ES2839998T3

ES2839998T3 - Métodos y sistemas para procesar partículas

Info

Publication number: ES2839998T3
Application number: ES15827324T
Authority: ES
Inventors: Michael Grisham; Curt I Civin; James C Sturm; Robert H Austin; Joseph D'silva; Yu Chen
Original assignee: University of Maryland Baltimore; Princeton University; GPB Scientific Inc; University of Maryland College Park
Current assignee: University of Maryland Baltimore; Princeton University; University of Maryland College Park; Curate Biosciences LLC
Priority date: 2014-08-01
Filing date: 2015-08-03
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2035-08-03
Also published as: EP3174976B1; DK3174976T3; EP3174976A1; EP3174976A4; WO2016019393A1

Abstract

Un dispositivo microfluídico para purificar primeras partículas de un tamaño predeterminado a partir de una muestra, comprendiendo el dispositivo: a) un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas hasta una pluralidad de salidas; b) una primera matriz de obstáculos de desplazamiento lateral determinista (DLD) dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos está desplazada lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de menos del tamaño predeterminado en la muestra a una segunda salida, y en donde: i) las superficies de dos obstáculos adyacentes en una fila de la matriz de obstáculos definen un espacio; ii) los dos obstáculos que definen un espacio tienen cada uno una sección transversal poligonal; y iii) los vértices de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apuntan uno hacia el otro en una dirección sustancialmente perpendicular a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos; c) una incubadora que comprende un primer portal conectado fluídicamente con la primera salida del dispositivo microfluídico y un segundo portal conectado fluídicamente con una segunda fuente de líquido.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y sistemas para procesar partículas

Antecedentes

Existe la necesidad de métodos mejorados para el tratamiento químico y/o enzimático, lavado y aislamiento de partículas (por ejemplo, células) obtenidas de muestras que comprenden partículas (por ejemplo, células). También existe la necesidad de métodos mejorados para aislar partículas, por ejemplo, células, a partir de una muestra.

Sumario

En un primer aspecto, la invención proporciona un dispositivo microfluídico para purificar primeras partículas de un tamaño predeterminado a partir de una muestra, comprendiendo el dispositivo: a) un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas hasta una pluralidad de salidas; b) una primera matriz de obstáculos de desplazamiento lateral determinista (DLD) dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de menos del tamaño predeterminado en la muestra a una segunda salida, y en donde: i) las superficies de dos obstáculos adyacentes en una fila de la matriz de obstáculos definen un espacio; ii) los dos obstáculos que definen un espacio tienen cada uno una sección transversal poligonal; y iii) los vértices de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apuntan uno hacia el otro en una dirección sustancialmente perpendicular a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos; c) una incubadora que comprende un primer portal conectado fluídicamente con la primera salida del dispositivo microfluídico y un segundo portal conectado fluídicamente con una segunda fuente de líquido.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para purificar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a partir de una muestra, en donde las primeras partículas comprenden leucocitos o células madre, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado y, opcionalmente, segundas partículas de menos del tamaño predeterminado; y b) pasar la muestra a través de al menos un dispositivo de la reivindicación 1, en donde: i) las primeras partículas purificadas entran en la incubadora desde la primera salida del dispositivo; ii) el segundo líquido también entra en la incubadora y comprende un reactivo seleccionado del grupo que consiste en un agente de unión que se une a un señalizador de la superficie celular; una sonda de ADN; una enzima; un fármaco; un agente de permeabilización y un fijador; y c) en donde dicha incubadora es una incubadora de flujo continuo.

En el presente documento se describen métodos, sistemas y dispositivos para el procesamiento de partículas que permitan automatizar y simplificar el proceso de preparación celular para el análisis de partículas.

También se describe en el presente documento un sistema para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el dispositivo: a) un primer canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; b) una primera matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de la primera matriz de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la primera matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de la muestra de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida, en donde el dispositivo está configurado de manera que las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían hacia una segunda corriente de flujo que fluye desde una segunda entrada a la primera salida mientras se desvían, en donde la segunda corriente de flujo comprende un reactivo; y c) un canal de incubadora de flujo continuo conectado fluídicamente con la primera salida, en donde el canal de incubadora de flujo continuo está conectado fluídicamente a un segundo canal, en donde el segundo canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el segundo canal comprende una segunda matriz de obstáculos. En algunos casos, el canal de incubadora de flujo continuo comprende un canal serpenteante. En algunos casos, el canal serpenteante comprende al menos 20 giros. En algunos casos, el canal serpenteante comprende una longitud total de al menos 30 mm. En algunos casos, el canal serpenteante comprende al menos 20 segmentos paralelos. En algunos casos, un segmento de los al menos 20 segmentos paralelos tiene aproximadamente 30 mm de longitud. En algunos casos, el canal serpenteante tiene una anchura de al menos 100 jm . En algunos casos, el canal serpenteante tiene una profundidad de al menos 100 |jm. En algunos casos, el canal de la incubadora de flujo continuo es un canal lineal. En algunos casos, en donde el canal de incubadora de flujo continuo comprende una estructura configurada para mover partículas en una corriente de flujo en el canal de incubadora de flujo continuo en relación con la corriente de flujo en el canal de incubadora de flujo continuo. En algunos casos, la estructura comprende una matriz de obstáculos configurados para desviar las partículas en una dirección que no es paralela a la primera corriente de flujo. En algunos casos, el canal de incubadora de flujo continuo comprende una entrada configurada para introducir una tercera corriente de flujo en el canal de la incubadora de flujo continuo. En algunos casos, el reactivo comprende un reactivo de marcaje, un agente de fijación, un reactivo de permeabilización o un tampón de lavado. En algunos casos, el sistema comprende además un equilibrador configurado para equilibrar la resistencia fluídica del sistema, en donde el equilibrador está conectado fluídicamente a la segunda salida. En algunos casos, el equilibrador está configurado para tener una resistencia fluídica que es sustancialmente la misma que la resistencia fluídica a través de la incubadora de flujo continuo. En algunos casos, el equilibrador comprende un control de presión fluídica. En algunos casos, el control de presión fluídica es capaz de generar presión negativa en el equilibrador. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo comprende un primer canal serpenteante y el equilibrador comprende un segundo canal serpenteante. En algunos casos, el segundo canal serpenteante está conectado a un tercer canal que comprende una matriz de obstáculos, en donde el tercer canal es sustancialmente similar al primer canal. En algunos casos, la primera corriente de flujo y la segunda corriente de flujo son paralelas entre sí. En algunos casos, el primer canal comprende al menos una pared separadora orientada paralela a al menos una de las corrientes de flujo, y dicha al menos una pared separadora está configurada para retrasar el flujo de partículas desviadas, en donde el retraso sirve para incrementar sustancialmente la cantidad de tiempo durante el que las partículas desviadas residen en una corriente de flujo y/o reducir sustancialmente la mezcla entre la primera corriente de flujo y la segunda corriente de flujo. En algunos casos, el sistema comprende además un componente analítico conectado fluídicamente al segundo canal. En algunos casos, el componente analítico es un clasificador de células.

En el presente documento se describe además un sistema para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el sistema (1) un dispositivo microfluídico, comprendiendo el dispositivo microfluídico (A) un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas hasta una pluralidad de salidas; y (B) una primera matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de la muestra de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida; y (2) una incubadora que comprende un primer portal conectado fluídicamente con la primera salida del dispositivo microfluídico y un segundo portal conectado fluídicamente con una segunda fuente de líquido. En algunos casos, la incubadora es un recipiente. En algunos casos, el recipiente es un vial de vidrio. En algunos casos, el sistema comprende además un controlador de flujo configurado para controlar el flujo en el dispositivo microfluídico o incubadora. En algunos casos, el primer portal de la incubadora es una primera entrada de la incubadora y el segundo portal es una segunda entrada de la incubadora. En algunos casos, el primer portal de la incubadora es una primera entrada de la incubadora y el segundo portal de la incubadora es una primera salida de la incubadora. En algunos casos, la segunda fuente de líquido comprende un reactivo de tratamiento. En algunos casos, la incubadora está configurada para agitar un líquido en la incubadora. En algunos casos, la incubadora está configurada para mezclar un líquido en la incubadora.

En el presente documento se describe además un dispositivo para purificar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el dispositivo una matriz de obstáculos dispuestos en filas, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos desvía diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de menos del tamaño predeterminado en la muestra a una segunda salida, en donde las superficies de dos obstáculos adyacentes en una fila de la matriz de obstáculos definen un espacio, en donde la forma del espacio es sustancialmente simétrica con respecto a un plano paralelo a la dirección del flujo, en donde el plano es equidistante del centro de la sección transversal de cada uno de los dos obstáculos en la fila, en donde los dos obstáculos que definen un espacio tienen una sección transversal poligonal, en donde los vértices de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apuntan uno hacia el otro en una dirección sustancialmente perpendicular a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos. En algunos casos, la sección transversal poligonal es una sección transversal de un cuadrilátero. En algunos casos, la sección transversal del cuadrilátero es una sección transversal cuadrada.

En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el método a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; b) pasar la muestra a través de un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el canal comprende una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado se desvían diferencialmente a una primera salida, y el dispositivo está configurado para desviar diferencialmente las segundas partículas de al menos un tamaño predeterminado a una segunda salida, en donde las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían a una segunda corriente de flujo que fluye desde una segunda entrada a la primera salida mientras se desvían, en donde la segunda corriente de flujo comprende un reactivo; y c) incubar las primeras partículas desviadas con el reactivo en un canal de incubadora de flujo continuo, en donde el canal de incubadora de flujo continuo está conectado fluídicamente con la primera salida, en donde el canal de incubadora de flujo continuo está conectado fluídicamente a un segundo canal, en donde el segundo canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el segundo canal comprende una segunda matriz de obstáculos. En algunos casos, el método comprende además hacer pasar las primeras partículas desviadas a través de una tercera corriente de flujo en el segundo canal. En algunos casos, la tercera corriente de flujo comprende un tampón de lavado. En algunos casos, el reactivo comprende un anticuerpo. En algunos casos, las primeras partículas comprenden células. En algunos casos, las células comprenden glóbulos blancos. En algunos casos, las primeras partículas desviadas están en la incubadora de flujo continuo durante un periodo de hasta 10 minutos.

En el presente documento se describe además un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; b) pasar la muestra a través de un dispositivo que comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal comprende una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado se desvían diferencialmente a una primera salida, y en donde el dispositivo está configurado para desviar diferencialmente las segundas partículas de menos de un tamaño predeterminado a una segunda salida; y c) incubar las primeras partículas desviadas diferencialmente en una incubadora, en donde la incubadora comprende un primer portal conectado fluídicamente con la primera salida del dispositivo microfluídico y un segundo portal conectado fluídicamente con una segunda fuente de líquido. En algunos casos, las primeras partículas comprenden células. En algunos casos, las células comprenden glóbulos blancos. En algunos casos, las primeras partículas desviadas están en la incubadora durante al menos 10 minutos.

En el presente documento se describe además un método para purificar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; y b) pasar la muestra a través de un dispositivo, comprendiendo el sistema una matriz de obstáculos dispuestos en filas, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado se desvían diferencialmente a una primera salida, y en donde el dispositivo está configurado para desviar diferencialmente segundas partículas de menos del tamaño predeterminado a una segunda salida, en donde las superficies de dos obstáculos adyacentes en una fila de la matriz de obstáculos definen un espacio, en donde la forma del espacio es sustancialmente simétrica con respecto a un plano paralelo a la dirección del flujo, en donde el plano es equidistante del centro de la sección transversal de cada uno de los dos obstáculos en la fila, en donde los dos obstáculos que definen un espacio tienen una sección transversal poligonal, en donde los vértices de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apuntan uno hacia el otro en una dirección sustancialmente perpendicular a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos. En algunos casos, un producto purificado de la primera salida comprende al menos el 60 % de las primeras partículas de la muestra. En algunos casos, un producto purificado de la primera salida comprende al menos el 80 % de las primeras partículas de la muestra. En algunos casos, la muestra comprende además segundas partículas de menos del tamaño predeterminado, en donde las segundas partículas de menos del tamaño predeterminado se desvían diferencialmente hacia la segunda salida. En algunos casos, un producto purificado de la primera salida comprende menos del 0,1 % de las segundas partículas de la muestra. En algunos casos, un producto purificado de la primera salida comprende menos del 0,01 % de las segundas partículas de la muestra. En algunos casos, la muestra es sangre entera. En algunos casos, las primeras partículas comprenden glóbulos blancos. En algunos casos, las segundas partículas comprenden glóbulos rojos. En algunos casos, el método comprende además analizar las primeras partículas usando un componente analítico. En algunos casos, el componente analítico es un clasificador de células. En algunos casos, la muestra se pasa a un caudal de aproximadamente 40 ml/h.

En el presente documento se describe además un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; b) marcar una o más moléculas en una superficie de las primeras partículas en donde no se realiza el marcaje de la etapa b) en el dispositivo microfluídico; c) pasar la muestra a través de un dispositivo microfluídico que comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el canal comprende una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida, en donde las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían para fluir en una segunda corriente de flujo que fluye desde una segunda entrada a la primera salida mientras se desvían, en donde la segunda corriente de flujo comprende un tampón de lavado; d) fijar las primeras partículas, en donde no se realiza la fijación en el dispositivo microfluídico; e) permeabilizar las primeras partículas, en donde no realiza la permeabilización en el dispositivo microfluídico; y f) etiquetar una o más moléculas dentro de las primeras partículas, en donde no se realiza el etiquetado en el dispositivo microfluídico, en donde la etapa c se realiza entre la etapa b) y la etapa d), entre la etapa d) y la etapa e), entre la etapa e y la etapa f, y/o después de la etapa e). En algunos casos, las primeras partículas son células. En algunos casos, las células son glóbulos blancos. En algunos casos, la muestra es sangre entera. En algunos casos, el canal comprende al menos una pared separadora orientada paralela a al menos una de las corrientes de flujo, y dicha al menos una pared separadora está configurada para retrasar el flujo de las primeras partículas desviadas, en donde el retraso sirve para incrementar sustancialmente la cantidad de tiempo durante el que las partículas desviadas residen en una corriente de flujo y/o reducir sustancialmente la mezcla entre la primera corriente de flujo y la segunda corriente de flujo. En algunos casos, el método comprende además analizar las primeras partículas usando un componente analítico. En algunos casos, el componente analítico es un clasificador de células.

En el presente documento se describe además un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; b) pasar la muestra a través de un dispositivo microfluídico que comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el canal comprende una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida, en donde las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían para fluir en una primera corriente de flujo de reacción que comprende un reactivo que marca una molécula en una superficie de las primeras partículas y una segunda corriente de flujo de reacción que comprende un tampón de lavado, en donde las corrientes de flujo de reacción fluyen desde la pluralidad de entradas a la pluralidad de salidas; c) fijar las primeras partículas, en donde no se realiza la fijación en el dispositivo microfluídico; d) permeabilizar las primeras partículas, en donde no realiza la permeabilización en el dispositivo microfluídico; y e) etiquetar una molécula dentro de las primeras partículas, en donde no se realiza el etiquetado en el dispositivo microfluídico. En algunos casos, las partículas son células. En algunos casos, las partículas son glóbulos blancos. En algunos casos, la muestra es sangre entera. En algunos casos, el canal comprende al menos una pared separadora orientada paralela a al menos una de las corrientes de flujo, y dicha al menos una pared separadora está configurada para retrasar el flujo de las partículas desviadas, en donde el retraso sirve para incrementar sustancialmente la cantidad de tiempo durante el que las partículas desviadas residen en una corriente de flujo y/o reducir sustancialmente la mezcla entre la primera corriente de flujo de reacción y la segunda corriente de flujo de reacción. En algunos casos, el método comprende además analizar las primeras partículas usando un componente analítico. En algunos casos, el componente analítico es un clasificador de células. En algunos casos, el método comprende además una etapa de lavado en un dispositivo microfluídico entre la etapa c) y la etapa d), entre la etapa d) y la etapa e), y/o después de la etapa e).

En el presente documento se describe además un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; b) marcar una molécula en una superficie de las primeras partículas; c) pasar la muestra a través de un dispositivo microfluídico que comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el canal comprende una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida, en donde las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían para fluir hacia una primera corriente de flujo de reacción que comprende un reactivo de fijación y un reactivo de permeabilización y la segunda corriente de flujo de reacción que comprende un tampón de lavado; y d) marcar una molécula dentro de las primeras partículas, en donde el marcaje de una molécula dentro de las primeras partículas no se realiza en el dispositivo microfluídico, en donde el marcaje de una molécula en la superficie de las primeras partículas no se realiza en un dispositivo microfluídico. En algunos casos, las partículas son células. En algunos casos, las células son glóbulos blancos. En algunos casos, la muestra es sangre entera. En algunos casos, el canal comprende al menos una pared separadora orientada paralela a al menos una de las corrientes de flujo, y dicha al menos una pared separadora está configurada para retrasar el flujo de las partículas desviadas, en donde el retraso sirve para incrementar sustancialmente la cantidad de tiempo durante el que las partículas desviadas residen en una corriente de flujo y/o reducir sustancialmente la mezcla entre la primera corriente de flujo de reacción y la segunda corriente de flujo de reacción. En algunos casos, el método comprende además analizar las primeras partículas usando un componente analítico. En algunos casos, el componente analítico es un clasificador de células. En algunos casos, se realiza una etapa de lavado después de la etapa d) en un dispositivo microfluídico.

En el presente documento se describe además un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; b) marcar una molécula en una superficie de las primeras partículas; c) fijar las primeras partículas; d) permeabilizar las primeras partículas; y e) pasar la muestra a través de un dispositivo microfluídico que comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el canal comprende una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida, en donde las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían para fluir a través de un primer flujo de reacción que comprende un reactivo que marca una molécula dentro de las primeras partículas y una segunda corriente de flujo de reacción que comprende un tampón de lavado, en donde el marcaje de la molécula en una superficie no se realiza en el dispositivo microfluídico, en donde la fijación no se realiza en el dispositivo microfluídico y en donde la permeabilización no se realiza en el dispositivo microfluídico. En algunos casos, las partículas son células. En algunos casos, las células son glóbulos blancos. En algunos casos, la muestra es sangre entera. En algunos casos, el canal comprende al menos una pared separadora orientada paralela a al menos una de las corrientes de flujo, y dicha al menos una pared separadora está configurada para retrasar el flujo de las partículas desviadas, en donde el retraso sirve para incrementar sustancialmente la cantidad de tiempo durante el que las partículas desviadas residen en una corriente de flujo y/o reducir sustancialmente la mezcla entre la primera corriente de flujo de reacción y la segunda corriente de flujo de reacción. En algunos casos, el método comprende además analizar las primeras partículas usando un componente analítico. En algunos casos, el componente analítico es un clasificador de células.

Breve descripción de los dibujos

Las nuevas características de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en la que se utilizan los principios de la invención y los dibujos adjuntos de los cuales:

La FIG. 1 es un diagrama esquemático de la sección transversal de un dispositivo de "matriz de impacto" que tiene obstáculos con forma de triángulos rectángulos dispuestos en un canal microfluídico. En la figura, el flujo de fluido alterna entre las direcciones de derecha a izquierda y de izquierda a derecha, como indica la flecha de dos puntas marcada como "Flujo de fluido". En esta matriz, los postes de triángulos rectángulos están dispuestos en una configuración de retícula de cuadrados que está inclinada con respecto a las direcciones de flujo de fluido. El ángulo de inclinación e (épsilon) se elige de manera que el dispositivo sea periódico. En esta realización, un ángulo de inclinación de 18,4 grados (1/3 radianes) hace que el dispositivo sea periódico después de tres filas. El espacio entre los postes se indica como G siendo S la longitud del lado del triángulo y P el campo de la matriz. Se muestran líneas de corriente que se extienden entre los postes, dividiéndose el flujo de fluido entre los postes en tres regiones ("tubos de corriente") de igual flujo volumétrico.

Las FIG. 2A, 2B y 2C, muestran las trayectorias de perlas esféricas de poliestireno de tres tamaños diferentes en una matriz del tipo que se muestra en la FIG. 1 ya que la dirección del flujo de fluido realiza un ciclo de ida y vuelta dos veces. La orientación de los postes de triángulos rectángulos se indica en la parte inferior derecha de cada figura. Los triángulos rectángulos isósceles tienen un lado de 6 micrómetros con una separación de poste a poste de 10 micrómetros y un ángulo de inclinación de 5,71 grados (0,1 radianes). Los tamaños de partículas son 1,1 micrómetros en FIG. 2A, 3,1 micrómetros en la FIG. 2B y 1,9 micrómetros en FIG. 2C. Las partículas mostradas en las FIGS. 2A y 2B deshacen su camino cuando cambia la dirección del fluido, siguiendo generalmente las partículas en la FIG. 2A la dirección del fluido en cada dirección de flujo de fluido y siguiendo generalmente las partículas en la FIG. 2B la dirección de la matriz en cada dirección de flujo de fluido. Por el contrario, la trayectoria de las partículas mostradas en la FIG. 2C varía con la dirección del flujo de fluido. En la FIG. 2C, las flechas pequeñas indican la dirección del fluido a lo largo de la trayectoria de las partículas; las partículas generalmente siguen la dirección del fluido cuando la dirección del flujo de fluido es de izquierda a derecha y generalmente siguen la dirección de la matriz cuando la dirección del flujo de fluido es de derecha a izquierda.

La FIG. 3A muestra trayectorias simuladas de partículas de 1,0 micrómetros de diámetro que se mueven a través de una matriz de postes de triángulos rectángulos dispuestos en un canal de flujo microfluídico en el que el flujo de fluido alterna entre las direcciones de derecha a izquierda y de izquierda a derecha. La FIG. 3B muestra trayectorias simuladas de partículas de 3,6 micrómetros de diámetro que se mueven a través de una matriz de postes de triángulos rectángulos dispuestos en un canal de flujo microfluídico en el que el flujo de fluido alterna entre las direcciones de derecha a izquierda y de izquierda a derecha. La FIG. 3C muestra trayectorias simuladas de partículas de 3,2 micrómetros de diámetro que se mueven a través de una matriz de postes de triángulos rectángulos dispuestos en un canal de flujo microfluídico en el que el flujo de fluido alterna entre las direcciones de derecha a izquierda y de izquierda a derecha. En estos diagramas, las partículas de 1,0 micrómetros de diámetro son más pequeñas que el tamaño crítico de la matriz en las dos direcciones de flujo de fluido, las partículas de 3,6 micrómetros de diámetro son más grandes que el tamaño crítico de la matriz en las dos direcciones de flujo de fluido y las partículas de 3,2 micrómetros de diámetro son más pequeñas que el tamaño crítico de la matriz en una dirección de flujo (de derecha a izquierda), pero más grandes que el tamaño crítico de la matriz en la otra dirección de flujo (de izquierda a derecha).

La FIG. 4A es un gráfico que muestra el flujo de velocidad normalizado simulado entre dos postes de triángulos rectángulos.

La FIG.4B es un gráfico que muestra los perfiles de velocidad normalizados a través de espacios entre obstáculos redondos (curva que es simétrica con respecto a Y/Espacio = 0,5) y obstáculos con forma de triángulo rectángulo en una matriz del tipo que se muestra en la FIG. 1 (e = 1/3 radianes). En estos perfiles, las líneas verticales delimitan las áreas debajo de cada curva en tercios, que representan tres tubos de corriente de igual flujo volumétrico. La curva en el caso de los obstáculos redondos demuestra que un tercio del flujo volumétrico entre obstáculos redondos tiene lugar en un tubo de corriente que es adyacente a cualquier obstáculo y tiene una anchura que es el 38 % de la anchura del espacio. La curva en el caso de los obstáculos de triángulos rectángulos demuestra que un tercio del flujo volumétrico entre obstáculos triangulares tiene lugar en un tubo de corriente que es adyacente al lado plano de uno de los dos obstáculos triangulares y tiene una anchura que es el 42 % de la anchura del espacio y que otro tercio tiene lugar en un tubo de corriente que es adyacente al lado agudo del par de obstáculos triangulares y tiene una anchura que es el 34 % de la anchura del espacio.

La FIG. 5 es un gráfico del diámetro crítico predicho frente al ángulo de inclinación de la matriz (e) para matrices de obstáculos triangulares (línea inferior) y circulares (línea superior).

La FIG. 6A es un diagrama esquemático de la sección transversal de un dispositivo de "matriz de impacto" que tiene obstáculos con forma de triángulos equiláteros dispuestos en un canal microfluídico. En la figura, el fluido fluye en la dirección de izquierda a derecha, como indica la flecha marcada como "Líquido". En esta matriz, los postes de triángulo equilátero están dispuestos en una configuración de retícula de paralelogramos que está inclinada con respecto a las direcciones de flujo de fluido. También se pueden usar otras configuraciones de retícula (por ejemplo, cuadrada, rectangular, trapezoidal, hexagonal, etc.). El ángulo de inclinación e (épsilon) se elige de manera que el dispositivo sea periódico. En esta realización, un ángulo de inclinación de 18,4 grados (1/3 radianes) hace que el dispositivo sea periódico después de tres filas. El ángulo de inclinación e también representa el ángulo por el que se desvía la dirección de la matriz con respecto a la dirección del flujo de fluido. El espacio entre los postes se indica como G siendo S la longitud del lado del triángulo equilátero. Se muestran líneas de corriente que se extienden entre los postes, dividiéndose el flujo de fluido entre los postes en tres regiones ("tubos de corriente") de igual flujo volumétrico. Una partícula relativamente grande (que tiene un tamaño mayor que el tamaño crítico para la matriz) sigue el ángulo de inclinación de la matriz cuando el flujo de fluido está en la dirección que se muestra. Una partícula relativamente pequeña (que tiene un tamaño menor que el tamaño crítico para la matriz) sigue la dirección del flujo de fluido.

La FIG. 6B es una comparación del flujo de velocidad normalizado entre dos postes de triángulo equilátero (panel izquierdo) y el flujo de velocidad normalizado entre dos postes circulares (panel derecho). Las porciones sombreadas representan una proporción igual de área bajo la curva, que demuestran que el radio crítico para las partículas que fluyen más allá del punto del triángulo es significativamente más pequeño (<15 % de la anchura del espacio) que el radio crítico para las partículas que fluyen más allá del poste redondo (>20 % de la anchura del espacio).

La FIG. 7 es un gráfico que ilustra los efectos hipotéticos y experimentales del ángulo de inclinación ("Inclinación de matriz" en la FIG. 7) sobre el desplazamiento de las partículas.

La FIG. 8 es un gráfico que ilustra el efecto del ángulo de inclinación ("Inclinación de matriz" en la FIG. 8) sobre la longitud del espacio G. Gt se refiere a la longitud del espacio entre los postes triangulares, y Ge se refiere a la longitud del espacio entre postes redondos.

La FIG. 9 es un gráfico que ilustra el efecto de la presión aplicada sobre la velocidad de las partículas en matrices de protuberancias que tienen postes triangulares (los datos se muestran como triángulos) y matrices de protuberancias que tienen postes circulares (los datos se muestran como círculos).

La FIG. 10 es un gráfico que ilustra el efecto de la redondez del borde del obstáculo (expresada como r/S) sobre el tamaño crítico exhibido en el lado de un espacio limitado por el borde.

La FIG. 11 es una imagen de una matriz construida como se describe en el presente documento.

La FIG. 12 ilustra el movimiento de las partículas en una matriz de impacto de trinquete del tipo descrito en el presente documento.

La FIG. 13 ilustra el movimiento de las partículas en una matriz de impacto de trinquete del tipo descrito en el presente documento.

La FIG. 14 ilustra el movimiento de las partículas en una matriz de impacto de trinquete del tipo descrito en el presente documento.

La FIG. 15 es un gráfico que compara las características de tamaño crítico de los postes redondos y triangulares. La FIG. 16 muestra métodos convencionales (izquierda) para procesar células (por ejemplo, leucocitos) y dos realizaciones de los métodos descritos en el presente documento (verticalmente en el centro y verticalmente en la derecha)

La FIG. 17A muestra una matriz DLD diseñada para "tropezar" con E. coli (Tamaño >1 pm). Vista superior: un ejemplo de mecanismo de DLD que muestra una entrada uniforme de bacterias E. coli fluorescentes (blancas) en una matriz de postes inclinados que se tropiezan y dirigen hacia abajo formando un ángulo con el flujo de fluido, para conseguir una alta concentración contra la pared inferior de la matriz y posteriormente recogerse, mientras que el fluido se mueve horizontalmente.

La FIG. 17B muestra una matriz DLD que tiene una primera corriente que comprende una corriente de muestra y una segunda corriente que comprende un tampón. Vista esquemática: Lavado de glóbulos blancos (WBC) por extensión de la FIG. 17A añadiendo una corriente de tampón de entrada. Solo los glóbulos blancos (WBC) (más grandes que los glóbulos rojos (RBC)) descienden hacia la corriente de tampón y la pared inferior.

La FIG. 17C muestra una imagen de lapso de tiempo de leucocitos que se concentran y se recogen de una matriz DLD similar a la matriz DLD que se muestra en FIG. 17B. Imagen de lapso de tiempo de glóbulos blancos (WBC) (azules por la tinción nuclear) que se recogen de una corriente de sangre completa (rojiza/blanca) que se desplaza de izquierda a derecha usando un chip con el diseño de la Figura 17B.

La FIG 18A muestra un chip de "lavado de coches" de múltiples corrientes para el procesamiento químico secuencial múltiple. Vista esquemática del concepto de lavado de coches para procesamiento químico secuencial múltiple en chip para preparación celular. Un solo proceso de flujo continuo combina todas las etapas en la Figura 42 en un solo chip.

La FIG 18B muestra una imagen fluorescente de falso color de lapso de tiempo de plaquetas que descienden en una matriz DLD. Demostración de células en movimiento (en este caso, plaquetas) por DLD a través de una "corriente de procesamiento" y en una corriente de tampón de lavado como en la FIG. 18A. Imagen fluorescente de falso color de lapso de tiempo de plaquetas que descienden en una matriz DLD a través de 3 corrientes paralelas en el chip para marcaje y lavado en el chip. Corriente superior: entrada de plaquetas no marcadas (invisibles); Corriente media: marcador de CD41 conjugado con ficoeritrina; Corriente inferior: plaquetas marcadas en una corriente de tampón de lavado.

La FIG. 19 muestra vistas de entrada y salida de una matriz DLD de "lavado de coches" de múltiples corrientes para múltiples procesos químicos y/o enzimáticos secuenciales.

La FIG. 20A muestra perlas de l0 pm que fluyen desde una porción de entrada, intermedia y de salida de una matriz DLD de "lavado de coches" de múltiples corrientes como se muestra en la FIG. 19.

La FIG. 20B muestra perlas de 2 pm que fluyen desde una porción intermedia y de salida de una matriz DLD de "lavado de coches" de múltiples corrientes como se muestra en la FIG. 19.

La FIG. 21 muestra un esquema de la difusión entre una corriente de reactivo y una corriente de flujo paralelo adyacente a medida que las corrientes de flujo paralelas fluyen al interior de un canal microfluídico.

La FIG. 22 muestra un esquema de un modelo de tiempo de incubación y difusión de fuente limitada.

La FIG. 23 muestra la relación entre el tiempo de incubación y la velocidad de flujo (parte superior), así como la relación entre la concentración y la velocidad de flujo (parte inferior) en un chip de "lavado de coches" como se representa en las FIG. 18A y 19.

La FIG. 24A muestra un modelo de chip de "lavado de coches" que comprende una corriente de muestra, corriente de reactivo y corriente tampón que comprende además un par de paredes separadoras opuestas que se extienden hacia el interior de la matriz de impacto y separan la corriente de reactivo de la corriente de tampón. La FIG. 24B muestra las vistas de entrada, intermedia y de salida de una matriz DLD de "lavado de coches" de múltiples corrientes como se describe en FIG. 24A que comprende un par de paredes separadoras opuestas que se extienden hacia la matriz de obstáculos para el procesamiento químico secuencial múltiple.

La FIG. 25 muestra los resultados del paso de una muestra que comprende perlas marcadas de 2 pm y 10 pm a través de una matriz DLD de "lavado de coches" que comprende un par de paredes separadoras opuestas como se representa en las FIG. 24A y B.

La FIG. 26 muestra una comparación de la contaminación en la parte de salida de una matriz DLD de "lavado de coches" con paredes separadoras opuestas (modificada) y sin ellas (original).

La FIG. 27A muestra un modelo de chip de "lavado de coches" que comprende una corriente de muestra y 2 corrientes de tampón adyacentes que comprenden además un par de paredes separadoras opuestas que se extienden hacia el interior de la matriz de impacto y separan las dos corrientes de tampón. La FIG. 27B muestra las vistas de entrada, intermedia y de salida de una matriz DLD de "lavado de coches" de múltiples corrientes como se describe en FIG. 27A que comprende un par de paredes separadoras opuestas que se extienden al interior de la matriz de obstáculos para el procesamiento químico secuencial múltiple.

La FIG. 28 muestra los resultados del paso de una muestra de sangre a través de una matriz DLD de "lavado de coches" que comprende un par de paredes separadoras opuestas como se representa en las FIG. 27A y B. La FIG.29A muestra vistas de áreas de posible obstrucción en las porciones de entrada, intermedia y de salida de la matriz de obstáculos en la matriz DLD de la FIG. 28 después de hacer fluir una muestra de sangre a través de la matriz DLD que se muestra en la FIG.28. La FIG. 29B muestra vistas ampliadas de áreas de posible obstrucción en las partes intermedia y de salida de la matriz de obstáculos que se muestra en la FIG. 29A.

La FIG. 30 muestra las entradas y salidas de cuando se hace pasar una muestra de sangre a través de cualquiera de las matrices de DLD de "lavado de coches" proporcionadas en el presente documento.

La FIG. 31 muestra la relación entre el tiempo de incubación y la velocidad de flujo (parte superior) así como la relación entre la concentración y la velocidad de flujo (parte inferior) en un chip de "lavado de coches" con un par de paredes separadoras opuestas (diseño modificado; FIG. 27A y B) y sin ellas (Ver. 1 chip; FIG. 19).

La FIG. 32 muestra un modelo de un chip de "lavado de coches" que comprende una corriente de muestra, dos corrientes de reactivos y dos corrientes de tampón que comprenden además tres pares de paredes separadoras opuestas que se extienden hacia el interior de la matriz de impacto y separan las corrientes de reactivo de las corrientes de tampón.

La FIG. 33A muestra una matriz DLD con un sistema de limpieza en el chip, que comprende entradas y salidas en el par de paredes opuestas para el confinamiento de fluidos. La FIG. 33B muestra el bloqueo del sistema de limpieza en el chip mientras la matriz DLD está en el modo de impacto (por ejemplo, muestra o fluido que comprende partículas (por ejemplo, células) que fluyen de izquierda a derecha a través de la matriz DLD). La FIG.

33C muestra el bloqueo del canal que comprende la matriz DLD durante la limpieza de la matriz DLD usando un sistema de limpieza en el chip como se describe en el presente documento.

La FIG. 34A muestra perlas obstruidas en una matriz DLD que comprende un sistema de limpieza en el chip como se representa en las FIG. 33A-C después del flujo de perlas marcadas a través de la matriz DLD durante el modo de impacto. La FIG. 34B muestra una porción de la matriz DLD después del modo de impacto antes del modo de limpieza (parte superior) y después del modo de limpieza (parte inferior).

La FIG.35 muestra un diagrama simplificado del proceso mediante el cual puede producirse la obstrucción inducida por plaquetas de una matriz DLD como se proporciona en el presente documento.

La FIG. 36 muestra los resultados de experimentos que identifican integrinas dependientes de calcio y activación plaquetaria inducida por trombina como contribuyentes dominantes a la obstrucción inducida por plaquetas de matrices DLD proporcionadas en el presente documento. El eje x muestra el volumen de sangre que se ha procesado a través de la matriz, mientras que el eje y muestra la fluorescencia de los leucocitos atascados u obstruidos en la matriz. realmente se procesó sangre diluida, pero este eje x representa la cantidad de sangre sin diluir que se usó antes de la dilución y que fluyó a través de la matriz, que tenía postes triangulares de 40 micrómetros y una anchura de separación de 27 micrómetros.

La FIG. 37 muestra imágenes de obstrucción en matrices con tres parámetros diferentes para (a) EDTA 1 mM y (b) EDTA 5 mM y PPACK 40 pM. El volumen de sangre a través de cada canal y la velocidad de flujo fueron los mismos en (a) y (b). La dirección del flujo fue de izquierda a derecha. El color verde indicaba leucocitos atascados u obstruidos.

La FIG. 38 muestra el efecto del caudal y la dilución de la sangre sobre la obstrucción de una matriz DLD proporcionada en el presente documento.

La FIG. 39 ilustra una realización de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos que comprende 14 canales.

La FIG. 40 ilustra una realización de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos que comprende 2 canales.

La FIG. 41 ilustra un instrumento de sobremesa y un módulo de separación de células desechable. Se pueden usar hasta 8 módulos de separación de células en el instrumento de sobremesa, con hasta 10 muestras por módulo. El instrumento puede ser autónomo o puede estar integrado en línea con otro equipo. Un módulo de separación de células desechable puede comprender un puerto de entrada de muestra de sangre (en algunos casos con una característica de recinto seguro), una cámara de matriz de micropostes, un puerto de salida de producto, un puerto de salida de residuos (en algunos casos con una función de contención segura incorporada y un puerto de entrada de tampón).

La FIG. 42 ilustra métodos convencionales (izquierda/1a columna) para procesar células (por ejemplo, leucocitos) y cuatro realizaciones de los métodos descritos en el presente documento (verticalmente en la segunda columna hasta verticalmente las columnas de la derecha).

La FIG. 43 ilustra citogramas de citometría de flujo que muestran glóbulos blancos (WBC) recogidos por lavado en el chip y concentración de los glóbulos blancos (WBC). Eje Y: dispersión de luz lateral; eje X: Inmunomarcaje de CD45.

La FIG. 44 ilustra un chip DLD en un colector como se describe en el presente documento.

La FIG. 45 ilustra un prototipo de plataforma de alta presión para procesar sangre a velocidades >100 ml/h mediante un dispositivo DLD.

La FIG.46 muestra un esquema que representa cambios en el protocolo de preparación de muestras convencional y el tiempo mediante el uso de dispositivos DLD descritos en el presente documento. El tiempo de preparación de la muestra se puede reducir de aproximadamente 2 a 3 horas a menos de 20 minutos.

La FIG.47 ilustra un sistema de preparación de productos para muestras que utiliza los dispositivos DLD descritos en el presente documento.

Las FIG. 48A-D ilustran un ejemplo de paredes separadoras de un dispositivo DLD. FIG. 48A: el esquema del diseño de la matriz DLD con paredes separadoras para el procesamiento y lavado de células en el chip. Las células diana (que siguen la trayectoria P1 y P2) se procesan y se lavan en un flujo fluídico continuo. Las paredes separadoras reducen la difusión del producto químico de tratamiento, como se indica por el sombreado rojo, para minimizar la contaminación en la salida del producto. FIG. 48B: el esquema del diseño detallado de la matriz DLD (d = 18 |jm, g = 18 jm y e = 1,36°) y el movimiento de las células en esta matriz DLD. Las células más pequeñas que un tamaño crítico seguirán la línea de corriente en una dirección recta en promedio (célula pequeña, flecha negra), mientras que las células más grandes que el tamaño crítico tropezarán con los postes siguiendo el eje inclinado de la matriz (célula diana, flecha roja). FIG. 48C: Esquema de la configuración del colector. FIG. 48D:

Esquema de la configuración experimental para el procesamiento de células en el chip.

Las FIG. 49A-B ilustran simulaciones COMSOL de concentración relativa entre dispositivos. Simulaciones COMSOL de concentración relativa entre dispositivos sin pared separadora, con una pared separadora y con dos paredes separadoras a una velocidad promedio de fluido de 100 jm /s y 1 cm/s. SS: corriente de entrada de la muestra, TS: corriente de entrada de tratamiento, WS: corriente de entrada de lavado, WO: salida de residuos y PO: salida del producto. Cada condición muestra las regiones de entrada, intermedia y de salida (0,8 mm de longitud) de los dispositivos. Para 100 jm /s (1 cm/s), la contaminación de salida relativa es 0,33 (0,12), 0,32 (0,025) y 0,14 (0,017) sin, con 1 y con 2 paredes separadoras respectivamente. La contaminación de salida del producto químico de tratamiento se puede reducir eficazmente con el diseño de la pared separadora.

Las FIG. 50A-B muestran imágenes fluorescentes de R6G que fluye en las corrientes de tratamiento. Imágenes fluorescentes de R6G que fluye en la corriente de tratamiento de la matriz DLD convencional de la FIG. 50A y la matriz DLD de la FIG. 50B con dos paredes separadoras, que muestran una clara reducción de la contaminación en la salida del producto. La velocidad promedio del fluido en los espacios de los postes es de 1,4 mm/s. FIG. 50C Resultados de simulación experimental y COMSOL de concentración relativa frente a velocidad promedio de fluido para matrices DLD convencionales (negro) y con paredes separadoras (rojo). Los cuadrados blancos son resultados experimentales medidos como la relación entre la intensidad de fluorescencia en la salida del producto y la de la entrada de la corriente de tratamiento. Las líneas continuas son los resultados de la simulación COMSOL. En la FIG. 50C se traza una línea negra de puntos para señalar la velocidad crítica del fluido de 300 jm /s para el diseño convencional. La concentración de R6G es de 20 jg/ml.

La FIG. 51 muestra los resultados de simulación experimental y COMSOL de la concentración relativa frente al tiempo mínimo de incubación calculado para las matrices DLD convencionales (negro) y con pared separadora (rojo), conseguidos variando la velocidad promedio del fluido. Los cuadrados blancos son resultados experimentales y las líneas continuas son los resultados de la simulación COMSOL. Para las pruebas de tinción posteriores se seleccionó la condición para el diseño con dos paredes separadoras de una velocidad promedio de fluido en los espacios de los postes de 2,8 mm/s con un tiempo de incubación mínimo de ~ 4 s y una contaminación de salida de producto de 0,067 (indicada por líneas rojas de puntos).

Las FIG. 52A-B muestran imágenes fluorescentes de tinción de leucocitos en el chip con R6G con matrices DLD con pared separadora utilizando sangre humana diluida como entrada, sin centrifugación ni lisis. La velocidad promedio del fluido en los espacios de los postes es de 2,8 mm/s. La FIG. 52A muestra la región intermedia de la matriz DLD con pared separadora donde los leucocitos pasan a través de la corriente de R6G y están cerca de entrar en la corriente de lavado (región "B" en la FIG. 50B). La FIG. 52B muestra leucocitos marcados en el canal de salida con un fondo de fluorescencia insignificante. El recuadro de la FIG. 52B muestra viales de producto recogido y salidas de residuos, que muestran un nivel bajo de glóbulos rojos en el producto.

Las FIG. 53A-C muestran la purificación de glóbulos blancos (WBC) con obstáculos con diferentes formas de sección transversal en una matriz DLD. La FIG. 53A muestra el rendimiento de glóbulos blancos (WBC) y la contaminación con glóbulos rojos (RBC) obtenidos utilizando obstáculos con diferentes formas de sección transversal a aproximadamente 40 ml/h. La "X" representa un cuarto de círculo. La orientación del flujo es de arriba hacia abajo. La FIG. 53B muestra los efectos inerciales de obstáculos circulares, con forma de diamante y triangulares asimétricos. El flujo está en la dirección y; la velocidad x es la velocidad lateral debida a los efectos inerciales. y = 0 es el espacio (punto más estrecho), los valores y negativos están aguas arriba en la dirección del flujo, y los valores y positivos están aguas abajo en la dirección del flujo. La FIG. 53C muestra una comparación de las fuerzas de cizallamiento generadas por obstáculos circulares y con forma de diamante. El flujo es de arriba hacia abajo.

Las FIG. 54A-B muestran incubadoras de flujo continuo ilustrativas. La FIG. 54A muestra una incubadora de flujo continuo ilustrativa que conecta dos matrices DLD. La FIG. 54B muestra un equilibrador de resistencia fluídica ilustrativo conectado a una matriz DLD conectada a una incubadora de flujo continuo conectada a una segunda matriz DLD.

La FIG. 55 muestra una incubadora fuera de chip ilustrativa. La incubadora puede ser un vial de vidrio con puertos para conectarse con uno o más chips microfluídicos.

La FIG. 56 ilustra una salida de una matriz DLD; la relación de resistencia fluídica entre la salida de producto y la salida de residuos es de 3:1. La relación de volumen de la salida del producto y la salida de residuos es de 1:3. La FIG. 57 ilustra una relación de resistencia fluídica entre la salida de producto y la salida de residuos de una matriz DLD que es de 3:1. La relación de volumen de la salida del producto y la salida de residuos es de 1:3. La FIG. 58 ilustra una relación de resistencia fluídica entre la salida de producto y la salida de residuos de una matriz DLD que es de 6:1. La relación de volumen de la salida del producto y la salida de residuos es de 1:6.

Descripción detallada

I. Descripción general

En el presente documento se describen métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y kits para el procesamiento químico, purificación, aislamiento y/o concentración de partículas. En algunos casos, el procesamiento químico, la purificación, el aislamiento y/o la concentración de partículas puede ser de alto rendimiento. El procesamiento químico, la purificación, el aislamiento y/o la concentración de partículas puede implicar la separación de partículas según el tamaño, por ejemplo, haciendo fluir una muestra a través de una matriz de obstáculos, por ejemplo, una matriz de desplazamiento lateral determinista (DLD). Se describen dispositivos para separar partículas según el tamaño y/o usando DLD, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 7.150.812, 7.318.902, 7.472.794, 7.735.652, 7.988.840, 8.021.614, 8.282.799, 8.304.230, 8.579.117 y en la publicación PCT n.° WO2012094642. En algunos casos, los métodos de alto rendimiento comprenden caudales de al menos 1 ml/min, al menos 5 ml/min, al menos 10 ml/min o al menos 20 ml/min. En algunos casos, los dispositivos descritos en el presente documento pueden procesar menos de 1 ml, al menos 10 ml, al menos 100 ml o al menos 300 ml de muestra.

En el presente documento se describen métodos, sistemas y dispositivos (por ejemplo, chips de DLD) para automatizar y simplificar el proceso de preparación de células para el análisis celular (por ejemplo, análisis de citometría de flujo o clasificación celular). En la primera columna de la FIG. 42 se muestra un procedimiento de procesamiento celular manual de varias etapas para citometría de flujo. Los chips DLD descritos en el presente documento pueden permitir la automatización y combinación de estas etapas. Los métodos, sistemas y dispositivos proporcionados en el presente documento pueden reemplazar a las etapas de lavado manuales que implican centrifugación y resuspensión, así como a la etapa de lisis de glóbulos rojos (RBC) y todas las etapas de manipulación manual asociadas con el marcaje de superficie e intracelular y la fijación/permeabilización (fijación/permeabilización). En algunos casos, se usan chips DLD junto con procedimientos fuera del chip para procesar células. Los métodos, sistemas y dispositivos también pueden reducir el tamaño de la muestra inicial (por ejemplo, a no más de aproximadamente 100 pl de sangre completa). En algunos casos, las etapas de lavado convencionales se pueden reemplazar con un proceso en chip que purifica ("recoge") glóbulos blancos (WBC) sin centrifugación de una mezcla de anticuerpos monoclonales (Mab) y otros marcadores, reactivos de fijación/permeabilización y glóbulos rojos (RBC).

Los métodos, sistemas y dispositivos descritos en el presente documento se pueden usar para realizar una o más etapas de procesamiento celular en un chip microfluídico. La realización de las etapas en el chip microfluídico puede reducir el tiempo y el coste de manipulación. En algunos casos, se puede realizar una etapa de lavado y/o concentración en un chip microfluídico. En algunos casos, se pueden realizar individualmente una etapa de fijación/permeabilización, una etapa de marcaje de la superficie celular y una etapa de marcaje intracelular o en cualquier combinación en un chip microfluídico. En algún caso, puede realizarse cualquiera de las etapas mencionadas anteriormente, o una combinación de las mismas, en combinación con un lavado/concentración en un chip microfluídico. Por ejemplo, se puede realizar una etapa de fijación/permeabilización y una etapa de lavado/concentración en un chip microfluídico. En otro ejemplo, se puede realizar una etapa de marcaje de la superficie celular y una etapa de lavado/concentración en un chip microfluídico. En otro ejemplo, se puede realizar una etapa de mareaje intracelular y una etapa de lavado/concentración en un chip microfluídico.

Cualquiera de los chips microfluídicos o combinaciones puede usarse junto con cualquier método fuera del chip para procesar células. En algunos casos, una o más de las etapas de procesamiento celular se pueden realizar en uno o más chips microfluídicos, y las otras etapas de procesamiento celular se pueden realizar usando cualquiera de los métodos fuera del chip. En algunos casos, todas las etapas de procesamiento celular se pueden realizar en un chip microfluídico. Por ejemplo, todas las etapas de marcaje de la superficie, fijación, permeabilización, marcaje intracelular y las etapas de lavado asociadas se pueden integrar en un solo chip de "lavado de coches" en la presente invención. La combinación de las etapas de procesamiento celular en microfluidos puede reducir el tiempo y el coste de manipulación, y puede tener como resultado chips y procesos de productos adicionales. En algunos casos, en el presente documento se proporciona un sistema para procesar partículas en una muestra, comprendiendo el sistema: un componente microfluídico, en donde el componente microfluídico comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; y una matriz de obstáculos, en donde la primera matriz de obstáculos desvía las partículas a través de una serie de corrientes de flujo que fluyen desde la pluralidad de entradas a la pluralidad de salidas, en donde las partículas se desvían hacia la segunda pared cuando fluyen desde las entradas a las salidas, y en donde la pluralidad de corrientes de flujo comprenden dos corrientes de flujo seleccionadas del grupo que consiste en una corriente de flujo que comprende un agente de marcaje, una corriente de flujo que comprende un agente de fijación y un agente de permeabilización, y una corriente de flujo que comprende un tampón de lavado; y un componente no microfluídico.

En el presente documento se describen métodos, dispositivos y sistemas para prolongar el tiempo de incubación de las células en una solución. En algunos casos, lo que se proporciona en el presente documento incluye un sistema para prolongar el tiempo de contacto de las partículas con una solución que comprende un agente de reacción, comprendiendo el sistema una incubadora de flujo continuo, en donde la incubadora de flujo continuo está conectada fluídicamente, por ejemplo, un canal que comprende una matriz DLD, en donde las partículas fluyen desde el canal a la incubadora de flujo continuo en una corriente de flujo, y en donde la corriente de flujo comprende la solución que comprende el agente de reacción. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede ser un componente en un chip microfluídico para procesar células. En algunos casos, el dispositivo y los métodos pueden prolongar la distancia que se desplazan las células en una solución, de manera que las células puedan mantenerse en contacto con la solución durante más tiempo sin reducir el caudal en el sistema. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede ser un canal en un chip microfluídico, por ejemplo, un canal serpenteante. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede ser un dispositivo fuera del chip. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede ser un recipiente fuera del chip. En algunos casos, un recipiente fuera del chip está conectado fluídicamente a un canal que comprende una matriz DLD.

La incubadora de flujo continuo puede usarse en combinación con cualquiera de los chips microfluídicos descritos en el presente documento para prolongar el tiempo de contacto de las células con una solución. En algunos casos, en el presente documento se proporciona un sistema para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el dispositivo: un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas hasta una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; una primera matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de la primera matriz de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la primera matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de la muestra de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida, en donde el dispositivo está configurado de manera que las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían hacia una segunda corriente de flujo que fluye desde una segunda entrada a la primera salida mientras se desvían hacia la segunda pared, en donde la segunda corriente de flujo comprende un reactivo; y una incubadora de flujo continuo conectada fluídicamente con la primera salida, en donde la incubadora de flujo continuo comprende un canal.

Se puede usar una incubadora fuera del chip con cualquiera de los chips microfluídicos para prolongar el tiempo de contacto de las células con una solución. En algunos casos, en el presente documento se describe un sistema para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el sistema: un dispositivo que comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas hasta una pluralidad de salidas; una primera matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de la muestra de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida; y una incubadora conectada fluídicamente con la primera salida.

En el presente documento se describen métodos y dispositivos para purificar un primer tipo de células en una muestra que comprende los primeros tipos de células. La muestra puede comprender un segundo tipo de células. Tales métodos y dispositivos pueden configurarse para lograr un alto rendimiento de los primeros tipos de células. Los métodos y dispositivos se pueden configurar para lograr una baja contaminación de los segundos tipos de células. En algunos casos, tales dispositivos pueden comprender una matriz de obstáculos con ciertas formas de sección transversal. Por ejemplo, al menos uno de los obstáculos puede tener forma de sección transversal cuadrilátera (por ejemplo, forma de diamante). En el presente documento se proporciona un sistema para purificar primeras partículas a partir de una muestra, comprendiendo el sistema: una matriz de obstáculos dispuestos en filas, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de menos del tamaño predeterminado en la muestra a una segunda salida, en donde las superficies de dos de los obstáculos definen un espacio respectivo, en donde el espacio respectivo está orientado de una forma sustancialmente simétrica con respecto a un plano que se extiende a través del centro del espacio respectivo y que es paralelo a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos, en donde cada uno de los dos obstáculos que definen un espacio respectivo tiene una sección transversal poligonal, en donde un vértice de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apunta a una dirección sustancialmente paralela a la dirección del flujo de la muestra a través del matriz de obstáculos.

También se describe en el presente documento un dispositivo DLD, comprendiendo el dispositivo al menos tres conjuntos de matrices de obstáculos dispuestos en filas, en donde el tamaño del espacio entre los obstáculos en la segunda matriz es menor que el tamaño del espacio entre los obstáculos en la primera matriz, y en donde el tamaño del espacio de los obstáculos en la tercera matriz es más pequeño que el tamaño del espacio entre los obstáculos en la segunda matriz, en donde la longitud de la tercera matriz es de aproximadamente 1,2 cm.

También se describe en el presente documento un DLD de espejo que comprende un canal de derivación configurado para fluir hacia un canal de salida de producto, en donde el volumen del canal de producto en la base de la matriz DLD es aproximadamente 1/3, 1/6 o 1/7 del volumen de un canal de recolección de residuos en la base de la matriz DLD (véase, por ejemplo, la FIG. 57 y la FIG. 58).

En el presente documento se describe además un dispositivo para procesar, purificar y concentrar partículas en donde el dispositivo comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, y en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; y una matriz de obstáculos dispuestos dentro del canal configurados para desviar partículas hacia la segunda pared cuando las partículas fluyen desde las entradas a las salidas. El dispositivo se puede configurar de manera que las partículas de una muestra de fluido se introduzcan en al menos una de la pluralidad de entradas y las partículas de un tamaño predeterminado en la muestra de fluido se desvíen a través de una serie de corrientes de flujo paralelas que fluyen desde la pluralidad de entradas a la una pluralidad de salidas mientras también se desvían hacia la segunda pared. En algunos casos, la serie de corrientes de flujo paralelas comprende al menos cuatro corrientes de flujo que comprenden un reactivo. Los reactivos pueden ser reactivos iguales o diferentes.

En el presente documento también se describe un dispositivo, comprendiendo el dispositivo un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, y en donde el dispositivo está configurado para hacer fluir una pluralidad de corrientes de flujo desde la pluralidad de entradas a la pluralidad de salidas, en donde la pluralidad de corrientes de flujo fluyen paralelas entre sí; y una matriz de obstáculos dispuestos dentro del canal configurados para desviar partículas hacia la segunda pared cuando las partículas fluyen desde las entradas a las salidas, en donde la matriz de obstáculos comprende al menos una pared separadora orientada paralela al flujo de la pluralidad de corrientes de flujo y la primera y segunda paredes. El dispositivo se puede configurar de forma que las partículas introducidas en una entrada de muestra cerca de la primera pared pasen a través de la pluralidad de corrientes de flujo mientras se desvían hacia la segunda pared, y de forma que dicha al menos una pared separadora esté configurada para retrasar el flujo de partículas desviadas hacia la segunda pared, en donde el retraso sirve para aumentar sustancialmente la cantidad de tiempo que las partículas desviadas residen en una corriente de flujo y/o reducir sustancialmente la mezcla entre corrientes de flujo paralelas.

En el presente documento también se describe un dispositivo, comprendiendo el dispositivo un canal que se extiende desde al menos una entrada a al menos una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; y una matriz de obstáculos dispuestos dentro del canal configurados para desviar partículas en una corriente que comprende partículas hacia la segunda pared cuando la corriente que comprende partículas fluye desde dicha al menos una entrada a la pluralidad de salidas. El dispositivo está configurado de forma que la primera pared comprende una pluralidad de entradas adaptadas para hacer fluir un fluido hacia una pluralidad de salidas en la segunda pared, en donde la dirección del flujo del fluido es perpendicular al flujo de la corriente que comprende las partículas y en donde el flujo del fluido está configurado para eliminar cualquier partícula que se haya atascado en la matriz de obstáculos después del movimiento de las partículas hacia la segunda pared.

En el presente documento se describe además un método para marcar células, comprendiendo el método proporcionar una muestra que comprende células, procesar la muestra que comprende células, en donde el procesamiento comprende introducir la muestra que comprende células en una entrada de muestra de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos y pasar la muestra a través de la matriz de obstáculos, en donde el matriz de obstáculos comprende una pluralidad de corrientes de flujo paralelas que fluyen a través de la matriz de obstáculos, en donde el paso comprende el flujo de células de la muestra desde la entrada de muestra a través de la pluralidad de corrientes de flujo paralelas, en donde al menos una de la pluralidad de corrientes de flujo paralelas comprende un reactivo de mareaje, al menos una de la pluralidad de corrientes de flujo paralelas comprende un agente de fijación, al menos una de la pluralidad de corrientes de flujo paralelas comprende un agente de permeabilización y al menos una de la pluralidad de corrientes de flujo paralelas comprende un tampón de lavado, con lo que el paso de la muestra a través de la matriz de obstáculos sirve para marcar las células mientras se separan las células simultáneamente por tamaño; y recoger células marcadas de un tamaño predeterminado de una de una pluralidad de salidas del dispositivo.

En el presente documento se describe además un método para procesar leucocitos para pruebas de diagnóstico molecular, comprendiendo el método marcar y recoger los leucocitos de una muestra usando un dispositivo microfluídico, en donde el rendimiento de células marcadas es de al menos el 85 % y la viabilidad de las células marcadas es de al menos el 90 %.

En el presente documento se describen además métodos para procesar partículas en una muestra utilizando el dispositivo microfluídico y la incubadora de flujo continuo desvelados en el presente documento. Dichos métodos pueden permitir que las partículas se incuben con un agente de reacción durante un tiempo suficiente sin reducir el caudal en el dispositivo microfluídico. Los métodos proporcionados en el presente documento pueden comprender el paso de partículas en una muestra a través de un sistema que comprende cualquier chip microfluídico y cualquier incubadora proporcionada en el presente documento. En algunos casos, lo que se proporciona en el presente documento incluye un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el método: proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado y, opcionalmente, segundas partículas de menos del tamaño predeterminado; pasar la muestra a través de un sistema, en donde el sistema comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas a una primera salida y las segundas partículas a una segunda salida, en donde el dispositivo está configurado de manera que las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían hacia una segunda corriente de flujo que fluye desde una segunda entrada a la primera salida mientras se desvían hacia la segunda pared, en donde la segunda corriente de flujo comprende un reactivo; y una incubadora de flujo continuo conectada fluídicamente con la primera salida, en donde la incubadora de flujo continuo comprende un canal.

En el presente documento se describen además métodos para purificar un grupo de partículas de una muestra. En algunos casos, los métodos comprenden pasar la muestra a través de una matriz de obstáculos con ciertas formas de sección transversal, por ejemplo, una forma cuadrilátera. Dichos obstáculos pueden tener un efecto de desplazamiento mejorado de los obstáculos (por ejemplo, debido al mayor efecto de inercia) y pueden reducir la deformación de las partículas. Por tanto, las partículas se pueden purificar de la muestra con un alto rendimiento y una baja contaminación de otros componentes de la muestra. En el presente documento se proporciona un método para purificar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el método: proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado y, opcionalmente, segundas partículas de menos del tamaño predeterminado; pasar la muestra a través de una matriz de obstáculos dispuestos en filas, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente primeras partículas a una primera salida y segundas partículas a una segunda salida, en donde las superficies de dos de los obstáculos definen un espacio respectivo, en donde el espacio respectivo está orientado de una forma sustancialmente simétrica con respecto a un plano que se extiende a través del centro del espacio respectivo y que es paralelo a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos, en donde cada uno de los dos obstáculos que definen un espacio respectivo tiene una sección transversal poligonal, en donde un vértice de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apunta a una dirección sustancialmente paralela a la dirección del flujo de la muestra a través del matriz de obstáculos.

En el presente documento se describen además métodos para procesar partículas en una muestra usando uno o más chips microfluídicos y uno o más dispositivos fuera del chip. Tales combinaciones pueden proporcionar procedimientos flexibles para procesar las partículas. En algunos casos, lo que se proporciona en el presente documento incluye un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado, comprendiendo el método: proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado y, opcionalmente, segundas partículas de menos del tamaño predeterminado; pasar la muestra a través de un dispositivo microfluídico, sistema, en donde el sistema comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas a una primera salida y las segundas partículas a una segunda salida, en donde el dispositivo está configurado de manera que las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían para fluir a través de una o más corrientes de flujo de reacción que fluyen desde la pluralidad de entradas a la pluralidad de salidas, en donde dichas una o más corrientes de flujo de reacción comprenden una corriente de flujo de reacción que comprende un reactivo de mareaje, una corriente de flujo de reacción que comprende un agente de fijación, una corriente de flujo de reacción que comprende un agente de permeabilización y una corriente de flujo de reacción que comprende un tampón de lavado, o cualquier combinación de las mismas; pasar la muestra a través de un dispositivo no microfluídico, en donde el dispositivo no microfluídico comprende una solución que comprende un reactivo, en donde el reactivo se selecciona del grupo de un reactivo de marcaje, un agente de fijación, un reactivo de permeabilización o un tampón de lavado.

En el presente documento se describen además métodos para prolongar el tiempo de las partículas en una solución que comprende un agente de reacción cuando las partículas pasan desde un depósito que comprende la solución. En algunos casos, uno de los métodos puede comprender pasar las partículas desde el depósito en un dispositivo microfluídico a través de una incubadora de flujo continuo, en donde la incubadora de flujo continuo está conectada fluídicamente con el depósito, y en donde las partículas están en la solución cuando pasan a través de la incubadora de flujo continuo.

En algunos casos, uno de los métodos puede comprender: proporcionar una muestra que comprende partículas; introducir la muestra en un dispositivo microfluídico, donde el dispositivo microfluídico comprende una matriz de obstáculos, una pluralidad de entradas y una pluralidad de salidas, y en donde las partículas se introducen en al menos una de la pluralidad de entradas; pasar las partículas a través de la matriz de obstáculos, en donde las partículas se desvían a través de una serie de corrientes de flujo que fluyen desde la pluralidad de entradas a la pluralidad de salidas, y en donde la pluralidad de corrientes de flujo comprenden dos corrientes de flujo seleccionadas del grupo que consiste en una corriente de flujo que comprende un reactivo de marcaje, una corriente de flujo que comprende un agente de fijación, una corriente de flujo que comprende un agente de permeabilización y una corriente de flujo que comprende un tampón de lavado; y pasar las partículas a través de una incubadora de flujo continuo, en donde la incubadora de flujo continuo está conectada fluídicamente con la matriz de obstáculos, prolongándose así el tiempo que las partículas están en al menos una de las corrientes de flujo.

En el presente documento se describe además un sistema para procesar y analizar partículas, comprendiendo el sistema una pluralidad de depósitos, en donde al menos uno de los depósitos comprende una muestra que comprende partículas, y al menos uno de los depósitos comprende un reactivo; un dispositivo, en donde el dispositivo está en comunicación fluida con cada uno de la pluralidad de depósitos, y en donde el dispositivo está adaptado para procesar partículas de la muestra que comprende partículas, en donde el procesamiento comprende hacer fluir la muestra que comprende partículas desde el depósito que comprende la muestra a una entrada de un dispositivo y hacer pasar las partículas a través del dispositivo, en donde el paso comprende hacer fluir las partículas desde la entrada a través de una pluralidad de corrientes de flujo paralelas dentro del dispositivo, en donde al menos una de las corrientes de flujo paralelas comprende un reactivo que fluye desde al menos uno de la pluralidad de depósitos, y en donde el dispositivo comprende una matriz de obstáculos, con lo que el paso de las partículas a través del dispositivo sirve para procesar las partículas así como para separar las partículas por tamaño; y un dispositivo analítico en comunicación fluida con al menos uno de una pluralidad de puertos de salida del dispositivo, en donde el dispositivo analítico está configurado para realizar un análisis de partículas procesadas por el dispositivo.

Los procesos microfluídicos conocidos como desplazamiento lateral determinista (DLD) pueden retirar células de un flujo de fluido, en función de su tamaño (2). Cuando una mezcla de fluido y partículas fluye a través de una matriz de micropostes, en la que el eje de micropostes puede estar inclinado formando un pequeño ángulo de unos pocos grados desde la dirección del flujo de fluido, las partículas por encima de un cierto tamaño crítico (tales como leucocitos) pueden "impactar" con los postes desviándose para fluir en una dirección a lo largo del eje de la matriz inclinada (por lo tanto, el dispositivo puede denominarse "matriz de impacto"). Las partículas más pequeñas y moléculas disueltas, tales como glóbulos rojos, anticuerpos monoclonales (Mab) y reactivos químicos (por ejemplo, agentes de fijación, enzimas, agentes de permeabilización) pueden fluir en línea recta, en promedio, con o en la corriente de fluido. Por tanto, después de desplazarse a través del chip microfluídico, las células más grandes pueden salir y alejarse de la corriente de fluido de la mezcla de entrada original y pueden recogerse por separado. El proceso se puede utilizar para retirar una gama de objetos de un fluido de entrada, que varían desde grandes oligómeros de ADN (-100 kpb) hasta E. co liy otras bacterias, plaquetas, eritrocitos y leucocitos (2,4,5). El tamaño crítico que determina qué trayectoria siguen las celdas u otros objetos se puede controlar mediante el diseño de la matriz de micropostes (por ejemplo, el tamaño y la forma de los postes, los espacios entre postes, el ángulo de inclinación del eje) (6). Las células o partículas varias veces más grandes que el tamaño crítico que determina el impacto (es decir, las células que se recogen) pueden fluir a través del dispositivo sin atascarse. En algunos casos, las condiciones de funcionamiento (por ejemplo, carga del chip, caudales, recogida de salida) se pueden automatizar.

Un método de procesamiento de células descrito en el presente documento puede recuperar todos los subconjuntos de leucocitos con un rendimiento >90 %. Los métodos y dispositivos pueden ser una herramienta de investigación, clínica y/o comercial que puede reemplazar las etapas de lavado/concentrado con centrifugación convencionales actuales que pueden ser comunes en los laboratorios clínicos y de investigación. El uso del procedimiento de procesamiento celular no está restringido a la citometría de flujo y/o leucocitos.

