe a continuación.

Por tanto, en una realización, la invención proporciona un péptido macrocíclico para su uso en la inhibición del crecimiento de células tumorales en un sujeto.

Los cánceres preferentes cuyo crecimiento puede inhibirse mediante los péptidos macrocíclicos de la descripción incluyen cánceres sensibles a la inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de cánceres preferidos para tratamiento incluyen melanoma (por ejemplo, melanoma metastásico maligno), carcinoma de células renales (por ejemplo, carcinoma de células claras), cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata resistente a hormonas y cáncer de próstata resistente a la castración), cáncer de mama, cáncer colorrectal y cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón escamoso y no escamoso no microcítico). Además, la divulgación incluye tumores malignos recurrentes o refractarios cuyo crecimiento puede inhibirse usando los péptidos macrocíclicos de la divulgación.

Los ejemplos de otros cánceres que pueden tratarse usando los métodos de la divulgación incluyen cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago/gástrico, cáncer de testículo, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemias crónicas o agudas, incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de linfocitos T, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo aquellos inducidos por amianto, y combinaciones de dichos cánceres. La presente divulgación también es útil para el tratamiento de cánceres metastásicos, especialmente cánceres metastásicos que expresan PD-L1 (Iwai et al., Int. Immunol., 17:133-144 (2005)).

Opcionalmente, péptidos macrocíclicos para PD-L1 pueden combinarse con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células, y células transfectadas con genes que codifican citocinas estimulantes inmunitarias (He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004)). Los ejemplos no limitantes de vacunas tumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citoquina ^g M-CSF (discutido adicionalmente posteriormente).

En seres humanos, se ha demostrado que algunos tumores son inmunogénicos tales como melanomas. Se anticipa que al elevar el umbral de activación de linfocitos T por bloqueo de PD-L1, podemos esperar activar respuestas tumorales en el huésped.

El bloqueo de PD-L1 es probable que sea más eficaz cuando se combina con un protocolo de vacunación. Se han ideado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300­ 302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000); véase también Restifo, N. et al., Cancer Vaccines, Capítulo 61, pág. 3023-3043, en DeVita, V. et al., eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, quinta edición (1997)). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna usando células tumorales autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que estas vacunas celulares son más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que GM-CSF es un potente activador de la presentación de antígenos para la vacunación de tumores (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3539-3543 (1993)).

El estudio de la expresión génica y los patrones de expresión génica a gran escala en varios tumores ha conducido a la definición de los llamados antígenos específicos de tumor (Rosenberg, S.A., Immunity, 10:281-287 (1999)). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumor son antígenos diferenciados expresados en los tumores y en la célula de donde surgió el tumor, por ejemplo, antígenos de melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. Más importante aún, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son las dianas de linfocitos T específicos de tumor encontrados en el huésped. El bloqueo de PD-L1 se puede usar junto con una colección de proteínas recombinantes y péptidos expresados en un tumor para generar una respuesta inmune a estas proteínas. Estas proteínas son normalmente vistas por el sistema inmunitario como antígenos propios y por lo tanto, son tolerantes a ellos. El antígeno tumoral también puede incluir la proteína telomerasa, que se requiere para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más de 85 % de los cánceres humanos y solo en un número limitado de tejidos somáticos (Kim et al., Science, 266:2011-2013 (1994)). (Estos tejidos somáticos pueden protegerse del ataque inmunitario por diversos medios). El antígeno tumoral también puede ser "neoantígenos" expresados en células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia de proteínas o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Filadelfia), o idiotipo de tumores de linfocitos B.

Otras vacunas de tumores pueden incluir las proteínas de virus implicados en cánceres humanos tales como virus del papiloma humano (HPV), Virus de la hepatitis (VHB y VHC) y Virus del sarcoma de herpes de Kaposi (KHSV). Otra forma de antígeno específico de tumor que se puede usar junto con el bloqueo de PD-L1 se purifica proteínas de choque térmico (HSP) aisladas del tejido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas HSP son altamente eficaces en el suministro a las células presentadoras de antígeno para inducir inmunidad tumoral (Suot et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura, Y. et al., Science, 278:117-120 (1997)).

Las células dendríticas (DC) son potentes células de presentación de antígeno que pueden usarse para preparar respuestas específicas de antígeno. Las DC pueden producirse ex vivo y cargarse con diversos antígenos de proteínas y péptidos, así como extractos de células tumorales (Nestle, F. et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998)). Las DC también pueden ser transducidas por medios genéticos para expresar también estos antígenos tumorales. Las DC también se han fusionado directamente a las células tumorales con fines de inmunización (Kugler, A. et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000)). Como método de vacunación, La inmunización con DC puede combinarse eficazmente con el bloqueo de PD-L1 para activar respuestas antitumorales más potentes.

El bloqueo de PD-L1 también se puede combinar con tratamientos estándar contra el cáncer. El bloqueo de PD-L1 puede combinarse eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, puede ser posible reducir la dosis de reactivo quimioterapéutico administrado (Mokyr, M. et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)). Un ejemplo de tal combinación es un péptido macrocíclico junto con la descarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo de tal combinación es un péptido macrocíclico junto con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. El fundamento científico detrás del uso combinado de bloqueo de PD-L1 y quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería dar lugar a niveles aumentados de antígeno tumoral en la ruta de presentación del antígeno. Otras terapias combinadas que pueden dar como resultado una sinergia con el bloqueo de PD-L1 a través de la muerte celular son la radiación, cirugía y privación de hormonas. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el huésped. Los inhibidores de la angiogénesis también pueden combinarse con el bloqueo de PD-L1. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de células tumorales que pueden alimentar el antígeno tumoral en las rutas de presentación del antígeno huésped.

Los péptidos macrocíclicos que bloquean PD-L1 también pueden usarse junto con péptidos macrocíclicos biespecíficos que dirigen células efectoras que expresan receptores de Fc alfa o Fc gamma a células tumorales (véase, p. ej., las patentes de Estados Unidos n.° 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar péptidos macrocíclicos biespecíficos para dirigir dos antígenos separados. Por ejemplo, se han usado péptidos macrocíclicos biespecíficos del receptor anti-Fc/antígeno antitumoral (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir macrófagos a sitios de tumor. Este direccionamiento puede activar más eficazmente las respuestas tumorales específicas. El brazo de linfocitos T de estas respuestas se vería aumentado por el uso del bloqueo de PD-L1. Como alternativa, el antígeno puede administrarse directamente a las DC mediante el uso de péptidos macrocíclicos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y un marcador de superficie celular específico de células dendríticas.

Los tumores evaden la vigilancia inmune del huésped por una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la inactivación de proteínas que son expresadas por los tumores y que son inmunosupresoras. Estos incluyen entre otros TGF-beta (Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050 (1986)), IL-10 (Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200 (1992)), y ligando Fas (Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996)). Los péptidos macrocíclicos para cada una de estas entidades pueden usarse junto con anti-PD-L1 para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer las respuestas inmunes tumorales por parte del huésped.

Se pueden usar otros péptidos macrocíclicos que pueden activar la respuesta inmunitaria del hospedador junto con anti-PD-L1. Estos incluyen moléculas en la superficie de las células dendríticas que activan la función DC y la presentación del antígeno. Los péptidos macrocíclicos anti-CD40 pueden sustituir eficazmente la actividad auxiliar de linfocitos T (Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998)) y pueden usarse junto con anticuerpos de PD-1 (Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000)). Péptidos macrocíclicos activantes para moléculas coestimuladoras de linfocitos T tales como CTLA-4 (por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 5.811.097), OX-40 (Weinberg, A. et al., Immunol., 164:2160-2169 (2000)), 4-1BB (Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997), e ICOS (Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999)) pueden proporcionar también niveles aumentados de activación de linfocitos T.

El trasplante de médula ósea se utiliza actualmente para tratar diversos tumores de origen hematopoyético. Mientras que la enfermedad del injerto contra huésped es una consecuencia de este tratamiento, el beneficio terapéutico puede obtenerse a partir de respuestas de injerto frente a tumor. El bloqueo de PD-L1 se puede usar para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos de tumor injertados de donante.

También hay varios protocolos de tratamiento experimental que involucran activación y expansión ex vivo de linfocitos T específicos de antígeno y transferencia adoptiva de estas células en receptores para linfocitos T específicos de antígeno contra tumor (Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999)). Estos métodos también pueden usarse para activar las respuestas de los linfocitos T a agentes infecciosos tales como CMV. Se puede esperar que la activación ex vivo en presencia de péptidos macrocíclicos aumente la frecuencia y la actividad de los linfocitos T transferidos adoptivamente.

Enfermedades infecciosas

Otros métodos de la divulgación se usan para tratar pacientes que han estado expuestos a toxinas o patógenos particulares. Por tanto, otro aspecto de la invención proporciona un péptido macrocíclico de la presente divulgación para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto de tal manera que se trate la enfermedad infecciosa del sujeto.

Similar a su aplicación a los tumores como se ha analizado anteriormente, El bloqueo de PD-L1 se puede usar solo, o como adyuvante, en combinación con vacunas, para estimular la respuesta inmune a patógenos, toxinas y autoantígenos. Los ejemplos de agentes patógenos para los que este enfoque terapéutico puede ser particularmente útil, incluyen patógenos para los que actualmente no existe una vacuna eficaz, o patógenos para los cuales las vacunas convencionales son menos que completamente eficaces. Estos incluyen, pero sin limitación, VIH, Hepatitis (A, B, y C), gripe, Herpes, Giardia, Paludismo (Butler, N.S. et al., Nature Immunology 13, 188-195 (2012); Hafalla, J.C.R., et al. PLOS Pathogens; 2 de febrero, 2012)), Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas Aeruginosa. El bloqueo de PD-L1 es particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes tales como VIH que presentan antígenos alterados durante el curso de las infecciones. Estos nuevos epítopos se reconocen como extraños en el momento de la administración de PD-L1 anti-humano, provocando así una fuerte respuesta de linfocitos T que no se ve atenuada por señales negativas a través de PD-L1.

Algunos ejemplos de virus patógenos que causan infecciones tratables mediante métodos de la divulgación incluyen VIH, hepatitis (A, B o C), virus del herpes (p. ej., VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, y CMV, virus Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, cornovirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus de molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral.

Algunos ejemplos de bacterias patógenas que causan infecciones tratables mediante métodos de la divulgación incluyen clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos y conococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis, y bacterias de enfermedad de Lyme.

Algunos ejemplos de hongos patógenos que causan infecciones tratables mediante los métodos de la divulgación incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.

Algunos ejemplos de parásitos patógenos que causan infecciones tratables mediante los métodos de la divulgación incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi y Nippostrongylus brasiliensis.

En todos los métodos anteriores, el bloqueo de PD-L1 puede combinarse con otras formas de inmunoterapia tales como tratamiento con citocinas (por ejemplo, interferones, agentes dirigidos a actividad de VEGF o receptores de VEGF, GM-CSF, G-CSF, IL-2) o terapia de anticuerpos biespecíficos, que proporciona una presentación de antígenos tumorales aumentada (véase, p. ej., Holliger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Poljak, Structure, 2:1121-1123 (1994)).

Vacunas

Los péptidos macrocíclicos pueden usarse para estimular respuestas inmunitarias específicas de antígeno mediante la administración conjunta de un macrociclo anti-PD-1 con un antígeno de interés (porejemplo, una vacuna). Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona (i) el antígeno; y (ii) un macrociclo anti-PD-1 para uso en la potenciación de una respuesta inmunitaria frente a un antígeno en un sujeto, de modo que se potencia una respuesta inmunitaria frente al antígeno en el sujeto. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno vírico, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno. Los ejemplos no limitativos de tales antígenos incluyen los analizados en las secciones anteriores, tales como los antígenos tumorales (o vacunas tumorales) analizados anteriormente, o antígenos de los virus, bacterias u otros patógenos descritos anteriormente.

Vías adecuadas de administración de las composiciones (por ejemplo, péptidos macrocíclicos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la descripción in vivo e in vitro se conocen bien en la técnica y pueden seleccionarse por los expertos en la materia. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar por inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las dosis adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y la concentración y/o formulación de la composición.

Como se describió previamente, los péptidos macrocíclicos de la descripción pueden administrarse conjuntamente con otro agente terapéutico más, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. El péptido puede estar unido al agente (como un inmunocomplejo) o puede administrarse por separado del agente. En el último caso (administración separada), el péptido se puede administrar antes, después de o simultáneamente con el agente o puede administrarse conjuntamente con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia anticancerosa, p. ej., radiación. Dichos agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino bleomicina sulfato, carmustina, clorambucilo, descarbazina y ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí solos, son solamente eficaces a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra por vía intravenosa como una dosis de 100 mg/dosis una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra por vía intravenosa como una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La administración conjunta de los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticancerígenos que operan a través de diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico para las células tumorales humanas. Dicha administración conjunta puede resolver problemas debido al desarrollo de resistencia a fármacos o un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que las haría no reactivas con los péptidos.

Dentro del alcance de la presente divulgación también se encuentran kits que comprenden las composiciones de la divulgación (por ejemplo, péptidos macrocíclicos, biespecíficas o moléculas multiespecíficas, o inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional, o uno o más péptidos macrocíclicos adicionales de la divulgación(por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno PD-L1 distinto del macrociclo). Los kits incluyen normalmente una etiqueta que indica el uso pretendido del contenido del kit. El término etiqueta incluye cualquier material escrito o grabado suministrado en o con el kit, o que de otro modo acompaña al kit.

Terapia combinada

La combinación de los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación con otro antagonista de PD-L1 y otro inmunomodulador es útil para potenciar una respuesta inmune contra una enfermedad hiperproliferativa. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para mejorar inmunidad en diversas situaciones. El bloqueo de PD-L1 por péptidos macrocíclicos puede mejorar la respuesta inmune a las células cancerosas en el paciente. Los cánceres cuyo crecimiento puede inhibirse usando los péptidos macrocíclicos de la divulgación instantánea incluyen cánceres sensibles a la inmunoterapia. Los ejemplos representativos de cánceres para el tratamiento con la terapia de combinación de la presente divulgación incluyen melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastásico), cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer pulmonar. Los ejemplos de otros cánceres que pueden tratarse usando los métodos de la presente divulgación incluyen cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemias crónicas o agudas, incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de linfocitos T, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo aquellos inducidos por amianto, y combinaciones de dichos cánceres. La presente descripción también es útil para el tratamiento de cánceres metastásicos.

En ciertas realizaciones, la combinación de agentes terapéuticos que contienen al menos un péptido macrocíclico discutido en este documento puede administrarse simultáneamente como una composición única en un vehículo farmacéuticamente aceptable, o simultáneamente como composiciones separadas en donde cada agente puede administrarse secuencialmente. Por ejemplo, un segundo inmunomodulador y un péptido macrocíclico de la presente divulgación pueden administrarse secuencialmente, tal como el segundo inmunomodulador administrado primero y el péptido macrocíclico segundo, o el péptido macrocíclico administrado primero y el segundo inmunomodulador segundo. Además, si se administra secuencialmente más de una dosis de la terapia combinada, el orden de la administración secuencial se puede revertir o mantener en el mismo orden en cada momento de administración, las administraciones secuenciales pueden combinarse con administraciones concurrentes, o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, la primera administración de un segundo inmunomodulador y el péptido macrocíclico puede ser concurrente, la segunda administración puede ser secuencial con el segundo inmunomodulador primero y el péptido macrocíclico segundo, y la tercera administración puede ser secuencial con el péptido macrocíclico primero y el segundo inmunomodulador segundo, etc. Otro esquema de dosificación representativo puede implicar una primera administración que es secuencial con el péptido macrocíclico primero y el segundo inmunomodulador segundo, y las administraciones posteriores pueden ser concurrentes.

Opcionalmente, la combinación del péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador puede combinarse adicionalmente con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células, y células transfectadas con genes que codifican citocinas estimulantes inmunitarias (He et al., J. Immunol., 173:4919-4928 (2004)). Los ejemplos no limitativos de vacunas tumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citoquina GM-CSF (discutido adicionalmente posteriormente).

