ES2839998T3

ES2839998T3 - Methods and systems for processing particles

Info

Publication number: ES2839998T3
Application number: ES15827324T
Authority: ES
Inventors: Michael Grisham; Curt I Civin; James C Sturm; Robert H Austin; Joseph D'silva; Yu Chen
Original assignee: University of Maryland Baltimore; Princeton University; GPB Scientific Inc; University of Maryland College Park
Current assignee: University of Maryland Baltimore; Princeton University; University of Maryland College Park; Curate Biosciences LLC
Priority date: 2014-08-01
Filing date: 2015-08-03
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2035-08-03
Also published as: WO2016019393A1; DK3174976T3; EP3174976A1; EP3174976B1; EP3174976A4

Abstract

Un dispositivo microfluídico para purificar primeras partículas de un tamaño predeterminado a partir de una muestra, comprendiendo el dispositivo: a) un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas hasta una pluralidad de salidas; b) una primera matriz de obstáculos de desplazamiento lateral determinista (DLD) dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos está desplazada lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de menos del tamaño predeterminado en la muestra a una segunda salida, y en donde: i) las superficies de dos obstáculos adyacentes en una fila de la matriz de obstáculos definen un espacio; ii) los dos obstáculos que definen un espacio tienen cada uno una sección transversal poligonal; y iii) los vértices de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apuntan uno hacia el otro en una dirección sustancialmente perpendicular a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos; c) una incubadora que comprende un primer portal conectado fluídicamente con la primera salida del dispositivo microfluídico y un segundo portal conectado fluídicamente con una segunda fuente de líquido.A microfluidic device for purifying first particles of a predetermined size from a sample, the device comprising: a) a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets; b) a first deterministic lateral displacement (DLD) obstacle matrix arranged in rows in the channel, wherein each subsequent row of obstacles is laterally offset with respect to a previous row, wherein the obstacle matrix is configured to differentially deflect the first particles of at least a predetermined size to a first exit and second particles of less than the predetermined size in the sample to a second exit, and wherein: i) the surfaces of two adjacent obstacles in a row of the obstacle matrix define a space; ii) the two obstacles defining a space each have a polygonal cross section; and iii) the vertices of each of the two obstacles with the polygonal cross section point towards each other in a direction substantially perpendicular to a direction of flow of the sample through the obstacle matrix; c) an incubator comprising a first portal fluidly connected to the first outlet of the microfluidic device and a second portal fluidly connected to a second source of liquid.

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Métodos y sistemas para procesar partículasMethods and systems for processing particles

AntecedentesBackground

Existe la necesidad de métodos mejorados para el tratamiento químico y/o enzimático, lavado y aislamiento de partículas (por ejemplo, células) obtenidas de muestras que comprenden partículas (por ejemplo, células). También existe la necesidad de métodos mejorados para aislar partículas, por ejemplo, células, a partir de una muestra. There is a need for improved methods for the chemical and / or enzymatic treatment, washing and isolation of particles (eg, cells) obtained from samples comprising particles (eg, cells). There is also a need for improved methods of isolating particles, eg cells, from a sample.

SumarioSummary

En un primer aspecto, la invención proporciona un dispositivo microfluídico para purificar primeras partículas de un tamaño predeterminado a partir de una muestra, comprendiendo el dispositivo: a) un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas hasta una pluralidad de salidas; b) una primera matriz de obstáculos de desplazamiento lateral determinista (DLD) dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de menos del tamaño predeterminado en la muestra a una segunda salida, y en donde: i) las superficies de dos obstáculos adyacentes en una fila de la matriz de obstáculos definen un espacio; ii) los dos obstáculos que definen un espacio tienen cada uno una sección transversal poligonal; y iii) los vértices de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apuntan uno hacia el otro en una dirección sustancialmente perpendicular a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos; c) una incubadora que comprende un primer portal conectado fluídicamente con la primera salida del dispositivo microfluídico y un segundo portal conectado fluídicamente con una segunda fuente de líquido.In a first aspect, the invention provides a microfluidic device for purifying first particles of a predetermined size from a sample, the device comprising: a) a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets; b) a first deterministic lateral displacement (DLD) obstacle matrix arranged in rows in the channel, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, where the obstacle matrix is configured to differentially deflect the first particles of at least a predetermined size to a first exit and second particles of less than the predetermined size in the sample to a second exit, and wherein: i) the surfaces of two adjacent obstacles in a row of the obstacle matrix define a space; ii) the two obstacles defining a space each have a polygonal cross section; and iii) the vertices of each of the two obstacles with the polygonal cross section point towards each other in a direction substantially perpendicular to a direction of flow of the sample through the obstacle matrix; c) an incubator comprising a first portal fluidly connected to the first outlet of the microfluidic device and a second portal fluidly connected to a second source of liquid.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para purificar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a partir de una muestra, en donde las primeras partículas comprenden leucocitos o células madre, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado y, opcionalmente, segundas partículas de menos del tamaño predeterminado; y b) pasar la muestra a través de al menos un dispositivo de la reivindicación 1, en donde: i) las primeras partículas purificadas entran en la incubadora desde la primera salida del dispositivo; ii) el segundo líquido también entra en la incubadora y comprende un reactivo seleccionado del grupo que consiste en un agente de unión que se une a un señalizador de la superficie celular; una sonda de ADN; una enzima; un fármaco; un agente de permeabilización y un fijador; y c) en donde dicha incubadora es una incubadora de flujo continuo.In a second aspect, the invention provides a method for purifying first particles of at least a predetermined size from a sample, wherein the first particles comprise leukocytes or stem cells, the method comprising: a) providing a sample comprising first particles of at least one predetermined size and optionally second particles of less than the predetermined size; and b) passing the sample through at least one device of claim 1, wherein: i) the first purified particles enter the incubator from the first exit of the device; ii) the second liquid also enters the incubator and comprises a reagent selected from the group consisting of a binding agent that binds to a cell surface marker; a DNA probe; an enzyme; a drug; a permeation agent and a fixative; and c) wherein said incubator is a continuous flow incubator.

En el presente documento se describen métodos, sistemas y dispositivos para el procesamiento de partículas que permitan automatizar y simplificar el proceso de preparación celular para el análisis de partículas.This document describes methods, systems and devices for the processing of particles that allow to automate and simplify the process of cell preparation for the analysis of particles.

También se describe en el presente documento un sistema para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el dispositivo: a) un primer canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; b) una primera matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de la primera matriz de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la primera matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de la muestra de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida, en donde el dispositivo está configurado de manera que las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían hacia una segunda corriente de flujo que fluye desde una segunda entrada a la primera salida mientras se desvían, en donde la segunda corriente de flujo comprende un reactivo; y c) un canal de incubadora de flujo continuo conectado fluídicamente con la primera salida, en donde el canal de incubadora de flujo continuo está conectado fluídicamente a un segundo canal, en donde el segundo canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el segundo canal comprende una segunda matriz de obstáculos. En algunos casos, el canal de incubadora de flujo continuo comprende un canal serpenteante. En algunos casos, el canal serpenteante comprende al menos 20 giros. En algunos casos, el canal serpenteante comprende una longitud total de al menos 30 mm. En algunos casos, el canal serpenteante comprende al menos 20 segmentos paralelos. En algunos casos, un segmento de los al menos 20 segmentos paralelos tiene aproximadamente 30 mm de longitud. En algunos casos, el canal serpenteante tiene una anchura de al menos 100 jm . En algunos casos, el canal serpenteante tiene una profundidad de al menos 100 |jm. En algunos casos, el canal de la incubadora de flujo continuo es un canal lineal. En algunos casos, en donde el canal de incubadora de flujo continuo comprende una estructura configurada para mover partículas en una corriente de flujo en el canal de incubadora de flujo continuo en relación con la corriente de flujo en el canal de incubadora de flujo continuo. En algunos casos, la estructura comprende una matriz de obstáculos configurados para desviar las partículas en una dirección que no es paralela a la primera corriente de flujo. En algunos casos, el canal de incubadora de flujo continuo comprende una entrada configurada para introducir una tercera corriente de flujo en el canal de la incubadora de flujo continuo. En algunos casos, el reactivo comprende un reactivo de marcaje, un agente de fijación, un reactivo de permeabilización o un tampón de lavado. En algunos casos, el sistema comprende además un equilibrador configurado para equilibrar la resistencia fluídica del sistema, en donde el equilibrador está conectado fluídicamente a la segunda salida. En algunos casos, el equilibrador está configurado para tener una resistencia fluídica que es sustancialmente la misma que la resistencia fluídica a través de la incubadora de flujo continuo. En algunos casos, el equilibrador comprende un control de presión fluídica. En algunos casos, el control de presión fluídica es capaz de generar presión negativa en el equilibrador. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo comprende un primer canal serpenteante y el equilibrador comprende un segundo canal serpenteante. En algunos casos, el segundo canal serpenteante está conectado a un tercer canal que comprende una matriz de obstáculos, en donde el tercer canal es sustancialmente similar al primer canal. En algunos casos, la primera corriente de flujo y la segunda corriente de flujo son paralelas entre sí. En algunos casos, el primer canal comprende al menos una pared separadora orientada paralela a al menos una de las corrientes de flujo, y dicha al menos una pared separadora está configurada para retrasar el flujo de partículas desviadas, en donde el retraso sirve para incrementar sustancialmente la cantidad de tiempo durante el que las partículas desviadas residen en una corriente de flujo y/o reducir sustancialmente la mezcla entre la primera corriente de flujo y la segunda corriente de flujo. En algunos casos, el sistema comprende además un componente analítico conectado fluídicamente al segundo canal. En algunos casos, el componente analítico es un clasificador de células.Also described herein is a system for processing first particles of at least a predetermined size in a sample, the device comprising: a) a first channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, wherein the channel it is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall; b) a first obstacle matrix arranged in rows in the channel, where each subsequent row of the first obstacle matrix is laterally displaced with respect to a previous row, where the first obstacle matrix is configured to differentially deflect the first particles of at least a predetermined size to a first outlet and second sample particles of a smaller than predetermined size to a second outlet, wherein the device is configured such that the first particles are introduced into a first flow stream from a first inlet and divert to a second flow stream that flows from a second inlet to the first outlet while diverting, wherein the second flow stream comprises a reagent; and c) a continuous flow incubator channel fluidically connected to the first outlet, wherein the continuous flow incubator channel is fluidically connected to a second channel, where the second channel is delimited by a first wall and a second wall opposite to the first wall, wherein the second channel comprises a second obstacle matrix. In some cases, the flow-through incubator channel comprises a meandering channel. In some cases, the meandering channel comprises at least 20 turns. In some cases, the meandering channel comprises a total length of at least 30mm. In some cases, the meandering channel comprises at least 20 parallel segments. In some cases, one segment of the at least 20 parallel segments is approximately 30mm long. In some cases, the meandering channel has a width of at least 100 µm. In some cases, the meandering channel is at least 100 µm deep. In some cases, the channel of the flow-through incubator is a linear channel. In some cases, where the flow-through incubator channel comprises a structure configured to move particles in a flow stream in the flow-through incubator channel relative to the flow stream in the flow-through incubator channel. In some cases, the structure comprises a matrix of obstacles configured to deflect the particles in a direction that is not parallel to the first flow stream. In some cases, the flow-through incubator channel comprises an inlet configured to introduce a third flow stream into the flow-through incubator channel. In some cases, the reagent comprises a labeling reagent, a binding agent, a permeabilization reagent, or a wash buffer. In some cases, the system further comprises a balancer configured to balance the fluidic resistance of the system, wherein the balancer is fluidly connected to the second outlet. In some cases, the balancer is configured to have fluid resistance which is substantially the same as the fluid resistance through the continuous flow incubator. In some cases, the balancer comprises a fluidic pressure control. In some cases, the fluidic pressure control is capable of generating negative pressure in the balancer. In some cases, the flow-through incubator comprises a first meandering channel and the balancer comprises a second meandering channel. In some cases, the second meandering channel is connected to a third channel comprising an obstacle matrix, where the third channel is substantially similar to the first channel. In some cases, the first flow stream and the second flow stream are parallel to each other. In some cases, the first channel comprises at least one separating wall oriented parallel to at least one of the flow streams, and said at least one separating wall is configured to retard the flow of deflected particles, wherein the delay serves to substantially increase the amount of time that the deflected particles reside in a flow stream and / or substantially reduce mixing between the first flow stream and the second flow stream. In some cases, the system further comprises an analytical component fluidly connected to the second channel. In some cases, the analytical component is a cell sorter.

En el presente documento se describe además un sistema para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el sistema (1) un dispositivo microfluídico, comprendiendo el dispositivo microfluídico (A) un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas hasta una pluralidad de salidas; y (B) una primera matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de la muestra de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida; y (2) una incubadora que comprende un primer portal conectado fluídicamente con la primera salida del dispositivo microfluídico y un segundo portal conectado fluídicamente con una segunda fuente de líquido. En algunos casos, la incubadora es un recipiente. En algunos casos, el recipiente es un vial de vidrio. En algunos casos, el sistema comprende además un controlador de flujo configurado para controlar el flujo en el dispositivo microfluídico o incubadora. En algunos casos, el primer portal de la incubadora es una primera entrada de la incubadora y el segundo portal es una segunda entrada de la incubadora. En algunos casos, el primer portal de la incubadora es una primera entrada de la incubadora y el segundo portal de la incubadora es una primera salida de la incubadora. En algunos casos, la segunda fuente de líquido comprende un reactivo de tratamiento. En algunos casos, la incubadora está configurada para agitar un líquido en la incubadora. En algunos casos, la incubadora está configurada para mezclar un líquido en la incubadora.Further described herein is a system for processing first particles of at least a predetermined size in a sample, the system (1) comprising a microfluidic device, the microfluidic device (A) comprising a channel extending from a plurality of inlets up to a plurality of outputs; and (B) a first obstacle matrix arranged in rows in the channel, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, where the obstacle matrix is configured to differentially deflect the first particles of at least a predetermined size to a first outlet and second sample particles of a smaller than predetermined size to a second outlet; and (2) an incubator comprising a first portal fluidly connected to the first outlet of the microfluidic device and a second portal fluidly connected to a second source of liquid. In some cases, the incubator is a container. In some cases, the container is a glass vial. In some cases, the system further comprises a flow controller configured to control flow in the microfluidic device or incubator. In some cases, the first incubator portal is a first incubator entrance and the second portal is a second incubator entrance. In some cases, the first incubator portal is a first incubator inlet and the second incubator portal is a first incubator exit. In some cases, the second liquid source comprises a treatment reagent. In some cases, the incubator is configured to shake a liquid in the incubator. In some cases, the incubator is configured to mix a liquid in the incubator.

En el presente documento se describe además un dispositivo para purificar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el dispositivo una matriz de obstáculos dispuestos en filas, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos desvía diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de menos del tamaño predeterminado en la muestra a una segunda salida, en donde las superficies de dos obstáculos adyacentes en una fila de la matriz de obstáculos definen un espacio, en donde la forma del espacio es sustancialmente simétrica con respecto a un plano paralelo a la dirección del flujo, en donde el plano es equidistante del centro de la sección transversal de cada uno de los dos obstáculos en la fila, en donde los dos obstáculos que definen un espacio tienen una sección transversal poligonal, en donde los vértices de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apuntan uno hacia el otro en una dirección sustancialmente perpendicular a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos. En algunos casos, la sección transversal poligonal es una sección transversal de un cuadrilátero. En algunos casos, la sección transversal del cuadrilátero es una sección transversal cuadrada.This document further describes a device for purifying first particles of at least a predetermined size in a sample, the device comprising a matrix of obstacles arranged in rows, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row. , wherein the obstacle matrix differentially deflects the first particles of at least a predetermined size to a first exit and the second particles of less than the predetermined size in the sample to a second exit, wherein the surfaces of two adjacent obstacles in a row of the obstacle matrix define a space, where the shape of the space is substantially symmetrical with respect to a plane parallel to the direction of flow, where the plane is equidistant from the center of the cross section of each of the two obstacles in the row, where the two obstacles that define a space have a polygonal cross section, wherein the vertices of each of the two obstacles with the polygonal cross section point towards each other in a direction substantially perpendicular to a direction of flow of the sample through the obstacle matrix. In some cases, the polygonal cross section is a cross section of a quadrilateral. In some cases, the cross section of the quadrilateral is a square cross section.

En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el método a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; b) pasar la muestra a través de un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el canal comprende una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado se desvían diferencialmente a una primera salida, y el dispositivo está configurado para desviar diferencialmente las segundas partículas de al menos un tamaño predeterminado a una segunda salida, en donde las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían a una segunda corriente de flujo que fluye desde una segunda entrada a la primera salida mientras se desvían, en donde la segunda corriente de flujo comprende un reactivo; y c) incubar las primeras partículas desviadas con el reactivo en un canal de incubadora de flujo continuo, en donde el canal de incubadora de flujo continuo está conectado fluídicamente con la primera salida, en donde el canal de incubadora de flujo continuo está conectado fluídicamente a un segundo canal, en donde el segundo canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el segundo canal comprende una segunda matriz de obstáculos. En algunos casos, el método comprende además hacer pasar las primeras partículas desviadas a través de una tercera corriente de flujo en el segundo canal. En algunos casos, la tercera corriente de flujo comprende un tampón de lavado. En algunos casos, el reactivo comprende un anticuerpo. En algunos casos, las primeras partículas comprenden células. En algunos casos, las células comprenden glóbulos blancos. En algunos casos, las primeras partículas desviadas están en la incubadora de flujo continuo durante un periodo de hasta 10 minutos. In another aspect, provided herein is a method for processing first particles of at least a predetermined size in a sample, the method comprising a) providing a sample comprising first particles of at least a predetermined size; b) passing the sample through a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, wherein the channel is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall, wherein the channel comprises a matrix of obstacles arranged in rows in the channel, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, where the first particles of at least a predetermined size are differentially deflected to a first exit, and the device is configured to differentially deflect second particles of at least a predetermined size to a second outlet, wherein the first particles are introduced into a first flow stream from a first inlet and are deflected into a second flow stream flowing from a second inlet to the first outlet while diverting, wherein the second flow stream comprises a reagent; and c) incubating the first diverted particles with the reagent in a continuous-flow incubator channel, wherein the continuous-flow incubator channel is fluidically connected to the first outlet, wherein the continuous-flow incubator channel is fluidically connected to a second channel, where the second channel is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall, where the second channel comprises a second matrix of obstacles. In some cases, the method further comprises passing the first deflected particles through a third flow stream in the second channel. In some cases, the third flow stream comprises a wash buffer. In some cases, the reagent comprises an antibody. In some cases, the first particles comprise cells. In some cases, the cells comprise white blood cells. In some cases, the first deflected particles are in the flow-through incubator for up to 10 minutes.

En el presente documento se describe además un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; b) pasar la muestra a través de un dispositivo que comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal comprende una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado se desvían diferencialmente a una primera salida, y en donde el dispositivo está configurado para desviar diferencialmente las segundas partículas de menos de un tamaño predeterminado a una segunda salida; y c) incubar las primeras partículas desviadas diferencialmente en una incubadora, en donde la incubadora comprende un primer portal conectado fluídicamente con la primera salida del dispositivo microfluídico y un segundo portal conectado fluídicamente con una segunda fuente de líquido. En algunos casos, las primeras partículas comprenden células. En algunos casos, las células comprenden glóbulos blancos. En algunos casos, las primeras partículas desviadas están en la incubadora durante al menos 10 minutos.Further described herein is a method for processing first particles of at least a predetermined size in a sample, the method comprising: a) providing a sample comprising first particles of at least a predetermined size; b) passing the sample through a device comprising a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, wherein the channel comprises a matrix of obstacles arranged in rows in the channel, wherein each subsequent row of obstacles are offset laterally with respect to a previous row, where the first particles of at least a predetermined size are differentially deflected to a first outlet, and where the device is configured to differentially deflect the second particles of less than a predetermined size to a second exit; and c) incubating the first differentially deflected particles in an incubator, wherein the incubator comprises a first portal fluidly connected to the first outlet of the microfluidic device and a second portal fluidly connected to a second source of liquid. In some cases, the first particles comprise cells. In some cases, the cells comprise white blood cells. In some cases, the first deflected particles are in the incubator for at least 10 minutes.

En el presente documento se describe además un método para purificar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; y b) pasar la muestra a través de un dispositivo, comprendiendo el sistema una matriz de obstáculos dispuestos en filas, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado se desvían diferencialmente a una primera salida, y en donde el dispositivo está configurado para desviar diferencialmente segundas partículas de menos del tamaño predeterminado a una segunda salida, en donde las superficies de dos obstáculos adyacentes en una fila de la matriz de obstáculos definen un espacio, en donde la forma del espacio es sustancialmente simétrica con respecto a un plano paralelo a la dirección del flujo, en donde el plano es equidistante del centro de la sección transversal de cada uno de los dos obstáculos en la fila, en donde los dos obstáculos que definen un espacio tienen una sección transversal poligonal, en donde los vértices de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apuntan uno hacia el otro en una dirección sustancialmente perpendicular a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos. En algunos casos, un producto purificado de la primera salida comprende al menos el 60 % de las primeras partículas de la muestra. En algunos casos, un producto purificado de la primera salida comprende al menos el 80 % de las primeras partículas de la muestra. En algunos casos, la muestra comprende además segundas partículas de menos del tamaño predeterminado, en donde las segundas partículas de menos del tamaño predeterminado se desvían diferencialmente hacia la segunda salida. En algunos casos, un producto purificado de la primera salida comprende menos del 0,1 % de las segundas partículas de la muestra. En algunos casos, un producto purificado de la primera salida comprende menos del 0,01 % de las segundas partículas de la muestra. En algunos casos, la muestra es sangre entera. En algunos casos, las primeras partículas comprenden glóbulos blancos. En algunos casos, las segundas partículas comprenden glóbulos rojos. En algunos casos, el método comprende además analizar las primeras partículas usando un componente analítico. En algunos casos, el componente analítico es un clasificador de células. En algunos casos, la muestra se pasa a un caudal de aproximadamente 40 ml/h.Further described herein is a method for purifying first particles of at least a predetermined size in a sample, the method comprising: a) providing a sample comprising first particles of at least a predetermined size; and b) passing the sample through a device, the system comprising a matrix of obstacles arranged in rows, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, where first particles of at least a predetermined size are differentially deflect to a first exit, and wherein the device is configured to differentially deflect second particles of less than the predetermined size to a second exit, where the surfaces of two adjacent obstacles in a row of the obstacle matrix define a space, in where the shape of the space is substantially symmetric with respect to a plane parallel to the direction of flow, where the plane is equidistant from the center of the cross section of each of the two obstacles in the row, where the two defining obstacles a space has a polygonal cross section, where the vertices of each of the two obstacles with the section Polygonal cross sections point toward each other in a direction substantially perpendicular to a direction of flow of the sample through the obstacle matrix. In some cases, a first outlet purified product comprises at least 60% of the first sample particles. In some cases, a first outlet purified product comprises at least 80% of the first sample particles. In some cases, the sample further comprises second particles of less than the predetermined size, wherein the second particles of less than the predetermined size are differentially deflected towards the second outlet. In some cases, a purified product from the first outlet comprises less than 0.1% of the second sample particles. In some cases, a purified product from the first outlet comprises less than 0.01% of the second sample particles. In some cases, the sample is whole blood. In some cases, the first particles comprise white blood cells. In some cases, the second particles comprise red blood cells. In some cases, the method further comprises analyzing the first particles using an analytical component. In some cases, the analytical component is a cell sorter. In some cases, the sample is passed at a flow rate of approximately 40 ml / h.

En el presente documento se describe además un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; b) marcar una o más moléculas en una superficie de las primeras partículas en donde no se realiza el marcaje de la etapa b) en el dispositivo microfluídico; c) pasar la muestra a través de un dispositivo microfluídico que comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el canal comprende una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida, en donde las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían para fluir en una segunda corriente de flujo que fluye desde una segunda entrada a la primera salida mientras se desvían, en donde la segunda corriente de flujo comprende un tampón de lavado; d) fijar las primeras partículas, en donde no se realiza la fijación en el dispositivo microfluídico; e) permeabilizar las primeras partículas, en donde no realiza la permeabilización en el dispositivo microfluídico; y f) etiquetar una o más moléculas dentro de las primeras partículas, en donde no se realiza el etiquetado en el dispositivo microfluídico, en donde la etapa c se realiza entre la etapa b) y la etapa d), entre la etapa d) y la etapa e), entre la etapa e y la etapa f, y/o después de la etapa e). En algunos casos, las primeras partículas son células. En algunos casos, las células son glóbulos blancos. En algunos casos, la muestra es sangre entera. En algunos casos, el canal comprende al menos una pared separadora orientada paralela a al menos una de las corrientes de flujo, y dicha al menos una pared separadora está configurada para retrasar el flujo de las primeras partículas desviadas, en donde el retraso sirve para incrementar sustancialmente la cantidad de tiempo durante el que las partículas desviadas residen en una corriente de flujo y/o reducir sustancialmente la mezcla entre la primera corriente de flujo y la segunda corriente de flujo. En algunos casos, el método comprende además analizar las primeras partículas usando un componente analítico. En algunos casos, el componente analítico es un clasificador de células.A method for processing first particles of at least a predetermined size is further described herein, the method comprising: a) providing a sample comprising first particles of at least a predetermined size; b) marking one or more molecules on a surface of the first particles where the marking of step b) is not performed in the microfluidic device; c) passing the sample through a microfluidic device comprising a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, wherein the channel is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall, in where the channel comprises a matrix of obstacles arranged in rows in the channel, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, where the matrix of obstacles is configured to differentially deflect the first particles of at least one predetermined size to a first outlet and second particles smaller than predetermined size to a second outlet, wherein the first particles are introduced into a first flow stream from a first inlet and diverted to flow in a second flow stream flowing from a second inlet to the first outlet while diverting, wherein the second stream of flow comprises at wash ampon; d) fixing the first particles, where the fixation is not carried out in the microfluidic device; e) permeabilizing the first particles, where the permeabilization is not carried out in the microfluidic device; and f) labeling one or more molecules within the first particles, where labeling is not performed in the microfluidic device, where stage c is performed between stage b) and stage d), between stage d) and stage stage e), between stage e and stage f, and / or after stage e). In some cases, the first particles are cells. In some cases, the cells are white blood cells. In some cases, the sample is whole blood. In some cases, the channel comprises at least one separating wall oriented parallel to at least one of the flow streams, and said at least one separating wall is configured to retard the flow of the first deflected particles, wherein the delay serves to increase substantially the amount of time that the deflected particles reside in a flow stream and / or substantially reduce the mixing between the first flow stream and the second flow stream. In some cases, the method further comprises analyzing the first particles using an analytical component. In some cases, the analytical component is a cell sorter.

En el presente documento se describe además un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; b) pasar la muestra a través de un dispositivo microfluídico que comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el canal comprende una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida, en donde las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían para fluir en una primera corriente de flujo de reacción que comprende un reactivo que marca una molécula en una superficie de las primeras partículas y una segunda corriente de flujo de reacción que comprende un tampón de lavado, en donde las corrientes de flujo de reacción fluyen desde la pluralidad de entradas a la pluralidad de salidas; c) fijar las primeras partículas, en donde no se realiza la fijación en el dispositivo microfluídico; d) permeabilizar las primeras partículas, en donde no realiza la permeabilización en el dispositivo microfluídico; y e) etiquetar una molécula dentro de las primeras partículas, en donde no se realiza el etiquetado en el dispositivo microfluídico. En algunos casos, las partículas son células. En algunos casos, las partículas son glóbulos blancos. En algunos casos, la muestra es sangre entera. En algunos casos, el canal comprende al menos una pared separadora orientada paralela a al menos una de las corrientes de flujo, y dicha al menos una pared separadora está configurada para retrasar el flujo de las partículas desviadas, en donde el retraso sirve para incrementar sustancialmente la cantidad de tiempo durante el que las partículas desviadas residen en una corriente de flujo y/o reducir sustancialmente la mezcla entre la primera corriente de flujo de reacción y la segunda corriente de flujo de reacción. En algunos casos, el método comprende además analizar las primeras partículas usando un componente analítico. En algunos casos, el componente analítico es un clasificador de células. En algunos casos, el método comprende además una etapa de lavado en un dispositivo microfluídico entre la etapa c) y la etapa d), entre la etapa d) y la etapa e), y/o después de la etapa e).Further described herein is a method for processing first particles of at least one size predetermined, the method comprising: a) providing a sample comprising first particles of at least a predetermined size; b) passing the sample through a microfluidic device comprising a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, wherein the channel is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall, in where the channel comprises a matrix of obstacles arranged in rows in the channel, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, where the matrix of obstacles is configured to differentially deflect the first particles of at least one predetermined size to a first outlet and second particles smaller than predetermined size to a second outlet, wherein the first particles are introduced into a first flow stream from a first inlet and diverted to flow in a first flow stream reaction comprising a reagent that labels a molecule on a surface of the first particles and a second stream reaction flow comprising a wash buffer, wherein the reaction flow streams flow from the plurality of inlets to the plurality of outlets; c) fixing the first particles, where the fixation is not carried out in the microfluidic device; d) permeabilize the first particles, where it does not perform permeabilization in the microfluidic device; and e) labeling a molecule within the first particles, where labeling is not performed in the microfluidic device. In some cases, the particles are cells. In some cases, the particles are white blood cells. In some cases, the sample is whole blood. In some cases, the channel comprises at least one separating wall oriented parallel to at least one of the flow streams, and said at least one separating wall is configured to retard the flow of the deflected particles, wherein the delay serves to substantially increase the amount of time that the deflected particles reside in a flow stream and / or substantially reduce the mixing between the first reaction flow stream and the second reaction flow stream. In some cases, the method further comprises analyzing the first particles using an analytical component. In some cases, the analytical component is a cell sorter. In some cases, the method further comprises a washing step in a microfluidic device between step c) and step d), between step d) and step e), and / or after step e).

En el presente documento se describe además un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; b) marcar una molécula en una superficie de las primeras partículas; c) pasar la muestra a través de un dispositivo microfluídico que comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el canal comprende una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida, en donde las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían para fluir hacia una primera corriente de flujo de reacción que comprende un reactivo de fijación y un reactivo de permeabilización y la segunda corriente de flujo de reacción que comprende un tampón de lavado; y d) marcar una molécula dentro de las primeras partículas, en donde el marcaje de una molécula dentro de las primeras partículas no se realiza en el dispositivo microfluídico, en donde el marcaje de una molécula en la superficie de las primeras partículas no se realiza en un dispositivo microfluídico. En algunos casos, las partículas son células. En algunos casos, las células son glóbulos blancos. En algunos casos, la muestra es sangre entera. En algunos casos, el canal comprende al menos una pared separadora orientada paralela a al menos una de las corrientes de flujo, y dicha al menos una pared separadora está configurada para retrasar el flujo de las partículas desviadas, en donde el retraso sirve para incrementar sustancialmente la cantidad de tiempo durante el que las partículas desviadas residen en una corriente de flujo y/o reducir sustancialmente la mezcla entre la primera corriente de flujo de reacción y la segunda corriente de flujo de reacción. En algunos casos, el método comprende además analizar las primeras partículas usando un componente analítico. En algunos casos, el componente analítico es un clasificador de células. En algunos casos, se realiza una etapa de lavado después de la etapa d) en un dispositivo microfluídico.A method for processing first particles of at least a predetermined size is further described herein, the method comprising: a) providing a sample comprising first particles of at least a predetermined size; b) marking a molecule on a surface of the first particles; c) passing the sample through a microfluidic device comprising a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, wherein the channel is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall, in where the channel comprises a matrix of obstacles arranged in rows in the channel, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, where the matrix of obstacles is configured to differentially deflect the first particles of at least one predetermined size to a first outlet and second particles smaller than predetermined size to a second outlet, wherein the first particles are introduced into a first flow stream from a first inlet and diverted to flow into a first flow stream reaction comprising a fixing reagent and a permeation reagent and the second reaction flow stream comprising a wash buffer; and d) marking a molecule within the first particles, where the marking of a molecule within the first particles is not carried out in the microfluidic device, where the marking of a molecule on the surface of the first particles is not carried out in a microfluidic device. In some cases, the particles are cells. In some cases, the cells are white blood cells. In some cases, the sample is whole blood. In some cases, the channel comprises at least one separating wall oriented parallel to at least one of the flow streams, and said at least one separating wall is configured to retard the flow of the deflected particles, wherein the delay serves to substantially increase the amount of time that the deflected particles reside in one flow stream and / or substantially reduce the mixing between the first reaction flow stream and the second reaction flow stream. In some cases, the method further comprises analyzing the first particles using an analytical component. In some cases, the analytical component is a cell sorter. In some cases, a washing step is performed after step d) in a microfluidic device.

En el presente documento se describe además un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado, comprendiendo el método: a) proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado; b) marcar una molécula en una superficie de las primeras partículas; c) fijar las primeras partículas; d) permeabilizar las primeras partículas; y e) pasar la muestra a través de un dispositivo microfluídico que comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, en donde el canal comprende una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida, en donde las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían para fluir a través de un primer flujo de reacción que comprende un reactivo que marca una molécula dentro de las primeras partículas y una segunda corriente de flujo de reacción que comprende un tampón de lavado, en donde el marcaje de la molécula en una superficie no se realiza en el dispositivo microfluídico, en donde la fijación no se realiza en el dispositivo microfluídico y en donde la permeabilización no se realiza en el dispositivo microfluídico. En algunos casos, las partículas son células. En algunos casos, las células son glóbulos blancos. En algunos casos, la muestra es sangre entera. En algunos casos, el canal comprende al menos una pared separadora orientada paralela a al menos una de las corrientes de flujo, y dicha al menos una pared separadora está configurada para retrasar el flujo de las partículas desviadas, en donde el retraso sirve para incrementar sustancialmente la cantidad de tiempo durante el que las partículas desviadas residen en una corriente de flujo y/o reducir sustancialmente la mezcla entre la primera corriente de flujo de reacción y la segunda corriente de flujo de reacción. En algunos casos, el método comprende además analizar las primeras partículas usando un componente analítico. En algunos casos, el componente analítico es un clasificador de células.A method for processing first particles of at least a predetermined size is further described herein, the method comprising: a) providing a sample comprising first particles of at least a predetermined size; b) marking a molecule on a surface of the first particles; c) fix the first particles; d) permeabilize the first particles; and e) passing the sample through a microfluidic device comprising a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, wherein the channel is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall, in where the channel comprises a matrix of obstacles arranged in rows in the channel, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, where the matrix of obstacles is configured to differentially deflect the first particles of at least one predetermined size to a first outlet and second particles smaller than predetermined size to a second outlet, wherein the first particles are introduced into a first flow stream from a first inlet and diverted to flow through a first flow reaction comprising a reagent that labels a molecule within the first particles and a second stream of reaction flow tion comprising a wash buffer, where the labeling of the molecule on a surface is not done in the microfluidic device, where the fixation is not done in the microfluidic device, and where the permeabilization is not done in the microfluidic device. In some cases, the particles are cells. In some cases, the cells are white blood cells. In some cases, the sample is whole blood. In some cases, the channel comprises at least one dividing wall oriented parallel to at least one of the flow streams, and said at least one partition wall is configured to retard the flow of the diverted particles, wherein the delay serves to substantially increase the amount of time that the diverted particles reside in a flow stream and / or substantially reducing the mixing between the first reaction flow stream and the second reaction flow stream. In some cases, the method further comprises analyzing the first particles using an analytical component. In some cases, the analytical component is a cell sorter.

Breve descripción de los dibujosBrief description of the drawings

Las nuevas características de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en la que se utilizan los principios de la invención y los dibujos adjuntos de los cuales:The new features of the invention are set forth with particularity in the appended claims. A better understanding of the features and advantages of the present invention will be obtained by referring to the following detailed description setting forth illustrative embodiments, using the principles of the invention and the accompanying drawings of which:

La FIG. 1 es un diagrama esquemático de la sección transversal de un dispositivo de "matriz de impacto" que tiene obstáculos con forma de triángulos rectángulos dispuestos en un canal microfluídico. En la figura, el flujo de fluido alterna entre las direcciones de derecha a izquierda y de izquierda a derecha, como indica la flecha de dos puntas marcada como "Flujo de fluido". En esta matriz, los postes de triángulos rectángulos están dispuestos en una configuración de retícula de cuadrados que está inclinada con respecto a las direcciones de flujo de fluido. El ángulo de inclinación e (épsilon) se elige de manera que el dispositivo sea periódico. En esta realización, un ángulo de inclinación de 18,4 grados (1/3 radianes) hace que el dispositivo sea periódico después de tres filas. El espacio entre los postes se indica como G siendo S la longitud del lado del triángulo y P el campo de la matriz. Se muestran líneas de corriente que se extienden entre los postes, dividiéndose el flujo de fluido entre los postes en tres regiones ("tubos de corriente") de igual flujo volumétrico. FIG. 1 is a schematic cross-sectional diagram of an "impact matrix" device having obstacles in the shape of right triangles arranged in a microfluidic channel. In the figure, the fluid flow alternates between the right-to-left and left-to-right directions, as indicated by the double-headed arrow marked "Fluid Flow." In this array, the right triangle posts are arranged in a square lattice configuration that is inclined with respect to fluid flow directions. The angle of inclination e (epsilon) is chosen so that the device is periodic. In this embodiment, a tilt angle of 18.4 degrees (1/3 radians) makes the device periodic after three rows. The space between the posts is indicated as G where S is the length of the triangle's side and P is the matrix field. Streamlines are shown extending between the posts, with the fluid flow between the posts dividing into three regions ("stream tubes") of equal volumetric flow.

Las FIG. 2A, 2B y 2C, muestran las trayectorias de perlas esféricas de poliestireno de tres tamaños diferentes en una matriz del tipo que se muestra en la FIG. 1 ya que la dirección del flujo de fluido realiza un ciclo de ida y vuelta dos veces. La orientación de los postes de triángulos rectángulos se indica en la parte inferior derecha de cada figura. Los triángulos rectángulos isósceles tienen un lado de 6 micrómetros con una separación de poste a poste de 10 micrómetros y un ángulo de inclinación de 5,71 grados (0,1 radianes). Los tamaños de partículas son 1,1 micrómetros en FIG. 2A, 3,1 micrómetros en la FIG. 2B y 1,9 micrómetros en FIG. 2C. Las partículas mostradas en las FIGS. 2A y 2B deshacen su camino cuando cambia la dirección del fluido, siguiendo generalmente las partículas en la FIG. 2A la dirección del fluido en cada dirección de flujo de fluido y siguiendo generalmente las partículas en la FIG. 2B la dirección de la matriz en cada dirección de flujo de fluido. Por el contrario, la trayectoria de las partículas mostradas en la FIG. 2C varía con la dirección del flujo de fluido. En la FIG. 2C, las flechas pequeñas indican la dirección del fluido a lo largo de la trayectoria de las partículas; las partículas generalmente siguen la dirección del fluido cuando la dirección del flujo de fluido es de izquierda a derecha y generalmente siguen la dirección de la matriz cuando la dirección del flujo de fluido es de derecha a izquierda. FIGS. 2A, 2B and 2C show the trajectories of spherical polystyrene beads of three different sizes in a matrix of the type shown in FIG. 1 as the direction of fluid flow cycles back and forth twice. The orientation of the right triangle posts is indicated at the bottom right of each figure. Isosceles right triangles have a side of 6 microns with a pole-to-pole spacing of 10 microns and a tilt angle of 5.71 degrees (0.1 radians). The particle sizes are 1.1 microns in FIG. 2A , 3.1 microns in FIG. 2B and 1.9 microns in FIG. 2C . The particles shown in FIGS. 2A and 2B undo their path when the direction of the fluid changes, generally following the particles in FIG. 2A fluid direction in each fluid flow direction and generally following the particles in FIG. 2B the direction of the die in each fluid flow direction. In contrast, the trajectory of the particles shown in FIG. 2C varies with the direction of fluid flow. In FIG. 2C , the small arrows indicate the direction of the fluid along the path of the particles; the particles generally follow the direction of the fluid when the direction of fluid flow is from left to right and generally follow the direction of the matrix when the direction of fluid flow is from right to left.

La FIG. 3A muestra trayectorias simuladas de partículas de 1,0 micrómetros de diámetro que se mueven a través de una matriz de postes de triángulos rectángulos dispuestos en un canal de flujo microfluídico en el que el flujo de fluido alterna entre las direcciones de derecha a izquierda y de izquierda a derecha. La FIG. 3B muestra trayectorias simuladas de partículas de 3,6 micrómetros de diámetro que se mueven a través de una matriz de postes de triángulos rectángulos dispuestos en un canal de flujo microfluídico en el que el flujo de fluido alterna entre las direcciones de derecha a izquierda y de izquierda a derecha. La FIG. 3C muestra trayectorias simuladas de partículas de 3,2 micrómetros de diámetro que se mueven a través de una matriz de postes de triángulos rectángulos dispuestos en un canal de flujo microfluídico en el que el flujo de fluido alterna entre las direcciones de derecha a izquierda y de izquierda a derecha. En estos diagramas, las partículas de 1,0 micrómetros de diámetro son más pequeñas que el tamaño crítico de la matriz en las dos direcciones de flujo de fluido, las partículas de 3,6 micrómetros de diámetro son más grandes que el tamaño crítico de la matriz en las dos direcciones de flujo de fluido y las partículas de 3,2 micrómetros de diámetro son más pequeñas que el tamaño crítico de la matriz en una dirección de flujo (de derecha a izquierda), pero más grandes que el tamaño crítico de la matriz en la otra dirección de flujo (de izquierda a derecha). FIG. 3A shows simulated trajectories of 1.0 micron diameter particles moving through an array of right-triangle posts arranged in a microfluidic flow channel in which fluid flow alternates between the right-to-left and right-to-left directions. left to right. FIG. 3B shows simulated trajectories of 3.6 micron diameter particles moving through an array of right-triangle posts arranged in a microfluidic flow channel in which fluid flow alternates between the right-to-left and right-to-left directions. left to right. FIG. 3C shows simulated trajectories of 3.2 micron diameter particles moving through an array of right-triangle posts arranged in a microfluidic flow channel in which fluid flow alternates between the right-to-left and right-to-left directions. left to right. In these diagrams, the 1.0 micron diameter particles are smaller than the critical size of the matrix in the two fluid flow directions, the 3.6 micron diameter particles are larger than the critical size of the matrix. matrix in the two fluid flow directions and the 3.2 micrometer diameter particles are smaller than the critical size of the matrix in one flow direction (from right to left), but larger than the critical size of the matrix in the other flow direction (from left to right).

La FIG. 4A es un gráfico que muestra el flujo de velocidad normalizado simulado entre dos postes de triángulos rectángulos. FIG. 4A is a graph showing simulated normalized velocity flow between two right triangle poles.

La FIG.4B es un gráfico que muestra los perfiles de velocidad normalizados a través de espacios entre obstáculos redondos (curva que es simétrica con respecto a Y/Espacio = 0,5) y obstáculos con forma de triángulo rectángulo en una matriz del tipo que se muestra en la FIG. 1 (e = 1/3 radianes). En estos perfiles, las líneas verticales delimitan las áreas debajo de cada curva en tercios, que representan tres tubos de corriente de igual flujo volumétrico. La curva en el caso de los obstáculos redondos demuestra que un tercio del flujo volumétrico entre obstáculos redondos tiene lugar en un tubo de corriente que es adyacente a cualquier obstáculo y tiene una anchura que es el 38 % de la anchura del espacio. La curva en el caso de los obstáculos de triángulos rectángulos demuestra que un tercio del flujo volumétrico entre obstáculos triangulares tiene lugar en un tubo de corriente que es adyacente al lado plano de uno de los dos obstáculos triangulares y tiene una anchura que es el 42 % de la anchura del espacio y que otro tercio tiene lugar en un tubo de corriente que es adyacente al lado agudo del par de obstáculos triangulares y tiene una anchura que es el 34 % de la anchura del espacio. FIG 4B is a graph showing normalized velocity profiles through spaces between round obstacles (curve that is symmetric with respect to Y / Space = 0.5) and right triangle shaped obstacles in a matrix of the type that shown in FIG. 1 (e = 1/3 radians). In these profiles, the vertical lines delimit the areas under each curve in thirds, representing three stream tubes of equal volumetric flow. The curve in the case of round obstacles shows that one third of the volumetric flow between round obstacles takes place in a stream tube that is adjacent to any obstacle and has a width that is 38% of the width of the space. The curve in the case of the right triangle obstacles shows that one third of the volumetric flow between triangular obstacles takes place in a stream tube that is adjacent to the flat side of one of the two triangular obstacles and has a width that is 42% of the width of the space and that another third takes place in a stream tube that is adjacent to the acute side of the pair of triangular obstacles and has a width that is 34% of the width of the space.

La FIG. 5 es un gráfico del diámetro crítico predicho frente al ángulo de inclinación de la matriz (e) para matrices de obstáculos triangulares (línea inferior) y circulares (línea superior). FIG. 5 is a plot of predicted critical diameter versus matrix tilt angle (e) for triangular (bottom line) and circular (top line) obstacle matrices.

La FIG. 6A es un diagrama esquemático de la sección transversal de un dispositivo de "matriz de impacto" que tiene obstáculos con forma de triángulos equiláteros dispuestos en un canal microfluídico. En la figura, el fluido fluye en la dirección de izquierda a derecha, como indica la flecha marcada como "Líquido". En esta matriz, los postes de triángulo equilátero están dispuestos en una configuración de retícula de paralelogramos que está inclinada con respecto a las direcciones de flujo de fluido. También se pueden usar otras configuraciones de retícula (por ejemplo, cuadrada, rectangular, trapezoidal, hexagonal, etc.). El ángulo de inclinación e (épsilon) se elige de manera que el dispositivo sea periódico. En esta realización, un ángulo de inclinación de 18,4 grados (1/3 radianes) hace que el dispositivo sea periódico después de tres filas. El ángulo de inclinación e también representa el ángulo por el que se desvía la dirección de la matriz con respecto a la dirección del flujo de fluido. El espacio entre los postes se indica como G siendo S la longitud del lado del triángulo equilátero. Se muestran líneas de corriente que se extienden entre los postes, dividiéndose el flujo de fluido entre los postes en tres regiones ("tubos de corriente") de igual flujo volumétrico. Una partícula relativamente grande (que tiene un tamaño mayor que el tamaño crítico para la matriz) sigue el ángulo de inclinación de la matriz cuando el flujo de fluido está en la dirección que se muestra. Una partícula relativamente pequeña (que tiene un tamaño menor que el tamaño crítico para la matriz) sigue la dirección del flujo de fluido. FIG. 6A is a schematic cross-sectional diagram of an "impact matrix" device having equilateral triangle shaped obstacles arranged in a microfluidic channel. In the figure, the fluid flows in the direction from left to right, as indicated by the arrow marked "Liquid". In this array, the equilateral triangle posts are arranged in a parallelogram lattice configuration that is inclined with respect to fluid flow directions. Other grid configurations can also be used (eg square, rectangular, trapezoidal, hexagonal, etc.). The angle of inclination e (epsilon) is chosen so that the device is periodic. In this embodiment, a tilt angle of 18.4 degrees (1/3 radians) makes the device periodic after three rows. The angle of inclination e also represents the angle by which the direction of the matrix deviates from the direction of fluid flow. The space between the posts is indicated as G where S is the length of the side of the equilateral triangle. Streamlines are shown extending between the posts, with the fluid flow between the posts dividing into three regions ("stream tubes") of equal volumetric flow. A relatively large particle (having a size greater than the critical size for the matrix) follows the angle of inclination of the matrix when fluid flow is in the direction shown. A relatively small particle (having a size smaller than the critical size for the matrix) follows the direction of fluid flow.

La FIG. 6B es una comparación del flujo de velocidad normalizado entre dos postes de triángulo equilátero (panel izquierdo) y el flujo de velocidad normalizado entre dos postes circulares (panel derecho). Las porciones sombreadas representan una proporción igual de área bajo la curva, que demuestran que el radio crítico para las partículas que fluyen más allá del punto del triángulo es significativamente más pequeño (<15 % de la anchura del espacio) que el radio crítico para las partículas que fluyen más allá del poste redondo (>20 % de la anchura del espacio). FIG. 6B is a comparison of the normalized velocity flow between two equilateral triangle posts (left panel) and the normalized velocity flow between two circular posts (right panel). The shaded portions represent an equal proportion of area under the curve, demonstrating that the critical radius for particles flowing past the point of the triangle is significantly smaller (<15% of the width of the space) than the critical radius for the particles flowing past the round post (> 20% of the width of the space).

La FIG. 7 es un gráfico que ilustra los efectos hipotéticos y experimentales del ángulo de inclinación ("Inclinación de matriz" en la FIG. 7) sobre el desplazamiento de las partículas. FIG. 7 is a graph illustrating the hypothetical and experimental effects of tilt angle ("Matrix Tilt" in FIG. 7 ) on particle displacement.

La FIG. 8 es un gráfico que ilustra el efecto del ángulo de inclinación ("Inclinación de matriz" en la FIG. 8) sobre la longitud del espacio G. Gt se refiere a la longitud del espacio entre los postes triangulares, y Ge se refiere a la longitud del espacio entre postes redondos. FIG. 8 is a graph illustrating the effect of tilt angle ("Matrix tilt" in FIG. 8 ) on the length of the gap G. Gt refers to the length of the gap between the triangular posts, and Ge refers to the length of space between round posts.

La FIG. 9 es un gráfico que ilustra el efecto de la presión aplicada sobre la velocidad de las partículas en matrices de protuberancias que tienen postes triangulares (los datos se muestran como triángulos) y matrices de protuberancias que tienen postes circulares (los datos se muestran como círculos). FIG. 9 is a graph illustrating the effect of applied pressure on particle velocity in boss arrays that have triangular posts (data is displayed as triangles) and bulge arrays that have circular posts (data is displayed as circles) .

La FIG. 10 es un gráfico que ilustra el efecto de la redondez del borde del obstáculo (expresada como r/S) sobre el tamaño crítico exhibido en el lado de un espacio limitado por el borde. FIG. 10 is a graph illustrating the effect of obstacle edge roundness (expressed as r / S) on the critical size displayed on the side of a space bounded by the edge.

La FIG. 11 es una imagen de una matriz construida como se describe en el presente documento. FIG. 11 is an image of a matrix constructed as described herein.

La FIG. 12 ilustra el movimiento de las partículas en una matriz de impacto de trinquete del tipo descrito en el presente documento. FIG. 12 illustrates the movement of the particles in a ratchet impact matrix of the type described herein.

La FIG. 13 ilustra el movimiento de las partículas en una matriz de impacto de trinquete del tipo descrito en el presente documento. FIG. 13 illustrates the movement of the particles in a ratchet impact matrix of the type described herein.

La FIG. 14 ilustra el movimiento de las partículas en una matriz de impacto de trinquete del tipo descrito en el presente documento. FIG. 14 illustrates the movement of the particles in a ratchet impact matrix of the type described herein.

La FIG. 15 es un gráfico que compara las características de tamaño crítico de los postes redondos y triangulares. La FIG. 16 muestra métodos convencionales (izquierda) para procesar células (por ejemplo, leucocitos) y dos realizaciones de los métodos descritos en el presente documento (verticalmente en el centro y verticalmente en la derecha) FIG. 15 is a graph comparing the critical size characteristics of round and triangle posts. FIG. 16 shows conventional methods (left) for processing cells (eg, leukocytes) and two embodiments of the methods described herein (vertically in the center and vertically in the right)

La FIG. 17A muestra una matriz DLD diseñada para "tropezar" con E. coli (Tamaño >1 pm). Vista superior: un ejemplo de mecanismo de DLD que muestra una entrada uniforme de bacterias E. coli fluorescentes (blancas) en una matriz de postes inclinados que se tropiezan y dirigen hacia abajo formando un ángulo con el flujo de fluido, para conseguir una alta concentración contra la pared inferior de la matriz y posteriormente recogerse, mientras que el fluido se mueve horizontalmente. FIG. 17A shows a DLD array designed to "trip over" E. coli (Size> 1 pm). Top view: An example of a DLD mechanism showing uniform entry of fluorescent (white) E. coli bacteria into an array of slanted posts that are tripping and directing down at an angle to the fluid flow to achieve a high concentration against the bottom wall of the die and subsequently collected, while the fluid moves horizontally.

La FIG. 17B muestra una matriz DLD que tiene una primera corriente que comprende una corriente de muestra y una segunda corriente que comprende un tampón. Vista esquemática: Lavado de glóbulos blancos (WBC) por extensión de la FIG. 17A añadiendo una corriente de tampón de entrada. Solo los glóbulos blancos (WBC) (más grandes que los glóbulos rojos (RBC)) descienden hacia la corriente de tampón y la pared inferior. FIG. 17B shows a DLD matrix having a first stream comprising a sample stream and a second stream comprising a buffer. Schematic view: Wash of white blood cells (WBC) by extension of FIG. 17A adding an input buffer stream. Only white blood cells (WBC) (larger than red blood cells (RBC)) descend into the buffer stream and the bottom wall.

La FIG. 17C muestra una imagen de lapso de tiempo de leucocitos que se concentran y se recogen de una matriz DLD similar a la matriz DLD que se muestra en FIG. 17B. Imagen de lapso de tiempo de glóbulos blancos (WBC) (azules por la tinción nuclear) que se recogen de una corriente de sangre completa (rojiza/blanca) que se desplaza de izquierda a derecha usando un chip con el diseño de la Figura 17B. FIG. 17C shows a time-lapse image of leukocytes being concentrated and collected from a DLD matrix similar to the DLD matrix shown in FIG. 17B. Time-lapse image of white blood cells (WBC) (blue by nuclear staining) collected from a stream of whole blood (reddish / white) moving from left to right using a chip with the design of Figure 17B.

La FIG 18A muestra un chip de "lavado de coches" de múltiples corrientes para el procesamiento químico secuencial múltiple. Vista esquemática del concepto de lavado de coches para procesamiento químico secuencial múltiple en chip para preparación celular. Un solo proceso de flujo continuo combina todas las etapas en la Figura 42 en un solo chip. FIG 18A shows a multi-stream "car wash" chip for multiple sequential chemical processing. Schematic view of car wash concept for on-chip multiple sequential chemical processing for cell preparation. A single continuous flow process combines all the stages in Figure 42 on a single chip.

La FIG 18B muestra una imagen fluorescente de falso color de lapso de tiempo de plaquetas que descienden en una matriz DLD. Demostración de células en movimiento (en este caso, plaquetas) por DLD a través de una "corriente de procesamiento" y en una corriente de tampón de lavado como en la FIG. 18A. Imagen fluorescente de falso color de lapso de tiempo de plaquetas que descienden en una matriz DLD a través de 3 corrientes paralelas en el chip para marcaje y lavado en el chip. Corriente superior: entrada de plaquetas no marcadas (invisibles); Corriente media: marcador de CD41 conjugado con ficoeritrina; Corriente inferior: plaquetas marcadas en una corriente de tampón de lavado. FIG 18B shows a time lapse false color fluorescent image of descending platelets in a DLD array. Demonstration of moving cells (in this case platelets) by DLD through a "processing stream" and in a stream of wash buffer as in FIG. 18. Time-lapse false-color fluorescent image of platelets descending on a DLD array through 3 parallel streams on the chip for labeling and on-chip washing. Upper stream: entry of unmarked (invisible) platelets; Midstream: CD41 marker conjugated to phycoerythrin; Bottom stream: labeled platelets in a stream of wash buffer.

La FIG. 19 muestra vistas de entrada y salida de una matriz DLD de "lavado de coches" de múltiples corrientes para múltiples procesos químicos y/o enzimáticos secuenciales. FIG. 19 shows inlet and outlet views of a multi-stream "car wash" DLD matrix for multiple sequential chemical and / or enzymatic processes.

La FIG. 20A muestra perlas de l0 pm que fluyen desde una porción de entrada, intermedia y de salida de una matriz DLD de "lavado de coches" de múltiples corrientes como se muestra en la FIG. 19. FIG. 20A shows 10 pm beads flowing from an inlet, middle, and outlet portion of a multi-stream "car wash" DLD array as shown in FIG. 19.

La FIG. 20B muestra perlas de 2 pm que fluyen desde una porción intermedia y de salida de una matriz DLD de "lavado de coches" de múltiples corrientes como se muestra en la FIG. 19. FIG. 20B shows 2 pm beads flowing from an intermediate and outlet portion of a multi-stream "car wash" DLD array as shown in FIG. 19.

La FIG. 21 muestra un esquema de la difusión entre una corriente de reactivo y una corriente de flujo paralelo adyacente a medida que las corrientes de flujo paralelas fluyen al interior de un canal microfluídico. FIG. 21 shows a diagram of the diffusion between a reagent stream and an adjacent parallel flow stream as parallel flow streams flow into a microfluidic channel.

La FIG. 22 muestra un esquema de un modelo de tiempo de incubación y difusión de fuente limitada. FIG. 22 shows a schematic of a limited source diffusion and incubation time model.

La FIG. 23 muestra la relación entre el tiempo de incubación y la velocidad de flujo (parte superior), así como la relación entre la concentración y la velocidad de flujo (parte inferior) en un chip de "lavado de coches" como se representa en las FIG. 18A y 19. FIG. 23 shows the relationship between incubation time and flow rate (top), as well as the relationship between concentration and flow rate (bottom) in a "car wash" chip as depicted in FIGS. . 18A and 19.

La FIG. 24A muestra un modelo de chip de "lavado de coches" que comprende una corriente de muestra, corriente de reactivo y corriente tampón que comprende además un par de paredes separadoras opuestas que se extienden hacia el interior de la matriz de impacto y separan la corriente de reactivo de la corriente de tampón. La FIG. 24B muestra las vistas de entrada, intermedia y de salida de una matriz DLD de "lavado de coches" de múltiples corrientes como se describe en FIG. 24A que comprende un par de paredes separadoras opuestas que se extienden hacia la matriz de obstáculos para el procesamiento químico secuencial múltiple. FIG. 24A shows a "car wash" chip model comprising a sample stream, reagent stream, and buffer stream further comprising a pair of opposing partition walls that extend into the impact matrix and separate the stream of reagent from the buffer stream. FIG. 24B shows the inlet, middle and outlet views of a multi-stream "car wash" DLD array as described in FIG. 24A comprising a pair of opposing partition walls extending into the matrix of obstacles for multiple sequential chemical processing.

La FIG. 25 muestra los resultados del paso de una muestra que comprende perlas marcadas de 2 pm y 10 pm a través de una matriz DLD de "lavado de coches" que comprende un par de paredes separadoras opuestas como se representa en las FIG. 24A y B. FIG. 25 shows the results of passing a sample comprising 2 pm and 10 pm labeled beads through a "car wash" DLD matrix comprising a pair of opposing partition walls as depicted in FIGS. 24A and B.

La FIG. 26 muestra una comparación de la contaminación en la parte de salida de una matriz DLD de "lavado de coches" con paredes separadoras opuestas (modificada) y sin ellas (original). FIG. 26 shows a comparison of contamination in the outlet part of a "car wash" DLD matrix with opposite partition walls (modified) and without them (original).

La FIG. 27A muestra un modelo de chip de "lavado de coches" que comprende una corriente de muestra y 2 corrientes de tampón adyacentes que comprenden además un par de paredes separadoras opuestas que se extienden hacia el interior de la matriz de impacto y separan las dos corrientes de tampón. La FIG. 27B muestra las vistas de entrada, intermedia y de salida de una matriz DLD de "lavado de coches" de múltiples corrientes como se describe en FIG. 27A que comprende un par de paredes separadoras opuestas que se extienden al interior de la matriz de obstáculos para el procesamiento químico secuencial múltiple. FIG. 27A shows a "car wash" chip model comprising a sample stream and 2 adjacent buffer streams further comprising a pair of opposing partition walls that extend into the impact die and separate the two streams of buffer. tampon. FIG. 27B shows the inlet, middle and outlet views of a multi-stream "car wash" DLD array as described in FIG. 27A comprising a pair of opposing partition walls that extend into the obstacle matrix for multiple sequential chemical processing.

La FIG. 28 muestra los resultados del paso de una muestra de sangre a través de una matriz DLD de "lavado de coches" que comprende un par de paredes separadoras opuestas como se representa en las FIG. 27A y B. La FIG.29A muestra vistas de áreas de posible obstrucción en las porciones de entrada, intermedia y de salida de la matriz de obstáculos en la matriz DLD de la FIG. 28 después de hacer fluir una muestra de sangre a través de la matriz DLD que se muestra en la FIG.28. La FIG. 29B muestra vistas ampliadas de áreas de posible obstrucción en las partes intermedia y de salida de la matriz de obstáculos que se muestra en la FIG. 29A. FIG. 28 shows the results of passing a blood sample through a "car wash" DLD matrix comprising a pair of opposing partition walls as depicted in FIGS. 27A and B. FIG . 29A shows views of areas of possible obstruction at the inlet, middle, and outlet portions of the obstacle matrix in the DLD matrix of FIG. 28 after flowing a blood sample through the DLD matrix shown in FIG. 28. FIG. 29B shows enlarged views of areas of possible obstruction in the intermediate and exit portions of the obstacle matrix shown in FIG. 29A.

La FIG. 30 muestra las entradas y salidas de cuando se hace pasar una muestra de sangre a través de cualquiera de las matrices de DLD de "lavado de coches" proporcionadas en el presente documento. FIG. 30 shows the ins and outs of when a blood sample is passed through any of the "car wash" DLD matrices provided herein.

La FIG. 31 muestra la relación entre el tiempo de incubación y la velocidad de flujo (parte superior) así como la relación entre la concentración y la velocidad de flujo (parte inferior) en un chip de "lavado de coches" con un par de paredes separadoras opuestas (diseño modificado; FIG. 27A y B) y sin ellas (Ver. 1 chip; FIG. 19). FIG. 31 shows the relationship between incubation time and flow rate (top) as well as the relationship between concentration and flow rate (bottom) in a "car wash" chip with a pair of opposing partition walls. (modified design; FIG. 27A and B ) and without (Ver. 1 chip; FIG. 19 ).

La FIG. 32 muestra un modelo de un chip de "lavado de coches" que comprende una corriente de muestra, dos corrientes de reactivos y dos corrientes de tampón que comprenden además tres pares de paredes separadoras opuestas que se extienden hacia el interior de la matriz de impacto y separan las corrientes de reactivo de las corrientes de tampón. FIG. 32 shows a model of a "car wash" chip comprising one sample stream, two reagent streams, and two buffer streams further comprising three pairs of opposing spacer walls extending into the impact matrix and they separate the reagent streams from the buffer streams.

La FIG. 33A muestra una matriz DLD con un sistema de limpieza en el chip, que comprende entradas y salidas en el par de paredes opuestas para el confinamiento de fluidos. La FIG. 33B muestra el bloqueo del sistema de limpieza en el chip mientras la matriz DLD está en el modo de impacto (por ejemplo, muestra o fluido que comprende partículas (por ejemplo, células) que fluyen de izquierda a derecha a través de la matriz DLD). La FIG. FIG. 33A shows a DLD array with an on-chip cleaning system, comprising inputs and outputs on the pair of opposing walls for fluid confinement. FIG. 33B shows blockage of cleaning system on the chip while DLD array is in impact mode (e.g. sample or fluid comprising particles (e.g. cells) flowing from left to right through DLD array) . FIG.

33C muestra el bloqueo del canal que comprende la matriz DLD durante la limpieza de la matriz DLD usando un sistema de limpieza en el chip como se describe en el presente documento. 33C shows blockage of the channel comprising the DLD array during cleaning of the DLD array using an on-chip cleaning system as described herein.

La FIG. 34A muestra perlas obstruidas en una matriz DLD que comprende un sistema de limpieza en el chip como se representa en las FIG. 33A-C después del flujo de perlas marcadas a través de la matriz DLD durante el modo de impacto. La FIG. 34B muestra una porción de la matriz DLD después del modo de impacto antes del modo de limpieza (parte superior) y después del modo de limpieza (parte inferior). FIG. 34A shows clogged beads in a DLD array comprising an on-chip cleaning system as depicted in FIGS. 33A-C after the flow of labeled beads through the DLD matrix during impact mode. FIG. 34B shows a portion of the DLD matrix after impact mode before cleaning mode (top) and after cleaning mode (bottom).

La FIG.35 muestra un diagrama simplificado del proceso mediante el cual puede producirse la obstrucción inducida por plaquetas de una matriz DLD como se proporciona en el presente documento. FIG. 35 shows a simplified diagram of the process by which platelet-induced plugging of a DLD matrix can occur as provided herein.

La FIG. 36 muestra los resultados de experimentos que identifican integrinas dependientes de calcio y activación plaquetaria inducida por trombina como contribuyentes dominantes a la obstrucción inducida por plaquetas de matrices DLD proporcionadas en el presente documento. El eje x muestra el volumen de sangre que se ha procesado a través de la matriz, mientras que el eje y muestra la fluorescencia de los leucocitos atascados u obstruidos en la matriz. realmente se procesó sangre diluida, pero este eje x representa la cantidad de sangre sin diluir que se usó antes de la dilución y que fluyó a través de la matriz, que tenía postes triangulares de 40 micrómetros y una anchura de separación de 27 micrómetros. FIG. 36 shows the results of experiments identifying calcium-dependent integrins and thrombin-induced platelet activation as dominant contributors to platelet-induced blockage of DLD matrices provided herein. The x-axis shows the volume of blood that has been processed through the matrix, while the y-axis shows the fluorescence of leukocytes stuck or clogged in the matrix. diluted blood was actually processed, but this x-axis represents the amount of undiluted blood that was used prior to dilution and that flowed through the array, which had 40 micron triangular posts and a 27 micron gap width.

La FIG. 37 muestra imágenes de obstrucción en matrices con tres parámetros diferentes para (a) EDTA 1 mM y (b) EDTA 5 mM y PPACK 40 pM. El volumen de sangre a través de cada canal y la velocidad de flujo fueron los mismos en (a) y (b). La dirección del flujo fue de izquierda a derecha. El color verde indicaba leucocitos atascados u obstruidos. FIG. 37 shows images of obstruction on arrays with three different parameters for (a) 1 mM EDTA and (b) 5 mM EDTA and 40 pM PPACK. The volume of blood through each channel and the flow rate were the same in (a) and (b). The direction of flow was from left to right. Green color indicated stuck leukocytes or clogged.

La FIG. 38 muestra el efecto del caudal y la dilución de la sangre sobre la obstrucción de una matriz DLD proporcionada en el presente documento. FIG. 38 shows the effect of flow rate and blood dilution on clogging of a DLD matrix provided herein.

La FIG. 39 ilustra una realización de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos que comprende 14 canales. FIG. 39 illustrates an embodiment of a device comprising an obstacle matrix comprising 14 channels.

La FIG. 40 ilustra una realización de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos que comprende 2 canales. FIG. 40 illustrates an embodiment of a device comprising an obstacle matrix comprising 2 channels.

La FIG. 41 ilustra un instrumento de sobremesa y un módulo de separación de células desechable. Se pueden usar hasta 8 módulos de separación de células en el instrumento de sobremesa, con hasta 10 muestras por módulo. El instrumento puede ser autónomo o puede estar integrado en línea con otro equipo. Un módulo de separación de células desechable puede comprender un puerto de entrada de muestra de sangre (en algunos casos con una característica de recinto seguro), una cámara de matriz de micropostes, un puerto de salida de producto, un puerto de salida de residuos (en algunos casos con una función de contención segura incorporada y un puerto de entrada de tampón). FIG. 41 illustrates a benchtop instrument and a disposable cell separation module. Up to 8 cell separation modules can be used in the benchtop instrument, with up to 10 samples per module. The instrument can be standalone or can be integrated online with other equipment. A disposable cell separation module may comprise a blood sample inlet port (in some cases with a secure enclosure feature), a micropost array chamber, a product outlet port, a waste outlet port ( in some cases with a built-in safe containment feature and a buffer inlet port).

La FIG. 42 ilustra métodos convencionales (izquierda/1a columna) para procesar células (por ejemplo, leucocitos) y cuatro realizaciones de los métodos descritos en el presente documento (verticalmente en la segunda columna hasta verticalmente las columnas de la derecha). FIG. 42 illustrates conventional methods (left / 1st column) for processing cells (eg, leukocytes) and four embodiments of the methods described herein (vertically in the second column to vertically in the columns on the right).

La FIG. 43 ilustra citogramas de citometría de flujo que muestran glóbulos blancos (WBC) recogidos por lavado en el chip y concentración de los glóbulos blancos (WBC). Eje Y: dispersión de luz lateral; eje X: Inmunomarcaje de CD45. FIG. 43 illustrates flow cytometry cytograms showing white blood cells (WBC) collected by washing on the chip and white blood cell (WBC) concentration. Y axis: lateral light scattering; X-axis: CD45 immunolabeling.

La FIG. 44 ilustra un chip DLD en un colector como se describe en el presente documento. FIG. 44 illustrates a DLD chip in a manifold as described herein.

La FIG. 45 ilustra un prototipo de plataforma de alta presión para procesar sangre a velocidades >100 ml/h mediante un dispositivo DLD. FIG. 45 illustrates a prototype high pressure platform for processing blood at rates> 100 ml / hr using a DLD device.

La FIG.46 muestra un esquema que representa cambios en el protocolo de preparación de muestras convencional y el tiempo mediante el uso de dispositivos DLD descritos en el presente documento. El tiempo de preparación de la muestra se puede reducir de aproximadamente 2 a 3 horas a menos de 20 minutos. FIG. 46 shows a schematic depicting changes in conventional sample preparation protocol and time using the DLD devices described herein. Sample preparation time can be reduced from approximately 2 to 3 hours to less than 20 minutes.

La FIG.47 ilustra un sistema de preparación de productos para muestras que utiliza los dispositivos DLD descritos en el presente documento. FIG. 47 illustrates a sample product preparation system utilizing the DLD devices described herein.

Las FIG. 48A-D ilustran un ejemplo de paredes separadoras de un dispositivo DLD. FIG. 48A: el esquema del diseño de la matriz DLD con paredes separadoras para el procesamiento y lavado de células en el chip. Las células diana (que siguen la trayectoria P1 y P2) se procesan y se lavan en un flujo fluídico continuo. Las paredes separadoras reducen la difusión del producto químico de tratamiento, como se indica por el sombreado rojo, para minimizar la contaminación en la salida del producto. FIG. 48B: el esquema del diseño detallado de la matriz DLD (d = 18 |jm, g = 18 jm y e = 1,36°) y el movimiento de las células en esta matriz DLD. Las células más pequeñas que un tamaño crítico seguirán la línea de corriente en una dirección recta en promedio (célula pequeña, flecha negra), mientras que las células más grandes que el tamaño crítico tropezarán con los postes siguiendo el eje inclinado de la matriz (célula diana, flecha roja). FIG. 48C: Esquema de la configuración del colector. FIG. 48D: FIGS. 48A-D illustrate an example of partition walls of a DLD device. FIG. 48A - DLD array layout schematic with partition walls for on-chip cell processing and washing. The target cells (which follow the P1 and P2 pathways) are processed and washed in a continuous fluidic flow. The partition walls reduce the diffusion of the treatment chemical, as indicated by the red shading, to minimize contamination at the product outlet. FIG. 48B: the schematic of the detailed design of the DLD matrix (d = 18 | jm, g = 18 jm and e = 1.36 °) and the movement of the cells in this DLD matrix. Cells smaller than a critical size will follow the streamline in a straight direction on average (small cell, black arrow), while cells larger than critical size will bump into posts following the inclined axis of the matrix (cell target, red arrow). FIG. 48C: Diagram of the collector configuration. FIG. 48D:

Esquema de la configuración experimental para el procesamiento de células en el chip.Schematic of the experimental setup for processing cells on the chip.

Las FIG. 49A-B ilustran simulaciones COMSOL de concentración relativa entre dispositivos. Simulaciones COMSOL de concentración relativa entre dispositivos sin pared separadora, con una pared separadora y con dos paredes separadoras a una velocidad promedio de fluido de 100 jm /s y 1 cm/s. SS: corriente de entrada de la muestra, TS: corriente de entrada de tratamiento, WS: corriente de entrada de lavado, WO: salida de residuos y PO: salida del producto. Cada condición muestra las regiones de entrada, intermedia y de salida (0,8 mm de longitud) de los dispositivos. Para 100 jm /s (1 cm/s), la contaminación de salida relativa es 0,33 (0,12), 0,32 (0,025) y 0,14 (0,017) sin, con 1 y con 2 paredes separadoras respectivamente. La contaminación de salida del producto químico de tratamiento se puede reducir eficazmente con el diseño de la pared separadora. FIGS. 49A-B illustrate COMSOL simulations of relative concentration between devices. COMSOL simulations of relative concentration between devices without a separating wall, with a separating wall and with two separating walls at an average fluid velocity of 100 jm / s and 1 cm / s. SS: sample inlet stream, TS: treatment inlet stream, WS: wash inlet stream, WO: waste outlet and PO: product outlet. Each condition shows the entry, middle, and exit regions (0.8 mm in length) of the devices. For 100 jm / s (1 cm / s), the relative outlet contamination is 0.33 (0.12), 0.32 (0.025) and 0.14 (0.017) without, with 1 and with 2 separating walls respectively . The outlet contamination of the treatment chemical can be effectively reduced by the design of the partition wall.

Las FIG. 50A-B muestran imágenes fluorescentes de R6G que fluye en las corrientes de tratamiento. Imágenes fluorescentes de R6G que fluye en la corriente de tratamiento de la matriz DLD convencional de la FIG. 50A y la matriz DLD de la FIG. 50B con dos paredes separadoras, que muestran una clara reducción de la contaminación en la salida del producto. La velocidad promedio del fluido en los espacios de los postes es de 1,4 mm/s. FIG. 50C Resultados de simulación experimental y COMSOL de concentración relativa frente a velocidad promedio de fluido para matrices DLD convencionales (negro) y con paredes separadoras (rojo). Los cuadrados blancos son resultados experimentales medidos como la relación entre la intensidad de fluorescencia en la salida del producto y la de la entrada de la corriente de tratamiento. Las líneas continuas son los resultados de la simulación COMSOL. En la FIG. 50C se traza una línea negra de puntos para señalar la velocidad crítica del fluido de 300 jm /s para el diseño convencional. La concentración de R6G es de 20 jg/ml. FIGS. 50A-B show fluorescent images of R6G flowing in treatment streams. Fluorescent images of R6G flowing in the conventional DLD matrix treatment stream of FIG. 50A and the DLD matrix of FIG. 50B with two partition walls, showing a clear reduction in contamination at the product outlet. Average fluid velocity in post spaces is 1.4 mm / s. FIG. 50C Experimental and COMSOL simulation results of relative concentration vs. average fluid velocity for conventional DLD matrices (black) and with separating walls (red). The open squares are experimental results measured as the ratio between the fluorescence intensity at the product outlet and that at the treatment stream inlet. The solid lines are the results of the COMSOL simulation. In FIG. 50C a black dotted line is drawn to denote the critical fluid velocity of 300 jm / s for the conventional design. The R6G concentration is 20 µg / ml.

La FIG. 51 muestra los resultados de simulación experimental y COMSOL de la concentración relativa frente al tiempo mínimo de incubación calculado para las matrices DLD convencionales (negro) y con pared separadora (rojo), conseguidos variando la velocidad promedio del fluido. Los cuadrados blancos son resultados experimentales y las líneas continuas son los resultados de la simulación COMSOL. Para las pruebas de tinción posteriores se seleccionó la condición para el diseño con dos paredes separadoras de una velocidad promedio de fluido en los espacios de los postes de 2,8 mm/s con un tiempo de incubación mínimo de ~ 4 s y una contaminación de salida de producto de 0,067 (indicada por líneas rojas de puntos). FIG. 51 shows the results of experimental and COMSOL simulation of the relative concentration versus the minimum incubation time calculated for the conventional DLD matrices (black) and with separating wall (red), achieved by varying the average speed of the fluid. Open squares are experimental results and solid lines are COMSOL simulation results. For the subsequent staining tests, the design condition was selected with two separating walls of an average fluid velocity in the post spaces of 2.8 mm / s with a minimum incubation time of ~ 4 s and an exit contamination. 0.067 product (indicated by dotted red lines).

Las FIG. 52A-B muestran imágenes fluorescentes de tinción de leucocitos en el chip con R6G con matrices DLD con pared separadora utilizando sangre humana diluida como entrada, sin centrifugación ni lisis. La velocidad promedio del fluido en los espacios de los postes es de 2,8 mm/s. La FIG. 52A muestra la región intermedia de la matriz DLD con pared separadora donde los leucocitos pasan a través de la corriente de R6G y están cerca de entrar en la corriente de lavado (región "B" en la FIG. 50B). La FIG. 52B muestra leucocitos marcados en el canal de salida con un fondo de fluorescencia insignificante. El recuadro de la FIG. 52B muestra viales de producto recogido y salidas de residuos, que muestran un nivel bajo de glóbulos rojos en el producto. FIGS. 52A-B show fluorescent images of leukocyte staining on the R6G chip with separating wall DLD arrays using diluted human blood as input, without centrifugation or lysis. Average fluid velocity in post spaces is 2.8mm / s. FIG. 52A shows the intermediate region of the DLD matrix with partition wall where leukocytes pass through the R6G stream and are close to entering the wash stream (region "B" in FIG. 50B ) . FIG. 52B shows labeled leukocytes in the exit channel with negligible fluorescence background. The inset of FIG. 52B shows collected product vials and waste outlets, showing a low level of red blood cells in the product.

Las FIG. 53A-C muestran la purificación de glóbulos blancos (WBC) con obstáculos con diferentes formas de sección transversal en una matriz DLD. La FIG. 53A muestra el rendimiento de glóbulos blancos (WBC) y la contaminación con glóbulos rojos (RBC) obtenidos utilizando obstáculos con diferentes formas de sección transversal a aproximadamente 40 ml/h. La "X" representa un cuarto de círculo. La orientación del flujo es de arriba hacia abajo. La FIG. 53B muestra los efectos inerciales de obstáculos circulares, con forma de diamante y triangulares asimétricos. El flujo está en la dirección y; la velocidad x es la velocidad lateral debida a los efectos inerciales. y = 0 es el espacio (punto más estrecho), los valores y negativos están aguas arriba en la dirección del flujo, y los valores y positivos están aguas abajo en la dirección del flujo. La FIG. 53C muestra una comparación de las fuerzas de cizallamiento generadas por obstáculos circulares y con forma de diamante. El flujo es de arriba hacia abajo. FIGS. 53A-C show the purification of white blood cells (WBC) with obstacles with different cross-sectional shapes in a DLD matrix. FIG. 53A shows the yield of white blood cells (WBC) and contamination with red blood cells (RBC) obtained using obstacles with different cross-sectional shapes at approximately 40 ml / h. The "X" represents a quarter of a circle. The flow orientation is from top to bottom. FIG. 53B shows the inertial effects of circular, diamond-shaped, and asymmetric triangular obstacles. The flow is in the y direction; the velocity x is the lateral velocity due to inertial effects. y = 0 is the space (narrowest point), negative y values are upstream in the flow direction, and positive y values are downstream in the flow direction. FIG. 53C shows a comparison of the shear forces generated by circular and diamond-shaped obstacles. The flow is from top to bottom.

Las FIG. 54A-B muestran incubadoras de flujo continuo ilustrativas. La FIG. 54A muestra una incubadora de flujo continuo ilustrativa que conecta dos matrices DLD. La FIG. 54B muestra un equilibrador de resistencia fluídica ilustrativo conectado a una matriz DLD conectada a una incubadora de flujo continuo conectada a una segunda matriz DLD. FIGS. 54A-B show illustrative flow-through incubators. FIG. 54A shows an illustrative flow-through incubator connecting two DLD arrays. FIG. 54B shows an illustrative fluidic resistance balancer connected to a DLD array connected to a continuous flow incubator connected to a second DLD array.

La FIG. 55 muestra una incubadora fuera de chip ilustrativa. La incubadora puede ser un vial de vidrio con puertos para conectarse con uno o más chips microfluídicos. FIG. 55 shows an illustrative off-chip incubator. The incubator can be a glass vial with ports to connect with one or more microfluidic chips.

La FIG. 56 ilustra una salida de una matriz DLD; la relación de resistencia fluídica entre la salida de producto y la salida de residuos es de 3:1. La relación de volumen de la salida del producto y la salida de residuos es de 1:3. La FIG. 57 ilustra una relación de resistencia fluídica entre la salida de producto y la salida de residuos de una matriz DLD que es de 3:1. La relación de volumen de la salida del producto y la salida de residuos es de 1:3. La FIG. 58 ilustra una relación de resistencia fluídica entre la salida de producto y la salida de residuos de una matriz DLD que es de 6:1. La relación de volumen de la salida del producto y la salida de residuos es de 1:6. FIG. 56 illustrates an output from a DLD matrix; the fluid resistance ratio between the product outlet and the waste outlet is 3: 1. The volume ratio of the product outlet and the waste outlet is 1: 3. FIG. 57 illustrates a fluidic resistance ratio between the product outlet and the waste outlet of a DLD matrix that is 3: 1. The volume ratio of the product outlet and the waste outlet is 1: 3. FIG. 58 illustrates a fluidic resistance ratio between the product outlet and the waste outlet of a DLD matrix that is 6: 1. The volume ratio of the product outlet and the waste outlet is 1: 6.

Descripción detalladaDetailed description

I. Descripción generalI. General description

En el presente documento se describen métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y kits para el procesamiento químico, purificación, aislamiento y/o concentración de partículas. En algunos casos, el procesamiento químico, la purificación, el aislamiento y/o la concentración de partículas puede ser de alto rendimiento. El procesamiento químico, la purificación, el aislamiento y/o la concentración de partículas puede implicar la separación de partículas según el tamaño, por ejemplo, haciendo fluir una muestra a través de una matriz de obstáculos, por ejemplo, una matriz de desplazamiento lateral determinista (DLD). Se describen dispositivos para separar partículas según el tamaño y/o usando DLD, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 7.150.812, 7.318.902, 7.472.794, 7.735.652, 7.988.840, 8.021.614, 8.282.799, 8.304.230, 8.579.117 y en la publicación PCT n.° WO2012094642. En algunos casos, los métodos de alto rendimiento comprenden caudales de al menos 1 ml/min, al menos 5 ml/min, al menos 10 ml/min o al menos 20 ml/min. En algunos casos, los dispositivos descritos en el presente documento pueden procesar menos de 1 ml, al menos 10 ml, al menos 100 ml o al menos 300 ml de muestra.Methods, compositions, devices, systems and kits for chemical processing, purification, isolation and / or concentration of particles are described herein. In some cases, chemical processing, purification, isolation, and / or particle concentration can be high throughput. Chemical processing, purification, isolation and / or concentration of particles may involve separation of particles based on size, for example by flowing a sample through a matrix of obstacles, for example a deterministic side-shift matrix (DLD). Devices for separating particles according to size and / or using DLD are described, for example, in US Patent Nos. 7,150,812, 7,318,902, 7,472,794, 7,735,652, 7,988,840, 8,021,614. , 8,282,799, 8,304,230, 8,579,117 and in PCT Publication No. WO2012094642. In some cases, high throughput methods comprise flow rates of at least 1 ml / min, at least 5 ml / min, at least 10 ml / min, or at least 20 ml / min. In some cases, the devices described herein can process less than 1 ml, at least 10 ml, at least 100 ml, or at least 300 ml of sample.

En el presente documento se describen métodos, sistemas y dispositivos (por ejemplo, chips de DLD) para automatizar y simplificar el proceso de preparación de células para el análisis celular (por ejemplo, análisis de citometría de flujo o clasificación celular). En la primera columna de la FIG. 42 se muestra un procedimiento de procesamiento celular manual de varias etapas para citometría de flujo. Los chips DLD descritos en el presente documento pueden permitir la automatización y combinación de estas etapas. Los métodos, sistemas y dispositivos proporcionados en el presente documento pueden reemplazar a las etapas de lavado manuales que implican centrifugación y resuspensión, así como a la etapa de lisis de glóbulos rojos (RBC) y todas las etapas de manipulación manual asociadas con el marcaje de superficie e intracelular y la fijación/permeabilización (fijación/permeabilización). En algunos casos, se usan chips DLD junto con procedimientos fuera del chip para procesar células. Los métodos, sistemas y dispositivos también pueden reducir el tamaño de la muestra inicial (por ejemplo, a no más de aproximadamente 100 pl de sangre completa). En algunos casos, las etapas de lavado convencionales se pueden reemplazar con un proceso en chip que purifica ("recoge") glóbulos blancos (WBC) sin centrifugación de una mezcla de anticuerpos monoclonales (Mab) y otros marcadores, reactivos de fijación/permeabilización y glóbulos rojos (RBC).Methods, systems, and devices (eg, DLD chips) to automate and simplify the process of preparing cells for cell analysis (eg, flow cytometric analysis or cell sorting) are described herein. In the first column of FIG. 42 shows a multi-step manual cell processing procedure for flow cytometry. The DLD chips described herein can allow automation and combining of these steps. The methods, systems and devices provided herein can replace manual washing steps that involve centrifugation and resuspension, as well as the red blood cell (RBC) lysis step and all manual manipulation steps associated with labeling. surface and intracellular and fixation / permeabilization (fixation / permeabilization). In some cases, DLD chips are used in conjunction with off-chip procedures to process cells. Methods, systems, and devices can also reduce the initial sample size (eg, to no more than about 100 µl of whole blood). In some cases, conventional washing steps can be replaced with an on-chip process that purifies ("collects") white blood cells (WBCs) without centrifugation from a mixture of monoclonal antibodies (Mabs) and other labels, binding / permeabilization reagents, and red blood cells (RBC).

Los métodos, sistemas y dispositivos descritos en el presente documento se pueden usar para realizar una o más etapas de procesamiento celular en un chip microfluídico. La realización de las etapas en el chip microfluídico puede reducir el tiempo y el coste de manipulación. En algunos casos, se puede realizar una etapa de lavado y/o concentración en un chip microfluídico. En algunos casos, se pueden realizar individualmente una etapa de fijación/permeabilización, una etapa de marcaje de la superficie celular y una etapa de marcaje intracelular o en cualquier combinación en un chip microfluídico. En algún caso, puede realizarse cualquiera de las etapas mencionadas anteriormente, o una combinación de las mismas, en combinación con un lavado/concentración en un chip microfluídico. Por ejemplo, se puede realizar una etapa de fijación/permeabilización y una etapa de lavado/concentración en un chip microfluídico. En otro ejemplo, se puede realizar una etapa de marcaje de la superficie celular y una etapa de lavado/concentración en un chip microfluídico. En otro ejemplo, se puede realizar una etapa de mareaje intracelular y una etapa de lavado/concentración en un chip microfluídico.The methods, systems, and devices described herein can be used to perform one or more cell processing steps on a microfluidic chip. Performing the stages on the microfluidic chip can reduce handling time and cost. In some cases, a wash and / or concentration step can be performed on a microfluidic chip. In some cases, a fixation / permeabilization step, a cell surface labeling step, and an intracellular labeling step can be performed individually or in any combination on a microfluidic chip. In some case, any of the steps mentioned above, or a combination thereof, can be performed in combination with a wash / concentration on a microfluidic chip. For example, a fixation / permeabilization step and a washing / concentrating step can be performed on a microfluidic chip. In another example, a surface marking step can be performed cell and a wash / concentration step on a microfluidic chip. In another example, an intracellular labeling step and a washing / concentrating step can be performed on a microfluidic chip.

Cualquiera de los chips microfluídicos o combinaciones puede usarse junto con cualquier método fuera del chip para procesar células. En algunos casos, una o más de las etapas de procesamiento celular se pueden realizar en uno o más chips microfluídicos, y las otras etapas de procesamiento celular se pueden realizar usando cualquiera de los métodos fuera del chip. En algunos casos, todas las etapas de procesamiento celular se pueden realizar en un chip microfluídico. Por ejemplo, todas las etapas de marcaje de la superficie, fijación, permeabilización, marcaje intracelular y las etapas de lavado asociadas se pueden integrar en un solo chip de "lavado de coches" en la presente invención. La combinación de las etapas de procesamiento celular en microfluidos puede reducir el tiempo y el coste de manipulación, y puede tener como resultado chips y procesos de productos adicionales. En algunos casos, en el presente documento se proporciona un sistema para procesar partículas en una muestra, comprendiendo el sistema: un componente microfluídico, en donde el componente microfluídico comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; y una matriz de obstáculos, en donde la primera matriz de obstáculos desvía las partículas a través de una serie de corrientes de flujo que fluyen desde la pluralidad de entradas a la pluralidad de salidas, en donde las partículas se desvían hacia la segunda pared cuando fluyen desde las entradas a las salidas, y en donde la pluralidad de corrientes de flujo comprenden dos corrientes de flujo seleccionadas del grupo que consiste en una corriente de flujo que comprende un agente de marcaje, una corriente de flujo que comprende un agente de fijación y un agente de permeabilización, y una corriente de flujo que comprende un tampón de lavado; y un componente no microfluídico.Any of the microfluidic chips or combinations can be used in conjunction with any off-chip method to process cells. In some cases, one or more of the cell processing steps can be performed on one or more microfluidic chips, and the other cell processing steps can be performed using any of the off-chip methods. In some cases, all cell processing steps can be performed on a microfluidic chip. For example, all the steps of surface marking, fixation, permeabilization, intracellular marking and associated washing steps can be integrated into a single "car wash" chip in the present invention. The combination of cell processing steps in microfluidics can reduce handling time and cost, and can result in additional chips and product processes. In some instances, a system for processing particles in a sample is provided herein, the system comprising: a microfluidic component, wherein the microfluidic component comprises a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, in where the channel is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall; and an obstacle matrix, wherein the first obstacle matrix deflects the particles through a series of flow streams that flow from the plurality of inlets to the plurality of outlets, wherein the particles deflect toward the second wall as they flow. from the inlets to the outlets, and wherein the plurality of flow streams comprise two flow streams selected from the group consisting of a flow stream comprising a labeling agent, a flow stream comprising a fixing agent, and a permeation agent, and a flow stream comprising a wash buffer; and a non-microfluidic component.