Las pruebas para cuantificar el número y los estados funcionales de los tipos de leucocitos clave de las muestras de sangre pueden ofrecer una mayor precisión y personalización del diagnóstico clínico, pronóstico y respuesta al tratamiento. Por ejemplo, el mareaje de >30 moléculas diana intracelulares y de la superficie celular puede evaluar el estado de la vía de señalización de múltiples tipos de leucocitos normales frente a células leucémicas simultáneamente, mediante citometría de flujo multiparamétrica o espectrometría de masas atómica (1). Las células madre o las células infectadas se pueden analizar de manera similar. Las células se pueden analizar mediante secuenciación de última generación. Sin embargo, los procedimientos actuales para procesar leucocitos sanguíneos pueden ser caros, laboriosos, repetitivos y dependientes de operarios humanos; y pueden tener un bajo rendimiento celular y pueden requerir una considerable habilidad humana.

Convencionalmente, el marcaje combinado de la membrana de la superficie e intracelular de leucocitos sanguíneos puede requerir la lisis de eritrocitos para recoger la población de leucocitos (Lisis); incubación con anticuerpos monoclonales (Mab) fluorescentes contra el linaje/estadio de leucocitos o señalizadores de cáncer en la superficie celular (Marcaje en la superficie); realización de una etapa de fijación/permeabilización (Fijación/permeabilización); e incubación con reactivos (por ejemplo, Mab con etiqueta, ácidos nucleicos, colorantes) que se pueden unir a moléculas intracelulares (citoplasmáticas y nucleares) (Marcaje intracelular). Después de cada una de estas 4 etapas, se pueden requerir una o más etapas de lavado/concentración, que actualmente implican centrifugación y resuspensión del sedimento celular. El rendimiento de leucocitos puede ser ~80-90 % en cada etapa de lavado/concentración, por lo que el rendimiento general puede ser <50 % después de múltiples lavados.

En el presente documento se describen métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits que utilizan la tecnología microfluídica de desplazamiento lateral determinista (DLD) (2) para reemplazar cada una de las etapas de lavado/concentración. En algunos casos, se combina en una sola etapa una recolección de leucocitos y una etapa de lavado/concentración, evitando así la lisis y simplificando aún más el flujo de trabajo. Por tanto, un proceso de múltiples etapas, intensivo en mano de obra, que requiere hasta medio día puede reemplazarse por procesos de bajo coste y alto rendimiento que requieren < 1 hora y pueden tener menos o mínimas etapas dependientes de operarios. En algunos casos, las múltiples etapas secuenciales se pueden realizar para recoger, marcar y lavar/concentrar leucocitos en un enfoque de "lavado de coches" en un solo microchip, introduciendo sangre completa y extrayendo células marcadas para aplicaciones posteriores (por ejemplo, citometría de flujo o análisis de espectrometría de masas).

La separación por desplazamiento lateral determinista (DLD) descrita en el presente documento puede superar los procedimientos de centrifugación convencionales. En el presente documento se proporcionan dispositivos microfluídicos, composiciones, sistemas, kits y métodos para lavar y concentrar leucocitos rápidamente, a bajo coste, con mayor rendimiento celular y con mejor reproducibilidad. Los sistemas microfluídicos DLD pueden diseñarse y fabricarse para retirar y concentrar leucocitos o células leucémicas con proteínas espiga a partir de una corriente que contiene Mab utilizados para las etapas de marcaje o de la solución utilizada para una etapa de fijación/permeabilización. Se pueden procesar volúmenes de 0,1-1 ml en <5-10 minutos (por ejemplo, mediante un proceso automatizado). En algunos casos, se consigue un rendimiento >90 % y 90 % de viabilidad de leucocitos y la retirada de >99 % de reactivos fluorescentes no unidos o de fijación/permeabilización sin sesgo de las subpoblaciones.

En algunos casos, la etapa de lisis de eritrocitos y la etapa de lavado/concentración con centrifugación posterior se reemplazan por una etapa de DLD microfluídico. En algunos casos, la etapa de DLD microfluídico es una sola etapa de DLD microfluídico.

Como se describe en el presente documento, los leucocitos se pueden marcar en sangre completa (muestras sanas y de leucemia), y luego un proceso microfluídico DLD puede aislar, purificar y/o concentrar los leucocitos marcados con Mab de la mezcla de sangre y exceso de Mab libre. En algunos casos, se consigue >99 % de reducción de eritrocitos.

Los dispositivos, métodos, composiciones y/o kits pueden preparar leucocitos (incluidas células leucémicas en sangre) para una citometría de flujo. En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento son un reemplazo general para la centrifugación en procedimientos preparativos para diversas pruebas a realizar en muestras. Las diversas pruebas pueden ser cualquier prueba o aplicación posterior como se describe en el presente documento. Las muestras pueden ser cualquier muestra como se proporciona en el presente documento (por ejemplo, en leucocitos sanguíneos).

II. Partículas

En algunos casos, una partícula que puede procesare o tratarse química y/o enzimáticamente, purificarse, aislarse y/o concentrarse utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento puede ser una célula, fragmento celular o ácido nucleico. En algunos casos, la partícula no es una célula, fragmento celular o ácido nucleico, por ejemplo, la partícula es una perla.

A. Componentes sanguíneos

En algunos casos, la partícula es un componente sanguíneo. En algunos casos, Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), purificar o separar componentes sanguíneos, por ejemplo, para bancos de sangre. En algunos casos, el componente sanguíneo comprende una plaqueta, glóbulo rojo (eritrocito), glóbulo blanco (por ejemplo, granulocitos, por ejemplo, neutrófilos, basófilos o eosinófilos, o agranulocitos, por ejemplo, linfocitos, monocitos o macrófagos). En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para la reducción de leucocitos de glóbulos rojos o plaquetas (por ejemplo, para reemplazar filtros de leucocitos en el procesamiento de productos sanguíneos para transfusión en pacientes). En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para el aislamiento de leucocitos o plaquetas en línea (por ejemplo, para reemplazar la aféresis centrífuga). En algunos casos, Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para reducir los eritrocitos de una muestra de sangre, por ejemplo, una muestra de sangre del cordón umbilical.

En algunos casos, la célula es una célula dendrítica. En algunos casos, la célula es cualquier célula del sistema inmunológico innato o adaptativo.

B. Leucocitos (glóbulos blancos)

En algunos casos, una célula procesada (por ejemplo, procesada o tratada química y/o enzimáticamente), purificada, aislada y/o concentrada utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento es un leucocito (glóbulo blanco). Un leucocito puede ser, por ejemplo, un neutrófilo, eosinófilo, basófilo, linfocito o monocito. Un leucocito puede ser, por ejemplo, un granulocito o agranulocito. En algunos casos, un granulocito es un neutrófilo, basófilo o eosinófilo. En algunos casos, un agranulocito es un linfocito, monocito o macrófago. Un linfocito puede ser, por ejemplo, una célula B o una célula T. Una célula T puede ser, por ejemplo, una célula auxiliar T CD4+ (por ejemplo, T^h1, T^h2, T^h3, T^h17, T^h9 o T^fh), una célula T citotóxica CD8+, una célula T y§, una célula T reguladora (supresora), una célula T asesina natural (NKT), una célula T específica de antígeno, por ejemplo, célula T de memoria, por ejemplo, células T de memoria central, células T^emo células T^emra. En algunos casos, un linfocito es una célula asesina natural (NK). Una célula B puede ser una célula B plasmática, una célula B de memoria, una célula B-1, una célula B-2, una célula B de la zona marginal, una célula B folicular o una célula B reguladora. En algunos casos, la célula es un macrófago regulador. En algunos casos, la célula es una célula dendrítica plasmocitoide (pDC). En algunos casos, la célula son células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). En algunos casos, la célula es un megacarocito.

En algunos casos, un leucocito (glóbulo blanco) puede identificarse mediante uno o más señalizadores de la superficie celular. En algunos casos, un leucocito (glóbulo blanco) se puede identificar mediante el uso de agentes de unión (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, sondas, etc., como se proporciona en el presente documento) a uno o más señalizadores de la superficie celular (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un señalizador asociado con el agente de unión). El señalizador de la superficie celular en un leucocito (humano o de ratón) puede ser una proteína transmembrana. La proteína transmembrana puede ser una glicoproteína. En algunos casos, una glicoproteína transmembrana utilizada para identificar un leucocito (por ejemplo, humano o de ratón) es un grupo de glicoproteínas transmembrana de diferenciación (CD). El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.) La proteína CD puede ser CD1a, 1b, 1c, Id, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 11a, 11b, 11c, 13, 14, 15, 16/32, 19, 20, 21/35 (CR2/CR1), 22, 23, 25, 26, 31, 33, 38, 39, 40, 44, 45RB, 45RA, 45R/B220, 49b (células pan-NK), 49d, 52, 53, 54, 57, 62L, 63, 64, 66b, 68, 69, 70, 73, 79a (Iga), 79b (IgP), 80, 83, 85 g/ILT7, 86, 88, 93, 94, 103, 105 (Endoglina), 107a, 107 (Mac3), 114, 115, 117, 119, 122, 123, 124, 127, 129, 134, 137(4-1BB), 138 (Syndecan-1), 158 (Kir), 161, 163, 183, 184 (CXCR4), 191, 193 (CCR3), 194 (CCR4), 195, 195 (CCR5), 197, 197 (CCR7), w198 (CCR8), 203c, 205/Dec-205, 207 (Langerina), 209DC-SIGN), 223, 244 (2B4), 252 (OX40L), 267, 268 (BAFF-R), 273 (B7-DC, PD-L2), 278 (ICOS), 279/PD-1, 282 (TLR2), 289 (TLR9), 284 (TLR4), 294, 303, 304, 305, 314 (NKG2D), 319 (CRACC), 328 (Siglec-7) o 335 (NKp46). Un señalizador de la superficie celular de leucocitos (glóbulos blancos) puede ser, por ejemplo, IgM de superficie, IgD, Marcador de DC (33D1), F4/80, CMKLR-1, HLA-DR, Siglex H, MHC de clase II, LAP (TGF-b), GITR, GARP, FR4, CTLA-4, TRANCE, TNI-p, TNF-a, Tim-3, LT-pR, IL-18R, CCR1, TGF-p, IL-1R, CCR6, CCR4, CRTH2, IFN-yR, Tim-1, Va24-Ja18 TCR (iNKT), Ly108, Ly49, CD56 (NCAM), TCR-a/p, TCR-y/5, CXCR1, CXCR2, GR-1, JAML, TLR2, CCR2, Ly-6C, Ly-6G, F4/80, VEGFR1, C3AR, FcsRIa, Galectina-9, MRP-14, Siglec-8, Siglec-10. TLR4, IgE, GITRL, HLA-DR, ILT-3, Mac-2 (Galectina-3). CMKLR-1 o señalizador de DC (33D1).

En algunos casos, un leucocito (glóbulo blanco) puede identificarse mediante uno o más señalizadores intracelulares. Un señalizador intracelular de leucocitos (glóbulos blancos) puede ser, por ejemplo, Pax-5, Helios, FoxP3, GM-CSF, IL-2, IFN-y, T-bet, IL-21, IL-17A, IL-17F, IL-22, RORYt, RORa, STAT3, IL-10, IL-13, IL-5, IL-4, IL-6, GATA3, c-Maf, Granzima B, Perforina o granulisina.

En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para diferenciar entre células B y T maduras e inmaduras. Tal como se proporciona en el presente documento, la diferenciación o identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas por un señalizador como se proporciona en el presente documento puede determinarse mediante el uso de un agente de unión específico para o dirigido a o contra el señalizador (por ejemplo, de la superficie celular y/o intracelular). El agente de unión puede ser cualquier agente de unión conocido en la técnica (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, sonda (por ejemplo, sonda de ácido nucleico), etc.). El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La diferenciación entre células T maduras e inmaduras se puede realizar identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de señalizadores CD3, 4, 8, 25, 44, l l7 , 127 y TCR-a/p, Tc R-y/5 (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). La diferenciación entre células Treg maduras e inmaduras se puede realizar identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de señalizadores CD3, 4, 8, 25, 40, 44, 45RA, 45RB, 62L, 117, 127, 134 (OX40), 137 (4-1BB), 197, 199 (CCR9), 223 (LAG-3), Integrina a4, Integrina p7, 304 (Neuropilina), 357(GITR), CTLA-4, Foxp3, GARP, IL-10, IL-15Ra, LAP (TGFp) y TCR-a/p. La diferenciación entre células B de ratón maduras e inmaduras se puede realizar identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de señalizadores CD2, 11b, 16/32.19, 21/35, 23, 22, 24 (HAS), 43, 45R (B220), 93 (AA4.1), 117, 127, BP-1, C|j, S|j, A,5, IgD, IgM. La diferenciación entre células B humanas maduras e inmaduras se puede realizar identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de señalizadores CD9, 19, 20, 23, 24 (HSA), 27, 28, 31, 34, 38, 4o, 45R (B220), 95 (FAS), 150 (SLAM), 184 (CXCR4), IgD, IgM, IgA, IgG. La diferenciación entre células dendríticas humanas o de ratón maduras e inmaduras se puede realizar identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de señalizadores CD3, 11b, 11c, 14, 16, 19, 34 (49b), 68, 80, 86, 107b (Mac-3), 115, 117, 123, 127, 135, 303 (BDCA-2), CXCR1, F4/80, Ly6C, Ly6G, Gr-1, MHC II, NKp46, Sca-1, Ter119, iNOS, TNFa. La diferenciación entre monocitos/macrófagos humanos o de ratón maduros e inmaduros se puede realizar identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de señalizadores CD3, 11b, 11c, 13, 14, 16, 19, 33, 34, 43, 45, 62L, 68, 115, 117, 123, 127, 135, 163, 204, 206, CCR2, CCR5, CX3CR1, F4/80, LysA/E, Tie-2, Lys6B.2, Ly6C, Ly6G, Gr-1, MHC II, NKp46, Sca-1, Ter119 o VEGFR1. La diferenciación entre subclases de macrófagos de ratón y humanos maduros e inmaduros se puede realizar por la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de varias proteínas, entre las que se incluyen CD14, CD11b, 16, 32, 51/61. 64, 68, 86, 121a, 121b, 124, 150, 163, 181, 182, 206, 210, 215, CCL 1, 2, 3, 4, 5, 8, 15, 16, 18, 20, 24, CCR2, CCR7, CXCL, 8, 9, 10, 11, 13, 16, IFNy, IL-1RA, IL-1p, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-23, iNOS, Ly6C, MHC II (humano y de ratón), TNF-a, Dectina-1, FcsR1a, Lectinas, RAGE, receptor depurador, arginasa o señalizadores LAP (TGFp).

En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para diferenciar entre o identificar subconjuntos de leucocitos (glóbulos blancos). La diferenciación o identificación de subconjuntos de leucocitos (glóbulos blancos) puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, leucocitos) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más de los señalizadores (por ejemplo, señalizadores de la superficie celular o intracelulares). El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.) Los subconjuntos de leucocitos (glóbulos blancos) se pueden diferenciar de otros leucocitos identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de señalizadores intracelulares específicos de tipo leucocitario (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). Los subconjuntos de leucocitos (glóbulos blancos) se pueden diferenciar de otros leucocitos identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de señalizadores específicos de tipo leucocitario. Por ejemplo, las células Th2 pueden identificarse por el factor de transcripción GATA3 y las citocinas: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y IL-13. Las células Th17 pueden identificarse por RORYt intracelular y STAT3 y la producción de citocinas: IL-17A, IL-17F, IL-21 e IL-22. Las células Th1 pueden identificarse por el factor de transcripción T-bet y las citocinas: IL-2, IFN-y y TNF. Un megacariocito puede identificarse por GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, quimiocinas (SDF-1; FGF-4) y eritropoyetina. NK puede identificarse por la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de los señalizadores de la superficie celular CD16 (FcyRIII) y CD56 en humanos, NK1.1 o NK1.2 en ratones C57BL/6, si bien no expresan receptores de antígenos de células T (TCR) o el señalizador Pan T CD3 o receptores de células B de inmunoglobulinas (Ig), que se encuentran en las células T y B. Hasta el 80% de las células NK humanas pueden expresar CD8. Son distintas de las células T asesinas naturales, que pueden expresar CD3. En seres humanos, Las pDC expresan los señalizadores de superficie CD123, BDCA-2 (c D303) y BDCA-4 (CD304), pero no expresan CD11c o CD14, que las distingue de las células dendríticas convencionales o monocitos, respectivamente. Las pDC de ratón expresan CD11c, B220, BST-2 (mPDCA) y Siglec-H y son negativas para CD11b. Las células T reguladoras pueden caracterizarse o identificarse por la presencia (por ejemplo, positivas), ausencia (por ejemplo, negativas) y/o una combinación de las mismas de CD4, CD25 y Foxp3, mientras que carecen de CD127. Se ha hecho referencia a las células T reguladoras CD4+Foxp3+ como células T reguladoras "de origen natural" para distinguirlas de las poblaciones de células T "supresoras" que se generan in vitro. Si bien existen otras variantes de células T supresoras, tales como las células supresoras CD8, células Th3 y Tr-1, las T reg se definen clásicamente como células CD4+CD25+ FOXP3+. Los macrófagos pueden identificarse mediante la expresión específica de varias proteínas entre las que se incluyen CD14, CD11b, F4/80 (ratones)/EMR1 (humano), MAC-1/MAC-3 y CD68. Las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) son una población heterogénea de células que tienen una potente función supresora de células T, caracterizadas por un estado activado con mayor producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, y arginasa 1. En ratones, las MDSC pueden identificarse por CD11b+GR1+, mientras que en los seres humanos, las MDSC pueden identificarse por LIN-HLA-DR-CD33+ o CD11b+CD14-CD33+. Las células Th17 se pueden identificar utilizando señalizadores de la superficie celular para CD4, CD161 y CCR6.

C. Células madre

En algunos casos, una célula procesada (por ejemplo, procesada o tratada química o enzimáticamente), purificada, aislada y/o concentrada utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento es una célula madre. En algunos casos, la célula madre es una célula madre adulta (célula madre somática). En algunos casos, una célula madre adulta es una célula madre hematopoyética (HSC) o una célula progenitora hematopoyética (HPC). En algunos casos, la HSC proviene de la médula ósea (por ejemplo, médula ósea de la pelvis, fémur o esternón). En algunos casos, la HSC está en una muestra de sangre de cordón, por ejemplo, sangre de cordón umbilical. En algunos casos, la HSC proviene de la placenta. En algunos casos, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) se administra a un sujeto; el G-CSF puede inducir a las HSC a salir de la médula ósea y circular en los vasos sanguíneos. En algunos casos, la HSC está en sangre periférica (por ejemplo, sangre periférica de adulto movilizada con G-CSF). En algunos casos, la célula madre es una célula madre a largo plazo o una célula progenitora a corto plazo. En algunos casos, las células madre se utilizan para expansión ex vivo y los productos de la expansión ex vivo se purifican usando métodos y dispositivos descritos en el presente documento. En algunos casos, la célula madre deriva del tejido adiposo (células madre derivadas de tejido adiposo (ASC)). En algunos casos, las células madre derivan de un producto de digestión por colengasa del tejido adiposo.

En algunos casos, una HSC (por ejemplo, HSC indiferenciada) puede identificarse mediante uno o más señalizadores de la superficie celular. En algunos casos, la caracterización o identificación de una HSC (por ejemplo, HSC indiferenciada) comprende identificar la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de uno o más señalizadores de la superficie celular. La identificación puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, HSC) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más de los señalizadores (por ejemplo, de la superficie celular). El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La identificación puede realizarse mediante la identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de los señalizadores (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). El señalizador puede ser un señalizador de la superficie celular o intracelular. El agente de unión puede ser cualquier agente de unión conocido en la técnica (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, sonda (por ejemplo, sonda de ácido nucleico), etc.). Un señalizador de la superficie celular en una HSC puede ser un grupo de glicoproteínas transmembrana de diferenciación (CD). El CD puede ser CD 10, 31, 34, 38, 44, 45, 59, 84, 90, 93 (C1Rqp), 105 (Endoglina), 110, 111, 117 (c-Kit), 133, 135 (Flk-2), 150 (SLAM), 184 (CXCR4), 202b (Tie2/Tek), 243 9MDR-1), 271 (NGFR), 309 (VEGFR2), 338. Un señalizador de superficie celular en una HSC puede ser un señalizador de células madre hematopoyéticas, Receptor 2 de VEGF, CXCR4, Enzima convertidora de angiotensina 1, BCRP/ABCG2, Ly-6A/E (Sca-1). Un señalizador de la superficie de células HSC humanas puede ser, por ejemplo, CD34+, CD59+*, Thy1+, CD38bajo/', C-kit'/baj° o lin-. Un señalizador de la superficie celular de HSC de ratón puede ser, por ejemplo, CD34bajo/-, SCA-1+, Thy1+/baj° CD38+, C-kit+ o lin-. Un señalizador intracelular puede ser, por ejemplo, At F2, g AtA 1, GATA2, GFI1 o RUNX1/AML1.

Una HSC puede dar lugar a células sanguíneas, por ejemplo, glóbulos rojos, linfocitos B, linfocitos T, células asesinas naturales, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos y macrófagos.

Una célula madre adulta (célula madre somática) puede ser una HSC, una célula madre mesenquimatosa, una célula madre neural, una célula madre epitelial o una célula madre de la piel. En algunos casos, la célula madre es una célula madre mesenquimatosa. Una célula madre mesenquimatosa puede dar lugar a, por ejemplo, células óseas (osteocitos), células de cartílago (condrocitos), células grasas (adipocitos) y otros tipos de células del tejido conectivo, tales como las de los tendones.

En algunos casos, la célula madre es una célula madre neural. Se puede encontrar una célula madre neural en el cerebro. Una célula madre neural puede dar lugar a, por ejemplo, células nerviosas (neuronas) y dos categorías de células no neuronales, por ejemplo, astrocitos y oligodendrocitos. En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para identificar una célula madre neural. La identificación de una célula madre neural puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, célula madre neural) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más señalizadores (por ejemplo, señalizadores de la superficie celular o intracelulares) expresados por células madre neurales. El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La identificación puede realizarse mediante la identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de los señalizadores (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). Los señalizadores pueden ser señalizadores de la superficie celular, por ejemplo, CD 15, 24 o 184. Los señalizadores pueden ser señalizadores intracelulares, por ejemplo, Nestina, Pax6, Sox1 o Sox2.

En algunos casos, la célula madre es una célula madre del epitelio intestinal. Una célula madre del epitelio intestinal puede revestir el tracto digestivo y puede aparecer en criptas profundas. Una célula madre del epitelio intestinal puede dar lugar a células absorbentes, células caliciformes, células de Paneth y/o células enteroendocrinas. En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para identificar una célula madre del epitelio intestinal. La identificación de una célula del epitelio intestinal puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, una célula madre del epitelio intestinal) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más señalizadores (por ejemplo, señalizadores de la superficie celular o intracelulares) expresados por una célula madre del epitelio intestinal. El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La identificación puede realizarse mediante la identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de los señalizadores (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). Los señalizadores pueden ser señalizadores intracelulares o de la superficie celular conocidos en la técnica. Los señalizadores pueden ser, por ejemplo, CD 44, ICAM-1/CD54, CD34, Lrig1, Lgr5, Bmi1, Tert o Hopx.

En algunos casos, la célula madre es una célula madre de la piel. Una célula madre de la piel puede aparecer en la capa basal de la epidermis y en la base de los folículos pilosos. Una célula madre epidérmica puede dar lugar a queratinocitos, que pueden migrar a la superficie de la piel y formar una capa protectora. Las células madre foliculares pueden dar lugar tanto al folículo piloso como a la epidermis. En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para identificar una célula madre de la piel. La identificación de una célula madre de la piel puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, célula madre de la piel) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más señalizadores (por ejemplo, señalizadores de la superficie celular o intracelulares) expresados por células madre de la piel. El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La identificación puede realizarse mediante la identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de los señalizadores (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). Los señalizadores pueden ser señalizadores intracelulares o de la superficie celular conocidos en la técnica. Los señalizadores pueden ser, por ejemplo, CD 34, K15, Nestina, Folistatina, p63, Integrina alfa 6, Tenascina C, EGFR, IGFR, Delta 1, Tb RiI o factores Frizzled.

En algunos casos, la célula madre es una célula madre embrionaria (ES). Una célula madre embrionaria puede derivar de embriones que se desarrollan a partir de un óvulo que se ha fertilizado in vitro. En algunos casos, la célula madre embrionaria es una célula madre embrionaria humana. En algunos casos, la célula madre es una célula madre pluripotente inducida (iPSC). La iPSC puede ser una célula somática que se reprograma genéticamente a un estado similar al de una célula madre embrionaria. En algunos casos, la célula madre es una célula madre indiferenciada. En algunos casos, la célula madre es una célula madre cancerosa. En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para identificar una célula ES. La identificación de una célula ES puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, célula ES) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más señalizadores (por ejemplo, señalizadores de la superficie celular o intracelulares) expresados por células ES. El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La identificación puede realizarse mediante la identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de los señalizadores (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). Los señalizadores pueden ser señalizadores de la superficie celular, por ejemplo, CD 9, 15 (SSEA-1), 49f, 24, 29, 324, 338, SSEA-3, Ss Ea -4, SSEA-5, TRA-1-81, TRA-1-60, TRA-2-49 o TRA-2-54. Los señalizadores pueden ser un señalizador intracelular, por ejemplo, c-Myc, Nanog, FOXD3, OCT3/4. Stat-3 o Sox2.

En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para identificar una célula madre mesenquimatosa. La identificación de una célula madre mesenquimatosa puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, célula madre mesenquimatosa) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más señalizadores (por ejemplo, señalizadores de la superficie celular o intracelulares) expresados por células madre mesenquimatosas. El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La identificación puede realizarse mediante la identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de los señalizadores (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). Los señalizadores pueden ser señalizadores de la superficie celular, por ejemplo, CD 10, 13, 29, 31, 44, 45RO, 49a, 49e, 51, 54, 56, 73, 90, 105 (Endoglina), 106 (VCAM-1), 117 (c-kit), 166 (ALCAM), 349 (Frizzled-9), TfR, BMPRs-IA, IB y II, N-cadherina, SSEA-4, STRO-1, Sca-1/Ly6, PDGF R alfa, HLA de clase I, Antígeno carcinoembrionario, Integrina 5a, Integrina p1, p75, Receptor de NGF, Sprouty 2 o TNAP. Los señalizadores pueden ser señalizadores intracelulares, por ejemplo, Fosfatasa alcalina ósea, dbx2, Flightless 1, KLF5, Spi1, Tafazzin, nucleostemina o vimentina.

D. Otras partículas

En algunos casos, una partícula que puede procesarse (por ejemplo, procesarse o tratarse química y/o enzimáticamente), purificarse, aislarse y/o concentrarse utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento puede ser una célula cancerosa, una célula tumoral circulante (CTC), una célula epitelial, una célula endotelial circulante (CEC), una célula madre circulante (CSC) o células madre cancerosas. En algunos casos, la partícula es una célula de médula ósea, célula de espuma de células progenitoras, célula fetal, célula mesenquimatosa, célula epitelial circulante, célula endometrial circulante, trofoblasto, célula del sistema inmunológico (hospedador o injerto), célula del tejido conjuntivo, bacteria, hongo, virus, protozoo, algas o células vegetales. En algunos casos, la partícula es una micropartícula.

En algunos casos, la partícula es un fragmento celular. En algunos casos, el fragmento celular es una proteína. En algunos casos, la proteína es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunos casos, el fragmento celular es un receptor de células T. En algunos casos, la proteína es una inmunoglobulina. En algunos casos, la partícula es un polipéptido.

En algunos casos, la partícula es una célula rara, por ejemplo, un tipo de célula con una abundancia de menos de 1000 en una muestra de un ml, por ejemplo, células tumorales circulantes (CTC), células fetales circulantes, células madre o células infectadas por un virus o parásito. Si la muestra es una muestra de agua, una célula rara puede ser una bacteria patógena o una célula infectada con un virus.

En algunos casos, el fragmento celular es un ácido nucleico. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ADN o ARN. El ADN puede ser ADN genómico, ADN mitocondrial y/o ADN libre de células. El ARN puede ser, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ARNr), ARN de transferencia (ARNt), ARN de partículas de reconocimiento de señales, ARN nuclear pequeño, ARN nucleoar pequeño, ARN SmY, ARN específico de cuerpos de Cajal pequeño, ARN de la telomerasa, ARN líder empalmado, ARN antisentido, ARN CRISPR, ARN no codificante largo (ARNnc largo), microARN (miARN), ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN de horquilla corta (ARNhc), ARNip de acción trans, ARNip asociado a repeticiones y/o ARN libre de células. En algunos casos, el "ácido nucleico" es bicatenario. En algunos casos, el "ácido nucleico" es monocatenario. En algunos casos, el ácido nucleico comprende uno o dos salientes. En algunos casos, el ácido nucleico comprende un saliente 5'. En algunos casos, el ácido nucleico comprende un saliente 3'. En algunos casos, el ácido nucleico comprende un ácido nucleico de "alto peso molecular". En algunos casos, el ácido nucleico es un ácido nucleico de bajo peso molecular. En algunos casos, el ácido nucleico es intranuclear, intracelular o extracelular.

Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" o equivalentes gramaticales, pueden referirse a dos o más nucleótidos unidos covalentemente entre sí. Un ácido nucleico descrito en el presente documento puede contener enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, como se indica a continuación (por ejemplo, en la construcción de cebadores y sondas tales como sondas marcadoras), se incluyen análogos de ácido nucleico que pueden tener cadenas principales alternativas, que comprenden, por ejemplo, fosforamida (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925 (1993) y referencias citadas en el mismo; Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14: 3487 (1986); Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); y Pauwels et al., Chemica Scripta 26:141 91986)), fosforotioato (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991); y la patente de Estados Unidos N.° 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2321 (1989), enlaces O-metilfosforoamidita (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) y cadenas principales y enlaces de ácidos peptidonucleicos (también denominados en el presente documento "APN") (véase Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380:207 (1996)). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen los que tienen estructuras bicíclicas entre los que se incluyen ácidos nucleicos bloqueados (también denominados en el presente documento "ANB"), Koshkin et al., J. Am. Chem. Soc. 120.13252 3 (1998); cadenas principales positivas (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995); cadenas principales no iónicas (Patentes de Estados Unidos N.° 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994); Capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. YS Sanghui y P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) y cadenas principales sin ribosa, entre las que se incluyen las descritas en las Patentes de Estados Unidos N.° 5.235.033 y 5.034.506, y Capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui y P. Dan Cook. También se incluyen dentro de la definición de ácidos nucleicos los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos (véase Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169 176). Se describen varios análogos de ácido nucleico en Rawls, C & E News 2 de junio de 1997, página 35. También se incluyen dentro de la definición de análogos de ácidos nucleicos los "ácidos nucleicos bloqueados". Los ANB pueden ser una clase de análogos de ácidos nucleicos en los que el anillo de ribosa está "bloqueado" por un puente de metileno que conecta el átomo 2'-0 con el átomo 4'-C. Estas modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato pueden realizarse para aumentar la estabilidad y la vida media de tales moléculas en entornos fisiológicos. Por ejemplo, los híbridos de APN:ADN y ANB-ADN pueden presentar mayor estabilidad y, por tanto, se pueden usar en algunas realizaciones. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, como se especifica, o contienen porciones de la secuencia bicatenaria o monocatenaria. Dependiendo de la aplicación, los ácidos nucleicos pueden ser ADN (incluyendo, por ejemplo, ADN genómico, ADN mitocondrial y ADNc), ARN (incluyendo, por ejemplo, ARNm y ARNr) o un híbrido, donde el ácido nucleico contiene cualquier combinación de desoxirribo- y ribo-nucleótidos, y cualquier combinación de bases, incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xathanina, hipoxatina, isocitosina, isoguanina, etc.

En algunos casos, el fragmento celular es una membrana, orgánulo celular, nucleosoma, exosoma o núcleo. En algunos casos, el fragmento celular es una mitocondria, retículo endoplasmático rugoso, ribosoma, retículo endoplasmático liso, cloroplasto, aparato de Golgi, cuerpo de Golgi, glucoproteína, glucolípido, cisternas, liposoma, peroxisoma, glioxisoma, centríolo, citoesqueleto, lisosoma, cilios, flagelo, vacuola contráctil, vesícula, envuelta nuclear, vacuola, membrana celular, microtúbulo, nucléolo, membrana plasmática o cromatina.

Una o más partículas descritas en el presente documento pueden estar en una muestra. En algunos casos, En una muestra pueden estar uno o más tipos diferentes de partículas descritos en el presente documento.

E. Tamaños de partículas

En algunos casos, una partícula procesada (por ejemplo, procesada o tratada químicamente), purificada, aislada y/o concentrada utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento, tiene un tamaño de partícula predeterminado (o tamaño crítico de partícula). En algunos casos, las partículas con un tamaño al menos de un tamaño de partícula predeterminado se dirigen a una primera salida en un dispositivo, mientras que las partículas inferiores a un valor predeterminado se dirigen a una segunda salida en un dispositivo. En algunos casos, el tamaño de partícula es el diámetro de la partícula.

En algunos casos, el tamaño de partícula es al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4.5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18.5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 |jm.

En algunos casos, el tamaño de partícula es aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17.5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 jm .

En algunos casos, el tamaño de partícula es menor que 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 jm .

En algunos casos, el tamaño de partícula es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 jm , de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 jm , de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 jm , de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 jm , de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 jm , de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 jm , de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 jm , de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 jm , de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 jm , de aproximadamente 70 a aproximadamente 80 jm , de aproximadamente 80 a aproximadamente 90 jm o de aproximadamente 90 a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 200 a aproximadamente 300 jm , de aproximadamente 300 a aproximadamente 400 jm , de aproximadamente 400 a aproximadamente 500 jm , de aproximadamente 500 a aproximadamente 600 jm o de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 jm .

En algunos casos, donde la partícula es un polinucleótido, el polinucleótido comprende al menos 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000 o 100.000 bases.

En algunos casos, donde la partícula es un polinucleótido, el polinucleótido comprende aproximadamente 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000 o 10.000.000 bases. En algunos casos, el polinucleótido es un cromosoma completo. En algunos casos, el polinucleótido es un cromosoma humano 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X o Y.

En algunos casos, donde la partícula es un polinucleótido, el polinucleótido comprende menos de 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000 o 10.000.000 bases.

En algunos casos, el polinucleótido comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 bases, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 bases, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 bases, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 bases, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 2000 bases, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 5000 bases, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 10.000 bases, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 50.000 bases o de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 100.000 bases.

III. Muestras

Las partículas de las muestras pueden procesarse (por ejemplo, procesarse o tratarse química o enzimáticamente), purificarse, aislarse y/o concentrarse utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento.

A. Tipos de muestras

En algunos casos, la muestra es una muestra biológica. En algún caso, la muestra biológica es sangre. La muestra de sangre puede ser, por ejemplo, sangre periférica, sangre materna, sangre periférica de adulto movilizada con G-CSF o sangre de cordón. La sangre de cordón puede ser, por ejemplo, sangre de cordón umbilical o sangre de cordón placentario.

En algunos casos, la muestra biológica es suero, plasma, sudor, lágrimas, flujo del oído, esputo, líquido sinovial, linfa, suspensión de médula ósea, orina, saliva, semen, flujo o secreción vaginal, líquido cefalorraquídeo, heces, lavado cervical, sebo, semen, fluido prostático, fluido de Cowper, líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, líquido cerebral (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo), ascitis, leche (por ejemplo, leche materna), cerumen, secreciones del tracto respiratorios, intestinal o genitourinario, líquido de lavado broncoalveolar, líquido amniótico, humor acuoso y muestras de agua). Una muestra puede ser fluidos en los que se han introducido células (por ejemplo, medios de cultivo y muestras de tejido licuado). Una muestra puede ser un lisado. Una muestra biológica puede ser cabello, líquido quístico, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, líquido menstrual, pus, sebo, secreción mucosa, agua fecal, jugo pancreático, líquido de lavado de cavidades sinusales, aspirado broncopulmonar o líquido de la cavidad blastocele. La muestra biológica puede ser una muestra de tejido o una biopsia. Una muestra de fluido de un organismo o una que ha sido solubilizado puede ser de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 500, 1000 o 1500 ml.

En algunos casos, la muestra biológica es de un animal, por ejemplo, ser humano, ratón, rata, gato, perro, vaca, pollo, burro, conejo, chimpancé, gorila, orangután, caballo, cobaya, cerdo o mono rhesus.

En algunos casos, la muestra biológica es de una planta. En algunos casos, la muestra biológica comprende una planta.

En algunos casos, la muestra biológica es de un hongo. En algunos casos, la muestra biológica comprende un hongo.

En algunos casos, la muestra comprende leucocitos y eritrocitos.

En algunos casos, la muestra comprende células. En algunos casos, la muestra comprende células muertas y/o desechos. Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para la eliminación basada en el tamaño de desechos y/o células muertas de una muestra que comprende células. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procedimientos de lavado de células. En algunos casos, la muestra es una muestra de cultivo celular. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar células de otros componentes en una muestra de cultivo celular, por ejemplo, medio, factores de crecimiento, etc.

En algunos casos, la muestra comprende un tampón. El tampón puede estar libre o sustancialmente libre de un reactivo. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para el intercambio de tampón/medio.

En algunos casos, la muestra comprende tejido adiposo digerido con enzimas. En algunos casos, el tejido adiposo digerido con enzimas es una fuente de células progenitoras autólogas. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para limpiar tejido adiposo digerido con enzima (por ejemplo, colagenasa) como fuente de células progenitoras autólogas, por ejemplo, para purificar células madre del tejido adiposo digerido con enzimas.

En algunos casos, una muestra comprende células cancerosas de tumores. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar químicamente), aislar, purificar y/o concentrar células cancerosas de tumores.

En algunos casos, una muestra comprende células hospedadoras infiltrantes o estromales de un tumor. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar células infiltrantes o células hospedadoras estromales de un tumor. Por ejemplo, los linfocitos que se infiltran en tumores pueden ser glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo y migrado a un tumor. Las células estromales pueden ser tejido conjuntivo. Las células estromales pueden proporcionar una matriz extracelular en la que pueden crecer tumores.

En algunos casos, una muestra es una muestra industrial. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar partículas en una muestra industrial.

En algunos casos, una muestra comprende algas, levaduras, bacterias o un virus. En algunos casos, Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar algas, levaduras, bacterias y/o un virus. Por ejemplo, una muestra con levadura puede ser una muestra de producción de cerveza. Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar levaduras a partir de la muestra de una muestra de producción de cerveza.

En algunos casos, la muestra comprende un anticuerpo. En algunos casos, Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar un anticuerpo a partir de una muestra que comprende un anticuerpo.

En algunos casos, la muestra comprende plantas, mitocondrias, lentivirus, exosomas o células en división. Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar plantas, mitocondrias, lentivirus, exosomas o células en división de la muestra.

En algunos casos, la muestra comprende células en diferentes fases del ciclo celular, G0 (Intervalo 0/En reposo), G1 (Intervalo 1), S (Síntesis), M (Mitosis) o G2 (Intervalo 2). Las células pueden tener diferentes tamaños en diferentes fases del ciclo celular. En algunos casos, los métodos y dispositivos descritos en el presente documento se utilizan para separar células en diferentes fases del ciclo celular.

En algunos casos, la muestra es de una masa de agua. La masa de agua puede ser, por ejemplo, de un arroyo, charca, río, océano, alberca, mar, charco, canal de corriente, humedal, embalse, depósito, puerto, bahía, alberca artificial, barachois, cuenca, brazo pantanoso, riachuelo, ensenada, poza, hervido, rivera, regato, canal, caleta, extracción, estuario, desembocadura, fiordo, glaciar, golfo, cala, tetera, pieza, laguna, lago, manglar, mar mediterráneo, balsa, estanque de molino, foso, alberca de herradura, fitotelma, piscina (piscina, piscina reflectante), cueva, rápido, rada, torrente, marisma, lago de mar, brazo de mar, fuente, manantial, estrecho, corriente, subglacial, alberca, pantano, lago de montaña, piscina de marea, humedad temporal, aguada o humedal. Una muestra de agua puede ser una aguada de tanque de lastre, por ejemplo, procedente de un buque de transporte (véase, por ejemplo, //news.sciencemag.org/biology/2015/01/tests-used-ensure-ships-don-t-carry-deadly-cargo-draw-sharp-criticism).

En algunos casos, la muestra procede de un ataque de bioterrorismo. En algunos casos, la muestra de un ataque de bioterrorismo comprende un virus, por ejemplo, virus de la viruela o virus de la gripe. En algunos casos, la muestra de un ataque de bioterrorismo comprende ántrax. En algunos casos, la muestra de un ataque de bioterrorismo comprende más de un tipo de agente infeccioso.

En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento se utilizan para purificar virus de células, por ejemplo, un lentivirus. Los ejemplos de lentivirus incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la inmunodeficiencia de simios, virus de la inmunodeficiencia felina, lentivirus del puma, virus de la anemia infecciosa equina, virus de la inmunodeficiencia bovina, virus de la artritis encefalitis caprina o virus Visna. En algunos casos, el virus se puede purificar a partir de células y/o desechos celulares.

En algunos casos, la muestra procede de un hospital u otro centro de atención médica. En algunos casos, la muestra es de una instalación de tratamiento de aguas residuales. En algunos casos, la muestra procede de una instalación de producción de biocombustible de algas. En algunos casos, la muestra procede de una cervecería. En algunos casos, la muestra procede de un sistema público de agua. En algunos casos, la muestra procede de un sistema de alcantarillado.

En algunos casos, la muestra procede de un derrame químico. En algunos casos, la muestra procede de una mina, por ejemplo, mina de carbón. En algunos casos, la muestra es una muestra arqueológica. En algunos casos, la muestra es una muestra forense.

En algunos casos, los eritrocitos de las muestras no están lisados. En algunos casos, los eritrocitos de las muestras están lisados.

En algunos casos, la muestra comprende uno o más marcadores. En algunos casos, la muestra comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 marcadores diferentes. En algunos casos, el marcador es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, colorante, tinte (por ejemplo, bromuro de etidio), adaptador de ácido nucleico, partícula radiactiva, partícula fluorescente, oligonucleótido, sonda o sonda marcada con fluorescencia. En algunos casos, el marcador está unido, ligado o conjugado con un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, colorante, tinte (por ejemplo, bromuro de etidio), adaptador de ácido nucleico, partícula radiactiva, partícula fluorescente, oligonucleótido, sonda o sonda marcada con fluorescencia. En algunos casos, un dispositivo, método, composición, sistema y/o kit como se proporciona en el presente documento procesa una partícula (por ejemplo, una célula) de manera que la partícula (por ejemplo, la célula) comprenda un primer marcador y un segundo marcador. El primer y el segundo marcadores pueden ser marcadores diferentes. El primer marcador puede unirse, conjugarse o ligarse a un agente de unión como se proporciona en el presente documento dirigido a un señalizador de la superficie de la partícula (por ejemplo, señalizador de la superficie celular), mientras que el segundo marcador puede unirse, conjugarse o ligarse a un agente de unión como se proporciona en el presente documento dirigido a un señalizador en el interior de la partícula (por ejemplo, señalizador intracelular). El marcador puede ser cualquier marcador proporcionado en el presente documento.

En algunos casos, la muestra comprende una enzima, por ejemplo, una enzima de restricción, quinasa (por ejemplo, ADN quinasa (por ejemplo, polinucleótido quinasa de T4), proteína quinasa, por ejemplo, serina quinasa, treonina quinasa, tirosina quinasa), DNasa, RNasa, fosfatasa, ligasa (por ejemplo, ARN ligasa, ADN ligasa), peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (FAL), glucosa oxidasa, polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa termoestable, polimerasa Taq) ARN polimerasa), desoxinucleotidil transferasa terminal, transcriptasa inversa (por ejemplo, transcriptasa inversa viral, transcriptasa inversa no viral), telomerasa, metilasa o topoisomerasa. En algunos casos, los métodos y/o dispositivos usados en el presente documento se pueden usar para separar un marcador o enzima de otro componente de una muestra, por ejemplo, un polinucleótido o una célula.

B. Número de partículas/número de diferentes tipos de partículas en una muestra

Una muestra puede comprender una o más primeras partículas. En algunos casos, la muestra puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000, 100.000.000, 1.000. 000.000, 10.000.000.000, 100.000.000.000 o 1.000.000.000.000 primeras partículas. La muestra puede comprender aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000, 100.000. 000, 1.000.000.000, 10.000.000.000, 100.000.000.000 o 1.000.000.000.000 primeras partículas. En algunos casos, la muestra comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 primeras partículas, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 primeras partículas, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 primeras partículas, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 primeras partículas, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 primeras partículas, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10.000 primeras partículas, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 100.000 primeras partículas, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 1.000.000 primeras partículas, de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 10.000. 000 primeras partículas, de aproximadamente 10.000.000 a aproximadamente 100.000.000 primeras partículas, de aproximadamente 100.000.000 a aproximadamente 1.000.000.000 primeras partículas, de aproximadamente 1.000.000.000 a aproximadamente 10.000.000.000 primeras partículas, de aproximadamente 10.000. 000.000 a aproximadamente 100.000.000.000 primeras partículas o de aproximadamente 100.000.000.000 a aproximadamente 1.000.000.000.000 primeras partículas.

En algunos casos, la muestra comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000, 1.000. 000, 10.000.000, 100.000.000, 1.000.000.000, 10.000.000.000, 100.000.000.000 o 1.000.000.000.000 partículas en total. La muestra puede comprender aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000, 100.000.000, 1.000.000.000, 10.000.000.000, 100.000.000.000 o 1.000. 000.000.000 primeras partículas. En algunos casos, la muestra comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 partículas en total, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 partículas en total, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 partículas en total, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 partículas en total o de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 partículas en total, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10.000 partículas en total, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 100.000 partículas en total, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 1.000.000 partículas en total, de aproximadamente 1.000. 000 a aproximadamente 10.000.000 partículas en total, de aproximadamente 10.000.000 a aproximadamente 100.000. 000 partículas en total, de aproximadamente 100.000.000 a aproximadamente 1.000.000.000 partículas en total, de aproximadamente 1.000.000.000 a aproximadamente 10.000.000.000 partículas en total, de aproximadamente 10.000.000.000 a aproximadamente 100.000.000.000 partículas en total o de aproximadamente 100.000. 000.000 a aproximadamente 1.000.000.000.000 partículas en total.

La muestra puede comprender uno o más tipos diferentes de partículas. La muestra puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000, 100.000.000, 1.000.000.000, 10.000. 000.000, 100.000.000.000 o 1.000.000.000.000 de tipos diferentes de partículas. La muestra puede comprender aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000, 100.000. 000, 1.000.000.000, 10.000.000.000, 100.000.000.000 o 1.000.000.000.000 tipos de partículas diferentes. En algunos casos, la muestra comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 tipos de partículas diferentes o de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 100.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 1.000.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 10.000.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 10.000.000 a aproximadamente 100.000.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 100.000.000 a aproximadamente 1.000.000.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 1.000.000.000 a aproximadamente 10.000.000.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 10.000.000.000 a aproximadamente 100.000.000.000 tipos de partículas diferentes o de aproximadamente 100.000. 000.000 a aproximadamente 1.000.000.000.000 tipos de partículas diferentes.

C. Relación de primera y segunda partículas en una muestra

En algunos casos, la muestra comprende una primera partícula y una segunda partícula. Una muestra puede comprender solo un tipo de partícula, por ejemplo, una partícula de menos de un tamaño predeterminado o una partícula de al menos un tamaño predeterminado. En algunos casos, la relación de la abundancia entre la primera partícula y la segunda partícula en la muestra es menor que 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000, 1:10.000.000, 1:100.000.000 o 1:1.000.000.000. En algunos casos, la relación de la abundancia entre la primera partícula y la segunda partícula en la muestra es mayor que 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000, 1:10.000.000, 1:100.000.000 o 1:1.000.000.000. En algunos casos, la relación de la abundancia entre la primera partícula y la segunda partícula en la muestra es aproximadamente 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000, 1:10.000.000, 1:100.000.000 o 1:1.000.000.000.

En algunos casos, la muestra comprende un tipo de célula rara. En algunos casos, la relación entre la abundancia del tipo de célula rara y la abundancia de células de uno o más tipos celulares distintos en una muestra es aproximadamente 1:100, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000, 1:10.000.000, 1:100.000.000 o 1:1.000.000.000.

En algunos casos, la relación entre la abundancia de células del tipo de célula rara y la abundancia de células de uno o más tipos celulares distintos es menor que 1:100, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000, 1:10.000.000, 1:100.000.000 o 1:1.000.000.000.

D. Dilución de la muestra

En algunos casos, la muestra se diluye. En algunos casos, una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre, se diluye antes de aplicarse a un dispositivo descrito en el presente documento. Una muestra se puede diluir, por ejemplo, para evitar la obstrucción de un dispositivo descrito en el presente documento. En algunos casos, la muestra se diluye después de pasar a través de un dispositivo descrito en el presente documento.

Una muestra se puede diluir al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6.5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000 veces.

En algunos casos, una muestra se diluye aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3.5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17.5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000 veces.

Una muestra se puede diluir, por ejemplo, añadiendo agua, tampón y/u otro fluido a la muestra. En algunos casos, la muestra se diluye añadiendo un aditivo.

E. Obstrucciones y aditivos para muestras

En el presente documento se describen métodos para procesar grandes volúmenes de sangre con matrices de desplazamiento lateral determinista, por ejemplo, para el aislamiento de células raras. En algunos casos, los métodos descritos se pueden usar para extraer células tumorales circulantes de grandes volúmenes (-100 ml) de sangre completa de pacientes con cáncer o, por ejemplo, para extraer células madre de grandes volúmenes de sangre de cordón umbilical. Los métodos desvelados también son útiles para el procesamiento general de sangre utilizando matrices DLD.

En algunos casos, se utilizan matrices de desplazamiento lateral determinista (DLD) para extraer células raras de cientos de microlitros de sangre. Usando los métodos divulgados, se pueden utilizar matrices DLD para extraer células raras de cientos de mililitros de sangre. También se mejora la "robustez" de la técnica contra la obstrucción y el ensuciamiento para rendimientos más bajos para otras aplicaciones de sangre.

En algunos casos, un proceso para reducir la obstrucción comprende una combinación de cuatro técnicas: 1) aumento de la concentración del anticoagulante quelante de calcio EDTA de, por ejemplo, 1 mM a, por ejemplo, 5 mM; 2) adición de un inhibidor directo de la trombina, por ejemplo, PPACK a una concentración de, por ejemplo, 40 pM; 3) aumento de la velocidad de flujo 10 veces; y 4) aumento de 3 veces en la dilución de la sangre. En algunos casos, solo se realiza una técnica. En algunos casos, se realizan dos o más de las técnicas.

En algunos casos, se proporciona un kit que comprende un agente quelante de calcio y un inhibidor de trombina. En algunos casos, el kit incluye EDTA y PPACK.

Usando sangre con leucocitos teñidos con fluorescencia, el nivel de obstrucción se puede medir en función del volumen de sangre que ha pasado a través de la matriz DLD. Empleando el enfoque desvelado, -100 ml de sangre pueden pasar a través de la matriz DLD antes de obstruirse utilizando una combinación de los cuatro métodos anteriores, en comparación con unos cientos de microlitros en la situación previa.

La combinación de EDTA y PPACK se puede utilizar como tampón de ejecución para la dilución de la sangre en preparación para el procesamiento de la sangre con matrices DLD.

Se pueden usar matrices de desplazamiento lateral determinista para capturar leucocitos y células tumorales circulantes de la sangre con alto enriquecimiento y con altos caudales.

En algunos casos, el volumen de sangre que se puede procesar con estos dispositivos es limitado debido a la obstrucción de la matriz de micropostes (obstáculos). En algunos casos, mediante la eliminación de las plaquetas de la sangre antes de poner la sangre en las matrices, las plaquetas se pueden identificar como un contribuyente dominante a la obstrucción. Por ejemplo, hacer pasar leucocitos solos puede provocar una obstrucción mucho menor que hacer pasar sangre. En algunos casos, puede desactivarse un mecanismo biológico que causa la obstrucción, que puede producir una reducción de al menos 40 veces en la obstrucción. En algunos casos, se pueden usar caudales mayores y una mayor dilución de la sangre para conseguir una mayor reducción de la obstrucción de una matriz de micropostes.

Las condiciones fisiológicas en los dispositivos que comprenden una matriz de obstáculos (alto cizallamiento, aceleración y desaceleración repetidas rápidas) pueden ser diferentes de las que se encuentran en situaciones típicas que implican los estudios de coagulación sanguínea.

La obstrucción de una matriz de micropostes (obstáculos) puede causarse por uno o ambos de dos procesos complementarios mutuamente dependientes implicados en la hemostasia: coagulación y activación plaquetaria, que conducen a un coágulo. En algunos casos, los coágulos (que luego pueden atrapar leucocitos) pueden causar la obstrucción.

La FIG. 35 ilustra una vista simplificada de las posibles formas en las que estos dos procesos pueden interactuar para causar obstrucciones, así como los mecanismos subyacentes que pueden ser atacados para desactivar estos mecanismos. El ciclo puede iniciarse por tensión mecánica en las plaquetas debido a fuerzas de cizallamiento cuando las plaquetas pasan entre los postes en una matriz de micropostes, o su rápida aceleración y desaceleración causada por una estructura de micromatriz.

Los procesos relacionados con la coagulación están en el lado izquierdo del diagrama y los procesos plaquetarios están en el lado derecho del diagrama. Pueden interrelacionarse a través de trombina y vías y dependencias de calcio. En algunos casos, se pueden abordar tanto la trombina como las vías/dependencias de calcio para una máxima eficacia.

En algunos casos, tanto el alto caudal como la dilución conducen a un aumento del rendimiento máximo de sangre completa antes de que se produzca una obstrucción significativa.

En algunos casos, un mecanismo de obstrucción dominante es la actividad de integrinas dependientes de calcio en las superficies de las plaquetas, cuya interacción puede llevar a la agregación de plaquetas. En algunos casos, las integrinas dependientes de calcio son uno de los contribuyentes dominantes a la obstrucción inducida por plaquetas. En algunos casos, el aumento de la concentración de EDTA de 1 mM a 5 mM puede dar como resultado una reducción de 8 veces en la obstrucción. En algunos casos, una solución de citrato dextrosa ácido (ACD), tal como el EDTA, que quela el calcio en el plasma sanguíneo, tiene un efecto similar. La quelación del calcio también puede reducir las vías de coagulación (a la izquierda del diagrama).

En algunos casos, un mecanismo de obstrucción dominante se debe a los efectos de la trombina, por ejemplo, activación plaquetaria inducida por trombina. La trombina puede catalizar la conversión de fibrinógeno en fibrina como parte de una cascada de coagulación. En algunos casos, la trombina es un potente agonista activador de plaquetas. La heparina puede ser eficaz para reducir la obstrucción; puede reducir la formación de trombina.

En algunos casos, se puede combinar un quelante de calcio con un inhibidor de trombina. En algunos casos, la inhibición de la trombina con el inhibidor directo de trombina PPACK puede conseguir una reducción adicional de 5 veces en la obstrucción además de la que se consigue con una concentración de 5 mM de EDTA.

La FIG. 36 muestra estos resultados para el caso de una matriz con postes triangulares de 40 um con espacios de 27 um para la separación de leucocitos de la sangre.

Se han utilizado matrices de desplazamiento lateral determinista (DLD) para concentrar células tumorales circulantes (CTC) en sangre completa diluida a caudales de hasta 10 ml/min con eficiencias de captura superiores al 85 % (K. Loutherback et al., AIP Advances, 2012). En algunos casos, el volumen equivalente de sangre sin diluir que se puede procesar está limitado a 0,3 ml por matriz DLD debido a la obstrucción de la matriz. Dado que la concentración de CTC puede ser tan baja como 1-10 células/ml en muestras clínicas, el aumento del volumen de sangre que puede procesarse con matrices DLD puede permitir la recolección de un número suficiente de CTC para experimentos biológicos o estudios de diagnóstico clínico. Adicionalmente, mediante el impacto de células grandes, tales como CTC, en una corriente de tampón, se pueden utilizar matrices DLD para recoger CTC sin el efecto de fondo de partículas más pequeñas, tales como leucocitos, eritrocitos y plaquetas presentes en la sangre o, libres de plasma, dando como resultado un producto altamente enriquecido o concentrado (véase, por ejemplo, J.A. Davis, et al., PNAS, 2006).

En algunos casos, dos mecanismos biológicos pueden causar la obstrucción de la matriz y estos dos mecanismos pueden inhibirse. En algunos casos, la agregación plaquetaria inducida por cizallamiento es solo un contribuyente minoritario a la obstrucción de la matriz. En algunos casos, comparando la reducción de la obstrucción conseguida por los anticoagulantes quelantes de calcio EDTA y ACD con la conseguida por el inhibidor indirecto de trombina heparina, así como midiendo la reducción de la obstrucción dependiente de la concentración de EDTA, se puede identificar la actividad de las integrinas dependientes de calcio como contribuyente dominante a la obstrucción. En algunos casos, se puede usar la combinación de EDTA con el inhibidor directo de trombina PPACK para identificar la activación plaquetaria inducida por trombina como segundo mecanismo dominante que contribuye a la obstrucción. Usando una combinación de EDTA y PPACK, se puede demostrar una disminución de 40 veces en la obstrucción de la matriz, lo que puede permitir un aumento proporcional en el volumen de sangre procesada. Basándose en datos en un dispositivo de un solo canal (2 mm de anchura), se puede esperar que un chip completo pueda procesar cantidades de sangre >100 ml en 30 minutos sin obstrucciones significativas. Finalmente, en algunos casos, el complejo de integrina glicoproteína 11b/IIIa, que se activa por fuerzas de cizallamiento, se puede inhibir usando el inhibidor de la glicoproteína 11b/IIIa tirofiban para demostrar que la agregación plaquetaria inducida por cizallamiento juega solo un papel minoritario en la obstrucción de la matriz.

En algunos casos, una muestra puede comprender uno o más aditivos. En algunos casos, se añade un agente quelante a la muestra. En algunos casos, el agente quelante comprende un agente quelante de calcio. En algunos casos, el agente quelante comprende acetilacetona, aerobactina, aminoetiletanolamina, ácido aminopolicarboxílico, ATMP, BAPTA, BDTH2, benzotriazol, Bipiridina, 2,2'-Bipiridina, 4,4'-Bipiridina, 1,2-Bis(dimetilarsino)benceno, 1,2-Bis(difenilfosfino)etano, 1,2-Bis(difenilfosfino)etano, Catecol, Chelex 100, Ácido cítrico, Corrole, Éter de corona, 18-Corona-6, Criptando, 2.2.2-Criptando, Cyclen, Deferasirox, Deferiprona, Deferoxamina, Dexrazoxano, Trans-1,2-diaminociclohexano, 1,2-Diaminopropano, Dibenzoilmetano, Dietilentriamina, Diglyme, Ácido 2,3-dihidroxibenzoico, Dimercaprol, Ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfónico, Ácido dimercaptosuccínico, Dimetilglioxima, DIOP, Difeniletilendiamina, DOTA, DOTA-TATE, DTPMP, EDDH, EDDS, EDTMP, EGTA, 1,2-Etanoditiol, Etilendiaimina, Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), Ácido etidrónico, Porfirinas extendidas, Ferricromo, Fluo-4, Fura-2, Ácido glucónico, Glioxal-bis(mesitilimina), Hexafluoroacetilacetona, Ácido homocítrico, Ácido iminodiacético, Indo-1, Acetilacetonatos de metales, Complejo de ditioleno metálico, Corona de metal, Ácido nitrilotriacético, Pendetide, Penicilamina, Ácido pentético, Phanephos, Fenantrolina, O-fenilendiamina, Fosfonato, Fitoquelatina, Ácido poliaspártico, Porfina, Porfirina, 3-Piridilnicotinamida, 4-Piridilnicotinamida, Dietilditiocarbamato de sodio, Poliaspartato de sodio, Terpiridina, Tetrametiletilendiamina, Tetrafenilporfirina, 1,4,7-Triazaciclononano, Trietilentetramina, Trifos, Citrato trisódico o 1,4,7-tritiaciclononano. En algunos casos, dichos uno o más aditivos es Kolliphor®, por ejemplo, Kolliphor® P 188 (poli(etilenglicol)-bloque-poli(propilenglicol)-bloque-poli(etilenglicol). En algunos casos, dicho uno o más aditivos comprenden Kolliphor® ELP, EL, RH 40, CS12, CS20, CS B, CS S, CS A, CS L, TPGS, PS 60, PS 80, HS15, P 407, P 237 o P 338. La concentración de un Kolliphor puede ser de aproximadamente el 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 %. Por ejemplo, Kolliphor® puede ser Sigma K4894-500 g o Sigma P5556.

En algunos casos, la muestra, por ejemplo, una muestra de sangre, se recoge en un tubo que comprende K²EDTA o K³EDTA.

En algunos casos, la muestra comprende un agente que reduce la actividad de las integrinas dependientes de calcio. En algunos casos, la muestra comprende un agente que reduce la formación de trombina dependiente del calcio.

En algunos casos, un agente que quela calcio comprende citrato dextrosa ácido (ACD). La concentración final de ACD en una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre, puede ser del 10 %.

En algunos casos, el agente quelante es EDTA. En algunos casos, el agente quelante de calcio es EDTA. En algunos casos, la concentración final del agente quelante en la muestra es al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1.5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5 o 20 mM. En algunos casos, la concentración final de EDTA en la muestra es al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 mM. En algunos casos, la concentración de EDTA es de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 7 mM, o de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 6 mM.

En algunos casos, se añaden uno o más inhibidores de trombina a una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre. En algunos casos, el inhibidor de trombina es un inhibidor directo de trombina. En algunos casos, el inhibidor directo de trombina es un inhibidor de trombina bivalente. En algunos casos, el inhibidor directo de trombina es un inhibidor de trombina univalente. En algunos casos, el inhibidor directo de trombina es un inhibidor alostérico. Un inhibidor directo de trombina bivalente puede ser hirudina, bivalirudina, lepirudina o desirudina. Un inhibidor directo de trombina univalente puede ser argatrobán, melagatrán, ximelagatrán o dabigatrán. Un inhibidor directo de trombina alostérico puede ser un aptámero de ADN, dímero de benzofurano, trímero de benzofurano o lignina polimérica. En algunos casos, un inhibidor directo de trombina es PPACK (D-Phe-Pro-Arg-CMK).

En algunos casos, el inhibidor de trombina es PPACK (D-Phe-Pro-Arg-CMK), clorhidrato de benzamidina, p-APMSF, clorhidrato de p-APMSF, clorhidrato de TLCK, inhibidor de uPA, diclorhidrato de PPACK o diclorhidrato de PPACK biotinilado. En algunos casos, la heparina es un inhibidor de trombina.

En algunos casos, la concentración final del inhibidor de trombina, por ejemplo, inhibidor directo de trombina en una muestra es al menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13.5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 o 400 |jM. En algunos casos, la concentración final de un inhibidor de trombina en una muestra es de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 j M, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 j M.

En algunos casos, la concentración final de PPACK en una muestra es al menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6.5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 o 400 j M. En algunos casos, la concentración final de PPACK en una muestra es de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 j M o de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 j M.

En algunos casos, se añaden a la muestra un agente quelante y un inhibidor de trombina. En algunos casos, se añaden a la muestra un agente quelante de calcio y un inhibidor de trombina. En algunos casos, se añaden a la muestra un agente quelante y un inhibidor de trombina y la muestra se diluye al menos 3 veces.

En algunos casos, la muestra comprende EDTA y PPACK. En algunos casos, la muestra comprende EDTA a una concentración de aproximadamente 5 mM y PPACK a una concentración de aproximadamente 40 j M. En algunos casos, una muestra de sangre comprende EDTA a una concentración de aproximadamente 5 mM y PPACK a una concentración de aproximadamente 40 j M.

En algunos casos, la muestra de sangre se diluye aproximadamente 3 veces y la muestra de sangre diluida comprende EDTA y PPACK. En algunos casos, la muestra de sangre se diluye aproximadamente 3 veces y la muestra de sangre diluida comprende EDTA a una concentración de aproximadamente 5 mM y PPACK a una concentración de aproximadamente 40 j M.

En algunos casos, una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre, comprende uno o más aditivos, por ejemplo, fluoruro de sodio (NaF), heparina, EDTA o citrato de sodio. En algunos casos, un aditivo es un agente anticoagulante o antiplaquetario, por ejemplo, clopidogrel, prasugrel, ticagrelor, ticlopidina, argatrobán, bivalirudina, dalteparina, enoxaparina, fondaparinux, heparina, solución heparínica de lavado, lepirudina, anagrelida, apixabán, aspirina, aspirina/dipiridamol, cilostazol, dabigatrán, dipiridamol, batroxobina, hementina, rivaroxabán, warfarina o uroquinasa.

En algunos casos, el anticoagulante es un antitrómbico, fibrinolítico o trombolítico.

En algunos casos, la sangre completa se diluye con PBS 1x con EDTA 2 mM y BSA al 0,5%. En algunos casos, la obstrucción en el dispositivo y los sistemas de la presente invención puede reducirse o evitarse reduciendo el volumen de la muestra introducida en los dispositivos y sistemas. Por ejemplo, la obstrucción se puede reducir o prevenir reduciendo el volumen de la muestra a no más de 150, 140, 130, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 o 1 pl. En algunos casos, la muestra introducida en un dispositivo o sistema puede tener un volumen no mayor que 1, 2, 3, 4, 5,

6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,

39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,

70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100,

101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,

124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146,

147, 148, 149 o 150 pl. En un caso particular, la muestra introducida en los dispositivos y sistemas puede tener un volumen no mayor que 100 pl.

F. Volúmenes de muestra

Las muestras se pueden aplicar a los dispositivos descritos en el presente documento, por ejemplo, dispositivos con matrices ordenadas de obstáculos, por ejemplo, dispositivos de desplazamiento lateral determinista (DLD). El volumen de muestra que puede aplicarse a un dispositivo y/o procesarse por un dispositivo puede ser al menos 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,7, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5,

7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20,

21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,

52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,

83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,

550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 ml.

El volumen de muestra que puede aplicarse a un dispositivo y/o procesarse por un dispositivo puede ser menor que

0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,7, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5,

5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5,

19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,

49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,

80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350,

400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 ml. En algunos casos, el volumen de muestra que se puede aplicar a un dispositivo y/o procesar por un dispositivo puede no ser superior a 150 pl. Por ejemplo, el volumen de muestra que puede aplicarse a un dispositivo y/o procesarse por un dispositivo puede no ser mayor que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,

63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,

94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118,

119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141,

142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150 pl. En un caso particular, el volumen de muestra que se puede aplicar a un dispositivo y/o procesar por un dispositivo puede no ser superior a 100 pl.

El volumen de muestra que se puede aplicar a un dispositivo y/o procesar por un dispositivo puede ser de aproximadamente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,7, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2,

2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5,

17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,

75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200,

250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 ml. En algunos casos, el volumen de muestra que se puede aplicar a un dispositivo y/o procesar por un dispositivo puede ser aproximadamente

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 55, 56, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,

79, 80, 81, 82, 83, 86, 87, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140,

144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150 pl. En un caso particular, el volumen de muestra que se puede aplicar a un dispositivo y/o procesar por un dispositivo puede ser de aproximadamente 100 pl.

El volumen de muestra que se puede aplicar al dispositivo y/o procesar por un dispositivo puede ser de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 ml, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 20 ml, de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 50 ml, de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 100 ml, de aproximadamente 20 ml a aproximadamente 100 ml, de aproximadamente 100 ml a aproximadamente 300 ml, de aproximadamente 100 ml a aproximadamente 1000 ml, de aproximadamente 100 ml a aproximadamente 500 ml o de aproximadamente 100 ml a aproximadamente 3000 ml.