Un péptido macrocíclico PD-L1 combinado y un segundo inmunomodulador pueden combinarse adicionalmente con un protocolo de vacunación. Se han ideado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring: 300-302 (2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring: 414-428 (2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring: 730-738 (2000); véase también Restifo et al., Cancer Vaccines, Capítulo 61, págs. 3023-3043 en DeVita et al., eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, quinta edición (1997)). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna usando células tumorales autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que estas vacunas celulares son más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que GM-CSF es un potente activador de la presentación de antígenos para la vacunación de tumores (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3539-3543 (1993)).

El estudio de la expresión génica y los patrones de expresión génica a gran escala en varios tumores ha conducido a la definición de los llamados antígenos específicos de tumor (Rosenberg, Immunity, 10:281-287 (1999)). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumor son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula de la que se originó el tumor, por ejemplo, antígenos de melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. Más importante aún, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son las dianas de linfocitos T específicos de tumor encontrados en el huésped. En ciertas realizaciones, se puede usar un péptido macrocíclico PD-L1 combinado y un segundo inmunomodulador junto con una colección de proteínas recombinantes y/o péptidos expresados en un tumor para generar una respuesta inmune a estas proteínas. Estas proteínas son normalmente vistas por el sistema inmune como autoantígenos y son, por tanto, tolerantes a ello. El antígeno tumoral también puede incluir la proteína telomerasa, que se requiere para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más de 85 % de los cánceres humanos y solo en un número limitado de tejidos somáticos (Kim et al., Science, 266:2011-2013 (1994)). (Estos tejidos somáticos pueden protegerse del ataque inmunitario por diversos medios). El antígeno tumoral también pueden ser "neoantígenos" expresados en células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia de proteínas o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Filadelfia), o idiotipo de tumores de linfocitos B.

Otras vacunas de tumores pueden incluir las proteínas de virus implicados en cánceres humanos tales como virus del papiloma humano (HPV), Virus de la hepatitis (VHB y VHC) y Virus del sarcoma de herpes de Kaposi (KHSV). Otra forma de antígeno específico de tumor que se puede usar junto con el bloqueo del péptido macrocíclico PD-L1 es proteínas de choque térmico (HSP) purificadas aisladas del tejido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas HSP son altamente eficaces en el suministro a las células presentadoras de antígeno para inducir inmunidad tumoral (Suot et al., Science, 269:1585-1588 (1995); Tamura et al., Science, 278:117-120 (1997)).

Las células dendríticas (DC) son potentes células de presentación de antígeno que pueden usarse para preparar respuestas específicas de antígeno. Las DC pueden producirse ex vivo y cargarse con diversos antígenos de proteínas y péptidos, así como extractos de células tumorales (Nestle, et al., Nat. Med., 4:328-332 (1998)). Las DC también pueden ser transducidas por medios genéticos para expresar también estos antígenos tumorales. Las DC también se han fusionado directamente a las células tumorales con fines de inmunización (Kugler et al., Nat. Med., 6:332-336 (2000)). Como método de vacunación, La inmunización con DC puede combinarse eficazmente con un péptido macrocíclico anti-PD-L1 combinado y un segundo inmunomodulador para activar respuestas antitumorales más potentes.

Un péptido macrocíclico anti-PD-L1 combinado y un inmunomodulador adicional también se pueden combinar con los tratamientos estándar contra el cáncer. Por ejemplo, una combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador puede combinarse eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, como se observa con la combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador, puede ser posible reducir la dosis de otro reactivo quimioterapéutico administrado con la combinación de la presente divulgación (Mokyr et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)). Un ejemplo de dicha combinación es una combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador junto con la descarbina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo es una combinación de un péptido macrocíclico y un segundo agente inmunomodulador además de interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. El fundamento científico detrás del uso combinado del péptido macrocíclico PD-L1 y otro inmunomodulador con quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería dar lugar a niveles aumentados de antígeno tumoral en la ruta de presentación del antígeno. Otras terapias combinadas que pueden dar como resultado una sinergia con un péptido macrocíclico combinado anti-PD-L1 y un inmunomodulador adicional a través de la muerte celular incluyen radiación, cirugía, o privación hormonal. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el huésped. Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con un PD-L1 y segundo inmunomodulador combinados. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de las células tumorales, que también puede ser una fuente de antígeno tumoral para ser alimentado en las vías de presentación del antígeno del huésped.

También se puede usar una combinación de PD-L1 y otro inmunomodulador junto con péptidos macrocíclicos biespecíficos que se dirigen a células efectoras que expresan receptores Fc.alfa. o Fc.gamma. a células tumorales (véase, p. ej., las patentes de Estados Unidos n.° 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar péptidos macrocíclicos biespecíficos para dirigir dos antígenos separados. Por ejemplo, se han usado péptidos macrocíclicos biespecíficos del receptor anti-Fc/antígeno antitumoral (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir macrófagos a sitios de tumor. Este direccionamiento puede activar más eficazmente las respuestas tumorales específicas. El brazo de linfocitos T de estas respuestas se incrementaría con el uso de un PD-L1 y un segundo inmunomodulador combinados. Como alternativa, el antígeno puede administrarse directamente a las DC mediante el uso de péptidos macrocíclicos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y un marcador de superficie celular específico de células dendríticas.

En otro ejemplo, se puede usar una combinación de un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador junto con agentes macrocíclicos antineoplásicos, tales como RITUXAN® (rituximab), HERCEPTIN® (trastuzumab), BEXXAR® (tositumomab), ZEVALIN® (ibritumomab), CAMPATH® (alemtuzumab), Linfocida (eprtuzumab), AVASTIN® (bevacizumab), y TARCEVA® (erlotinib), y similares. A modo de ejemplo y sin el deseo de quedar vinculados a teoría alguna, el tratamiento con un anticuerpo anticanceroso o un anticuerpo anticanceroso conjugado con una toxina puede dar lugar a la muerte de células cancerosas (por ejemplo, células tumorales), lo que potenciaría una respuesta inmunitaria mediada por la segunda diana de inmunomodulador o PD-L1. En una realización de ejemplo, un tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, un tumor canceroso) puede incluir un anticuerpo anticanceroso junto con un péptido macrocíclico y un segundo inmunomodulador simultáneamente o secuencialmente o cualquier combinación de los mismos, que puede potenciar una respuesta inmune antitumoral por parte del huésped.

Los tumores evaden la vigilancia inmune del huésped por una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la inactivación de proteínas, que se expresan por los tumores y que son inmunosupresoras. Estos incluyen, entre otros, TGF-.beta. (Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050 (1986)), IL-10 (Howard, M. et al., Immunology Today, 13:198-200 (1992)), y ligando Fas (Hahne, M. et al., Science, 274:1363-1365 (1996)). En otro ejemplo, los anticuerpos para cada una de estas entidades pueden combinarse adicionalmente con un péptido macrocíclico y otro inmunomodulador para contrarrestar los efectos de los agentes inmunosupresores y favorecer las respuestas inmunitarias antitumorales por parte del huésped.

Otros agentes que pueden usarse para activar la respuesta inmune del huésped pueden usarse además junto con un péptido macrocíclico de la presente divulgación. Estos incluyen moléculas en la superficie de las células dendríticas que activan la función DC y la presentación del antígeno. Los péptidos macrocíclicos anti-CD40 pueden sustituir eficazmente la actividad auxiliar de linfocitos T (Ridge, J. et al., Nature, 393:474-478 (1998)) y pueden usarse junto con los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación, solos o junto con una combinación anti-CTLA-4 (Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5):527-540 (2000)). Péptidos macrocíclicos activantes para moléculas coestimuladoras de linfocitos T, tal como OX-40 (Weinberg, A. et al., Immunol., 164:2160-2169 (2000)), 4-1BB (Melero, I. et al., Nat. Med., 3:682-685 (1997), e ICOS (Hutloff, A. et al., Nature, 397:262-266 (1999)) pueden proporcionar también niveles aumentados de activación de linfocitos T.

El trasplante de médula ósea se utiliza actualmente para tratar diversos tumores de origen hematopoyético. Mientras que la enfermedad del injerto contra huésped es una consecuencia de este tratamiento, el beneficio terapéutico puede obtenerse a partir de respuestas de injerto frente a tumor. Un péptido macrocíclico de la presente divulgación, ya sea solo o junto con otro inmunomodulador, se puede usar para aumentar la eficacia de los linfocitos T específicos de tumor injertados en el donante.

También hay varios protocolos de tratamiento experimental que involucran activación y expansión ex vivo de linfocitos T específicos de antígeno y transferencia adoptiva de estas células en receptores para linfocitos T específicos de antígeno contra tumor (Greenberg, R. et al., Science, 285:546-551 (1999)). Estos métodos también pueden usarse para activar las respuestas de los linfocitos T a agentes infecciosos tales como CMV. Activación ex vivo en presencia de un péptido macrocíclico de la presente divulgación, ya sea solo o junto con otro innumomodulador, cabe esperar que aumente la frecuencia y la actividad de los linfocitos T transferidos adoptivamente.

En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un péptido macrocíclico de la presente divulgación junto con una dosis subterapéutica de otro inmunomodulador para su uso en la alteración de un evento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, . Por ejemplo, los métodos de la presente divulgación proporcionan un método de reducción de la frecuencia de colitis o diarrea inducida por un anticuerpo terapéutico inmunoestimulador mediante la administración de un esteroide no absorbible al paciente. Debido a que cualquier paciente que reciba un anticuerpo terapéutico inmunoestimulador está en riesgo de desarrollar colitis o diarrea inducida por dicho tratamiento, toda esta población de pacientes es adecuada para la terapia según los métodos de la presente divulgación. Aunque se han administrado esteroides para tratar la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) y prevenir las exacerbaciones de la IBD, no se han utilizado para prevenir (disminuir la incidencia de) IBD en pacientes que no han sido diagnosticados con IBD. Los efectos secundarios significativos asociados con esteroides, incluso esteroides no absorbibles, han desalentado el uso profiláctico.

En realizaciones adicionales, un péptido macrocíclico de la presente divulgación, ya sea solo o junto con otro inmunomodulador, se puede combinar además con el uso de cualquier esteroide no absorbible. Como se usa en este documento, un "esteroide no absorbible" es un glucocorticoide que exhibe un extenso metabolismo de primer paso tal que, después del metabolismo en el hígado, la biodisponibilidad del esteroide es baja, es decir, menos de aproximadamente 20 %. En una realización de la divulgación, el esteroide no absorbible es budesonida. La budesonida es un glucocorticosteroide de acción local, que se metaboliza ampliamente, principalmente por el hígado, después de la administración oral. ENTOCORT® EC (Astra-Zeneca) es una formulación oral de budesonida dependiente del tiempo y del pH desarrollada para optimizar el suministro de fármacos al íleon y todo el colon. ENTOCORT® EC está aprobado en Estados Unidos para tratamiento de la enfermedad de Crohn leve a moderada que afecta al íleon y/o al colon ascendente. La dosis oral habitual de ENTOCORT® EC para el tratamiento de la enfermedad de Crohn es de 6 a 9 mg/día. ENTOCORT® EC se libera en los intestinos antes de ser absorbido y retenido en la mucosa intestinal. Una vez que pasa a través del tejido diana de la mucosa intestinal, ENTOCORT® EC se metaboliza ampliamente por el sistema del citocromo P450 en el hígado a metabolitos con una actividad glucocorticoide insignificante. Por tanto, la biodisponibilidad es baja (alrededor del 10 %). La baja biodisponibilidad de budesonida da como resultado una relación terapéutica mejorada en comparación con otros glucocorticoides con un metabolismo de primer paso menos extenso. Budesonida resulta en menos efectos adversos, incluyendo menos supresión hipotalámica-pituitaria, que los corticosteroides de acción sistémica. Sin embargo, la administración crónica de ENTOCORT® EC puede producir efectos glucocorticoides sistémicos tales como hipercorticismo y supresión suprarrenal. Véase Physicians' Desk Reference Supplement, 58a edición, 608-610 (2004).

En otras realizaciones adicionales, una combinación PD-L1 y otro inmunomodulador junto con un esteroide no absorbible pueden combinarse adicionalmente con un salicilato. Los salicilatos incluyen agentes 5-ASA tales como, por ejemplo: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn); olsalazina (DIPe Nt UM®, Pharmacia & Upjohn); balsalazida (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); y mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).

Dosificación y Formulación

Un péptido adecuado de Fórmula I, o más específicamente un péptido macrocíclico descrito en este documento, puede administrarse a pacientes para tratar diabetes y otras enfermedades relacionadas, ya que el compuesto solo se mezcla con un vehículo aceptable en forma de formulaciones farmacéuticas. Los expertos en la técnica de tratamiento de diabetes pueden determinar fácilmente la dosis y la vía de administración del compuesto a mamíferos, incluyendo seres humanos, que necesitan dicho tratamiento. La ruta de administración pueden incluir pero sin limitación oral, intraoral, rectal, transdérmica, bucal, intranasal, pulmonar, subcutánea, intramuscular, intradérmica, sublingual, intracolónica, intraocular, intravenosa, o administración intestinal. El compuesto se formula en función de la vía de administración basada en la práctica farmacéutica aceptable (Fingl et al., en The Pharmacological Basis of Therapeutics, Capítulo 1, pág. 1 (1975); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)).

Las composiciones peptídicas farmacéuticamente aceptables descritas en el presente documento pueden administrarse en múltiples formas de dosificación tales como comprimidos, cápsulas (cada una de las cuales incluye formulaciones de liberación sostenida o de liberación programada), píldoras, polvos, gránulos, elixires, geles in situ, microesferas, complejos cristalinos, liposomas, microemulsiones, tinturas, suspensiones, jarabes, pulverizaciones de aerosol y emulsiones. Las composiciones descritas en el presente documento también se pueden administrar en forma oral, (bolo o infusión) intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica o intramuscular, usando todas ellas formas de dosificación bien conocidas por los expertos en la materia farmacéutica. Las composiciones pueden administrarse solas, pero generalmente se administrarán con un vehículo seleccionado dependiendo de la vía de administración escogida y de la práctica farmacéutica convencional.

El régimen de dosificación para las composiciones descritas en este documento, por supuesto, variará dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular y su modo y vía de administración; la especie, la edad, sexo, la salud, el estado médico y peso del receptor; la naturaleza y el alcance de los síntomas; la clase de tratamiento concurrente; la frecuencia del tratamiento; la vía de administración, la función renal y hepática del paciente y el efecto deseado. Un médico o un veterinario puede determinar y prescribir la cantidad eficaz del fármaco que es necesaria para prevenir, contrarrestar, o detener el progreso de la patología.

Como orientación general, la dosificación oral diaria del ingrediente activo, cuando se usan para los efectos indicados, variará entre aproximadamente 0,001 a 1000 mg/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal por día, y lo más preferentemente entre aproximadamente 0,6 a 20 mg/kg/día. Por vía intravenosa, la dosis diaria del ingrediente activo cuando se usa para los efectos indicados oscilará entre 0,001 ng a 100,0 ng por minuto/por kg de peso corporal durante una infusión a velocidad constante. Dicha infusión intravenosa constante se puede administrar preferentemente a una velocidad de 0,01 ng a 50 ng por minuto por kg de peso corporal y lo más preferentemente de 0,01 ng a 10,0 mg por minuto por kg de peso corporal. Las composiciones descritas en este documento pueden administrarse en una dosis diaria única, o la dosis diaria total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día. Las composiciones descritas en este documento también pueden administrarse mediante una formulación de depósito que permitirá la liberación sostenida del fármaco durante un período de días/semanas/meses, según se desee.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse en forma intranasal mediante el uso tópico de vehículos intranasales adecuados, o mediante rutas transdérmicas, usando parches cutáneos transdérmicos. Cuando se administra en forma de un sistema de suministro transdérmico, la administración de la dosis será, por supuesto, continua en lugar de intermitente a largo del régimen de dosificación.