En el presente documento se describen métodos, dispositivos y sistemas para prolongar el tiempo de incubación de las células en una solución. En algunos casos, lo que se proporciona en el presente documento incluye un sistema para prolongar el tiempo de contacto de las partículas con una solución que comprende un agente de reacción, comprendiendo el sistema una incubadora de flujo continuo, en donde la incubadora de flujo continuo está conectada fluídicamente, por ejemplo, un canal que comprende una matriz DLD, en donde las partículas fluyen desde el canal a la incubadora de flujo continuo en una corriente de flujo, y en donde la corriente de flujo comprende la solución que comprende el agente de reacción. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede ser un componente en un chip microfluídico para procesar células. En algunos casos, el dispositivo y los métodos pueden prolongar la distancia que se desplazan las células en una solución, de manera que las células puedan mantenerse en contacto con la solución durante más tiempo sin reducir el caudal en el sistema. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede ser un canal en un chip microfluídico, por ejemplo, un canal serpenteante. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede ser un dispositivo fuera del chip. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede ser un recipiente fuera del chip. En algunos casos, un recipiente fuera del chip está conectado fluídicamente a un canal que comprende una matriz DLD.Methods, devices, and systems for prolonging the incubation time of cells in solution are described herein. In some instances, what is provided herein includes a system for prolonging the contact time of the particles with a solution comprising a reaction agent, the system comprising a flow-through incubator, wherein the flow-through incubator a channel comprising a DLD matrix is fluidically connected, for example, wherein the particles flow from the channel to the flow-through incubator in a flow stream, and wherein the flow stream comprises the solution comprising the agent for reaction. In some cases, the flow-through incubator can be a component on a microfluidic chip for processing cells. In some cases, the device and methods can extend the distance that cells travel in a solution so that the cells can stay in contact with the solution for longer without reducing the flow rate in the system. In some cases, the flow-through incubator may be a channel in a microfluidic chip, for example a meandering channel. In some cases, the flow-through incubator may be an off-chip device. In some cases, the flow-through incubator may be an off-chip container. In some cases, an off-chip container is fluidly connected to a channel comprising a DLD matrix.

La incubadora de flujo continuo puede usarse en combinación con cualquiera de los chips microfluídicos descritos en el presente documento para prolongar el tiempo de contacto de las células con una solución. En algunos casos, en el presente documento se proporciona un sistema para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el dispositivo: un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas hasta una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; una primera matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de la primera matriz de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la primera matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de la muestra de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida, en donde el dispositivo está configurado de manera que las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían hacia una segunda corriente de flujo que fluye desde una segunda entrada a la primera salida mientras se desvían hacia la segunda pared, en donde la segunda corriente de flujo comprende un reactivo; y una incubadora de flujo continuo conectada fluídicamente con la primera salida, en donde la incubadora de flujo continuo comprende un canal.The flow-through incubator can be used in combination with any of the microfluidic chips described herein to extend the contact time of cells with a solution. In some cases, provided herein is a system for processing first particles of at least a predetermined size in a sample, the device comprising: a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, wherein the channel it is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall; a first obstacle matrix arranged in rows in the channel, where each subsequent row of the first obstacle matrix is laterally displaced with respect to a previous row, where the first obstacle matrix is configured to differentially deflect the first particles from the minus a predetermined size to a first outlet and the second sample particles of a smaller than predetermined size to a second outlet, wherein the device is configured such that the first particles are introduced into a first flow stream from a first inlet and divert to a second flow stream that flows from a second inlet to the first outlet while diverting to the second wall, wherein the second flow stream comprises a reagent; and a flow-through incubator fluidly connected to the first outlet, wherein the flow-through incubator comprises a channel.

Se puede usar una incubadora fuera del chip con cualquiera de los chips microfluídicos para prolongar el tiempo de contacto de las células con una solución. En algunos casos, en el presente documento se describe un sistema para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el sistema: un dispositivo que comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas hasta una pluralidad de salidas; una primera matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de la muestra de un tamaño menor que el predeterminado a una segunda salida; y una incubadora conectada fluídicamente con la primera salida.An off-chip incubator can be used with any of the microfluidic chips to extend the contact time of cells with a solution. In some instances, a system for processing first particles of at least a predetermined size in a sample is described herein, the system comprising: a device comprising a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets; a first obstacle matrix arranged in rows in the channel, wherein each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, wherein the obstacle matrix is configured to differentially deflect the first particles of at least a predetermined size to a first outlet and the second sample particles of a size smaller than predetermined to a second outlet; and an incubator fluidically connected to the first outlet.

En el presente documento se describen métodos y dispositivos para purificar un primer tipo de células en una muestra que comprende los primeros tipos de células. La muestra puede comprender un segundo tipo de células. Tales métodos y dispositivos pueden configurarse para lograr un alto rendimiento de los primeros tipos de células. Los métodos y dispositivos se pueden configurar para lograr una baja contaminación de los segundos tipos de células. En algunos casos, tales dispositivos pueden comprender una matriz de obstáculos con ciertas formas de sección transversal. Por ejemplo, al menos uno de los obstáculos puede tener forma de sección transversal cuadrilátera (por ejemplo, forma de diamante). En el presente documento se proporciona un sistema para purificar primeras partículas a partir de una muestra, comprendiendo el sistema: una matriz de obstáculos dispuestos en filas, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida y las segundas partículas de menos del tamaño predeterminado en la muestra a una segunda salida, en donde las superficies de dos de los obstáculos definen un espacio respectivo, en donde el espacio respectivo está orientado de una forma sustancialmente simétrica con respecto a un plano que se extiende a través del centro del espacio respectivo y que es paralelo a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos, en donde cada uno de los dos obstáculos que definen un espacio respectivo tiene una sección transversal poligonal, en donde un vértice de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apunta a una dirección sustancialmente paralela a la dirección del flujo de la muestra a través del matriz de obstáculos.Described herein are methods and devices for purifying a first cell type in a sample comprising the first cell types. The sample may comprise a second type of cells. Such methods and devices can be configured to achieve high throughput of the first cell types. The methods and devices can be configured to achieve low contamination of the second cell types. In In some cases, such devices may comprise an obstacle matrix with certain cross-sectional shapes. For example, at least one of the obstacles may be in the shape of a quadrilateral cross section (eg, diamond shape). A system for purifying first particles from a sample is provided herein, the system comprising: a matrix of obstacles arranged in rows, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, where the The obstacle matrix is configured to differentially deflect the first particles of at least a predetermined size to a first exit and the second particles of less than the predetermined size in the sample to a second exit, where the surfaces of two of the obstacles define a space respective space, wherein the respective space is oriented in a substantially symmetrical manner with respect to a plane extending through the center of the respective space and which is parallel to a flow direction of the sample through the obstacle matrix, in where each of the two obstacles defining a respective space has a polygonal cross section , wherein one vertex of each of the two obstacles with the polygonal cross section points to a direction substantially parallel to the direction of flow of the sample through the obstacle matrix.

También se describe en el presente documento un dispositivo DLD, comprendiendo el dispositivo al menos tres conjuntos de matrices de obstáculos dispuestos en filas, en donde el tamaño del espacio entre los obstáculos en la segunda matriz es menor que el tamaño del espacio entre los obstáculos en la primera matriz, y en donde el tamaño del espacio de los obstáculos en la tercera matriz es más pequeño que el tamaño del espacio entre los obstáculos en la segunda matriz, en donde la longitud de la tercera matriz es de aproximadamente 1,2 cm.Also described herein is a DLD device, the device comprising at least three sets of obstacle matrices arranged in rows, wherein the size of the space between the obstacles in the second matrix is smaller than the size of the space between the obstacles in the first matrix, and wherein the size of the space of the obstacles in the third matrix is smaller than the size of the space between the obstacles in the second matrix, where the length of the third matrix is approximately 1.2 cm.

También se describe en el presente documento un DLD de espejo que comprende un canal de derivación configurado para fluir hacia un canal de salida de producto, en donde el volumen del canal de producto en la base de la matriz DLD es aproximadamente 1/3, 1/6 o 1/7 del volumen de un canal de recolección de residuos en la base de la matriz DLD (véase, por ejemplo, la FIG. 57 y la FIG. 58).Also described herein is a mirror DLD comprising a bypass channel configured to flow into a product outlet channel, wherein the volume of the product channel at the base of the DLD matrix is approximately 1/3.1 / 6 or 1/7 the volume of a waste collection channel at the base of the DLD array (see, for example, FIG. 57 and FIG. 58 ).

En el presente documento se describe además un dispositivo para procesar, purificar y concentrar partículas en donde el dispositivo comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, y en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; y una matriz de obstáculos dispuestos dentro del canal configurados para desviar partículas hacia la segunda pared cuando las partículas fluyen desde las entradas a las salidas. El dispositivo se puede configurar de manera que las partículas de una muestra de fluido se introduzcan en al menos una de la pluralidad de entradas y las partículas de un tamaño predeterminado en la muestra de fluido se desvíen a través de una serie de corrientes de flujo paralelas que fluyen desde la pluralidad de entradas a la una pluralidad de salidas mientras también se desvían hacia la segunda pared. En algunos casos, la serie de corrientes de flujo paralelas comprende al menos cuatro corrientes de flujo que comprenden un reactivo. Los reactivos pueden ser reactivos iguales o diferentes.Further described herein is a device for processing, purifying and concentrating particles wherein the device comprises a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, and wherein the channel is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall; and an array of obstacles arranged within the channel configured to deflect particles toward the second wall as the particles flow from the inlets to the outlets. The device can be configured so that particles from a fluid sample are introduced into at least one of the plurality of inlets and particles of a predetermined size in the fluid sample are diverted through a series of parallel flow streams. flowing from the plurality of inlets to the plurality of outlets while also diverting towards the second wall. In some cases, the series of parallel flow streams comprises at least four flow streams that comprise a reagent. The reagents can be the same or different reagents.

En el presente documento también se describe un dispositivo, comprendiendo el dispositivo un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared, y en donde el dispositivo está configurado para hacer fluir una pluralidad de corrientes de flujo desde la pluralidad de entradas a la pluralidad de salidas, en donde la pluralidad de corrientes de flujo fluyen paralelas entre sí; y una matriz de obstáculos dispuestos dentro del canal configurados para desviar partículas hacia la segunda pared cuando las partículas fluyen desde las entradas a las salidas, en donde la matriz de obstáculos comprende al menos una pared separadora orientada paralela al flujo de la pluralidad de corrientes de flujo y la primera y segunda paredes. El dispositivo se puede configurar de forma que las partículas introducidas en una entrada de muestra cerca de la primera pared pasen a través de la pluralidad de corrientes de flujo mientras se desvían hacia la segunda pared, y de forma que dicha al menos una pared separadora esté configurada para retrasar el flujo de partículas desviadas hacia la segunda pared, en donde el retraso sirve para aumentar sustancialmente la cantidad de tiempo que las partículas desviadas residen en una corriente de flujo y/o reducir sustancialmente la mezcla entre corrientes de flujo paralelas.Also described herein is a device, the device comprising a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, wherein the channel is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall, and wherein the device is configured to flow a plurality of flow streams from the plurality of inlets to the plurality of outlets, wherein the plurality of flow streams flow parallel to each other; and an obstacle matrix arranged within the channel configured to deflect particles towards the second wall as the particles flow from the inlets to the outlets, wherein the obstacle matrix comprises at least one separating wall oriented parallel to the flow of the plurality of streams of flow and the first and second walls. The device can be configured such that particles introduced into a sample inlet near the first wall pass through the plurality of flow streams while deflecting toward the second wall, and such that said at least one separating wall is configured to retard the flow of deflected particles toward the second wall, wherein the delay serves to substantially increase the amount of time that the deflected particles reside in one flow stream and / or substantially reduce mixing between parallel flow streams.

En el presente documento también se describe un dispositivo, comprendiendo el dispositivo un canal que se extiende desde al menos una entrada a al menos una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; y una matriz de obstáculos dispuestos dentro del canal configurados para desviar partículas en una corriente que comprende partículas hacia la segunda pared cuando la corriente que comprende partículas fluye desde dicha al menos una entrada a la pluralidad de salidas. El dispositivo está configurado de forma que la primera pared comprende una pluralidad de entradas adaptadas para hacer fluir un fluido hacia una pluralidad de salidas en la segunda pared, en donde la dirección del flujo del fluido es perpendicular al flujo de la corriente que comprende las partículas y en donde el flujo del fluido está configurado para eliminar cualquier partícula que se haya atascado en la matriz de obstáculos después del movimiento de las partículas hacia la segunda pared.Also described herein is a device, the device comprising a channel extending from at least one inlet to at least a plurality of outlets, wherein the channel is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall. ; and an array of obstacles disposed within the channel configured to deflect particles in a stream comprising particles toward the second wall when the stream comprising particles flows from said at least one inlet to the plurality of outlets. The device is configured such that the first wall comprises a plurality of inlets adapted to flow a fluid towards a plurality of outlets in the second wall, wherein the direction of the flow of the fluid is perpendicular to the flow of the current comprising the particles. and wherein the flow of the fluid is configured to remove any particles that have become stuck in the matrix of obstacles after movement of the particles towards the second wall.

En el presente documento se describe además un método para marcar células, comprendiendo el método proporcionar una muestra que comprende células, procesar la muestra que comprende células, en donde el procesamiento comprende introducir la muestra que comprende células en una entrada de muestra de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos y pasar la muestra a través de la matriz de obstáculos, en donde el matriz de obstáculos comprende una pluralidad de corrientes de flujo paralelas que fluyen a través de la matriz de obstáculos, en donde el paso comprende el flujo de células de la muestra desde la entrada de muestra a través de la pluralidad de corrientes de flujo paralelas, en donde al menos una de la pluralidad de corrientes de flujo paralelas comprende un reactivo de mareaje, al menos una de la pluralidad de corrientes de flujo paralelas comprende un agente de fijación, al menos una de la pluralidad de corrientes de flujo paralelas comprende un agente de permeabilización y al menos una de la pluralidad de corrientes de flujo paralelas comprende un tampón de lavado, con lo que el paso de la muestra a través de la matriz de obstáculos sirve para marcar las células mientras se separan las células simultáneamente por tamaño; y recoger células marcadas de un tamaño predeterminado de una de una pluralidad de salidas del dispositivo.A method for labeling cells is further described herein, the method comprising providing a sample comprising cells, processing the sample comprising cells, wherein the processing comprises introducing the sample comprising cells into a sample inlet of a device that comprises an obstacle matrix and passing the sample through the obstacle matrix, wherein the obstacle matrix comprises a plurality of parallel flow streams flowing through the obstacle matrix, wherein the step comprises the flow of sample cells from the sample inlet through the plurality of parallel flow streams, wherein at least one of the plurality of parallel flow streams comprises a labeling reagent, at least one of the plurality of parallel flow streams comprises a fixing agent, at least one of the plurality of parallel flow streams comprises a permeation agent and at least one of the plurality of parallel flow streams comprises a wash buffer, whereby the passage of the sample through the matrix of obstacles serves to mark the cells while simultaneously separating the cells by size; and collecting labeled cells of a predetermined size from one of a plurality of outlets of the device.

En el presente documento se describe además un método para procesar leucocitos para pruebas de diagnóstico molecular, comprendiendo el método marcar y recoger los leucocitos de una muestra usando un dispositivo microfluídico, en donde el rendimiento de células marcadas es de al menos el 85 % y la viabilidad de las células marcadas es de al menos el 90 %.A method for processing leukocytes for molecular diagnostic tests is further described herein, the method comprising marking and collecting leukocytes from a sample using a microfluidic device, wherein the yield of labeled cells is at least 85% and the Labeled cell viability is at least 90%.

En el presente documento se describen además métodos para procesar partículas en una muestra utilizando el dispositivo microfluídico y la incubadora de flujo continuo desvelados en el presente documento. Dichos métodos pueden permitir que las partículas se incuben con un agente de reacción durante un tiempo suficiente sin reducir el caudal en el dispositivo microfluídico. Los métodos proporcionados en el presente documento pueden comprender el paso de partículas en una muestra a través de un sistema que comprende cualquier chip microfluídico y cualquier incubadora proporcionada en el presente documento. En algunos casos, lo que se proporciona en el presente documento incluye un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el método: proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado y, opcionalmente, segundas partículas de menos del tamaño predeterminado; pasar la muestra a través de un sistema, en donde el sistema comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas a una primera salida y las segundas partículas a una segunda salida, en donde el dispositivo está configurado de manera que las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían hacia una segunda corriente de flujo que fluye desde una segunda entrada a la primera salida mientras se desvían hacia la segunda pared, en donde la segunda corriente de flujo comprende un reactivo; y una incubadora de flujo continuo conectada fluídicamente con la primera salida, en donde la incubadora de flujo continuo comprende un canal.Methods for processing particles in a sample using the microfluidic device and continuous flow incubator disclosed herein are further described herein. Such methods can allow the particles to be incubated with a reaction agent for a sufficient time without reducing the flow rate in the microfluidic device. The methods provided herein may comprise passing particles in a sample through a system comprising any microfluidic chip and any incubator provided herein. In some instances, what is provided herein includes a method for processing first particles of at least a predetermined size in a sample, the method comprising: providing a sample comprising first particles of at least a predetermined size, and optionally, second particles less than the predetermined size; passing the sample through a system, wherein the system comprises a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, wherein the channel is bounded by a first wall and a second wall opposite the first wall; an obstacle matrix arranged in rows in the channel, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, wherein the obstacle matrix is configured to differentially deflect the first particles to a first exit and the second particles to a second outlet, wherein the device is configured such that the first particles are introduced into a first flow stream from a first inlet and are diverted into a second flow stream that flows from a second inlet to the first outlet while deflect towards the second wall, where the second flow stream comprises a reagent; and a flow-through incubator fluidly connected to the first outlet, wherein the flow-through incubator comprises a channel.

En el presente documento se describen además métodos para purificar un grupo de partículas de una muestra. En algunos casos, los métodos comprenden pasar la muestra a través de una matriz de obstáculos con ciertas formas de sección transversal, por ejemplo, una forma cuadrilátera. Dichos obstáculos pueden tener un efecto de desplazamiento mejorado de los obstáculos (por ejemplo, debido al mayor efecto de inercia) y pueden reducir la deformación de las partículas. Por tanto, las partículas se pueden purificar de la muestra con un alto rendimiento y una baja contaminación de otros componentes de la muestra. En el presente documento se proporciona un método para purificar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado en una muestra, comprendiendo el método: proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado y, opcionalmente, segundas partículas de menos del tamaño predeterminado; pasar la muestra a través de una matriz de obstáculos dispuestos en filas, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente primeras partículas a una primera salida y segundas partículas a una segunda salida, en donde las superficies de dos de los obstáculos definen un espacio respectivo, en donde el espacio respectivo está orientado de una forma sustancialmente simétrica con respecto a un plano que se extiende a través del centro del espacio respectivo y que es paralelo a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos, en donde cada uno de los dos obstáculos que definen un espacio respectivo tiene una sección transversal poligonal, en donde un vértice de cada uno de los dos obstáculos con la sección transversal poligonal apunta a una dirección sustancialmente paralela a la dirección del flujo de la muestra a través del matriz de obstáculos.Methods for purifying a group of particles from a sample are further described herein. In some cases, the methods comprise passing the sample through an obstacle matrix with certain cross-sectional shapes, for example, a quadrilateral shape. Such obstacles can have an improved obstacle displacement effect (for example, due to the greater inertia effect) and can reduce the deformation of the particles. Therefore, the particles can be purified from the sample with high throughput and low contamination of other components of the sample. Provided herein is a method for purifying first particles of at least a predetermined size in a sample, the method comprising: providing a sample comprising first particles of at least a predetermined size and optionally second particles of less than the predetermined size ; passing the sample through an obstacle matrix arranged in rows, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, where the obstacle matrix is configured to differentially deflect first particles to a first exit and second particles to a second exit, wherein the surfaces of two of the obstacles define a respective space, wherein the respective space is oriented in a substantially symmetrical manner with respect to a plane extending through the center of the respective space and which is parallel to a flow direction of the sample through the obstacle matrix, where each of the two obstacles that define a respective space has a polygonal cross section, where a vertex of each of the two obstacles with the section polygonal cross-section points to a direction substantially parallel to the direction of flow of the sample through the matrix of obstacles.

En el presente documento se describen además métodos para procesar partículas en una muestra usando uno o más chips microfluídicos y uno o más dispositivos fuera del chip. Tales combinaciones pueden proporcionar procedimientos flexibles para procesar las partículas. En algunos casos, lo que se proporciona en el presente documento incluye un método para procesar primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado, comprendiendo el método: proporcionar una muestra que comprende primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado y, opcionalmente, segundas partículas de menos del tamaño predeterminado; pasar la muestra a través de un dispositivo microfluídico, sistema, en donde el sistema comprende un canal que se extiende desde una pluralidad de entradas a una pluralidad de salidas, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared opuesta a la primera pared; una matriz de obstáculos dispuestos en filas en el canal, en donde cada fila posterior de obstáculos se desplaza lateralmente con respecto a una fila anterior, en donde la matriz de obstáculos está configurada para desviar diferencialmente las primeras partículas a una primera salida y las segundas partículas a una segunda salida, en donde el dispositivo está configurado de manera que las primeras partículas se introducen en una primera corriente de flujo desde una primera entrada y se desvían para fluir a través de una o más corrientes de flujo de reacción que fluyen desde la pluralidad de entradas a la pluralidad de salidas, en donde dichas una o más corrientes de flujo de reacción comprenden una corriente de flujo de reacción que comprende un reactivo de mareaje, una corriente de flujo de reacción que comprende un agente de fijación, una corriente de flujo de reacción que comprende un agente de permeabilización y una corriente de flujo de reacción que comprende un tampón de lavado, o cualquier combinación de las mismas; pasar la muestra a través de un dispositivo no microfluídico, en donde el dispositivo no microfluídico comprende una solución que comprende un reactivo, en donde el reactivo se selecciona del grupo de un reactivo de marcaje, un agente de fijación, un reactivo de permeabilización o un tampón de lavado.Also described herein are methods for processing particles in a sample using one or more microfluidic chips and one or more off-chip devices. Such combinations can provide flexible procedures for processing the particles. In some instances, what is provided herein includes a method for processing first particles of at least a predetermined size, the method comprising: providing a sample comprising first particles of at least a predetermined size and optionally second particles of less than the default size; passing the sample through a microfluidic device, system, wherein the system comprises a channel extending from a plurality of inlets to a plurality of outlets, wherein the channel is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall; an obstacle matrix arranged in rows in the channel, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, wherein the obstacle matrix is configured to differentially deflect the first particles to a first exit and the second particles to a second outlet, wherein the device is configured such that the first particles are introduced into a first flow stream from a first inlet and diverted to flow through one or more reaction flow streams flowing from the plurality from inlets to the plurality of outlets, wherein said one or more streams of flow of reaction comprise a reaction flow stream comprising a labeling reagent, a reaction flow stream comprising a fixing agent, a reaction flow stream comprising a permeation agent and a reaction flow stream comprising a wash buffer, or any combination thereof; passing the sample through a non-microfluidic device, wherein the non-microfluidic device comprises a solution comprising a reagent, wherein the reagent is selected from the group of a labeling reagent, a fixing agent, a permeabilization reagent, or a wash buffer.

En el presente documento se describen además métodos para prolongar el tiempo de las partículas en una solución que comprende un agente de reacción cuando las partículas pasan desde un depósito que comprende la solución. En algunos casos, uno de los métodos puede comprender pasar las partículas desde el depósito en un dispositivo microfluídico a través de una incubadora de flujo continuo, en donde la incubadora de flujo continuo está conectada fluídicamente con el depósito, y en donde las partículas están en la solución cuando pasan a través de la incubadora de flujo continuo.Also described herein are methods for prolonging the time of particles in a solution comprising a reaction agent as the particles pass from a reservoir comprising the solution. In some cases, one of the methods may comprise passing the particles from the reservoir in a microfluidic device through a flow-through incubator, wherein the flow-through incubator is fluidically connected to the reservoir, and wherein the particles are in constant flow. the solution as they pass through the flow-through incubator.

En algunos casos, uno de los métodos puede comprender: proporcionar una muestra que comprende partículas; introducir la muestra en un dispositivo microfluídico, donde el dispositivo microfluídico comprende una matriz de obstáculos, una pluralidad de entradas y una pluralidad de salidas, y en donde las partículas se introducen en al menos una de la pluralidad de entradas; pasar las partículas a través de la matriz de obstáculos, en donde las partículas se desvían a través de una serie de corrientes de flujo que fluyen desde la pluralidad de entradas a la pluralidad de salidas, y en donde la pluralidad de corrientes de flujo comprenden dos corrientes de flujo seleccionadas del grupo que consiste en una corriente de flujo que comprende un reactivo de marcaje, una corriente de flujo que comprende un agente de fijación, una corriente de flujo que comprende un agente de permeabilización y una corriente de flujo que comprende un tampón de lavado; y pasar las partículas a través de una incubadora de flujo continuo, en donde la incubadora de flujo continuo está conectada fluídicamente con la matriz de obstáculos, prolongándose así el tiempo que las partículas están en al menos una de las corrientes de flujo.In some cases, one of the methods may comprise: providing a sample comprising particles; introducing the sample into a microfluidic device, wherein the microfluidic device comprises an array of obstacles, a plurality of inlets and a plurality of outlets, and wherein the particles are introduced into at least one of the plurality of inlets; passing the particles through the obstacle matrix, wherein the particles are deflected through a series of flow streams flowing from the plurality of inlets to the plurality of outlets, and wherein the plurality of flow streams comprise two flow streams selected from the group consisting of a flow stream comprising a labeling reagent, a flow stream comprising a fixing agent, a flow stream comprising a permeation agent, and a flow stream comprising a buffer washing; and passing the particles through a flow-through incubator, wherein the flow-through incubator is fluidly connected to the matrix of obstacles, thus prolonging the time that the particles are in at least one of the flow streams.

En el presente documento se describe además un sistema para procesar y analizar partículas, comprendiendo el sistema una pluralidad de depósitos, en donde al menos uno de los depósitos comprende una muestra que comprende partículas, y al menos uno de los depósitos comprende un reactivo; un dispositivo, en donde el dispositivo está en comunicación fluida con cada uno de la pluralidad de depósitos, y en donde el dispositivo está adaptado para procesar partículas de la muestra que comprende partículas, en donde el procesamiento comprende hacer fluir la muestra que comprende partículas desde el depósito que comprende la muestra a una entrada de un dispositivo y hacer pasar las partículas a través del dispositivo, en donde el paso comprende hacer fluir las partículas desde la entrada a través de una pluralidad de corrientes de flujo paralelas dentro del dispositivo, en donde al menos una de las corrientes de flujo paralelas comprende un reactivo que fluye desde al menos uno de la pluralidad de depósitos, y en donde el dispositivo comprende una matriz de obstáculos, con lo que el paso de las partículas a través del dispositivo sirve para procesar las partículas así como para separar las partículas por tamaño; y un dispositivo analítico en comunicación fluida con al menos uno de una pluralidad de puertos de salida del dispositivo, en donde el dispositivo analítico está configurado para realizar un análisis de partículas procesadas por el dispositivo.Further described herein is a system for processing and analyzing particles, the system comprising a plurality of reservoirs, wherein at least one of the reservoirs comprises a sample comprising particles, and at least one of the reservoirs comprises a reagent; a device, wherein the device is in fluid communication with each of the plurality of reservoirs, and wherein the device is adapted to process particles of the sample comprising particles, wherein the processing comprises flowing the sample comprising particles from the reservoir comprising the sample at an inlet of a device and passing the particles through the device, wherein the passage comprises flowing the particles from the inlet through a plurality of parallel flow streams within the device, wherein at least one of the parallel flow streams comprises a reagent flowing from at least one of the plurality of reservoirs, and wherein the device comprises a matrix of obstacles, whereby the passage of the particles through the device serves to process the particles as well as to separate the particles by size; and an analytical device in fluid communication with at least one of a plurality of outlet ports of the device, wherein the analytical device is configured to perform an analysis of particles processed by the device.

Los procesos microfluídicos conocidos como desplazamiento lateral determinista (DLD) pueden retirar células de un flujo de fluido, en función de su tamaño (2). Cuando una mezcla de fluido y partículas fluye a través de una matriz de micropostes, en la que el eje de micropostes puede estar inclinado formando un pequeño ángulo de unos pocos grados desde la dirección del flujo de fluido, las partículas por encima de un cierto tamaño crítico (tales como leucocitos) pueden "impactar" con los postes desviándose para fluir en una dirección a lo largo del eje de la matriz inclinada (por lo tanto, el dispositivo puede denominarse "matriz de impacto"). Las partículas más pequeñas y moléculas disueltas, tales como glóbulos rojos, anticuerpos monoclonales (Mab) y reactivos químicos (por ejemplo, agentes de fijación, enzimas, agentes de permeabilización) pueden fluir en línea recta, en promedio, con o en la corriente de fluido. Por tanto, después de desplazarse a través del chip microfluídico, las células más grandes pueden salir y alejarse de la corriente de fluido de la mezcla de entrada original y pueden recogerse por separado. El proceso se puede utilizar para retirar una gama de objetos de un fluido de entrada, que varían desde grandes oligómeros de ADN (-100 kpb) hasta E. co liy otras bacterias, plaquetas, eritrocitos y leucocitos (2,4,5). El tamaño crítico que determina qué trayectoria siguen las celdas u otros objetos se puede controlar mediante el diseño de la matriz de micropostes (por ejemplo, el tamaño y la forma de los postes, los espacios entre postes, el ángulo de inclinación del eje) (6). Las células o partículas varias veces más grandes que el tamaño crítico que determina el impacto (es decir, las células que se recogen) pueden fluir a través del dispositivo sin atascarse. En algunos casos, las condiciones de funcionamiento (por ejemplo, carga del chip, caudales, recogida de salida) se pueden automatizar.Microfluidic processes known as deterministic lateral displacement (DLD) can remove cells from a fluid flow, depending on their size (2). When a mixture of fluid and particles flows through a micropost array, in which the axis of the microposts may be inclined at a small angle of a few degrees from the direction of fluid flow, the particles above a certain size Critical cells (such as leukocytes) can "hit" the posts by deflecting to flow in one direction along the axis of the inclined matrix (hence the device may be referred to as "hitting matrix"). Smaller particles and dissolved molecules, such as red blood cells, monoclonal antibodies (Mabs), and chemical reagents (e.g., binding agents, enzymes, permeabilizing agents) can flow in a straight line, on average, with or in the stream of fluid. Thus, after moving through the microfluidic chip, larger cells can exit and move away from the original inlet fluid stream and can be collected separately. The process can be used to remove a range of objects from an input fluid, ranging from large DNA oligomers (-100 kbp) to E. coli and other bacteria, platelets, erythrocytes, and leukocytes (2,4,5). . The critical size that determines which path cells or other objects follow can be controlled by the design of the micropost array (for example, size and shape of posts, spacing between posts, axis tilt angle) ( 6). Cells or particles several times larger than the critical size that determines the impact (that is, cells that are collected) can flow through the device without clogging. In some cases, operating conditions (eg chip loading, flow rates, output pickup) can be automated.

Un método de procesamiento de células descrito en el presente documento puede recuperar todos los subconjuntos de leucocitos con un rendimiento >90 %. Los métodos y dispositivos pueden ser una herramienta de investigación, clínica y/o comercial que puede reemplazar las etapas de lavado/concentrado con centrifugación convencionales actuales que pueden ser comunes en los laboratorios clínicos y de investigación. El uso del procedimiento de procesamiento celular no está restringido a la citometría de flujo y/o leucocitos.A cell processing method described herein can recover all the leukocyte subsets in> 90% yield. The methods and devices can be a research, clinical and / or commercial tool that can replace current conventional centrifugal wash / concentrate steps that may be common in clinical and research laboratories. The use of the cell processing procedure is not restricted to flow cytometry and / or leukocytes.

Las pruebas para cuantificar el número y los estados funcionales de los tipos de leucocitos clave de las muestras de sangre pueden ofrecer una mayor precisión y personalización del diagnóstico clínico, pronóstico y respuesta al tratamiento. Por ejemplo, el mareaje de >30 moléculas diana intracelulares y de la superficie celular puede evaluar el estado de la vía de señalización de múltiples tipos de leucocitos normales frente a células leucémicas simultáneamente, mediante citometría de flujo multiparamétrica o espectrometría de masas atómica (1). Las células madre o las células infectadas se pueden analizar de manera similar. Las células se pueden analizar mediante secuenciación de última generación. Sin embargo, los procedimientos actuales para procesar leucocitos sanguíneos pueden ser caros, laboriosos, repetitivos y dependientes de operarios humanos; y pueden tener un bajo rendimiento celular y pueden requerir una considerable habilidad humana.Tests to quantify the number and functional states of key leukocyte types in blood samples can provide greater precision and customization of clinical diagnosis, prognosis, and response to testing. treatment. For example, the labeling of> 30 intracellular and cell surface target molecules can assess the status of the signaling pathway of multiple types of normal leukocytes versus leukemic cells simultaneously, using multiparametric flow cytometry or atomic mass spectrometry (1) . Stem cells or infected cells can be analyzed in a similar way. Cells can be analyzed using state-of-the-art sequencing. However, current procedures for processing blood leukocytes can be expensive, time consuming, repetitive, and dependent on human operators; and they may have low cellular yield and may require considerable human skill.

Convencionalmente, el marcaje combinado de la membrana de la superficie e intracelular de leucocitos sanguíneos puede requerir la lisis de eritrocitos para recoger la población de leucocitos (Lisis); incubación con anticuerpos monoclonales (Mab) fluorescentes contra el linaje/estadio de leucocitos o señalizadores de cáncer en la superficie celular (Marcaje en la superficie); realización de una etapa de fijación/permeabilización (Fijación/permeabilización); e incubación con reactivos (por ejemplo, Mab con etiqueta, ácidos nucleicos, colorantes) que se pueden unir a moléculas intracelulares (citoplasmáticas y nucleares) (Marcaje intracelular). Después de cada una de estas 4 etapas, se pueden requerir una o más etapas de lavado/concentración, que actualmente implican centrifugación y resuspensión del sedimento celular. El rendimiento de leucocitos puede ser ~80-90 % en cada etapa de lavado/concentración, por lo que el rendimiento general puede ser <50 % después de múltiples lavados.Conventionally, the combined surface and intracellular membrane labeling of blood leukocytes may require erythrocyte lysis to collect the leukocyte population (Lysis); incubation with fluorescent monoclonal antibodies (Mabs) against the cell surface leukocyte lineage / stage or cancer signaling agents (Surface Labeling); performing a fixation / permeabilization step (Fixation / permeabilization); and incubation with reagents (eg, tagged Mabs, nucleic acids, dyes) that can bind to intracellular molecules (cytoplasmic and nuclear) (Intracellular labeling). After each of these 4 steps, one or more wash / concentration steps may be required, currently involving centrifugation and resuspension of the cell pellet. The leukocyte yield can be ~ 80-90% in each wash / concentration step, so the overall yield can be <50% after multiple washes.

En el presente documento se describen métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits que utilizan la tecnología microfluídica de desplazamiento lateral determinista (DLD) (2) para reemplazar cada una de las etapas de lavado/concentración. En algunos casos, se combina en una sola etapa una recolección de leucocitos y una etapa de lavado/concentración, evitando así la lisis y simplificando aún más el flujo de trabajo. Por tanto, un proceso de múltiples etapas, intensivo en mano de obra, que requiere hasta medio día puede reemplazarse por procesos de bajo coste y alto rendimiento que requieren < 1 hora y pueden tener menos o mínimas etapas dependientes de operarios. En algunos casos, las múltiples etapas secuenciales se pueden realizar para recoger, marcar y lavar/concentrar leucocitos en un enfoque de "lavado de coches" en un solo microchip, introduciendo sangre completa y extrayendo células marcadas para aplicaciones posteriores (por ejemplo, citometría de flujo o análisis de espectrometría de masas). Methods, compositions, devices, systems and / or kits that utilize deterministic lateral shift (DLD) microfluidic technology (2) to replace each of the wash / concentration steps are described herein. In some cases, a leukocyte harvesting and a washing / concentrating step are combined into a single step, thus avoiding lysis and further simplifying workflow. Thus, a labor-intensive, multi-stage process that requires up to half a day can be replaced by low-cost, high-throughput processes that require <1 hour and may have fewer or minimal operator-dependent stages. In some cases, multiple sequential steps can be performed to collect, label, and wash / concentrate leukocytes in a "car wash" approach on a single microchip, introducing whole blood and extracting labeled cells for subsequent applications (e.g., cell cytometry). flow or mass spectrometric analysis).

La separación por desplazamiento lateral determinista (DLD) descrita en el presente documento puede superar los procedimientos de centrifugación convencionales. En el presente documento se proporcionan dispositivos microfluídicos, composiciones, sistemas, kits y métodos para lavar y concentrar leucocitos rápidamente, a bajo coste, con mayor rendimiento celular y con mejor reproducibilidad. Los sistemas microfluídicos DLD pueden diseñarse y fabricarse para retirar y concentrar leucocitos o células leucémicas con proteínas espiga a partir de una corriente que contiene Mab utilizados para las etapas de marcaje o de la solución utilizada para una etapa de fijación/permeabilización. Se pueden procesar volúmenes de 0,1-1 ml en <5-10 minutos (por ejemplo, mediante un proceso automatizado). En algunos casos, se consigue un rendimiento >90 % y 90 % de viabilidad de leucocitos y la retirada de >99 % de reactivos fluorescentes no unidos o de fijación/permeabilización sin sesgo de las subpoblaciones. The deterministic lateral shift separation (DLD) described herein can outperform conventional centrifugation procedures. Provided herein are microfluidic devices, compositions, systems, kits and methods for washing and concentrating leukocytes rapidly, at low cost, with higher cell yield and with better reproducibility. DLD microfluidic systems can be designed and manufactured to remove and concentrate leukocytes or leukemic cells with spike proteins from a stream containing Mab used for the labeling steps or from the solution used for a fixation / permeabilization step. Volumes of 0.1-1 ml can be processed in <5-10 minutes (eg by automated process). In some cases,> 90% yield and 90% viability of leukocytes and removal of> 99% of unbound fluorescent or fixing / permeabilization reagents are achieved without biasing the subpopulations.

En algunos casos, la etapa de lisis de eritrocitos y la etapa de lavado/concentración con centrifugación posterior se reemplazan por una etapa de DLD microfluídico. En algunos casos, la etapa de DLD microfluídico es una sola etapa de DLD microfluídico.In some cases, the erythrocyte lysis step and the wash / concentration step with subsequent centrifugation are replaced by a microfluidic DLD step. In some cases, the microfluidic DLD stage is a single microfluidic DLD stage.

Como se describe en el presente documento, los leucocitos se pueden marcar en sangre completa (muestras sanas y de leucemia), y luego un proceso microfluídico DLD puede aislar, purificar y/o concentrar los leucocitos marcados con Mab de la mezcla de sangre y exceso de Mab libre. En algunos casos, se consigue >99 % de reducción de eritrocitos.As described herein, leukocytes can be labeled in whole blood (healthy and leukemia samples), and then a DLD microfluidic process can isolate, purify, and / or concentrate the Mab-labeled leukocytes from the mixture of blood and excess. of free Mab. In some cases,> 99% reduction in red blood cells is achieved.

Los dispositivos, métodos, composiciones y/o kits pueden preparar leucocitos (incluidas células leucémicas en sangre) para una citometría de flujo. En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento son un reemplazo general para la centrifugación en procedimientos preparativos para diversas pruebas a realizar en muestras. Las diversas pruebas pueden ser cualquier prueba o aplicación posterior como se describe en el presente documento. Las muestras pueden ser cualquier muestra como se proporciona en el presente documento (por ejemplo, en leucocitos sanguíneos).Devices, methods, compositions and / or kits can prepare leukocytes (including leukemic cells in blood) for flow cytometry. In some cases, the devices, methods, compositions, systems, and / or kits provided herein are a general replacement for centrifugation in preparatory procedures for various tests to be performed on samples. The various tests can be any subsequent test or application as described herein. The samples can be any sample as provided herein (eg, on blood leukocytes).

II. PartículasII. Particles

En algunos casos, una partícula que puede procesare o tratarse química y/o enzimáticamente, purificarse, aislarse y/o concentrarse utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento puede ser una célula, fragmento celular o ácido nucleico. En algunos casos, la partícula no es una célula, fragmento celular o ácido nucleico, por ejemplo, la partícula es una perla.In some cases, a particle that can be chemically and / or enzymatically processed or treated, purified, isolated, and / or concentrated using methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be a cell, cell fragment, or acid. nucleic. In some cases, the particle is not a cell, cell fragment or nucleic acid, for example, the particle is a bead.

A. Componentes sanguíneosA. Blood components

En algunos casos, la partícula es un componente sanguíneo. En algunos casos, Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), purificar o separar componentes sanguíneos, por ejemplo, para bancos de sangre. En algunos casos, el componente sanguíneo comprende una plaqueta, glóbulo rojo (eritrocito), glóbulo blanco (por ejemplo, granulocitos, por ejemplo, neutrófilos, basófilos o eosinófilos, o agranulocitos, por ejemplo, linfocitos, monocitos o macrófagos). En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para la reducción de leucocitos de glóbulos rojos o plaquetas (por ejemplo, para reemplazar filtros de leucocitos en el procesamiento de productos sanguíneos para transfusión en pacientes). En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para el aislamiento de leucocitos o plaquetas en línea (por ejemplo, para reemplazar la aféresis centrífuga). En algunos casos, Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para reducir los eritrocitos de una muestra de sangre, por ejemplo, una muestra de sangre del cordón umbilical.In some cases, the particle is a blood component. In some instances, the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to process (for example, chemically and / or enzymatically process or treat), purify, or separate blood components, for example, to banks of blood. In some cases, the blood component comprises a platelet, red blood cell (erythrocyte), white blood cell (eg, granulocytes, eg, neutrophils, basophils, or eosinophils, or agranulocytes, eg, lymphocytes, monocytes, or macrophages). In some cases, the methods described herein can be used for the reduction of leukocytes from red blood cells or platelets (eg, to replace leukocyte filters in the processing of blood products for transfusion in patients). In some cases, the methods described herein can be used for on-line leukocyte or platelet isolation (eg, to replace centrifugal apheresis). In some instances, the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to deplete erythrocytes from a blood sample, eg, an umbilical cord blood sample.

En algunos casos, la célula es una célula dendrítica. En algunos casos, la célula es cualquier célula del sistema inmunológico innato o adaptativo.In some cases, the cell is a dendritic cell. In some cases, the cell is any cell of the innate or adaptive immune system.

B. Leucocitos (glóbulos blancos)B. Leukocytes (white blood cells)

En algunos casos, una célula procesada (por ejemplo, procesada o tratada química y/o enzimáticamente), purificada, aislada y/o concentrada utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento es un leucocito (glóbulo blanco). Un leucocito puede ser, por ejemplo, un neutrófilo, eosinófilo, basófilo, linfocito o monocito. Un leucocito puede ser, por ejemplo, un granulocito o agranulocito. En algunos casos, un granulocito es un neutrófilo, basófilo o eosinófilo. En algunos casos, un agranulocito es un linfocito, monocito o macrófago. Un linfocito puede ser, por ejemplo, una célula B o una célula T. Una célula T puede ser, por ejemplo, una célula auxiliar T CD4+ (por ejemplo, T^h1, T^h2, T^h3, T^h17, T^h9 o T^fh), una célula T citotóxica CD8+, una célula T y§, una célula T reguladora (supresora), una célula T asesina natural (NKT), una célula T específica de antígeno, por ejemplo, célula T de memoria, por ejemplo, células T de memoria central, células T^emo células T^emra. En algunos casos, un linfocito es una célula asesina natural (NK). Una célula B puede ser una célula B plasmática, una célula B de memoria, una célula B-1, una célula B-2, una célula B de la zona marginal, una célula B folicular o una célula B reguladora. En algunos casos, la célula es un macrófago regulador. En algunos casos, la célula es una célula dendrítica plasmocitoide (pDC). En algunos casos, la célula son células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). En algunos casos, la célula es un megacarocito.In some cases, a cell processed (e.g., chemically and / or enzymatically processed or treated), purified, isolated, and / or concentrated using methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein is a leukocyte (blood cell White). A leukocyte can be, for example, a neutrophil, eosinophil, basophil, lymphocyte, or monocyte. A leukocyte can be, for example, a granulocyte or agranulocyte. In some cases, a granulocyte is a neutrophil, basophil, or eosinophil. In some cases, an agranulocyte is a lymphocyte, monocyte, or macrophage. A lymphocyte can be, for example, a B cell or a T cell. A T cell can be, for example, a CD4 + T helper cell (for example, T ^h 1, T ^h 2, T ^h 3, T ^h 17, T ^h 9 or T ^fh ), a CD8 + cytotoxic T cell, a y§ T cell, a regulatory (suppressor) T cell, a natural killer (NKT) T cell, an antigen-specific T cell, e.g., memory, eg central memory T cells, ^em T cells or ^emra T cells. In some cases, a lymphocyte is a natural killer (NK) cell. A B cell can be a plasma B cell, a memory B cell, a B-1 cell, a B-2 cell, a marginal zone B cell, a follicular B cell, or a regulatory B cell. In some cases, the cell is a regulatory macrophage. In some cases, the cell is a plasmacytoid dendritic cell (pDC). In some cases, the cell is myeloid-derived suppressor cells (MDSC). In some cases, the cell is a megacarocyte.

En algunos casos, un leucocito (glóbulo blanco) puede identificarse mediante uno o más señalizadores de la superficie celular. En algunos casos, un leucocito (glóbulo blanco) se puede identificar mediante el uso de agentes de unión (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, sondas, etc., como se proporciona en el presente documento) a uno o más señalizadores de la superficie celular (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un señalizador asociado con el agente de unión). El señalizador de la superficie celular en un leucocito (humano o de ratón) puede ser una proteína transmembrana. La proteína transmembrana puede ser una glicoproteína. En algunos casos, una glicoproteína transmembrana utilizada para identificar un leucocito (por ejemplo, humano o de ratón) es un grupo de glicoproteínas transmembrana de diferenciación (CD). El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.) La proteína CD puede ser CD1a, 1b, 1c, Id, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 11a, 11b, 11c, 13, 14, 15, 16/32, 19, 20, 21/35 (CR2/CR1), 22, 23, 25, 26, 31, 33, 38, 39, 40, 44, 45RB, 45RA, 45R/B220, 49b (células pan-NK), 49d, 52, 53, 54, 57, 62L, 63, 64, 66b, 68, 69, 70, 73, 79a (Iga), 79b (IgP), 80, 83, 85 g/ILT7, 86, 88, 93, 94, 103, 105 (Endoglina), 107a, 107 (Mac3), 114, 115, 117, 119, 122, 123, 124, 127, 129, 134, 137(4-1BB), 138 (Syndecan-1), 158 (Kir), 161, 163, 183, 184 (CXCR4), 191, 193 (CCR3), 194 (CCR4), 195, 195 (CCR5), 197, 197 (CCR7), w198 (CCR8), 203c, 205/Dec-205, 207 (Langerina), 209DC-SIGN), 223, 244 (2B4), 252 (OX40L), 267, 268 (BAFF-R), 273 (B7-DC, PD-L2), 278 (ICOS), 279/PD-1, 282 (TLR2), 289 (TLR9), 284 (TLR4), 294, 303, 304, 305, 314 (NKG2D), 319 (CRACC), 328 (Siglec-7) o 335 (NKp46). Un señalizador de la superficie celular de leucocitos (glóbulos blancos) puede ser, por ejemplo, IgM de superficie, IgD, Marcador de DC (33D1), F4/80, CMKLR-1, HLA-DR, Siglex H, MHC de clase II, LAP (TGF-b), GITR, GARP, FR4, CTLA-4, TRANCE, TNI-p, TNF-a, Tim-3, LT-pR, IL-18R, CCR1, TGF-p, IL-1R, CCR6, CCR4, CRTH2, IFN-yR, Tim-1, Va24-Ja18 TCR (iNKT), Ly108, Ly49, CD56 (NCAM), TCR-a/p, TCR-y/5, CXCR1, CXCR2, GR-1, JAML, TLR2, CCR2, Ly-6C, Ly-6G, F4/80, VEGFR1, C3AR, FcsRIa, Galectina-9, MRP-14, Siglec-8, Siglec-10. TLR4, IgE, GITRL, HLA-DR, ILT-3, Mac-2 (Galectina-3). CMKLR-1 o señalizador de DC (33D1).In some cases, a leukocyte (white blood cell) can be identified by one or more cell surface markers. In some cases, a leukocyte (white blood cell) can be identified through the use of binding agents (eg, antibodies, antibody fragments, probes, etc., as provided herein) to one or more signallers of the cell. cell surface (eg, detecting the presence and / or absence of a marker associated with the binding agent). The cell surface marker in a leukocyte (human or mouse) can be a transmembrane protein. The transmembrane protein can be a glycoprotein. In some cases, a transmembrane glycoprotein used to identify a leukocyte (eg, human or mouse) is a group of differentiation transmembrane glycoproteins (DCs). The binding agent may comprise a marker as provided herein. The marker as provided herein may be detectable (eg, fluorescence, etc.) The CD protein may be CD1a, 1b, 1c, Id, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 11a, 11b, 11c, 13, 14, 15, 16/32, 19, 20, 21/35 (CR2 / CR1), 22, 23, 25, 26, 31, 33, 38, 39, 40, 44, 45RB, 45RA, 45R / B220, 49b (pan-NK cells), 49d, 52, 53, 54, 57, 62L, 63, 64, 66b, 68, 69, 70, 73, 79a (Iga), 79b (IgP), 80, 83 , 85 g / ILT7, 86, 88, 93, 94, 103, 105 (Endoglin), 107a, 107 (Mac3), 114, 115, 117, 119, 122, 123, 124, 127, 129, 134, 137 ( 4-1BB), 138 (Syndecan-1), 158 (Kir), 161, 163, 183, 184 (CXCR4), 191, 193 (CCR3), 194 (CCR4), 195, 195 (CCR5), 197, 197 (CCR7), w198 (CCR8), 203c, 205 / Dec-205, 207 (Langerina), 209DC-SIGN), 223, 244 (2B4), 252 (OX40L), 267, 268 (BAFF-R), 273 ( B7-DC, PD-L2), 278 (ICOS), 279 / PD-1, 282 (TLR2), 289 (TLR9), 284 (TLR4), 294, 303, 304, 305, 314 (NKG2D), 319 ( CRACC), 328 (Siglec-7) or 335 (NKp46). A leukocyte (white blood cell) cell surface marker can be, for example, surface IgM, IgD, DC marker (33D1), F4 / 80, CMKLR-1, HLA-DR, Siglex H, MHC class II , LAP (TGF-b), GITR, GARP, FR4, CTLA-4, TRANCE, TNI-p, TNF-a, Tim-3, LT-pR, IL-18R, CCR1, TGF-p, IL-1R, CCR6, CCR4, CRTH2, IFN-yR, Tim-1, Va24-Ja18 TCR (iNKT), Ly108, Ly49, CD56 (NCAM), TCR-a / p, TCR-y / 5, CXCR1, CXCR2, GR-1 , JAML, TLR2, CCR2, Ly-6C, Ly-6G, F4 / 80, VEGFR1, C3AR, FcsRIa, Galectin-9, MRP-14, Siglec-8, Siglec-10. TLR4, IgE, GITRL, HLA-DR, ILT-3, Mac-2 (Galectin-3). CMKLR-1 or DC flag (33D1).

En algunos casos, un leucocito (glóbulo blanco) puede identificarse mediante uno o más señalizadores intracelulares. Un señalizador intracelular de leucocitos (glóbulos blancos) puede ser, por ejemplo, Pax-5, Helios, FoxP3, GM-CSF, IL-2, IFN-y, T-bet, IL-21, IL-17A, IL-17F, IL-22, RORYt, RORa, STAT3, IL-10, IL-13, IL-5, IL-4, IL-6, GATA3, c-Maf, Granzima B, Perforina o granulisina.In some cases, a leukocyte (white blood cell) can be identified by one or more intracellular markers. An intracellular leukocyte (white blood cell) marker can be, for example, Pax-5, Helios, FoxP3, GM-CSF, IL-2, IFN-y, T-bet, IL-21, IL-17A, IL-17F , IL-22, RORYt, RORa, STAT3, IL-10, IL-13, IL-5, IL-4, IL-6, GATA3, c-Maf, Granzyme B, Perforin or granulysin.

En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para diferenciar entre células B y T maduras e inmaduras. Tal como se proporciona en el presente documento, la diferenciación o identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas por un señalizador como se proporciona en el presente documento puede determinarse mediante el uso de un agente de unión específico para o dirigido a o contra el señalizador (por ejemplo, de la superficie celular y/o intracelular). El agente de unión puede ser cualquier agente de unión conocido en la técnica (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, sonda (por ejemplo, sonda de ácido nucleico), etc.). El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La diferenciación entre células T maduras e inmaduras se puede realizar identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de señalizadores CD3, 4, 8, 25, 44, l l7 , 127 y TCR-a/p, Tc R-y/5 (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). La diferenciación entre células Treg maduras e inmaduras se puede realizar identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de señalizadores CD3, 4, 8, 25, 40, 44, 45RA, 45RB, 62L, 117, 127, 134 (OX40), 137 (4-1BB), 197, 199 (CCR9), 223 (LAG-3), Integrina a4, Integrina p7, 304 (Neuropilina), 357(GITR), CTLA-4, Foxp3, GARP, IL-10, IL-15Ra, LAP (TGFp) y TCR-a/p. La diferenciación entre células B de ratón maduras e inmaduras se puede realizar identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de señalizadores CD2, 11b, 16/32.19, 21/35, 23, 22, 24 (HAS), 43, 45R (B220), 93 (AA4.1), 117, 127, BP-1, C|j, S|j, A,5, IgD, IgM. La diferenciación entre células B humanas maduras e inmaduras se puede realizar identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de señalizadores CD9, 19, 20, 23, 24 (HSA), 27, 28, 31, 34, 38, 4o, 45R (B220), 95 (FAS), 150 (SLAM), 184 (CXCR4), IgD, IgM, IgA, IgG. La diferenciación entre células dendríticas humanas o de ratón maduras e inmaduras se puede realizar identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de señalizadores CD3, 11b, 11c, 14, 16, 19, 34 (49b), 68, 80, 86, 107b (Mac-3), 115, 117, 123, 127, 135, 303 (BDCA-2), CXCR1, F4/80, Ly6C, Ly6G, Gr-1, MHC II, NKp46, Sca-1, Ter119, iNOS, TNFa. La diferenciación entre monocitos/macrófagos humanos o de ratón maduros e inmaduros se puede realizar identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de señalizadores CD3, 11b, 11c, 13, 14, 16, 19, 33, 34, 43, 45, 62L, 68, 115, 117, 123, 127, 135, 163, 204, 206, CCR2, CCR5, CX3CR1, F4/80, LysA/E, Tie-2, Lys6B.2, Ly6C, Ly6G, Gr-1, MHC II, NKp46, Sca-1, Ter119 o VEGFR1. La diferenciación entre subclases de macrófagos de ratón y humanos maduros e inmaduros se puede realizar por la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de varias proteínas, entre las que se incluyen CD14, CD11b, 16, 32, 51/61. 64, 68, 86, 121a, 121b, 124, 150, 163, 181, 182, 206, 210, 215, CCL 1, 2, 3, 4, 5, 8, 15, 16, 18, 20, 24, CCR2, CCR7, CXCL, 8, 9, 10, 11, 13, 16, IFNy, IL-1RA, IL-1p, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-23, iNOS, Ly6C, MHC II (humano y de ratón), TNF-a, Dectina-1, FcsR1a, Lectinas, RAGE, receptor depurador, arginasa o señalizadores LAP (TGFp).In some cases, the devices, methods, compositions, systems, and / or kits provided herein can be used to differentiate between mature and immature B and T cells. As provided herein, the differentiation or identification of the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or a combination thereof by a flag as provided herein can be determined by using a specific binding agent for or directed at or against the marker (eg, cell surface and / or intracellular). The binding agent can be any binding agent known in the art (eg, antibody, antibody fragment, probe (eg, nucleic acid probe), etc.). The binding agent may comprise a marker as provided herein. The label as provided herein may be detectable (eg, fluorescence, etc.). Differentiation between mature and immature T cells can be performed by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative), and / or a combination thereof of CD3, 4, 8, 25, 44, l7 markers. , 127 and TCR-a / p, Tc Ry / 5 (eg, detecting the presence and / or absence of a marker associated with a binding agent). Differentiation between mature and immature Treg cells can be performed by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or a combination thereof of CD3, 4, 8, 25, 40, 44, marker. 45RA, 45RB, 62L, 117, 127, 134 (OX40), 137 (4-1BB), 197, 199 (CCR9), 223 (LAG-3), Integrin a4, Integrin p7, 304 (Neuropilin), 357 (GITR ), CTLA-4, Foxp3, GARP, IL-10, IL-15Ra, LAP (TGFp) and TCR-a / p. Differentiation between mature and immature mouse B cells can be accomplished by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or a combination thereof of CD2, 11b, 16/32/19, 21 / 35, 23, 22, 24 (HAS), 43, 45R (B220), 93 (AA4.1), 117, 127, BP-1, C | j, S | j, A, 5, IgD, IgM. Differentiation between mature and immature human B cells can be accomplished by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or a combination thereof of CD9, 19, 20, 23, 24 (HSA ), 27, 28, 31, 34, 38, 4th, 45R (B220), 95 (FAS), 150 (SLAM), 184 (CXCR4), IgD, IgM, IgA, IgG. Differentiation between mature and immature human or mouse dendritic cells can be performed by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or a combination thereof of CD3, 11b, 11c, 14 markers. 16, 19, 34 (49b), 68, 80, 86, 107b (Mac-3), 115, 117, 123, 127, 135, 303 (BDCA-2), CXCR1, F4 / 80, Ly6C, Ly6G, Gr -1, MHC II, NKp46, Sca-1, Ter119, iNOS, TNFa. Differentiation between mature and immature human or mouse monocytes / macrophages can be performed by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative), and / or a combination thereof of CD3, 11b, 11c, 13 markers. , 14, 16, 19, 33, 34, 43, 45, 62L, 68, 115, 117, 123, 127, 135, 163, 204, 206, CCR2, CCR5, CX3CR1, F4 / 80, LysA / E, Tie -2, Lys6B.2, Ly6C, Ly6G, Gr-1, MHC II, NKp46, Sca-1, Ter119 or VEGFR1. Differentiation between mature and immature human and mouse macrophage subclasses can be made by the presence (eg, positive), absence (eg, negative), and / or a combination thereof of various proteins, including CD14, CD11b, 16, 32, 51/61. 64, 68, 86, 121a, 121b, 124, 150, 163, 181, 182, 206, 210, 215, CCL 1, 2, 3, 4, 5, 8, 15, 16, 18, 20, 24, CCR2 , CCR7, CXCL, 8, 9, 10, 11, 13, 16, IFNy, IL-1RA, IL-1p, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-23, iNOS, Ly6C , MHC II (human and mouse), TNF-a, Dectin-1, FcsR1a, Lectins, RAGE, scavenger receptor, arginase, or LAP signallers (TGFp).

En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para diferenciar entre o identificar subconjuntos de leucocitos (glóbulos blancos). La diferenciación o identificación de subconjuntos de leucocitos (glóbulos blancos) puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, leucocitos) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más de los señalizadores (por ejemplo, señalizadores de la superficie celular o intracelulares). El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.) Los subconjuntos de leucocitos (glóbulos blancos) se pueden diferenciar de otros leucocitos identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de señalizadores intracelulares específicos de tipo leucocitario (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). Los subconjuntos de leucocitos (glóbulos blancos) se pueden diferenciar de otros leucocitos identificando la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de señalizadores específicos de tipo leucocitario. Por ejemplo, las células Th2 pueden identificarse por el factor de transcripción GATA3 y las citocinas: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y IL-13. Las células Th17 pueden identificarse por RORYt intracelular y STAT3 y la producción de citocinas: IL-17A, IL-17F, IL-21 e IL-22. Las células Th1 pueden identificarse por el factor de transcripción T-bet y las citocinas: IL-2, IFN-y y TNF. Un megacariocito puede identificarse por GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, quimiocinas (SDF-1; FGF-4) y eritropoyetina. NK puede identificarse por la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o una combinación de las mismas de los señalizadores de la superficie celular CD16 (FcyRIII) y CD56 en humanos, NK1.1 o NK1.2 en ratones C57BL/6, si bien no expresan receptores de antígenos de células T (TCR) o el señalizador Pan T CD3 o receptores de células B de inmunoglobulinas (Ig), que se encuentran en las células T y B. Hasta el 80% de las células NK humanas pueden expresar CD8. Son distintas de las células T asesinas naturales, que pueden expresar CD3. En seres humanos, Las pDC expresan los señalizadores de superficie CD123, BDCA-2 (c D303) y BDCA-4 (CD304), pero no expresan CD11c o CD14, que las distingue de las células dendríticas convencionales o monocitos, respectivamente. Las pDC de ratón expresan CD11c, B220, BST-2 (mPDCA) y Siglec-H y son negativas para CD11b. Las células T reguladoras pueden caracterizarse o identificarse por la presencia (por ejemplo, positivas), ausencia (por ejemplo, negativas) y/o una combinación de las mismas de CD4, CD25 y Foxp3, mientras que carecen de CD127. Se ha hecho referencia a las células T reguladoras CD4+Foxp3+ como células T reguladoras "de origen natural" para distinguirlas de las poblaciones de células T "supresoras" que se generan in vitro. Si bien existen otras variantes de células T supresoras, tales como las células supresoras CD8, células Th3 y Tr-1, las T reg se definen clásicamente como células CD4+CD25+ FOXP3+. Los macrófagos pueden identificarse mediante la expresión específica de varias proteínas entre las que se incluyen CD14, CD11b, F4/80 (ratones)/EMR1 (humano), MAC-1/MAC-3 y CD68. Las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) son una población heterogénea de células que tienen una potente función supresora de células T, caracterizadas por un estado activado con mayor producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, y arginasa 1. En ratones, las MDSC pueden identificarse por CD11b+GR1+, mientras que en los seres humanos, las MDSC pueden identificarse por LIN-HLA-DR-CD33+ o CD11b+CD14-CD33+. Las células Th17 se pueden identificar utilizando señalizadores de la superficie celular para CD4, CD161 y CCR6. In some cases, the devices, methods, compositions, systems, and / or kits provided herein can be used to differentiate between or identify subsets of leukocytes (white blood cells). Differentiation or identification of subsets of leukocytes (white blood cells) can be accomplished by treating a sample comprising particles (eg, leukocytes) with one or more binding agents as described herein specific for or directed at or against one. or more of the markers (eg, cell surface or intracellular markers). The binding agent may comprise a marker as provided herein. The marker as provided herein may be detectable (eg, fluorescence, etc.). Subsets of leukocytes (white blood cells) can be differentiated from other leukocytes by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or combinations of leukocyte-type specific intracellular markers (eg, detecting the presence and / or absence of a marker associated with a binding agent). Leukocyte subsets (white blood cells) can be differentiated from other leukocytes by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or combinations of leukocyte-type specific markers. For example, Th2 cells can be identified by the transcription factor GATA3 and the cytokines: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, and IL-13. Th17 cells can be identified by intracellular RORYt and STAT3 and the production of cytokines: IL-17A, IL-17F, IL-21 and IL-22. Th1 cells can be identified by the transcription factor T-bet and the cytokines: IL-2, IFN-y, and TNF. A megakaryocyte can be identified by GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, chemokines (SDF-1; FGF-4), and erythropoietin. NK can be identified by the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or a combination thereof of the human cell surface markers CD16 (FcyRIII) and CD56, NK1.1 or NK1. 2 in C57BL / 6 mice, although they do not express T-cell antigen receptors (TCRs) or the Pan T CD3 marker or immunoglobulin (Ig) B-cell receptors, which are found on T and B cells. Up to 80 % of human NK cells can express CD8. They are different from natural killer T cells, which can express CD3. In humans, pDCs express the surface markers CD123, BDCA-2 (c D303) and BDCA-4 (CD304), but do not express CD11c or CD14, which distinguishes them from conventional dendritic cells or monocytes, respectively. Mouse pDCs express CD11c, B220, BST-2 (mPDCA) and Siglec-H and are negative for CD11b. Regulatory T cells can be characterized or identified by the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or a combination thereof of CD4, CD25, and Foxp3, while lacking CD127. CD4 + Foxp3 + regulatory T cells have been referred to as "naturally occurring" regulatory T cells to distinguish them from "suppressor" T cell populations that are generated in vitro. While there are other variants of suppressor T cells, such as CD8 suppressor cells, Th3 and Tr-1 cells, T regs are classically defined as CD4 + CD25 + FOXP3 + cells. Macrophages can be identified by the specific expression of several proteins including CD14, CD11b, F4 / 80 (mice) / EMR1 (human), MAC-1 / MAC-3, and CD68. Myeloid-derived suppressor cells (MDSC) are a heterogeneous population of cells that have a potent T-cell suppressor function, characterized by an activated state with increased production of reactive oxygen and nitrogen species, and arginase 1. In mice, MDSCs can be identified by CD11b + GR1 +, whereas in humans, MDSCs can be identified by LIN-HLA-DR-CD33 + or CD11b + CD14-CD33 +. Th17 cells can be identified using cell surface markers for CD4, CD161, and CCR6.

C. Células madreC. Stem cells

En algunos casos, una célula procesada (por ejemplo, procesada o tratada química o enzimáticamente), purificada, aislada y/o concentrada utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento es una célula madre. En algunos casos, la célula madre es una célula madre adulta (célula madre somática). En algunos casos, una célula madre adulta es una célula madre hematopoyética (HSC) o una célula progenitora hematopoyética (HPC). En algunos casos, la HSC proviene de la médula ósea (por ejemplo, médula ósea de la pelvis, fémur o esternón). En algunos casos, la HSC está en una muestra de sangre de cordón, por ejemplo, sangre de cordón umbilical. En algunos casos, la HSC proviene de la placenta. En algunos casos, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) se administra a un sujeto; el G-CSF puede inducir a las HSC a salir de la médula ósea y circular en los vasos sanguíneos. En algunos casos, la HSC está en sangre periférica (por ejemplo, sangre periférica de adulto movilizada con G-CSF). En algunos casos, la célula madre es una célula madre a largo plazo o una célula progenitora a corto plazo. En algunos casos, las células madre se utilizan para expansión ex vivo y los productos de la expansión ex vivo se purifican usando métodos y dispositivos descritos en el presente documento. En algunos casos, la célula madre deriva del tejido adiposo (células madre derivadas de tejido adiposo (ASC)). En algunos casos, las células madre derivan de un producto de digestión por colengasa del tejido adiposo.In some cases, a cell processed (eg, chemically or enzymatically processed or treated), purified, isolated, and / or concentrated using methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein is a stem cell. In some cases, the stem cell is an adult stem cell (somatic stem cell). In some cases, an adult stem cell is a hematopoietic stem cell (HSC) or a hematopoietic progenitor cell (HPC). In some cases, HSC comes from the bone marrow (for example, bone marrow from the pelvis, femur, or breastbone). In some cases, the HSC is in a sample of cord blood, for example, umbilical cord blood. In some cases, HSC comes from the placenta. In some cases, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is administered to a subject; G-CSF can induce HSCs to leave the bone marrow and circulate in the blood vessels. In some cases, HSC is in peripheral blood (eg, adult peripheral blood mobilized with G-CSF). In some cases, the stem cell is a long-term stem cell or a short-term progenitor cell. In some cases, stem cells are used for ex vivo expansion and the products of ex vivo expansion are purified using methods and devices described herein. In some cases, the stem cell is derived from adipose tissue (adipose-derived stem cells (ASC)). In some cases, stem cells are derived from a cholengase digestion product of adipose tissue.

En algunos casos, una HSC (por ejemplo, HSC indiferenciada) puede identificarse mediante uno o más señalizadores de la superficie celular. En algunos casos, la caracterización o identificación de una HSC (por ejemplo, HSC indiferenciada) comprende identificar la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de uno o más señalizadores de la superficie celular. La identificación puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, HSC) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más de los señalizadores (por ejemplo, de la superficie celular). El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La identificación puede realizarse mediante la identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de los señalizadores (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). El señalizador puede ser un señalizador de la superficie celular o intracelular. El agente de unión puede ser cualquier agente de unión conocido en la técnica (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, sonda (por ejemplo, sonda de ácido nucleico), etc.). Un señalizador de la superficie celular en una HSC puede ser un grupo de glicoproteínas transmembrana de diferenciación (CD). El CD puede ser CD 10, 31, 34, 38, 44, 45, 59, 84, 90, 93 (C1Rqp), 105 (Endoglina), 110, 111, 117 (c-Kit), 133, 135 (Flk-2), 150 (SLAM), 184 (CXCR4), 202b (Tie2/Tek), 243 9MDR-1), 271 (NGFR), 309 (VEGFR2), 338. Un señalizador de superficie celular en una HSC puede ser un señalizador de células madre hematopoyéticas, Receptor 2 de VEGF, CXCR4, Enzima convertidora de angiotensina 1, BCRP/ABCG2, Ly-6A/E (Sca-1). Un señalizador de la superficie de células HSC humanas puede ser, por ejemplo, CD34+, CD59+*, Thy1+, CD38bajo/', C-kit'/baj° o lin-. Un señalizador de la superficie celular de HSC de ratón puede ser, por ejemplo, CD34bajo/-, SCA-1+, Thy1+/baj° CD38+, C-kit+ o lin-. Un señalizador intracelular puede ser, por ejemplo, At F2, g AtA 1, GATA2, GFI1 o RUNX1/AML1.In some cases, an HSC (eg, undifferentiated HSC) can be identified by one or more cell surface markers. In some cases, characterizing or identifying an HSC (eg, undifferentiated HSC) comprises identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or combinations of one or more cell surface markers. Identification can be accomplished by treating a sample comprising particles (eg, HSC) with one or more binding agents as described herein specific to or directed to or against one or more of the markers (eg, de the cell surface). The binding agent may comprise a marker as provided herein. The label as provided herein may be detectable (eg, fluorescence, etc.). Identification can be accomplished by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or combinations of the markers (eg, detecting the presence and / or absence of a marker associated with an agent of Union). The flag can be a cell surface or intracellular flag. The binding agent can be any binding agent known in the art (eg, antibody, antibody fragment, probe (eg, nucleic acid probe), etc.). A cell surface marker in an HSC can be a group of differentiation transmembrane glycoproteins (CDs). The CD can be CD 10, 31, 34, 38, 44, 45, 59, 84, 90, 93 (C1Rqp), 105 (Endoglin), 110, 111, 117 (c-Kit), 133, 135 (Flk- 2), 150 (SLAM), 184 (CXCR4), 202b (Tie2 / Tek), 243 9MDR-1), 271 (NGFR), 309 (VEGFR2), 338. A cell surface marker in an HSC can be a marker Hematopoietic stem cells, VEGF Receptor 2, CXCR4, Angiotensin Converting Enzyme 1, BCRP / ABCG2, Ly-6A / E (Sca-1). A marker on the surface of human HSC cells can be, for example, CD34 +, CD59 + *, Thy1 +, CD38 low / ', C-kit' / low or lin-. A mouse HSC cell surface marker can be, for example, CD34low / -, SCA-1 +, Thy1 + / low ° CD38 +, C-kit + or lin-. An intracellular marker can be, for example, At F2, g AtA 1, GATA2, GFI1 or RUNX1 / AML1.

Una HSC puede dar lugar a células sanguíneas, por ejemplo, glóbulos rojos, linfocitos B, linfocitos T, células asesinas naturales, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos y macrófagos.An HSC can give rise to blood cells, eg, red blood cells, B lymphocytes, T lymphocytes, natural killer cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, and macrophages.

Una célula madre adulta (célula madre somática) puede ser una HSC, una célula madre mesenquimatosa, una célula madre neural, una célula madre epitelial o una célula madre de la piel. En algunos casos, la célula madre es una célula madre mesenquimatosa. Una célula madre mesenquimatosa puede dar lugar a, por ejemplo, células óseas (osteocitos), células de cartílago (condrocitos), células grasas (adipocitos) y otros tipos de células del tejido conectivo, tales como las de los tendones.An adult stem cell (somatic stem cell) can be a HSC, a mesenchymal stem cell, a neural stem cell, an epithelial stem cell, or a skin stem cell. In some cases, the stem cell is a mesenchymal stem cell. A mesenchymal stem cell can give rise to, for example, bone cells (osteocytes), cartilage cells (chondrocytes), fat cells (adipocytes), and other types of connective tissue cells, such as tendon cells.

En algunos casos, la célula madre es una célula madre neural. Se puede encontrar una célula madre neural en el cerebro. Una célula madre neural puede dar lugar a, por ejemplo, células nerviosas (neuronas) y dos categorías de células no neuronales, por ejemplo, astrocitos y oligodendrocitos. En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para identificar una célula madre neural. La identificación de una célula madre neural puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, célula madre neural) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más señalizadores (por ejemplo, señalizadores de la superficie celular o intracelulares) expresados por células madre neurales. El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La identificación puede realizarse mediante la identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de los señalizadores (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). Los señalizadores pueden ser señalizadores de la superficie celular, por ejemplo, CD 15, 24 o 184. Los señalizadores pueden ser señalizadores intracelulares, por ejemplo, Nestina, Pax6, Sox1 o Sox2.In some cases, the stem cell is a neural stem cell. A neural stem cell can be found in the brain. A neural stem cell can give rise to, for example, nerve cells (neurons) and two categories of non-neuronal cells, for example, astrocytes and oligodendrocytes. In some cases, the devices, methods, compositions, systems, and / or kits provided herein can be used to identify a neural stem cell. Identification of a neural stem cell can be accomplished by treating a sample comprising particles (eg, neural stem cell) with one or more binding agents as described herein specific for or directed at or against one or more markers. (eg, cell surface or intracellular signallers) expressed by neural stem cells. The binding agent may comprise a marker as provided herein. The label as provided herein may be detectable (eg, fluorescence, etc.). Identification can be accomplished by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or combinations of the markers (eg, detecting the presence and / or absence of a marker associated with an agent of Union). The markers can be cell surface markers, eg, CD 15, 24 or 184. The markers can be intracellular markers, eg, Nestin, Pax6, Sox1 or Sox2.

En algunos casos, la célula madre es una célula madre del epitelio intestinal. Una célula madre del epitelio intestinal puede revestir el tracto digestivo y puede aparecer en criptas profundas. Una célula madre del epitelio intestinal puede dar lugar a células absorbentes, células caliciformes, células de Paneth y/o células enteroendocrinas. En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para identificar una célula madre del epitelio intestinal. La identificación de una célula del epitelio intestinal puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, una célula madre del epitelio intestinal) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más señalizadores (por ejemplo, señalizadores de la superficie celular o intracelulares) expresados por una célula madre del epitelio intestinal. El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La identificación puede realizarse mediante la identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de los señalizadores (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). Los señalizadores pueden ser señalizadores intracelulares o de la superficie celular conocidos en la técnica. Los señalizadores pueden ser, por ejemplo, CD 44, ICAM-1/CD54, CD34, Lrig1, Lgr5, Bmi1, Tert o Hopx.In some cases, the stem cell is a stem cell of the intestinal epithelium. A stem cell from the intestinal epithelium can line the digestive tract and can appear in deep crypts. A stem cell of the intestinal epithelium can give rise to absorbent cells, goblet cells, Paneth cells and / or enteroendocrine cells. In some cases, the devices, methods, compositions, systems, and / or kits provided herein can be used to identify a stem cell from the intestinal epithelium. Identification of an intestinal epithelial cell can be accomplished by treating a sample comprising particles (eg, an intestinal epithelial stem cell) with one or more binding agents as described herein specific for or directed at or against. one or more markers (eg, cell surface or intracellular markers) expressed by a stem cell of the intestinal epithelium. The binding agent may comprise a marker as provided herein. The label as provided herein may be detectable (eg, fluorescence, etc.). Identification can be accomplished by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or combinations of the markers (eg, detecting the presence and / or absence of a marker associated with an agent of Union). The markers can be intracellular or cell surface markers known in the art. The flags can be, for example, CD 44, ICAM-1 / CD54, CD34, Lrig1, Lgr5, Bmi1, Tert or Hopx.

En algunos casos, la célula madre es una célula madre de la piel. Una célula madre de la piel puede aparecer en la capa basal de la epidermis y en la base de los folículos pilosos. Una célula madre epidérmica puede dar lugar a queratinocitos, que pueden migrar a la superficie de la piel y formar una capa protectora. Las células madre foliculares pueden dar lugar tanto al folículo piloso como a la epidermis. En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para identificar una célula madre de la piel. La identificación de una célula madre de la piel puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, célula madre de la piel) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más señalizadores (por ejemplo, señalizadores de la superficie celular o intracelulares) expresados por células madre de la piel. El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La identificación puede realizarse mediante la identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de los señalizadores (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). Los señalizadores pueden ser señalizadores intracelulares o de la superficie celular conocidos en la técnica. Los señalizadores pueden ser, por ejemplo, CD 34, K15, Nestina, Folistatina, p63, Integrina alfa 6, Tenascina C, EGFR, IGFR, Delta 1, Tb RiI o factores Frizzled.In some cases, the stem cell is a skin stem cell. A skin stem cell can appear in the basal layer of the epidermis and at the base of the hair follicles. An epidermal stem cell can give rise to keratinocytes, which can migrate to the surface of the skin and form a protective layer. Follicular stem cells can give rise to both the hair follicle and the epidermis. In some cases, the devices, methods, compositions, systems, and / or kits provided herein can be used to identify a skin stem cell. Identification of a skin stem cell can be accomplished by treating a sample comprising particles (eg, skin stem cell) with one or more binding agents as described herein specific for or directed at or against. one or more markers (eg, cell surface or intracellular markers) expressed by skin stem cells. The binding agent may comprise a marker as provided herein. The label as provided herein may be detectable (eg, fluorescence, etc.). Identification can be accomplished by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or combinations of the markers (eg, detecting the presence and / or absence of a marker associated with an agent of Union). The markers can be intracellular or cell surface markers known in the art. The markers can be, for example, CD 34, K15, Nestin, Follistatin, p63, Integrin alpha 6, Tenascin C, EGFR, IGFR, Delta 1, Tb RiI or Frizzled factors.

En algunos casos, la célula madre es una célula madre embrionaria (ES). Una célula madre embrionaria puede derivar de embriones que se desarrollan a partir de un óvulo que se ha fertilizado in vitro. En algunos casos, la célula madre embrionaria es una célula madre embrionaria humana. En algunos casos, la célula madre es una célula madre pluripotente inducida (iPSC). La iPSC puede ser una célula somática que se reprograma genéticamente a un estado similar al de una célula madre embrionaria. En algunos casos, la célula madre es una célula madre indiferenciada. En algunos casos, la célula madre es una célula madre cancerosa. En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para identificar una célula ES. La identificación de una célula ES puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, célula ES) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más señalizadores (por ejemplo, señalizadores de la superficie celular o intracelulares) expresados por células ES. El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La identificación puede realizarse mediante la identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de los señalizadores (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). Los señalizadores pueden ser señalizadores de la superficie celular, por ejemplo, CD 9, 15 (SSEA-1), 49f, 24, 29, 324, 338, SSEA-3, Ss Ea -4, SSEA-5, TRA-1-81, TRA-1-60, TRA-2-49 o TRA-2-54. Los señalizadores pueden ser un señalizador intracelular, por ejemplo, c-Myc, Nanog, FOXD3, OCT3/4. Stat-3 o Sox2.In some cases, the stem cell is an embryonic stem cell (ES). An embryonic stem cell can be derived from embryos that develop from an egg that has been fertilized in vitro. In some cases, the embryonic stem cell is a human embryonic stem cell. In some cases, the stem cell is an induced pluripotent stem cell (iPSC). IPSC can be a somatic cell that is genetically reprogrammed to a state similar to that of an embryonic stem cell. In some cases, the stem cell is an undifferentiated stem cell. In some cases, the stem cell is a cancer stem cell. In some cases, the devices, methods, compositions, systems, and / or kits provided herein can be used to identify an ES cell. Identification of an ES cell can be accomplished by treating a sample comprising particles (e.g., ES cell) with one or more binding agents as described herein specific for or directed to or against one or more flaggers (e.g. eg, cell surface or intracellular markers) expressed by ES cells. The binding agent may comprise a marker as provided herein. The label as provided herein may be detectable (eg, fluorescence, etc.). Identification can be accomplished by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or combinations of the markers (eg, detecting the presence and / or absence of a marker associated with an agent of Union). The markers can be cell surface markers, for example, CD 9, 15 (SSEA-1), 49f, 24, 29, 324, 338, SSEA-3, Ss Ea -4, SSEA-5, TRA-1- 81, TRA-1-60, TRA-2-49 or TRA-2-54. The markers can be an intracellular marker, eg, c-Myc, Nanog, FOXD3, OCT3 / 4. Stat-3 or Sox2.

En algunos casos, los dispositivos, método, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se pueden usar para identificar una célula madre mesenquimatosa. La identificación de una célula madre mesenquimatosa puede realizarse mediante el tratamiento de una muestra que comprende partículas (por ejemplo, célula madre mesenquimatosa) con uno o más agentes de unión como se describen en el presente documento específicos para o dirigidos a o contra uno o más señalizadores (por ejemplo, señalizadores de la superficie celular o intracelulares) expresados por células madre mesenquimatosas. El agente de unión puede comprender un marcador como el proporcionado en el presente documento. El marcador como se proporciona en el presente documento puede ser detectable (por ejemplo, fluorescencia, etc.). La identificación puede realizarse mediante la identificación de la presencia (por ejemplo, positiva), ausencia (por ejemplo, negativa) y/o combinaciones de los señalizadores (por ejemplo, detectando la presencia y/o ausencia de un marcador asociado con un agente de unión). Los señalizadores pueden ser señalizadores de la superficie celular, por ejemplo, CD 10, 13, 29, 31, 44, 45RO, 49a, 49e, 51, 54, 56, 73, 90, 105 (Endoglina), 106 (VCAM-1), 117 (c-kit), 166 (ALCAM), 349 (Frizzled-9), TfR, BMPRs-IA, IB y II, N-cadherina, SSEA-4, STRO-1, Sca-1/Ly6, PDGF R alfa, HLA de clase I, Antígeno carcinoembrionario, Integrina 5a, Integrina p1, p75, Receptor de NGF, Sprouty 2 o TNAP. Los señalizadores pueden ser señalizadores intracelulares, por ejemplo, Fosfatasa alcalina ósea, dbx2, Flightless 1, KLF5, Spi1, Tafazzin, nucleostemina o vimentina. In some cases, the devices, methods, compositions, systems, and / or kits provided herein can be used to identify a mesenchymal stem cell. Identification of a mesenchymal stem cell can be accomplished by treating a sample comprising particles (eg, mesenchymal stem cell) with one or more binding agents as described herein specific for or directed at or against one or more marker. (eg, cell surface or intracellular markers) expressed by mesenchymal stem cells. The binding agent may comprise a marker as provided herein. The label as provided herein may be detectable (eg, fluorescence, etc.). Identification can be accomplished by identifying the presence (eg, positive), absence (eg, negative) and / or combinations of the markers (eg, detecting the presence and / or absence of a marker associated with an agent of Union). The markers can be cell surface markers, for example CD 10, 13, 29, 31, 44, 45RO, 49a, 49e, 51, 54, 56, 73, 90, 105 (Endoglin), 106 (VCAM-1 ), 117 (c-kit), 166 (ALCAM), 349 (Frizzled-9), TfR, BMPRs-IA, IB and II, N-cadherin, SSEA-4, STRO-1, Sca-1 / Ly6, PDGF R alpha, HLA class I, Carcinoembryonic antigen, Integrin 5a, Integrin p1, p75, NGF Receptor, Sprouty 2 or TNAP. The markers can be intracellular markers, for example, Bone Alkaline Phosphatase, dbx2, Flightless 1, KLF5, Spi1, Tafazzin, nucleostemin, or vimentin.

D. Otras partículasD. Other particles

En algunos casos, una partícula que puede procesarse (por ejemplo, procesarse o tratarse química y/o enzimáticamente), purificarse, aislarse y/o concentrarse utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento puede ser una célula cancerosa, una célula tumoral circulante (CTC), una célula epitelial, una célula endotelial circulante (CEC), una célula madre circulante (CSC) o células madre cancerosas. En algunos casos, la partícula es una célula de médula ósea, célula de espuma de células progenitoras, célula fetal, célula mesenquimatosa, célula epitelial circulante, célula endometrial circulante, trofoblasto, célula del sistema inmunológico (hospedador o injerto), célula del tejido conjuntivo, bacteria, hongo, virus, protozoo, algas o células vegetales. En algunos casos, la partícula es una micropartícula.In some cases, a particle that can be processed (eg, chemically and / or enzymatically processed or treated), purified, isolated, and / or concentrated using methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be a cancer cell, a circulating tumor cell (CTC), an epithelial cell, a circulating endothelial cell (CEC), a circulating stem cell (CSC), or cancer stem cells. In some cases, the particle is a bone marrow cell, progenitor cell foam cell, fetal cell, mesenchymal cell, circulating epithelial cell, circulating endometrial cell, trophoblast, immune system cell (host or graft), connective tissue cell , bacteria, fungus, virus, protozoan, algae or plant cells. In some cases, the particle is a microparticle.

En algunos casos, la partícula es un fragmento celular. En algunos casos, el fragmento celular es una proteína. En algunos casos, la proteína es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunos casos, el fragmento celular es un receptor de células T. En algunos casos, la proteína es una inmunoglobulina. En algunos casos, la partícula es un polipéptido.In some cases, the particle is a cell fragment. In some cases, the cell fragment is a protein. In some cases, the protein is an antibody or antibody fragment. In some cases, the cell fragment is a T cell receptor. In some cases, the protein is an immunoglobulin. In some cases, the particle is a polypeptide.

En algunos casos, la partícula es una célula rara, por ejemplo, un tipo de célula con una abundancia de menos de 1000 en una muestra de un ml, por ejemplo, células tumorales circulantes (CTC), células fetales circulantes, células madre o células infectadas por un virus o parásito. Si la muestra es una muestra de agua, una célula rara puede ser una bacteria patógena o una célula infectada con un virus.In some cases, the particle is a rare cell, for example, a cell type with an abundance of less than 1000 in a one-ml sample, for example, circulating tumor cells (CTC), circulating fetal cells, stem cells, or cells. infected by a virus or parasite. If the sample is a water sample, a rare cell may be a pathogenic bacterium or a cell infected with a virus.

En algunos casos, el fragmento celular es un ácido nucleico. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ADN o ARN. El ADN puede ser ADN genómico, ADN mitocondrial y/o ADN libre de células. El ARN puede ser, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ARNr), ARN de transferencia (ARNt), ARN de partículas de reconocimiento de señales, ARN nuclear pequeño, ARN nucleoar pequeño, ARN SmY, ARN específico de cuerpos de Cajal pequeño, ARN de la telomerasa, ARN líder empalmado, ARN antisentido, ARN CRISPR, ARN no codificante largo (ARNnc largo), microARN (miARN), ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN de horquilla corta (ARNhc), ARNip de acción trans, ARNip asociado a repeticiones y/o ARN libre de células. En algunos casos, el "ácido nucleico" es bicatenario. En algunos casos, el "ácido nucleico" es monocatenario. En algunos casos, el ácido nucleico comprende uno o dos salientes. En algunos casos, el ácido nucleico comprende un saliente 5'. En algunos casos, el ácido nucleico comprende un saliente 3'. En algunos casos, el ácido nucleico comprende un ácido nucleico de "alto peso molecular". En algunos casos, el ácido nucleico es un ácido nucleico de bajo peso molecular. En algunos casos, el ácido nucleico es intranuclear, intracelular o extracelular.In some cases, the cell fragment is a nucleic acid. A nucleic acid can be, for example, DNA or RNA. The DNA can be genomic DNA, mitochondrial DNA, and / or cell-free DNA. The RNA may be, for example, messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA), signal recognition particle RNA, small nuclear RNA, small nucleoar RNA, SmY RNA, body-specific RNA small Cajal RNA, telomerase RNA, spliced leader RNA, antisense RNA, CRISPR RNA, long noncoding RNA (long cRNA), microRNA (miRNA), small interference RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), siRNA of trans action, siRNA associated with repeats and / or cell-free RNA. In some cases, the "nucleic acid" is double stranded. In some cases, the "nucleic acid" is single-stranded. In some cases, the nucleic acid comprises one or two overhangs. In some cases, the nucleic acid comprises a 5 'overhang. In some cases, the nucleic acid comprises a 3 'overhang. In some cases, the nucleic acid comprises a "high molecular weight" nucleic acid. In some cases, the nucleic acid is a low molecular weight nucleic acid. In some cases, the nucleic acid is intranuclear, intracellular, or extracellular.

Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" o equivalentes gramaticales, pueden referirse a dos o más nucleótidos unidos covalentemente entre sí. Un ácido nucleico descrito en el presente documento puede contener enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, como se indica a continuación (por ejemplo, en la construcción de cebadores y sondas tales como sondas marcadoras), se incluyen análogos de ácido nucleico que pueden tener cadenas principales alternativas, que comprenden, por ejemplo, fosforamida (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925 (1993) y referencias citadas en el mismo; Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14: 3487 (1986); Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); y Pauwels et al., Chemica Scripta 26:141 91986)), fosforotioato (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991); y la patente de Estados Unidos N.° 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2321 (1989), enlaces O-metilfosforoamidita (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) y cadenas principales y enlaces de ácidos peptidonucleicos (también denominados en el presente documento "APN") (véase Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380:207 (1996)). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen los que tienen estructuras bicíclicas entre los que se incluyen ácidos nucleicos bloqueados (también denominados en el presente documento "ANB"), Koshkin et al., J. Am. Chem. Soc. 120.13252 3 (1998); cadenas principales positivas (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995); cadenas principales no iónicas (Patentes de Estados Unidos N.° 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994); Capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. YS Sanghui y P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) y cadenas principales sin ribosa, entre las que se incluyen las descritas en las Patentes de Estados Unidos N.° 5.235.033 y 5.034.506, y Capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui y P. Dan Cook. También se incluyen dentro de la definición de ácidos nucleicos los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos (véase Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169 176). Se describen varios análogos de ácido nucleico en Rawls, C & E News 2 de junio de 1997, página 35. También se incluyen dentro de la definición de análogos de ácidos nucleicos los "ácidos nucleicos bloqueados". Los ANB pueden ser una clase de análogos de ácidos nucleicos en los que el anillo de ribosa está "bloqueado" por un puente de metileno que conecta el átomo 2'-0 con el átomo 4'-C. Estas modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato pueden realizarse para aumentar la estabilidad y la vida media de tales moléculas en entornos fisiológicos. Por ejemplo, los híbridos de APN:ADN y ANB-ADN pueden presentar mayor estabilidad y, por tanto, se pueden usar en algunas realizaciones. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, como se especifica, o contienen porciones de la secuencia bicatenaria o monocatenaria. Dependiendo de la aplicación, los ácidos nucleicos pueden ser ADN (incluyendo, por ejemplo, ADN genómico, ADN mitocondrial y ADNc), ARN (incluyendo, por ejemplo, ARNm y ARNr) o un híbrido, donde el ácido nucleico contiene cualquier combinación de desoxirribo- y ribo-nucleótidos, y cualquier combinación de bases, incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xathanina, hipoxatina, isocitosina, isoguanina, etc. The terms "polynucleotide", "nucleic acid" or grammatical equivalents, can refer to two or more nucleotides covalently linked to each other. A nucleic acid described herein may contain phosphodiester linkages, although in some instances, as noted below (for example, in the construction of primers and probes such as marker probes), nucleic acid analogs that may have strands are included. main alternatives, comprising, for example, phosphoramide (Beaucage et al., Tetrahedron 49 (10): 1925 (1993) and references cited therein; Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzl et al. al., Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977), Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14: 3487 (1986), Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al. , J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); and Pauwels et al., Chemica Scripta 26: 141-91986)), phosphorothioate (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991); and US Patent No. 5,644,048), phosphorodithioate (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2321 (1989), O-methylphosphoramidite linkages (see Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Appr oach, Oxford University Press) and peptide nucleic acid backbones and bonds (also referred to herein as "APN") (see Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380: 207 (1996)). Other analogous nucleic acids include those with bicyclic structures including blocked nucleic acids (also referred to herein as "ANB"), Koshkin et al., J. Am. Chem. Soc. 120.13252 3 (1998); positive backbones (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097 (1995); nonionic backbones (US Patent Nos. 5,386,023, 5,637,684, 5,602,240, 5,216 .141 and 4,469,863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30: 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. YS Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem Lett. 4: 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (1994); Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996)) and ribose-free backbones, including those described in US Patent Nos. 5,235,033 and 5,034,506, and Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. YS Sanghui and P. Dan Cook. Also included within the definition of nucleic acids nuc acids leicos containing one or more carbocyclic sugars (see Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169 176). Various nucleic acid analogs are described in Rawls, C & E News June 2, 1997, page 35. Also included within the definition of nucleic acid analogs are "blocked nucleic acids." ANBs can be a class of nucleic acid analogs in which the ribose ring is "blocked" by a methylene bridge connecting the 2'-0 atom to the 4'-C atom. These modifications of the ribose phosphate backbone can be made to increase the stability and half-life of such molecules in physiological environments. For example, PNA: DNA and ANB-DNA hybrids may be more stable and thus may be used in some embodiments. Nucleic acids can be single-stranded or double-stranded, as specified, or contain portions of the double-stranded sequence or single chain. Depending on the application, the nucleic acids can be DNA (including, for example, genomic DNA, mitochondrial DNA, and cDNA), RNA (including, for example, mRNA and rRNA), or a hybrid, where the nucleic acid contains any combination of deoxyribo - and ribo-nucleotides, and any combination of bases, including uracil, adenine, thymine, cytosine, guanine, inosine, xathanine, hypoxatin, isocytosine, isoguanine, etc.

En algunos casos, el fragmento celular es una membrana, orgánulo celular, nucleosoma, exosoma o núcleo. En algunos casos, el fragmento celular es una mitocondria, retículo endoplasmático rugoso, ribosoma, retículo endoplasmático liso, cloroplasto, aparato de Golgi, cuerpo de Golgi, glucoproteína, glucolípido, cisternas, liposoma, peroxisoma, glioxisoma, centríolo, citoesqueleto, lisosoma, cilios, flagelo, vacuola contráctil, vesícula, envuelta nuclear, vacuola, membrana celular, microtúbulo, nucléolo, membrana plasmática o cromatina.In some cases, the cell fragment is a membrane, cell organelle, nucleosome, exosome, or nucleus. In some cases, the cell fragment is a mitochondrion, rough endoplasmic reticulum, ribosome, smooth endoplasmic reticulum, chloroplast, Golgi apparatus, Golgi body, glycoprotein, glycolipid, cisternae, liposome, peroxisome, glyoxysome, centriole, cytoskeleton, lysosome, cilia , flagellum, contractile vacuole, vesicle, nuclear envelope, vacuole, cell membrane, microtubule, nucleolus, plasma membrane or chromatin.

Una o más partículas descritas en el presente documento pueden estar en una muestra. En algunos casos, En una muestra pueden estar uno o más tipos diferentes de partículas descritos en el presente documento.One or more particles described herein may be in a sample. In some cases, one or more different types of particles described herein may be in a sample.

E. Tamaños de partículasE. Particle sizes

En algunos casos, una partícula procesada (por ejemplo, procesada o tratada químicamente), purificada, aislada y/o concentrada utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento, tiene un tamaño de partícula predeterminado (o tamaño crítico de partícula). En algunos casos, las partículas con un tamaño al menos de un tamaño de partícula predeterminado se dirigen a una primera salida en un dispositivo, mientras que las partículas inferiores a un valor predeterminado se dirigen a una segunda salida en un dispositivo. En algunos casos, el tamaño de partícula es el diámetro de la partícula.In some cases, a particle processed (e.g., processed or chemically treated), purified, isolated, and / or concentrated using methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein, has a predetermined particle size (or critical particle size). In some cases, particles with a size of at least a predetermined particle size go to a first outlet in a device, while particles less than a predetermined value go to a second outlet in a device. In some cases, the particle size is the diameter of the particle.

En algunos casos, el tamaño de partícula es al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4.5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18.5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 |jm.In some cases, the particle size is at least 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1 , 5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10 , 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5 , 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 , 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 | jm.

En algunos casos, el tamaño de partícula es aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17.5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 jm .In some cases, the particle size is about 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1, 5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18, 5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 jm.

En algunos casos, el tamaño de partícula es menor que 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 jm .In some cases, the particle size is less than 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1 , 5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 , 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18 , 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 , 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 , 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 jm.

En algunos casos, el tamaño de partícula es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 jm , de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 jm , de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 jm , de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 jm , de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 jm , de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 jm , de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 jm , de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 jm , de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 jm , de aproximadamente 70 a aproximadamente 80 jm , de aproximadamente 80 a aproximadamente 90 jm o de aproximadamente 90 a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 200 a aproximadamente 300 jm , de aproximadamente 300 a aproximadamente 400 jm , de aproximadamente 400 a aproximadamente 500 jm , de aproximadamente 500 a aproximadamente 600 jm o de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 jm .In some cases, the particle size is about 0.1 to about 1 µm, about 1 to about 5 µm, about 5 to about 10 µm, about 10 to about 15 µm, about 10 to about 20 µm. , from about 10 to about 25 µm, from about 15 to about 25 µm, from about 20 to about 30 µm, from about 30 to about 40 µm, from about 40 to about 50 µm, from about 50 to about 60 µm, from about 60 to about 70 µm, about 70 to about 80 µm, about 80 to about 90 µm, or about 90 to about 100 µm, about 100 to about 200 µm, about 200 to about 300 µm, about 300 µm at about 400 jm, from about 400 to about 500 jm, from about 500 to about te 600 jm or from about 500 to about 1000 jm.

En algunos casos, donde la partícula es un polinucleótido, el polinucleótido comprende al menos 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000 o 100.000 bases.In some cases, where the particle is a polynucleotide, the polynucleotide comprises at least 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000 or 100,000 bases.

En algunos casos, donde la partícula es un polinucleótido, el polinucleótido comprende aproximadamente 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000 o 10.000.000 bases. En algunos casos, el polinucleótido es un cromosoma completo. En algunos casos, el polinucleótido es un cromosoma humano 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X o Y.In some cases, where the particle is a polynucleotide, the polynucleotide comprises about 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 , 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000 , 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, or 10,000,000 bases. In some cases, the polynucleotide is a complete chromosome. In some cases, the polynucleotide is a human chromosome 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X or Y.

En algunos casos, donde la partícula es un polinucleótido, el polinucleótido comprende menos de 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000 o 10.000.000 bases.In some cases, where the particle is a polynucleotide, the polynucleotide comprises less than 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, or 10,000,000 bases.

En algunos casos, el polinucleótido comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 bases, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 bases, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 bases, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 bases, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 2000 bases, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 5000 bases, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 10.000 bases, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 50.000 bases o de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 100.000 bases.In some cases, the polynucleotide comprises from about 10 to about 100 bases, from about 50 to about 100 bases, from about 100 to about 200 bases, from about 500 to about 1000 bases, from about 1000 to about 2000 bases, from about 2000 at about 5000 bases, from about 5000 to about 10,000 bases, from about 10,000 to about 50,000 bases, or from about 50,000 to about 100,000 bases.

III. MuestrasIII. Samples

Las partículas de las muestras pueden procesarse (por ejemplo, procesarse o tratarse química o enzimáticamente), purificarse, aislarse y/o concentrarse utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento.Sample particles can be processed (eg, chemically or enzymatically processed or treated), purified, isolated, and / or concentrated using the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein.

A. Tipos de muestrasA. Types of samples

En algunos casos, la muestra es una muestra biológica. En algún caso, la muestra biológica es sangre. La muestra de sangre puede ser, por ejemplo, sangre periférica, sangre materna, sangre periférica de adulto movilizada con G-CSF o sangre de cordón. La sangre de cordón puede ser, por ejemplo, sangre de cordón umbilical o sangre de cordón placentario.In some cases, the sample is a biological sample. In some cases, the biological sample is blood. The blood sample can be, for example, peripheral blood, maternal blood, adult peripheral blood mobilized with G-CSF or cord blood. The cord blood can be, for example, umbilical cord blood or placental cord blood.

En algunos casos, la muestra biológica es suero, plasma, sudor, lágrimas, flujo del oído, esputo, líquido sinovial, linfa, suspensión de médula ósea, orina, saliva, semen, flujo o secreción vaginal, líquido cefalorraquídeo, heces, lavado cervical, sebo, semen, fluido prostático, fluido de Cowper, líquido preeyaculatorio, eyaculación femenina, líquido cerebral (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo), ascitis, leche (por ejemplo, leche materna), cerumen, secreciones del tracto respiratorios, intestinal o genitourinario, líquido de lavado broncoalveolar, líquido amniótico, humor acuoso y muestras de agua). Una muestra puede ser fluidos en los que se han introducido células (por ejemplo, medios de cultivo y muestras de tejido licuado). Una muestra puede ser un lisado. Una muestra biológica puede ser cabello, líquido quístico, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, líquido menstrual, pus, sebo, secreción mucosa, agua fecal, jugo pancreático, líquido de lavado de cavidades sinusales, aspirado broncopulmonar o líquido de la cavidad blastocele. La muestra biológica puede ser una muestra de tejido o una biopsia. Una muestra de fluido de un organismo o una que ha sido solubilizado puede ser de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 500, 1000 o 1500 ml.In some cases, the biological sample is serum, plasma, sweat, tears, ear discharge, sputum, synovial fluid, lymph, bone marrow suspension, urine, saliva, semen, vaginal discharge or discharge, cerebrospinal fluid, stool, cervical lavage , sebum, semen, prostate fluid, Cowper's fluid, pre-ejaculatory fluid, female ejaculation, brain fluid (for example, cerebrospinal fluid), ascites, milk (for example, breast milk), earwax, secretions from the respiratory, intestinal or genitourinary tract, bronchoalveolar lavage fluid, amniotic fluid, aqueous humor, and water samples). A sample can be fluids into which cells have been introduced (eg, culture media and liquefied tissue samples). A sample can be a lysate. A biological sample can be hair, cystic fluid, pleural fluid, peritoneal fluid, pericardial fluid, lymph, chyme, chyle, bile, interstitial fluid, menstrual fluid, pus, sebum, mucous discharge, fecal water, pancreatic juice, lavage fluid. sinus cavities, bronchopulmonary aspirate, or blastocele cavity fluid. The biological sample can be a tissue sample or a biopsy. A sample of fluid from an organism or one that has been solubilized can be at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 500, 1000 or 1500 ml.

En algunos casos, la muestra biológica es de un animal, por ejemplo, ser humano, ratón, rata, gato, perro, vaca, pollo, burro, conejo, chimpancé, gorila, orangután, caballo, cobaya, cerdo o mono rhesus.In some cases, the biological sample is from an animal, eg, human, mouse, rat, cat, dog, cow, chicken, donkey, rabbit, chimpanzee, gorilla, orangutan, horse, guinea pig, pig, or rhesus monkey.

En algunos casos, la muestra biológica es de una planta. En algunos casos, la muestra biológica comprende una planta.In some cases, the biological sample is from a plant. In some cases, the biological sample comprises a plant.

En algunos casos, la muestra biológica es de un hongo. En algunos casos, la muestra biológica comprende un hongo. In some cases, the biological sample is from a fungus. In some cases, the biological sample comprises a fungus.

En algunos casos, la muestra comprende leucocitos y eritrocitos.In some cases, the sample includes leukocytes and erythrocytes.

En algunos casos, la muestra comprende células. En algunos casos, la muestra comprende células muertas y/o desechos. Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para la eliminación basada en el tamaño de desechos y/o células muertas de una muestra que comprende células. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procedimientos de lavado de células. En algunos casos, la muestra es una muestra de cultivo celular. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar células de otros componentes en una muestra de cultivo celular, por ejemplo, medio, factores de crecimiento, etc. In some cases, the sample comprises cells. In some cases, the sample contains dead cells and / or debris. The methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used for size-based removal of debris and / or dead cells from a sample comprising cells. In some cases, the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used for cell washing procedures. In some cases, the sample is a cell culture sample. In some cases, the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to process (for example, chemically and / or enzymatically process or treat), isolate, purify, and / or concentrate cells from others. components in a cell culture sample, eg, medium, growth factors, etc.

En algunos casos, la muestra comprende un tampón. El tampón puede estar libre o sustancialmente libre de un reactivo. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para el intercambio de tampón/medio.In some cases, the sample comprises a buffer. The buffer can be free or substantially free of a reagent. In some cases, the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used for buffer / medium exchange.

En algunos casos, la muestra comprende tejido adiposo digerido con enzimas. En algunos casos, el tejido adiposo digerido con enzimas es una fuente de células progenitoras autólogas. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para limpiar tejido adiposo digerido con enzima (por ejemplo, colagenasa) como fuente de células progenitoras autólogas, por ejemplo, para purificar células madre del tejido adiposo digerido con enzimas.In some cases, the sample comprises adipose tissue digested with enzymes. In some cases, enzyme-digested adipose tissue is a source of autologous progenitor cells. In some cases, the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to cleanse digested adipose tissue. with enzyme (eg collagenase) as a source of autologous progenitor cells, eg to purify stem cells from enzyme-digested adipose tissue.

En algunos casos, una muestra comprende células cancerosas de tumores. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar químicamente), aislar, purificar y/o concentrar células cancerosas de tumores.In some cases, a sample contains cancer cells from tumors. In some instances, the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to process (eg, process or chemically treat), isolate, purify, and / or concentrate cancer cells from tumors.

En algunos casos, una muestra comprende células hospedadoras infiltrantes o estromales de un tumor. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar células infiltrantes o células hospedadoras estromales de un tumor. Por ejemplo, los linfocitos que se infiltran en tumores pueden ser glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo y migrado a un tumor. Las células estromales pueden ser tejido conjuntivo. Las células estromales pueden proporcionar una matriz extracelular en la que pueden crecer tumores.In some cases, a sample comprises infiltrating or stromal host cells from a tumor. In some cases, the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to process (e.g., chemically and / or enzymatically process or treat), isolate, purify, and / or concentrate infiltrating cells or stromal host cells of a tumor. For example, lymphocytes that infiltrate tumors can be white blood cells that have left the bloodstream and migrated to a tumor. Stromal cells can be connective tissue. Stromal cells can provide an extracellular matrix in which tumors can grow.

En algunos casos, una muestra es una muestra industrial. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar partículas en una muestra industrial.In some cases, a sample is an industrial sample. In some instances, the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to process (e.g., chemically and / or enzymatically process or treat), isolate, purify, and / or concentrate particles into a industrial sign.

En algunos casos, una muestra comprende algas, levaduras, bacterias o un virus. En algunos casos, Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar algas, levaduras, bacterias y/o un virus. Por ejemplo, una muestra con levadura puede ser una muestra de producción de cerveza. Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar levaduras a partir de la muestra de una muestra de producción de cerveza.In some cases, a sample comprises algae, yeast, bacteria, or a virus. In some cases, the methods, compositions, devices, systems and / or kits described herein can be used to process (for example, chemically and / or enzymatically process or treat), isolate, purify and / or concentrate algae, yeast , bacteria and / or a virus. For example, a yeast sample can be a beer production sample. The methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to process (e.g., chemically and / or enzymatically process or treat), isolate, purify, and / or concentrate yeast from the sample of a sample of beer production.

En algunos casos, la muestra comprende un anticuerpo. En algunos casos, Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar un anticuerpo a partir de una muestra que comprende un anticuerpo.In some cases, the sample comprises an antibody. In some instances, the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to process (e.g., chemically and / or enzymatically process or treat), isolate, purify, and / or concentrate an antibody to starting from a sample comprising an antibody.

En algunos casos, la muestra comprende plantas, mitocondrias, lentivirus, exosomas o células en división. Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para procesar (por ejemplo, procesar o tratar química y/o enzimáticamente), aislar, purificar y/o concentrar plantas, mitocondrias, lentivirus, exosomas o células en división de la muestra.In some cases, the sample comprises plants, mitochondria, lentiviruses, exosomes, or dividing cells. The methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to process (eg, chemically and / or enzymatically process or treat), isolate, purify, and / or concentrate plants, mitochondria, lentiviruses, exosomes. or dividing cells in the sample.

En algunos casos, la muestra comprende células en diferentes fases del ciclo celular, G0 (Intervalo 0/En reposo), G1 (Intervalo 1), S (Síntesis), M (Mitosis) o G2 (Intervalo 2). Las células pueden tener diferentes tamaños en diferentes fases del ciclo celular. En algunos casos, los métodos y dispositivos descritos en el presente documento se utilizan para separar células en diferentes fases del ciclo celular.In some cases, the sample comprises cells in different phases of the cell cycle, G0 (Range 0 / Resting), G1 (Range 1), S (Synthesis), M (Mitosis), or G2 (Range 2). Cells can be of different sizes at different phases of the cell cycle. In some cases, the methods and devices described herein are used to separate cells at different phases of the cell cycle.

En algunos casos, la muestra es de una masa de agua. La masa de agua puede ser, por ejemplo, de un arroyo, charca, río, océano, alberca, mar, charco, canal de corriente, humedal, embalse, depósito, puerto, bahía, alberca artificial, barachois, cuenca, brazo pantanoso, riachuelo, ensenada, poza, hervido, rivera, regato, canal, caleta, extracción, estuario, desembocadura, fiordo, glaciar, golfo, cala, tetera, pieza, laguna, lago, manglar, mar mediterráneo, balsa, estanque de molino, foso, alberca de herradura, fitotelma, piscina (piscina, piscina reflectante), cueva, rápido, rada, torrente, marisma, lago de mar, brazo de mar, fuente, manantial, estrecho, corriente, subglacial, alberca, pantano, lago de montaña, piscina de marea, humedad temporal, aguada o humedal. Una muestra de agua puede ser una aguada de tanque de lastre, por ejemplo, procedente de un buque de transporte (véase, por ejemplo, //news.sciencemag.org/biology/2015/01/tests-used-ensure-ships-don-t-carry-deadly-cargo-draw-sharp-criticism). In some cases, the sample is from a body of water. The body of water can be, for example, a stream, pond, river, ocean, pool, sea, puddle, stream channel, wetland, reservoir, reservoir, port, bay, artificial pool, barachois, basin, swamp arm, creek, cove, pool, boiled, rivera, stream, channel, cove, extraction, estuary, mouth, fjord, glacier, gulf, cove, teapot, piece, lagoon, lake, mangrove, mediterranean sea, raft, mill pond, moat , horseshoe pool, fitotelma, swimming pool (pool, reflecting pool), cave, rapid, roadstead, torrent, marshland, sea lake, arm of the sea, source, spring, strait, stream, subglacial, pool, swamp, mountain lake , tidal pool, temporary humidity, watery or wetland. A water sample can be a ballast tank wash, for example, from a transport vessel (see, for example, //news.sciencemag.org/biology/2015/01/tests-used-ensure-ships- don-t-carry-deadly-cargo-draw-sharp-criticism).

En algunos casos, la muestra procede de un ataque de bioterrorismo. En algunos casos, la muestra de un ataque de bioterrorismo comprende un virus, por ejemplo, virus de la viruela o virus de la gripe. En algunos casos, la muestra de un ataque de bioterrorismo comprende ántrax. En algunos casos, la muestra de un ataque de bioterrorismo comprende más de un tipo de agente infeccioso.In some cases, the sample is from a bioterrorism attack. In some cases, the sample from a bioterrorism attack comprises a virus, for example, smallpox virus or influenza virus. In some cases, the sample from a bioterrorism attack includes anthrax. In some cases, the sample from a bioterrorism attack comprises more than one type of infectious agent.

En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento se utilizan para purificar virus de células, por ejemplo, un lentivirus. Los ejemplos de lentivirus incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la inmunodeficiencia de simios, virus de la inmunodeficiencia felina, lentivirus del puma, virus de la anemia infecciosa equina, virus de la inmunodeficiencia bovina, virus de la artritis encefalitis caprina o virus Visna. En algunos casos, el virus se puede purificar a partir de células y/o desechos celulares.In some cases, the methods described herein are used to purify viruses from cells, eg, a lentivirus. Examples of lentiviruses include human immunodeficiency virus (HIV), simian immunodeficiency virus, feline immunodeficiency virus, puma lentivirus, equine infectious anemia virus, bovine immunodeficiency virus, arthritis encephalitis virus. goat or Visna virus. In some cases, the virus can be purified from cells and / or cellular debris.

En algunos casos, la muestra procede de un hospital u otro centro de atención médica. En algunos casos, la muestra es de una instalación de tratamiento de aguas residuales. En algunos casos, la muestra procede de una instalación de producción de biocombustible de algas. En algunos casos, la muestra procede de una cervecería. En algunos casos, la muestra procede de un sistema público de agua. En algunos casos, la muestra procede de un sistema de alcantarillado.In some cases, the sample comes from a hospital or other healthcare facility. In some cases, the sample is from a wastewater treatment facility. In some cases, the sample is from an algae biofuel production facility. In some cases, the sample comes from a brewery. In some In some cases, the sample comes from a public water system. In some cases, the sample comes from a sewer system.

En algunos casos, la muestra procede de un derrame químico. En algunos casos, la muestra procede de una mina, por ejemplo, mina de carbón. En algunos casos, la muestra es una muestra arqueológica. En algunos casos, la muestra es una muestra forense.In some cases, the sample is from a chemical spill. In some cases, the sample is from a mine, for example a coal mine. In some cases, the sample is an archaeological sample. In some cases, the sample is a forensic sample.

En algunos casos, los eritrocitos de las muestras no están lisados. En algunos casos, los eritrocitos de las muestras están lisados.In some cases, the erythrocytes in the samples are not lysed. In some cases, the erythrocytes in the samples are lysed.

En algunos casos, la muestra comprende uno o más marcadores. En algunos casos, la muestra comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 marcadores diferentes. En algunos casos, el marcador es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, colorante, tinte (por ejemplo, bromuro de etidio), adaptador de ácido nucleico, partícula radiactiva, partícula fluorescente, oligonucleótido, sonda o sonda marcada con fluorescencia. En algunos casos, el marcador está unido, ligado o conjugado con un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, colorante, tinte (por ejemplo, bromuro de etidio), adaptador de ácido nucleico, partícula radiactiva, partícula fluorescente, oligonucleótido, sonda o sonda marcada con fluorescencia. En algunos casos, un dispositivo, método, composición, sistema y/o kit como se proporciona en el presente documento procesa una partícula (por ejemplo, una célula) de manera que la partícula (por ejemplo, la célula) comprenda un primer marcador y un segundo marcador. El primer y el segundo marcadores pueden ser marcadores diferentes. El primer marcador puede unirse, conjugarse o ligarse a un agente de unión como se proporciona en el presente documento dirigido a un señalizador de la superficie de la partícula (por ejemplo, señalizador de la superficie celular), mientras que el segundo marcador puede unirse, conjugarse o ligarse a un agente de unión como se proporciona en el presente documento dirigido a un señalizador en el interior de la partícula (por ejemplo, señalizador intracelular). El marcador puede ser cualquier marcador proporcionado en el presente documento.In some cases, the sample comprises one or more markers. In some cases, the sample comprises at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 different markers. In some cases, the label is an antibody, antibody fragment, dye, dye (eg, ethidium bromide), nucleic acid linker, radioactive particle, fluorescent particle, oligonucleotide, probe, or fluorescently labeled probe. In some cases, the label is attached, ligated, or conjugated to an antibody, antibody fragment, dye, dye (eg, ethidium bromide), nucleic acid linker, radioactive particle, fluorescent particle, oligonucleotide, probe, or labeled probe. fluorescence. In some cases, a device, method, composition, system, and / or kit as provided herein processes a particle (eg, a cell) such that the particle (eg, the cell) comprises a first marker and a second marker. The first and second markers can be different markers. The first marker can bind, conjugate or bind to a binding agent as provided herein directed to a particle surface marker (eg, cell surface marker), while the second marker can bind, conjugated or linked to a binding agent as provided herein directed to a marker within the particle (eg, intracellular marker). The marker can be any marker provided herein.

En algunos casos, la muestra comprende una enzima, por ejemplo, una enzima de restricción, quinasa (por ejemplo, ADN quinasa (por ejemplo, polinucleótido quinasa de T4), proteína quinasa, por ejemplo, serina quinasa, treonina quinasa, tirosina quinasa), DNasa, RNasa, fosfatasa, ligasa (por ejemplo, ARN ligasa, ADN ligasa), peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (FAL), glucosa oxidasa, polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa termoestable, polimerasa Taq) ARN polimerasa), desoxinucleotidil transferasa terminal, transcriptasa inversa (por ejemplo, transcriptasa inversa viral, transcriptasa inversa no viral), telomerasa, metilasa o topoisomerasa. En algunos casos, los métodos y/o dispositivos usados en el presente documento se pueden usar para separar un marcador o enzima de otro componente de una muestra, por ejemplo, un polinucleótido o una célula.In some cases, the sample comprises an enzyme, for example, a restriction enzyme, kinase (for example, DNA kinase (for example, T4 polynucleotide kinase), protein kinase, for example, serine kinase, threonine kinase, tyrosine kinase) , DNase, RNase, phosphatase, ligase (for example, RNA ligase, DNA ligase), horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (ALP), glucose oxidase, polymerase (for example, DNA polymerase (for example, thermostable DNA polymerase) , Taq polymerase) RNA polymerase), terminal deoxynucleotidyl transferase, reverse transcriptase (eg, viral reverse transcriptase, non-viral reverse transcriptase), telomerase, methylase, or topoisomerase. In some cases, the methods and / or devices used herein can be used to separate a marker or enzyme from another component of a sample, eg, a polynucleotide or a cell.

B. Número de partículas/número de diferentes tipos de partículas en una muestraB. Number of particles / number of different types of particles in a sample

Una muestra puede comprender una o más primeras partículas. En algunos casos, la muestra puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000, 100.000.000, 1.000. 000.000, 10.000.000.000, 100.000.000.000 o 1.000.000.000.000 primeras partículas. La muestra puede comprender aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000, 100.000. 000, 1.000.000.000, 10.000.000.000, 100.000.000.000 o 1.000.000.000.000 primeras partículas. En algunos casos, la muestra comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 primeras partículas, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 primeras partículas, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 primeras partículas, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 primeras partículas, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 primeras partículas, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10.000 primeras partículas, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 100.000 primeras partículas, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 1.000.000 primeras partículas, de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 10.000. 000 primeras partículas, de aproximadamente 10.000.000 a aproximadamente 100.000.000 primeras partículas, de aproximadamente 100.000.000 a aproximadamente 1.000.000.000 primeras partículas, de aproximadamente 1.000.000.000 a aproximadamente 10.000.000.000 primeras partículas, de aproximadamente 10.000. 000.000 a aproximadamente 100.000.000.000 primeras partículas o de aproximadamente 100.000.000.000 a aproximadamente 1.000.000.000.000 primeras partículas.A sample can comprise one or more first particles. In some cases, the sample may comprise at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000, 100,000,000, 1,000. 000,000, 10,000,000,000, 100,000,000,000 or 1,000,000,000,000 first particles. The sample can comprise about 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,50,100,500,1000,10,000,100,000,1,000,000, 10,000,000, 100,000. 000, 1,000,000,000, 10,000,000,000, 100,000,000,000 or 1,000,000,000,000 first particles. In some cases, the sample comprises from about 10 to about 100 first particles, from about 5 to about 10 first particles, from about 10 to about 50 first particles, from about 50 to about 100 first particles, from about 100 to about 1000 first particles, from about 1000 to about 10,000 first particles, from about 10,000 to about 100,000 first particles, from about 100,000 to about 1,000,000 first particles, from about 1,000,000 to about 10,000. 000 first particles, from about 10,000,000 to about 100,000,000 first particles, from about 100,000,000 to about 1,000,000,000 first particles, from about 1,000,000,000 to about 10,000,000,000 first particles, from about 10,000. 000,000 to about 100,000,000,000 first particles or from about 100,000,000,000 to about 1,000,000,000,000 first particles.

En algunos casos, la muestra comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000, 1.000. 000, 10.000.000, 100.000.000, 1.000.000.000, 10.000.000.000, 100.000.000.000 o 1.000.000.000.000 partículas en total. La muestra puede comprender aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000, 100.000.000, 1.000.000.000, 10.000.000.000, 100.000.000.000 o 1.000. 000.000.000 primeras partículas. En algunos casos, la muestra comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 partículas en total, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 partículas en total, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 partículas en total, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 partículas en total o de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 partículas en total, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10.000 partículas en total, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 100.000 partículas en total, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 1.000.000 partículas en total, de aproximadamente 1.000. 000 a aproximadamente 10.000.000 partículas en total, de aproximadamente 10.000.000 a aproximadamente 100.000. 000 partículas en total, de aproximadamente 100.000.000 a aproximadamente 1.000.000.000 partículas en total, de aproximadamente 1.000.000.000 a aproximadamente 10.000.000.000 partículas en total, de aproximadamente 10.000.000.000 a aproximadamente 100.000.000.000 partículas en total o de aproximadamente 100.000. 000.000 a aproximadamente 1.000.000.000.000 partículas en total.In some cases, the sample comprises at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 100,000, 1,000. 000, 10,000,000, 100,000,000, 1,000,000,000, 10,000,000,000, 100,000,000,000 or 1,000,000,000,000 particles in total. The sample can comprise approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000, 100,000,000, 1,000 .000,000, 10,000,000,000, 100,000,000,000, or 1,000. 000,000,000 first particles. In some cases, the sample comprises about 10 to about 100 total particles, about 5 to about 10 total particles, about 10 to about 50 total particles, about 50 to about 100 total particles, or about 100 to about 1000 total particles, from about 1000 to about 10,000 total particles, from about 10,000 to about 100,000 total particles, from about 100,000 to about 1,000,000 total particles, from about 1,000. 000 to about 10,000,000 total particles, from about 10,000,000 to about 100,000. 000 particles in total, from about 100,000,000 to about 1,000,000,000 particles in total, from about 1,000,000,000 to about 10,000,000,000 total particles, from about 10,000,000,000 to about 100,000,000,000 total particles, or about 100,000. 000,000 to approximately 1,000,000,000,000 particles in total.

La muestra puede comprender uno o más tipos diferentes de partículas. La muestra puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000, 100.000.000, 1.000.000.000, 10.000. 000.000, 100.000.000.000 o 1.000.000.000.000 de tipos diferentes de partículas. La muestra puede comprender aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10.000, 100.000, 1.000.000, 10.000.000, 100.000. 000, 1.000.000.000, 10.000.000.000, 100.000.000.000 o 1.000.000.000.000 tipos de partículas diferentes. En algunos casos, la muestra comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 tipos de partículas diferentes o de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 100.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 1.000.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 10.000.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 10.000.000 a aproximadamente 100.000.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 100.000.000 a aproximadamente 1.000.000.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 1.000.000.000 a aproximadamente 10.000.000.000 tipos de partículas diferentes, de aproximadamente 10.000.000.000 a aproximadamente 100.000.000.000 tipos de partículas diferentes o de aproximadamente 100.000. 000.000 a aproximadamente 1.000.000.000.000 tipos de partículas diferentes.The sample can comprise one or more different types of particles. The sample can comprise at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000, 100,000,000, 1,000,000,000, 10,000. 000,000, 100,000,000,000 or 1,000,000,000,000 of different types of particles. The sample can comprise about 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,50,100,500,1000,10,000,100,000,1,000,000, 10,000,000, 100,000. 000, 1,000,000,000, 10,000,000,000, 100,000,000,000, or 1,000,000,000,000 different types of particles. In some cases, the sample comprises from about 10 to about 100 different types of particles, from about 5 to about 10 different types of particles, from about 10 to about 50 different types of particles, from about 50 to about 100 different types of particles. or from about 100 to about 1000 different particle types, from about 1000 to about 10,000 different particle types, from about 10,000 to about 100,000 different particle types, from about 100,000 to about 1,000,000 different particle types, from about 1,000 .000 to about 10,000,000 different particle types, from about 10,000,000 to about 100,000,000 different particle types, from about 100,000,000 to about 1,000,000,000 different particle types, from about 1,000,000,000 to about 1 0,000,000,000 different particle types, from about 10,000,000,000 to about 100,000,000,000 different particle types, or about 100,000. 000,000 to about 1,000,000,000,000 different types of particles.

C. Relación de primera y segunda partículas en una muestraC. Ratio of first and second particles in a sample

En algunos casos, la muestra comprende una primera partícula y una segunda partícula. Una muestra puede comprender solo un tipo de partícula, por ejemplo, una partícula de menos de un tamaño predeterminado o una partícula de al menos un tamaño predeterminado. En algunos casos, la relación de la abundancia entre la primera partícula y la segunda partícula en la muestra es menor que 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000, 1:10.000.000, 1:100.000.000 o 1:1.000.000.000. En algunos casos, la relación de la abundancia entre la primera partícula y la segunda partícula en la muestra es mayor que 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000, 1:10.000.000, 1:100.000.000 o 1:1.000.000.000. En algunos casos, la relación de la abundancia entre la primera partícula y la segunda partícula en la muestra es aproximadamente 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000, 1:10.000.000, 1:100.000.000 o 1:1.000.000.000.In some cases, the sample comprises a first particle and a second particle. A sample may comprise only one type of particle, for example, a particle of less than a predetermined size or a particle of at least a predetermined size. In some cases, the abundance ratio between the first particle and the second particle in the sample is less than 1: 1, 1:10, 1: 100, 1: 1000, 1: 10,000, 1: 100,000, 1: 1,000 .000, 1: 10,000,000, 1: 100,000,000 or 1: 1,000,000,000. In some cases, the abundance ratio between the first particle and the second particle in the sample is greater than 1: 1, 1:10, 1: 100, 1: 1000, 1: 10,000, 1: 100,000, 1: 1,000 .000, 1: 10,000,000, 1: 100,000,000 or 1: 1,000,000,000. In some cases, the ratio of the abundance between the first particle and the second particle in the sample is approximately 1: 1, 1:10, 1: 100, 1: 1000, 1: 10,000, 1: 100,000, 1: 1,000. 000, 1: 10,000,000, 1: 100,000,000, or 1: 1,000,000,000.

En algunos casos, la muestra comprende un tipo de célula rara. En algunos casos, la relación entre la abundancia del tipo de célula rara y la abundancia de células de uno o más tipos celulares distintos en una muestra es aproximadamente 1:100, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000, 1:10.000.000, 1:100.000.000 o 1:1.000.000.000.In some cases, the sample comprises a rare cell type. In some cases, the ratio of the abundance of the rare cell type to the abundance of cells of one or more different cell types in a sample is approximately 1: 100, 1: 1000, 1: 10,000, 1: 100,000, 1: 1,000 .000, 1: 10,000,000, 1: 100,000,000 or 1: 1,000,000,000.

En algunos casos, la relación entre la abundancia de células del tipo de célula rara y la abundancia de células de uno o más tipos celulares distintos es menor que 1:100, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000, 1:10.000.000, 1:100.000.000 o 1:1.000.000.000.In some cases, the ratio of the abundance of cells of the rare cell type to the abundance of cells of one or more different cell types is less than 1: 100, 1: 1000, 1: 10,000, 1: 100,000, 1: 1,000 .000, 1: 10,000,000, 1: 100,000,000 or 1: 1,000,000,000.

D. Dilución de la muestraD. Sample dilution

En algunos casos, la muestra se diluye. En algunos casos, una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre, se diluye antes de aplicarse a un dispositivo descrito en el presente documento. Una muestra se puede diluir, por ejemplo, para evitar la obstrucción de un dispositivo descrito en el presente documento. En algunos casos, la muestra se diluye después de pasar a través de un dispositivo descrito en el presente documento.In some cases, the sample is diluted. In some cases, a sample, for example a blood sample, is diluted before being applied to a device described herein. A sample can be diluted, for example, to avoid clogging a device described herein. In some cases, the sample is diluted after passing through a device described herein.

Una muestra se puede diluir al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6.5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000 veces.A sample can be diluted at least 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2 , 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5 , 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19 , 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 , 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 , 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 or 3000, 4000, 5000 , 6000, 7000, 8000, 9000 or 10,000 times.

En algunos casos, una muestra se diluye aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3.5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17.5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000 veces.In some cases, a sample is diluted approximately 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5 , 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10 , 5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19 , 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41.42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 , 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 , 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 or 3000, 4000, 5000 , 6000, 7000, 8000, 9000 or 10,000 times.

Una muestra se puede diluir, por ejemplo, añadiendo agua, tampón y/u otro fluido a la muestra. En algunos casos, la muestra se diluye añadiendo un aditivo.A sample can be diluted, for example, by adding water, buffer, and / or other fluid to the sample. In some cases, the sample is diluted by adding an additive.

E. Obstrucciones y aditivos para muestrasE. Obstructions and additives for samples

En el presente documento se describen métodos para procesar grandes volúmenes de sangre con matrices de desplazamiento lateral determinista, por ejemplo, para el aislamiento de células raras. En algunos casos, los métodos descritos se pueden usar para extraer células tumorales circulantes de grandes volúmenes (-100 ml) de sangre completa de pacientes con cáncer o, por ejemplo, para extraer células madre de grandes volúmenes de sangre de cordón umbilical. Los métodos desvelados también son útiles para el procesamiento general de sangre utilizando matrices DLD.Methods for processing large volumes of blood with deterministic side-shift matrices are described herein, eg, for the isolation of rare cells. In some cases, the described methods can be used to extract large volumes (-100 ml) circulating tumor cells from whole blood of cancer patients or, for example, to extract stem cells from large volumes of umbilical cord blood. The disclosed methods are also useful for general blood processing using DLD matrices.

En algunos casos, se utilizan matrices de desplazamiento lateral determinista (DLD) para extraer células raras de cientos de microlitros de sangre. Usando los métodos divulgados, se pueden utilizar matrices DLD para extraer células raras de cientos de mililitros de sangre. También se mejora la "robustez" de la técnica contra la obstrucción y el ensuciamiento para rendimientos más bajos para otras aplicaciones de sangre.In some cases, deterministic lateral displacement (DLD) arrays are used to extract rare cells from hundreds of microliters of blood. Using the disclosed methods, DLD arrays can be used to extract rare cells from hundreds of milliliters of blood. The "robustness" of the technique against clogging and fouling is also improved for lower yields for other blood applications.

En algunos casos, un proceso para reducir la obstrucción comprende una combinación de cuatro técnicas: 1) aumento de la concentración del anticoagulante quelante de calcio EDTA de, por ejemplo, 1 mM a, por ejemplo, 5 mM; 2) adición de un inhibidor directo de la trombina, por ejemplo, PPACK a una concentración de, por ejemplo, 40 pM; 3) aumento de la velocidad de flujo 10 veces; y 4) aumento de 3 veces en la dilución de la sangre. En algunos casos, solo se realiza una técnica. En algunos casos, se realizan dos o más de las técnicas.In some cases, a process to reduce the obstruction comprises a combination of four techniques: 1) increasing the concentration of the calcium chelating anticoagulant EDTA from, for example, 1mM to, for example, 5mM; 2) addition of a direct thrombin inhibitor, for example PPACK at a concentration of, for example, 40 pM; 3) increase the flow rate 10 times; and 4) 3-fold increase in blood dilution. In some cases, only one technique is performed. In some cases, two or more of the techniques are performed.

En algunos casos, se proporciona un kit que comprende un agente quelante de calcio y un inhibidor de trombina. En algunos casos, el kit incluye EDTA y PPACK.In some cases, a kit is provided comprising a calcium chelating agent and a thrombin inhibitor. In some cases, the kit includes EDTA and PPACK.

Usando sangre con leucocitos teñidos con fluorescencia, el nivel de obstrucción se puede medir en función del volumen de sangre que ha pasado a través de la matriz DLD. Empleando el enfoque desvelado, -100 ml de sangre pueden pasar a través de la matriz DLD antes de obstruirse utilizando una combinación de los cuatro métodos anteriores, en comparación con unos cientos de microlitros en la situación previa.Using blood with fluorescence-stained leukocytes, the level of obstruction can be measured based on the volume of blood that has passed through the DLD matrix. Employing the disclosed approach, -100 ml of blood can pass through the DLD matrix before clogging using a combination of the four methods above, compared to a few hundred microliters in the previous situation.

La combinación de EDTA y PPACK se puede utilizar como tampón de ejecución para la dilución de la sangre en preparación para el procesamiento de la sangre con matrices DLD.The combination of EDTA and PPACK can be used as a run buffer for blood dilution in preparation for processing blood with DLD matrices.

Se pueden usar matrices de desplazamiento lateral determinista para capturar leucocitos y células tumorales circulantes de la sangre con alto enriquecimiento y con altos caudales.Deterministic side-shift matrices can be used to capture circulating leukocytes and tumor cells from the blood at high enrichment and at high flow rates.

En algunos casos, el volumen de sangre que se puede procesar con estos dispositivos es limitado debido a la obstrucción de la matriz de micropostes (obstáculos). En algunos casos, mediante la eliminación de las plaquetas de la sangre antes de poner la sangre en las matrices, las plaquetas se pueden identificar como un contribuyente dominante a la obstrucción. Por ejemplo, hacer pasar leucocitos solos puede provocar una obstrucción mucho menor que hacer pasar sangre. En algunos casos, puede desactivarse un mecanismo biológico que causa la obstrucción, que puede producir una reducción de al menos 40 veces en la obstrucción. En algunos casos, se pueden usar caudales mayores y una mayor dilución de la sangre para conseguir una mayor reducción de la obstrucción de una matriz de micropostes.In some cases, the volume of blood that can be processed with these devices is limited due to the obstruction of the micropost array (obstacles). In some cases, by removing platelets from the blood before putting the blood into the arrays, platelets can be identified as a dominant contributor to blockage. For example, passing white blood cells alone can cause much less obstruction than passing blood. In some cases, a biological mechanism causing the obstruction can be deactivated, which can lead to a reduction of at least 40 times in the obstruction. In some cases, higher flow rates and greater blood dilution can be used to achieve further reduction in clogging of a micropost array.

Las condiciones fisiológicas en los dispositivos que comprenden una matriz de obstáculos (alto cizallamiento, aceleración y desaceleración repetidas rápidas) pueden ser diferentes de las que se encuentran en situaciones típicas que implican los estudios de coagulación sanguínea.Physiological conditions in devices that comprise a matrix of obstacles (high shear, rapid repeated acceleration and deceleration) may be different from those found in typical situations involving blood coagulation studies.

La obstrucción de una matriz de micropostes (obstáculos) puede causarse por uno o ambos de dos procesos complementarios mutuamente dependientes implicados en la hemostasia: coagulación y activación plaquetaria, que conducen a un coágulo. En algunos casos, los coágulos (que luego pueden atrapar leucocitos) pueden causar la obstrucción.The obstruction of a micropost array (obstacles) can be caused by one or both of two mutually dependent complementary processes involved in hemostasis: coagulation and platelet activation, leading to a clot. In some cases, clots (which can later trap white blood cells) can cause the blockage.

La FIG. 35 ilustra una vista simplificada de las posibles formas en las que estos dos procesos pueden interactuar para causar obstrucciones, así como los mecanismos subyacentes que pueden ser atacados para desactivar estos mecanismos. El ciclo puede iniciarse por tensión mecánica en las plaquetas debido a fuerzas de cizallamiento cuando las plaquetas pasan entre los postes en una matriz de micropostes, o su rápida aceleración y desaceleración causada por una estructura de micromatriz. FIG. 35 illustrates a simplified view of the possible ways in which these two processes can interact to cause clogging, as well as the underlying mechanisms that can be attacked to disable these mechanisms. The cycle can be initiated by mechanical stress on the platelets due to shear forces as the platelets pass between the posts in a micropost array, or their rapid acceleration and deceleration caused by a microarray structure.

Los procesos relacionados con la coagulación están en el lado izquierdo del diagrama y los procesos plaquetarios están en el lado derecho del diagrama. Pueden interrelacionarse a través de trombina y vías y dependencias de calcio. En algunos casos, se pueden abordar tanto la trombina como las vías/dependencias de calcio para una máxima eficacia.Coagulation-related processes are on the left side of the diagram and platelet processes are on the right side of the diagram. They can be interrelated through thrombin and calcium pathways and dependencies. In some cases, both thrombin and calcium pathways / dependencies can be addressed for maximum efficacy.

En algunos casos, tanto el alto caudal como la dilución conducen a un aumento del rendimiento máximo de sangre completa antes de que se produzca una obstrucción significativa.In some cases, both high flow rate and dilution lead to increased peak blood yield before a significant obstruction occurs.

En algunos casos, un mecanismo de obstrucción dominante es la actividad de integrinas dependientes de calcio en las superficies de las plaquetas, cuya interacción puede llevar a la agregación de plaquetas. En algunos casos, las integrinas dependientes de calcio son uno de los contribuyentes dominantes a la obstrucción inducida por plaquetas. En algunos casos, el aumento de la concentración de EDTA de 1 mM a 5 mM puede dar como resultado una reducción de 8 veces en la obstrucción. En algunos casos, una solución de citrato dextrosa ácido (ACD), tal como el EDTA, que quela el calcio en el plasma sanguíneo, tiene un efecto similar. La quelación del calcio también puede reducir las vías de coagulación (a la izquierda del diagrama).In some cases, a dominant obstruction mechanism is the activity of calcium-dependent integrins on platelet surfaces, the interaction of which can lead to platelet aggregation. In some cases, calcium-dependent integrins are one of the dominant contributors to platelet-induced obstruction. In some cases, increasing the EDTA concentration from 1 mM to 5 mM can result in an 8-fold reduction in obstruction. In some cases, an acid citrate dextrose (ACD) solution, such as EDTA, that chelates calcium in blood plasma, has a similar effect. Chelation of calcium can also reduce clotting pathways (on the left in the diagram).

En algunos casos, un mecanismo de obstrucción dominante se debe a los efectos de la trombina, por ejemplo, activación plaquetaria inducida por trombina. La trombina puede catalizar la conversión de fibrinógeno en fibrina como parte de una cascada de coagulación. En algunos casos, la trombina es un potente agonista activador de plaquetas. La heparina puede ser eficaz para reducir la obstrucción; puede reducir la formación de trombina.In some cases, a dominant obstruction mechanism is due to the effects of thrombin, eg, thrombin-induced platelet activation. Thrombin can catalyze the conversion of fibrinogen to fibrin as part of a coagulation cascade. In some cases, thrombin is a potent platelet activating agonist. Heparin may be effective in reducing the obstruction; can reduce thrombin formation.

En algunos casos, se puede combinar un quelante de calcio con un inhibidor de trombina. En algunos casos, la inhibición de la trombina con el inhibidor directo de trombina PPACK puede conseguir una reducción adicional de 5 veces en la obstrucción además de la que se consigue con una concentración de 5 mM de EDTA.In some cases, a calcium chelator can be combined with a thrombin inhibitor. In some cases, inhibition of thrombin with the direct thrombin inhibitor PPACK can achieve an additional 5-fold reduction in obstruction in addition to that achieved with a concentration of 5 mM EDTA.

La FIG. 36 muestra estos resultados para el caso de una matriz con postes triangulares de 40 um con espacios de 27 um para la separación de leucocitos de la sangre. FIG. 36 shows these results for the case of a matrix with 40 um triangular posts with 27 um spaces for the separation of leukocytes from the blood.

Se han utilizado matrices de desplazamiento lateral determinista (DLD) para concentrar células tumorales circulantes (CTC) en sangre completa diluida a caudales de hasta 10 ml/min con eficiencias de captura superiores al 85 % (K. Loutherback et al., AIP Advances, 2012). En algunos casos, el volumen equivalente de sangre sin diluir que se puede procesar está limitado a 0,3 ml por matriz DLD debido a la obstrucción de la matriz. Dado que la concentración de CTC puede ser tan baja como 1-10 células/ml en muestras clínicas, el aumento del volumen de sangre que puede procesarse con matrices DLD puede permitir la recolección de un número suficiente de CTC para experimentos biológicos o estudios de diagnóstico clínico. Adicionalmente, mediante el impacto de células grandes, tales como CTC, en una corriente de tampón, se pueden utilizar matrices DLD para recoger CTC sin el efecto de fondo de partículas más pequeñas, tales como leucocitos, eritrocitos y plaquetas presentes en la sangre o, libres de plasma, dando como resultado un producto altamente enriquecido o concentrado (véase, por ejemplo, J.A. Davis, et al., PNAS, 2006). Deterministic Lateral Shift (DLD) matrices have been used to concentrate circulating tumor cells (CTC) in diluted whole blood at flow rates up to 10 ml / min with capture efficiencies greater than 85% (K. Loutherback et al., AIP Advances, 2012). In some cases, the equivalent volume of undiluted blood that can be processed is limited to 0.3 ml per DLD matrix due to matrix obstruction. Since the concentration of CTC can be as low as 1-10 cells / ml in clinical samples, the increased volume of blood that can be processed with DLD matrices can allow the collection of a sufficient number of CTCs for biological experiments or diagnostic studies. clinical. Additionally, by impacting large cells, such as CTC, in a buffer stream, DLD matrices can be used to collect CTC without the background effect of smaller particles, such as leukocytes, erythrocytes, and platelets present in the blood or, plasma-free, resulting in a highly enriched or concentrated product (see, for example, JA Davis, et al., PNAS, 2006).

En algunos casos, dos mecanismos biológicos pueden causar la obstrucción de la matriz y estos dos mecanismos pueden inhibirse. En algunos casos, la agregación plaquetaria inducida por cizallamiento es solo un contribuyente minoritario a la obstrucción de la matriz. En algunos casos, comparando la reducción de la obstrucción conseguida por los anticoagulantes quelantes de calcio EDTA y ACD con la conseguida por el inhibidor indirecto de trombina heparina, así como midiendo la reducción de la obstrucción dependiente de la concentración de EDTA, se puede identificar la actividad de las integrinas dependientes de calcio como contribuyente dominante a la obstrucción. En algunos casos, se puede usar la combinación de EDTA con el inhibidor directo de trombina PPACK para identificar la activación plaquetaria inducida por trombina como segundo mecanismo dominante que contribuye a la obstrucción. Usando una combinación de EDTA y PPACK, se puede demostrar una disminución de 40 veces en la obstrucción de la matriz, lo que puede permitir un aumento proporcional en el volumen de sangre procesada. Basándose en datos en un dispositivo de un solo canal (2 mm de anchura), se puede esperar que un chip completo pueda procesar cantidades de sangre >100 ml en 30 minutos sin obstrucciones significativas. Finalmente, en algunos casos, el complejo de integrina glicoproteína 11b/IIIa, que se activa por fuerzas de cizallamiento, se puede inhibir usando el inhibidor de la glicoproteína 11b/IIIa tirofiban para demostrar que la agregación plaquetaria inducida por cizallamiento juega solo un papel minoritario en la obstrucción de la matriz.In some cases, two biological mechanisms can cause matrix obstruction, and these two mechanisms can be inhibited. In some cases, shear-induced platelet aggregation is only a minor contributor to matrix obstruction. In some cases, by comparing the reduction in obstruction achieved by the calcium-chelating anticoagulants EDTA and ACD with that achieved by the indirect thrombin inhibitor heparin, as well as by measuring the concentration-dependent reduction in obstruction of EDTA, the activity of calcium-dependent integrins as a dominant contributor to obstruction. In some cases, the combination of EDTA with the direct thrombin inhibitor PPACK can be used to identify thrombin-induced platelet activation as the second dominant mechanism contributing to obstruction. Using a combination of EDTA and PPACK, a 40-fold decrease in womb obstruction can be demonstrated, which may allow for a proportional increase in the volume of blood processed. Based on data in a single channel device (2 mm wide), it can be expected that a complete chip can process amounts of blood> 100 ml in 30 minutes without significant obstruction. Finally, in some cases, the integrin glycoprotein 11b / IIIa complex, which is activated by shear forces, can be inhibited using the glycoprotein 11b / IIIa inhibitor tirofiban to demonstrate that shear-induced platelet aggregation plays only a minor role. in the obstruction of the womb.

En algunos casos, una muestra puede comprender uno o más aditivos. En algunos casos, se añade un agente quelante a la muestra. En algunos casos, el agente quelante comprende un agente quelante de calcio. En algunos casos, el agente quelante comprende acetilacetona, aerobactina, aminoetiletanolamina, ácido aminopolicarboxílico, ATMP, BAPTA, BDTH2, benzotriazol, Bipiridina, 2,2'-Bipiridina, 4,4'-Bipiridina, 1,2-Bis(dimetilarsino)benceno, 1,2-Bis(difenilfosfino)etano, 1,2-Bis(difenilfosfino)etano, Catecol, Chelex 100, Ácido cítrico, Corrole, Éter de corona, 18-Corona-6, Criptando, 2.2.2-Criptando, Cyclen, Deferasirox, Deferiprona, Deferoxamina, Dexrazoxano, Trans-1,2-diaminociclohexano, 1,2-Diaminopropano, Dibenzoilmetano, Dietilentriamina, Diglyme, Ácido 2,3-dihidroxibenzoico, Dimercaprol, Ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfónico, Ácido dimercaptosuccínico, Dimetilglioxima, DIOP, Difeniletilendiamina, DOTA, DOTA-TATE, DTPMP, EDDH, EDDS, EDTMP, EGTA, 1,2-Etanoditiol, Etilendiaimina, Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), Ácido etidrónico, Porfirinas extendidas, Ferricromo, Fluo-4, Fura-2, Ácido glucónico, Glioxal-bis(mesitilimina), Hexafluoroacetilacetona, Ácido homocítrico, Ácido iminodiacético, Indo-1, Acetilacetonatos de metales, Complejo de ditioleno metálico, Corona de metal, Ácido nitrilotriacético, Pendetide, Penicilamina, Ácido pentético, Phanephos, Fenantrolina, O-fenilendiamina, Fosfonato, Fitoquelatina, Ácido poliaspártico, Porfina, Porfirina, 3-Piridilnicotinamida, 4-Piridilnicotinamida, Dietilditiocarbamato de sodio, Poliaspartato de sodio, Terpiridina, Tetrametiletilendiamina, Tetrafenilporfirina, 1,4,7-Triazaciclononano, Trietilentetramina, Trifos, Citrato trisódico o 1,4,7-tritiaciclononano. En algunos casos, dichos uno o más aditivos es Kolliphor®, por ejemplo, Kolliphor® P 188 (poli(etilenglicol)-bloque-poli(propilenglicol)-bloque-poli(etilenglicol). En algunos casos, dicho uno o más aditivos comprenden Kolliphor® ELP, EL, RH 40, CS12, CS20, CS B, CS S, CS A, CS L, TPGS, PS 60, PS 80, HS15, P 407, P 237 o P 338. La concentración de un Kolliphor puede ser de aproximadamente el 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 %. Por ejemplo, Kolliphor® puede ser Sigma K4894-500 g o Sigma P5556.In some cases, a sample may comprise one or more additives. In some cases, a chelating agent is added to the sample. In some cases, the chelating agent comprises a calcium chelating agent. In some cases, the chelating agent comprises acetylacetone, aerobactin, aminoethylethanolamine, aminopolycarboxylic acid, ATMP, BAPTA, BDTH2, benzotriazole, Bipyridine, 2,2'-Bipyridine, 4,4'-Bipyridine, 1,2-Bis (dimethylarsine) benzene , 1,2-Bis (diphenylphosphino) ethane, 1,2-Bis (diphenylphosphino) ethane, Catechol, Chelex 100, Citric acid, Corrole, Crown ether, 18-Crown-6, Cryptan, 2.2.2-Cryptan, Cyclen , Deferasirox, Deferiprone, Deferoxamine, Dexrazoxane, Trans-1,2-diaminocyclohexane, 1,2-Diaminopropane, Dibenzoylmethane, Diethylenetriamine, Diglyme, 2,3-Dihydroxybenzoic Acid, Dimercaprol, 2,3-Dimercapto-1-Propanesulfonic Acid, Dimercaptosuccinic, Dimethylglyoxime, DIOP, Diphenylethylenediamine, DOTA, DOTA-TATE, DTPMP, EDDH, EDDS, EDTMP, EGTA, 1,2-Ethanedithiol, Ethylenediaimine, Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA), Ethidronic Acid, Extended Ferricrins, Ferricrins Fura-2, Gluconic acid, Glioxal-bis (mesitylimine), Hexafluoroacetylacetone, Homocytric acid, Iminodi acid Acetic acid, Indo-1, Metal acetylacetonates, Metal dithiolene complex, Metal crown, Nitrilotriacetic acid, Pendetide, Penicillamine, Pentatic acid, Phanephos, Phenanthroline, O-phenylenediamine, Phosphonate, Phytochelatin, Polyaspartic acid, Porphine, Porphyrin, 3- Pyridylnicotinamide, 4-Pyridylnicotinamide, Sodium Diethyldithiocarbamate, Sodium Polyaspartate, Terpyridine, Tetramethylethylenediamine, Tetraphenylporphyrin, 1,4,7-Triazacyclononane, Triethylenetetramine, Triphos, Trisodium Citlonrate or 1,4,7-trithiaziclonrate. In some cases, said one or more additives is Kolliphor®, for example, Kolliphor® P 188 (poly (ethylene glycol) -block-poly (propylene glycol) -block-poly (ethylene glycol). Further additives include Kolliphor® ELP, EL, RH 40, CS12, CS20, CS B, CS S, CS A, CS L, TPGS, PS 60, PS 80, HS15, P 407, P 237 or P 338. The concentration of a Kolliphor can be approximately 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, or 5%. For example, Kolliphor® can be Sigma K4894-500 g or Sigma P5556.

En algunos casos, la muestra, por ejemplo, una muestra de sangre, se recoge en un tubo que comprende K²EDTA o K³EDTA.In some cases, the sample, for example a blood sample, is collected in a tube comprising K ² EDTA or K ³ EDTA.

En algunos casos, la muestra comprende un agente que reduce la actividad de las integrinas dependientes de calcio. En algunos casos, la muestra comprende un agente que reduce la formación de trombina dependiente del calcio. In some cases, the sample comprises an agent that reduces the activity of calcium-dependent integrins. In some cases, the sample comprises an agent that reduces calcium-dependent thrombin formation.

En algunos casos, un agente que quela calcio comprende citrato dextrosa ácido (ACD). La concentración final de ACD en una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre, puede ser del 10 %.In some cases, a calcium chelator comprises acid citrate dextrose (ACD). The final concentration of ACD in a sample, for example a blood sample, can be 10%.

En algunos casos, el agente quelante es EDTA. En algunos casos, el agente quelante de calcio es EDTA. En algunos casos, la concentración final del agente quelante en la muestra es al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1.5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5 o 20 mM. En algunos casos, la concentración final de EDTA en la muestra es al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 mM. En algunos casos, la concentración de EDTA es de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 7 mM, o de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 6 mM.In some cases, the chelating agent is EDTA. In some cases, the calcium chelating agent is EDTA. In some cases, the final concentration of the chelating agent in the sample is at least 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0, 9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17, 5, 18, 18.5, 19, 19.5, or 20 mM. In some cases, the final concentration of EDTA in the sample is at least 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 , 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9 , 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17 , 5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24 or 25 mM. In some cases, the EDTA concentration is from about 2mM to about 7mM, or from about 3mM to about 6mM.

En algunos casos, se añaden uno o más inhibidores de trombina a una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre. En algunos casos, el inhibidor de trombina es un inhibidor directo de trombina. En algunos casos, el inhibidor directo de trombina es un inhibidor de trombina bivalente. En algunos casos, el inhibidor directo de trombina es un inhibidor de trombina univalente. En algunos casos, el inhibidor directo de trombina es un inhibidor alostérico. Un inhibidor directo de trombina bivalente puede ser hirudina, bivalirudina, lepirudina o desirudina. Un inhibidor directo de trombina univalente puede ser argatrobán, melagatrán, ximelagatrán o dabigatrán. Un inhibidor directo de trombina alostérico puede ser un aptámero de ADN, dímero de benzofurano, trímero de benzofurano o lignina polimérica. En algunos casos, un inhibidor directo de trombina es PPACK (D-Phe-Pro-Arg-CMK).In some cases, one or more thrombin inhibitors are added to a sample, for example a blood sample. In some cases, the thrombin inhibitor is a direct thrombin inhibitor. In some cases, the direct thrombin inhibitor is a bivalent thrombin inhibitor. In some cases, the direct thrombin inhibitor is a univalent thrombin inhibitor. In some cases, the direct thrombin inhibitor is an allosteric inhibitor. A direct bivalent thrombin inhibitor can be hirudin, bivalirudin, lepirudin, or desirudin. A direct univalent thrombin inhibitor can be argatroban, melagatran, ximelagatran, or dabigatran. A direct allosteric thrombin inhibitor can be a DNA aptamer, benzofuran dimer, benzofuran trimer, or polymeric lignin. In some cases, a direct thrombin inhibitor is PPACK (D-Phe-Pro-Arg-CMK).

En algunos casos, el inhibidor de trombina es PPACK (D-Phe-Pro-Arg-CMK), clorhidrato de benzamidina, p-APMSF, clorhidrato de p-APMSF, clorhidrato de TLCK, inhibidor de uPA, diclorhidrato de PPACK o diclorhidrato de PPACK biotinilado. En algunos casos, la heparina es un inhibidor de trombina.In some cases, the thrombin inhibitor is PPACK (D-Phe-Pro-Arg-CMK), benzamidine hydrochloride, p-APMSF, p-APMSF hydrochloride, TLCK hydrochloride, uPA inhibitor, PPACK dihydrochloride or dihydrochloride. Biotinylated PPACK. In some cases, heparin is a thrombin inhibitor.

En algunos casos, la concentración final del inhibidor de trombina, por ejemplo, inhibidor directo de trombina en una muestra es al menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13.5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 o 400 |jM. En algunos casos, la concentración final de un inhibidor de trombina en una muestra es de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 j M, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 j M.In some cases, the final concentration of the thrombin inhibitor, for example, direct thrombin inhibitor in a sample is at least 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5 , 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5 , 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 , 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125 , 150, 175, 200, 250, 300, 350 or 400 | j M. in some cases, the final concentration of thrombin inhibitor in a sample is about 30 to about 50 j M, or about 20 to about 60 j M.

En algunos casos, la concentración final de PPACK en una muestra es al menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6.5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 o 400 j M. En algunos casos, la concentración final de PPACK en una muestra es de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 j M o de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 j M.In some cases, the final concentration of PPACK in a sample is at least 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7 , 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15 , 5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 , 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 , 350 or 400 µM. In some cases, the final concentration of PPACK in a sample is from about 30 to about 50 µM or from about 20 to about 60 µM.

En algunos casos, se añaden a la muestra un agente quelante y un inhibidor de trombina. En algunos casos, se añaden a la muestra un agente quelante de calcio y un inhibidor de trombina. En algunos casos, se añaden a la muestra un agente quelante y un inhibidor de trombina y la muestra se diluye al menos 3 veces.In some cases, a chelating agent and a thrombin inhibitor are added to the sample. In some cases, a calcium chelating agent and a thrombin inhibitor are added to the sample. In some cases, a chelating agent and a thrombin inhibitor are added to the sample and the sample is diluted at least 3 times.

En algunos casos, la muestra comprende EDTA y PPACK. En algunos casos, la muestra comprende EDTA a una concentración de aproximadamente 5 mM y PPACK a una concentración de aproximadamente 40 j M. En algunos casos, una muestra de sangre comprende EDTA a una concentración de aproximadamente 5 mM y PPACK a una concentración de aproximadamente 40 j M.In some cases, the sample comprises EDTA and PPACK. In some cases, the sample comprises EDTA at a concentration of approximately 5 mM and PPACK at a concentration of approximately 40 μM. In some cases, a blood sample comprises EDTA at a concentration of approximately 5 mM and PPACK at a concentration of approximately 40 j M.

En algunos casos, la muestra de sangre se diluye aproximadamente 3 veces y la muestra de sangre diluida comprende EDTA y PPACK. En algunos casos, la muestra de sangre se diluye aproximadamente 3 veces y la muestra de sangre diluida comprende EDTA a una concentración de aproximadamente 5 mM y PPACK a una concentración de aproximadamente 40 j M. In some cases, the blood sample is diluted approximately 3 times and the diluted blood sample comprises EDTA and PPACK. In some cases, the blood sample is diluted approximately 3-fold and the diluted blood sample comprises EDTA at a concentration of approximately 5 mM and PPACK at a concentration of approximately 40 µM.

En algunos casos, una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre, comprende uno o más aditivos, por ejemplo, fluoruro de sodio (NaF), heparina, EDTA o citrato de sodio. En algunos casos, un aditivo es un agente anticoagulante o antiplaquetario, por ejemplo, clopidogrel, prasugrel, ticagrelor, ticlopidina, argatrobán, bivalirudina, dalteparina, enoxaparina, fondaparinux, heparina, solución heparínica de lavado, lepirudina, anagrelida, apixabán, aspirina, aspirina/dipiridamol, cilostazol, dabigatrán, dipiridamol, batroxobina, hementina, rivaroxabán, warfarina o uroquinasa.In some cases, a sample, for example a blood sample, comprises one or more additives, for example sodium fluoride (NaF), heparin, EDTA or sodium citrate. In some cases, an additive is an anticoagulant or antiplatelet agent, for example, clopidogrel, prasugrel, ticagrelor, ticlopidine, argatroban, bivalirudin, dalteparin, enoxaparin, fondaparinux, heparin, heparin wash, lepirudin, aspirin, anagrelin, aspirin, aspirin / dipyridamole, cilostazol, dabigatran, dipyridamole, batroxobin, hementin, rivaroxaban, warfarin, or urokinase.

En algunos casos, el anticoagulante es un antitrómbico, fibrinolítico o trombolítico.In some cases, the anticoagulant is an antithrombic, fibrinolytic, or thrombolytic.

En algunos casos, la sangre completa se diluye con PBS 1x con EDTA 2 mM y BSA al 0,5%. En algunos casos, la obstrucción en el dispositivo y los sistemas de la presente invención puede reducirse o evitarse reduciendo el volumen de la muestra introducida en los dispositivos y sistemas. Por ejemplo, la obstrucción se puede reducir o prevenir reduciendo el volumen de la muestra a no más de 150, 140, 130, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 o 1 pl. En algunos casos, la muestra introducida en un dispositivo o sistema puede tener un volumen no mayor que 1, 2, 3, 4, 5,In some cases, whole blood is diluted with 1x PBS with 2 mM EDTA and 0.5% BSA. In some cases, clogging in the device and systems of the present invention can be reduced or avoided by reducing the volume of sample introduced into the devices and systems. For example, clogging can be reduced or prevented by reducing the sample volume to no more than 150, 140, 130, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, or 1 pl. In some cases, the sample introduced into a device or system may have a volume no greater than 1, 2, 3, 4, 5,

6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,

39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,

70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100,70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100,

101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,

124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146,124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146,

147, 148, 149 o 150 pl. En un caso particular, la muestra introducida en los dispositivos y sistemas puede tener un volumen no mayor que 100 pl.147, 148, 149 or 150 pl. In a particular case, the sample introduced into the devices and systems may have a volume no greater than 100 µl.

F. Volúmenes de muestraF. Sample volumes

Las muestras se pueden aplicar a los dispositivos descritos en el presente documento, por ejemplo, dispositivos con matrices ordenadas de obstáculos, por ejemplo, dispositivos de desplazamiento lateral determinista (DLD). El volumen de muestra que puede aplicarse a un dispositivo y/o procesarse por un dispositivo puede ser al menos 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,7, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5,The samples can be applied to the devices described herein, eg devices with ordered arrays of obstacles, eg deterministic lateral displacement devices (DLD). The sample volume that can be applied to a device and / or processed by a device can be at least 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.7, 0 .08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2 , 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5,

7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20,7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20,

21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,

52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,

83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,

550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 ml.550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 or 3000 ml.

El volumen de muestra que puede aplicarse a un dispositivo y/o procesarse por un dispositivo puede ser menor queThe sample volume that can be applied to a device and / or processed by a device can be less than

0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,7, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5,0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.7, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0, 4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5,

5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5,5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5,

19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,

49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,

80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350,80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350,

400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 ml. En algunos casos, el volumen de muestra que se puede aplicar a un dispositivo y/o procesar por un dispositivo puede no ser superior a 150 pl. Por ejemplo, el volumen de muestra que puede aplicarse a un dispositivo y/o procesarse por un dispositivo puede no ser mayor que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 or 3000 ml. In some cases, the sample volume that can be applied to a device and / or processed by a device may not exceed 150 µl. For example, the sample volume that can be applied to a device and / or processed by a device may not be greater than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 , 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,

63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,

94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118,94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118,

119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141,119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141,

142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150 pl. En un caso particular, el volumen de muestra que se puede aplicar a un dispositivo y/o procesar por un dispositivo puede no ser superior a 100 pl.142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 or 150 pl. In a particular case, the sample volume that can be applied to a device and / or processed by a device may not exceed 100 µl.

El volumen de muestra que se puede aplicar a un dispositivo y/o procesar por un dispositivo puede ser de aproximadamente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,7, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2,The sample volume that can be applied to a device and / or processed by a device can be approximately 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.7, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2,

2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5,2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10, 5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5,

17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,

75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200,

250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 ml. En algunos casos, el volumen de muestra que se puede aplicar a un dispositivo y/o procesar por un dispositivo puede ser aproximadamente250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 or 3000 ml. In some cases, the sample volume that can be applied to a device and / or processed by a device can be approximately

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 55, 56, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,

79, 80, 81, 82, 83, 86, 87, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140,

144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150 pl. En un caso particular, el volumen de muestra que se puede aplicar a un dispositivo y/o procesar por un dispositivo puede ser de aproximadamente 100 pl.144, 145, 146, 147, 148, 149 or 150 pl. In a particular case, the sample volume that can be applied to a device and / or process by a device can be approximately 100 pl.

El volumen de muestra que se puede aplicar al dispositivo y/o procesar por un dispositivo puede ser de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 ml, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 20 ml, de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 50 ml, de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 100 ml, de aproximadamente 20 ml a aproximadamente 100 ml, de aproximadamente 100 ml a aproximadamente 300 ml, de aproximadamente 100 ml a aproximadamente 1000 ml, de aproximadamente 100 ml a aproximadamente 500 ml o de aproximadamente 100 ml a aproximadamente 3000 ml.The sample volume that can be applied to the device and / or processed by a device can be from about 0.1 to about 1 ml, from about 1 to about 10 ml, from about 10 ml to about 20 ml, from about 10 ml to about 50ml, from about 10ml to about 100ml, from about 20ml to about 100ml, from about 100ml to about 300ml, from about 100ml to about 1000ml, from about 100ml to about 500ml or from about 100 ml to about 3000 ml.

G. Concentración de partículas en una muestraG. Concentration of particles in a sample

En algunos casos, la concentración de primeras partículas, segundas partículas o partículas totales en una muestra es aproximadamente 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 o 1011 por ml de muestra.In some cases, the concentration of first particles, second particles, or total particles in a sample is approximately 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, or 1011 per ml of sample.

En algunos casos, la concentración de primeras partículas, segundas partículas o partículas totales en una muestra es menor que 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 o 1011 por ml de muestra.In some cases, the concentration of first particles, second particles, or total particles in a sample is less than 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, or 1011 per ml of sample.

En algunos casos, la concentración de primeras partículas, segundas partículas o partículas totales en una muestra es al menos 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 o 1011 por ml de mu In some cases, the concentration of first particles, second particles, or total particles in a sample is at least 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, or 1011 per ml of mu

IV. DispositivosIV. Devices

Se describen dispositivos ilustrativos para separar partículas basándose en el tamaño, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N.° 7.150.812, 7.318.902, 7.472.794, 7.735.652, 7.988.840, 8.021.614, 8.282.799, 8.304.230, 8.579.117 y en la Publicación PCT N.° WO2012094642. Las partículas y muestras descritas en el presente documento pueden aplicarse a dispositivos descritos en el presente documento para conseguir una separación basada en el tamaño, por ejemplo, una separación basada en el tamaño de alto rendimiento.Illustrative devices for separating particles based on size are described, for example, in US Patent Nos. 7,150,812, 7,318,902, 7,472,794, 7,735,652, 7,988,840, 8,021,614, 8,282. 799, 8,304,230, 8,579,117 and in PCT Publication No. WO2012094642. The particles and samples described herein can be applied to devices described herein to achieve size-based separation, eg, high-throughput size-based separation.

La divulgación se refiere, en general, al campo de la separación de partículas tales como esferas, células, virus y moléculas. La divulgación se refiere a la separación de partículas basándose en su comportamiento de flujo en un campo de obstáculos lleno de fluido en el que el transporte advectivo de partículas por un fluido en movimiento supera los efectos del transporte difusivo de partículas.The disclosure generally relates to the field of separation of particles such as spheres, cells, viruses and molecules. The disclosure relates to the separation of particles based on their flow behavior in a fluid-filled obstacle field in which the advective transport of particles by a moving fluid overcomes the effects of diffusive transport of particles.

La separación de partículas por tamaño o masa puede ser una técnica analítica y preparativa fundamental en biología, medicina, química e industria. Los métodos incluyen electroforesis en gel, fraccionamiento de flujo de campo, cromatografía de sedimentación y exclusión por tamaño. Se ha descrito la separación de partículas y biopolímeros cargados utilizando matrices de obstáculos a través las cuales pasan partículas bajo la influencia del flujo de fluido o un campo eléctrico aplicado. La separación de partículas mediante estos dispositivos de matriz de obstáculos puede estar mediada por interacciones entre los biopolímeros y los obstáculos y por el comportamiento de flujo del fluido que pasa entre los obstáculos.Particle size or mass separation can be a fundamental analytical and preparative technique in biology, medicine, chemistry, and industry. Methods include gel electrophoresis, field flow fractionation, sedimentation chromatography, and size exclusion. Separation of charged particles and biopolymers has been described using matrices of obstacles through which particles pass under the influence of fluid flow or an applied electric field. Particle separation by these obstacle matrix devices can be mediated by interactions between the biopolymers and the obstacles and by the flow behavior of the fluid passing between the obstacles.

Se ha desvelado una diversidad de matrices de tamizado microfabricadas para separar partículas (Chou et. al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 13762; Han, et al., 2000, Science 288:1026; Huang et al., 2002, Nat. Biotechnol. 20:1048;A variety of microfabricated sieving matrices have been disclosed to separate particles (Chou et. Al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 13762; Han, et al., 2000, Science 288: 1026; Huang et al. ., 2002, Nat. Biotechnol. 20: 1048;

Turner et al., 2002, Phys. Rev. Lett. 88(12):128103; Huang et al., 2002, Phys. Rev. Lett. 89:178301; Patente de Estados Unidos N.° 5.427.663; Patente de Estados Unidos N.° 7.150.812; Patente de Estados Unidos N.° 6.881.317). Estas matrices pueden depender de la fabricación precisa de pequeñas características (por ejemplo, postes u obstáculos en un canal microfluídico). La precisión con la que se pueden fabricar pequeñas características puede estar limitada en todos los métodos de microfabricación, especialmente a medida que disminuye el tamaño de las características. La resistencia y rigidez de los materiales en los que se fabrican las pequeñas características también pueden limitar la utilidad práctica del dispositivo fabricado. Adicionalmente, el pequeño tamaño de los espacios entre los obstáculos en dichas matrices puede hacer que las matrices sean susceptibles de obstruirse por partículas demasiado grandes para caber entre los obstáculos. La fabricación a escala micrométrica y nanométrica también puede requerir técnicas de fabricación del estado de la técnica, y los dispositivos fabricados utilizando dichos métodos pueden tener un coste elevado.Turner et al., 2002, Phys. Rev. Lett. 88 (12): 128103; Huang et al., 2002, Phys. Rev. Lett. 89: 178301; US Patent No. 5,427,663; US Patent No. 7,150,812; US Patent No. 6,881,317). These arrays can depend on the precise fabrication of small features (eg, posts or obstacles in a microfluidic channel). The precision with which small features can be fabricated may be limited in all microfabrication methods, especially as feature size decreases. The strength and rigidity of the materials in which the small features are made can also limit the practical utility of the manufactured device. Additionally, the small size of the gaps between the obstacles in such matrices can make the matrices susceptible to being clogged by particles too large to fit between the obstacles. Manufacture at the micrometer and nanometer scale may also require state-of-the-art fabrication techniques, and devices manufactured using such methods may be expensive.

Se han descrito dispositivos de matriz de impacto (también conocida como "matriz de obstáculos") y se explica su funcionamiento básico, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 7.150.812. Haciendo referencia a las FIG. 3 y 4 de la Patente de Estados Unidos N.° 7.150.812, una matriz de impacto puede funcionar esencialmente segregando partículas que pasan a través de una matriz (generalmente, una matriz ordenada periódicamente) de obstáculos, produciéndose la segregación entre partículas que siguen la "dirección de la matriz" que se desplaza de la dirección del flujo general de fluido o de la dirección de un campo aplicado.Impact matrix devices (also known as "obstacle matrix") have been described and their basic operation explained, for example, in US Patent No. 7,150,812. Referring to FIGS. 3 and 4 of U.S. Patent No. 7,150,812, an impact matrix can function essentially by segregating particles that pass through a matrix (generally, a periodically ordered matrix) of obstacles, resulting in segregation between particles that follow the "direction of the matrix" that is displaced from the direction of general fluid flow or the direction of an applied field.

Al nivel de flujo entre dos obstáculos adyacentes en condiciones de número de Reynold relativamente bajo, el flujo de fluido puede ocurrir de forma laminar. Considerando el flujo volumétrico entre dos obstáculos en capas hipotéticas (por ejemplo, modelando el flujo considerando múltiples tubos de flujo adyacentes de igual flujo volumétrico entre los obstáculos, como se muestra en la FIG. 8 de la Patente de Estados Unidos N.° 7.150.812), la probabilidad de que el At the level of flow between two adjacent obstacles under relatively low Reynold number conditions, fluid flow can occur in a laminar fashion. Considering the volumetric flow between two hypothetical layered obstacles (for example, modeling the flow considering multiple adjacent flow tubes of equal volumetric flow between the obstacles, as shown in FIG. 8 of US Patent No. 7,150. 812), the probability that the

fluido de una capa pase por un lado u otro del siguiente obstáculo (es decir, aguas abajo) puede calcularse mediante métodos convencionales (véase, por ejemplo, Inglis et al., 2006, Lab Chip 6: 655-658). Para una matriz ordenada de obstáculos desplazados de la dirección del flujo general de fluido, la disposición de los obstáculos puede definir una dirección de la matriz correspondiente a la dirección en la que se desplaza la mayoría de las capas de fluido entre dos obstáculos. Una minoría de capas de fluido puede desplazarse alrededor del obstáculo aguas abajo en una dirección diferente a la dirección de la matriz.Fluid from a layer passing one side or the other of the next obstacle (ie downstream) can be calculated by conventional methods (see, for example, Inglis et al., 2006, Lab Chip 6: 655-658). For an ordered matrix of obstacles displaced from the direction of the general fluid flow, the arrangement of the obstacles may define a direction of the matrix corresponding to the direction in which the majority of the fluid layers are displaced between two obstacles. A minority of fluid layers can travel around the downstream obstacle in a direction other than the direction of the die.

La trayectoria que puede tomar una partícula que pasa entre los dos obstáculos puede depender del flujo del fluido en las capas ocupadas por la partícula. Conceptualmente, para una partícula que tiene un tamaño igual a una de las capas de fluido hipotéticas descritas en el párrafo anterior, la partícula puede seguir la trayectoria de la capa de fluido en la que se encuentra, a menos que se difunda a una capa diferente. Para partículas más grandes que una sola capa de fluido, la partícula puede seguir la trayectoria correspondiente a la mayoría de las capas de fluido que actúan sobre ella. Las partículas que tienen un tamaño mayor que el doble de la suma de los espesores de la minoría de capas que se desplazan alrededor de un obstáculo aguas abajo en una dirección distinta a la dirección de la matriz pueden ser afectadas por más capas fluidas que se mueven en la dirección de la matriz, lo que significa que dichas partículas se desplazarán en la dirección de la matriz. Este concepto también se ilustra en las FIG. 5-11 de la Patente de Estados Unidos N.° 7.150.812. Por tanto, puede haber un "tamaño crítico" para las partículas que pasan entre dos obstáculos en dicha matriz, de modo que las partículas que tienen un tamaño mayor a ese tamaño crítico pueden desplazarse en la dirección de la matriz, en lugar de en la dirección del flujo general de fluido y las partículas que tienen un tamaño menor que el tamaño crítico pueden desplazarse en la dirección del flujo general de fluido. Las partículas que tienen un tamaño exactamente igual al tamaño crítico pueden tener la misma probabilidad de fluir en cualquiera de las dos direcciones. Al hacer funcionar un dispositivo de este tipo con un número de Peclet alto (es decir, de manera que el transporte advectivo de partículas por capas de fluido supere en gran medida a las partículas difusivas entre capas), se pueden ignorar los efectos de la difusión de partículas entre capas de fluidos.The path that a particle can take that passes between the two obstacles may depend on the flow of the fluid in the layers occupied by the particle. Conceptually, for a particle that is equal in size to one of the hypothetical fluid layers described in the previous paragraph, the particle can follow the path of the fluid layer it is in, unless it diffuses to a different layer . For particles larger than a single fluid layer, the particle can follow the path corresponding to most fluid layers acting on it. Particles that are larger than twice the sum of the thickness of the minority of layers that travel around a downstream obstacle in a direction other than the direction of the matrix can be affected by more fluid layers that move. in the direction of the matrix, which means that said particles will move in the direction of the matrix. This concept is also illustrated in FIGS. 5-11 of US Patent No. 7,150,812. Thus, there may be a "critical size" for the particles that pass between two obstacles in such a matrix, so that particles that are larger than that critical size can move in the direction of the matrix, rather than in the direction of the matrix. direction of general fluid flow and particles that are smaller than the critical size can move in the direction of general fluid flow. Particles that are exactly equal to the critical size can be equally likely to flow in either direction. By operating such a device with a high Peclet number (i.e. such that advective transport of particles through fluid layers greatly outweighs diffusive particles between layers), the effects of diffusion can be ignored. of particles between fluid layers.

A. Matrices de impactoA. Impact matrices

En el presente documento se describen formas de estructurar y hacer funcionar matrices de obstáculos para separar partículas. En algunas matrices de obstáculos, los obstáculos tienen formas y están dispuestos de modo que el perfil del flujo de fluido a través de los espacios entre obstáculos adyacentes sea simétrico con respecto a la línea central del espacio. La geometría de los obstáculos adyacentes puede ser tal que las porciones de los obstáculos que definen el espacio sean simétricas con respecto al eje del espacio que se extiende en la dirección del flujo general de fluido. La velocidad o el perfil volumétrico del flujo de fluido a través de dichos espacios puede ser aproximadamente parabólico a través del espacio, siendo la velocidad y el flujo del fluido cero en la superficie de cada obstáculo que define el espacio (asumiendo condiciones de flujo sin deslizamiento) y alcanzando un valor máximo en el punto central del espacio. Al ser parabólico el perfil, una capa de fluido de una anchura dada adyacente a uno de los obstáculos que definen el espacio puede contener una proporción igual de flujo de fluido que una capa de fluido de la misma anchura adyacente al otro obstáculo que define el espacio, lo que significa que el tamaño crítico de las partículas que "impactan" durante el paso a través del espacio es igual independientemente del obstáculo al que se acerque la partícula. Ways to structure and operate obstacle arrays to separate particles are described herein. In some obstacle arrays, the obstacles are shaped and arranged so that the profile of fluid flow through the gaps between adjacent obstacles is symmetrical with respect to the center line of the gap. The geometry of the adjacent obstacles may be such that the portions of the obstacles defining the space are symmetrical with respect to the axis of the space extending in the direction of the general fluid flow. The velocity or volumetric profile of fluid flow through such spaces can be approximately parabolic through the space, with the velocity and flow of the fluid being zero at the surface of each obstacle defining the space (assuming no-slip flow conditions ) and reaching a maximum value at the center point of the space. As the profile is parabolic, a fluid layer of a given width adjacent to one of the obstacles defining the space can contain an equal proportion of fluid flow as a fluid layer of the same width adjacent to the other obstacle defining the space. , which means that the critical size of the particles that "hit" during the passage through space is the same regardless of the obstacle the particle approaches.

En algunos casos, el rendimiento de segregación de tamaños de partícula de una matriz de obstáculos se puede mejorar dando forma y disponiendo los obstáculos de manera que las porciones de los obstáculos adyacentes que desvían el flujo de fluido hacia un espacio entre obstáculos no sean simétricas con respecto al eje del espacio que se extiende en la dirección del flujo general de fluido. Tal falta de simetría de flujo en el espacio puede conducir a un perfil de flujo de fluido no simétrico dentro del espacio. La concentración del flujo de fluido hacia un lado de un espacio (es decir, una consecuencia del perfil de flujo de fluido no simétrico a través del espacio) puede reducir el tamaño crítico de las partículas que se introducen para desplazarse en la dirección de la matriz, en lugar de en la dirección del flujo general de fluido. Esto puede ser así porque la falta de simetría del perfil de flujo puede causar diferencias entre la anchura de la capa de flujo adyacente a un obstáculo que contiene una proporción seleccionada de flujo de fluido a través del espacio y la anchura de la capa de flujo que contiene la misma proporción de flujo de fluido y que es adyacente al otro obstáculo que define el espacio. Las diferentes anchuras de las capas de fluido adyacentes a los obstáculos definen un espacio que presenta dos tamaños críticos de partículas diferentes. Una partícula que atraviesa el espacio puede impactar (es decir, desplazarse en la dirección de la matriz, en lugar de en la dirección del flujo general de fluido) si excede el tamaño crítico de la capa de fluido en la que se transporta. Por tanto, es posible que una partícula que atraviesa un espacio que tiene un perfil de flujo no simétrico impacte si la partícula se desplaza en la capa de fluido adyacente a un obstáculo, pero no debe impactar si se desplaza en la capa de fluido adyacente al otro obstáculo que define el espacio.In some cases, the particle size segregation performance of an obstacle matrix can be improved by shaping and arranging the obstacles so that the portions of the adjacent obstacles that divert fluid flow into an obstacle gap are not symmetrical with relative to the axis of space extending in the direction of general fluid flow. Such lack of flow symmetry in space can lead to a non-symmetrical fluid flow profile within the space. Concentrating fluid flow to one side of a space (i.e., a consequence of the non-symmetric fluid flow profile through the space) can reduce the critical size of the particles that are introduced to move in the direction of the matrix , rather than in the direction of general fluid flow. This may be so because the lack of symmetry of the flow profile can cause differences between the width of the flow layer adjacent to an obstacle containing a selected proportion of fluid flow through the space and the width of the flow layer that it contains the same proportion of fluid flow and it is adjacent to the other obstacle that defines the space. The different widths of the fluid layers adjacent to the obstacles define a space that has two different critical particle sizes. A particle passing through space can impact (i.e., move in the direction of the matrix, rather than in the direction of general fluid flow) if it exceeds the critical size of the fluid layer in which it is transported. Therefore, it is possible that a particle passing through a space that has a non-symmetric flow profile will impact if the particle moves in the fluid layer adjacent to an obstacle, but should not impact if it moves in the fluid layer adjacent to the obstacle. another obstacle that defines the space.

Las partículas que atraviesan una matriz de obstáculos pasan a través de múltiples espacios entre obstáculos y tienen múltiples oportunidades de impactar. Cuando una partícula atraviesa un espacio que tiene un perfil de flujo no simétrico, la partícula puede impactar si el tamaño de la partícula excede los tamaños críticos (diferentes) definidos por las capas de flujo adyacentes a los dos obstáculos que definen el espacio. Sin embargo, la partícula a veces puede impactar si el tamaño de la partícula excede el tamaño crítico definido por la capa de flujo adyacente a uno de los dos obstáculos, pero no excede el tamaño crítico definido por la capa de flujo adyacente al otro obstáculo. En algunos casos, las partículas que no exceden el tamaño crítico definido por la capa de flujo adyacente a cualquiera de los obstáculos no pueden impactar. Hay al menos dos implicaciones que se derivan de esta observación. Particles that traverse an obstacle matrix pass through multiple gaps between obstacles and have multiple opportunities to impact. When a particle traverses a space that has a non-symmetric flow profile, the particle can impact if the particle size exceeds the critical (different) sizes defined by the flow layers adjacent to the two obstacles that define the space. However, the particle can sometimes impact if the particle size exceeds the critical size defined by the flow layer adjacent to one of the two obstacles, but does not exceed the critical size defined by the flow layer adjacent to the other obstacle. In some cases, particles that do not exceed the critical size defined by the flow layer adjacent to any of the obstacles cannot impact. There are at least two implications that follow from this observation.