G. Concentración de partículas en una muestra

En algunos casos, la concentración de primeras partículas, segundas partículas o partículas totales en una muestra es aproximadamente 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 o 1011 por ml de muestra.

En algunos casos, la concentración de primeras partículas, segundas partículas o partículas totales en una muestra es menor que 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 o 1011 por ml de muestra.

En algunos casos, la concentración de primeras partículas, segundas partículas o partículas totales en una muestra es al menos 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 o 1011 por ml de mu

IV. Dispositivos

Se describen dispositivos ilustrativos para separar partículas basándose en el tamaño, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N.° 7.150.812, 7.318.902, 7.472.794, 7.735.652, 7.988.840, 8.021.614, 8.282.799, 8.304.230, 8.579.117 y en la Publicación PCT N.° WO2012094642. Las partículas y muestras descritas en el presente documento pueden aplicarse a dispositivos descritos en el presente documento para conseguir una separación basada en el tamaño, por ejemplo, una separación basada en el tamaño de alto rendimiento.

La divulgación se refiere, en general, al campo de la separación de partículas tales como esferas, células, virus y moléculas. La divulgación se refiere a la separación de partículas basándose en su comportamiento de flujo en un campo de obstáculos lleno de fluido en el que el transporte advectivo de partículas por un fluido en movimiento supera los efectos del transporte difusivo de partículas.

La separación de partículas por tamaño o masa puede ser una técnica analítica y preparativa fundamental en biología, medicina, química e industria. Los métodos incluyen electroforesis en gel, fraccionamiento de flujo de campo, cromatografía de sedimentación y exclusión por tamaño. Se ha descrito la separación de partículas y biopolímeros cargados utilizando matrices de obstáculos a través las cuales pasan partículas bajo la influencia del flujo de fluido o un campo eléctrico aplicado. La separación de partículas mediante estos dispositivos de matriz de obstáculos puede estar mediada por interacciones entre los biopolímeros y los obstáculos y por el comportamiento de flujo del fluido que pasa entre los obstáculos.

Se ha desvelado una diversidad de matrices de tamizado microfabricadas para separar partículas (Chou et. al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 13762; Han, et al., 2000, Science 288:1026; Huang et al., 2002, Nat. Biotechnol. 20:1048;

Turner et al., 2002, Phys. Rev. Lett. 88(12):128103; Huang et al., 2002, Phys. Rev. Lett. 89:178301; Patente de Estados Unidos N.° 5.427.663; Patente de Estados Unidos N.° 7.150.812; Patente de Estados Unidos N.° 6.881.317). Estas matrices pueden depender de la fabricación precisa de pequeñas características (por ejemplo, postes u obstáculos en un canal microfluídico). La precisión con la que se pueden fabricar pequeñas características puede estar limitada en todos los métodos de microfabricación, especialmente a medida que disminuye el tamaño de las características. La resistencia y rigidez de los materiales en los que se fabrican las pequeñas características también pueden limitar la utilidad práctica del dispositivo fabricado. Adicionalmente, el pequeño tamaño de los espacios entre los obstáculos en dichas matrices puede hacer que las matrices sean susceptibles de obstruirse por partículas demasiado grandes para caber entre los obstáculos. La fabricación a escala micrométrica y nanométrica también puede requerir técnicas de fabricación del estado de la técnica, y los dispositivos fabricados utilizando dichos métodos pueden tener un coste elevado.

Se han descrito dispositivos de matriz de impacto (también conocida como "matriz de obstáculos") y se explica su funcionamiento básico, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 7.150.812. Haciendo referencia a las FIG. 3 y 4 de la Patente de Estados Unidos N.° 7.150.812, una matriz de impacto puede funcionar esencialmente segregando partículas que pasan a través de una matriz (generalmente, una matriz ordenada periódicamente) de obstáculos, produciéndose la segregación entre partículas que siguen la "dirección de la matriz" que se desplaza de la dirección del flujo general de fluido o de la dirección de un campo aplicado.

Al nivel de flujo entre dos obstáculos adyacentes en condiciones de número de Reynold relativamente bajo, el flujo de fluido puede ocurrir de forma laminar. Considerando el flujo volumétrico entre dos obstáculos en capas hipotéticas (por ejemplo, modelando el flujo considerando múltiples tubos de flujo adyacentes de igual flujo volumétrico entre los obstáculos, como se muestra en la FIG. 8 de la Patente de Estados Unidos N.° 7.150.812), la probabilidad de que el

fluido de una capa pase por un lado u otro del siguiente obstáculo (es decir, aguas abajo) puede calcularse mediante métodos convencionales (véase, por ejemplo, Inglis et al., 2006, Lab Chip 6: 655-658). Para una matriz ordenada de obstáculos desplazados de la dirección del flujo general de fluido, la disposición de los obstáculos puede definir una dirección de la matriz correspondiente a la dirección en la que se desplaza la mayoría de las capas de fluido entre dos obstáculos. Una minoría de capas de fluido puede desplazarse alrededor del obstáculo aguas abajo en una dirección diferente a la dirección de la matriz.

La trayectoria que puede tomar una partícula que pasa entre los dos obstáculos puede depender del flujo del fluido en las capas ocupadas por la partícula. Conceptualmente, para una partícula que tiene un tamaño igual a una de las capas de fluido hipotéticas descritas en el párrafo anterior, la partícula puede seguir la trayectoria de la capa de fluido en la que se encuentra, a menos que se difunda a una capa diferente. Para partículas más grandes que una sola capa de fluido, la partícula puede seguir la trayectoria correspondiente a la mayoría de las capas de fluido que actúan sobre ella. Las partículas que tienen un tamaño mayor que el doble de la suma de los espesores de la minoría de capas que se desplazan alrededor de un obstáculo aguas abajo en una dirección distinta a la dirección de la matriz pueden ser afectadas por más capas fluidas que se mueven en la dirección de la matriz, lo que significa que dichas partículas se desplazarán en la dirección de la matriz. Este concepto también se ilustra en las FIG. 5-11 de la Patente de Estados Unidos N.° 7.150.812. Por tanto, puede haber un "tamaño crítico" para las partículas que pasan entre dos obstáculos en dicha matriz, de modo que las partículas que tienen un tamaño mayor a ese tamaño crítico pueden desplazarse en la dirección de la matriz, en lugar de en la dirección del flujo general de fluido y las partículas que tienen un tamaño menor que el tamaño crítico pueden desplazarse en la dirección del flujo general de fluido. Las partículas que tienen un tamaño exactamente igual al tamaño crítico pueden tener la misma probabilidad de fluir en cualquiera de las dos direcciones. Al hacer funcionar un dispositivo de este tipo con un número de Peclet alto (es decir, de manera que el transporte advectivo de partículas por capas de fluido supere en gran medida a las partículas difusivas entre capas), se pueden ignorar los efectos de la difusión de partículas entre capas de fluidos.

A. Matrices de impacto

En el presente documento se describen formas de estructurar y hacer funcionar matrices de obstáculos para separar partículas. En algunas matrices de obstáculos, los obstáculos tienen formas y están dispuestos de modo que el perfil del flujo de fluido a través de los espacios entre obstáculos adyacentes sea simétrico con respecto a la línea central del espacio. La geometría de los obstáculos adyacentes puede ser tal que las porciones de los obstáculos que definen el espacio sean simétricas con respecto al eje del espacio que se extiende en la dirección del flujo general de fluido. La velocidad o el perfil volumétrico del flujo de fluido a través de dichos espacios puede ser aproximadamente parabólico a través del espacio, siendo la velocidad y el flujo del fluido cero en la superficie de cada obstáculo que define el espacio (asumiendo condiciones de flujo sin deslizamiento) y alcanzando un valor máximo en el punto central del espacio. Al ser parabólico el perfil, una capa de fluido de una anchura dada adyacente a uno de los obstáculos que definen el espacio puede contener una proporción igual de flujo de fluido que una capa de fluido de la misma anchura adyacente al otro obstáculo que define el espacio, lo que significa que el tamaño crítico de las partículas que "impactan" durante el paso a través del espacio es igual independientemente del obstáculo al que se acerque la partícula.

En algunos casos, el rendimiento de segregación de tamaños de partícula de una matriz de obstáculos se puede mejorar dando forma y disponiendo los obstáculos de manera que las porciones de los obstáculos adyacentes que desvían el flujo de fluido hacia un espacio entre obstáculos no sean simétricas con respecto al eje del espacio que se extiende en la dirección del flujo general de fluido. Tal falta de simetría de flujo en el espacio puede conducir a un perfil de flujo de fluido no simétrico dentro del espacio. La concentración del flujo de fluido hacia un lado de un espacio (es decir, una consecuencia del perfil de flujo de fluido no simétrico a través del espacio) puede reducir el tamaño crítico de las partículas que se introducen para desplazarse en la dirección de la matriz, en lugar de en la dirección del flujo general de fluido. Esto puede ser así porque la falta de simetría del perfil de flujo puede causar diferencias entre la anchura de la capa de flujo adyacente a un obstáculo que contiene una proporción seleccionada de flujo de fluido a través del espacio y la anchura de la capa de flujo que contiene la misma proporción de flujo de fluido y que es adyacente al otro obstáculo que define el espacio. Las diferentes anchuras de las capas de fluido adyacentes a los obstáculos definen un espacio que presenta dos tamaños críticos de partículas diferentes. Una partícula que atraviesa el espacio puede impactar (es decir, desplazarse en la dirección de la matriz, en lugar de en la dirección del flujo general de fluido) si excede el tamaño crítico de la capa de fluido en la que se transporta. Por tanto, es posible que una partícula que atraviesa un espacio que tiene un perfil de flujo no simétrico impacte si la partícula se desplaza en la capa de fluido adyacente a un obstáculo, pero no debe impactar si se desplaza en la capa de fluido adyacente al otro obstáculo que define el espacio.

Las partículas que atraviesan una matriz de obstáculos pasan a través de múltiples espacios entre obstáculos y tienen múltiples oportunidades de impactar. Cuando una partícula atraviesa un espacio que tiene un perfil de flujo no simétrico, la partícula puede impactar si el tamaño de la partícula excede los tamaños críticos (diferentes) definidos por las capas de flujo adyacentes a los dos obstáculos que definen el espacio. Sin embargo, la partícula a veces puede impactar si el tamaño de la partícula excede el tamaño crítico definido por la capa de flujo adyacente a uno de los dos obstáculos, pero no excede el tamaño crítico definido por la capa de flujo adyacente al otro obstáculo. En algunos casos, las partículas que no exceden el tamaño crítico definido por la capa de flujo adyacente a cualquiera de los obstáculos no pueden impactar. Hay al menos dos implicaciones que se derivan de esta observación.

En primer lugar, en un matriz de obstáculos en el que los obstáculos definen huecos que tienen un perfil de flujo no simétrico, las partículas que tienen un tamaño que excede el más pequeño de los dos tamaños críticos definidos por las capas de flujo adyacentes a los obstáculos se pueden separar de las partículas que tienen un tamaño más pequeño que el tamaño crítico más pequeño. El tamaño crítico definido por un espacio se puede disminuir alterando la simetría de flujo a través del espacio sin disminuir necesariamente el tamaño del espacio ("G" en la FIG. 1). La disminución del tamaño del espacio puede aumentar el coste y la dificultad de producir la matriz. Por el contrario, para un tamaño crítico dado, el tamaño del espacio que define ese tamaño crítico puede aumentarse alterando la simetría del flujo a través del espacio. Como es más probable que se obstruyan los espacios más pequeños con respecto a los más grandes, esta disposición puede mejorar la operatividad de las matrices, lo que permite un mayor rendimiento y una menor probabilidad de obstrucciones.

En segundo lugar, en un matriz de obstáculos en la que los obstáculos definen huecos que tienen un perfil de flujo no simétrico, las partículas se pueden separar en tres poblaciones: i) partículas que tienen un tamaño menor que cualquiera de los tamaños críticos definidos por las capas de flujo adyacentes a los obstáculos; ii) partículas que tienen un tamaño intermedio entre los dos tamaños críticos definidos por las capas de flujo adyacentes a los obstáculos; y iii) partículas que tienen un tamaño mayor que cualquiera de los tamaños críticos definidos por las capas de flujo adyacentes a los obstáculos.

La disminución de la redondez de los bordes de los obstáculos que definen los espacios puede mejorar el rendimiento de segregación del tamaño de partículas de una matriz de obstáculos. A modo de ejemplo, las matrices de obstáculos que tienen una sección transversal triangular con vértices agudos pueden presentar un tamaño crítico de partícula menor que las matrices de obstáculos triangulares de idéntico tamaño e idénticos espacios que tienen vértices redondeados.

Por tanto, mediante la agudización de los bordes de los obstáculos que definen espacios en una matriz de obstáculos, el tamaño crítico de las partículas desviadas en la dirección de la matriz bajo la influencia del flujo general de fluido puede disminuirse sin reducir necesariamente el tamaño de los obstáculos. Por el contrario, los obstáculos que tienen bordes más agudos se pueden espaciar más que, pero teniendo aún propiedades de segregación de partículas equivalentes a, obstáculos de idéntico tamaño con bordes menos agudos.

La conformación de los obstáculos en una matriz de obstáculos se realiza de tal manera que la geometría de los obstáculos con los que se encuentra el fluido que fluye a través de la matriz en una dirección difiera (y defina un tamaño crítico de partícula diferente) de la geometría de los obstáculos con los que se encuentra el fluido que fluye a través de la matriz en una segunda dirección. Por ejemplo, el fluido que fluye a través de la matriz ilustrada en la FIG.

1 en una dirección de izquierda a derecha se encuentra y fluye alrededor de los vértices redondeados de los postes de triángulo rectángulo de la matriz (en esta dirección de flujo, el perfil del flujo de fluido a través de los espacios es asimétrico con respecto al eje de los espacios). Sin embargo, el fluido que fluye a través de la misma matriz en una dirección de derecha a izquierda se encuentra y fluye alrededor de los bordes planos de los postes de triángulo rectángulo de la matriz (en esta dirección de flujo, el perfil del flujo de fluido a través de los espacios es simétrico con respecto al eje de los espacios, siendo esencialmente parabólico).

B. Matrices de impacto que tienen espacios con perfiles de flujo asimétricos

En el presente documento se describen dispositivos de matriz de impacto que son útiles para segregar partículas por tamaño. En una realización, un dispositivo incluye un cuerpo que define un canal de flujo microfluídico para contener el flujo de fluido. Una matriz de obstáculos se dispone dentro del canal de flujo, de manera que el fluido que fluye a través del canal fluya alrededor de los obstáculos. Los obstáculos se extienden a través del canal de flujo, generalmente estando fijados a, siendo integrales con o siendo colindantes con la superficie del canal de flujo en cada extremo del obstáculo.

Los obstáculos se pueden disponer en filas y columnas, en una configuración tal que las filas definen una dirección de la matriz que difiere de la dirección del flujo de fluido en el canal de flujo en un ángulo de inclinación (e) que tiene una magnitud mayor que cero. El valor máximo operativo de e puede ser 1/3 radianes. El valor de e puede ser 1/5 radianes o menos, y un valor de 1/10 radianes puede ser adecuado en diversas realizaciones de las matrices descritas en el presente documento. Los obstáculos que se encuentran en las columnas definen espacios entre ellos, y el fluido que fluye a través del canal de flujo puede pasar entre estos espacios, en una dirección que es generalmente transversal con respecto a las columnas (es decir, generalmente perpendicular al eje largo de los obstáculos en la columna y generalmente perpendicular a un plano que se extiende a través de los obstáculos en la columna).

Los obstáculos pueden tener tales formas que las superficies (aguas arriba de, aguas abajo de, o alrededor del espacio, con respecto a la dirección del flujo general de fluido) de dos obstáculos que definen un espacio están orientadas asimétricamente con respecto al plano que se extiende a través del centro del espacio y que es paralelo a la dirección del flujo general de fluido a través del canal. Es decir, las porciones de los dos obstáculos pueden causar un flujo de fluido asimétrico a través del espacio. El resultado puede ser que el perfil de velocidad del flujo de fluido a través del espacio esté orientado asimétricamente con respecto al plano. Como resultado de esto, el tamaño crítico de partícula para las partículas que pasan a través del espacio adyacente a uno de los obstáculos puede ser diferente del tamaño crítico de partícula para las partículas que pasan a través del espacio adyacente al otro de los obstáculos.

Un dispositivo puede estar hecho de cualquiera de los materiales con los que se fabrican típicamente los dispositivos de manipulación de fluidos a micro y nanoescala, entre los que se incluyen silicio, vidrios, plásticos y materiales híbridos. El canal de flujo se puede construir utilizando dos o más piezas que, cuando se ensamblan, forman una cavidad cerrada (preferentemente una que tiene orificios para añadir o retirar fluidos) que tiene los obstáculos dispuestos en su interior. Los obstáculos se pueden fabricar en una o más piezas que se ensamblan para formar el canal de flujo, o se pueden fabricar en forma de un inserto que se intercala entre dos o más piezas que definen los límites del canal de flujo. En la técnica se conocen materiales y métodos para fabricar tales dispositivos.

En algunos casos, el canal de flujo se puede formar entre dos superficies sustancialmente planas, paralelas, con los obstáculos formados en una de las dos superficies (por ejemplo, por grabado de la superficie para eliminar el material que originalmente rodeaba las partes no grabadas que permanecen como obstáculos). Los obstáculos pueden tener una sección transversal sustancialmente constante a lo largo de su longitud, reconociéndose que las técnicas utilizadas para fabricar los obstáculos pueden limitar la uniformidad de la sección transversal.

Los obstáculos pueden ser cuerpos sólidos que se extienden a través del canal de flujo, en algunos casos, de una cara del canal de flujo a una cara opuesta del canal de flujo. Cuando un obstáculo es integral con (o una extensión de) una de las caras del canal de flujo en un extremo del obstáculo, el otro extremo del obstáculo se puede sellar o presionar contra la cara opuesta del canal de flujo. Un espacio pequeño (preferentemente demasiado pequeño como para acomodar cualquier partícula de interés para un uso previsto) puede ser tolerable entre un extremo de un obstáculo y una cara del canal de flujo, siempre que el espacio no afecte negativamente a la estabilidad estructural del obstáculo o a las propiedades de flujo relevantes del dispositivo. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los obstáculos se definen por una forma de sección transversal (por ejemplo, redonda o triangular). Los métodos para impartir una forma a un obstáculo formado a partir de un material monolítico son bien conocidos (por ejemplo, fotolitografía y diversas técnicas de micromecanizado) y sustancialmente puede utilizarse cualquiera de tales técnicas para fabricar los obstáculos descritos en el presente documento. Los tamaños de los espacios, obstáculos y otras características de las matrices descritas en el presente documento dependen de la identidad y el tamaño de las partículas a manejar y separar en el dispositivo, tal como se describe en otras partes del presente documento. Las dimensiones típicas son del orden de micrómetros o cientos de nanómetros, pero son posibles dimensiones mayores y menores, sujeto a las limitaciones de las técnicas de fabricación.

Como se describe en el presente documento, se pueden lograr ciertas ventajas formando obstáculos que tengan bordes agudos (es decir, no redondeados), especialmente en la parte más estrecha de un espacio entre dos obstáculos. Para aprovechar los efectos beneficiosos de los bordes agudos, un experto en la materia reconocerá que ciertas técnicas de microfabricación pueden ser preferibles a otras para formar tales bordes. La agudeza de los bordes se puede describir de cualquiera de varias formas. A modo de ejemplo, el radio de curvatura de un borde (por ejemplo, el vértice de un poste triangular) se puede medir o estimar y ese radio se puede comparar con una dimensión característica del obstáculo (por ejemplo, el lado más corto adyacente al vértice de un poste triangular, cuadrado o rectangular, o el radio de un poste redondo que tiene una sección puntiaguda). La agudeza se puede describir, por ejemplo, como una relación entre el radio de curvatura y la dimensión característica. Utilizando postes triangulares equiláteros como ejemplo, las relaciones adecuadas incluyen las que no son mayores de 0,25, y preferentemente no mayores de 0,2.

En algunos casos, el número de obstáculos que existen en una matriz no es crítico, pero los obstáculos pueden ser lo suficientemente numerosos como para que se puedan conseguir las propiedades de separación de partículas de las matrices que se describen en el presente documento. En algunos casos, la distribución y la forma precisas de la matriz no son críticas. en vista de las divulgaciones descritas en el presente documento, un experto en este campo es capaz de diseñar la distribución y el número de obstáculos necesarios para fabricar matrices de impacto capaces de separar partículas, teniendo en cuenta los tamaños e identidades de las partículas a separar, el volumen de fluido en el que están contenidas las partículas a separar, la resistencia y rigidez de los materiales utilizados para fabricar la matriz, la capacidad de presión de los dispositivos de manipulación de fluidos que se utilizarán con la matriz, y otras características de diseño habituales.

Los obstáculos generalmente se pueden organizar en filas y columnas (el uso de los términos filas y columnas no significa ni implica que las filas y columnas sean perpendiculares entre sí). Los obstáculos que generalmente están alineados en una dirección transversal al flujo de fluido en el canal de flujo pueden denominarse obstáculos en una columna. Los obstáculos adyacentes entre sí en una columna pueden definir un espacio a través del cual fluye el fluido. Los obstáculos en las columnas adyacentes se pueden estar desplazados entre sí en un grado caracterizado por un ángulo de inclinación, denominado £ (épsilon). Por tanto, para varias columnas adyacentes entre sí (es decir, varias columnas de obstáculos que se pasan consecutivamente por el flujo de fluido en una sola dirección generalmente transversal a las columnas), los obstáculos correspondientes en las columnas pueden estar desplazados entre sí de modo que los obstáculos correspondientes formen una fila de obstáculos que se extienda en el ángulo £ con respecto a la dirección del flujo de fluido que pasa por las columnas. Se puede seleccionar el ángulo de inclinación y las columnas se pueden espaciar unas de otras de manera que 1/£ (cuando £ se expresa en radianes) sea un número entero, y las columnas de obstáculos se repitan periódicamente. Los obstáculos en una sola columna también pueden estar desplazados entre sí por el mismo ángulo de inclinación o por otro diferente. A modo de ejemplo, las filas y columnas pueden disponerse formando un ángulo de 90 grados entre sí, con las filas y las columnas inclinadas, en relación con la dirección del flujo general de fluido a través del canal de flujo, en el mismo ángulo de £

Una o más porciones de dos obstáculos que definen un espacio pueden conformarse de tal manera que las porciones de los obstáculos que están aguas arriba de, aguas abajo de, o alrededor (o alguna combinación de estos, con referencia a la dirección del flujo general de fluido a través del canal de flujo) de la parte más estrecha del espacio entre los obstáculos sea asimétrica con respecto al plano que biseca el espacio y es paralelo a la dirección de flujo general de fluido. Tanto para simplificar la fabricación como para ayudar a modelar el comportamiento de la matriz, todos los obstáculos en una matriz pueden ser idénticos en tamaño y forma, aunque no tiene por qué ser así. En algunos casos, todos los obstáculos de una matriz no tienen la misma forma. Adicionalmente, pueden fabricarse matrices que tienen porciones en las que los obstáculos son idénticos entre sí dentro de una sola porción, pero diferentes de los obstáculos en otras porciones.

La asimetría en una o más porciones de uno o ambos obstáculos que definen un espacio puede conducir a un aumento del flujo de fluido en un lado o en el otro del espacio. Una partícula puede impactar al pasar a través de un espacio únicamente si la partícula excede el tamaño crítico de partícula correspondiente al espacio. El tamaño crítico de partícula se puede determinar por la densidad del flujo de fluido cerca de los límites del espacio (es decir, los bordes de los obstáculos que definen el espacio). El aumento del flujo de fluido en un lado de un espacio (es decir, contra uno de los dos obstáculos que definen la parte más estrecha del espacio) puede intensificar la densidad de flujo cerca de ese lado, reduciendo el tamaño de la partícula que impactará al pasar a través de ese lado del espacio.

En una realización del dispositivo, la forma de cada uno de los múltiples obstáculos en una columna puede ser sustancialmente idéntica y simétrica con respecto al plano que biseca cada uno de los múltiples obstáculos. Es decir, para cualquier columna de obstáculos, la geometría que encuentran las partículas que se desplazan en un fluido que fluye a través de los espacios entre los obstáculos en la columna puede ser idéntica cuando el fluido se desplaza en una primera dirección y cuando el fluido se desplaza en una segunda dirección que está separada de la primera dirección en 180 grados (es decir, fluye en la dirección opuesta).

La geometría que encuentran las partículas que se desplazan en un fluido que fluye a través de los espacios entre los obstáculos en la columna puede ser diferente cuando el fluido se desplaza en una primera dirección, de la geometría que encuentran cuando el fluido se desplaza en una segunda dirección que es diferente de la primera dirección en 90 180 grados. En esta realización, flujo de fluido puede, por ejemplo, oscilar entre las dos direcciones de flujo, y las partículas en el fluido pueden encontrar la diferente geometría de obstáculo. Si estas diferencias geométricas pueden dar como resultado diferentes perfiles de fluido a través de los espacios (compárense los paneles de la FIG. 6B, por ejemplo), entonces el espacio puede presentar diferentes tamaños de partículas críticos en las dos direcciones. Si un espacio presenta diferentes tamaños críticos para el flujo en las dos direcciones, entonces las poblaciones de partículas que impactarán al pasar a través del espacio pueden diferir dependiendo de la dirección del flujo. Esta diferencia en las poblaciones impactadas en las dos direcciones se puede utilizar para efectuar la segregación de las partículas que actúan de manera diferente.

Por ejemplo, considérese un espacio que presenta un primer tamaño crítico para el flujo general de fluido en una dirección, pero presenta un tamaño crítico diferente para el flujo general de fluido en una segunda dirección. Para el flujo de fluido en la primera dirección, las partículas que tienen un tamaño mayor que el primer tamaño crítico pueden impactar y las partículas que tienen un tamaño menor que el primer tamaño crítico no pueden impactar. Asimismo, para el flujo de fluido en la segunda dirección, las partículas que tienen un tamaño mayor que el segundo tamaño crítico pueden impactar y las partículas que tienen un tamaño menor que el segundo tamaño crítico no pueden impactar. Si el flujo oscila entre la primera y la segunda dirección, entonces las partículas que tienen un tamaño mayor que el primero y el segundo tamaños críticos pueden impactar en ambas direcciones. Asimismo, las partículas que tienen un tamaño menor que el primero y el segundo tamaños críticos no pueden impactar en ninguna dirección. Para estas dos poblaciones de partículas, las oscilaciones de flujo de cantidades aproximadamente iguales en ambas direcciones pueden dejar estas partículas sustancialmente en su posición inicial. Sin embargo, las partículas que tienen un tamaño intermedio entre los dos tamaños críticos pueden impactar cuando el flujo general de fluido es en una dirección, pero no pueden impactar cuando el flujo general de fluido está en la otra dirección. Por tanto, cuando se realizan oscilaciones de flujo de cantidades aproximadamente iguales en ambas direcciones, estas partículas no pueden permanecer en su posición inicial, sino que, en su lugar, pueden haberse desplazado de esa posición original en una cantidad igual a (el tamaño de un obstáculo la distancia del espacio G) x (el número de oscilaciones). De esta manera, estas partículas (las que tienen un tamaño intermedio entre los dos tamaños críticos) se pueden segregar de las otras partículas con las que inicialmente estaban mezcladas.

Cuando la primera y la segunda direcciones difieren 180 grados (es decir, los flujos están en direcciones opuestas), las partículas que tienen un tamaño intermedio entre los dos tamaños críticos se pueden desplazar formando un ángulo de 90 grados con respecto a la dirección del flujo oscilante.

El comportamiento de las partículas en una matriz de impacto no es una función de la dirección absoluta en la que se mueven las partículas (o el fluido en el que están suspendidas), sino que más bien puede ser una función de la geometría de la matriz que encuentran las partículas. Como alternativa al funcionamiento de una matriz de impacto con flujo alterno entre la primera y la segunda dirección, se pueden obtener los mismos efectos de desplazamiento de partículas usando el flujo únicamente en la primera dirección aumentando el tamaño de la matriz en dos veces el número de oscilaciones, manteniendo una parte de la matriz en su disposición original, pero alterando la segunda porción de la matriz de modo que la geometría de la matriz sea idéntica a la geometría encontrada por las partículas en el fluido que se mueven en la segunda dirección en la matriz original (aunque el fluido se mueva únicamente en la primera dirección). Usando la matriz ilustrada en la FIG. 1 a modo de ejemplo, se pueden obtener los mismos efectos de desplazamiento sobre las partículas mediante dos oscilaciones de flujo en esta matriz (es decir, dos unidades de flujo de izquierda a derecha y dos unidades de flujo de derecha a izquierda) que se pueden obtener con cuatro unidades de flujo de izquierda a derecha a través de una matriz que tiene cuatro veces la longitud (de izquierda a derecha) de la matriz de la FIG. 1, siempre y cuando dos longitudes de la matriz estén dispuestas como se muestra en la FIG. 1 y dos longitudes de la matriz estén dispuestas como la imagen especular (de izquierda a derecha) de la matriz que se muestra en la FIG. 1.

En el presente documento se describe un dispositivo microfluídico diseñado para separar objetos basándose en su tamaño físico. Los objetos pueden ser células, biomoléculas, perlas inorgánicas u otros objetos redondos o de otra forma. Los tamaños típicos fraccionados pueden variar de 100 nanómetros a 50 micrómetros; los tamaños más pequeños o más grandes se pueden fraccionar. El uso de estas matrices puede implicar flujos continuos en una dirección, y las partículas pueden separarse de la dirección del flujo formando un ángulo que es una función monótona de su tamaño.

Al cambiar la forma de los postes de círculos a una forma que es asimétrica con respecto a un eje paralelo al flujo de fluido, se pueden añadir funcionalidades:

1. El tamaño crítico de partícula para el impacto puede ser diferente según la dirección en la que se mueva una partícula a través de la matriz. Esto se ha verificado experimentalmente con postes de triángulos rectángulos y se extiende a formas arbitrarias que son asimétricas con respecto al eje de flujo.

2. Con tales diseños, el ángulo de desplazamiento del flujo fluido de partículas puede diseñarse para que no sea monótono, por ejemplo, con un pico a un cierto tamaño de partícula.

Tales matrices de impacto tienen múltiples usos, entre los que se incluyen todos los usos para los que se conocían previamente las matrices de impacto.

El dispositivo se puede utilizar para separar partículas en una banda de tamaños seleccionada de una mezcla mediante un desplazamiento lateral determinista. El mecanismo de separación puede ser el mismo que el de la matriz de impacto, pero puede funcionar bajo flujo oscilatorio (condiciones CA; es decir, flujo general de fluido que alterna entre dos direcciones) en lugar de flujo continuo (condiciones de CC; es decir, flujo general de fluido en una sola dirección). En el flujo oscilatorio, las partículas de un intervalo de tamaños dado se pueden separar perpendicularmente de una corriente de entrada (perpendicular al eje de flujo alterno cuando los flujos alternos difieren en dirección en 180 grados) sin ningún desplazamiento neto del fluido general o desplazamiento neto de partículas fuera del intervalo deseado. Por tanto, al inyectar una muestra que incluye partículas del intervalo dado en una matriz de obstáculos y posteriormente alternando el flujo de fluido a través de la matriz de obstáculos en direcciones opuestas (es decir, en direcciones separadas entre sí por 180 grados), las partículas que exceden el tamaño crítico en una dirección de flujo pero no exceden el tamaño crítico en la otra dirección del flujo se pueden separar de otras partículas en la muestra por el impacto inducido por la matriz. Estas partículas pueden impactar (y seguir la dirección de la matriz) cuando el fluido fluye en una dirección, pero no impactan (y siguen la dirección del flujo general de fluido) cuando el fluido fluye en la dirección opuesta. Las partículas que no exceden el tamaño crítico en ninguna dirección de flujo no impactarán por la matriz (es decir, seguirán el fluido general en ambas direcciones) y permanecerán con la embolada de muestra. Las partículas que exceden el tamaño crítico en ambas direcciones de flujo impactarán por la matriz (es decir, seguirán la dirección de la matriz) cuando el fluido fluya en una dirección, y también impactarán (es decir, seguirán la dirección de la matriz en la dirección opuesta) cuando el líquido fluya en la dirección opuesta y, por lo tanto, permanecerán con la embolada de muestra.

El tamaño crítico de partícula puede depender de la dirección del flujo del fluido. Se pueden hacer partículas de tamaño intermedio para escalar un dispositivo bajo flujo oscilatorio.

En segundo lugar, en un modo de flujo continuo, se puede inducir a las partículas de un tamaño deseado a moverse hacia un lado de una corriente de fluido, y a las partículas por encima o por debajo de ese tamaño a moverse al otro lado o a permanecer sin ningún desplazamiento. Por lo tanto, la recolección de partículas deseadas puede ser más fácil. En dispositivos convencionales, las partículas por encima de un intervalo deseado también se desplazan desde el flujo de fluido al mismo lado del flujo, de manera que la separación de las partículas deseadas de las que son más grandes y no deseadas puede ser más difícil. En esta realización, los obstáculos que definen diferentes tamaños críticos para el flujo de fluido en direcciones opuestas se emplean en dos configuraciones que son imágenes especulares entre sí. Por ejemplo, haciendo referencia a la FIG. 1, dicha matriz incluiría postes de triángulo rectángulo dispuestos como se muestra en la FIG. 1 (es decir, hipotenusa inclinada desde la parte inferior derecha a la superior izquierda y el ángulo de inclinación £ se extiende desde la horizontal hacia la parte inferior de la figura) y también incluiría postes de triángulo rectángulo dispuestos como aparecerían en un espejo sostenido perpendicularmente en el lado derecho o izquierdo de la matriz que se muestra en la FIG. 1 (es decir, postes de triángulo rectángulo que tienen su hipotenusa inclinada desde la parte superior derecha a la inferior izquierda y el ángulo de inclinación £ se extiende desde la horizontal hacia la parte superior de la figura). La separación de partículas conseguida por el flujo general de fluido en una sola dirección (es decir, de izquierda a derecha o de derecha a izquierda) a través de dicha matriz sería equivalente a un flujo de ida y vuelta a través de la matriz ilustrada en la FlG. 1. Las partículas en el intervalo de tamaños seleccionado pueden impactar y desviarse hacia la parte superior de la matriz (como se muestra en la FIG. 1), mientras que las partículas que tienen tamaños más grandes o más pequeños pueden permanecer en el nivel vertical en el que entran en la matriz (suponiendo que se encuentren aproximadamente el mismo número de obstáculos en cada una de las dos configuraciones).

se puede producir una reducción del tamaño crítico de partícula como una relación del espacio, en comparación con los postes circulares, cuando las partículas impactan con bordes agudos. Esto puede permitir un ángulo de separación mayor sin temor de obstruir el dispositivo en separaciones más rápidas.

Estos desarrollos pueden reducir el área de chip necesaria en comparación con una matriz de impacto de flujo continuo.

Un dispositivo descrito en el presente documento puede ser una matriz de postes microfabricada construida usando fotolitografía convencional. Se puede grabar una sola capa de máscara en silicio o usarse para fabricar una plantilla para el moldeado de PDMS. Habitualmente, las matrices de postes se pueden sellar con un cubreobjetos recubierto de PDMS para proporcionar canales cerrados.

La operación de flujo oscilatorio puede requerir impulsores e interfaces de control de fluidos más complicados que la operación de flujo continuo.

La FIG. 11 es una imagen de microscopio electrónico de barrido de postes en una matriz de obstáculos del tipo descrito en el presente documento. Se pusieron postes triangulares isósceles derechos, de 6 micrómetros de lado, en una retícula cuadrada con un espaciado de 10 micrómetros, proporcionando un espacio de aproximadamente 4 micrómetros. La retícula cuadrada se inclinó 5,71 grados (0,1 radianes) con respecto a las paredes laterales del dispositivo para proporcionar la asimetría necesaria. El fluido fluye a lo largo del eje horizontal.

En la FIG. 1, el flujo total de fluido a través de cada espacio se puede dividir en n = 1/£' corrientes de flujo (tubos de corriente), donde n es un número entero. Cada corriente de flujo puede transportar el mismo flujo de fluido, mostrado esquemáticamente en la FIG. 1 para n = 3. Los tubos de corriente pueden separarse mediante líneas de parada, comenzando y terminando cada línea de parada en un poste. Los tubos de corriente cambian sus posiciones cíclicamente de modo que, después de n filas, cada línea de corriente regresa a su posición inicial dentro del espacio.

La anchura de la corriente más cercana a un poste puede determinar el tamaño crítico de partícula. Si el radio de la partícula es menor que la anchura de la corriente, entonces la trayectoria de la partícula no puede ser perturbada por los postes y desplazarse en la misma dirección del flujo. Si el radio de la partícula es mayor que la anchura de la corriente más cercana, entonces puede desplazarse a través de la línea de parada y su trayectoria puede seguir el eje inclinado de la matriz (es decir, la dirección de la matriz).

La anchura de la corriente más cercana al poste se puede determinar asumiendo que el perfil de velocidad a través de un espacio es parabólico, el caso de un flujo completamente desarrollado en un canal rectangular. Dado que cada corriente puede llevar el mismo flujo y hay n corrientes, se puede hacer una integración sobre el perfil de flujo de manera que el flujo a través de una corriente de anchura Dc/2 (Dc es el diámetro crítico de una partícula) más cercana al poste sea igual al flujo total a través del espacio dividido por n. Es decir, la integral de 0 a Dc/2 de u(x) dx (siendo u una función del flujo en cualquier posición x dentro del espacio) es igual a 1/n veces la integral de u(x) dx sobre todo el espacio.

Por tanto, el tamaño crítico de partícula se puede determinar a partir del perfil de flujo. Para el caso de postes circulares, un perfil de flujo parabólico puede aproximarse mucho al perfil de flujo a través del espacio y el tamaño crítico de partícula se puede determinar analíticamente.

La FIG. 4A muestra una simulación numérica del perfil de flujo para una matriz de postes triangulares. En algunos casos, no se puede suponer que el perfil de flujo a través de postes triangulares sea parabólico debido a la simetría rota. Por lo tanto, el perfil de flujo a través del espacio de los postes triangulares se extrajo de la simulación numérica (programa-COMSOL) del flujo a través de una matriz con el mismo tamaño y espaciado que los dispositivos realmente fabricados.

La FIG. 4B ilustra una comparación de los perfiles de flujo de velocidad entre postes circulares y triangulares. Se muestran perfiles de velocidad normalizados a través del espacio entre postes triangulares y circulares. Como se muestra, el perfil de flujo para los postes triangulares es asimétrico con respecto al centro del espacio; fluye más fluido a lo largo del vértice del triángulo que a lo largo del borde plano.

Las FIGS. 12-14 ilustran el movimiento de las partículas en una matriz de impacto de trinquete de un tipo descrito en el presente documento. Cuando las partículas se mueven a través de la matriz, el lado del poste con el que interactúan depende de la dirección en la que se muevan en la matriz. En este caso, cuando las partículas se mueven de derecha a izquierda, impactan con el borde plano de los postes triangulares. Cuando las partículas se mueven de izquierda a derecha, impactan con el vértice agudo de los postes triangulares. Por tanto, dado que el perfil de flujo es asimétrico, no se puede esperar que las partículas sigan la misma trayectoria cuando se desplazan en ambas direcciones a través de la matriz.

En el tamaño crítico de partícula para postes triangulares empleando el mismo tipo de análisis descrito en Inglis et al., 2006, Lab Chip 6: 655-658, la integración se puede producir sobre el perfil de flujo para encontrar la anchura de las corrientes características. Sin embargo, dado que el perfil de flujo es asimétrico con respecto al centro del espacio, la anchura de la corriente y, por tanto, el tamaño crítico de partícula pueden ser diferentes dependiendo de qué lado se examine. Como se muestra en la FIG. 4B, el resultado de la asimetría introducida por los postes triangulares es que el tamaño crítico de partícula puede ser diferente dependiendo de con qué lado del obstáculo triangular interactúan las partículas. Si se mueven a lo largo del vértice agudo, entonces el tamaño crítico de partícula puede ser menor que si se movieran a lo largo del borde plano. En la FIG. 15 se representa el tamaño crítico de partícula frente al ángulo de la matriz (e) en comparación con los postes circulares. El tamaño crítico de partícula para el impacto a lo largo del vértice agudo del triángulo puede ser sustancialmente menor que el de los postes circulares o el borde plano. Esto puede permitir el uso de ángulos de separación mayores sin temor de obstruir los dispositivos. Cuando el diámetro de las partículas es mayor que el tamaño del espacio (G en la FIG. 1), puede haber un riesgo sustancial de que la matriz se obstruya si la densidad de partículas es alta.

Las FIG. 3A-3C ilustran el comportamiento representativo de las partículas en una matriz de impacto de trinquete. Para un dispositivo construido como se muestra en la FIG. 11, se eligieron tres partículas representativas para esta ilustración. Se eligió una partícula (ilustrada en la Figura 3B) más grande que los dos tamaños críticos de partícula (es decir, más grandes que los tamaños críticos de partícula definidos por los flujos de fluido de derecha a izquierda y de izquierda a derecha). Se eligió una partícula (ilustrada en la Figura 3A) que era más pequeña que los dos tamaños críticos de partícula. Finalmente, se eligió una partícula (ilustrada en la Figura 3C) en el intervalo intermedio, es decir, menor que el tamaño crítico de partícula (Df en la Fig. 12) a lo largo del borde plano, pero mayor que el tamaño crítico de partícula (Dv en la Fig. 12) a lo largo del borde agudo. Estas figuras ilustran el comportamiento de las partículas que se colocaron en el dispositivo y se observó su trayectoria bajo flujo oscilatorio.

Partícula grande (FIG. 3B): como la partícula es más grande que el tamaño crítico de partícula en ambos bordes, sigue el eje de inclinación de la matriz (E) en ambas direcciones y no muestra ningún desplazamiento neto bajo flujo oscilatorio.

Partícula pequeña (FIG. 3A): como la partícula es más pequeña que el tamaño crítico de partícula en ambos bordes, sigue la trayectoria del fluido en ambas direcciones y no muestra ningún desplazamiento neto.

Partícula intermedia (FIG. 3C): Cuando la partícula se mueve hacia la derecha, impacta con el borde plano de los postes triangulares. Como es más pequeña que el tamaño crítico de partícula (D^f), sigue la trayectoria del fluido. Cuando la partícula se mueve hacia la izquierda, impacta con el vértice agudo de los postes triangulares. Como es mayor que el tamaño crítico de partícula en este lado (D^v), sigue el eje de inclinación de la matriz y se desplaza hacia arriba. Como se muestra, bajo flujo oscilatorio, las partículas en el intervalo intermedio se desplazan perpendicularmente a la dirección del flujo. Después de tres ciclos de movimiento de ida y vuelta, el fluido general no se ha desplazado, pero la partícula se ha movido 200 micrómetros.

Si los tres tipos de partículas se mezclaran y se colocaran en una sola matriz bajo flujo oscilatorio (es decir, flujo de fluido que oscila entre las direcciones de derecha a izquierda y de izquierda a derecha), las partículas intermedias se desplazarían hacia la parte superior de estas figuras, mientras que las partículas pequeñas y grandes no tendrían ningún movimiento neto.

En las FIG. 12-14, se superpusieron representaciones de partículas intermedias, pequeñas y grandes (respectivamente) sobre la simulación numérica de tubos de corriente para mostrar el movimiento de las partículas con mayor claridad. Se eligió un n = 1/e de 3 para permitir que la periodicidad se viera más fácilmente.

Cuando las partículas intermedias (FIG. 12) se desplazan a lo largo del borde agudo, impactan como es de esperar. Sin embargo, cuando las partículas se desplazan a lo largo del borde plano, su movimiento puede ser diferente del de las partículas pequeñas. Cuando realizan su característico zig para continuar en la misma dirección que el fluido, son demasiado grandes para permanecer en esa corriente que está cerca del vértice agudo y se desplazan a través de la primera línea de parada. El resultado es que su movimiento es periódico en dos filas en lugar de tres. Con cualquier otro ángulo de inclinación, el movimiento puede ser similar y la periodicidad es n-1. El resultado de esta periodicidad n-1 es que las partículas de tamaño intermedio se desplazan realmente contra el ángulo de inclinación del eje. Por tanto, una mezcla de partículas grandes, pequeñas e intermedias se separará en tres corrientes. Las partículas pequeñas pasarán directamente (véase la FIG. 13). Las partículas grandes seguirán el eje de inclinación de la matriz (véase la FIG. 14). Las partículas intermedias seguirán una trayectoria separada que depende de la geometría del poste.

Las aplicaciones para las que son útiles los dispositivos descritos en el presente documento incluyen las mismas que se describen en la patente de Huang (Patente de Estados Unidos N.° 7.150.812): biotecnología y otras operaciones microfluídicas que implican la separación de partículas.

Previamente se ha demostrado el fraccionamiento de flujo continuo de partículas pequeñas en un líquido basado en su tamaño en una "matriz de impacto" de micropostes por desplazamiento lateral determinista (por ejemplo, Huang et al., 2004, Science 304:987-990). Una matriz de impacto de trinquete descrita en el presente documento puede poseer las mismas ventajas del trabajo anterior, pero puede añadir dos nuevas funcionalidades:

En primer lugar, los dispositivos se pueden usar para separar partículas en una banda de tamaños seleccionada de una mezcla por desplazamiento lateral determinista bajo flujo oscilatorio (condiciones de CA) en lugar de flujo continuo (condiciones de c C). En el flujo oscilatorio, las partículas de un intervalo de tamaños dado se pueden separar perpendicularmente de una corriente de entrada (perpendicular al eje de flujo de CA) sin ningún desplazamiento neto del fluido general o partículas fuera del intervalo deseado.

En segundo lugar, en modo de flujo continuo, el dispositivo puede presentar un comportamiento trimodal. Se puede inducir a las partículas de un intervalo de tamaños deseado a moverse hacia un lado de una corriente de fluido, y a las partículas por encima o por debajo de ese tamaño a moverse al otro lado o a permanecer sin ningún desplazamiento. Por tanto, la recolección de estas partículas deseadas puede ser más fácil. En dispositivos convencionales, los dispositivos eran bimodales y todas las partículas por encima del intervalo de tamaños deseado se desplazan desde el flujo de fluido al mismo lado del flujo, por lo que la separación de las partículas deseadas de otras más grandes y no deseadas puede requerir múltiples etapas, mientras que la matriz de impacto de trinquete puede requerir solo una.

Como se usan en el presente documento, cada uno de los siguientes términos puede tener el significado asociado con él en esta sección.

Los términos "matriz de impacto" y "matriz de obstáculos" se utilizan como sinónimos en el presente documento y pueden describir una matriz ordenada de obstáculos que están dispuestos en un canal de flujo a través del cual puede pasar un fluido que porta partículas.

Una superficie "sustancialmente plana" puede ser una superficie que se ha hecho aproximadamente tan plana como se puede hacer una superficie en vista de las técnicas de fabricación utilizadas para obtener una superficie plana. En algunos casos, ninguna técnica de fabricación producirá una superficie perfectamente plana. Siempre que las porciones no planas de una superficie no alteren significativamente el comportamiento de los fluidos y las partículas que se mueven en o cerca de la superficie, la superficie puede considerarse sustancialmente plana.

En un dispositivo de matriz de impacto, "flujo de fluido" y "flujo general de fluido" se pueden usar como sinónimos para referirse al movimiento macroscópico del fluido en una dirección general a través de un matriz de obstáculos. Estos términos no tienen en cuenta los desplazamientos temporales de las corrientes de fluido para que el fluido se mueva alrededor de un obstáculo para que el fluido continúe moviéndose en la dirección general. En algunos casos, el flujo general de fluido a través de una matriz de obstáculos como se proporciona en el presente documento comprende dos o más corrientes de fluido que fluyen desde una entrada, porción o área de entrada de la matriz a una salida, parte o área de salida de la matriz. Cada una de las dos o más corrientes de fluido pueden fluir paralelas entre sí. Las dos o más corrientes de fluido pueden comprender los mismos o diferentes componentes. Los componentes pueden ser cualquier tampón o reactivo descrito en el presente documento o conocido en la técnica. En algunos casos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 corrientes de fluido fluyen en paralelo desde una entrada o porción o área de entrada de una matriz como se proporciona en el presente documento a una salida o porción o área de salida de la matriz. La corriente de fluido también se puede denominar "tubo de corriente".

En un dispositivo de matriz de impacto, el ángulo de inclinación £ puede ser el ángulo entre la dirección del flujo general de fluido y la dirección definida por el alineamiento de filas de obstáculos secuenciales (en la dirección del flujo general de fluido) en la matriz. Este ángulo se ilustra en las FIG. 1, 6 y 11, por ejemplo.

En un dispositivo de matriz de impacto, la "dirección de la matriz" puede ser una dirección definida por el alineamiento de filas de obstáculos secuenciales (en la dirección del flujo general de fluido) en la matriz.

Un "tamaño crítico" o "tamaño predeterminado" de las partículas que pasan a través de una matriz de obstáculos puede ser un parámetro que describe el límite de tamaño de las partículas que pueden seguir el flujo laminar de fluido más cercano a un lado de un espacio a través del cual se desplazan las partículas cuando el flujo de ese fluido diverge de la mayor parte del flujo de fluido a través del espacio. Las partículas más grandes que el tamaño crítico pueden "impactar" y desviarse de la trayectoria de flujo del fluido más cercano a ese lado del espacio hacia la trayectoria de flujo de la mayor parte del fluido que fluye a través del espacio. En un dispositivo de matriz de impacto, dicha partícula puede desplazarse la distancia de (el tamaño de un obstáculo el tamaño del espacio entre los obstáculos) al pasar a través del espacio y encontrarse con la columna de obstáculos aguas abajo, mientras que las partículas que tienen tamaños inferiores al tamaño crítico (o tamaño predeterminado) no necesariamente se desplazarán así. Cuando un perfil de flujo de fluido a través de un espacio es simétrico con respecto al plano que biseca el espacio en la dirección del flujo general de fluido, el tamaño crítico puede ser idéntico para ambos lados del espacio; sin embargo, cuando el perfil es asimétrico, los tamaños críticos de los dos lados del espacio pueden diferir. Cuando se evalúa una partícula no esférica, su tamaño puede considerarse el volumen de exclusión esférico barrido por la rotación de la partícula alrededor de un centro de gravedad en un fluido, al menos para partículas que se mueven rápidamente en solución. Las características de tamaño de las partículas no esféricas se pueden determinar empíricamente usando una diversidad de métodos conocidos, y tales determinaciones se pueden usar para seleccionar o diseñar matrices de obstáculos apropiadas para usar como se describe en el presente documento. El cálculo, la medición y la estimación de los volúmenes de exclusión para partículas de todo tipo son bien conocidos.

Una partícula puede "impactar" en una matriz de impacto si, al pasar a través de un espacio y encontrar un obstáculo aguas abajo, la trayectoria general de la partícula sigue la dirección de la matriz de impacto (es decir, se desplaza en el ángulo de inclinación £ con respecto al flujo general de fluido). Una partícula no impacta si su trayectoria general sigue la dirección del flujo general de fluido en esas circunstancias. Conceptualmente, si el flujo a través de un espacio se visualiza como compuesto de múltiples capas individuales de fluido (es decir, tubos de corriente, si se considera una sección transversal de fluido que fluye a través del espacio), una partícula puede "impactar" si la partícula se desplaza por un poste fuera de su tubo de flujo incidente hacia un tubo de flujo adyacente cuando atraviesa un espacio delimitado por el poste.

"La dirección del flujo general de fluido" en un dispositivo de matriz de obstáculos puede referirse a la dirección promedio (por ejemplo, Macroscópica) del flujo de fluido a través del dispositivo (es decir, ignorando las desviaciones de flujo locales exigidas por el flujo alrededor de obstáculos en el canal de fluido)

C. Un trinquete microfluídico determinista

Este ejemplo describe un dispositivo microfluídico en el que la trayectoria de las partículas dentro de un cierto intervalo de tamaños varía con la dirección en la que las partículas se mueven a través del dispositivo. Este efecto de trinquete puede producirse empleando postes o micropostes u obstáculos triangulares en lugar de circulares convencionales en un dispositivo de desplazamiento lateral determinista (DLD) donde una matriz de postes desplaza selectivamente las partículas a medida que se mueven a través de la matriz. Este efecto se puede utilizar después para demostrar una técnica de fraccionamiento en la que las partículas se pueden separar de un tapón de fluido sin ningún movimiento neto del tapón de fluido original. El mecanismo subyacente de este método puede basarse en una distribución asimétrica de la velocidad del fluido a través del espacio entre los postes.

Los dispositivos microfluídicos, tales como los que se utilizan en aplicaciones de "lab on a chip", pueden funcionar con un número de Reynolds bajo (un número de Reynolds "bajo" se refiere a un número de Reynolds no mayor que 1, y preferentemente menor, tal como 0,1, 10-3 o menor). En este régimen, el flujo de fluido a través de una geometría arbitraria se puede considerar invariante en el tiempo. La inversión del gradiente de presión aplicado que impulsa el fluido invertirá el campo de flujo porque los efectos de inercia son insignificantes. A un número de Peclet alto (el número de Peclet "alto" puede referirse a un número de Peclet mayor que 1, y preferentemente mucho mayor, tal como 10, 100 o mayor), esto puede ampliarse para decir que los efectos de difusión pueden ignorarse y los objetos en el fluido fluirán de manera determinista a lo largo de un tubo de corriente a menos que haya alguna otra interacción, tal como un desplazamiento por repulsión estérica de la pared de un canal, interrumpa su trayectoria y los mueva a un tubo de corriente adyacente. El grado en el que la trayectoria de las partículas se puede desviar de su trayectoria original puede depender directamente de su tamaño; las partículas más grandes pueden desplazarse más lejos que las partículas más pequeñas y, en consecuencia, pueden seguir diferentes tubos de corriente a medida que avanzan a través del dispositivo. Este fenómeno, que se puede denominar desplazamiento lateral determinista (DLD), se ha utilizado en varios esquemas para realizar separaciones de partículas a microescala.

Una "matriz de impacto" puede ser un dispositivo microfluídico que se basa en el desplazamiento lateral determinista (DLD) para separar partículas con alta resolución. Este dispositivo puede depender de la bifurcación asimétrica de corrientes de fluido en una matriz de postes que está inclinada en un ángulo £ (épsilon; típicamente del orden de 0,1 radianes) con respecto a la dirección del flujo total de fluido. El fluido que fluye a través de un espacio se divide alrededor de un poste en la siguiente fila, pasando 1/£ del fluido por el espacio en un lado del siguiente poste, mientras que el otro £ de fluido va por el otro lado del siguiente poste. Como resultado, el movimiento del fluido se puede caracterizar por corrientes 1/£ que recorren posiciones en el espacio, pero se desplaza en línea recta en promedio. Si una partícula suspendida en el fluido es pequeña en comparación con la anchura de una corriente en un espacio, los postes no la afectarán mientras se mueve a través de la matriz y puede viajar en línea recta con el flujo de fluido. Sin embargo, si la partícula es grande en relación con la anchura de una corriente, se puede desplazar a una corriente adyacente cuando la corriente que ocupa está más cerca de un poste mientras se mueve a través de un espacio. Debido a la forma cíclica en que la corriente puede moverse a través de los espacios, este desplazamiento o "impacto" puede ocurrir en cada fila y la partícula puede desplazarse formando un ángulo con respecto al fluido y otras partículas pequeñas. Con un dispositivo suficientemente largo, se puede obtener una separación significativa entre partículas grandes y pequeñas.

La FIG. 2A muestra una imagen fluorescente de lapso de tiempo de una partícula pequeña (perla de poliestireno de 1,1 micrómetros de diámetro) que fluye a través de dicha matriz a una velocidad típica de 100 micrómetros/s. A medida que la partícula avanza, realiza muchos pasos pequeños paralelos al eje de la matriz a medida que se mueve, seguidos de un paso más grande perpendicular al movimiento del fluido (en lo que se denomina "modo en zigzag"), de modo que el movimiento general debe seguir el tapón de fluido que originalmente contenía la partícula. Considerando la imagen de la FIG. 2A, el flujo de fluido realizó un ciclo de ida y vuelta (por inversión de la presión) dos veces. La partícula deshizo su camino, como era de esperar en flujos a bajo número de Reynolds y alto número de Peclet en un dispositivo determinista que no depende de la difusión.

La FIG. 2B muestra una imagen similar pero para una partícula más grande (3,1 micrómetros). En este caso, la partícula sigue claramente el eje de la matriz (es decir, se desplaza en la dirección de la matriz) y no el flujo de fluido. Debido a que la partícula se desplaza de su trayectoria de flujo por los postes en cada fila, esto puede denominarse "modo de impacto". Esta diferencia en la dirección del flujo en función del tamaño de las partículas puede aprovecharse para fabricar dispositivos de fraccionamiento para perlas de poliestireno así como partículas biológicas. Como en la FIG. 2A, la imagen de lapso de tiempo muestra la trayectoria de la partícula durante dos ciclos de flujo hacia adelante y hacia atrás, y nuevamente la trayectoria de las partículas es reversible (es decir, las partículas terminan donde comenzaron).

La FIG. 2C muestra el mismo experimento en la misma matriz para una partícula de tamaño intermedio (1,9 micrómetros). Los resultados son muy diferentes a los mostrados en las FIG. 2A y 2B. Esta partícula "zigzaguea" cuando va hacia la derecha (es decir, se mueve de izquierda a derecha) para seguir el flujo de fluido, pero "impacta" cuando va hacia la izquierda para seguir el eje de la matriz de postes. Su trayectoria no se invierte cuando se invierte la dirección del flujo de fluido, con el resultado neto de que tales partículas se separan de un tapón de fluido en una dirección perpendicular cuando el fluido se somete a un flujo oscilatorio.

El desplazamiento de una partícula fuera de un poste puede ser una interacción inherentemente irreversible, pero las trayectorias de las partículas en una matriz de impacto de postes circulares son aparentemente reversibles debido a la simetría. No hay controversia en esta afirmación para las partículas pequeñas que siguen al fluido porque el flujo del fluido tiene que ser reversible en el régimen de bajo número de Reynolds (Re 10e-3 típico para una velocidad del fluido de 100 micrómetros/s y una escala de longitud de 10 micrómetros). Sin embargo, las partículas grandes no siguen al fluido; en cambio, se desplazan de los postes por repulsión estérica, por lo que aunque el fluido puede invertir la dirección, la trayectoria de las partículas que interactúan con los postes no será necesariamente reversible a menos que su interacción con los postes sea simétrica con la dirección del fluido. En el esquema de FIG. 3A, las partículas que se mueven hacia la izquierda se desplazan hacia abajo por la fila superior de postes, mientras que las partículas que se mueven hacia la derecha se desplazan en la misma cantidad por la fila inferior de postes. Sin embargo, si la imagen se gira 180 grados, que es análogo a cambiar la dirección del fluido, la situación cambia exactamente, por lo que el resultado debe ser el mismo en cualquier dirección. Esta rotación funciona porque tanto los puntos de retícula como la forma del poste son invariables bajo una rotación de 180 grados. Como resultado, tanto las partículas grandes como las pequeñas en una matriz de impacto con postes circulares pueden volver sobre sus pasos si el flujo se cambia hacia adelante y hacia atrás.

Las simulaciones numéricas mostraron que el perfil de velocidad a través de un espacio entre postes triangulares se desplazó hacia el lado del espacio con el vértice. El perfil de velocidad del fluido a través de un espacio entre postes depende en gran medida de la geometría local en el espacio. Para el caso de los postes triangulares presentados en el presente documento, donde hay un vértice agudo en la parte inferior y un borde plano en la parte superior, debe esperarse una desviación significativa del perfil de flujo parabólico utilizado para describir el flujo impulsado por presión a través de postes circulares. La FIG. 4A muestra una simulación numérica de la velocidad del fluido en una matriz como la que se utiliza para producir las trayectorias de partículas en la FIG. 2, junto con una sección transversal del perfil de velocidad a través del espacio. La línea se puso a lo largo del espacio más pequeño entre los postes para corresponder con las anchuras de corriente más estrechas donde es más probable que se crucen las líneas de parada. Los vértices del triángulo se redondearon con una curvatura de 500 nm para aproximar el redondeo de una punta aguda que resulta de la litografía óptica. Se observó que el perfil de flujo era invariante bajo cambios en la inclinación de la matriz, por lo que se puede suponer que este perfil de flujo es el perfil de flujo general para postes triangulares dispuestos de esta manera.

La FIG. 4B muestra una comparación entre los perfiles de flujo de los postes triangulares y circulares. Para postes redondos, el perfil es casi parabólico como se esperaba para el flujo de Poiseuille a través de un canal unidimensional infinitamente largo. Para postes triangulares, sin embargo, el perfil de flujo está sesgado hacia la esquina triangular aguda que apunta hacia la corriente de flujo. En otras palabras, las corrientes se agrupan más cerca de este vértice y el tamaño crítico de partícula para que una partícula impacte a través de una línea de parada es menor de lo que sería para una matriz con el mismo tamaño de espacio pero con obstáculos redondos. A lo largo del borde plano, ocurre lo contrario. Debido a que el fluido se desplaza preferentemente a lo largo del vértice, la anchura de la corriente a lo largo del borde plano es mayor que para los postes circulares. El efecto de los postes triangulares es crear dos tamaños de partículas críticos separados, uno para moverse a lo largo del vértice del triángulo y otro para moverse a lo largo del borde plano. Por lo tanto, las partículas entre estos dos tamaños de partícula críticos pueden exhibir un comportamiento diferente dependiendo de la dirección en la que se muevan a través de la matriz. Para mostrar esto, se empleó una técnica utilizada por Inglis et al., 2006, Lab Chip 6: 655-658 para estimar el tamaño crítico de partícula para postes circulares utilizando el perfil de velocidad extraído en lugar de la parábola asumida para postes circulares.

La FIG. 5 muestra este cálculo del tamaño crítico de partícula como una relación del espacio para el vértice y el plano del triángulo, así como para postes circulares frente al ángulo de inclinación de la matriz. Las partículas que se muestran en la figura dos se muestran como círculos en el gráfico. Muestran una buena concordancia con el comportamiento previsto. La perla de 1,1 micrómetros es más pequeña que los dos tamaños de partículas críticos, por lo que se desplaza con el fluido en ambas direcciones y no muestra ningún desplazamiento neto cuando se realiza un ciclo en la dirección del fluido. La partícula de 3,1 micrómetros es más grande que los dos tamaños de partículas críticos, por lo que se desplaza a lo largo del eje de la matriz en ambas direcciones y no muestra ningún desplazamiento neto cuando se realiza un ciclo en la dirección del fluido. La partícula de 1,9 micrómetros se encuentra entre los dos tamaños de partículas críticos, por lo que se desplaza con el fluido cuando se mueve a lo largo del borde plano del triángulo y con el eje de la matriz cuando se mueve a lo largo del vértice del triángulo. Como resultado, muestra un desplazamiento neto cuando se cicla el flujo de fluido. Esto es característico de un comportamiento de trinquete. Sin desplazamiento neto del fluido, las partículas en el intervalo intermedio de una matriz muestran un desplazamiento neto después de varias oscilaciones del flujo de fluido. Este trinquete se diferencia de otros trinquetes en que el movimiento de trinquete no se produce a lo largo del eje de la fuerza aplicada correspondiente al flujo de fluido en ninguna dirección. En su lugar, es perpendicular al movimiento del fluido.

Los sistemas y dispositivos de procesamiento celular basados en chips DLD como se describen en el presente documento pueden recuperar todos los subconjuntos de glóbulos blancos (WBC) de la sangre completa con un rendimiento > 90 % sin la necesidad de una etapa de lisis de glóbulos rojos (RBC) separada. El uso de este nuevo método de procesamiento de células basado en chips DLD como se proporciona en el presente documento puede ser aplicable a muchas investigaciones y ensayos de diagnóstico que requieren análisis de una sola célula o aislamiento de células raras, incluida la citometría de flujo, citometría de masas, genómica unicelular, proteómica, metabolómica y una amplia gama de nuevas técnicas en desarrollo. Los métodos, sistemas y dispositivos del presente documento pueden ser una investigación, innovación clínica y comercial que puede interrumpir productivamente el procesamiento celular y puede reemplazar las etapas de lavado convencionales por centrifugación actuales que son omnipresentes en los laboratorios clínicos y de investigación.

También se describe en el presente documento el proceso del chip DLD microfluídico, que puede recoger células de un flujo de fluido en función del tamaño. Una mezcla de fluido y partículas fluye a través de una matriz de micropostes, en la que el eje de micropostes puede estar inclinado formando un pequeño ángulo de unos pocos grados desde la dirección del flujo de fluido. Las partículas por encima de un cierto tamaño crítico (en nuestro caso, los glóbulos blancos (WBC)) pueden "impactar" con los postes para fluir en una dirección a lo largo del eje de la matriz inclinada (por lo tanto, el dispositivo puede denominarse "matriz de impacto"; FIG. 17). Las partículas más pequeñas y moléculas disueltas, tales como glóbulos rojos (RBC), plaquetas, constituyentes del suero solubles y en forma de partículas, Mab y reactivos químicos pueden fluir en línea recta, en promedio, con la corriente de fluido. Por tanto, después de desplazarse a través del chip microfluídico, las células más grandes pueden haber salido y pueden haberse alejado de la corriente de fluido de la mezcla de entrada original y pueden recogerse por separado. El proceso se ha utilizado para retirar una diversidad de objetos de un fluido de entrada, que varían desde grandes oligómeros de ADN (~100 kpb) hasta bacterias E. coli y otras bacterias, plaquetas, glóbulos rojos (RBC) y glóbulos blancos (WBC). El tamaño crítico que determina qué trayectoria siguen las celdas u otros objetos se puede controlar mediante el diseño de la matriz de micropostes (por ejemplo, el tamaño y la forma de los postes, espacios entre postes, ángulo de inclinación del eje). Este no es un proceso de tamizado; las células o partículas varias veces más grandes que el tamaño crítico que determina el impacto (por ejemplo, las células que se van a recoger) pueden fluir a través del dispositivo sin atascarse. La naturaleza de flujo continuo del DLD puede ofrecer la posibilidad de alto rendimiento sin degradar la resolución para un enfoque reproducible, de bajo coste, para lavar glóbulos blancos que se han marcado para citometría de flujo.

D. Matriz de impacto que emplea postes triangulares

Este ejemplo describe matrices microfluídicas que clasifican partículas según el tamaño de acuerdo con el método de desplazamiento lateral determinista (DLD), utilizando postes triangulares en lugar de postes redondos o circulares. Cuando se utilizan postes triangulares en lugar de postes redondos, y los postes triangulares están orientados de manera apropiada (es decir, de manera que las superficies que definen el espacio son asimétricas), se reduce el tamaño crítico para un tamaño de espacio determinado entre los postes. Esto se debe a que la diferente geometría del poste a cada lado del espacio provoca un perfil de flujo asimétrico a través del espacio, desplazándose el flujo hacia el vértice del triángulo. Este cambio en el flujo de fluido reduce la anchura de la corriente que determina el tamaño de partícula crítico. En este ejemplo, se usan tanto el experimento como el modelado para mostrar que el cambio de la forma del poste de circular a triangular da como resultado varias ventajas prácticas con respecto a matrices similares con postes circulares que incluyen un mayor intervalo dinámico y rendimiento.