Las composiciones están administradas en una mezcla con diluyentes farmacéuticos adecuados, excipientes o vehículos farmacéuticamente adecuados (denominados colectivamente en el presente documento como transportadores farmacéuticos) seleccionados adecuadamente con respecto a la forma de administración prevista, es decir, comprimidos orales, cápsulas, elixires, aerosoles generados con o sin propulsores y jarabes, y consistentes con las prácticas farmacéuticas convencionales.

Por ejemplo, para la administración oral en forma de un comprimido o una cápsula, el componente de fármaco activo puede combinarse con un vehículo inerte oral, vehículo inerte, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tal como, sin limitación, lactosa, almidón, sacarosa, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, manitol y sorbitol; para la administración oral en forma líquida, los componentes orales de fármaco puede combinarse con cualquier vehículo inerte oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable tal como, pero sin limitación, etanol, glicerol, y agua. Además, cuando se desee o sea necesario, se pueden incorporar también aglutinantes, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes adecuados en la mezcla. Los aglutinantes adecuados incluyen, pero sin limitación, almidón, gelatina, azúcares naturales tales como, pero sin limitación, glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, y ceras. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen oleato sódico, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato sódico, y cloruro sódico. Los disgregantes incluyen, pero sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, y goma de xantano.

Las composiciones descritas en el presente documento también pueden administrarse en forma de sistemas mixtos de administración de micelas o liposomas, tales como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas se pueden formar a partir de varios fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. Se pueden agregar potenciadores de permeación para mejorar la absorción del fármaco.

Dado que se sabe que los profármacos mejoran numerosas calidades deseables de los compuestos farmacéuticos (p. ej., solubilidad, biodisponibilidad, fabricación, etc.) los compuestos descritos en el presente documento pueden suministrarse en forma de profármaco. Por tanto, la materia objeto descrita en el presente documento pretende cubrir profármacos de los compuestos actualmente reivindicados, métodos de suministro de los mismos y composiciones que contienen los mismos.

Las composiciones descritas en el presente documento también se pueden acoplar con polímeros solubles como vehículos de fármacos dirigibles. Dichos polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietilaspartamidafenol u óxido de polietilen-polilisina sustituido con restos palmitoílo. Además, las composiciones descritas en el presente documento pueden combinarse con una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico y poliglicólico, poliépsilon caprolactona, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polihidropiranos, policianoacilatos y copolímeros de bloque de hidrogeles reticulados o anfipáticos.

Las formas de dosificación (composiciones farmacéuticas) adecuadas para la administración pueden contener de aproximadamente 0,01 miligramos a aproximadamente 500 miligramos de ingrediente activo por unidad de dosificación. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo normalmente estará presente en una cantidad de aproximadamente 0,5-95 % en peso basado en el peso total de la composición.

Las cápsulas de gelatina pueden contener el principio activo y transportadores en polvo, tales como lactosa, almidón, derivado de celulosa, estearato de magnesio y ácido esteárico. Para elaborar comprimidos compactados pueden usarse diluyentes similares. Tanto los comprimidos como las cápsulas pueden fabricarse como productos de liberación sostenida para proporcionar la liberación continua de la medicación durante un periodo de horas. Los comprimidos pueden recubrirse con azúcar o con una película para ocultar cualquier sabor desagradable y proteger al comprimido de la atmósfera, o pueden tener un recubrimiento entérico para la disgregación selectiva en el tubo digestivo.

Las formas farmacéuticas líquidas para la administración oral pueden contener colorantes y saborizantes para aumentar la aceptación del paciente.

En general, agua, un aceite adecuado, solución salina, solución acuosa de dextrosa (glucosa) y soluciones de azúcares relacionados y glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicoles son vehículos adecuados para las soluciones parenterales. La solución para la administración parenteral contiene una sal soluble en agua del ingrediente activo, agentes estabilizantes adecuados y, si es necesario, sustancias tamponantes. Los agentes antioxidantes tales como, bisulfito de sodio, sulfito de sodio o ácido ascórbico, solos o combinados, son agentes estabilizantes adecuados. También se usan ácido cítrico y sus sales y EDTA sódico. Además, las soluciones parenterales pueden contener conservantes, tales como cloruro de benzalconio, metil- o propil-parabeno, y clorobutanol.

Se describen vehículos farmacéuticamente adecuados en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Decimonovena edición, Mack Publishing Company (1995), un texto de referencia en este campo.

Las formas de dosificación farmacéuticas útiles representativas para la administración de los compuestos descritas en el presente documento pueden ilustrarse como sigue:

Cápsulas

Se puede preparar una gran cantidad de cápsulas unitarias llenando cápsulas de gelatina dura estándar de dos piezas con 100 miligramos de ingrediente activo en polvo, 150 miligramos de lactosa, 50 miligramos de celulosa, y 6 miligramos de estearato de magnesio.

Cápsulas de gelatina blanda

Una mezcla de ingrediente activo en un aceite digerible tal como aceite de soja, aceite de oliva o aceite de semilla de algodón puede prepararse e inyectarse por medio de una bomba de desplazamiento positivo en gelatina para formar cápsulas de gelatina blandas que contienen 100 miligramos del ingrediente activo. Las cápsulas deben lavarse y secarse.

Comprimidos

Pueden prepararse comprimidos mediante procedimientos específicos para que la unidad de dosificación, por ejemplo, sea 100 miligramos de ingrediente activo, 0,2 miligramos de dióxido de silicio coloidal, 5 miligramos de estearato de magnesio, 275 miligramos de celulosa microcristalina, 11 miligramos de almidón y 98,8 miligramos de lactosa. Se pueden aplicar revestimientos apropiados para aumentar la palatabilidad o retrasar la absorción.

Inyectable

Una formulación inyectable de una composición peptídica descrita en el presente documento puede no requerir el uso de excipientes tales como los que han sido aprobados por organismos reguladores. Estos excipientes incluyen, pero sin limitación, disolventes y codisolventes, solubilizante, agentes emulgentes o espesantes, agentes quelantes, antioxidantes y agentes reductores, conservantes antimicrobianos, tampones y agentes de ajuste de pH, agentes de carga, protectores y ajustadores de tonicidad y aditivos especiales. Una formulación inyectable tiene que ser estéril, libre de pirógenos, en el caso de soluciones, libre de material particulado.

Una composición parenteral adecuada para administración por inyección puede prepararse agitando, por ejemplo, 1,5 % en peso de ingrediente activo en un tampón farmacéuticamente aceptable que puede no contener un codisolvente u otro excipiente. La solución debe hacerse isotónica con cloruro sódico y esterilizada.

Suspensión

Se puede preparar una suspensión acuosa para administración oral y/o parenteral de modo que, por ejemplo, cada 5 ml contenga 100 mg de ingrediente activo finamente dividido, 20 mg de carboximetil celulosa sódica, 5 mg de benzoato sódico, 1,0 g de solución de sorbitol, U.S.P., y 0,025 ml de vainillina u otro saborizante agradable al paladar.

Micropartículas Biodegradables

Se puede preparar una composición parenteral de liberación sostenida adecuada para la administración por inyección, por ejemplo, disolviendo un polímero biodegradable adecuado en un disolvente, añadiendo a la solución de polímero el agente activo a incorporar, y eliminando el polímero de la matriz formando así la matriz del polímero con el agente activo distribuido por toda la matriz.

Síntesis de péptidos

La descripción de la presente divulgación del presente documento debe interpretarse de manera coherente con las leyes y principios de la unión química. Debe entenderse que los compuestos abarcados por la presente divulgación son aquellos que son estables de forma adecuada para su uso como agente farmacéutico. Un experto en la materia sabrá qué compuestos serían y no serían estables basándose en los principios generales de enlace químico y estabilidad.

Puede realizarse síntesis química de un péptido macrocíclico de la presente divulgación utilizando varios métodos reconocidos en la técnica, incluyendo síntesis en fase sólida por etapas, semi-síntesis a través de los fragmentos peptídicos de re-ligadura asistida conformacionalmente, ligadura enzimática clonada o segmentos de péptidos sintéticos, y ligadura química. Un método preferente para sintetizar los péptidos macrocíclicos y sus análogos descritos en este documento es la síntesis química usando diversas técnicas de fase sólida tales como las descritas en Chan, W.C. et al., eds., Fmoc Solid Phase Synthesis, Oxford University Press, Oxford (2000); Barany, G. et al., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2: "Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A", pág. 3-284, Gross, E. et al., eds., Academic Press, Nueva York (1980); y en Stewart, J.M. et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Edición, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984). La estrategia preferente se basa en el grupo Fmoc (9-fluorenilmetil metiloxicarbonilo) para la protección temporal del grupo a-amino, en combinación con el grupo tere-butilo para la protección temporal de las cadenas laterales de aminoácidos (véase por ejemplo Atherton, E. et al., "The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group", en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 9: "Special Methods in Peptide Synthesis, Parte C", pág. 1-38, Undenfriend, S. et al., eds., Academic Press, San Diego (1987).

Los péptidos pueden sintetizarse de manera gradual en un soporte de polímero insoluble (también denominado "resina") partiendo del extremo C-terminal del péptido. Se inicia una síntesis añadiendo el aminoácido C-terminal del péptido a la resina a través de la formación de un enlace amida o éster. Esto permite la liberación eventual del péptido resultante como una amida o ácido carboxílico C-terminal, respectivamente.

Se requiere que el aminoácido C-terminal y todos los demás aminoácidos utilizados en la síntesis tengan sus grupos a-amino y las funcionalidades de la cadena lateral (si están presentes) protegidas diferencialmente de manera que el protector del grupo a-amino pueda eliminarse selectivamente durante la síntesis. El acoplamiento de un aminoácido se realiza mediante la activación de su grupo carboxilo como cómo éster activo y reacción del mismo con el grupo aamino no bloqueado del aminoácido N-terminal unido a la resina. La secuencia de desprotección y acoplamiento del grupo a-amino se repite hasta que se ensambla toda la secuencia peptídica. El péptido se libera luego de la resina con la desprotección concomitante de las funcionalidades de la cadena lateral, generalmente en presencia de secuestradores apropiados para limitar las reacciones secundarias. El péptido resultante finalmente se purificó por HPLC de fase inversa.

La síntesis de las resinas de peptidilo requeridas como precursores de los péptidos finales utiliza resinas poliestirenopoliméricas reticuladas disponibles comercialmente (Novabiochem, San Diego, CA; Applied Biosystems, Foster City, CA). Los soportes sólidos preferentes son: resina 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxiacetil-p-metil benzhidrilamina (resina Rink amida MBHA); resina 9-Fmoc-amino-xanten-3-iloxi-Merrifield (resina Sieber amida); resina 4-(9-Fmoc)aminometil-3,5-dimetoxifenoxi)valeril-aminometil-Merrifield (resina PAL), para carboxamidas C-terminales. El acoplamiento del primer y posteriores aminoácidos puede realizarse usando HOBt, 6-Cl-HOBt o HOAt ésteres activos producidos a partir de DIC/HOBt, HBTU/HOBt, BOP, PyBOP, o de DIC/6-Cl-HOBt, HCTU, DIC/HOAt o HATU, respectivamente. Los soportes sólidos preferentes son: resina cloruro de 2-Clorotritilo y resina 9-Fmoc-aminoxanten-3-iloxi-Merrifield (resina Sieber amida) para fragmentos peptídicos protegidos. La carga del primer aminoácido en la resina de cloruro de 2-clorotritilo se logra mejor haciendo reaccionar el aminoácido protegido con Fmoc con la resina en diclorometano y DIEA. Si fuera necesario, se puede agregar una pequeña cantidad de DMF para facilitar la disolución del aminoácido.

Las síntesis de los análogos de péptidos descritos en este documento pueden realizarse utilizando un sintetizador de péptidos único o multicanal, tal como un sintetizador CEM Liberty Microwave, o Protein Technologies, Inc. Prelude (6 canales) o Sintetizador Symphony (12 canales).

Los precursores de resina de peptidilo para sus péptidos respectivos se pueden escindir y desproteger mediante cualquier procedimiento estándar (véase, por ejemplo, King, D.S. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 36:255-266 (1990)). Un método deseado es el uso de TFA en presencia de agua y TIS como secuestradores. Normalmente, la resina de peptidilo se agita en TFA/agua/TIS (94:3:3, v:v:v; 1 ml/100 mg de resina de peptidilo) durante 2-6 horas a temperatura ambiente. La resina gastada se retiró por filtración después y la solución de TFA se concentra o seca a ^{presión reducida. El péptido crudo resultante precipita y se lava con Et}2^{O o se redisuelve directamente en DMSO o} ácido acético acuoso al 50 % para purificación por HPLC preparativa.

Los péptidos con la pureza deseada se pueden obtener mediante purificación mediante HPLC preparativa, por ejemplo, en un Waters Modelo 4000 o en un cromatógrafo líquido Shimadzu Modelo LC-8A. La solución de péptido en bruto se inyecta en una columna YMC S5 ODS (20X100 mm) y eluye con un gradiente lineal de MeCN en agua, ambos tamponados con 0,1 % de TFA, usando un caudal de 14-20 ml/min con monitorización de efluente por absorbancia UV a 220 nm. Las estructuras de los péptidos purificados se pueden confirmar mediante análisis MS por electronebulización.

Procedimientos experimentales

Las abreviaturas utilizadas en la presente solicitud, incluidas particularmente en los esquemas y ejemplos ilustrativos a continuación, se conocen bien por los expertos en la materia. Algunas de las abreviaturas utilizadas son las siguientes: DMF para N,N-dimetilformamida; HATU para hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; HCTU para hexafluorofosfato de O-(6-Cl-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; TFA para ácido trifluoroacético; DBU para 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno; DIAD para azodicarboxilato de diisopropilo; TIS para triisopropilsilano; DMSO para dimetilsulfóxido; MeCN o ACN para acetonitrilo; DCM para 1,1-diclorometano; DIEA o DIPEA para diisopropiletilamina; Fmoc para 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; NMM para N-metilmorfolina; DMAP para 4-N, N-dimetilaminopiridina; NMP para N-metilpirrolidona; Ac para acetilo; y Et para etilo.

Datos analíticos:

Espectrometría de Masas: "ESI-MS(+)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización realizada en modo ion positivo; "ESI-MS(-)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización realizada en modo ion negativo; "ESI-HRMS(+)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización de alta resolución realizada en modo ion positivo; "ESI-HRMS(-)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización de alta resolución realizada en modo ion negativo. Las masas detectadas se informan siguiendo las designación de unidades "m/z". Los compuestos con masas exactas mayores de 1000 se detectaron a menudo como iones de doble carga o triple carga.

Condición A para análisis por LCMS:

Columna: Waters BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvil A: agua con TFA al 0,05 %; Fase móvil B: Acetonitrilo con TFA al 0,05 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: B al 2% a B al 98% durante 2 min, después mantener O, 5 min con B al 98 %; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Condición C para análisis por LCMS:

^{Columna: Waters BEH C18, 2,1 x} 50 ^{mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvil A: agua con ácido fórmico al 0,2 % y TFA} al 0,01 %; Fase móvil B: Acetonitrilo con ácido fórmico al 0,2 % y TFA al 0,01 %; Temperatura: 50 °C; Gradiente: B al 2% a B al 80% durante 2 min, B al 80 % a B al 98 % durante 0,1 minutos y después mantener 0,5 min. con B al 98 %; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Condición D para análisis por LCMS:

Columna: Waters BEH C18, 2,1 * 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 70 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 min, después mantener 2,0 minutos a 100% B; Flujo: 0,75 ml/min; Detección: UV ^a 220 ^nm.