En primer lugar, en un matriz de obstáculos en el que los obstáculos definen huecos que tienen un perfil de flujo no simétrico, las partículas que tienen un tamaño que excede el más pequeño de los dos tamaños críticos definidos por las capas de flujo adyacentes a los obstáculos se pueden separar de las partículas que tienen un tamaño más pequeño que el tamaño crítico más pequeño. El tamaño crítico definido por un espacio se puede disminuir alterando la simetría de flujo a través del espacio sin disminuir necesariamente el tamaño del espacio ("G" en la FIG. 1). La disminución del tamaño del espacio puede aumentar el coste y la dificultad de producir la matriz. Por el contrario, para un tamaño crítico dado, el tamaño del espacio que define ese tamaño crítico puede aumentarse alterando la simetría del flujo a través del espacio. Como es más probable que se obstruyan los espacios más pequeños con respecto a los más grandes, esta disposición puede mejorar la operatividad de las matrices, lo que permite un mayor rendimiento y una menor probabilidad de obstrucciones.First, in an obstacle matrix in which the obstacles define voids that have a non-symmetric flow profile, the particles that have a size that exceeds the smaller of the two critical sizes defined by the flow layers adjacent to the Obstacles can be separated from particles that are smaller than the smallest critical size. The critical size defined by a space can be decreased by altering the flow symmetry through the space without necessarily decreasing the size of the space ("G" in FIG. 1 ). Decreasing the size of the space can increase the cost and difficulty of producing the die. On the contrary, for a given critical size, the size of the space that defines that critical size can be increased by altering the symmetry of the flow through the space. Since smaller spaces are more likely to clog over larger ones, this arrangement can improve the operability of the dies, allowing for higher throughput and less chance of clogging.

En segundo lugar, en un matriz de obstáculos en la que los obstáculos definen huecos que tienen un perfil de flujo no simétrico, las partículas se pueden separar en tres poblaciones: i) partículas que tienen un tamaño menor que cualquiera de los tamaños críticos definidos por las capas de flujo adyacentes a los obstáculos; ii) partículas que tienen un tamaño intermedio entre los dos tamaños críticos definidos por las capas de flujo adyacentes a los obstáculos; y iii) partículas que tienen un tamaño mayor que cualquiera de los tamaños críticos definidos por las capas de flujo adyacentes a los obstáculos.Second, in an obstacle matrix in which the obstacles define voids that have a non-symmetric flow profile, the particles can be separated into three populations: i) particles that are smaller than any of the critical sizes defined by flow layers adjacent to obstacles; ii) particles that are intermediate in size between the two critical sizes defined by the flow layers adjacent to the obstacles; and iii) particles that are larger than any of the critical sizes defined by the flow layers adjacent to the obstacles.

La disminución de la redondez de los bordes de los obstáculos que definen los espacios puede mejorar el rendimiento de segregación del tamaño de partículas de una matriz de obstáculos. A modo de ejemplo, las matrices de obstáculos que tienen una sección transversal triangular con vértices agudos pueden presentar un tamaño crítico de partícula menor que las matrices de obstáculos triangulares de idéntico tamaño e idénticos espacios que tienen vértices redondeados.Decreasing the roundness of the obstacle edges defining the gaps can improve the particle size segregation performance of an obstacle matrix. By way of example, obstacle matrices having a triangular cross section with sharp vertices may have a smaller critical particle size than triangular obstacle matrices of identical size and identical spaces having rounded vertices.

Por tanto, mediante la agudización de los bordes de los obstáculos que definen espacios en una matriz de obstáculos, el tamaño crítico de las partículas desviadas en la dirección de la matriz bajo la influencia del flujo general de fluido puede disminuirse sin reducir necesariamente el tamaño de los obstáculos. Por el contrario, los obstáculos que tienen bordes más agudos se pueden espaciar más que, pero teniendo aún propiedades de segregación de partículas equivalentes a, obstáculos de idéntico tamaño con bordes menos agudos.Thus, by sharpening the edges of obstacles that define spaces in an obstacle matrix, the critical size of the particles deflected in the direction of the matrix under the influence of the general fluid flow can be decreased without necessarily reducing the size of the obstacles. obstacles. In contrast, obstacles having sharper edges can be further spaced than, but still having particle segregation properties equivalent to, identical size obstacles with less sharp edges.

La conformación de los obstáculos en una matriz de obstáculos se realiza de tal manera que la geometría de los obstáculos con los que se encuentra el fluido que fluye a través de la matriz en una dirección difiera (y defina un tamaño crítico de partícula diferente) de la geometría de los obstáculos con los que se encuentra el fluido que fluye a través de la matriz en una segunda dirección. Por ejemplo, el fluido que fluye a través de la matriz ilustrada en la FIG.The shaping of obstacles in an obstacle matrix is done in such a way that the geometry of the obstacles encountered by the fluid flowing through the matrix in one direction differs (and defines a different critical particle size) from the geometry of the obstacles encountered by the fluid flowing through the matrix in a second direction. For example, fluid flowing through the matrix illustrated in FIG.

1 en una dirección de izquierda a derecha se encuentra y fluye alrededor de los vértices redondeados de los postes de triángulo rectángulo de la matriz (en esta dirección de flujo, el perfil del flujo de fluido a través de los espacios es asimétrico con respecto al eje de los espacios). Sin embargo, el fluido que fluye a través de la misma matriz en una dirección de derecha a izquierda se encuentra y fluye alrededor de los bordes planos de los postes de triángulo rectángulo de la matriz (en esta dirección de flujo, el perfil del flujo de fluido a través de los espacios es simétrico con respecto al eje de los espacios, siendo esencialmente parabólico).1 in a left-to-right direction meets and flows around the rounded vertices of the right triangle posts of the array (in this flow direction, the profile of fluid flow through the gaps is asymmetric with respect to the axis of the spaces). However, fluid flowing through the same matrix in a right-to-left direction meets and flows around the flat edges of the right triangle poles of the matrix (in this flow direction, the flow profile of fluid through the spaces is symmetric with respect to the axis of the spaces, being essentially parabolic).

B. Matrices de impacto que tienen espacios con perfiles de flujo asimétricosB. Impact matrices that have spaces with asymmetric flow profiles

En el presente documento se describen dispositivos de matriz de impacto que son útiles para segregar partículas por tamaño. En una realización, un dispositivo incluye un cuerpo que define un canal de flujo microfluídico para contener el flujo de fluido. Una matriz de obstáculos se dispone dentro del canal de flujo, de manera que el fluido que fluye a través del canal fluya alrededor de los obstáculos. Los obstáculos se extienden a través del canal de flujo, generalmente estando fijados a, siendo integrales con o siendo colindantes con la superficie del canal de flujo en cada extremo del obstáculo.Described herein are impact matrix devices that are useful for segregating particles by size. In one embodiment, a device includes a body that defines a microfluidic flow channel to contain fluid flow. An obstacle matrix is arranged within the flow channel so that fluid flowing through the channel flows around the obstacles. The obstacles extend through the flow channel, generally being attached to, being integral with or abutting the surface of the flow channel at each end of the obstacle.

Los obstáculos se pueden disponer en filas y columnas, en una configuración tal que las filas definen una dirección de la matriz que difiere de la dirección del flujo de fluido en el canal de flujo en un ángulo de inclinación (e) que tiene una magnitud mayor que cero. El valor máximo operativo de e puede ser 1/3 radianes. El valor de e puede ser 1/5 radianes o menos, y un valor de 1/10 radianes puede ser adecuado en diversas realizaciones de las matrices descritas en el presente documento. Los obstáculos que se encuentran en las columnas definen espacios entre ellos, y el fluido que fluye a través del canal de flujo puede pasar entre estos espacios, en una dirección que es generalmente transversal con respecto a las columnas (es decir, generalmente perpendicular al eje largo de los obstáculos en la columna y generalmente perpendicular a un plano que se extiende a través de los obstáculos en la columna).The obstacles can be arranged in rows and columns, in a configuration such that the rows define a direction of the matrix that differs from the direction of fluid flow in the flow channel by an angle of inclination (e) that has a greater magnitude. than zero. The maximum operating value of e can be 1/3 radians. The value of e may be 1/5 radians or less, and a value of 1/10 radians may be suitable in various embodiments of the matrices described herein. Obstacles in the columns define spaces between them, and fluid flowing through the flow channel can pass between these spaces, in a direction that is generally transverse to the columns (i.e., generally perpendicular to the axis along the obstacles in the column and generally perpendicular to a plane extending through the obstacles in the column).

Los obstáculos pueden tener tales formas que las superficies (aguas arriba de, aguas abajo de, o alrededor del espacio, con respecto a la dirección del flujo general de fluido) de dos obstáculos que definen un espacio están orientadas asimétricamente con respecto al plano que se extiende a través del centro del espacio y que es paralelo a la dirección del flujo general de fluido a través del canal. Es decir, las porciones de los dos obstáculos pueden causar un flujo de fluido asimétrico a través del espacio. El resultado puede ser que el perfil de velocidad del flujo de fluido a través del espacio esté orientado asimétricamente con respecto al plano. Como resultado de esto, el tamaño crítico de partícula para las partículas que pasan a través del espacio adyacente a uno de los obstáculos puede ser diferente del tamaño crítico de partícula para las partículas que pasan a través del espacio adyacente al otro de los obstáculos. Obstacles can have such shapes that the surfaces (upstream of, downstream of, or around the space, with respect to the direction of the general fluid flow) of two obstacles defining a space are oriented asymmetrically with respect to the plane to be seen. extends through the center of space and is parallel to the direction of general fluid flow through the channel. That is, the portions of the two obstacles can cause asymmetric fluid flow through the space. The result may be that the velocity profile of the fluid flow through the space is oriented asymmetrically with respect to the plane. As a result of this, the critical size Particle size for particles passing through the space adjacent to one of the obstacles may be different from the critical particle size for particles passing through the space adjacent to the other obstacle.

Un dispositivo puede estar hecho de cualquiera de los materiales con los que se fabrican típicamente los dispositivos de manipulación de fluidos a micro y nanoescala, entre los que se incluyen silicio, vidrios, plásticos y materiales híbridos. El canal de flujo se puede construir utilizando dos o más piezas que, cuando se ensamblan, forman una cavidad cerrada (preferentemente una que tiene orificios para añadir o retirar fluidos) que tiene los obstáculos dispuestos en su interior. Los obstáculos se pueden fabricar en una o más piezas que se ensamblan para formar el canal de flujo, o se pueden fabricar en forma de un inserto que se intercala entre dos o más piezas que definen los límites del canal de flujo. En la técnica se conocen materiales y métodos para fabricar tales dispositivos.A device can be made from any of the materials that micro- and nanoscale fluid handling devices are typically made from, including silicon, glass, plastics, and hybrid materials. The flow channel can be constructed using two or more pieces that, when assembled, form a closed cavity (preferably one that has holes for adding or removing fluids) that has obstacles arranged within it. The obstacles can be manufactured in one or more pieces that are assembled to form the flow channel, or they can be manufactured in the form of an insert that is sandwiched between two or more pieces that define the limits of the flow channel. Materials and methods for making such devices are known in the art.

En algunos casos, el canal de flujo se puede formar entre dos superficies sustancialmente planas, paralelas, con los obstáculos formados en una de las dos superficies (por ejemplo, por grabado de la superficie para eliminar el material que originalmente rodeaba las partes no grabadas que permanecen como obstáculos). Los obstáculos pueden tener una sección transversal sustancialmente constante a lo largo de su longitud, reconociéndose que las técnicas utilizadas para fabricar los obstáculos pueden limitar la uniformidad de la sección transversal.In some cases, the flow channel can be formed between two substantially planar, parallel surfaces, with obstacles formed on one of the two surfaces (for example, by etching the surface to remove material that originally surrounded the non-etched portions that remain as obstacles). The obstacles may have a substantially constant cross section along their length, it being recognized that the techniques used to manufacture the obstacles may limit the uniformity of the cross section.

Los obstáculos pueden ser cuerpos sólidos que se extienden a través del canal de flujo, en algunos casos, de una cara del canal de flujo a una cara opuesta del canal de flujo. Cuando un obstáculo es integral con (o una extensión de) una de las caras del canal de flujo en un extremo del obstáculo, el otro extremo del obstáculo se puede sellar o presionar contra la cara opuesta del canal de flujo. Un espacio pequeño (preferentemente demasiado pequeño como para acomodar cualquier partícula de interés para un uso previsto) puede ser tolerable entre un extremo de un obstáculo y una cara del canal de flujo, siempre que el espacio no afecte negativamente a la estabilidad estructural del obstáculo o a las propiedades de flujo relevantes del dispositivo. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los obstáculos se definen por una forma de sección transversal (por ejemplo, redonda o triangular). Los métodos para impartir una forma a un obstáculo formado a partir de un material monolítico son bien conocidos (por ejemplo, fotolitografía y diversas técnicas de micromecanizado) y sustancialmente puede utilizarse cualquiera de tales técnicas para fabricar los obstáculos descritos en el presente documento. Los tamaños de los espacios, obstáculos y otras características de las matrices descritas en el presente documento dependen de la identidad y el tamaño de las partículas a manejar y separar en el dispositivo, tal como se describe en otras partes del presente documento. Las dimensiones típicas son del orden de micrómetros o cientos de nanómetros, pero son posibles dimensiones mayores y menores, sujeto a las limitaciones de las técnicas de fabricación.The obstacles can be solid bodies that extend through the flow channel, in some cases from one face of the flow channel to an opposite face of the flow channel. When an obstacle is integral with (or an extension of) one of the faces of the flow channel at one end of the obstacle, the other end of the obstacle can be sealed or pressed against the opposite face of the flow channel. A small space (preferably too small to accommodate any particle of interest for an intended use) may be tolerable between an end of an obstacle and a face of the flow channel, provided that the space does not adversely affect the structural stability of the obstacle or the relevant flow properties of the device. In some embodiments described herein, obstacles are defined by a cross-sectional shape (eg, round or triangular). Methods for imparting a shape to an obstacle formed from a monolithic material are well known (eg, photolithography and various micromachining techniques) and substantially any such technique can be used to fabricate the obstacles described herein. The sizes of the gaps, obstacles and other characteristics of the matrices described herein depend on the identity and size of the particles to be handled and separated in the device, as described elsewhere in this document. Typical dimensions are on the order of micrometers or hundreds of nanometers, but larger and smaller dimensions are possible, subject to the limitations of manufacturing techniques.

Como se describe en el presente documento, se pueden lograr ciertas ventajas formando obstáculos que tengan bordes agudos (es decir, no redondeados), especialmente en la parte más estrecha de un espacio entre dos obstáculos. Para aprovechar los efectos beneficiosos de los bordes agudos, un experto en la materia reconocerá que ciertas técnicas de microfabricación pueden ser preferibles a otras para formar tales bordes. La agudeza de los bordes se puede describir de cualquiera de varias formas. A modo de ejemplo, el radio de curvatura de un borde (por ejemplo, el vértice de un poste triangular) se puede medir o estimar y ese radio se puede comparar con una dimensión característica del obstáculo (por ejemplo, el lado más corto adyacente al vértice de un poste triangular, cuadrado o rectangular, o el radio de un poste redondo que tiene una sección puntiaguda). La agudeza se puede describir, por ejemplo, como una relación entre el radio de curvatura y la dimensión característica. Utilizando postes triangulares equiláteros como ejemplo, las relaciones adecuadas incluyen las que no son mayores de 0,25, y preferentemente no mayores de 0,2.As described herein, certain advantages can be achieved by forming obstacles that have sharp (ie, not rounded) edges, especially in the narrowest part of a space between two obstacles. To take advantage of the beneficial effects of sharp edges, one skilled in the art will recognize that certain microfabrication techniques may be preferable to others for forming such edges. Edge sharpness can be described in any of several ways. As an example, the radius of curvature of an edge (for example, the vertex of a triangular post) can be measured or estimated and that radius can be compared to a characteristic dimension of the obstacle (for example, the shorter side adjacent to the vertex of a triangular, square or rectangular pole, or the radius of a round pole that has a pointed section). Sharpness can be described, for example, as a relationship between the radius of curvature and the characteristic dimension. Using equilateral triangular posts as an example, suitable ratios include those that are not greater than 0.25, and preferably not greater than 0.2.

En algunos casos, el número de obstáculos que existen en una matriz no es crítico, pero los obstáculos pueden ser lo suficientemente numerosos como para que se puedan conseguir las propiedades de separación de partículas de las matrices que se describen en el presente documento. En algunos casos, la distribución y la forma precisas de la matriz no son críticas. en vista de las divulgaciones descritas en el presente documento, un experto en este campo es capaz de diseñar la distribución y el número de obstáculos necesarios para fabricar matrices de impacto capaces de separar partículas, teniendo en cuenta los tamaños e identidades de las partículas a separar, el volumen de fluido en el que están contenidas las partículas a separar, la resistencia y rigidez de los materiales utilizados para fabricar la matriz, la capacidad de presión de los dispositivos de manipulación de fluidos que se utilizarán con la matriz, y otras características de diseño habituales.In some cases, the number of obstacles that exist in a matrix is not critical, but the obstacles may be numerous enough that the particle separation properties of the matrices described herein can be achieved. In some cases, the precise distribution and shape of the matrix is not critical. In view of the disclosures described herein, an expert in this field is able to design the distribution and the number of obstacles necessary to manufacture impact matrices capable of separating particles, taking into account the sizes and identities of the particles to be separated. , the volume of fluid in which the particles to be separated are contained, the strength and rigidity of the materials used to make the matrix, the pressure capacity of the fluid handling devices to be used with the matrix, and other characteristics of usual layout.

Los obstáculos generalmente se pueden organizar en filas y columnas (el uso de los términos filas y columnas no significa ni implica que las filas y columnas sean perpendiculares entre sí). Los obstáculos que generalmente están alineados en una dirección transversal al flujo de fluido en el canal de flujo pueden denominarse obstáculos en una columna. Los obstáculos adyacentes entre sí en una columna pueden definir un espacio a través del cual fluye el fluido. Los obstáculos en las columnas adyacentes se pueden estar desplazados entre sí en un grado caracterizado por un ángulo de inclinación, denominado £ (épsilon). Por tanto, para varias columnas adyacentes entre sí (es decir, varias columnas de obstáculos que se pasan consecutivamente por el flujo de fluido en una sola dirección generalmente transversal a las columnas), los obstáculos correspondientes en las columnas pueden estar desplazados entre sí de modo que los obstáculos correspondientes formen una fila de obstáculos que se extienda en el ángulo £ con respecto a la dirección del flujo de fluido que pasa por las columnas. Se puede seleccionar el ángulo de inclinación y las columnas se pueden espaciar unas de otras de manera que 1/£ (cuando £ se expresa en radianes) sea un número entero, y las columnas de obstáculos se repitan periódicamente. Los obstáculos en una sola columna también pueden estar desplazados entre sí por el mismo ángulo de inclinación o por otro diferente. A modo de ejemplo, las filas y columnas pueden disponerse formando un ángulo de 90 grados entre sí, con las filas y las columnas inclinadas, en relación con la dirección del flujo general de fluido a través del canal de flujo, en el mismo ángulo de £ Obstacles can generally be arranged in rows and columns (the use of the terms rows and columns does not mean or imply that the rows and columns are perpendicular to each other). Obstacles that are generally aligned in a direction transverse to the flow of fluid in the flow channel can be referred to as obstacles in a column. Obstacles adjacent to each other in a column can define a space through which fluid flows. Obstacles in adjacent columns can be offset from one another by a degree characterized by an angle of inclination, termed £ (epsilon). Thus, for several columns adjacent to each other (that is, several columns of obstacles that are consecutively passed by fluid flow in a single direction generally transverse to the columns), the corresponding obstacles in the columns may be offset from each other so that the corresponding obstacles form a row of obstacles extending at angle £ with respect to the direction of fluid flow through the columns. The tilt angle can be selected and the columns can be spaced from each other such that 1 / £ (when £ is expressed in radians) be a whole number, and the obstacle columns repeat periodically. Obstacles in a single column can also be offset from one another by the same or a different angle of inclination. By way of example, the rows and columns may be arranged at a 90 degree angle to each other, with the rows and columns inclined, relative to the direction of general fluid flow through the flow channel, at the same angle of £

Una o más porciones de dos obstáculos que definen un espacio pueden conformarse de tal manera que las porciones de los obstáculos que están aguas arriba de, aguas abajo de, o alrededor (o alguna combinación de estos, con referencia a la dirección del flujo general de fluido a través del canal de flujo) de la parte más estrecha del espacio entre los obstáculos sea asimétrica con respecto al plano que biseca el espacio y es paralelo a la dirección de flujo general de fluido. Tanto para simplificar la fabricación como para ayudar a modelar el comportamiento de la matriz, todos los obstáculos en una matriz pueden ser idénticos en tamaño y forma, aunque no tiene por qué ser así. En algunos casos, todos los obstáculos de una matriz no tienen la misma forma. Adicionalmente, pueden fabricarse matrices que tienen porciones en las que los obstáculos son idénticos entre sí dentro de una sola porción, pero diferentes de los obstáculos en otras porciones.One or more portions of two obstacles defining a space can be shaped such that the portions of the obstacles that are upstream of, downstream of, or around (or some combination of these, with reference to the direction of the general flow of fluid through the flow channel) of the narrowest part of the space between the obstacles is asymmetric with respect to the plane that bisects the space and is parallel to the general direction of fluid flow. Both to simplify manufacturing and to help model matrix behavior, all obstacles in a matrix can be identical in size and shape, but they don't have to. In some cases, all obstacles in a matrix are not the same shape. Additionally, dies can be made having portions in which the obstacles are identical to each other within a single portion, but different from the obstacles in other portions.

La asimetría en una o más porciones de uno o ambos obstáculos que definen un espacio puede conducir a un aumento del flujo de fluido en un lado o en el otro del espacio. Una partícula puede impactar al pasar a través de un espacio únicamente si la partícula excede el tamaño crítico de partícula correspondiente al espacio. El tamaño crítico de partícula se puede determinar por la densidad del flujo de fluido cerca de los límites del espacio (es decir, los bordes de los obstáculos que definen el espacio). El aumento del flujo de fluido en un lado de un espacio (es decir, contra uno de los dos obstáculos que definen la parte más estrecha del espacio) puede intensificar la densidad de flujo cerca de ese lado, reduciendo el tamaño de la partícula que impactará al pasar a través de ese lado del espacio.Asymmetry in one or more portions of one or both of the obstacles defining a space can lead to increased fluid flow on one side or the other of the space. A particle can impact when passing through space only if the particle exceeds the critical particle size for space. The critical particle size can be determined by the density of the fluid flow near the limits of space (that is, the edges of the obstacles that define the space). Increasing fluid flow on one side of a space (that is, against one of the two obstacles that define the narrowest part of the space) can intensify the flux density near that side, reducing the size of the particle that will impact. when passing through that side of space.

En una realización del dispositivo, la forma de cada uno de los múltiples obstáculos en una columna puede ser sustancialmente idéntica y simétrica con respecto al plano que biseca cada uno de los múltiples obstáculos. Es decir, para cualquier columna de obstáculos, la geometría que encuentran las partículas que se desplazan en un fluido que fluye a través de los espacios entre los obstáculos en la columna puede ser idéntica cuando el fluido se desplaza en una primera dirección y cuando el fluido se desplaza en una segunda dirección que está separada de la primera dirección en 180 grados (es decir, fluye en la dirección opuesta).In one embodiment of the device, the shape of each of the multiple obstacles in a column may be substantially identical and symmetrical with respect to the plane bisecting each of the multiple obstacles. That is, for any column of obstacles, the geometry encountered by moving particles in a fluid flowing through the gaps between obstacles in the column can be identical when the fluid is moving in a first direction and when the fluid is moving in a first direction. it travels in a second direction that is 180 degrees apart from the first direction (that is, it flows in the opposite direction).

La geometría que encuentran las partículas que se desplazan en un fluido que fluye a través de los espacios entre los obstáculos en la columna puede ser diferente cuando el fluido se desplaza en una primera dirección, de la geometría que encuentran cuando el fluido se desplaza en una segunda dirección que es diferente de la primera dirección en 90 180 grados. En esta realización, flujo de fluido puede, por ejemplo, oscilar entre las dos direcciones de flujo, y las partículas en el fluido pueden encontrar la diferente geometría de obstáculo. Si estas diferencias geométricas pueden dar como resultado diferentes perfiles de fluido a través de los espacios (compárense los paneles de la FIG. 6B, por ejemplo), entonces el espacio puede presentar diferentes tamaños de partículas críticos en las dos direcciones. Si un espacio presenta diferentes tamaños críticos para el flujo en las dos direcciones, entonces las poblaciones de partículas que impactarán al pasar a través del espacio pueden diferir dependiendo de la dirección del flujo. Esta diferencia en las poblaciones impactadas en las dos direcciones se puede utilizar para efectuar la segregación de las partículas que actúan de manera diferente.The geometry encountered by moving particles in a fluid flowing through the gaps between obstacles in the column may be different when the fluid moves in a first direction, from the geometry encountered when the fluid moves in a first direction. second direction that is different from the first direction by 90 180 degrees. In this embodiment, fluid flow can, for example, oscillate between the two flow directions, and the particles in the fluid can encounter the different obstacle geometry. If these geometric differences can result in different fluid profiles through the gaps (compare the panels of FIG. 6B , for example), then the gap may have different critical particle sizes in the two directions. If a space has different critical sizes for flow in the two directions, then the populations of particles that will impact as they pass through the space may differ depending on the direction of the flow. This difference in the impacted populations in the two directions can be used to effect segregation of particles that act differently.

Por ejemplo, considérese un espacio que presenta un primer tamaño crítico para el flujo general de fluido en una dirección, pero presenta un tamaño crítico diferente para el flujo general de fluido en una segunda dirección. Para el flujo de fluido en la primera dirección, las partículas que tienen un tamaño mayor que el primer tamaño crítico pueden impactar y las partículas que tienen un tamaño menor que el primer tamaño crítico no pueden impactar. Asimismo, para el flujo de fluido en la segunda dirección, las partículas que tienen un tamaño mayor que el segundo tamaño crítico pueden impactar y las partículas que tienen un tamaño menor que el segundo tamaño crítico no pueden impactar. Si el flujo oscila entre la primera y la segunda dirección, entonces las partículas que tienen un tamaño mayor que el primero y el segundo tamaños críticos pueden impactar en ambas direcciones. Asimismo, las partículas que tienen un tamaño menor que el primero y el segundo tamaños críticos no pueden impactar en ninguna dirección. Para estas dos poblaciones de partículas, las oscilaciones de flujo de cantidades aproximadamente iguales en ambas direcciones pueden dejar estas partículas sustancialmente en su posición inicial. Sin embargo, las partículas que tienen un tamaño intermedio entre los dos tamaños críticos pueden impactar cuando el flujo general de fluido es en una dirección, pero no pueden impactar cuando el flujo general de fluido está en la otra dirección. Por tanto, cuando se realizan oscilaciones de flujo de cantidades aproximadamente iguales en ambas direcciones, estas partículas no pueden permanecer en su posición inicial, sino que, en su lugar, pueden haberse desplazado de esa posición original en una cantidad igual a (el tamaño de un obstáculo la distancia del espacio G) x (el número de oscilaciones). De esta manera, estas partículas (las que tienen un tamaño intermedio entre los dos tamaños críticos) se pueden segregar de las otras partículas con las que inicialmente estaban mezcladas.For example, consider a space that has a first critical size for general fluid flow in one direction, but has a different critical size for general fluid flow in a second direction. For fluid flow in the first direction, particles that are larger than the first critical size can impact and particles that are smaller than the first critical size cannot impact. Also, for fluid flow in the second direction, particles that are larger than the second critical size can impact and particles that are smaller than the second critical size cannot impact. If the flow oscillates between the first and second directions, then particles that are larger than the first and second critical sizes can impact in both directions. Also, particles that are smaller than the first and second critical sizes cannot impact in either direction. For these two populations of particles, flow oscillations of approximately equal amounts in both directions can leave these particles substantially in their initial position. However, particles that are intermediate in size between the two critical sizes can impact when the general fluid flow is in one direction, but cannot impact when the general fluid flow is in the other direction. Therefore, when flow oscillations of approximately equal amounts are made in both directions, these particles cannot remain in their initial position, but instead may have moved from that original position by an amount equal to (the size of an obstacle the distance from the space G) x (the number of oscillations). In this way, these particles (those with a size intermediate between the two critical sizes) can be segregated from the other particles with which they were initially mixed.

Cuando la primera y la segunda direcciones difieren 180 grados (es decir, los flujos están en direcciones opuestas), las partículas que tienen un tamaño intermedio entre los dos tamaños críticos se pueden desplazar formando un ángulo de 90 grados con respecto a la dirección del flujo oscilante.When the first and second directions differ 180 degrees (that is, the flows are in opposite directions), the particles that are intermediate in size between the two critical sizes can be displaced at a 90 degree angle with respect to the direction of the flow. oscillating.

El comportamiento de las partículas en una matriz de impacto no es una función de la dirección absoluta en la que se mueven las partículas (o el fluido en el que están suspendidas), sino que más bien puede ser una función de la geometría de la matriz que encuentran las partículas. Como alternativa al funcionamiento de una matriz de impacto con flujo alterno entre la primera y la segunda dirección, se pueden obtener los mismos efectos de desplazamiento de partículas usando el flujo únicamente en la primera dirección aumentando el tamaño de la matriz en dos veces el número de oscilaciones, manteniendo una parte de la matriz en su disposición original, pero alterando la segunda porción de la matriz de modo que la geometría de la matriz sea idéntica a la geometría encontrada por las partículas en el fluido que se mueven en la segunda dirección en la matriz original (aunque el fluido se mueva únicamente en la primera dirección). Usando la matriz ilustrada en la FIG. 1 a modo de ejemplo, se pueden obtener los mismos efectos de desplazamiento sobre las partículas mediante dos oscilaciones de flujo en esta matriz (es decir, dos unidades de flujo de izquierda a derecha y dos unidades de flujo de derecha a izquierda) que se pueden obtener con cuatro unidades de flujo de izquierda a derecha a través de una matriz que tiene cuatro veces la longitud (de izquierda a derecha) de la matriz de la FIG. 1, siempre y cuando dos longitudes de la matriz estén dispuestas como se muestra en la FIG. 1 y dos longitudes de la matriz estén dispuestas como la imagen especular (de izquierda a derecha) de la matriz que se muestra en la FIG. 1.The behavior of the particles in an impact matrix is not a function of the absolute direction in which they are move the particles (or the fluid in which they are suspended), but rather may be a function of the geometry of the matrix that the particles encounter. As an alternative to operating an impact matrix with alternating flow between the first and second directions, the same particle displacement effects can be obtained by using flow only in the first direction by increasing the size of the matrix by twice the number of oscillations, keeping a part of the matrix in its original arrangement, but altering the second portion of the matrix so that the geometry of the matrix is identical to the geometry found by the particles in the fluid moving in the second direction in the original matrix (even though the fluid moves only in the first direction). Using the matrix illustrated in FIG. 1 by way of example, the same displacement effects on the particles can be obtained by two flow oscillations in this matrix (that is, two flow units from left to right and two flow units from right to left) that can be obtain with four units flow from left to right through a matrix that is four times the length (from left to right) of the matrix of FIG. 1 , as long as two lengths of the array are arranged as shown in FIG. 1 and two lengths of the array are arranged as the mirror image (from left to right) of the array shown in FIG. 1 .

En el presente documento se describe un dispositivo microfluídico diseñado para separar objetos basándose en su tamaño físico. Los objetos pueden ser células, biomoléculas, perlas inorgánicas u otros objetos redondos o de otra forma. Los tamaños típicos fraccionados pueden variar de 100 nanómetros a 50 micrómetros; los tamaños más pequeños o más grandes se pueden fraccionar. El uso de estas matrices puede implicar flujos continuos en una dirección, y las partículas pueden separarse de la dirección del flujo formando un ángulo que es una función monótona de su tamaño.Described herein is a microfluidic device designed to separate objects based on their physical size. The objects can be cells, biomolecules, inorganic beads, or other objects, round or otherwise. Typical fractional sizes can range from 100 nanometers to 50 microns; smaller or larger sizes can be split. The use of these matrices can involve continuous flows in one direction, and the particles can be separated from the flow direction at an angle that is a monotonic function of their size.

Al cambiar la forma de los postes de círculos a una forma que es asimétrica con respecto a un eje paralelo al flujo de fluido, se pueden añadir funcionalidades:By changing the shape of the circle posts to a shape that is asymmetric with respect to an axis parallel to the fluid flow, functionalities can be added:

1. El tamaño crítico de partícula para el impacto puede ser diferente según la dirección en la que se mueva una partícula a través de la matriz. Esto se ha verificado experimentalmente con postes de triángulos rectángulos y se extiende a formas arbitrarias que son asimétricas con respecto al eje de flujo.1. The critical particle size for impact can be different depending on the direction a particle moves through the matrix. This has been experimentally verified with right triangle poles and extends to arbitrary shapes that are asymmetric with respect to the flow axis.

2. Con tales diseños, el ángulo de desplazamiento del flujo fluido de partículas puede diseñarse para que no sea monótono, por ejemplo, con un pico a un cierto tamaño de partícula.2. With such designs, the angle of displacement of the fluid flow of particles can be designed to be non-monotonous, eg, peaking at a certain particle size.

Tales matrices de impacto tienen múltiples usos, entre los que se incluyen todos los usos para los que se conocían previamente las matrices de impacto.Such impact matrices have multiple uses, including all the uses for which impact matrices were previously known.

El dispositivo se puede utilizar para separar partículas en una banda de tamaños seleccionada de una mezcla mediante un desplazamiento lateral determinista. El mecanismo de separación puede ser el mismo que el de la matriz de impacto, pero puede funcionar bajo flujo oscilatorio (condiciones CA; es decir, flujo general de fluido que alterna entre dos direcciones) en lugar de flujo continuo (condiciones de CC; es decir, flujo general de fluido en una sola dirección). En el flujo oscilatorio, las partículas de un intervalo de tamaños dado se pueden separar perpendicularmente de una corriente de entrada (perpendicular al eje de flujo alterno cuando los flujos alternos difieren en dirección en 180 grados) sin ningún desplazamiento neto del fluido general o desplazamiento neto de partículas fuera del intervalo deseado. Por tanto, al inyectar una muestra que incluye partículas del intervalo dado en una matriz de obstáculos y posteriormente alternando el flujo de fluido a través de la matriz de obstáculos en direcciones opuestas (es decir, en direcciones separadas entre sí por 180 grados), las partículas que exceden el tamaño crítico en una dirección de flujo pero no exceden el tamaño crítico en la otra dirección del flujo se pueden separar de otras partículas en la muestra por el impacto inducido por la matriz. Estas partículas pueden impactar (y seguir la dirección de la matriz) cuando el fluido fluye en una dirección, pero no impactan (y siguen la dirección del flujo general de fluido) cuando el fluido fluye en la dirección opuesta. Las partículas que no exceden el tamaño crítico en ninguna dirección de flujo no impactarán por la matriz (es decir, seguirán el fluido general en ambas direcciones) y permanecerán con la embolada de muestra. Las partículas que exceden el tamaño crítico en ambas direcciones de flujo impactarán por la matriz (es decir, seguirán la dirección de la matriz) cuando el fluido fluya en una dirección, y también impactarán (es decir, seguirán la dirección de la matriz en la dirección opuesta) cuando el líquido fluya en la dirección opuesta y, por lo tanto, permanecerán con la embolada de muestra.The device can be used to separate particles into a selected size band from a mixture by deterministic side shift. The separation mechanism can be the same as that of the impact matrix, but can operate under oscillatory flow (AC conditions; that is, general fluid flow that alternates between two directions) instead of continuous flow (DC conditions; is i.e. general flow of fluid in only one direction). In oscillatory flow, particles of a given size range can be separated perpendicularly from an input stream (perpendicular to the alternating flow axis when the alternating flows differ in direction by 180 degrees) without any net general fluid displacement or net displacement. of particles outside the desired range. Thus, by injecting a sample that includes particles of the given range into an obstacle matrix and subsequently alternating the flow of fluid through the obstacle matrix in opposite directions (that is, in directions 180 degrees apart from each other), the Particles that exceed the critical size in one flow direction but do not exceed the critical size in the other flow direction can be separated from other particles in the sample by matrix-induced impact. These particles can impact (and follow the direction of the matrix) when fluid flows in one direction, but they do not impact (and follow the direction of general fluid flow) when fluid flows in the opposite direction. Particles that do not exceed the critical size in either flow direction will not impact the matrix (that is, they will follow the general fluid in both directions) and will remain with the sample stroke. Particles that exceed the critical size in both flow directions will impact the matrix (that is, they will follow the direction of the matrix) when the fluid flows in one direction, and they will also impact (that is, they will follow the direction of the matrix in the opposite direction) when the liquid flows in the opposite direction and therefore will remain with the sample stroke.

El tamaño crítico de partícula puede depender de la dirección del flujo del fluido. Se pueden hacer partículas de tamaño intermedio para escalar un dispositivo bajo flujo oscilatorio.The critical particle size can depend on the direction of fluid flow. Intermediate size particles can be made to scale a device under oscillatory flow.

En segundo lugar, en un modo de flujo continuo, se puede inducir a las partículas de un tamaño deseado a moverse hacia un lado de una corriente de fluido, y a las partículas por encima o por debajo de ese tamaño a moverse al otro lado o a permanecer sin ningún desplazamiento. Por lo tanto, la recolección de partículas deseadas puede ser más fácil. En dispositivos convencionales, las partículas por encima de un intervalo deseado también se desplazan desde el flujo de fluido al mismo lado del flujo, de manera que la separación de las partículas deseadas de las que son más grandes y no deseadas puede ser más difícil. En esta realización, los obstáculos que definen diferentes tamaños críticos para el flujo de fluido en direcciones opuestas se emplean en dos configuraciones que son imágenes especulares entre sí. Por ejemplo, haciendo referencia a la FIG. 1, dicha matriz incluiría postes de triángulo rectángulo dispuestos como se muestra en la FIG. 1 (es decir, hipotenusa inclinada desde la parte inferior derecha a la superior izquierda y el ángulo de inclinación £ se extiende desde la horizontal hacia la parte inferior de la figura) y también incluiría postes de triángulo rectángulo dispuestos como aparecerían en un espejo sostenido perpendicularmente en el lado derecho o izquierdo de la matriz que se muestra en la FIG. 1 (es decir, postes de triángulo rectángulo que tienen su hipotenusa inclinada desde la parte superior derecha a la inferior izquierda y el ángulo de inclinación £ se extiende desde la horizontal hacia la parte superior de la figura). La separación de partículas conseguida por el flujo general de fluido en una sola dirección (es decir, de izquierda a derecha o de derecha a izquierda) a través de dicha matriz sería equivalente a un flujo de ida y vuelta a través de la matriz ilustrada en la FlG. 1. Las partículas en el intervalo de tamaños seleccionado pueden impactar y desviarse hacia la parte superior de la matriz (como se muestra en la FIG. 1), mientras que las partículas que tienen tamaños más grandes o más pequeños pueden permanecer en el nivel vertical en el que entran en la matriz (suponiendo que se encuentren aproximadamente el mismo número de obstáculos en cada una de las dos configuraciones).Second, in a continuous flow mode, particles of a desired size can be induced to move to one side of a fluid stream, and particles above or below that size to move to the other side or remain. without any displacement. Therefore, the collection of desired particles can be easier. In conventional devices, particles above a desired range are also shifted from the fluid flow to the same side of the flow, so separating the desired particles from those that are larger and unwanted can be more difficult. In this embodiment, obstacles that define different critical sizes for fluid flow in opposite directions are employed in two configurations that are mirror images of each other. For example, referring to FIG. 1 , such an array would include right triangle posts arranged as shown in FIG. 1 (that is, hypotenuse sloping from lower right to upper right left and the tilt angle £ extends from the horizontal towards the bottom of the figure) and would also include right triangle posts arranged as they would appear in a mirror held perpendicularly to the right or left side of the array shown in FIG . 1 (that is, right triangle poles that have their hypotenuse sloped from the upper right to the lower left and the angle of inclination £ extends from the horizontal towards the upper part of the figure). The separation of particles achieved by the general flow of fluid in a single direction (i.e. left to right or right to left) through said matrix would be equivalent to a round-trip flow through the matrix illustrated in the FlG. 1. Particles in the selected size range can impact and deflect towards the top of the matrix (as shown in FIG. 1), while particles having larger or smaller sizes can remain at the vertical level. where they enter the matrix (assuming roughly the same number of obstacles are encountered in each of the two configurations).

se puede producir una reducción del tamaño crítico de partícula como una relación del espacio, en comparación con los postes circulares, cuando las partículas impactan con bordes agudos. Esto puede permitir un ángulo de separación mayor sin temor de obstruir el dispositivo en separaciones más rápidas.A reduction in critical particle size can occur as a ratio of space, compared to circular posts, when the particles impact with sharp edges. This can allow for a greater angle of separation without fear of clogging the device at faster separations.

Estos desarrollos pueden reducir el área de chip necesaria en comparación con una matriz de impacto de flujo continuo.These developments can reduce the required chip area compared to a continuous flow impact matrix.

Un dispositivo descrito en el presente documento puede ser una matriz de postes microfabricada construida usando fotolitografía convencional. Se puede grabar una sola capa de máscara en silicio o usarse para fabricar una plantilla para el moldeado de PDMS. Habitualmente, las matrices de postes se pueden sellar con un cubreobjetos recubierto de PDMS para proporcionar canales cerrados.A device described herein can be a microfabricated post array constructed using conventional photolithography. A single layer of mask can be etched into silicon or used to fabricate a template for PDMS molding. Typically, the post arrays can be sealed with a PDMS-coated coverslip to provide closed channels.

La operación de flujo oscilatorio puede requerir impulsores e interfaces de control de fluidos más complicados que la operación de flujo continuo.Oscillatory flow operation may require more complicated fluid control drivers and interfaces than continuous flow operation.

La FIG. 11 es una imagen de microscopio electrónico de barrido de postes en una matriz de obstáculos del tipo descrito en el presente documento. Se pusieron postes triangulares isósceles derechos, de 6 micrómetros de lado, en una retícula cuadrada con un espaciado de 10 micrómetros, proporcionando un espacio de aproximadamente 4 micrómetros. La retícula cuadrada se inclinó 5,71 grados (0,1 radianes) con respecto a las paredes laterales del dispositivo para proporcionar la asimetría necesaria. El fluido fluye a lo largo del eje horizontal. FIG. 11 is a scanning electron microscope image of poles in an obstacle matrix of the type described herein. Right isosceles triangular posts, 6 microns on a side, were placed in a square grid with a 10 micron spacing, providing a gap of approximately 4 microns. The square lattice was tilted 5.71 degrees (0.1 radians) from the side walls of the device to provide the necessary asymmetry. The fluid flows along the horizontal axis.

En la FIG. 1, el flujo total de fluido a través de cada espacio se puede dividir en n = 1/£' corrientes de flujo (tubos de corriente), donde n es un número entero. Cada corriente de flujo puede transportar el mismo flujo de fluido, mostrado esquemáticamente en la FIG. 1 para n = 3. Los tubos de corriente pueden separarse mediante líneas de parada, comenzando y terminando cada línea de parada en un poste. Los tubos de corriente cambian sus posiciones cíclicamente de modo que, después de n filas, cada línea de corriente regresa a su posición inicial dentro del espacio. In FIG. 1, the total flow of fluid through each space can be divided into n = 1 / £ 'flow streams (stream tubes), where n is an integer. Each flow stream can carry the same fluid flow, shown schematically in FIG. 1 for n = 3. Stream tubes can be separated by stop lines, each stop line starting and ending at a pole. Stream tubes change their positions cyclically so that after n rows, each stream line returns to its initial position within the space.

La anchura de la corriente más cercana a un poste puede determinar el tamaño crítico de partícula. Si el radio de la partícula es menor que la anchura de la corriente, entonces la trayectoria de la partícula no puede ser perturbada por los postes y desplazarse en la misma dirección del flujo. Si el radio de la partícula es mayor que la anchura de la corriente más cercana, entonces puede desplazarse a través de la línea de parada y su trayectoria puede seguir el eje inclinado de la matriz (es decir, la dirección de la matriz).The width of the stream closest to a pole can determine the critical particle size. If the radius of the particle is less than the width of the stream, then the path of the particle cannot be disturbed by the poles and travel in the same direction of the flow. If the radius of the particle is greater than the width of the nearest stream, then it can travel through the stop line and its path can follow the inclined axis of the matrix (that is, the direction of the matrix).

La anchura de la corriente más cercana al poste se puede determinar asumiendo que el perfil de velocidad a través de un espacio es parabólico, el caso de un flujo completamente desarrollado en un canal rectangular. Dado que cada corriente puede llevar el mismo flujo y hay n corrientes, se puede hacer una integración sobre el perfil de flujo de manera que el flujo a través de una corriente de anchura Dc/2 (Dc es el diámetro crítico de una partícula) más cercana al poste sea igual al flujo total a través del espacio dividido por n. Es decir, la integral de 0 a Dc/2 de u(x) dx (siendo u una función del flujo en cualquier posición x dentro del espacio) es igual a 1/n veces la integral de u(x) dx sobre todo el espacio.The width of the stream closest to the pole can be determined by assuming that the velocity profile through a space is parabolic, the case of a fully developed flow in a rectangular channel. Since each stream can carry the same flux and there are n streams, an integration can be made on the flux profile so that the flux through a stream of width Dc / 2 (Dc is the critical diameter of a particle) plus near the pole equals the total flow through the space divided by n. That is, the integral from 0 to Dc / 2 of u (x) dx (where u is a function of the flow at any position x within space) is equal to 1 / n times the integral of u (x) dx over the entire space.

Por tanto, el tamaño crítico de partícula se puede determinar a partir del perfil de flujo. Para el caso de postes circulares, un perfil de flujo parabólico puede aproximarse mucho al perfil de flujo a través del espacio y el tamaño crítico de partícula se puede determinar analíticamente.Therefore, the critical particle size can be determined from the flow profile. For the case of circular poles, a parabolic flow profile can closely approximate the flow profile through space and the critical particle size can be determined analytically.

La FIG. 4A muestra una simulación numérica del perfil de flujo para una matriz de postes triangulares. En algunos casos, no se puede suponer que el perfil de flujo a través de postes triangulares sea parabólico debido a la simetría rota. Por lo tanto, el perfil de flujo a través del espacio de los postes triangulares se extrajo de la simulación numérica (programa-COMSOL) del flujo a través de una matriz con el mismo tamaño y espaciado que los dispositivos realmente fabricados. FIG. 4A shows a numerical simulation of the flow profile for a triangular pole array. In some cases, the flow profile through triangular poles cannot be assumed to be parabolic due to broken symmetry. Therefore, the flow profile through the space of the triangular posts was extracted from the numerical simulation (program-COMSOL) of the flow through a matrix with the same size and spacing as the devices actually manufactured.

La FIG. 4B ilustra una comparación de los perfiles de flujo de velocidad entre postes circulares y triangulares. Se muestran perfiles de velocidad normalizados a través del espacio entre postes triangulares y circulares. Como se muestra, el perfil de flujo para los postes triangulares es asimétrico con respecto al centro del espacio; fluye más fluido a lo largo del vértice del triángulo que a lo largo del borde plano. FIG. 4B illustrates a comparison of velocity flow profiles between circular and triangular posts. Normalized velocity profiles are shown through the space between triangular and circular posts. As shown, the flow profile for the triangular posts is asymmetric with respect to the center of the space; flows more fluid along the vertex of the triangle than along the flat edge.

Las FIGS. 12-14 ilustran el movimiento de las partículas en una matriz de impacto de trinquete de un tipo descrito en el presente documento. Cuando las partículas se mueven a través de la matriz, el lado del poste con el que interactúan depende de la dirección en la que se muevan en la matriz. En este caso, cuando las partículas se mueven de derecha a izquierda, impactan con el borde plano de los postes triangulares. Cuando las partículas se mueven de izquierda a derecha, impactan con el vértice agudo de los postes triangulares. Por tanto, dado que el perfil de flujo es asimétrico, no se puede esperar que las partículas sigan la misma trayectoria cuando se desplazan en ambas direcciones a través de la matriz. FIGS. 12-14 illustrate particle motion in a ratchet impact matrix of a type described herein. When the particles move through the matrix, the side of the pole they interact with depends on the direction they move in the matrix. In this case, when the particles move from right to left, they hit the flat edge of the triangular posts. As the particles move from left to right, they hit the sharp vertex of the triangular posts. Therefore, since the flow profile is asymmetric, the particles cannot be expected to follow the same path when moving in both directions through the matrix.

En el tamaño crítico de partícula para postes triangulares empleando el mismo tipo de análisis descrito en Inglis et al., 2006, Lab Chip 6: 655-658, la integración se puede producir sobre el perfil de flujo para encontrar la anchura de las corrientes características. Sin embargo, dado que el perfil de flujo es asimétrico con respecto al centro del espacio, la anchura de la corriente y, por tanto, el tamaño crítico de partícula pueden ser diferentes dependiendo de qué lado se examine. Como se muestra en la FIG. 4B, el resultado de la asimetría introducida por los postes triangulares es que el tamaño crítico de partícula puede ser diferente dependiendo de con qué lado del obstáculo triangular interactúan las partículas. Si se mueven a lo largo del vértice agudo, entonces el tamaño crítico de partícula puede ser menor que si se movieran a lo largo del borde plano. En la FIG. 15 se representa el tamaño crítico de partícula frente al ángulo de la matriz (e) en comparación con los postes circulares. El tamaño crítico de partícula para el impacto a lo largo del vértice agudo del triángulo puede ser sustancialmente menor que el de los postes circulares o el borde plano. Esto puede permitir el uso de ángulos de separación mayores sin temor de obstruir los dispositivos. Cuando el diámetro de las partículas es mayor que el tamaño del espacio (G en la FIG. 1), puede haber un riesgo sustancial de que la matriz se obstruya si la densidad de partículas es alta.In the critical particle size for triangular poles using the same type of analysis described in Inglis et al., 2006, Lab Chip 6: 655-658, integration can occur over the flow profile to find the width of the characteristic streams. . However, since the flow profile is asymmetric with respect to the center of space, the width of the stream and thus the critical particle size may be different depending on which side is examined. As shown in FIG. 4B, the result of the asymmetry introduced by the triangular posts is that the critical particle size can be different depending on which side of the triangular obstacle the particles interact with. If they move along the acute vertex, then the critical particle size may be less than if they moved along the flat edge. In FIG. 15 the critical particle size is plotted against the matrix angle (e) compared to circular posts. The critical particle size for impact along the acute apex of the triangle can be substantially less than that of the circular posts or the flat edge. This can allow the use of higher clearance angles without fear of clogging the devices. When the diameter of the particles is greater than the size of the gap (G in FIG. 1), there may be a substantial risk of the matrix clogging if the particle density is high.

Las FIG. 3A-3C ilustran el comportamiento representativo de las partículas en una matriz de impacto de trinquete. Para un dispositivo construido como se muestra en la FIG. 11, se eligieron tres partículas representativas para esta ilustración. Se eligió una partícula (ilustrada en la Figura 3B) más grande que los dos tamaños críticos de partícula (es decir, más grandes que los tamaños críticos de partícula definidos por los flujos de fluido de derecha a izquierda y de izquierda a derecha). Se eligió una partícula (ilustrada en la Figura 3A) que era más pequeña que los dos tamaños críticos de partícula. Finalmente, se eligió una partícula (ilustrada en la Figura 3C) en el intervalo intermedio, es decir, menor que el tamaño crítico de partícula (Df en la Fig. 12) a lo largo del borde plano, pero mayor que el tamaño crítico de partícula (Dv en la Fig. 12) a lo largo del borde agudo. Estas figuras ilustran el comportamiento de las partículas que se colocaron en el dispositivo y se observó su trayectoria bajo flujo oscilatorio. FIGS. 3A-3C illustrate representative behavior of particles in a ratchet impact matrix. For a device constructed as shown in FIG. 11, three representative particles were chosen for this illustration. A particle (illustrated in Figure 3B) larger than the two critical particle sizes was chosen (that is, larger than the critical particle sizes defined by the right-to-left and left-to-right fluid flows). A particle (illustrated in Figure 3A) was chosen that was smaller than the two critical particle sizes. Finally, a particle (illustrated in Figure 3C) was chosen in the intermediate range, that is, smaller than the critical particle size (Df in Fig. 12 ) along the flat edge, but larger than the critical size of particle (Dv in Fig. 12 ) along the sharp edge. These figures illustrate the behavior of the particles that were placed in the device and their trajectory was observed under oscillatory flow.

Partícula grande (FIG. 3B): como la partícula es más grande que el tamaño crítico de partícula en ambos bordes, sigue el eje de inclinación de la matriz (E) en ambas direcciones y no muestra ningún desplazamiento neto bajo flujo oscilatorio.Large particle (FIG. 3B): As the particle is larger than the critical particle size at both edges, it follows the axis of inclination of the matrix (E) in both directions and does not show any net displacement under oscillatory flux.

Partícula pequeña (FIG. 3A): como la partícula es más pequeña que el tamaño crítico de partícula en ambos bordes, sigue la trayectoria del fluido en ambas direcciones y no muestra ningún desplazamiento neto.Small particle (FIG. 3A): Since the particle is smaller than the critical particle size at both edges, it follows the fluid path in both directions and shows no net displacement.

Partícula intermedia (FIG. 3C): Cuando la partícula se mueve hacia la derecha, impacta con el borde plano de los postes triangulares. Como es más pequeña que el tamaño crítico de partícula (D^f), sigue la trayectoria del fluido. Cuando la partícula se mueve hacia la izquierda, impacta con el vértice agudo de los postes triangulares. Como es mayor que el tamaño crítico de partícula en este lado (D^v), sigue el eje de inclinación de la matriz y se desplaza hacia arriba. Como se muestra, bajo flujo oscilatorio, las partículas en el intervalo intermedio se desplazan perpendicularmente a la dirección del flujo. Después de tres ciclos de movimiento de ida y vuelta, el fluido general no se ha desplazado, pero la partícula se ha movido 200 micrómetros.Intermediate particle (FIG. 3C): When the particle moves to the right, it hits the flat edge of the triangular posts. Because it is smaller than the critical particle size (D ^f ), it follows the path of the fluid. As the particle moves to the left, it hits the sharp vertex of the triangular posts. Since it is larger than the critical particle size on this side (D ^v ), it follows the axis of inclination of the matrix and shifts upward. As shown, under oscillatory flow, the particles in the intermediate range move perpendicular to the direction of flow. After three cycles of back and forth motion, the overall fluid has not moved, but the particle has moved 200 microns.

Si los tres tipos de partículas se mezclaran y se colocaran en una sola matriz bajo flujo oscilatorio (es decir, flujo de fluido que oscila entre las direcciones de derecha a izquierda y de izquierda a derecha), las partículas intermedias se desplazarían hacia la parte superior de estas figuras, mientras que las partículas pequeñas y grandes no tendrían ningún movimiento neto.If the three types of particles were mixed and placed in a single matrix under oscillatory flow (that is, fluid flow oscillating between the right-to-left and left-to-right directions), the intermediate particles would move to the top. of these figures, while small and large particles would not have any net motion.

En las FIG. 12-14, se superpusieron representaciones de partículas intermedias, pequeñas y grandes (respectivamente) sobre la simulación numérica de tubos de corriente para mostrar el movimiento de las partículas con mayor claridad. Se eligió un n = 1/e de 3 para permitir que la periodicidad se viera más fácilmente.In FIGS. 12-14, representations of intermediate, small and large particles (respectively) were superimposed on the numerical simulation of stream tubes to show the movement of the particles more clearly. An n = 1 / e of 3 was chosen to allow the periodicity to be more easily seen.

Cuando las partículas intermedias (FIG. 12) se desplazan a lo largo del borde agudo, impactan como es de esperar. Sin embargo, cuando las partículas se desplazan a lo largo del borde plano, su movimiento puede ser diferente del de las partículas pequeñas. Cuando realizan su característico zig para continuar en la misma dirección que el fluido, son demasiado grandes para permanecer en esa corriente que está cerca del vértice agudo y se desplazan a través de la primera línea de parada. El resultado es que su movimiento es periódico en dos filas en lugar de tres. Con cualquier otro ángulo de inclinación, el movimiento puede ser similar y la periodicidad es n-1. El resultado de esta periodicidad n-1 es que las partículas de tamaño intermedio se desplazan realmente contra el ángulo de inclinación del eje. Por tanto, una mezcla de partículas grandes, pequeñas e intermedias se separará en tres corrientes. Las partículas pequeñas pasarán directamente (véase la FIG. 13). Las partículas grandes seguirán el eje de inclinación de la matriz (véase la FIG. 14). Las partículas intermedias seguirán una trayectoria separada que depende de la geometría del poste.When the intermediate particles (FIG. 12 ) travel along the sharp edge, they impact as expected. However, when the particles travel along the flat edge, their motion may be different from that of the small particles. When they perform their characteristic zig to continue in the same direction as the fluid, they are too large to stay in that stream that is near the acute vertex and they travel through the first stop line. The result is that its movement is periodic in two rows instead of three. With any other angle of inclination, the movement can be similar and the periodicity is n-1. The result of this n-1 periodicity is that the intermediate-size particles actually move against the angle of inclination of the axis. Therefore, a mixture of large, small, and intermediate particles will separate into three streams. The particles small ones will pass directly (see FIG. 13 ). Large particles will follow the axis of inclination of the matrix (see FIG. 14 ). Intermediate particles will follow a separate path depending on the geometry of the post.

Las aplicaciones para las que son útiles los dispositivos descritos en el presente documento incluyen las mismas que se describen en la patente de Huang (Patente de Estados Unidos N.° 7.150.812): biotecnología y otras operaciones microfluídicas que implican la separación de partículas.Applications for which the devices described herein are useful include those described in the Huang patent (US Patent No. 7,150,812): biotechnology and other microfluidic operations involving particle separation.

Previamente se ha demostrado el fraccionamiento de flujo continuo de partículas pequeñas en un líquido basado en su tamaño en una "matriz de impacto" de micropostes por desplazamiento lateral determinista (por ejemplo, Huang et al., 2004, Science 304:987-990). Una matriz de impacto de trinquete descrita en el presente documento puede poseer las mismas ventajas del trabajo anterior, pero puede añadir dos nuevas funcionalidades:Continuous flow fractionation of small particles in a liquid based on their size in a deterministic lateral displacement micropost "impact matrix" has previously been demonstrated (eg, Huang et al., 2004, Science 304: 987-990) . A ratchet impact matrix described in this document may have the same advantages as the previous work, but it can add two new functionalities:

En primer lugar, los dispositivos se pueden usar para separar partículas en una banda de tamaños seleccionada de una mezcla por desplazamiento lateral determinista bajo flujo oscilatorio (condiciones de CA) en lugar de flujo continuo (condiciones de c C). En el flujo oscilatorio, las partículas de un intervalo de tamaños dado se pueden separar perpendicularmente de una corriente de entrada (perpendicular al eje de flujo de CA) sin ningún desplazamiento neto del fluido general o partículas fuera del intervalo deseado.First, the devices can be used to separate particles into a selected size band from a deterministic sideshift mixing under oscillatory flow (AC conditions) rather than continuous flow (C C conditions). In oscillatory flow, particles of a given size range can be separated perpendicularly from an input stream (perpendicular to the axis of AC flow) without any net displacement of the general fluid or particles outside the desired range.

En segundo lugar, en modo de flujo continuo, el dispositivo puede presentar un comportamiento trimodal. Se puede inducir a las partículas de un intervalo de tamaños deseado a moverse hacia un lado de una corriente de fluido, y a las partículas por encima o por debajo de ese tamaño a moverse al otro lado o a permanecer sin ningún desplazamiento. Por tanto, la recolección de estas partículas deseadas puede ser más fácil. En dispositivos convencionales, los dispositivos eran bimodales y todas las partículas por encima del intervalo de tamaños deseado se desplazan desde el flujo de fluido al mismo lado del flujo, por lo que la separación de las partículas deseadas de otras más grandes y no deseadas puede requerir múltiples etapas, mientras que la matriz de impacto de trinquete puede requerir solo una.Second, in continuous flow mode, the device can exhibit trimodal behavior. Particles of a desired size range can be induced to move to one side of a fluid stream, and particles above or below that size to move to the other side or remain undisturbed. Therefore, the collection of these desired particles can be easier. In conventional devices, the devices were bimodal and all particles above the desired size range move from the fluid flow to the same side of the flow, so separating the desired particles from larger, unwanted particles may require multiple stages, while the ratchet impact die may require only one.

Como se usan en el presente documento, cada uno de los siguientes términos puede tener el significado asociado con él en esta sección.As used herein, each of the following terms may have the meaning associated with it in this section.

Los términos "matriz de impacto" y "matriz de obstáculos" se utilizan como sinónimos en el presente documento y pueden describir una matriz ordenada de obstáculos que están dispuestos en un canal de flujo a través del cual puede pasar un fluido que porta partículas.The terms "impact matrix" and "obstacle matrix" are used synonymously herein and can describe an ordered matrix of obstacles that are arranged in a flow channel through which a particle-bearing fluid can pass.

Una superficie "sustancialmente plana" puede ser una superficie que se ha hecho aproximadamente tan plana como se puede hacer una superficie en vista de las técnicas de fabricación utilizadas para obtener una superficie plana. En algunos casos, ninguna técnica de fabricación producirá una superficie perfectamente plana. Siempre que las porciones no planas de una superficie no alteren significativamente el comportamiento de los fluidos y las partículas que se mueven en o cerca de la superficie, la superficie puede considerarse sustancialmente plana.A "substantially flat" surface can be a surface that has been made approximately as flat as a surface can be made in view of the manufacturing techniques used to obtain a flat surface. In some cases, no manufacturing technique will produce a perfectly flat surface. As long as non-planar portions of a surface do not significantly alter the behavior of fluids and particles moving on or near the surface, the surface can be considered substantially planar.

En un dispositivo de matriz de impacto, "flujo de fluido" y "flujo general de fluido" se pueden usar como sinónimos para referirse al movimiento macroscópico del fluido en una dirección general a través de un matriz de obstáculos. Estos términos no tienen en cuenta los desplazamientos temporales de las corrientes de fluido para que el fluido se mueva alrededor de un obstáculo para que el fluido continúe moviéndose en la dirección general. En algunos casos, el flujo general de fluido a través de una matriz de obstáculos como se proporciona en el presente documento comprende dos o más corrientes de fluido que fluyen desde una entrada, porción o área de entrada de la matriz a una salida, parte o área de salida de la matriz. Cada una de las dos o más corrientes de fluido pueden fluir paralelas entre sí. Las dos o más corrientes de fluido pueden comprender los mismos o diferentes componentes. Los componentes pueden ser cualquier tampón o reactivo descrito en el presente documento o conocido en la técnica. En algunos casos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 corrientes de fluido fluyen en paralelo desde una entrada o porción o área de entrada de una matriz como se proporciona en el presente documento a una salida o porción o área de salida de la matriz. La corriente de fluido también se puede denominar "tubo de corriente".In an impact matrix device, "fluid flow" and "general fluid flow" can be used synonymously to refer to the macroscopic movement of fluid in a general direction through a matrix of obstacles. These terms do not take into account the temporary displacements of fluid streams for the fluid to move around an obstacle so that the fluid continues to move in the general direction. In some cases, the general flow of fluid through an obstacle matrix as provided herein comprises two or more fluid streams flowing from an inlet, portion, or inlet area of the matrix to an outlet, part, or matrix exit area. Each of the two or more fluid streams can flow parallel to each other. The two or more fluid streams can comprise the same or different components. The components can be any buffer or reagent described herein or known in the art. In some cases, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 fluid streams flow in parallel from one inlet or an inlet portion or area of a die as provided herein to an outlet or outlet portion or area of the die. The fluid stream can also be referred to as a "stream tube".

En un dispositivo de matriz de impacto, el ángulo de inclinación £ puede ser el ángulo entre la dirección del flujo general de fluido y la dirección definida por el alineamiento de filas de obstáculos secuenciales (en la dirección del flujo general de fluido) en la matriz. Este ángulo se ilustra en las FIG. 1, 6 y 11, por ejemplo.In an impact matrix device, the angle of inclination £ can be the angle between the direction of the general flow of fluid and the direction defined by the alignment of rows of sequential obstacles (in the direction of the general flow of fluid) in the matrix . This angle is illustrated in FIGS. 1, 6 and 11 , for example.

En un dispositivo de matriz de impacto, la "dirección de la matriz" puede ser una dirección definida por el alineamiento de filas de obstáculos secuenciales (en la dirección del flujo general de fluido) en la matriz.In an impact die device, the "die direction" can be a direction defined by the alignment of sequential rows of obstacles (in the direction of general fluid flow) in the die.

Un "tamaño crítico" o "tamaño predeterminado" de las partículas que pasan a través de una matriz de obstáculos puede ser un parámetro que describe el límite de tamaño de las partículas que pueden seguir el flujo laminar de fluido más cercano a un lado de un espacio a través del cual se desplazan las partículas cuando el flujo de ese fluido diverge de la mayor parte del flujo de fluido a través del espacio. Las partículas más grandes que el tamaño crítico pueden "impactar" y desviarse de la trayectoria de flujo del fluido más cercano a ese lado del espacio hacia la trayectoria de flujo de la mayor parte del fluido que fluye a través del espacio. En un dispositivo de matriz de impacto, dicha partícula puede desplazarse la distancia de (el tamaño de un obstáculo el tamaño del espacio entre los obstáculos) al pasar a través del espacio y encontrarse con la columna de obstáculos aguas abajo, mientras que las partículas que tienen tamaños inferiores al tamaño crítico (o tamaño predeterminado) no necesariamente se desplazarán así. Cuando un perfil de flujo de fluido a través de un espacio es simétrico con respecto al plano que biseca el espacio en la dirección del flujo general de fluido, el tamaño crítico puede ser idéntico para ambos lados del espacio; sin embargo, cuando el perfil es asimétrico, los tamaños críticos de los dos lados del espacio pueden diferir. Cuando se evalúa una partícula no esférica, su tamaño puede considerarse el volumen de exclusión esférico barrido por la rotación de la partícula alrededor de un centro de gravedad en un fluido, al menos para partículas que se mueven rápidamente en solución. Las características de tamaño de las partículas no esféricas se pueden determinar empíricamente usando una diversidad de métodos conocidos, y tales determinaciones se pueden usar para seleccionar o diseñar matrices de obstáculos apropiadas para usar como se describe en el presente documento. El cálculo, la medición y la estimación de los volúmenes de exclusión para partículas de todo tipo son bien conocidos.A "critical size" or "predetermined size" of the particles that pass through an obstacle matrix can be a parameter that describes the size limit of the particles that can follow the laminar flow of fluid closest to one side of a space through which particles move when the flow of that fluid diverges from most of the fluid flow through space. Particles larger than the critical size can "hit" and deviate from the fluid flow path closest to that side of space into the path of flow of most of the fluid that flows through space. In an impact matrix device, said particle can travel the distance of (the size of an obstacle the size of the space between the obstacles) as it passes through the space and meets the column of obstacles downstream, while the particles that having sizes less than the critical size (or default size) will not necessarily shift as well. When a fluid flow profile through a space is symmetric with respect to the plane that bisects the space in the direction of general fluid flow, the critical size can be identical for both sides of the space; however, when the profile is asymmetric, the critical sizes of the two sides of the space may differ. When evaluating a non-spherical particle, its size can be considered the spherical exclusion volume swept by the rotation of the particle around a center of gravity in a fluid, at least for rapidly moving particles in solution. Non-spherical particle size characteristics can be determined empirically using a variety of known methods, and such determinations can be used to select or design appropriate obstacle matrices for use as described herein. The calculation, measurement and estimation of exclusion volumes for particles of all types are well known.

Una partícula puede "impactar" en una matriz de impacto si, al pasar a través de un espacio y encontrar un obstáculo aguas abajo, la trayectoria general de la partícula sigue la dirección de la matriz de impacto (es decir, se desplaza en el ángulo de inclinación £ con respecto al flujo general de fluido). Una partícula no impacta si su trayectoria general sigue la dirección del flujo general de fluido en esas circunstancias. Conceptualmente, si el flujo a través de un espacio se visualiza como compuesto de múltiples capas individuales de fluido (es decir, tubos de corriente, si se considera una sección transversal de fluido que fluye a través del espacio), una partícula puede "impactar" si la partícula se desplaza por un poste fuera de su tubo de flujo incidente hacia un tubo de flujo adyacente cuando atraviesa un espacio delimitado por el poste.A particle can "impact" an impact matrix if, when passing through a space and encountering an obstacle downstream, the general trajectory of the particle follows the direction of the impact matrix (that is, it moves at the angle inclination £ with respect to the general fluid flow). A particle does not impact if its general path follows the direction of the general fluid flow under those circumstances. Conceptually, if flow through a space is visualized as being composed of multiple individual layers of fluid (ie stream tubes, considering a cross-section of fluid flowing through space), a particle can "impact" if the particle travels down a pole outside its incident flow tube towards an adjacent flow tube when it passes through a space delimited by the pole.

"La dirección del flujo general de fluido" en un dispositivo de matriz de obstáculos puede referirse a la dirección promedio (por ejemplo, Macroscópica) del flujo de fluido a través del dispositivo (es decir, ignorando las desviaciones de flujo locales exigidas por el flujo alrededor de obstáculos en el canal de fluido)"Direction of general fluid flow" in an obstacle matrix device can refer to the average (eg Macroscopic) direction of fluid flow through the device (ie, ignoring local flow deviations demanded by the flow around obstacles in the fluid channel)

C. Un trinquete microfluídico deterministaC. A deterministic microfluidic ratchet

Este ejemplo describe un dispositivo microfluídico en el que la trayectoria de las partículas dentro de un cierto intervalo de tamaños varía con la dirección en la que las partículas se mueven a través del dispositivo. Este efecto de trinquete puede producirse empleando postes o micropostes u obstáculos triangulares en lugar de circulares convencionales en un dispositivo de desplazamiento lateral determinista (DLD) donde una matriz de postes desplaza selectivamente las partículas a medida que se mueven a través de la matriz. Este efecto se puede utilizar después para demostrar una técnica de fraccionamiento en la que las partículas se pueden separar de un tapón de fluido sin ningún movimiento neto del tapón de fluido original. El mecanismo subyacente de este método puede basarse en una distribución asimétrica de la velocidad del fluido a través del espacio entre los postes.This example describes a microfluidic device in which the trajectory of particles within a certain size range varies with the direction in which the particles move through the device. This ratcheting effect can be produced by employing triangular posts or microposts or obstacles rather than conventional circular ones in a deterministic lateral displacement device (DLD) where an array of posts selectively displace the particles as they move through the array. This effect can then be used to demonstrate a fractionation technique in which particles can be separated from a fluid plug without any net movement of the original fluid plug. The underlying mechanism of this method may be based on an asymmetric distribution of fluid velocity through the space between the posts.

Los dispositivos microfluídicos, tales como los que se utilizan en aplicaciones de "lab on a chip", pueden funcionar con un número de Reynolds bajo (un número de Reynolds "bajo" se refiere a un número de Reynolds no mayor que 1, y preferentemente menor, tal como 0,1, 10-3 o menor). En este régimen, el flujo de fluido a través de una geometría arbitraria se puede considerar invariante en el tiempo. La inversión del gradiente de presión aplicado que impulsa el fluido invertirá el campo de flujo porque los efectos de inercia son insignificantes. A un número de Peclet alto (el número de Peclet "alto" puede referirse a un número de Peclet mayor que 1, y preferentemente mucho mayor, tal como 10, 100 o mayor), esto puede ampliarse para decir que los efectos de difusión pueden ignorarse y los objetos en el fluido fluirán de manera determinista a lo largo de un tubo de corriente a menos que haya alguna otra interacción, tal como un desplazamiento por repulsión estérica de la pared de un canal, interrumpa su trayectoria y los mueva a un tubo de corriente adyacente. El grado en el que la trayectoria de las partículas se puede desviar de su trayectoria original puede depender directamente de su tamaño; las partículas más grandes pueden desplazarse más lejos que las partículas más pequeñas y, en consecuencia, pueden seguir diferentes tubos de corriente a medida que avanzan a través del dispositivo. Este fenómeno, que se puede denominar desplazamiento lateral determinista (DLD), se ha utilizado en varios esquemas para realizar separaciones de partículas a microescala.Microfluidic devices, such as those used in "lab on a chip" applications, can operate with a low Reynolds number (a "low" Reynolds number refers to a Reynolds number no greater than 1, and preferably less, such as 0.1, 10-3 or less). In this regime, the flow of fluid through an arbitrary geometry can be considered invariant in time. Reversal of the applied pressure gradient driving the fluid will reverse the flow field because the inertial effects are negligible. At a high Peclet number ("high" Peclet number can refer to a Peclet number greater than 1, and preferably much greater, such as 10, 100 or greater), this can be extended to say that diffusion effects can ignored and objects in the fluid will flow deterministically along a stream tube unless there is some other interaction, such as a steric repulsion shift of a channel wall, interrupt their path and move them into a tube adjacent stream. The degree to which the trajectory of the particles can deviate from their original trajectory can depend directly on their size; Larger particles can travel farther than smaller particles and consequently can follow different stream tubes as they move through the device. This phenomenon, which can be called deterministic lateral displacement (DLD), has been used in various schemes to perform microscale particle separations.

Una "matriz de impacto" puede ser un dispositivo microfluídico que se basa en el desplazamiento lateral determinista (DLD) para separar partículas con alta resolución. Este dispositivo puede depender de la bifurcación asimétrica de corrientes de fluido en una matriz de postes que está inclinada en un ángulo £ (épsilon; típicamente del orden de 0,1 radianes) con respecto a la dirección del flujo total de fluido. El fluido que fluye a través de un espacio se divide alrededor de un poste en la siguiente fila, pasando 1/£ del fluido por el espacio en un lado del siguiente poste, mientras que el otro £ de fluido va por el otro lado del siguiente poste. Como resultado, el movimiento del fluido se puede caracterizar por corrientes 1/£ que recorren posiciones en el espacio, pero se desplaza en línea recta en promedio. Si una partícula suspendida en el fluido es pequeña en comparación con la anchura de una corriente en un espacio, los postes no la afectarán mientras se mueve a través de la matriz y puede viajar en línea recta con el flujo de fluido. Sin embargo, si la partícula es grande en relación con la anchura de una corriente, se puede desplazar a una corriente adyacente cuando la corriente que ocupa está más cerca de un poste mientras se mueve a través de un espacio. Debido a la forma cíclica en que la corriente puede moverse a través de los espacios, este desplazamiento o "impacto" puede ocurrir en cada fila y la partícula puede desplazarse formando un ángulo con respecto al fluido y otras partículas pequeñas. Con un dispositivo suficientemente largo, se puede obtener una separación significativa entre partículas grandes y pequeñas.An "impact matrix" can be a microfluidic device that relies on deterministic lateral displacement (DLD) to separate particles with high resolution. This device may depend on the asymmetric bifurcation of fluid streams in a pole array that is inclined by an angle £ (epsilon; typically on the order of 0.1 radians) with respect to the direction of total fluid flow. Fluid flowing through one space splits around a pole in the next row, with 1 / £ of the fluid passing through the space on one side of the next pole, while the other £ of fluid going the other side of the next post. As a result, fluid motion can be characterized by 1 / £ currents that travel positions in space, but travel in a straight line on average. If a particle suspended in the fluid is small compared to the width of a stream in a space, the poles will not affect it as it moves through the matrix and it can travel in a straight line with the flow of fluid. However, if the particle is large relative to the width of a stream, it can drift into an adjacent stream when the stream it occupies is closer to a pole as it moves through a space. Due to the cyclical way in which the current can move through the spaces, this displacement or "impact" can occur in each row and the particle can move at an angle with respect to the fluid and other particles. little. With a sufficiently long device, a significant separation between large and small particles can be obtained.

La FIG. 2A muestra una imagen fluorescente de lapso de tiempo de una partícula pequeña (perla de poliestireno de 1,1 micrómetros de diámetro) que fluye a través de dicha matriz a una velocidad típica de 100 micrómetros/s. A medida que la partícula avanza, realiza muchos pasos pequeños paralelos al eje de la matriz a medida que se mueve, seguidos de un paso más grande perpendicular al movimiento del fluido (en lo que se denomina "modo en zigzag"), de modo que el movimiento general debe seguir el tapón de fluido que originalmente contenía la partícula. Considerando la imagen de la FIG. 2A, el flujo de fluido realizó un ciclo de ida y vuelta (por inversión de la presión) dos veces. La partícula deshizo su camino, como era de esperar en flujos a bajo número de Reynolds y alto número de Peclet en un dispositivo determinista que no depende de la difusión.FIG. 2A shows a time-lapse fluorescent image of a small particle (polystyrene bead 1.1 microns in diameter) flowing through said array at a typical velocity of 100 microns / s. As the particle advances, it takes many small steps parallel to the axis of the matrix as it moves, followed by one larger step perpendicular to the motion of the fluid (in what is called a "zigzag mode"), such that the overall motion must follow the plug of fluid that originally contained the particle. Considering the image of FIG. 2A, the fluid flow cycled back and forth (by pressure reversal) twice. The particle unraveled, as expected in low Reynolds number, high Peclet number flows in a deterministic device that does not depend on diffusion.

La FIG. 2B muestra una imagen similar pero para una partícula más grande (3,1 micrómetros). En este caso, la partícula sigue claramente el eje de la matriz (es decir, se desplaza en la dirección de la matriz) y no el flujo de fluido. Debido a que la partícula se desplaza de su trayectoria de flujo por los postes en cada fila, esto puede denominarse "modo de impacto". Esta diferencia en la dirección del flujo en función del tamaño de las partículas puede aprovecharse para fabricar dispositivos de fraccionamiento para perlas de poliestireno así como partículas biológicas. Como en la FIG. 2A, la imagen de lapso de tiempo muestra la trayectoria de la partícula durante dos ciclos de flujo hacia adelante y hacia atrás, y nuevamente la trayectoria de las partículas es reversible (es decir, las partículas terminan donde comenzaron).FIG. 2B shows a similar image but for a larger particle (3.1 microns). In this case, the particle clearly follows the axis of the matrix (that is, it moves in the direction of the matrix) and not the fluid flow. Because the particle travels out of its flow path down the posts in each row, this can be called "impact mode." This difference in flow direction as a function of particle size can be used to make fractionating devices for polystyrene beads as well as biological particles. As in FIG. 2A, the time-lapse image shows the path of the particle during two cycles of flow back and forth, and again the path of the particles is reversible (that is, the particles end where they started).

La FIG. 2C muestra el mismo experimento en la misma matriz para una partícula de tamaño intermedio (1,9 micrómetros). Los resultados son muy diferentes a los mostrados en las FIG. 2A y 2B. Esta partícula "zigzaguea" cuando va hacia la derecha (es decir, se mueve de izquierda a derecha) para seguir el flujo de fluido, pero "impacta" cuando va hacia la izquierda para seguir el eje de la matriz de postes. Su trayectoria no se invierte cuando se invierte la dirección del flujo de fluido, con el resultado neto de que tales partículas se separan de un tapón de fluido en una dirección perpendicular cuando el fluido se somete a un flujo oscilatorio.FIG. 2C shows the same experiment on the same matrix for a particle of intermediate size (1.9 microns). The results are very different from those shown in FIGS. 2A and 2B . This particle "zigzags" when it goes to the right (that is, it moves from left to right) to follow the flow of fluid, but it "hits" when it goes to the left to follow the axis of the pole array. Their path is not reversed when the direction of fluid flow is reversed, with the net result that such particles separate from a fluid plug in a perpendicular direction when the fluid is subjected to oscillatory flow.

El desplazamiento de una partícula fuera de un poste puede ser una interacción inherentemente irreversible, pero las trayectorias de las partículas en una matriz de impacto de postes circulares son aparentemente reversibles debido a la simetría. No hay controversia en esta afirmación para las partículas pequeñas que siguen al fluido porque el flujo del fluido tiene que ser reversible en el régimen de bajo número de Reynolds (Re 10e-3 típico para una velocidad del fluido de 100 micrómetros/s y una escala de longitud de 10 micrómetros). Sin embargo, las partículas grandes no siguen al fluido; en cambio, se desplazan de los postes por repulsión estérica, por lo que aunque el fluido puede invertir la dirección, la trayectoria de las partículas que interactúan con los postes no será necesariamente reversible a menos que su interacción con los postes sea simétrica con la dirección del fluido. En el esquema de FIG. 3A, las partículas que se mueven hacia la izquierda se desplazan hacia abajo por la fila superior de postes, mientras que las partículas que se mueven hacia la derecha se desplazan en la misma cantidad por la fila inferior de postes. Sin embargo, si la imagen se gira 180 grados, que es análogo a cambiar la dirección del fluido, la situación cambia exactamente, por lo que el resultado debe ser el mismo en cualquier dirección. Esta rotación funciona porque tanto los puntos de retícula como la forma del poste son invariables bajo una rotación de 180 grados. Como resultado, tanto las partículas grandes como las pequeñas en una matriz de impacto con postes circulares pueden volver sobre sus pasos si el flujo se cambia hacia adelante y hacia atrás.The displacement of a particle off a pole can be an inherently irreversible interaction, but particle trajectories in a circular pole impact matrix are apparently reversible due to symmetry. There is no controversy in this statement for small particles that follow the fluid because the flow of the fluid has to be reversible in the low Reynolds number regime (Re 10e-3 typical for a fluid velocity of 100 micrometers / s and a scale of 10 micron length). However, large particles do not follow the fluid; instead, they displace from the posts by steric repulsion, so although the fluid can reverse direction, the trajectory of the particles interacting with the posts will not necessarily be reversible unless their interaction with the posts is symmetric with the direction. fluid. In the scheme of FIG. 3A, particles moving to the left travel down the top row of posts, while particles moving to the right travel the same amount down the bottom row of posts. However, if the image is rotated 180 degrees, which is analogous to changing the direction of the fluid, the situation changes exactly, so the result should be the same in either direction. This rotation works because both the grid points and the shape of the pole are invariable under 180 degree rotation. As a result, both large and small particles in a circular post impact matrix can retrace their steps if the flow is shifted back and forth.

Las simulaciones numéricas mostraron que el perfil de velocidad a través de un espacio entre postes triangulares se desplazó hacia el lado del espacio con el vértice. El perfil de velocidad del fluido a través de un espacio entre postes depende en gran medida de la geometría local en el espacio. Para el caso de los postes triangulares presentados en el presente documento, donde hay un vértice agudo en la parte inferior y un borde plano en la parte superior, debe esperarse una desviación significativa del perfil de flujo parabólico utilizado para describir el flujo impulsado por presión a través de postes circulares. La FIG. 4A muestra una simulación numérica de la velocidad del fluido en una matriz como la que se utiliza para producir las trayectorias de partículas en la FIG. 2, junto con una sección transversal del perfil de velocidad a través del espacio. La línea se puso a lo largo del espacio más pequeño entre los postes para corresponder con las anchuras de corriente más estrechas donde es más probable que se crucen las líneas de parada. Los vértices del triángulo se redondearon con una curvatura de 500 nm para aproximar el redondeo de una punta aguda que resulta de la litografía óptica. Se observó que el perfil de flujo era invariante bajo cambios en la inclinación de la matriz, por lo que se puede suponer que este perfil de flujo es el perfil de flujo general para postes triangulares dispuestos de esta manera.Numerical simulations showed that the velocity profile through a triangular pole spacing shifted to the side of the space with the vertex. The velocity profile of the fluid through a post spacing is highly dependent on the local geometry in the space. For the case of the triangular poles presented herein, where there is a sharp vertex at the bottom and a flat edge at the top, a significant deviation from the parabolic flow profile used to describe pressure-driven flow at through circular posts. FIG. 4A shows a numerical simulation of fluid velocity in a matrix such as that used to produce the particle trajectories in FIG. 2 , along with a cross section of the velocity profile through space. The line was laid along the smallest space between the posts to correspond to the narrower stream widths where the stop lines are most likely to cross. The vertices of the triangle were rounded with a curvature of 500 nm to approximate the rounding of a sharp point that results from optical lithography. It was observed that the flow profile was invariant under changes in the inclination of the matrix, so it can be assumed that this flow profile is the general flow profile for triangular posts arranged in this way.

La FIG. 4B muestra una comparación entre los perfiles de flujo de los postes triangulares y circulares. Para postes redondos, el perfil es casi parabólico como se esperaba para el flujo de Poiseuille a través de un canal unidimensional infinitamente largo. Para postes triangulares, sin embargo, el perfil de flujo está sesgado hacia la esquina triangular aguda que apunta hacia la corriente de flujo. En otras palabras, las corrientes se agrupan más cerca de este vértice y el tamaño crítico de partícula para que una partícula impacte a través de una línea de parada es menor de lo que sería para una matriz con el mismo tamaño de espacio pero con obstáculos redondos. A lo largo del borde plano, ocurre lo contrario. Debido a que el fluido se desplaza preferentemente a lo largo del vértice, la anchura de la corriente a lo largo del borde plano es mayor que para los postes circulares. El efecto de los postes triangulares es crear dos tamaños de partículas críticos separados, uno para moverse a lo largo del vértice del triángulo y otro para moverse a lo largo del borde plano. Por lo tanto, las partículas entre estos dos tamaños de partícula críticos pueden exhibir un comportamiento diferente dependiendo de la dirección en la que se muevan a través de la matriz. Para mostrar esto, se empleó una técnica utilizada por Inglis et al., 2006, Lab Chip 6: 655-658 para estimar el tamaño crítico de partícula para postes circulares utilizando el perfil de velocidad extraído en lugar de la parábola asumida para postes circulares. FIG. 4B shows a comparison between the flow profiles of the triangular and circular poles. For round posts, the profile is nearly parabolic as expected for Poiseuille flow through an infinitely long one-dimensional channel. For triangular posts, however, the flow profile is skewed towards the sharp triangular corner that points toward the flow stream. In other words, the currents cluster closer to this vertex and the critical particle size for a particle to impact through a stop line is smaller than it would be for a matrix with the same gap size but with round obstacles. . Along the flat edge, the opposite occurs. Because the fluid travels preferentially along the apex, the width of the stream along the flat edge is greater than for circular posts. The effect of the triangular posts is to create two sizes of Separate critical particles, one to move along the vertex of the triangle and one to move along the flat edge. Therefore, particles between these two critical particle sizes can exhibit different behavior depending on the direction in which they move through the matrix. To show this, a technique used by Inglis et al., 2006, Lab Chip 6: 655-658 was employed to estimate the critical particle size for circular posts using the extracted velocity profile instead of the assumed parabola for circular posts.

La FIG. 5 muestra este cálculo del tamaño crítico de partícula como una relación del espacio para el vértice y el plano del triángulo, así como para postes circulares frente al ángulo de inclinación de la matriz. Las partículas que se muestran en la figura dos se muestran como círculos en el gráfico. Muestran una buena concordancia con el comportamiento previsto. La perla de 1,1 micrómetros es más pequeña que los dos tamaños de partículas críticos, por lo que se desplaza con el fluido en ambas direcciones y no muestra ningún desplazamiento neto cuando se realiza un ciclo en la dirección del fluido. La partícula de 3,1 micrómetros es más grande que los dos tamaños de partículas críticos, por lo que se desplaza a lo largo del eje de la matriz en ambas direcciones y no muestra ningún desplazamiento neto cuando se realiza un ciclo en la dirección del fluido. La partícula de 1,9 micrómetros se encuentra entre los dos tamaños de partículas críticos, por lo que se desplaza con el fluido cuando se mueve a lo largo del borde plano del triángulo y con el eje de la matriz cuando se mueve a lo largo del vértice del triángulo. Como resultado, muestra un desplazamiento neto cuando se cicla el flujo de fluido. Esto es característico de un comportamiento de trinquete. Sin desplazamiento neto del fluido, las partículas en el intervalo intermedio de una matriz muestran un desplazamiento neto después de varias oscilaciones del flujo de fluido. Este trinquete se diferencia de otros trinquetes en que el movimiento de trinquete no se produce a lo largo del eje de la fuerza aplicada correspondiente al flujo de fluido en ninguna dirección. En su lugar, es perpendicular al movimiento del fluido. FIG. 5 shows this calculation of the critical particle size as a ratio of the space for the vertex and plane of the triangle, as well as for circular poles versus the angle of inclination of the matrix. The particles shown in figure two are shown as circles on the graph. They show good agreement with the expected behavior. The 1.1 micron bead is smaller than the two critical particle sizes, so it travels with the fluid in both directions and does not show any net displacement when cycled in the fluid direction. The 3.1 micron particle is larger than the two critical particle sizes, so it travels along the matrix axis in both directions and shows no net displacement when cycled in the fluid direction . The 1.9 micron particle is between the two critical particle sizes, so it travels with the fluid as it moves along the flat edge of the triangle and with the axis of the matrix as it moves along the vertex of the triangle. As a result, it shows a net displacement when the fluid flow is cycled. This is characteristic of ratcheting behavior. With no net displacement of the fluid, the particles in the intermediate range of a matrix show a net displacement after several oscillations of the fluid flow. This ratchet differs from other ratchets in that the ratchet movement does not occur along the axis of applied force corresponding to fluid flow in either direction. Instead, it is perpendicular to the movement of the fluid.