El desplazamiento lateral determinista puede ser una técnica de separación de partículas en función del tamaño que se basa en el desplazamiento selectivo de partículas por una matriz de obstáculos dispuestos en un fluido que fluye. La FIG.6A ilustra un esquema de los parámetros de matriz relevantes y características importantes de los dispositivos descritos en este ejemplo. La matriz de obstáculos se compone de columnas de postes en donde cada columna adyacente está desplazada una pequeña distancia con respecto a paredes del canal más grandes que dictan la dirección del flujo general de fluido ("FLUIDO" en la FIG. 6A). En este caso, los postes son triángulos equiláteros con una longitud S de lado (al contrario que en la FIG. 6A, S es la longitud del lado, no la distancia desde un vértice del triángulo hasta la base opuesta a ese vértice). Este desplazamiento produce una matriz en la que un eje a lo largo del cual se sitúan los obstáculos está situado formando un ángulo de inclinación £ con respecto a la dirección del flujo de fluido. El ángulo de inclinación se selecciona de manera que la matriz sea periódica después de 1/£ filas. En este caso, el fluido que fluye a través de los espacios entre los postes (la longitud del espacio se denomina G en FIG. 6A) se puede dividir en un número entero de tubos de corriente delineados por líneas de corriente de estancamiento. Restringido por la periodicidad y la dirección del flujo de fluido en promedio, cada uno de estos tubos de corriente lleva el mismo flujo volumétrico.

Las partículas suspendidas en el fluido exhiben uno de dos comportamientos dependiendo de su tamaño en relación con la anchura del tubo de corriente más cercano al poste a medida que se mueven a través de un espacio. No perturbadas por otros efectos, las partículas pueden seguir aproximadamente los tubos de corriente en el flujo de fluido. Este comportamiento se puede observar para partículas que tienen radios más estrechos que la anchura del tubo de corriente. Estas partículas, mostradas como la partícula inferior y la trayectoria de puntos en la FIG. 6A, no se ven afectadas por los postes y se abren paso a través de la matriz mientras permanecen dentro de los límites de una sola corriente. Como resultado, se desplazan en promedio en la misma dirección que el flujo general de fluido. Las partículas con radios mayores que la anchura del tubo de corriente, indicadas como la partícula superior y la trayectoria de puntos en la FIG. 6A, no caben dentro de un solo tubo de corriente mientras se desplazan a través del espacio. Esas partículas más grandes se desplazan de manera determinista por el poste a través de la línea de corriente de estancamiento hacia el tubo de corriente adyacente. Debido a la forma en que los tubos de corriente pasan por su posición en el espacio, este desplazamiento tendrá lugar en cada columna de postes y la partícula más grande se desplazará a lo largo del eje de la matriz (es decir, en la dirección de la matriz, que difiere de la dirección general del fluido por el ángulo de inclinación E). Este comportamiento binario lleva a los presentes solicitantes a describir un tamaño crítico que separa estos dos comportamientos. Como la mayoría de las veces las partículas a separar se describen por su diámetro, el tamaño crítico se denota como el doble de la anchura del tubo de corriente más cercano al poste en el espacio entre los postes.

El cambio de la forma del poste puede tener un fuerte efecto sobre el tamaño de partícula crítico al cambiar la forma del perfil de flujo a través del espacio. Las alteraciones en el perfil del flujo alteran la anchura de los tubos de corriente más cercanos a los postes que definen un espacio. Debido a que el tamaño de partícula crítico puede estar directamente relacionado con estas anchuras, la alteración del perfil de flujo dentro de un espacio también altera el o los tamaños críticos definidos por el espacio. Al cambiar la forma de la sección transversal de los postes de una forma circular a triángulos equiláteros, se puede crear una asimetría en el perfil de flujo a través del espacio que desplaza más flujo de fluido hacia el vértice del triángulo, como se muestra en la Fig. 6B. Esto da como resultado diferentes anchuras de tubo de corriente en la parte superior (adyacente al borde plano de un poste triangular) y en la parte inferior (adyacente al vértice de un poste triangular) del espacio y le da a la matriz dos tamaños de partículas críticos distintos.

El cambio en el flujo hacia el vértice del triángulo puede conducir a una anchura reducida del tubo de corriente a lo largo de este borde y, por lo tanto, puede reducir el tamaño de partícula crítico correspondiente a ese tubo de corriente y borde, con respecto a una matriz similar con postes circulares. Esto se demuestra en los dos paneles de la FIG. 6B, que muestra perfiles de flujo simulados numéricamente a través de los espacios. Los dos perfiles de flujo, normalizados con respecto a la anchura del espacio entre los postes y la velocidad máxima, se representan uno al lado del otro con fines comparativos. El fluido que constituye el primer tubo de corriente para el ángulo de inclinación £ = 1/10 se ha sombreado para enfatizar la diferencia en la anchura de corriente, que disminuye desde aproximadamente el 20 % del espacio delimitado por postes circulares a aproximadamente el 15 % del espacio delimitado por postes triangulares. Este cambio es fundamental para la reducción del comportamiento del tamaño crítico de las partículas que presentan los dispositivos con postes triangulares. El perfil de flujo cambiado creado por postes triangulares se puede utilizar para crear un trinquete microfluídico determinista. En la información analizada en este ejemplo, la atención se centra en la mejora de los dispositivos de separación de partículas de flujo continuo y el desplazamiento lateral determinista de las partículas dentro de ellos que se posibilita al cambiar la forma del poste.

La reducción en el tamaño crítico de partícula permitida por los postes triangulares se caracterizó examinando el comportamiento de perlas fluorescentes en matrices con diversas cantidades de inclinación de matriz y comparando los resultados con las predicciones teóricas. La FIG. 7 muestra el comportamiento observado de partículas (desplazadas por la matriz o no desplazadas por la matriz) normalizado con respecto al tamaño del espacio frente a la inclinación de la matriz, así como los tamaños críticos de partículas predichos utilizando el método descrito por Inglis et al., 2006, Lab Chip 6:655-658. Las líneas en FIG. 7 representan el tamaño crítico de partícula predicho para un ángulo de inclinación dado, representando la línea continua las predicciones para matrices con postes triangulares y representando la línea de puntos las predicciones para matrices con postes redondos. Es de esperar que las partículas por encima de la línea se desplacen por la matriz, y no es de esperar que se desplacen las partículas por debajo de la línea. Los datos demostraron que existe un acuerdo razonable con el comportamiento predicho para ángulos de inclinación mayores, mientras que hay alguna desviación en los ángulos de inclinación menos profundos, especialmente en un ángulo de inclinación £ de 1/20 radianes. Esta desviación podría deberse a que el flujo a través de la matriz no es completamente horizontal, lo que tendrá un gran efecto a inclinaciones de la matriz menos profundas, o al redondeo de los bordes de los postes triangulares, que se analizará más adelante en este ejemplo.

Como comparación se ha añadido el comportamiento de partículas predicho para postes circulares, representado por la línea de puntos. Para cualquier ángulo de inclinación práctico (entre 1/5 y 1/100), el tamaño crítico en una matriz con postes triangulares puede ser sustancialmente menor que el tamaño crítico en una matriz similar con postes circulares, ascendiendo la diferencia hasta el 10 % del espacio para los ángulos de inclinación más pronunciados. Estas propiedades permiten separar partículas más pequeñas por una matriz de postes triangulares que las que pueden separarse por una matriz de postes redondos que tiene la misma separación de espacios. Estas propiedades también hacen que la separación de espacios en el caso de los postes triangulares que es necesaria para separar partículas de un tamaño seleccionado sea mayor que la separación de huecos correspondiente en el caso de los postes redondos que sería necesaria para separar las mismas partículas.

En cualquier caso, un tamaño crítico de partícula reducido como una fracción del espacio puede ser útil para reducir la obstrucción en la matriz. En algunos casos, las muestras biológicas contienen especies con una amplia gama de tamaños. En algunos casos, se pueden utilizar etapas de filtrado o de separación múltiple para garantizar que una matriz siga funcionando. El uso de postes triangulares permite aumentar el tamaño del espacio para un tamaño crítico de partícula determinado y reducir las posibilidades de que se obstruya la matriz. La FIG. 8 ilustra cuánto más grande puede hacerse el espacio entre los postes en función de la inclinación de la matriz. Representada como una relación de los dos espacios para un tamaño crítico de partícula fijo, se puede ver una mejora mínima del 20 % al aumentar el tamaño del espacio a medida que se reduce la inclinación, con una relación de 1,25 para un ángulo de inclinación de 1/4 y una relación de 1,94 para un ángulo de inclinación de 1/100. Por tanto, los ángulos de inclinación menos profundos pueden facilitar el uso de espacios más grandes a costa de un ángulo de separación más pequeño y un tamaño de matriz mayor. Sin embargo, los espacios más grandes pueden proporcionar otro beneficio en términos de mayor rendimiento de la matriz.

Una comparación de rendimiento entre una matriz con postes triangulares y circulares mostró un aumento sustancial en la velocidad promedio para una caída de presión dada en la matriz con postes triangulares. Se construyeron matrices con postes triangulares o con postes circulares con características casi idénticas. Todas tenían la misma anchura y longitud general de canal, profundidad, ángulo de inclinación (1/10) y tamaño de postes (los diámetros de los postes redondos eran iguales a las longitudes de los lados de los postes de triángulo equilátero). La única variación era el espacio entre los postes, que se diseñó y se verificó con simulación numérica para dar un diámetro crítico de partícula de aproximadamente 3,2 micrómetros para las dos matrices. Esas simulaciones numéricas indicaron que el diámetro crítico de partícula se logró utilizando un espacio de 10,5 micrómetros en matrices con postes triangulares y un espacio de 8,3 micrómetros en matrices con postes circulares.

Las trayectorias de perlas fluorescentes de 500 nanómetros se registraron con una cámara de dispositivo acoplado cargado de multiplicación de electrones (EMCCD) que capturaba un vídeo a 10 fotogramas por segundo y luego se analizaron usando el software MATLAB™ para un gradiente de presión dado a través de la matriz.

Se eligieron partículas pequeñas que no serían desplazadas (es decir, impactadas) por la matriz para que muestrearan cada una de las corrientes de flujo de manera uniforme y proporcionaran una representación precisa de la velocidad promedio general del fluido.

Las velocidades promedio de las partículas se representan en la FIG. 9 en función del gradiente de presión junto con un ajuste lineal ponderado. Las líneas ajustadas demuestran que las partículas en la matriz de postes triangulares se movieron mucho más rápido. El intervalo superior de presiones estaba limitado por el campo de visión del microscopio y la velocidad de captura de la cámara. Más allá de varios kPa de presión, las partículas atravesaron todo el campo de visión dentro de uno o dos fotogramas del vídeo y no se pudo hacer una estimación precisa de la velocidad. Sin embargo, dado que el número de Reynolds en estos experimentos es del orden de 10-2, el ajuste lineal se puede extender de manera segura en el intervalo de decenas de kPa para igualar la relación lineal esperada entre la velocidad y la presión que se observa para flujos de bajo número de Reynolds. Los postes no necesitan tener una sección transversal triangular. También se pueden utilizar postes que tengan otros perfiles de sección transversal (cuadrados, oblongos o irregulares), siempre que la forma de los obstáculos haga que el espacio sea asimétrico.

Comparando las pendientes de los dos ajustes lineales en la FIG. 9 , se puede ver que las partículas en la matriz con postes triangulares se desplazaron un 85 % más rápido en promedio que las de una matriz con postes circulares. Este resultado concuerda con la simulación numérica realizada con el software COMSOL™ que mostró que la velocidad promedio fue 82 % más rápida para los postes triangulares. El mecanismo detrás de estos hallazgos se puede entender haciendo una analogía con el flujo de Poiseuille entre dos placas paralelas, donde la velocidad promedio para un gradiente de presión fijo es proporcional a la distancia más pequeña entre las placas al cuadrado. La analogía no es exacta porque la estructura de confinamiento es una matriz de postes en lugar de dos placas paralelas, pero subraya los beneficios de aumentar la anchura del espacio, donde solo unos pocos micrómetros producen un aumento sustancial en el rendimiento.

Las ganancias conseguidas cambiando la forma del poste se degradan si no se tiene cuidado de mantener los vértices del poste agudos. La FIG. 10 muestra el efecto de redondear los bordes de los postes triangulares sobre el tamaño crítico de partícula. se simuló una matriz con postes de 10 micrómetros, espacios de 10 micrómetros entre postes y un ángulo de inclinación de 1/30 utilizando el software COMSOL™, variando los vértices redondeados a varios radios de curvatura desde ninguno (r = 0) hasta el redondeo completo donde la forma final es un círculo (r = S/121/2). Se extrajeron los perfiles de flujo a través de los espacios para cada redondeo y se calculó el tamaño crítico para la inclinación dada utilizando métodos previamente establecidos. Como se muestra en la FIG. 10, hay un aumento espectacular en el tamaño crítico de partícula a medida que la forma del poste pasa de triangular a circular. A partir de 0,174 G cuando el poste es completamente triangular (es decir, r = 0), el tamaño crítico de partícula aumenta un 35 % a 0,235 G cuando el poste es completamente circular (r = S/121/2). La transición sugiere que si en un proceso de fabricación se produce un redondeo de vértice indeseable, el uso de postes más grandes (aumentando S) ayudará a mantener el tamaño crítico de partícula reducido que resulta del uso de postes triangulares.

Esta observación también ayuda a explicar la desviación del comportamiento esperado observado para algunas de las perlas fluorescentes en la FIG. 7. Las imágenes SEM de los postes muestran un redondeo de vértices (r/S) de 0,118 ± 0,006, que corresponde a un aumento en el tamaño crítico de partícula de 0,93 micrómetros a 1,12 micrómetros.

Cuando se purifica una pluralidad de partículas pasándolas a través de una matriz de obstáculos, el rendimiento de las partículas deseadas se puede regular ajustando la forma de la sección transversal de los obstáculos. En algunos casos, el ajuste de la forma de sección transversal de los obstáculos puede aumentar el rendimiento de las partículas deseadas. En algunos casos, la forma de los obstáculos puede afectar al nivel de deformación de las partículas que fluyen a través de los obstáculos. Las partículas que se deforman pueden tener un bajo rendimiento después de atravesar los obstáculos (véase, por ejemplo, la FIG.53A). Por tanto, los obstáculos con formas de sección transversal que provocan un bajo nivel de deformación pueden incrementar el rendimiento de las partículas. En algunos casos, la forma de sección transversal de los obstáculos puede crear efectos de inercia que dan como resultado un desplazamiento lateral adicional cuando las partículas fluyen a través de los obstáculos. El efecto de inercia puede dar como resultado una mejor separación de partículas de diferentes tamaños en una muestra.

Los métodos y dispositivos para purificar las partículas pueden comprender una matriz de obstáculos con secciones transversales que tienen uno o más vértices. Los obstáculos de tales formas pueden crear menos fuerza de cizallamiento para las partículas que fluyen en comparación con los obstáculos con formas suaves, tales como redonda. En algunos casos, la forma de la sección transversal de los obstáculos puede ser poligonal, por ejemplo, un cuadrilátero. Los ejemplos no limitantes de cuadrilátero incluyen un cuadrilátero cíclico, cuadrado, cometa, paralelogramo, rombo, oblongo, romboide, rectángulo, cuadrilátero tangencial, trapezoide, trapecio o trapezoide isósceles. El cuadrilátero puede tener al menos un ángulo entre 87 ° y 93 °. Por ejemplo, la forma de los obstáculos puede ser cuadrada.

los espacios de los obstáculos también pueden afectar a la fuerza de cizallamiento de los obstáculos para las partículas que fluyen a través de los obstáculos. Un espacio respectivo se puede definir por la superficie de dos obstáculos. En algunos casos, el espacio respectivo puede estar orientado de una forma sustancialmente simétrica con respecto a un plano que se extiende a través del centro del espacio respectivo y que es paralelo a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos. En algunos casos, el espacio respectivo puede estar orientado de una forma sustancialmente simétrica con respecto a un plano que se extiende a través del centro del espacio respectivo y que es paralelo a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos.

En algunos casos, se pueden utilizar métodos que aprovechan los obstáculos con formas de sección transversal optimizadas para aislar un primer tipo de partículas en una muestra que comprende los primeros tipos de partículas y un segundo tipo de partículas, purificando así el primer tipo de partículas de la muestra. Lo que se proporciona en el presente documento incluye un método para separar un primer grupo de partículas y un segundo grupo de partículas en una muestra que comprende el primer grupo de partículas y el segundo grupo de partículas, comprendiendo el método: (a) pasar la muestra a través de una matriz de obstáculos, obteniéndose así un producto. En algunos casos, la forma de la sección transversal de los obstáculos puede ser un cuadrilátero, por ejemplo, un cuadrilátero cíclico, cuadrado, cometa, paralelogramo, rombo, oblongo, romboide, rectángulo, cuadrilátero tangencial, trapezoide, trapecio o trapezoide isósceles. En algunos casos, el espacio entre las partículas es simétrico y los dos obstáculos que forman el espacio tienen vértices que se apuntan entre sí a través del espacio. La forma de la sección transversal del obstáculo puede ser cualquier forma que tenga un vértice en el espacio que produzca un espacio simétrico, por ejemplo, cuadrilátero, hexágono, octágono, decágono, etc.

Tales métodos y dispositivos pueden configurarse para conseguir un alto rendimiento de los primeros tipos de células y una baja contaminación de los segundos tipos de células en el producto purificado. En algunos casos, el rendimiento del primer grupo de partículas (por ejemplo, las partículas deseadas) puede ser al menos del 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. En algunos casos, el rendimiento del primer grupo de partículas (por ejemplo, las partículas deseadas) puede ser del 100 %. En algunos casos, la contaminación del segundo grupo de partículas (por ejemplo, las partículas no deseadas) puede ser inferior al 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,09 %, 0,08 %, 0,07 %, 0,06 %, 0,05 %, 0,04 %, 0,03 %, 0,02 %, 0,01 %, 0,005 % o 0,001 %. En algunos casos, el segundo grupo de partículas no existe en el producto purificado. En algunos casos, el producto purificado puede comprender al menos el 80 % del primer grupo de partículas y menos del 0,01 % del segundo grupo de partículas.

E. Dispositivo de "lavado de coches"

Los dispositivos, métodos, composiciones y kits descritos en el presente documento reemplazan el tratamiento químico o con reactivos y/o las etapas manuales de lavado/concentrado presentes en muchas técnicas conocidas en este campo. Los dispositivos proporcionados en el presente documento pueden reemplazar cualquier procedimiento que requiera centrifugación conocido en la técnica. En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones y kits proporcionados en el presente documento reemplazan las etapas de marcaje (por ejemplo, de la superficie celular y/o intracelular) y lavado/concentrado utilizadas para procesar muestras que comprenden células. Las células procesadas pueden usarse luego para investigación y/o pruebas de diagnóstico clínico. En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones y kits proporcionados en el presente documento reemplazan las etapas de marcaje (por ejemplo, de la superficie celular y/o intracelular), lavado/concentrado y/o lisis de eritrocitos utilizadas para procesar muestras de sangre para su uso en investigación y pruebas de diagnóstico clínico. Las pruebas clínicas y de diagnóstico se pueden utilizar para el cáncer, enfermedades infecciosas e inflamatorias y/o muchas otras enfermedades. En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones y kits proporcionados en el presente documento reemplazan las etapas de lisis, tratamiento(s) enzimático(s), clonación y/o lavado/concentrado utilizadas para procesar muestras que comprenden células desde células a bibliotecas de ácidos nucleicos. Las bibliotecas de ácidos nucleicos se pueden utilizar en secuenciación. La secuenciación puede ser cualquier método o plataforma de secuenciación de última generación conocido en la técnica. Los métodos proporcionados en el presente documento pueden ser procesos microfluídicos automatizados sin reactivos que pueden recoger, lavar y concentrar eficazmente partículas (por ejemplo, células) en varios minutos, con alto rendimiento, alta reproducibilidad y bajo coste. Las partículas pueden ser cualquiera de las células proporcionadas en el presente documento. En algún caso, las partículas son células madre, leucocitos y/o células de leucemia.

Como se muestra en la FIG 17B, un dispositivo de "lavado de coches" tal como se proporciona en el presente documento puede comprender dos entradas (Figura 17B; 'muestra' y 'tampón') que están configuradas para hacer fluir dos fluidos separados desde un área de entrada de un dispositivo a un área de salida del dispositivo. En la FIG.

17B, los dos fluidos fluyen de manera laminar paralela a través del dispositivo hacia dos salidas en una parte de salida del dispositivo, en donde los fluidos de flujo laminar están presentes como corrientes o tubos de corriente que no se mezclan. Como también se muestra en la FIG. 17B, los fluidos que fluyen a través del dispositivo desde el área de entrada al área de salida encuentran una matriz de obstáculos entre ellas. La matriz de obstáculos puede ser una matriz DLD (matriz de postes inclinados en la FIG. 17B) tal como se proporciona en el presente documento. La matriz se puede configurar para separar partículas en las corrientes de flujo laminar, paralelas, basándose en el tamaño de una manera determinista como se describe en el presente documento. Las partículas más grandes que el tamaño crítico de la matriz DLD pueden "tropezar" como se describe en el presente documento y dirigirse hacia la "parte inferior" de la matriz DLD y posteriormente fluir hacia una salida y recogerse en ella (porción de salida de producto de la FIG. 17B). Como se muestra en la FIG. 17B, las dos entradas están separadas entre sí por una pared. En algunos casos, una pared que separa las entradas adyacentes en un dispositivo de lavado de coches de múltiples entradas tal como se proporciona en el presente documento se extiende hacia el interior de un canal que comprende las entradas, la matriz DLD y las salidas hasta que la pared se encuentra o topa con un borde de la matriz DLD. El borde de la matriz DLD puede ser el borde más cercano o más próximo a las entradas. Como se muestra en la FIG. 17B, el borde de la matriz DLD es perpendicular a la pared que separa las entradas. Como se muestra en la FIG. 17B, las dos salidas están separadas entre sí por una pared. Como se muestra en la FIG. 17B, la pared que separa las salidas adyacentes en un dispositivo de "lavado de coches" tal como se proporciona en el presente documento puede extenderse desde el borde de la matriz DLD más cercano a las salidas hasta el final del canal, en donde el borde de la matriz DLD es perpendicular a la pared que separa las salidas. Basándose en los principios de DLD como se describe en el presente documento, las partículas (por ejemplo, células, ácidos nucleicos, reactivos tales como anticuerpos, sondas, etc.) por encima de un tamaño crítico fluirán en la dirección del flujo general de fluido y saldrán del dispositivo por una salida (producción de residuos en la FIG. 17B), mientras que las partículas (por ejemplo, células, ácidos nucleicos, etc.) por encima del tamaño crítico salen del dispositivo por una segunda salida o salida separada (salida de producto en la FIG. 17B). Como se muestra en la FIG. 17B, un dispositivo de "lavado de coches" tal como se proporciona en el presente documento se usa para lavar glóbulos blancos (por ejemplo, leucocitos) en una muestra que comprende agentes de unión que comprenden marcadores (por ejemplo, moléculas marcadoras) y células más pequeñas (por ejemplo, glóbulos rojos). Tal como se puede observar, la muestra fluye desde el área de entrada a través de la matriz DLD hasta el área de salida, en donde al entrar en la matriz de postes inclinados, los glóbulos blancos tropiezan y se desvían de la corriente de flujo de muestra a la corriente de flujo de tampón paralela, mientras que los agentes de unión que comprenden marcadores (por ejemplo, moléculas marcadoras) y glóbulos rojos permanecen en la corriente de muestra. Después, los glóbulos blancos se pueden recoger de la salida de producto esencialmente lavados y purificados de las moléculas marcadoras y los glóbulos rojos (FIG. 17C).

Como se muestra en la FIG. 19, un dispositivo de "lavado de coches" tal como se proporciona en el presente documento puede comprender una pluralidad de entradas y una pluralidad de salidas con una matriz de obstáculos entre ellas (por ejemplo, matriz de postes inclinados de la FIG. 19). La pluralidad de entradas puede ser más de dos entradas. La pluralidad de salidas puede ser más de dos salidas. El dispositivo puede comprender un canal delimitado por una primera pared y una segunda pared, en donde la segunda pared se opone a la primera pared, y en donde la primera y la segunda paredes están configuradas para confinar fluidos que fluyen entre ellas. El dispositivo puede comprender además una pluralidad de entradas entre la primera y la segunda pared. Como se muestra en la FIG. 19, las entradas pueden ser adyacentes entre sí y pueden estar separadas por una pared. Las paredes separadoras entre entradas adyacentes pueden extenderse al interior del canal a lo largo de una distancia. La distancia puede ser hasta el borde perpendicular más cercano de la matriz DLD. El canal se puede configurar para que fluya una pluralidad de fluidos en corrientes desde la pluralidad de entradas a través de la matriz DLD hasta la pluralidad de salidas. Las corrientes pueden fluir de una manera laminar paralela, en donde las corrientes de flujo adyacentes ("corrientes de flujo" o "tubos de corriente") experimentan una mezcla mínima (por ejemplo, debido a una difusión limitada), nula o sustancialmente nula entre las corrientes de flujo adyacentes. En algunos casos, una partícula (por ejemplo, una célula) puede moverse formando un ángulo con las corrientes de flujo paralelas por la acción del desplazamiento lateral determinista (DLD). En algunos casos, las células se introducen sin un reactivo químico o enzimático de procesamiento, se desplazan al interior de una corriente de flujo que comprende dicho reactivo químico o enzimático por DLD y después salen de la corriente y entran en una corriente que comprende un tampón limpio (es decir, libre de reactivos) y luego salen a una salida de producto, ya lavadas. La matriz DLD entre la pluralidad de entradas y salidas puede ser cualquier matriz DLD tal como se proporciona en el presente documento. En algunos casos, la matriz DLD comprende micropostes redondos. En algunos casos, la matriz DLD comprende micropostes triangulares. En algunos casos, la DLD comprende micropostes tanto redondos como triangulares. Los micropostes pueden tener cualquiera de las dimensiones proporcionadas en el presente documento. Las corrientes de fluido pueden fluir a través del canal a cualquiera de los caudales proporcionados en el presente documento. En algunos casos, un dispositivo de lavado de coches tal como se proporciona en el presente documento está configurado para ser de alto rendimiento, en donde las corrientes de fluido fluyen a altas velocidades de flujo (por ejemplo, al menos 1 ml/min). En algunos casos, un dispositivo de lavado de coches tal como se proporciona en el presente documento está configurado o adaptado para ser de alto rendimiento, en donde el volumen de muestra para pasar por el dispositivo es superior a 100 ml. La FIG.

19 muestra un dispositivo que comprende 3 entradas en el área de entrada de un dispositivo que comprende una matriz DLD. Las 3 entradas están configuradas para hacer fluir 3 corrientes de flujo paralelas entre sí. Una primera corriente de flujo comprende una muestra, en donde la muestra comprende partículas, una segunda corriente de flujo comprende un reactivo y una tercera corriente de flujo comprende un tampón de lavado. El dispositivo está configurado de manera que la muestra se introduce en las entradas más cercanas a una primera pared límite y las partículas dentro de la muestra se desvían hacia una segunda pared límite opuesta a medida que las partículas se mueven a través de la matriz DLD, con lo que las partículas dentro de la muestra se separan por tamaño de una manera determinista. Las partículas dentro de la muestra por encima de un tamaño crítico de la matriz DLD se pueden desviar hacia la segunda pared, mientras que las partículas por debajo del tamaño crítico pueden fluir a través de la matriz DLD en la dirección de las corrientes de flujo. En la FIG. 19, las partículas dentro de la corriente de muestra desviadas hacia la segunda pared pasan a través de la corriente de reactivo y luego a la corriente de flujo de tampón, en donde un reactivo dentro de la corriente de flujo de reactivo puede reaccionar con las partículas a medida que pasan a través de la corriente de reactivo, y en donde el reactivo puede retirarse por lavado o eliminarse de las partículas a medida que fluyen a través de la corriente de flujo de tampón posterior. Como se muestra en la FIG. 19, las partículas desviadas hacia la segunda pared se pueden concentrar cuando se encuentran con la segunda pared, y posteriormente pueden fluir a través y recogerse de una (por ejemplo, producto en la FIG. 19) de la pluralidad de salidas en el área de salida del dispositivo, mientras que las partículas no desviadas hacia la segunda pared, así como el reactivo de la corriente de reactivo fluye a través de una o más salidas de la pluralidad de salidas que están separadas de la salida del producto (salida de residuos en la FIG. 19). Las partículas desviadas recogidas de un dispositivo como el proporcionado pueden estar libres o sustancialmente libres de reactivos después del flujo de las partículas a través de una corriente de reactivo en un dispositivo de "lavado de coches" de múltiples corrientes como el proporcionado en el presente documento.

La FIG. 18A muestra una realización de un dispositivo de "lavado de coches" como se describe en el presente documento. El dispositivo de la FIG. 18A comprende una pluralidad de entradas y una pluralidad de salidas con una matriz de obstáculos (matriz de postes inclinados en la FIG. 18A) dispuesta entre medias. La pluralidad de entradas se puede configurar para hacer fluir una pluralidad de corrientes de flujo hacia la pluralidad de salidas, en donde cada una de la pluralidad de corrientes de flujo comprende un fluido separado. En la FIG. 18A, el canal comprende 6 entradas configuradas para hacer fluir seis corrientes de flujo separadas en corrientes de flujo laminar a través de una matriz de postes inclinados hacia 2 salidas, una salida de producto y una salida de residuos. Una primera corriente de flujo comprende una muestra que comprende partículas, una segunda corriente comprende un tampón, una tercera corriente comprende una corriente de fijador y de permeabilización, una cuarta corriente comprende un tampón, una quinta corriente comprende una corriente de marcador intracelular y una sexta corriente comprende un tampón. En algunos casos, un dispositivo de múltiples corrientes como el descrito en el presente documento comprende una pluralidad de corrientes de flujo paralelas que fluyen desde una parte de entrada del dispositivo a una parte de salida del dispositivo, en donde al menos 4 de las corrientes de flujo comprenden un reactivo. Dichas al menos 4 corrientes de flujo que comprenden un reactivo pueden comprender el mismo reactivo y/o reactivos diferentes. En algunos casos, cada una de las corrientes de flujo que comprenden un reactivo está delimitada por dos corrientes de flujo paralelas, cada una de las cuales lleva un tampón. El tampón puede ser un tampón de lavado. Un dispositivo como el mostrado en la FIG. 18A se puede configurar para desviar partículas (por ejemplo, leucocitos en una muestra que comprende leucocitos y glóbulos rojos, por ejemplo, sangre) de un tamaño predeterminado (por ejemplo, por encima de un tamaño crítico de la matriz de postes inclinados) desde la corriente de muestra a través de las cinco corrientes de flujo paralelas posteriores en serie (por ejemplo, muestra ^ tampón ^ fijación/permeabilización ^ tampón ^ interior de célula. marcador^ tampón en la FIG. 18A). Las corrientes de tampón pueden servir para lavar reactivos adsorbidos de forma no específica (es decir, débilmente) en las partículas (por ejemplo, células) y reactivos no unidos de la corriente de flujo adyacente precedente del entorno de las partículas desviadas a través de las corrientes. La corriente de tampón puede retirar o retirar sustancialmente el reactivo unido de forma no específica y no unido de una partícula así como de la corriente que comprende las partículas. Como se muestra en la FIG. 18A, una salida de residuos puede tener una anchura mayor que la anchura de la salida de producto. La salida de residuos en la FIG. 18A comprende reactivos (por ejemplo, Mab de marcaje de superficie, reactivos de fijación/permeabilización y agentes de unión intracelulares que comprenden un marcador, así como partículas no deseadas, por ejemplo, glóbulos rojos (RBC), por debajo del tamaño crítico de la matriz de postes inclinados).

Algunas o todas las etapas de lavado en el procesamiento de glóbulos blancos (WBC) por citometría de flujo se pueden reemplazar con un proceso de chip DLD microfluídico que puede aumentar el rendimiento y la automatización, y reducir el tiempo, la variabilidad y el coste. Las etapas de lavado durante el procesamiento celular para citometría de flujo, que se pueden realizar después del marcaje de la superficie, fijación/permeabilización y marcaje intracelular, pueden asociarse con variabilidad, pérdida de células y coste (basado principalmente en la mano de obra necesaria). Los glóbulos blancos (WBC) deseados se pueden mover formando un ángulo con la dirección del flujo, definido por la geometría del poste, desde la corriente de entrada hasta la salida del producto. Al hacer circular el fluido a velocidades de flujo moderadas (pocos mm/s, junto con la longitud de una matriz DLD de aproximadamente 3-5 cm), las células pueden moverse desde la entrada del chip a la salida del chip en aproximadamente 30 s o menos. En tan poco tiempo, con un diseño adecuado, puede haber pocas posibilidades de que pasen componentes más pequeños no deseados, que no impactan, a la corriente de salida del producto por difusión aleatoria. Esto conduce a un lavado eficaz en una sola pasada a través del chip.

Una o más de las etapas de marcaje de superficie, fijación, permeabilización y marcaje intracelular se pueden realizar en un chip microfluídico proporcionado en el presente documento. En algunos casos, una o más de estas etapas se pueden combinar con una o más etapas de lavado en el mismo chip (FIG. 42). En algunos casos, esto se puede conseguir añadiendo otra entrada al chip DLD para la infusión de los marcadores o los reactivos de fijación/permeabilización. La conversión de estos procedimientos en procesos en el chip puede reducir aún más el coste y el tiempo y mejorar la repetibilidad y la robustez de la prueba. En algunos casos, las partículas se pueden marcar en la superficie y luego lavar en el mismo chip. En algunos casos, las partículas se pueden fijar y/o permeabilizar y luego lavar en el mismo chip. En algunos casos, la partícula se puede marcar intracelularmente y luego lavar en el mismo chip. En algunos casos, las partículas se pueden marcar en la superficie, lavar, fijo y/o permeabilizar, y luego lavar en el mismo chip. En algunos casos, las partículas se pueden fijar y/o permeabilizar, lavar, marcar intracelularmente, y luego lavar en el mismo chip. En algunos casos, las partículas se pueden marcar en la superficie, lavar, fijar y/o permeabilizar, lavar, marcar intracelularmente, y luego lavar en el mismo chip.

Los chips y los protocolos de procesamiento se pueden desarrollar en un proceso iterativo para proporcionar combinaciones con capacidades diferentes/crecientes (FIG. 42). Las capacidades del dispositivo de plataforma se pueden desarrollar de forma sincrónica.

Los chips microfluídicos que realizan diferentes etapas de procesamiento celular se pueden usar junto con uno o más pasos de procesamiento fuera del chip. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie y lavar en un chip microfluídico, fijar y/o permeabilizar por cualquier método fuera del chip. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie mediante cualquier método fuera del chip, y luego fijar/permeabilizar y lavar en un chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden fijar y/o permeabilizar y lavar en un chip microfluídico que realiza la fijación/permeabilización y el lavado de las células, y luego marcar intracelularmente mediante cualquier método fuera del chip. En algunos casos, las células se pueden fijar/permeabilizar y lavar mediante cualquier método fuera del chip, y luego marcar intracelularmente y lavar en un chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie y lavar mediante cualquier método fuera del chip, y luego fijar y/o permeabilizar, lavar, marcar intracelularmente y lavar en un chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie y lavar en un chip microfluídico, y luego fijar y/o permeabilizar, lavar, marcar intracelularmente y lavar por cualquier método fuera del chip. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie, lavar, fijar y/o permeabilizar, y lavar por cualquier método fuera del chip, y luego marcar intracelularmente y lavar en un chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie, lavar, fijar y/o permeabilizar y lavar en un chip microfluídico, y luego marcar intracelularmente por cualquier método fuera del chip.

Los chips microfluídicos que realizan diferentes etapas de procesamiento celular pueden usarse juntos para el procesamiento celular. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie y lavar en un primer chip microfluídico, y fijar y/o permeabilizar y lavar en un segundo chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden fijar y/o permeabilizar y lavar en un primer chip microfluídico, y marcar intracelularmente y lavar en un segundo chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie y lavar en un primer chip microfluídico, fijar y/o permeabilizar, y lavar en un segundo chip microfluídico, y marcar intracelularmente y lavar en un tercer chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie y lavar en un primer chip microfluídico, fijar y/o permeabilizar y lavar por cualquier método fuera del chip, y luego marcar intracelularmente y lavar en un segundo chip microfluídico.

Como se representa en la FIG. 46, dependiendo de la metodología de preparación de la muestra utilizada, se pueden utilizar varias etapas secuenciales, cada una con una o más etapas de lavado (centrifugación, decantación, resuspensión), ocasionando pérdida de células y baja productividad. Las X muestran las etapas que pueden eliminarse mediante los dispositivos, métodos y sistemas descritos en el presente documento. Normalmente, después de cada etapa de lavado, el rendimiento de células puede ser ~ 80-90 % del número de partida de células y, por lo tanto, después de varias etapas de lavado secuenciales en un proceso, el rendimiento total de células puede caer a ~ 50 %.

Los métodos y dispositivos proporcionados en el presente documento pueden generar preparaciones de glóbulos blancos uniformes marcadas intracelularmente y en la superficie de forma rápida y a bajo coste.

Una técnica que no implica una etapa de lavado puede tener Mab fluorescentes libres que pueden crear un aumento en la desviación típica tanto del valor de referencia como de la fluorescencia señal de las células, que puede afectar a la sensibilidad y precisión del ensayo. Los fragmentos celulares, plaquetas y otros desechos generados por el uso de una etapa de lisis pueden crear varios artefactos de citometría de flujo, tales como daños en los glóbulos blancos (WBC) que interfieren y disminuyen la calidad del análisis. Estos factores pueden controlarse en muestras de sangre normales. En muestras de pacientes, tales como muestras que contienen células de leucemia o cancerosas, las células malignas pueden ser altamente sensibles a los reactivos de lisis hipotónicos y la calidad general de la muestra puede ser menor (por ejemplo, las células muertas resultantes pueden unirse de manera no específica al Mab fluorescente y dar así falsos positivos y/o elevar los niveles de referencia). El manejo y manipulación de células puede ser perjudicial para los glóbulos blancos (WBC) frágiles, perturbando potencialmente los resultados, y puede exponer al trabajador del laboratorio a materiales y aerosoles de riesgo biológico.

En el presente documento se describen sistemas, métodos y dispositivos para reemplazar la mayoría de las etapas asociadas con el procesamiento de glóbulos blancos (WBC) para citometría de flujo con procesos basados en chips DLD microfluídicos automatizados que pueden realizar todas las etapas de marcaje de superficie, fijación/permeabilización, marcaje intracelular y lavado con > 90 % de rendimiento de glóbulos blancos a partir de 10 ul de sangre en menos de 10 minutos. El enfoque descrito en el presente documento puede comenzar enriqueciendo la población de glóbulos blancos (WBC) de la sangre humana eliminando suavemente los glóbulos rojos (RBC), plaquetas y otras partículas sin introducir desechos u otros contaminantes en la preparación. El proceso de enriquecimiento descrito en el presente documento puede producir > 90 % de glóbulos blancos de partida mientras se mantienen las proporciones de células. En algunos casos, a medida que las células pasan a través del chip DLD, se pueden introducir reactivos en una corriente para marcar los glóbulos blancos (WBC), o preparar los glóbulos blancos (WBC) para teñirlos con un marcador de la superficie o intracelular. Los Mab no unidos, otros marcadores, colorantes, reactivos de fijación/permeabilización y otros contaminantes no deseados de los glóbulos blancos (WBC) marcados pueden eliminarse bañando suavemente las células en tampón durante el paso a través del chip DLD sin necesidad de una centrifugación, pipeteo y resuspensión, potencialmente dañinas para los glóbulos blancos (WBC).

Los enfoques descritos en el presente documento pueden proporcionar beneficios significativos para los laboratorios clínicos y de investigación: los flujos de trabajo automatizados pueden proporcionar un procesamiento suave y uniforme de las células, un tiempo de respuesta rápido y muestras de glóbulos blancos (WBC) enriquecidas que tienen una alta viabilidad, pureza y viabilidad. Esto puede llevar a resultados de alta calidad aguas abajo y ganancias de coste/eficiencia para los laboratorios.

Los métodos, sistemas y dispositivos descritos en el presente documento pueden centrarse específicamente en la preparación de glóbulos blancos (WBC) para citometría de flujo. Esta tecnología también puede tener una amplia aplicabilidad para técnicas analíticas aguas abajo más allá de la citometría de flujo, tales como pruebas basadas en ADN y ARN para el cáncer y otras enfermedades (por ejemplo, perfilado de expresión génica de células de leucemia utilizando micromatrices y secuenciación de ADN de última generación) y detección de células raras (por ejemplo, células madre, células tumorales circulantes o enfermedad mínima residual) donde puede mejorar de manera similar la recuperación celular, simplificar el procesamiento y mejorar la calidad y la eficiencia de las pruebas.

Los sistemas de procesamiento basados en chips microfluídicos descritos en el presente documento también se pueden adaptar para procesar células distintas de los glóbulos blancos (WBC) de sangre humana (por ejemplo, células eritroides, plaquetas y otras células de la médula ósea, otros fluidos corporales y tumores sólidos) abriendo nuevos campos de posibilidades para la comercialización de esta tecnología en la investigación y el diagnóstico clínico.

Las muestras de partida más grandes pueden ser problemáticas para pacientes pediátricos y anémicos, pacientes que requieran múltiples análisis de sangre o estén en tratamiento, así como en estudios con animales pequeños (por ejemplo, se pueden usar < 10 ul de muestras de ratones, sin que se muera el animal, que permiten estudios longitudinales de, por ejemplo, farmacocinética, mutaciones cancerosas). Los pacientes pediátricos con síndrome mielodisplásico (MDS) u otros que presentan neoplasias hematológicas o que están sometidos a terapia a menudo pueden presentar recuentos muy bajos de glóbulos blancos (WBC). Los chips descritos en el presente documento pueden mitigar este problema de muestreo clínico.

La detección precisa, sensible y multiplexada de proteínas bioseñalizadoras, ADN o ARN, se puede utilizar para el diagnóstico personalizado de cánceres. Los ensayos basados en perlas (BBA) pueden medir una diversidad de proteínas solubles e intracelulares, entre las que se incluyen citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y proteínas de señalización celular fosforiladas mediante citometría de flujo. El ensayo ELISA o la transferencia de Western pueden ofrecer una reacción por muestra, donde el valor en BBA puede estar en la capacidad de multiplexar varias reacciones en cada perla. También se han usado perlas magnéticas con frecuencia en inmunoensayos. El chip descrito en el presente documento se puede configurar para preparar muestras para todos estos tipos de BBA.

El diagnóstico y la estadificación de leucemia/linfoma, o la evaluación de la enfermedad residual mínima (ERM) pueden requerir capacidades y habilidades de alto nivel. Las tecnologías que pueden estandarizar y simplificar manipulaciones de muestras de alta complejidad pueden aumentar la utilización e impulsar la disponibilidad de estas pruebas más allá de los laboratorios de referencia o grandes centros médicos hacia lugares más pequeños, más distribuidos, más cercanos al paciente. Asimismo, la tecnología descrita en el presente documento puede tener el potencial de acelerar la adopción de pruebas de citometría de flujo en países en desarrollo y con escasos recursos.

Los enfoques de preparación de muestras descritos en el presente documento pueden mejorar las entradas para la citometría de flujo al proporcionar muestras estandarizadas con procesamiento suave y uniforme, sin pérdida selectiva de células y acomodación de tamaños de muestra pequeños, medianos y grandes. Los enfoques de preparación de muestras descritos en el presente documento pueden proporcionar una mejor economía de laboratorio, por ejemplo, el menor tiempo para obtener resultados, y la necesidad de menos habilidades técnicas puede dar como resultado un menor coste medio, la automatización puede significar menos tiempo de trabajo y más productividad, y menos reactivos puede significar un menor coste. Los enfoques de preparación de muestras pueden ser de amplia aplicación, por ejemplo, para el enriquecimiento celular para una miríada de aplicaciones posteriores (por ejemplo, citometría de flujo, citometría de masas, ensayos de ADN/ARN, ensayos de células raras, ensayos funcionales, pueden procesar muchos tipos de células diferentes (por ejemplo, sangre, médula ósea (BM), fluidos corporales) y pueden admitir otras plataformas tecnológicas (por ejemplo, ensayos magnéticos y basados en perlas). Los enfoques de preparación de muestras pueden ofrecer un acceso más amplio al mercado (por ejemplo, técnicas más sencillas pueden acercar las pruebas al paciente, técnicas más sencillas y de menor coste pueden favorecer la difusión de la tecnología en los países en desarrollo, técnicas más sencillas y de menor coste pueden impulsar el desarrollo de nuevas aplicaciones, y la estandarización puede impulsar el desarrollo de nuevas aplicaciones clínicas.

Los agentes antineoplásicos dirigidos más nuevos pueden requerir un seguimiento diagnóstico adjunto de pacientes individuales para elegir con precisión los mejores fármacos y para determinar y ajustar la dosis y el calendario de los fármacos administrados en función de la respuesta temprana. Están surgiendo inmunoterapias antineoplásicas que se centran en las vulnerabilidades específicas de mutaciones de cáncer de las células cancerosas involucradas en la capacidad de respuesta del sistema inmunológico contra el cáncer. Los pacientes en estudios clínicos o que se someten a estos tipos de tratamientos pueden requerir pruebas de citometría de flujo extensas para evaluar su estado con el fin de calificarlos para el tratamiento y evaluar/supervisar la eficacia del tratamiento. La estandarización de las entradas de muestra para estas emocionantes modalidades terapéuticas emergentes puede ser imperativa.

F. Dispositivo de "lavado de coches" con paredes separadoras

Un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, "lavado de coches") tal como se proporciona en el presente documento puede comprender además un mecanismo para reducir la mezcla entre corrientes de flujo o fluidos que fluyen en paralelo laminares. Con el tiempo se puede producir la mezcla entre corrientes de flujo paralelas, lo cual puede contaminar la salida de un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento. Por tanto, puede existir una compensación entre los tiempos de procesamiento prolongados que pueden ser necesarios para algunas corrientes químicas o enzimáticas y tener una baja contaminación en una salida final de un dispositivo de lavado de coches tal como se proporciona en el presente documento. Por ejemplo, los tiempos de incubación para la fijación y/o permeabilización pueden ser de ~ 10 min, mientras que el marcaje con un agente de marcaje (por ejemplo, anticuerpos, sondas) puede ser de ~ 5 min. En comparación, la Tabla 1 muestra coeficientes de difusión de algunos reactivos.

Tabla 1: Coeficientes de difusión de reactivos comunes

continuación

Los reactivos con coeficientes de difusión relativamente pequeños (por ejemplo, metanol), pueden difundirse a corrientes adyacentes incluso con tiempos de incubación cortos, lo que puede llevar a que un porcentaje significativo del o de los reactivos entre en una corriente de producto, como puede predecirse mediante un modelo de difusión de fuente limitada (FIG. 22). En algunos casos, el ángulo de flujo de partículas se puede ajustar con respecto a las corrientes de flujo horizontal. En algunos casos, se usa una pared separadora para separar corrientes de flujo adyacentes en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento. En algunos casos, un dispositivo de múltiples corrientes tal como se proporciona en el presente documento comprende una o más paredes separadoras. En algunos casos, un dispositivo de múltiples corrientes tal como se proporciona en el presente documento comprende una pluralidad de paredes separadoras. Las paredes separadoras pueden estar en pares. En algunos casos, una del par de paredes separadoras se extiende desde una porción de entrada de un canal que comprende el par de paredes separadoras, mientras que la otra del par se extiende desde una porción de salida del canal. En algunos casos, una pared separadora o un par de paredes separadoras son paralelas al flujo de corriente y no interfieren con los patrones de flujo de corriente. El par de paredes separadoras pueden ser opuestas. Como se muestra en la FIG. 24A y B, el par de paredes separadoras pueden estar escalonadas entre sí, con lo que una del par está más cerca de una primera pared que delimita el canal, mientras que la otra del par está más cerca de una segunda pared que delimita el canal. En algunos casos, un par de paredes separadoras comprende un espacio entre las paredes separadoras en el par de paredes separadoras (por ejemplo, FIG. 24A y B). El espacio puede comprender una anchura tal que las partículas puedan pasar a través del espacio. En algunos casos, un dispositivo de múltiples corrientes tal como se proporciona en el presente documento comprende una pluralidad de pares de paredes separadoras (por ejemplo, FIG. 32). Como se representa en la FIG. 32, cada una del par de paredes separadoras puede estar escalonada y puede comprender un espacio entre el par que está configurado para permitir que las partículas que se desvían a través de una matriz de obstáculos (por ejemplo, matriz DLD) pasen entre el par de paredes separadoras. En algunos casos, se pone una pared separadora o un par de paredes separadoras entre una corriente de reactivo (por ejemplo, químico o enzima) y una corriente de tampón adyacente (por ejemplo, tampón de lavado).

Una pared separadora o un par de paredes separadoras en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento puede servir para aumentar sustancialmente la cantidad de tiempo que una partícula permanece en una corriente de flujo (por ejemplo, reactivo). El aumento en el tiempo que una partícula permanece en una corriente de flujo se puede aumentar en al menos, como máximo, menos de, más de, o aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % del tiempo que una partícula pasaría en una corriente de flujo (por ejemplo, corriente de flujo de reactivo) en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento que no comprende una pared separadora o un par de paredes separadoras.

Una pared separadora o un par de paredes separadoras pueden servir para limitar o bloquear sustancialmente la difusión de un reactivo (por ejemplo, químico y/o enzimático) a una corriente de flujo adyacente en un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, lavado de coches) tal como se proporciona en el presente documento. La difusión puede limitarse en al menos, como máximo, menos de, más de, o aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %.

En algunos casos, una corriente de flujo en un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, lavado de coches) tal como se proporciona en el presente documento comprende un reactivo de lisis. En algunos casos, el reactivo de lisis comprende un detergente. En algunos casos, el detergente comprende Triton X-100, SDS, CHAPS o Tween-20.

En algunos casos, una corriente de flujo en un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, lavado de coches) tal como se proporciona en el presente documento comprende un tampón. El tampón puede ser un tampón de lavado. El tampón puede ser F108. Ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES); Ácido N-(2-acetamido)iminodiacético (ADA); Acetato de magnesio; Acetato sódico; base Trizma®; 2-Amino-2-metil-1-propanol (AMP); Ácido aminoacético; Ácido aminoetanoico; 2-Amino-2-metil-1,3-propanodiol (AMPD); Fosfato monobásico de amonio; Fosfato dibásico de sodio y amonio tetrahidratado; Fosfato dibásico de sodio y amonio tetrahidratado; Bicarbonato de amonio; Fosfato monobásico de amonio; 5,5-Dietilbarbiturato de sodio; Ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES); Bis-(2-hidroxietil)amina, 2,2'-Iminodietanol (Dietanolamina); 2-Bis(2-hidroxietil)amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol; Bis(2-hidroxietil)amino-tris(hidroximetil)metano; N,N-Bis(2-hidroxietil)glicina; N,N-Bis(2-hidroxietil)taurina; 2,2-Bis(hidroximetil)-2,2',2"-nitrilotrietanol; BIS-TRIS; Acetato de calcio hidratado; Carbonato de calcio; Citrato de calcio tribásico tetrahidratado; Formiato de calcio; CAPS; Ácido N-(carbamoilmetil)-2-aminoetanosulfónico; Ácido (carbamoilmetilamino)etanosulfónico; Ácido N-(carbamoilmetil)iminodiacético; N-(carbamoilmetil)taurina; CHES; Ácido cítrico; Ácido 3-(cidohexilamino)-1-propanosulfónico; MOPS; HEPES; Imidazol; HEPPS; Ácido fórmico; Glicina; EPPS; Sal edetato disódico deshidratada; Acetato de magnesio; Acetato de litio; Ácido oxálico; Solución salina tamponada con fosfato; Piperazina; PIPES; Bicarbonato de potasio; Carbonato de potasio; Cloruro de potasio; Cloruro de litio; Fosfato potásico; Ácido propiónico; Acetato sódico; Bicarbonato de sodio; Carbonato de sodio; Citrato de sodio; Fosfato de sodio; Tetraborato de sodio; Solución tampón STE; Solución tampón STET; Solución salina tamponada con TRIS; Solución tampón TRIS-EDTA; Pirofosfato de sodio tetrabásico; Carbonato de Trizma®; Clorhidrato de Trizma®; Maleato de Trizma®; TRIS NaCl Tween 20; Trietanolamina; Acetato de Trizma®; y/o TAPS.

En algunos casos, una corriente de flujo en un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, lavado de coches) tal como se proporciona en el presente documento comprende un reactivo. El reactivo puede ser un reactivo químico o enzimático. El reactivo puede ser un fijador, agente de permeabilización, enzima, agente de escisión, agente citotóxico, molécula pequeña, resto de fármaco, agente quimioterapéutico o una combinación o mezcla de los mismos.

En algunos casos, el reactivo es un fijador. El fijador puede ser formaldehído, glutaraldehído, alcohol metílico y/o alcohol etílico. El fijador puede ser formalina tamponada con fosfato; formal calcio; formal solución salina; formalina de zinc (sin tampón); Fijador de Zenker; Fijador de Helly; Fijador B-5; Solución de Bouin; Fijador de Hollande; Solución de Gendre; Solución de Clarke; Solución de Carnoy; Methacarn; Formalina alcohólica; y/o alcohol acético de formol.

En algunos casos, el reactivo es un agente de permeabilización. El agente de permeabilización puede ser detergentes, alcoholes (alcohol metílico), tóxicos que rompen la membrana como la digitonina, melitina y/o saponina. Los detergentes pueden ser hidrobromuro de 2-aminoetilmetantiosulfonato, CHAPS, CHAPSO, digitonina, dodecil sulfato de litio, n-dodecil-beta-D-maltopiranósido, n-octil-beta-d-glucopiranósido, NDSB-195, NDSB-201, NDSB-211, NDSB-221, NDSB-256, NONIDET-P40, Pluronic F68, Pluronic F-127, MTSES, Tween-20, Tween-80, Tween-40, dodecil sulfato de sodio (SDS), Triton X-100, Triton X-114, MTSET, sulfobetaína-10, sulfobetaína-12 o sulfobetaína-14, Igepal® CA-630 o n-dodecil-p-D-maltósido (DDM).

En algunos casos, el reactivo comprende un agente de unión. Un reactivo que comprende un agente de unión también se puede denominar agente de marcaje. El agente de marcaje puede ser cualquier agente de marcaje conocido en la técnica. El agente de marcaje puede ser un agente de marcaje de la superficie celular. El agente de marcaje puede ser un agente de marcaje intracelular. El agente de marcaje puede ser anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, sondas de ácido nucleico, aptámeros, balizas moleculares y/o sustratos enzimáticos. el agente de unión puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, un ácido nucleico (por ejemplo, sonda), aptámero, molécula pequeña o baliza molecular. El anticuerpo puede ser un anticuerpo primario o secundario. El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos y fragmentos de anticuerpo, siempre que muestren la actividad biológica deseada. La expresión "anticuerpo multiespecífico" puede usarse en el sentido más amplio y abarca específicamente un anticuerpo que comprende un dominio de unión a antígeno que tiene especificidad poliepitópica (es decir, es capaz de unirse específicamente a dos, o más, epítopos diferentes en una molécula biológica o es capaz de unirse específicamente a epítopos en dos, o más, moléculas biológicas diferentes). Un ejemplo específico de un dominio de unión a antígeno es una unidad V^hV^lcompuesta por un dominio variable de cadena pesada (V^h) y un dominio variable de cadena ligera (V^l). Dichos anticuerpos multiespecíficos pueden incluir, pero sin limitación, anticuerpos de longitud completa, anticuerpos que tienen dos o más dominios V^ly V^h, fragmentos de anticuerpo (tales como Fab, Fv, dsFv, scFV, diacuerpos, diacuerpos biespecíficos y triacuerpos, fragmentos de anticuerpos que se han unido de forma covalente o no covalente. Un "anticuerpo biespecífico" puede ser un anticuerpo multiespecífico que comprende un dominio de unión a antígeno que puede ser capaz de unirse específicamente a dos epítopos diferentes en una molécula biológica o puede ser capaz de unirse específicamente a epítopos en dos moléculas biológicas diferentes. También se puede hacer referencia al anticuerpo biespecífico por tener "especificidad dual" o como "específico dual". En algunos casos, el reactivo de unión es una sonda de ácido nucleico, en donde la sonda de ácido nucleico comprende uno o nucleótidos que comprenden un marcador incorporado en la sonda de ácido nucleico. La sonda de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN o una combinación de los mismos. Los nucleótidos marcados se pueden marcar con colorantes Alexa Fluor®. Otros marcadores fluorescentes en nucleótidos para usar en sondas de ácido nucleico pueden ser, pero sin limitación, Dietilaminocumarina (DEAC), Cianina 3 (Cy3), Cianina 5 (Cy5), Fluoresceína (FITC), Lisamina, R110, R6G, Tetrametilrodamina (TAMRA) y Rojo Texas. Los nucleótidos marcados se pueden marcar con un hapteno. El marcador hapteno puede ser, pero sin limitación, Amino-digoxigenina (DIG), Biotina, Dinitrofenilo (DNP) y Fluoresceína (FITC). Los nucleótidos marcados pueden comprender un marcador radiactivo. Por ejemplo, los nucleótidos marcados radiactivos pueden incluir, pero sin limitación, 33P, 32P, 35S, 3H y 14C nucleótidos. En algunos casos, el agente de unión se une o se dirige hacia o contra un señalizador de la superficie celular. El señalizador de la superficie celular puede ser cualquier señalizador de superficie celular como se proporciona aquí. En algunos casos, el agente de unión se une o se dirige a o contra un señalizador intracelular. El señalizador intracelular puede ser cualquier señalizador intracelular tal como se proporciona en el presente documento. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para hacer fluir una corriente de flujo de reactivo que comprende un agente de unión, en donde el agente de unión se une a un señalizador de la superficie celular. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para hacer fluir una corriente de flujo de reactivo que comprende un agente de unión, en donde el agente de unión se une a un señalizador intracelular. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para hacer fluir una pluralidad de corrientes de flujo, en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un agente de unión que se une a un señalizador de la superficie celular, y al menos una de las corrientes de flujo comprende un agente de unión que se une a un señalizador intracelular. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento comprende una pluralidad de corrientes de flujo, en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un reactivo, en donde el reactivo es un agente de unión, y en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un reactivo que no es un agente de unión. El reactivo que no es agente de unión puede ser una enzima, un fijador, un agente de permeabilización o una combinación o mezcla de los mismos.

En algunos casos, el reactivo comprende una enzima. En algunos casos, el reactivo comprende una pluralidad de enzimas. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento comprende una pluralidad de corrientes de flujo, en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un reactivo, en donde el reactivo es una enzima. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento comprende una pluralidad de corrientes de flujo, en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un reactivo, en donde el reactivo es una enzima, y en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un reactivo que no es una enzima. El reactivo que no es una enzima puede ser un agente de unión, un fijador, un agente de permeabilización o una combinación o mezcla de los mismos. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento comprende una pluralidad de corrientes de flujo, en donde más de una de las corrientes de flujo comprende un reactivo, en donde el reactivo en cada una de las más de una corriente de flujo es una enzima, en donde la enzima en cada una de las más de una corrientes de flujo comprende la misma enzima o una enzima diferente. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para hacer fluir una pluralidad de corrientes de flujo, en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un agente de unión que se une a un señalizador de la superficie celular, al menos una de las corrientes de flujo comprende un agente de unión que se une a un señalizador intracelular, y al menos una de las corrientes de flujo comprende una enzima. La enzima puede ser una enzima de restricción, proteasa, polimerasa, ligasa, nucleasa, endonucleasa, exonucleasa, fosfatasa, metilasa, topoisomerasa o una combinación o mezcla de las mismas. La polimerasa puede ser cualquier polimerasa conocida en la técnica. La polimerasa puede ser una ADN polimerasa dependiente de ADN. Los ejemplos de ADN polimerasa dependiente de ADN incluyen, pero sin limitación, polimerasa de Klenow, con o sin 3'-exonucleasa, ADN polimerasa de Bst, polimerasa de Bca, ADN polimerasa de phi.29, polimerasa Vent, polimerasa Deep Vent, polimerasa de Taq, polimerasa de T4 y ADN polimerasa 1 de E. coli, derivados de las mismas, o una mezcla de polimerasas. En algunos casos, la polimerasa no comprende una actividad 5'-exonucleasa. En otros casos, la polimerasa comprende actividad 5'-exonucleasa. La polimerasa puede ser una ADN polimerasa dependiente de ARN o transcriptasa inversa (RT). Los ejemplos de RT incluyen, pero sin limitación, transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLv ), transcriptasa inversa del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), transcriptasa inversa del virus del sarcoma de rous (RSV), transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV), transcriptasa inversa del virus asociado a rous (RAV) y transcriptasa inversa del virus asociado a la mieloblastosis (MAV) u otras transcriptasas inversas de virus del sarcoma-leucosis aviar (ASLV), y RT modificadas derivadas de las mismas. La exonucleasa puede ser, pero sin limitación, exonucleasa 1, exonucleasa 7 o una combinación o mezcla de las mismas. Las endonucleasas pueden ser, por ejemplo, pero sin limitación, a endonucleasa de frijol mungo o endonucleasa S1 o una combinación o mezcla de las mismas.

En algunos casos, el reactivo comprende un marcador. En algunos casos, el reactivo comprende un agente de unión, en donde el agente de unión comprende un marcador. En algunos casos, el reactivo comprende una enzima, en donde la enzima comprende un marcador. El marcador se puede conjugar, unir o ligar a un reactivo tal como se proporciona en el presente documento. El marcador puede referirse a cualquier átomo o molécula conocida en la técnica que pueda usarse para proporcionar un efecto detectable y/o cuantificable. El marcador se puede unir a un ácido nucleico o proteína (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo y/o enzima). En algunos casos, el marcador proporciona un efecto cuantificable. En algunos casos, el marcador proporciona un efecto detectable y cuantificable, Los marcadores pueden incluir, pero sin limitación, colorantes; radiomarcadores tales como 32P; restos de unión tales como biotina; haptenos tales como digoxigenina; restos luminogénicos, fosforescentes o fluorogénicos; etiquetas de masa; y colorantes fluorescentes solos o en combinación con restos que pueden suprimir o cambiar los espectros de emisión mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), Los marcadores pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radiactividad, colorimetría, gravimetría, difracción o absorción de rayos X, magnetismo, actividad enzimática, características de masa o comportamiento afectados por la masa (por ejemplo, espectrometría de masas de tiempo de vuelo MALDI) y similares. Un marcador puede ser un resto cargado (carga positiva o negativa) o, como alternativa, puede ser de carga neutra. En algunos casos, el marcador es un colorante fluorescente. El colorante fluorescente puede ser un tinte basado en ácido escuárico. Los colorantes basados en ácido escuárico se pueden seleccionar entre derivados de ciclobutenodiona, escuaraínas simétricas y asimétricas, compuestos de cefalosporina sustituidos, composiciones de escuaraína fluorada, alquilalcoxi escuaraínas o compuestos de escuarilio. Los colorantes basados en ácido escuárico se pueden seleccionar entre un colorante fluorescente rojo y un colorante fluorescente naranja, tal como el colorante fluorescente rojo que comprende 1,3-bis(1,3-dihidro-1,3,3-trimetil-2H-indol-2-iliden)metil]-2,4-dihidroxiciclobutenodiilio, bis(sal interna) y el colorante fluorescente naranja que comprende 2-(3,5-dimetilpirrol-2-il)-4-(3,5-dimetil-2H-pirrol-2-iliden)-3-hidroxi-2-ciclobuten-1-ona. Los marcadores pueden incluir o consistir en una secuencia de ácido nucleico o proteína, siempre que la secuencia que comprende el marcador sea detectable y/o cuantificable.

En algunos casos, el reactivo comprende un agente citotóxico, toxina o agente quimioterapéutico. Por ejemplo, el agente citotóxico o la toxina puede ser, pero sin limitación, toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas, incluida la cadena A de difteria, fragmentos activos no de unión de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, o los tricotecenos, o combinaciones o mezclas de los mismos. Los ejemplos de toxinas de molécula pequeña pueden incluir, pero sin limitación, una caliqueamicina, maitansinoides, dolastatinas, aurostatinas, un tricoteceno, o CC1065, o los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina. Los ejemplos de agentes quimioterepéuticos incluyen, pero no se limitan a agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®); alquilsulfonatos, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético de topotecán (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos, adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno, tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma 1I y caliqueamicina omega ll (véase, por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor oral de alfa-4 integrina; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarcinostatina y cromóforos de antibióticos de enediina relacionados con cromoproteína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-1,norleucina, doxorrubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, inyección liposómica de doxorrubicina HCl (DOXIL®), doxorrubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®), doxorrubicina liposomal pegilada (CAELYX®) y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epiliostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor del ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complejo polisacarídico PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2'-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartículas obtenidas por ingeniería de albúminas de paclitaxel (ABRAXANE™) y docetaxel (TAXOTERE®); clorambucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino, tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATTN®) y carboplatino; vincas, que evitan que la polimerización de tubulina forme microtúbulos, incluyendo vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) y vinorelbina (NAVELBINE®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos, tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROc Al®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo nucleosídico de 1,3-dioxolano citosina; oligonucleótidos antisentido, particularmente, los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas, tales como la vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib), inhibidor del proteasoma (por ejemplo, PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2, tal como oblimersen sódico (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de EGFR (véase definición posterior); inhibidores de tirosina quinasa (véase definición a continuación); inhibidores de serina-treonina quinasa, tales como rapamicina (sirolimus, RAPa Mu NE®); inhibidores de farnesil transferasa, tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxiplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina. . Los agentes quimioterapéuticos adicionales pueden incluir "agentes anti hormonales" o "agentes terapéuticos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer. Pueden ser hormonas en si mismos, entre las que se incluyen, pero sin limitación: anti-estrógenos con perfil mixto agonista/antagonista, entre los que se incluyen, tamoxifeno (NOLVADEX®), 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTON®), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®), trioxifeno, keoxifeno, y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM) tales como SERM3; anti-estrógenos puros sin propiedades agonistas, tales como fulvestrant (FASLODEX®) y EM800 (dichos agentes pueden bloquear la dimerización del receptor de estrógenos (ER), inhibir la unión de ADN, aumentar la renovación de ER y/o suprimir los niveles de ER); inhibidores de la aromatasa, incluyendo inhibidores de aromatasa esteroideos tales como formestano y exemestano (AROMASIN®), e inhibidores de aromatasa no esteroideos tales como anastrazol (ARIMIDEX®), letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida, y otros inhibidores de aromatasa incluyendo vorozol (RIVISOR®), acetato de megestrol (MEGASE®), fadrozol y 4(5)-imidazoles; agonistas de la hormona liberadora de hormona lutenizante, incluyendo leuprolide (LUPRON® y e LiGARD®), goserelina, goserelina, buserelina y tripterelina; esteroides sexuales, incluyendo progestinas tales como acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, estrógenos tales como dietilestilbestrol y premarina, y andrógenos/retinoides tales fluoximesterona, ácido todo transretinóico y fenretinida; onapristona; anti-progesteronas; reguladores negativos del receptor de estrógenos (ERD); antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.

En algunos casos, las partículas procesadas usando un dispositivo de múltiples corrientes tal como se proporciona en el presente documento pueden procesarse mediante reacciones químicas y/o enzimáticas dentro de la matriz de impacto para impartir propiedades fluorescentes, magnéticas o radiactivas a esas moléculas.