Condición E para análisis por LCMS:

Columna: Waters BEH C18, 2,1 * 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvil A: acetonitrilo:agua 5:95 con 0,1 % de ácido trifluoroacético; Fase móvil B: acetonitrilo:agua 95:5 con 0,1 % de ácido trifluoroacético; temperatura: 50 °C o 70 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 3 min, después mantener 0,75 o 2,0 minutos en B al 100 %; Flujo: 0,75 o 1,11 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Condición F para análisis por LCMS:

Columna: Waters XBridge C18, 2,1 x 50 mm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 35 °C; Gradiente: 0-100 % de B durante 4 min, después mantener 1 minutos a 100% B; Flujo: 4 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Condición G para análisis por LCMS:

Columna: Waters BEH C18, 2,0 * 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0­ 100 % de B durante 3 min, después mantener 0,5 minutos a 100% B; Flujo: 0,5 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Condición H para análisis por LCMS:

Columna: Waters BEH C18, 2,0 * 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0-100 % B durante 3 minutos, después mantener 0,5 minutos a 100 % B; Flujo: 1,0 ml/min; Detección: UV ^a 220 ^nm.

Condición I para análisis por LCMS:

Columna: Waters BEH C18, 2,0 * 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0­ 100 % B durante 3 minutos, después mantener 0,5 minutos a 100 % B; Flujo: 0,5 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Condición J para análisis por LCMS:

Waters CSH C18, 2,1 * 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con ácido trifluoroacético; Temperatura: 70 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 3 minutos, después mantener 2,0 minutos a 100 % B; Flujo: 0,75 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Procedimientos generales:

Método Symphony A:

Todas las manipulaciones se realizaron con automatización en un sintetizador de péptidos Symphony (Protein Technologies). Todos los procedimientos, a menos que se indique lo contrario, se realizaron en un recipiente de polipropileno Symphony equipado con una frita inferior. El recipiente conecta al sintetizador de péptidos Symphony a través tanto del fondo como de la parte superior del tubo. Todos los disolventes, DMF, DCM, aminoácidos y reactivos se agregan a través del fondo del recipiente y pasan a través de la frita para entrar en contacto con la resina. Todas ^{las soluciones se eliminan a través del fondo del recipiente. "Agitación periódica" describe un breve pulso de gas N}2 ^a través de la frita inferior; el pulso dura aproximadamente 5 segundos y se produce cada 15 segundos. Las soluciones de aminoácidos generalmente no se usaron más de tres semanas después de la preparación. Las soluciones de HATU se utilizaron a los 5 días de preparación. DMF = dimetilformamida; DCM = diclorometano; THF = tetrahidrofurano; HCTU = 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; HATU = 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio; NMM = N-metil morfolina; DIPEA = diisopropiletilamina; DMAP = N,N-dimetilpiridin-4-amina; resina Rink = resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxiacetamidoaminometilo; Resina Sieber = Fmoc-aminoxanteno-3-iloxi, donde "3-iloxi" describe la posición y el tipo de conectividad con la resina de poliestireno. Las resinas utilizadas son polímero Merrifield (poliestireno) con un enlazador Rink o Sieber (protegido con Fmoc en nitrógeno); malla 100-200, DVB al 1 %, carga de 0,35 mmol/g o 0,71 mmol/g, respectivamente. En la síntesis también se pueden utilizar otras resinas comunes sensibles a los ácidos, tal como la resina de clorotritilo funcionalizada. Los aminoácidos comunes utilizados se enumeran a continuación con los grupos protectores de cadena lateral indicados entre paréntesis. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH (Dab = ácido 2,4-diaminobutírico); Fmoc-Dap(Boc)-OH (Dap = ácido 2,3-diaminopropiónico); Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-t-Hyp(tBu)-OH (t-Hyp = trans-4-hidroxiprolina); Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH (Sar = sarcosina o [N-Me]Gly); Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

Los procedimientos del "Método Symphony A" describen un experimento realizado a una escala de 0,050-0,100 mmol, donde la escala está determinada por la sustitución de la resina. Esta escala corresponde a aproximadamente 143­ 286 mg o 70-140 mg de las resinas Rink o Sieber-Merrifield, respectivamente, anteriormente descritas. Todos los procedimientos se pueden modificar a escala más allá de la escala de 0,050-0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Antes del acoplamiento de aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de hinchamiento de resina, descrito a continuación como "Procedimiento de hinchamiento". El acoplamiento de aminoácidos a una amina primaria N-terminal utilizó el "procedimiento de acoplamiento convencional" que se describe a continuación. El acoplamiento de aminoácidos a una amina secundaria N-terminal usó el procedimiento de "acoplamiento de amina secundaria" descrito a continuación.

Procedimiento de hinchamiento:

A un recipiente de reacción de polipropileno Symphony se añadió resina Sieber o Rink o Merrifield (70 mg, 0,050 mmol o 140 mg, 0,100 mmol). La resina se lavó (hinchó) tres veces como sigue: al recipiente de reacción se le añadió DMF ⁽

1²

0^{,5-5,0 ml) y la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N}2 ^{desde el fondo del recipiente de reacción durante minutos antes de drenar el disolvente a través de la frita.}

Procedimiento de acoplamiento convencional:

La resina se lavó tres veces como sigue: al recipiente de reacción se le añadió DMF (2,5-5,0 ml) y la mezcla se agitó ^{periódicamente con burbujeo de N}2 ^{desde el fondo del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de drenar el} disolvente a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5-5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. El procedimiento se repitió ^{una vez más. La resina se lavó} 6 ^{veces como sigue: para cada lavado, se añadió DMF (2,5-5,0 ml) a través del fondo} del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,25-2,5 ml, 5 eq), después HATU (0,2 M en DMF, 1,25-2,5 ml, 5 eq) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 1,25-2,5 ml, 10 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante una hora, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó con DMF (2,5-5,0 ml) cinco veces, agitando durante 30 segundos cada vez. Al recipiente de reacción se añadió una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:5:85 v/v/v, 2,5-5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 20 minutos, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,5-5,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria:

La resina se lavó tres veces como sigue: al recipiente de reacción se le añadió DMF (2,5-5,0 ml) y la mezcla se agitó ^{periódicamente con burbujeo de N}2 ^{desde el fondo del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de drenar el} disolvente a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5-5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. El procedimiento se repitió ^{una vez más. La resina se lavó} 6 ^{veces como sigue: para cada lavado, se añadió DMF (2,5-5,0 ml) a través del fondo} del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5-5,0 ml, 10 eq), después HATU (0,2 M en DMF, 2,5-5,0 ml, 10 eq) y finalmente NMM (0,8 M en D^m F, 2,5-5,0 ml, 20 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante dos horas, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó con DMF (2,5-5,0 ml) cinco veces, agitando durante 30 segundos cada vez. Al recipiente de reacción se añadió una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:5:85 v/v/v, 2,5-5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 20 minutos, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,5-5,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Acoplamiento de amina secundaria sin procedimiento de desprotección de Fmoc:

La resina se lavó tres veces como sigue: al recipiente de reacción se le añadió DMF (2,5-5,0 ml) y la mezcla se agitó ^{periódicamente con burbujeo de N}2 ^{desde el fondo del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de drenar el} disolvente a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5-5,0 ml, 10 eq), después HATU (0,2 M en DMF, 2,5-5,0 ml, 10 eq) y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 2,5-5,0 ml, 20 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante seis horas, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó con DMF (2,5-5,0 ml) cinco veces, agitando durante 30 segundos cada vez. Al recipiente de reacción se añadió una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:5:85 v/v/v, 2,5-5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 20 minutos, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,5-5,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético:

La resina se lavó tres veces como sigue: al recipiente de reacción se le añadió DMF (2,5-5,0 ml) y la mezcla se agitó ^{periódicamente con burbujeo de N}2 ^{desde el fondo del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de drenar el} disolvente a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5-5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó una vez con DMF (2,5-5,0 ml). Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5-5,0 ml). La mezcla se agitó ^{periódicamente durante 5 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó} 6 ^{veces como} sigue: para cada lavado, se añadió DMF (2,5-5,0 ml) a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió NMM (0,8 M en DMF, 3,0 ml, 48 eq) seguido de anhídrido cloroacético (0,4 M en ^d M^f , 3,0 ml, 24 eq). La mezcla se agitó periódicamente durante 30 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó una vez con DMF (4,0 ml). Al recipiente de reacción se añadió NMM (0,8 M en DMF, 3,0 ml, 48 eq) seguido de anhídrido cloroacético (0,4 M en DMF, 3,0 ml, 24 eq). La mezcla se agitó periódicamente durante 30 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces con DMF (3,0 ml) con agitación periódica de la mezcla durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. A continuación, la resina se lavó cinco veces con DCM (3,0 ml) con agitación periódica de la mezcla resultante durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. A continuación, la resina resultante se secó con una ^{corriente de nitrógeno durante} 10 ^minutos.

Método Symphony B:

Todas las manipulaciones se realizaron con automatización en un sintetizador de péptidos Symphony (Protein Technologies). Todos los procedimientos, a menos que se indique lo contrario, se realizaron en un tubo Symphony de polipropileno de 20 ml equipado con una frita inferior. El tubo conecta al sintetizador de péptidos Symphony a través tanto del fondo como de la parte superior del tubo. Todos los disolventes, DMF, DCM, aminoácidos y reactivos se agregan a través del fondo del tubo y pasan a través de la frita para entrar en contacto con la resina. Todas las soluciones se retiran a través del fondo del tubo. "Agitación periódica" describe un breve pulso de gas N2 a través de la frita inferior; el pulso dura aproximadamente 5 segundos y se produce cada 15 segundos. Las soluciones de aminoácidos generalmente no se usaron más de tres semanas después de la preparación. Las soluciones de HATU se utilizaron a los 5 días de preparación. DMF = dimetilformamida; HCTU = 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; HATU = 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio; NMM = N-metil morfolina; DIPEA = diisopropiletilamina; Sieber = Fmoc-amino-xanteno-3-iloxi, donde "3-iloxi" describe la posición y el tipo de conectividad con la resina de poliestireno. La resina utilizada es polímero Merrifield (poliestireno) con un enlazador Sieber (protegido con Fmoc en nitrógeno); malla 100-200, DVB al 1 %, carga de 0,71 mmol/g. En la síntesis también se pueden utilizar otras resinas comunes sensibles a los ácidos, como Rink o la resina de clorotritilo funcionalizada. Los aminoácidos comunes utilizados se enumeran a continuación con los grupos protectores de cadena lateral indicados entre paréntesis. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-t-Hyp(tBu)-OH (t-Hyp = trans-4-hidroxiprolina; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

El procedimiento de "Método Symphony B" describe un experimento realizado en una escala de 0,10 mmol, donde la escala está determinada por la cantidad de enlazador Sieber unido a la resina. Esta escala corresponde a aproximadamente 140 mg de la resina Sieber-Merrifield descrita anteriormente. Todos los procedimientos se pueden ^{modificar a escala más allá de la escala de} 0,10 ^{mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala.} Antes del acoplamiento de aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de hinchamiento de resina, descrito a continuación como "Procedimiento de hinchamiento". El acoplamiento de aminoácidos a una amina primaria N-terminal utilizó el "procedimiento de acoplamiento convencional" que se describe a continuación. El acoplamiento de aminoácidos a una amina secundaria N-terminal utilizó el "Procedimiento B de acoplamiento a amina secundaria", Los aminoácidos personalizados se acoplan mediante una adición manual en blanco del aminoácido mediante el "Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado" descrito a continuación, y se añade anhídrido de cloroacetilo a la posición final de la secuencia utilizando el "P ro ce d im ie n to de p ro te cc ió n fina l" de sc rito a con tinu ac ió n .

Procedimiento de hinchamiento:

A un recipiente de reacción de polipropileno Symphony se añadió resina Merrifield Sieber (140 mg, 0,100 mmol). La resina se lavó (hinchó) tres veces como sigue: al recipiente de reacción se le añadió DMF (2,5-5,0 ml) y la mezcla se ^{agitó periódicamente con burbujeo de N2 desde el fondo del recipiente de reacción durante} 10 ^{minutos antes de drenar} el disolvente a través de la frita.

Procedimiento de acoplamiento convencional:

La resina se lavó tres veces como sigue: al recipiente de reacción se le añadió DMF (2,5 ml) y la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N² desde el fondo del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de drenar el disolvente a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos y después la solución ^{se drenó a través de la frita. La resina se lavó} 6 ^{veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,5 ml) a través} del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq.), después HATU (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq.), y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 2,5 ml, 20 eq). La mezcla se agitó periódicamente ^{durante 30 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó} 6 ^{veces como} sigue: Se añadió DMF (2,5 ml) a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió Ac²O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:32,5 ml) la mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,5 ml) a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria:

La resina se lavó tres veces como sigue: al recipiente de reacción se le añadió DMF (2,5 ml) y la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N2 desde el fondo del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de drenar el disolvente a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 5 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos y después la solución ^{se drenó a través de la frita. La resina se lavó} 6 ^{veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,5 ml) a través} del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq.), después HATU (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq.), y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 2,5 ml, 20 eq). La mezcla se agitó periódicamente durante 60 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó con DMF (6,25 ml) que se añadió a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq.), después HATU (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq.), y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 2,5 ml, 20 eq.). La mezcla se agitó periódicamente durante 60 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,5 ml) a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió Ac²O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:32,5 ml) la mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,5 ml) a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado:

La resina se lavó tres veces como sigue: al recipiente de reacción se le añadió DMF (2,5 ml) y la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N² desde el fondo del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de drenar el disolvente a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq.), después HATU (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq.), y finalmente NMM (0,8 M en DMF, 2,5 ml, 20 eq). La mezcla se agitó ^{periódicamente durante seis horas, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó} 6 veces como sigue: Se añadió DMF (2,5 ml) a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió A^c2O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2,5 ml) la mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,5 ml) a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de protección terminal con caperuza:

La resina se lavó tres veces como sigue: al recipiente de reacción se le añadió DMF (2,5 ml) y la mezcla se agitó periódicamente con burbujeo de N² desde el fondo del recipiente de reacción durante 30 segundos antes de drenar el disolvente a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5-5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó una vez con DMF (2,5-5,0 ml). Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,5-5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó seis veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,5 ml) a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió NMM (0,8 M en DMF, 2,5 ml, 20 eq) seguido de la adición del anhídrido cloroacético (0,4 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó con DMF (6,25 ml) que se añadió a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió NMM (0,8 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq) seguido de la adición del anhídrido cloroacético (0,4 M en DMF, 2,5 ml, 10 eq). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó 6 veces como sigue: Se añadió DMF (2,5 ml) a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió Ac²O/DIPEA/DMF (v/v/v 1:1:3 2,5 ml) la mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,5 ml) a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DCM (2,5 ml) a través del fondo del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. A continuación, la resina resultante se secó con una corriente de nitrógeno durante 10 minutos.

Procedimientos Manuales

Acoplamiento de ácido bromoacético:

Todas las manipulaciones se realizaron manualmente a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. La resina se lavó tres veces como sigue: las resinas de cuatro síntesis Symphony a escala de 0,100 mmol utilizadas para preparar los intermedios de resina A y B se combinaron en un reactor de vidrio fritado de 50 ml equipado con una llave de paso de tres vías y se lavaron con DMF (10 ml) tres veces con agitación mediante burbujeo de N² desde el fondo del recipiente de reacción. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 10 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. El procedimiento se repitió una vez más. La resina se lavó seis veces con DMF (10 ml). Se añadió al recipiente de reacción una solución de ácido bromoacético (10,0 eq) en DMF (5,0 ml) y DIC (10,3 eq). La mezcla se agitó con burbujeo de N² durante una hora, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó con DMF (5 ml) cinco veces. La resina resultante se suspendió en DCM/DMF (3:2) y se dividió, en volumen, en siete partes iguales (0,057 mmol), que se transfirieron a jeringas fritadas de 25 ml. Cada alícuota de resina se usó directamente en la siguiente etapa de N-alquilación sobre resina.