Los sistemas y dispositivos de procesamiento celular basados en chips DLD como se describen en el presente documento pueden recuperar todos los subconjuntos de glóbulos blancos (WBC) de la sangre completa con un rendimiento > 90 % sin la necesidad de una etapa de lisis de glóbulos rojos (RBC) separada. El uso de este nuevo método de procesamiento de células basado en chips DLD como se proporciona en el presente documento puede ser aplicable a muchas investigaciones y ensayos de diagnóstico que requieren análisis de una sola célula o aislamiento de células raras, incluida la citometría de flujo, citometría de masas, genómica unicelular, proteómica, metabolómica y una amplia gama de nuevas técnicas en desarrollo. Los métodos, sistemas y dispositivos del presente documento pueden ser una investigación, innovación clínica y comercial que puede interrumpir productivamente el procesamiento celular y puede reemplazar las etapas de lavado convencionales por centrifugación actuales que son omnipresentes en los laboratorios clínicos y de investigación.DLD chip-based cell processing systems and devices as described herein can recover all subsets of white blood cells (WBCs) from whole blood with> 90% yield without the need for a red blood cell lysis step. (RBC) separate. The use of this new DLD chip-based cell processing method as provided herein may be applicable to many research and diagnostic assays that require single cell analysis or rare cell isolation, including flow cytometry, mass cytometry, single cell genomics, proteomics, metabolomics, and a wide range of new techniques in development. The methods, systems and devices herein may be a research, clinical and commercial innovation that can productively disrupt cell processing and can replace current conventional centrifugal washing steps that are ubiquitous in clinical and research laboratories.

También se describe en el presente documento el proceso del chip DLD microfluídico, que puede recoger células de un flujo de fluido en función del tamaño. Una mezcla de fluido y partículas fluye a través de una matriz de micropostes, en la que el eje de micropostes puede estar inclinado formando un pequeño ángulo de unos pocos grados desde la dirección del flujo de fluido. Las partículas por encima de un cierto tamaño crítico (en nuestro caso, los glóbulos blancos (WBC)) pueden "impactar" con los postes para fluir en una dirección a lo largo del eje de la matriz inclinada (por lo tanto, el dispositivo puede denominarse "matriz de impacto"; FIG. 17). Las partículas más pequeñas y moléculas disueltas, tales como glóbulos rojos (RBC), plaquetas, constituyentes del suero solubles y en forma de partículas, Mab y reactivos químicos pueden fluir en línea recta, en promedio, con la corriente de fluido. Por tanto, después de desplazarse a través del chip microfluídico, las células más grandes pueden haber salido y pueden haberse alejado de la corriente de fluido de la mezcla de entrada original y pueden recogerse por separado. El proceso se ha utilizado para retirar una diversidad de objetos de un fluido de entrada, que varían desde grandes oligómeros de ADN (~100 kpb) hasta bacterias E. coli y otras bacterias, plaquetas, glóbulos rojos (RBC) y glóbulos blancos (WBC). El tamaño crítico que determina qué trayectoria siguen las celdas u otros objetos se puede controlar mediante el diseño de la matriz de micropostes (por ejemplo, el tamaño y la forma de los postes, espacios entre postes, ángulo de inclinación del eje). Este no es un proceso de tamizado; las células o partículas varias veces más grandes que el tamaño crítico que determina el impacto (por ejemplo, las células que se van a recoger) pueden fluir a través del dispositivo sin atascarse. La naturaleza de flujo continuo del DLD puede ofrecer la posibilidad de alto rendimiento sin degradar la resolución para un enfoque reproducible, de bajo coste, para lavar glóbulos blancos que se han marcado para citometría de flujo.Also described herein is the microfluidic DLD chip process, which can collect cells from a fluid stream as a function of size. A mixture of fluid and particles flows through a micropost array, in which the axis of microposts may be inclined at a small angle of a few degrees from the direction of fluid flow. Particles above a certain critical size (in our case, the white blood cells (WBC)) can "hit" the posts to flow in one direction along the axis of the inclined matrix (therefore the device can be called "impact matrix"; FIG. 17 ). Smaller particles and dissolved molecules, such as red blood cells (RBC), platelets, soluble and particulate serum constituents, Mabs, and chemical reagents can flow in straight lines, on average, with the fluid stream. Thus, after moving through the microfluidic chip, the larger cells may have exited and may have drifted away from the original input mix fluid stream and may be collected separately. The process has been used to remove a variety of objects from an input fluid, ranging from large DNA oligomers (~ 100 kbp) to E. coli bacteria and other bacteria, platelets, red blood cells (RBCs), and white blood cells (WBCs). ). The critical size that determines which path cells or other objects follow can be controlled by the design of the micropost array (eg, size and shape of posts, spacing between posts, axis tilt angle). This is not a screening process; cells or particles several times larger than the critical size determining the impact (eg, cells to be collected) can flow through the device without clogging. The flow-through nature of DLD may offer the possibility of high throughput without degrading resolution for a low-cost, reproducible approach to washing white blood cells that have been labeled for flow cytometry.

D. Matriz de impacto que emplea postes triangularesD. Impact matrix using triangular posts

Este ejemplo describe matrices microfluídicas que clasifican partículas según el tamaño de acuerdo con el método de desplazamiento lateral determinista (DLD), utilizando postes triangulares en lugar de postes redondos o circulares. Cuando se utilizan postes triangulares en lugar de postes redondos, y los postes triangulares están orientados de manera apropiada (es decir, de manera que las superficies que definen el espacio son asimétricas), se reduce el tamaño crítico para un tamaño de espacio determinado entre los postes. Esto se debe a que la diferente geometría del poste a cada lado del espacio provoca un perfil de flujo asimétrico a través del espacio, desplazándose el flujo hacia el vértice del triángulo. Este cambio en el flujo de fluido reduce la anchura de la corriente que determina el tamaño de partícula crítico. En este ejemplo, se usan tanto el experimento como el modelado para mostrar que el cambio de la forma del poste de circular a triangular da como resultado varias ventajas prácticas con respecto a matrices similares con postes circulares que incluyen un mayor intervalo dinámico y rendimiento. This example describes microfluidic matrices that size particles according to the deterministic lateral displacement (DLD) method, using triangular posts instead of round or circular posts. When triangular posts are used instead of round posts, and the triangular posts are oriented appropriately (i.e. so that the space-defining surfaces are asymmetrical), the critical size is reduced for a given space size between the posts. poles. This is because the different geometry of the post on each side of the space causes an asymmetric flow profile through the space, moving the flow towards the apex of the triangle. This change in fluid flow reduces the width of the stream that determines the critical particle size. In this example, both experiment and modeling are used to show that changing the post shape from circular to triangular results in several practical advantages over similar arrays with circular posts including greater dynamic range and performance.

El desplazamiento lateral determinista puede ser una técnica de separación de partículas en función del tamaño que se basa en el desplazamiento selectivo de partículas por una matriz de obstáculos dispuestos en un fluido que fluye. La FIG.6A ilustra un esquema de los parámetros de matriz relevantes y características importantes de los dispositivos descritos en este ejemplo. La matriz de obstáculos se compone de columnas de postes en donde cada columna adyacente está desplazada una pequeña distancia con respecto a paredes del canal más grandes que dictan la dirección del flujo general de fluido ("FLUIDO" en la FIG. 6A). En este caso, los postes son triángulos equiláteros con una longitud S de lado (al contrario que en la FIG. 6A, S es la longitud del lado, no la distancia desde un vértice del triángulo hasta la base opuesta a ese vértice). Este desplazamiento produce una matriz en la que un eje a lo largo del cual se sitúan los obstáculos está situado formando un ángulo de inclinación £ con respecto a la dirección del flujo de fluido. El ángulo de inclinación se selecciona de manera que la matriz sea periódica después de 1/£ filas. En este caso, el fluido que fluye a través de los espacios entre los postes (la longitud del espacio se denomina G en FIG. 6A) se puede dividir en un número entero de tubos de corriente delineados por líneas de corriente de estancamiento. Restringido por la periodicidad y la dirección del flujo de fluido en promedio, cada uno de estos tubos de corriente lleva el mismo flujo volumétrico.Deterministic lateral displacement can be a size-dependent particle separation technique that relies on the selective displacement of particles through a matrix of obstacles arranged in a flowing fluid. FIG.6A illustrates a schematic of the relevant matrix parameters and important characteristics of the devices described in this example. The obstacle matrix is composed of post columns where each adjacent column is offset a small distance from larger channel walls that dictate the direction of the overall fluid flow ("FLUID" in FIG. 6A ). In this case, the posts are equilateral triangles with a side length S (unlike in FIG. 6A , S is the side length, not the distance from one vertex of the triangle to the base opposite that vertex). This displacement produces a matrix in which an axis along which the obstacles are located is located at an angle of inclination £ with respect to the direction of fluid flow. The angle of inclination is selected so that the matrix is periodic after 1 / £ rows. In this case, the fluid flowing through the gaps between the posts (the length of the gap is denoted G in FIG. 6A ) can be divided into an integer number of stream tubes delineated by stagnant streamlines. Restricted by the periodicity and direction of fluid flow on average, each of these stream tubes carries the same volumetric flow.

Las partículas suspendidas en el fluido exhiben uno de dos comportamientos dependiendo de su tamaño en relación con la anchura del tubo de corriente más cercano al poste a medida que se mueven a través de un espacio. No perturbadas por otros efectos, las partículas pueden seguir aproximadamente los tubos de corriente en el flujo de fluido. Este comportamiento se puede observar para partículas que tienen radios más estrechos que la anchura del tubo de corriente. Estas partículas, mostradas como la partícula inferior y la trayectoria de puntos en la FIG. 6A, no se ven afectadas por los postes y se abren paso a través de la matriz mientras permanecen dentro de los límites de una sola corriente. Como resultado, se desplazan en promedio en la misma dirección que el flujo general de fluido. Las partículas con radios mayores que la anchura del tubo de corriente, indicadas como la partícula superior y la trayectoria de puntos en la FIG. 6A, no caben dentro de un solo tubo de corriente mientras se desplazan a través del espacio. Esas partículas más grandes se desplazan de manera determinista por el poste a través de la línea de corriente de estancamiento hacia el tubo de corriente adyacente. Debido a la forma en que los tubos de corriente pasan por su posición en el espacio, este desplazamiento tendrá lugar en cada columna de postes y la partícula más grande se desplazará a lo largo del eje de la matriz (es decir, en la dirección de la matriz, que difiere de la dirección general del fluido por el ángulo de inclinación E). Este comportamiento binario lleva a los presentes solicitantes a describir un tamaño crítico que separa estos dos comportamientos. Como la mayoría de las veces las partículas a separar se describen por su diámetro, el tamaño crítico se denota como el doble de la anchura del tubo de corriente más cercano al poste en el espacio entre los postes.Particles suspended in the fluid exhibit one of two behaviors depending on their size in relation to the width of the stream tube closest to the pole as they move through a space. Undisturbed by other effects, the particles can roughly follow the stream tubes in the fluid flow. This behavior can be observed for particles that have radii narrower than the width of the stream tube. These particles, shown as the bottom particle and the dotted path in FIG. 6A , are unaffected by the posts and work their way through the matrix while staying within the limits of a single current. As a result, they travel on average in the same direction as the general fluid flow. Particles with radii greater than the width of the stream tube, indicated as the top particle and the dotted path in FIG. 6A , they will not fit inside a single stream tube as they travel through space. Those larger particles deterministically travel down the pole through the stagnant streamline to the adjacent stream tube. Due to the way the stream tubes pass through their position in space, this displacement will take place in each column of poles and the largest particle will travel along the axis of the matrix (that is, in the direction of the matrix, which differs from the general direction of the fluid by the angle of inclination E). This binary behavior leads present applicants to describe a critical size that separates these two behaviors. As most of the time the particles to be separated are described by their diameter, the critical size is denoted as twice the width of the stream tube closest to the pole in the space between the poles.

El cambio de la forma del poste puede tener un fuerte efecto sobre el tamaño de partícula crítico al cambiar la forma del perfil de flujo a través del espacio. Las alteraciones en el perfil del flujo alteran la anchura de los tubos de corriente más cercanos a los postes que definen un espacio. Debido a que el tamaño de partícula crítico puede estar directamente relacionado con estas anchuras, la alteración del perfil de flujo dentro de un espacio también altera el o los tamaños críticos definidos por el espacio. Al cambiar la forma de la sección transversal de los postes de una forma circular a triángulos equiláteros, se puede crear una asimetría en el perfil de flujo a través del espacio que desplaza más flujo de fluido hacia el vértice del triángulo, como se muestra en la Fig. 6B. Esto da como resultado diferentes anchuras de tubo de corriente en la parte superior (adyacente al borde plano de un poste triangular) y en la parte inferior (adyacente al vértice de un poste triangular) del espacio y le da a la matriz dos tamaños de partículas críticos distintos.Changing the shape of the pole can have a strong effect on the critical particle size by changing the shape of the flow profile through space. Alterations in the flow profile alter the width of the stream tubes closest to the poles that define a space. Because the critical particle size can be directly related to these widths, altering the flow profile within a space also alters the critical size (s) defined by the space. By changing the cross-sectional shape of the posts from a circular shape to equilateral triangles, an asymmetry can be created in the flow profile through the space that displaces more fluid flow toward the apex of the triangle, as shown in Fig. Fig. 6B . This results in different stream tube widths at the top (adjacent to the flat edge of a triangular post) and at the bottom (adjacent to the apex of a triangular post) of the space and gives the array two particle sizes different critics.

El cambio en el flujo hacia el vértice del triángulo puede conducir a una anchura reducida del tubo de corriente a lo largo de este borde y, por lo tanto, puede reducir el tamaño de partícula crítico correspondiente a ese tubo de corriente y borde, con respecto a una matriz similar con postes circulares. Esto se demuestra en los dos paneles de la FIG. 6B, que muestra perfiles de flujo simulados numéricamente a través de los espacios. Los dos perfiles de flujo, normalizados con respecto a la anchura del espacio entre los postes y la velocidad máxima, se representan uno al lado del otro con fines comparativos. El fluido que constituye el primer tubo de corriente para el ángulo de inclinación £ = 1/10 se ha sombreado para enfatizar la diferencia en la anchura de corriente, que disminuye desde aproximadamente el 20 % del espacio delimitado por postes circulares a aproximadamente el 15 % del espacio delimitado por postes triangulares. Este cambio es fundamental para la reducción del comportamiento del tamaño crítico de las partículas que presentan los dispositivos con postes triangulares. El perfil de flujo cambiado creado por postes triangulares se puede utilizar para crear un trinquete microfluídico determinista. En la información analizada en este ejemplo, la atención se centra en la mejora de los dispositivos de separación de partículas de flujo continuo y el desplazamiento lateral determinista de las partículas dentro de ellos que se posibilita al cambiar la forma del poste.The change in flux towards the apex of the triangle can lead to a reduced width of the stream tube along this edge and thus may reduce the critical particle size corresponding to that stream tube and edge, with respect to to a similar matrix with circular posts. This is demonstrated in the two panels of FIG. 6B , which shows numerically simulated flow profiles through the gaps. The two flow profiles, normalized with respect to the width of the space between the posts and the maximum velocity, are represented side by side for comparison purposes. The fluid constituting the first stream tube for tilt angle £ = 1/10 has been shaded to emphasize the difference in stream width, which decreases from about 20% of the space bounded by circular poles to about 15% of the space delimited by triangular posts. This change is fundamental for reducing the behavior of the critical size of the particles that the devices with triangular posts present. The changed flow profile created by triangular posts can be used to create a deterministic microfluidic ratchet. In the information discussed in this example, the focus is on improving continuous flow particle separation devices and the deterministic lateral displacement of the particles within them that is enabled by changing the shape of the pole.

La reducción en el tamaño crítico de partícula permitida por los postes triangulares se caracterizó examinando el comportamiento de perlas fluorescentes en matrices con diversas cantidades de inclinación de matriz y comparando los resultados con las predicciones teóricas. La FIG. 7 muestra el comportamiento observado de partículas (desplazadas por la matriz o no desplazadas por la matriz) normalizado con respecto al tamaño del espacio frente a la inclinación de la matriz, así como los tamaños críticos de partículas predichos utilizando el método descrito por Inglis et al., 2006, Lab Chip 6:655-658. Las líneas en FIG. 7 representan el tamaño crítico de partícula predicho para un ángulo de inclinación dado, representando la línea continua las predicciones para matrices con postes triangulares y representando la línea de puntos las predicciones para matrices con postes redondos. Es de esperar que las partículas por encima de la línea se desplacen por la matriz, y no es de esperar que se desplacen las partículas por debajo de la línea. Los datos demostraron que existe un acuerdo razonable con el comportamiento predicho para ángulos de inclinación mayores, mientras que hay alguna desviación en los ángulos de inclinación menos profundos, especialmente en un ángulo de inclinación £ de 1/20 radianes. Esta desviación podría deberse a que el flujo a través de la matriz no es completamente horizontal, lo que tendrá un gran efecto a inclinaciones de la matriz menos profundas, o al redondeo de los bordes de los postes triangulares, que se analizará más adelante en este ejemplo.The reduction in critical particle size allowed by the triangular posts was characterized by examining the behavior of fluorescent beads in arrays with various amounts of array tilt and comparing the results with theoretical predictions. FIG. 7 shows the observed behavior of particles (displaced by the matrix or not displaced by the matrix) normalized with respect to the size of the space versus the inclination of the matrix, as well as the critical sizes of particles predicted using the method described by Inglis et al. ., 2006, Lab Chip 6: 655-658. The lines in FIG. 7 represent the predicted critical particle size for a given inclination angle, with the solid line representing the predictions for arrays with triangular posts and the dotted line representing the predictions for arrays with round posts. It is to be expected that the particles above the line move through the matrix, and particles below the line are not expected to move. The data demonstrated that there is reasonable agreement with the predicted behavior for larger tilt angles, whereas there is some deviation at the shallower tilt angles, especially at a 1/20 radian tilt angle £. This deviation could be due to the flow through the array not being completely horizontal, which will have a great effect at shallower array slopes, or rounding off the edges of triangular posts, which will be discussed later in this example.

Como comparación se ha añadido el comportamiento de partículas predicho para postes circulares, representado por la línea de puntos. Para cualquier ángulo de inclinación práctico (entre 1/5 y 1/100), el tamaño crítico en una matriz con postes triangulares puede ser sustancialmente menor que el tamaño crítico en una matriz similar con postes circulares, ascendiendo la diferencia hasta el 10 % del espacio para los ángulos de inclinación más pronunciados. Estas propiedades permiten separar partículas más pequeñas por una matriz de postes triangulares que las que pueden separarse por una matriz de postes redondos que tiene la misma separación de espacios. Estas propiedades también hacen que la separación de espacios en el caso de los postes triangulares que es necesaria para separar partículas de un tamaño seleccionado sea mayor que la separación de huecos correspondiente en el caso de los postes redondos que sería necesaria para separar las mismas partículas.As a comparison, the predicted particle behavior for circular posts has been added, represented by the dotted line. For any practical angle of inclination (between 1/5 and 1/100), the critical size in a matrix with triangular posts can be substantially less than the critical size in a similar matrix with circular posts, the difference being up to 10% of the room for the steepest lean angles. These properties allow smaller particles to be separated by a matrix of triangular posts than can be separated by a matrix of round posts having the same spacing. These properties also make the gap spacing in the case of triangular posts that is necessary to separate particles of a selected size greater than the corresponding gap spacing in the case of round posts that would be necessary to separate the same particles.

En cualquier caso, un tamaño crítico de partícula reducido como una fracción del espacio puede ser útil para reducir la obstrucción en la matriz. En algunos casos, las muestras biológicas contienen especies con una amplia gama de tamaños. En algunos casos, se pueden utilizar etapas de filtrado o de separación múltiple para garantizar que una matriz siga funcionando. El uso de postes triangulares permite aumentar el tamaño del espacio para un tamaño crítico de partícula determinado y reducir las posibilidades de que se obstruya la matriz. La FIG. 8 ilustra cuánto más grande puede hacerse el espacio entre los postes en función de la inclinación de la matriz. Representada como una relación de los dos espacios para un tamaño crítico de partícula fijo, se puede ver una mejora mínima del 20 % al aumentar el tamaño del espacio a medida que se reduce la inclinación, con una relación de 1,25 para un ángulo de inclinación de 1/4 y una relación de 1,94 para un ángulo de inclinación de 1/100. Por tanto, los ángulos de inclinación menos profundos pueden facilitar el uso de espacios más grandes a costa de un ángulo de separación más pequeño y un tamaño de matriz mayor. Sin embargo, los espacios más grandes pueden proporcionar otro beneficio en términos de mayor rendimiento de la matriz.In either case, a critical particle size reduced as a fraction of the space can be helpful in reducing blockage in the matrix. In some cases, biological samples contain species with a wide range of sizes. In some cases, multiple separation or filtration stages can be used to ensure that a matrix continues to function. The use of triangular posts allows to increase the size of the space for a given critical particle size and reduce the chances of the matrix clogging. FIG. 8 illustrates how much larger the space between the posts can be made based on the inclination of the die. Represented as a ratio of the two spaces for a fixed critical particle size, a minimum improvement of 20% can be seen with increasing the size of the space as the tilt is reduced, with a ratio of 1.25 for an angle of 1/4 tilt and 1.94 ratio for 1/100 tilt angle. Therefore, shallower rake angles can facilitate the use of larger gaps at the cost of a smaller clearance angle and larger die size. However, larger spaces can provide another benefit in terms of higher matrix performance.

Una comparación de rendimiento entre una matriz con postes triangulares y circulares mostró un aumento sustancial en la velocidad promedio para una caída de presión dada en la matriz con postes triangulares. Se construyeron matrices con postes triangulares o con postes circulares con características casi idénticas. Todas tenían la misma anchura y longitud general de canal, profundidad, ángulo de inclinación (1/10) y tamaño de postes (los diámetros de los postes redondos eran iguales a las longitudes de los lados de los postes de triángulo equilátero). La única variación era el espacio entre los postes, que se diseñó y se verificó con simulación numérica para dar un diámetro crítico de partícula de aproximadamente 3,2 micrómetros para las dos matrices. Esas simulaciones numéricas indicaron que el diámetro crítico de partícula se logró utilizando un espacio de 10,5 micrómetros en matrices con postes triangulares y un espacio de 8,3 micrómetros en matrices con postes circulares.A performance comparison between an array with triangular and circular posts showed a substantial increase in average velocity for a given pressure drop in the array with triangular posts. Matrices were constructed with triangular posts or with circular posts with almost identical characteristics. They all had the same overall channel width and length, depth, tilt angle (1/10), and post size (the diameters of the round posts were equal to the lengths of the sides of the equilateral triangle posts). The only variation was the spacing between the posts, which was designed and verified with numerical simulation to give a critical particle diameter of approximately 3.2 microns for the two matrices. Those numerical simulations indicated that the critical particle diameter was achieved using a 10.5 micron gap in arrays with triangular posts and an 8.3 micron gap in arrays with circular posts.

Las trayectorias de perlas fluorescentes de 500 nanómetros se registraron con una cámara de dispositivo acoplado cargado de multiplicación de electrones (EMCCD) que capturaba un vídeo a 10 fotogramas por segundo y luego se analizaron usando el software MATLAB™ para un gradiente de presión dado a través de la matriz.The 500 nanometer fluorescent bead trajectories were recorded with an Electron Multiplication Charged Coupled Device (EMCCD) camera that captured video at 10 frames per second and then analyzed using MATLAB ™ software for a given pressure gradient across of the matrix.

Se eligieron partículas pequeñas que no serían desplazadas (es decir, impactadas) por la matriz para que muestrearan cada una de las corrientes de flujo de manera uniforme y proporcionaran una representación precisa de la velocidad promedio general del fluido.Small particles that would not be displaced (ie impacted) by the matrix were chosen to sample each of the flow streams uniformly and provide an accurate representation of the overall average velocity of the fluid.

Las velocidades promedio de las partículas se representan en la FIG. 9 en función del gradiente de presión junto con un ajuste lineal ponderado. Las líneas ajustadas demuestran que las partículas en la matriz de postes triangulares se movieron mucho más rápido. El intervalo superior de presiones estaba limitado por el campo de visión del microscopio y la velocidad de captura de la cámara. Más allá de varios kPa de presión, las partículas atravesaron todo el campo de visión dentro de uno o dos fotogramas del vídeo y no se pudo hacer una estimación precisa de la velocidad. Sin embargo, dado que el número de Reynolds en estos experimentos es del orden de 10-2, el ajuste lineal se puede extender de manera segura en el intervalo de decenas de kPa para igualar la relación lineal esperada entre la velocidad y la presión que se observa para flujos de bajo número de Reynolds. Los postes no necesitan tener una sección transversal triangular. También se pueden utilizar postes que tengan otros perfiles de sección transversal (cuadrados, oblongos o irregulares), siempre que la forma de los obstáculos haga que el espacio sea asimétrico.Average particle velocities are depicted in FIG. 9 as a function of pressure gradient along with a weighted linear fit. The fitted lines demonstrate that the particles in the triangular pole array moved much faster. The upper range of pressures was limited by the field of view of the microscope and the speed of capture of the camera. Beyond several kPa of pressure, the particles traversed the entire field of view within a frame or two of the video, and an accurate estimate of velocity could not be made. However, since the Reynolds number in these experiments is on the order of 10-2, the linear fit can be safely extended over the range of tens of kPa to equal the expected linear relationship between velocity and pressure that occurs. observed for low Reynolds number flows. The posts do not need to have a triangular cross section. Posts that have other cross-sectional profiles (square, oblong, or irregular) can also be used, as long as the shape of the obstacles makes the space asymmetrical.

Comparando las pendientes de los dos ajustes lineales en la FIG. 9 , se puede ver que las partículas en la matriz con postes triangulares se desplazaron un 85 % más rápido en promedio que las de una matriz con postes circulares. Este resultado concuerda con la simulación numérica realizada con el software COMSOL™ que mostró que la velocidad promedio fue 82 % más rápida para los postes triangulares. El mecanismo detrás de estos hallazgos se puede entender haciendo una analogía con el flujo de Poiseuille entre dos placas paralelas, donde la velocidad promedio para un gradiente de presión fijo es proporcional a la distancia más pequeña entre las placas al cuadrado. La analogía no es exacta porque la estructura de confinamiento es una matriz de postes en lugar de dos placas paralelas, pero subraya los beneficios de aumentar la anchura del espacio, donde solo unos pocos micrómetros producen un aumento sustancial en el rendimiento.Comparing the slopes of the two linear fits in FIG. 9 , it can be seen that the particles in the matrix with triangular posts moved 85% faster on average than those in a matrix with circular posts. This result agrees with the numerical simulation performed with the COMSOL ™ software which showed that the average speed was 82% faster for the triangular posts. The mechanism behind these findings can be understood by making an analogy with Poiseuille flow between two parallel plates, where the average velocity for a fixed pressure gradient is proportional to the smallest distance between the squared plates. The analogy is not exact because the confining structure is an array of posts rather than two parallel plates, but underscores the benefits of increasing the width of the gap, where just a few microns produce a substantial increase in performance.

Las ganancias conseguidas cambiando la forma del poste se degradan si no se tiene cuidado de mantener los vértices del poste agudos. La FIG. 10 muestra el efecto de redondear los bordes de los postes triangulares sobre el tamaño crítico de partícula. se simuló una matriz con postes de 10 micrómetros, espacios de 10 micrómetros entre postes y un ángulo de inclinación de 1/30 utilizando el software COMSOL™, variando los vértices redondeados a varios radios de curvatura desde ninguno (r = 0) hasta el redondeo completo donde la forma final es un círculo (r = S/121/2). Se extrajeron los perfiles de flujo a través de los espacios para cada redondeo y se calculó el tamaño crítico para la inclinación dada utilizando métodos previamente establecidos. Como se muestra en la FIG. 10, hay un aumento espectacular en el tamaño crítico de partícula a medida que la forma del poste pasa de triangular a circular. A partir de 0,174 G cuando el poste es completamente triangular (es decir, r = 0), el tamaño crítico de partícula aumenta un 35 % a 0,235 G cuando el poste es completamente circular (r = S/121/2). La transición sugiere que si en un proceso de fabricación se produce un redondeo de vértice indeseable, el uso de postes más grandes (aumentando S) ayudará a mantener el tamaño crítico de partícula reducido que resulta del uso de postes triangulares.The gains made by changing the shape of the pole are degraded if care is not taken to keep the vertices of the pole sharp. FIG. 10 shows the effect of rounding the edges of the triangular posts on the critical particle size. An array with 10 micron posts, 10 micron spacing between posts, and 1/30 tilt angle was simulated using COMSOL ™ software, varying the rounded vertices at various radii of curvature from none (r = 0) to rounding complete where the final shape is a circle (r = S / 121/2). Flow profiles through the gaps were extracted for each rounding and the critical size for the given slope was calculated using previously established methods. As shown in FIG. 10 , there is a dramatic increase in critical particle size as the shape of the post changes from triangular to circular. From 0.174 G when the pole is completely triangular (that is, r = 0), the critical particle size increases by 35% to 0.235 G when the pole is completely circular (r = S / 121/2). The transition suggests that if undesirable corner rounding occurs in a manufacturing process, the use of larger posts (increasing S) will help keep the critical particle size reduced that results from the use of triangular posts.

Esta observación también ayuda a explicar la desviación del comportamiento esperado observado para algunas de las perlas fluorescentes en la FIG. 7. Las imágenes SEM de los postes muestran un redondeo de vértices (r/S) de 0,118 ± 0,006, que corresponde a un aumento en el tamaño crítico de partícula de 0,93 micrómetros a 1,12 micrómetros.This observation also helps explain the deviation from the expected behavior observed for some of the fluorescent beads in FIG. 7. The SEM images of the posts show vertex rounding (r / S) of 0.118 ± 0.006, which corresponds to an increase in critical particle size from 0.93 microns to 1.12 microns.

Cuando se purifica una pluralidad de partículas pasándolas a través de una matriz de obstáculos, el rendimiento de las partículas deseadas se puede regular ajustando la forma de la sección transversal de los obstáculos. En algunos casos, el ajuste de la forma de sección transversal de los obstáculos puede aumentar el rendimiento de las partículas deseadas. En algunos casos, la forma de los obstáculos puede afectar al nivel de deformación de las partículas que fluyen a través de los obstáculos. Las partículas que se deforman pueden tener un bajo rendimiento después de atravesar los obstáculos (véase, por ejemplo, la FIG.53A). Por tanto, los obstáculos con formas de sección transversal que provocan un bajo nivel de deformación pueden incrementar el rendimiento de las partículas. En algunos casos, la forma de sección transversal de los obstáculos puede crear efectos de inercia que dan como resultado un desplazamiento lateral adicional cuando las partículas fluyen a través de los obstáculos. El efecto de inercia puede dar como resultado una mejor separación de partículas de diferentes tamaños en una muestra.When a plurality of particles are purified by passing them through an array of obstacles, the performance of the desired particles can be regulated by adjusting the cross-sectional shape of the obstacles. In some cases, adjusting the cross-sectional shape of obstacles can increase the performance of the desired particles. In some cases, the shape of the obstacles can affect the level of deformation of the particles flowing through the obstacles. Deformed particles can perform poorly after traversing obstacles (see, for example, FIG . 53A). Therefore, obstacles with cross-sectional shapes that cause a low level of deformation can increase the performance of the particles. In some cases, the cross-sectional shape of obstacles can create inertial effects that result in additional lateral displacement when particles flow through obstacles. The inertial effect can result in better separation of different sized particles in a sample.

Los métodos y dispositivos para purificar las partículas pueden comprender una matriz de obstáculos con secciones transversales que tienen uno o más vértices. Los obstáculos de tales formas pueden crear menos fuerza de cizallamiento para las partículas que fluyen en comparación con los obstáculos con formas suaves, tales como redonda. En algunos casos, la forma de la sección transversal de los obstáculos puede ser poligonal, por ejemplo, un cuadrilátero. Los ejemplos no limitantes de cuadrilátero incluyen un cuadrilátero cíclico, cuadrado, cometa, paralelogramo, rombo, oblongo, romboide, rectángulo, cuadrilátero tangencial, trapezoide, trapecio o trapezoide isósceles. El cuadrilátero puede tener al menos un ángulo entre 87 ° y 93 °. Por ejemplo, la forma de los obstáculos puede ser cuadrada.The methods and devices for purifying the particles may comprise a matrix of obstacles with cross-sections having one or more vertices. Obstacles of such shapes can create less shear force for the flowing particles compared to obstacles with smooth shapes, such as round. In some cases, the cross-sectional shape of obstacles may be polygonal, for example a quadrilateral. Non-limiting examples of a quadrilateral include a cyclic, square, comet, parallelogram, rhombus, oblong, rhomboid, rectangle, tangential quadrilateral, trapezoid, trapezoid, or isosceles trapezoid. The quadrilateral can have at least one angle between 87 ° and 93 °. For example, the shape of obstacles can be square.

los espacios de los obstáculos también pueden afectar a la fuerza de cizallamiento de los obstáculos para las partículas que fluyen a través de los obstáculos. Un espacio respectivo se puede definir por la superficie de dos obstáculos. En algunos casos, el espacio respectivo puede estar orientado de una forma sustancialmente simétrica con respecto a un plano que se extiende a través del centro del espacio respectivo y que es paralelo a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos. En algunos casos, el espacio respectivo puede estar orientado de una forma sustancialmente simétrica con respecto a un plano que se extiende a través del centro del espacio respectivo y que es paralelo a una dirección de flujo de la muestra a través de la matriz de obstáculos.Obstacle gaps can also affect the obstacle shear force for particles flowing through the obstacles. A respective space can be defined by the surface of two obstacles. In some cases, the respective space may be oriented substantially symmetrically with respect to a plane extending through the center of the respective space and which is parallel to a flow direction of the sample through the obstacle matrix. In some cases, the respective space may be oriented substantially symmetrically with respect to a plane extending through the center of the respective space and which is parallel to a flow direction of the sample through the obstacle matrix.

En algunos casos, se pueden utilizar métodos que aprovechan los obstáculos con formas de sección transversal optimizadas para aislar un primer tipo de partículas en una muestra que comprende los primeros tipos de partículas y un segundo tipo de partículas, purificando así el primer tipo de partículas de la muestra. Lo que se proporciona en el presente documento incluye un método para separar un primer grupo de partículas y un segundo grupo de partículas en una muestra que comprende el primer grupo de partículas y el segundo grupo de partículas, comprendiendo el método: (a) pasar la muestra a través de una matriz de obstáculos, obteniéndose así un producto. En algunos casos, la forma de la sección transversal de los obstáculos puede ser un cuadrilátero, por ejemplo, un cuadrilátero cíclico, cuadrado, cometa, paralelogramo, rombo, oblongo, romboide, rectángulo, cuadrilátero tangencial, trapezoide, trapecio o trapezoide isósceles. En algunos casos, el espacio entre las partículas es simétrico y los dos obstáculos que forman el espacio tienen vértices que se apuntan entre sí a través del espacio. La forma de la sección transversal del obstáculo puede ser cualquier forma que tenga un vértice en el espacio que produzca un espacio simétrico, por ejemplo, cuadrilátero, hexágono, octágono, decágono, etc.In some cases, methods that take advantage of obstacles with optimized cross-sectional shapes can be used to isolate a first type of particles in a sample comprising the first types of particles and a second type of particles, thus purifying the first type of particles from the sample. What is provided herein includes a method for separating a first group of particles and a second group of particles in a sample comprising the first group of particles and the second group of particles, the method comprising: (a) passing the sample through a matrix of obstacles, thus obtaining a product. In some cases, the cross-sectional shape of obstacles may be a quadrilateral, for example a cyclic quadrilateral, square, comet, parallelogram, rhombus, oblong, rhomboid, rectangle, tangential quadrilateral, trapezoid, trapezoid, or isosceles trapezoid. In some cases, the space between the particles is symmetric and the two obstacles that make up the space have vertices that point to each other through the space. The cross-sectional shape of the obstacle can be any shape that has a vertex in space that produces a symmetrical space, for example, quadrilateral, hexagon, octagon, decagon, etc.

Tales métodos y dispositivos pueden configurarse para conseguir un alto rendimiento de los primeros tipos de células y una baja contaminación de los segundos tipos de células en el producto purificado. En algunos casos, el rendimiento del primer grupo de partículas (por ejemplo, las partículas deseadas) puede ser al menos del 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. En algunos casos, el rendimiento del primer grupo de partículas (por ejemplo, las partículas deseadas) puede ser del 100 %. En algunos casos, la contaminación del segundo grupo de partículas (por ejemplo, las partículas no deseadas) puede ser inferior al 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,09 %, 0,08 %, 0,07 %, 0,06 %, 0,05 %, 0,04 %, 0,03 %, 0,02 %, 0,01 %, 0,005 % o 0,001 %. En algunos casos, el segundo grupo de partículas no existe en el producto purificado. En algunos casos, el producto purificado puede comprender al menos el 80 % del primer grupo de partículas y menos del 0,01 % del segundo grupo de partículas.Such methods and devices can be configured to achieve high throughput of the first cell types and low contamination of the second cell types in the purified product. In some cases, the yield of the first group of particles (for example, the desired particles) can be at least 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68% , 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%. In some cases, the yield of the first group of particles (eg, the desired particles) can be 100%. In some cases, the contamination of the second group of particles (for example, unwanted particles) may be less than 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5 %, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04 %, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.005%, or 0.001%. In some cases, the second group of particles does not exist in the purified product. In some cases, the purified product may comprise at least 80% of the first group of particles and less than 0.01% of the second group of particles.

E. Dispositivo de "lavado de coches"E. "Car wash" device

Los dispositivos, métodos, composiciones y kits descritos en el presente documento reemplazan el tratamiento químico o con reactivos y/o las etapas manuales de lavado/concentrado presentes en muchas técnicas conocidas en este campo. Los dispositivos proporcionados en el presente documento pueden reemplazar cualquier procedimiento que requiera centrifugación conocido en la técnica. En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones y kits proporcionados en el presente documento reemplazan las etapas de marcaje (por ejemplo, de la superficie celular y/o intracelular) y lavado/concentrado utilizadas para procesar muestras que comprenden células. Las células procesadas pueden usarse luego para investigación y/o pruebas de diagnóstico clínico. En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones y kits proporcionados en el presente documento reemplazan las etapas de marcaje (por ejemplo, de la superficie celular y/o intracelular), lavado/concentrado y/o lisis de eritrocitos utilizadas para procesar muestras de sangre para su uso en investigación y pruebas de diagnóstico clínico. Las pruebas clínicas y de diagnóstico se pueden utilizar para el cáncer, enfermedades infecciosas e inflamatorias y/o muchas otras enfermedades. En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones y kits proporcionados en el presente documento reemplazan las etapas de lisis, tratamiento(s) enzimático(s), clonación y/o lavado/concentrado utilizadas para procesar muestras que comprenden células desde células a bibliotecas de ácidos nucleicos. Las bibliotecas de ácidos nucleicos se pueden utilizar en secuenciación. La secuenciación puede ser cualquier método o plataforma de secuenciación de última generación conocido en la técnica. Los métodos proporcionados en el presente documento pueden ser procesos microfluídicos automatizados sin reactivos que pueden recoger, lavar y concentrar eficazmente partículas (por ejemplo, células) en varios minutos, con alto rendimiento, alta reproducibilidad y bajo coste. Las partículas pueden ser cualquiera de las células proporcionadas en el presente documento. En algún caso, las partículas son células madre, leucocitos y/o células de leucemia.The devices, methods, compositions and kits described herein replace the chemical or reagent treatment and / or manual wash / concentrate steps present in many techniques known in the art. The devices provided herein can replace any procedure that requires centrifugation known in the art. In some cases, the devices, methods, compositions, and kits provided herein replace the labeling (eg, cell surface and / or intracellular) and wash / concentrate steps used to process samples comprising cells. The processed cells can then be used for research and / or clinical diagnostic tests. In some instances, the devices, methods, compositions, and kits provided herein supersede the steps of labeling (e.g., cell surface and / or intracellular), washing / concentrating, and / or lysis of erythrocytes used to process samples of blood for use in research and clinical diagnostic tests. Clinical and diagnostic tests can be used for cancer, infectious and inflammatory diseases, and / or many other diseases. In some instances, the devices, methods, compositions, and kits provided herein supersede the lysis, enzymatic treatment (s), cloning, and / or wash / concentrate steps used to process samples comprising cells from cells to libraries. nucleic acids. Nucleic acid libraries can be used in sequencing. Sequencing can be any state-of-the-art sequencing method or platform known in the art. The methods provided herein can be automated reagent-free microfluidic processes that can efficiently collect, wash, and concentrate particles (eg, cells) in several minutes, with high throughput, high reproducibility, and low cost. The particles can be any of the cells provided herein. In some cases, the particles are stem cells, leukocytes, and / or leukemia cells.

Como se muestra en la FIG 17B, un dispositivo de "lavado de coches" tal como se proporciona en el presente documento puede comprender dos entradas (Figura 17B; 'muestra' y 'tampón') que están configuradas para hacer fluir dos fluidos separados desde un área de entrada de un dispositivo a un área de salida del dispositivo. En la FIG. As shown in FIG 17B, a "car wash" device as provided herein may comprise two inlets (Figure 17B; 'sample' and 'buffer') that are configured to flow two separate fluids from an input area of a device to an output area of the device. In FIG.

17B, los dos fluidos fluyen de manera laminar paralela a través del dispositivo hacia dos salidas en una parte de salida del dispositivo, en donde los fluidos de flujo laminar están presentes como corrientes o tubos de corriente que no se mezclan. Como también se muestra en la FIG. 17B, los fluidos que fluyen a través del dispositivo desde el área de entrada al área de salida encuentran una matriz de obstáculos entre ellas. La matriz de obstáculos puede ser una matriz DLD (matriz de postes inclinados en la FIG. 17B) tal como se proporciona en el presente documento. La matriz se puede configurar para separar partículas en las corrientes de flujo laminar, paralelas, basándose en el tamaño de una manera determinista como se describe en el presente documento. Las partículas más grandes que el tamaño crítico de la matriz DLD pueden "tropezar" como se describe en el presente documento y dirigirse hacia la "parte inferior" de la matriz DLD y posteriormente fluir hacia una salida y recogerse en ella (porción de salida de producto de la FIG. 17B). Como se muestra en la FIG. 17B, las dos entradas están separadas entre sí por una pared. En algunos casos, una pared que separa las entradas adyacentes en un dispositivo de lavado de coches de múltiples entradas tal como se proporciona en el presente documento se extiende hacia el interior de un canal que comprende las entradas, la matriz DLD y las salidas hasta que la pared se encuentra o topa con un borde de la matriz DLD. El borde de la matriz DLD puede ser el borde más cercano o más próximo a las entradas. Como se muestra en la FIG. 17B, el borde de la matriz DLD es perpendicular a la pared que separa las entradas. Como se muestra en la FIG. 17B, las dos salidas están separadas entre sí por una pared. Como se muestra en la FIG. 17B, la pared que separa las salidas adyacentes en un dispositivo de "lavado de coches" tal como se proporciona en el presente documento puede extenderse desde el borde de la matriz DLD más cercano a las salidas hasta el final del canal, en donde el borde de la matriz DLD es perpendicular a la pared que separa las salidas. Basándose en los principios de DLD como se describe en el presente documento, las partículas (por ejemplo, células, ácidos nucleicos, reactivos tales como anticuerpos, sondas, etc.) por encima de un tamaño crítico fluirán en la dirección del flujo general de fluido y saldrán del dispositivo por una salida (producción de residuos en la FIG. 17B), mientras que las partículas (por ejemplo, células, ácidos nucleicos, etc.) por encima del tamaño crítico salen del dispositivo por una segunda salida o salida separada (salida de producto en la FIG. 17B). Como se muestra en la FIG. 17B, un dispositivo de "lavado de coches" tal como se proporciona en el presente documento se usa para lavar glóbulos blancos (por ejemplo, leucocitos) en una muestra que comprende agentes de unión que comprenden marcadores (por ejemplo, moléculas marcadoras) y células más pequeñas (por ejemplo, glóbulos rojos). Tal como se puede observar, la muestra fluye desde el área de entrada a través de la matriz DLD hasta el área de salida, en donde al entrar en la matriz de postes inclinados, los glóbulos blancos tropiezan y se desvían de la corriente de flujo de muestra a la corriente de flujo de tampón paralela, mientras que los agentes de unión que comprenden marcadores (por ejemplo, moléculas marcadoras) y glóbulos rojos permanecen en la corriente de muestra. Después, los glóbulos blancos se pueden recoger de la salida de producto esencialmente lavados y purificados de las moléculas marcadoras y los glóbulos rojos (FIG. 17C). 17B, the two fluids flow in a parallel laminar fashion through the device to two outlets in an outlet portion of the device, where the laminar flow fluids are present as streams or stream tubes that do not mix. As also shown in FIG. 17B , the fluids flowing through the device from the entrance area to the exit area encounter a matrix of obstacles between them. The obstacle matrix may be a DLD matrix (inclined post matrix in FIG. 17B ) as provided herein. The matrix can be configured to separate particles in parallel, laminar flow streams based on size in a deterministic manner as described herein. Particles larger than the critical size of the DLD matrix can "trip" as described herein and head towards the "bottom" of the DLD matrix and subsequently flow into and collect therein (exit portion of product of FIG. 17B ). As shown in FIG. 17B, the two entrances are separated from each other by a wall. In some cases, a wall separating adjacent inlets in a multi-inlet car wash device as provided herein extends into a channel comprising the inlets, the DLD matrix, and the outlets until the wall meets or butts against an edge of the DLD matrix. The edge of the DLD matrix can be the closest or closest edge to the inputs. As shown in FIG. 17B, the edge of the DLD matrix is perpendicular to the wall separating the entrances. As shown in FIG. 17B, the two outlets are separated from each other by a wall. As shown in FIG. 17B , the wall separating adjacent outlets in a "car wash" device as provided herein may extend from the edge of the DLD array closest to the outlets to the end of the channel, where the edge of the DLD matrix is perpendicular to the wall separating the outlets. Based on the principles of DLD as described herein, particles (eg, cells, nucleic acids, reagents such as antibodies, probes, etc.) above a critical size will flow in the direction of general fluid flow. and will exit the device through one exit (waste production in FIG. 17B ), while particles (e.g. cells, nucleic acids, etc.) above the critical size exit the device through a second exit or separate exit ( product outlet in FIG. 17B ). As shown in FIG. 17B , a "car wash" device as provided herein is used to wash white blood cells (eg, leukocytes) in a sample comprising binding agents comprising markers (eg, marker molecules) and cells. smaller (for example, red blood cells). As can be seen, the sample flows from the entrance area through the DLD matrix to the exit area, where upon entering the slanted pole matrix, the white blood cells stumble and deviate from the flow stream of sample to the parallel buffer flow stream, while binding agents comprising markers (eg, marker molecules) and red blood cells remain in the sample stream. The white blood cells can then be collected from the essentially washed and purified product outlet of the marker molecules and red blood cells ( FIG. 17C ).

Como se muestra en la FIG. 19, un dispositivo de "lavado de coches" tal como se proporciona en el presente documento puede comprender una pluralidad de entradas y una pluralidad de salidas con una matriz de obstáculos entre ellas (por ejemplo, matriz de postes inclinados de la FIG. 19). La pluralidad de entradas puede ser más de dos entradas. La pluralidad de salidas puede ser más de dos salidas. El dispositivo puede comprender un canal delimitado por una primera pared y una segunda pared, en donde la segunda pared se opone a la primera pared, y en donde la primera y la segunda paredes están configuradas para confinar fluidos que fluyen entre ellas. El dispositivo puede comprender además una pluralidad de entradas entre la primera y la segunda pared. Como se muestra en la FIG. 19, las entradas pueden ser adyacentes entre sí y pueden estar separadas por una pared. Las paredes separadoras entre entradas adyacentes pueden extenderse al interior del canal a lo largo de una distancia. La distancia puede ser hasta el borde perpendicular más cercano de la matriz DLD. El canal se puede configurar para que fluya una pluralidad de fluidos en corrientes desde la pluralidad de entradas a través de la matriz DLD hasta la pluralidad de salidas. Las corrientes pueden fluir de una manera laminar paralela, en donde las corrientes de flujo adyacentes ("corrientes de flujo" o "tubos de corriente") experimentan una mezcla mínima (por ejemplo, debido a una difusión limitada), nula o sustancialmente nula entre las corrientes de flujo adyacentes. En algunos casos, una partícula (por ejemplo, una célula) puede moverse formando un ángulo con las corrientes de flujo paralelas por la acción del desplazamiento lateral determinista (DLD). En algunos casos, las células se introducen sin un reactivo químico o enzimático de procesamiento, se desplazan al interior de una corriente de flujo que comprende dicho reactivo químico o enzimático por DLD y después salen de la corriente y entran en una corriente que comprende un tampón limpio (es decir, libre de reactivos) y luego salen a una salida de producto, ya lavadas. La matriz DLD entre la pluralidad de entradas y salidas puede ser cualquier matriz DLD tal como se proporciona en el presente documento. En algunos casos, la matriz DLD comprende micropostes redondos. En algunos casos, la matriz DLD comprende micropostes triangulares. En algunos casos, la DLD comprende micropostes tanto redondos como triangulares. Los micropostes pueden tener cualquiera de las dimensiones proporcionadas en el presente documento. Las corrientes de fluido pueden fluir a través del canal a cualquiera de los caudales proporcionados en el presente documento. En algunos casos, un dispositivo de lavado de coches tal como se proporciona en el presente documento está configurado para ser de alto rendimiento, en donde las corrientes de fluido fluyen a altas velocidades de flujo (por ejemplo, al menos 1 ml/min). En algunos casos, un dispositivo de lavado de coches tal como se proporciona en el presente documento está configurado o adaptado para ser de alto rendimiento, en donde el volumen de muestra para pasar por el dispositivo es superior a 100 ml. La FIG. As shown in FIG. 19 , a "car wash" device as provided herein may comprise a plurality of entrances and a plurality of exits with an array of obstacles between them (eg, array of slanted posts of FIG. 19 ) . The plurality of entries can be more than two entries. The plurality of outlets can be more than two outlets. The device may comprise a channel delimited by a first wall and a second wall, wherein the second wall opposes the first wall, and wherein the first and second walls are configured to confine fluids flowing between them. The device may further comprise a plurality of inlets between the first and the second wall. As shown in FIG. 19 , the entrances can be adjacent to each other and can be separated by a wall. The partition walls between adjacent entrances can extend into the channel over a distance. The distance can be to the closest perpendicular edge of the DLD matrix. The channel can be configured to flow a plurality of fluids in streams from the plurality of inlets through the DLD matrix to the plurality of outlets. The streams can flow in a parallel laminar fashion, where adjacent flow streams ("flow streams" or "stream tubes") experience minimal mixing (for example, due to limited diffusion), no or substantially no mixing between adjacent flow streams. In some cases, a particle (eg, a cell) can move at an angle to parallel flow currents by the action of deterministic lateral displacement (DLD). In some cases, cells are introduced without a chemical or enzymatic processing reagent, move into a flow stream comprising said chemical or enzymatic reagent by DLD, and then exit the stream and enter a stream comprising a buffer. clean (that is, free of reagents) and then they go out to a product outlet, already washed. The DLD matrix among the plurality of inputs and outputs can be any DLD matrix as provided herein. In some cases, the DLD matrix comprises round microposts. In some cases, the DLD matrix comprises triangular microposts. In some cases, the DLD comprises both round and triangular microposts. The microposts can have any of the dimensions provided herein. Fluid streams can flow through the channel at any of the flow rates provided herein. In some cases, a car wash device as provided herein is configured to be high performance, where fluid streams flow at high flow rates (eg, at least 1 ml / min). In some cases, a car wash device as provided herein is configured or adapted to be high throughput, where the sample volume to pass through the device is greater than 100 ml. FIG.

19 muestra un dispositivo que comprende 3 entradas en el área de entrada de un dispositivo que comprende una matriz DLD. Las 3 entradas están configuradas para hacer fluir 3 corrientes de flujo paralelas entre sí. Una primera corriente de flujo comprende una muestra, en donde la muestra comprende partículas, una segunda corriente de flujo comprende un reactivo y una tercera corriente de flujo comprende un tampón de lavado. El dispositivo está configurado de manera que la muestra se introduce en las entradas más cercanas a una primera pared límite y las partículas dentro de la muestra se desvían hacia una segunda pared límite opuesta a medida que las partículas se mueven a través de la matriz DLD, con lo que las partículas dentro de la muestra se separan por tamaño de una manera determinista. Las partículas dentro de la muestra por encima de un tamaño crítico de la matriz DLD se pueden desviar hacia la segunda pared, mientras que las partículas por debajo del tamaño crítico pueden fluir a través de la matriz DLD en la dirección de las corrientes de flujo. En la FIG. 19, las partículas dentro de la corriente de muestra desviadas hacia la segunda pared pasan a través de la corriente de reactivo y luego a la corriente de flujo de tampón, en donde un reactivo dentro de la corriente de flujo de reactivo puede reaccionar con las partículas a medida que pasan a través de la corriente de reactivo, y en donde el reactivo puede retirarse por lavado o eliminarse de las partículas a medida que fluyen a través de la corriente de flujo de tampón posterior. Como se muestra en la FIG. 19, las partículas desviadas hacia la segunda pared se pueden concentrar cuando se encuentran con la segunda pared, y posteriormente pueden fluir a través y recogerse de una (por ejemplo, producto en la FIG. 19) de la pluralidad de salidas en el área de salida del dispositivo, mientras que las partículas no desviadas hacia la segunda pared, así como el reactivo de la corriente de reactivo fluye a través de una o más salidas de la pluralidad de salidas que están separadas de la salida del producto (salida de residuos en la FIG. 19). Las partículas desviadas recogidas de un dispositivo como el proporcionado pueden estar libres o sustancialmente libres de reactivos después del flujo de las partículas a través de una corriente de reactivo en un dispositivo de "lavado de coches" de múltiples corrientes como el proporcionado en el presente documento. 19 shows a device comprising 3 inputs in the input area of a device comprising a DLD matrix. The 3 inputs are configured to flow 3 flow streams parallel to each other. A first flow stream comprises a sample, wherein the sample comprises particles, a second flow stream comprises a reagent, and a third flow stream comprises a wash buffer. The device is configured so that the sample is introduced into the entrances closest to a first boundary wall and the particles within the sample are deflected towards a second opposite boundary wall as the particles move through the DLD matrix, whereby the particles within the sample are separated by size in a deterministic manner. Particles within the sample above a critical size of the DLD matrix can be deflected towards the second wall, while particles below the critical size can flow through the DLD matrix in the direction of the flow streams. In FIG. 19 , the particles within the sample stream diverted toward the second wall pass through the reagent stream and then into the buffer flow stream, where a reagent within the reagent flow stream can react with the particles. as they pass through the reagent stream, and wherein the reagent can be washed off or removed from the particles as they flow through the subsequent buffer flow stream. As shown in FIG. 19 , particles deflected toward the second wall can be concentrated when encountering the second wall, and can subsequently flow through and be collected from one (eg, product in FIG. 19 ) of the plurality of outlets in the area of outlet of the device, while the particles not deflected towards the second wall, as well as the reagent of the reagent stream flows through one or more outlets of the plurality of outlets that are separated from the product outlet (waste outlet in FIG. 19 ). Diverted particles collected from a device such as the one provided may be free or substantially free of reagents after flow of the particles through a reagent stream in a multi-stream "car wash" device such as that provided herein. .

La FIG. 18A muestra una realización de un dispositivo de "lavado de coches" como se describe en el presente documento. El dispositivo de la FIG. 18A comprende una pluralidad de entradas y una pluralidad de salidas con una matriz de obstáculos (matriz de postes inclinados en la FIG. 18A) dispuesta entre medias. La pluralidad de entradas se puede configurar para hacer fluir una pluralidad de corrientes de flujo hacia la pluralidad de salidas, en donde cada una de la pluralidad de corrientes de flujo comprende un fluido separado. En la FIG. 18A, el canal comprende 6 entradas configuradas para hacer fluir seis corrientes de flujo separadas en corrientes de flujo laminar a través de una matriz de postes inclinados hacia 2 salidas, una salida de producto y una salida de residuos. Una primera corriente de flujo comprende una muestra que comprende partículas, una segunda corriente comprende un tampón, una tercera corriente comprende una corriente de fijador y de permeabilización, una cuarta corriente comprende un tampón, una quinta corriente comprende una corriente de marcador intracelular y una sexta corriente comprende un tampón. En algunos casos, un dispositivo de múltiples corrientes como el descrito en el presente documento comprende una pluralidad de corrientes de flujo paralelas que fluyen desde una parte de entrada del dispositivo a una parte de salida del dispositivo, en donde al menos 4 de las corrientes de flujo comprenden un reactivo. Dichas al menos 4 corrientes de flujo que comprenden un reactivo pueden comprender el mismo reactivo y/o reactivos diferentes. En algunos casos, cada una de las corrientes de flujo que comprenden un reactivo está delimitada por dos corrientes de flujo paralelas, cada una de las cuales lleva un tampón. El tampón puede ser un tampón de lavado. Un dispositivo como el mostrado en la FIG. 18A se puede configurar para desviar partículas (por ejemplo, leucocitos en una muestra que comprende leucocitos y glóbulos rojos, por ejemplo, sangre) de un tamaño predeterminado (por ejemplo, por encima de un tamaño crítico de la matriz de postes inclinados) desde la corriente de muestra a través de las cinco corrientes de flujo paralelas posteriores en serie (por ejemplo, muestra ^ tampón ^ fijación/permeabilización ^ tampón ^ interior de célula. marcador^ tampón en la FIG. 18A). Las corrientes de tampón pueden servir para lavar reactivos adsorbidos de forma no específica (es decir, débilmente) en las partículas (por ejemplo, células) y reactivos no unidos de la corriente de flujo adyacente precedente del entorno de las partículas desviadas a través de las corrientes. La corriente de tampón puede retirar o retirar sustancialmente el reactivo unido de forma no específica y no unido de una partícula así como de la corriente que comprende las partículas. Como se muestra en la FIG. 18A, una salida de residuos puede tener una anchura mayor que la anchura de la salida de producto. La salida de residuos en la FIG. 18A comprende reactivos (por ejemplo, Mab de marcaje de superficie, reactivos de fijación/permeabilización y agentes de unión intracelulares que comprenden un marcador, así como partículas no deseadas, por ejemplo, glóbulos rojos (RBC), por debajo del tamaño crítico de la matriz de postes inclinados). FIG. 18A shows one embodiment of a "car wash" device as described herein. The device of FIG. 18A comprises a plurality of inputs and a plurality of outputs with an obstacle matrix (inclined post matrix in FIG. 18A ) arranged in between. The plurality of inlets may be configured to flow a plurality of flow streams to the plurality of outlets, wherein each of the plurality of flow streams comprises a separate fluid. In FIG. 18A , the channel comprises 6 inlets configured to flow six separate flow streams in laminar flow streams through an array of slanted posts toward 2 outlets, a product outlet and a waste outlet. A first flow stream comprises a sample comprising particles, a second stream comprises a buffer, a third stream comprises a fixative and permeabilization stream, a fourth stream comprises a buffer, a fifth stream comprises an intracellular marker stream, and a sixth stream comprises a buffer. In some cases, a multi-stream device as described herein comprises a plurality of parallel flow streams flowing from an inlet portion of the device to an outlet portion of the device, wherein at least 4 of the streams are flow comprise a reagent. Said at least 4 flow streams comprising a reagent may comprise the same reagent and / or different reagents. In some cases, each of the flow streams comprising a reagent is bounded by two parallel flow streams, each of which wears a tampon. The buffer can be a wash buffer. A device like the one shown in FIG. 18A can be configured to deflect particles (eg, leukocytes in a sample comprising leukocytes and red blood cells, eg, blood) of a predetermined size (eg, above a critical size of the slanted pole array) from the sample stream through the subsequent five parallel flow streams in series (eg, sample ^ buffer ^ fixation / permeabilization ^ buffer ^ cell interior. marker ^ buffer in FIG. 18A ). The buffer streams can serve to wash non-specifically (i.e. weakly) adsorbed reagents on the particles (e.g. cells) and unbound reagents from the preceding adjacent flow stream from the environment of the particles diverted through the cells. currents. The buffer stream can remove or substantially remove non-specifically bound and unbound reagent from a particle as well as from the stream comprising the particles. As shown in FIG. 18A , a waste outlet may have a width greater than the width of the product outlet. The waste outlet in FIG. 18A comprises reagents (e.g., surface-labeling Mabs, binding / permeabilization reagents, and intracellular binding agents that comprise a marker, as well as unwanted particles, e.g., red blood cells (RBC), below the critical size of the inclined post matrix).

Algunas o todas las etapas de lavado en el procesamiento de glóbulos blancos (WBC) por citometría de flujo se pueden reemplazar con un proceso de chip DLD microfluídico que puede aumentar el rendimiento y la automatización, y reducir el tiempo, la variabilidad y el coste. Las etapas de lavado durante el procesamiento celular para citometría de flujo, que se pueden realizar después del marcaje de la superficie, fijación/permeabilización y marcaje intracelular, pueden asociarse con variabilidad, pérdida de células y coste (basado principalmente en la mano de obra necesaria). Los glóbulos blancos (WBC) deseados se pueden mover formando un ángulo con la dirección del flujo, definido por la geometría del poste, desde la corriente de entrada hasta la salida del producto. Al hacer circular el fluido a velocidades de flujo moderadas (pocos mm/s, junto con la longitud de una matriz DLD de aproximadamente 3-5 cm), las células pueden moverse desde la entrada del chip a la salida del chip en aproximadamente 30 s o menos. En tan poco tiempo, con un diseño adecuado, puede haber pocas posibilidades de que pasen componentes más pequeños no deseados, que no impactan, a la corriente de salida del producto por difusión aleatoria. Esto conduce a un lavado eficaz en una sola pasada a través del chip.Some or all of the washing steps in flow cytometric white blood cell (WBC) processing can be replaced with a microfluidic DLD chip process that can increase throughput and automation, and reduce time, variability, and cost. The washing steps during cell processing for flow cytometry, which can be performed after surface labeling, fixation / permeabilization and intracellular labeling, can be associated with variability, cell loss, and cost (based primarily on the labor required ). The desired white blood cells (WBC) can be moved at an angle to the direction of flow, defined by the geometry of the pole, from the inlet stream to the outlet of the product. By circulating the fluid at moderate flow rates (few mm / s, coupled with a DLD array length of about 3-5 cm), cells can move from chip inlet to chip outlet in about 30 sec. less. In such a short time, with proper design, there may be little chance of unwanted, non-impacting smaller components passing into the product outlet stream by random diffusion. This leads to efficient washing in a single pass through the chip.

Una o más de las etapas de marcaje de superficie, fijación, permeabilización y marcaje intracelular se pueden realizar en un chip microfluídico proporcionado en el presente documento. En algunos casos, una o más de estas etapas se pueden combinar con una o más etapas de lavado en el mismo chip (FIG. 42). En algunos casos, esto se puede conseguir añadiendo otra entrada al chip DLD para la infusión de los marcadores o los reactivos de fijación/permeabilización. La conversión de estos procedimientos en procesos en el chip puede reducir aún más el coste y el tiempo y mejorar la repetibilidad y la robustez de la prueba. En algunos casos, las partículas se pueden marcar en la superficie y luego lavar en el mismo chip. En algunos casos, las partículas se pueden fijar y/o permeabilizar y luego lavar en el mismo chip. En algunos casos, la partícula se puede marcar intracelularmente y luego lavar en el mismo chip. En algunos casos, las partículas se pueden marcar en la superficie, lavar, fijo y/o permeabilizar, y luego lavar en el mismo chip. En algunos casos, las partículas se pueden fijar y/o permeabilizar, lavar, marcar intracelularmente, y luego lavar en el mismo chip. En algunos casos, las partículas se pueden marcar en la superficie, lavar, fijar y/o permeabilizar, lavar, marcar intracelularmente, y luego lavar en el mismo chip.One or more of the steps of surface labeling, fixation, permeabilization, and intracellular labeling can be performed on a microfluidic chip provided herein. In some cases, one or more of these steps can be combined with one or more wash steps on the same chip ( FIG. 42). In some cases, this can be accomplished by adding another input to the DLD chip for infusion of the markers or binding / permeabilization reagents. Converting these procedures to on-chip processes can further reduce cost and time and improve test repeatability and robustness. In some cases, the particles can be marked on the surface and then washed on the chip itself. In some cases, the particles can be fixed and / or permeabilized and then washed on the chip itself. In some cases, the particle can be marked intracellularly and then washed on the same chip. In some cases, the particles can be marked on the surface, washed, fixed and / or permeabilized, and then washed on the chip itself. In some cases, the particles can be fixed and / or permeabilized, washed, labeled intracellularly, and then washed on the same chip. In some cases, the particles can be marked on the surface, washed, fixed and / or permeabilized, washed, marked intracellularly, and then washed on the chip itself.

Los chips y los protocolos de procesamiento se pueden desarrollar en un proceso iterativo para proporcionar combinaciones con capacidades diferentes/crecientes (FIG. 42). Las capacidades del dispositivo de plataforma se pueden desarrollar de forma sincrónica.Chips and processing protocols can be developed in an iterative process to provide combinations with varying / increasing capabilities ( FIG. 42 ). Platform device capabilities can be developed synchronously.

Los chips microfluídicos que realizan diferentes etapas de procesamiento celular se pueden usar junto con uno o más pasos de procesamiento fuera del chip. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie y lavar en un chip microfluídico, fijar y/o permeabilizar por cualquier método fuera del chip. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie mediante cualquier método fuera del chip, y luego fijar/permeabilizar y lavar en un chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden fijar y/o permeabilizar y lavar en un chip microfluídico que realiza la fijación/permeabilización y el lavado de las células, y luego marcar intracelularmente mediante cualquier método fuera del chip. En algunos casos, las células se pueden fijar/permeabilizar y lavar mediante cualquier método fuera del chip, y luego marcar intracelularmente y lavar en un chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie y lavar mediante cualquier método fuera del chip, y luego fijar y/o permeabilizar, lavar, marcar intracelularmente y lavar en un chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie y lavar en un chip microfluídico, y luego fijar y/o permeabilizar, lavar, marcar intracelularmente y lavar por cualquier método fuera del chip. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie, lavar, fijar y/o permeabilizar, y lavar por cualquier método fuera del chip, y luego marcar intracelularmente y lavar en un chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie, lavar, fijar y/o permeabilizar y lavar en un chip microfluídico, y luego marcar intracelularmente por cualquier método fuera del chip.Microfluidic chips that perform different stages of cell processing can be used in conjunction with one or more off-chip processing steps. In some cases, cells can be surface-marked and washed on a microfluidic chip, fixed, and / or permeabilized by any off-chip method. In some cases, cells can be surface marked by any off-chip method, and then fixed / permeabilized and washed on a microfluidic chip. In some cases, cells can be fixed and / or permeabilized and washed on a microfluidic chip that performs cell fixation / permeabilization and washing, and then intracellularly labeled by any off-chip method. In some cases, cells can be fixed / permeabilized and washed by any off-chip method, and then intracellularly labeled and washed on a microfluidic chip. In some cases, cells can be surface labeled and washed by any off-chip method, and then fixed and / or permeabilized, washed, intracellularly labeled, and washed on a microfluidic chip. In some cases, cells can be surface-marked and washed on a microfluidic chip, and then fixed and / or permeabilized, washed, intracellularly labeled, and washed by any off-chip method. In some cases, cells can be surface marked, washed, fixed and / or permeabilized, and washed by any off-chip method, and then intracellularly marked and washed on a microfluidic chip. In some cases, cells can be surface marked, washed, fixed, and / or permeabilized and washed on a microfluidic chip, and then intracellularly marked by any off-chip method.

Los chips microfluídicos que realizan diferentes etapas de procesamiento celular pueden usarse juntos para el procesamiento celular. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie y lavar en un primer chip microfluídico, y fijar y/o permeabilizar y lavar en un segundo chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden fijar y/o permeabilizar y lavar en un primer chip microfluídico, y marcar intracelularmente y lavar en un segundo chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie y lavar en un primer chip microfluídico, fijar y/o permeabilizar, y lavar en un segundo chip microfluídico, y marcar intracelularmente y lavar en un tercer chip microfluídico. En algunos casos, las células se pueden marcar en la superficie y lavar en un primer chip microfluídico, fijar y/o permeabilizar y lavar por cualquier método fuera del chip, y luego marcar intracelularmente y lavar en un segundo chip microfluídico.Microfluidic chips that perform different stages of cell processing can be used together for cell processing. In some cases, cells can be surface-marked and washed on a first microfluidic chip, and fixed and / or permeabilized and washed on a second microfluidic chip. In some cases, cells can be fixed and / or permeabilized and washed on a first microfluidic chip, and intracellularly labeled and washed on a second microfluidic chip. In some cases, cells can be marked on the surface and washed on a first microfluidic chip, fix and / or permeabilize, and wash on a second microfluidic chip, and intracellularly label and wash on a third microfluidic chip. In some cases, cells can be surface labeled and washed on a first microfluidic chip, fixed and / or permeabilized and washed by any off-chip method, and then intracellularly labeled and washed on a second microfluidic chip.

Como se representa en la FIG. 46, dependiendo de la metodología de preparación de la muestra utilizada, se pueden utilizar varias etapas secuenciales, cada una con una o más etapas de lavado (centrifugación, decantación, resuspensión), ocasionando pérdida de células y baja productividad. Las X muestran las etapas que pueden eliminarse mediante los dispositivos, métodos y sistemas descritos en el presente documento. Normalmente, después de cada etapa de lavado, el rendimiento de células puede ser ~ 80-90 % del número de partida de células y, por lo tanto, después de varias etapas de lavado secuenciales en un proceso, el rendimiento total de células puede caer a ~ 50 %. As depicted in FIG. 46 , depending on the sample preparation methodology used, several sequential stages can be used, each with one or more washing stages (centrifugation, decantation, resuspension), causing cell loss and low productivity. The Xs show the steps that can be eliminated by the devices, methods, and systems described herein. Typically after each wash step, the cell yield can be ~ 80-90% of the starting number of cells, and therefore after several sequential wash steps in a run, the total cell yield can drop. to ~ 50%.

Los métodos y dispositivos proporcionados en el presente documento pueden generar preparaciones de glóbulos blancos uniformes marcadas intracelularmente y en la superficie de forma rápida y a bajo coste.The methods and devices provided herein can generate uniform intracellularly and surface-labeled white blood cell preparations quickly and at low cost.

Una técnica que no implica una etapa de lavado puede tener Mab fluorescentes libres que pueden crear un aumento en la desviación típica tanto del valor de referencia como de la fluorescencia señal de las células, que puede afectar a la sensibilidad y precisión del ensayo. Los fragmentos celulares, plaquetas y otros desechos generados por el uso de una etapa de lisis pueden crear varios artefactos de citometría de flujo, tales como daños en los glóbulos blancos (WBC) que interfieren y disminuyen la calidad del análisis. Estos factores pueden controlarse en muestras de sangre normales. En muestras de pacientes, tales como muestras que contienen células de leucemia o cancerosas, las células malignas pueden ser altamente sensibles a los reactivos de lisis hipotónicos y la calidad general de la muestra puede ser menor (por ejemplo, las células muertas resultantes pueden unirse de manera no específica al Mab fluorescente y dar así falsos positivos y/o elevar los niveles de referencia). El manejo y manipulación de células puede ser perjudicial para los glóbulos blancos (WBC) frágiles, perturbando potencialmente los resultados, y puede exponer al trabajador del laboratorio a materiales y aerosoles de riesgo biológico.A technique that does not involve a washing step can have free fluorescent Mabs that can create an increase in the standard deviation of both the baseline and the signal fluorescence of the cells, which can affect the sensitivity and precision of the assay. Cell fragments, platelets, and other debris generated by the use of a lysis step can create various flow cytometric artifacts, such as white blood cell (WBC) damage, that interfere and decrease the quality of the analysis. These factors can be controlled in normal blood samples. In patient samples, such as samples containing leukemia or cancer cells, malignant cells can be highly sensitive to hypotonic lysis reagents and the overall quality of the sample can be lower (for example, the resulting dead cells can bind in non-specific way to the fluorescent Mab and thus give false positives and / or raise the reference levels). Handling and handling of cells can be detrimental to fragile white blood cells (WBCs), potentially disturbing results, and can expose the laboratory worker to biohazard materials and aerosols.

En el presente documento se describen sistemas, métodos y dispositivos para reemplazar la mayoría de las etapas asociadas con el procesamiento de glóbulos blancos (WBC) para citometría de flujo con procesos basados en chips DLD microfluídicos automatizados que pueden realizar todas las etapas de marcaje de superficie, fijación/permeabilización, marcaje intracelular y lavado con > 90 % de rendimiento de glóbulos blancos a partir de 10 ul de sangre en menos de 10 minutos. El enfoque descrito en el presente documento puede comenzar enriqueciendo la población de glóbulos blancos (WBC) de la sangre humana eliminando suavemente los glóbulos rojos (RBC), plaquetas y otras partículas sin introducir desechos u otros contaminantes en la preparación. El proceso de enriquecimiento descrito en el presente documento puede producir > 90 % de glóbulos blancos de partida mientras se mantienen las proporciones de células. En algunos casos, a medida que las células pasan a través del chip DLD, se pueden introducir reactivos en una corriente para marcar los glóbulos blancos (WBC), o preparar los glóbulos blancos (WBC) para teñirlos con un marcador de la superficie o intracelular. Los Mab no unidos, otros marcadores, colorantes, reactivos de fijación/permeabilización y otros contaminantes no deseados de los glóbulos blancos (WBC) marcados pueden eliminarse bañando suavemente las células en tampón durante el paso a través del chip DLD sin necesidad de una centrifugación, pipeteo y resuspensión, potencialmente dañinas para los glóbulos blancos (WBC).Described herein are systems, methods, and devices to replace most of the steps associated with white blood cell (WBC) processing for flow cytometry with automated microfluidic DLD chip-based processes that can perform all surface marking steps. , fixation / permeabilization, intracellular labeling and washing with> 90% yield of white blood cells from 10 ul of blood in less than 10 minutes. The approach described herein can begin by enriching the human blood white blood cell (WBC) population by gently removing red blood cells (RBC), platelets, and other particles without introducing debris or other contaminants into the preparation. The enrichment process described herein can produce> 90% starting white blood cells while maintaining cell ratios. In some cases, as cells pass through the DLD chip, reagents can be introduced into a stream to mark white blood cells (WBCs), or white blood cells (WBCs) can be prepared for staining with a surface or intracellular marker. . Unbound Mabs, other labels, dyes, binding / permeabilization reagents, and other unwanted contaminants from labeled white blood cells (WBCs) can be removed by gently bathing cells in buffer during passage through the DLD chip without the need for centrifugation, pipetting and resuspension, potentially harmful to white blood cells (WBC).

Los enfoques descritos en el presente documento pueden proporcionar beneficios significativos para los laboratorios clínicos y de investigación: los flujos de trabajo automatizados pueden proporcionar un procesamiento suave y uniforme de las células, un tiempo de respuesta rápido y muestras de glóbulos blancos (WBC) enriquecidas que tienen una alta viabilidad, pureza y viabilidad. Esto puede llevar a resultados de alta calidad aguas abajo y ganancias de coste/eficiencia para los laboratorios.The approaches described herein can provide significant benefits for clinical and research laboratories: automated workflows can provide smooth and consistent cell processing, fast response time, and enriched white blood cell (WBC) samples that they have high viability, purity and viability. This can lead to high-quality downstream results and cost / efficiency gains for laboratories.

Los métodos, sistemas y dispositivos descritos en el presente documento pueden centrarse específicamente en la preparación de glóbulos blancos (WBC) para citometría de flujo. Esta tecnología también puede tener una amplia aplicabilidad para técnicas analíticas aguas abajo más allá de la citometría de flujo, tales como pruebas basadas en ADN y ARN para el cáncer y otras enfermedades (por ejemplo, perfilado de expresión génica de células de leucemia utilizando micromatrices y secuenciación de ADN de última generación) y detección de células raras (por ejemplo, células madre, células tumorales circulantes o enfermedad mínima residual) donde puede mejorar de manera similar la recuperación celular, simplificar el procesamiento y mejorar la calidad y la eficiencia de las pruebas.The methods, systems, and devices described herein can specifically target the preparation of white blood cells (WBC) for flow cytometry. This technology may also have wide applicability for downstream analytical techniques beyond flow cytometry, such as DNA- and RNA-based testing for cancer and other diseases (e.g., leukemia cell gene expression profiling using microarrays and state-of-the-art DNA sequencing) and rare cell detection (e.g. stem cells, circulating tumor cells, or minimal residual disease) where you can similarly improve cell recovery, simplify processing, and improve the quality and efficiency of testing .

Los sistemas de procesamiento basados en chips microfluídicos descritos en el presente documento también se pueden adaptar para procesar células distintas de los glóbulos blancos (WBC) de sangre humana (por ejemplo, células eritroides, plaquetas y otras células de la médula ósea, otros fluidos corporales y tumores sólidos) abriendo nuevos campos de posibilidades para la comercialización de esta tecnología en la investigación y el diagnóstico clínico. The microfluidic chip-based processing systems described herein can also be adapted to process cells other than human blood white blood cells (WBCs) (eg, erythroid cells, platelets and other bone marrow cells, other body fluids. and solid tumors) opening new fields of possibilities for the commercialization of this technology in research and clinical diagnosis.

Las muestras de partida más grandes pueden ser problemáticas para pacientes pediátricos y anémicos, pacientes que requieran múltiples análisis de sangre o estén en tratamiento, así como en estudios con animales pequeños (por ejemplo, se pueden usar < 10 ul de muestras de ratones, sin que se muera el animal, que permiten estudios longitudinales de, por ejemplo, farmacocinética, mutaciones cancerosas). Los pacientes pediátricos con síndrome mielodisplásico (MDS) u otros que presentan neoplasias hematológicas o que están sometidos a terapia a menudo pueden presentar recuentos muy bajos de glóbulos blancos (WBC). Los chips descritos en el presente documento pueden mitigar este problema de muestreo clínico.Larger starting samples can be problematic for pediatric and anemic patients, patients requiring multiple blood tests or undergoing treatment, as well as in small animal studies (e.g. <10 ul of mouse samples can be used, without death of the animal, which allow longitudinal studies of, for example, pharmacokinetics, cancer mutations). Pediatric patients with myelodysplastic syndrome (MDS) or others who have hematologic malignancies or who are undergoing therapy often they may have very low white blood cell (WBC) counts. The chips described herein can mitigate this clinical sampling problem.

La detección precisa, sensible y multiplexada de proteínas bioseñalizadoras, ADN o ARN, se puede utilizar para el diagnóstico personalizado de cánceres. Los ensayos basados en perlas (BBA) pueden medir una diversidad de proteínas solubles e intracelulares, entre las que se incluyen citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y proteínas de señalización celular fosforiladas mediante citometría de flujo. El ensayo ELISA o la transferencia de Western pueden ofrecer una reacción por muestra, donde el valor en BBA puede estar en la capacidad de multiplexar varias reacciones en cada perla. También se han usado perlas magnéticas con frecuencia en inmunoensayos. El chip descrito en el presente documento se puede configurar para preparar muestras para todos estos tipos de BBA.Accurate, sensitive and multiplexed detection of biosignal proteins, DNA or RNA, can be used for personalized diagnosis of cancers. Bead-based assays (BBA) can measure a variety of soluble and intracellular proteins, including cytokines, chemokines, growth factors, and phosphorylated cell signaling proteins using flow cytometry. ELISA or Western blotting can offer one reaction per sample, where the BBA value can be in the ability to multiplex several reactions on each bead. Magnetic beads have also been used frequently in immunoassays. The chip described herein can be configured to prepare samples for all of these types of BBA.

El diagnóstico y la estadificación de leucemia/linfoma, o la evaluación de la enfermedad residual mínima (ERM) pueden requerir capacidades y habilidades de alto nivel. Las tecnologías que pueden estandarizar y simplificar manipulaciones de muestras de alta complejidad pueden aumentar la utilización e impulsar la disponibilidad de estas pruebas más allá de los laboratorios de referencia o grandes centros médicos hacia lugares más pequeños, más distribuidos, más cercanos al paciente. Asimismo, la tecnología descrita en el presente documento puede tener el potencial de acelerar la adopción de pruebas de citometría de flujo en países en desarrollo y con escasos recursos.Leukemia / lymphoma diagnosis and staging, or assessment of minimal residual disease (MRD) may require high-level skills and abilities. Technologies that can standardize and simplify highly complex sample manipulations can increase utilization and drive the availability of these tests beyond reference laboratories or large medical centers to smaller, more distributed locations closer to the patient. In addition, the technology described in this document may have the potential to accelerate the adoption of flow cytometry tests in resource-poor and developing countries.

Los enfoques de preparación de muestras descritos en el presente documento pueden mejorar las entradas para la citometría de flujo al proporcionar muestras estandarizadas con procesamiento suave y uniforme, sin pérdida selectiva de células y acomodación de tamaños de muestra pequeños, medianos y grandes. Los enfoques de preparación de muestras descritos en el presente documento pueden proporcionar una mejor economía de laboratorio, por ejemplo, el menor tiempo para obtener resultados, y la necesidad de menos habilidades técnicas puede dar como resultado un menor coste medio, la automatización puede significar menos tiempo de trabajo y más productividad, y menos reactivos puede significar un menor coste. Los enfoques de preparación de muestras pueden ser de amplia aplicación, por ejemplo, para el enriquecimiento celular para una miríada de aplicaciones posteriores (por ejemplo, citometría de flujo, citometría de masas, ensayos de ADN/ARN, ensayos de células raras, ensayos funcionales, pueden procesar muchos tipos de células diferentes (por ejemplo, sangre, médula ósea (BM), fluidos corporales) y pueden admitir otras plataformas tecnológicas (por ejemplo, ensayos magnéticos y basados en perlas). Los enfoques de preparación de muestras pueden ofrecer un acceso más amplio al mercado (por ejemplo, técnicas más sencillas pueden acercar las pruebas al paciente, técnicas más sencillas y de menor coste pueden favorecer la difusión de la tecnología en los países en desarrollo, técnicas más sencillas y de menor coste pueden impulsar el desarrollo de nuevas aplicaciones, y la estandarización puede impulsar el desarrollo de nuevas aplicaciones clínicas.The sample preparation approaches described herein can improve inputs for flow cytometry by providing standardized samples with smooth and uniform processing, without selective cell loss, and accommodation of small, medium, and large sample sizes. The sample preparation approaches described herein can provide better laboratory economics, for example, less time to get results, and the need for fewer technical skills can result in lower average cost, automation can mean less. uptime and more productivity, and fewer reagents can mean lower cost. Sample preparation approaches can be broadly applicable, e.g. for cell enrichment for a myriad of downstream applications (e.g. flow cytometry, mass cytometry, DNA / RNA assays, rare cell assays, functional assays , can process many different cell types (e.g. blood, bone marrow (BM), body fluids) and can support other technology platforms (e.g. magnetic and bead-based assays). Sample preparation approaches can offer a broader access to the market (for example, simpler techniques can bring testing closer to the patient, simpler and lower-cost techniques can promote diffusion of technology in developing countries, simpler and lower-cost techniques can drive development of new applications, and standardization can drive the development of new clinical applications.

Los agentes antineoplásicos dirigidos más nuevos pueden requerir un seguimiento diagnóstico adjunto de pacientes individuales para elegir con precisión los mejores fármacos y para determinar y ajustar la dosis y el calendario de los fármacos administrados en función de la respuesta temprana. Están surgiendo inmunoterapias antineoplásicas que se centran en las vulnerabilidades específicas de mutaciones de cáncer de las células cancerosas involucradas en la capacidad de respuesta del sistema inmunológico contra el cáncer. Los pacientes en estudios clínicos o que se someten a estos tipos de tratamientos pueden requerir pruebas de citometría de flujo extensas para evaluar su estado con el fin de calificarlos para el tratamiento y evaluar/supervisar la eficacia del tratamiento. La estandarización de las entradas de muestra para estas emocionantes modalidades terapéuticas emergentes puede ser imperativa.Newer targeted antineoplastic agents may require adjunct diagnostic follow-up of individual patients to accurately choose the best drugs and to determine and adjust the dose and timing of the drugs administered based on early response. Antineoplastic immunotherapies are emerging that focus on the specific vulnerabilities of cancer mutations of cancer cells involved in the immune system's responsiveness against cancer. Patients in clinical studies or undergoing these types of treatments may require extensive flow cytometry testing to assess their status in order to qualify for treatment and assess / monitor the efficacy of treatment. Standardization of sample inputs for these exciting emerging therapeutic modalities may be imperative.

F. Dispositivo de "lavado de coches" con paredes separadorasF. "Car wash" device with partition walls

Un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, "lavado de coches") tal como se proporciona en el presente documento puede comprender además un mecanismo para reducir la mezcla entre corrientes de flujo o fluidos que fluyen en paralelo laminares. Con el tiempo se puede producir la mezcla entre corrientes de flujo paralelas, lo cual puede contaminar la salida de un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento. Por tanto, puede existir una compensación entre los tiempos de procesamiento prolongados que pueden ser necesarios para algunas corrientes químicas o enzimáticas y tener una baja contaminación en una salida final de un dispositivo de lavado de coches tal como se proporciona en el presente documento. Por ejemplo, los tiempos de incubación para la fijación y/o permeabilización pueden ser de ~ 10 min, mientras que el marcaje con un agente de marcaje (por ejemplo, anticuerpos, sondas) puede ser de ~ 5 min. En comparación, la Tabla 1 muestra coeficientes de difusión de algunos reactivos.A multi-stream device (eg, "car wash") as provided herein may further comprise a mechanism for reducing mixing between flow streams or laminar parallel-flowing fluids. Mixing between parallel flow streams can occur over time, which can contaminate the outlet of a device as provided herein. Thus, there can be a trade-off between the long processing times that may be required for some chemical or enzyme streams and having low contamination at a final outlet from a car wash device as provided herein. For example, incubation times for fixation and / or permeabilization can be ~ 10 min, while labeling with a labeling agent (eg, antibodies, probes) can be ~ 5 min. In comparison, Table 1 shows diffusion coefficients for some reagents.

Tabla 1: Coeficientes de difusión de reactivos comunes Table 1: Diffusion coefficients of common reagents

continuacióncontinuation

Los reactivos con coeficientes de difusión relativamente pequeños (por ejemplo, metanol), pueden difundirse a corrientes adyacentes incluso con tiempos de incubación cortos, lo que puede llevar a que un porcentaje significativo del o de los reactivos entre en una corriente de producto, como puede predecirse mediante un modelo de difusión de fuente limitada (FIG. 22). En algunos casos, el ángulo de flujo de partículas se puede ajustar con respecto a las corrientes de flujo horizontal. En algunos casos, se usa una pared separadora para separar corrientes de flujo adyacentes en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento. En algunos casos, un dispositivo de múltiples corrientes tal como se proporciona en el presente documento comprende una o más paredes separadoras. En algunos casos, un dispositivo de múltiples corrientes tal como se proporciona en el presente documento comprende una pluralidad de paredes separadoras. Las paredes separadoras pueden estar en pares. En algunos casos, una del par de paredes separadoras se extiende desde una porción de entrada de un canal que comprende el par de paredes separadoras, mientras que la otra del par se extiende desde una porción de salida del canal. En algunos casos, una pared separadora o un par de paredes separadoras son paralelas al flujo de corriente y no interfieren con los patrones de flujo de corriente. El par de paredes separadoras pueden ser opuestas. Como se muestra en la FIG. 24A y B, el par de paredes separadoras pueden estar escalonadas entre sí, con lo que una del par está más cerca de una primera pared que delimita el canal, mientras que la otra del par está más cerca de una segunda pared que delimita el canal. En algunos casos, un par de paredes separadoras comprende un espacio entre las paredes separadoras en el par de paredes separadoras (por ejemplo, FIG. 24A y B). El espacio puede comprender una anchura tal que las partículas puedan pasar a través del espacio. En algunos casos, un dispositivo de múltiples corrientes tal como se proporciona en el presente documento comprende una pluralidad de pares de paredes separadoras (por ejemplo, FIG. 32). Como se representa en la FIG. 32, cada una del par de paredes separadoras puede estar escalonada y puede comprender un espacio entre el par que está configurado para permitir que las partículas que se desvían a través de una matriz de obstáculos (por ejemplo, matriz DLD) pasen entre el par de paredes separadoras. En algunos casos, se pone una pared separadora o un par de paredes separadoras entre una corriente de reactivo (por ejemplo, químico o enzima) y una corriente de tampón adyacente (por ejemplo, tampón de lavado).Reagents with relatively small diffusion coefficients (for example, methanol), can diffuse into adjacent streams even with short incubation times, which can lead to a significant percentage of the reagent (s) entering a product stream, as can predicted by a limited source diffusion model ( FIG. 22 ). In some cases, the particle flow angle can be adjusted with respect to horizontal flow streams. In some cases, a partition wall is used to separate adjacent flow streams in a device as provided herein. In some cases, a multi-stream device as provided herein comprises one or more partition walls. In some cases, a multi-stream device as provided herein comprises a plurality of partition walls. The partition walls can be in pairs. In some cases, one of the pair of spacer walls extends from an inlet portion of a channel comprising the pair of spacer walls, while the other of the pair extends from an outlet portion of the channel. In some cases, a partition wall or a pair of partition walls are parallel to current flow and do not interfere with current flow patterns. The pair of partition walls can be opposite. As shown in FIG. 24A and B , the pair of separating walls can be staggered to each other, whereby one of the pair is closer to a first wall that delimits the channel, while the other of the pair is closer to a second wall that delimits the channel. . In some cases, a pair of partition walls comprises a space between the partition walls in the pair of partition walls (eg FIG. 24A and B ). The space may comprise a width such that the particles can pass through the space. In some cases, a multi-stream device as provided herein comprises a plurality of pairs of partition walls (eg, FIG. 32 ). As depicted in FIG. 32 , each of the pair of separating walls may be staggered and may comprise a space between the pair that is configured to allow particles that are deflected through an obstacle matrix (e.g., DLD matrix) to pass between the pair of partition walls. In some cases, a partition wall or pair of partition walls is placed between a reagent stream (eg, chemical or enzyme) and an adjacent buffer stream (eg, wash buffer).