G. Incubadora de flujo continuo

En algunos casos, el tiempo de contacto de las partículas en una corriente de flujo se puede prolongar haciéndolas pasar a través de una incubadora de flujo continuo proporcionada en el presente documento. En algunos casos, cuando las partículas fluyen desde una primera matriz DLD a una segunda matriz DLD en una corriente de flujo, la incubadora de flujo continuo se puede conectar fluídicamente con las dos matrices DLD, extendiendo así la distancia de desplazamiento de las partículas en la corriente de flujo. En algunos casos, la corriente de flujo puede comprender una solución de reacción (por ejemplo, con un reactivo, por ejemplo, un anticuerpo). Por lo tanto, la incubadora de flujo continuo puede prolongar el tiempo de incubación de las partículas en la solución de reacción. En algunos casos, el tiempo de incubación puede prolongarse mediante la incubadora de flujo continuo sin aumentar el caudal de las partículas. El caudal en la incubadora de flujo continuo puede ser menor que, igual o mayor que el caudal en la matriz DLD aguas arriba o aguas abajo de la incubadora de flujo continuo. En algunos casos, las partículas de al menos un tamaño predeterminado se dirigen a una incubadora de flujo continuo. En algunos casos, las partículas de menos de un tamaño predeterminado se dirigen a una incubadora de flujo continuo.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede conectarse con uno o más chips microfluídicos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, la incubadora de flujo continuo se puede conectar con un componente de un chip microfluídico para procesar partículas proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, la incubadora de flujo continuo puede ser un canal en el chip. El canal se puede conectar fluídicamente con dos matrices DLD (por ejemplo, dos matrices de obstáculos) en el chip. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede comprender un canal lineal. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede comprender un canal con una región curva. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede comprender un canal serpenteante. La incubadora de flujo continuo puede comprender una o más matrices DLD desveladas en el presente documento. La FIG. 54A muestra una incubadora de flujo continuo serpenteante ilustrativa que conecta dos canales microfluídicos, cada uno de los cuales comprende 3 matrices DLD. Las partículas de entrada se pueden desviar a una corriente de flujo con anticuerpos para marcar las partículas. Las partículas desviadas a la salida 2 pueden fluir hacia la incubadora de flujo continuo, y el tiempo de incubación de las partículas con los anticuerpos se puede prolongar mediante el paso por la incubadora de flujo continuo. Las partículas marcadas pueden fluir desde la incubadora de flujo continuo hasta la entrada 3 del segundo canal microfluídico con una matriz de obstáculos para el lavado, concentración y/u otro procesamiento.

La incubadora de flujo continuo puede comprender un canal con al menos un giro. En algunos casos, el canal puede tener más de un giro. Por ejemplo, el canal puede ser un canal serpenteante. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede comprender un canal con al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 giros. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede comprender un canal con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 giros.

En algunos casos, el chip que comprende la incubadora de flujo continuo puede comprender un equilibrador para

equilibrar las resistencias fluídicas de diferentes trayectorias de flujo. El equilibrador se puede utilizar para equilibrar

la contrapresión generada por la incubadora de flujo continuo. En algunos casos, el equilibrador puede ser

sustancialmente el mismo que la incubadora de flujo continuo y puede estar conectado a otra salida en el dispositivo

microfluídico. En algunos casos, el equilibrador puede estar en una configuración diferente de la incubadora de flujo

continuo, pero puede crear la misma resistencia fluídica que la incubadora de flujo continuo. En algunos casos, el

equilibrador puede ser un control de presión fluídica. Por ejemplo, el control de presión fluídica puede generar una

presión negativa que puede equilibrar la contrapresión generada por la incubadora de flujo continuo. Por ejemplo, el

componente para equilibrar las resistencias fluídicas puede ser un canal en el chip. En un caso, el componente para

equilibrar la resistencia fluídica se puede conectar fluídicamente con la incubadora de flujo continuo. La FIG. 54B

muestra un equilibrador ilustrativo. Una incubadora de flujo continuo está conectada con la salida 2 en el canal

microfluídico que comprende una matriz (DLD 1). Un equilibrador para equilibrar la resistencia de flujo en la incubadora

de flujo continuo está conectado a la salida 1 en el canal microfluídico que comprende una matriz (DLD 1). El

equilibrador se puede configurar para que sea el mismo que la incubadora de flujo continuo y se puede conectar a la

DLD 1 de manera que refleje la incubadora de flujo continuo.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una longitud de al menos 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,

37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,

68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,

99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320,

330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 o 400 mm. Una incubadora de flujo continuo, por ejemplo, un canal serpenteante,

puede comprender uno o más segmentos conectados, en donde cada uno de estos segmentos tiene una o más de

estas longitudes.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una longitud de aproximadamente

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,

35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 6 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 9 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300,

310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 o 400 mm. En un caso, la incubadora de flujo continuo puede ser un canal

con una longitud de aproximadamente 30 mm. Una incubadora de flujo continuo puede comprender uno o más

segmentos conectados con una o más de estas longitudes.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una profundidad de al menos 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,

36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 6 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 9 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750,

800, 850, 900, 950 o 1000 pm.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una profundidad de

aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,

30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,

61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,

92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,

550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 pm. Por ejemplo, la incubadora de flujo continuo en un chip puede

ser un canal con una profundidad de aproximadamente 100 pm.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una anchura de al menos 1, 2,

99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,

123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145,

146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168,

169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191,

192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 o 200 pm.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una anchura de aproximadamente

35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,

66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,

97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120,

121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 o 200 jm . Por ejemplo, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una anchura de aproximadamente 100 |jm. La anchura y/o la profundidad de la incubadora de flujo continuo pueden variar a lo largo de la longitud de la incubadora de flujo continuo.

En algunos casos, un chip microfluídico puede comprender una o más incubadoras de flujo continuo. Las incubadoras de flujo continuo se pueden utilizar para prolongar el tiempo de contacto de las partículas en diferentes corrientes de flujo. En algunos casos, un chip microfluídico puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 incubadoras de flujo continuo. En algunos casos, un chip microfluídico puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 incubadoras de flujo continuo.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede comprender un componente que promueva que las partículas se muevan en relación con la corriente de flujo en la incubadora. El movimiento de las células en relación con la corriente de flujo puede permitir que las partículas muevan las diferentes partes de la corriente de flujo que tienen diferentes concentraciones de reactivo. En algunos casos, dichos componentes pueden incluir una matriz de obstáculos, por ejemplo, obstáculos que desvían las partículas en una dirección que no es paralela a la corriente de flujo. En algunos casos, el componente puede incluir una entrada que introduzca una segunda corriente de flujo en el canal. En algunos casos, el componente puede ser una región curvada en la incubadora de flujo continuo. El fluido en una incubadora de flujo continuo puede someterse a agitación mediante fuerza interna o externa a la incubadora de flujo continuo. Por ejemplo, se puede colocar un agitador magnético (por ejemplo, una barra de agitación) dentro de la incubadora de flujo continuo, y el chip que comprende una incubadora de flujo continuo se puede colocar en una placa de agitación magnética, y el fluido en la incubadora de flujo continuo se puede agitar con la barra de agitación. Un chip con una incubadora de flujo continuo se puede colocar en una plataforma giratoria u oscilante, o se puede someter a un vórtice, para agitar el fluido en la incubadora de flujo continuo.

El tiempo que una partícula puede pasar en una incubadora de flujo continuo puede ser de 10 segundos a aproximadamente 30 segundos, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 1 minuto, de aproximadamente 1 min a aproximadamente 5 min, de aproximadamente 5 min a aproximadamente 10 min, de aproximadamente 10 min a aproximadamente 15 min, de aproximadamente 15 min a aproximadamente 30 min, de aproximadamente 30 min a 1 h, de aproximadamente 1 h a aproximadamente 2 h, de aproximadamente 1 h a aproximadamente 12 h, de aproximadamente 12 h a 24 h, de aproximadamente 24 h a aproximadamente 48 h, o de aproximadamente 2 días a aproximadamente 7 días. El tiempo que una partícula puede pasar en una incubadora de flujo continuo puede ser de aproximadamente, o al menos 30 segundos, 1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 12 h, 24 h, 48 h o 7 días. En algunos casos, el flujo en la incubadora de flujo continuo se puede detener y la incubación puede se puede realizar en condiciones de ausencia de flujo.

La temperatura de la incubadora de flujo continuo se puede regular. La temperatura de la incubadora de flujo continuo puede regularse por separado que la temperatura de las matrices DLD conectadas de forma fluida, o la temperatura de la incubadora de flujo continuo y una o más matrices de DLD se pueden regular al mismo tiempo. La temperatura de la incubadora de flujo continuo se puede mantener constante. La temperatura de la incubadora de flujo continuo puede ser de aproximadamente, o al menos de 4 °C, 16 °C, 25 °C, 30 °C, 37 °C, 50 °C, 60 °C, 65 °C, 72 °C o 95 °C. La temperatura en la incubadora fuera del chip se puede ciclar.

El flujo en la incubadora de flujo continuo se puede invertir. Por ejemplo, se puede aplicar presión para mover un líquido hacia adelante y hacia atrás en una incubadora de flujo continuo.

En un ejemplo, una incubadora de flujo continuo con un tiempo máximo de incubación de aproximadamente 10 min comprende 20 canales paralelos de 3 cm de longitud, una anchura de 100 jm y una profundidad de 100 jm , a una velocidad de fluido de aproximadamente 1 mm/s. El área del chip puede ser de 2 canales serpenteantes x 3 cm de longitud de cada segmento x 20 segmentos x (canal de 100 jm de anchura espaciado de 100 jm entre canales) 2 DLD x 7 cm de longitud de DLD x 600 jm de anchura de DLD = 3,68 cm2.

H. Incubadora fuera del chip

En algunos casos, una incubadora proporcionada en el presente documento puede ser un componente fuera del chip conectado de forma fluida a un chip. Una incubadora fuera del chip se puede conectar a un chip que no es un chip de "lavado de coches". En algunos casos, una incubadora fuera del chip puede ser una incubadora de flujo continuo fuera del chip. En algunos casos, la incubadora fuera del chip puede ser un recipiente. La incubadora fuera del chip se puede conectar fluídicamente con un primer canal microfluídico (por ejemplo, un canal que comprende una matriz DLD) y un segundo canal microfluídico (por ejemplo, un canal que comprende una matriz d Ld ), y la incubadora de fuera del chip y el primer canal microfluídico pueden comprender la misma solución. En este ejemplo, las células pueden permanecer en contacto con la solución cuando fluyen desde el primer canal microfluídico (por ejemplo, un canal que comprende una matriz DLD) al segundo canal microfluídico (por ejemplo, un canal que comprende una matriz DLD) a través de la incubadora de flujo continuo. El primer y/o el segundo canales microfluídicos pueden ser un componente en un chip microfluídico para procesar células. El recipiente se puede conectar fluídicamente con uno o más chips microfluídicos para procesar las partículas que contiene. En algunos casos, la incubadora fuera del chip se puede conectar con un primer chip microfluídico, pero no conectarse con un segundo chip microfluídico. La incubadora puede recoger las partículas procesadas del primer chip microfluídico. Las partículas recogidas se pueden introducir en un segundo chip microfluídico para su posterior procesamiento. En algunos casos, una incubadora fuera del chip puede comprender uno o más controladores de flujo. Los controladores de flujo pueden controlar el caudal de partículas que fluyen hacia el interior y/o el exterior de la incubadora de flujo continuo. En algunos casos, la incubadora fuera del chip puede ser un depósito en una placa, un tubo de ensayo, un vial, un tubo o un capilar.

En algunos casos, las partículas de al menos un tamaño predeterminado se dirigen a una incubadora fuera del chip. En algunos casos, las partículas de menos de un tamaño predeterminado se dirigen a una incubadora fuera del chip.

Una incubadora de flujo continuo fuera del chip puede comprender uno o más puertos para la conexión fluídica con otros dispositivos, por ejemplo, un chip microfluídico. Una incubadora fuera del chip puede tener aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 puertos para la conexión fluídica con uno o más dispositivos. En algunos casos, el fluido que entra en una incubadora fuera del chip desde un primer puerto de la incubadora fuera del chip también sale por el primer puerto de la incubadora fuera del chip. En algunos casos, el fluido que entra en una incubadora fuera del chip desde un primer puerto sale de un segundo puerto de la incubadora fuera del chip. En algunos casos, las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado pasan a través de un canal que comprende una matriz DLD, y las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado salen del canal que comprende la matriz DLD desde una salida y entran en la incubadora fuera del chip. Las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado se incuban en la incubadora fuera del chip durante un período de tiempo. Se puede introducir un tratamiento químico en la incubadora fuera del chip, por ejemplo, un anticuerpo.

El tiempo que una partícula puede pasar en una incubadora fuera del chip puede ser de aproximadamente 10 a 30 segundos, de 30 segundos a aproximadamente 1 min, de aproximadamente 1 min a aproximadamente 5 min, de aproximadamente 5 min a aproximadamente 10 min, de aproximadamente 10 min a aproximadamente 15 min, de aproximadamente 15 min a aproximadamente 30 min, de aproximadamente 30 min a 1 h, de aproximadamente 1 h a aproximadamente 2 h, de aproximadamente 1 h a aproximadamente 12 h, de aproximadamente 12 h a 24 h, de aproximadamente 24 h a aproximadamente 48 h, o de aproximadamente 2 días a aproximadamente 7 días. El tiempo que una partícula puede pasar en una incubadora fuera del chip puede ser de al menos 10 segundos, 30 segundos, 1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 12 h, 24 h, 48 h o 7 días. El flujo en la incubadora fuera del chip se puede detener y la incubación puede tener lugar en condiciones sin flujo. El flujo en una incubadora fuera del chip puede ser continuo.

La temperatura de la incubadora fuera del chip se puede regular. La temperatura de la incubadora fuera del chip puede regularse por separado que la temperatura de los canales con matrices DLD conectados de forma fluida, o la temperatura de la incubadora fuera del chip y uno o más canales con matrices DLD se pueden regular al mismo tiempo. La temperatura de la incubadora fuera del chip se puede mantener constante. La temperatura de la incubadora fuera del chip puede ser de aproximadamente, o al menos, 4 °C, 16 °C, 25 °C, 30 °C, 37 °C, 50 °C, 60 °C, 65 °C, 72 °C o 95 °C. La temperatura en la incubadora fuera del chip se puede ciclar.

El flujo en la incubadora fuera del chip se puede invertir. Por ejemplo, se puede aplicar presión para mover un líquido hacia adelante y hacia atrás en una incubadora fuera del chip.

El fluido en una incubadora fuera del chip puede someterse a agitación mediante fuerza interna o externa a la incubadora fuera del chip. Por ejemplo, se puede colocar un agitador magnético (por ejemplo, una barra de agitación) dentro de la incubadora fuera del chip, y la incubadora fuera del chip se puede colocar en una placa de agitación magnética, y el fluido en la incubadora fuera del chip se puede agitar con una barra de agitación. Una incubadora fuera del chip se puede colocar en una plataforma giratoria u oscilante, o se puede someter a un vórtice, para agitar el fluido en la incubadora fuera del chip.

El volumen de una incubadora fuera del chip puede ser de aproximadamente 100 pl a aproximadamente 500 pl, de aproximadamente 500 pl a aproximadamente 1 ml, de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 5 ml o de aproximadamente 5 ml a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 10 ml a 50 ml, de aproximadamente 50 ml a aproximadamente 100 ml, de aproximadamente 100 ml a aproximadamente 500 ml, de aproximadamente 500 ml a aproximadamente 1000 ml, de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5 L o de aproximadamente 5 L a aproximadamente 10 L. El volumen de una incubadora fuera del chip puede ser de aproximadamente 100 pl, 500 pl, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000 ml, 5 L o 10 L. El volumen de una incubadora fuera del chip puede ser de al menos 100 pl, 500 pl, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000 ml, 5 L o 10 L.

Un reactivo puede colocarse en una incubadora fuera del chip cuando una partícula llega a la incubadora fuera del chip. En algunos casos, una partícula entra en la incubadora fuera del chip antes de que el reactivo entre en la incubadora fuera del chip. Las reacciones pueden tener lugar en la incubadora fuera del chip, por ejemplo, unión de anticuerpo/señalizador de superficie celular, lisis celular, marcaje intracelular, fijación, permeabilización o manipulación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR). Una incubadora fuera del chip se puede supervisar para seguir una reacción, por ejemplo, mediante un equipo espectrofotométrico, equipo de formación de imágenes, etc. Una incubadora fuera del chip puede comprender una superficie compatible para la adhesión celular. En algunos casos, una incubadora fuera del chip se trata para evitar la adhesión celular. El flujo hacia o desde una incubadora fuera del chip se puede modular manualmente (por ejemplo, con una bomba de jeringa) o automáticamente.

I. Características del dispositivo

Como se describe en el presente documento, un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, "lavado de coches") tal como se proporciona en el presente documento puede comprender un canal con una pluralidad de entradas, una pluralidad de salidas y una matriz de obstáculos dispuestos entre ellas. Los dispositivos ilustrativos pueden ser los dispositivos ilustrados en las FIG. 18A-B, 19, 20A-B, 24A-B, 27A-B, y 32. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento puede comprender un canal con al menos una entrada, al menos una salida y una matriz de obstáculos dispuestos entre ellas. Los dispositivos ilustrativos pueden ser los dispositivos ilustrados en las FIG. 39 y 40. Se ilustran ejemplos de parámetros de dispositivos en la Tabla 2.

Tabla 2. Anchuras de canal

Tabla 3. T poste (|jm)

La FIG. 39 muestra un diseño de un chip A. El chip A comprende un diseño de tres zonas (secciones) con pilares y espacios progresivamente más pequeños. El tamaño del espacio y el diámetro del poste se describen en la Tabla 2. El dispositivo puede comprender una entrada, por ejemplo, para sangre, una entrada para tampón, salidas de residuos y una salida de producto. El chip A puede comprender 14 canales paralelos. El volumen total de canales (incluidas las vías de 0,5 mm) (una vía puede ser un orificio que puede conectar la parte posterior de un chip, (por ejemplo, donde puede tener lugar la conexión del colector) al lado superior del chip (es decir, donde se encuentra la matriz) puede ser de 118 jl. El rendimiento del dispositivo es de aproximadamente 4-8 ml/h. El tiempo de procesamiento para una muestra de 8 ml puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas. El chip A se puede fabricar con silicio. El chip A se puede fabricar con polipropileno, poli(metacrilato de metilo) (PMMA) o polímero de cicloolefina (COP). En algunos casos, se pueden aplicar al dispositivo entre aproximadamente 5 ml y aproximadamente 20 ml de muestra. En algunos casos, se pueden aplicar al dispositivo entre aproximadamente 1 j l y aproximadamente 5 ml de muestra.

La FIG. 40 muestra otro ejemplo de un dispositivo (A2). El chip A2 comprende un diseño de tres zonas con pilares y espacios progresivamente más pequeños. Los tamaños de los espacios y los diámetros de los postes se describen en Tabla 3. La profundidad del canal es de 60 jm . Cada chip A2 consta de 2 canales independientes. El volumen total del canal (incluida la vía de 0,5 mm) es de aproximadamente 3,85 jl. El rendimiento del dispositivo puede ser de aproximadamente 0,12 a aproximadamente 0,24 ml/h, o de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,8 ml/h. El tiempo de procesamiento para una muestra de 100 j l puede ser de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 min. El chip A2 se puede fabricar con silicio. El chip a 2 se puede fabricar con polipropileno, poli(metacrilato de metilo) (PMMA) o polímero de cicloolefina (COP). El dispositivo se puede utilizar para procesar de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 uL de muestra. El dispositivo se puede utilizar para procesar de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 ul de muestra.

i. Canales

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento comprende un canal, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared, en donde la segunda pared se opone a la primera pared, y en donde la primera y la segunda pared son paralelas entre sí. El canal puede comprender una porción o área de entrada que comprende una pluralidad de entradas y una porción o área de salida que comprende una pluralidad de salidas. Cada una de la pluralidad de entradas puede estar configurada para fluir o permitir el paso de una corriente de flujo o tubo de corriente que comprende un fluido, en donde cada una de las corrientes de flujo o tubos de corriente fluye paralelamente a la otra corriente de flujo o tubo de corriente desde la porción de entrada del dispositivo a la porción de salida del dispositivo. En algunos casos, cada una de una pluralidad de corrientes de flujo se mueve desde una entrada a una salida directamente enfrente de u opuesta a la entrada. En algunos casos, un dispositivo comprende un canal con al menos una entrada y al menos una salida. En algunos casos, un dispositivo comprende un canal con dos entradas y dos salidas. En algunos casos, un dispositivo comprende un canal con más de dos entradas y más de dos salidas. En algunos casos, una primera entrada a un canal es una entrada de muestra y una segunda entrada a un canal es una entrada de tampón. En algunos casos, una primera entrada a un canal es una entrada de muestra, una segunda entrada a un canal es una entrada de reactivo y una tercera entrada es una entrada de tampón. Una sola corriente de flujo puede originarse a partir de una sola entrada. Una sola corriente de flujo puede originarse a partir de dos o más entradas adyacentes (por ejemplo, FIG. 19). En algunos casos, una primera salida a un canal es una salida de producto y una segunda salida a un canal es una salida de residuos. En algunos casos, una primera salida de una pluralidad de salidas a un canal es una salida de producto y cada una de la pluralidad restante de salidas comprende una salida de residuos. Cada una de la pluralidad restante de salidas puede comprender una salida distinta para una corriente de flujo que se origina a partir de una entrada presente en una porción de entrada de un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento que comprende la entrada y la salida de residuos, en donde la entrada está directamente opuesta a o enfrente de la salida de residuos. En algunos casos, un canal comprende una matriz de obstáculos entre una pluralidad de entradas y una pluralidad de salidas. En algunos casos, la matriz de obstáculos comprende zonas o secciones de obstáculos, en donde cada sección comprende obstáculos de sustancialmente el mismo diámetro y tamaño y espacios entre obstáculos de sustancialmente el mismo tamaño.

(a) Anchura del canal

En algunos casos, la anchura del canal es de aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 mm.

En algunos casos, la anchura del canal es de al menos 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 mm.

En algunos casos, la anchura del canal es menor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 mm.

En algunos casos, la anchura del canal es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mm, de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 mm, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 mm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mm, de

mente 60 a aproximadamente 70 mm o de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 mm.

(b) Longitud del canal

En algunos casos, la longitud del canal es aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mm.

En algunos casos, la longitud del canal es menor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mm.

En algunos casos, la longitud del canal es de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mm.

En algunos casos, la longitud del canal es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mm, de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 mm, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 mm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 mm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 mm o de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 mm.

(c) Profundidad del canal

En algunos casos, un canal tiene una profundidad de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 |jm.

En algunos casos, un canal tiene una profundidad de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 jm .

En algunos casos, un canal tiene una profundidad menor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 jm .

En algunos casos, un canal tiene una profundidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 jm , de aproximadamente 20 jm a aproximadamente 40 jm , de aproximadamente 30 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 50 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 100 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 200 jm a aproximadamente 400 jm , de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 jm o de aproximadamente 600 a aproximadamente 1000 jm .

(d) Número de canales por dispositivo (chip)

En algunos casos, un dispositivo comprende aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 canales. En algunos casos, un dispositivo comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 canales.

En algunos casos, un dispositivo comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 canales, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 canales, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 canales, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 canales, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 canales, de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 canales, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 canales o de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 canales.

(e) Volumen del canal

En algunos casos, el volumen total de un canal es aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150 o 200 ml.

En algunos casos, el volumen total de un canal es al menos 0, 001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150 o 200 ml.

En algunos casos, el volumen total de un canal es de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,01 ml, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ml, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 ml, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 ml, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 ml, de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 ml, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 ml o de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 ml.

En algunos casos, un dispositivo comprende múltiples canales. En algunos casos, el volumen total de los canales en un dispositivo es cualquiera de los volúmenes indicados anteriormente multiplicado por el número de canales en el dispositivo.

En algunos casos, el dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para procesar tan solo ~ 10 |jl y hasta 500 jl. En algunos casos, el dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para procesar entre 500 j l y 20 o 40 ml. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para procesar entre más de 40 ml.

(f) Zonas (fases) dentro de un canal

Un dispositivo descrito en el presente documento puede tener una pluralidad de zonas (fases o secciones). Una zona puede ser un área en un dispositivo con espacios y postes (obstáculos) del mismo tamaño o de tamaños similares. En algunos casos, un canal en un dispositivo comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 zonas. En algunos casos, un canal en un dispositivo comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 zonas.

En algunos casos, una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, puede comprender partículas con una amplia gama de tamaños. Si una partícula en una muestra es más grande que un espacio, la partícula puede obstruir el canal. En algunos casos, se pueden utilizar múltiples fases de separación con diferentes tamaños de espacios y postes. En algunos casos, el diámetro del poste y el tamaño del espacio son menores en una segunda zona con respecto a una primera zona. En algunos casos, un dispositivo comprende una pluralidad de zonas, en donde cuando se aplica un fluido a una entrada del dispositivo, fluye a través de una pluralidad de zonas en un canal, por ejemplo, al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 zonas. En algunos casos, el diámetro del poste y/o los tamaños de los espacios se hacen progresivamente más pequeños a medida que un fluido fluye desde una entrada a una salida a través de las zonas de un canal. Una zona puede tener aproximadamente 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6 o 1,7 cm de longitud.

(g) Tamaño del espacio (distancia de borde a borde entre postes u obstáculos)

En algunos casos, el tamaño del espacio en una matriz de obstáculos (distancia de borde a borde entre postes u obstáculos) es de aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 jm .

En algunos casos, el tamaño del espacio en una matriz de obstáculos es de al menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5.5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 jm .

En algunos casos, el tamaño del espacio en una matriz de obstáculos es menor de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19.5, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 jm .

En algunos casos, el tamaño del espacio es de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 10 jm a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 20 jm a aproximadamente 30 jm , de aproximadamente 30 jm a aproximadamente 40 jm , de aproximadamente 40 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 50 jm a aproximadamente 60 jm , de aproximadamente 60 jm a aproximadamente 70 jm , de aproximadamente 70 jm a aproximadamente 80 jm , de aproximadamente 80 jm a aproximadamente 90 jm , de aproximadamente 90 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 100 jm a aproximadamente 110 jm , de aproximadamente 110 jm a aproximadamente 120 jm , de aproximadamente 120 jm a aproximadamente 130 jm , de aproximadamente 130 jm a aproximadamente 140 jm , de aproximadamente 140 jm a aproximadamente 150 jm , de aproximadamente 150 jm a aproximadamente 160 jm , de aproximadamente 160 jm a aproximadamente 170 jm , de aproximadamente 170 jm a aproximadamente 180 jm , de aproximadamente 180 jm a aproximadamente 190 jm , de aproximadamente 190 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 200 jm a aproximadamente 250 jm , de aproximadamente 250 jm a aproximadamente 300 jm , de aproximadamente 300 jm a aproximadamente 400 jm , de aproximadamente 400 jm a aproximadamente 500 jm , de aproximadamente 500 jm a aproximadamente 600 jm , de aproximadamente 600 jm a aproximadamente 700 jm , de aproximadamente 700 jm a aproximadamente 800 jm , de aproximadamente 800 jm a aproximadamente 900 jm , de aproximadamente 900 jm a aproximadamente 1000 jm , de aproximadamente 1000 jm a aproximadamente 1500 jm , de aproximadamente 1500 jm a aproximadamente 2000 jm , de aproximadamente 2000 jm a aproximadamente 2500 jm o de aproximadamente 2500 jm a aproximadamente 3000 |jm.

(h) Diámetro del poste (obstáculo)

En algunos casos, el diámetro del poste (obstáculo) es de aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5,

83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150,

155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950,

1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800,

2900 o 3000 jm.

En algunos casos, el diámetro del poste (obstáculo) es de al menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5,

8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21,22,

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,

54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,

85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155,

160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,

1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 jm.

En algunos casos, el diámetro del poste (obstáculo) es menor de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8,

8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22,

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 4 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,

(i) Forma de la sección transversal del obstáculo

En algunos casos, la forma de la sección transversal de un poste u obstáculo es un círculo, triángulo, cuadrado, rectángulo, pentágono, hexágono, heptágono, octágono, nonágono, decágono, endecágono, dodecágono, hexadecágono, icoságono o estrella. En algunos casos, el triángulo es un triángulo agudo, triángulo equilátero, triángulo isósceles, triángulo obtuso, triángulo racional, triángulo rectángulo (triángulo 30-60-90, triángulo rectángulo isósceles, triángulo de Kepler) o triángulo escaleno. En algunos casos, la forma de la sección transversal de un poste u obstáculo es un cuadrilátero, por ejemplo, un cuadrilátero cíclico, cuadrado, cometa, paralelogramo, rombo, oblongo, romboide, rectángulo, cuadrilátero tangencial, trapezoide, trapecio o trapezoide isósceles. En algunos casos, la forma de la sección transversal de un poste u obstáculo es una media luna, elipse, luna, óvalo, polígono de Reuleaux, triángulo de Reuleaux, lente, vesica piscis, salinon, semicírculo, tomoe, magatama, triquetra, asteroide, superelipse deltoides o hacha. En algunos casos, la forma de sección transversal con una punta tiene una punta afilada. En algunos casos, la forma de sección transversal con una punta tiene una punta redondeada. En algunos casos, la forma de sección transversal con más de una punta tiene al menos una punta redondeada y al menos una punta afilada.

En algunos casos, el poste (obstáculo) tiene forma cilíndrica.

(j) Distancia de postes (obstáculos) desde una entrada

Una primera fila de postes puede estar separada por menos de aproximadamente 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700,

650, 600, 550 o 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 10 o 5 jm de una entrada.

(k) Ángulo de inclinación

En algunos casos, una matriz de obstáculos tiene un ángulo de inclinación £ (con respecto a la dirección del flujo de fluido) de 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/10, 1/11, 1/12, 1/13, 1/14, 1/15, 1/16, 1/17, 1/18, 1/19, 1/20, 1/21, 1/22, 1/23,

1/24, 1/25, 1/26, 1/27, 1/28, 1/29, 1/30, 1/31, 1/32, 1/33, 1/34, 1/35, 1/36, 1/37, 1/38, 1/39, 1/40, 1/41, 1/42, 1/43, 1/44,

1/45, 1/46, 1/47, 1/48, 1/49, 1/50, 1/51, 1/52, 1/53, 1/54, 1/55, 1/56, 1/57, 1/58, 1/59, 1/60, 1/61, 1/62, 1/63, 1/64, 1/65,

1/66, 1/67, 1/68, 1/69, 1/70, 1/71, 1/72, 1/73, 1/74, 1/75, 1/76, 1/77, 1/78, 1/79, 1/80, 1/81, 1/82, 1/83, 1/84, 1/85, 1/86,

1/87, 1/88, 1/89, 1/90, 1/91, 1/92, 1/93, 1/94, 1/95, 1/96, 1/97, 1/98, 1/99, 1/100, 1/110, 1/120, 1/130, 1/140, 1/150, 1/160, 1/170, 1/180, 1/190, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/600, 1/700, 1/800, 1/900, 1/1000, 1/2000, 1/3000, 1/4000, 1/5000, 1/6000, 1/7000, 1/8000, 1/9000 o 1/10.000 radianes.

En algunos casos, £ es menor de 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/10, 1/11, 1/12, 1/13, 1/14, 15/1, 16/1, 17/1, 18/1,

1/19, 1/20, 1/21, 1/22, 1/23, 1/24, 1/25, 1/26, 1/27, 1/28, 1/29, 1/30, 1/31, 1/32, 1/33, 1/34, 1/35, 1/36, 1/37, 1/38, 1/39,

1/40, 1/41, 1/42, 1/43, 1/44, 1/45, 1/46, 1/47, 1/48, 1/49, 1/50, 1/51, 1/52, 1/53, 1/54, 1/55, 1/56, 1/57, 1/58, 1/59, 1/60,

1/61, 1/62, 1/63, 1/64, 1/65, 1/66, 1/67, 1/68, 1/69, 1/70, 1/71, 1/72, 1/73, 1/74, 1/75, 1/76, 1/77, 1/78, 1/79, 1/80, 1/81,

1/82, 1/83, 1/84, 1/85, 1/86, 1/87, 1/88, 1/89, 1/90, 1/91, 1/92, 1/93, 1/94, 1/95, 1/96, 1/97, 1/98, 1/99, 1/100, 1/110,

1/120, 1/130, 1/140, 1/150, 1/160, 1/170, 1/180, 1/190, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/600, 1/700, 1/800, 1/900, 1/1000,

1/2000, 1/3000, 1/4000, 1/5000, 1/6000, 1/7000, 1/8000, 1/9000 o 1/10.000 radianes.

En algunos casos, el ángulo de inclinación está comprendido entre aproximadamente 1/1000 y aproximadamente 1/3,

o es de aproximadamente 1/100 a aproximadamente 1/5, o de aproximadamente 1/1000 a aproximadamente 1/100, o

de aproximadamente 1/500 a aproximadamente 1/100, o de aproximadamente 1/50 a aproximadamente 1/3.

(l) Anchura de entrada o del canal de entrada

En algunos casos, cada una de una pluralidad de entradas en un dispositivo tal como se proporciona en el presente

documento que comprende la pluralidad de entradas tiene la misma o sustancialmente la misma anchura. En algunos

casos, cada una de una pluralidad de entradas en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento

que comprende la pluralidad de entradas tiene una anchura diferente o sustancialmente diferente. En algunos casos,

una o más de una pluralidad de entradas en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento que

comprende una pluralidad de entradas comprende una entrada de muestra, en donde la entrada de muestra tiene una

anchura diferente o sustancialmente diferente que cada una de la otra pluralidad de entradas. En algunos casos, cada

entrada de una pluralidad de entradas es un canal de entrada, en donde el canal de entrada está delimitado por dos

paredes opuestas. Cada entrada o canal de entrada puede corresponder a una corriente de flujo. En algunos casos,

la anchura del canal de entrada (por ejemplo, muestra, tampón y/o reactivo) es de aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3,

3.5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17,

17.5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44,

45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,

76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,

105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133,

134, 135, 136, 137, 138, 139,

140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156,

157, 158, 159, 160, 161, 162,

163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185,

186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200,

201, 202,

203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300,

350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 pm

En algunos casos, la anchura del canal de entrada (por ejemplo, muestra, tampón y/o reactivo) es de al menos 1, 1,5,

2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16,

16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,

42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,

73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102,

103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,

126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,

149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,

172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194,

195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217,

218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750,

800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 pm.

En algunos casos, la anchura del canal de entrada (por ejemplo, muestra, tampón y/o reactivo) es menor de 1, 1,5, 2,

75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,

105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127,

128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150,

151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173,

174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196,

197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219,

220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850,

900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 pm.

En algunos casos, la anchura del canal de entrada (por ejemplo, muestra, tampón y/o reactivo) es de aproximadamente

1 a aproximadamente 10 pm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 pm, de aproximadamente 20 a

aproximadamente 30 pm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 pm, de aproximadamente 60 a

aproximadamente 90 pm, de aproximadamente 90 a aproximadamente 120 pm, de aproximadamente 120 a

aproximadamente 180 pm, de aproximadamente 180 a aproximadamente 250 pm, de aproximadamente 250 a

aproximadamente 500 pm, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 pm, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 1500 |jm.

(m) Anchura de salida de producto o del canal de salida de producto

En algunos casos, cada una de una pluralidad de salidas en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento que comprende la pluralidad de salidas tiene la misma o sustancialmente la misma anchura. En algunos casos, cada una de una pluralidad de salidas en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento que comprende la pluralidad de salidas tiene una anchura diferente o sustancialmente diferente. En algunos casos, una o más de una pluralidad de salidas en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento que comprende una pluralidad de salidas comprende una entrada de muestra, en donde la entrada de muestra tiene una anchura diferente o sustancialmente diferente que cada una de la otra pluralidad de salidas. En algunos casos, cada salida de una pluralidad de salidas es un canal de salida, en donde el canal de salida está delimitado por dos paredes opuestas. Cada salida o canal de salida puede corresponder a una corriente de flujo. En algunos casos, la anchura del canal de salida (por ejemplo, producto, residuo (por ejemplo, tampón y/o reactivo) es de aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 jm .

En algunos casos, la anchura del canal de salida (por ejemplo, producto, residuo (por ejemplo, tampón y/o reactivo) es de al menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 jm .

En algunos casos, la anchura del canal de salida (por ejemplo, producto, residuo (por ejemplo, tampón y/o reactivo) es menor de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 jm .

En algunos casos, la anchura de un canal de salida (por ejemplo, producto, residuo (por ejemplo, reactivo y/o tampón)) es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 jm , de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 jm , de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 jm , de aproximadamente 90 a aproximadamente 120 jm , de aproximadamente 120 a aproximadamente 180 jm , de aproximadamente 180 a aproximadamente 250 jm , de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 jm , de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 jm , de aproximadamente 1000 a aproximadamente 1500 jm . En algunos casos, la relación entre la anchura de la salida de producto en la base de una matriz DLD y la anchura de una salida de residuo en la base de una matriz DLD es aproximadamente 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 o 1:10. La relación entre la anchura de la salida de producto en la base de una matriz DLD y la anchura de una salida de residuo en la base de una matriz DLD puede ser de al menos 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 o 1:10.

(n) Longitud de la pared separadora

En algunos casos, una pared separadora se extiende hacia el interior de una matriz de obstáculos en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento. La pared separadora puede extenderse en al menos, como máximo, más de, menos de o aproximadamente el 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100 % de la longitud de un canal que comprende la matriz de obstáculos y la pared separadora.

En algunos casos, la longitud de la pared separadora es aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mm.

En algunos casos, la longitud de la pared separadora es menor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mm.

En algunos casos, la pared separadora es de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mm.

En algunos casos, la pared separadora es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mm, de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 mm, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 mm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 mm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 mm o de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 mm.

(o) Anchura de la pared separadora

En algunos casos, una pared separadora en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento tiene la misma anchura a lo largo de toda la longitud de la pared separadora. La pared separadora puede estrecharse, en donde un primer extremo de la pared separadora tiene una anchura mayor que un segundo extremo de la pared separadora.

En algunos casos, la anchura de la pared separadora es de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750 o 1000 pm.

En algunos casos, la anchura de la pared separadora es de al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750 o 1000 pm.

En algunos casos, la anchura de la pared separadora es menor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750 o 1000 pm.

En algunos casos, la anchura de la pared separadora es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 pm, de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 9 pm, de aproximadamente 3 pm a aproximadamente 8 pm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 pm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 pm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 pm, de aproximadamente 40 pm a aproximadamente 60 pm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 pm, de aproximadamente 70 pm a aproximadamente 100 pm, de aproximadamente 100 a aproximadamente 250, de aproximadamente 250 a aproximadamente 500, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 pm.

En algunos casos, un tamaño predeterminado es al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3.5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17.5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 pm.

En algunos casos, un tamaño predeterminado es de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16.5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 pm.

En algunos casos, un tamaño predeterminado es menor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3,

17.5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,

76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 |jm.

(p) Anchura de espacio entre paredes separadoras

En algunos casos, existe un espacio entre paredes separadoras adyacentes en un dispositivo de múltiples corrientes

(por ejemplo, "lavado de coches") tal como se proporciona en el presente documento. El espacio se puede configurar para que las partículas (por ejemplo, células) que se desvían a través de una matriz de obstáculos en un dispositivo

tal como se proporciona en el presente documento puedan pasar entre ellos. En algunos casos, la anchura del espacio

entre paredes separadoras (por ejemplo, paredes separadoras opuestas) es de aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3,

197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 jm .

En algunos casos, la anchura del espacio entre paredes separadoras (por ejemplo, paredes separadoras opuestas) es de al menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,

36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,

67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,

98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,

122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144,

145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167,

168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190,

191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213,

214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550,

600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 jm .

En algunos casos, la anchura del espacio entre paredes separadoras (por ejemplo, paredes separadoras opuestas)

, 33, 3 , 64, 6

, 95, 9

650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 jm .

En algunos casos, la anchura del espacio entre paredes separadoras (por ejemplo, paredes separadoras opuestas) es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 jm , de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 jm , de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 jm , de aproximadamente 90 a aproximadamente 120 jm , de aproximadamente 120 a aproximadamente 180 jm , de aproximadamente 180 a aproximadamente 250 jm , de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 jm , de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 jm , de aproximadamente 1000 a aproximadamente 1500 jm .

(q) Configuraciones de canal

En algunos casos, un dispositivo puede tener una configuración de un dispositivo tal como se describe en la Patente

de Estados Unidos N.° 8021614. En algunos casos, un canal en un dispositivo comprende matrices de obstáculos de espejo, en donde una matriz de obstáculos está configurada para desviar una partícula de al menos un tamaño predeterminado a un canal de derivación central, y una segunda matriz de obstáculos adyacentes a la primera matriz

de obstáculos también dirige partículas de al menos un primer tamaño predeterminado al canal de derivación central.

En algunos casos, el canal de derivación comprende una pared que separa la primera matriz de obstáculos y la segunda matriz de obstáculos. En algunos casos, el canal de derivación no comprende una pared que separa la primera matriz de obstáculos y la segunda matriz de obstáculos. En algunos casos, un canal con una matriz de espejo comprende al menos dos entradas. En algunos casos, una salida de muestra está en comunicación fluida con el canal de derivación. En algunos casos, un canal con una matriz de espejo comprende al menos una salida de residuos. En algunos casos, un canal con una matriz de espejo comprende una pluralidad de entradas y una pluralidad de salidas con una matriz de obstáculos dispuestos entre ellas, en donde cada una de las matrices en la matriz de espejo, y en donde el canal está configurado para hacer fluir una pluralidad de fluidos desde la pluralidad de entradas a la pluralidad de salidas. Cada uno de la pluralidad de fluidos puede fluir en paralelo a los flujos de fluidos adyacentes. En algunos casos, un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, "lavado de coches") que comprende una matriz de espejo tal como se describe en el presente documento comprende además una o más paredes separadoras entre corrientes de flujo adyacentes. En algunos casos, El canal con una matriz de espejo comprende al menos una salida de residuos.

En algunos casos, un canal no comprende una matriz de espejo. En algunos casos, un canal comprende una primera matriz de obstáculos que dirigen partículas de al menos un tamaño predeterminado a un canal de derivación adyacente a una pared del canal. En algunos casos, un canal comprende una pluralidad de canales de derivación. En algunos casos, un canal comprende dos matrices de espejo de obstáculos, dos entradas y una corriente de tampón central para concentrar las partículas de cada una de las matrices de espejo de obstáculos. En algunos casos, un canal comprende una entrada. En algunos casos, un canal comprende dos entradas.

(r) Propiedades de flujo

En algunos casos, el flujo a través de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos es laminar.

Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento pueden facilitar un caudal rápido a través de un dispositivo. En algunos casos, el caudal a través de un dispositivo es de al menos 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19.5, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 ml/min.

En algunos casos, el caudal a través de un dispositivo es de aproximadamente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10.5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87. 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 ml/min.

En algunos casos, el caudal a través de un dispositivo es menor de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11.5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 ml/min.

En algunos casos, el caudal a través de un dispositivo es de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,1 ml/min, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 ml/min, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 ml/min, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 ml/min, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 ml/min, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 ml/min, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 ml/min, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 ml/min, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 ml/min, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 500 ml/min.

En algunos casos, la velocidad del fluido es de al menos 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000 mm/s.

En algunos casos, la velocidad del fluido es de aproximadamente 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000 mm/s.

En algunos casos, la velocidad del fluido es menor de 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000 mm/s.

En algunos casos, la fuerza de cizallamiento es de aproximadamente 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10.000, 25.000, 50.000, 75.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000 o 1.000.000 s-1.

En algunos casos, la fuerza de cizallamiento es menor de 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10.000, 25.000, 50.000, 75.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000 o 1.000.000 s-1.

En algunos casos, la fuerza de cizallamiento es mayor de 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10.000, 25.000, 50.000, 75.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000 o 1.000.000 s-1.

(s) Presión

En algunos casos, una muestra se hace fluir a través de un dispositivo a una presión de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 atm.

En algunos casos, una muestra se hace fluir a través de un dispositivo a una presión de al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3.3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 atm.

En algunos casos, una muestra se hace fluir a través de un dispositivo a una presión menor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3.4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 atm.

(t) Tamaño predeterminado (tamaño crítico)

En algunos casos, un dispositivo tal como se describe en el presente documento puede utilizarse para desviar partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida (por ejemplo, producto) y partículas menores de un tamaño predeterminado a una segunda salida (por ejemplo, residuo). En algunos casos, un tamaño predeterminado es de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6.5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 |jm.

En algunos casos, el tamaño predeterminado es menor que 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3.5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17.5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 jm .

En algunos casos, el tamaño predeterminado es mayor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 jm .

En algunos casos, un dispositivo comprende una matriz de obstáculos, en donde los obstáculos comprenden obstáculos con un diámetro de 18 jm , y la matriz de obstáculos comprende filas u obstáculos con un espacio de 18 jm , en donde una fila posterior tiene un desplazamiento de fila de 1/42. En algún caso, los obstáculos son semiespeculares. Semi-especular puede significar que la distribución puede reflejar la matriz a través de la línea central (es decir, el canal de recolección) y después desplazar esa matriz reflejada hacia abajo hacia la salida en un cierto número de filas. En algunos casos, el número de filas es 5. La anchura del canal de recolección puede mantenerse uniforme o sustancialmente más uniforme que si los obstáculos fueran realmente especulares. Las matrices a ambos lados del canal de recolección pueden ser idénticas, pero solamente están desplazadas entre sí en la dirección del flujo,

(u) Recubrimiento de obstáculos

En algunos casos, los obstáculos comprenden un agente de captura por afinidad, por ejemplo, un anticuerpo, otro agente de unión a proteínas, o ácido nucleico. Los obstáculos pueden comprender un agente de captura por afinidad específico para capturar partículas específicas en una muestra. La captura por afinidad se describe, por ejemplo, en la Publicación PCT N.° WO2012094642.

(v) Sistema de limpieza en el chip

En algunos casos, los dispositivos descritos en el presente documento pueden comprender un sistema integrado para la limpieza en el chip. Se ilustran ejemplos del sistema de autolimpieza en la FIG. 33A-C. En algunos casos, el sistema de limpieza en el chip comprende aberturas en las paredes de un canal de modo que el fluido pueda fluir a través de las aberturas, donde el flujo de fluido es sustancialmente perpendicular a la trayectoria de flujo habitual del canal. El sistema de limpieza se puede utilizar para retirar partículas, por ejemplo, células atrapadas en una matriz de obstáculos. En algunos casos, las aberturas están presentes en una sola pared que delimita el canal. En algunos casos, las aberturas están presentes en las dos paredes que delimitan el canal.

La FIG. 33A ilustra un dispositivo que comprende una matriz de desplazamiento lateral determinista (DLD) que también comprende un sistema de limpieza en el chip. Las entradas de muestra y tampón se ilustran a la izquierda del canal, y las salidas de producto y residuo se ilustran a la derecha. Se ilustran las paredes para la contención del fluido. El sistema de limpieza en el chip se ilustra en una configuración "abierta" con aberturas en las paredes que delimitan la matriz DLD. Se ilustra un fluido que fluye desde la parte superior del esquema hasta la parte inferior del esquema formando un ángulo recto con la dirección del flujo de partículas y tampón.

La FIG.33B ilustra un sistema de limpieza en el chip en una configuración cerrada. En esta configuración, las aberturas en las paredes que delimitan el canal están bloqueadas.

La FIG.33C ilustra un sistema de limpieza en el chip en una configuración abierta. En esta configuración, las aberturas en las paredes que delimitan el canal están desbloqueadas. En algunos casos, como se ilustra en la Fig. 33C, los extremos de entrada y salida del canal se pueden bloquear mientras las aberturas en la pared están en la posición abierta. En algunos casos, los extremos de entrada y/o salida del canal no están bloqueados cuando las aberturas en la pared están en una configuración desbloqueada.

En algunos casos, el bloqueo y desbloqueo de las aberturas en las paredes se controla de forma manual o automática. En algunos casos, El bloqueo y desbloqueo de las aberturas en las paredes se controla electrónicamente.

En algunos casos, un sistema de limpieza en el chip se activa cuando se estimula un sensor. En algunos casos, el sensor es un sensor de presión (por ejemplo, si la contrapresión en el dispositivo supera un umbral (por ejemplo, debido a una obstrucción), se puede enviar una alerta de que puede utilizarse el sistema de limpieza en el chip o de que puede activarse automáticamente el sistema de limpieza en el chip). En algún caso, el sensor es un sensor óptico, por ejemplo, un sistema óptico, por ejemplo, un microscopio. En algunos casos, el sistema óptico puede monitorear el dispositivo para detectar obstrucciones, por ejemplo, mediante la detección de partículas fluorescentes atrapadas. En algunos casos, el sensor es un espectrofotómetro que detecta la obstrucción de una trayectoria de luz a través de la parte inferior y superior del dispositivo (por ejemplo, la reducción en la transmisión de luz a través del dispositivo indica obstrucción).

Cualquier dispositivo que comprenda un canal que comprenda una matriz de obstáculos puede comprender un sistema de limpieza en el chip. El conjunto de obstáculos puede ser una matriz simétrica de obstáculos, matriz asimétrica de obstáculos, matriz especular de obstáculos, una matriz de obstáculos especulares con un canal de derivación central con o sin una pared, o una matriz semiespecular de obstáculos.

El sistema de limpieza en el chip se puede organizar en una diversidad de configuraciones. El número de aberturas en las paredes que delimitan un canal puede depender de la longitud del canal. En algunos casos, cada pared comprende una pluralidad de aberturas, por ejemplo, al menos 2, 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 500, 750, 1000, 5000 o 10.000. En algunos casos, cada pared comprende como máximo 2, 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 500, 750, 1000, 5000 o 10.000 aberturas. En algunos casos, cada una de las aberturas en una pared está en una configuración desbloqueada o bloqueada. En algunos casos, no todas las aberturas en una pared están en una configuración desbloqueada o bloqueada. En algunos casos, al menos el 2, 5, 10, 20, 50, 70, 90 o 100% de las aberturas en un lado de una pared están configuradas para tener una configuración bloqueada o desbloqueada. En algunos casos, menos del 2, 5, 10, 20, 50, 70, 90 o 100% de las aberturas en un lado de una pared están configuradas para estar en una configuración bloqueada o desbloqueada.

Cada una de las aberturas en las paredes de un canal puede tener un diámetro de al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 |jm. En algunos casos, cada una de las aberturas en una pared de canal tiene un diámetro menor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 jm . En algunos casos, cada una de las aberturas en una pared de canal tiene un diámetro de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 jm . En algunos casos, las aberturas en una pared de un canal están conectadas a trayectorias de flujo. En algunos casos, cada una de las trayectorias de flujo está bajo el control del mismo sistema de flujo de fluido. En algunos casos, cada una de las trayectorias de flujo no está bajo el control del mismo sistema de flujo de fluido.

El caudal de una solución de limpieza que utiliza el sistema de limpieza en el chip puede ser de al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 ml/min.

El caudal de una solución de limpieza que utiliza el sistema de limpieza en el chip puede ser menor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 ml/min.

El caudal de una solución de limpieza que utiliza el sistema de limpieza en el chip puede ser de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 ml/min.

El flujo a través de las aberturas en una pared de un canal puede ser alimentado por una bomba, por ejemplo, bomba de jeringa o bomba de alta presión. En algunos casos, el funcionamiento de un sistema de limpieza en el chip está automatizado. En algún caso, el funcionamiento de un sistema de limpieza en el chip se realiza a través de un dispositivo electrónico, por ejemplo, un ordenador.

Una solución de limpieza utilizada en un sistema de limpieza en el chip puede comprender uno o más agentes, por ejemplo, un detergente (por ejemplo, bromhidrato de tiosulfonato de 2-aminoetilmetano, CHAPS, CHAPSO, digitonina, dodecil sulfato de litio, n-dodecil-beta-D-maltopiranósido, n-octil-beta-d-glucopiranósido, NDSB-195, NDSB-201, NDSB-211, NDSB-221, NDSB-256, NONIDET-P40, Pluronic F68, Pluronic F-127, MTSES, Tween-20, Tween-80, Tween-40, dodecil sulfato de sodio (SDS), Triton X-100, Triton X-114, MTSET, sulfobetaína-10, sulfobetaína-12 o sulfobetaína-14), alcohol (por ejemplo, etanol, metanol), tampón (por ejemplo, Tris-HCl, Trizma, HEPES, MES, tampón fosfato, tampón potasio), enzima (DNasa, RNasa, proteasa, enzima de restricción), agente reductor (DTT, betamercaptoetanol), agente quelante (por ejemplo, EDTA (por ejemplo, 1 mM, 5 mM), EGTA (por ejemplo, 1 mM, 5 mM)), agente antibacteriano, antibiótico (por ejemplo, cloranfenicol, ampicilina, kanamicina, eritromicina, gentamicina, neomicina, nelimicina, estreptomicina, tobramicina, penicilina, bacitracina, polimixina B, ciproflaxina o tetraciclina), agente antifúngico, agente antivírico, inhibidor de proteasas, ácido (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido tartárico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido bórico, ácido metanosulfónico, ácido acético, ácido cítrico, ácido fórmico o ácido fluoroacético), base (por ejemplo, NaOH). En algunos casos, la solución de limpieza comprende de aproximadamente un 1 a aproximadamente un 20 % de etanol, o de aproximadamente un 10 a aproximadamente un 20 % de etanol, o menos de un 20 % de etanol.

Una solución de limpieza puede comprender F108, que puede ser un tensioactivo de copolímero de bloque bifuncional.

En algunos casos, se hacen fluir múltiples soluciones a través del sistema de limpieza en sucesión.

En algunos casos, se aplica una solución de limpieza a un dispositivo y se deja que permanezca en el dispositivo durante al menos 1, 5, 10, 30 o 60 minutos, o aproximadamente al menos 4, 8, 12, 16, 20 o 24 horas, o al menos 3, 5, 7, 14, 21 o 28 días. En algunos casos, se aplica una solución de limpieza a un dispositivo y se deja que permanezca en el dispositivo durante menos de aproximadamente 1, 5, 10, 30 o 60 minutos, o menos de 4, 8, 12, 16, 20 o 24 horas, o menos de 3, 5, 7, 14, 21 o 28 días.

En algunos casos, la solución de limpieza se lava con agua.

El ejemplo 8 describe el uso de un sistema de limpieza en el chip.

En algunos casos, los métodos de separación basados en el tamaño descritos en el presente documento no utilizan una centrifugación y/o sedimentación. En algunos casos, los métodos de separación basados en el tamaño descritos en el presente documento utilizan una centrifugación o sedimentación.

(w) ángulo cónico

Un obstáculo o pilar puede ser cilindrico. En algunos casos, los obstáculos en un dispositivo no son perfectamente cilindricos. Un obstáculo, o al menos el 50 % de los obstáculos en una matriz, puede tener un ángulo cónico de menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 °. Un obstáculo puede tener un ángulo cónico de 0 °. Un obstáculo, o al menos el 50 % de los obstáculos en una matriz, puede tener un ángulo cónico de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, de aproximadamente 3 a aproximadamente 4, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 °.

(x) Conjuntos de matrices

En algunos casos, un canal puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 conjuntos de matrices. En algunos casos, un canal puede comprender menos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 conjuntos de matrices. En algunos casos, un canal puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 conjuntos de matrices.

J. Materiales de construcción y química de superficie

En algunas realizaciones, un dispositivo se fabrica mediante estampado en caliente de PMMA y policarbonato. Debido a su bajo coste y compatibilidad con métodos de fabricación basados en replicación, los termoplásticos pueden representar una atractiva familia de materiales para la fabricación de plataformas lab-on-a-chip. Se dispone de una amplia gama de materiales termoplásticos adecuados para la fabricación microfluídica, que ofrecen una amplia selección de propiedades mecánicas y químicas que se pueden aprovechar y adaptar adicionalmente para aplicaciones específicas. Los métodos de estampado de alto rendimiento, tales como el procesamiento de bobina a bobina de termoplásticos, es un método atractivo para la producción industrial de chips microfluídicos. El uso de estampado en caliente de un solo chip puede ser una técnica rentable para realizar dispositivos microfluídicos de alta calidad durante la etapa de creación de prototipos. En el presente documento se describen métodos para la replicación de características a microescala en dos termoplásticos, polimetilmetacrilato (PMMA) y/o policarbonato (PC) usando estampado en caliente a partir de una plantilla de silicio fabricada mediante grabado profundo con iones reactivos. Se pueden encontrar más detalles en "Microfluidic device fabrication by thermoplastic hot-embossing" por Yang y Devoe, Methods Mol. Biol. 2013; 949: 115-23. En algunos casos, un dispositivo está hecho de polipropileno.

En algunos casos, los materiales y diseños pueden optimizarse para fabricar sistemas y dispositivos efectivos y económicos en la presente invención. En algunos casos, lo proporcionado en el presente documento también incluyen prototipos de plataforma de sistema automatizado con interfaz de operario que puede controlar el flujo de fluido a través de los chips microfluídicos. Por ejemplo, la plataforma del sistema se puede diseñar para que su funcionamiento sea fácil y rentable y para ocupar un pequeño espacio en la mesa de trabajo. En algunos casos, es de esperar que los métodos, sistemas y dispositivos proporcionados en el presente documento consigan un rendimiento superior al 90 % de glóbulos blancos (WBC) en no más de 10 minutos de tiempo de procesamiento total.

En algunos casos, el dispositivo comprende un polímero. En algunos casos, el dispositivo se fabrica mediante moldeo por inyección. En algunos casos, el dispositivo se fabrica mediante una técnica fotolitográfica. En algunos casos, el dispositivo se fabrica mediante estampado suave. En algunos casos, el estampado se produce en un chip de polímero.

En algunos casos, el dispositivo comprende plástico.

Un dispositivo puede sellarse y unirse de cualquier manera adecuada. El principal desafío puede ser unir partes microfluídicas planas entre sí de forma hermética sin afectar a la forma y el tamaño de los canales de tamaño micrométrico. Son adecuadas varias técnicas de unión, tales como el calentamiento por inducción. Los canales se pueden fabricar utilizando un equipo láser Excimer. Se pueden encontrar más detalles en "Sealing and bonding techniques for polymer-based microfluidic devices" por Abdirahman Yussuf, Igor Sbarski, Jason Hayes y Matthew Solomon.

Otras técnicas de unión incluyen la unión adhesiva, cinta sensible a la presión/laminación, unión por fusión térmica, unión con disolvente, soldadura localizada, tratamiento superficial y combinaciones de las mismas. Se pueden encontrar más detalles en "Bonding of thermoplastic polymer microfluidics" por Chia-Wen Tsao y Don L. DeVoe, Microfluid Nanofluid (2009) 6: 1-16.

En algunas realizaciones, el dispositivo se fabrica a partir de polímero y/o plástico. El polímero y/o plástico pueden ser hidrófilos y/o humectables. La Tabla 4 resume las propiedades de algunos plásticos.

Tabla 4 Resumen de las propiedades físicas de termoplásticos microfluídicos comunes

Polímero Acrónimo Tg (° Tm (° CTE (10' Absorción de Resistencia a Resistencia a Transmisividad óptica _____________________________________ C)_____ C)_____6°C-1)_____ agua (%)_________ disolventes________ ácido/base________ Visible UVa______ (Co)polímero de olefina COC/COP 70 190 60-80 0,01 Excelente Buena Excelente Excelente cíclica 155 320

Polimetacrilato de PMMA 100 250 70-150 0,3-0,6 Buena Buena Excelente Buena metilo 122 260

Policarbonato PC 145 260 60-70 0,12-0,34 Buena Buena Excelente Mala

148 270

Poliestireno PS 92 240 10-150 0,02-0,15 Mala Buena Excelente Mala

100 260

Polipropileno PP -20 160 18-185 0,10 Buena Buena Buena Regular Polietercetona PEEK 147 340 47-54 0,1-05 Excelente Buena Mala Mala

158 350

Polietilentereftalato PET 69-78 248 48-78 0,1-05 Excelente Excelente Buena Buena

260

Polietileno PE -30 120 180-230 0,01 Excelente Excelente Regular Regular

130

Poli(cloruro de PVDC 0 76 190 0,10 Buena Buena Buena Mala

vinilideno)

(continuación)

^{P lím r A r nim}T ^{° Tm ° TE 1 -}Absorción de Resistencia a Resistencia a Transmisividad

v n o

Polisulfona PSU 170- 180- 55-60 0,3-0,4 Regular Buena Regular Mala 187 190

Tm tem peratura de fusión, CTE coeficiente de expansión térmica

a La alta transm isividad UV con frecuencia requiere la selección de calidades especiales de polímero, por ejemplo, sin estabilizadores u otros aditivos

Un dispositivo se puede fabricar de cualquier manera adecuada. Algunas técnicas incluyen el moldeado de réplicas, litografía suave con PDMS, termofraguado de poliéster, estampado, moldeo por inyección, ablación láser y combinaciones de los mismos. Se pueden encontrar más detalles en "Disposable microfluidic devices: fabrication, function and application" por Gina S. Fiorini y Daniel T. Chiu, BioTechniques 38: 429-446 (Marzo de 2005). El libro "Lab on a Chip Technology" editado por Keith E. Herold y Avraham Rasooly, Caister Academic Press Norfolk UK (2009) es un recurso para métodos de fabricación y demás. Un dispositivo puede fabricarse mediante moldeo por fundición o moldeo por inyección reactiva.

Los materiales ilustrativos para fabricar los dispositivos de la invención incluyen vidrio, silicio, acero, níquel, polímeros, por ejemplo, poli(metacrilato de metilo) (PMMa ), policarbonato, poliestireno, polietileno, poliolefinas, siliconas (por ejemplo, poli(dimetilsiloxano)), polipropileno, cis-poliisopreno (caucho), poli(cloruro de vinilo) (PVC), poli(acetato de vinilo) (PVAc), policloropreno (neopreno), politetrafluoroetileno (teflón), poli(cloruro de vinilideno) (SaranA) y polímero de olefina cíclica (COP) y copolímero de olefina cíclica (COC), y combinaciones de los mismos. En la técnica se conocen otras variantes. Por ejemplo, se puede utilizar grabado profundo con iones reactivos (DRIE) para fabricar dispositivos basados en silicio con pequeños espacios, pequeños obstáculos y grandes relaciones de aspecto (relación entre la altura del obstáculo y la dimensión lateral). También se puede utilizar el termoformado (estampado, moldeo por inyección) de dispositivos de plástico. Otros métodos incluyen fotolitografía (por ejemplo, estereolitografía o fotolitografía de rayos X), moldeo, estampado, micromecanizado de silicio, grabado químico húmedo o seco, molienda, corte con diamante, Lithographie Galvanoformung and Abformung (litografía, electrodeposición y moldeo) (LIGA) y galvanoplastia. Por ejemplo, para el vidrio, pueden emplearse técnicas tradicionales de fabricación de silicio de fotolitografía seguidas de grabado en húmedo (KOH) o en seco (grabado con iones reactivos con flúor u otro gas reactivo). Se pueden adoptar técnicas tales como el micromecanizado láser para materiales plásticos con alta eficiencia de absorción de fotones. Esta técnica es adecuada para la fabricación de menor rendimiento debido a la naturaleza en serie del proceso. Para dispositivos de plástico producidos masivamente, pueden ser adecuados el moldeo por inyección de termoplásticos y el moldeo por compresión. Para fabricar los dispositivos también se puede emplear el moldeo por inyección de termoplásticos convencional utilizado para la fabricación masiva de discos compactos (que conserva la fidelidad de las características en escala submicrométrica). Por ejemplo, las características del dispositivo se reproducen en un patrón de vidrio mediante fotolitografía convencional. El patrón de vidrio está electroformado para producir un molde duro, resistente al choque térmico, térmicamente conductor y compacto. Este molde sirve como plantilla patrón para moldear por inyección o moldear por compresión las características en un dispositivo de plástico. Dependiendo del material plástico utilizado para fabricar los dispositivos y los requisitos de calidad óptica y rendimiento del producto terminado, se puede elegir moldeo por compresión o moldeo por inyección como método de fabricación. El moldeo por compresión (también denominado estampado en caliente o impresión en relieve) puede tener la ventaja de ser compatible con polímeros de alto peso molecular, que pueden ser excelentes para estructuras pequeñas y puede replicar estructuras de alta relación de aspecto, pero tiene tiempos de ciclo más largos. El moldeo por inyección puede funcionar bien para estructuras de baja relación de aspecto y puede ser adecuado para polímeros de bajo peso molecular. Se puede fabricar un dispositivo utilizando cualquiera de los materiales descritos en el presente documento. En algunos casos, la superficie del dispositivo (plástico) se trata para hacer que sea hidrófilo y/o humectable. Las superficies en los dispositivos, por ejemplo, dispositivos microfluídicos, pueden desempeñar un papel fundamental porque pueden definir propiedades tales como humectación, adsorción y repelencia de biomoléculas, reconocimiento biomolecular utilizando receptores inmovilizados en la superficie, sellado y unión de diferentes materiales. En algunos casos, Se pueden utilizar dos tipos de tratamientos para modificar las propiedades de superficie de un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo microfluídico: tratamientos químicos húmedos y tratamientos en fase gaseosa. Los tratamientos húmedos pueden ser sencillos en términos de requisitos de infraestructura; pueden ser flexibles y rápidos de desarrollar desde el punto de vista de la investigación. Sin embargo, la mejor forma de conseguir el tratamiento de superficie de un dispositivo, por ejemplo, dispositivo microfluídico, para producción, utilizando procesos en seco basados en plasma y deposición química de vapor. Estos tratamientos pueden eliminar la necesidad de etapas de aclarado y secado, tienen una alta capacidad de rendimiento y son altamente reproducibles.

En algunos casos, el tratamiento es un tratamiento químico húmedo. Entre los tratamientos químicos húmedos disponibles, La formación de monocapas autoensambladas (SAM) es uno de los tratamientos superficiales más versátiles y fáciles de usar. Se han desarrollado SAM en metales, óxidos de silicio y polímeros. Las moléculas en las SAM pueden compactarse estrechamente y pueden estar compuestas por un grupo de cabeza que puede unirse covalentemente al sustrato, una cadena alquilo y un grupo funcional terminal. El espesor de la SAM puede depender de la longitud de la cadena alquilo y la densidad de las moléculas en la superficie y suele ser de unos pocos nanómetros. Las SAM pueden ser fáciles de preparar y pueden modelarse con una resolución lateral submicrométrica.

Se pueden usar diferentes grupos terminales para definir las propiedades humectantes de la superficie, así como la afinidad o repelencia de proteínas. Para superficies de vidrio, óxidos y polímeros oxidables, el injerto de alquilsiloxanos en las superficies podría ser el método más sencillo y económico. Se puede lograr un gradiente de humectabilidad de superhidrófobo a hidrófilo superponiendo un gradiente de humectación basado en SAM en microestructuras de silicio que tienen un espaciado lateral variable.

Las SAM poliméricas pueden comprender copolímeros de bloque y pueden tener varias estructuras tridimensionales, lo que puede dar la oportunidad de variar su modo de injerto en una superficie y los tipos de funcionalidades que portan. Tales capas pueden alcanzar un espesor significativo de varios cientos de nanómetros y proteger/funcionalizar superficies de manera más fiable que las monocapas más delgadas. Por ejemplo, un cepillo de polímero de poli (oligo(etilenglicol)metacrilato) puede revestir dispositivos de vidrio, por ejemplo, chips, por ejemplo, chips microfluídicos para hacerlos hidrófilos y antiincrustantes.