Método A de N-Gly-Alquilación sobre resina:

Todas las manipulaciones se realizaron manualmente a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. A la resina de la etapa de bromoacetilación (0,057 mmol) se le añadió una solución de la amina requerida (10 eq.) y DIEA (11 eq.) en ^d M^f (ml) y la mezcla resultante se agitó durante una hora. La resina se lavó cinco veces con DMF (10 ml). El procedimiento se repitió una vez más. Cuando se usó la sal clorhidrato de la amina, se utilizaron 10 eq. adicionales de DIEA. El progreso de la reacción se controló mediante microescisión con TFA de pequeñas muestras de resina. Al finalizar la reacción, la resina N-alquilada se lavó cinco veces con DMF (10 ml) y se volvió a colocar en un recipiente de reacción Symphony para completar el ensamblaje de la secuencia en el sintetizador de péptidos Symphony.

Método B de N-Gly-Alquilación sobre resina:

Todas las manipulaciones se realizaron manualmente a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. A la resina de la etapa de bromoacetilación (0,057 mmol) se le añadió una solución de la amina requerida (10 eq.) y DIEA (11 eq.) en ^d M^f (ml) y la mezcla resultante se agitó durante una hora. La resina se lavó cinco veces con DMF (10 ml). El procedimiento se repitió una vez más. Cuando se usó la sal clorhidrato de la amina, se utilizaron 10 eq. adicionales de DIEA. A continuación, la resina se trató con una solución de amina (10-20 eq.) y DMAP (21 eq.) durante una a dieciséis horas. El progreso de la reacción se controló mediante microescisión con TFA de pequeñas muestras de resina. Al finalizar la reacción, la resina N-alquilada se lavó cinco veces con DMF (10 ml) y se volvió a colocar en un recipiente de reacción Symphony para completar el ensamblaje de la secuencia en el sintetizador de péptidos Symphony.

Método C de N-Gly-Alquilación sobre resina:

Todas las manipulaciones se realizaron manualmente a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. Este procedimiento se usó cuando la amina requerida era etilamina. A la resina de la etapa de bromoacetilación (0,057 mmol) se le añadió una solución de clorhidrato de etilamina (10 eq.) y DIEA (21 eq.) en DMF (ml) y la mezcla resultante se agitó durante una hora. La resina se lavó cinco veces con DMF (10 ml). El procedimiento se repitió una vez más. A continuación, la resina se trató con una solución 2 M de etilamina en THF (10 ml) durante dieciséis horas. El progreso de la reacción se controló mediante microescisión con TFA de pequeñas muestras de resina. Al finalizar la reacción, la resina N-alquilada se lavó cinco veces con DMF (10 ml) y se volvió a colocar en un recipiente de reacción Symphony para completar el ensamblaje de la secuencia en el sintetizador de péptidos Symphony.

Método D de N-Gly-Alquilación sobre resina

Todas las manipulaciones se realizaron manualmente a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. A la resina bromoacetilada (0,100 mmol) se añadió una solución de la amina requerida (10 eq., 1,0 mmol) y DBU (5 eq., 0,5 mmol) en DMF (3 ml) y la mezcla resultante se agitó durante tres horas. La resina se lavó una vez con DMF (5 ml). Este procedimiento se repitió una vez más, pero se dejó que la reacción prosiguiera durante 16 horas. La resina se lavó cuatro veces con DMF (4 ml) y DCM (4 ml) y después se volvió a colocar en un recipiente de reacción Symphony para completar el ensamblaje de la secuencia en el sintetizador de péptidos Symphony.

Método A de alquilación:

A la resina nosilada (0,186 g, 0,100 mmol) se le añadió una solución del alcohol correspondiente al grupo alquilante ^{(0,046 g,} 1,000 ^{mmol), trifenilfosfina (0,131 g, 0,500 mmol) y DIAD (0,097 ml, 0,500 mmol) en 3 ml de Th F, y la mezcla} de reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. La resina se lavó tres veces con THF (5 ml), tetrahidrofurano, y el procedimiento anterior se repitió 1-3 veces. El progreso de la reacción se controló mediante microescisión con TFA de pequeñas muestras de resina tratadas con una solución de 50 pl de TIS en 1 ml de TFA durante 1,5 horas.

Método de alquilación B:

La resina nosilada (0,100 mmol) se lavó tres veces con N-metilpirrolidona (NMP) (3 ml). Se añadió una solución de NMP (3 ml), bromuro de alquilo (20 eq, 2.000 mmol) y DBU (20 eq, 0,301 ml, 2,000 mmol) a la resina y la mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. La resina se lavó con NMP (3 ml) y el procedimiento anterior se repitió una vez más. El progreso de la reacción se controló mediante microescisión con TFA de pequeñas muestras de resina tratadas con una solución de 50 pl de TIS en 1 ml de TFA durante 1,5 horas.

Formación de nosilato:

^{Se añadió a la resina una solución de colidina (10 eq.) en DCM (2 ml), seguido de una solución de Nos-Cl} (8 ^{eq.) en} DCM (1 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. La resina se lavó tres veces con DCM (4 ml) y tres veces con DMF (4 ml). Los lavados alternos de DCM y DMF se repitieron tres veces, seguidos de una serie final de cuatro lavados con DCM (4 ml).

Eliminación de nosilato:

La resina (0,100 mmol) se hinchó usando tres lavados con DMF (3 ml) y tres lavados con NMP (3 ml). Se añadió una solución de NMP (3 ml), DBU (0,075 ml, 0,500 mmol) y 2-mercaptoetanol (0,071 ml, 1,000 mmol) a la resina y la mezcla de reacción se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de filtrar y lavar con NMP (3 ml), la resina se volvió a tratar con una solución de NMP (3 ml), DBU (0,075 ml, 0,500 mmol) y 2-mercaptoetanol (0,071 ml, 1,000 mmol) durante 5 minutos a temperatura ambiente. La resina se lavó tres veces con NMP (3 ml), cuatro veces con DMF (4 ml) y cuatro veces con DCM (4 ml), y se volvió a colocar en un recipiente de reacción Symphony para completar el ensamblaje de la secuencia en el sintetizador de péptidos Symphony.

Procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 5 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (5,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadieron 3,5 ml de una solución de DIPEA (40 eq) y cloruro de cloroacetilo (20 eq) en DMF. La mezcla se agitó periódicamente durante tres horas, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (5,0 ml) por la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 60 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente ^{tres veces como sigue: para cada lavado, Se añadió CH}2^{Ch (5,0 ml) a la parte superior del recipiente y la mezcla} resultante se agitó periódicamente durante 60 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. A continuación, la resina se secó a alto vacío.

Método A de CEM:

Todas las manipulaciones se realizaron con automatización en un sintetizador de péptidos por microondas CEM Liberty (CEM Corporation). Todos los procedimientos, a menos que se indique lo contrario, se realizaron en un tubo de polipropileno de 30 o 125 ml equipado con una frita de fondo en una unidad de microondas CEM Discovery. El tubo se conecta al sintetizador CEM Liberty a través del fondo y de la parte superior del tubo. Pueden añadirse DMF y DCM a través de la parte superior y del fondo del tubo, que lavan los lados del tubo por igual. Todas las soluciones se eliminan por el fondo del tubo, excepto cuando se transfiere la resina desde la parte superior. "Burbujeo periódico" describe un breve pulso de gas N2 a través de la frita inferior. Las soluciones de aminoácidos generalmente no se usaron más de tres semanas después de la preparación. Las soluciones de HATU se utilizaron a los 5 días de preparación. DMF = dimetilformamida; HCTU = 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; HATU = 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio; DIPEA = diisopropiletilamina; Sieber = Fmoc-amino-xanteno-3-iloxi, donde "3-iloxi" describe la posición y el tipo de conectividad con la resina de poliestireno. La resina utilizada es polímero Merrifield (poliestireno) con un enlazador Sieber (protegido con Fmoc en nitrógeno); malla 100-200, DVB al 1 %, carga de 0,71 mmol/g. Los aminoácidos comunes utilizados se enumeran a continuación con los grupos protectores de cadena lateral indicados entre paréntesis. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH

Los procedimientos del "Método CEM A" describen un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, donde la escala está determinada por la cantidad de enlazador Sieber unido a la resina. Esta escala corresponde a aproximadamente 140 mg de la resina Sieber-Merrifield descrita anteriormente. Todos los procedimientos se pueden ^{modificar a escala más allá de la escala de} 0,100 ^{mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala.} Antes del acoplamiento de aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de hinchamiento de resina, descrito a continuación como "Procedimiento de hinchamiento de resina". El acoplamiento de aminoácidos a una amina primaria N-terminal utilizó el "procedimiento de acoplamiento individual" que se describe a continuación. El acoplamiento de aminoácidos a una amina secundaria en el extremo N utilizó el "Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" descrito más adelante. El acoplamiento del grupo cloroacetilo al extremo N del péptido se describe mediante el "procedimiento de acoplamiento del cloruro de cloroacetilo" o "procedimiento de acoplamiento del ácido cloroacético" detallado anteriormente.

Procedimiento de hinchamiento de resina:

A un tubo cónico de polipropileno de 50 ml se añadió resina Merrifield:Sieber (140 mg, 0,100 mmol). Después se añadió DMF (7 ml) al tubo seguido de DCM (7 ml). A continuación, la resina se transfirió al recipiente de reacción desde la parte superior del recipiente. El procedimiento se repite adicionalmente dos veces. Se añadió DMF (7 ml) seguido de DCM (7 ml). Se permitió que la resina se hinchara con burbujeo de N2 desde el fondo del recipiente de reacción durante 15 minutos antes de drenar el disolvente a través de la frita.

Procedimiento de acoplamiento convencional:

Al recipiente de reacción que contenía resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió una solución de piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: lavado desde la parte superior con DMF (7 ml), seguido de lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq), HATU (0,5 M en DMF, 1,0 ml, 5 eq.), y DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml, 10 eq). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N2 durante 5 minutos a 75 °C para todos los aminoácidos, excepto Fmoc-Cys(Trt)-OH y Fmoc-His(Trt)-OH que se acoplan a 50 °C, la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: lavado desde la parte superior con DMF (7 ml), seguido de lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. Al recipiente de reacción se añadió una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó por burbujeo periódicamente durante 2 minutos a 65 °C, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: lavado desde la parte superior con DMF (7 ml), seguido de lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de doble par:

Al recipiente de reacción que contenía resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió una solución de piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: lavado desde la parte superior con DMF (7 ml), seguido de lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq), HATU (0,5 M en DMF, 1,0 ml, 5 eq.), y DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml, 10 eq). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N2 durante 5 minutos a 75 °C para todos los aminoácidos, excepto Fmoc-Cys(Trt)-OH y Fmoc-His(Trt)-OH que se acoplan a 50 °C, la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: lavado desde la parte superior con DMF (7 ml), seguido de lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 2,5 ml, 5 eq), HATU (0,5 M en DMF, 1,0 ml, 5 eq.), y DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml, 10 eq). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N2 durante 5 minutos a 75 °C para todos los aminoácidos, excepto Fmoc-Cys(Trt)-OH y Fmoc-His(Trt)-OH que se acoplan a 50 °C, la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: lavado desde la parte superior con DMF (7 ml), seguido de lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. Al recipiente de reacción se añadió una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó por burbujeo periódicamente durante 2 minutos a 65 °C, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: lavado desde la parte superior con DMF (7 ml), seguido de lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado:

Al recipiente de reacción que contenía resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió una solución de piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: lavado desde la parte superior con DMF (7 ml), seguido de lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. Al recipiente de reacción se añadió la solución de aminoácidos (1,25 ml a 5 ml, 2,5 eq a 10 eq) que contenía H^a TU (2,5 eq a 10 eq), y finalmente DIPEA (2 M en NMP, 0,5 ml a 1 ml, 20 eq). La mezcla se mezcló mediante burbujeo de N2 durante 5 minutos a 2 horas de 25 °C a 75 °C, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: lavado desde la parte superior con DMF (7 ml), seguido de lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. Al recipiente de reacción se añadió una solución de anhídrido acético:DIEA:DMF (10:1:89 v/v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó por burbujeo periódicamente durante 2 minutos a 65 °C, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: lavado desde la parte superior con DMF (7 ml), seguido de lavado con DMF (7 ml) desde el fondo y finalmente con lavado con DMF (7 ml) desde la parte superior. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 5,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cinco veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (4,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadieron 3,0 ml de una solución de DIPEA (4,0 mmol, 0,699 ml, 40 eq) y cloruro de cloroacetilo (2,0 mmol, 0,160 ml, 20 eq) en DMF. La mezcla se agitó periódicamente durante 12 a 18 horas, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (4,0 ml) por la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de ^{la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, Se añadió CH}2^{Ch (2,0 ml) a la} parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita.

Método A de desprotección global:

Todas las manipulaciones se realizaron manualmente a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. El procedimiento de "Método A de desprotección" describe un experimento realizado en una escala de 0,057-0,100 mmol, donde la escala está determinada por la cantidad de enlazador Rink o Sieber unido a la resina. El procedimiento se puede modificar a escala más allá de la escala de 0,057-0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Se preparó una "solución de desprotección" utilizando ácido trifluoroacético:triisopropilsilano:ditiotreitol (95:2,5:2,5 v:v:w) o ácido trifluoroacético:triisopropilsilano:ditiotreitol (96,5:2,5:1,0 v:v:w). La solución se enfrió previamente en hielo antes de añadirla a la resina. Se añadió la "solución de desprotección" (2,5-4,0 ml) a la resina en una jeringa fritada de 25 ml. La mezcla se mezcló en un agitador durante 60 min. La solución se filtró a través de la frita en éter dietílico frío (30 ml). El sólido precipitado se centrifugó durante 3 min. La solución sobrenadante se decantó y el sólido se resuspendió en éter dietílico (15 ml). Este procedimiento se repitió dos veces más. El sobrenadante se decantó y el sólido restante se secó a alto vacío. El péptido en bruto se obtuvo como un sólido de color blanco a blanquecino.

Método A de delación:

Todas las manipulaciones se realizaron manualmente a menos que se indique de otro modo. El procedimiento de "Método A de ciclación" describe un experimento realizado en una escala de 0,057-0,100 mmol. El péptido sólido en bruto se disolvió en una solución de acetonitrilo:tampón acuoso de bicarbonato de amonio 0,1 M (1:3 o 1:2, v:v; 30-40 ml), y el pH de la solución se ajustó cuidadosamente a 8,5-9,0 utilizando NaOH acuoso (1,0 M). A continuación, la solución se mezcló con un agitador durante 12 a 18 horas. La solución de reacción se concentró y después el residuo se disolvió en acetonitrilo: agua. Esta solución se sometió a purificación por HPLC de fase inversa para proporcionar el péptido cíclico deseado.

Preparación de resinas intermedias para los ejemplos 3003-3050

Preparación de la Resina Intermedia A:

A recipientes de reacción Symphony de 20 ml se añadió resina Sieber (0,100 mmol) y el recipiente se colocó en el sintetizador de péptidos Symphony. A continuación, se realizaron los siguientes procedimientos secuencialmente:

"Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina" con Fmoc-Gly-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Cys(Trt)-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional' con Fmoc-Leu-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional' con Fmoc-Ala-OH.

El grupo Fmoc se eliminó usando piperidina al 20 %/DMF (5 ml) durante 5 minutos con agitación periódica con nitrógeno. La resina se lavó con DMF (2,5 ml) y después se añadió piperidina al 20 %/DMF (5 ml) a la resina, y se continuó la agitación periódica con nitrógeno durante 5 minutos. La resina resultante se lavó seis veces con DMF (2,5 ml), después cinco veces con DCM (2,5 ml), y se usó como producto intermedio para los procedimientos de N-alquilación.

Preparación de la Resina Intermedia B:

A recipientes de reacción Symphony de 20 ml se añadió resina Sieber (0,100 mmol) y el recipiente se colocó en el sintetizador de péptidos Symphony. A continuación, se realizaron los siguientes procedimientos secuencialmente:

"Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina" con Fmoc-Gly-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Cys(Trt)-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional' con Fmoc-Leu-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc- Nle-OH.