Una pared separadora o un par de paredes separadoras en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento puede servir para aumentar sustancialmente la cantidad de tiempo que una partícula permanece en una corriente de flujo (por ejemplo, reactivo). El aumento en el tiempo que una partícula permanece en una corriente de flujo se puede aumentar en al menos, como máximo, menos de, más de, o aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % del tiempo que una partícula pasaría en una corriente de flujo (por ejemplo, corriente de flujo de reactivo) en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento que no comprende una pared separadora o un par de paredes separadoras.A partition wall or a pair of partition walls in a device as provided herein can serve to substantially increase the amount of time that a particle remains in a flow stream (eg, reactant). The increase in time that a particle remains in a flow stream can be increased by at least, at most, less than, more than, or approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 , 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 , 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 , 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% of the time that a particle would spend in a flow stream (for example, stream of reagent flow) in a device as provided herein that does not comprise a partition wall or a pair of partition walls.

Una pared separadora o un par de paredes separadoras pueden servir para limitar o bloquear sustancialmente la difusión de un reactivo (por ejemplo, químico y/o enzimático) a una corriente de flujo adyacente en un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, lavado de coches) tal como se proporciona en el presente documento. La difusión puede limitarse en al menos, como máximo, menos de, más de, o aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %.A partition wall or a pair of partition walls can serve to substantially limit or block the diffusion of a reagent (eg, chemical and / or enzymatic) to an adjacent flow stream in a multi-stream device (eg, car wash ) as provided herein. Diffusion can be limited to at least, at most, less than, more than, or about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100%.

En algunos casos, una corriente de flujo en un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, lavado de coches) tal como se proporciona en el presente documento comprende un reactivo de lisis. En algunos casos, el reactivo de lisis comprende un detergente. En algunos casos, el detergente comprende Triton X-100, SDS, CHAPS o Tween-20. In some cases, a flow stream in a multi-stream device (eg, car wash) as provided herein comprises a lysis reagent. In some cases, the lysis reagent comprises a detergent. In some cases, the detergent comprises Triton X-100, SDS, CHAPS, or Tween-20.

En algunos casos, una corriente de flujo en un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, lavado de coches) tal como se proporciona en el presente documento comprende un tampón. El tampón puede ser un tampón de lavado. El tampón puede ser F108. Ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES); Ácido N-(2-acetamido)iminodiacético (ADA); Acetato de magnesio; Acetato sódico; base Trizma®; 2-Amino-2-metil-1-propanol (AMP); Ácido aminoacético; Ácido aminoetanoico; 2-Amino-2-metil-1,3-propanodiol (AMPD); Fosfato monobásico de amonio; Fosfato dibásico de sodio y amonio tetrahidratado; Fosfato dibásico de sodio y amonio tetrahidratado; Bicarbonato de amonio; Fosfato monobásico de amonio; 5,5-Dietilbarbiturato de sodio; Ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES); Bis-(2-hidroxietil)amina, 2,2'-Iminodietanol (Dietanolamina); 2-Bis(2-hidroxietil)amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol; Bis(2-hidroxietil)amino-tris(hidroximetil)metano; N,N-Bis(2-hidroxietil)glicina; N,N-Bis(2-hidroxietil)taurina; 2,2-Bis(hidroximetil)-2,2',2"-nitrilotrietanol; BIS-TRIS; Acetato de calcio hidratado; Carbonato de calcio; Citrato de calcio tribásico tetrahidratado; Formiato de calcio; CAPS; Ácido N-(carbamoilmetil)-2-aminoetanosulfónico; Ácido (carbamoilmetilamino)etanosulfónico; Ácido N-(carbamoilmetil)iminodiacético; N-(carbamoilmetil)taurina; CHES; Ácido cítrico; Ácido 3-(cidohexilamino)-1-propanosulfónico; MOPS; HEPES; Imidazol; HEPPS; Ácido fórmico; Glicina; EPPS; Sal edetato disódico deshidratada; Acetato de magnesio; Acetato de litio; Ácido oxálico; Solución salina tamponada con fosfato; Piperazina; PIPES; Bicarbonato de potasio; Carbonato de potasio; Cloruro de potasio; Cloruro de litio; Fosfato potásico; Ácido propiónico; Acetato sódico; Bicarbonato de sodio; Carbonato de sodio; Citrato de sodio; Fosfato de sodio; Tetraborato de sodio; Solución tampón STE; Solución tampón STET; Solución salina tamponada con TRIS; Solución tampón TRIS-EDTA; Pirofosfato de sodio tetrabásico; Carbonato de Trizma®; Clorhidrato de Trizma®; Maleato de Trizma®; TRIS NaCl Tween 20; Trietanolamina; Acetato de Trizma®; y/o TAPS.In some cases, a flow stream in a multi-stream device (eg, car wash) as provided herein comprises a buffer. The buffer can be a wash buffer. The buffer can be F108. N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES); N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA); Magnesium acetate; Sodium acetate; Trizma® base; 2-Amino-2-methyl-1-propanol (AMP); Aminoacetic acid; Aminoethanoic acid; 2-Amino-2-methyl-1,3-propanediol (AMPD); Monobasic Ammonium Phosphate; Dibasic sodium ammonium phosphate tetrahydrate; Dibasic sodium ammonium phosphate tetrahydrate; Ammonium bicarbonate; Monobasic Ammonium Phosphate; Sodium 5,5-Diethylbarbiturate; N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES); Bis- (2-hydroxyethyl) amine, 2,2'-Iminodiethanol (Diethanolamine); 2-Bis (2-hydroxyethyl) amino-2- (hydroxymethyl) -1,3-propanediol; Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methane; N, N-Bis (2-hydroxyethyl) glycine; N, N-Bis (2-hydroxyethyl) taurine; 2,2-Bis (hydroxymethyl) -2,2 ', 2 "-nitrilotrietanol;BIS-TRIS; Calcium acetate hydrate; Calcium carbonate; Tribasic calcium citrate tetrahydrate; Calcium formate; CAPS; N- (carbamoylmethyl) acid -2-aminoethanesulfonic; Acid (carbamoylmethylamino) ethanesulfonic; N- (carbamoylmethyl) iminodiacetic acid; N- (carbamoylmethyl) taurine; CHES; Citric acid; 3- (Acidhexylamino) -1-propanesulfonic acid; MOPS; HEPES; Imidazole; HEPPS; Formic acid; Glycine; EPPS; Dehydrated edetate disodium salt; Magnesium acetate; Lithium acetate; Oxalic acid; Phosphate Buffered Saline; Piperazine; PIPES; Potassium bicarbonate; Potassium carbonate; Potassium chloride; Lithium chloride; Potassium phosphate; Propionic acid; Sodium acetate; Sodium bicarbonate; Sodium carbonate; Sodium citrate; Sodium phosphate; Sodium tetraborate; STE buffer solution; STET buffer solution; TRIS buffered saline; TRIS-EDTA buffer solution; Tetrabasic sodium pyrophosphate; Trizma® Carbonate; Trizma® Hydrochloride; Trizma® Maleate; TRIS NaCl Tween 20; Triethanolamine; Trizma® Acetate; and / or TAPS.

En algunos casos, una corriente de flujo en un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, lavado de coches) tal como se proporciona en el presente documento comprende un reactivo. El reactivo puede ser un reactivo químico o enzimático. El reactivo puede ser un fijador, agente de permeabilización, enzima, agente de escisión, agente citotóxico, molécula pequeña, resto de fármaco, agente quimioterapéutico o una combinación o mezcla de los mismos.In some cases, a flow stream in a multi-stream device (eg, car wash) as provided herein comprises a reagent. The reagent can be a chemical or enzymatic reagent. The reagent can be a fixative, permeation agent, enzyme, cleavage agent, cytotoxic agent, small molecule, drug moiety, chemotherapeutic agent, or a combination or mixture thereof.

En algunos casos, el reactivo es un fijador. El fijador puede ser formaldehído, glutaraldehído, alcohol metílico y/o alcohol etílico. El fijador puede ser formalina tamponada con fosfato; formal calcio; formal solución salina; formalina de zinc (sin tampón); Fijador de Zenker; Fijador de Helly; Fijador B-5; Solución de Bouin; Fijador de Hollande; Solución de Gendre; Solución de Clarke; Solución de Carnoy; Methacarn; Formalina alcohólica; y/o alcohol acético de formol. In some cases, the reagent is a fixative. The fixative can be formaldehyde, glutaraldehyde, methyl alcohol and / or ethyl alcohol. The fixative can be phosphate buffered formalin; formal calcium; formal saline solution; zinc formalin (without buffer); Zenker's fixative; Helly's Fixer; Fixative B-5; Bouin's solution; Hollande's fixator; Gendre's solution; Clarke's solution; Carnoy's solution; Methacarn; Alcoholic formalin; and / or formaldehyde acetic alcohol.

En algunos casos, el reactivo es un agente de permeabilización. El agente de permeabilización puede ser detergentes, alcoholes (alcohol metílico), tóxicos que rompen la membrana como la digitonina, melitina y/o saponina. Los detergentes pueden ser hidrobromuro de 2-aminoetilmetantiosulfonato, CHAPS, CHAPSO, digitonina, dodecil sulfato de litio, n-dodecil-beta-D-maltopiranósido, n-octil-beta-d-glucopiranósido, NDSB-195, NDSB-201, NDSB-211, NDSB-221, NDSB-256, NONIDET-P40, Pluronic F68, Pluronic F-127, MTSES, Tween-20, Tween-80, Tween-40, dodecil sulfato de sodio (SDS), Triton X-100, Triton X-114, MTSET, sulfobetaína-10, sulfobetaína-12 o sulfobetaína-14, Igepal® CA-630 o n-dodecil-p-D-maltósido (DDM).In some cases, the reagent is a permeation agent. The permeation agent can be detergents, alcohols (methyl alcohol), membrane-breaking toxins such as digitonin, melittin and / or saponin. Detergents can be 2-aminoethylmethanthiosulfonate hydrobromide, CHAPS, CHAPSO, digitonin, lithium dodecyl sulfate, n-dodecyl-beta-D-maltopyranoside, n-octyl-beta-d-glucopyranoside, NDSB-195, NDSB-201, NDSB -211, NDSB-221, NDSB-256, NONIDET-P40, Pluronic F68, Pluronic F-127, MTSES, Tween-20, Tween-80, Tween-40, Sodium dodecyl sulfate (SDS), Triton X-100, Triton X-114, MTSET, sulfobetaine-10, sulfobetaine-12 or sulfobetaine-14, Igepal® CA-630 or n-dodecyl-pD-maltoside (DDM).

En algunos casos, el reactivo comprende un agente de unión. Un reactivo que comprende un agente de unión también se puede denominar agente de marcaje. El agente de marcaje puede ser cualquier agente de marcaje conocido en la técnica. El agente de marcaje puede ser un agente de marcaje de la superficie celular. El agente de marcaje puede ser un agente de marcaje intracelular. El agente de marcaje puede ser anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, sondas de ácido nucleico, aptámeros, balizas moleculares y/o sustratos enzimáticos. el agente de unión puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, un ácido nucleico (por ejemplo, sonda), aptámero, molécula pequeña o baliza molecular. El anticuerpo puede ser un anticuerpo primario o secundario. El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos y fragmentos de anticuerpo, siempre que muestren la actividad biológica deseada. La expresión "anticuerpo multiespecífico" puede usarse en el sentido más amplio y abarca específicamente un anticuerpo que comprende un dominio de unión a antígeno que tiene especificidad poliepitópica (es decir, es capaz de unirse específicamente a dos, o más, epítopos diferentes en una molécula biológica o es capaz de unirse específicamente a epítopos en dos, o más, moléculas biológicas diferentes). Un ejemplo específico de un dominio de unión a antígeno es una unidad V^hV^lcompuesta por un dominio variable de cadena pesada (V^h) y un dominio variable de cadena ligera (V^l). Dichos anticuerpos multiespecíficos pueden incluir, pero sin limitación, anticuerpos de longitud completa, anticuerpos que tienen dos o más dominios V^ly V^h, fragmentos de anticuerpo (tales como Fab, Fv, dsFv, scFV, diacuerpos, diacuerpos biespecíficos y triacuerpos, fragmentos de anticuerpos que se han unido de forma covalente o no covalente. Un "anticuerpo biespecífico" puede ser un anticuerpo multiespecífico que comprende un dominio de unión a antígeno que puede ser capaz de unirse específicamente a dos epítopos diferentes en una molécula biológica o puede ser capaz de unirse específicamente a epítopos en dos moléculas biológicas diferentes. También se puede hacer referencia al anticuerpo biespecífico por tener "especificidad dual" o como "específico dual". En algunos casos, el reactivo de unión es una sonda de ácido nucleico, en donde la sonda de ácido nucleico comprende uno o nucleótidos que comprenden un marcador incorporado en la sonda de ácido nucleico. La sonda de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN o una combinación de los mismos. Los nucleótidos marcados se pueden marcar con colorantes Alexa Fluor®. Otros marcadores fluorescentes en nucleótidos para usar en sondas de ácido nucleico pueden ser, pero sin limitación, Dietilaminocumarina (DEAC), Cianina 3 (Cy3), Cianina 5 (Cy5), Fluoresceína (FITC), Lisamina, R110, R6G, Tetrametilrodamina (TAMRA) y Rojo Texas. Los nucleótidos marcados se pueden marcar con un hapteno. El marcador hapteno puede ser, pero sin limitación, Amino-digoxigenina (DIG), Biotina, Dinitrofenilo (DNP) y Fluoresceína (FITC). Los nucleótidos marcados pueden comprender un marcador radiactivo. Por ejemplo, los nucleótidos marcados radiactivos pueden incluir, pero sin limitación, 33P, 32P, 35S, 3H y 14C nucleótidos. En algunos casos, el agente de unión se une o se dirige hacia o contra un señalizador de la superficie celular. El señalizador de la superficie celular puede ser cualquier señalizador de superficie celular como se proporciona aquí. En algunos casos, el agente de unión se une o se dirige a o contra un señalizador intracelular. El señalizador intracelular puede ser cualquier señalizador intracelular tal como se proporciona en el presente documento. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para hacer fluir una corriente de flujo de reactivo que comprende un agente de unión, en donde el agente de unión se une a un señalizador de la superficie celular. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para hacer fluir una corriente de flujo de reactivo que comprende un agente de unión, en donde el agente de unión se une a un señalizador intracelular. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para hacer fluir una pluralidad de corrientes de flujo, en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un agente de unión que se une a un señalizador de la superficie celular, y al menos una de las corrientes de flujo comprende un agente de unión que se une a un señalizador intracelular. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento comprende una pluralidad de corrientes de flujo, en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un reactivo, en donde el reactivo es un agente de unión, y en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un reactivo que no es un agente de unión. El reactivo que no es agente de unión puede ser una enzima, un fijador, un agente de permeabilización o una combinación o mezcla de los mismos.In some cases, the reagent comprises a binding agent. A reagent comprising a binding agent can also be referred to as a labeling agent. The labeling agent can be any labeling agent known in the art. The labeling agent can be a cell surface labeling agent. The labeling agent can be an intracellular labeling agent. The labeling agent can be antibodies, antibody fragments, nucleic acid probes, aptamers, molecular beacons, and / or enzyme substrates. the binding agent can be an antibody, antibody fragment, nucleic acid (eg, probe), aptamer, small molecule, or molecular beacon. The antibody can be a primary or secondary antibody. The term "antibody" is used herein in the broadest sense and specifically encompasses monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies, and antibody fragments, provided they exhibit the desired biological activity. The term "multispecific antibody" can be used in the broadest sense and specifically encompasses an antibody that comprises an antigen-binding domain that has polyepitopic specificity (that is, is capable of specifically binding two, or more, different epitopes on a molecule. biological or is capable of specifically binding epitopes on two, or more, different biological molecules). A specific example of an antigen-binding domain is a V ^h V ^{l unit} composed of a heavy chain variable domain (V ^h ) and a light chain variable domain (V ^l ). Such multispecific antibodies may include, but are not limited to, full-length antibodies, antibodies having two or more V ^l and V ^h domains, antibody fragments (such as Fab, Fv, dsFv, scFV, diabodies, bispecific diabodies, and tri-bodies, fragments of antibodies that have been linked covalently or non-covalently. A "bispecific antibody" can be a multispecific antibody that comprises an antigen-binding domain that may be capable of specifically binding to two different epitopes on a biological molecule or it may be capable of specifically binding to epitopes on two different biological molecules. The bispecific antibody may also be referred to as having "dual specificity" or as "dual specific." In some cases, the binding reagent is a nucleic acid probe, where the nucleic acid probe comprises one or more nucleotides comprising a marker incorporated into the nucleic acid probe. leico can comprise DNA, RNA, or a combination thereof. The labeled nucleotides can be labeled with Alexa Fluor® dyes. Other nucleotide fluorescent markers for use in nucleic acid probes include, but are not limited to, Diethylaminocoumarin (DEAC), Cyanine 3 (Cy3), Cyanine 5 (Cy5), Fluorescein (FITC), Lisamine, R110, R6G, Tetramethylrhodamine (TAMRA ) and Texas Red. The labeled nucleotides can be labeled with a hapten. The hapten marker can be, but is not limited to, Amino-digoxigenin (DIG), Biotin, Dinitrophenyl (DNP), and Fluorescein (FITC). The labeled nucleotides can comprise a radioactive label. For example, radioactive labeled nucleotides can include, but are not limited to, 33P, 32P, 35S, 3H, and 14C nucleotides. In some cases, the binding agent binds or is directed to or against a cell surface marker. The cell surface marker can be any cell surface marker as provided herein. In some cases, the binding agent binds or targets an intracellular marker. The intracellular marker can be any intracellular marker as provided herein. In some cases, a device as provided herein is adapted to flow a reagent flow stream comprising a binding agent, wherein the binding agent binds to a cell surface marker. In some cases, a device as provided herein is adapted to flow a reagent flow stream comprising a binding agent, wherein the binding agent binds to an intracellular marker. In some cases, a device as provided herein is adapted to flow a plurality of flow streams, wherein at least one of the flow streams comprises a binding agent that binds to a cell surface marker, and at least one of the flow streams comprises a binding agent that binds to a intracellular marker. In some cases, a device as provided herein comprises a plurality of flow streams, wherein at least one of the flow streams comprises a reagent, wherein the reagent is a binding agent, and wherein at least one of the flow streams comprises a reagent that is not a binding agent. The non-binding agent reagent may be an enzyme, a fixative, a permeation agent, or a combination or mixture thereof.

En algunos casos, el reactivo comprende una enzima. En algunos casos, el reactivo comprende una pluralidad de enzimas. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento comprende una pluralidad de corrientes de flujo, en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un reactivo, en donde el reactivo es una enzima. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento comprende una pluralidad de corrientes de flujo, en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un reactivo, en donde el reactivo es una enzima, y en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un reactivo que no es una enzima. El reactivo que no es una enzima puede ser un agente de unión, un fijador, un agente de permeabilización o una combinación o mezcla de los mismos. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento comprende una pluralidad de corrientes de flujo, en donde más de una de las corrientes de flujo comprende un reactivo, en donde el reactivo en cada una de las más de una corriente de flujo es una enzima, en donde la enzima en cada una de las más de una corrientes de flujo comprende la misma enzima o una enzima diferente. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para hacer fluir una pluralidad de corrientes de flujo, en donde al menos una de las corrientes de flujo comprende un agente de unión que se une a un señalizador de la superficie celular, al menos una de las corrientes de flujo comprende un agente de unión que se une a un señalizador intracelular, y al menos una de las corrientes de flujo comprende una enzima. La enzima puede ser una enzima de restricción, proteasa, polimerasa, ligasa, nucleasa, endonucleasa, exonucleasa, fosfatasa, metilasa, topoisomerasa o una combinación o mezcla de las mismas. La polimerasa puede ser cualquier polimerasa conocida en la técnica. La polimerasa puede ser una ADN polimerasa dependiente de ADN. Los ejemplos de ADN polimerasa dependiente de ADN incluyen, pero sin limitación, polimerasa de Klenow, con o sin 3'-exonucleasa, ADN polimerasa de Bst, polimerasa de Bca, ADN polimerasa de phi.29, polimerasa Vent, polimerasa Deep Vent, polimerasa de Taq, polimerasa de T4 y ADN polimerasa 1 de E. coli, derivados de las mismas, o una mezcla de polimerasas. En algunos casos, la polimerasa no comprende una actividad 5'-exonucleasa. En otros casos, la polimerasa comprende actividad 5'-exonucleasa. La polimerasa puede ser una ADN polimerasa dependiente de ARN o transcriptasa inversa (RT). Los ejemplos de RT incluyen, pero sin limitación, transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLv ), transcriptasa inversa del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), transcriptasa inversa del virus del sarcoma de rous (RSV), transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV), transcriptasa inversa del virus asociado a rous (RAV) y transcriptasa inversa del virus asociado a la mieloblastosis (MAV) u otras transcriptasas inversas de virus del sarcoma-leucosis aviar (ASLV), y RT modificadas derivadas de las mismas. La exonucleasa puede ser, pero sin limitación, exonucleasa 1, exonucleasa 7 o una combinación o mezcla de las mismas. Las endonucleasas pueden ser, por ejemplo, pero sin limitación, a endonucleasa de frijol mungo o endonucleasa S1 o una combinación o mezcla de las mismas.In some cases, the reagent comprises an enzyme. In some cases, the reagent comprises a plurality of enzymes. In some cases, a device as provided herein comprises a plurality of flow streams, wherein at least one of the flow streams comprises a reagent, wherein the reagent is an enzyme. In some cases, a device as provided herein comprises a plurality of flow streams, wherein at least one of the flow streams comprises a reagent, wherein the reagent is an enzyme, and wherein at least one of the flow streams comprise a reagent that is not an enzyme. The non-enzyme reagent can be a binding agent, a fixative, a permeation agent, or a combination or mixture thereof. In some cases, a device as provided herein comprises a plurality of flow streams, wherein more than one of the flow streams comprises a reagent, wherein the reagent in each of the more than one flow streams flow is an enzyme, wherein the enzyme in each of the more than one flow streams comprises the same enzyme or a different enzyme. In some cases, a device as provided herein is adapted to flow a plurality of flow streams, wherein at least one of the flow streams comprises a bonding agent that binds to a surface marker. cellular, at least one of the flow streams comprises a binding agent that binds to an intracellular marker, and at least one of the flow streams comprises an enzyme. The enzyme can be a restriction enzyme, protease, polymerase, ligase, nuclease, endonuclease, exonuclease, phosphatase, methylase, topoisomerase, or a combination or mixture thereof. The polymerase can be any polymerase known in the art. The polymerase can be a DNA-dependent DNA polymerase. Examples of DNA-dependent DNA polymerase include, but are not limited to, Klenow polymerase, with or without 3'-exonuclease, Bst DNA polymerase, Bca polymerase, phi.29 DNA polymerase, Vent polymerase, Deep Vent polymerase, polymerase of Taq, T4 polymerase and E. coli DNA polymerase 1, derivatives thereof, or a mixture of polymerases. In some cases, the polymerase does not comprise a 5'-exonuclease activity. In other cases, the polymerase comprises 5'-exonuclease activity. The polymerase can be an RNA-dependent DNA polymerase or reverse transcriptase (RT). Examples of RT include, but are not limited to, Moloney murine leukemia virus (M-MLv) reverse transcriptase, human immunodeficiency virus (HIV) reverse transcriptase, rous sarcoma virus (RSV) reverse transcriptase, Avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase, rous-associated virus (RAV) reverse transcriptase, and myeloblastosis-associated virus (MAV) reverse transcriptase or other avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) reverse transcriptases, and Modified RT derived therefrom. The exonuclease can be, but is not limited to, exonuclease 1, exonuclease 7, or a combination or mixture thereof. The endonucleases can be, for example, but not limited to, mung bean endonuclease or S1 endonuclease or a combination or mixture thereof.

En algunos casos, el reactivo comprende un marcador. En algunos casos, el reactivo comprende un agente de unión, en donde el agente de unión comprende un marcador. En algunos casos, el reactivo comprende una enzima, en donde la enzima comprende un marcador. El marcador se puede conjugar, unir o ligar a un reactivo tal como se proporciona en el presente documento. El marcador puede referirse a cualquier átomo o molécula conocida en la técnica que pueda usarse para proporcionar un efecto detectable y/o cuantificable. El marcador se puede unir a un ácido nucleico o proteína (por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo y/o enzima). En algunos casos, el marcador proporciona un efecto cuantificable. En algunos casos, el marcador proporciona un efecto detectable y cuantificable, Los marcadores pueden incluir, pero sin limitación, colorantes; radiomarcadores tales como 32P; restos de unión tales como biotina; haptenos tales como digoxigenina; restos luminogénicos, fosforescentes o fluorogénicos; etiquetas de masa; y colorantes fluorescentes solos o en combinación con restos que pueden suprimir o cambiar los espectros de emisión mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), Los marcadores pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radiactividad, colorimetría, gravimetría, difracción o absorción de rayos X, magnetismo, actividad enzimática, características de masa o comportamiento afectados por la masa (por ejemplo, espectrometría de masas de tiempo de vuelo MALDI) y similares. Un marcador puede ser un resto cargado (carga positiva o negativa) o, como alternativa, puede ser de carga neutra. En algunos casos, el marcador es un colorante fluorescente. El colorante fluorescente puede ser un tinte basado en ácido escuárico. Los colorantes basados en ácido escuárico se pueden seleccionar entre derivados de ciclobutenodiona, escuaraínas simétricas y asimétricas, compuestos de cefalosporina sustituidos, composiciones de escuaraína fluorada, alquilalcoxi escuaraínas o compuestos de escuarilio. Los colorantes basados en ácido escuárico se pueden seleccionar entre un colorante fluorescente rojo y un colorante fluorescente naranja, tal como el colorante fluorescente rojo que comprende 1,3-bis(1,3-dihidro-1,3,3-trimetil-2H-indol-2-iliden)metil]-2,4-dihidroxiciclobutenodiilio, bis(sal interna) y el colorante fluorescente naranja que comprende 2-(3,5-dimetilpirrol-2-il)-4-(3,5-dimetil-2H-pirrol-2-iliden)-3-hidroxi-2-ciclobuten-1-ona. Los marcadores pueden incluir o consistir en una secuencia de ácido nucleico o proteína, siempre que la secuencia que comprende el marcador sea detectable y/o cuantificable.In some cases, the reagent comprises a label. In some cases, the reagent comprises a binding agent, where the binding agent comprises a label. In some cases, the reagent comprises an enzyme, where the enzyme comprises a label. The label can be conjugated, attached, or linked to a reagent as provided herein. The label can refer to any atom or molecule known in the art that can be used to provide a detectable and / or quantifiable effect. The marker can be attached to a nucleic acid or protein (eg, antibody, antibody fragment, and / or enzyme). In some cases, the marker provides a measurable effect. In some cases, the marker provides a detectable and quantifiable effect. Markers can include, but are not limited to, dyes; radio markers such as 32P; binding moieties such as biotin; haptens such as digoxigenin; luminogenic, phosphorescent or fluorogenic moieties; mass labels; and fluorescent dyes alone or in combination with moieties that can suppress or change emission spectra by fluorescence resonance energy transfer (FRET), Markers can provide detectable signals by fluorescence, radioactivity, colorimetry, gravimetry, diffraction, or ray absorption X, magnetism, enzyme activity, mass characteristics or behavior affected by mass (eg, MALDI time-of-flight mass spectrometry), and the like. A marker can be a charged moiety (positively or negatively charged) or, alternatively, it can be neutrally charged. In some cases, the marker is a fluorescent dye. The fluorescent dye can be a squaric acid-based dye. Squaric acid based dyes can be selected from cyclobutenedione derivatives, symmetric and asymmetric squarains, substituted cephalosporin compounds, fluorinated squarine compositions, alkylalkoxy squaraines, or squarylium compounds. Squaric acid-based dyes can be selected from a red fluorescent dye and an orange fluorescent dye, such as the red fluorescent dye comprising 1,3-bis (1,3-dihydro-1,3,3-trimethyl-2H- indol-2-ylidene) methyl] -2,4-dihydroxycyclobutenediyl, bis (internal salt) and the orange fluorescent dye comprising 2- (3,5-dimethylpyrrol-2-yl) -4- (3,5-dimethyl- 2H-pyrrol-2-ylidene) -3-hydroxy-2-cyclobuten-1-one. Markers can include or consist of a nucleic acid or protein sequence, as long as the sequence comprising the marker is detectable and / or quantifiable.

En algunos casos, el reactivo comprende un agente citotóxico, toxina o agente quimioterapéutico. Por ejemplo, el agente citotóxico o la toxina puede ser, pero sin limitación, toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas, incluida la cadena A de difteria, fragmentos activos no de unión de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, o los tricotecenos, o combinaciones o mezclas de los mismos. Los ejemplos de toxinas de molécula pequeña pueden incluir, pero sin limitación, una caliqueamicina, maitansinoides, dolastatinas, aurostatinas, un tricoteceno, o CC1065, o los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina. Los ejemplos de agentes quimioterepéuticos incluyen, pero no se limitan a agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®); alquilsulfonatos, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético de topotecán (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos, adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno, tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma 1I y caliqueamicina omega ll (véase, por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor oral de alfa-4 integrina; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarcinostatina y cromóforos de antibióticos de enediina relacionados con cromoproteína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-1,norleucina, doxorrubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, inyección liposómica de doxorrubicina HCl (DOXIL®), doxorrubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®), doxorrubicina liposomal pegilada (CAELYX®) y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epiliostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor del ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complejo polisacarídico PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2'-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartículas obtenidas por ingeniería de albúminas de paclitaxel (ABRAXANE™) y docetaxel (TAXOTERE®); clorambucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino, tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATTN®) y carboplatino; vincas, que evitan que la polimerización de tubulina forme microtúbulos, incluyendo vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) y vinorelbina (NAVELBINE®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos, tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROc Al®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo nucleosídico de 1,3-dioxolano citosina; oligonucleótidos antisentido, particularmente, los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas, tales como la vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib), inhibidor del proteasoma (por ejemplo, PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2, tal como oblimersen sódico (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de EGFR (véase definición posterior); inhibidores de tirosina quinasa (véase definición a continuación); inhibidores de serina-treonina quinasa, tales como rapamicina (sirolimus, RAPa Mu NE®); inhibidores de farnesil transferasa, tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxiplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina. . Los agentes quimioterapéuticos adicionales pueden incluir "agentes anti hormonales" o "agentes terapéuticos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer. Pueden ser hormonas en si mismos, entre las que se incluyen, pero sin limitación: anti-estrógenos con perfil mixto agonista/antagonista, entre los que se incluyen, tamoxifeno (NOLVADEX®), 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTON®), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®), trioxifeno, keoxifeno, y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM) tales como SERM3; anti-estrógenos puros sin propiedades agonistas, tales como fulvestrant (FASLODEX®) y EM800 (dichos agentes pueden bloquear la dimerización del receptor de estrógenos (ER), inhibir la unión de ADN, aumentar la renovación de ER y/o suprimir los niveles de ER); inhibidores de la aromatasa, incluyendo inhibidores de aromatasa esteroideos tales como formestano y exemestano (AROMASIN®), e inhibidores de aromatasa no esteroideos tales como anastrazol (ARIMIDEX®), letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida, y otros inhibidores de aromatasa incluyendo vorozol (RIVISOR®), acetato de megestrol (MEGASE®), fadrozol y 4(5)-imidazoles; agonistas de la hormona liberadora de hormona lutenizante, incluyendo leuprolide (LUPRON® y e LiGARD®), goserelina, goserelina, buserelina y tripterelina; esteroides sexuales, incluyendo progestinas tales como acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, estrógenos tales como dietilestilbestrol y premarina, y andrógenos/retinoides tales fluoximesterona, ácido todo transretinóico y fenretinida; onapristona; anti-progesteronas; reguladores negativos del receptor de estrógenos (ERD); antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.In some cases, the reagent comprises a cytotoxic agent, toxin, or chemotherapeutic agent. For example, him Cytotoxic agent or toxin can be, but is not limited to, enzymatically active toxins and fragments thereof, including diphtheria A chain, non-binding active fragments of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii proteins, dianthin proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII and PAP-S), Momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, Sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restrictocin, phenomycin, enomycin, or the trichothecenes, or combinations or mixtures thereof. Examples of small molecule toxins can include, but are not limited to, a calicheamicin, maytansinoids, dolastatins, aurostatins, a trichothecene, or CC1065, or derivatives of these toxins that have toxin activity. Examples of chemotherapeutic agents include, but are not limited to, alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (CYTOXAN®); alkylsulfonates, such as busulfan, improsulfan, and piposulfan; aziridines, such as benzodopa, carboquone, methuredopa, and uredopa; ethyleneimines and methylmelamines, including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide, and trimethylomelamine; acetogenins (especially bullatacin and bullatacinone); delta-9-tetrahydrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachone; lapachol; colchicines; betulinic acid; a camptothecin (including the synthetic topotecan analog (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetylcamptothecin, scopolectin and 9-aminocamptothecin); bryostatin; calistatin; CC-1065 (including its synthetic analogs, adozelesin, carzelesin, and bizelesin); podophyllotoxin; podophyllinic acid; teniposide; cryptophycin (particularly cryptophycin 1 and cryptophycin 8); dolastatin; duocarmycin (including the synthetic analogs, KW-2189 and CB1-TM1); eleutherobine; pancratistatin; a sarcodictin; spongistatin; nitrogen mustards, such as chlorambucil, chlornaphazine, chlorophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembikine, phenesterine, prednimustine, trophosphamide, uracil mustard; nitrosoureas, such as carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, and ranimnustine; antibiotics, such as the enediin antibiotics (eg, calicheamicin, especially calicheamicin gamma 1I and calicheamicin omega ll (see, for example, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994 )); CDP323, an oral inhibitor of alpha-4 integrin; dynemycin, including dynemycin A; a speramycin; as well as neocarcinostatin chromophore and chromoprotein-related antibiotic chromophores), clarcinomysins, actinomycin, autramycin, azaserin, bleomycin, cactinomycin , carbycin, carminomycin, carzinophyllin, chromomycin, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-1, norleucine, doxorubicin (including ADRIAMYCIN®, morpholino-doxorubicin, cyanomorpholino-doxorubicin injection, lyromorpholino-doxorubicin injection, 2-doxorubicin injection doxorubicin HCl (DOXIL®), liposomal doxorubicin TLC D-99 (MYOCET®), pegylated liposomal doxorubicin (CAELYX®) and deoxydoxorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomi cinin, mitomycin, such as mitomycin C, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycin, peplomycin, porphyromycin, puromycin, chelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabolites, such as methotrexate, gemcitabine (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabine (XELODA®), an epothilone, and 5-fluorouracil (5-FU); folic acid analogs, such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; purine analogs, such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine; pyrimidine analogs, such as ancitabine, azacytidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxyfluridine, enocytabine, floxuridine; androgens, such as calusterone, dromostanolone propionate, epiliostanol, mepitiostan, testolactone; antisuprarenals, such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane; folic acid replenisher, such as frolinic acid; aceglatone; Aldophosphamide Glycoside; aminolevulinic acid; eniluracil; amsacrine; bestrabucilo; bisantreno; edatraxate; defofamin; demecolcin; diaziquone; elfornithine; elliptinium acetate; an epothilone; ethoglucid; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidainine; maytansinoids, such as maytansine and ansamitocins; mitoguazone; mitoxantrone; mopidanmol; nitraerine; pentostatin; fenamet; pyrarubicin; losoxantrone; 2-ethyl hydrazide; procarbazine; PSK® polysaccharide complex (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxane; rhizoxin; sizophirane; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquone; 2,2 ', 2'-trichlorotriethylamine; trichothecenes (especially toxin T-2, verracurin A, roridin A, and anguidine); urethane; vindesine (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazine; manomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacytosine; arabinoside ("Ara-C");thiotepa; taxoid, eg, paclitaxel (TAXOL®), nanoparticle formulation engineered from albumins of paclitaxel (ABRAXANE ™) and docetaxel (TAXOTERE®); chlorambucil; 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; platinum agents, such as cisplatin, oxaliplatin (eg, ELOXATTN®), and carboplatin; vincas, which prevent tubulin polymerization from forming microtubules, including vinblastine (VELBAN®), vincristine (ONCOVIN®), vindesine (ELDISINE®, FILDESIN®), and vinorelbine (NAVELBINE®); etoposide (VP-16); ifosfamide; mitoxantrone; leucovorin; novantrone; edatrexate; daunomycin; aminopterin; ibandronate; RFS 2000 topoisomerase inhibitor; Difluoromethylornithine (DMFO); retinoids, such as retinoic acid, including bexarotene (TARGRETIN®); bisphosphonates, such as clodronate (for example, BONEFOS® or OSTAC®), etidronate (DIDROc Al®), NE-58095, zoledronic acid / zoledronate (ZOMETA®), alendronate (FOSAMAX®), pamidronate (AREDIA®), tiludronate ( SKELID®) or risedronate (ACTONEL®); troxacitabine (a nucleoside analog of 1,3-dioxolane cytosine; antisense oligonucleotides, particularly those that inhibit the expression of genes in signaling pathways involved in aberrant cell proliferation, such as, for example, PKC-alpha, Raf, H- Ras, and epidermal growth factor receptor (EGF-R); vaccines, such as THERATOPE® vaccine and gene therapy vaccines, for example, ALLOVECTIN® vaccine, LEUVECTIN® vaccine, and VAXID® vaccine; topoisomerase 1 inhibitor ( for example, LURTOTECAN®); rmRH (for example, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); periphosine, COX-2 inhibitor (for example, celecoxib or etoricoxib) , proteasome inhibitor (eg, PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; Bcl-2 inhibitor, such as oblimersen sodium (GENASENSE®); pixantrone; EGFR inhibitors (see definition below); tyrosine kinase inhibitors (see definition below) on); serine-threonine kinase inhibitors, such as rapamycin (sirolimus, RAPa Mu NE®); farnesyl transferase inhibitors, such as Lanafarnib (SCH 6636, SARASAR ™); and you go out pharmaceutically acceptable acids or derivatives of any of the above; as well as combinations of two or more of the foregoing such as CHOP, an abbreviation for a combination therapy of cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisolone; and FOLFOX, an abbreviation for an oxiplatin (ELOXATIN ™) treatment regimen combined with 5-FU and leucovorin. . Additional chemotherapeutic agents can include "anti-hormonal agents" or "endocrine therapeutics" that act to regulate, reduce, block, or inhibit the effects of hormones that can promote cancer growth. They can be hormones themselves, including but not limited to: anti-estrogens with a mixed agonist / antagonist profile, including tamoxifen (NOLVADEX®), 4-hydroxy tamoxifen, toremifene (FARESTON®), idoxifene , droloxifene, raloxifene (EVISTA®), trioxifene, keoxifene, and selective estrogen receptor modulators (SERMs) such as SERM3; pure anti-estrogens without agonist properties, such as fulvestrant (FASLODEX®) and EM800 (these agents can block estrogen receptor (ER) dimerization, inhibit DNA binding, increase ER turnover, and / or suppress levels of ER); aromatase inhibitors, including steroidal aromatase inhibitors such as formestane and exemestane (AROMASIN®), and non-steroidal aromatase inhibitors such as anastrazole (ARIMIDEX®), letrozole (FEMARA®), and aminoglutethimide, and other aromatase inhibitors including vorozole ( RIVISOR®), megestrol acetate (MEGASE®), fadrozole and 4 (5) -imidazoles; lutenizing hormone-releasing hormone agonists, including leuprolide (LUPRON® and LiGARD®), goserelin, goserelin, buserelin, and tripterelin; sex steroids, including progestins such as megestrol acetate and medroxyprogesterone acetate, estrogens such as diethylstilbestrol and premarin, and androgens / retinoids such as fluoxymesterone, all transretinoic acid, and fenretinide; onapristone; anti-progesterones; estrogen receptor negative regulators (ERD); antiandrogens such as flutamide, nilutamide, and bicalutamide; and pharmaceutically acceptable salts, acids, or derivatives of any of the foregoing; as well as combinations of two or more of the above.

En algunos casos, las partículas procesadas usando un dispositivo de múltiples corrientes tal como se proporciona en el presente documento pueden procesarse mediante reacciones químicas y/o enzimáticas dentro de la matriz de impacto para impartir propiedades fluorescentes, magnéticas o radiactivas a esas moléculas.In some cases, particles processed using a multi-stream device as provided herein can be processed by chemical and / or enzymatic reactions within the impact matrix to impart fluorescent, magnetic, or radioactive properties to those molecules.

G. Incubadora de flujo continuoG. Continuous Flow Incubator

En algunos casos, el tiempo de contacto de las partículas en una corriente de flujo se puede prolongar haciéndolas pasar a través de una incubadora de flujo continuo proporcionada en el presente documento. En algunos casos, cuando las partículas fluyen desde una primera matriz DLD a una segunda matriz DLD en una corriente de flujo, la incubadora de flujo continuo se puede conectar fluídicamente con las dos matrices DLD, extendiendo así la distancia de desplazamiento de las partículas en la corriente de flujo. En algunos casos, la corriente de flujo puede comprender una solución de reacción (por ejemplo, con un reactivo, por ejemplo, un anticuerpo). Por lo tanto, la incubadora de flujo continuo puede prolongar el tiempo de incubación de las partículas en la solución de reacción. En algunos casos, el tiempo de incubación puede prolongarse mediante la incubadora de flujo continuo sin aumentar el caudal de las partículas. El caudal en la incubadora de flujo continuo puede ser menor que, igual o mayor que el caudal en la matriz DLD aguas arriba o aguas abajo de la incubadora de flujo continuo. En algunos casos, las partículas de al menos un tamaño predeterminado se dirigen a una incubadora de flujo continuo. En algunos casos, las partículas de menos de un tamaño predeterminado se dirigen a una incubadora de flujo continuo.In some cases, the contact time of the particles in a flow stream can be extended by passing them through a continuous flow incubator provided herein. In some cases, when particles flow from a first DLD matrix to a second DLD matrix in a flow stream, the flow-through incubator can be fluidly connected with the two DLD matrices, thus extending the travel distance of the particles in the flow. flow stream. In some cases, the flow stream may comprise a reaction solution (eg, with a reagent, eg, an antibody). Therefore, the flow-through incubator can prolong the incubation time of the particles in the reaction solution. In some cases, the incubation time can be extended using the continuous flow incubator without increasing the flow rate of the particles. The flow rate in the continuous flow incubator can be less than, equal to or greater than the flow rate in the DLD matrix upstream or downstream of the continuous flow incubator. In some cases, particles of at least a predetermined size are directed to a continuous flow incubator. In some cases, particles less than a predetermined size are directed to a continuous flow incubator.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede conectarse con uno o más chips microfluídicos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, la incubadora de flujo continuo se puede conectar con un componente de un chip microfluídico para procesar partículas proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, la incubadora de flujo continuo puede ser un canal en el chip. El canal se puede conectar fluídicamente con dos matrices DLD (por ejemplo, dos matrices de obstáculos) en el chip. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede comprender un canal lineal. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede comprender un canal con una región curva. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede comprender un canal serpenteante. La incubadora de flujo continuo puede comprender una o más matrices DLD desveladas en el presente documento. La FIG. 54A muestra una incubadora de flujo continuo serpenteante ilustrativa que conecta dos canales microfluídicos, cada uno de los cuales comprende 3 matrices DLD. Las partículas de entrada se pueden desviar a una corriente de flujo con anticuerpos para marcar las partículas. Las partículas desviadas a la salida 2 pueden fluir hacia la incubadora de flujo continuo, y el tiempo de incubación de las partículas con los anticuerpos se puede prolongar mediante el paso por la incubadora de flujo continuo. Las partículas marcadas pueden fluir desde la incubadora de flujo continuo hasta la entrada 3 del segundo canal microfluídico con una matriz de obstáculos para el lavado, concentración y/u otro procesamiento.In some cases, the flow-through incubator may be connected to one or more microfluidic chips provided herein. For example, the flow-through incubator can be connected to a component of a microfluidic chip to process particles provided herein. For example, the flow-through incubator can be a channel on the chip. The channel can be fluidly connected with two DLD arrays (eg two obstacle arrays) on the chip. In some cases, the flow-through incubator may comprise a linear channel. In some cases, the flow-through incubator may comprise a channel with a curved region. In some cases, the flow-through incubator may comprise a meandering channel. The flow-through incubator may comprise one or more DLD arrays disclosed herein. FIG. 54A shows an illustrative meandering continuous flow incubator connecting two microfluidic channels, each comprising 3 DLD arrays. The input particles can be diverted into a flow stream with antibodies to label the particles. The particles diverted to outlet 2 can flow into the flow-through incubator, and the incubation time of the particles with the antibodies can be extended by passing through the flow-through incubator. The labeled particles can flow from the flow-through incubator to the inlet 3 of the second microfluidic channel with a matrix of obstacles for washing, concentration and / or other processing.

La incubadora de flujo continuo puede comprender un canal con al menos un giro. En algunos casos, el canal puede tener más de un giro. Por ejemplo, el canal puede ser un canal serpenteante. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede comprender un canal con al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 giros. En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede comprender un canal con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 giros.The flow-through incubator may comprise a channel with at least one turn. In some cases, the channel may have more than one turn. For example, the channel can be a meandering channel. In some cases, the flow-through incubator may comprise a channel with at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 spins. In some cases, the flow-through incubator may comprise a channel with 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 spins.

En algunos casos, el chip que comprende la incubadora de flujo continuo puede comprender un equilibrador paraIn some cases, the chip comprising the flow-through incubator may comprise a balancer to

equilibrar las resistencias fluídicas de diferentes trayectorias de flujo. El equilibrador se puede utilizar para equilibrarbalance the fluidic resistances of different flow paths. The balancer can be used to balance

la contrapresión generada por la incubadora de flujo continuo. En algunos casos, el equilibrador puede serthe back pressure generated by the flow-through incubator. In some cases, the balancer may be

sustancialmente el mismo que la incubadora de flujo continuo y puede estar conectado a otra salida en el dispositivosubstantially the same as the continuous flow incubator and may be connected to another outlet on the device

microfluídico. En algunos casos, el equilibrador puede estar en una configuración diferente de la incubadora de flujomicrofluidic. In some cases, the balancer may be in a different configuration than the flow incubator

continuo, pero puede crear la misma resistencia fluídica que la incubadora de flujo continuo. En algunos casos, elflow, but can create the same fluid resistance as the flow-through incubator. In some cases, the

equilibrador puede ser un control de presión fluídica. Por ejemplo, el control de presión fluídica puede generar unabalancer can be a fluidic pressure control. For example, fluidic pressure control can generate a

presión negativa que puede equilibrar la contrapresión generada por la incubadora de flujo continuo. Por ejemplo, elnegative pressure that can balance the back pressure generated by the flow-through incubator. For example, him

componente para equilibrar las resistencias fluídicas puede ser un canal en el chip. En un caso, el componente paracomponent to balance fluidic resistances can be a channel on the chip. In one case, the component for

equilibrar la resistencia fluídica se puede conectar fluídicamente con la incubadora de flujo continuo. La FIG. 54B balance fluid resistance can be fluidly connected with the continuous flow incubator. FIG. 54B

muestra un equilibrador ilustrativo. Una incubadora de flujo continuo está conectada con la salida 2 en el canalshows an illustrative balancer. A continuous flow incubator is connected to outlet 2 on the channel

microfluídico que comprende una matriz (DLD 1). Un equilibrador para equilibrar la resistencia de flujo en la incubadoramicrofluidic comprising a matrix (DLD 1). A balancer to balance the flow resistance in the incubator

de flujo continuo está conectado a la salida 1 en el canal microfluídico que comprende una matriz (DLD 1). ElContinuous flow is connected to outlet 1 in the microfluidic channel comprising a matrix (DLD 1). The

equilibrador se puede configurar para que sea el mismo que la incubadora de flujo continuo y se puede conectar a laThe balancer can be configured to be the same as the flow-through incubator and can be connected to the

DLD 1 de manera que refleje la incubadora de flujo continuo.DLD 1 so that it reflects the flow-through incubator.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una longitud de al menos 1, 2,In some cases, the continuous flow incubator on a chip can be a channel with a length of at least 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,

37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,

68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,

99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320,99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320,

330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 o 400 mm. Una incubadora de flujo continuo, por ejemplo, un canal serpenteante,330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 or 400 mm. A continuous flow incubator, for example a meandering channel,

puede comprender uno o más segmentos conectados, en donde cada uno de estos segmentos tiene una o más demay comprise one or more connected segments, where each of these segments has one or more of

estas longitudes.these lengths.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una longitud de aproximadamenteIn some cases, the continuous flow incubator on a chip can be a channel with a length of approximately

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,

35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 6 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 9 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 6 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 , 9 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300,

310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 o 400 mm. En un caso, la incubadora de flujo continuo puede ser un canal310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 or 400 mm. In one case, the flow-through incubator may be a channel

con una longitud de aproximadamente 30 mm. Una incubadora de flujo continuo puede comprender uno o máswith a length of approximately 30 mm. A continuous flow incubator may comprise one or more

segmentos conectados con una o más de estas longitudes.segments connected with one or more of these lengths.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una profundidad de al menos 1,In some cases, the continuous flow incubator on a chip can be a channel with a depth of at least 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,

36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 6 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 9 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750,36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 6 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 9 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750,

800, 850, 900, 950 o 1000 pm.800, 850, 900, 950 or 1000 pm.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una profundidad deIn some cases, the continuous flow incubator on a chip may be a channel with a depth of

aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 27, 28, 29,

30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,

61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,

92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,

550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 pm. Por ejemplo, la incubadora de flujo continuo en un chip puede550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 or 1000 pm. For example, the continuous flow incubator on a chip can

ser un canal con una profundidad de aproximadamente 100 pm.be a channel with a depth of approximately 100 pm.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una anchura de al menos 1, 2,In some cases, the continuous flow incubator on a chip may be a channel with a width of at least 1, 2,

99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,

123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145,123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145,

146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168,146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168,

169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191,169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191,

192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 o 200 pm.192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 or 200 pm.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una anchura de aproximadamenteIn some cases, the continuous flow incubator on a chip may be a channel with a width of approximately

35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,

66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,

97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120,

121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 o 200 jm . Por ejemplo, la incubadora de flujo continuo en un chip puede ser un canal con una anchura de aproximadamente 100 |jm. La anchura y/o la profundidad de la incubadora de flujo continuo pueden variar a lo largo de la longitud de la incubadora de flujo continuo.121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 or 200 jm. For example, the continuous flow incubator on a chip can be a channel with a width of approximately 100 µm. The width and / or depth of the flow-through incubator can vary along the length of the flow-through incubator.

En algunos casos, un chip microfluídico puede comprender una o más incubadoras de flujo continuo. Las incubadoras de flujo continuo se pueden utilizar para prolongar el tiempo de contacto de las partículas en diferentes corrientes de flujo. En algunos casos, un chip microfluídico puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 incubadoras de flujo continuo. En algunos casos, un chip microfluídico puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 incubadoras de flujo continuo.In some cases, a microfluidic chip may comprise one or more continuous flow incubators. Continuous flow incubators can be used to extend the contact time of the particles in different flow streams. In some cases, a microfluidic chip can comprise at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 continuous flow incubators. In some cases, a microfluidic chip may comprise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 incubators continuous flow.

En algunos casos, la incubadora de flujo continuo puede comprender un componente que promueva que las partículas se muevan en relación con la corriente de flujo en la incubadora. El movimiento de las células en relación con la corriente de flujo puede permitir que las partículas muevan las diferentes partes de la corriente de flujo que tienen diferentes concentraciones de reactivo. En algunos casos, dichos componentes pueden incluir una matriz de obstáculos, por ejemplo, obstáculos que desvían las partículas en una dirección que no es paralela a la corriente de flujo. En algunos casos, el componente puede incluir una entrada que introduzca una segunda corriente de flujo en el canal. En algunos casos, el componente puede ser una región curvada en la incubadora de flujo continuo. El fluido en una incubadora de flujo continuo puede someterse a agitación mediante fuerza interna o externa a la incubadora de flujo continuo. Por ejemplo, se puede colocar un agitador magnético (por ejemplo, una barra de agitación) dentro de la incubadora de flujo continuo, y el chip que comprende una incubadora de flujo continuo se puede colocar en una placa de agitación magnética, y el fluido en la incubadora de flujo continuo se puede agitar con la barra de agitación. Un chip con una incubadora de flujo continuo se puede colocar en una plataforma giratoria u oscilante, o se puede someter a un vórtice, para agitar el fluido en la incubadora de flujo continuo.In some cases, the flow-through incubator may comprise a component that promotes the particles to move relative to the flow stream in the incubator. The movement of the cells in relation to the flow stream can allow the particles to move the different parts of the flow stream that have different concentrations of reagent. In some cases, such components may include a matrix of obstacles, for example obstacles that deflect the particles in a direction that is not parallel to the flow stream. In some cases, the component may include an inlet that introduces a second flow stream into the channel. In some cases, the component may be a curved region in the flow-through incubator. The fluid in a flow-through incubator can be agitated by force internal or external to the flow-through incubator. For example, a magnetic stirrer (for example, a stir bar) can be placed inside the continuous flow incubator, and the chip comprising a continuous flow incubator can be placed on a magnetic stir plate, and the fluid in The flow-through incubator can be shaken with the stir bar. A chip with a flow-through incubator can be placed on a rotating or rocking platform, or can be vortexed, to agitate the fluid in the flow-through incubator.

El tiempo que una partícula puede pasar en una incubadora de flujo continuo puede ser de 10 segundos a aproximadamente 30 segundos, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 1 minuto, de aproximadamente 1 min a aproximadamente 5 min, de aproximadamente 5 min a aproximadamente 10 min, de aproximadamente 10 min a aproximadamente 15 min, de aproximadamente 15 min a aproximadamente 30 min, de aproximadamente 30 min a 1 h, de aproximadamente 1 h a aproximadamente 2 h, de aproximadamente 1 h a aproximadamente 12 h, de aproximadamente 12 h a 24 h, de aproximadamente 24 h a aproximadamente 48 h, o de aproximadamente 2 días a aproximadamente 7 días. El tiempo que una partícula puede pasar en una incubadora de flujo continuo puede ser de aproximadamente, o al menos 30 segundos, 1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 12 h, 24 h, 48 h o 7 días. En algunos casos, el flujo en la incubadora de flujo continuo se puede detener y la incubación puede se puede realizar en condiciones de ausencia de flujo.The time that a particle can spend in a continuous flow incubator can be from 10 seconds to about 30 seconds, from about 30 seconds to about 1 minute, from about 1 min to about 5 min, from about 5 min to about 10 min, from about 10 min to about 15 min, from about 15 min to about 30 min, from about 30 min to 1 h, from about 1 h to about 2 h, from about 1 h to about 12 h, from about 12 h to 24 h, from approximately 24 hours to approximately 48 hours, or from approximately 2 days to approximately 7 days. The time that a particle can spend in a continuous flow incubator can be approximately, or at least 30 seconds, 1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 12 h, 24 h , 48 h or 7 days. In some cases, the flow in the flow-through incubator can be stopped and incubation can be performed under no-flow conditions.

La temperatura de la incubadora de flujo continuo se puede regular. La temperatura de la incubadora de flujo continuo puede regularse por separado que la temperatura de las matrices DLD conectadas de forma fluida, o la temperatura de la incubadora de flujo continuo y una o más matrices de DLD se pueden regular al mismo tiempo. La temperatura de la incubadora de flujo continuo se puede mantener constante. La temperatura de la incubadora de flujo continuo puede ser de aproximadamente, o al menos de 4 °C, 16 °C, 25 °C, 30 °C, 37 °C, 50 °C, 60 °C, 65 °C, 72 °C o 95 °C. La temperatura en la incubadora fuera del chip se puede ciclar.The temperature of the flow-through incubator can be regulated. The temperature of the flow-through incubator can be regulated separately that the temperature of the fluidly connected DLD arrays, or the temperature of the flow-through incubator and one or more DLD arrays can be regulated at the same time. The temperature of the flow-through incubator can be kept constant. The temperature of the flow-through incubator can be approximately or at least 4 ° C, 16 ° C, 25 ° C, 30 ° C, 37 ° C, 50 ° C, 60 ° C, 65 ° C, 72 ° C or 95 ° C. The temperature in the incubator outside the chip can be cycled.

El flujo en la incubadora de flujo continuo se puede invertir. Por ejemplo, se puede aplicar presión para mover un líquido hacia adelante y hacia atrás en una incubadora de flujo continuo.The flow in the flow-through incubator can be reversed. For example, pressure can be applied to move a liquid back and forth in a continuous flow incubator.

En un ejemplo, una incubadora de flujo continuo con un tiempo máximo de incubación de aproximadamente 10 min comprende 20 canales paralelos de 3 cm de longitud, una anchura de 100 jm y una profundidad de 100 jm , a una velocidad de fluido de aproximadamente 1 mm/s. El área del chip puede ser de 2 canales serpenteantes x 3 cm de longitud de cada segmento x 20 segmentos x (canal de 100 jm de anchura espaciado de 100 jm entre canales) 2 DLD x 7 cm de longitud de DLD x 600 jm de anchura de DLD = 3,68 cm2.In one example, a continuous flow incubator with a maximum incubation time of approximately 10 min comprises 20 parallel channels 3 cm in length, a width of 100 µm, and a depth of 100 µm, at a fluid velocity of approximately 1 mm. / s. The chip area can be 2 meandering channels x 3 cm length of each segment x 20 segments x (100 jm wide channel spaced 100 jm between channels) 2 DLD x 7 cm long DLD x 600 jm width DLD = 3.68 cm2.

H. Incubadora fuera del chipH. Off-chip incubator

En algunos casos, una incubadora proporcionada en el presente documento puede ser un componente fuera del chip conectado de forma fluida a un chip. Una incubadora fuera del chip se puede conectar a un chip que no es un chip de "lavado de coches". En algunos casos, una incubadora fuera del chip puede ser una incubadora de flujo continuo fuera del chip. En algunos casos, la incubadora fuera del chip puede ser un recipiente. La incubadora fuera del chip se puede conectar fluídicamente con un primer canal microfluídico (por ejemplo, un canal que comprende una matriz DLD) y un segundo canal microfluídico (por ejemplo, un canal que comprende una matriz d Ld ), y la incubadora de fuera del chip y el primer canal microfluídico pueden comprender la misma solución. En este ejemplo, las células pueden permanecer en contacto con la solución cuando fluyen desde el primer canal microfluídico (por ejemplo, un canal que comprende una matriz DLD) al segundo canal microfluídico (por ejemplo, un canal que comprende una matriz DLD) a través de la incubadora de flujo continuo. El primer y/o el segundo canales microfluídicos pueden ser un componente en un chip microfluídico para procesar células. El recipiente se puede conectar fluídicamente con uno o más chips microfluídicos para procesar las partículas que contiene. En algunos casos, la incubadora fuera del chip se puede conectar con un primer chip microfluídico, pero no conectarse con un segundo chip microfluídico. La incubadora puede recoger las partículas procesadas del primer chip microfluídico. Las partículas recogidas se pueden introducir en un segundo chip microfluídico para su posterior procesamiento. En algunos casos, una incubadora fuera del chip puede comprender uno o más controladores de flujo. Los controladores de flujo pueden controlar el caudal de partículas que fluyen hacia el interior y/o el exterior de la incubadora de flujo continuo. En algunos casos, la incubadora fuera del chip puede ser un depósito en una placa, un tubo de ensayo, un vial, un tubo o un capilar.In some cases, an incubator provided herein may be an off-chip component fluidly connected to a chip. An off-chip incubator can be connected to a chip that is not a "car wash" chip. In some cases, an off-chip incubator may be an off-chip continuous flow incubator. In some cases, the incubator outside the chip can be a container. The off-chip incubator can be fluidically connected with a first microfluidic channel (eg, a channel comprising a DLD array) and a second microfluidic channel (eg, a channel comprising a Ld array), and the outside incubator of the chip and the first microfluidic channel may comprise the same solution. In this example, the cells can remain in contact with the solution as they flow from the first microfluidic channel (eg, a channel comprising a DLD matrix) to the second microfluidic channel (eg, a channel comprising a DLD matrix) through flow incubator. The first and / or second microfluidic channels can be a component on a chip microfluidic to process cells. The container can be fluidly connected with one or more microfluidic chips to process the particles it contains. In some cases, the off-chip incubator can be connected to a first microfluidic chip, but not connected to a second microfluidic chip. The incubator can collect the processed particles from the first microfluidic chip. The collected particles can be fed into a second microfluidic chip for further processing. In some cases, an off-chip incubator may comprise one or more flow controllers. Flow controllers can control the flow rate of particles flowing into and / or out of the continuous flow incubator. In some cases, the off-chip incubator can be a reservoir on a plate, a test tube, a vial, a tube, or a capillary.

En algunos casos, las partículas de al menos un tamaño predeterminado se dirigen a una incubadora fuera del chip. En algunos casos, las partículas de menos de un tamaño predeterminado se dirigen a una incubadora fuera del chip. In some cases, particles of at least a predetermined size are directed to an off-chip incubator. In some cases, particles less than a predetermined size are directed to an off-chip incubator.

Una incubadora de flujo continuo fuera del chip puede comprender uno o más puertos para la conexión fluídica con otros dispositivos, por ejemplo, un chip microfluídico. Una incubadora fuera del chip puede tener aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 puertos para la conexión fluídica con uno o más dispositivos. En algunos casos, el fluido que entra en una incubadora fuera del chip desde un primer puerto de la incubadora fuera del chip también sale por el primer puerto de la incubadora fuera del chip. En algunos casos, el fluido que entra en una incubadora fuera del chip desde un primer puerto sale de un segundo puerto de la incubadora fuera del chip. En algunos casos, las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado pasan a través de un canal que comprende una matriz DLD, y las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado salen del canal que comprende la matriz DLD desde una salida y entran en la incubadora fuera del chip. Las primeras partículas de al menos un tamaño predeterminado se incuban en la incubadora fuera del chip durante un período de tiempo. Se puede introducir un tratamiento químico en la incubadora fuera del chip, por ejemplo, un anticuerpo.An off-chip continuous flow incubator may comprise one or more ports for fluidic connection to other devices, eg, a microfluidic chip. An off-chip incubator can have approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 ports for fluid connection to one or more devices. In some cases, fluid entering an off-chip incubator from a first off-chip incubator port also exits the off-chip first incubator port. In some cases, fluid entering an off-chip incubator from a first port exits a second off-chip incubator port. In some cases, the first particles of at least a predetermined size pass through a channel comprising a DLD matrix, and the first particles of at least a predetermined size exit the channel comprising the DLD matrix from an exit and enter the incubator off the chip. The first particles of at least a predetermined size are incubated in the off-chip incubator for a period of time. A chemical treatment can be introduced into the incubator outside of the chip, for example an antibody.

El tiempo que una partícula puede pasar en una incubadora fuera del chip puede ser de aproximadamente 10 a 30 segundos, de 30 segundos a aproximadamente 1 min, de aproximadamente 1 min a aproximadamente 5 min, de aproximadamente 5 min a aproximadamente 10 min, de aproximadamente 10 min a aproximadamente 15 min, de aproximadamente 15 min a aproximadamente 30 min, de aproximadamente 30 min a 1 h, de aproximadamente 1 h a aproximadamente 2 h, de aproximadamente 1 h a aproximadamente 12 h, de aproximadamente 12 h a 24 h, de aproximadamente 24 h a aproximadamente 48 h, o de aproximadamente 2 días a aproximadamente 7 días. El tiempo que una partícula puede pasar en una incubadora fuera del chip puede ser de al menos 10 segundos, 30 segundos, 1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 12 h, 24 h, 48 h o 7 días. El flujo en la incubadora fuera del chip se puede detener y la incubación puede tener lugar en condiciones sin flujo. El flujo en una incubadora fuera del chip puede ser continuo.The time a particle can spend in an off-chip incubator can be from about 10 to 30 seconds, from 30 seconds to about 1 min, from about 1 min to about 5 min, from about 5 min to about 10 min, from about 10 min to about 15 min, from about 15 min to about 30 min, from about 30 min to 1 h, from about 1 h to about 2 h, from about 1 h to about 12 h, from about 12 h to 24 h, from about 24 h has approximately 48 h, or from approximately 2 days to approximately 7 days. The time that a particle can spend in an incubator off the chip can be at least 10 seconds, 30 seconds, 1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 12 h, 24 h , 48 h or 7 days. Flow in the off-chip incubator can be stopped and incubation can take place under no-flow conditions. Flow in an off-chip incubator can be continuous.

La temperatura de la incubadora fuera del chip se puede regular. La temperatura de la incubadora fuera del chip puede regularse por separado que la temperatura de los canales con matrices DLD conectados de forma fluida, o la temperatura de la incubadora fuera del chip y uno o más canales con matrices DLD se pueden regular al mismo tiempo. La temperatura de la incubadora fuera del chip se puede mantener constante. La temperatura de la incubadora fuera del chip puede ser de aproximadamente, o al menos, 4 °C, 16 °C, 25 °C, 30 °C, 37 °C, 50 °C, 60 °C, 65 °C, 72 °C o 95 °C. La temperatura en la incubadora fuera del chip se puede ciclar.The temperature of the incubator outside the chip can be regulated. The temperature of the off-chip incubator can be regulated separately that the temperature of the channels with fluidly connected DLD arrays, or the temperature of the off-chip incubator and one or more channels with DLD arrays can be regulated at the same time. The incubator temperature outside the chip can be kept constant. The off-chip incubator temperature can be approximately or at least 4 ° C, 16 ° C, 25 ° C, 30 ° C, 37 ° C, 50 ° C, 60 ° C, 65 ° C, 72 ° C or 95 ° C. The temperature in the incubator outside the chip can be cycled.

El flujo en la incubadora fuera del chip se puede invertir. Por ejemplo, se puede aplicar presión para mover un líquido hacia adelante y hacia atrás en una incubadora fuera del chip.The flow in the incubator off the chip can be reversed. For example, pressure can be applied to move a liquid back and forth in an incubator off the chip.

El fluido en una incubadora fuera del chip puede someterse a agitación mediante fuerza interna o externa a la incubadora fuera del chip. Por ejemplo, se puede colocar un agitador magnético (por ejemplo, una barra de agitación) dentro de la incubadora fuera del chip, y la incubadora fuera del chip se puede colocar en una placa de agitación magnética, y el fluido en la incubadora fuera del chip se puede agitar con una barra de agitación. Una incubadora fuera del chip se puede colocar en una plataforma giratoria u oscilante, o se puede someter a un vórtice, para agitar el fluido en la incubadora fuera del chip.Fluid in an off-chip incubator can be agitated by force internal or external to the off-chip incubator. For example, a magnetic stirrer (for example, a stir bar) can be placed inside the incubator outside the chip, and the incubator outside the chip can be placed on a magnetic stir plate, and the fluid in the incubator outside the chip can be shaken with a stir bar. An off-chip incubator can be placed on a rotating or rocking platform, or it can be vortexed, to agitate the fluid in the off-chip incubator.

El volumen de una incubadora fuera del chip puede ser de aproximadamente 100 pl a aproximadamente 500 pl, de aproximadamente 500 pl a aproximadamente 1 ml, de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 5 ml o de aproximadamente 5 ml a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 10 ml a 50 ml, de aproximadamente 50 ml a aproximadamente 100 ml, de aproximadamente 100 ml a aproximadamente 500 ml, de aproximadamente 500 ml a aproximadamente 1000 ml, de aproximadamente 1 L a aproximadamente 5 L o de aproximadamente 5 L a aproximadamente 10 L. El volumen de una incubadora fuera del chip puede ser de aproximadamente 100 pl, 500 pl, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000 ml, 5 L o 10 L. El volumen de una incubadora fuera del chip puede ser de al menos 100 pl, 500 pl, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000 ml, 5 L o 10 L.The volume of an off-chip incubator can be from about 100 µl to about 500 µl, from about 500 µl to about 1 ml, from about 1 ml to about 5 ml, or from about 5 ml to about 10 ml, from about 10 ml to 50 ml, from about 50 ml to about 100 ml, from about 100 ml to about 500 ml, from about 500 ml to about 1000 ml, from about 1 L to about 5 L, or from about 5 L to about 10 L. The The volume of an off-chip incubator can be approximately 100 µl, 500 µl, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000 ml, 5 L, or 10 L. The volume of an off-chip incubator of the chip can be at least 100 µl, 500 µl, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1000 ml, 5 L or 10 L.

Un reactivo puede colocarse en una incubadora fuera del chip cuando una partícula llega a la incubadora fuera del chip. En algunos casos, una partícula entra en la incubadora fuera del chip antes de que el reactivo entre en la incubadora fuera del chip. Las reacciones pueden tener lugar en la incubadora fuera del chip, por ejemplo, unión de anticuerpo/señalizador de superficie celular, lisis celular, marcaje intracelular, fijación, permeabilización o manipulación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR). Una incubadora fuera del chip se puede supervisar para seguir una reacción, por ejemplo, mediante un equipo espectrofotométrico, equipo de formación de imágenes, etc. Una incubadora fuera del chip puede comprender una superficie compatible para la adhesión celular. En algunos casos, una incubadora fuera del chip se trata para evitar la adhesión celular. El flujo hacia o desde una incubadora fuera del chip se puede modular manualmente (por ejemplo, con una bomba de jeringa) o automáticamente.A reagent can be placed in an off-chip incubator when a particle reaches the off-chip incubator. In some cases, a particle enters the incubator outside of the chip before the reagent enters the incubator outside the chip. Reactions can take place in the off-chip incubator, eg, antibody / cell surface marker binding, cell lysis, intracellular labeling, fixation, permeabilization, or manipulation of nucleic acids (eg, PCR). An off-chip incubator can be monitored to follow a reaction, for example, by spectrophotometric equipment, imaging equipment, etc. An off-chip incubator may comprise a compatible surface for cell adhesion. In some cases, an off-chip incubator is treated to prevent cell adhesion. Flow to or from an off-chip incubator can be modulated manually (eg with a syringe pump) or automatically.

I. Características del dispositivoI. Device characteristics

Como se describe en el presente documento, un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, "lavado de coches") tal como se proporciona en el presente documento puede comprender un canal con una pluralidad de entradas, una pluralidad de salidas y una matriz de obstáculos dispuestos entre ellas. Los dispositivos ilustrativos pueden ser los dispositivos ilustrados en las FIG. 18A-B, 19, 20A-B, 24A-B, 27A-B, y 32. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento puede comprender un canal con al menos una entrada, al menos una salida y una matriz de obstáculos dispuestos entre ellas. Los dispositivos ilustrativos pueden ser los dispositivos ilustrados en las FIG. 39 y 40. Se ilustran ejemplos de parámetros de dispositivos en la Tabla 2. As described herein, a multi-stream device (eg, "car wash") as provided herein may comprise a channel with a plurality of inlets, a plurality of outlets, and an obstacle matrix. arranged between them. Illustrative devices may be the devices illustrated in FIGS. 18A-B, 19, 20A-B, 24A-B, 27A-B, and 32. In some cases, a device as provided herein may comprise a channel with at least one inlet, at least one outlet, and a matrix of obstacles arranged between them. Illustrative devices may be the devices illustrated in FIGS. 39 and 40. Examples of device parameters are illustrated in Table 2.

Tabla 2. Anchuras de canal Table 2. Channel widths

Tabla 3. T poste (|jm) Table 3. T pole (| jm)

La FIG. 39 muestra un diseño de un chip A. El chip A comprende un diseño de tres zonas (secciones) con pilares y espacios progresivamente más pequeños. El tamaño del espacio y el diámetro del poste se describen en la Tabla 2. El dispositivo puede comprender una entrada, por ejemplo, para sangre, una entrada para tampón, salidas de residuos y una salida de producto. El chip A puede comprender 14 canales paralelos. El volumen total de canales (incluidas las vías de 0,5 mm) (una vía puede ser un orificio que puede conectar la parte posterior de un chip, (por ejemplo, donde puede tener lugar la conexión del colector) al lado superior del chip (es decir, donde se encuentra la matriz) puede ser de 118 jl. El rendimiento del dispositivo es de aproximadamente 4-8 ml/h. El tiempo de procesamiento para una muestra de 8 ml puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas. El chip A se puede fabricar con silicio. El chip A se puede fabricar con polipropileno, poli(metacrilato de metilo) (PMMA) o polímero de cicloolefina (COP). En algunos casos, se pueden aplicar al dispositivo entre aproximadamente 5 ml y aproximadamente 20 ml de muestra. En algunos casos, se pueden aplicar al dispositivo entre aproximadamente 1 j l y aproximadamente 5 ml de muestra. FIG. 39 shows a one-chip A design. Chip A comprises a three-zone (section) layout with progressively smaller pillars and gaps. The size of the space and the diameter of the post are described in Table 2. The device may comprise an inlet, for example, for blood, an inlet for buffer, waste outlets and a product outlet. Chip A can comprise 14 parallel channels. The total volume of channels (including 0.5mm vias) (a vias can be a hole that can connect the back of a chip, (for example, where the collector connection can take place) to the upper side of the chip (ie where the matrix is located) can be 118 µl Device throughput is approximately 4-8 ml / hr Processing time for an 8 ml sample can be approximately 1 to approximately 2 hours. Chip A can be made of silicon. Chip A can be made of polypropylene, poly (methyl methacrylate) (PMMA), or cycloolefin polymer (COP). In some cases, about 5 ml to about 20 ml of sample In some cases, between about 1 µl and about 5 ml of sample can be applied to the device.

La FIG. 40 muestra otro ejemplo de un dispositivo (A2). El chip A2 comprende un diseño de tres zonas con pilares y espacios progresivamente más pequeños. Los tamaños de los espacios y los diámetros de los postes se describen en Tabla 3. La profundidad del canal es de 60 jm . Cada chip A2 consta de 2 canales independientes. El volumen total del canal (incluida la vía de 0,5 mm) es de aproximadamente 3,85 jl. El rendimiento del dispositivo puede ser de aproximadamente 0,12 a aproximadamente 0,24 ml/h, o de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,8 ml/h. El tiempo de procesamiento para una muestra de 100 j l puede ser de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 min. El chip A2 se puede fabricar con silicio. El chip a 2 se puede fabricar con polipropileno, poli(metacrilato de metilo) (PMMA) o polímero de cicloolefina (COP). El dispositivo se puede utilizar para procesar de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 uL de muestra. El dispositivo se puede utilizar para procesar de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 ul de muestra. FIG. 40 shows another example of a device (A2). The A2 chip comprises a three-zone design with progressively smaller pillars and gaps. The sizes of the spaces and the diameters of the posts are described in Table 3. The depth of the channel is 60 jm. Each A2 chip consists of 2 independent channels. The total volume of the canal (including the 0.5 mm pathway) is approximately 3.85 jl. The throughput of the device can be from about 0.12 to about 0.24 ml / hr, or from about 0.4 to about 0.8 ml / hr. Processing time for a 100 µl sample can be from about 25 to about 50 min. The A2 chip can be made of silicon. The a 2 chip can be made from polypropylene, poly (methyl methacrylate) (PMMA), or cycloolefin polymer (COP). The device can be used to process from about 50 to about 500 uL of sample. The device can be used to process from about 1 to about 50 ul of sample.

i. Canalesi. Channels

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento comprende un canal, en donde el canal está delimitado por una primera pared y una segunda pared, en donde la segunda pared se opone a la primera pared, y en donde la primera y la segunda pared son paralelas entre sí. El canal puede comprender una porción o área de entrada que comprende una pluralidad de entradas y una porción o área de salida que comprende una pluralidad de salidas. Cada una de la pluralidad de entradas puede estar configurada para fluir o permitir el paso de una corriente de flujo o tubo de corriente que comprende un fluido, en donde cada una de las corrientes de flujo o tubos de corriente fluye paralelamente a la otra corriente de flujo o tubo de corriente desde la porción de entrada del dispositivo a la porción de salida del dispositivo. En algunos casos, cada una de una pluralidad de corrientes de flujo se mueve desde una entrada a una salida directamente enfrente de u opuesta a la entrada. En algunos casos, un dispositivo comprende un canal con al menos una entrada y al menos una salida. En algunos casos, un dispositivo comprende un canal con dos entradas y dos salidas. En algunos casos, un dispositivo comprende un canal con más de dos entradas y más de dos salidas. En algunos casos, una primera entrada a un canal es una entrada de muestra y una segunda entrada a un canal es una entrada de tampón. En algunos casos, una primera entrada a un canal es una entrada de muestra, una segunda entrada a un canal es una entrada de reactivo y una tercera entrada es una entrada de tampón. Una sola corriente de flujo puede originarse a partir de una sola entrada. Una sola corriente de flujo puede originarse a partir de dos o más entradas adyacentes (por ejemplo, FIG. 19). En algunos casos, una primera salida a un canal es una salida de producto y una segunda salida a un canal es una salida de residuos. En algunos casos, una primera salida de una pluralidad de salidas a un canal es una salida de producto y cada una de la pluralidad restante de salidas comprende una salida de residuos. Cada una de la pluralidad restante de salidas puede comprender una salida distinta para una corriente de flujo que se origina a partir de una entrada presente en una porción de entrada de un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento que comprende la entrada y la salida de residuos, en donde la entrada está directamente opuesta a o enfrente de la salida de residuos. En algunos casos, un canal comprende una matriz de obstáculos entre una pluralidad de entradas y una pluralidad de salidas. En algunos casos, la matriz de obstáculos comprende zonas o secciones de obstáculos, en donde cada sección comprende obstáculos de sustancialmente el mismo diámetro y tamaño y espacios entre obstáculos de sustancialmente el mismo tamaño.In some cases, a device as provided herein comprises a channel, wherein the channel is delimited by a first wall and a second wall, where the second wall opposes the first wall, and wherein the first and the second wall are parallel to each other. The channel may comprise an inlet portion or area comprising a plurality of inlets and an outlet portion or area comprising a plurality of outlets. Each of the plurality of inlets may be configured to flow or allow the passage of a flow stream or stream tube comprising a fluid, wherein each of the flow streams or stream tubes flows parallel to the other stream of stream flow or tube from the inlet portion of the device to the outlet portion of the device. In some cases, each of a plurality of flow streams moves from an inlet to an outlet directly opposite or opposite the inlet. In some cases, a device comprises a channel with at least one input and at least one output. In some cases, a device comprises a channel with two inputs and two outputs. In some cases, a device comprises a channel with more than two inputs and more than two outputs. In some cases, a first input to a channel is a sample input and a second input to a channel is a buffer input. In some cases, a first entry to a channel is a sample inlet, a second inlet to a channel is a reagent inlet, and a third inlet is a buffer inlet. A single flow stream can originate from a single input. A single flow stream can originate from two or more adjacent inlets (eg FIG. 19 ). In some cases, a first channel outlet is a product outlet and a second channel outlet is a waste outlet. In some cases, a first outlet of a plurality of outlets to a channel is a product outlet and each of the remaining plurality of outlets comprises a waste outlet. Each of the remaining plurality of outlets may comprise a separate outlet for a flow stream originating from an inlet present in an inlet portion of a device as provided herein comprising the inlet and the outlet. waste, where the inlet is directly opposite or opposite the waste outlet. In some cases, a channel comprises an obstacle matrix between a plurality of inputs and a plurality of outputs. In some cases, the obstacle matrix comprises obstacle zones or sections, where each section comprises obstacles of substantially the same diameter and size and spaces between obstacles of substantially the same size.

(a) Anchura del canal(a) Channel width

En algunos casos, la anchura del canal es de aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 mm.In some cases, the channel width is approximately 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 , 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 , 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 , 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 mm.

En algunos casos, la anchura del canal es de al menos 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 mm.In some cases, the channel width is at least 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 mm.

En algunos casos, la anchura del canal es menor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 mm.In some cases, the channel width is less than 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 , 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 , 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 , 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 mm.

En algunos casos, la anchura del canal es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mm, de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 mm, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 mm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mm, de

mente 60 a aproximadamente 70 mm o de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 mm.In some cases, the channel width is from about 1 to about 10mm, from about 2 to about 9mm, from about 3 to about 8mm, from about 10 to about 20mm, from about 20 to about 30mm, from about 30 to about 40mm, from about 40 to about 60mm, from

60 to about 70 mm or about 70 to about 100 mm.

(b) Longitud del canal(b) Channel length

En algunos casos, la longitud del canal es aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mm.In some cases, the channel length is about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 or 200 mm.

En algunos casos, la longitud del canal es menor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mm.In some cases, the channel length is less than 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 , 47, 48, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 , 76, 77, 78, 79, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140 , 150, 160, 170, 180, 190 or 200 mm.

En algunos casos, la longitud del canal es de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mm.In some cases, the channel length is at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 or 200 mm.

En algunos casos, la longitud del canal es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mm, de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 mm, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 mm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 mm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 mm o de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 mm.In some cases, the channel length is from about 1 to about 10mm, from about 2 to about 9mm, from about 3 to about 8mm, from about 10 to about 20mm, from about 20 to about 30mm, from about 30 to about 40mm, about 40 to about 60mm, about 60 to about 70mm, about 70 to about 100mm, or about 100 to about 200mm.

(c) Profundidad del canal (c) Channel depth

En algunos casos, un canal tiene una profundidad de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 |jm.In some cases, a channel has a depth of approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 , 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 , 750, 800, 850, 900, 950 or 1000 | jm.

En algunos casos, un canal tiene una profundidad de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 jm .In some cases, a channel has a depth of at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 or 1000 jm.

En algunos casos, un canal tiene una profundidad menor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 jm .In some cases, a channel is less than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 , 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 , 750, 800, 850, 900, 950 or 1000 jm.

En algunos casos, un canal tiene una profundidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 jm , de aproximadamente 20 jm a aproximadamente 40 jm , de aproximadamente 30 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 50 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 100 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 200 jm a aproximadamente 400 jm , de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 jm o de aproximadamente 600 a aproximadamente 1000 jm .In some cases, a channel has a depth from about 10 to about 30 jm, from about 20 jm to about 40 jm, from about 30 jm to about 50 jm, from about 50 jm to about 100 jm, from about 100 jm to about 200 jm, from about 200 jm to about 400 jm, from about 400 to about 600 jm, or from about 600 to about 1000 jm.

(d) Número de canales por dispositivo (chip)(d) Number of channels per device (chip)

En algunos casos, un dispositivo comprende aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 canales. En algunos casos, un dispositivo comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 canales.In some cases, a device comprises approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 channels. In some cases, a device comprises at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 , 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 , 97, 98, 99 or 100 channels.

En algunos casos, un dispositivo comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 canales, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 canales, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 canales, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 canales, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 canales, de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 canales, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 canales o de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 canales.In some cases, a device comprises from about 2 to about 10 channels, from about 10 to about 20 channels, from about 20 to about 30 channels, from about 30 to about 40 channels, from about 40 to about 50 channels, from about 50 to about 60 channels, from about 60 to about 70 channels, or from about 70 to about 100 channels.

(e) Volumen del canal(e) Channel volume

En algunos casos, el volumen total de un canal es aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150 o 200 ml.In some cases, the total volume of a channel is approximately 0.001, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0, 09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150 or 200 ml.

En algunos casos, el volumen total de un canal es al menos 0, 001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150 o 200 ml.In some cases, the total volume of a channel is at least 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 , 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 , 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150 or 200 ml.

En algunos casos, el volumen total de un canal es de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,01 ml, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ml, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 ml, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 ml, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 ml, de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 ml, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 ml o de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 ml.In some cases, the total volume of a channel is from about 0.001 to about 0.01 ml, from about 0.01 to about 0.1 ml, from about 0.1 to about 0.5 ml, from about 1 to about 2 ml, from about 2 to about 3 ml, from about 3 to about 5 ml, from about 5 to about 10 ml, from about 10 to about 20 ml, or from about 20 to about 50 ml.

En algunos casos, un dispositivo comprende múltiples canales. En algunos casos, el volumen total de los canales en un dispositivo es cualquiera de los volúmenes indicados anteriormente multiplicado por el número de canales en el dispositivo.In some cases, a device comprises multiple channels. In some cases, the total volume of channels in a device is any of the volumes listed above multiplied by the number of channels in the device.

En algunos casos, el dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para procesar tan solo ~ 10 |jl y hasta 500 jl. En algunos casos, el dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para procesar entre 500 j l y 20 o 40 ml. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está adaptado para procesar entre más de 40 ml.In some cases, the device as provided herein is adapted to process as only ~ 10 | jl and up to 500 jl. In some cases, the device as provided herein is adapted to process between 500 jl and 20 or 40 ml. In some cases, a device as provided herein is adapted to process between more than 40 ml.

(f) Zonas (fases) dentro de un canal(f) Zones (phases) within a channel

Un dispositivo descrito en el presente documento puede tener una pluralidad de zonas (fases o secciones). Una zona puede ser un área en un dispositivo con espacios y postes (obstáculos) del mismo tamaño o de tamaños similares. En algunos casos, un canal en un dispositivo comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 zonas. En algunos casos, un canal en un dispositivo comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 zonas.A device described herein can have a plurality of zones (phases or sections). A zone can be an area on a device with spaces and posts (obstacles) of the same or similar sizes. In some cases, a channel in a device comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 zones. In some cases, a channel in a device comprises at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 zones.

En algunos casos, una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, puede comprender partículas con una amplia gama de tamaños. Si una partícula en una muestra es más grande que un espacio, la partícula puede obstruir el canal. En algunos casos, se pueden utilizar múltiples fases de separación con diferentes tamaños de espacios y postes. En algunos casos, el diámetro del poste y el tamaño del espacio son menores en una segunda zona con respecto a una primera zona. En algunos casos, un dispositivo comprende una pluralidad de zonas, en donde cuando se aplica un fluido a una entrada del dispositivo, fluye a través de una pluralidad de zonas en un canal, por ejemplo, al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 zonas. En algunos casos, el diámetro del poste y/o los tamaños de los espacios se hacen progresivamente más pequeños a medida que un fluido fluye desde una entrada a una salida a través de las zonas de un canal. Una zona puede tener aproximadamente 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6 o 1,7 cm de longitud.In some cases, a sample, for example a biological sample, may comprise particles with a wide range of sizes. If a particle in a sample is larger than a space, the particle can clog the channel. In some cases, multiple stages of separation can be used with different sizes of spaces and posts. In some cases, the diameter of the post and the size of the space are smaller in a second zone with respect to a first zone. In some cases, a device comprises a plurality of zones, wherein when a fluid is applied to an inlet of the device, it flows through a plurality of zones in a channel, for example, at least 1,2,3,4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 zones. In some cases, the diameter of the post and / or the sizes of the spaces become progressively smaller as a fluid flows from an inlet to an outlet through the zones of a channel. A zone can be approximately 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, or 1.7 cm in length.

(g) Tamaño del espacio (distancia de borde a borde entre postes u obstáculos)(g) Space size (edge-to-edge distance between posts or obstacles)

En algunos casos, el tamaño del espacio en una matriz de obstáculos (distancia de borde a borde entre postes u obstáculos) es de aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 jm .In some cases, the size of the gap in an obstacle matrix (edge-to-edge distance between posts or obstacles) is approximately 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 , 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13 , 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 , 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 , 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 , 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 or 3000 jm.

En algunos casos, el tamaño del espacio en una matriz de obstáculos es de al menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5.5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 jm .In some cases, the size of the space in an obstacle matrix is at least 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5 , 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15 , 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 , 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250 , 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 , 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 or 3000 jm.

En algunos casos, el tamaño del espacio en una matriz de obstáculos es menor de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19.5, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 jm .In some cases, the size of the space in an obstacle matrix is less than 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6, 5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 or 3000 jm.

En algunos casos, el tamaño del espacio es de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 10 jm a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 20 jm a aproximadamente 30 jm , de aproximadamente 30 jm a aproximadamente 40 jm , de aproximadamente 40 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 50 jm a aproximadamente 60 jm , de aproximadamente 60 jm a aproximadamente 70 jm , de aproximadamente 70 jm a aproximadamente 80 jm , de aproximadamente 80 jm a aproximadamente 90 jm , de aproximadamente 90 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 100 jm a aproximadamente 110 jm , de aproximadamente 110 jm a aproximadamente 120 jm , de aproximadamente 120 jm a aproximadamente 130 jm , de aproximadamente 130 jm a aproximadamente 140 jm , de aproximadamente 140 jm a aproximadamente 150 jm , de aproximadamente 150 jm a aproximadamente 160 jm , de aproximadamente 160 jm a aproximadamente 170 jm , de aproximadamente 170 jm a aproximadamente 180 jm , de aproximadamente 180 jm a aproximadamente 190 jm , de aproximadamente 190 jm a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 200 jm a aproximadamente 250 jm , de aproximadamente 250 jm a aproximadamente 300 jm , de aproximadamente 300 jm a aproximadamente 400 jm , de aproximadamente 400 jm a aproximadamente 500 jm , de aproximadamente 500 jm a aproximadamente 600 jm , de aproximadamente 600 jm a aproximadamente 700 jm , de aproximadamente 700 jm a aproximadamente 800 jm , de aproximadamente 800 jm a aproximadamente 900 jm , de aproximadamente 900 jm a aproximadamente 1000 jm , de aproximadamente 1000 jm a aproximadamente 1500 jm , de aproximadamente 1500 jm a aproximadamente 2000 jm , de aproximadamente 2000 jm a aproximadamente 2500 jm o de aproximadamente 2500 jm a aproximadamente 3000 |jm.In some cases, the size of the gap is from about 1 jm to about 10 jm, from about 10 jm to about 20 jm, from about 20 jm to about 30 jm, from about 30 jm to about 40 jm, from about 40 jm to from about 50 jm, from about 50 jm to about 60 jm, from about 60 jm to about 70 jm, from about 70 jm to about 80 jm, from about 80 jm to about 90 jm, from about 90 jm to about 100 jm, from approximately 100 jm to approximately 110 jm, approximately 110 jm to approximately 120 jm, approximately 120 jm to approximately 130 jm, approximately 130 jm to approximately 140 jm, approximately 140 jm to approximately 150 jm, approximately 150 jm to approximately 160 jm, from about 160 jm to about 170 jm, from about 170 jm to about 180 jm, from about 180 jm to about 190 jm, from about 190 jm to about 200 jm, from about 200 jm to about 250 jm, from about 250 jm to about 300 jm, from about 300 jm to about 400 jm, from about 400 jm to about 500 jm , from about 500 jm to about 600 jm, from about 600 jm to about 700 jm, from about 700 jm to about 800 jm, from about 800 jm to about 900 jm, from about 900 jm to about 1000 jm, from about 1000 jm at about 1500 jm, from about 1500 jm to about 2000 jm, from about 2000 jm to about 2500 jm, or from about 2500 jm to about 3000 | jm.