Es posible recubrir superficies con polímeros para modificar sus propiedades. Por ejemplo, se puede utilizar poli(etilenglicol) para pasivar "biológicamente" un dispositivo, por ejemplo, materiales de un dispositivo microfluídico y se puede injertar en superficies de PMMA de microchips de electroforesis capilar para que sean más hidrófilas. Se puede utilizar poli(tetrafluoroetileno) para fabricar dispositivos químicamente resistentes, por ejemplo, dispositivos microfluídicos. Los materiales poliméricos empleados para fabricar dispositivos, por ejemplo, dispositivos microfluídicos, se puede modificar de muchas formas. En algunos casos, se usan grupos funcionales tales como aminas o ácidos carboxílicos que se encuentran en el polímero nativo o se añaden mediante química húmeda o tratamiento con plasma para reticular proteínas y ácidos nucleicos. Puede unirse ADN a sustratos de COC y PMMA utilizando grupos amina de superficie. Pueden utilizarse tensioactivos tales como Pluronic® para fabricar superficies hidrófilas y repelentes de proteínas mediante la adición de Pluronic® a las formulaciones de PDMS. En algunos casos, se aplica un recubrimiento de capa de PMMA por centrifugación en un dispositivo, por ejemplo, un chip microfluídico y el PMMA se "dopa" con hidroxipropilcelulosa para variar su ángulo de contacto.

Se pueden usar proteínas en superficies para cambiar la humectabilidad de la superficie, para pasivar una superficie de la unión a proteínas no específica y para la funcionalización. Las proteínas se adsorben fácilmente en sustratos hidrófobos tales como PDMS y poliestireno. Aprovechando esta propiedad, pueden recubrirse sustratos de PDMS con neutravidina para inmovilizar proteínas biotiniladas o dextrano biotinilado. Los recubrimientos de anticuerpo se pueden optimizar dependiendo de la hidrofobicidad del sustrato polimérico. Se puede utilizar albúmina de suero bovino como proteína para pasivar las superficies de la adsorción no específica y es fácil de depositar espontáneamente desde la solución a las superficies hidrófobas. En un sustrato hidrófilo, primero se puede aplicar una capa de poli(tetrafluoroetileno) hidrófobo como recubrimiento para permitir la posterior deposición de albúmina de suero bovino. La heparina, una molécula biológica ampliamente utilizada como anticoagulante, se puede depositar desde una solución en PDMS para crear canales, por ejemplo, microcanales hidrófilos al mismo tiempo que se previene la adhesión de células sanguíneas y proteínas.

En algunas realizaciones, un dispositivo se somete a un tratamiento en fase gaseosa. El procesamiento de plasma no solo puede modificar la química de una superficie polimérica, sino que también puede afectar a su rugosidad de manera significativa, exacerbando así las propiedades de humectación para hacer que las superficies sean superhidrófilas y los fluorocarbonos se pueden depositar con plasma para hacer superficies superhidrófobas. Las superficies poliméricas pueden modelarse usando luz ultravioleta para iniciar la polimerización por radicales seguida de injerto covalente de polímeros. Se puede utilizar injerto inducido por plasma para unir poli(etilenglicol) sobre superficies de poliamida y poliéster para hacerlas antiincrustantes. El dextrano puede ser un polisacárido que comprende muchas moléculas de glucosa que se pueden recubrir para crear superficies antiincrustantes hidrófilas. En algunos casos, un punto de partida para modificar polímeros es introducir grupos hidroxilo en la superficie usando un tratamiento con plasma seguido del injerto de una capa de silano y dextrano. Asimismo, el PDMS se puede oxidar superficialmente usando luz ultravioleta para injertar un hidrogel de dextrano.

La gran relación superficie/volumen de los dispositivos, por ejemplo, las estructuras microfluídicas pueden hacer que cualquier interacción potencial entre el analito de superficie y el reactivo sea un problema potencial. Por lo tanto, independientemente del método utilizado para tratar las superficies de un dispositivo microfluídico para la prueba de POC, en algunos casos, las superficies del dispositivo no pueden atraer y reducir los analitos o agentes bioquímicos necesarios para la prueba. En algunos casos, los tratamientos de superficie no interfieren con los principios de generación y adquisición de señales del dispositivo. Se pueden encontrar más detalles en "Capillary microfluidic chips for point of care testing: from research tools to decentralized medical diagnostics" una tesis de Luc Gervais, Ecole polytechnique federale de Lausanne, 23 de junio de 2011.

Para reducir la adsorción inespecífica de células o compuestos, por ejemplo, liberados por células lisadas o encontrados en muestras biológicas, en las paredes de los canales, una o más paredes de los canales pueden modificarse químicamente para ser no adherentes o repulsivas. Las paredes pueden estar recubiertas con un recubrimiento de película delgada (por ejemplo, una monocapa) de reactivos antiadherentes comerciales, tales como los que se utilizan para formar hidrogeles. Otros ejemplos de especies químicas que pueden usarse para modificar las paredes de los canales incluyen oligoetilenglicoles, polímeros fluorados, organosilanos, tioles, polietilenglicol, ácido hialurónico, albúmina de suero bovino, alcohol polivinílico, mucina, poli-HEMA, PEG metacrilado y agarosa. También se pueden emplear polímeros cargados para repeler especies con carga opuesta. El tipo de especies químicas utilizadas para la repulsión y el método de unión a las paredes de los canales pueden depender de la naturaleza de las especies que se repelen y de la naturaleza de las paredes y las especies que se adhieren. Tales técnicas de modificación de superficies son bien conocidas en la técnica. Las paredes se pueden funcionalizar antes o después de ensamblar el dispositivo. Las paredes de los canales también se pueden revestir para capturar materiales en la muestra, por ejemplo, fragmentos de membrana o proteínas.

V. Propiedades de partículas que fluyen a través de dispositivos

Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para un procesamiento de alto rendimiento (por ejemplo, tratamiento químico y/o enzimático), purificación, aislamiento y/o concentración de partículas. Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para aislar partículas con pureza, rendimiento y/o viabilidad relativamente altas si las partículas están vivas, por ejemplo, células u organismos). Se pueden aplicar una o más muestras a una o más entradas de un dispositivo. Se pueden aplicar uno o más tampones a una o más entradas en un dispositivo. Las partículas de al menos un tamaño crítico (predeterminado) pueden pasar a través de una matriz de obstáculos y desviarse hacia una salida, y las partículas menores que el tamaño crítico pueden pasar a otra salida.

Una matriz de obstáculos puede comprender cualquier forma de sección transversal, diámetro del obstáculo, tamaño de espacio, ángulo de inclinación y/o geometría del patrón de matriz descritos en el presente documento.

La temperatura del líquido que fluye, o temperatura ambiente, o temperatura de un dispositivo, puede ser de aproximadamente -20, -10, 0, 4, 10, 15, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 ° C. La temperatura de un líquido que fluye, o temperatura ambiente, o temperatura de un dispositivo, puede ser menor de -20, -10, 0, 4, 10, 15, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 ° C. La temperatura de un líquido que fluye, o temperatura ambiente, o temperatura de un dispositivo, puede ser mayor de -20, -10, 0, 4, 10, 15, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 ° C. La temperatura de un líquido que fluye, o temperatura ambiente, o temperatura de un dispositivo puede ser de aproximadamente -20 a aproximadamente -10 ° C, de aproximadamente -10 a aproximadamente 0 ° C, de aproximadamente 0 a aproximadamente 4 ° C, de aproximadamente 4 a aproximadamente 25 ° C, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 ° C, de aproximadamente 30 a aproximadamente 37 ° C, de aproximadamente 37 a aproximadamente 50 ° C, de aproximadamente 50 a aproximadamente 65 ° C, o de aproximadamente 65 a aproximadamente 100 ° C.

A. Pureza

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para aislar primeras partículas, por ejemplo, células que tienen aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %) de pureza.

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para aislar primeras partículas, por ejemplo, células que tienen al menos el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de pureza.

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para aislar primeras partículas, por ejemplo, células, que tienen de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 10 % de pureza, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 20 % de pureza, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 30 % de pureza, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 40 % de pureza, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 50 % de pureza, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 60 % de pureza, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 % de pureza, de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 80 % de pureza, de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 90 % de pureza, o de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 % de pureza.

En algunos casos, los dispositivos y métodos descritos en el presente documento se utilizan para aislar leucocitos de sangre completa. En algunos casos, los dispositivos y métodos descritos en el presente documento retiran más del 99 % de los eritrocitos, plaquetas, proteínas plasmáticas y tintes no unidos de los leucocitos. En algunos casos, los leucocitos se retiran del suero.

B. Rendimiento

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para proporcionar un rendimiento de aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de primeras partículas, por ejemplo, células de una muestra.

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para proporcionar un rendimiento de al menos el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de primeras partículas, por ejemplo, células de una muestra.

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se

de de

de

de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 % de primeras partículas, por ejemplo, células de una muestra.

En algunos casos, los dispositivos y métodos descritos en el presente documento se utilizan para aislar leucocitos de sangre completa. En algunos casos, se recupera al menos el 80 %, el 85 % o el 90 % de los leucocitos a partir de una muestra de sangre completa sin introducir sesgos entre la población de leucocitos.

C. Viabilidad

En algunos casos, las partículas de una muestra están vivas (por ejemplo, una célula u organismo). En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para aislar partículas (por ejemplo, células, organismos) que tienen una viabilidad de aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %.

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para aislar partículas (por ejemplo, células, organismos) que tienen una viabilidad de al menos el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %.

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para aislar partículas (por ejemplo, células, organismos) que tienen una viabilidad de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 %, una viabilidad de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 20 %, una viabilidad de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 30 %, una viabilidad de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 40 %, una viabilidad de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 50 %, una viabilidad de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 60 %, una viabilidad de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 %, una viabilidad de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 80 %, una viabilidad de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 90 %, o una viabilidad de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 %.

En algunos casos, una muestra comprende leucocitos y eritrocitos. En algunos casos, el método, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para procesar (por ejemplo, tratamiento químico y/o enzimático), lavar y luego aislar los leucocitos de una muestra de modo que los leucocitos tengan una pureza superior al 90% (es decir, menos del 10 % de eritrocitos), se aíslen más del 90 % de los leucocitos de la muestra (rendimiento superior al 90 %) y sean viables más del 90 % de los leucocitos de la muestra.

VI. Aplicaciones

Estos dispositivos y métodos descritos en el presente documento pueden ser un reemplazo general de la centrifugación en el procesamiento celular. Los proveedores líderes de instrumentos clínicos y de investigación pueden estar buscando alternativas a los métodos actuales de procesamiento celular (3). En algunos casos, los métodos que utilizan la tecnología de DLD microfluídicas son como se describen en la Publicación de Publicación de patente de Estados Unidos N.° US2010/0059414.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para ensayos de ácidos nucleicos e inmunológicos basados en perlas (por ejemplo, ensayos Luminex, BD CBA).

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para inmunofluorescencia de superficies celulares.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para el marcaje de la superficie celular (por ejemplo, inmunofluorescencia) combinado con el marcaje intracelular.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para el fenotipado y genotipado de leucemia, incluido el lavado de los componentes sanguíneos solubles que interfieren.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para el análisis de ácidos nucleicos in situ (por ejemplo, hibridación in situ por fluorescencia).

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para la sincronización del ciclo celular mediante la selección del tamaño de las fases del ciclo celular.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se utiliza para purificar por tamaño, marcar y concentrar células a partir de muestras pequeñas de células como el líquido cefalorraquídeo.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para la fabricación industrial de partículas funcionalizadas (por ejemplo, micropartículas marcadas con anticuerpos para bioensayos).

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se utiliza para retirar partículas grandes/células para la detección sensible de bacterias, virus o exosomas en muestras biológicas (por ejemplo, sangre).

En algunos casos, se pueden reducir hasta al menos 8 etapas de lavado/concentración por centrifugación a 3 procesos en el chip de <5-10 min cada uno para muestras de 0,1-1 ml (por ejemplo, sangre) (FIG. 16). Las aplicaciones posteriores pueden ir mucho más allá de la citometría de flujo y pueden abarcar desde investigaciones de laboratorio hasta diagnósticos clínicos nuevos y existentes.

A. Tecnología microfluídica de DLD para lavar y concentrar leucocitos de la sangre.

En la FIG. 16, se muestran procesos convencionales para el marcaje de leucocitos (izquierda) y la reducción de hasta 8 etapas de lavado/concentración por centrifugación a 3 etapas microfluídicas en el chip (parte intermedia y derecha) usando un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento. La realización que desciende verticalmente por el centro reemplaza cada etapa de lavado/concentrado por centrifugación con un proceso de lavado/concentrado en el chip. La realización que desciende verticalmente por la derecha evita por completo la lisis de eritrocitos, aislando/recogiendo/lavando/concentrando leucocitos (y células leucémicas) a partir de muestras de sangre en una sola etapa después de la etapa de marcaje de superficie.

La separación DLD puede superar a los procedimientos de centrifugación convencionales. Por ejemplo, el procesamiento (por ejemplo, lavado/concentración microfluídica en el chip) de una muestra que comprende leucocitos y reactivo de marcaje (por ejemplo, anticuerpos) en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento, puede recoger > 90 % de leucocitos con una viabilidad > 90 % mientras retira > 99 % de reactivos fluorescentes o de fijación/permeabilización no unidos sin sesgo de subpoblaciones.

La FIG. 17A muestra una matriz DLD diseñada para "impactar" con E. coli (tamaño > 1 um). La suspensión bacteriana se introduce por la izquierda y fluye de izquierda a derecha, confinada por las paredes del dispositivo microfluídico. La matriz de micropostes hace que las bacterias fluorescentes (que contienen GFP) (vistas como la banda blanca borrosa) fluyan a lo largo del eje inclinado de la matriz, de modo que se mueven hacia abajo para acumularse contra la pared inferior de la matriz, mientras que la corriente de fluido sigue hacia adelante. Las bacterias se concentran a lo largo del borde inferior del dispositivo, visto como la raya blanca gruesa creciente. Al recoger por separado esta salida concentrada de su propio canal de salida, alejado del canal de salida del fluido residual, las bacterias pueden concentrarse 50 veces durante los -100 segundos que tardaron en fluir a través del dispositivo DLD.

El dispositivo que se muestra en la FIG. 17A se puede ampliar para incluir 2 corrientes de flujo: la corriente 1 puede ser una suspensión de leucocitos después del marcaje con Mab (o tratamiento con reactivos de fijación/permeabilización); La corriente 2 puede ser fluido de tampón (como se muestra en la FIG. 17B). La matriz de impacto rediseñada puede hacer que las células grandes, tales como leucocitos (> 8 um de diámetro; y células de leucemia, ~ 8-20 um) se muevan formando un ángulo con el flujo de fluido de entrada, mientras que las moléculas disueltas o pequeñas partículas suspendidas o moléculas en solución (por ejemplo, perlas inmunomagnéticas, Mab fluorescentes, reactivos de fijación/permeabilización) tienden a moverse de izquierda a derecha, en o siguiendo el flujo de fluido. El microchip puede funcionar con un número de Reynolds bajo, de modo que el flujo es laminar y no turbulento; por lo tanto, las 2 corrientes se mueven en paralelo. Como se ve en la FIG. 17A, las células deseadas (leucocitos y células de leucemia) se concentran en el borde inferior de la matriz. Dirigiendo la mayor parte del fluido de salida a un canal de residuos y las células concentradas a un canal de producto, se pueden conseguir al mismo tiempo el lavado y la concentración.

Además de la recolección de leucocitos, la tecnología DLD puede lograr un lavado simultáneo de las células. La sangre completa se puede incubar con CD45 FITC durante 30 minutos a temperatura ambiente, después, los leucocitos se pueden retirar de la sangre usando un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento. Se puede lograr una reducción de la fluorescencia en el producto libre de células de > 99 % después de la recolección de leucocitos en el dispositivo, lo que indica la eliminación eficaz del Mab fluorescente.

Como se muestra en la FIG 17: (a) Vista superior: ejemplo de mecanismo DLD que muestra una entrada uniforme de bacterias E. coli fluorescente (blancas) en una matriz de postes inclinados que impactan desplazándose hacia abajo formando un ángulo con respecto al flujo de fluido, para conseguir una alta concentración contra la pared inferior de la matriz y posteriormente recogerse, mientras que el fluido se mueve horizontalmente (7). (b) "Lavado" esquemático de leucocitos y/o células leucémicas por extensión de la FIG. 17A añadiendo una corriente de entrada de tampón. Solo los leucocitos grandes pueden descender hacia la corriente de tampón y la pared inferior. (c) Imagen de lapso de tiempo de leucocitos (color azul por tinción nuclear) que se extraen de una corriente de sangre (color rojizo/blanco) que se mueve de izquierda a derecha usando un chip con un diseño como el de la FIG. 17B. Debe tenerse en cuenta que puede verse la matriz inclinada de micropostes.

En algunos casos, se procesan 0,1-1 ml de sangre en < 5-10 minutos, con un rendimiento de leucocitos > 90 %, sin sesgo de los tipos de células en comparación con las células de entrada o los métodos convencionales, y > 99 % de retirada de Mab fluorescente no unido y reactivos de fijación/permeabilización. En algunos casos, las células se alejan de la corriente de entrada más rápido de lo que se ensancha la corriente de entrada debido a la difusión hacia la corriente de tampón limpia. Aunque los coeficientes de difusión de las partículas grandes, por ejemplo, los leucocitos y las células leucémicas pueden ser insignificantes en una aproximación de primer orden, los coeficientes de difusión de los Mab o de los reactivos de fijación/permeabilización generalmente no son insignificantes. En algunos casos, estas moléculas disueltas o suspendidas son mucho más pequeñas que las células y, por tanto, tienen un alto coeficiente de difusión. La propagación no deseada de estos reactivos puede provocar contaminación de la salida de leucocitos. El aumento del ángulo de inclinación puede ayudar a prevenir la propagación, pero puede reducir el espacio entre los postes para un tamaño fijo de célula, lo cual puede ser indeseable debido a células ocasionales muy grandes. Otra opción es alargar el chip, dado que el desplazamiento de las células puede ser lineal con la longitud de la matriz y la propagación (difusión) aumenta únicamente como la raíz cuadrada. Sin embargo, esto puede tener el inconveniente de requerir un chip más caro. En algunas realizaciones, la DLD es microscópicamente un proceso determinista, no uno aleatorio, tal como la electroforesis en gel. Por lo tanto, la realización de un proceso microfluídico de DLD más rápido no puede cambiar la trayectoria de las células deseadas, y la alta velocidad puede reducir el tiempo para la difusión de reactivos no deseados. En algunos casos, la velocidad del fluido es de ~ 0,1 mm/s. Por lo tanto, el paso a través de un chip de longitud típica (~ 3 cm) puede llevar 5 minutos, que puede ser demasiado lento no solo para el objetivo del rendimiento de leucocitos, sino también para prevenir la difusión no deseada. En algunos casos, el proceso de impacto funciona bien con un daño pequeño o mínimo de las células incluso a velocidades > 100 mm/s (es decir, caudales > 1 ml/min). La velocidad del flujo se puede variar cuando sea necesario para reducir la contaminación por reactivo de la salida. Las imágenes cualitativas de resultados con E. coli (5) indican que este problema de difusión retirar reactivos mediante lavado puede superarse a velocidades de flujo moderadas.

Un segundo desafío potencial es la amplia gama de tamaños celulares de diferentes tipos de leucocitos y células leucémicas. Esto se puede solucionar utilizando postes triangulares en lugar de redondos, lo que permite un espacio más grande entre los postes que con los postes redondos, debido a anisotropías de flujo en el espacio. Finalmente, después de la fijación/permeabilización, las células pueden ser "más rígidas" que antes y, por tanto, actuar como si tuvieran un diámetro diferente en el chip DLD. Si esto se observa, se puede necesitar un chip DLD con un tamaño crítico ligeramente mayor para las células después de la fijación/permeabilización.

B. Recolección microfluídica de leucocitos y lavado/concentración DLD en una sola etapa

La etapa de lisis de eritrocitos convencional y la etapa de lavado/concentración por centrifugación posterior se pueden reemplazar por una sola etapa microfluídica de DLD. Además de un rendimiento y viabilidad > 90 % con la eliminación completa de los reactivos de marcaje y fijación/permeabilización, algunas realizaciones también consiguen que este sistema microfluídico de lavado/concentración reduzca > 99 % de los eritrocitos de una muestra de sangre completa incubada con Mab fluorescentes.

Debido a que son más grandes que los glóbulos rojos, los leucocitos se pueden extraer por impacto a partir de una corriente de entrada de sangre entera o diluida en un chip DLD. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está configurado para marcar directamente en la superficie los leucocitos presentes en la sangre (sin ninguna lisis o eliminación de eritrocitos), seguido de la recolección, lavado y concentración de los leucocitos inmunoteñidos directamente de la sangre (Fig 17C). Esto puede permitir que el proceso completo de preparación de leucocitos se lleve a cabo con solo 3 etapas de lavado/concentración en el chip. Debe tenerse en cuenta que el microchip puede diseñarse de manera que los glóbulos rojos más pequeños (de sangre no lisada), las plaquetas y los componentes plasmáticos no celulares no impacten; por lo tanto, la salida puede contener solo los leucocitos recogidos, lavados y concentrados.

En algunos casos, una corriente de entrada comprende leucocitos en sangre completa con Mab añadidos a la misma. La sangre se puede diluir con tampón de proceso. En algunos casos, se requiere un mayor volumen de entrada debido a que la entrada comprende leucocitos concentrados, por lo que se requieren mayores cantidades de Mab (para compensar el factor de dilución) para una inmunotinción óptima.

En algunos casos, las células se inmunotiñen exactamente como se describe en el presente documento, con la excepción de que la preparación de células de partida puede comprender sangre no lisada, en lugar de sangre lisada. Las células inmunoteñidas pueden someterse a la etapa desarrollada de recolección/lavado/concentración de leucocitos en el chip, y después enumerarse por citometría de flujo. Los resultados se pueden comparar con las células inmunoteñidas después de una etapa de lisis de eritrocitos convencional. Pueden realizarse comparaciones estadísticas de viabilidad, rendimiento, pureza y subconjuntos de leucocitos.

Los glóbulos blancos (WBC) de interés se pueden teñir con una o más etiquetas marcadas con fluorescencia (por ejemplo, anticuerpos monoclonales (Mab). Los subtipos de glóbulos blancos (WBC) se pueden distinguir por Mab de diferenciación de leucocitos que se unen específicamente a (glico)proteínas que se encuentran en la superficie (por ejemplo, membrana celular) de un subtipo de glóbulo blanco (WBC) clave, selectivamente (por ejemplo, células madre de cáncer epitelial citoqueratina+). Para marcar moléculas que se encuentran dentro de la célula, la célula se puede permeabilizar mediante un proceso de fijación/permeabilización (Fix/Perm) que puede estabilizar las estructuras celulares y permitir que los marcadores entren en la célula. Se pueden realizar etapas de lavado para eliminar Mab fluorescentes no unidos, tintes y desechos. Un "lavado" puede implicar la centrifugación de las células para obtener un sedimento utilizando una centrífuga, la aspiración o decantación del sobrenadante y la resuspensión de las células en un tampón u otro medio.

En algunas realizaciones, se retira el 99% de los eritrocitos (es decir, se obtienen leucocitos contaminados < 10 % por eritrocitos). En algunos casos, la viscosidad de la sangre (debido al número 1000 veces mayor de eritrocitos) es mayor en comparación con una suspensión de leucocitos en tampón. Esto puede cambiar la dinámica interna de los patrones de flujo cerca del límite entre el tampón y la sangre. Se pueden utilizar al menos tres enfoques para resolver este problema: (a) dirigir la entrada de sangre y la entrada de tampón a diferentes presiones, (b) reemplazar el enfoque de dirección por presión por un enfoque de caudal fijo (bomba de jeringa), y (c) diluir la sangre (por ejemplo, 3-5 veces) para reducir su viscosidad. El último enfoque puede ser el más sencillo, aunque puede requerir caudales más altos para lograr los objetivos de rendimiento. En algunos casos, se consigue una salida que concentra los leucocitos 30 veces con respecto a la entrada (diluida). En la práctica, esto puede requerir un chip bastante ancho (y por lo tanto largo), que puede estar limitado por el tamaño de oblea de partida de ~ 100 mm. Las opciones incluyen el uso de una instalación de fabricación capaz de obtener tamaños de obleas más grandes (por ejemplo, 200 mm) o chips en cascada: un chip realiza la recolección y la concentración inicial (FIG. 17C), y luego el fluido fluye a través de un segundo chip diseñado para la concentración (como el de FIG. 17A). Finalmente, si el enfoque de postes triangulares para espacios anchos no elimina la obstrucción debida a células anormalmente grandes (por ejemplo, > 30 um), se puede realizar una filtración previa o se puede usar un tercer chip en serie para eliminar las células de tamaño > 30 um.

En algunas realizaciones, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento reemplaza las etapas convencionales de lisis y centrifugación para recoger leucocitos (y células leucémicas) de la sangre, y las etapas de lavado/concentración por centrifugación después del marcaje de la superficie celular, fijación/permeabilización y marcaje intracelular con procesos rápidos y repetibles en el chip, como se describe en el presente documento.

En algunos casos, el método se asemeja a un enfoque de "lavado de coches", en el que (análogamente) un coche se somete a múltiples tratamientos secuenciales (por ejemplo, lavado, aclarado, encerado, secado) a medida que avanza el proceso de lavado de coches (FIG. 18A). Basándose en el concepto de la FIG. 18B, la sangre entra en un chip y las células deseadas se mueven a través de corrientes secuenciales paralelas de agentes químicos (marcadores, reactivos de fijación/permeabilización, etc.) para realizar una etapa tras otra. En algunos casos, la sangre que ya se ha marcado con un señalizador de la superficie celular (pero no se ha lavado) entra en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento en la corriente superior (que fluye de izquierda a derecha), y se induce a las células leucémicas y leucocitos relativamente grandes a fluir hacia abajo formando un ángulo con el flujo de fluido por el proceso de impacto de DLD para recogerse de la sangre. Después las células fluyen a través de una corriente para fijar y permeabilizar las membranas celulares, y después a través de una corriente para el marcaje intracelular. Finalmente, las células marcadas en la superficie celular/intracelularmente se lavan, se concentran y se recogen en el borde inferior de la matriz.

Puede realizarse un marcaje en el chip de las células mediante el desplazamiento hacia el interior de una corriente de marcaje y la posterior eliminación de las células marcadas de la corriente de marcaje utilizando plaquetas de sangre previamente aisladas pero sin marcar como entrada y un marcador fluorescente de CD41 para la corriente de marcaje.

(FIG. 18B). Se puede realizar la lisis de células en el chip moviéndolas a través de una corriente de agentes de lisis. La lisis en el chip no es necesaria para el "lavado de coches" de la FIG. 18A, pero brinda la posibilidad de un procesamiento químico secuencial en el chip para etapas tales como la fijación/permeabilización antes de la tinción intracelular. Pueden determinarse los tiempos y concentraciones de incubación requeridos, los rendimientos y el ensanchamiento de las corrientes de incubación o fijación/permeabilización debido a la difusión.

La FIG. 18A muestra una vista esquemática de un concepto de "lavado de coches" para el procesamiento secuencial múltiple de tratamientos químicos en el chip para una preparación celular. Un solo proceso de flujo continuo combina todas las etapas en la FlG. 16 en un solo chip. La FIG. 18B muestra una imagen de falso color de lapso de tiempo de plaquetas que descienden en una matriz DLD a través de 3 corrientes paralelas en el chip para marcaje y lavado en el chip. Corriente superior: entrada de plaquetas no marcadas (invisibles); Corriente media: marcador de CD41 conjugado con ficoeritrina; Corriente inferior: plaquetas marcadas en tampón de lavado.

C. Generación de bibliotecas NGS utilizando una matriz DLD

En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o dispositivos proporcionados en el presente documento se utilizan para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) una muestra de una célula a un ácido nucleico. El procesamiento puede ser en serie. En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se utilizan para procesar en serie una muestra de una pluralidad de células a una pluralidad de ácidos nucleicos, en donde la pluralidad de ácidos nucleicos comprende ácidos nucleicos en una biblioteca de ácidos nucleicos. Se describen dispositivos, métodos y/o sistemas, por ejemplo, en la Publicación PCT N.° WO201302Q089. La célula se puede procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) usando un dispositivo de la presente invención hasta un ácido nucleico de alto peso molecular ("HMW") usando al menos una corriente de reactivo químico y/o enzimático que fluye a través de al menos una matriz de impacto DLD. La biblioteca de ácidos nucleicos se puede configurar para su uso en una plataforma de secuenciación. La plataforma de secuenciación puede ser cualquier plataforma de secuenciación de última generación conocida en la técnica. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) células hasta ácido nucleico se utiliza para procesar un gran volumen de una muestra que comprende las células. La muestra puede ser de al menos 10 ml. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) células hasta ácido nucleico se utiliza para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) a un caudal elevado. En algunos casos, los dispositivos tal como se proporcionan en el presente documento para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) células en una muestra que comprende células desde células hasta ácidos nucleicos comprenden al menos una pared separadora tal como se proporciona en el presente documento. Dicha al menos una pared separadora está configurada para separar una corriente de flujo que comprende un reactivo (por ejemplo, reactivo químico y/o enzimático tal como se proporciona en el presente documento) de una corriente de flujo adyacente. En algunos casos, los dispositivos tal como se proporcionan en el presente documento para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) células en una muestra que comprende células desde células hasta ácidos nucleicos comprenden un sistema de autolimpieza en el chip tal como se proporciona en el presente documento. En algunos casos, los dispositivos tal como se proporcionan en el presente documento para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) células en una muestra que comprende células desde células hasta ácidos nucleicos comprenden al menos una pared separadora y un sistema de autolimpieza en el chip tal como se proporciona en el presente documento.

En algunos casos, un ácido nucleico HMW aislado por los dispositivos y métodos proporcionados en el presente documento tiene un radio hidrodinámico eficaz que es mayor que un tamaño crítico de la matriz DLD en un dispositivo proporcionado en el presente documento. El método puede incluir recibir el ácido nucleico HMW en al menos una matriz de impacto y poner en contacto el ácido nucleico HMW con al menos una corriente de reactivo químico y/o enzimático, en donde dicha al menos una corriente de reactivo químico y/o enzimático fluye en la dirección del flujo general de fluido a través de la matriz de impacto, mientras que el ácido nucleico HMW fluye formando un ángulo con la dirección del flujo general de fluido. El ácido nucleico HMW puede reaccionar con dicha al menos una corriente de reactivo químico y/o enzimático.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento incluye al menos un dispositivo de matriz de impacto (por ejemplo, matriz DLD) que tiene una o más matrices de impacto. El dispositivo de matriz de impacto puede tratar y purificar en serie muestras de fluido de ácido nucleico. Se pueden realizar múltiples ciclos de tratamiento y purificación utilizando un solo dispositivo de flujo en una sola operación de flujo continuo. Los tratamientos pueden ser químicos y/o enzimáticos. Los ácidos nucleicos se pueden purificar a partir de células y/o muestras biológicas líquidas complejas, tales como sangre completa. El dispositivo de matriz de impacto también se puede utilizar para realizar diversos procesamientos de los ácidos nucleicos purificados. Los ejemplos no limitantes de dicho procesamiento pueden incluir al menos uno de los siguientes: fosforilación, desfosforilación, digestión de restricción, ligamiento, desnaturalización, hibridación, procesamiento por polimerasas, marcaje fluorescente o radiactivo, modificación química de bases de ADN o grupos de cadena principal, escisión enzimática o química de bases modificadas, tinción de ácidos nucleicos con cromóforos o fluoróforos, etc. y/u otros y/o cualquier combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser ácidos nucleicos unidos a partículas, donde los ácidos nucleicos pueden estar unidos a micropartículas. Esto puede permitir el procesamiento de ácidos nucleicos pequeños. Las partículas pueden hacer que los ácidos nucleicos adheridos impacten en matrices con dimensiones de matriz fácilmente fabricadas.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento se usa en un método para procesar fluidos. El procesamiento puede incluir la purificación de fluidos que se puede conseguir haciendo fluir una muestra de fluido compleja en el interior de una matriz de impacto, usando una matriz de impacto para aislar células que contienen ácidos nucleicos o partículas de interés en función del tamaño de partícula, usando una matriz de impacto para poner en contacto partículas aisladas con una o más corrientes de reactivo que puedan liberar ácido nucleico de las partículas en forma sustancialmente pura, y usando una matriz de impacto para extraer los ácidos nucleicos purificados de la corriente de reactivo. Una vez que los ácidos nucleicos purificados se han extraído de la corriente de reactivo, los ácidos nucleicos purificados pueden estar sustancialmente libres de otros componentes celulares y de muestra y pueden estar sustancialmente libres de los componentes de la corriente de reactivo de la matriz de impacto.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento comprende una serie de matrices de impacto (por ejemplo, DLD) conectadas en serie de modo que la salida de producto de una matriz de impacto está conectada a una entrada de muestra de una matriz de impacto individual posterior. En algunos casos, se utiliza una única matriz de impacto para todas las etapas. El fraccionamiento celular y los tratamientos con reactivos se pueden conseguir en regiones físicamente distintas de una única matriz de impacto. La muestra de entrada puede ser sangre de aves o mamíferos y las partículas que contienen ácido nucleico pueden ser glóbulos blancos. La muestra de entrada puede ser sangre de aves o mamíferos y las partículas que contienen ácido nucleico pueden ser células tumorales circulantes. La muestra de entrada puede ser sangre completa de aves o mamíferos y las partículas que contienen ácido nucleico pueden ser glóbulos blancos, bacterias, virus, hongos, protozoos parásitos y/o cualquier otra partícula tal como se proporciona en el presente documento y/o cualquier combinación de los mismos.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento proporciona un procesamiento en serie de ácidos nucleicos de alto peso molecular por medios químicos y/o enzimáticos en dispositivos tales como se proporcionan en el presente documento que comprenden matrices de impacto (por ejemplo, DLD). El ácido nucleico HMW puede tener un diámetro hidrodinámico eficaz que puede ser mayor que el diámetro crítico de la matriz de impacto y el ácido nucleico HMW puede ponerse en contacto con al menos una primera corriente de reactivo, donde la primera corriente de reactivo puede fluir en la dirección del flujo general de fluido y donde el ácido nucleico HMW se bombea a través de la primera corriente de reactivo y puede reaccionar con los primeros reactivos.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento proporciona un procesamiento en serie de ácidos nucleicos HMW por uno o más medios químicos o enzimáticos que se puede conseguir haciendo fluir una muestra de ácidos nucleicos HMW al interior de una matriz de impacto, usando una matriz de impacto para poner en contacto ácidos nucleicos HMW con al menos una corriente de reactivo que puede modificar los ácidos nucleicos (por ejemplo, químicamente, enzimáticamente, etc.), y, opcionalmente, utilizando una matriz de impacto para retirar los ácidos nucleicos purificados de la corriente de reactivo.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento comprende matrices de impacto individuales conectadas en una serie de matrices de impacto de modo que la salida del producto de una matriz de impacto se conecte a la entrada de muestra de una matriz de impacto individual posterior de la serie. Las matrices de impacto pueden ser las mismas matrices de impacto (y el fraccionamiento de células y los tratamientos con reactivos se pueden realizar en regiones físicamente distintas de una matriz de impacto continua). En algunos casos, una muestra de ADN puede unirse (de forma covalente o no covalente) a micropartículas, en donde las micropartículas pueden impactar, por lo que las micropartículas actúan como portadores para llevar el ADN a través de reacciones de modificación en corrientes de reactivo posteriores.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento proporciona el procesamiento de sangre completa para producir un ácido nucleico puro. Se puede usar un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento para producir un ácido nucleico puro modificado. El ácido nucleico puro modificado puede ser una biblioteca de secuenciación de ADN y/o una biblioteca de ADN recombinante.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa en un sistema que puede aceptar una muestra de sangre completa como entrada y producir una biblioteca de ADN genómico adecuada para la secuenciación de última generación ("NGS"). La construcción de la biblioteca puede realizarse en un solo proceso automatizado sin la intervención del usuario. El sistema puede reducir el coste y la mano de obra de la secuenciación NGS y acelerar el movimiento de la tecnología NGS hacia los entornos de diagnóstico. El sistema puede ser ampliable de escala para acomodar muestras que contienen muy pocas células (por ejemplo, un solo nivel celular), lo cual puede ser importante en el tratamiento de cánceres y/u otros problemas médicos importantes o muestras grandes (por ejemplo, de al menos 10 ml), lo cual puede ser importante para técnicas de alto rendimiento.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento incluye un diseño microfluídico, de flujo continuo. Se pueden hacer pasar muestras líquidas que contienen partículas (por ejemplo, células, núcleos y macromoléculas grandes tales como el ADN HMW enrollado aleatoriamente) a través de celdas de flujo que pueden estar pobladas por una matriz regular de postes de tamaño micrométrico. La separación y el alineamiento de los postes pueden disponerse de modo que las partículas por encima de un cierto tamaño crítico puedan "impactar" con los postes y pasar a una trayectoria de flujo que corre diagonalmente a través de la dirección del flujo general de líquido. Por el contrario, los componentes de muestra más pequeños que el tamaño crítico pueden desplazarse en línea recta junto con el flujo general. Usando este mecanismo, pueden separarse componentes de muestra más grandes y purificarse de los componentes más pequeños lateralmente a través del chip.

Las muestras pueden fluir a través de estas matrices de impacto en condiciones de flujo laminar (número de Reynolds, Re, << 1), de modo que se pueden introducir corrientes de reactivo discretas en las matrices sin una mezcla lateral significativa. Las partículas grandes pueden impactar y desviarse diagonalmente hacia el interior y hacia el exterior de tales corrientes de reactivos para realizar reacciones químicas o enzimáticas en las partículas. Los dispositivos tal como se proporcionan en el presente documento se pueden usar para purificar núcleos de leucocitos, purificar ADN y modificar enzimáticamente el ADN para la generación de bibliotecas NGS.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento se usa en un método para procesar secuencialmente muestras de sangre usando matrices de impacto. Se pueden obtener unos pocos microlitros ("pl") de sangre. Las células sanguíneas se pueden separar del plasma. Las células se pueden lavar con una corriente de tampón cuando se separan del plasma. En algunos casos, las células se lisan. Las células lavadas se pueden lisar haciéndolas impactar a través de una corriente de reactivo que contenga detergente no iónico. El detergente no iónico puede ser cualquier detergente no iónico conocido en la técnica. Después de retirar el reactivo de lisis, los núcleos de leucocitos intactos pueden impactar diagonalmente a través de una corriente de tampón de lavado. Los contenidos citoplasmáticos demasiado pequeños para impactar (por ejemplo, por debajo de un tamaño crítico de una matriz de impacto DLD) se pueden sacar de la matriz en la corriente de lisis de detergente. Se puede aislar y/o purificar ADN cromosómico. Los núcleos de leucocitos lavados se pueden hacer impactar a través de una corriente de reactivo de lisis nuclear para eliminar todos los lípidos y proteínas nucleares del ADN cromosómico HMW. La corriente de reactivo de lisis nuclear puede comprender un desnaturalizante de proteínas (por ejemplo, isotiocianato de guanidina) para extraer ácido nucleico (por ejemplo, ADN cromosómico HW) de proteínas (por ejemplo, proteínas histonas). En algunos casos, el isotiocianato de guanidina está presente en una corriente separada de la corriente de lisis nuclear. Las dimensiones de la matriz en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se pueden elegir de modo que el ADN HMW, en su configuración de enrollamiento aleatorio de doble cadena, pueda impactar y salir diagonalmente de la corriente de reactivo de lisis. Todos o sustancialmente todos los lípidos nucleares, el ARN y las proteínas demasiado pequeñas para impactar (por ejemplo, por debajo de un tamaño crítico de una matriz de impacto DLD) se pueden extraer de la matriz en la corriente de lisis. En algunos casos, el ADN purificado se hace reaccionar con un reactivo adaptado a la transposasa para generar cointegrados de biblioteca. El ADN HMW purificado se puede hacer impactar a través de una corriente de reactivo que contiene un complejo de transposasa que puede precargarse con extremos de transposón modificados con adaptador de secuenciación. Un método que usa un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento puede proporcionar un complejo de transposasa en el que los extremos del transposasoma adaptados al transposón pueden estar en la misma pieza lineal de ADN. Como resultado, una reacción del transposasoma con el ADN HMW puede generar un producto de inserción colineal que puede aumentar el tamaño de la diana de ADN HMW. El ADN diana puede seguir siendo impactable, en donde el ADN diana puede separarse de la corriente de reactivo del transposasoma y el ADN adaptador sin reaccionar. Los cointegrados de HMW se pueden purificar de la corriente de reactivo de transposasa. Los cointegrados se pueden hacer reaccionar con enzimas de restricción para generar una biblioteca de secuenciación. La biblioteca puede separarse del ADN HMW sin cortar y recuperarse de la matriz de impacto. En algunos casos, una biblioteca de secuenciación final producida mediante un método que utiliza un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento se puede escindir del ADN cointegrado HMW haciendo impactar el ADN a través de una corriente de reactivo de enzima de restricción. La enzima puede escindir sitios diseñados por ingeniería genética en el transposón modificado que se encuentran fuera de los adaptadores de secuenciación. La biblioteca escindida puede tener un peso molecular bajo (aproximadamente 200-2000 pb) y es posible que ya no sea impactable. La biblioteca se puede retirar de la matriz en la corriente de enzimas de restricción. El ADN HMW que no ha reaccionado, sin escindir, se puede extraer por impacto de la corriente de reactivo en diagonal (y se puede recuperar).

En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento incluyen matrices de postes de tamaño micrométrico con alta rigidez estructural y altas relaciones de aspecto con el fin de procesar muestras de fluidos. Las matrices de impacto se pueden fabricar a partir de silicio, resina de olefina cíclica, celdas de flujo desechables de plástico moldeado, así como de cualquier otro material.

En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento separan o fraccionan, analizan y/o recogen analitos de ácido polinucleico purificados o procesados o fracciones derivadas de una muestra biológica de partida tal como se proporciona en el presente documento.

En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento procesan moléculas de ácido nucleico más pequeñas uniendo los ácidos nucleicos a micropartículas que están adaptadas para impactar en una matriz de impacto (por ejemplo, matriz DLD). Las micropartículas pueden actuar como portadores para transportar los ácidos nucleicos unidos a través de corrientes de reactivos para la modificación de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, puede usarse PCR en emulsión con micropartículas modificadas con cebador para la generación de perlas de molde de secuenciación de ADN (métodos de secuenciación Ion Torrent y 454; Rothberg et al. 2011. Nature v475, pp348-352; Margulies et al., Nature. V437, pp 376-380). En algunos casos, pueden usarse métodos de PCR en emulsión para evaluar la frecuencia de genes mutantes raros en tejidos de pacientes con cáncer (método "BEAMing" de Vogelstein, Diehl et al. Nature Methods. 2006 v3 pp 551-559). En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se utilizan para procesar la PCR en emulsión basada en partículas mediante la combinación de lavado, desnaturalización e hibridación de cebadores en un solo proceso de matriz de impacto. Por ejemplo, se puede diseñar una matriz de impacto eligiendo un espacio de postes tal que el diámetro crítico de la matriz pueda ser menor que el de las micropartículas utilizadas para la PCR en emulsión. Esto puede garantizar que las micropartículas puedan impactar de manera consistente en todas las posiciones dentro de la matriz. Después de la PCR en emulsión, la emulsión se puede romper y la fracción acuosa de partículas se puede introducir en un dispositivo que comprende una matriz de impacto tal como se proporciona en el presente documento cerca de la esquina superior izquierda. A medida que las partículas entran en la matriz, las partículas se pueden desviar hacia una pared límite opuesta, mientras que los reactivos de PCR pueden fluir hacia abajo en la dirección del flujo general. Se puede introducir un tampón de lavado adecuado en la parte superior de la matriz inmediatamente a la derecha del puerto de entrada de partículas. A medida que las partículas impactan y se apartan de la corriente de entrada, las partículas pueden pasar a través de la corriente de tampón de lavado, que puede eliminar el reactivo de PCR adicional. A medida que las partículas se mueven hacia abajo en la matriz, las partículas pueden entrar en una corriente de reactivo desnaturalizante (por ejemplo, que puede contener NaOH o KOH aproximadamente 20-200 mM con EDTA aproximadamente 1-10 mM), que puede convertir los amplicones bicatenarios de las partículas en forma monocatenaria. La cadena de amplicón unida de forma no covalente se puede retirar de la matriz con la corriente desnaturalizante, y las partículas pueden impactar y desplazarse hacia la derecha en un tampón de neutralización que puede ser adecuado para las reacciones de hibridación en la siguiente etapa. En general, tal tampón de neutralización puede contener un tampón (por ejemplo, Tris-HCl 20-200 mM, pH 7,5-8,0) e iones monovalentes para soportar la hibridación (por ejemplo, NaCl 20-500 mM). Después, las partículas pueden hacerse impactar a través de una corriente de reactivo de hibridación que contiene un cebador de secuenciación (en el caso de las aplicaciones 454/Ion Torrent) o una sonda de oligonucleótido marcada (en el caso de la aplicación BEAMing). La corriente de reactivo puede tener sondas de oligonucleótido en el intervalo de concentración micromolar baja (de aproximadamente 0,1 micromolar a aproximadamente 50 micromolar), y puede tener aproximadamente la misma fuerza iónica que la corriente de tampón de neutralización descrita anteriormente. La fuerza iónica se puede ajustar hacia arriba o hacia abajo según sea necesario para conseguir la rigurosidad correcta de la hibridación. En etapa de procesamiento final de la matriz, las partículas hibridadas se pueden hacer impactar y salir de la corriente de hibridación a una corriente de tampón de lavado final. Este tampón de lavado final se elige de acuerdo con la aplicación posterior que se utilizará (secuenciación en el caso de aplicaciones 454/Ion, clasificación de partículas fluorescentes en el caso del ensayo BEAMing). Las partículas hibridadas y lavadas se recogen del puerto de salida del tampón de lavado final situado cerca de la esquina inferior derecha de la matriz.

VII. Aplicaciones posteriores

Las partículas procesadas (por ejemplo, procesadas o tratadas química o enzimáticamente), purificadas, aisladas y/o concentradas utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento pueden almacenarse y/o usarse en aplicaciones posteriores. En el presente documento se describen varias aplicaciones para partículas que se han procesado (por ejemplo, procesadas o tratadas químicamente), purificadas, aisladas y/o concentradas utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento.

Aunque esta divulgación analiza el procesamiento de leucocitos y células madre para citometría de flujo, la misma tecnología puede utilizarse para múltiples pruebas celulares nuevas y existentes y otras pruebas (por ejemplo, ADN, ARN) para el cáncer y otras enfermedades.

En algunos casos, los dispositivos, composiciones, sistemas, kits y/o métodos descritos en el presente documento se utilizan para preparar muestras para la secuenciación de ácidos nucleicos (por ejemplo, a Dn o ARN). Los ácidos nucleicos se pueden aislar de cualquier tipo de célula, entre las que se incluyen los procariotas, eucariotas, arqueas, organismos unicelulares, organismos o tejidos multicelulares (por ejemplo, plantas o animales) y similares. El ácido nucleico se puede secuenciar de cualquier manera, incluyendo la secuenciación de una sola molécula o de escopeta, en un nanoporo, mediante la detección de un cambio en el pH en acontecimientos de incorporación de nucleótidos, por detección de fluorescencia de colorantes incorporados o liberados, etc. Las células se lisan y el ácido nucleico se separa de los restos celulares utilizando las matrices de postes tal como se describe en el presente documento. El ácido nucleico puede concentrarse a cualquier concentración adecuada y/o purificarse a cualquier pureza adecuada (por ejemplo, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, al menos un 99,9 % y similares).

A. Banco de sangre (por ejemplo, Crioconservación)

En algunos casos, la sangre se separa en componentes usando dispositivos y métodos descritos en el presente documento, y los componentes se almacenan. En algunos casos, los eritrocitos se aíslan o se purifican. En algunos casos, los eritrocitos se almacenan a una temperatura de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 ° C. En algunos casos, los eritrocitos se almacenan durante aproximadamente 20 a aproximadamente 60 días, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 días, o hasta 42 días. En algunos casos, los eritrocitos se congelan (por ejemplo, con un crioprotector, por ejemplo, glicerol) y se almacenan a, por ejemplo, menos de -60 °C, por ejemplo, durante al menos 10 años. En algunos casos, los eritrocitos almacenados se utilizan para transfusiones. En algunos casos, se administran eritrocitos aislados a un paciente después de un traumatismo, cirugía, pérdida de sangre o a un paciente con un trastorno sanguíneo, por ejemplo, anemia de células falciformes.

En algunos casos, el plasma se aísla y se congela para su uso posterior. En algunos casos, el plasma se almacena durante hasta un año. El plasma puede administrarse a un sujeto, por ejemplo, un paciente quemado, sujeto en shock o sujeto con un trastorno hemorrágico.

En algunos casos, las plaquetas se aíslan. En algunos casos, las plaquetas se aíslan, por ejemplo, para transfusión. En algunos casos, las plaquetas aisladas se almacenan a temperatura ambiente, por ejemplo, durante aproximadamente 5 a 7 días. En algunos casos, las plaquetas se administran a un sujeto con cáncer, con un trasplante de órganos o a un sujeto que se está sometiendo o se ha sometido a una cirugía.

En algunos casos, un componente sanguíneo aislado es el factor antihemofílico crioprecipitado (AHF crioprecipitado). El AHF crioprecipitado se puede almacenar congelado durante aproximadamente un año. En algunos casos, el AHF crioprecipitado se administra a un sujeto con hemofilia o enfermedad de Von Willebrand.

Otros componentes sanguíneos que pueden aislarse y almacenarse son los granulocitos. En algunos casos, los granulocitos se utilizan para transfusión dentro de las 24 horas posteriores a la recolección. En algunos casos, los granulocitos se administran a sujetos para tratar infecciones que no responden a la terapia con antibióticos.

En algunos casos, los linfocitos se aíslan y pueden almacenarse, con o sin modificación genética, antes de la administración a pacientes con cáncer o enfermedades infecciosas u otras.

En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se conservan, por ejemplo, se crioconservan. Se describen métodos de crioconservación, por ejemplo, en Berz et al (2007) Cryopreservation of Hematopoietic Stem Cells. Am J Hematol. 82: 463-472. En algunos casos, se añade una solución heparinizada de plasmalyte y/o dimetilsulfóxido (DMSO) (por ejemplo, DMSO al 10%) a las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, HSC. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, las HSC se encuentran en una solución con una concentración final de DMSO inferior al 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5 % de DMSO. En algunos casos, las partículas, por ejemplo, células, por ejemplo, HSC, están en una solución con una concentración final de DMSO de aproximadamente el 2 a aproximadamente el 10 %, o de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 15 %. En algunos casos, los leucocitos se crioconservan.

En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se combinan con solución salina o albúmina sérica. En algunos casos, el crioprotector es hidroxietil almidón (HES), propilenglicol, alfa tocoferol, catalasa, ácido ascórbico, trehalosa o inhibidor de caspasa (por ejemplo, zVAD-fmk). En algunos casos, el crioprotector es un glicol (por ejemplo, etilenglicol, propilenglicol o glicerol). En algunos casos, el crioprotector es 2-metil-2,4-pentanodiol (MPD). En algunos casos, el crioprotector es sacarosa. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se mezclan con más de un crioprotector.

En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, HSC, se congelan a una temperatura inferior a 5 °C, a -79 °C, menor de -155 °C o menor de -195 °C. En algunas realizaciones, las partículas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se congelan a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente -80 °C, -156 °C o -196 °C. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se congelan a una temperatura de aproximadamente -196 °C a aproximadamente -80 °C. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se almacenan en una fase líquida de un tanque de nitrógeno. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se almacenan en una fase de vapor de nitrógeno.

En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se congelan a una velocidad de congelación controlada, por ejemplo, a una velocidad de 1-2 °C/min hasta un punto de temperatura de aproximadamente -40 °C. Entonces, el proceso de congelación hasta un objetivo de -120 °C se puede realizar a un ritmo más rápido, de aproximadamente 3-5 °C/min. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, HSC, se enfrían a una temperatura de -4 °C, y después se colocan en un congelador a -80 °C.

En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se crioconservan durante al menos 1, 10, 30, 180 o 365 días. En algunos casos, las HSC se crioconservan durante al menos 1, 5, 10, 20, 30, 50, 75 o 100 años.

En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se crioconservan a una densidad menor de 10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 células/ml. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se crioconservan a una densidad de al menos 10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 células/ml.

En algunos casos, las partículas purificadas crioconservadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se descongelan a 37 °C (por ejemplo, en un baño de agua, almohadillas de gel). En algunos casos, las partículas purificadas crioconservadas, por ejemplo, células, por ejemplo, HSC, se descongelan a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 37 °C.

En algunos casos, se elimina el crioconservante (por ejemplo, DMSO) por lavado de las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, muestra de HSC después de la descongelación. En algunos casos, una partícula purificada descongelada, por ejemplo, célula, por ejemplo, célula madre, por ejemplo, muestra de HSC, se diluye en albúmina de suero humano (HSA) (por ejemplo, 2,5 %) y dextrano 40 (por ejemplo, 5 %). La muestra después se puede centrifugar o pasar a través de un dispositivo microfluídico descrito en el presente documento, por ejemplo, a una temperatura de 10 °C. En algunos casos, se añade una solución de HSA/dextrano a las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC de nuevo. En algunos casos, la concentración de DMSO es menor del 1,7 %, por ejemplo, mediante lavado y/o dilución. En algunos casos, se infunden en un sujeto células madre, por ejemplo, HSC con una concentración de DMSO de menos del 1,7 %.

En algún caso, las partículas purificadas crioconservadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se almacenan en un recipiente. En algunos casos, el recipiente es un recipiente de etinil vinil acetato (EVA). En algunos casos, el recipiente se irradia con rayos gamma. En algunos casos, el recipiente es un recipiente de acero inoxidable. En algunos casos, el recipiente comprende, PVC, poliolefina o polietileno. En algunos casos, el recipiente comprende teflón, Kaplon, FEP y/o poliimida.

En algunos casos, las células purificadas, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se evalúan mediante recuento de células para determinar el total de células nucleadas y células CD34+ (por ejemplo, mediante citometría de flujo); por exclusión de azul tripán para determinar la viabilidad, con 7-acinoactinomicina para determinar la viabilidad o con yoduro de propidio para determinar la viabilidad; o por injerto en NOD/SCID (ratones inmunodeficientes) o un ensayo clonogénico (por ejemplo, ensayo CFU-Sd12 en ratones; CFU-GM; CFU-GEMM; BFU-E o LTC-IC).

B. Tratamiento de cánceres

En algunos casos, las células madre aisladas, purificadas y/o concentradas, por ejemplo, HSC, se pueden utilizar para tratar cánceres, por ejemplo, cáncer de la sangre, por ejemplo, leucemia o linfoma. En algunos casos, las células madre aisladas, purificadas y/o concentradas, por ejemplo, HSC, se obtienen de un sujeto y posteriormente se administran al mismo sujeto. Las células madre pueden desplazarse a la médula ósea y comenzar a producir nuevas células sanguíneas.

En algunos casos, las células madre, por ejemplo, HSC, se obtienen de un primer sujeto y se administran a un segundo sujeto (por ejemplo, pariente, por ejemplo, hermana o hermano del primer sujeto). En algunos casos, el primer sujeto y el segundo sujeto no son parientes. En algunos casos, el segundo sujeto es un donante compatible. En algunos casos, el primer sujeto y el segundo sujeto tienen antígenos leucocitarios humanos similares. En algunos casos, el primer sujeto y el segundo sujeto no tienen antígenos leucocitarios humanos similares. En algunos casos, a un sujeto diagnosticado o sospechoso de tener, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia mielógena crónica (CML), enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple o linfoma no Hodgkin se le administran HSC.

En algunos casos, la administración de células madre a un sujeto comprende el uso de una vía intravenosa (IV). En algunos casos, el trasplante tarda entre 1 y 5 horas aproximadamente. Después de entrar en el torrente sanguíneo, las células pueden desplazarse a la médula ósea. El injerto (producción normal de sangre) puede tener lugar dentro de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 semanas después del trasplante. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y kits descritos en el presente documento se utilizan para controlar un injerto.

En algunos casos, un sujeto recibe un trasplante de médula ósea (BMT). En algunos casos, un sujeto recibe un trasplante de células madre de sangre periférica (PBSCT). En algunos casos, el trasplante es un trasplante autólogo (el sujeto recibe sus propias células madre).

En algunos casos, el trasplante es un trasplante singénico (un sujeto recibe células madre de su gemelo idéntico). En algunos casos, el trasplante es un trasplante alogénico (un sujeto recibe células madre de su hermano, hermana, padre, madre o persona no relacionada con el sujeto.

En algunos casos, las células madre se purifican de la médula ósea en el hueso pélvico o el esternón. En algunos casos, Las PBSC se procesan y/o purifican mediante aféresis o leucocitaféresis. En algunos casos, las células madre se procesan y/o purifican del cordón umbilical o la placenta.

En algunos casos, se administran células madre aisladas, purificadas, procesadas o concentradas, por ejemplo, HSC, a un sujeto con CML, y al sujeto también se le administra mesilato de imatinib (Gleevec™). En algunos casos, al sujeto se le administran células madre, por ejemplo, HSC sin recibir mesilato de imatinib.

En algunos casos, el sujeto que recibe células madre, por ejemplo, HSC, es resistente a la quimioterapia.

En algunos casos, el sujeto que recibe células madre, por ejemplo, HSC, es un recién nacido, lactante, niño, adolescente, adulto joven, persona de mediana edad o anciano.

En algunos casos, el sujeto que recibe células madre, por ejemplo, HSC, tiene neuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas o enfermedad granulomatosa crónica.

En algunos casos, se utiliza un minitrasplante. En algunos casos, se utiliza un trasplante en tándem, que implica dos ciclos secuenciales de quimioterapia de dosis alta y trasplante de células madre.

En algunos casos, a un sujeto, por ejemplo, a un paciente con cáncer, se le administra radiación o quimioterapia, y la radiación o quimioterapia se dirige a las células hematopoyéticas, que pueden destruirse por radiación o quimioterapia. En algunos casos, se pueden trasplantar al sujeto HSC aisladas, purificadas, procesadas y/o concentradas del sujeto para reemplazar las células destruidas por la quimioterapia. La introducción de las propias HSC del sujeto puede reducir la posibilidad de un desajuste inmunológico o de una enfermedad de injerto contra huésped. En algunos casos, solo se trasplantan células Tby-1+ CD34+ al sujeto.

En algunos casos, se administran células madre a un sujeto que está en remisión (los signos y síntomas del cáncer han desaparecido).

En algunos casos, el trasplante de células madre procesadas y/o purificadas utilizando métodos y dispositivos descritos en el presente documento puede dar como resultado una reducción del riesgo de enfermedad de injerto contra huésped de al menos un 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % en relación con el trasplante de células madre purificadas por métodos convencionales.

En algunos casos, el sujeto al que se le administran células madre tiene uno o más de los siguientes cánceres: leucemia mieloide aguda; cáncer de vejiga, incluyendo tumores del tracto superior y carcinoma urotelial de próstata; cáncer de hueso, incluyendo condrosarcoma, sarcoma de Ewing y osteosarcoma; cáncer de mama, incluyendo no invasivo, invasivas, tumores filoides, enfermedad de Paget y cáncer de mama durante el embarazo; cánceres del sistema nervioso central, astrocitoma/oligodendroglioma supratentorial infiltrativo de bajo grado en adultos, ependimoma intracraneal adulto, astrocitoma anaplásico/oligodendroglioma anaplásico/glioblastoma multiforme, lesiones metastásicas limitadas (1-3), lesiones metastásicas múltiples (> 3), meningitis linfomatosa carcinomatosa, linfoma primario del SNC no inmunodeprimido y tumores de la columna metastásicos; cáncer cervicouterino; leucemia mielógena crónica (CML); cáncer de colon, cáncer rectal, carcinoma anal; cáncer de esófago; cáncer gástrico (estómago); cánceres de cabeza y cuello, incluyendo tumores del seno etmoidal, tumores del seno maxilar, tumores de las glándulas salivales, cáncer de labio, cáncer de boca, cáncer de orofaringe, cáncer de hipofaringe, cáncer primario oculto, cáncer de laringe glótica, cáncer de laringe supraglótica, cáncer de nasofaringe y cáncer avanzado de cabeza y cuello; cánceres hepatobiliares, incluido el carcinoma hepatocelular, cáncer de vesícula biliar, colangiocarcinoma intrahepático y colangiocarcinoma extrahepático; enfermedad/linfoma de Hodgkin; cáncer de riñón; melanoma; mieloma múltiple, amiloidosis sistémica de cadenas ligeras, macroglobulinemia de Waldenstrom; síndromes mielodisplásicos; tumores neuroendocrinos, incluida la neoplasia endocrina múltiple, tipo 1, neoplasia endocrina múltiple, tipo 2, tumores carcinoides, tumores de células de los islotes, feocromocitoma, carcinoides pulmonares poco diferenciados/de células pequeñas/atípicos; linfomas no Hodgkin, incluida la leucemia linfocítica crónica de linfocitos B/linfoma microlinfocítico, linfoma folicular, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma linfoblástico, linfoma de células B relacionado con el SIDA, linfoma periférico de células T y micosis fungoide/síndrome de Sezary; cánceres de piel no melanoma, incluidos los cánceres de piel de células basales y escamosas, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel; cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), incluyendo neoplasias tímicas; cáncer primario oculto; cáncer de ovario, incluido el cáncer epitelial de ovario, cáncer de ovario epitelial límite (bajo potencial maligno) e histologías de ovario menos comunes; adenocarcinoma pancreático; cáncer de próstata; cáncer de pulmón de células pequeñas y tumores neuroendocrinos de pulmón; sarcoma de tejidos blandos, incluyendo extremidades de tejidos blandos, retroperitoneal, sarcoma intraabdominal y desmoide; cáncer testicular; neoplasias tímicas, incluido el carcinoma de tiroides, evaluación de nódulos, carcinoma papilar, carcinoma folicular, neoplasia de células de Hiirthle, carcinoma medular y carcinoma anaplásico; neoplasias uterinas, incluido el cáncer de endometrio o sarcoma uterino.

En algunos casos, las células madre, por ejemplo, HSC se procesan, purifican, aíslan y/o concentran, por ejemplo, de un sujeto HLA compatible, y las HSC se trasplantan a otra persona, por ejemplo, un hermano del sujeto, en donde el hermano tiene cáncer. En algunos casos, las células madre hematopoyéticas trasplantadas muestran actividad antitumoral (tratamiento del cáncer de injerto contra tumor).

En algunos casos, Se usan células asesinas naturales (NK) en inmunoterapia, por ejemplo, para el cáncer, por ejemplo, leucemia. Se describen usos de las células NK, por ejemplo, en Grywacz et al. (2008) Use of natural killer cells as immunotherapy for leukaemia. Best Pract Res Clin Haematol. 3: 467-483 y Miller (2013) Therapeutic applications: natural killer cells in the clinic. Hematology 2013:247-253.

C. Diagnóstico de cáncer

En algunos casos, las células aisladas utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y kits descritos en el presente documento se utilizan para diagnosticar un cáncer descrito en el presente documento, por ejemplo, un cáncer de sangre, por ejemplo, leucemia, linfoma o mieloma. En algunos casos, la leucemia es leucemia linfoblástica aguda de adultos, leucemia linfoblástica aguda infantil, leucemia mieloide aguda de adultos, leucemia mieloide aguda infantil, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica o leucemia de células pilosas. En algunos casos, el linfoma es un linfoma relacionado con el SIDA, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin de adultos, linfoma de Hodgkin infantil, micosis fungoide, linfoma no Hodgkin de adultos, linfoma no Hodgkin infantil, linfoma primario del sistema nervioso central, síndrome de Sezary, linfoma cutáneo de células T o macroglobulinemia de Waldenstrom. En algunos casos, el cáncer de sangre es un trastorno mieloproliferativo crónico, histiocitosis de células de Langerhans, mieloma múltiple, neoplasia de células plasmáticas, un síndrome mielodisplásico, una neoplasia mielodisplásica/mieloproliferativa.

En algunos casos, los leucocitos se evalúan con un panel de investigación de leucemia y linfoma. En algunos casos, se utiliza un panel de investigación para buscar conjuntos de proteínas, por ejemplo, proteínas de la superficie celular y/o intracelulares que sirven como señalizadores para subtipos de leucocitos normales y neoplasias malignas hematológicas. En algunos casos, el panel se evalúa con citometría de flujo. El panel puede ser, por ejemplo, un panel de anticuerpos multicolor BD Euroflow (véase http://www.bdbiosciences.com/eu/documents/EuroFlow_datasheet_new.pdf). El señalizador en el panel de anticuerpos multicolor BD Euroflow puede ser, por ejemplo, CD-11c CD22, Cd 24, CD45, CD49d, CD 123, Igk, CD10, CD27, CD38, CD43, CD81, TCRyS, microglobulina (3-2, CD9, CD71, CD79b, 1gA, IREM-2 (CD300e), CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD16, CD16, CD20, CD23, CD36, CD38, CD41a, CD42a, CD45, CD56, CD64, CD105, CD138, CD200, IgA, IgK y HLA-DR. El marcador (por ejemplo, fluorocromo) asociado con el señalizador en el panel de anticuerpos multicolor BD Euroflow puede ser FITC, PE, V450, PE-Cy™7, PerCP-Cy5.5, APC-H7, V500-C, APC, PacB o PacO.

En algunos casos, los leucocitos recuperados usando dispositivos y/o métodos descritos en el presente documento se evalúan en análisis de células B (relación kappa y lambda). La comparación de la relación de kappa a lambda se puede utilizar para determinar si un sujeto podría tener un tumor de células plasmáticas, por ejemplo, mieloma múltiple, gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS), mieloma latente, plasmocitoma solitario del hueso o amiloidosis AL.

En algunos casos, se evalúa la producción de cadenas ligeras libres, que puede ser un pronóstico de un peor resultado en el mieloma múltiple o la leucemia linfocítica crónica.

D. Trastornos de la sangre

En algunos casos, las HSC procesadas (por ejemplo, procesadas o tratadas química y/o enzimáticamente), aisladas o concentradas se administran a un sujeto con un trastorno sanguíneo hereditario. El trastorno sanguíneo hereditario puede ser, por ejemplo, anemia aplásica, beta-talasemia, síndrome de Blackfan-Diamond, leucodistrofia de células globoides, anemia falciforme, inmunodeficiencia combinada grave, síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X o síndrome de Wiskott-Aldrich. Los errores innatos del metabolismo que pueden tratarse con trasplantes de médula ósea incluyen: síndrome de Hunter, síndrome de Hurler, síndrome de Lesch Nyhan y osteopetrosis. En algunos casos, el trastorno hereditario de la sangre es la anemia de Fanconi.

En algunos casos, Las HSC procesadas (por ejemplo, procesadas o tratadas químicamente), purificadas, aisladas o concentradas se administran a un sujeto para tratar un trastorno sanguíneo, por ejemplo, amiloidosis, anemia, trombocitopenia esencial, anemia de Fanconi, enfermedad de Gaucher, hemocromatosis, anemia hemolítica, hemofilia, hipereosinofilia, púrpura trombocitopénica idiopática, un síndrome hereditario de insuficiencia de la médula ósea, anemia con deficiencia de hierro, histiocitosis de células de Langerhans, leucopenia, mastocitosis, mielofibrosis, un trastorno mieloprofilerativo, anemia perniciosa, policitemia vera, porfiria, anemia de células falciformes, una talasemia, trombocitopenia, trombocitosis, púrpura trombocitopénica trombótica o enfermedad de von Willebrand.