El grupo Fmoc se eliminó usando piperidina al 20 %/DMF (5 ml) durante 5 minutos con agitación periódica con nitrógeno. La resina se lavó con DMF (2,5 ml) y después se añadió piperidina al 20 %/DMF (5 ml) a la resina, y se continuó la agitación periódica con nitrógeno durante 5 minutos. La resina resultante se lavó seis veces con DMF (2,5 ml), después cinco veces con DCM (2,5 ml), y se usó como producto intermedio para los procedimientos de N-alquilación.

Preparación de la Resina Intermedia C:

A recipientes de reacción Symphony de 20 ml se añadió resina Sieber (0,100 mmol) y el recipiente se colocó en el sintetizador de péptidos Symphony. A continuación, se realizaron los siguientes procedimientos secuencialmente:

"Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina" con Fmoc-Gly-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Cys(Trt)-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional' con Fmoc-Leu-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-nMetil-Nle-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento amina secundaria" con Fmoc-Nle-OH.

El grupo Fmoc se eliminó usando piperidina al 20 %/DMF (5 ml) durante 5 minutos con agitación periódica con nitrógeno. La resina se lavó con DMF (2,5 ml) y después se añadió piperidina al 20 %/DMF (5 ml) a la resina, y se continuó la agitación periódica con nitrógeno durante 5 minutos. La resina resultante se lavó seis veces con DMF (2,5 ml), después cinco veces con DCM (2,5 ml), y se usó como producto intermedio para los procedimientos de N-alquilación.

Preparación de la Resina Intermedia D:

A recipientes de reacción Symphony de 20 ml se añadió resina Sieber (0,100 mmol) y el recipiente se colocó en el sintetizador de péptidos Symphony. A continuación, se realizaron los siguientes procedimientos secuencialmente:

"Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina" con Fmoc-Gly-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Cys(Trt)-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Leu-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-nMetil-Nle-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-Ala-OH.

El grupo Fmoc se eliminó usando piperidina al 20 %/DMF (5 ml) durante 5 minutos con agitación periódica con nitrógeno. La resina se lavó con DMF (2,5 ml) y después se añadió piperidina al 20 %/DMF (5 ml) a la resina, y se continuó la agitación periódica con nitrógeno durante 5 minutos. La resina resultante se lavó seis veces con DMF (2,5 ml), después cinco veces con DCM (2,5 ml), y se usó como producto intermedio para los procedimientos de N-alquilación.

A recipientes de reacción Symphony de 20 ml se añadió resina Sieber (0,100 mmol) y el recipiente se colocó en el sintetizador de péptidos Symphony. A continuación, se realizaron los siguientes procedimientos secuencialmente:

"Método Symphony B Procedimiento de hinchamiento de resina" con Fmoc-Gly-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Cys(Trt)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional' con Fmoc-Leu-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-nMetil-Nle-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-nMetil-Nle-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-Trp(Boc)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Dab(Boc)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Trp(Boc)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Hyp(tBu)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-Glu(tBu)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-His(Trt)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Pro-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-Asn(Trt)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Ala-OH.

El grupo Fmoc se eliminó usando piperidina al 20 %/DMF (5 ml) durante 5 minutos con agitación periódica con nitrógeno. La resina se lavó con DMF (2,5 ml) y después se añadió piperidina al 20 %/DMF (5 ml) a la resina, y se continuó la agitación periódica con nitrógeno durante 5 minutos. La resina resultante se lavó seis veces con DMF (2,5 ml), después cinco veces con DCM (2,5 ml), y se usó como producto intermedio para los procedimientos de N-alquilación.

Preparación de la Resina Intermedia F:

A recipientes de reacción Symphony de 20 ml se añadió resina Sieber (0,100 mmol) y el recipiente se colocó en el sintetizador de péptidos Symphony. A continuación, se realizaron los siguientes procedimientos secuencialmente:

"Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina" con Fmoc-Gly-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Cys(Trt)-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional' con Fmoc-Leu-OH;

"Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-nMetil-Nle-OH.

El grupo Fmoc se eliminó usando piperidina al 20 %/DMF (5 ml) durante 5 minutos con agitación periódica con nitrógeno. La resina se lavó con DMF (2,5 ml) y después se añadió piperidina al 20 %/DMF (5 ml) a la resina, y se continuó la agitación periódica con nitrógeno durante 5 minutos. La resina resultante se lavó seis veces con DMF (2,5 ml) y después se transfirió a un tubo BioRad y se trató con la siguiente solución: Ácido bromoacético (10 eq., 1 mmol) y DIC (11 eq., 1,1 mmol) en DMF (3 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas. Después de la filtración y un lavado con DMF (3 ML), la resina se volvió a tratar con la siguiente solución: Ácido bromoacético (10 eq., 1 mmol) y DIC (11 eq., 1,1 mmol) en DMF (3 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas. Después de la filtración, la resina se lavó cinco veces con DMF (3,0 ml), después cinco veces con DCM (2,5 ml), y se usó como intermedio para los procedimientos de N-alquilación.

Preparación de la Resina Intermedia G:

A recipientes de reacción Symphony de 20 ml se añadió resina Sieber (0,100 mmol) y el recipiente se colocó en el sintetizador de péptidos Symphony. A continuación, se realizaron los siguientes procedimientos secuencialmente:

"Método Symphony B Procedimiento de hinchamiento de resina" con Fmoc-Gly-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Cys(Trt)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Leu-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-nMetil-Nle-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-nMetil-Nle-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-Trp(Boc)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Dab(Boc)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Trp(Boc)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Hyp(tBu)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-Glu(tBu)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-His(Trt)-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Pro-OH;

"Método Symphony B Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-Asn(Trt)-OH.

El grupo Fmoc se eliminó usando piperidina al 20 %/DMF (5 ml) durante 5 minutos con agitación periódica con nitrógeno. La resina se lavó con DMF (2,5 ml) y después se añadió piperidina al 20 %/DMF (5 ml) a la resina, y se continuó la agitación periódica con nitrógeno durante 5 minutos. La resina resultante se lavó seis veces con DMF (2,5 ml) y después se transfirió a un tubo BioRad y se trató con la siguiente solución: Ácido bromoacético (10 eq., 1 mmol) y DIC (11 eq., 1,1 mmol) en DMF (3 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas. Después de la filtración y un lavado con DMF (3 ML), la resina se volvió a tratar con la siguiente solución: Ácido bromoacético (10 eq., 1 mmol) y DIC (11 eq., 1,1 mmol) en DMF (3 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas. Después de la filtración, la resina se lavó cinco veces con DMF (3,0 ml), después cinco veces con DCM (2,5 ml), y se usó como intermedio para los procedimientos de N-alquilación.

Preparación de la Resina Intermedia H.

A cuatro recipientes de reacción Symphony se añadió resina Rink (mg, 0,100 mmol) y los recipientes se colocaron en el sintetizador de péptidos Symphony. A continuación, se realizaron los siguientes procedimientos secuencialmente:

"Método Symphony A: Procedimiento de hinchamiento de resina";

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Gly-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Cys(Trt)-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Leu-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-[N-Me]Nle-OH "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-Trp(Boc)-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Dab(Boc)-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Trp(Boc)-OH.

Las resinas resultantes se combinaron en un reactor de vidrio fritado de 50 ml y se lavaron con DMF como se describe en el procedimiento de acoplamiento con ácido bromoacético anterior.

Preparación de la Resina Intermedia I.

A cuatro recipientes de reacción Symphony se añadió resina Rink (mg, 0,100 mmol) y los recipientes se colocaron en el sintetizador de péptidos Symphony. A continuación, se realizaron los siguientes procedimientos secuencialmente:

"Método Symphony A: Procedimiento de hinchamiento de resina";

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Gly-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Cys(Trt)-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Leu-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-[N-Me]Nle-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-[N-Me]Nle-OH "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc-Trp(Boc)-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Dab(Boc)-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-Trp(Boc)-OH.

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc-t-Hyp(tBu)-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc- Glu(OtBu)-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc- His(Trt)-OH.

Las resinas resultantes se combinaron en un reactor de vidrio fritado de 50 ml y se lavaron con DMF como se describe en el procedimiento de acoplamiento con ácido bromoacético anterior.

Preparación del Ejemplo 3003

El Ejemplo 3003 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general que se describe a continuación, partiendo de la resina intermedia H. La resina intermedia A (0,400 mmol) se colocó en un reactor de vidrio fritado de 50 ml. A continuación, se realizaron los siguientes procedimientos secuencialmente:

procedimiento de "acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento del "Método C de N-Gly-Alquilación sobre resina";

"Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc" con Fmoc-Glu(OtBu)-OH; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc- His(Trt)-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional" con Fmoc- Pro-OH;

Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" se siguió con Fmoc-Asn(Trt)-OH; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional con Fmoc-[N-Me]Ala-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc- Tyr(tBu)-OH;

Procedimiento de protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético";

"Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 45-85 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 6,3 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 99 % utilizando la "Condición D para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,88 min; ESI-MS(+) m/z 935,1 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 934,4692 (M+2H)

Encontrado: 934,4674 (M+2H)

reparac n e empo

El ejemplo 3004 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3003, a partir de la resina intermedia H, utilizando los siguientes procedimientos generales: procedimiento de "Acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento de "Método A de N-Gly-Alquilación sobre resina"; procedimiento "Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria"; Procedimiento de "protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético"; "Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 50-90 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 6,6 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 95 % utilizando la "Condición D para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,87 min; ESI-MS(+) m/z 961,9 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 965,4771 (M+2H)

Encontrado: 965,4754 (M+2H)

Preparación del Ejemplo 3005

El ejemplo 3005 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3003, a partir de la resina intermedia H, utilizando los siguientes procedimientos generales: procedimiento de "Acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento de "Método B de N-Gly-Alquilación"; procedimiento "Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria"; Procedimiento de "protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético"; "Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 45-85 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 3,9 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 100 % utilizando la "Condición D para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,72 min; ESI-MS(+) m/z 950,4 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 949,4563 (M+2H)

Encontrado: 949,4547 (M+2H)

Preparación del Ejemplo 3006

El ejemplo 3006 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3003, a partir de la resina intermedia H, utilizando los siguientes procedimientos generales: procedimiento de "Acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento de "Método A de N-Gly-Alquilación sobre resina"; procedimiento "Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria"; Procedimiento de "protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético"; "Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 50-90 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 13,8 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 100 % utilizando las "Condiciones D y E para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,90 min; ESI-MS(+) m/z 950,5 (M+2H).

Condición E para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,58 min; ESI-MS(+) m/z 950,1 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 949,4745 (M+2H)

Encontrado: 949,4725 (M+2H)

Preparación del Ejemplo 3007

El ejemplo 3007 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3003, a partir de la resina intermedia H, utilizando los siguientes procedimientos generales: procedimiento de "Acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento de "Método B de N-Gly-Alquilación"; procedimiento "Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria"; Procedimiento de "protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético"; "Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 50-90 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 3,9 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 100 % utilizando la "Condición D para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,96 min; ESI-MS(+) m/z 969,3 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 968,4629 (M+2H)

Encontrado: 968,4617 (M+2H).

reparac n e empo

El Ejemplo 3008 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general que se describe a continuación, partiendo de la resina intermedia I. La resina intermedia B (0,400 mmol) se colocó en un reactor de vidrio fritado de 50 ml. A continuación, se realizaron los siguientes procedimientos secuencialmente:

procedimiento de "acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento del "Método A de N-Gly-Alquilación sobre resina";

"Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc" con Fmoc- Asn(Trt)-OH; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional con Fmoc-[N-Me]Ala-OH;

"Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria" con Fmoc- Tyr(tBu)-OH;

Procedimiento de protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético";

"Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 50-90 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación.

El rendimiento del producto fue de 10,6 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 99% utilizando la "Condición D para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,87 min; ESI-MS(+) m/z 974,3 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 973,4745 (M+2H)

Encontrado: 973,4729 (M+2H).

El ejemplo 3009 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3008, partiendo de la Resina Intermedia I, utilizando los siguientes procedimientos generales: procedimiento de "Acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento de "Método A de N-Gly-Alquilación sobre r e s in a procedimiento "Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria"; procedimiento de "protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético"; "Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 45-85 % de B durante 35 minutos, después mantener 5 minutos a 100% B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 9,1 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 100 % utilizando la "Condición E para análisis por LCMS".

Condición E para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,56 min; ESI-MS(+) m/z 958,0 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 957,4720 (M+2H)

Encontrado: 957,4693 (M+2H).

El ejemplo 3010 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3008, partiendo de la Resina Intermedia I, utilizando los siguientes procedimientos generales: procedimiento de "Acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento de "Método B de N-Gly-Alquilación"; procedimiento "Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria"; procedimiento de "protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético"; "Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 50-90 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 4,7 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 97 % utilizando la "Condición D para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,83 min; ESI-MS(+) m/z 977,7 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 976,4604 (M+2H)

Encontrado: 976,4592 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3011

El ejemplo 3011 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3003, a partir de la resina intermedia H, utilizando los siguientes procedimientos generales: procedimiento de "Acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento de "Método A de N-Gly-Alquilación sobre resina"; procedimiento "Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria"; Procedimiento de "protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético"; "Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 50-90 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 10,6 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 89 % utilizando las "Condiciones D y E para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,85 min; ESI-MS(+) m/z 942,9 (M+2H).

Condición E para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,47 min; ESI-MS(+) m/z 942,6 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 941,9723 (M+2H)

Encontrado: 941,9747 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3012

El ejemplo 3012 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3003, a partir de la resina intermedia H, utilizando los siguientes procedimientos generales: procedimiento de "Acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento de "Método A de N-Gly-Alquilación sobre resina"; procedimiento "Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria"; Procedimiento de "protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético"; "Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 45-85 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 3,4 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 95 % utilizando las "Condiciones D y E para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,95 min; ESI-MS(+) m/z (M+2H), no detectado.

Condición E para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,60 min; ESI-MS(+) m/z (M+2H), no detectado.

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 942,4667 (M+2H)

Encontrado: 942,4659 (M+2H).

El ejemplo 3013 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3008, partiendo de la Resina Intermedia I, utilizando los siguientes procedimientos generales: procedimiento de "Acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento de "Método C N-Gly-Alquilación"; procedimiento "Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria"; procedimiento de "protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético"; "Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 45-85 % de B durante 40 minutos, después mantener 5 minutos a 100% B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 5,8 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 97 % utilizando las "Condiciones D y E para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,80 min; ESI-MS(+) m/z 942,9 (M+2H);

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,56 min; ESI-MS(+) m/z 943,0 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 942,4667 (M+2H)

Encontrado: 942,4656 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3014

El ejemplo 3014 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3008, partiendo de la Resina Intermedia I, utilizando los siguientes procedimientos generales: procedimiento de "Acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento de "Método A de N-Gly-Alquilación sobre r e s in a procedimiento "Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria"; procedimiento de "protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético"; "Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 45-85 % de B durante 40 minutos, después mantener 5 minutos a 100% B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 10,2 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 90 % utilizando la "Condición D para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,75 min; ESI-MS(+) m/z 950,5 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 949,9722 (M+2H)

Encontrado: 949,9704 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3015

El ejemplo 3015 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3008, partiendo de la Resina Intermedia I, utilizando los siguientes procedimientos generales: procedimiento de "Acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento de "Método B de N-Gly-Alquilación"; procedimiento "Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria"; procedimiento de "protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético"; "Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 40-80 % de B durante 40 minutos, después mantener 5 minutos a 100% B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 3,4 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 90 % utilizando la "Condición D para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,72 min; ESI-MS(+) m/z 958,2 (M+2H).