(h) Diámetro del poste (obstáculo)(h) Diameter of the pole (obstacle)

En algunos casos, el diámetro del poste (obstáculo) es de aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5,In some cases, the diameter of the pole (obstacle) is about 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5,

83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150,83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150,

155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950,155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950,

1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800,1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800,

2900 o 3000 jm.2900 or 3000 jm.

En algunos casos, el diámetro del poste (obstáculo) es de al menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5,In some cases, the diameter of the pole (obstacle) is at least 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5 , 7, 7.5,

8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21,22,8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21.22,

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,

54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,

85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155,85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155,

160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,

1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 jm.1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 or 3000 jm.

En algunos casos, el diámetro del poste (obstáculo) es menor de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8,In some cases, the diameter of the pole (obstacle) is less than 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8,

8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22,8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16, 5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22,

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 4 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 4 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83, 84,

(i) Forma de la sección transversal del obstáculo(i) Obstacle cross section shape

En algunos casos, la forma de la sección transversal de un poste u obstáculo es un círculo, triángulo, cuadrado, rectángulo, pentágono, hexágono, heptágono, octágono, nonágono, decágono, endecágono, dodecágono, hexadecágono, icoságono o estrella. En algunos casos, el triángulo es un triángulo agudo, triángulo equilátero, triángulo isósceles, triángulo obtuso, triángulo racional, triángulo rectángulo (triángulo 30-60-90, triángulo rectángulo isósceles, triángulo de Kepler) o triángulo escaleno. En algunos casos, la forma de la sección transversal de un poste u obstáculo es un cuadrilátero, por ejemplo, un cuadrilátero cíclico, cuadrado, cometa, paralelogramo, rombo, oblongo, romboide, rectángulo, cuadrilátero tangencial, trapezoide, trapecio o trapezoide isósceles. En algunos casos, la forma de la sección transversal de un poste u obstáculo es una media luna, elipse, luna, óvalo, polígono de Reuleaux, triángulo de Reuleaux, lente, vesica piscis, salinon, semicírculo, tomoe, magatama, triquetra, asteroide, superelipse deltoides o hacha. En algunos casos, la forma de sección transversal con una punta tiene una punta afilada. En algunos casos, la forma de sección transversal con una punta tiene una punta redondeada. En algunos casos, la forma de sección transversal con más de una punta tiene al menos una punta redondeada y al menos una punta afilada.In some cases, the cross-sectional shape of a pole or obstacle is a circle, triangle, square, rectangle, pentagon, hexagon, heptagon, octagon, nonagon, decagon, hendecagon, dodecagon, hexadecagon, icosagon, or star. In some cases, the triangle is an acute triangle, equilateral triangle, isosceles triangle, obtuse triangle, rational triangle, right triangle (30-60-90 triangle, isosceles right triangle, Kepler triangle), or scalene triangle. In some cases, the cross-sectional shape of a pole or obstacle is a quadrilateral, for example a cyclic quadrilateral, square, comet, parallelogram, rhombus, oblong, rhomboid, rectangle, tangential quadrilateral, trapezoid, trapezoid, or isosceles trapezoid. In some cases, the cross-sectional shape of a pole or obstacle is a crescent, ellipse, moon, oval, Reuleaux polygon, Reuleaux triangle, lens, vesica piscis, salinon, semicircle, tomoe, magatama, triquetra, asteroid , deltoid superelipse or ax. In some cases, the cross-sectional shape with a point has a sharp point. In some cases, the cross-sectional shape with a tip has a rounded tip. In some cases, the cross-sectional shape with more than one point has at least one rounded point and at least one sharp point.

En algunos casos, el poste (obstáculo) tiene forma cilíndrica.In some cases, the post (obstacle) is cylindrical in shape.

(j) Distancia de postes (obstáculos) desde una entrada(j) Distance of posts (obstacles) from an entrance

Una primera fila de postes puede estar separada por menos de aproximadamente 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700,A first row of posts can be separated by less than about 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700,

650, 600, 550 o 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 10 o 5 jm de una entrada.650, 600, 550 or 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 10 or 5 jm of an entry.

(k) Ángulo de inclinación(k) Angle of inclination

En algunos casos, una matriz de obstáculos tiene un ángulo de inclinación £ (con respecto a la dirección del flujo de fluido) de 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/10, 1/11, 1/12, 1/13, 1/14, 1/15, 1/16, 1/17, 1/18, 1/19, 1/20, 1/21, 1/22, 1/23,In some cases, an obstacle matrix has an angle of inclination £ (with respect to the direction of fluid flow) of 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/10, 1/11, 1/12, 1/13, 1/14, 1/15, 1/16, 1/17, 1/18, 1/19, 1/20, 1 / 21, 1/22, 1/23,

1/24, 1/25, 1/26, 1/27, 1/28, 1/29, 1/30, 1/31, 1/32, 1/33, 1/34, 1/35, 1/36, 1/37, 1/38, 1/39, 1/40, 1/41, 1/42, 1/43, 1/44,1/24, 1/25, 1/26, 1/27, 1/28, 1/29, 1/30, 1/31, 1/32, 1/33, 1/34, 1/35, 1 / 36, 1/37, 1/38, 1/39, 1/40, 1/41, 1/42, 1/43, 1/44,

1/45, 1/46, 1/47, 1/48, 1/49, 1/50, 1/51, 1/52, 1/53, 1/54, 1/55, 1/56, 1/57, 1/58, 1/59, 1/60, 1/61, 1/62, 1/63, 1/64, 1/65,1/45, 1/46, 1/47, 1/48, 1/49, 1/50, 1/51, 1/52, 1/53, 1/54, 1/55, 1/56, 1 / 57, 1/58, 1/59, 1/60, 1/61, 1/62, 1/63, 1/64, 1/65,

1/66, 1/67, 1/68, 1/69, 1/70, 1/71, 1/72, 1/73, 1/74, 1/75, 1/76, 1/77, 1/78, 1/79, 1/80, 1/81, 1/82, 1/83, 1/84, 1/85, 1/86,1/66, 1/67, 1/68, 1/69, 1/70, 1/71, 1/72, 1/73, 1/74, 1/75, 1/76, 1/77, 1 / 78, 1/79, 1/80, 1/81, 1/82, 1/83, 1/84, 1/85, 1/86,

1/87, 1/88, 1/89, 1/90, 1/91, 1/92, 1/93, 1/94, 1/95, 1/96, 1/97, 1/98, 1/99, 1/100, 1/110, 1/120, 1/130, 1/140, 1/150, 1/160, 1/170, 1/180, 1/190, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/600, 1/700, 1/800, 1/900, 1/1000, 1/2000, 1/3000, 1/4000, 1/5000, 1/6000, 1/7000, 1/8000, 1/9000 o 1/10.000 radianes.1/87, 1/88, 1/89, 1/90, 1/91, 1/92, 1/93, 1/94, 1/95, 1/96, 1/97, 1/98, 1 / 99, 1/100, 1/110, 1/120, 1/130, 1/140, 1/150, 1/160, 1/170, 1/180, 1/190, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/600, 1/700, 1/800, 1/900, 1/1000, 1/2000, 1/3000, 1/4000, 1/5000, 1/6000, 1 / 7000, 1/8000, 1/9000, or 1 / 10,000 radians.

En algunos casos, £ es menor de 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/10, 1/11, 1/12, 1/13, 1/14, 15/1, 16/1, 17/1, 18/1,In some cases, £ is less than 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/10, 1/11, 1/12, 1 / 13, 1/14, 15/1, 16/1, 17/1, 18/1,

1/19, 1/20, 1/21, 1/22, 1/23, 1/24, 1/25, 1/26, 1/27, 1/28, 1/29, 1/30, 1/31, 1/32, 1/33, 1/34, 1/35, 1/36, 1/37, 1/38, 1/39, 1/19, 1/20, 1/21, 1/22, 1/23, 1/24, 1/25, 1/26, 1/27, 1/28, 1/29, 1/30, 1 / 31, 1/32, 1/33, 1/34, 1/35, 1/36, 1/37, 1/38, 1/39,

1/40, 1/41, 1/42, 1/43, 1/44, 1/45, 1/46, 1/47, 1/48, 1/49, 1/50, 1/51, 1/52, 1/53, 1/54, 1/55, 1/56, 1/57, 1/58, 1/59, 1/60,1/40, 1/41, 1/42, 1/43, 1/44, 1/45, 1/46, 1/47, 1/48, 1/49, 1/50, 1/51, 1 / 52, 1/53, 1/54, 1/55, 1/56, 1/57, 1/58, 1/59, 1/60,

1/61, 1/62, 1/63, 1/64, 1/65, 1/66, 1/67, 1/68, 1/69, 1/70, 1/71, 1/72, 1/73, 1/74, 1/75, 1/76, 1/77, 1/78, 1/79, 1/80, 1/81,1/61, 1/62, 1/63, 1/64, 1/65, 1/66, 1/67, 1/68, 1/69, 1/70, 1/71, 1/72, 1 / 73, 1/74, 1/75, 1/76, 1/77, 1/78, 1/79, 1/80, 1/81,

1/82, 1/83, 1/84, 1/85, 1/86, 1/87, 1/88, 1/89, 1/90, 1/91, 1/92, 1/93, 1/94, 1/95, 1/96, 1/97, 1/98, 1/99, 1/100, 1/110,1/82, 1/83, 1/84, 1/85, 1/86, 1/87, 1/88, 1/89, 1/90, 1/91, 1/92, 1/93, 1 / 94, 1/95, 1/96, 1/97, 1/98, 1/99, 1/100, 1/110,

1/120, 1/130, 1/140, 1/150, 1/160, 1/170, 1/180, 1/190, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/600, 1/700, 1/800, 1/900, 1/1000,1/120, 1/130, 1/140, 1/150, 1/160, 1/170, 1/180, 1/190, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1 / 600, 1/700, 1/800, 1/900, 1/1000,

1/2000, 1/3000, 1/4000, 1/5000, 1/6000, 1/7000, 1/8000, 1/9000 o 1/10.000 radianes.1/2000, 1/3000, 1/4000, 1/5000, 1/6000, 1/7000, 1/8000, 1/9000, or 1 / 10,000 radians.

En algunos casos, el ángulo de inclinación está comprendido entre aproximadamente 1/1000 y aproximadamente 1/3,In some cases, the angle of inclination is between approximately 1/1000 and approximately 1/3,

o es de aproximadamente 1/100 a aproximadamente 1/5, o de aproximadamente 1/1000 a aproximadamente 1/100, oo is about 1/100 to about 1/5, or about 1/1000 to about 1/100, or

de aproximadamente 1/500 a aproximadamente 1/100, o de aproximadamente 1/50 a aproximadamente 1/3.from about 1/500 to about 1/100, or from about 1/50 to about 1/3.

(l) Anchura de entrada o del canal de entrada(l) Inlet or inlet channel width

En algunos casos, cada una de una pluralidad de entradas en un dispositivo tal como se proporciona en el presenteIn some cases, each of a plurality of inputs on a device as provided herein

documento que comprende la pluralidad de entradas tiene la misma o sustancialmente la misma anchura. En algunosDocument comprising the plurality of entries has the same or substantially the same width. In some

casos, cada una de una pluralidad de entradas en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documentocases, each of a plurality of inputs on a device as provided herein

que comprende la pluralidad de entradas tiene una anchura diferente o sustancialmente diferente. En algunos casos,comprising the plurality of inlets has a different or substantially different width. In some cases,

una o más de una pluralidad de entradas en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento queone or more than a plurality of inputs on a device as provided herein that

comprende una pluralidad de entradas comprende una entrada de muestra, en donde la entrada de muestra tiene unacomprises a plurality of inlets comprises a sample inlet, wherein the sample inlet has a

anchura diferente o sustancialmente diferente que cada una de la otra pluralidad de entradas. En algunos casos, cadadifferent or substantially different width than each of the other plurality of entrances. In some cases, each

entrada de una pluralidad de entradas es un canal de entrada, en donde el canal de entrada está delimitado por dosinput of a plurality of inputs is an input channel, wherein the input channel is bounded by two

paredes opuestas. Cada entrada o canal de entrada puede corresponder a una corriente de flujo. En algunos casos,opposite walls. Each inlet or inlet channel can correspond to a flow stream. In some cases,

la anchura del canal de entrada (por ejemplo, muestra, tampón y/o reactivo) es de aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3,the width of the inlet channel (e.g. sample, buffer and / or reagent) is approximately 1, 1.5, 2, 2.5, 3,

3.5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17,3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17,

17.5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44,17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44,

45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,

76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,

105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133,

134, 135, 136, 137, 138, 139,

140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156,

157, 158, 159, 160, 161, 162,

163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185,

186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200,

201, 202,

203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300,

350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 pm105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133,

134, 135, 136, 137, 138, 139,

157, 158, 159, 160, 161, 162,

186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200,

201, 202,

350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 or 1500 pm

En algunos casos, la anchura del canal de entrada (por ejemplo, muestra, tampón y/o reactivo) es de al menos 1, 1,5,In some cases, the width of the inlet channel (e.g. sample, buffer, and / or reagent) is at least 1, 1.5,

2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16,2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16,

16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,

42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,

73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102,73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102,

103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,

126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148,

149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171,

172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194,172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194,

195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217,195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217,

218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750,218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750,

800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 pm.800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 or 1500 pm.

En algunos casos, la anchura del canal de entrada (por ejemplo, muestra, tampón y/o reactivo) es menor de 1, 1,5, 2,In some cases, the width of the inlet channel (e.g. sample, buffer, and / or reagent) is less than 1, 1.5, 2,

75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,

105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127,105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127,

128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150,128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150,

151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173,151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173,

174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196,174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196,

197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219,197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219,

220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850,220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850,

900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 pm.900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 or 1500 pm.

En algunos casos, la anchura del canal de entrada (por ejemplo, muestra, tampón y/o reactivo) es de aproximadamenteIn some cases, the width of the inlet channel (e.g., sample, buffer, and / or reagent) is approximately

1 a aproximadamente 10 pm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 pm, de aproximadamente 20 a1 to about 10 pm, from about 10 to about 20 pm, from about 20 to

aproximadamente 30 pm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 pm, de aproximadamente 60 aabout 30 pm, from about 30 to about 60 pm, from about 60 to

aproximadamente 90 pm, de aproximadamente 90 a aproximadamente 120 pm, de aproximadamente 120 aabout 90 pm, from about 90 to about 120 pm, from about 120 to

aproximadamente 180 pm, de aproximadamente 180 a aproximadamente 250 pm, de aproximadamente 250 aabout 180 pm, from about 180 to about 250 pm, from about 250 to

aproximadamente 500 pm, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 pm, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 1500 |jm.about 500 pm, from about 500 to about 1000 pm, from about 1000 to approximately 1500 | jm.

(m) Anchura de salida de producto o del canal de salida de producto(m) Width of product outlet or product outlet channel

En algunos casos, cada una de una pluralidad de salidas en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento que comprende la pluralidad de salidas tiene la misma o sustancialmente la misma anchura. En algunos casos, cada una de una pluralidad de salidas en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento que comprende la pluralidad de salidas tiene una anchura diferente o sustancialmente diferente. En algunos casos, una o más de una pluralidad de salidas en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento que comprende una pluralidad de salidas comprende una entrada de muestra, en donde la entrada de muestra tiene una anchura diferente o sustancialmente diferente que cada una de la otra pluralidad de salidas. En algunos casos, cada salida de una pluralidad de salidas es un canal de salida, en donde el canal de salida está delimitado por dos paredes opuestas. Cada salida o canal de salida puede corresponder a una corriente de flujo. En algunos casos, la anchura del canal de salida (por ejemplo, producto, residuo (por ejemplo, tampón y/o reactivo) es de aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 jm .In some cases, each of a plurality of outlets in a device as provided herein comprising the plurality of outlets has the same or substantially the same width. In some cases, each of a plurality of outlets in a device as provided herein comprising the plurality of outlets has a different or substantially different width. In some cases, one or more than a plurality of outlets in a device as provided herein comprising a plurality of outlets comprises a sample inlet, wherein the sample inlet has a different or substantially different width than each. one of the other plurality of outputs. In some cases, each outlet of a plurality of outlets is an outlet channel, where the outlet channel is bounded by two opposite walls. Each outlet or outlet channel can correspond to a flow stream. In some cases, the width of the outlet channel (e.g. product, residue (e.g. buffer and / or reagent) is approximately 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12, 5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 or 1500 jm.

En algunos casos, la anchura del canal de salida (por ejemplo, producto, residuo (por ejemplo, tampón y/o reactivo) es de al menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 jm .In some cases, the width of the outlet channel (e.g. product, residue (e.g. buffer and / or reagent) is at least 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 , 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12 , 5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 , 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 , 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 , 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400 , 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 or 1500 jm.

En algunos casos, la anchura del canal de salida (por ejemplo, producto, residuo (por ejemplo, tampón y/o reactivo) es menor de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 jm .In some cases, the width of the outlet channel (e.g. product, residue (e.g. buffer and / or reagent) is less than 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12, 5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 or 1500 jm.

En algunos casos, la anchura de un canal de salida (por ejemplo, producto, residuo (por ejemplo, reactivo y/o tampón)) es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 jm , de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 jm , de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 jm , de aproximadamente 90 a aproximadamente 120 jm , de aproximadamente 120 a aproximadamente 180 jm , de aproximadamente 180 a aproximadamente 250 jm , de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 jm , de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 jm , de aproximadamente 1000 a aproximadamente 1500 jm . En algunos casos, la relación entre la anchura de la salida de producto en la base de una matriz DLD y la anchura de una salida de residuo en la base de una matriz DLD es aproximadamente 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 o 1:10. La relación entre la anchura de la salida de producto en la base de una matriz DLD y la anchura de una salida de residuo en la base de una matriz DLD puede ser de al menos 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 o 1:10.In some cases, the width of an outlet channel (e.g., product, residue (e.g., reagent and / or buffer)) is from about 1 to about 10 µm, from about 10 to about 20 µm, from about 20 to about 30 µm, about 30 to about 60 µm, about 60 to about 90 µm, about 90 to about 120 µm, about 120 to about 180 µm, about 180 to about 250 µm, about 250 to about 500 µm jm, from about 500 to about 1000 jm, from about 1000 to about 1500 jm. In some cases, the ratio of the width of the product outlet at the base of a DLD matrix to the width of a residue outlet at the base of a DLD matrix is approximately 10: 1, 9: 1, 8: 1, 7: 1, 6: 1, 5: 1, 4: 1, 3: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 7, 1: 8, 1: 9, or 1:10. The ratio between the width of the product outlet at the base of a DLD matrix and the width of a waste outlet at the base of a DLD matrix can be at least 10: 1, 9: 1, 8: 1, 7 : 1, 6: 1, 5: 1, 4: 1, 3: 1, 2; 1, 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 7 , 1: 8, 1: 9 or 1:10.

(n) Longitud de la pared separadora(n) Length of partition wall

En algunos casos, una pared separadora se extiende hacia el interior de una matriz de obstáculos en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento. La pared separadora puede extenderse en al menos, como máximo, más de, menos de o aproximadamente el 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100 % de la longitud de un canal que comprende la matriz de obstáculos y la pared separadora.In some cases, a partition wall extends into an obstacle matrix in a device as provided herein. The partition wall may extend by at least, at most, more than, less than or about 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% of the length of a channel comprising the obstacle matrix and the dividing wall.

En algunos casos, la longitud de la pared separadora es aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mm. In some cases, the length of the partition wall is approximately 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 or 200 mm.

En algunos casos, la longitud de la pared separadora es menor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mm.In some cases, the length of the partition wall is less than 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 , 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 or 200 mm.

En algunos casos, la pared separadora es de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mm.In some cases, the partition wall is at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 , 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 , 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 or 200 mm.

En algunos casos, la pared separadora es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mm, de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 mm, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 mm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 mm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 100 mm o de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 mm.In some cases, the partition wall is from about 1 to about 10mm, from about 2 to about 9mm, from about 3 to about 8mm, from about 10 to about 20mm, from about 20 to about 30mm, from about 30 to about 40mm, from about 40 to about 60mm, from about 60 to about 70mm, from about 70 to about 100mm, or from about 100 to about 200mm.

(o) Anchura de la pared separadora(o) Width of partition wall

En algunos casos, una pared separadora en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento tiene la misma anchura a lo largo de toda la longitud de la pared separadora. La pared separadora puede estrecharse, en donde un primer extremo de la pared separadora tiene una anchura mayor que un segundo extremo de la pared separadora.In some cases, a partition wall in a device as provided herein has the same width along the entire length of the partition wall. The partition wall can be narrowed, wherein a first end of the partition wall has a greater width than a second end of the partition wall.

En algunos casos, la anchura de la pared separadora es de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750 o 1000 pm.In some cases, the width of the partition wall is approximately 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 , 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150 , 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750 or 1000 pm.

En algunos casos, la anchura de la pared separadora es de al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750 o 1000 pm.In some cases, the width of the partition wall is at least 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750 or 1000 pm.

En algunos casos, la anchura de la pared separadora es menor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750 o 1000 pm.In some cases, the width of the partition wall is less than 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 , 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150 , 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750 or 1000 pm.

En algunos casos, la anchura de la pared separadora es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 pm, de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 9 pm, de aproximadamente 3 pm a aproximadamente 8 pm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 pm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 pm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 pm, de aproximadamente 40 pm a aproximadamente 60 pm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 pm, de aproximadamente 70 pm a aproximadamente 100 pm, de aproximadamente 100 a aproximadamente 250, de aproximadamente 250 a aproximadamente 500, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 pm.In some cases, the width of the partition wall is from about 1 to about 10 pm, from about 2 pm to about 9 pm, from about 3 pm to about 8 pm, from about 10 to about 20 pm, from about 20 to about 30 pm, from about 30 to about 40 pm, from about 40 pm to about 60 pm, from about 60 to about 70 pm, from about 70 pm to about 100 pm, from about 100 to about 250, from about 250 to about 500 , or from about 500 to about 1000 pm.

En algunos casos, un tamaño predeterminado es al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3.5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17.5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 pm.In some cases, a default size is at least 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1, 5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 pm.

En algunos casos, un tamaño predeterminado es de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16.5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 pm. In some cases, a default size is approximately 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1, 5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18, 5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 pm.

En algunos casos, un tamaño predeterminado es menor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3,In some cases, a default size is less than 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1, 5, 2, 2.5, 3,

17.5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,

76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 |jm.76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 | jm.

(p) Anchura de espacio entre paredes separadoras(p) Spacing width between partition walls

En algunos casos, existe un espacio entre paredes separadoras adyacentes en un dispositivo de múltiples corrientesIn some cases, there is a gap between adjacent partition walls in a multi-stream device

(por ejemplo, "lavado de coches") tal como se proporciona en el presente documento. El espacio se puede configurar para que las partículas (por ejemplo, células) que se desvían a través de una matriz de obstáculos en un dispositivo(eg "car wash") as provided herein. Space can be configured so that particles (e.g. cells) that drift through an array of obstacles in a device

tal como se proporciona en el presente documento puedan pasar entre ellos. En algunos casos, la anchura del espacioas provided herein can pass between them. In some cases, the width of the space

entre paredes separadoras (por ejemplo, paredes separadoras opuestas) es de aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3,between partition walls (for example, opposing partition walls) is about 1, 1.5, 2, 2.5, 3,

197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 jm .197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 or 1500 jm.

En algunos casos, la anchura del espacio entre paredes separadoras (por ejemplo, paredes separadoras opuestas) es de al menos 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,In some cases, the width of the space between partition walls (for example, opposing partition walls) is at least 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5 , 5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5 , 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,

36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,

67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,

98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,

122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144,122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144,

145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167,145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167,

168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190,168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190,

191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213,191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213,

214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550,214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550,

600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 jm .600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 or 1500 jm.

En algunos casos, la anchura del espacio entre paredes separadoras (por ejemplo, paredes separadoras opuestas)In some cases, the width of the space between partition walls (for example, opposing partition walls)

, 33, 3 , 64, 6

, 95, 9, 33, 3, 64, 6

, 95, 9

650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 jm .650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 or 1500 jm.

En algunos casos, la anchura del espacio entre paredes separadoras (por ejemplo, paredes separadoras opuestas) es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 jm , de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 jm , de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 jm , de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 jm , de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 jm , de aproximadamente 90 a aproximadamente 120 jm , de aproximadamente 120 a aproximadamente 180 jm , de aproximadamente 180 a aproximadamente 250 jm , de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 jm , de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 jm , de aproximadamente 1000 a aproximadamente 1500 jm .In some cases, the width of the space between parting walls (for example, opposing parting walls) is from about 1 to about 10 µm, from about 10 to about 20 µm, from about 20 to about 30 µm, from about 30 to about 60 µm. jm, from about 60 to about 90 jm, from about 90 to about 120 jm, from about 120 to about 180 jm, from about 180 to about 250 jm, from about 250 to about 500 jm, from about 500 to about 1000 jm, from about 1000 to about 1500 jm.

(q) Configuraciones de canal(q) Channel settings

En algunos casos, un dispositivo puede tener una configuración de un dispositivo tal como se describe en la PatenteIn some cases, a device may have a device configuration such as described in the Patent

de Estados Unidos N.° 8021614. En algunos casos, un canal en un dispositivo comprende matrices de obstáculos de espejo, en donde una matriz de obstáculos está configurada para desviar una partícula de al menos un tamaño predeterminado a un canal de derivación central, y una segunda matriz de obstáculos adyacentes a la primera matrizUS Patent No. 8021614. In some cases, a channel in a device comprises mirror obstacle arrays, wherein an obstacle array is configured to deflect a particle of at least a predetermined size to a central bypass channel, and a second obstacle matrix adjacent to the first matrix

de obstáculos también dirige partículas de al menos un primer tamaño predeterminado al canal de derivación central. Obstacle also directs particles of at least a first predetermined size into the central bypass channel.

En algunos casos, el canal de derivación comprende una pared que separa la primera matriz de obstáculos y la segunda matriz de obstáculos. En algunos casos, el canal de derivación no comprende una pared que separa la primera matriz de obstáculos y la segunda matriz de obstáculos. En algunos casos, un canal con una matriz de espejo comprende al menos dos entradas. En algunos casos, una salida de muestra está en comunicación fluida con el canal de derivación. En algunos casos, un canal con una matriz de espejo comprende al menos una salida de residuos. En algunos casos, un canal con una matriz de espejo comprende una pluralidad de entradas y una pluralidad de salidas con una matriz de obstáculos dispuestos entre ellas, en donde cada una de las matrices en la matriz de espejo, y en donde el canal está configurado para hacer fluir una pluralidad de fluidos desde la pluralidad de entradas a la pluralidad de salidas. Cada uno de la pluralidad de fluidos puede fluir en paralelo a los flujos de fluidos adyacentes. En algunos casos, un dispositivo de múltiples corrientes (por ejemplo, "lavado de coches") que comprende una matriz de espejo tal como se describe en el presente documento comprende además una o más paredes separadoras entre corrientes de flujo adyacentes. En algunos casos, El canal con una matriz de espejo comprende al menos una salida de residuos.In some cases, the bypass channel comprises a wall separating the first obstacle matrix and the second obstacle matrix. In some cases, the bypass channel does not comprise a wall separating the first obstacle matrix and the second obstacle matrix. In some cases, a channel with a mirror matrix comprises at least two inputs. In some cases, a sample outlet is in fluid communication with the bypass channel. In some cases, a channel with a mirror matrix comprises at least one waste outlet. In some cases, a channel with a mirror matrix comprises a plurality of inputs and a plurality of outputs with an obstacle matrix arranged between them, wherein each of the matrices in the mirror matrix, and wherein the channel is configured to flow a plurality of fluids from the plurality of inlets to the plurality of outlets. Each of the plurality of fluids can flow in parallel to adjacent fluid flows. In some cases, a multi-stream device (eg, "car wash") comprising a mirror matrix as described herein further comprises one or more partition walls between adjacent flow streams. In some cases, the channel with a mirror matrix comprises at least one waste outlet.

En algunos casos, un canal no comprende una matriz de espejo. En algunos casos, un canal comprende una primera matriz de obstáculos que dirigen partículas de al menos un tamaño predeterminado a un canal de derivación adyacente a una pared del canal. En algunos casos, un canal comprende una pluralidad de canales de derivación. En algunos casos, un canal comprende dos matrices de espejo de obstáculos, dos entradas y una corriente de tampón central para concentrar las partículas de cada una de las matrices de espejo de obstáculos. En algunos casos, un canal comprende una entrada. En algunos casos, un canal comprende dos entradas.In some cases, a channel does not comprise a mirror matrix. In some cases, a channel comprises a first array of obstacles that direct particles of at least a predetermined size into a bypass channel adjacent to a channel wall. In some cases, a channel comprises a plurality of bypass channels. In some cases, a channel comprises two obstacle mirror arrays, two inputs, and a central buffer stream for concentrating the particles from each of the obstacle mirror arrays. In some cases, a channel comprises an input. In some cases, a channel comprises two inputs.

(r) Propiedades de flujo(r) Flow properties

En algunos casos, el flujo a través de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos es laminar.In some cases, the flow through a device comprising an obstacle matrix is laminar.

Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento pueden facilitar un caudal rápido a través de un dispositivo. En algunos casos, el caudal a través de un dispositivo es de al menos 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19.5, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 ml/min.The methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can facilitate rapid flow through a device. In some cases, the flow rate through a device is at least 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09 , 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 , 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11 , 5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20 , 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 , 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300 , 350, 400, 450 or 500 ml / min.

En algunos casos, el caudal a través de un dispositivo es de aproximadamente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10.5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87. 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 ml/min.In some cases, the flow rate through a device is approximately 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87. 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 or 500 ml / min.

En algunos casos, el caudal a través de un dispositivo es menor de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11.5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 ml/min.In some cases, the flow rate through a device is less than 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 or 500 ml / min.

En algunos casos, el caudal a través de un dispositivo es de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,1 ml/min, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 ml/min, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 ml/min, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 ml/min, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 ml/min, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 ml/min, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 ml/min, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 ml/min, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 ml/min, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 500 ml/min.In some cases, the flow rate through a device is from about 0.05 to about 0.1 ml / min, from about 0.1 to about 0.5 ml / min, from about 0.5 to about 1 ml / min. min, from about 1 to about 5 ml / min, from about 5 to about 10 ml / min, from about 10 to about 20 ml / min, from about 20 to about 50 ml / min, from about 50 to about 100 ml / min, from about 100 to about 200 ml / min, or from about 200 to about 500 ml / min.

En algunos casos, la velocidad del fluido es de al menos 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000 mm/s.In some cases, the fluid velocity is at least 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 or 10,000 mm / s.

En algunos casos, la velocidad del fluido es de aproximadamente 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000 mm/s.In some cases, the fluid velocity is approximately 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 , 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 or 10,000 mm / s.

En algunos casos, la velocidad del fluido es menor de 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000 mm/s.In some cases, the fluid velocity is less than 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 , 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 or 10,000 mm / s.

En algunos casos, la fuerza de cizallamiento es de aproximadamente 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10.000, 25.000, 50.000, 75.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000 o 1.000.000 s-1. In some cases, the shear force is about 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000, 25,000, 50,000, 75,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, or 1,000,000 s-1.

En algunos casos, la fuerza de cizallamiento es menor de 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10.000, 25.000, 50.000, 75.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000 o 1.000.000 s-1.In some cases, the shear force is less than 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000, 25,000, 50,000, 75,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, or 1,000 .000 s-1.

En algunos casos, la fuerza de cizallamiento es mayor de 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10.000, 25.000, 50.000, 75.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000 o 1.000.000 s-1.In some cases, the shear force is greater than 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000, 25,000, 50,000, 75,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, or 1,000 .000 s-1.

(s) Presión(s) Pressure

En algunos casos, una muestra se hace fluir a través de un dispositivo a una presión de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 atm.In some cases, a sample is flowed through a device at a pressure of approximately 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 , 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2 , 2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3 , 5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4 , 8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29 or 30 atm.

En algunos casos, una muestra se hace fluir a través de un dispositivo a una presión de al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3.3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 atm.In some cases, a sample is flowed through a device at a pressure of at least 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0, 8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3, 5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4, 8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 atm.

En algunos casos, una muestra se hace fluir a través de un dispositivo a una presión menor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3.4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 atm.In some cases, a sample is flowed through a device at a pressure less than 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 , 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2 , 2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5 , 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8 , 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27 , 28, 29 or 30 atm.

(t) Tamaño predeterminado (tamaño crítico)(t) Default size (critical size)

En algunos casos, un dispositivo tal como se describe en el presente documento puede utilizarse para desviar partículas de al menos un tamaño predeterminado a una primera salida (por ejemplo, producto) y partículas menores de un tamaño predeterminado a una segunda salida (por ejemplo, residuo). En algunos casos, un tamaño predeterminado es de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6.5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 |jm.In some cases, a device as described herein can be used to divert particles of at least a predetermined size to a first outlet (eg product) and smaller particles of a predetermined size to a second outlet (eg, residue). In some cases, a default size is approximately 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1, 5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18, 5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 | jm.

En algunos casos, el tamaño predeterminado es menor que 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3.5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17.5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 jm .In some cases, the default size is less than 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1, 5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 jm.

En algunos casos, el tamaño predeterminado es mayor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 jm .In some cases, the default size is larger than 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1, 5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 jm.

En algunos casos, un dispositivo comprende una matriz de obstáculos, en donde los obstáculos comprenden obstáculos con un diámetro de 18 jm , y la matriz de obstáculos comprende filas u obstáculos con un espacio de 18 jm , en donde una fila posterior tiene un desplazamiento de fila de 1/42. En algún caso, los obstáculos son semiespeculares. Semi-especular puede significar que la distribución puede reflejar la matriz a través de la línea central (es decir, el canal de recolección) y después desplazar esa matriz reflejada hacia abajo hacia la salida en un cierto número de filas. En algunos casos, el número de filas es 5. La anchura del canal de recolección puede mantenerse uniforme o sustancialmente más uniforme que si los obstáculos fueran realmente especulares. Las matrices a ambos lados del canal de recolección pueden ser idénticas, pero solamente están desplazadas entre sí en la dirección del flujo,In some cases, a device comprises an obstacle matrix, where the obstacles comprise obstacles with a diameter of 18 µm, and the obstacle matrix comprises rows or obstacles with a gap of 18 µm, where a rear row has an offset of row of 1/42. In some cases, the obstacles are semi-specular. Semi-specular can mean that the distribution can mirror the matrix across the center line (ie the collection channel) and then shift that reflected matrix down towards the output by a certain number of rows. In some cases, the number of rows is 5. The width of the collecting channel can be kept uniform or substantially more uniform than if the obstacles were actually specular. The matrices on both sides of the collection channel may be identical, but they are only offset from each other in the direction of flow,

(u) Recubrimiento de obstáculos(u) Obstacle covering

En algunos casos, los obstáculos comprenden un agente de captura por afinidad, por ejemplo, un anticuerpo, otro agente de unión a proteínas, o ácido nucleico. Los obstáculos pueden comprender un agente de captura por afinidad específico para capturar partículas específicas en una muestra. La captura por afinidad se describe, por ejemplo, en la Publicación PCT N.° WO2012094642.In some cases, the hindrances comprise an affinity capture agent, eg, an antibody, another protein-binding agent, or nucleic acid. Obstacles can comprise a specific affinity capture agent to capture specific particles in a sample. Affinity capture is described, for example, in PCT Publication No. WO2012094642.

(v) Sistema de limpieza en el chip(v) On-chip cleaning system

En algunos casos, los dispositivos descritos en el presente documento pueden comprender un sistema integrado para la limpieza en el chip. Se ilustran ejemplos del sistema de autolimpieza en la FIG. 33A-C. En algunos casos, el sistema de limpieza en el chip comprende aberturas en las paredes de un canal de modo que el fluido pueda fluir a través de las aberturas, donde el flujo de fluido es sustancialmente perpendicular a la trayectoria de flujo habitual del canal. El sistema de limpieza se puede utilizar para retirar partículas, por ejemplo, células atrapadas en una matriz de obstáculos. En algunos casos, las aberturas están presentes en una sola pared que delimita el canal. En algunos casos, las aberturas están presentes en las dos paredes que delimitan el canal.In some cases, the devices described herein may comprise an integrated on-chip cleaning system. Examples of the self-cleaning system are illustrated in FIG. 33A-C . In some cases, the on-chip cleaning system comprises openings in the walls of a channel so that fluid can flow through the openings, where the fluid flow is substantially perpendicular to the usual flow path of the channel. The cleaning system can be used to remove particles, for example cells trapped in a matrix of obstacles. In some cases, the openings are present in a single wall that delimits the canal. In some cases, the openings are present in the two walls that delimit the canal.

La FIG. 33A ilustra un dispositivo que comprende una matriz de desplazamiento lateral determinista (DLD) que también comprende un sistema de limpieza en el chip. Las entradas de muestra y tampón se ilustran a la izquierda del canal, y las salidas de producto y residuo se ilustran a la derecha. Se ilustran las paredes para la contención del fluido. El sistema de limpieza en el chip se ilustra en una configuración "abierta" con aberturas en las paredes que delimitan la matriz DLD. Se ilustra un fluido que fluye desde la parte superior del esquema hasta la parte inferior del esquema formando un ángulo recto con la dirección del flujo de partículas y tampón.FIG. 33A illustrates a device comprising a deterministic lateral shift matrix (DLD) that also comprises an on-chip cleaning system. Sample and buffer inlets are illustrated on the left of the channel, and product and residue outputs are illustrated on the right. Walls for fluid containment are illustrated. The on-chip cleaning system is illustrated in an "open" configuration with openings in the walls delimiting the DLD array. A fluid is illustrated flowing from the top of the scheme to the bottom of the scheme at right angles to the direction of particle and buffer flow.

La FIG.33B ilustra un sistema de limpieza en el chip en una configuración cerrada. En esta configuración, las aberturas en las paredes que delimitan el canal están bloqueadas. FIG. 33B illustrates an on-chip cleaning system in a closed configuration. In this configuration, the openings in the walls delimiting the channel are blocked.

La FIG.33C ilustra un sistema de limpieza en el chip en una configuración abierta. En esta configuración, las aberturas en las paredes que delimitan el canal están desbloqueadas. En algunos casos, como se ilustra en la Fig. 33C, los extremos de entrada y salida del canal se pueden bloquear mientras las aberturas en la pared están en la posición abierta. En algunos casos, los extremos de entrada y/o salida del canal no están bloqueados cuando las aberturas en la pared están en una configuración desbloqueada. FIG. 33C illustrates an on-chip cleaning system in an open configuration. In this configuration, the openings in the walls delimiting the channel are unlocked. In some cases, as illustrated in Fig. 33C , the inlet and outlet ends of the channel may be blocked while the openings in the wall are in the open position. In some cases, the inlet and / or outlet ends of the channel are not locked when the openings in the wall are in an unlocked configuration.

En algunos casos, el bloqueo y desbloqueo de las aberturas en las paredes se controla de forma manual o automática. En algunos casos, El bloqueo y desbloqueo de las aberturas en las paredes se controla electrónicamente.In some cases, the locking and unlocking of openings in the walls is controlled manually or automatically. In some cases, the locking and unlocking of the openings in the walls is controlled electronically.

En algunos casos, un sistema de limpieza en el chip se activa cuando se estimula un sensor. En algunos casos, el sensor es un sensor de presión (por ejemplo, si la contrapresión en el dispositivo supera un umbral (por ejemplo, debido a una obstrucción), se puede enviar una alerta de que puede utilizarse el sistema de limpieza en el chip o de que puede activarse automáticamente el sistema de limpieza en el chip). En algún caso, el sensor es un sensor óptico, por ejemplo, un sistema óptico, por ejemplo, un microscopio. En algunos casos, el sistema óptico puede monitorear el dispositivo para detectar obstrucciones, por ejemplo, mediante la detección de partículas fluorescentes atrapadas. En algunos casos, el sensor es un espectrofotómetro que detecta la obstrucción de una trayectoria de luz a través de la parte inferior y superior del dispositivo (por ejemplo, la reducción en la transmisión de luz a través del dispositivo indica obstrucción).In some cases, an on-chip cleaning system is activated when a sensor is stimulated. In some cases, the sensor is a pressure sensor (for example, if the back pressure in the device exceeds a threshold (for example, due to a clog), an alert can be sent that the on-chip cleaning system can be used or that the on-chip cleaning system can be activated automatically). In some case, the sensor is an optical sensor, for example an optical system, for example a microscope. In some cases, the optical system can monitor the device for obstructions, for example by detecting trapped fluorescent particles. In some cases, the sensor is a spectrophotometer that detects obstruction of a light path through the top and bottom of the device (for example, reduction in light transmission through the device indicates obstruction).

Cualquier dispositivo que comprenda un canal que comprenda una matriz de obstáculos puede comprender un sistema de limpieza en el chip. El conjunto de obstáculos puede ser una matriz simétrica de obstáculos, matriz asimétrica de obstáculos, matriz especular de obstáculos, una matriz de obstáculos especulares con un canal de derivación central con o sin una pared, o una matriz semiespecular de obstáculos.Any device comprising a channel comprising an obstacle matrix can comprise an on-chip cleaning system. The obstacle set may be a symmetric obstacle matrix, asymmetric obstacle matrix, mirror obstacle matrix, a mirror obstacle matrix with a central bypass channel with or without a wall, or a semi-specular obstacle matrix.

El sistema de limpieza en el chip se puede organizar en una diversidad de configuraciones. El número de aberturas en las paredes que delimitan un canal puede depender de la longitud del canal. En algunos casos, cada pared comprende una pluralidad de aberturas, por ejemplo, al menos 2, 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 500, 750, 1000, 5000 o 10.000. En algunos casos, cada pared comprende como máximo 2, 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 500, 750, 1000, 5000 o 10.000 aberturas. En algunos casos, cada una de las aberturas en una pared está en una configuración desbloqueada o bloqueada. En algunos casos, no todas las aberturas en una pared están en una configuración desbloqueada o bloqueada. En algunos casos, al menos el 2, 5, 10, 20, 50, 70, 90 o 100% de las aberturas en un lado de una pared están configuradas para tener una configuración bloqueada o desbloqueada. En algunos casos, menos del 2, 5, 10, 20, 50, 70, 90 o 100% de las aberturas en un lado de una pared están configuradas para estar en una configuración bloqueada o desbloqueada.The on-chip cleaning system can be arranged in a variety of configurations. The number of openings in the walls that delimit a channel may depend on the length of the channel. In some cases, each wall comprises a plurality of openings, for example, at least 2, 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 500, 750, 1000, 5000 or 10,000. In some cases, each wall comprises a maximum of 2, 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 500, 750, 1000, 5000 or 10,000 openings. In some cases, each of the openings in a wall is in an unlocked or locked configuration. In some cases, not all openings in a wall are in an unlocked or locked configuration. In some cases, at least 2, 5, 10, 20, 50, 70, 90, or 100% of the openings on one side of a wall are configured to have a locked or unlocked configuration. In some cases, less than 2, 5, 10, 20, 50, 70, 90, or 100% of the openings on one side of a wall are configured to be in a locked or unlocked configuration.

Cada una de las aberturas en las paredes de un canal puede tener un diámetro de al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 |jm. En algunos casos, cada una de las aberturas en una pared de canal tiene un diámetro menor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 jm . En algunos casos, cada una de las aberturas en una pared de canal tiene un diámetro de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 jm . En algunos casos, las aberturas en una pared de un canal están conectadas a trayectorias de flujo. En algunos casos, cada una de las trayectorias de flujo está bajo el control del mismo sistema de flujo de fluido. En algunos casos, cada una de las trayectorias de flujo no está bajo el control del mismo sistema de flujo de fluido. Each of the openings in the walls of a channel can have a diameter of at least 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 or 50 | jm. In some cases, each of the openings in a channel wall has a diameter less than 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 , 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 or 50 jm. In some cases, each of the openings in a channel wall has a diameter of about 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 , 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 or 50 jm. In some cases, openings in a channel wall are connected to flow paths. In some cases, each of the flow paths is under the control of the same fluid flow system. In some cases, each of the flow paths is not under the control of the same fluid flow system.

El caudal de una solución de limpieza que utiliza el sistema de limpieza en el chip puede ser de al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 ml/min.The flow rate of a cleaning solution using the on-chip cleaning system can be at least 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0 , 8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 or 50 ml / min.

El caudal de una solución de limpieza que utiliza el sistema de limpieza en el chip puede ser menor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 ml/min.The flow rate of a cleaning solution using the on-chip cleaning system can be less than 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0, 8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 or 50 ml / min.

El caudal de una solución de limpieza que utiliza el sistema de limpieza en el chip puede ser de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 ml/min.The flow rate of a cleaning solution using the on-chip cleaning system can be approximately 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0, 8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 or 50 ml / min.

El flujo a través de las aberturas en una pared de un canal puede ser alimentado por una bomba, por ejemplo, bomba de jeringa o bomba de alta presión. En algunos casos, el funcionamiento de un sistema de limpieza en el chip está automatizado. En algún caso, el funcionamiento de un sistema de limpieza en el chip se realiza a través de un dispositivo electrónico, por ejemplo, un ordenador.The flow through the openings in a wall of a channel can be supplied by a pump, eg, syringe pump or high pressure pump. In some cases, the operation of an on-chip cleaning system is automated. In some cases, the operation of an on-chip cleaning system is done through an electronic device, for example a computer.

Una solución de limpieza utilizada en un sistema de limpieza en el chip puede comprender uno o más agentes, por ejemplo, un detergente (por ejemplo, bromhidrato de tiosulfonato de 2-aminoetilmetano, CHAPS, CHAPSO, digitonina, dodecil sulfato de litio, n-dodecil-beta-D-maltopiranósido, n-octil-beta-d-glucopiranósido, NDSB-195, NDSB-201, NDSB-211, NDSB-221, NDSB-256, NONIDET-P40, Pluronic F68, Pluronic F-127, MTSES, Tween-20, Tween-80, Tween-40, dodecil sulfato de sodio (SDS), Triton X-100, Triton X-114, MTSET, sulfobetaína-10, sulfobetaína-12 o sulfobetaína-14), alcohol (por ejemplo, etanol, metanol), tampón (por ejemplo, Tris-HCl, Trizma, HEPES, MES, tampón fosfato, tampón potasio), enzima (DNasa, RNasa, proteasa, enzima de restricción), agente reductor (DTT, betamercaptoetanol), agente quelante (por ejemplo, EDTA (por ejemplo, 1 mM, 5 mM), EGTA (por ejemplo, 1 mM, 5 mM)), agente antibacteriano, antibiótico (por ejemplo, cloranfenicol, ampicilina, kanamicina, eritromicina, gentamicina, neomicina, nelimicina, estreptomicina, tobramicina, penicilina, bacitracina, polimixina B, ciproflaxina o tetraciclina), agente antifúngico, agente antivírico, inhibidor de proteasas, ácido (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido tartárico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido bórico, ácido metanosulfónico, ácido acético, ácido cítrico, ácido fórmico o ácido fluoroacético), base (por ejemplo, NaOH). En algunos casos, la solución de limpieza comprende de aproximadamente un 1 a aproximadamente un 20 % de etanol, o de aproximadamente un 10 a aproximadamente un 20 % de etanol, o menos de un 20 % de etanol.A cleaning solution used in an on-chip cleaning system may comprise one or more agents, for example, a detergent (for example, 2-aminoethylmethane thiosulfonate hydrobromide, CHAPS, CHAPSO, digitonin, lithium dodecyl sulfate, n- dodecyl-beta-D-maltopyranoside, n-octyl-beta-d-glucopyranoside, NDSB-195, NDSB-201, NDSB-211, NDSB-221, NDSB-256, NONIDET-P40, Pluronic F68, Pluronic F-127, MTSES, Tween-20, Tween-80, Tween-40, sodium dodecyl sulfate (SDS), Triton X-100, Triton X-114, MTSET, sulfobetaine-10, sulfobetaine-12 or sulfobetaine-14), alcohol (for example, ethanol, methanol), buffer (for example, Tris-HCl, Trizma, HEPES, MES, phosphate buffer, potassium buffer), enzyme (DNase, RNase, protease, restriction enzyme), reducing agent (DTT, betamercaptoethanol), chelating agent (eg EDTA (eg 1 mM, 5 mM), EGTA (eg 1 mM, 5 mM)), antibacterial agent, antibiotic (eg chloramphenicol, ampicillin, kanamycin, erythromycin, gentamicin, neomycin, nelimycin, streptomycin, tobramycin, penicillin, bacitracin, polymyxin B, ciproflaxin or tetracycline), antifungal agent, antiviral agent, protease inhibitor, acid (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid, tartaric acid, nitric acid, nitric acid, boric acid, methanesulfonic acid, acetic acid, citric acid, formic acid or fluoroacetic acid), base (eg NaOH). In some cases, the cleaning solution comprises from about 1 to about 20% ethanol, or from about 10 to about 20% ethanol, or less than 20% ethanol.

Una solución de limpieza puede comprender F108, que puede ser un tensioactivo de copolímero de bloque bifuncional. A cleaning solution can comprise F108, which can be a bifunctional block copolymer surfactant.

En algunos casos, se hacen fluir múltiples soluciones a través del sistema de limpieza en sucesión.In some cases, multiple solutions are flowed through the cleaning system in succession.

En algunos casos, se aplica una solución de limpieza a un dispositivo y se deja que permanezca en el dispositivo durante al menos 1, 5, 10, 30 o 60 minutos, o aproximadamente al menos 4, 8, 12, 16, 20 o 24 horas, o al menos 3, 5, 7, 14, 21 o 28 días. En algunos casos, se aplica una solución de limpieza a un dispositivo y se deja que permanezca en el dispositivo durante menos de aproximadamente 1, 5, 10, 30 o 60 minutos, o menos de 4, 8, 12, 16, 20 o 24 horas, o menos de 3, 5, 7, 14, 21 o 28 días.In some cases, a cleaning solution is applied to a device and allowed to remain on the device for at least 1, 5, 10, 30, or 60 minutes, or about at least 4, 8, 12, 16, 20, or 24. hours, or at least 3, 5, 7, 14, 21 or 28 days. In some cases, a cleaning solution is applied to a device and allowed to remain on the device for less than about 1, 5, 10, 30, or 60 minutes, or less than 4, 8, 12, 16, 20, or 24. hours, or less than 3, 5, 7, 14, 21, or 28 days.

En algunos casos, la solución de limpieza se lava con agua.In some cases, the cleaning solution is washed off with water.

El ejemplo 8 describe el uso de un sistema de limpieza en el chip.Example 8 describes the use of an on-chip cleaning system.

En algunos casos, los métodos de separación basados en el tamaño descritos en el presente documento no utilizan una centrifugación y/o sedimentación. En algunos casos, los métodos de separación basados en el tamaño descritos en el presente documento utilizan una centrifugación o sedimentación.In some cases, the size-based separation methods described herein do not use centrifugation and / or sedimentation. In some cases, the size-based separation methods described herein use centrifugation or sedimentation.

(w) ángulo cónico(w) conical angle

Un obstáculo o pilar puede ser cilindrico. En algunos casos, los obstáculos en un dispositivo no son perfectamente cilindricos. Un obstáculo, o al menos el 50 % de los obstáculos en una matriz, puede tener un ángulo cónico de menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 °. Un obstáculo puede tener un ángulo cónico de 0 °. Un obstáculo, o al menos el 50 % de los obstáculos en una matriz, puede tener un ángulo cónico de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, de aproximadamente 3 a aproximadamente 4, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 °.An obstacle or pillar can be cylindrical. In some cases, the obstacles in a device are not perfectly cylindrical. An obstacle, or at least 50% of the obstacles in an array, can have a conical angle of less than 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2, 5, 2, 1.5, 1, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 or 0.1 °. An obstacle can have a conical angle of 0 °. An obstacle, or at least 50% of the obstacles in an array, can have a conical angle from about 0.1 to about 1, from about 1 to about 2, from about 2 to about 3, from about 3 to about 4 , or from about 1 to about 4 °.

(x) Conjuntos de matrices(x) Sets of matrices

En algunos casos, un canal puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 conjuntos de matrices. En algunos casos, un canal puede comprender menos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 conjuntos de matrices. En algunos casos, un canal puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 conjuntos de matrices.In some cases, a channel may comprise at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 sets of matrices. In some cases, a channel may comprise less than 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100 sets of matrices. In some cases, a channel may comprise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 sets of matrices.

J. Materiales de construcción y química de superficieJ. Building Materials and Surface Chemistry

En algunas realizaciones, un dispositivo se fabrica mediante estampado en caliente de PMMA y policarbonato. Debido a su bajo coste y compatibilidad con métodos de fabricación basados en replicación, los termoplásticos pueden representar una atractiva familia de materiales para la fabricación de plataformas lab-on-a-chip. Se dispone de una amplia gama de materiales termoplásticos adecuados para la fabricación microfluídica, que ofrecen una amplia selección de propiedades mecánicas y químicas que se pueden aprovechar y adaptar adicionalmente para aplicaciones específicas. Los métodos de estampado de alto rendimiento, tales como el procesamiento de bobina a bobina de termoplásticos, es un método atractivo para la producción industrial de chips microfluídicos. El uso de estampado en caliente de un solo chip puede ser una técnica rentable para realizar dispositivos microfluídicos de alta calidad durante la etapa de creación de prototipos. En el presente documento se describen métodos para la replicación de características a microescala en dos termoplásticos, polimetilmetacrilato (PMMA) y/o policarbonato (PC) usando estampado en caliente a partir de una plantilla de silicio fabricada mediante grabado profundo con iones reactivos. Se pueden encontrar más detalles en "Microfluidic device fabrication by thermoplastic hot-embossing" por Yang y Devoe, Methods Mol. Biol. 2013; 949: 115-23. En algunos casos, un dispositivo está hecho de polipropileno.In some embodiments, a device is manufactured by hot stamping PMMA and polycarbonate. Due to their low cost and compatibility with replication-based manufacturing methods, thermoplastics can represent an attractive family of materials for manufacturing lab-on-a-chip platforms. A wide range of thermoplastic materials suitable for microfluidic manufacturing is available, offering a wide selection of mechanical and chemical properties that can be further exploited and adapted for specific applications. High-performance stamping methods, such as coil-to-coil processing of thermoplastics, is an attractive method for the industrial production of microfluidic chips. The use of single-chip hot stamping can be a cost-effective technique for making high-quality microfluidic devices during the prototyping stage. In this document, methods are described for the replication of microscale characteristics in two thermoplastics, polymethylmethacrylate (PMMA) and / or polycarbonate (PC) using hot stamping from a silicon template made by deep etching with reactive ions. More details can be found in "Microfluidic device fabrication by thermoplastic hot-embossing" by Yang and Devoe, Methods Mol. Biol. 2013; 949: 115-23. In some cases, a device is made of polypropylene.

En algunos casos, los materiales y diseños pueden optimizarse para fabricar sistemas y dispositivos efectivos y económicos en la presente invención. En algunos casos, lo proporcionado en el presente documento también incluyen prototipos de plataforma de sistema automatizado con interfaz de operario que puede controlar el flujo de fluido a través de los chips microfluídicos. Por ejemplo, la plataforma del sistema se puede diseñar para que su funcionamiento sea fácil y rentable y para ocupar un pequeño espacio en la mesa de trabajo. En algunos casos, es de esperar que los métodos, sistemas y dispositivos proporcionados en el presente documento consigan un rendimiento superior al 90 % de glóbulos blancos (WBC) en no más de 10 minutos de tiempo de procesamiento total.In some cases, materials and designs can be optimized to make effective and inexpensive systems and devices in the present invention. In some instances, what is provided herein also includes automated system platform prototypes with operator interface that can control fluid flow through microfluidic chips. For example, the system platform can be designed to be easy and cost-effective to operate and to occupy a small space on the bench. In some cases, the methods, systems, and devices provided herein are expected to achieve greater than 90% white blood cell (WBC) yield in no more than 10 minutes of total processing time.

En algunos casos, el dispositivo comprende un polímero. En algunos casos, el dispositivo se fabrica mediante moldeo por inyección. En algunos casos, el dispositivo se fabrica mediante una técnica fotolitográfica. En algunos casos, el dispositivo se fabrica mediante estampado suave. En algunos casos, el estampado se produce en un chip de polímero.In some cases, the device comprises a polymer. In some cases, the device is manufactured by injection molding. In some cases, the device is manufactured using a photolithographic technique. In some cases, the device is manufactured by soft stamping. In some cases, the stamping occurs on a polymer chip.

En algunos casos, el dispositivo comprende plástico.In some cases, the device comprises plastic.

Un dispositivo puede sellarse y unirse de cualquier manera adecuada. El principal desafío puede ser unir partes microfluídicas planas entre sí de forma hermética sin afectar a la forma y el tamaño de los canales de tamaño micrométrico. Son adecuadas varias técnicas de unión, tales como el calentamiento por inducción. Los canales se pueden fabricar utilizando un equipo láser Excimer. Se pueden encontrar más detalles en "Sealing and bonding techniques for polymer-based microfluidic devices" por Abdirahman Yussuf, Igor Sbarski, Jason Hayes y Matthew Solomon.A device can be sealed and attached in any suitable way. The main challenge may be to bond flat microfluidic parts together tightly without affecting the shape and size of the micron-sized channels. Various bonding techniques are suitable, such as induction heating. Channels can be fabricated using Excimer laser equipment. More details can be found in "Sealing and bonding techniques for polymer-based microfluidic devices" by Abdirahman Yussuf, Igor Sbarski, Jason Hayes and Matthew Solomon.

Otras técnicas de unión incluyen la unión adhesiva, cinta sensible a la presión/laminación, unión por fusión térmica, unión con disolvente, soldadura localizada, tratamiento superficial y combinaciones de las mismas. Se pueden encontrar más detalles en "Bonding of thermoplastic polymer microfluidics" por Chia-Wen Tsao y Don L. DeVoe, Microfluid Nanofluid (2009) 6: 1-16.Other bonding techniques include adhesive bonding, pressure sensitive tape / lamination, thermal fusion bonding, solvent bonding, spot welding, surface treatment, and combinations thereof. More details can be found in "Bonding of thermoplastic polymer microfluidics" by Chia-Wen Tsao and Don L. DeVoe, Microfluid Nanofluid (2009) 6: 1-16.

En algunas realizaciones, el dispositivo se fabrica a partir de polímero y/o plástico. El polímero y/o plástico pueden ser hidrófilos y/o humectables. La Tabla 4 resume las propiedades de algunos plásticos.In some embodiments, the device is made from polymer and / or plastic. The polymer and / or plastic can be hydrophilic and / or wettable. Table 4 summarizes the properties of some plastics.

Tabla 4 Resumen de las propiedades físicas de termoplásticos microfluídicos comunesTable 4 Summary of Physical Properties of Common Microfluidic Thermoplastics

Polímero Acrónimo Tg (° Tm (° CTE (10' Absorción de Resistencia a Resistencia a Transmisividad óptica _____________________________________ C)_____ C)_____6°C-1)_____ agua (%)_________ disolventes________ ácido/base________ Visible UVa______ (Co)polímero de olefina COC/COP 70 190 60-80 0,01 Excelente Buena Excelente Excelente cíclica 155 320Polymer Acronym Tg (° Tm (° CTE (10 'Absorption Resistance to Resistance to Optical Transmissivity _____________________________________ C) _____ C) _____ 6 ° C-1) _____ water (%) _________ solvents________ acid / base ________ Visible UVa______ (Co) olefin polymer COC / COP 70 190 60-80 0.01 Excellent Good Excellent Excellent cyclical 155 320

Polimetacrilato de PMMA 100 250 70-150 0,3-0,6 Buena Buena Excelente Buena metilo 122 260PMMA polymethacrylate 100 250 70-150 0.3-0.6 Good Good Excellent Good methyl 122 260

Policarbonato PC 145 260 60-70 0,12-0,34 Buena Buena Excelente MalaPolycarbonate PC 145 260 60-70 0.12-0.34 Good Good Excellent Bad

148 270148 270

Poliestireno PS 92 240 10-150 0,02-0,15 Mala Buena Excelente MalaPolystyrene PS 92 240 10-150 0.02-0.15 Bad Good Excellent Bad

100 260100 260

Polipropileno PP -20 160 18-185 0,10 Buena Buena Buena Regular Polietercetona PEEK 147 340 47-54 0,1-05 Excelente Buena Mala MalaPolypropylene PP -20 160 18-185 0.10 Good Good Good Fair Polyetherketone PEEK 147 340 47-54 0.1-05 Excellent Good Bad Bad

158 350158 350

Polietilentereftalato PET 69-78 248 48-78 0,1-05 Excelente Excelente Buena BuenaPolyethylene terephthalate PET 69-78 248 48-78 0.1-05 Excellent Excellent Good Good

260260

Polietileno PE -30 120 180-230 0,01 Excelente Excelente Regular RegularPolyethylene PE -30 120 180-230 0.01 Excellent Excellent Regular Regular

130130

Poli(cloruro de PVDC 0 76 190 0,10 Buena Buena Buena MalaPoly (PVDC chloride 0 76 190 0.10 Good Good Good Bad

vinilideno) vinylidene)

(continuación)(continuation)

^{P lím r A r nim}T ^{° Tm ° TE 1 -}Absorción de Resistencia a Resistencia a Transmisividad ^{P lim r A r nim} T ^{° Tm ° TE 1 -} Absorption Resistance to Resistance to Transmissivity

v n ov n o

Polisulfona PSU 170- 180- 55-60 0,3-0,4 Regular Buena Regular Mala 187 190Polysulfone PSU 170- 180- 55-60 0.3-0.4 Fair Good Fair Poor 187 190

Tm tem peratura de fusión, CTE coeficiente de expansión térmicaTm melting temperature, CTE coefficient of thermal expansion

a La alta transm isividad UV con frecuencia requiere la selección de calidades especiales de polímero, por ejemplo, sin estabilizadores u otros aditivos a High UV transmittance often requires the selection of special polymer grades, for example, without stabilizers or other additives

Un dispositivo se puede fabricar de cualquier manera adecuada. Algunas técnicas incluyen el moldeado de réplicas, litografía suave con PDMS, termofraguado de poliéster, estampado, moldeo por inyección, ablación láser y combinaciones de los mismos. Se pueden encontrar más detalles en "Disposable microfluidic devices: fabrication, function and application" por Gina S. Fiorini y Daniel T. Chiu, BioTechniques 38: 429-446 (Marzo de 2005). El libro "Lab on a Chip Technology" editado por Keith E. Herold y Avraham Rasooly, Caister Academic Press Norfolk UK (2009) es un recurso para métodos de fabricación y demás. Un dispositivo puede fabricarse mediante moldeo por fundición o moldeo por inyección reactiva.A device can be manufactured in any suitable way. Some techniques include replica molding, PDMS smooth lithography, polyester heat setting, stamping, injection molding, laser ablation, and combinations thereof. More details can be found in "Disposable microfluidic devices: fabrication, function and application" by Gina S. Fiorini and Daniel T. Chiu, BioTechniques 38: 429-446 (March 2005). The book "Lab on a Chip Technology" edited by Keith E. Herold and Avraham Rasooly, Caister Academic Press Norfolk UK (2009) is a resource for manufacturing methods and more. A device can be manufactured by casting or reactive injection molding.

Los materiales ilustrativos para fabricar los dispositivos de la invención incluyen vidrio, silicio, acero, níquel, polímeros, por ejemplo, poli(metacrilato de metilo) (PMMa ), policarbonato, poliestireno, polietileno, poliolefinas, siliconas (por ejemplo, poli(dimetilsiloxano)), polipropileno, cis-poliisopreno (caucho), poli(cloruro de vinilo) (PVC), poli(acetato de vinilo) (PVAc), policloropreno (neopreno), politetrafluoroetileno (teflón), poli(cloruro de vinilideno) (SaranA) y polímero de olefina cíclica (COP) y copolímero de olefina cíclica (COC), y combinaciones de los mismos. En la técnica se conocen otras variantes. Por ejemplo, se puede utilizar grabado profundo con iones reactivos (DRIE) para fabricar dispositivos basados en silicio con pequeños espacios, pequeños obstáculos y grandes relaciones de aspecto (relación entre la altura del obstáculo y la dimensión lateral). También se puede utilizar el termoformado (estampado, moldeo por inyección) de dispositivos de plástico. Otros métodos incluyen fotolitografía (por ejemplo, estereolitografía o fotolitografía de rayos X), moldeo, estampado, micromecanizado de silicio, grabado químico húmedo o seco, molienda, corte con diamante, Lithographie Galvanoformung and Abformung (litografía, electrodeposición y moldeo) (LIGA) y galvanoplastia. Por ejemplo, para el vidrio, pueden emplearse técnicas tradicionales de fabricación de silicio de fotolitografía seguidas de grabado en húmedo (KOH) o en seco (grabado con iones reactivos con flúor u otro gas reactivo). Se pueden adoptar técnicas tales como el micromecanizado láser para materiales plásticos con alta eficiencia de absorción de fotones. Esta técnica es adecuada para la fabricación de menor rendimiento debido a la naturaleza en serie del proceso. Para dispositivos de plástico producidos masivamente, pueden ser adecuados el moldeo por inyección de termoplásticos y el moldeo por compresión. Para fabricar los dispositivos también se puede emplear el moldeo por inyección de termoplásticos convencional utilizado para la fabricación masiva de discos compactos (que conserva la fidelidad de las características en escala submicrométrica). Por ejemplo, las características del dispositivo se reproducen en un patrón de vidrio mediante fotolitografía convencional. El patrón de vidrio está electroformado para producir un molde duro, resistente al choque térmico, térmicamente conductor y compacto. Este molde sirve como plantilla patrón para moldear por inyección o moldear por compresión las características en un dispositivo de plástico. Dependiendo del material plástico utilizado para fabricar los dispositivos y los requisitos de calidad óptica y rendimiento del producto terminado, se puede elegir moldeo por compresión o moldeo por inyección como método de fabricación. El moldeo por compresión (también denominado estampado en caliente o impresión en relieve) puede tener la ventaja de ser compatible con polímeros de alto peso molecular, que pueden ser excelentes para estructuras pequeñas y puede replicar estructuras de alta relación de aspecto, pero tiene tiempos de ciclo más largos. El moldeo por inyección puede funcionar bien para estructuras de baja relación de aspecto y puede ser adecuado para polímeros de bajo peso molecular. Se puede fabricar un dispositivo utilizando cualquiera de los materiales descritos en el presente documento. En algunos casos, la superficie del dispositivo (plástico) se trata para hacer que sea hidrófilo y/o humectable. Las superficies en los dispositivos, por ejemplo, dispositivos microfluídicos, pueden desempeñar un papel fundamental porque pueden definir propiedades tales como humectación, adsorción y repelencia de biomoléculas, reconocimiento biomolecular utilizando receptores inmovilizados en la superficie, sellado y unión de diferentes materiales. En algunos casos, Se pueden utilizar dos tipos de tratamientos para modificar las propiedades de superficie de un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo microfluídico: tratamientos químicos húmedos y tratamientos en fase gaseosa. Los tratamientos húmedos pueden ser sencillos en términos de requisitos de infraestructura; pueden ser flexibles y rápidos de desarrollar desde el punto de vista de la investigación. Sin embargo, la mejor forma de conseguir el tratamiento de superficie de un dispositivo, por ejemplo, dispositivo microfluídico, para producción, utilizando procesos en seco basados en plasma y deposición química de vapor. Estos tratamientos pueden eliminar la necesidad de etapas de aclarado y secado, tienen una alta capacidad de rendimiento y son altamente reproducibles.Illustrative materials for making the devices of the invention include glass, silicon, steel, nickel, polymers, for example, poly (methyl methacrylate) (PMMa), polycarbonate, polystyrene, polyethylene, polyolefins, silicones (for example, poly (dimethylsiloxane) )), polypropylene, cis-polyisoprene (rubber), poly (vinyl chloride) (PVC), poly (vinyl acetate) (PVAc), polychloroprene (neoprene), polytetrafluoroethylene (Teflon), poly (vinylidene chloride) (SaranA ) and cyclic olefin polymer (COP) and cyclic olefin copolymer (COC), and combinations thereof. Other variants are known in the art. For example, deep reactive ion etching (DRIE) can be used to fabricate silicon-based devices with small gaps, small obstacles, and large aspect ratios (ratio of obstacle height to lateral dimension). Thermoforming (stamping, injection molding) of plastic devices can also be used. Other methods include photolithography (e.g. stereolithography or X-ray photolithography), casting, stamping, micromachining of silicon, wet or dry chemical etching, grinding, diamond cutting, Lithographie Galvanoformung and Abformung (lithography, electrodeposition and casting) (LIGA) and electroplating. For example, for glass, traditional silicon fabrication techniques of photolithography followed by wet etching (KOH) or dry etching (reactive ion etching with fluorine or other reactive gas) may be employed. Techniques such as laser micromachining can be adopted for plastic materials with high photon absorption efficiency. This technique is suitable for lower throughput manufacturing due to the serial nature of the process. For mass-produced plastic devices, thermoplastic injection molding and compression molding may be suitable. Conventional thermoplastic injection molding used for mass manufacturing of compact discs (which retains the fidelity of the submicron scale characteristics) can also be used to manufacture the devices. For example, the characteristics of the device are reproduced in a glass pattern by conventional photolithography. The glass pattern is electroformed to produce a tough, thermally shock resistant, thermally conductive and compact mold. This mold serves as a template for injection molding or compression molding features into a plastic device. Depending on the plastic material used to make the devices and the optical quality and performance requirements of the finished product, compression molding or injection molding can be chosen as the manufacturing method. Compression molding (also called hot stamping or embossing) can have the advantage of being compatible with high molecular weight polymers, which can be great for small structures and can replicate high aspect ratio structures, but has lead times. longer cycle. Injection molding can work well for low aspect ratio structures and can be suitable for low molecular weight polymers. A device can be manufactured using any of the materials described herein. In some cases, the surface of the device (plastic) is treated to make it hydrophilic and / or wettable. Surfaces on devices, eg microfluidic devices, can play a fundamental role because they can define properties such as wetting, adsorption and repellency of biomolecules, biomolecular recognition using receptors immobilized on the surface, sealing and binding of different materials. In some cases, two types of treatments can be used to modify the surface properties of a device, for example a microfluidic device: wet chemical treatments and gas phase treatments. Wet treatments can be straightforward in terms of infrastructure requirements; they can be flexible and quick to develop from a research point of view. However, the best way to achieve the surface treatment of a device, eg microfluidic device, for production, using dry processes based on plasma and chemical vapor deposition. These treatments can eliminate the need for rinsing and drying steps, have a high throughput and are highly reproducible.

En algunos casos, el tratamiento es un tratamiento químico húmedo. Entre los tratamientos químicos húmedos disponibles, La formación de monocapas autoensambladas (SAM) es uno de los tratamientos superficiales más versátiles y fáciles de usar. Se han desarrollado SAM en metales, óxidos de silicio y polímeros. Las moléculas en las SAM pueden compactarse estrechamente y pueden estar compuestas por un grupo de cabeza que puede unirse covalentemente al sustrato, una cadena alquilo y un grupo funcional terminal. El espesor de la SAM puede depender de la longitud de la cadena alquilo y la densidad de las moléculas en la superficie y suele ser de unos pocos nanómetros. Las SAM pueden ser fáciles de preparar y pueden modelarse con una resolución lateral submicrométrica. In some cases, the treatment is a wet chemical treatment. Among the wet chemical treatments available, Self-Assembled Monolayer Forming (SAM) is one of the most versatile and easy-to-use surface treatments. SAMs have been developed in metals, silicon oxides, and polymers. Molecules in SAMs can be tightly packed and can be composed of a head group that can be covalently attached to the substrate, an alkyl chain, and a terminal functional group. The thickness of the SAM can depend on the length of the alkyl chain and the density of the molecules on the surface and is usually a few nanometers. SAMs can be easy to prepare and can be modeled with submicron lateral resolution.

Se pueden usar diferentes grupos terminales para definir las propiedades humectantes de la superficie, así como la afinidad o repelencia de proteínas. Para superficies de vidrio, óxidos y polímeros oxidables, el injerto de alquilsiloxanos en las superficies podría ser el método más sencillo y económico. Se puede lograr un gradiente de humectabilidad de superhidrófobo a hidrófilo superponiendo un gradiente de humectación basado en SAM en microestructuras de silicio que tienen un espaciado lateral variable.Different end groups can be used to define the wetting properties of the surface, as well as the affinity or repellency of proteins. For glass surfaces, oxides and oxidizable polymers, grafting alkylsiloxanes to the surfaces could be the simplest and most economical method. A superhydrophobic to hydrophilic wettability gradient can be achieved by overlaying a SAM-based wetting gradient on silicon microstructures that have variable lateral spacing.

Las SAM poliméricas pueden comprender copolímeros de bloque y pueden tener varias estructuras tridimensionales, lo que puede dar la oportunidad de variar su modo de injerto en una superficie y los tipos de funcionalidades que portan. Tales capas pueden alcanzar un espesor significativo de varios cientos de nanómetros y proteger/funcionalizar superficies de manera más fiable que las monocapas más delgadas. Por ejemplo, un cepillo de polímero de poli (oligo(etilenglicol)metacrilato) puede revestir dispositivos de vidrio, por ejemplo, chips, por ejemplo, chips microfluídicos para hacerlos hidrófilos y antiincrustantes.Polymeric SAMs can comprise block copolymers and can have various three-dimensional structures, which can provide the opportunity to vary their mode of grafting onto a surface and the types of functionalities they carry. Such layers can reach a significant thickness of several hundred nanometers and protect / functionalize surfaces more reliably than thinner monolayers. For example, a poly (oligo (ethylene glycol) methacrylate) polymer brush can coat glass devices, eg chips, eg microfluidic chips to render them hydrophilic and antifouling.

Es posible recubrir superficies con polímeros para modificar sus propiedades. Por ejemplo, se puede utilizar poli(etilenglicol) para pasivar "biológicamente" un dispositivo, por ejemplo, materiales de un dispositivo microfluídico y se puede injertar en superficies de PMMA de microchips de electroforesis capilar para que sean más hidrófilas. Se puede utilizar poli(tetrafluoroetileno) para fabricar dispositivos químicamente resistentes, por ejemplo, dispositivos microfluídicos. Los materiales poliméricos empleados para fabricar dispositivos, por ejemplo, dispositivos microfluídicos, se puede modificar de muchas formas. En algunos casos, se usan grupos funcionales tales como aminas o ácidos carboxílicos que se encuentran en el polímero nativo o se añaden mediante química húmeda o tratamiento con plasma para reticular proteínas y ácidos nucleicos. Puede unirse ADN a sustratos de COC y PMMA utilizando grupos amina de superficie. Pueden utilizarse tensioactivos tales como Pluronic® para fabricar superficies hidrófilas y repelentes de proteínas mediante la adición de Pluronic® a las formulaciones de PDMS. En algunos casos, se aplica un recubrimiento de capa de PMMA por centrifugación en un dispositivo, por ejemplo, un chip microfluídico y el PMMA se "dopa" con hidroxipropilcelulosa para variar su ángulo de contacto.It is possible to coat surfaces with polymers to modify their properties. For example, poly (ethylene glycol) can be used to "biologically" passivate a device, eg materials from a microfluidic device, and can be grafted onto PMMA surfaces of capillary electrophoresis microchips to make them more hydrophilic. Poly (tetrafluoroethylene) can be used to make chemically resistant devices, eg, microfluidic devices. The polymeric materials used to make devices, eg microfluidic devices, can be modified in many ways. In some cases, functional groups such as amines or carboxylic acids that are found in the native polymer or added by wet chemistry or plasma treatment are used to cross-link proteins and nucleic acids. DNA can be attached to COC and PMMA substrates using surface amine groups. Surfactants such as Pluronic® can be used to make hydrophilic and protein repellent surfaces by adding Pluronic® to PDMS formulations. In some cases, a PMMA layer coating is applied by centrifugation on a device, for example a microfluidic chip, and the PMMA is "doped" with hydroxypropylcellulose to vary its contact angle.

Se pueden usar proteínas en superficies para cambiar la humectabilidad de la superficie, para pasivar una superficie de la unión a proteínas no específica y para la funcionalización. Las proteínas se adsorben fácilmente en sustratos hidrófobos tales como PDMS y poliestireno. Aprovechando esta propiedad, pueden recubrirse sustratos de PDMS con neutravidina para inmovilizar proteínas biotiniladas o dextrano biotinilado. Los recubrimientos de anticuerpo se pueden optimizar dependiendo de la hidrofobicidad del sustrato polimérico. Se puede utilizar albúmina de suero bovino como proteína para pasivar las superficies de la adsorción no específica y es fácil de depositar espontáneamente desde la solución a las superficies hidrófobas. En un sustrato hidrófilo, primero se puede aplicar una capa de poli(tetrafluoroetileno) hidrófobo como recubrimiento para permitir la posterior deposición de albúmina de suero bovino. La heparina, una molécula biológica ampliamente utilizada como anticoagulante, se puede depositar desde una solución en PDMS para crear canales, por ejemplo, microcanales hidrófilos al mismo tiempo que se previene la adhesión de células sanguíneas y proteínas.Proteins can be used on surfaces to change the wettability of the surface, to passivate a non-specific protein binding surface, and for functionalization. Proteins are readily adsorbed on hydrophobic substrates such as PDMS and polystyrene. Taking advantage of this property, PDMS substrates can be coated with neutravidin to immobilize biotinylated proteins or biotinylated dextran. Antibody coatings can be optimized depending on the hydrophobicity of the polymeric substrate. Bovine serum albumin can be used as a protein to passivate non-specific adsorption surfaces and is easy to spontaneously deposit from solution to hydrophobic surfaces. On a hydrophilic substrate, a layer of hydrophobic poly (tetrafluoroethylene) may first be applied as a coating to allow subsequent deposition of bovine serum albumin. Heparin, a biological molecule widely used as an anticoagulant, can be deposited from solution in PDMS to create channels, eg, hydrophilic microchannels while preventing adhesion of blood cells and proteins.

En algunas realizaciones, un dispositivo se somete a un tratamiento en fase gaseosa. El procesamiento de plasma no solo puede modificar la química de una superficie polimérica, sino que también puede afectar a su rugosidad de manera significativa, exacerbando así las propiedades de humectación para hacer que las superficies sean superhidrófilas y los fluorocarbonos se pueden depositar con plasma para hacer superficies superhidrófobas. Las superficies poliméricas pueden modelarse usando luz ultravioleta para iniciar la polimerización por radicales seguida de injerto covalente de polímeros. Se puede utilizar injerto inducido por plasma para unir poli(etilenglicol) sobre superficies de poliamida y poliéster para hacerlas antiincrustantes. El dextrano puede ser un polisacárido que comprende muchas moléculas de glucosa que se pueden recubrir para crear superficies antiincrustantes hidrófilas. En algunos casos, un punto de partida para modificar polímeros es introducir grupos hidroxilo en la superficie usando un tratamiento con plasma seguido del injerto de una capa de silano y dextrano. Asimismo, el PDMS se puede oxidar superficialmente usando luz ultravioleta para injertar un hidrogel de dextrano.In some embodiments, a device undergoes gas phase treatment. Plasma processing can not only modify the chemistry of a polymeric surface, it can also affect its roughness significantly, thus exacerbating the wetting properties to make surfaces superhydrophilic and fluorocarbons can be plasma deposited to make superhydrophobic surfaces. Polymeric surfaces can be patterned using ultraviolet light to initiate radical polymerization followed by covalent grafting of polymers. Plasma-induced grafting can be used to bond poly (ethylene glycol) onto polyamide and polyester surfaces to make them antifouling. Dextran can be a polysaccharide comprising many glucose molecules that can be coated to create hydrophilic antifouling surfaces. In some cases, a starting point for modifying polymers is to introduce hydroxyl groups to the surface using a plasma treatment followed by grafting a layer of silane and dextran. Also, PDMS can be surface oxidized using ultraviolet light to graft a dextran hydrogel.

La gran relación superficie/volumen de los dispositivos, por ejemplo, las estructuras microfluídicas pueden hacer que cualquier interacción potencial entre el analito de superficie y el reactivo sea un problema potencial. Por lo tanto, independientemente del método utilizado para tratar las superficies de un dispositivo microfluídico para la prueba de POC, en algunos casos, las superficies del dispositivo no pueden atraer y reducir los analitos o agentes bioquímicos necesarios para la prueba. En algunos casos, los tratamientos de superficie no interfieren con los principios de generación y adquisición de señales del dispositivo. Se pueden encontrar más detalles en "Capillary microfluidic chips for point of care testing: from research tools to decentralized medical diagnostics" una tesis de Luc Gervais, Ecole polytechnique federale de Lausanne, 23 de junio de 2011.The large surface to volume ratio of the devices, eg microfluidic structures can make any potential interaction between the surface analyte and the reagent a potential problem. Therefore, regardless of the method used to treat the surfaces of a microfluidic device for the POC test, in some cases, the surfaces of the device are unable to attract and reduce the analytes or biochemicals needed for the test. In some cases, surface treatments do not interfere with the device's signal generation and acquisition principles. More details can be found in "Capillary microfluidic chips for point of care testing: from research tools to decentralized medical diagnostics" a thesis by Luc Gervais, Ecole polytechnique fedele de Lausanne, June 23, 2011.

Para reducir la adsorción inespecífica de células o compuestos, por ejemplo, liberados por células lisadas o encontrados en muestras biológicas, en las paredes de los canales, una o más paredes de los canales pueden modificarse químicamente para ser no adherentes o repulsivas. Las paredes pueden estar recubiertas con un recubrimiento de película delgada (por ejemplo, una monocapa) de reactivos antiadherentes comerciales, tales como los que se utilizan para formar hidrogeles. Otros ejemplos de especies químicas que pueden usarse para modificar las paredes de los canales incluyen oligoetilenglicoles, polímeros fluorados, organosilanos, tioles, polietilenglicol, ácido hialurónico, albúmina de suero bovino, alcohol polivinílico, mucina, poli-HEMA, PEG metacrilado y agarosa. También se pueden emplear polímeros cargados para repeler especies con carga opuesta. El tipo de especies químicas utilizadas para la repulsión y el método de unión a las paredes de los canales pueden depender de la naturaleza de las especies que se repelen y de la naturaleza de las paredes y las especies que se adhieren. Tales técnicas de modificación de superficies son bien conocidas en la técnica. Las paredes se pueden funcionalizar antes o después de ensamblar el dispositivo. Las paredes de los canales también se pueden revestir para capturar materiales en la muestra, por ejemplo, fragmentos de membrana o proteínas.To reduce nonspecific adsorption of cells or compounds, eg, released by lysed cells or found in biological samples, on the channel walls, one or more channel walls can be chemically modified to be non-adherent or repulsive. The walls may be coated with a thin film coating (eg, a monolayer) of commercial release reagents, such as those used to form hydrogels. Other examples of chemical species that can be used to modify channel walls include oligoethylene glycols, fluorinated polymers, organosilanes, thiols, polyethylene glycol, hyaluronic acid, bovine serum albumin, polyvinyl alcohol, mucin, poly-HEMA, methacrylated PEG, and agarose. Too Charged polymers can be used to repel oppositely charged species. The type of chemical species used for repulsion and the method of attachment to the channel walls may depend on the nature of the species that repel and the nature of the walls and species that adhere. Such surface modification techniques are well known in the art. The walls can be functionalized before or after assembling the device. Channel walls can also be coated to capture materials in the sample, for example membrane fragments or proteins.

V. Propiedades de partículas que fluyen a través de dispositivosV. Properties of Particles Flowing Through Devices

Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para un procesamiento de alto rendimiento (por ejemplo, tratamiento químico y/o enzimático), purificación, aislamiento y/o concentración de partículas. Los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para aislar partículas con pureza, rendimiento y/o viabilidad relativamente altas si las partículas están vivas, por ejemplo, células u organismos). Se pueden aplicar una o más muestras a una o más entradas de un dispositivo. Se pueden aplicar uno o más tampones a una o más entradas en un dispositivo. Las partículas de al menos un tamaño crítico (predeterminado) pueden pasar a través de una matriz de obstáculos y desviarse hacia una salida, y las partículas menores que el tamaño crítico pueden pasar a otra salida.The methods, compositions, devices, systems and / or kits described herein can be used for high throughput processing (eg, chemical and / or enzymatic treatment), purification, isolation and / or concentration of particles. The methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to isolate particles with relatively high purity, yield, and / or viability if the particles are alive (eg, cells or organisms). One or more samples can be applied to one or more inputs of a device. One or more buffers can be applied to one or more inputs on a device. Particles of at least one critical (predetermined) size can pass through an obstacle matrix and be diverted to one exit, and particles smaller than the critical size can pass to another exit.

Una matriz de obstáculos puede comprender cualquier forma de sección transversal, diámetro del obstáculo, tamaño de espacio, ángulo de inclinación y/o geometría del patrón de matriz descritos en el presente documento.An obstacle matrix can comprise any cross-sectional shape, obstacle diameter, gap size, tilt angle, and / or matrix pattern geometry described herein.

La temperatura del líquido que fluye, o temperatura ambiente, o temperatura de un dispositivo, puede ser de aproximadamente -20, -10, 0, 4, 10, 15, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 ° C. La temperatura de un líquido que fluye, o temperatura ambiente, o temperatura de un dispositivo, puede ser menor de -20, -10, 0, 4, 10, 15, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 ° C. La temperatura de un líquido que fluye, o temperatura ambiente, o temperatura de un dispositivo, puede ser mayor de -20, -10, 0, 4, 10, 15, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 ° C. La temperatura de un líquido que fluye, o temperatura ambiente, o temperatura de un dispositivo puede ser de aproximadamente -20 a aproximadamente -10 ° C, de aproximadamente -10 a aproximadamente 0 ° C, de aproximadamente 0 a aproximadamente 4 ° C, de aproximadamente 4 a aproximadamente 25 ° C, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 ° C, de aproximadamente 30 a aproximadamente 37 ° C, de aproximadamente 37 a aproximadamente 50 ° C, de aproximadamente 50 a aproximadamente 65 ° C, o de aproximadamente 65 a aproximadamente 100 ° C.The temperature of the flowing liquid, or room temperature, or temperature of a device, can be approximately -20, -10, 0, 4, 10, 15, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35 , 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100 ° C. The temperature of a flowing liquid, or ambient temperature, or temperature of a device, can be less than -20, -10, 0, 4, 10, 15, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 , 80, 85, 90, 95 or 100 ° C. The temperature of a flowing liquid, or room temperature, or temperature of a device, can be greater than -20, -10, 0, 4, 10, 15, 20 , 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100 ° C. The temperature of a liquid flowing, or room temperature, or temperature of a device can be from about -20 to about -10 ° C, from about -10 to about 0 ° C, from about 0 to about 4 ° C, from about 4 to about 2 5 ° C, about 25 to about 30 ° C, about 30 to about 37 ° C, about 37 to about 50 ° C, about 50 to about 65 ° C, or about 65 to about 100 ° C.

A. PurezaA. Purity

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para aislar primeras partículas, por ejemplo, células que tienen aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %) de pureza.In some cases, methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to isolate first particles, for example, cells that have about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100%) purity.

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para aislar primeras partículas, por ejemplo, células que tienen al menos el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de pureza.In some cases, methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to isolate first particles, for example, cells that have at least the 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 , 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 , 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 , 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% purity.

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para aislar primeras partículas, por ejemplo, células, que tienen de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 10 % de pureza, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 20 % de pureza, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 30 % de pureza, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 40 % de pureza, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 50 % de pureza, de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 60 % de pureza, de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 % de pureza, de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 80 % de pureza, de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 90 % de pureza, o de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 % de pureza.In some instances, methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to isolate first particles, for example, cells, that are from about 1 to about 10% purity, of about 10% purity. 10% to about 20% purity, from about 20% to about 30% purity, from about 30% to about 40% purity, from about 40% to about 50% purity, of about 50% to about 60% purity, about 60% to about 70% pure, about 70% to about 80% pure, about 80% to about 90% pure , or from about 90% to about 100% purity.

En algunos casos, los dispositivos y métodos descritos en el presente documento se utilizan para aislar leucocitos de sangre completa. En algunos casos, los dispositivos y métodos descritos en el presente documento retiran más del 99 % de los eritrocitos, plaquetas, proteínas plasmáticas y tintes no unidos de los leucocitos. En algunos casos, los leucocitos se retiran del suero.In some cases, the devices and methods described herein are used to isolate leukocytes from whole blood. In some cases, the devices and methods described herein remove more than 99% of unbound red blood cells, platelets, plasma proteins, and dyes from leukocytes. In some cases, the leukocytes are removed from the serum.

B. Rendimiento B. Performance

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para proporcionar un rendimiento de aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de primeras partículas, por ejemplo, células de una muestra.In some cases, methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to provide a throughput of about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% of first particles, for example cells from a sample.

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para proporcionar un rendimiento de al menos el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de primeras partículas, por ejemplo, células de una muestra.In some cases, methods, compositions, devices, systems and / or kits described herein can be used to provide a throughput of at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 , 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 , 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85 , 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% of first particles, for example cells from a sample.

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se In some cases, methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein are used

de de

de of of

of

de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 % de primeras partículas, por ejemplo, células de una muestra.from about 90% to about 100% of first particles, eg cells in a sample.

En algunos casos, los dispositivos y métodos descritos en el presente documento se utilizan para aislar leucocitos de sangre completa. En algunos casos, se recupera al menos el 80 %, el 85 % o el 90 % de los leucocitos a partir de una muestra de sangre completa sin introducir sesgos entre la población de leucocitos.In some cases, the devices and methods described herein are used to isolate leukocytes from whole blood. In some cases, at least 80%, 85%, or 90% of the leukocytes are recovered from a whole blood sample without introducing bias among the leukocyte population.

C. ViabilidadC. Feasibility

En algunos casos, las partículas de una muestra están vivas (por ejemplo, una célula u organismo). En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para aislar partículas (por ejemplo, células, organismos) que tienen una viabilidad de aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %.In some cases, the particles in a sample are alive (for example, a cell or organism). In some instances, methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to isolate particles (eg, cells, organisms) that have a viability of about 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 , 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100%.

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para aislar partículas (por ejemplo, células, organismos) que tienen una viabilidad de al menos el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %.In some cases, methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to isolate particles (eg, cells, organisms) that have a viability of at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100%.