En algunos casos, las partículas (por ejemplo, células) procesadas (por ejemplo, procesadas o tratadas química y/o enzimáticamente), purificadas, aisladas y/o concentradas usando métodos descritos en el presente documento se usan para diagnosticar un trastorno sanguíneo, por ejemplo, un trastorno sanguíneo descrito en el presente documento.

E. Enfermedad autoinmunitaria

Las células madre, por ejemplo, HSC procesadas (por ejemplo, procesadas o tratadas química y/o enzimáticamente), purificadas, aisladas y/o concentradas utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden administrar a un sujeto para tratar una enfermedad autoinmunitaria. En algunos casos, las células madre, por ejemplo, HSC purificadas, aisladas y/o concentradas utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits se pueden administrar a un sujeto con un trastorno autoinmunitario que afecta al corazón, cerebro, nervios, músculo, piel, ojo, articulaciones, pulmón, riñón, glándulas, el tracto digestivo o los vasos sanguíneos. En algunos casos, un trastorno autoinmunitario puede ser artritis reumatoide, enfermedad de Grave, tiroiditis, esclerodermia, esclerosis sistémica, vitíligo, lupus eritematoso sistémico (LES), alopecia areata, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmunitaria, dermatomiositis, diabetes (tipo 1), artritis idiopática juvenil, glomerulonefritis, síndrome de Guillain-Barre, púrpura trombocitopénica idiopática, miastenia grave, miocarditis, esclerosis múltiple, pénfigo/penfigoide, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, psoriasis, esclerodermia/esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, uveítis o granulomatosis con poliangitis (de Wegener).

F. Otros usos de las células madre

En algunos casos, las células madre procesadas (por ejemplo, procesadas o tratadas química y/o enzimáticamente), purificadas, aisladas y/o concentradas utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento pueden usarse para tratar enfermedades de Alzheimer, lesión de la médula espinal, ictus, quemaduras, enfermedad cardíaca u osteoartritis. En algunos casos, las células madre se pueden utilizar para tratar enfermedades cardiovasculares.

En algunos casos, las células madre se usan para tratar a un sujeto con una afección neurológica o neurocognitiva. La afección neurológica o neurocognitiva puede ser un trastorno neurológico que figura en la página web del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (www.ninds.nih.gov/disorders/disorder_index.htm). En algunas realizaciones, el sujeto puede tener un signo o síntoma. La afección o síntoma neurológico o neurocognitivo, puede ser, por ejemplo, abarognosis (por ejemplo, pérdida de la capacidad de detectar el peso de un objeto sostenido en la mano o de discernir la diferencia de peso entre dos objetos), enfermedad de la lipasa ácida, deficiencia de maltasa ácida, afasia epileptiforme adquirida, ausencia del septum pellucidum, encefalomielitis diseminada aguda, pupila de Adie, síndrome de Adie, adrenoleucodistrofia, agenesia del cuerpo calloso, agnosia, síndrome de Aicardi, trastorno del síndrome de Aicardi-Goutieres, SIDA - complicaciones neurológicas, acatisia, trastornos relacionados con el alcohol, enfermedad de Alexander, síndrome de la mano ajena (mano anárquica), aloquiria, enfermedad de Alper, mal de altura, hemiplejia alternante, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, anencefalia, aneurisma, síndrome de Angelman, angiomatosis, anoxia, síndrome antifosfolípido, afasia, apraxia, quistes aracnoideos, aracnoiditis, malformación de Arnold-Chiari, síndrome de Asperger, malformación arteriovenosa, ataxia, ataxias y degeneración cerebelar o espinocerebelar, ataxia telangiectasia, fibrilación auricular, ictus, trastorno por déficit de atención con hiperactividad, trastorno del procesamiento auditivo, autismo, disfunción autonómica, dolor de espalda, síndrome de Barth, enfermedad de Batten, miotonía de Becker, enfermedad de Behcet, parálisis de Bell, blefaroespasmo esencial benigno, amiotrofia focal benigna, hipertensión intracraneal benigna, síndrome de Bernhardt-Roth, polimicrogiria frontoparietal bilateral, enfermedad de Binswanger, blefaroespasmo, síndrome de Bloch-Sulzberger, lesiones de nacimiento del plexo braquial, lesión del plexo braquial, síndrome de Bradbury-Eggleston, tumor cerebral o espinal, abscesos cerebrales, aneurisma cerebral, daño cerebral, lesión cerebral, tumor cerebral, síndrome de Brown-Sequard, atrofia muscular bulboespinal, CADASIL (infartos subcorticales de arteriopatía cerebral autosómica dominante y leucoencefalopatía), enfermedad de Canavan, síndrome del túnel carpiano, causalgia, cavernomas, angioma cavernoso, malformación cavernosa, síndrome del cordón cervical central, síndrome del cordón central, síndrome de dolor central, mielinólisis pontina central, miopatía centronuclear, trastorno cefálico, deficiencia de ceramidasa, degeneración cerebelar, hipoplasia cerebelar, aneurisma cerebral, arteriosclerosis cerebral, atrofia cerebral, beriberi cerebral, malformación cavernosa cerebral, gigantismo cerebral, hipoxia cerebral, parálisis cerebral, vasculitis cerebral, síndrome cerebro-óculo-facio-esquelético (COFS), estenosis espinal cervical, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, malformación de Chiari, enfermedad por almacenamiento de ésteres de colesterol, corea, coreoacantocitosis, síndrome de fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), intolerancia ortostática crónica, dolor crónico, síndrome de Cockayne tipo II, síndrome de Coffin-Lowry, colpocefalia, coma, síndrome de dolor regional complejo, neuropatía por compresión, conmoción cerebral, diplejía facial congénita, miastenia congénita, miopatía congénita, malformaciones vasculares cavernosas congénitas, degeneración corticobasal, arteritis craneal, craneosinostosis, síndrome de Aicardi-Goutieres, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, trastornos de trauma acumulativo, síndrome de Cushing, enfermedad por cuerpos de inclusión citomegálica (CIBD), infección por citomegalovirus, síndrome de ojos y pies danzantes (síndrome opsoclonus myoclonus), síndrome de Dandy-Walker (DWS), enfermedad de Dawson, malestar de descompresión, síndrome de De Morsier, parálisis de Dejerine-Klumpke, enfermedad de Dejerine-Sottas, síndrome de fase de sueño retardada, demencia, demencia - infarto múltiple, demencia - semántica, demencia - subcortical, demencia con cuerpos de Lewy, ataxia cerebelar dentada, atrofia dentatorubral, depresión, dermatomiositis, dispraxia del desarrollo, síndrome de Devic, diabetes, neuropatía diabética, esclerosis difusa, síndrome de Dravet, disautonomía, discalculia, disgrafía, dislexia, disfagia, dispraxia, disinergia cerebelar mioclónica, disinergia cerebelar progresiva, distoma, distomas, epilepsia infantil temprana, síndrome de la silla turca vacía, encefalitis, encefalitis letárgica, encefalocele, encefalopatía, encefalopatía (familiar infantil), angiomatosis encefalotrigeminal, encopresis, epilepsia, hemiplejia epiléptica, parálisis de Erb, parálisis de Erb-Duchenne y Dejerine-Klumpke, eritromelalgia, temblor hereditario, mielinólisis extrapontina, enfermedad de Fabry, síndrome de Fahr, desmayos, disautonomia familiar, hemangioma familiar, calcificación familiar idiopática de los ganglios basales, parálisis periódicas familiares, parálisis espástica familiar, enfermedad de Farber, convulsiones febriles, displasia fibromuscular, fibromialgia, síndrome de Fisher, síndrome del bebé flácido, caída del pie, síndrome de Foville, ataxia de Friedreich, demencia frontotemporal, enfermedad de Gaucher, gangliosidosis generalizadas, síndrome de Gerstmann, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, neuropatía axonal gigante, arteritis de células gigantes, enfermedad de inclusión de células gigantes, leucodistrofia de células globoides, neuralgia glosofaríngea, enfermedad del almacenamiento de glucógeno, heterotopía de la materia gris, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hallervorden-Spatz, lesión craneal, dolor de cabeza, hemicránea continua, espasmo hemifacial, hemiplejia alterna, neuropatías hereditarias, paraplejia espástica hereditaria, heredopatía atáctica polineuritiformis, herpes zóster, herpes zoster ótico, síndrome de Hirayama, síndrome de Holmes-Adie, holoprosencefalia, mielopatía asociada a HTLV-1, infección por VIH, síndrome de Hughes, enfermedad de Huntington, hidranencefalia, hidrocefalia, hidrocefalia - presión normal, hidromielia, hipercortisolismo, hipersomnia, hipertensión, hipertonía, hipotonía, hipoxia, encefalomielitis inmunomediada, miositis por cuerpos de inclusión, incontinencia pigmentaria, hipotonía infantil, distrofia neuroaxonal infantil, enfermedad infantil por almacenamiento de ácido fitánico, enfermedad de Refsum infantil, espasmos infantiles, miopatía inflamatoria, miopatías inflamatorias, iniencefalia, lipodistrofia intestinal, quiste intracraneal, hipertensión intracraneal, síndrome de Isaac, síndrome de Joubert, síndrome de Karak, síndrome de Kearns-Sayre, enfermedad de Kennedy, síndrome de Kinsbourne, síndrome de Kleine-Levin, síndrome de Klippel Feil, síndrome de Klippel-Trenaunay (KTS), síndrome de Kluver-Bucy, síndrome amnésico de Korsakoff, enfermedad de Krabbe, enfermedad de Kugelberg-Welander, kuru, enfermedad de Lafora, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Landau-Kleffner, atrapamiento del nervio cutáneo femoral lateral, síndrome medular lateral (Wallenberg), dificultades de aprendizaje, enfermedad de Leigh, síndrome de Lennox-Gastaut, síndrome de Lesch-Nyhan, leucodistrofia, síndrome de Levine-Critchley, demencia con cuerpos de Lewy, enfermedades por almacenamiento de lípidos, proteinosis lipoide, lisencefalia, síndrome de enclaustramiento, enfermedad de Lou Gehrig, enfermedad del disco lumbar, estenosis espinal lumbar, lupus - secuelas neurológicas, enfermedad de Lyme - secuelas neurológicas, enfermedad de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelar tipo 3), macrencefalia, macropsia, megalencefalia, síndrome de Melkersson-Rosenthal, enfermedad de Meniere, meningitis, meningitis y encefalitis, enfermedad de Menkes, meralgia parestésica, leucodistrofia metacromática, trastornos metabólicos, microcefalia, micropsia, migraña, síndrome de Miller Fisher, mini-accidente cerebrovascular (ataque isquémico transitorio), misofonia, miopatía mitocondrial, síndrome de Mobius, síndrome de Moebius, amiotrofia monomélica, trastorno del estado de ánimo, enfermedad de las neuronas motoras, trastornos de las habilidades motoras, enfermedad de Moyamoya, mucolipidosis, mucopolisacaridosis, demencia por infarto múltiple, neuropatía motora multifocal, esclerosis múltiple, atrofia multisistémica, atrofia multisistémica con hipotensión ortostática, distrofia muscular, encefalomielitis miálgica, miastenia - congénita, miastenia grave, esclerosis difusa mielinoclástica, encefalopatía mioclónica de bebés, mioclonos, miopatía, miopatía - congénita, miopatía -tirotóxica, miotonía, miotonía congénita, miopatía miotubular, narcolepsia, neuroacantocitosis, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, neurofibromatosis, síndrome neuroléptico maligno, complicaciones neurológicas del SIDA, complicaciones neurológicas de la enfermedad de Lyme, consecuencias neurológicas de la infección por citomegalovirus, manifestaciones neurológicas del SIDA, Manifestaciones neurológicas de la enfermedad de Pompe, secuelas neurológicas de lupus, neuromielitis óptica, neuromiotonía, lipofuscinosis ceroide neuronal, trastornos de migración neuronal, neuropatía hereditaria, neurosarcoidosis, neurosífilis, neurotoxicidad, insulto neurotóxico, nevo cavernoso, enfermedad de Niemann-Pick, síndrome de sueño-vigilia no de 24 horas, trastorno del aprendizaje no verbal, hidrocefalia de presión normal, síndrome de O'Sullivan-McLeod, neuralgia occipital, secuencia oculta de disrafismo espinal, síndrome de Otahara, atrofia olivopontocerebelosa, opsoclono mioclono, síndrome de opsoclonomioclono, neuritis óptica, hipotensión ortostática, síndrome por sobreuso, dolor crónico, palinopsia, trastorno de pánico, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, paramiotonía congénita, enfermedades paraneoplásicas, parestesia, enfermedad de Parkinson, ataques paroxísticos, coreoatetosis paroxística, hemicránea paroxística, síndrome de Parry-Romberg, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, síndrome de Pena shokeir II, quistes perineurales, parálisis periódica, neuropatía periférica, leucomalacia periventricular, estado vegetativo persistente, trastornos profundos del desarrollo, reflejo de estornudo fótico, enfermedad por almacenamiento de ácido fitánico, enfermedad de Pick, pinzamiento de nervio, síndrome piriforme, tumores de la pituitaria, PMG, polio, polimicrogiria, polimiositis, enfermedad de Pompe, porencefalia, Síndrome pospoliomielítico, neuralgia posherpética (PHN), encefalomielitis posinfecciosa, hipotensión postural, síndrome de taquicardia ortostática postural, síndrome de taquicardia postural, síndrome de Prader-Willi, atrofia primaria del dentatum, esclerosis lateral primaria, afasia primaria progresiva, enfermedades priónicas, atrofia hemifacial progresiva, ataxia locomotora progresiva, leucoencefalopatía multifocal progresiva, Poliodistrofia esclerosante progresiva, parálisis supranuclear progresiva, prosopagnosia, síndrome pseudo-Torch, síndrome de pseudotoxoplasmosis, pseudotumor cerebral, rabia, síndrome de Ramsay Hunt tipo I, síndrome de Ramsay Hunt tipo II, síndrome de Ramsay Hunt tipo III, encefalitis de Rasmussen, distrofia neurovascular refleja, síndrome de distrofia simpática refleja, enfermedad de Refsum, enfermedad de Refsum - infantil, trastornos de movimientos repetitivos, lesión por estrés repetitivo, síndrome de piernas inquietas, mielopatía asociada a retrovirus, síndrome de Rett, síndrome de Reye, encefalitis reumática, trastorno del movimiento rítmico, síndrome de Riley-Day, síndrome de Romberg, quistes de la raíz del nervio sacro, baile de san vito, enfermedad de las glándulas salivales, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, esquizencefalia, esquizofrenia, enfermedad de Seitelberger, trastorno convulsivo, demencia semántica, disfunción de integración sensorial, displasia septoóptica, epilepsia mioclónica grave de la infancia (SMEI), síndrome del bebé sacudido, culebrilla, síndrome de Shy-Drager, síndrome de Sjogren, apnea del sueño, enfermedad del sueño, snatiation, síndrome de Sotos, espasticidad, espina bífida, infarto de la médula espinal, lesión de la médula espinal, tumor de la médula espinal, atrofia muscular espinal, ataxia espinocerebelar, atrofia espinocerebelosa, degeneración espinocerebelosa, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, síndrome de la persona rígida, degeneración estriatonigral, ictus, síndrome de Sturge-Weber, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalopatía arterioesclerótica subcortical, dolor de cabeza SUNCT, siderosis superficial, trastornos de la deglución, corea de Sydenham, síncope, sinestesia, esclerosis espinal sifilítica, siringohidromielia, siringomielia, lupus eritematoso sistémico, tabes dorsal, discinesia tardía, disfrenia tardía, quiste de Tarlov, síndrome del túnel tarsal, enfermedad de Tay-Sachs, arteritis temporal, tétanos, síndrome de médula espinal anclada, enfermedad de Thomsen, miotonía de Thomsen, síndrome de la salida torácica, miopatía tirotóxica, tic doloroso, parálisis de Todd, síndrome de Tourette, encefalopatía tóxica, ataque isquémico transitorio, encefalopatía espongiforme transmisible, mielitis transversa, lesión cerebral traumática, temblor, neuralgia del trigémino, paraparesis espástica tropical, síndrome de Troyer, tripanosomiasis, esclerosis tuberosa, ubisiosis, uremia, tumor eréctil vascular, síndromes de vasculitis del sistema nervioso central y periférico, encefalomielitis de Viliuisk (VE), enfermedad de von Economo, enfermedad de von Hippel-Lindau (VHL), enfermedad de von Recklinghausen, síndrome de Wallenberg, enfermedad de Werdnig-Hoffman, síndrome de Wernicke-Korsakoff, síndrome de West, latigazo, enfermedad de Whipple, síndrome de Williams, enfermedad de Wilson, enfermedad de Wolman, Atrofia muscular espinal y bulbar ligada al cromosoma X, o síndrome de Zellweger.

G. Microscopía

En algunos casos, las partículas que se procesan (por ejemplo, se procesan o se tratan química y/o enzimáticamente), purifican, aíslan y/o concentran utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento (por ejemplo, células) se pueden analizar mediante microscopía. En algunos casos, la microscopía puede ser microscopía óptica, electrónica o de sonda de barrido. En algún caso, la microscopía óptica comprende el uso de campo brillante, iluminación oblicua, luz contrapolarizada, tinción de dispersión, campo oscuro, contraste de fase, contraste de interferencia diferencial, microscopía de reflexión de interferencia, fluorescencia (por ejemplo, cuando las partículas, por ejemplo, células, están inmunoteñidas), confocal, microscopía de iluminación de un solo plano, microscopía de fluorescencia de haz de luz, deconvolución o microscopía amplificada codificada en tiempo en serie.

En algunos casos, la microscopía electrónica comprende la microscopía electrónica de transmisión (TEM) o la microscopía electrónica de barrido (SEM).

En algunos casos, un microscopio de sonda de barrido comprende un microscopio de fuerza atómica, un microscopio de barrido de efecto túnel o un microscopio de fuerza fotónica.

En algunos casos, un microscopio es un microscopio de fuerza ultrasónico (UFM).

En algunos casos, la microscopía comprende microscopía ultravioleta. En algunos casos, la microscopía comprende microscopía infrarroja. En algunos casos, la microscopía comprende microscopía holográfica digital, patología digital (microscopía virtual) o microscopía láser.

En algunos casos, un microscopio está en comunicación fluida con un dispositivo para tratamiento y/o purificación descrito en el presente documento. En algunos casos, un microscopio está en comunicación fluida con un dispositivo para tratamiento y/o purificación, en donde el microscopio está aguas abajo de un dispositivo para tratamiento y/o purificación. En algunos casos, un microscopio está en comunicación fluida con un dispositivo para tratamiento y/o purificación aguas arriba del dispositivo para purificación. En algunos casos, el microscopio está en comunicación fluida con un dispositivo para tratamiento y/o purificación aguas arriba y aguas abajo del dispositivo para tratamiento y/o purificación. En algunos casos, el microscopio está configurado para permitir la visualización de un dispositivo para el tratamiento y/o purificación descritos en el presente documento.

H. Citometría de flujo

En algunos casos, las partículas (por ejemplo, células) que se procesan (por ejemplo, se procesan o tratan química y/o enzimáticamente), purifican, aíslan y/o concentran utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento pueden analizarse mediante citometría de flujo. La manipulación de células en dispositivos en un citómetro de flujo se puede lograr usando fuerzas hidrodinámicas. Se puede inyectar una suspensión de partículas (por ejemplo, células) en el centro de un fluido envolvente que fluye. En algunos casos, las fuerzas del fluido envolvente circundante confinan la corriente de muestra a un núcleo estrecho que puede transportar células a través de la trayectoria de un láser que puede excitar los fluoróforos asociados y crear un patrón de dispersión.

La citometría de flujo puede comprender la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En algunos casos, una muestra se somete a citometría de flujo, por ejemplo, FACS, antes de que la muestra se aplique al dispositivo para el tratamiento y/o purificación descritos en el presente documento. En algunos casos, el citómetro de flujo está en comunicación fluida con un dispositivo para tratamiento y/o purificación descrito en el presente documento; en algunos casos, el citómetro de flujo está conectado de forma fluida aguas arriba de un dispositivo para tratamiento y/o purificación; en algunos casos, el citómetro de flujo está conectado de forma fluida aguas abajo de un dispositivo para el tratamiento y/o purificación descritos en el presente documento. En algunos casos, el citómetro de flujo está conectado de forma fluida aguas arriba y aguas abajo de un dispositivo para el tratamiento y/o purificación descritos en el presente documento.

En algunos casos, las partículas (por ejemplo, células) que se analizan mediante citometría de flujo están marcadas. En algunos casos, las partículas (por ejemplo, células) que se analizan mediante citometría de flujo se marcan usando un dispositivo de "lavado de coches" tal como se proporciona en el presente documento. Las partículas pueden ser células. El marcaje de las células puede ser un marcaje de superficie y/o un marcaje intracelular. En algunos casos, las partículas se marcan con un fluoróforo. En algunos casos, un fluoróforo se une a un anticuerpo y el anticuerpo se une a una partícula (por ejemplo, una célula). En algunos casos, un anticuerpo puede unirse a una membrana celular. En algunos casos, una partícula se marca con un punto cuántico.

Se puede utilizar FACS para clasificar una mezcla heterogénea de partículas, por ejemplo, células, en dos o más recipientes. La FACS puede basarse en las características de dispersión de luz y fluorescentes de cada tipo de célula. Una suspensión de partículas (por ejemplo, células) se puede arrastrar en una corriente de flujo de líquido. Puede haber separación entre partículas en el líquido. La corriente de partículas (por ejemplo, células) se puede romper en gotículas (por ejemplo, mediante un mecanismo de vibración). En algunos casos, solo hay una partícula (por ejemplo, una célula) en cada gotícula. En algunos casos, antes de que la corriente se rompa en gotículas, el líquido pasa a través de una estación de medición de fluorescencia. Se pueden medir las características de fluorescencia. Se puede dar una carga a cada gotícula en función de la medición de fluorescencia, y las gotículas cargadas pueden pasar a través de un sistema de deflexión electrostática que puede desviar las gotas a contenedores según la carga.

En algunos casos, los leucocitos recuperados usando los métodos y/o dispositivos descritos en el presente documento se tiñen con antiappa-FITC (isotiocianato de fluoresceína), anti-Lamda-PE (ficoeritrina), 7AAD-PerCP y/o CD-19-APC (aloficocianina), CD-45-APC-Cy7. Se puede utilizar un citómetro de flujo para procesar y/o analizar partículas, por ejemplo, células.

I. Enfoque acústico

En algunos casos, las partículas procesadas, por ejemplo, procesadas o tratadas química y/o enzimáticamente), purificadas, aisladas y/o concentradas utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se someten a un citómetro de flujo de enfoque acústico (por ejemplo, citómetro de flujo de enfoque acústico Attune®; Life Technologies™). En algunos casos, se utiliza un enfoque acústico en una muestra antes de que la muestra se aplique a un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos ordenados. Pueden usarse múltiples nodos de partículas enfocadas acústicamente. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 8830451. En algunos casos, se utiliza un nodo focal.

La citometría de enfoque acústico puede usar ondas ultrasónicas (por ejemplo, de más de 2 MHz) en lugar de fuerzas hidrodinámicas para colocar las células en una línea enfocada a lo largo de un eje central de un capilar. (véase, por ejemplo, www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometers/attuneacoustic-focusing-flow-cytometer/acoustic-focusing-technology-overview.htm). El enfoque acústico puede ser independiente de la tasa de entrada de muestra. El enfoque acústico puede permitir que las células estén bien enfocadas en un punto de interrogación láser. El enfoque acústico puede realizarse sin fluido envolvente de alta velocidad o gran volumen. En algunos casos, unas bombas de jeringa volumétricas pueden permitir el recuento celular absoluto sin perlas.

En algunos casos, la resonancia acústica se impulsa por un dispositivo piezoeléctrico.

El enfoque acústico puede hacer uso de una celda óptica para la interrogación de muestras, uno o más láseres y electrónica para recoger información de fluorescencia y/o dispersión. En algunos casos, el enfoque acústico hace uso de una bomba, por ejemplo, una bomba de jeringa. En algunos casos, la frecuencia utilizada en el enfoque acústico es de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,09, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5 o 6 MHz.

En algunos casos, el caudal en un citómetro de enfoque acústico es de al menos 10, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 pl/min.

J. Análisis de ácidos nucleicos o proteínas

En algunos casos, una partícula (por ejemplo, ácido nucleico y/o proteína) procesada (por ejemplo, procesada o tratada química y/o enzimáticamente), purificada, aislada y/o concentrada utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se puede analizar usando una o más de las siguientes técnicas: pruebas genéticas utilizando determinación de cariotipo con bandeo G, prueba de X frágil, micromatriz cromosómica (CMA, también conocida como hibridación genómica comparativa (CGH)) (por ejemplo, para analizar deleciones y/o duplicaciones genómicas submicroscópicas), hibridación genómica comparativa basada en matrices, detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) con matrices, hibridación subtelomérica fluorescente in situ (ST-FISH) (por ejemplo, para detectar variantes submicroscópicas de número de copias (CNV)), determinación del perfil de expresión, micromatriz de ADN, micromatriz de oligonucleótidos de alta densidad, matriz de expresión de ARN de genoma completo, micromatriz de péptidos, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), secuenciación del genoma, secuenciación de novo, secuenciación 454 (Roche), pirosecuenciación, secuenciación de una sola molécula verdadera de Helicos, secuenciación SOLiD ™ (Applied Biosystems, Life Technologies), secuenciación SOLEXA (secuenciación Illumina), nanosecuenciación, secuenciación de matriz de transistores de efecto de campo sensibles a productos químicos (chemFET) (Ion Torrent), secuenciación de semiconductores de iones (Ion Torrent), secuenciación de nanoesferas de ADN, secuenciación de nanoporos, secuenciación SMRT de Pacific Biosciences, secuenciación de ADN de una sola molécula de nanoporos de Genia Technologies, secuenciación de ADN de una sola molécula de Oxford Nanopore, secuenciación con polonio, secuenciación del análisis de variación del número de copias (CNV), análisis de polimorfismo de nucleótidos pequeños (SNP), inmunohistoquímica (IHC), inmunocitoquímica (ICC), espectrometría de masas, espectrometría de masas en tándem, espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS), hibridación in situ, hibridación in situ fluorescente (FISH), hibridación cromogénica in situ (CISH), hibridación in situ con plata (SISH), reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR digital (dPCR), PCR con transcripción inversa, Pc R cuantitativa (Q-PCR), qPCR de señalizador único, PCR en tiempo real, Análisis nCounter (Nanostring Technology), transferencia de Western, transferencia de Southern, SDS-PAGE, electroforesis en gel o transferencia de Northern. En algunos casos, el análisis comprende la secuenciación del exoma.

En algunos casos, el ácido nucleico se analiza utilizando tecnología de Sage Sciences, Inc. En algunos casos, el análisis comprende el dimensionamiento del ADN. En algunos casos, el dimensionamiento del ADN se realiza con casetes de gel desechables con agarosa prefabricada (Pippin, Sage Sciences).

En algunos casos, el ácido nucleico se analiza usando secuenciación del genoma de representación reducida. En algún caso, el ácido nucleico se analiza usando RADseq (secuenciación de ADN asociada al sitio de restricción). El ADN se separa a lo largo de una columna de gel hasta que un fragmento programado alcanza un punto de ramificación. A continuación, se cambia un electrodo activo para desviar el ADN a una cámara de tampón unida a la membrana. Cuando se ha recogido un intervalo de tamaños, un electrodo activo se cambia de nuevo a un canal de separación. La muestra deseada se puede extraer con una pipeta. El tamaño del ADN puede ser de 90 pb a 1,5 kb (Pippen Prep) y de 50 pb a 50 kb (BluePippen). Pippen Pulse puede ser una fuente de alimentación de electroforesis de campo pulsado que se puede utilizar con geles analíticos que pueden permitir a los usuarios resolver el ADN hasta 100 kb y más.

En algunos casos, se puede utilizar un SageELF (fraccionadores laterales electroforéticos) para el fraccionamiento de muestras completas para ADN y/o proteínas. Una muestra de ADN o proteína completa se puede fraccionar simultáneamente en al menos 12 fracciones de tamaño continuo. El ADN y/o las proteínas se separan por tamaño en una columna de separación de agarosa. Después de la separación, se puede activar un segundo conjunto de electrodos colocados lateralmente para electroeluir muestras en cámaras.

K. Secuenciación de última generación

En algunos casos, un ácido nucleico (polinucleótido) procesado (por ejemplo, procesado o tratado química y/o enzimáticamente), purificado, aislado y/o concentrado utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se analiza usando secuenciación de última generación. En algunos casos, la secuenciación de última generación comprende Helicos T rue Single Molecule Sequencing (tSMS) (véase, por ejemplo, Harris T.D. et al. (2008) Science 320:106-109); 454 sequencing (Roche) (véase, por ejemplo, Margulies, M. et al. 2005, Nature, 437, 376-380); tecnología SOLiD (Applied Biosystems); secuenciación SOLEXA (Illumina); tecnología de molécula única en tiempo real (SMRT™) de Pacific Biosciences; o secuenciación de nanoporos (Soni GV y Meller A. (2007) Clin Chem 53: 1996-2001; Oxford Nanopore, Genia Technologies y Nabsys); secuenciación de semiconductores (Ion Torrent (Life Technologies); Personal Genome Machine); secuenciación de nanoesferas de ADN (por ejemplo, Complete Genomics); secuenciación utilizando tecnología de Dover Systems (Polonator). Se describen métodos de secuenciación de última generación, por ejemplo, en la Publicación PCT N.° WO2012149472.

L. Construcción de bibliotecas de ácidos nucleicos

En algunos casos, los ácidos nucleicos procesados, por ejemplo, procesados o tratados química y/o enzimáticamente), purificados, aislados y/o concentrados utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se utilizan para construir una biblioteca, por ejemplo, una biblioteca de secuenciación de última generación. Un líquido que contiene ácido nucleico (por ejemplo, células, núcleos) puede hacerse fluir a través de un canal en un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. La matriz de obstáculos se puede configurar para desviar partículas de un tamaño predeterminado (tamaño crítico) en una trayectoria de flujo que es diagonal a la dirección del flujo general de fluido. Las partículas más pequeñas se pueden dirigir con el flujo general de fluido. Se pueden añadir adaptadores a los ácidos nucleicos antes de que los ácidos nucleicos fluyan a través de un dispositivo, mientras los ácidos nucleicos fluyen a través de un dispositivo o después de que los ácidos nucleicos hayan fluido a través de un dispositivo. En algunos casos, los adaptadores son compatibles con la secuenciación mediante secuenciación Ilumina o secuenciación 454. Los adaptadores pueden comprender secuencias complementarias a uno o más cebadores de secuenciación. Los ácidos nucleicos más grandes y/o más pequeños que un tamaño crítico se pueden usar para la formación de bibliotecas, por ejemplo, formación de bibliotecas de secuenciación de última generación.

En algunos casos, los ácidos nucleicos se amplifican antes de fluir a través de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, los ácidos nucleicos se amplifican después de fluir a través de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, se amplifican partículas de al menos un tamaño crítico después de fluir a través de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, las partículas de menos de un tamaño crítico se amplifican después de fluir a través de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos.

En algunos casos, los adaptadores comprenden códigos de barras. Los códigos de barras se pueden utilizar para identificar una muestra, organismo o célula de la que procede un ácido nucleico.

Se describen métodos para la formación de bibliotecas de secuenciación de última generación en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20130079251.

M. cultivo celular

En algunos casos, las células procesadas (procesadas o tratadas química y/o enzimáticamente), purificadas, aisladas y/o los kits descritos en el presente documento se utilizan para cultivo celular. En algunos casos, las células aisladas, por ejemplo, las células madre, se pueden diferenciar en cultivo. En algunos casos, las células madre aisladas, purificadas y/o concentradas se utilizan para expansión ex vivo. En algunos casos, la célula madre se somete a expansión ex vivo purificada.

En algunos casos, se usa una HSC para dar lugar a células sanguíneas, por ejemplo, glóbulos rojos, linfocitos B, linfocitos T, células asesinas naturales, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos y macrófagos. Una célula madre mesenquimatosa puede dar lugar a, por ejemplo, células óseas (osteocitos), células de cartílago (condrocitos), células grasas (adipocitos) y otros tipos de células del tejido conectivo, tales como las de los tendones. Una célula madre neural puede dar lugar a, por ejemplo, células nerviosas (neuronas) y dos categorías de células no neuronales, por ejemplo, astrocitos y oligodendrocitos. En algunos casos, la célula madre es una célula madre epitelial. Una célula madre epitelial puede revestir el tracto digestivo y puede aparecer en criptas profundas. Una célula madre epitelial puede dar lugar a células absorbentes, células caliciformes, células de Paneth y/o células enteroendocrinas. En algunos casos, la célula madre es una célula madre de la piel. Una célula madre de la piel puede aparecer en la capa basal de la epidermis y en la base de los folículos pilosos. Una célula madre epidérmica puede dar lugar a queratinocitos, que pueden migrar a la superficie de la piel y formar una capa protectora. Las células madre foliculares pueden dar lugar tanto al folículo piloso como a la epidermis.

En algunos casos, las células se cultivan en medio sin suero. En algunos casos, el cultivo celular comprende uno o más factores de crecimiento. En algunos casos, el medio de cultivo comprende el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), azida de sodio, ácido ascórbico, medio basal alfa-MEM, medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), L-glutamina, aminoácidos no esenciales MEM, 2-mercaptoetanol, bicarbonato de sodio, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (p-HEMA), NaOH, Percoll, PBS, PBS (sin calcio ni magnesio), gelatina de piel porcina, tipo A, EDTA, EDTA 0,5 M, pH 8,0, MTG, monotioglicerol, suero bovino fetal definido, tripsina 0,05 %/EDTa 0,5 mM, colagenasa tipo IV, Neupogen, Leukina, M-CSF humano, FGF-basi humano, ligando de Flt3 humano, Il-1beta humano, IL-3 humano, IL-4 humano, IL-5 humano, sRANKL humano, TGF-beta1 humano, TNF-alfa humano, 1 alfa, 25-dihidroxivitamina D3, solución de azul tripán, 0,4 %, aceite de inmersión, 7-aad, 7-aminoactinomicina D, fracción V de albúmina de suero bovino y/o etanol.

En algunos casos, se utilizan anticuerpos para analizar la diferenciación de progenitores hematopoyéticos y los linajes mieloides a partir de células madre pluripotentes humanas. Los anticuerpos pueden incluir anti-CD1a humano, anti-CD2 humano, anti-CD3 humano, anti-CD3 humano, anti-CD7 humano, anti-CD10 humano, anti-CD11b humano, anti-CD13 humano, anti-CD14 humano, anti-CD15 humano, anti-CD16 humano, anti-CD16 humano, anti-CD19 humano, anti-CD34 humano, anti-CD41a humano, anti-CD45 humano, anti-CD64 humano, anti-CD66b humano, anti-CD90 humano (Thy-1) anti-CD115 humano, anti-CD117 humano, anti-CD123 humano, anti-CD163 humano o anti-CD235a humano. Se describe la diferenciación hematopoyética de células madre, por ejemplo, en crm.nih.gov/stemcell_types/HSC/UWisc_HSC.asp.

En algunos casos, se comparan leucocitos totales y tres poblaciones principales (linfocitos, monocitos y granulocitos) con el recuento del analizador hematológico ABX.

VIII. Sistemas

En algunos casos, los dispositivos que comprenden una matriz de obstáculos como se describe en el presente

documento son parte de un sistema. En algunos casos, el sistema comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,

12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 dispositivos que están acoplados, por ejemplo, acoplados de forma fluida. En

algunos casos, una cámara o depósito está aguas arriba de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos.

La cámara o depósito puede comprender una muestra. Una primera cámara o depósito se puede acoplar de forma

fluida a una segunda cámara. La segunda cámara o depósito se puede utilizar para manipular partículas, por ejemplo,

partículas marcadoras.

En algunos casos, un sistema comprende una cámara de reacción. En una cámara de reacción, las partículas pueden

hacerse reaccionar, por ejemplo, las células se pueden marcar, por ejemplo, con un anticuerpo fluorescente. En

algunos casos, las células se lisan en una cámara de reacción. En algunos casos, un reactivo de lisis celular

comprende un detergente. En algunos casos, el detergente comprende Triton X-100, SDS, CHAPS o Tween-20.

En algunos casos, el sistema comprende una bomba. En algunos casos, una bomba está conectada de forma fluida

a una entrada o salida de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. La bomba se puede conectar a un

dispositivo que comprende una matriz de obstáculos directa o indirectamente. En algunos casos, la bomba está

conectada a una cámara, por ejemplo, una cámara de reacción.

En algunos casos, el sistema comprende un medio para propulsar partículas a través de un dispositivo o cámara. En

algunos casos, se usan fuerzas eléctricas, electroforéticas, electro-osmóticas, centrífugas, gravitacionales,

hidrodinámicas, de gradiente de presión o capilares para impulsar partículas o fluidos.

En algunos casos, un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos está conectado de forma fluida a un aparato

aguas abajo. En algunos casos, el aparato de aguas abajo permite el análisis de partículas desde una salida del

dispositivo. En algunos casos, el aparato aguas abajo es un microscopio, citómetro de flujo, máquina de secuenciación,

máquina de secuenciación de última generación, espectrómetro de masas, HPLc , cromatógrafo de gases,

espectrómetro de absorción atómica, detector de fluorescencia, contador de radiactividad, contador de centelleo o

espectrofotómetro, contador de células o coagulómetro.

En algunos casos, el sistema comprende un ordenador. Un ordenador puede estar en comunicación eléctrica con un

dispositivo que comprende una matriz de obstáculos.

En algunos casos, una muestra se filtra antes de aplicarse a un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos.

En algunos casos, una muestra pasa a través de un filtro después de que la muestra ha pasado a través de un

dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, un sistema de filtración está en comunicación

fluida con un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, un sistema de filtración no está

en comunicación fluida con un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, el filtro es un

filtro de jeringa. En algunos casos, el filtro comprende un tamaño de poro de 0,2 micrómetros o 0,45 micrómetros. En

algunos casos, el filtro comprende un filtro de 20 micrómetros. En algunos casos, el filtro comprende un tamaño de

poro de al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9,

9.5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24,

25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 5 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 8 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o 200 micrómetros.

En algunos casos, el filtro comprende un tamaño de poro de menos de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5,

16.5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,

73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o 200

micrómetros.

En algunos casos, el filtro comprende un tamaño de poro de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9,

1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5,

16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 6 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 1 micrómetros.

Se describen sistemas, por ejemplo, en la Publicación PCT N.° WO2012024194.

En algunos casos, una pluralidad de dispositivos, por ejemplo, chips microfluídicos, se pueden hacer funcionar

simultáneamente con un módulo. En algunos casos, la pluralidad de dispositivos (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6,

7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 100 o 200) se pueden hacer funcionar simultáneamente con un módulo. En

algunos casos, se puede colocar una pluralidad de dispositivos dentro de un módulo, en donde cada dispositivo

comprende al menos un canal que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, la aplicación de muestra,

la aplicación de tampón, el flujo de muestra, el flujo de tampón y/o la recolección de salida en cada uno de los dispositivos se pueden controlar por el módulo.

En algunos casos, el módulo es un instrumento de sobremesa como se muestra en la FIG. 30. En algunos casos, el módulo está acoplado electrónicamente a un ordenador. En algunos casos, el módulo está acoplado con uno o más componentes, por ejemplo, microscopio, citómetro de flujo, máquina de secuenciación de última generación, etc.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento puede ser parte de un sistema. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento es parte de un sistema para procesar y analizar partículas. El sistema puede comprender: una pluralidad de depósitos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento y un dispositivo analítico. El depósito puede comprender una muestra que comprende partículas, un tampón de lavado o un reactivo. El dispositivo puede ser cualquier dispositivo tal como se proporciona en el presente documento. El dispositivo puede estar en comunicación fluida con cada uno de la pluralidad de depósitos. El dispositivo se puede adaptar para procesar partículas de la muestra que comprende partículas. En algunos casos, el procesamiento comprende hacer fluir la muestra que comprende partículas desde un depósito que comprende la muestra a una entrada de un dispositivo y hacer pasar las partículas a través del dispositivo. El paso puede comprender hacer fluir las partículas desde la entrada a través de una pluralidad de corrientes de flujo paralelas dentro del dispositivo, en donde al menos una de las corrientes de flujo paralelas comprende un reactivo que fluye desde al menos uno de la pluralidad de depósitos, y en donde el dispositivo comprende una matriz de obstáculos, con lo que el paso de las partículas a través del dispositivo sirve para procesar las partículas así como para separar las partículas por tamaño. El dispositivo analítico puede estar en comunicación fluida con al menos uno de una pluralidad de puertos de salida del dispositivo. El dispositivo analítico se puede configurar para realizar un análisis de partículas procesadas por el dispositivo. En algunos casos, el dispositivo analítico puede ser cualquier aparato aguas abajo descrito en el presente documento. En algunos casos, el dispositivo analítico puede ser un dispositivo que realice cualquiera de los análisis descritos en el presente documento. En un caso, el dispositivo analítico puede ser un clasificador de células, por ejemplo, un citómetro de flujo.

Algunos procesos manuales pueden ser propensos a errores. Por ejemplo, un proceso manual puede introducir reactivos citotóxicos, puede ofrecer rendimientos celulares bajos, puede perder células selectivamente, puede necesitar mucho tiempo y puede requerir una considerable habilidad y experiencia humana para generar una muestra uniforme que tenga un alto rendimiento, pureza y viabilidad. En sangre humana no fraccionada, los glóbulos rojos (RBC) pueden superar en gran medida el número de plaquetas y glóbulos blancos (WBC) en aproximadamente 650:40:1, respectivamente. En algunos casos, una fracción de glóbulos blancos se enriquece mediante (1) destrucción de la fracción de RBC (lisis hipotónica de RBC), 2) separación de células usando un gradiente de densidad (por ejemplo, Ficoll-Hypaque), o 3) usando partículas inmunomagnéticas.

IX. Dispositivos y sistemas

Se puede desarrollar un conjunto de productos para procesar muestras de sangre utilizando microchips de varios diseños que se describen en el presente documento. Estos microchips pueden diseñarse para manejar diferentes tipos de muestras y aplicaciones y tener diferentes formas.

Se puede utilizar un "sistema de preparación de muestras" (SPS). El SPS puede integrarse y optimizarse, y comprende un instrumento que impulsa corrientes fluídicas desde una serie de consumibles de chip DLD microfluídico junto con protocolos operativos de instrumentos que pueden proporcionar diferentes funcionalidades, dependiendo de los requisitos de la aplicación.

El instrumento puede ser el "controlador" de los microchips y puede proporcionar fluidos de entrada/salida, depósitos de tampón/reactivo y software de automatización para hacer funcionar los chips. El número de entradas y salidas de fluidos se puede determinar según los requisitos de cada ensayo. El software puede automatizar la configuración, operación y apagado del sistema.

Se puede ofrecer una serie de chips microfluídicos con niveles específicos de capacidad para maximizar la flexibilidad en el cumplimiento de los requisitos del cliente. El diseño del chip y los protocolos asociados pueden producir un producto discreto. El chip se puede integrar en un cartucho que se ajusta al instrumento. La geometría del chip se puede determinar según los requisitos de rendimiento funcional, es decir, el número de muestras por chip, volumen de muestra y tiempo de procesamiento. Los diseños de chips pueden acomodar múltiples muestras independientes según los requisitos del usuario y el coste por muestra.

En los ejemplos 13, 14 y 15 se describen ejemplos del sistema de preparación de muestras 1.0 (SPS 1.0). En los ejemplos 16, 17, 18 y 19 se describen ejemplos del sistema de preparación de muestras (SPS 2.0/Car Wash). Pueden comprender un instrumento, un conjunto de chips y protocolos de procesamiento. SPS 2.0 puede realizar múltiples etapas de procesamiento celular, análogas a un "lavado de coches" de múltiples etapas. Conceptualmente similar a un coche que se mueve a través de un lavado de coches que puede someterse a múltiples tratamientos secuenciales (por ejemplo, lavado, aclarado, encerado, secado), las células que fluyen a través del chip pueden ser guiadas suavemente por la geometría de los postes a través de una secuencia programable de tampones y reactivos para marcarlas, fijarlas, permeabilizarlas y lavarlas mientras se retiran los glóbulos rojos (RBC), las plaquetas y las partículas más pequeñas. Este proceso puede producir una preparación "limpia" de células diana que pueden proporcionar resultados de citometría de flujo de alta calidad. La FIG.47 y el Ejemplo 24 proporcionan una descripción general de los productos.

Existe la necesidad de nuevos métodos para mejorar la eficiencia de la preparación de muestras para el método analítico de citometría de flujo ampliamente utilizado. La citometría de flujo multiparamétrica puede ser una tecnología poderosa y ampliamente utilizada en investigación y en pruebas de diagnóstico clínico para el cáncer y muchas otras enfermedades (12-14). Por ejemplo, la citometría de flujo puede ser una herramienta de apoyo analítica vital para el análisis de subconjuntos de células y la cuantificación de citocinas basada en microesferas en el campo emergente de la inmunoterapia para el cáncer (15). Otras aplicaciones clínicas emergentes y de investigación importantes pueden incluir la clasificación celular para la genómica unicelular, proteómica y metabolómica (17), análisis de subpoblaciones para cáncer y enfermedades inmunológicas (18) y evaluación del riesgo cardiovascular (19).

La tecnología de procesamiento microfluídico de células descrita en el presente documento puede proporcionar alternativas a los métodos actuales de procesamiento de células (20). Los procesos de chips DLD microfluídicos pueden recoger células de un flujo de fluido en función del tamaño (21). Las partículas por encima de un cierto tamaño crítico (por ejemplo, los glóbulos blancos (WBC)) pueden "impactar" con los postes para fluir en una dirección a lo largo del eje de la matriz inclinada (por lo tanto, el dispositivo puede denominarse "matriz de impacto"; FIG. 17). Las partículas más pequeñas y moléculas disueltas, tales como glóbulos rojos (RBC), plaquetas, constituyentes del suero solubles y en forma de partículas, Mab y reactivos químicos pueden fluir en línea recta, en promedio, con la corriente de fluido. Por tanto, después de desplazarse a través del chip microfluídico, las células más grandes pueden haber salido y pueden haberse alejado de la corriente de fluido de la mezcla de entrada original y pueden recogerse por separado. El proceso se puede utilizar para retirar una gama de objetos de un fluido de entrada, que varían desde grandes oligómeros de ADN (-100 kpb) hasta E. coli y otras bacterias, plaquetas, glóbulos rojos (RBC) y glóbulos blancos (WBC) (21-23). El tamaño crítico que determina qué trayectoria siguen las celdas u otros objetos se puede controlar mediante el diseño de la matriz de micropostes (por ejemplo, el tamaño y la forma de los postes, espacios entre postes, el ángulo de inclinación del eje) (24).

Los métodos, dispositivos y sistemas proporcionados en el presente documento pueden realizar el marcaje y lavado en el chip de glóbulos blancos (WBC), después de recogerlos de una corriente de entrada de sangre completa en el mismo chip, pasándolos a través de una corriente de rodamina 6G, aunque los resultados no se cuantificaron (28). También se describe en el presente documento un concepto de "pared separadora" que puede tanto confinar las células a la corriente de proceso central durante más tiempo como ralentizar la difusión de los reactivos (28).

Ejemplos

Ejemplo 1: Fabricación

Se fabrican chips utilizando grabado profundo con iones reactivos (DRIE) altamente anisotrópico en sustratos pulidos de silicio cristalino utilizando un proceso "Bosch" que alterna entre las etapas de grabado y pasivación de la pared lateral, de modo que la pared lateral del poste difiere de la vertical solo en ~ 1 °. La litografía óptica define los patrones. Se micromecanizan orificios pasantes a través del sustrato que permiten la carga/descarga de fluido desde la parte trasera, que están acoplados a una plantilla de plástico con conectores a las fuentes de entrada y la recolección de salida. El chip se pretrata con copolímero Triblock F108 (2 g/l) para reducir la adhesión celular. Los parámetros de diseño del chip (por ejemplo, tamaño crítico para el comportamiento de impacto) se ajustan para obtener un alto rendimiento.

Ejemplo 2: Operación

Se incuban leucocitos de 0,1-1 ml de sangre completa lisada con eritrocitos (opcionalmente diluida con tampón (PBS sin calcio y magnesio, que contiene BSA 1 % y EDTA 4 mM) y opcionalmente enriquecidos con células leucémicas) con Mab fluorescentes ("inmunotinción") contra múltiples antígenos de superficie celular de diferenciación de leucocitos (es decir, CD45/CD14/15 (para enumerar los tipos de células monogranulocíticas), CD3/4/8 (para enumerar los subconjuntos de linfocitos T comunes), CD19/56/14 (para identificar linfocitos B y células NK), CD45/CD235a/CD71 (para identificar cualquier célula eritroide contaminante) y con un colorante de viabilidad. Esto se hace de forma convencional, es decir, fuera de chip. Después, las células se lavan y se concentran a ~ 1-10 millones de células/ml utilizando chips DLD diseñados para mover leucocitos y células leucémicas desde la corriente inicial de la suspensión de células de entrada que contiene Mab fluorescentes a la corriente de salida de tampón limpio contra la pared del chip (Figura 17B).

El método puede recuperar > 90 % de los leucocitos de entrada, concentrados de nuevo a su concentración original en sangre completa (~ 1-10 millones de células/ml), a un caudal de -200 pl/min. La viabilidad de los leucocitos se evalúa mediante un colorante de viabilidad (objetivo: > 90 % de viabilidad) y el inmunomarcaje se evalúa mediante citometría de flujo (FACS) para determinar el contenido de cada tipo de célula leucocitaria principal (es decir, rendimiento de cada uno de los tipos de leucocitos anteriores y células leucémicas añadidas opcionalmente marcadas; en algunos casos, > 90 % de rendimiento de cada tipo de célula) frente a las células idénticas procesadas mediante métodos convencionales de lavado/concentración por centrifugación. Posteriormente se compara la calidad de la inmunotinción de cada tipo de célula con el lavado/concentración microfluídica frente al convencional. Se cuantifica la cantidad de Mab fluorescentes residuales que contaminan los leucocitos obtenidos por ambas técnicas midiendo la fluorescencia de alícuotas libres de células de la muestra de partida y de los productos leucocitarios (objetivo: queda < 1 % del Mab inicial). Estas mediciones de fluorescencia se realizan en pocillos por triplicado de una placa de 96 pocillos utilizando un lector de placas de fluorescencia.

Se realizan experimentos análogos después de una reacción de fijación/permeabilización fuera del chip en leucocitos de 0,1-1 ml de sangre completa con eritrocitos lisados (opcionalmente diluida con tampón y opcionalmente enriquecida con células de leucemia). La presencia de cantidades significativas de reactivos de fijación/permeabilización residuales se determina indirectamente por el nivel de unión no selectiva posterior de Mab fluorescentes irrelevantes (Mab de control de isotipo fluorescentes). Finalmente, se realizan experimentos similares después del marcaje intracelular y se miden los anticuerpos fluorescentes libres residuales en el producto leucocitario.

Cuando el dispositivo y los protocolos se optimizan para producir de forma rutinaria leucocitos de salida que cumplen los criterios deseados, se realiza una serie de varios experimentos sucesivos (número de experimentos sujeto al significado estadístico y cálculos de potencia) en los que los leucocitos de una muestra de sangre determinada se lavan/concentran simultáneamente en el dispositivo microfluídico frente a procedimientos convencionales de centrifugación realizados por un individuo experimentado. Se realizan comparaciones estadísticas de viabilidad celular, rendimiento, pureza y subconjuntos de leucocitos.

Ejemplo 3: Leucocitos de sangre de cordón umbilical (UCB)

Se pueden recoger leucocitos de una diversidad de tejidos. La Tabla 5 muestra experimentos de enriquecimiento de leucocitos de sangre de cordón umbilical (UCB). La muestra de partida son 3 ml de UCB, diluida 1:1 con tampón de proceso. El producto de salida enriquecido con leucocitos contenía niveles de eritrocitos por debajo de la detección (contador de células Hemavet), por lo que la pureza del producto se determina mediante análisis FACS multicolor utilizando marcadores contra CD45, CD14, CD235a y un colorante de ácido nucleico viable. Para las fracciones combinadas, la reducción de eritrocitos es del 99 %, la recuperación de leucocitos es del 87 % y la pureza de los leucocitos (es decir, 100 % -% de eritrocitos) es del 81-88 %. Hay algún volumen muerto en la configuración del instrumento, por lo que una pequeña parte de la muestra permanece en el sistema y no se procesa. Con algunos cambios de ingeniería minoritarios, se puede clasificar la muestra completa y la recuperación de leucocitos puede aumentar hasta > 90 %. La viabilidad por exclusión del colorante azul tripán es > 90 % en todas las fracciones. Los granulocitos, linfocitos y monocitos están cerca de las proporciones iniciales de "leucocitos diferenciales".

en algunos casos, la separación y lavado de leucocitos de sangre completa lisada ha confirmado la eliminación de > 99 % de los eritrocitos, plaquetas, proteínas plasmáticas y Mab no unidos, y una recuperación de leucocitos cercana al 90 % sin introducir sesgos entre las subpoblaciones de leucocitos (3).

Ejemplo 4: Prueba de perlas en un dispositivo microfluídico de múltiples corrientes

En este ejemplo, una muestra que comprende perlas de prueba de 10 pm y 2 pm marcadas con fluorescencia se hace fluir a través de un dispositivo microfluídico que comprende una matriz DLD como se muestra en la FIG. 19. Como se muestra en la FIG. 19, el dispositivo se configuró para hacer fluir 3 corrientes de flujo en paralelo desde la porción de entrada del dispositivo a través de una matriz de impacto DLD hasta la porción de salida del dispositivo. Como se muestra en la FIG. 19, la porción de entrada del dispositivo comprende 2 pocillos de entrada cada uno para la corriente de flujo, la corriente de flujo de reactivo y la corriente de flujo de tampón de lavado, y 2 pocillos de salida en la parte de salida del dispositivo, en donde cada uno de los pocillos de entrada y salida está delimitado por paredes opuestas. Cada una de las entradas de muestra, reactivo y tampón tenían una anchura de 126 micrómetros, con una longitud total del chip de ~ 3 cm. En este ejemplo, una corriente de perlas que comprende las perlas de prueba de 10 pm y 2 pm marcadas y dos corrientes de tampón se hacen fluir a través del dispositivo que comprende la matriz DLD de múltiples corrientes. La matriz de impacto DLD comprendía obstáculos circulares o micropostes con un diámetro de 18 |jm, un espacio entre micropostes de 18 |jm, un desplazamiento de fila de 1/42 y un tamaño crítico de aproximadamente 5 jm . Las perlas de 10 jm se diseñaron para imitar los tipos de células en una solución como la sangre con un diámetro mayor que el tamaño crítico (por ejemplo, leucocitos, diámetro de aproximadamente 7 jm), mientras que las perlas marcadas de 2 jm se diseñaron para imitar tipos de células más pequeñas en una solución como sangre (por ejemplo, glóbulos rojos, diámetro de aproximadamente 2 jm ). La FIG. 20A muestra que las perlas marcadas de 1o jm impactaban principalmente desde la parte superior de la matriz DLD hasta el último pocillo de salida del dispositivo. La FIG. 20B muestra que las perlas marcadas de 2 jm fluían generalmente desde los pocillos de entrada de muestra a los cuatro pocillos de salida superiores del dispositivo.

Ejemplo 5: Prueba de perlas en un dispositivo microfluídico de múltiples corrientes que comprende paredes separadoras

En este ejemplo, se probó la mezcla difusional entre corrientes de flujo paralelas haciendo fluir perlas de prueba marcadas de 1o y 0,2 jm a través de un dispositivo microfluídico de múltiples corrientes modificado (lavado de coches) que comprende un par de paredes opuestas dentro de la matriz DLD y orientadas en paralelo a la dirección del flujo como se muestra en las FIG. 24A y B. El modelo de difusión de fuente limitada modificado representado en la FIG. 22 fue desarrollado para describir la propagación de la corriente química central en el dispositivo representado en las FIG 24A y B frente al dispositivo representado en la FIG. 19. En este ejemplo, el dispositivo utilizado para probar las perlas de prueba marcadas de 10 y 0,2 jm se diseñó para contener un tamaño crítico de 7 micrómetros, de modo que las partículas por encima de este tamaño atraviesen la corriente química y las partículas más pequeñas fluyan a lo largo de la dirección del flujo del fluido. Como puede verse en la FIG. 25, el 90 % de las partículas (perlas de prueba de 10 micrómetros) en la corriente fuente se movieron con éxito a través de la corriente química y se concentraron y recogieron en la salida. La contaminación se midió utilizando perlas fluorescentes de 0,2 micrómetros como señalizador para la localización del producto químico de la corriente central. Tal como se observa en la Tabla 1, la constante de difusión (1 x 10-8 cm2 s-1) de las perlas de 0,2 micrómetros era comparable a la de la mayoría de los marcadores de anticuerpos monoclonales, como los que se usarían en diseños convencionales y modificados. La fluorescencia en las corrientes central y de salida tanto para el dispositivo convencional (FIG. 19) como para el modificado (FIG. 24A y B) se mostró en la FIG. 26. De forma general, se observó una reducción de la contaminación de 20 veces en la salida a un caudal bajo (> 0,1 mm/s) y una reducción de 10 veces a un caudal alto (> 1 mm/s) utilizando el dispositivo que se muestra en las FIG. 24A y B, lo cual estaba de acuerdo con la simulación. Además, el tiempo empleado en la corriente de procesamiento central se incrementó en un factor de 3. En resumen, el diseño del dispositivo en la FIG. 24A y 24B permitió mejorar la limitación práctica para el procesamiento químico en el chip de corriente continua y el lavado de células en más de un orden de magnitud.

Ejemplo 6: Prueba de mezcla difusional entre corrientes de flujo adyacentes en dos dispositivos de "lavado de coches"

En este ejemplo, la mezcla por difusión de una corriente de reactivo de metanol con una corriente de tampón que fluye paralelamente adyacente se probó en el dispositivo mostrado en la FIG. 19 o la FIG.24B. La FIG.23 mostró la relación entre la concentración de un reactivo (es decir, metanol; coeficiente de difusión en agua de 10-5 cm2/s) y el tiempo de incubación con velocidad de flujo para un dispositivo como se representa en la FIG. 19, en donde el dispositivo tenía una longitud total de 3 cm, anchuras de entrada de muestra, reactivo y tampón de 126 jm , micropostes circulares de 18 jm de diámetro, un espacio de 18 jm , un desplazamiento de fila de 1/42 y un tamaño crítico de ~ 5 jm . Tal como se puede observar, un tiempo de incubación de 10 segundos condujo a una salida con metanol al 33% del de la corriente de reactivo. En comparación, La FIG. 31 mostró la relación entre la concentración de un reactivo (es decir, metanol; coeficiente de difusión en agua de 10-5 cm2/s) y el tiempo de incubación con velocidad de flujo para un dispositivo como se representa en la FIG. 24B, en donde el dispositivo tenía una longitud total de 3 cm, una pared separadora de entrada con una longitud de 6 mm, una pared separadora de salida con una longitud de 12 mm, anchuras de entrada de muestra, reactivo y tampón de 126 jm , micropostes circulares de 18 jm de diámetro, un espacio de 18 jm , un desplazamiento de fila de 1/42 y un tamaño crítico de ~ 5 jm . En resumen, el diseño del dispositivo modificado en la FIG. 24B mostró una reducción de 2 a 200 veces en la concentración de metanol y una mejora de 2,14 veces en el tiempo de incubación a velocidades de flujo bajas. Por tanto, con el diseño modificado, a velocidades de flujo más altas se puede ejecutar el mismo tiempo de incubación, mientras que a la misma velocidad de flujo, el diseño modificado puede conseguir una mayor eficiencia de lavado.

Ejemplo 7: Prueba de sangre en un dispositivo microfluídico de múltiples corrientes que comprende paredes separadoras

En este ejemplo, se probó la mezcla difusional entre corrientes de flujo paralelas con sangre que fluía a través de un dispositivo microfluídico de múltiples corrientes modificado (lavado de coches) que comprende un par de paredes opuestas dentro de la matriz DLD y orientadas en paralelo a la dirección del flujo como se muestra en las FIG. 27A y 27B. En este ejemplo, la sangre se diluyó 4 veces, se lisaron los glóbulos rojos y se centrifugó la muestra de sangre resultante para retirar las plaquetas. Posteriormente, se pasaron 5 ml de la muestra de sangre procesada marcada con fluorescencia a través de un dispositivo como se muestra en las FIG. 27A y 27B a una velocidad de flujo de 0,1 ml/min durante 50 minutos. Como se puede ver en la FIG. 28, una parte significativa de las células sanguíneas marcadas en la corriente fuente se movió con éxito a través de la corriente de producto químico, a través del espacio entre las paredes separadora de entrada y separadora de salida, y se concentra y recoge en la salida. La FIG. 30 mostró la diferencia entre la entrada de sangre y las salidas del dispositivo, que mostró una eliminación exitosa de los glóbulos rojos (RBC). Se observaron algunas obstrucciones en las diversas regiones del dispositivo como se observa en las FIG. 29A y 29B.

Ejemplo 8: Prueba de perlas en dispositivo microfluídico con sistema de limpieza en el chip:

En este ejemplo, se hizo fluir una muestra que comprendía perlas de prueba de 10 pm marcadas con fluorescencia a través de un dispositivo microfluídico que comprendía una matriz DLD y un sistema de limpieza en el chip como se muestra en las FIG. 34A y C. El dispositivo utilizado en este ejemplo comprende micropostes con un diámetro de 18 pm, un espacio entre micropostes de 18 pm, un desplazamiento de fila de 1/42 y un tamaño crítico de aproximadamente 7 pm. Se hicieron fluir 6 ml de una muestra que comprendía perlas de 10 pm marcadas con fluorescencia de color verde (1 x 105 perlas/ml) a través del dispositivo a 0,1 ml/min durante 60 minutos en el modo de impacto, seguido de un flujo de 5 ml de tampón F108 a 0,5 ml/min para retirar las perlas no obstruidas restantes. Finalmente, se hicieron fluir 5 ml de una corriente de limpieza (también tampón F108) a 0,5 ml/min en el modo de limpieza para limpiar el dispositivo. Como se muestra en la FIG. 34A y en la parte superior de la 34B, se observaron perlas obstruidas en el dispositivo después del modo de impacto, que se eliminaron sustancialmente después del modo de limpieza (parte inferior de la f Ig .34B).

Ejemplo 9: Reducción de la obstrucción:

La FIG. 36 muestra los resultados de experimentos que identifican integrinas dependientes de calcio y activación plaquetaria inducida por trombina como contribuyentes dominantes a la obstrucción inducida por plaquetas de matrices DLD. La conclusión es que la FIG. 36 muestra cómo se puede usar un aumento de aproximadamente 3 veces en el caudal para conseguir una reducción adicional de la obstrucción además de la conseguida con EDTA 5 mM y PPACK 40 uM. [NOTA: estos gráficos muestran en el eje x (horizontal) el volumen de sangre que se ha procesado a través de una matriz, y en el eje y (vertical) la fluorescencia de los leucocitos atascados en la matriz. La sangre diluida se procesó realmente, pero este eje x representa la cantidad de sangre sin diluir que se utilizó antes de la dilución y que fluyó a través del chip. Los leucocitos se etiquetaron con un colorante fluorescente antes de poner la sangre en la matriz, por lo que la fluorescencia mide el número de células atascadas. Esta matriz era una matriz con postes triangulares de 40 micrómetros y la anchura del espacio es de 27 micrómetros.

La matriz tenía parámetros comúnmente utilizados para el aislamiento de leucocitos o células tumorales circulantes. La sangre humana fue suministrada por un proveedor y tratada con un nivel de 1 ml/ACD por 8 ml de sangre. (Antes de la dilución 3:1). La ACD típica se compone de 22,0 g/l de C3434 (ácido cítrico, sal trisódica, dihidrato); 7,3 g/l de C0759 (ácido cítrico, anhidro); y 24,5 g/l de G7528 (D-(+)-Glucosa).

Las condiciones de prueba convencionales implican diluir la muestra de sangre 3:1 con un tampón antes del procesamiento. El caudal promedio es de ~ 4 cm/s. La profundidad de la matriz grabada en silicio fue de ~ 0,15 mm. El tiempo de ejecución convencional fue de 30 minutos. En este tiempo se procesaron ~ 3 ml de la mezcla de sangre diluida, correspondientes a 0,75 ml de sangre total. Se añadieron aditivos a la mezcla diluida antes del procesamiento. Los leucocitos se etiquetaron con un colorante fluorescente antes de poner la sangre en la matriz, por lo que la fluorescencia mide el número de células atascadas.

Obsérvese en la FIG. 36 que deben tenerse en cuenta las siguientes observaciones experimentales para diferentes aditivos a la entrada: EDTA 1 mM (1 mM en la entrada de sangre diluida) proporciona un aumento rápido en la señal de fluorescencia (de leucocitos atascados) que indica una obstrucción rápida; EDTA 5 mM (en la entrada de sangre diluida) reduce la obstrucción a aproximadamente 1/8 del nivel de EDTA 1 mM; ACD (1 ml por 9 ml de la entrada de sangre diluida) reduce la obstrucción de manera similar al EDTA 5 mM. La heparina (40 unidades por ml de la entrada de sangre diluida (sin EDTA) muestra cierta reducción de la obstrucción. La adición de PPACK 40 uM al EDTA 5 mM reduce la obstrucción a un nivel casi indetectable. El aumento de la velocidad de flujo en un factor de ~ 3X (con EDTA 5 mM y PPACK 40 uM) proporciona -2,3 ml de producción de sangre completa en el chip en una matriz en 30 minutos para una matriz, y una obstrucción aún insignificante.

Estos resultados se han demostrado para postes circulares y triangulares con parámetros de matriz que se utilizan comúnmente para el aislamiento de leucocitos y células tumorales circulantes de la sangre. La FIG. 37 muestra imágenes de la obstrucción con EDTA 1 mM y con EDTA 5 mM PPACK 40 uM para cada uno de los tres parámetros de matriz diferentes. Las dos matrices superiores (P18/G18/C [[diámetro del poste 18 um; espacio 18 um; postes circulares]] y P40/G27/T [[postes 40 um; espacio 27 um; postes triangulares]]) tienen parámetros comúnmente utilizados para el aislamiento de leucocitos, mientras que la matriz inferior (P60/G40/T [[postes 60 um; espacios 40 um; poste triangular]]) se puede utilizar comúnmente para el aislamiento de células tumorales circulantes. La conclusión es que la combinación de un agente para reducir las vías dependientes de calcio (tales como el agente quelante de calcio (EDTA 5 mM) y un inhibidor de trombina (PPACK 40 uM) funciona mejor en todos los diseños de chips.

Ejemplo 10: Experimentos que identifican los efectos de mayores caudales y mayores diluciones de sangre sobre la obstrucción en matrices DLD:

En un experimento de apoyo (FIG. 38) al Ejemplo 9, se muestra que se pueden usar caudales más altos y mayores diluciones de sangre para reducir aún más la obstrucción en la matriz de micropostes. Todos los datos corresponden a la misma condición de EDTA 1 mM en la entrada de sangre diluida al chip. Los tiempos de cada experimento son diferentes, pero la clave es la cantidad de fluorescencia (que representa leucocitos atascados) para una sangre completa equivalente dada de entrada. Debe ser lo más pequeña posible para la misma cantidad de sangre. La hipótesis dice que un caudal más alto permite menos tiempo para que se formen los agregados de plaquetas en la matriz y proporciona una fuerza mayor para evitar la adhesión plaqueta-poste, y que la dilución más alta previene la formación de agregados plaquetarios al minimizar la interacción plaqueta-plaqueta. La FIG. 38 muestra que una combinación de un aumento de 3 veces en la dilución de la sangre y un aumento de 10 veces en el caudal reduce la obstrucción, consiguiendo la combinación una reducción de la obstrucción en un factor de 10 veces.