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 957,4538 (M+2H)

Encontrado: 957,4521 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3016

El ejemplo 3016 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3008, partiendo de la Resina Intermedia I, utilizando los siguientes procedimientos generales: procedimiento de "Acoplamiento de ácido bromoacético"; procedimiento de "Método A de N-Gly-Alquilación sobre resina"; procedimiento "Método Symphony A: Acoplamiento de amina secundaria sin desprotección de Fmoc"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento convencional"; "Método Symphony A: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria"; procedimiento de "protección terminal con caperuza con anhídrido cloroacético"; "Método A de desprotección global"; "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 45-85 % de B durante 35 minutos, después mantener 5 minutos a 100% B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue de 4,0 mg, y su pureza estimada por análisis LCMS fue del 98 % utilizando las "Condiciones D y E para análisis por LCMS".

Condición D para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,85 min; ESI-MS(+) m/z, (M+2H) no detectado;

Condición E para análisis por LCMS: Tiempo de retención = 1,56 min; ESI-MS(+) m/z, (M+2H) no detectado.

ESI-HRMS(+) m/z:

Calculado: 950,4642 (M+2H)

Encontrado: 950,4629 (M+2H).

Ejemplo de preparación 3017

El Ejemplo 3017 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general que se describe a continuación, partiendo de la Resina Intermedia E. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos:

"Formación de nosilato", "Método de alquilación B", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 45-85 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El material se purificó adicionalmente mediante CL/EM preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos con B al 100 %; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 5,1 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 100 %.

Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,71 min.; ESI-MS(+) m/z 956,2 (M+2H);

Condición I para análisis por LCMS: tiempo de retención = 2,73 min.; ESI-MS(+) m/z 956,3 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3019

El ejemplo 3019 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la Resina Intermedia E. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método A de alquilación", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 45-85 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 10,7 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 97 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,73 min.; ESI-MS(+) m/z 987,2 (M+2H).

Condición I para análisis por LCMS: tiempo de retención = 2,81 min.; ESI-MS(+) m/z 987,2 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3020

El ejemplo 3020 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la resina intermedia A. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método de alquilación B", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional1', "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 14,1 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCM^s fue del 97 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,5 min.; ESI-MS(+) m/z 935,9 (M+2H).

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,26 min.; ESI-MS(+) m/z 935,0 (M+2H).

El ejemplo 3021 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la resina intermedia B. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método de alquilación B", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; Gradiente: 10-50% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 6,0 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 100 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,77 min.; ESI-MS(+) m/z 956,4 (M+2H).

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,47 min.; ESI-MS(+) m/z 956,3 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3022

El ejemplo 3022 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la resina intermedia D. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método A de alquilación", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de delación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 |jm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 35-75 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 10,7 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 100 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,26 min.; ESI-MS(+) m/z 942,8 (M+2H).

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,0 min.; ESI-MS(+) m/z 942,5 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3023

El ejemplo 3023 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la resina intermedia C. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método de alquilación B", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 jm ; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 6,9 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCM^s fue del 98 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,67 min.; ESI-MS(+) m/z 955,9 (M+2H).

Condición I para análisis por LCMS: tiempo de retención = 2,73 min.; ESI-MS(+) m/z 956,2 (M+2H).

El ejemplo 3024 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la resina intermedia D. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método de alquilación B", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 9,2 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 100 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,59 min.; ESI-MS(+) m/z 935,0 (M+2H).

Condición E para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,38 min.; ESI-MS(+) m/z 935,3 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3025

El ejemplo 3025 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la resina intermedia D. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método A de alquilación", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 |jm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 8,0 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCM^s fue del 95 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,5 min.; ESI-MS(+) m/z 950,0 (M+2H).

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,37 min.; ESI-MS(+) m/z 949,6 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3026

El ejemplo 3026 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la resina intermedia E. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método A de alquilación", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 jm ; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El material se purificó adicionalmente mediante CL/^e M preparativa con las condiciones siguientes: Columna: Waters CSH C18, 19 * 200 mm, partículas de 5 jm ; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 5-45 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 10,8 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 78 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,74 min.; ESI-MS(+) m/z 971,1 (M+2H).

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,37 min.; ESI-MS(+) m/z 971,1 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3028

El ejemplo 3028 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la resina intermedia D. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método de alquilación B", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 5-45% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 4,1 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMs fue del 82 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,31 min.; ESI-MS(+) m/z 950,0 (M+2H).

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,16 min.; ESI-MS(+) m/z 950,0 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3029

El ejemplo 3029 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la resina intermedia D. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método A de alquilación", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 50-90 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 2,7 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 78 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,97 min.; ESI-MS(+) m/z 967,7 (M+2H).

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,53 min.; ESI-MS(-) m/z 965,5 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3030

El ejemplo 3030 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la resina intermedia C. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método A de alquilación", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50 % de B durante 40 minutos, después mantener 5 minutos a 100% B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 3,0 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMs fue del 86 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,59 min.; ESI-MS(+) m/z 964,3 (M+2H).

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,27 min.; ESI-MS(+) m/z 964,3 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3032

El ejemplo 3032 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la resina intermedia E. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método A de alquilación", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El material se purificó adicionalmente mediante CL/e M preparativa con las condiciones siguientes: Columna: Waters CSH C18, 19 * 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 0-40 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 4,6 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 98 %. Condición H para análisis por L^c M^s : tiempo de retención = 1,69 min.; ESI-MS(+) m/z 963,4 (M+2H).

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,14 min.; ESI-MS(+) m/z 964,2 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3033

El ejemplo 3033 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, partiendo de la resina intermedia D. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Formación de nosilato", "Método A de alquilación", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 5-45% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El material se purificó adicionalmente mediante CL/e M preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 25-70 % de B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100% B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 0,6 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 85 %.

Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,42 min.; ESI-MS(+) m/z 943,0 (M+2H).

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,13 min.; ESI-MS(+) mlz 1883,9 (M+H).

El ejemplo 3037 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, comenzando con la resina intermedia F. Se realizaron secuencialmente los siguientes procedimientos: "Método D de N-Gly-Alquilación sobre resina", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 0-40% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 32,0 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMs fue del 94 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,25 min.; ESI-MS(+) m/z 943,2 (M+2H);

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,14 min.; ESI-MS(+) m/z 943,2 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3038

El ejemplo 3038 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, compuesto por los siguientes procedimientos generales, comenzando con la resina intermedia F: "Método D de N-Gly-Alquilación sobre resina", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional', "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 |jm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 11,9 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCM^s fue del 95 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,64 min.; ESI-MS(+) mlz 962,1 (M+2H);

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,33 min.; ESI-MS(+) m/z 962,0 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3041

El ejemplo 3041 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, compuesto por los siguientes procedimientos generales, a partir de la resina intermedia D: "Formación de nosilato", "Método A de alquilación", "Eliminación de nosilato", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional', "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 jm ; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 3,8 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMs fue del 81 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,68 min.; ESI-MS(+) m/z 970,0 (M+2H);

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,51 min.; ESI-MS(+) m/z 969,3 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3044

El ejemplo 3044 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 0001, compuesto por los siguientes procedimientos generales, comenzando con la resina intermedia G: "Método D de N-Gly-Alquilación sobre resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: waters CSH c-18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; Gradiente: 10-50 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El material se purificó adicionalmente mediante CL/EM preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 19,4 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 96 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,55 min.; ESI-MS(+) m/z 964,1 (M+2H);

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,32 min.; ESI-MS(+) m/z 963,8 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3045

El ejemplo 3045 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, compuesto por los siguientes procedimientos generales, comenzando con la resina intermedia G: "Método D de N-Gly-Alquilación sobre resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 15-55% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El material se purificó adicionalmente mediante CL/^e M preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 5-45 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 1,5 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 94 %. Condición H para análisis por Lc Ms : tiempo de retención = 1,60 min.; ESI-MS(+) m/z 957,1 (M+2H);

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,30 min.; ESI-MS(+) m/z 957,5 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3046

El ejemplo 3046 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, compuesto por los siguientes procedimientos generales, comenzando con la resina intermedia G: "Método D de N-Gly-Alquilación sobre resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50% B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El material se purificó adicionalmente mediante CL/^e M preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 10-50 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 7,2 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 100 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,71 min.; ESI-MS(+) m/z 982,9 (M+2H).

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,40 min.; ESI-MS(+) m/z 982,9 (M+2H).

Preparación del Ejemplo 3047

El ejemplo 3047 se preparó siguiendo la secuencia de síntesis general descrita para la preparación del ejemplo 3017, compuesto por los siguientes procedimientos generales, comenzando con la resina intermedia F: "Método D de N-Gly-Alquilación sobre resina", "Método Symphony B: Procedimiento de hinchamiento de resina", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento convencional', "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de amina secundaria", "Método Symphony B: Procedimiento de acoplamiento de aminoácidos personalizado", "Método Symphony B: Procedimiento de protección terminal con caperuza", "Método A de desprotección global", y "Método A de ciclación".

El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 |jm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 40-80 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El material se purificó adicionalmente mediante CL/EM preparativa con las condiciones siguientes: Columna: Waters CSH C18, 19 * 200 mm, partículas de 5 jm ; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 5-45 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 1,0 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 97 %. Condición H para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,44 min.; ESI-MS(+) m/z 936,1 (M+2H);

Condición J para análisis por LCMS: tiempo de retención = 1,21 min.; ESI-MS(+) m/z 936,4 (M+2H).

Procedimientos experimentales para los compuestos 5001, 5002, 5003

Datos analíticos:

Espectrometría de Masas: "ESI-MS(+)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización realizada en modo ion positivo; "ESI-MS(-)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización realizada en modo ion negativo; "ESI-HRMS(+)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización de alta resolución realizada en modo ion positivo; "ESI-HRMS(-)" significa espectrometría de masas de ionización por electronebulización de alta resolución realizada en modo ion negativo. Las masas detectadas se informan siguiendo las designación de unidades "m/z'. Los compuestos con masas exactas mayores de 1000 se detectaron a menudo como iones de doble carga o triple carga.

Condiciones de análisis A:

Columna: Waters BEH C18, 2,0 * 50 mm, partículas de 1,7 jm ; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo:agua con acetato de amonio 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 3 minutos, después mantener 0,5 minutos a 100 % B; Flujo: 1 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Condiciones de análisis B:

Columna: Waters BEH C18, 2,0 * 50 mm, partículas de 1,7 jm ; Fase móvil A: 5:95 de metanol:agua con acetato amónico 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol:agua con acetato amónico 10 mM; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % B durante 3 minutos, después mantener 0,5 minutos a 100 % B; Flujo: 0,5 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Condiciones de análisis C:

Columna: Waters Aquity BEH C18 2,1 X 50 mm partículas de 1,7 jm ; Fase móvil A: agua con TFA al 0,05 %; Fase móvil B: acetonitrilo con TFA al 0,05 %; Temperatura: 40 °C; Gradiente: 0 % B, 0-100 % de B durante 1,5 minutos, después mantener 0,5 minutos con B al 100 %; Flujo: 0,8 ml/min; Detección: UV a 220 nm.

Procedimientos generales:

Método Prelude A:

Todas las manipulaciones se realizaron con automatización en un sintetizador de péptidos Prelude (Protein Technologies). Todos los procedimientos, a menos que se indique lo contrario, se realizaron en un tubo de polipropileno de 10 ml equipado con una frita inferior; cuando la escala de reacción excedió de 0,100 mmol, se usó un tubo de polipropileno de 40 ml equipado con una frita inferior. El tubo se conecta al sintetizador de péptidos Prelude a través de la parte inferior y la parte superior del tubo. Pueden añadirse DMF y DCM a través de la parte superior del tubo, que lavan los lados del tubo por igual. Los reactivos restantes se agregan a través del fondo del tubo y pasan a través de la frita para contactar con la resina. Todas las soluciones se retiran a través del fondo del tubo. "Agitación periódica" describe un breve pulso de gas N2 a través de la frita inferior; el pulso dura aproximadamente 5 segundos y ocurre cada 30 segundos. Se usaron soluciones de cloruro de cloroacetilo en DMF en 24h de preparación. Las soluciones de aminoácidos generalmente no se usaron más de tres semanas después de la preparación. Las soluciones HATU se utilizaron dentro de los 5 días de preparación. DMF = dimetilformamida; HATU = 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio; DIPEA = diisopropiletilamina; Rink = (2,4-dimetoxifenil)(4-alcoxifenil)metanamina, donde "4-alcoxi" describe la posición y el tipo de conectividad con la resina de poliestireno. La resina utilizada es polímero Merrifield (poliestireno) con un enlazador Rink (protegido con Fmoc en nitrógeno); malla 100-200, DVB al 1 %, carga de 0,56 mmol/g. Los aminoácidos comunes utilizados se enumeran a continuación con los grupos protectores de cadena lateral indicados entre paréntesis.

Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; Fmoc-Dab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(tBu)-OH; Fmoc-Ile-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]Ala-OH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Sar-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH.

Los procedimientos del "Método Prelude A" describen un experimento realizado a una escala de 0,100 mmol, donde la escala está determinada por la cantidad de enlazador Rink unido a la resina. Esta escala corresponde a aproximadamente 178 mg de la resina Rink-Merrifield descrita anteriormente. Todos los procedimientos se pueden ^{modificar a escala más allá de la escala de} 0,100 ^{mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala.} Antes del acoplamiento de aminoácidos, todas las secuencias de síntesis de péptidos comenzaron con un procedimiento de hinchamiento de resina, descrito a continuación como "Procedimiento de hinchamiento de resina". El acoplamiento de aminoácidos a una amina primaria N-terminal utilizó el "procedimiento de acoplamiento individual" que se describe a continuación. El acoplamiento de aminoácidos a una amina secundaria en el extremo N utilizó el "Procedimiento de acoplamiento doble" descrito más adelante. El acoplamiento del cloruro de cloroacetilo al extremo N del péptido se describe mediante el "procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo" que se detalla a continuación.

Procedimiento de hinchamiento de resina:

A un recipiente de reacción en fase sólida de polipropileno de 10 ml se añadió resina Merrifield:Rink (178 mg, 0,100 mmol). La resina se lavó (hinchó) tres veces como sigue: al recipiente de reacción se añadió DMF (2,0 ml), ^{posteriormente la mezcla se agitó periódicamente durante} 10 ^{minutos antes de drenar el disolvente a través de la frita.}

Procedimiento de acoplamiento individual:

Al recipiente de reacción que contiene resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 eq.), después HATU (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 eq.), y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 0,5 ml, 4 eq). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes ^{de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió anhídrido acético (}2,0 ^{ml). La mezcla se} agitó periódicamente durante 10 minutos, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

Procedimiento de acoplamiento doble:

Al recipiente de reacción que contiene resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 eq.), después HATU (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 eq.), y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 0,5 ml, 4 eq). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó dos veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió el aminoácido (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 eq.), después HATU (0,2 M en DMF, 1,0 ml, 2 eq.), y finalmente DIPEA (0,8 M en DMF, 0,5 ml, 4 eq). La mezcla se agitó periódicamente durante 15 minutos, después la solución de reacción se drenó a través de la frita. La resina se lavó dos veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió anhídrido acético (2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 10 minutos, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina resultante se usó directamente en la siguiente etapa.

roce men o e acopamen o e coruro e coroace o:

Al recipiente de reacción que contenía la resina de la etapa previa se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió piperidina:DMF (20:80 v/v, 2,0 ml). La mezcla se agitó periódicamente durante 3 minutos y después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente seis veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,0 ml) a través de la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 30 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. Al recipiente de reacción se añadió DIPEA (0,8 M en DMF, 3,0 ml, 24 eq.), después cloruro de cloroacetilo (0,8 M en DMF, 1,65 ml, 13,2 eq). La mezcla se agitó periódicamente durante 30 minutos, después la solución se drenó a través de la frita. La resina se lavó sucesivamente tres veces como sigue: para cada lavado, Se añadió DMF (2,0 ml) por la parte superior del recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de la frita. La resina se ^{lavó sucesivamente cuatro veces como sigue: para cada lavado, Se añadió CH}2^{Ch (2,0 ml) a la parte superior del} recipiente y la mezcla resultante se agitó periódicamente durante 90 segundos antes de drenar la solución a través de ^{la frita. La resina resultante se puso bajo una corriente de N}2 ^{durante 15 minutos.}

Método Symphony A:

Esta colección de procedimientos es idéntica al "Método Prelude A" excepto lo indicado. Para todos los procedimientos, se utiliza un sintetizador de péptidos Symphony X (Protein Technologies) en el lugar de un sintetizador de péptidos Prelude y todos los reactivos se agregan a través de la parte superior del recipiente de reacción.