En resumen, los ejemplos 9 y 10 demostraron que se pueden procesar > 2,25 ml de sangre por matriz DLD a un nivel de obstrucción muy por debajo de aquel en el que el rendimiento del chip comienza a degradarse. Esto corresponde a > 30 ml de sangre por chip convencional con 15 matrices DLD. Adicionalmente, dado que la obstrucción no parece aumentar en comparación con el tiempo en el mejor de los casos (alto rendimiento, PPACK y EDTA en la FIG. 36), a partir de nuestros resultados se pueden procesar > 250 ml de sangre utilizando un chip convencional con 15 matrices DLD antes de que la obstrucción comience a degradar significativamente el rendimiento del dispositivo. Este logro se puede atribuir a cuatro medidas que redujeron la obstrucción: 1. Incapacitación de la actividad de las integrinas dependientes de calcio en las plaquetas y/o disminución de la formación de trombina dependiente de calcio al aumentar la concentración de EDTA de 1 mM a 5 mM. Otros métodos que reducen o bloquean el calcio pueden actuar de manera similar. 2. Prevención de la activación plaquetaria inducida por trombina y la producción de fibrina mediante el uso del inhibidor directo de trombina PPACK a una concentración de 40 uM. Otros métodos que inhiben o reducen la trombina pueden actuar de manera similar. Las siguientes 2 condiciones experimentales también reducen la obstrucción: 3. Mayor caudal (que puede deberse a menos tiempo para que se produzcan las reacciones que conducen a la obstrucción). 4. Mayor dilución (que puede deberse a una interacción plaqueta-plaqueta minimizada que conduce a la formación de agregados plaquetarios).

Ejemplo 11: Tecnología microfluídica de DLD para lavar y concentrar leucocitos de la sangre

Los glóbulos blancos (WBC), que son más grandes que otros tipos de células y desechos en la sangre normal, se mueven formando un ángulo en comparación con la dirección del flujo del fluido (FIG. 17B, 17C). Los glóbulos blancos (WBC) salieron de la corriente de entrada y pasaron a una corriente de tampón limpio y, por lo tanto, se lavaron eficazmente para liberarse de otras células y Mab no unidos sin necesidad de lisis o centrifugación convencionales de glóbulos rojos (RBC).

Las fracciones de glóbulos blancos (WBC) recogidas por lisis y centrifugación convencionales de glóbulos rojos (RBC) se marcaron con Mab fluorescentes contra CD19 (señalizador de linfocitos pan-B) y CD3 (señalizador de linfocitos pan-T) fuera del chip, y después se lavaron en el chip muestras pequeñas (aproximadamente 100 j l diluidos con 100 |jl de tampón). El producto y las fracciones residuales se analizaron mediante recuento celular y citometría de flujo. En un proceso representativo (Tabla 6 y FIG. 43), el 97 % de los glóbulos blancos se recuperaron en la fracción de producto, en un volumen más pequeño y más concentrado que la muestra de entrada. La viabilidad celular fue consistentemente superior al 90 %. Se lograron recuperaciones de más del 90 % para los 3 principales subconjuntos de glóbulos blancos (WBC) (granulocitos, monocitos, linfocitos), y cada subpoblación era distinta y tenía una excelente intensidad de señal de citometría de flujo, similar a la muestra de entrada. Los linfocitos son los glóbulos blancos (WBC) más pequeños, de modo que puede sospecharse que se pierden durante el procesamiento de DLD basado en el tamaño; no obstante, se encontró que las cantidades de células T CD3+ y de células B CD19+ se conservaban en el producto, al igual que su calidad de marcaje. Este resultado indicó que la recolección de chips DLD preservaba la calidad de estos análisis citométricos de flujo posteriores.

La eliminación del marcador no unido puede ser útil en citometría de flujo para reducir el efecto de fondo, aumentar la precisión de la señal y prevenir la unión inespecífica del reactivo a las células durante los posibles pasos posteriores de fijación/permeabilización. Por lo tanto, se midió la fluorescencia de las muestras de entrada y salida centrifugadas se midió con un fluorímetro (conjunto de lectores de placas de microtitulación para detectar la fluorescencia de Mab conjugados con fluorocromo no unidos). Una serie de experimentos mostró que el lavado de chips eliminaba la fluorescencia inicial que variaba de aproximadamente el 99 % de eliminación hasta el límite de detección o por debajo del mismo. Esto último se equiparó con una eliminación superior al 91 % de Mab libre. La sensibilidad del instrumento se puede modificar para detectar niveles ultrabajos de fluorescencia con el fin de medir un mayor grado de eliminación de Mab.

continuación

Ejemplo 12: Combinación de la recolección microfluídica de leucocitos con el sistema de lavado/concentrado de DLD en una sola etapa

Los glóbulos rojos (RBC) pueden estar presentes en la sangre en un exceso 1000 veces mayor que los glóbulos blancos (WBC). Por tanto, la eliminación de los glóbulos rojos (RBC) antes del análisis puede resultar útil para evitar tiempos de análisis citométricos de flujo prolongados. El uso de un umbral de fluorescencia durante la citometría de flujo puede solucionar este problema hasta cierto punto, pero esto puede causar la pérdida de información de dispersión de luz que ayuda a distinguir los tipos de células. Por lo tanto, los glóbulos rojos (RBC) residuales se midieron mediante microscopía, Contadores Hemavet y Coulter y citometría de flujo. La sangre entera se marcó fuera del chip con CD19 y CD3. La entrada del chip DLD fue de ~ 100 ul de sangre completa diluida en 100 ul de tampón.

Recuperación de glóbulos blancos (WBC) y retirada de glóbulos rojos RBC. La Tabla 7 muestra los resultados de un experimento representativo. La recuperación de glóbulos blancos (WBC) fue del 97 % y los porcentajes de las subpoblaciones de glóbulos blancos (WBC) son esencialmente idénticos en producto frente a entrada. En una serie de 9 experimentos repetidos durante varias semanas, se recuperó un promedio de 99 ± 4 % de los glóbulos blancos (WBC) de entrada en la fracción de producto, y 2,1 ± 0,6 % de glóbulos blancos (WBC) en la fracción de desechos. En promedio, más del 99,5% de los glóbulos rojos (RBC) de partida se eliminaron de la fracción de producto. El análisis de subconjuntos en la fracción de producto indicó que la distribución de las 3 principales subpoblaciones de glóbulos blancos (WBC) se mantenía en el producto dentro del 1 % de su distribución en la entrada. El promedio de 6 experimentos con sangre completa teñida mostró que la variación era de solo 0,8 0,4 % para los granulocitos, de 0,4 0,2 % para los monocitos y de 1,0 0,4 % para los linfocitos, lo que demuestra resultados consistentes en todas las muestras y a lo largo del tiempo.

Obstrucción. Se abordó el problema de que las células de la sangre completa podrían agregarse o coagularse y obstruir los canales en los chips DLD. La obstrucción puede ser un problema cuando los tamaños de muestra de entrada son mucho mayores de 100 pl de sangre completa. La adición de anticoagulantes, tales como un quelante de calcio (EDTA 5 mM) y un inhibidor de trombina (D-fenilalanil-L-prolil-L-arginina clorometilcetona 40 pM); PPACK) puede permitir más de 2000 pl de sangre a través de un solo canal en un chip DLD sin obstrucciones (datos no mostrados).

Conclusión. Los resultados que se muestran en el presente documento demuestran que los chips DLD como se describen en el presente documento pueden recoger glóbulos blancos (WBC) marcados con Mab a partir de una mezcla de incubación de entrada de Mab fluorescentes en sangre completa humana con alta recuperación y viabilidad de los glóbulos blancos (WBC), mientras se reducen los glóbulos rojos (RBC) y los Mab no unidos, y sin sesgar la distribución de los subconjuntos de glóbulos blancos (WBC) (Tabla 8). Los Mab libres se eliminaron hasta el límite de detección, aumentando considerablemente las relaciones S/N de los citogramas de flujo. Estos resultados fueron consistentes entre los 3 laboratorios colaboradores que utilizaron dispositivos fabricados tanto de silicona/vidrio como de plástico. Finalmente, Los resultados del análisis de citometría de flujo de las células procesadas en los chips fueron de alta calidad.

Ejemplo 13: Sistema microfluídico basado en chip DLD para el lavado de glóbulos blancos humanos después del marcaje convencional de la superficie de sangre completa

La FIG. 43 de resultados y las Tablas 6-8 describen el enfoque básico y los resultados para lavar glóbulos blancos que se han inmunoteñido de manera convencional (por ejemplo, fuera del chip) en sangre completa. Debido a que los glóbulos blancos (WBC) son más grandes que los glóbulos rojos (RBC), plaquetas, componentes del plasma y Mab, el chip DLD puede recoger los glóbulos blancos (WBC) de un flujo sanguíneo de entrada. Debido a que los glóbulos rojos (RBC) se reducen de manera eficiente, puede que no sea necesario lisar los glóbulos rojos (RBC) como en el procesamiento convencional. El enfoque del chip DLD puede lavar eficazmente los glóbulos blancos (WBC) y reducir el recuento de glóbulos rojos (RBC) en más del 99 %. El rendimiento puede ser superior al 90 % de los glóbulos blancos (WBC) recolectados en la salida, con una viabilidad superior al 90 %.

Métodos. Se pueden utilizar muestras de múltiples donantes de sangre sanos. El procesamiento de glóbulos blancos (WBC) en el chip se puede realizar en menos de 10 minutos para muestras de 100 pl. La evaluación citométrica de flujo de las células de entrada y salida se puede expandir para enumerar varios subconjuntos críticos de glóbulos blancos (WBC), utilizando cócteles comerciales de Mab multicolores que se utilizan ampliamente en la investigación y el diagnóstico del cáncer.

Medidas de resultado. Se caracterizan alícuotas de la entrada y salida del chip DLD como en los Resultados anteriores. La evaluación de citometría de flujo se puede ampliar utilizando los siguientes cócteles de Mab para el marcaje de superficies (25-26) (estos kits contienen números específicos de perlas para permitir el recuento total de células de citometría de flujo): T rucount CD4/CD8/CD3 (BD T ritest N.° de catálogo 340401); CD3/CD19/CD45 T rucount (BD Tritest N.° de catálogo 340405); CD3/CD16 56/CD45 Trucount (BD Tritest N.° de catálogo 340403); CD45/14 (BD Simultest N.° de catálogo 340040); CD34/CD45/Kit de enumeración de células progenitoras Procount de colorante de ácido nucleico (BD N.° de catálogo 340498; determina el recuento total de células madre progenitoras, recuento total de células nucleadas y recuento total de glóbulos blancos (WBC)); CD34/CD45/7-AAD ISHAGE Kit de enumeración de células madre (BD N.° de catálogo 344563; determina el recuento total de células madre progenitoras mediante el algoritmo ISHAGE); Control de isotipo IgG1/IgG1/CD45 (BD Tritest N.° de catálogo 340385).

Se pueden utilizar muestras de voluntarios adultos sanos con un panel de marcadores intracelulares y de superficie de uso común. Pueden utilizarse muestras de pacientes con una diversidad de diagnósticos tales como cáncer, enfermedad infecciosa, etc., y que representan adultos, niños y minorías raciales/étnicas.

Ejemplo 14: Sistema microfluídico de DLD basado en chip para lavar glóbulos blancos (WBC) humanos después de la fijación y permeabilización convencionales

Antes del marcaje intracelular, puede ser necesario estabilizar ("fijar") las células usando un reactivo de entrecruzamiento químico y luego permeabilizar la célula y las membranas intracelulares (por ejemplo, nucleares) para permitir que los marcadores intracelulares entren en la célula. Por ejemplo, los protocolos actuales pueden utilizar formaldehído para la fijación y metanol para la permeabilización (29). Después de estas etapas, las células se pueden lavar para eliminar estos productos químicos desnaturalizantes, antes de la incubación con los reactivos de marcaje intracelular (por ejemplo, Mab). La etapa de fijación/permeabilización se puede realizar en glóbulos blancos (WBC) aislados fuera del chip, utilizando un protocolo convencional, por ejemplo, el descrito en Chow et al., (Chow S, Hedley D, Grom P, Magari R, Jacobberger JW, Shankey TV. Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations. Cytometry A.

2005;67(1):4-17). Después, la etapa de lavado por centrifugación convencional se reemplaza por un lavado basado en chips DLD. El lavado basado en chips DLD se realiza como en la FIG. 17B, con la excepción de que la entrada es la mezcla de los glóbulos blancos (WBC) aislados y los reactivos de fijación/permeabilización. Los glóbulos blancos (WBC) fijos/permeabilizados grandes impactan y se desvían hacia la salida, y el formaldehído, metanol, etc. se mueven directamente hasta el residuo. El rendimiento de glóbulos blancos (WBC) se evalúa como en los resultados preliminares. En lugar de medir los niveles residuales de formaldehído, metanol, etc. , los glóbulos blancos (WBC) fijados/permeabilizados lavados en el chip DLD se inmunotiñen y luego se evalúa la calidad de la inmunotinción intracelular, en comparación con una alícuota separada de la misma muestra de glóbulos blancos (WBC) de partida marcada por un protocolo manual convencional (por ejemplo, todas las etapas de marcaje y lavado completadas fuera del chip) (27), como el descrito en Chow et al., (Chow S, Hedley D, Grom P, Magari R, Jacobberger JW, Shankey TV. Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations. Cytometry A. 2005;67(1):4-17).

Medidas de resultado. Para el marcaje intracelular se utilizan los siguientes Mab y cócteles comerciales: Anti-pStatl-PE (BD Biosciences N.° de catálogo 612564; detecta el factor de transcripción Statl fosforilado); Anti-IFN-gamma (BD Biosciences N.° de catálogo 554552); FITC BRDU Flow Kit (BD Pharmingen N.° de catálogo 557891) Solución de tinción 7-AAD (BD Pharmingen N.° de catálogo 559925); Phosflow Kit (BD N.° de catálogo 560750; detecta p38 MAPK, ERK, Statl, Stat3, Stat6, Cóctel de células T humanas; contiene reactivos para analizar simultáneamente múltiples señalizadores de células T con una de varias fosfoproteínas intracelulares para estudiar la señalización específica del subconjunto de células T); Kit de tinción FoxP3: FoxP3/CD4/CD25 (BD Pharmingen, N.° de catálogo 560l33; El factor de transcripción FoxP3 es un señalizador para las células T reguladoras (T reg), y la mayoría de las células T CD4+ CD25++ en sangre lo expresan selectivamente de forma intracelular, mientras que menos de la mitad de las células CD4+ CD25+ son FoxP3+; El kit también contiene Mab CD4 y CD25); FastImmune IFN-gamma/CD69/CD8/CD3 (BD N.° de catálogo 346048; El IFN-g se expresa intracelularmente en la mayoría de las células T CD8+, por los subconjuntos TH1 y TH0 de células T CD4+ y por las células NK tras la activación; CD69 está presente en linfocitos T, B y Nk activados).

Ejemplo 15: Sistema basado en chip DLD microfluídico para lavar glóbulos blancos (WBC) humanos después del mareaje intracelular convencional

Después del marcaje intracelular, se puede realizar un lavado para eliminar los marcadores intracelulares no unidos. Existen protocolos de procesamiento de células para análisis de citometría de flujo que no requieren lavado. Estos métodos pueden tener el inconveniente de una alta fluorescencia de fondo. Los chips DLD descritos en el presente documento se pueden usar para reemplazar las etapas de centrifugación y resuspensión, y se puede usar citometría de flujo para evaluar la recuperación y la inmunotinción del chip DLD procesado. / s. células procesadas convencionalmente (fuera del chip), usando los cócteles de Mab.

Otra posible ventaja del procesamiento del chip DLD puede ser que la salida de residuos de esta etapa (FIG. 17C) debe contener solo el tampón y los marcadores no unidos, siendo la cantidad de tampón aproximadamente igual a la de la entrada. Por tanto, estos "residuos" pueden contener los marcadores no utilizados que luego pueden "reciclarse" para utilizarse de nuevo en etapas futuras. Esto puede ser significativo debido al alto coste de algunos marcadores Mab, especialmente cócteles multi-Mab. Este posible reciclaje de reactivos se evalúa más a fondo en el presente documento.

Análisis de datos y medidas de resultado: Para asegurarse de que los resultados sean representativos de un producto futuro, se examina cada uno de los procesos del chip DLD (secuencialmente, a medida que se perfeccionan) para obtener una reproducibilidad robusta en múltiples muestras de sangre de donantes (por ejemplo, más de 10) utilizando los chips DLD y el sistema de plataforma microfluídica automatizado. Los resultados experimentales se comparan con los resultados de la preparación manual de muestras por un citometrista experto. Los resultados de los chips pueden mostrar un mejor rendimiento celular y una reproducibilidad mejor o comparable, medida por el coeficiente de variación de los números de subconjuntos y relaciones S/N equivalentes o más altas. Estos resultados pueden ser representativos del rendimiento de los productos que se ofrecerán para licencia y venta.

Para el lavado posterior a las etapas de fijación/permeabilización y marcaje intracelular, respectivamente, los glóbulos blancos (WBC) fijados/permeabilizados pueden ser ligeramente más pequeños y más rígidos que los glóbulos blancos (WBC) viables. Esta característica puede ser importante porque los impactos y la separación celular resultante basada en el chip DLD pueden depender del tamaño de las células y, en menor grado, de la rigidez de las células. Por lo tanto, para optimizar el impacto de los glóbulos blancos (WBC) fijados/permeabilizados, los parámetros de la matriz de postes se pueden ajustar ligeramente en comparación con los utilizados hasta la fecha para los glóbulos blancos (WBC) viables. Además, el coeficiente de difusión del metanol en tampón (~ 10-5 cm2/s) es mayor que el de los Mab (~ 10 6 cm2/s). Por tanto, es más probable que el producto lavado se contamine con los reactivos de fijación/permeabilización (por ejemplo, metanol) que con los marcadores Mab no unidos. Esta característica se puede abordar aumentando ligeramente la velocidad de flujo o realizando cambios minoritarios en el diseño del chip DLD, tal como un aumento de la anchura de la entrada del tampón, de modo que los reactivos puedan difundirse más lejos (de manera perpendicular al flujo de fluido) para alcanzar el canal de salida.

Ejemplo 16: Sistema de DLD microfluídico basado en chip para recoger glóbulos blancos (WBC) de sangre total y después marcarlos en la superficie y lavarlos, Todo en el mismo chip (FIG. 42)

Primero se recogen glóbulos blancos en el chip a partir de sangre completa, seguido de las etapas de marcaje de la superficie y lavado en el chip. Los métodos pueden aumentar la automatización del proceso y permitir la recuperación potencial de marcadores no utilizados.

Métodos. Se puede usar un chip como el de la FIG. 18A y un marcador de superficie tal como Mab de CD45. La eficacia de marcaje de glóbulos blancos (WBC) se ajusta mediante la concentración de marcador y el tiempo de permanencia en la corriente de marcaje central. El tiempo de permanencia, que es el tiempo de incubación, puede controlarse por la velocidad de flujo del fluido (típicamente aproximadamente 1 mm/s), la anchura de la corriente de marcaje (típicamente de aproximadamente 0,5 mm) y el ángulo de inclinación de la matriz (de 2 ° a 6 °), para dar un tiempo de permanencia de aproximadamente 10-20 segundos. El tiempo total de flujo a través del chip puede ser del orden de unos pocos minutos. El rendimiento de glóbulos blancos (WBC) marcados (y la intensidad de fluorescencia de cada subconjunto de glóbulos blancos (WBC) definido por Mab, determinado por citometría de flujo) se compara con el obtenido usando métodos convencionales de lavado y marcaje fuera de chip. La recuperación del marcador no utilizado (creando una salida de chip separada para el) se prueba y mide por fluorescencia en comparación con la corriente de entrada del marcador. Los caudales de fluido y los parámetros de diseño del chip se pueden ajustar en respuesta a esto.

Análisis de datos. Los experimentos pueden lograr: un rendimiento de marcaje (o fijación/permeabilización) tan alto como el de los métodos convencionales, recuperación de glóbulos blancos (WBC) superior al 90 %, eliminación de más del 99 % de glóbulos rojos (RBC), más del 90 % de viabilidad, eliminación superior al 90 % de Mab no unidos y una calidad de análisis de citometría de flujo comparable a la de las células procesadas convencionalmente.

Ejemplo 17: Sistema de DLD microfluídico basado en chip para fijar, permeabilizar y lavar glóbulos blancos marcados en la superficie

Se realiza una fijación/permeabilización en el chip seguido de un lavado en el chip (FIG. 42).

Métodos. Para el marcaje en el chip de células permeabilizadas, las células de fijación/permeabilizadas se introducen en el puerto de entrada de células del chip y se hacen reaccionar con los reactivos conjugados con fluorocromo enumerados en los Ejemplos 13 y 14. La citometría de flujo se realiza en paralelo con las células procesadas manualmente. El análisis de datos es como se describe en el Ejemplo 16.

Ejemplo 18: Sistema de DLD microfluídico basado en chip para marcar y lavar intracelularmente glóbulos blancos (WBC) marcados en la superficie

El marcaje y lavado intracelular se realizan en el mismo chip (FIG. 42). Se utiliza un diseño como el de la FIG. 18A, con células de fijación/permeabilizadas como entrada y un marcador de superficie como corriente central del proceso.

Métodos. Las etapas previas de marcaje de superficie y de fijación/permeabilización se realizan mediante métodos convencionales fuera del chip. Los marcadores intracelulares que se utilizarán incluyen pStat1, la forma fosforilada del factor de transcripción Stat1 y la citocina IFN-gamma. Para las pruebas se utilizan anticuerpos conjugados con ficoeritrina (por ejemplo, BD Biosciences N.° de catálogo 612564 y 554552). Las células permeabilizadas se introducen en el puerto de entrada de células del chip y se hacen reaccionar con los reactivos conjugados con fluorocromo. La citometría de flujo se realiza en paralelo con las células procesadas manualmente. Los Ejemplos 16, 17 y 18 se realizan en múltiples muestras utilizando una plataforma de sistema proporcionada en la divulgación (por ejemplo, Ejemplos 20 y 21). Se utiliza un chip con una o más paredes separadoras.

Ejemplo 19: Sistema de DLD microfluídico basado en chip para fijar, permeabilizar, marcar intracelularmente, lavar y concentrar glóbulos blancos (WBC) en un solo chip:

Todas las etapas involucradas en la preparación de glóbulos blancos (WBC) para citometría de flujo se combinan en un solo chip DLD (FIG. 42).

Métodos. Se utiliza un diseño de chip similar al de la FIG. 18A, con el diseño detallado de cada región basado en el resultado de los Ejemplos 16, 17 y 18. El chip tiene una única entrada (sangre completa, que ya puede estar marcada). El chip tiene al menos 2 corrientes de proceso (para permitir la fijación/permeabilización y el marcaje intracelular). El chip puede tener corrientes separadas para fijación y para permeabilización. El chip tiene otra corriente para el marcaje de superficie después de que las células se hayan recogido de la sangre completa. El chip tiene al menos 3 entradas de tampón, un canal de salida final para las células preparadas y al menos una salida de residuos. Se pueden usar canales de salida adicionales para recoger marcadores no utilizados.

Medidas de resultado: Véase el Ejemplo 15.

Análisis de datos. El enfoque automatizado se compara con los métodos convencionales en cuanto al rendimiento, relaciones de subconjuntos y mediciones de citometría de flujo con al menos 5 preparaciones de la misma muestra de sangre y para al menos 10 donantes. Una muestra puede pasar por dos o tres chips, uno después del otro.

Ejemplo 20: Materiales de chip y chips DLD microfluídicos específicos de aplicación prototipos de fabricación para procesamiento de glóbulos blancos (WBC)

Como se muestra en la FIG. 42 y se ha descrito anteriormente, se puede diseñar un chip y un protocolo separados dependiendo del protocolo deseado. Cada uno de estos sistemas puede convertirse en un producto independiente. La geometría del chip se puede determinar basándose en los requisitos de rendimiento del producto, número de muestras por chip y consideraciones de coste. Por ejemplo, para aumentar el rendimiento, se puede aumentar la profundidad del canal, se pueden añadir más calles en paralelo o se puede aumentar la caída de presión a través del chip. Además, se pueden elegir el caudal y el diseño, por ejemplo, utilizando el concepto de pared separadora para aumentar el tiempo de interacción del tinte y las células, si se requiere, sin aumentar la contaminación de salida.

Métodos. Para cada diseño de chip, se realiza un dibujo de diseño asistido por ordenador (CAD) con múltiples réplicas del diseño del chip ajustadas en el tamaño de una oblea de 4" o 6". Usando fotomáscaras generadas a partir de los dibujos CAD, se graba un patrón con paredes laterales lisas de casi 90 ° en una oblea de Si utilizando el proceso de grabado profundo con iones reactivos (DRIE). Los chips de Si se pueden utilizar como maestros para crear chips de plástico mediante un estampado suave. En primer lugar, se vierte un material de caucho de silicona sobre los chips de Si para formar una réplica negativa del chip maestro de Si. La silicona endurecida se usa luego como herramienta de estampado para estampar en caliente las microestructuras en un material termoplástico. Los chips están hechos con diferentes polímeros tales como COP (polímero de olefina cíclica), PMMA (polimetacrilato de metilo) y PP (polipropileno), con profundidades de hasta 120 pm y espacios entre pilares de solo 9 pm. Las piezas finales de plástico de -1,5 pm se tienen en cuenta ajustando los diseños CAD para este sesgo. Después del estampado suave, los chips se limpian y sellan con cinta adhesiva. Se utilizan cintas adhesivas tanto PSA como activadas por calor. Los materiales de elección incluyen PMMA para el chip estampado y una cinta adhesiva hidrófila activada por calor para la tapa. Todos los diseños y materiales se eligen para que el sistema se pueda esterilizar fácilmente para su uso futuro en el cultivo de células después de la clasificación celular, por ejemplo, mediante haz de electrones o etanol.

Para cada diseño de chip, se diseña un colector con las entradas y salidas de fluido necesarias, con bajo volumen muerto. Se pueden procesar múltiples muestras en paralelo en el mismo chip, para reducir el coste por muestra utilizando la tecnología de chip. Esto se puede hacer fabricando múltiples calles independientes en el mismo chip, donde cada calle se puede cargar de forma independiente y extraer el producto. Por ejemplo, La FIG. 44 muestra un chip en un colector que tiene 2 canales independientes por chip y cada canal tiene 2 entradas y 2 salidas. Se puede desarrollar un chip y un sistema para 8 muestras independientes (cada una con entrada y salidas) en el mismo chip. Los colectores están hechos de polímero acrílico y utilizan tubos de acero inoxidable como puertos de entrada y salida y, por lo tanto, el colector se puede esterilizar fácilmente.

Para cada diseño de chip, se caracterizan las dimensiones críticas de los maestros de Si y los chips de plástico. Los SEM de las secciones transversales se calculan para medir la profundidad de grabado del maestro de Si y la profundidad de estampado de los chips de plástico. Los diámetros y espacios de los pilares se miden mediante microscopía óptica. En todos los chips se inspeccionan los defectos tales como pilares faltantes, pilares doblados y desechos. Se establecen criterios de control de calidad para la inspección de los chips. Dado que hay mucha redundancia en el número de pilares, los pequeños defectos tales como la falta de algunos pilares son aceptables y los chips son completamente funcionales incluso con estos pequeños defectos. Para cada diseño de chip, se obtiene un colector correspondiente y un conjunto de condiciones de ejecución (guiones de tiempo de presión) para realizar las diversas operaciones de marcaje, lavado, fijación/permeabilización, etc. en el chip. El rendimiento del chip se mide primero haciendo ensayos ficticios con soluciones tampón antes de procesar las muestras de células. Se realizan análisis de los datos.

Opcionalmente, se pueden diseñar chips separados y la salida de un chip se puede recogerse e introducirse manualmente en la entrada del siguiente chip.

Ejemplo 21: Fabricación de un producto de plataforma automatizada para controlar el procesamiento de glóbulos blancos (WBC) a través de una interfaz de usuario

Una plataforma automatizada puede realizar 3 funciones: 1) Puede proporcionar los flujos adecuados a cada una de las corrientes de entrada al chip. Esto se puede hacer conectando el depósito apropiado a cada entrada de chip y aplicando las presiones adecuadas a cada una (normalmente unas pocas psi (libra por pulgada al cuadrado). 2) Puede recoger las células apropiadas en las salidas para la citometría de flujo (u otra caracterización) posterior, o para su procesamiento posterior (fuera del chip o en otro chip). Esto se puede hacer conectando cada salida de chip a un depósito de recolección vacío, o posiblemente directamente a otro chip. 3) Puede proporcionar una interfaz de usuario sencilla, con automatización para especificar el proceso fluídico para lograr el resultado deseado.

Se diseña un instrumento que contiene hardware y software para controlar el flujo de varias corrientes fluídicas a través del chip microfluídico. Como se describe en el Ejemplo 20, se puede diseñar y fabricar un colector para ajustarse a cada chip DLD optimizado. Se prueban múltiples diseños de chip y, por lo tanto, se pueden usar múltiples colectores diseñados y fabricados para ajustarse a los diferentes chips. El instrumento puede tener la capacidad de ejecutar todos los diversos diseños de chips y, por lo tanto, es posible que no se necesiten cambios importantes en el instrumento a medida que se generan nuevos diseños de chips DLD/colector.

Métodos. Un instrumento ilustrativo mostrado en la FIG.45 controla un chip en un colector, con 2 corrientes de entrada y 2 corrientes de salida. El instrumento tiene 2 fuentes de control de presión independientes para que la presión de las 2 corrientes de entrada se pueda controlar de forma independiente. Una función de esta plataforma es mantener la presión estable sin fluctuaciones durante las ejecuciones. Las fuentes de presión que se pueden incorporar a esta plataforma se pueden adquirir fácilmente en el mercado (por ejemplo, Fluigent). Se pueden usar hasta 7 presiones independientes, una presión máxima de 20 psi (138 kPa) y hasta 6 corrientes de recolección de salida. Para ejecutar múltiples muestras independientes en un chip, el colector puede distribuir cada fuente de presión independiente para impulsar cada muestra de forma individual. Estas capacidades se pueden diseñar en el instrumento. Las presiones en corrientes de fluido específicas se pueden cambiar durante el curso de una ejecución. Las presiones se pueden controlar mediante software y se puede escribir un guión para cambiar las presiones en los momentos deseados.

Cada generación de chips se prueba con múltiples réplicas y los datos se analizan como se describe. La funcionalidad del instrumento se prueba procesando soluciones tampón a través del dispositivo DLD microfluídico utilizando guiones de perfil de presión. Se realizan múltiples análisis en cada muestra de sangre y se recogen y caracterizan las fracciones de salida deseadas. Los resultados se comparan con el rendimiento anticipado para cada diseño de chip, y se comparan con células procesadas convencionalmente (fuera del chip) en paralelo. La fiabilidad del sistema se evalúa evaluando la variación en múltiples ejecuciones con la misma configuración.

El instrumento puede conectarse a todos los diversos diseños de colectores generados para cada configuración de chip. El instrumento puede almacenar las condiciones de ejecución (guiones de tiempos de presión) para cada diseño de chip, y un usuario puede seleccionar y ejecutar el guión adecuado para cada diseño. Una vez que se han recogido las fracciones de fluido de salida, se analizan. La obstrucción se puede prevenir utilizando volúmenes del orden de 100 |jl o añadiendo los aditivos anticoagulantes descritos en esta divulgación.

Ejemplo 22: Procesamiento químico microfluídico con lavado en el chip mediante matrices de desplazamiento lateral determinista con paredes separadoras

Este ejemplo describe un dispositivo microfluídico para procesamiento químico en el chip, tal como la tinción y el posterior lavado de las células. Se introducen "paredes separadoras" para aumentar el tiempo de incubación en el chip y mejorar la calidad del lavado. Las células de interés se concentran en una corriente de tratamiento de reactivos químicos en la primera pared separadora para una incubación prolongada en el chip sin causar un exceso de contaminación en la salida debido a la difusión de los productos químicos de tratamiento sin reaccionar, y después se dirigen a la corriente de lavado antes de las recolecciones finales. La segunda pared separadora reduce aún más la contaminación de salida de la difusión a la corriente de lavado. Con este enfoque, se demuestra la tinción de leucocitos en el chip con rodamina 6G y lavado. El dispositivo puede reemplazar otros procesos biológicos y analíticos convencionales.

INTRODUCCIÓN

Las etapas de preparación para el análisis de células biológicas pueden implicar el tratamiento químico de las células (tal como la tinción con anticuerpos monoclonales, una etapa de fijación/permeabilización, etc.). Estas etapas pueden ir seguidas de una etapa de "lavado" para retirar los marcadores no unidos o el exceso de productos químicos de tratamiento de las células tratadas, para producir células tratadas y lavadas. Tanto el tratamiento como el lavado pueden incluir múltiples etapas manuales, tales como pipeteo, centrifugación y resuspensión de un sedimento después de la centrifugación. Estas etapas pueden requerir mucha mano de obra y pueden provocar variaciones en la calidad de las células preparadas y en los resultados de análisis o diagnósticos posteriores. (30)

Se pueden realizar un procesamiento y preparación de células automatizados e integrados para obtener muestras preparadas de manera más uniforme. Algunos dispositivos microfluídicos pueden realizar una de las etapas de preparación celular. M. A. McClain, et al. han mostrado un microcanal para la lisis celular en el chip utilizando campo eléctrico. (31) La centrifugación (y el lavado) convencional se puede realizar antes (y después) de la lisis celular en el chip. Asimismo, las estructuras distintivas de estos dispositivos pueden dar lugar a dificultades en la integración de nivel superior. J. Nguyen, et al. han presentado un sistema PDMS microfluídico para la preparación y análisis de células sanguíneas en el chip, (32) que tiene un diseño de múltiples secciones funcionales y puede necesitar controles de fluidos precisos para funcionar correctamente.

Otros dispositivos de preparación y procesamiento de células incluyen un dispositivo de "centrifugado en el chip" para la preparación de células utilizando canales simples de forma rectangular. (33) El mecanismo de separación subyacente de los vórtices en el chip puede limitar la eficiencia de captura de células al 20 % y la pureza al 40 %. Los dispositivos microfluídicos integrados para el tratamiento químico con alta eficiencia de captura de células pueden verse limitados por la difusión del producto químico de tratamiento. La difusión del producto químico de tratamiento puede causar una contaminación en la salida por el producto químico de tratamiento y una disminución de la concentración efectiva del producto químico de tratamiento. Se puede utilizar una alta velocidad de fluido para evitar esta difusión. En un dispositivo, se utiliza la fuerza de elevación inercial como mecanismo de separación para proporcionar una eficiencia de captura de células muy alta. (34) Las células se dirigen a una corriente de carbonato de sodio desde un tampón de suspensión de hematoxilina con una corriente de ácido acético como barrera de difusión para evitar la mezcla de carbonato de sodio y tampón de suspensión de hematoxilina. La velocidad del fluido puede ser de -0,6 m/s para una constante de difusión de producto químico de tratamiento de 10-9 m2/s, que se puede conseguir mediante una incubación separada en el chip o fuera del chip.

K. Morton et al. han presentado un método para el procesamiento de células en chip en un chip microfluídico de flujo continuo, en el que se utilizan matrices de desplazamiento lateral determinista (d Ld ) para mover las células diana hacia el interior y después hacia el exterior de una corriente de procesamiento químico de tratamiento. (35) Se pueden usar altas velocidades de fluido para evitar la difusión del producto químico de tratamiento. El diseño del dispositivo y la alta eficiencia de captura de células y pureza (36, 37) hacen que el dispositivo sea atractivo. En este ejemplo, se ha demostrado que un enfoque de preparación y procesamiento de células en el chip logra tanto un tiempo de incubación prolongado como una contaminación baja del exceso de producto químico de tratamiento utilizando matrices de DLD "separadas por paredes". El dispositivo es un dispositivo microfluídico de tres entradas (corriente de muestra, corriente de tratamiento y corriente de lavado) para tinción y lavado de leucocitos en el chip utilizando rodamina 6G (R6G) con poca contaminación de salida. Las moléculas de R6G se pueden utilizar como colorante de tinción en análisis biológicos (38) y pueden tener una constante de difusión de 4x10-10m2/s en agua, próxima a la del etanol, metanol y 1-2 órdenes de magnitud mayor que la de los anticuerpos monoclonales, (39) todos los cuales pueden utilizarse en tratamientos químicos y biológicos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño de dispositivo microfluídico

La FIG. 48A demuestra el diseño de matriz de desplazamiento lateral determinista (DLD) "separada por paredes". La entrada incluye tres corrientes: una corriente de muestra (sangre diluida en los presentes experimentos), una corriente de tratamiento (tal como productos químicos de tinción) y una corriente de lavado (tal como tampón de albúmina de suero bovino (BSA)). La salida incluye dos corrientes: el producto de las células tratadas y lavadas, y los desechos. En la región central hay una matriz DLD que consiste en una matriz de postes ligeramente inclinados en un ángulo pequeño e de la dirección de flujo en promedio impuesta por las paredes. Las células más pequeñas que un tamaño crítico D^c (celda pequeña en la FIG. 48B) pueden seguir la corriente que ondea alrededor de los postes en una dirección horizontal promedio, como se indica por la flecha negra. Las células más grandes que este tamaño crítico (célula diana en la FIG. 48B) puede seguir el eje de la matriz de postes, "impactando" y desviándose del poste en cada columna como se indica por la flecha roja. (40) Las células grandes se mueven hacia el interior de la corriente de tratamiento para ser tratadas y luego salen de la corriente de tratamiento para lavarse y recogerse como producción de producto (FIG. 48A). (34) El tamaño crítico puede determinarse mediante la geometría de la matriz d Ld . (40) En este trabajo, como se muestra en la FIG. 48B, con postes esféricos de d = 18 pm de diámetro y espacios g = 18 m entre los postes, y e = 1,36 °, el tamaño crítico (Dc) es de aproximadamente 6 pm. Los bordes de la pared de la matriz DLD están diseñados de acuerdo con las directrices de D. W. Inglis. (41)

Una primera pared puede prevenir cualquier difusión de producto químico (indicado por el sombreado de la FIG. 48A) hacia la salida mientras se incuban las células. Las células o partículas diana se concentran en la primera pared separadora de longitud l ⁱ = 2 cm, y luego se dirigen al interior de la corriente de lavado. Después de la primera pared separadora, las células diana pueden impactar por la matriz de DLD e impulsarse hacia el interior y a través de la corriente de lavado para ser recogidas. La corriente de tratamiento ahora puede difundirse libremente a la salida del producto y la difusión a la salida del chip se limita solo a esta región, mientras que la matriz DLD convencional tiene difusión a la salida de producto que tiene lugar en toda la matriz. El producto químico de tratamiento puede tener un tiempo de difusión más corto en la matriz DLD "separada por paredes" que en la matriz DLD convencional. La difusión en esta última región se puede volver a suprimir añadiendo una segunda pared separadora, de longitud I² = 1 cm en el diseño actual. La segunda pared separadora puede reducir la posibilidad de que una porción de los reactivos químicos se difunda hacia el canal de salida. El espacio (W^{1& 2}) entre la primera y la segunda pared separadora es de 90 pm, y puede ser lo más pequeño posible para evitar que el producto químico de tratamiento llegue a la corriente de lavado, pero puede ser lo suficientemente grande como para evitar la obstrucción de las células diana.

Fabricación y funcionamiento del dispositivo

Se fabricaron dispositivos con y sin paredes separadoras en obleas de silicio utilizando técnicas estándar de microfabricación. Se formaron máscaras de grabado sobre las obleas de silicio usando fotolitografía de una sola capa (Karl Suss, MA6) con fotorresistente AZ 4330 (AZ Electronic Materials, Estados Unidos) y revelador AZ 300 MIF. Después, las muestras se grabaron anisotrópicamente a 120 pm de profundidad usando un Samco RIE800iPB para grabado profundo con iones reactivos (DRIE). Las entradas y salidas son orificios pasantes a través de la oblea creados mediante chorro de arena usando partículas de óxido de aluminio de 50 pm de diámetro (PrepStart, Danville Engineering, Estados Unidos). Los dispositivos se sellaron con cinta selladora de poliolefina 3M 9795R con un cubreobjetos de vidrio en la parte inferior ("Tapa" en la FIG. 48C). Los dispositivos se montaron en una plantilla de policarbonato (FIG. 48C) conectada a una bomba de jeringa externa (Fusion 400, Chemyx, Estados Unidos). A continuación, se aplicaron filtros de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,2 pm a la plantilla para permitir que el aire saliera del colector. Finalmente, se utilizó una placa de metal de acero inoxidable con una ventana para observación microscópica para sujetar los dispositivos y la plantilla de policarbonato.

Se utilizó un microscopio invertido (Nikon Eclipse Ti) para obtener imágenes de la distribución de R6G fluorescente y células marcadas en los dispositivos, con lámpara de mercurio de alta presión como fuente de excitación con un conjunto de filtros de fluorescencia correspondiente (TRITC, excitación de 532-556 nm y emisión de 570-613 nm). Las imágenes y películas se grabaron utilizando una cámara CCD CoolSNAP ES2 y el software NIS-Elements.

La FIG. 48D muestra la bomba de jeringa y el sistema microfluídicos en su totalidad. El sistema y los tubos primero se aclararon y humedecieron con tensioactivo Pluronic F108 desgasificado al 0,2% en agua desionizada y después con el tampón de ejecución (véase más adelante). A continuación, la solución de muestra como corriente de entrada de muestra, la solución de tinción como corriente de entrada del tratamiento y el tampón de ejecución como corriente de entrada de lavado se cargaron en la bomba de jeringa como entradas del dispositivo y se impulsaron a través del sistema microfluídico para realizar experimentos. La bomba de jeringa se hizo funcionar en el intervalo de 0,1 pl/min a 100 pl/min (tasa de volumen total de 0,3 pl/min a 300 pl/min para las tres entradas) para formar una velocidad de fluido promedio en los espacios de los postes que varía de aproximadamente 140 pm/s a 14 cm/s.

Preparación de muestras experimentales

El tampón de ejecución contenía NaCl 150 mM a pH 7,2 que contenía NaN3 al 0,09%, BSA al 1% y EDTA 7 mM. Se podría añadir D-fenilalanil-prolil-arginil clorometilcetona (PPACK) 40 pM al tampón de ejecución para reducir aún más la obstrucción en el chip durante un uso prolongado del dispositivo (> 30 minutos). (42) Se diluyó sangre venosa anticoagulada con EDTA (comprada en Interstate Blood Bank, Inc., Memphis, TN, Estados Unidos) 1:3 con el tampón de ejecución como solución de muestra. Después, la sangre diluida se utilizó directamente como entrada de corriente de muestra, sin etapas de centrifugación o lisis. La solución de tinción (la entrada de la corriente de tratamiento) fue de 20 pg/l de R6G en el tampón de ejecución.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Difusión de productos químicos de tratamiento

En las FIG. 50A y B se muestran los resultados de la simulación de la concentración relativa del producto químico de tratamiento (la relación entre la concentración del producto químico de tratamiento y la de la corriente química de entrada) para dispositivos sin pared separadora, con una pared separadora y con dos paredes separadoras usando COMSOL. La constante de difusión del producto químico de tratamiento se estableció en 4*10'10 m2/s (la constante de difusión de R6G) y los postes se omitieron de la estructura de simulación por simplicidad de cálculo. La concentración relativa del producto químico de tratamiento se mostró en la entrada del chip, la parte intermedia del chip y la salida del chip. La reducción de la contaminación por el producto químico de tratamiento en la salida del producto provocada por la primera y segunda paredes separadoras puede verse por estos resultados de simulación. A una velocidad de fluido promedio de 100 pm/s para el diseño con solo la primera pared separadora (FIG. 49A), el producto químico de tratamiento fue bloqueado por la primera pared separadora, pero todavía quedaba tiempo suficiente en la última sección del chip para difundirse sin límites a través de toda la trayectoria de flujo, de modo que el diseño de 1 pared es un poco mejor que el diseño convencional sin pared. La contaminación en la salida del producto se calculó como la concentración relativa promedio del producto químico de tratamiento sobre el canal de salida del producto de 60 pm de anchura. Mediante la implementación de la segunda pared separadora, esta contaminación relativa se puede reducir a 0,14. Con la velocidad promedio del fluido de 1 cm/s (FIG. 49B), se redujo el tiempo de difusión, pero el diseño convencional todavía tenía una contaminación de salida de concentración relativa de aproximadamente 0,1. La contaminación de salida se redujo aproximadamente 4,6 veces con el primer diseño de pared separadora y se puede reducir aún más utilizando dos paredes separadoras hasta 0,017.

La difusión de R6G en las matrices fabricadas sin y con paredes separadoras se midió experimentalmente mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa. De manera similar a los resultados de la simulación, la contaminación de salida debida a la difusión de R6G se evaluó mediante la concentración relativa promedio de R6G que entra en la salida del producto. La concentración relativa de R6G se definió como la relación entre la intensidad de fluorescencia de R6G y la de la entrada de la corriente de tratamiento, ya que la intensidad de fluorescencia de R6G tiene una relación lineal con su concentración a baja concentración. (43) Las FIG. 50A y B muestran las imágenes de fluorescencia de las regiones de entrada, intermedia y de salida de matrices DLD sin y con paredes separadoras de la misma longitud, pero con dimensiones por lo demás idénticas. A una velocidad promedio del fluido de 1,4 mm/s en espacios de postes, la contaminación en la salida del producto casi alcanzó un nivel saturado de aproximadamente 0,3 en la matriz DLD convencional (FIG. 50A). En la matriz separada por paredes, la presencia de las paredes separadoras condujo a una reducción de la contaminación de salida de 3 veces hasta aproximadamente 0,1 (FIG.

50B).

Los resultados del experimento a diferentes velocidades de fluido coincidieron bien con la simulación numérica, como se muestra en la FIG. 50C. (La velocidad promedio del fluido se usó para la simulación COMSOL y la velocidad promedio del fluido en los espacios de los postes se usó para los experimentos). La contaminación de salida dependía de la rapidez con la que se produce la difusión del producto químico de tratamiento en comparación con la velocidad a la que el fluido se mueve a través del dispositivo, caracterizada clásicamente por el número de Peclet. Para un dispositivo sin paredes separadoras, una velocidad crítica (v^c) puede ser una a la que la longitud de difusión L^{d = ^}D ^~t es igual a la distancia desde la corriente de tratamiento hasta la situación de la salida del producto, que es ww, la anchura de la corriente de lavado, donde ^t~ L^tot/v ^c es el tiempo que el fluido está en el dispositivo, y L^tot es la longitud total del dispositivo. Por lo tanto, una velocidad de fluido crítica se puede escribir como:

Para una matriz DLD convencional, la línea vertical negra punteada en la FIG. 50C puede indicar esta velocidad crítica del fluido de 300 pm/s. A una velocidad de fluido inferior a vc, w^w<L^d y la contaminación alcanza una meseta. A una velocidad de fluido superior a Vc, w^w>L^d y la contaminación se reduce.

Para la matriz DLD "separada por paredes", el tiempo de difusión en el dispositivo se puede reducir de (iⁱ+Í²)/v a I²/V, donde v es la velocidad promedio del fluido, y la 2a pared separadora en la última región del dispositivo puede evitar además que algún producto químico de tratamiento pueda moverse a la salida. La mejora en la reducción de la contaminación de salida fue de 3 a 10 veces, dependiendo de la velocidad de fluido (FIG. 50C). Por ejemplo, a partir de los resultados experimentales, a una velocidad media de fluido de 14 mm/s en los espacios de los postes, la concentración de R6G en el canal de salida del producto se redujo de 0,07 sin paredes separadoras a solo 0,01 con la implementación de paredes separadoras.

Tiempo de incubación vs. contaminación de salida

El tiempo mínimo de incubación puede ser un factor clave en las aplicaciones de preparación y procesamiento de células en el chip. El tiempo mínimo de incubación se estimó en la matriz DLD "separada por paredes". Las células que fluyen dentro del dispositivo en el límite más alto experimentaron el tiempo de incubación mínimo (P1 en FIG.

48A). Este tiempo mínimo de incubación t^{m in} en la matriz DLD separada por paredes se estimó como:

^{í ,} ^{e l - w T - w s} _{tm n in} _{-----------------} _I----- 1 _{-------------} ₍₂₎

e v célu la ,D L D e v m áx

dónde w^t y ws son las anchuras de la corriente de tratamiento y la corriente de muestra respectivamente, V^{c é iu}i^{a, d l d} es la velocidad de la célula en la matriz DLD, y v^{m á x} es la velocidad máxima del fluido en los espacios. Cuando las células diana fluyen en la matriz DLD, su velocidad puede cambiar periódicamente de rápida en los espacios a lenta en las regiones abiertas. Para estimar el tiempo mínimo de incubación, la velocidad del fluido en los espacios de los postes se utilizó de forma conservadora. Las células diana que estaban por encima del tamaño crítico y, por lo tanto, "impactaron" con los postes en cada columna de obstáculos, se movieron a lo largo de los postes a medida que seguían el ángulo de inclinación (célula diana en la FIG. 48B). Suponiendo que la célula diana grande se movía a la velocidad del fluido de la línea de corriente donde estaba el centro de la célula y un perfil de flujo parabólico, la velocidad de la célula fue v^{cé iu la , d l d}~ 4v^{m á x} (r^{cé iu la}/g-r¡:élula/g2), donde r^{c é u a} era el radio de las células diana (se supone r^{c é lu la} de 3,5 p para los leucocitos), y v^{m á x} era la velocidad máxima del fluido en los espacios de los postes y era 1,5 veces la velocidad promedio del fluido. (30)

El primer término de la ecuación (2) es la aproximación del tiempo de incubación en la matriz DLD convencional. El segundo término de la ecuación (2) es el tiempo de incubación adicional ganado al implementar la primera pared separadora. A medida que la célula diana se mueve más a través de la matriz DLD, se puede recoger contra la primera pared separadora y se puede conducir gradualmente a una posición de equilibrio donde la fuerza de elevación del efecto de la pared y la fuerza de elevación del gradiente de cizallamiento se equilibran. (44) A partir de observaciones experimentales, la posición de equilibrio de los leucocitos estaba cerca de la mitad del espacio donde la velocidad del fluido alcanza un máximo (vmáx) (FIG. 48B). El tiempo de incubación se puede aumentar aumentando la longitud total de la primera pared separadora sin penalización por la contaminación del producto químico de tratamiento en la salida del producto.

En la FIG.51 se muestran los resultados de simulación experimental y COMSOL de la contaminación de salida relativa frente al tiempo mínimo de incubación calculado de acuerdo con la ecuación (2) para las matrices DLD convencionales (negro) y "separadas por pared" (rojo). En caso de alta velocidad de fluido, tanto el tiempo de incubación como la contaminación de salida fueron bajos. Ambos parámetros aumentaron a medida que disminuía la velocidad del fluido. Para una prueba de tinción de leucocitos, se seleccionó la velocidad promedio del fluido en los espacios de los postes de 2,8 mm/s (indicada por las líneas de trazos rojos) como una condición experimental de tinción de leucocitos en el chip, con un tiempo de incubación mínimo de ~ 4 s y una contaminación de salida de producto de 0,067. Como se muestra en los experimentos posteriores, los leucocitos se tiñeron con una intensidad de fluorescencia reconocible en comparación con una intensidad de fondo de contaminación muy baja en esta situación.

El dispositivo con pared separadora se usó después para demostrar la tinción y el lavado en el chip de leucocitos con R6G, utilizando sangre completa diluida como entrada de corriente de muestra. R6G puede difundirse al interior de las células y adherirse a sus mitocondrias. (39) La matriz separó los leucocitos de la corriente de muestra y luego los dirigió al tratamiento y las corrientes de lavado posteriores. El tamaño crítico (Dc) era de aproximadamente 6 pm en la matriz DLD medida por perlas fluorescentes de diferentes tamaños, que estaba por debajo del tamaño de la mayoría de los leucocitos. El diámetro de los eritrocitos fue de aproximadamente 6 a 8 |jm. Sin embargo, debido a su forma bicóncava distintiva, se alinearon con el flujo de fluido para comportarse como partículas pequeñas y no se desplazaron en la matriz, siguiendo así la dirección promedio del fluido. (45) Además, el tamaño del otro contenido (plaquetas, proteínas, etc.) de la sangre era mayoritariamente menor de 6 jm , de modo que solo se recogieron leucocitos de la corriente de muestra. Se utilizó microscopía fluorescente para rastrear las trayectorias y la tinción de las células (FIG.

52). En la región de entrada, no se pudieron ver leucocitos fluorescentes u otras células, ya que las células aún no estaban marcadas (FIG. 50B). A continuación, los leucocitos se concentraron e incubaron a lo largo de la primera pared separadora en la región intermedia de la matriz DLD separada por paredes B (FIG. 51A FIG. 50B). Finalmente, los leucocitos marcados se recogieron en la salida del producto (FIG. 50B) y eran visibles (FIG. 51B). El recuadro de FIG. 51B muestra la salida de producto y la salida de desechos obtenidos de un experimento de 200 j l de sangre diluida. Puede indicarse una buena separación de leucocitos de eritrocitos por la notable diferencia de color. En la imagen de fluorescencia de la corriente de salida del producto, se encontraron pocos antecedentes de fluorescencia, lo que indica una buena tinción por R6G y baja contaminación de R6G sin reaccionar en la salida del producto.

CONCLUSIÓN

Este ejemplo presenta una matriz DLD separada por paredes para la recolección de células, procesamiento químico y lavado integrados en un chip. El diseño "separado por paredes" puede mejorar la compensación entre tiempos prolongados de tratamiento químico y baja contaminación de salida a baja velocidad del fluido, permitiendo tanto (i) un mayor tiempo de incubación, como (ii) una menor contaminación del producto químico de tratamiento en la salida del producto. Los leucocitos se pueden separar de la sangre completa, teñirse con R6G y lavarse en un solo dispositivo de matriz DLD sin ningún procesamiento previo de la sangre o manipulación manual entre las etapas. El dispositivo también se puede aplicar a otras etapas de procesamiento y lavado en el chip, tales como el marcaje con anticuerpos monoclonales, fijación/permeabilización y otras aplicaciones novedosas.

Ejemplo 23: Purificación de glóbulos blancos (WBC) de sangre completa utilizando DLD con diferentes formas de sección transversal de obstáculos

Se utilizaron chips microfluídicos con obstáculos para purificar glóbulos blancos (WBC) a partir de sangre completa. El diseño de las formas de las secciones transversales de los obstáculos puede permitir obtener un alto rendimiento de glóbulos blancos (WBC) y una baja contaminación debida a los glóbulos rojos (RBC).

Se usaron chips microfluídicos con obstáculos que tenían una sección transversal en forma de diamante, (o un cuadrado girado, donde un vértice del cuadrado girado apunta en la dirección del flujo de la muestra), una sección transversal en forma de triángulo, una sección transversal de forma redonda, una sección transversal de forma cuadrada y una sección transversal de forma de cuarto de círculo para purificar los glóbulos blancos (WBC) de muestras de sangre completa. Los caudales de las muestras fueron de aproximadamente 40 ml/hora.

Cada uno de los chips microfluídicos era de silicio con una única matriz DLD grabada a una profundidad de 150 jm . La velocidad promedio en los espacios fue de aproximadamente 10 cm/segundo. Cada matriz DLD tenía una inclinación de 1/42. Los espacios en cada matriz tenían 17 jm de anchura y los obstáculos tenían un tamaño de 19 jm . La muestra de sangre utilizada en los experimentos se diluyó 1:4 en un tampón de ejecución (tampón PBS) con una concentración final de EDTA 5 mM, PPACK 40 jM y BSA al 1 %. Se pasaron volúmenes iguales de la muestra de sangre y el tampón de ejecución a través del chip simultáneamente de modo que se recogieron los glóbulos blancos (WBC) de la muestra de sangre en el tampón de ejecución libre de glóbulos rojos (RBC). La velocidad se midió por el caudal promedio dividido por el área de la sección transversal del canal a través del cual fluía el fluido. La velocidad de cizallamiento se calculó como la velocidad promedio dividida por la mitad de la anchura del espacio.

Los rendimientos de glóbulos blancos (WBC) y las tasas de contaminación de glóbulos rojos (RBC) se muestran en FIG. 53A para matrices con obstáculos con diferentes formas de sección transversal. Entre los obstáculos con diferentes formas de sección transversal utilizados en los experimentos, una matriz con obstáculos con una sección transversal de diamante purificó glóbulos blancos (WBC) con el máximo rendimiento (más del 80 %) y con la menor contaminación por glóbulos rojos (RBC) (menos del 0,01 %).

La separación de glóbulos blancos (WBC) y glóbulos rojos (RBC) y la contaminación por glóbulos rojos (RBC) pueden verse afectadas por los efectos de inercia creados por obstáculos con diferentes formas de sección transversal. La FIG.53B muestra los efectos de inercia creados por obstáculos con secciones transversales de diamante, triangulares y circulares. Los efectos de inercia dan como resultado un desplazamiento lateral extra (dirección x) con postes triangulares asimétricos, pero no con postes circulares o de diamante. Los obstáculos con diferentes formas de sección transversal pueden causar diferentes niveles de deformación de los glóbulos blancos (WBC). Los obstáculos con secciones transversales de diamante crearon menos fuerza de cizallamiento en comparación con los obstáculos con secciones transversales circulares como se muestra en la FIG.53C. La alta velocidad de cizallamiento en una longitud de arco larga, que se puede observar con postes de sección circular, no se observa con postes con una sección transversal en forma de diamante. Una alta velocidad de cizallamiento en una longitud de arco larga puede provocar una deformación de glóbulos blancos (WBC) que puede dar como resultado bajos rendimientos.

Ejemplo 24: Resumen de microchips DLD

Producto de Microchip del Ejemplo 13 n. ° 1-Lava glóbulos blancos (WBC) humanos de sangre humana después del mareaje de superficie convencional.

Producto de Microchip del Ejemplo 14 n. ° 2-Lava glóbulos blancos (WBC) fijados/permanentes después de la fijación/permeabilización convencional.

Producto de Microchip del Ejemplo 15 n. ° 3-Lava glóbulos blancos (WBC) con marcaje intracelular después del marcaje intracelular convencional.

Producto de Microchip del Ejemplo 16 n. ° 4-Recoge glóbulos blancos (WBC) humanos de sangre humana que se somete a marcaje de superficie y se lava en el chip.

Producto de Microchip del Ejemplo 17 n. ° 5-Recoge glóbulos blancos (WBC) humanos marcados en la superficie que se fijan/permeabilizan, se lavan en el chip, y se tiñen con un tinte intracelular fuera del chip.

Producto de Microchip del Ejemplo 18 n. ° 6-Los glóbulos blancos (WBC) de sangre humana se tiñen en la superficie y se fijan/permeabilizan fuera del chip, después se tiñen intracelularmente y se lavan en el chip.

Producto de Microchip del Ejemplo 19 n. ° 7-Un sistema de chip DLD microfluídico para fijación/permeabilización en el chip, marcaje intracelular de glóbulos blancos (WBC), con lavado y concentración en el chip.

Ejemplo 25: Aislamiento de glóbulos blancos (WBC) usando diferentes configuraciones de chip

A: Se diluyó sangre de un día (Interstate Blood Bank) 1:5 (1 parte de sangre, 4 partes de tampón (BSA 1%/PBS)), Se añadió EDTA a 7 mM y PPACK a 40 j M), la muestra se procesó en un chip de silicio a una velocidad de entrada de muestra de 15 jl/m in y a una velocidad de entrada de tampón de 45 jl/min. El chip de silicio comprendía una matriz DLD de 3 zonas. La matriz DLD de 3 zonas tenía 3 zonas de postes circulares de desplazamiento de fila 1/10 y una profundidad de 100 jm . Las 3 zonas tenían postes de 27 jm , 18 jm y 11 jm respectivamente. Las 3 zonas tenían espacios de 18 jm , 12 jm u 11 jm , respectivamente. La longitud de cada matriz era de 1 cm, 1 cm y 1,2 cm, respectivamente. La longitud total, incluidas las regiones de entrada y salida, fue de 7 cm. La FIG. 56 muestra la matriz 3 con 11 postes jm y espacios de 11 jm . Se añadió un volumen de entrada de 900 j l de muestra durante 60 min y se utilizaron 2,7 ml de tampón. Se recogieron aproximadamente 1,8 ml de producto a través de la salida de la FIG. 56.

El rendimiento de glóbulos blancos (WBC) fue del 71 %.

B: Se diluyó sangre de un día (Interstate Blood Bank) 1:5 (1 parte de sangre, 4 partes de tampón (BSA 1%/PBS)), Se añadió EDTA a 7 mM y PPACK a 40 j M), la muestra se procesó en un chip de silicio a una velocidad de entrada de muestra de 15 jl/m in y a una velocidad de entrada de tampón de 45 jl/min. El chip de silicio comprendía una matriz DLD de 3 zonas. La matriz DLD de 3 zonas tenía 3 zonas de postes circulares de desplazamiento de fila 1/10 y una profundidad de 100 jm . Las 3 zonas tenían postes de 27 jm , 18 jm y 11 jm respectivamente. Las 3 zonas tenían espacios de 18 jm , 12 jm u 11 jm , respectivamente. La longitud de cada matriz era de 1 cm, 1 cm y 1,2 cm, respectivamente. La longitud total, incluidas las regiones de entrada y salida, fue de 7 cm. La FIG. 57 muestra la matriz 3 con 11 postes jm y espacios de 11 jm . Se añadió un volumen de entrada de 900 j l de muestra durante 60 min y se utilizaron 2,7 ml de tampón. Se recogieron aproximadamente 1,5 ml de producto a través de la salida de la FIG. 57.

El rendimiento de glóbulos blancos (WBC) fue del 83 %.

C: Se diluyó sangre de un día (Interstate Blood Bank) 1:5 (1 parte de sangre, 4 partes de tampón (BSA 1%/PBS)), Se añadió EDTA a 7 mM y PPACK a 40 j M), la muestra se procesó en un chip de silicio a una velocidad de entrada de muestra de 15 jl/m in y a una velocidad de entrada de tampón de 45 jl/min. El chip de silicio comprendía una matriz DLD de 3 zonas. La matriz DLD de 3 zonas tenía 3 zonas de postes circulares de desplazamiento de fila 1/10 y una profundidad de 100 jm . Las 3 zonas tenían postes de 27 jm , 18 jm y 11 jm respectivamente. Las 3 zonas tenían espacios de 18 jm , 12 jm u 11 jm , respectivamente. La longitud de cada matriz era de 1 cm, 1 cm y 1,2 cm, respectivamente. La longitud total, incluidas las regiones de entrada y salida, fue de 7 cm. La FIG. 58 muestra la matriz 3 con 11 postes jm y espacios de 11 jm . Se añadió un volumen de entrada de 900 j l de muestra durante 60 min y se utilizaron 2,7 ml de tampón. Se recogieron aproximadamente 1,0 ml de producto a través de la salida de la FIG. 58.

El rendimiento de glóbulos blancos (WBC) fue del 75 %.

Los resultados del análisis se resumen en la Tabla 9 :

continuación

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Si bien se han mostrado y descrito en el presente documento realizaciones preferidas, será obvio para los expertos en la materia que tales realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. A los expertos en la materia se les ocurrirán ahora numerosas variaciones, cambios y sustituciones sin apartarse de las descripciones proporcionadas en el presente documento. Debe entenderse que se pueden emplear diversas alternativas a las realizaciones descritas en el presente documento al poner en práctica los métodos y dispositivos descritos en el presente documento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo microfluídico para purificar primeras partículas de un tamaño predeterminado a partir de una muestra, comprendiendo el dispositivo:

a) un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas hasta una pluralidad de salidas;

b) una primera matriz de obstáculos de desplazamiento lateral determinista (DLD) dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos está desplazada lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de menos del tamaño predeterminado en la muestra a una segunda salida, y en donde:

i) las superficies de dos obstáculos adyacentes en una fila de la matriz de obstáculos definen un espacio; ii) los dos obstáculos que definen un espacio tienen cada uno una sección transversal poligonal; y iii) los vértices de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apuntan uno hacia el otro en una dirección sustancialmente perpendicular a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos;

c) una incubadora que comprende un primer portal conectado fluídicamente con la primera salida del dispositivo microfluídico y un segundo portal conectado fluídicamente con una segunda fuente de líquido.

2. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde el espacio definido por las superficies de dichos dos obstáculos adyacentes comprende una forma que está simétricamente orientada con respecto a un plano paralelo a la dirección de flujo de una muestra a través de la matriz de obstáculos y equidistante del centro de la sección transversal de cada uno de los dos obstáculos en la fila.

3. El dispositivo de la reivindicación 2, en donde la sección transversal poligonal es una sección transversal de un cuadrilátero cíclico, cometa, paralelogramo, rombo, oblongo, romboide, rectángulo, cuadrilátero tangencial, trapezoide, trapecio o trapezoide isósceles.

4. El dispositivo de la reivindicación 2, en donde las primeras partículas de un tamaño predeterminado son leucocitos.

5. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicha incubadora es una incubadora de flujo continuo.

6. El dispositivo de la reivindicación 5, donde la incubadora comprende un canal serpenteante y donde un equilibrador está conectado de forma fluida a una segunda salida del dispositivo.

7. El dispositivo de la reivindicación 5, en donde el espacio definido por las superficies de dichos dos obstáculos adyacentes comprende una forma que está orientada asimétricamente en un plano que se extiende a través del centro del espacio y que es paralela a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos.

8. El dispositivo de la reivindicación 7, en donde la sección transversal poligonal es una sección transversal de un cuadrilátero cíclico, cometa, paralelogramo, rombo, oblongo, romboide, rectángulo, cuadrilátero tangencial, trapezoide, trapecio o trapezoide isósceles.

9. El dispositivo de la reivindicación 7, en donde las primeras partículas de un tamaño predeterminado son leucocitos.

10. El dispositivo de la reivindicación 5, en donde el flujo a través de la incubadora está conectado fluídicamente a un segundo canal, que está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, y en donde el segundo canal comprende una segunda matriz de obstáculos DLD.

11. El dispositivo de la reivindicación 10, en donde la incubadora comprende un canal serpenteante y donde un equilibrador está conectado de forma fluida a una segunda salida del dispositivo.

12. El dispositivo según la reivindicación 5, en donde la incubadora está configurada para mezclar un líquido en la incubadora.

13. Un método para purificar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, en donde las primeras partículas comprenden leucocitos o células madre, comprendiendo el método:

a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado y, opcionalmente, segundas partículas de menos del tamaño predeterminado; y

b) pasar la muestra a través de al menos un dispositivo de la reivindicación 1, en donde:

i) las primeras partículas purificadas entran en la incubadora desde la primera salida del dispositivo;

ii) el segundo líquido también entra en la incubadora y comprende un reactivo seleccionado del grupo que consiste en un agente de unión que se une a un señalizador de la superficie celular; una sonda de ADN; una enzima; un fármaco; un agente de permeabilización y un fijador; y

c) en donde dicha incubadora es una incubadora de flujo continuo.

14. El método de la reivindicación 13, en donde el flujo a través de la incubadora está conectado flídicamente a un segundo canal en donde el segundo canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, y el segundo canal comprende una segunda matriz de obstáculos DLD.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la incubadora comprende un canal serpenteante y donde un equilibrador está conectado de forma fluida a una segunda salida del dispositivo.