Procedimiento de hinchamiento de resina:

Este procedimiento es idéntico al "Método Prelude A: Procedimiento de hinchamiento de resina".

Procedimiento de acoplamiento individual:

Este procedimiento es idéntico al "Método Prelude A: Procedimiento de acoplamiento individual" excepto que la concentración de solución de DIPEA fue 0,4 M y 1,0 ml de esta solución se suministró a la reacción.

Procedimiento de acoplamiento doble:

Este procedimiento es idéntico al "Método Prelude A: Procedimiento de acoplamiento doble" excepto que la concentración de solución de DIPEA fue 0,4 M y 1,0 ml de esta solución se suministró a la reacción.

Procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo:

Este procedimiento es idéntico al "Método Prelude A: Procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo".

Método A de desprotección global:

Todas las manipulaciones se realizaron manualmente a menos que se indique lo contrario. El procedimiento de "Método A de desprotección global" describe un experimento realizado en una escala de 0,100 mmol, donde la escala está determinada por la cantidad de enlazador Rink unido a la resina. El procedimiento se puede modificar a escala más allá de la escala de 0,100 mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la escala. Se preparó una "solución de desprotección" combinando en un vial de vidrio de 40 ml ácido trifluoroacético (22 ml), fenol (1,325 g), agua (1,25 ml) y triisopropilsilano (0,5 ml). La resina se retiró del recipiente de reacción y transfirió a un vial de vidrio de 4 ml. Al vial se añadió la "solución de desprotección" (2,0 ml). La mezcla se mezcló vigorosamente en un agitador (1000 RPM durante 1 minuto, después 500 RPM durante 1-2 h). La mezcla se filtró a través de a filtro de jeringa de 0,2 ^{micrómetros y los sólidos se extrajeron con la "solución de desprotección" (}1,0 ^{ml) o TFA (}1,0 ^{ml). Al tubo de ensayo de 24 ml cargado con los filtrados combinados se añadió Et}2^{O (15 ml). La mezcla se mezcló vigorosamente} hasta que precipitó una cantidad significativa de un sólido blanco. La mezcla se centrifugó durante 5 minutos, después ^{la solución se decantó de los sólidos y descartó. Los sólidos se suspendieron en Et}2^{O (20 ml); después la mezcla se} centrifugó durante 5 minutos; y la solución se decantó de los sólidos y descartó. Por última vez, los sólidos se ^{suspendieron en Et}2^{O (20 ml); la mezcla se centrifugó durante 5 minutos; y la solución se decantó de los sólidos y} descartó para proporcionar el péptido crudo como sólido blanco a blanquecino.

Método A de ciclación:

Todas las manipulaciones se realizaron manualmente a menos que se indique lo contrario. El procedimiento de "Método B de ciclación" describe un experimento realizado en una escala de 0,100 mmol, donde la escala está determinada por la cantidad de enlazador Rink unido a la resina que se usó para generar el péptido. Esta escala no se basa en una determinación directa de la cantidad de péptido utilizada en el procedimiento. El procedimiento se ^{puede modificar a escala más allá de la escala de} 0,100 ^{mmol ajustando los volúmenes descritos por el múltiplo de la} escala. Los sólidos de péptido en bruto se disolvieron en MeCN:ac. NHaOAc 0,1 M (1:1) hasta un volumen total de 18-22 ml, y después la solución se ajustó cuidadosamente a pH = 8,5-9,0 usando NaOH acuoso (1,0 M). A ^{continuación, se dejó reposar la solución sin agitación durante} 6 ^{días. La solución de reacción se concentró y después} el residuo se disolvió en DMSO:MeOH. Esta solución se sometió a purificación por HPLC de fase inversa para proporcionar el péptido cíclico deseado.

Secuencia de síntesis general A:

"Secuencia de síntesis general A" describe una secuencia general de procedimientos que se usaron para proporcionar los péptidos cíclicos descritos en este documento. Para los fines de este procedimiento general, los procedimientos de "Método Symphony A" son intercambiables con los de "Método Prelude A". A un recipiente de reacción en fase sólida de polipropileno de 10 ml se añadió resina Rink-Merrifield (178 mg, 0,100 mmol) y el recipiente de reacción se colocó en el sintetizador de péptidos Prelude. Se siguió el "Método Prelude A: Procedimiento de hinchamiento de resina. Luego se realizó una serie de acoplamientos de aminoácido secuencialmente en el Prelude siguiendo "Método Prelude A: procedimiento de acoplamiento individual" si el N-terminal del péptido unido a resina fue una amina primaria o "Método Prelude A: procedimiento de acoplamiento doble" si el N-terminal del péptido unido a resina fue una amina secundaria. Se siguió el "Método Prelude A: procedimiento de acoplamiento de cloruro de cloroacetilo"; después se siguió el "Método A de desprotección global"; después se siguió el "Método de ciclación A".

Preparación de Ejemplo 5001

El ejemplo 5001 se preparó siguiendo la "Secuencia de síntesis general A. En la síntesis se utilizó ácido 2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)(2-(terc-butoxi)-2-oxoetil)amino)acético como indica la secuencia. El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 |jm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 50-90 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 7,8 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 100 ^%.

Condiciones de análisis A: Tiempo de retención = 1,48 min; ESI-MS(+) m/z 956,8,1 (M-2H)

Condiciones de análisis B: Tiempo de retención = 2,82 min; ESI-MS(+) m/z 958,2 (M+2H).

P rep a ra c ión de E je m p lo 5002

El ejemplo 5002 se preparó siguiendo la "Secuencia de síntesis general A". En la síntesis se utilizó ácido 2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilX2-(ferc-butoxi)-2-oxoetil)amino)acético como indica la secuencia. El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 |jm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 55-95 % de B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100% B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 2,2 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 81 %.

Condiciones de análisis A: Tiempo de retención = 1,51 min; ESI-MS(+) m/z 964,1 (M-2H)

Condiciones de análisis B: Tiempo de retención = 2,88 min; ESI-MS(+) m/z 966,5 (m 2H).

Preparación del Ejemplo 5003

El ejemplo 5003 se preparó siguiendo la "Secuencia de síntesis general A". En la síntesis se utilizó ácido 2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)(2-(terc-butoxi)-2-oxoetil)amino)acético como indica la secuencia. El material en bruto se purificó a través de LC/MS preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 |jm; Fase móvil A: 5:95 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de metanol: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 60-100 % de B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100% B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El material se purificó adicionalmente mediante CL/EM preparativa con las condiciones siguientes: Columna: XBridge Phenyl, 19 x 200 mm, partículas de 5 jm ; Fase móvil A: 5:95 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Fase móvil B: 95:5 de acetonitrilo: agua con acetato de amonio 10 mM; Gradiente: 5-40 % B durante 30 minutos, después mantener 5 minutos a 100 % B; Flujo: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se secaron mediante evaporación por centrifugación. El rendimiento del producto fue 4,0 mg y su pureza estimada mediante análisis por LCMS fue del 100 %.

Condiciones de análisis A: Tiempo de retención = 1,777 min; ESI-MS(+) m/z 972,40 (M+2H) Condición de análisis B: Tiempo de retención = 2,393 min; ESI-MS(+) mlz 968,25 (M-2H) ESI-HRMS(+) m/z: Calculado: 971,9344 (M+2H) Encontrado: 971,9311 (M+2H).

MÉTODOS PARA ENSAYAR LA CAPACIDAD DE LOS PÉPTIDOS MACROCÍCLICOS PARA COMPETIR POR LA UNIÓN DE PD-1 A PD-L1 UTILIZANDO ENSAYOS DE ENLACE DE FLUORESCENCIA HOMÓGENA RESUELTA EN TIEMPO (HTRF)

La capacidad de los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación para unirse a PD-L1 se investigó mediante un ensayo de unión de fluorescencia homogénea resuelta en tiempo de PD-1/PD-L1 (HTRF).

Métodos

Ensayos de fluorescencia homogénea resuelta en tiempo (HTRF) de unión de PD-1 soluble a PD-L1 soluble. PD-1 soluble y PD-L1 soluble se refieren a proteínas con truncamientos del extremo carboxilo que eliminan las regiones transmembrana y se fusionan con secuencias heterólogas, específicamente la porción Fc de la secuencia G de inmunoglobulina humana (Ig) o la etiqueta del epítopo de hexahistidina (His). Todos los estudios de unión se realizaron en un tampón de ensayo HTRF que consiste en dPBS suplementado con albúmina de suero bovino al 0,1 % (p/v) y Tween-20 al 0,05 % (v/v). Para el ensayo de unión de PD-1-Ig/PD-L1-His, los inhibidores se incubaron previamente con PD-L1-His (final 10 nM) durante 15 m en 4 j l de tampón de ensayo, seguido de la adición de PD-1-Ig (final 20 nM) en 1 j l de tampón de ensayo y una incubación adicional durante 15 m. Proteínas de fusión de PD-L1 humana, macacos cinomologos, ratón, u otras especies, se utilizaron. La detección de HTRF se logró usando el anticuerpo monoclonal anti-Ig marcado con criptato de europio (1 nM final) y el anticuerpo monoclonal anti-His marcado con aloficocianina (APC) (20 nM final). Los anticuerpos se diluyeron en tampón de detección de HTRF y se dispensaron 5 j l por encima de la reacción de unión. La reacción se dejó equilibrar durante 30 minutos y la señal (relación 665 nm/620 nm) se comprobó utilizando un fluorómetro EnVision. Se establecieron ensayos de unión adicionales entre PD-1-Ig/PD-L2-His (20 y 5 nM, respectivamente), CD80-His/PD-L1-Ig (100 y 10 nM, respectivamente) y CD80-His/CTLA4-Ig (10 y 5 nM, respectivamente). Los estudios de unión/competición entre Compuesto n.° 71 biotinilado y PD-L1-His humano se realizaron como sigue. Los inhibidores de péptidos macrocíclicos se incubaron previamente con PD-L1-His (10 nM final) durante 60 minutos en 4 j l de tampón de ensayo seguido de la adición de Compuesto n.° 71 biotinilado (0,5 nM final) en 1 j l de tampón de ensayo. Se permitió que la unión se equilibrara durante 30 minutos seguido de la adición de estreptavidina marcada con criptato de europio (2,5 pM final) y anti-His marcado con APC (20 nM final) en 5 j l de tampón HTRF. La reacción se dejó equilibrar durante 30 m y se obtuvo una señal (relación 665 nm/620 nm) usando un fluorómetro EnVision.

Proteínas recombinantes. PD-1 humana truncada con carboxilo (aminoácidos 25-167) con una etiqueta de epítopo de Ig humana C-terminal [hPD-1 (25-167)-3S-IG] y PD-L1 humana (aminoácidos 18-239) con una etiqueta de epítopo His C-terminal [hPD-L1 (19-239)-sitio de escisión de proteasa del virus de moteado en venas del tabaco (TVMV)-His] se expresó en células HEK293T y se purificó secuencialmente por cromatografía de afinidad de Proteína A recombinante y cromatografía de exclusión por tamaño. PD-L2-His humana (Sino Biologicals), CD80-His (Sino Biologicals), CTLA4-Ig (RnD Systems) se obtuvieron todas de fuentes comerciales.

Secuencia de PD-1-Ig humana recombinante

hPD1(25-167)-3S-IG

1 LD SED R PW N ? P T F S F A L L W TEG D N A TFTY S F S U T S E S F V L IIW Y F H S P S K

51 ¿T D K L A A F F E D R S G F G C D 2 R FR V Tv'LPlIG P. D FH M SW R A F. R ÍID S G T Y L 2G 101 f t lF f iA P K í tC 1 K FS LRAELP.V T ER R A E V FT A H P S P S ÍP P A G Q F Y O S F G G '^jG 151 G F E P K F S G R T H T S P F S E A P E L L G G S S V F L F F P K P K I'T L M l S F .T P E V T C W 201 V B V SH E PP E V KFIJWYVE GVE VHNAKTKE RE ^{e c y u s t y p} .^w SVLTVLHQE'K 251 L U 3 F J3 i 'F .C F V S M I A L E A P I E F T IS K A E G Í 'P P S P 1 V Y T L P P 5PD EL T K N G V 301 SLTC LV K G FY P S D 1 AV EN ES NG QPENNYKT T P E V L E .S rG S FF LY SK LT V D 351 KSP.WPQGUVF SCSVM HEALK U H Y T Q K S L S L 3PG K

(SEQ ID NO:1)

Secuencia de PD-L1-TVMV-His humana recombinante (PD-L1-His)

hPDL1(19-239)-TVMV-His

I FTVTVPfOLY ^{W 2 Y G S N M T I E C K F P V E K Q L} DLAALIVYWE MEDRNJJQFV

5 L HGEEDLKVQH ^{S S Y R Q R A R L L} KDQLS ^{L G N A A} LQITDVKLQD AGVYRCMISY

101 ^{G G A D Y K R I T V K V N A P Y N K I N O R I L V V D P V T} SEHELTCQAE ^{G Y r ' K A E V I W T}

151 ^{S S D H Q V L S G K} TTTTNSKREE ^{K L F K V T S T L R I N T T T N E I F Y} CTFRRLDPEE

201 ^{N K T A E L V I P E L P L A H P P N E R} TGSSETVRFQ GHHKHHH

(SEQ ID NO: 2)

Los resultados se muestran en la Tabla 1. Como se muestra, los péptidos macrocíclicos de la presente divulgación demostraron una potente inhibición de la actividad de unión de PD-1-Ig a PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His). Los intervalos son los siguientes: A = 0,10-10 pM; B = 0,01-0,099 pM; C = 0,005 - 0,0099 pM.

Tabla 1

(continuación)

Será evidente para un experto en la materia que la presente divulgación no se limita a los ejemplos ilustrativos anteriores. Por lo tanto, se desea que los ejemplos se consideren a todos los efectos ilustrativos y no restrictivos, haciendo referencia a las reivindicaciones adjuntas, en lugar de a los ejemplos anteriores.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto seleccionado de entre:



o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

2. Un compuesto de la reivindicación 1 o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para uso en inhibir el crecimiento, la proliferación o la metástasis de células cancerosas en un sujeto que lo necesita.

3. Un compuesto o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso según la reivindicación 2 en donde el cáncer se selecciona de entre melanoma, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón no microcítico escamoso (CPNM), CPNM no escamoso, cáncer colorrectal, cáncer de próstata resistente a la castración, cáncer de ovario, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de páncreas, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinomas del esófago, tracto gastrointestinal y mama, y tumores malignos hematológicos.

4. Un compuesto de la reivindicación 1 o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto que lo necesita.

5. Un compuesto o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso según la reivindicación 4 en donde la enfermedad infecciosa está causada por un virus.

6. Un compuesto o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso según la reivindicación 5 en donde el virus se selecciona de entre VIH, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, herpes virus e influenza.

7. Un compuesto según la reivindicación 1 o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de choque séptico en un sujeto que lo necesita.

8. Un compuesto o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2-7 que comprende además administrar un agente adicional antes de, después de, o simultáneamente con el compuesto de la reivindicación 1 o una sal terapéuticamente aceptable del mismo.

9. Un compuesto o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso según la reivindicación 8 en donde el agente adicional es un agente antimicrobiano, un agente antivírico, un agente citotóxico y/o un modificador de la respuesta inmunitaria.

10. Un compuesto o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso según la reivindicación 8 en donde el agente adicional es un inhibidor de HDAC.

11. Un compuesto o una sal terapéuticamente aceptable del mismo para su uso según la reivindicación 8 en donde el agente adicional es un agonista de TLR7 y/o TLR8.