En algunos casos, métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden usar para aislar partículas (por ejemplo, células, organismos) que tienen una viabilidad de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 %, una viabilidad de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 20 %, una viabilidad de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 30 %, una viabilidad de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 40 %, una viabilidad de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 50 %, una viabilidad de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 60 %, una viabilidad de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 %, una viabilidad de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 80 %, una viabilidad de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 90 %, o una viabilidad de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 %.In some instances, methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to isolate particles (eg, cells, organisms) that have a viability of from about 1% to about 10%, a viability from about 10% to about 20%, viability from about 20% to about 30%, viability from about 30% to about 40%, viability from about 40% to about 50% , a viability from about 50% to about 60%, a viability from about 60% to about 70%, a viability from about 70% to about 80%, a viability from about 80% to about 70% 90%, or a viability of about 90% to about 100%.

En algunos casos, una muestra comprende leucocitos y eritrocitos. En algunos casos, el método, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden utilizar para procesar (por ejemplo, tratamiento químico y/o enzimático), lavar y luego aislar los leucocitos de una muestra de modo que los leucocitos tengan una pureza superior al 90% (es decir, menos del 10 % de eritrocitos), se aíslen más del 90 % de los leucocitos de la muestra (rendimiento superior al 90 %) y sean viables más del 90 % de los leucocitos de la muestra.In some cases, a sample includes leukocytes and erythrocytes. In some cases, the method, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be used to process (eg, chemical and / or enzymatic treatment), wash, and then isolate leukocytes from a sample so that the leukocytes are more than 90% pure (i.e. less than 10% erythrocytes), more than 90% of the leukocytes in the sample are isolated (yield greater than 90%), and more than 90% of the leukocytes are viable of the sample.

VI. AplicacionesSAW. Applications

Estos dispositivos y métodos descritos en el presente documento pueden ser un reemplazo general de la centrifugación en el procesamiento celular. Los proveedores líderes de instrumentos clínicos y de investigación pueden estar buscando alternativas a los métodos actuales de procesamiento celular (3). En algunos casos, los métodos que utilizan la tecnología de DLD microfluídicas son como se describen en la Publicación de Publicación de patente de Estados Unidos N.° US2010/0059414. These devices and methods described herein can be a general replacement for centrifugation in cell processing. Leading providers of clinical and research instruments may be looking for alternatives to current cell processing methods (3). In some cases, methods using microfluidic DLD technology are as described in United States Patent Publication Publication No. US2010 / 0059414.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para ensayos de ácidos nucleicos e inmunológicos basados en perlas (por ejemplo, ensayos Luminex, BD CBA).In some cases, a device as provided herein is used for bead-based immunological and nucleic acid assays (eg, Luminex assays, BD CBA).

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para inmunofluorescencia de superficies celulares.In some cases, a device as provided herein is used for immunofluorescence of cell surfaces.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para el marcaje de la superficie celular (por ejemplo, inmunofluorescencia) combinado con el marcaje intracelular.In some cases, a device as provided herein is used for cell surface labeling (eg, immunofluorescence) combined with intracellular labeling.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para el fenotipado y genotipado de leucemia, incluido el lavado de los componentes sanguíneos solubles que interfieren.In some cases, a device such as provided herein is used for phenotyping and genotyping of leukemia, including flushing out interfering soluble blood components.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para el análisis de ácidos nucleicos in situ (por ejemplo, hibridación in situ por fluorescencia).In some cases, a device as provided herein is used for in situ nucleic acid analysis (eg, fluorescence in situ hybridization).

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para la sincronización del ciclo celular mediante la selección del tamaño de las fases del ciclo celular.In some cases, a device as provided herein is used for cell cycle synchronization by selecting the size of cell cycle phases.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se utiliza para purificar por tamaño, marcar y concentrar células a partir de muestras pequeñas de células como el líquido cefalorraquídeo.In some cases, a device as provided herein is used to size purify, label, and concentrate cells from small cell samples such as cerebrospinal fluid.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa para la fabricación industrial de partículas funcionalizadas (por ejemplo, micropartículas marcadas con anticuerpos para bioensayos). In some cases, a device as provided herein is used for the industrial manufacture of functionalized particles (eg, antibody-labeled microparticles for bioassays).

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se utiliza para retirar partículas grandes/células para la detección sensible de bacterias, virus o exosomas en muestras biológicas (por ejemplo, sangre).In some cases, a device as provided herein is used to remove large particles / cells for the sensitive detection of bacteria, viruses, or exosomes in biological samples (eg, blood).

En algunos casos, se pueden reducir hasta al menos 8 etapas de lavado/concentración por centrifugación a 3 procesos en el chip de <5-10 min cada uno para muestras de 0,1-1 ml (por ejemplo, sangre) (FIG. 16). Las aplicaciones posteriores pueden ir mucho más allá de la citometría de flujo y pueden abarcar desde investigaciones de laboratorio hasta diagnósticos clínicos nuevos y existentes.In some cases, down to at least 8 wash / concentration steps can be reduced by centrifugation to 3 on-chip runs of <5-10 min each for 0.1-1 ml samples (e.g. blood) (FIG. 16). Subsequent applications can go far beyond flow cytometry and can range from laboratory investigations to new and existing clinical diagnostics.

A. Tecnología microfluídica de DLD para lavar y concentrar leucocitos de la sangre.A. DLD microfluidic technology for washing and concentrating leukocytes from the blood.

En la FIG. 16, se muestran procesos convencionales para el marcaje de leucocitos (izquierda) y la reducción de hasta 8 etapas de lavado/concentración por centrifugación a 3 etapas microfluídicas en el chip (parte intermedia y derecha) usando un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento. La realización que desciende verticalmente por el centro reemplaza cada etapa de lavado/concentrado por centrifugación con un proceso de lavado/concentrado en el chip. La realización que desciende verticalmente por la derecha evita por completo la lisis de eritrocitos, aislando/recogiendo/lavando/concentrando leucocitos (y células leucémicas) a partir de muestras de sangre en una sola etapa después de la etapa de marcaje de superficie.In FIG. 16 , conventional processes are shown for leukocyte labeling (left) and reduction of up to 8 wash / concentration steps by centrifugation to 3 on-chip microfluidic steps (middle and right) using a device as provided herein. document. The vertically down-the-center embodiment replaces each spin wash / concentrate step with an on-chip wash / concentrate process. The right-hand vertically descending embodiment completely avoids erythrocyte lysis, isolating / collecting / washing / concentrating leukocytes (and leukemia cells) from blood samples in a single step after the surface marking step.

La separación DLD puede superar a los procedimientos de centrifugación convencionales. Por ejemplo, el procesamiento (por ejemplo, lavado/concentración microfluídica en el chip) de una muestra que comprende leucocitos y reactivo de marcaje (por ejemplo, anticuerpos) en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento, puede recoger > 90 % de leucocitos con una viabilidad > 90 % mientras retira > 99 % de reactivos fluorescentes o de fijación/permeabilización no unidos sin sesgo de subpoblaciones.DLD separation can outperform conventional centrifugation procedures. For example, processing (eg, on-chip microfluidic wash / concentration) of a sample comprising leukocytes and labeling reagent (eg, antibodies) in a device as provided herein, can collect> 90% of leukocytes with> 90% viability while removing> 99% of unbound fluorescent or binding / permeabilizing reagents without subpopulation bias.

La FIG. 17A muestra una matriz DLD diseñada para "impactar" con E. coli (tamaño > 1 um). La suspensión bacteriana se introduce por la izquierda y fluye de izquierda a derecha, confinada por las paredes del dispositivo microfluídico. La matriz de micropostes hace que las bacterias fluorescentes (que contienen GFP) (vistas como la banda blanca borrosa) fluyan a lo largo del eje inclinado de la matriz, de modo que se mueven hacia abajo para acumularse contra la pared inferior de la matriz, mientras que la corriente de fluido sigue hacia adelante. Las bacterias se concentran a lo largo del borde inferior del dispositivo, visto como la raya blanca gruesa creciente. Al recoger por separado esta salida concentrada de su propio canal de salida, alejado del canal de salida del fluido residual, las bacterias pueden concentrarse 50 veces durante los -100 segundos que tardaron en fluir a través del dispositivo DLD. FIG. 17A shows a DLD array designed to "hit" with E. coli (size> 1 um). The bacterial suspension is introduced from the left and flows from left to right, confined by the walls of the microfluidic device. The micropost array causes fluorescent (GFP-containing) bacteria (seen as the fuzzy white band) to flow along the slanted axis of the array, moving downward to accumulate against the bottom wall of the array, while the fluid stream continues forward. Bacteria are concentrated along the lower edge of the device, seen as the thick white growing streak. By separately collecting this concentrated outlet from its own outlet channel, away from the residual fluid outlet channel, bacteria can concentrate 50 times during the -100 seconds it took to flow through the DLD device.

El dispositivo que se muestra en la FIG. 17A se puede ampliar para incluir 2 corrientes de flujo: la corriente 1 puede ser una suspensión de leucocitos después del marcaje con Mab (o tratamiento con reactivos de fijación/permeabilización); La corriente 2 puede ser fluido de tampón (como se muestra en la FIG. 17B). La matriz de impacto rediseñada puede hacer que las células grandes, tales como leucocitos (> 8 um de diámetro; y células de leucemia, ~ 8-20 um) se muevan formando un ángulo con el flujo de fluido de entrada, mientras que las moléculas disueltas o pequeñas partículas suspendidas o moléculas en solución (por ejemplo, perlas inmunomagnéticas, Mab fluorescentes, reactivos de fijación/permeabilización) tienden a moverse de izquierda a derecha, en o siguiendo el flujo de fluido. El microchip puede funcionar con un número de Reynolds bajo, de modo que el flujo es laminar y no turbulento; por lo tanto, las 2 corrientes se mueven en paralelo. Como se ve en la FIG. 17A, las células deseadas (leucocitos y células de leucemia) se concentran en el borde inferior de la matriz. Dirigiendo la mayor parte del fluido de salida a un canal de residuos y las células concentradas a un canal de producto, se pueden conseguir al mismo tiempo el lavado y la concentración.The device shown in FIG. 17A can be expanded to include 2 flow streams: stream 1 can be a leukocyte suspension after Mab labeling (or treatment with binding / permeabilization reagents); Stream 2 may be buffer fluid (as shown in FIG. 17B ). The redesigned impact matrix can make large cells, such as leukocytes (> 8 um in diameter; and leukemia cells, ~ 8-20 um) move at an angle to the inflow fluid flow, while molecules Dissolved or small suspended particles or molecules in solution (e.g. immunomagnetic beads, fluorescent Mabs, binding / permeabilization reagents) tend to move from left to right, in or following the flow fluid. The microchip can operate with a low Reynolds number, so the flow is laminar and not turbulent; therefore, the 2 currents move in parallel. As seen in FIG. 17A, the desired cells (leukocytes and leukemia cells) are concentrated at the lower edge of the matrix. By directing most of the outlet fluid to a waste channel and the concentrated cells to a product channel, washing and concentration can be achieved at the same time.

Además de la recolección de leucocitos, la tecnología DLD puede lograr un lavado simultáneo de las células. La sangre completa se puede incubar con CD45 FITC durante 30 minutos a temperatura ambiente, después, los leucocitos se pueden retirar de la sangre usando un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento. Se puede lograr una reducción de la fluorescencia en el producto libre de células de > 99 % después de la recolección de leucocitos en el dispositivo, lo que indica la eliminación eficaz del Mab fluorescente.In addition to leukocyte harvesting, DLD technology can achieve simultaneous washing of cells. Whole blood can be incubated with CD45 FITC for 30 minutes at room temperature, then leukocytes can be removed from the blood using a device as provided herein. A reduction in fluorescence in the cell-free product of> 99% can be achieved after collection of leukocytes in the device, indicating efficient removal of the fluorescent Mab.

Como se muestra en la FIG 17: (a) Vista superior: ejemplo de mecanismo DLD que muestra una entrada uniforme de bacterias E. coli fluorescente (blancas) en una matriz de postes inclinados que impactan desplazándose hacia abajo formando un ángulo con respecto al flujo de fluido, para conseguir una alta concentración contra la pared inferior de la matriz y posteriormente recogerse, mientras que el fluido se mueve horizontalmente (7). (b) "Lavado" esquemático de leucocitos y/o células leucémicas por extensión de la FIG. 17A añadiendo una corriente de entrada de tampón. Solo los leucocitos grandes pueden descender hacia la corriente de tampón y la pared inferior. (c) Imagen de lapso de tiempo de leucocitos (color azul por tinción nuclear) que se extraen de una corriente de sangre (color rojizo/blanco) que se mueve de izquierda a derecha usando un chip con un diseño como el de la FIG. 17B. Debe tenerse en cuenta que puede verse la matriz inclinada de micropostes.As shown in FIG 17: (a) Top view: example of a DLD mechanism showing uniform entry of fluorescent E. coli bacteria (white) into an array of slanted poles that impact moving downward at an angle to the flow of fluid, to achieve a high concentration against the lower wall of the matrix and later be collected, while the fluid moves horizontally (7). (b) Schematic "washing" of leukocytes and / or leukemic cells by extension of FIG. 17A adding a buffer input current. Only large leukocytes can descend into the buffer stream and the bottom wall. (c) Time-lapse image of leukocytes (blue color by nuclear staining) drawn from a blood stream (reddish / white color) moving from left to right using a chip with a pattern like that of FIG. 17B. It should be noted that the tilted array of microposts can be seen.

En algunos casos, se procesan 0,1-1 ml de sangre en < 5-10 minutos, con un rendimiento de leucocitos > 90 %, sin sesgo de los tipos de células en comparación con las células de entrada o los métodos convencionales, y > 99 % de retirada de Mab fluorescente no unido y reactivos de fijación/permeabilización. En algunos casos, las células se alejan de la corriente de entrada más rápido de lo que se ensancha la corriente de entrada debido a la difusión hacia la corriente de tampón limpia. Aunque los coeficientes de difusión de las partículas grandes, por ejemplo, los leucocitos y las células leucémicas pueden ser insignificantes en una aproximación de primer orden, los coeficientes de difusión de los Mab o de los reactivos de fijación/permeabilización generalmente no son insignificantes. En algunos casos, estas moléculas disueltas o suspendidas son mucho más pequeñas que las células y, por tanto, tienen un alto coeficiente de difusión. La propagación no deseada de estos reactivos puede provocar contaminación de la salida de leucocitos. El aumento del ángulo de inclinación puede ayudar a prevenir la propagación, pero puede reducir el espacio entre los postes para un tamaño fijo de célula, lo cual puede ser indeseable debido a células ocasionales muy grandes. Otra opción es alargar el chip, dado que el desplazamiento de las células puede ser lineal con la longitud de la matriz y la propagación (difusión) aumenta únicamente como la raíz cuadrada. Sin embargo, esto puede tener el inconveniente de requerir un chip más caro. En algunas realizaciones, la DLD es microscópicamente un proceso determinista, no uno aleatorio, tal como la electroforesis en gel. Por lo tanto, la realización de un proceso microfluídico de DLD más rápido no puede cambiar la trayectoria de las células deseadas, y la alta velocidad puede reducir el tiempo para la difusión de reactivos no deseados. En algunos casos, la velocidad del fluido es de ~ 0,1 mm/s. Por lo tanto, el paso a través de un chip de longitud típica (~ 3 cm) puede llevar 5 minutos, que puede ser demasiado lento no solo para el objetivo del rendimiento de leucocitos, sino también para prevenir la difusión no deseada. En algunos casos, el proceso de impacto funciona bien con un daño pequeño o mínimo de las células incluso a velocidades > 100 mm/s (es decir, caudales > 1 ml/min). La velocidad del flujo se puede variar cuando sea necesario para reducir la contaminación por reactivo de la salida. Las imágenes cualitativas de resultados con E. coli (5) indican que este problema de difusión retirar reactivos mediante lavado puede superarse a velocidades de flujo moderadas.In some cases, 0.1-1 ml of blood is processed in <5-10 minutes, with a leukocyte yield> 90%, without bias of cell types compared to input cells or conventional methods, and > 99% removal of unbound fluorescent Mab and fixation / permeabilization reagents. In some cases, cells move away from the input stream faster than the input stream widens due to diffusion into the clean buffer stream. Although the diffusion coefficients of large particles, eg, leukocytes and leukemia cells, may be negligible to a first order approximation, the diffusion coefficients of Mabs or binding / permeabilization reagents are generally not negligible. In some cases, these dissolved or suspended molecules are much smaller than cells and therefore have a high diffusion coefficient. Unwanted spread of these reagents can cause contamination of the leukocyte outlet. Increasing the tilt angle can help prevent propagation, but can reduce the spacing between the posts for a fixed cell size, which can be undesirable due to the occasional very large cells. Another option is to lengthen the chip, since the displacement of the cells can be linear with the length of the matrix and the propagation (diffusion) increases only as the square root. However, this can have the drawback of requiring a more expensive chip. In some embodiments, DLD is microscopically a deterministic process, not a random one, such as gel electrophoresis. Therefore, performing a faster DLD microfluidic process cannot change the path of the desired cells, and the high speed can reduce the time for diffusion of unwanted reagents. In some cases, the fluid velocity is ~ 0.1mm / s. Therefore, passing through a chip of typical length (~ 3 cm) can take 5 minutes, which may be too slow not only for the objective of leukocyte yield, but also to prevent unwanted diffusion. In some cases, the impact process works well with little or minimal cell damage even at speeds> 100mm / s (i.e. flow rates> 1ml / min). The flow rate can be varied as necessary to reduce reagent contamination of the outlet. Qualitative images of results with E. coli (5) indicate that this problem of diffusion removing reagents by washing can be overcome at moderate flow rates.

Un segundo desafío potencial es la amplia gama de tamaños celulares de diferentes tipos de leucocitos y células leucémicas. Esto se puede solucionar utilizando postes triangulares en lugar de redondos, lo que permite un espacio más grande entre los postes que con los postes redondos, debido a anisotropías de flujo en el espacio. Finalmente, después de la fijación/permeabilización, las células pueden ser "más rígidas" que antes y, por tanto, actuar como si tuvieran un diámetro diferente en el chip DLD. Si esto se observa, se puede necesitar un chip DLD con un tamaño crítico ligeramente mayor para las células después de la fijación/permeabilización.A second potential challenge is the wide range of cell sizes of different types of leukocytes and leukemia cells. This can be solved by using triangular posts instead of round posts, allowing a larger space between posts than with round posts, due to flow anisotropies in space. Finally, after fixation / permeabilization, the cells can be "stiffer" than before and thus act as if they have a different diameter on the DLD chip. If this is observed, a DLD chip with a slightly larger critical size for cells may be required after fixation / permeabilization.

B. Recolección microfluídica de leucocitos y lavado/concentración DLD en una sola etapaB. Microfluidic Leukocyte Harvesting and DLD Concentration / Wash in One Step

La etapa de lisis de eritrocitos convencional y la etapa de lavado/concentración por centrifugación posterior se pueden reemplazar por una sola etapa microfluídica de DLD. Además de un rendimiento y viabilidad > 90 % con la eliminación completa de los reactivos de marcaje y fijación/permeabilización, algunas realizaciones también consiguen que este sistema microfluídico de lavado/concentración reduzca > 99 % de los eritrocitos de una muestra de sangre completa incubada con Mab fluorescentes.The conventional erythrocyte lysis step and the subsequent centrifugal wash / concentration step can be replaced by a single DLD microfluidic step. In addition to> 90% yield and viability with complete removal of labeling and fixation / permeabilization reagents, some embodiments also achieve this microfluidic wash / concentration system to reduce> 99% of red blood cells in a whole blood sample incubated with Fluorescent Mabs.

Debido a que son más grandes que los glóbulos rojos, los leucocitos se pueden extraer por impacto a partir de una corriente de entrada de sangre entera o diluida en un chip DLD. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento está configurado para marcar directamente en la superficie los leucocitos presentes en la sangre (sin ninguna lisis o eliminación de eritrocitos), seguido de la recolección, lavado y concentración de los leucocitos inmunoteñidos directamente de la sangre (Fig 17C). Esto puede permitir que el proceso completo de preparación de leucocitos se lleve a cabo con solo 3 etapas de lavado/concentración en el chip. Debe tenerse en cuenta que el microchip puede diseñarse de manera que los glóbulos rojos más pequeños (de sangre no lisada), las plaquetas y los componentes plasmáticos no celulares no impacten; por lo tanto, la salida puede contener solo los leucocitos recogidos, lavados y concentrados.Because they are larger than red blood cells, leukocytes can be impacted from an incoming stream of whole or diluted blood on a DLD chip. In some cases, a device as provided herein is configured to directly surface label leukocytes present in the blood (without any lysis or removal of erythrocytes), followed by collection, washing, and concentration of the immunostained leukocytes. directly from the blood (Fig 17C). This can allow the entire process of Leukocyte preparation is carried out with only 3 washing / concentration steps on the chip. It should be noted that the microchip can be designed in such a way that the smaller red blood cells (non-lysed blood), platelets and non-cellular plasma components do not impact; therefore, the outlet may contain only the collected, washed and concentrated leukocytes.

En algunos casos, una corriente de entrada comprende leucocitos en sangre completa con Mab añadidos a la misma. La sangre se puede diluir con tampón de proceso. En algunos casos, se requiere un mayor volumen de entrada debido a que la entrada comprende leucocitos concentrados, por lo que se requieren mayores cantidades de Mab (para compensar el factor de dilución) para una inmunotinción óptima.In some cases, an input stream comprises whole blood leukocytes with Mabs added thereto. Blood can be diluted with process buffer. In some cases, a larger input volume is required because the input comprises concentrated leukocytes, thus requiring larger amounts of Mab (to compensate for the dilution factor) for optimal immunostaining.

En algunos casos, las células se inmunotiñen exactamente como se describe en el presente documento, con la excepción de que la preparación de células de partida puede comprender sangre no lisada, en lugar de sangre lisada. Las células inmunoteñidas pueden someterse a la etapa desarrollada de recolección/lavado/concentración de leucocitos en el chip, y después enumerarse por citometría de flujo. Los resultados se pueden comparar con las células inmunoteñidas después de una etapa de lisis de eritrocitos convencional. Pueden realizarse comparaciones estadísticas de viabilidad, rendimiento, pureza y subconjuntos de leucocitos.In some cases, cells are immunostained exactly as described herein, with the exception that the starting cell preparation may comprise non-lysed blood, rather than lysed blood. Immunostained cells can be subjected to the developed step of collecting / washing / concentrating leukocytes on the chip, and then enumerated by flow cytometry. Results can be compared to immunostained cells after a standard erythrocyte lysis step. Statistical comparisons of leukocyte viability, yield, purity, and subsets can be made.

Los glóbulos blancos (WBC) de interés se pueden teñir con una o más etiquetas marcadas con fluorescencia (por ejemplo, anticuerpos monoclonales (Mab). Los subtipos de glóbulos blancos (WBC) se pueden distinguir por Mab de diferenciación de leucocitos que se unen específicamente a (glico)proteínas que se encuentran en la superficie (por ejemplo, membrana celular) de un subtipo de glóbulo blanco (WBC) clave, selectivamente (por ejemplo, células madre de cáncer epitelial citoqueratina+). Para marcar moléculas que se encuentran dentro de la célula, la célula se puede permeabilizar mediante un proceso de fijación/permeabilización (Fix/Perm) que puede estabilizar las estructuras celulares y permitir que los marcadores entren en la célula. Se pueden realizar etapas de lavado para eliminar Mab fluorescentes no unidos, tintes y desechos. Un "lavado" puede implicar la centrifugación de las células para obtener un sedimento utilizando una centrífuga, la aspiración o decantación del sobrenadante y la resuspensión de las células en un tampón u otro medio.White blood cells (WBC) of interest can be stained with one or more fluorescently labeled tags (eg, monoclonal antibodies (Mabs). White blood cell (WBC) subtypes can be distinguished by differentiating Mabs from leukocytes that specifically bind a (glyco) proteins found on the surface (eg, cell membrane) of a key white blood cell (WBC) subtype, selectively (eg, cytokeratin + epithelial cancer stem cells). To mark molecules within the cell, the cell can be permeabilized by a fixation / permeabilization (Fix / Perm) process that can stabilize cell structures and allow markers to enter the cell. Washing steps can be performed to remove unbound fluorescent Mabs, dyes and waste. A "wash" may involve centrifugation of cells to obtain a pellet using a centrifuge, aspiration or decantation of the supernatant, and resuspending the cells in a buffer or other medium.

En algunas realizaciones, se retira el 99% de los eritrocitos (es decir, se obtienen leucocitos contaminados < 10 % por eritrocitos). En algunos casos, la viscosidad de la sangre (debido al número 1000 veces mayor de eritrocitos) es mayor en comparación con una suspensión de leucocitos en tampón. Esto puede cambiar la dinámica interna de los patrones de flujo cerca del límite entre el tampón y la sangre. Se pueden utilizar al menos tres enfoques para resolver este problema: (a) dirigir la entrada de sangre y la entrada de tampón a diferentes presiones, (b) reemplazar el enfoque de dirección por presión por un enfoque de caudal fijo (bomba de jeringa), y (c) diluir la sangre (por ejemplo, 3-5 veces) para reducir su viscosidad. El último enfoque puede ser el más sencillo, aunque puede requerir caudales más altos para lograr los objetivos de rendimiento. En algunos casos, se consigue una salida que concentra los leucocitos 30 veces con respecto a la entrada (diluida). En la práctica, esto puede requerir un chip bastante ancho (y por lo tanto largo), que puede estar limitado por el tamaño de oblea de partida de ~ 100 mm. Las opciones incluyen el uso de una instalación de fabricación capaz de obtener tamaños de obleas más grandes (por ejemplo, 200 mm) o chips en cascada: un chip realiza la recolección y la concentración inicial (FIG. 17C), y luego el fluido fluye a través de un segundo chip diseñado para la concentración (como el de FIG. 17A). Finalmente, si el enfoque de postes triangulares para espacios anchos no elimina la obstrucción debida a células anormalmente grandes (por ejemplo, > 30 um), se puede realizar una filtración previa o se puede usar un tercer chip en serie para eliminar las células de tamaño > 30 um.In some embodiments, 99% of the erythrocytes are removed (ie, <10% contaminated leukocytes are obtained by erythrocytes). In some cases, the viscosity of the blood (due to the 1000 times greater number of erythrocytes) is higher compared to a suspension of leukocytes in buffer. This can change the internal dynamics of flow patterns near the buffer-blood boundary. At least three approaches can be used to solve this problem: (a) direct the blood inlet and the buffer inlet at different pressures, (b) replace the pressure directing approach with a fixed flow approach (syringe pump) , and (c) diluting the blood (eg, 3-5 times) to reduce its viscosity. The latter approach may be the simplest, although it may require higher flow rates to achieve performance goals. In some cases, an outlet is achieved that concentrates the leukocytes 30 times relative to the inlet (diluted). In practice this may require a fairly wide (and therefore long) chip, which may be limited by the starting wafer size of ~ 100mm. Options include using a fabrication facility capable of larger wafer sizes (eg 200mm) or cascading chips - one chip performs the collection and initial concentration (FIG. 17C), and then the fluid flows through a second chip designed for concentration (like the one in FIG. 17A ). Finally, if the wide-gap triangular post approach does not remove the obstruction due to abnormally large cells (e.g.> 30 um), a pre-filtration can be performed or a third chip in series can be used to remove the oversized cells. > 30 um.

En algunas realizaciones, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento reemplaza las etapas convencionales de lisis y centrifugación para recoger leucocitos (y células leucémicas) de la sangre, y las etapas de lavado/concentración por centrifugación después del marcaje de la superficie celular, fijación/permeabilización y marcaje intracelular con procesos rápidos y repetibles en el chip, como se describe en el presente documento. In some embodiments, a device as provided herein supersedes conventional lysis and centrifugation steps for collecting leukocytes (and leukemic cells) from blood, and centrifugal wash / concentration steps after cell surface labeling. , fixation / permeabilization and intracellular labeling with fast and repeatable processes on the chip, as described herein.

En algunos casos, el método se asemeja a un enfoque de "lavado de coches", en el que (análogamente) un coche se somete a múltiples tratamientos secuenciales (por ejemplo, lavado, aclarado, encerado, secado) a medida que avanza el proceso de lavado de coches (FIG. 18A). Basándose en el concepto de la FIG. 18B, la sangre entra en un chip y las células deseadas se mueven a través de corrientes secuenciales paralelas de agentes químicos (marcadores, reactivos de fijación/permeabilización, etc.) para realizar una etapa tras otra. En algunos casos, la sangre que ya se ha marcado con un señalizador de la superficie celular (pero no se ha lavado) entra en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento en la corriente superior (que fluye de izquierda a derecha), y se induce a las células leucémicas y leucocitos relativamente grandes a fluir hacia abajo formando un ángulo con el flujo de fluido por el proceso de impacto de DLD para recogerse de la sangre. Después las células fluyen a través de una corriente para fijar y permeabilizar las membranas celulares, y después a través de una corriente para el marcaje intracelular. Finalmente, las células marcadas en la superficie celular/intracelularmente se lavan, se concentran y se recogen en el borde inferior de la matriz.In some cases, the method resembles a "car wash" approach, in which (analogously) a car undergoes multiple sequential treatments (eg, washing, rinsing, waxing, drying) as the process progresses car wash (FIG. 18A). Based on the concept of FIG. 18B, the blood enters a chip and the desired cells are moved through sequential parallel streams of chemical agents (markers, binding / permeabilization reagents, etc.) to perform one step after another. In some cases, blood that has already been labeled with a cell surface marker (but has not been washed) enters a device as provided herein in the overhead stream (flowing from left to right), and relatively large leukemic cells and leukocytes are induced to flow downward at an angle to the fluid flow by the DLD impact process to be collected from the blood. The cells then flow through a stream to fix and permeabilize cell membranes, and then through a stream for intracellular labeling. Finally, cells labeled on the cell surface / intracellularly are washed, concentrated and collected at the lower edge of the matrix.

Puede realizarse un marcaje en el chip de las células mediante el desplazamiento hacia el interior de una corriente de marcaje y la posterior eliminación de las células marcadas de la corriente de marcaje utilizando plaquetas de sangre previamente aisladas pero sin marcar como entrada y un marcador fluorescente de CD41 para la corriente de marcaje. On-chip labeling of cells can be performed by inward movement of a labeling stream and subsequent removal of the labeled cells from the labeling stream using previously isolated but unlabeled blood platelets as input and a fluorescent marker of CD41 for the marking current.

(FIG. 18B). Se puede realizar la lisis de células en el chip moviéndolas a través de una corriente de agentes de lisis. La lisis en el chip no es necesaria para el "lavado de coches" de la FIG. 18A, pero brinda la posibilidad de un procesamiento químico secuencial en el chip para etapas tales como la fijación/permeabilización antes de la tinción intracelular. Pueden determinarse los tiempos y concentraciones de incubación requeridos, los rendimientos y el ensanchamiento de las corrientes de incubación o fijación/permeabilización debido a la difusión. (FIG. 18B). Cells can be lysed on the chip by moving them through a stream of lysing agents. On-chip lysis is not required for the "car wash" of FIG. 18A, but provides the possibility of on-chip sequential chemical processing for steps such as fixation / permeabilization prior to intracellular staining. The required incubation times and concentrations, the yields and the broadening of the incubation or fixation / permeabilization streams due to diffusion can be determined.

La FIG. 18A muestra una vista esquemática de un concepto de "lavado de coches" para el procesamiento secuencial múltiple de tratamientos químicos en el chip para una preparación celular. Un solo proceso de flujo continuo combina todas las etapas en la FlG. 16 en un solo chip. La FIG. 18B muestra una imagen de falso color de lapso de tiempo de plaquetas que descienden en una matriz DLD a través de 3 corrientes paralelas en el chip para marcaje y lavado en el chip. Corriente superior: entrada de plaquetas no marcadas (invisibles); Corriente media: marcador de CD41 conjugado con ficoeritrina; Corriente inferior: plaquetas marcadas en tampón de lavado. FIG. 18A shows a schematic view of a "car wash" concept for multiple sequential processing of on-chip chemical treatments for a cell preparation. A single continuous flow process combines all the stages in the FlG. 16 on a single chip. FIG. 18B shows a time lapse false color image of platelets descending in a DLD matrix through 3 parallel streams on the chip for marking and washing on the chip. Upper stream: entry of unmarked (invisible) platelets; Midstream: CD41 marker conjugated to phycoerythrin; Lower stream: labeled platelets in wash buffer.

C. Generación de bibliotecas NGS utilizando una matriz DLDC. Generating NGS Libraries Using a DLD Array

En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o dispositivos proporcionados en el presente documento se utilizan para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) una muestra de una célula a un ácido nucleico. El procesamiento puede ser en serie. En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se utilizan para procesar en serie una muestra de una pluralidad de células a una pluralidad de ácidos nucleicos, en donde la pluralidad de ácidos nucleicos comprende ácidos nucleicos en una biblioteca de ácidos nucleicos. Se describen dispositivos, métodos y/o sistemas, por ejemplo, en la Publicación PCT N.° WO201302Q089. La célula se puede procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) usando un dispositivo de la presente invención hasta un ácido nucleico de alto peso molecular ("HMW") usando al menos una corriente de reactivo químico y/o enzimático que fluye a través de al menos una matriz de impacto DLD. La biblioteca de ácidos nucleicos se puede configurar para su uso en una plataforma de secuenciación. La plataforma de secuenciación puede ser cualquier plataforma de secuenciación de última generación conocida en la técnica. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) células hasta ácido nucleico se utiliza para procesar un gran volumen de una muestra que comprende las células. La muestra puede ser de al menos 10 ml. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) células hasta ácido nucleico se utiliza para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) a un caudal elevado. En algunos casos, los dispositivos tal como se proporcionan en el presente documento para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) células en una muestra que comprende células desde células hasta ácidos nucleicos comprenden al menos una pared separadora tal como se proporciona en el presente documento. Dicha al menos una pared separadora está configurada para separar una corriente de flujo que comprende un reactivo (por ejemplo, reactivo químico y/o enzimático tal como se proporciona en el presente documento) de una corriente de flujo adyacente. En algunos casos, los dispositivos tal como se proporcionan en el presente documento para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) células en una muestra que comprende células desde células hasta ácidos nucleicos comprenden un sistema de autolimpieza en el chip tal como se proporciona en el presente documento. En algunos casos, los dispositivos tal como se proporcionan en el presente documento para procesar (por ejemplo, procesamiento o tratamiento químico y/o enzimático) células en una muestra que comprende células desde células hasta ácidos nucleicos comprenden al menos una pared separadora y un sistema de autolimpieza en el chip tal como se proporciona en el presente documento.In some instances, the devices, methods, compositions, systems, and / or devices provided herein are used to process (eg, chemical and / or enzymatic processing or treatment) a sample from a cell to nucleic acid. Processing can be serial. In some instances, the devices, methods, compositions, systems, and / or kits provided herein are used to serially process a sample from a plurality of cells to a plurality of nucleic acids, wherein the plurality of nucleic acids comprise acids. nucleic acids in a nucleic acid library. Devices, methods and / or systems are described, for example, in PCT Publication No. WO201302Q089. The cell can be processed (eg, chemical and / or enzymatic processing or treatment) using a device of the present invention to a high molecular weight ("HMW") nucleic acid using at least one chemical and / or enzymatic reagent stream. flowing through at least one DLD impact die. The nucleic acid library can be configured for use on a sequencing platform. The sequencing platform can be any next generation sequencing platform known in the art. In some cases, a device as provided herein for processing (eg, chemical and / or enzymatic processing or treatment) cells to nucleic acid is used to process a large volume of a sample comprising the cells. The sample can be at least 10 ml. In some cases, a device as provided herein to process (eg, chemical and / or enzymatic processing or treatment) cells to nucleic acid is used to process (eg, chemical and / or enzymatic processing or treatment) at a high flow rate. In some cases, devices as provided herein for processing (eg, chemical and / or enzymatic processing or treatment) cells in a sample comprising cells from cells to nucleic acids comprise at least one separating wall as described. provided in this document. Said at least one partition wall is configured to separate a flow stream comprising a reagent (eg, chemical and / or enzymatic reagent as provided herein) from an adjacent flow stream. In some instances, devices as provided herein for processing (eg, chemical and / or enzymatic processing or treatment) cells in a sample comprising cells from cells to nucleic acids comprise an on-chip self-cleaning system such as provided herein. In some cases, devices as provided herein for processing (eg, chemical and / or enzymatic processing or treatment) cells in a sample comprising cells from cells to nucleic acids comprise at least one separating wall and a system on-chip self-cleaning as provided herein.

En algunos casos, un ácido nucleico HMW aislado por los dispositivos y métodos proporcionados en el presente documento tiene un radio hidrodinámico eficaz que es mayor que un tamaño crítico de la matriz DLD en un dispositivo proporcionado en el presente documento. El método puede incluir recibir el ácido nucleico HMW en al menos una matriz de impacto y poner en contacto el ácido nucleico HMW con al menos una corriente de reactivo químico y/o enzimático, en donde dicha al menos una corriente de reactivo químico y/o enzimático fluye en la dirección del flujo general de fluido a través de la matriz de impacto, mientras que el ácido nucleico HMW fluye formando un ángulo con la dirección del flujo general de fluido. El ácido nucleico HMW puede reaccionar con dicha al menos una corriente de reactivo químico y/o enzimático.In some cases, an HMW nucleic acid isolated by the devices and methods provided herein has an effective hydrodynamic radius that is greater than a critical DLD matrix size in a device provided herein. The method may include receiving the HMW nucleic acid in at least one impact matrix and contacting the HMW nucleic acid with at least one chemical and / or enzymatic reagent stream, wherein said at least one chemical reagent stream and / or Enzyme flows in the direction of general fluid flow through the impact matrix, while HMW nucleic acid flows at an angle to the direction of general fluid flow. The HMW nucleic acid can react with said at least one chemical and / or enzymatic reagent stream.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento incluye al menos un dispositivo de matriz de impacto (por ejemplo, matriz DLD) que tiene una o más matrices de impacto. El dispositivo de matriz de impacto puede tratar y purificar en serie muestras de fluido de ácido nucleico. Se pueden realizar múltiples ciclos de tratamiento y purificación utilizando un solo dispositivo de flujo en una sola operación de flujo continuo. Los tratamientos pueden ser químicos y/o enzimáticos. Los ácidos nucleicos se pueden purificar a partir de células y/o muestras biológicas líquidas complejas, tales como sangre completa. El dispositivo de matriz de impacto también se puede utilizar para realizar diversos procesamientos de los ácidos nucleicos purificados. Los ejemplos no limitantes de dicho procesamiento pueden incluir al menos uno de los siguientes: fosforilación, desfosforilación, digestión de restricción, ligamiento, desnaturalización, hibridación, procesamiento por polimerasas, marcaje fluorescente o radiactivo, modificación química de bases de ADN o grupos de cadena principal, escisión enzimática o química de bases modificadas, tinción de ácidos nucleicos con cromóforos o fluoróforos, etc. y/u otros y/o cualquier combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser ácidos nucleicos unidos a partículas, donde los ácidos nucleicos pueden estar unidos a micropartículas. Esto puede permitir el procesamiento de ácidos nucleicos pequeños. Las partículas pueden hacer que los ácidos nucleicos adheridos impacten en matrices con dimensiones de matriz fácilmente fabricadas.In some cases, a device and / or system as provided herein includes at least one impact die device (eg, DLD die) that has one or more impact dies. The impact matrix device can serially process and purify nucleic acid fluid samples. Multiple treatment and purification cycles can be performed using a single flow device in a single continuous flow operation. The treatments can be chemical and / or enzymatic. Nucleic acids can be purified from cells and / or complex liquid biological samples, such as whole blood. The impact matrix device can also be used to perform various processing of the purified nucleic acids. Non-limiting examples of such processing may include at least one of the following: phosphorylation, dephosphorylation, restriction digestion, ligation, denaturation, hybridization, polymerase processing, fluorescent or radioactive labeling, chemical modification of DNA bases or backbone groups. , enzymatic or chemical cleavage of modified bases, staining of nucleic acids with chromophores or fluorophores, etc. and / or others and / or any combination thereof. Nucleic acids can be particle-bound nucleic acids, where nucleic acids they can be attached to microparticles. This can allow the processing of small nucleic acids. The particles can cause adhered nucleic acids to impact matrices with easily fabricated matrix dimensions.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento se usa en un método para procesar fluidos. El procesamiento puede incluir la purificación de fluidos que se puede conseguir haciendo fluir una muestra de fluido compleja en el interior de una matriz de impacto, usando una matriz de impacto para aislar células que contienen ácidos nucleicos o partículas de interés en función del tamaño de partícula, usando una matriz de impacto para poner en contacto partículas aisladas con una o más corrientes de reactivo que puedan liberar ácido nucleico de las partículas en forma sustancialmente pura, y usando una matriz de impacto para extraer los ácidos nucleicos purificados de la corriente de reactivo. Una vez que los ácidos nucleicos purificados se han extraído de la corriente de reactivo, los ácidos nucleicos purificados pueden estar sustancialmente libres de otros componentes celulares y de muestra y pueden estar sustancialmente libres de los componentes de la corriente de reactivo de la matriz de impacto.In some cases, a device and / or system as provided herein is used in a method for processing fluids. Processing may include fluid purification that can be achieved by flowing a complex fluid sample into an impact matrix, using an impact matrix to isolate cells containing nucleic acids or particles of interest based on particle size. , using an impact matrix to contact isolated particles with one or more reagent streams that can release nucleic acid from the particles in substantially pure form, and using an impact matrix to extract the purified nucleic acids from the reagent stream. Once the purified nucleic acids have been extracted from the reagent stream, the purified nucleic acids can be substantially free of other cellular and sample components and can be substantially free of the impact matrix reagent stream components.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento comprende una serie de matrices de impacto (por ejemplo, DLD) conectadas en serie de modo que la salida de producto de una matriz de impacto está conectada a una entrada de muestra de una matriz de impacto individual posterior. En algunos casos, se utiliza una única matriz de impacto para todas las etapas. El fraccionamiento celular y los tratamientos con reactivos se pueden conseguir en regiones físicamente distintas de una única matriz de impacto. La muestra de entrada puede ser sangre de aves o mamíferos y las partículas que contienen ácido nucleico pueden ser glóbulos blancos. La muestra de entrada puede ser sangre de aves o mamíferos y las partículas que contienen ácido nucleico pueden ser células tumorales circulantes. La muestra de entrada puede ser sangre completa de aves o mamíferos y las partículas que contienen ácido nucleico pueden ser glóbulos blancos, bacterias, virus, hongos, protozoos parásitos y/o cualquier otra partícula tal como se proporciona en el presente documento y/o cualquier combinación de los mismos.In some cases, a device and / or system as provided herein comprises a series of impact dies (e.g. DLD) connected in series so that the product outlet of an impact die is connected to a Sample input from a posterior single impact matrix. In some cases, a single impact matrix is used for all stages. Cell fractionation and reagent treatments can be accomplished in physically distinct regions of a single impact matrix. The input sample can be bird or mammalian blood and the nucleic acid-containing particles can be white blood cells. The input sample can be bird or mammalian blood and the nucleic acid-containing particles can be circulating tumor cells. The input sample can be whole blood from birds or mammals and the nucleic acid containing particles can be white blood cells, bacteria, viruses, fungi, parasitic protozoa and / or any other particle as provided herein and / or any combination thereof.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento proporciona un procesamiento en serie de ácidos nucleicos de alto peso molecular por medios químicos y/o enzimáticos en dispositivos tales como se proporcionan en el presente documento que comprenden matrices de impacto (por ejemplo, DLD). El ácido nucleico HMW puede tener un diámetro hidrodinámico eficaz que puede ser mayor que el diámetro crítico de la matriz de impacto y el ácido nucleico HMW puede ponerse en contacto con al menos una primera corriente de reactivo, donde la primera corriente de reactivo puede fluir en la dirección del flujo general de fluido y donde el ácido nucleico HMW se bombea a través de la primera corriente de reactivo y puede reaccionar con los primeros reactivos.In some cases, a device and / or system as provided herein provides for serial processing of high molecular weight nucleic acids by chemical and / or enzymatic means in devices such as provided herein that comprise arrays. impact (for example, DLD). The HMW nucleic acid can have an effective hydrodynamic diameter that can be greater than the critical diameter of the impact matrix and the HMW nucleic acid can be contacted with at least a first reagent stream, where the first reagent stream can flow in the direction of the general fluid flow and where the HMW nucleic acid is pumped through the first reagent stream and can react with the first reagents.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento proporciona un procesamiento en serie de ácidos nucleicos HMW por uno o más medios químicos o enzimáticos que se puede conseguir haciendo fluir una muestra de ácidos nucleicos HMW al interior de una matriz de impacto, usando una matriz de impacto para poner en contacto ácidos nucleicos HMW con al menos una corriente de reactivo que puede modificar los ácidos nucleicos (por ejemplo, químicamente, enzimáticamente, etc.), y, opcionalmente, utilizando una matriz de impacto para retirar los ácidos nucleicos purificados de la corriente de reactivo.In some cases, a device and / or system as provided herein provides for serial processing of HMW nucleic acids by one or more chemical or enzymatic means that can be accomplished by flowing a sample of HMW nucleic acids into the interior of an impact matrix, using an impact matrix to contact HMW nucleic acids with at least one reagent stream that can modify nucleic acids (e.g. chemically, enzymatically, etc.), and optionally using a matrix of impact to remove purified nucleic acids from the reagent stream.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento comprende matrices de impacto individuales conectadas en una serie de matrices de impacto de modo que la salida del producto de una matriz de impacto se conecte a la entrada de muestra de una matriz de impacto individual posterior de la serie. Las matrices de impacto pueden ser las mismas matrices de impacto (y el fraccionamiento de células y los tratamientos con reactivos se pueden realizar en regiones físicamente distintas de una matriz de impacto continua). En algunos casos, una muestra de ADN puede unirse (de forma covalente o no covalente) a micropartículas, en donde las micropartículas pueden impactar, por lo que las micropartículas actúan como portadores para llevar el ADN a través de reacciones de modificación en corrientes de reactivo posteriores.In some cases, a device and / or system as provided herein comprises individual impact dies connected in a series of impact dies so that the product outlet of one impact die connects to the sample inlet. of an individual impact matrix later in the series. The impact matrices can be the same impact matrices (and cell fractionation and reagent treatments can be performed in physically different regions of a continuous impact matrix). In some cases, a DNA sample can bind (covalently or non-covalently) to microparticles, where the microparticles can impact, whereby the microparticles act as carriers to carry the DNA through modification reactions in reagent streams. later.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento proporciona el procesamiento de sangre completa para producir un ácido nucleico puro. Se puede usar un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento para producir un ácido nucleico puro modificado. El ácido nucleico puro modificado puede ser una biblioteca de secuenciación de ADN y/o una biblioteca de ADN recombinante.In some cases, a device and / or system as provided herein provides for the processing of whole blood to produce a pure nucleic acid. A device and / or system as provided herein can be used to produce a pure modified nucleic acid. The modified pure nucleic acid can be a DNA sequencing library and / or a recombinant DNA library.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se usa en un sistema que puede aceptar una muestra de sangre completa como entrada y producir una biblioteca de ADN genómico adecuada para la secuenciación de última generación ("NGS"). La construcción de la biblioteca puede realizarse en un solo proceso automatizado sin la intervención del usuario. El sistema puede reducir el coste y la mano de obra de la secuenciación NGS y acelerar el movimiento de la tecnología NGS hacia los entornos de diagnóstico. El sistema puede ser ampliable de escala para acomodar muestras que contienen muy pocas células (por ejemplo, un solo nivel celular), lo cual puede ser importante en el tratamiento de cánceres y/u otros problemas médicos importantes o muestras grandes (por ejemplo, de al menos 10 ml), lo cual puede ser importante para técnicas de alto rendimiento.In some cases, a device as provided herein is used in a system that can accept a whole blood sample as input and produce a genomic DNA library suitable for next-generation sequencing ("NGS"). Building the library can be done in a single automated process without user intervention. The system can reduce the cost and labor of NGS sequencing and accelerate the movement of NGS technology into diagnostic environments. The system can be scalable to accommodate samples containing very few cells (for example, a single cell level), which can be important in treating cancers and / or other major medical problems or large samples (for example, from at least 10 ml), which can be important for high-throughput techniques.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento incluye un diseño microfluídico, de flujo continuo. Se pueden hacer pasar muestras líquidas que contienen partículas (por ejemplo, células, núcleos y macromoléculas grandes tales como el ADN HMW enrollado aleatoriamente) a través de celdas de flujo que pueden estar pobladas por una matriz regular de postes de tamaño micrométrico. La separación y el alineamiento de los postes pueden disponerse de modo que las partículas por encima de un cierto tamaño crítico puedan "impactar" con los postes y pasar a una trayectoria de flujo que corre diagonalmente a través de la dirección del flujo general de líquido. Por el contrario, los componentes de muestra más pequeños que el tamaño crítico pueden desplazarse en línea recta junto con el flujo general. Usando este mecanismo, pueden separarse componentes de muestra más grandes y purificarse de los componentes más pequeños lateralmente a través del chip.In some cases, a device and / or system as provided herein includes a design microfluidic, continuous flow. Liquid samples containing particles (eg, cells, nuclei, and large macromolecules such as randomly wound HMW DNA) can be passed through flow cells that may be populated by a regular array of micrometer-sized posts. The spacing and alignment of the posts can be arranged so that particles above a certain critical size can "hit" the posts and pass into a flow path that runs diagonally through the direction of general liquid flow. In contrast, sample components smaller than the critical size can travel in a straight line along with the overall flow. Using this mechanism, larger sample components can be separated and purified from the smaller components laterally across the chip.

Las muestras pueden fluir a través de estas matrices de impacto en condiciones de flujo laminar (número de Reynolds, Re, << 1), de modo que se pueden introducir corrientes de reactivo discretas en las matrices sin una mezcla lateral significativa. Las partículas grandes pueden impactar y desviarse diagonalmente hacia el interior y hacia el exterior de tales corrientes de reactivos para realizar reacciones químicas o enzimáticas en las partículas. Los dispositivos tal como se proporcionan en el presente documento se pueden usar para purificar núcleos de leucocitos, purificar ADN y modificar enzimáticamente el ADN para la generación de bibliotecas NGS.Samples can flow through these impact matrices under laminar flow conditions (Reynolds number, Re, << 1), so that discrete reagent streams can be introduced into the matrices without significant side mixing. Large particles can impact and deflect diagonally in and out of such reactant streams to perform chemical or enzymatic reactions on the particles. Devices as provided herein can be used to purify leukocyte nuclei, purify DNA, and enzymatically modify DNA for generation of NGS libraries.

En algunos casos, un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento se usa en un método para procesar secuencialmente muestras de sangre usando matrices de impacto. Se pueden obtener unos pocos microlitros ("pl") de sangre. Las células sanguíneas se pueden separar del plasma. Las células se pueden lavar con una corriente de tampón cuando se separan del plasma. En algunos casos, las células se lisan. Las células lavadas se pueden lisar haciéndolas impactar a través de una corriente de reactivo que contenga detergente no iónico. El detergente no iónico puede ser cualquier detergente no iónico conocido en la técnica. Después de retirar el reactivo de lisis, los núcleos de leucocitos intactos pueden impactar diagonalmente a través de una corriente de tampón de lavado. Los contenidos citoplasmáticos demasiado pequeños para impactar (por ejemplo, por debajo de un tamaño crítico de una matriz de impacto DLD) se pueden sacar de la matriz en la corriente de lisis de detergente. Se puede aislar y/o purificar ADN cromosómico. Los núcleos de leucocitos lavados se pueden hacer impactar a través de una corriente de reactivo de lisis nuclear para eliminar todos los lípidos y proteínas nucleares del ADN cromosómico HMW. La corriente de reactivo de lisis nuclear puede comprender un desnaturalizante de proteínas (por ejemplo, isotiocianato de guanidina) para extraer ácido nucleico (por ejemplo, ADN cromosómico HW) de proteínas (por ejemplo, proteínas histonas). En algunos casos, el isotiocianato de guanidina está presente en una corriente separada de la corriente de lisis nuclear. Las dimensiones de la matriz en un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento se pueden elegir de modo que el ADN HMW, en su configuración de enrollamiento aleatorio de doble cadena, pueda impactar y salir diagonalmente de la corriente de reactivo de lisis. Todos o sustancialmente todos los lípidos nucleares, el ARN y las proteínas demasiado pequeñas para impactar (por ejemplo, por debajo de un tamaño crítico de una matriz de impacto DLD) se pueden extraer de la matriz en la corriente de lisis. En algunos casos, el ADN purificado se hace reaccionar con un reactivo adaptado a la transposasa para generar cointegrados de biblioteca. El ADN HMW purificado se puede hacer impactar a través de una corriente de reactivo que contiene un complejo de transposasa que puede precargarse con extremos de transposón modificados con adaptador de secuenciación. Un método que usa un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento puede proporcionar un complejo de transposasa en el que los extremos del transposasoma adaptados al transposón pueden estar en la misma pieza lineal de ADN. Como resultado, una reacción del transposasoma con el ADN HMW puede generar un producto de inserción colineal que puede aumentar el tamaño de la diana de ADN HMW. El ADN diana puede seguir siendo impactable, en donde el ADN diana puede separarse de la corriente de reactivo del transposasoma y el ADN adaptador sin reaccionar. Los cointegrados de HMW se pueden purificar de la corriente de reactivo de transposasa. Los cointegrados se pueden hacer reaccionar con enzimas de restricción para generar una biblioteca de secuenciación. La biblioteca puede separarse del ADN HMW sin cortar y recuperarse de la matriz de impacto. En algunos casos, una biblioteca de secuenciación final producida mediante un método que utiliza un dispositivo y/o sistema tal como se proporciona en el presente documento se puede escindir del ADN cointegrado HMW haciendo impactar el ADN a través de una corriente de reactivo de enzima de restricción. La enzima puede escindir sitios diseñados por ingeniería genética en el transposón modificado que se encuentran fuera de los adaptadores de secuenciación. La biblioteca escindida puede tener un peso molecular bajo (aproximadamente 200-2000 pb) y es posible que ya no sea impactable. La biblioteca se puede retirar de la matriz en la corriente de enzimas de restricción. El ADN HMW que no ha reaccionado, sin escindir, se puede extraer por impacto de la corriente de reactivo en diagonal (y se puede recuperar).In some cases, a device and / or system as provided herein is used in a method for sequentially processing blood samples using impact matrices. A few microliters ("pl") of blood can be obtained. Blood cells can be separated from plasma. Cells can be washed with a stream of buffer when separated from plasma. In some cases, the cells are lysed. The washed cells can be lysed by being impacted through a stream of reagent containing nonionic detergent. The nonionic detergent can be any nonionic detergent known in the art. After removal of the lysis reagent, intact leukocyte nuclei can be impacted diagonally through a stream of wash buffer. Cytoplasmic contents too small to impact (eg, below a critical size of a DLD impact matrix) can be removed from the matrix in the detergent lysis stream. Chromosomal DNA can be isolated and / or purified. The washed leukocyte nuclei can be impacted through a stream of nuclear lysis reagent to remove all lipids and nuclear proteins from the HMW chromosomal DNA. The nuclear lysis reagent stream may comprise a protein denaturant (eg, guanidine isothiocyanate) to extract nucleic acid (eg, HW chromosomal DNA) from proteins (eg, histone proteins). In some cases, guanidine isothiocyanate is present in a separate stream from the nuclear lysis stream. The dimensions of the array in a device as provided herein can be chosen so that the HMW DNA, in its double stranded random coil configuration, can impact and exit diagonally from the lysis reagent stream. All or substantially all of the nuclear lipids, RNA, and proteins too small to impact (eg, below a critical size of a DLD impact matrix) can be removed from the matrix in the lysis stream. In some cases, the purified DNA is reacted with a transposase-adapted reagent to generate library cointegrates. The purified HMW DNA can be impacted through a reagent stream containing a transposase complex that can be preloaded with sequencing adapter modified transposon ends. A method using a device as provided herein can provide a transposase complex in which the transposon-matched ends of the transposasome can be on the same linear piece of DNA. As a result, a reaction of the transposasome with HMW DNA can generate a collinear insertion product that can increase the size of the HMW DNA target. The target DNA can remain impactable, where the target DNA can be separated from the reagent stream of the transposasome and the unreacted adapter DNA. HMW cointegrates can be purified from the transposase reagent stream. The cointegrates can be reacted with restriction enzymes to generate a sequencing library. The library can be separated from the uncut HMW DNA and recovered from the impact matrix. In some cases, a final sequencing library produced by a method using a device and / or system as provided herein can be excised from HMW cointegrated DNA by impacting the DNA through a stream of enzyme reagent from restriction. The enzyme can cleave engineered sites on the modified transposon that lie outside of the sequencing adapters. The cleaved library may have a low molecular weight (approximately 200-2000 bp) and may no longer be impactable. The library can be removed from the matrix in the restriction enzyme stream. Unreacted, uncleaved HMW DNA can be blasted out of the reagent stream (and recovered).

En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento incluyen matrices de postes de tamaño micrométrico con alta rigidez estructural y altas relaciones de aspecto con el fin de procesar muestras de fluidos. Las matrices de impacto se pueden fabricar a partir de silicio, resina de olefina cíclica, celdas de flujo desechables de plástico moldeado, así como de cualquier otro material. In some cases, the devices, methods, compositions, systems, and / or kits provided herein include micrometer-sized post arrays with high structural rigidity and high aspect ratios for the purpose of processing fluid samples. Impact dies can be made from silicon, cyclic olefin resin, molded plastic disposable flow cells, as well as any other material.

En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento separan o fraccionan, analizan y/o recogen analitos de ácido polinucleico purificados o procesados o fracciones derivadas de una muestra biológica de partida tal como se proporciona en el presente documento.In some cases, the devices, methods, compositions, systems and / or kits provided herein separate or fractionate, analyze and / or collect purified or processed polynucleic acid analytes or fractions derived from a starting biological sample as provided. in the present document.

En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento procesan moléculas de ácido nucleico más pequeñas uniendo los ácidos nucleicos a micropartículas que están adaptadas para impactar en una matriz de impacto (por ejemplo, matriz DLD). Las micropartículas pueden actuar como portadores para transportar los ácidos nucleicos unidos a través de corrientes de reactivos para la modificación de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, puede usarse PCR en emulsión con micropartículas modificadas con cebador para la generación de perlas de molde de secuenciación de ADN (métodos de secuenciación Ion Torrent y 454; Rothberg et al. 2011. Nature v475, pp348-352; Margulies et al., Nature. V437, pp 376-380). En algunos casos, pueden usarse métodos de PCR en emulsión para evaluar la frecuencia de genes mutantes raros en tejidos de pacientes con cáncer (método "BEAMing" de Vogelstein, Diehl et al. Nature Methods. 2006 v3 pp 551-559). En algunos casos, los dispositivos, métodos, composiciones, sistemas y/o kits proporcionados en el presente documento se utilizan para procesar la PCR en emulsión basada en partículas mediante la combinación de lavado, desnaturalización e hibridación de cebadores en un solo proceso de matriz de impacto. Por ejemplo, se puede diseñar una matriz de impacto eligiendo un espacio de postes tal que el diámetro crítico de la matriz pueda ser menor que el de las micropartículas utilizadas para la PCR en emulsión. Esto puede garantizar que las micropartículas puedan impactar de manera consistente en todas las posiciones dentro de la matriz. Después de la PCR en emulsión, la emulsión se puede romper y la fracción acuosa de partículas se puede introducir en un dispositivo que comprende una matriz de impacto tal como se proporciona en el presente documento cerca de la esquina superior izquierda. A medida que las partículas entran en la matriz, las partículas se pueden desviar hacia una pared límite opuesta, mientras que los reactivos de PCR pueden fluir hacia abajo en la dirección del flujo general. Se puede introducir un tampón de lavado adecuado en la parte superior de la matriz inmediatamente a la derecha del puerto de entrada de partículas. A medida que las partículas impactan y se apartan de la corriente de entrada, las partículas pueden pasar a través de la corriente de tampón de lavado, que puede eliminar el reactivo de PCR adicional. A medida que las partículas se mueven hacia abajo en la matriz, las partículas pueden entrar en una corriente de reactivo desnaturalizante (por ejemplo, que puede contener NaOH o KOH aproximadamente 20-200 mM con EDTA aproximadamente 1-10 mM), que puede convertir los amplicones bicatenarios de las partículas en forma monocatenaria. La cadena de amplicón unida de forma no covalente se puede retirar de la matriz con la corriente desnaturalizante, y las partículas pueden impactar y desplazarse hacia la derecha en un tampón de neutralización que puede ser adecuado para las reacciones de hibridación en la siguiente etapa. En general, tal tampón de neutralización puede contener un tampón (por ejemplo, Tris-HCl 20-200 mM, pH 7,5-8,0) e iones monovalentes para soportar la hibridación (por ejemplo, NaCl 20-500 mM). Después, las partículas pueden hacerse impactar a través de una corriente de reactivo de hibridación que contiene un cebador de secuenciación (en el caso de las aplicaciones 454/Ion Torrent) o una sonda de oligonucleótido marcada (en el caso de la aplicación BEAMing). La corriente de reactivo puede tener sondas de oligonucleótido en el intervalo de concentración micromolar baja (de aproximadamente 0,1 micromolar a aproximadamente 50 micromolar), y puede tener aproximadamente la misma fuerza iónica que la corriente de tampón de neutralización descrita anteriormente. La fuerza iónica se puede ajustar hacia arriba o hacia abajo según sea necesario para conseguir la rigurosidad correcta de la hibridación. En etapa de procesamiento final de la matriz, las partículas hibridadas se pueden hacer impactar y salir de la corriente de hibridación a una corriente de tampón de lavado final. Este tampón de lavado final se elige de acuerdo con la aplicación posterior que se utilizará (secuenciación en el caso de aplicaciones 454/Ion, clasificación de partículas fluorescentes en el caso del ensayo BEAMing). Las partículas hibridadas y lavadas se recogen del puerto de salida del tampón de lavado final situado cerca de la esquina inferior derecha de la matriz.In some cases, the devices, methods, compositions, systems, and / or kits provided herein process smaller nucleic acid molecules by attaching the nucleic acids to microparticles that are adapted to impact an impact matrix (e.g., DLD matrix. ). Microparticles can act as carriers for transporting the bound nucleic acids through nucleic acid modification reagent streams. For example, primer-modified microparticle emulsion PCR can be used for the generation of DNA sequencing template beads (Ion Torrent and 454 sequencing methods; Rothberg et al. 2011. Nature v475, pp348-352; Margulies et al. , Nature. V437, pp 376-380). In some cases, emulsion PCR methods can be used to assess the frequency of rare mutant genes in tissues from cancer patients ("BEAMing" method of Vogelstein, Diehl et al. Nature Methods. 2006 v3 pp 551-559). In some instances, the devices, methods, compositions, systems, and / or kits provided herein are used to process particle-based emulsion PCR by combining primer washing, denaturation, and hybridization in a single matrix process. impact. For example, an impact matrix can be designed by choosing a post space such that the critical diameter of the matrix can be less than that of the microparticles used for emulsion PCR. This can ensure that the microparticles can consistently impact at all positions within the matrix. After emulsion PCR, the emulsion can be broken down and the aqueous fraction of particles can be introduced into a device comprising an impact matrix as provided herein near the upper left corner. As the particles enter the matrix, the particles can be deflected toward an opposite boundary wall, while the PCR reagents can flow downward in the general flow direction. A suitable wash buffer can be inserted into the top of the array immediately to the right of the particle inlet port. As the particles impact and move away from the input stream, the particles can pass through the wash buffer stream, which can remove additional PCR reagent. As the particles move down the matrix, the particles can enter a denaturing reagent stream (for example, which can contain about 20-200 mM NaOH or KOH with about 1-10 mM EDTA), which can convert the double-stranded amplicons of the particles in single-stranded form. The non-covalently bound amplicon strand can be removed from the matrix with the denaturing current, and the particles can be impacted and drifted to the right in a neutralization buffer that may be suitable for hybridization reactions in the next step. In general, such a neutralization buffer may contain a buffer (eg, 20-200 mM Tris-HCl, pH 7.5-8.0) and monovalent ions to support hybridization (eg, 20-500 mM NaCl). The particles can then be impacted through a hybridization reagent stream containing a sequencing primer (in the case of the 454 / Ion Torrent applications) or a labeled oligonucleotide probe (in the case of the BEAMing application). The reagent stream can have oligonucleotide probes in the low micromolar concentration range (from about 0.1 micromolar to about 50 micromolar), and can have about the same ionic strength as the neutralization buffer stream described above. The ionic strength can be adjusted up or down as necessary to achieve the correct stringency of hybridization. In the final matrix processing step, the hybridized particles can be impacted and exited from the hybridization stream into a stream of final wash buffer. This final wash buffer is chosen according to the subsequent application to be used (sequencing in the case of 454 / Ion applications, sorting of fluorescent particles in the case of the BEAMing assay). Hybridized and washed particles are collected from the final wash buffer outlet port located near the lower right corner of the array.

VII. Aplicaciones posterioresVII. Subsequent applications

Las partículas procesadas (por ejemplo, procesadas o tratadas química o enzimáticamente), purificadas, aisladas y/o concentradas utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento pueden almacenarse y/o usarse en aplicaciones posteriores. En el presente documento se describen varias aplicaciones para partículas que se han procesado (por ejemplo, procesadas o tratadas químicamente), purificadas, aisladas y/o concentradas utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento.The particles processed (eg, chemically or enzymatically processed or treated), purified, isolated, and / or concentrated using methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be stored and / or used in downstream applications. Described herein are various applications for particles that have been processed (eg, processed or chemically treated), purified, isolated, and / or concentrated using methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein.

Aunque esta divulgación analiza el procesamiento de leucocitos y células madre para citometría de flujo, la misma tecnología puede utilizarse para múltiples pruebas celulares nuevas y existentes y otras pruebas (por ejemplo, ADN, ARN) para el cáncer y otras enfermedades.Although this disclosure discusses leukocyte and stem cell processing for flow cytometry, the same technology can be used for multiple new and existing cell tests and other tests (eg, DNA, RNA) for cancer and other diseases.

En algunos casos, los dispositivos, composiciones, sistemas, kits y/o métodos descritos en el presente documento se utilizan para preparar muestras para la secuenciación de ácidos nucleicos (por ejemplo, a Dn o ARN). Los ácidos nucleicos se pueden aislar de cualquier tipo de célula, entre las que se incluyen los procariotas, eucariotas, arqueas, organismos unicelulares, organismos o tejidos multicelulares (por ejemplo, plantas o animales) y similares. El ácido nucleico se puede secuenciar de cualquier manera, incluyendo la secuenciación de una sola molécula o de escopeta, en un nanoporo, mediante la detección de un cambio en el pH en acontecimientos de incorporación de nucleótidos, por detección de fluorescencia de colorantes incorporados o liberados, etc. Las células se lisan y el ácido nucleico se separa de los restos celulares utilizando las matrices de postes tal como se describe en el presente documento. El ácido nucleico puede concentrarse a cualquier concentración adecuada y/o purificarse a cualquier pureza adecuada (por ejemplo, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, al menos un 99,9 % y similares).In some cases, the devices, compositions, systems, kits, and / or methods described herein are used to prepare samples for nucleic acid sequencing (eg, to Dn or RNA). Nucleic acids can be isolated from any type of cell, including prokaryotes, eukaryotes, archaea, single-celled organisms, multicellular organisms or tissues (eg, plants or animals), and the like. Nucleic acid can be sequenced in any way, including single molecule or shotgun sequencing, in a nanopore, by detecting a change in pH in nucleotide incorporation events, by fluorescence detection of incorporated or released dyes , etc. Cells are lysed and nucleic acid is separated from cell debris using post arrays as described herein. Nucleic acid can be concentrated to any suitable concentration and / or purified to any suitable purity (eg, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 99% , at least 99.9% and the like).

A. Banco de sangre (por ejemplo, Crioconservación)A. Blood bank (for example, Cryopreservation)

En algunos casos, la sangre se separa en componentes usando dispositivos y métodos descritos en el presente documento, y los componentes se almacenan. En algunos casos, los eritrocitos se aíslan o se purifican. En algunos casos, los eritrocitos se almacenan a una temperatura de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 ° C. En algunos casos, los eritrocitos se almacenan durante aproximadamente 20 a aproximadamente 60 días, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 días, o hasta 42 días. En algunos casos, los eritrocitos se congelan (por ejemplo, con un crioprotector, por ejemplo, glicerol) y se almacenan a, por ejemplo, menos de -60 °C, por ejemplo, durante al menos 10 años. En algunos casos, los eritrocitos almacenados se utilizan para transfusiones. En algunos casos, se administran eritrocitos aislados a un paciente después de un traumatismo, cirugía, pérdida de sangre o a un paciente con un trastorno sanguíneo, por ejemplo, anemia de células falciformes.In some cases, blood is separated into components using devices and methods described herein. document, and the components are stored. In some cases, the erythrocytes are isolated or purified. In some cases, erythrocytes are stored at a temperature of about 1 to about 6 ° C. In some cases, erythrocytes are stored for about 20 to about 60 days, or about 30 to about 50 days, or up to 42 days. In some cases, erythrocytes are frozen (eg with a cryoprotectant, eg glycerol) and stored at eg less than -60 ° C eg for at least 10 years. In some cases, the stored red blood cells are used for transfusions. In some cases, isolated erythrocytes are administered to a patient after trauma, surgery, blood loss, or to a patient with a blood disorder, eg, sickle cell anemia.

En algunos casos, el plasma se aísla y se congela para su uso posterior. En algunos casos, el plasma se almacena durante hasta un año. El plasma puede administrarse a un sujeto, por ejemplo, un paciente quemado, sujeto en shock o sujeto con un trastorno hemorrágico.In some cases, the plasma is isolated and frozen for later use. In some cases, plasma is stored for up to a year. The plasma can be administered to a subject, for example, a burned patient, subject in shock, or subject with a bleeding disorder.

En algunos casos, las plaquetas se aíslan. En algunos casos, las plaquetas se aíslan, por ejemplo, para transfusión. En algunos casos, las plaquetas aisladas se almacenan a temperatura ambiente, por ejemplo, durante aproximadamente 5 a 7 días. En algunos casos, las plaquetas se administran a un sujeto con cáncer, con un trasplante de órganos o a un sujeto que se está sometiendo o se ha sometido a una cirugía.In some cases, platelets are isolated. In some cases, platelets are isolated, for example, for transfusion. In some cases, isolated platelets are stored at room temperature, for example, for about 5 to 7 days. In some cases, platelets are administered to a subject with cancer, an organ transplant, or a subject who is undergoing or has undergone surgery.

En algunos casos, un componente sanguíneo aislado es el factor antihemofílico crioprecipitado (AHF crioprecipitado). El AHF crioprecipitado se puede almacenar congelado durante aproximadamente un año. En algunos casos, el AHF crioprecipitado se administra a un sujeto con hemofilia o enfermedad de Von Willebrand.In some cases, an isolated blood component is cryoprecipitated antihemophilic factor (cryoprecipitated AHF). Cryoprecipitated AHF can be stored frozen for approximately one year. In some cases, the cryoprecipitated AHF is administered to a subject with hemophilia or Von Willebrand disease.

Otros componentes sanguíneos que pueden aislarse y almacenarse son los granulocitos. En algunos casos, los granulocitos se utilizan para transfusión dentro de las 24 horas posteriores a la recolección. En algunos casos, los granulocitos se administran a sujetos para tratar infecciones que no responden a la terapia con antibióticos.Other blood components that can be isolated and stored are granulocytes. In some cases, granulocytes are used for transfusion within 24 hours of collection. In some cases, granulocytes are given to subjects to treat infections that do not respond to antibiotic therapy.

En algunos casos, los linfocitos se aíslan y pueden almacenarse, con o sin modificación genética, antes de la administración a pacientes con cáncer o enfermedades infecciosas u otras.In some cases, the lymphocytes are isolated and can be stored, with or without genetic modification, prior to administration to patients with cancer or infectious or other diseases.

En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se conservan, por ejemplo, se crioconservan. Se describen métodos de crioconservación, por ejemplo, en Berz et al (2007) Cryopreservation of Hematopoietic Stem Cells. Am J Hematol. 82: 463-472. En algunos casos, se añade una solución heparinizada de plasmalyte y/o dimetilsulfóxido (DMSO) (por ejemplo, DMSO al 10%) a las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, HSC. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, las HSC se encuentran en una solución con una concentración final de DMSO inferior al 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5 % de DMSO. En algunos casos, las partículas, por ejemplo, células, por ejemplo, HSC, están en una solución con una concentración final de DMSO de aproximadamente el 2 a aproximadamente el 10 %, o de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 15 %. En algunos casos, los leucocitos se crioconservan.In some cases, purified particles, eg cells, eg stem cells, eg HSC, are preserved eg cryopreserved. Cryopreservation methods are described, for example, in Berz et al (2007) Cryopreservation of Hematopoietic Stem Cells. Am J Hematol. 82: 463-472. In some cases, a heparinized solution of plasmalyte and / or dimethylsulfoxide (DMSO) (eg, 10% DMSO) is added to the purified particles, eg , cells, eg , HSC. In some cases, the purified particles, for example HSCs, are in a solution with a final DMSO concentration of less than 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, or 0.5% DMSO. In some cases, the particles, eg, cells, eg, HSC, are in solution with a final DMSO concentration of from about 2 to about 10%, or from about 5% to about 15%. In some cases, the leukocytes are cryopreserved.

En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se combinan con solución salina o albúmina sérica. En algunos casos, el crioprotector es hidroxietil almidón (HES), propilenglicol, alfa tocoferol, catalasa, ácido ascórbico, trehalosa o inhibidor de caspasa (por ejemplo, zVAD-fmk). En algunos casos, el crioprotector es un glicol (por ejemplo, etilenglicol, propilenglicol o glicerol). En algunos casos, el crioprotector es 2-metil-2,4-pentanodiol (MPD). En algunos casos, el crioprotector es sacarosa. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se mezclan con más de un crioprotector.In some cases, purified particles, eg cells, eg stem cells, eg HSC, are combined with saline or serum albumin. In some cases, the cryoprotectant is hydroxyethyl starch (HES), propylene glycol, alpha tocopherol, catalase, ascorbic acid, trehalose, or caspase inhibitor (eg, zVAD-fmk). In some cases, the cryoprotectant is a glycol (eg, ethylene glycol, propylene glycol, or glycerol). In some cases, the cryoprotectant is 2-methyl-2,4-pentanediol (MPD). In some cases, the cryoprotectant is sucrose. In some cases, purified particles, eg cells, eg stem cells, eg HSC, are mixed with more than one cryoprotectant.

En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, HSC, se congelan a una temperatura inferior a 5 °C, a -79 °C, menor de -155 °C o menor de -195 °C. En algunas realizaciones, las partículas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se congelan a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente -80 °C, -156 °C o -196 °C. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se congelan a una temperatura de aproximadamente -196 °C a aproximadamente -80 °C. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se almacenan en una fase líquida de un tanque de nitrógeno. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se almacenan en una fase de vapor de nitrógeno.In some cases, purified particles, for example cells, for example stem cells, HSC, are frozen at a temperature below 5 ° C, at -79 ° C, below -155 ° C or below -195 ° C. In some embodiments, the particles, eg, cells, eg, stem cells, eg, HSC, are frozen at a temperature of from about 4 ° C to about -80 ° C, -156 ° C, or -196 ° C. In some cases, purified particles, eg cells, eg stem cells, eg HSC, are frozen at a temperature of from about -196 ° C to about -80 ° C. In some cases, purified particles, eg cells, eg stem cells, eg HSC, are stored in a liquid phase of a nitrogen tank. In some cases, purified particles, eg cells, eg stem cells, eg HSC, are stored in a nitrogen vapor phase.

En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se congelan a una velocidad de congelación controlada, por ejemplo, a una velocidad de 1-2 °C/min hasta un punto de temperatura de aproximadamente -40 °C. Entonces, el proceso de congelación hasta un objetivo de -120 °C se puede realizar a un ritmo más rápido, de aproximadamente 3-5 °C/min. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, HSC, se enfrían a una temperatura de -4 °C, y después se colocan en un congelador a -80 °C.In some cases, purified particles, for example cells, for example stem cells, for example HSC, are frozen at a controlled freezing rate, for example at a rate of 1-2 ° C / min to a point temperature of about -40 ° C. Then the freezing process to a target of -120 ° C can be done at a faster rate, of about 3-5 ° C / min. In some cases, purified particles, eg cells, eg HSC, are cooled to -4 ° C, and then placed in a -80 ° C freezer.

En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se crioconservan durante al menos 1, 10, 30, 180 o 365 días. En algunos casos, las HSC se crioconservan durante al menos 1, 5, 10, 20, 30, 50, 75 o 100 años.In some cases, purified particles, eg, cells, eg, stem cells, eg, HSC, are cryopreserved for at least 1, 10, 30, 180, or 365 days. In some cases, HSCs are cryopreserved for at least minus 1, 5, 10, 20, 30, 50, 75 or 100 years.

En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se crioconservan a una densidad menor de 10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 células/ml. En algunos casos, las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se crioconservan a una densidad de al menos 10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 células/ml.In some cases, purified particles, eg cells, eg stem cells, eg HSC, are cryopreserved at a density less than 10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7 , 10-6, 10-5 cells / ml. In some cases, purified particles, eg cells, eg stem cells, eg HSC, are cryopreserved at a density of at least 10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10- 7, 10-6, 10-5 cells / ml.

En algunos casos, las partículas purificadas crioconservadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se descongelan a 37 °C (por ejemplo, en un baño de agua, almohadillas de gel). En algunos casos, las partículas purificadas crioconservadas, por ejemplo, células, por ejemplo, HSC, se descongelan a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 37 °C.In some cases, cryopreserved purified particles, eg, cells, eg, stem cells, eg, HSC, are thawed at 37 ° C (eg, in a water bath, gel pads). In some cases, cryopreserved purified particles, eg cells, eg HSC, are thawed at a temperature of from about 0 ° C to about 37 ° C.

En algunos casos, se elimina el crioconservante (por ejemplo, DMSO) por lavado de las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, muestra de HSC después de la descongelación. En algunos casos, una partícula purificada descongelada, por ejemplo, célula, por ejemplo, célula madre, por ejemplo, muestra de HSC, se diluye en albúmina de suero humano (HSA) (por ejemplo, 2,5 %) y dextrano 40 (por ejemplo, 5 %). La muestra después se puede centrifugar o pasar a través de un dispositivo microfluídico descrito en el presente documento, por ejemplo, a una temperatura de 10 °C. En algunos casos, se añade una solución de HSA/dextrano a las partículas purificadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC de nuevo. En algunos casos, la concentración de DMSO es menor del 1,7 %, por ejemplo, mediante lavado y/o dilución. En algunos casos, se infunden en un sujeto células madre, por ejemplo, HSC con una concentración de DMSO de menos del 1,7 %.In some cases, the cryopreservative (eg, DMSO) is removed by washing the purified particles, eg, cells, eg, HSC sample after thawing. In some cases, a thawed purified particle, eg cell, eg stem cell, eg HSC sample, is diluted in human serum albumin (HSA) (eg 2.5%) and dextran 40 ( for example, 5%). The sample can then be centrifuged or passed through a microfluidic device described herein, for example, at a temperature of 10 ° C. In some cases, a HSA / dextran solution is added to the purified particles, eg cells, eg stem cells, eg HSC again. In some cases, the DMSO concentration is less than 1.7%, for example, by washing and / or dilution. In some cases, a subject is infused with stem cells, for example, HSC with a DMSO concentration of less than 1.7%.

En algún caso, las partículas purificadas crioconservadas, por ejemplo, células, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se almacenan en un recipiente. En algunos casos, el recipiente es un recipiente de etinil vinil acetato (EVA). En algunos casos, el recipiente se irradia con rayos gamma. En algunos casos, el recipiente es un recipiente de acero inoxidable. En algunos casos, el recipiente comprende, PVC, poliolefina o polietileno. En algunos casos, el recipiente comprende teflón, Kaplon, FEP y/o poliimida.In some cases, cryopreserved purified particles, eg cells, eg stem cells, eg HSC, are stored in a container. In some cases, the container is an Ethinyl Vinyl Acetate (EVA) container. In some cases, the container is irradiated with gamma rays. In some cases, the container is a stainless steel container. In some cases, the container comprises PVC, polyolefin, or polyethylene. In some cases, the container comprises Teflon, Kaplon, FEP, and / or polyimide.

En algunos casos, las células purificadas, por ejemplo, células madre, por ejemplo, HSC, se evalúan mediante recuento de células para determinar el total de células nucleadas y células CD34+ (por ejemplo, mediante citometría de flujo); por exclusión de azul tripán para determinar la viabilidad, con 7-acinoactinomicina para determinar la viabilidad o con yoduro de propidio para determinar la viabilidad; o por injerto en NOD/SCID (ratones inmunodeficientes) o un ensayo clonogénico (por ejemplo, ensayo CFU-Sd12 en ratones; CFU-GM; CFU-GEMM; BFU-E o LTC-IC).In some cases, purified cells, eg, stem cells, eg, HSC, are evaluated by cell counting for total nucleated cells and CD34 + cells (eg, by flow cytometry); by exclusion of trypan blue to determine viability, with 7-acinoactinomycin to determine viability or with propidium iodide to determine viability; or by grafting into NOD / SCID (immunodeficient mice) or a clonogenic assay (eg CFU-Sd12 assay in mice; CFU-GM; CFU-GEMM; BFU-E or LTC-IC).

B. Tratamiento de cánceresB. Treatment of cancers

En algunos casos, las células madre aisladas, purificadas y/o concentradas, por ejemplo, HSC, se pueden utilizar para tratar cánceres, por ejemplo, cáncer de la sangre, por ejemplo, leucemia o linfoma. En algunos casos, las células madre aisladas, purificadas y/o concentradas, por ejemplo, HSC, se obtienen de un sujeto y posteriormente se administran al mismo sujeto. Las células madre pueden desplazarse a la médula ósea y comenzar a producir nuevas células sanguíneas.In some cases, isolated, purified and / or concentrated stem cells, for example HSC, can be used to treat cancers, for example blood cancer, for example leukemia or lymphoma. In some cases, isolated, purified, and / or concentrated stem cells, eg, HSC, are obtained from a subject and subsequently administered to the same subject. Stem cells can travel to the bone marrow and start making new blood cells.

En algunos casos, las células madre, por ejemplo, HSC, se obtienen de un primer sujeto y se administran a un segundo sujeto (por ejemplo, pariente, por ejemplo, hermana o hermano del primer sujeto). En algunos casos, el primer sujeto y el segundo sujeto no son parientes. En algunos casos, el segundo sujeto es un donante compatible. En algunos casos, el primer sujeto y el segundo sujeto tienen antígenos leucocitarios humanos similares. En algunos casos, el primer sujeto y el segundo sujeto no tienen antígenos leucocitarios humanos similares. En algunos casos, a un sujeto diagnosticado o sospechoso de tener, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia mielógena crónica (CML), enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple o linfoma no Hodgkin se le administran HSC.In some cases, stem cells, eg, HSC, are obtained from a first subject and administered to a second subject (eg, relative, eg, sister or brother of the first subject). In some cases, the first subject and the second subject are not related. In some cases, the second subject is a compatible donor. In some cases, the first subject and the second subject have similar human leukocyte antigens. In some cases, the first subject and the second subject do not have similar human leukocyte antigens. In some cases, a subject diagnosed or suspected of having acute lymphoblastic leukemia, acute myeloblastic leukemia, chronic myelogenous leukemia (CML), Hodgkin's disease, multiple myeloma, or non-Hodgkin's lymphoma is administered HSC.

En algunos casos, la administración de células madre a un sujeto comprende el uso de una vía intravenosa (IV). En algunos casos, el trasplante tarda entre 1 y 5 horas aproximadamente. Después de entrar en el torrente sanguíneo, las células pueden desplazarse a la médula ósea. El injerto (producción normal de sangre) puede tener lugar dentro de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 semanas después del trasplante. En algunos casos, los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y kits descritos en el presente documento se utilizan para controlar un injerto. In some cases, the administration of stem cells to a subject comprises the use of an intravenous (IV) line. In some cases, the transplant takes about 1 to 5 hours. After entering the bloodstream, the cells can travel to the bone marrow. The graft (normal blood production) can take place within about 2 to about 4 weeks after transplantation. In some cases, the methods, compositions, devices, systems, and kits described herein are used to monitor a graft.

En algunos casos, un sujeto recibe un trasplante de médula ósea (BMT). En algunos casos, un sujeto recibe un trasplante de células madre de sangre periférica (PBSCT). En algunos casos, el trasplante es un trasplante autólogo (el sujeto recibe sus propias células madre).In some cases, a subject receives a bone marrow transplant (BMT). In some cases, a subject receives a peripheral blood stem cell transplant (PBSCT). In some cases, the transplant is an autologous transplant (the subject receives their own stem cells).

En algunos casos, el trasplante es un trasplante singénico (un sujeto recibe células madre de su gemelo idéntico). En algunos casos, el trasplante es un trasplante alogénico (un sujeto recibe células madre de su hermano, hermana, padre, madre o persona no relacionada con el sujeto.In some cases, the transplant is a syngeneic transplant (a subject receives stem cells from his identical twin). In some cases, the transplant is an allogeneic transplant (a subject receives stem cells from his brother, sister, father, mother, or person not related to the subject.

En algunos casos, las células madre se purifican de la médula ósea en el hueso pélvico o el esternón. En algunos casos, Las PBSC se procesan y/o purifican mediante aféresis o leucocitaféresis. En algunos casos, las células madre se procesan y/o purifican del cordón umbilical o la placenta.In some cases, stem cells are purified from the bone marrow in the pelvic bone or sternum. In some In cases, PBSCs are processed and / or purified by apheresis or leukapheresis. In some cases, stem cells are processed and / or purified from the umbilical cord or placenta.

En algunos casos, se administran células madre aisladas, purificadas, procesadas o concentradas, por ejemplo, HSC, a un sujeto con CML, y al sujeto también se le administra mesilato de imatinib (Gleevec™). En algunos casos, al sujeto se le administran células madre, por ejemplo, HSC sin recibir mesilato de imatinib.In some cases, isolated, purified, processed, or concentrated stem cells, eg, HSC, are administered to a subject with CML, and the subject is also administered imatinib mesylate (Gleevec ™). In some cases, the subject is administered stem cells, for example, HSC without receiving imatinib mesylate.

En algunos casos, el sujeto que recibe células madre, por ejemplo, HSC, es resistente a la quimioterapia.In some cases, the subject receiving stem cells, eg HSC, is resistant to chemotherapy.

En algunos casos, el sujeto que recibe células madre, por ejemplo, HSC, es un recién nacido, lactante, niño, adolescente, adulto joven, persona de mediana edad o anciano.In some cases, the subject receiving stem cells, eg, HSC, is a newborn, infant, child, adolescent, young adult, middle-aged person, or elderly person.

En algunos casos, el sujeto que recibe células madre, por ejemplo, HSC, tiene neuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas o enfermedad granulomatosa crónica.In some cases, the subject receiving stem cells, eg, HSC, has neuroblastoma, Ewing's sarcoma, desmoplastic small round cell tumor, or chronic granulomatous disease.

En algunos casos, se utiliza un minitrasplante. En algunos casos, se utiliza un trasplante en tándem, que implica dos ciclos secuenciales de quimioterapia de dosis alta y trasplante de células madre.In some cases, a mini transplant is used. In some cases, a tandem transplant is used, which involves two sequential cycles of high-dose chemotherapy and stem cell transplantation.

En algunos casos, a un sujeto, por ejemplo, a un paciente con cáncer, se le administra radiación o quimioterapia, y la radiación o quimioterapia se dirige a las células hematopoyéticas, que pueden destruirse por radiación o quimioterapia. En algunos casos, se pueden trasplantar al sujeto HSC aisladas, purificadas, procesadas y/o concentradas del sujeto para reemplazar las células destruidas por la quimioterapia. La introducción de las propias HSC del sujeto puede reducir la posibilidad de un desajuste inmunológico o de una enfermedad de injerto contra huésped. En algunos casos, solo se trasplantan células Tby-1+ CD34+ al sujeto.In some cases, a subject, for example a cancer patient, is given radiation or chemotherapy, and the radiation or chemotherapy targets hematopoietic cells, which can be destroyed by radiation or chemotherapy. In some cases, isolated, purified, processed, and / or concentrated HSCs from the subject can be transplanted into the subject to replace cells destroyed by chemotherapy. The introduction of the subject's own HSCs may reduce the possibility of immune mismatch or graft-versus-host disease. In some cases, only Tby-1 + CD34 + cells are transplanted into the subject.

En algunos casos, se administran células madre a un sujeto que está en remisión (los signos y síntomas del cáncer han desaparecido).In some cases, stem cells are given to a subject who is in remission (the signs and symptoms of the cancer have disappeared).

En algunos casos, el trasplante de células madre procesadas y/o purificadas utilizando métodos y dispositivos descritos en el presente documento puede dar como resultado una reducción del riesgo de enfermedad de injerto contra huésped de al menos un 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % en relación con el trasplante de células madre purificadas por métodos convencionales.In some cases, transplantation of processed and / or purified stem cells using methods and devices described herein may result in a reduction in the risk of graft-versus-host disease of at least 1,2,3,4,5. , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 , 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 .81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% relative to purified stem cell transplantation by conventional methods.

En algunos casos, el sujeto al que se le administran células madre tiene uno o más de los siguientes cánceres: leucemia mieloide aguda; cáncer de vejiga, incluyendo tumores del tracto superior y carcinoma urotelial de próstata; cáncer de hueso, incluyendo condrosarcoma, sarcoma de Ewing y osteosarcoma; cáncer de mama, incluyendo no invasivo, invasivas, tumores filoides, enfermedad de Paget y cáncer de mama durante el embarazo; cánceres del sistema nervioso central, astrocitoma/oligodendroglioma supratentorial infiltrativo de bajo grado en adultos, ependimoma intracraneal adulto, astrocitoma anaplásico/oligodendroglioma anaplásico/glioblastoma multiforme, lesiones metastásicas limitadas (1-3), lesiones metastásicas múltiples (> 3), meningitis linfomatosa carcinomatosa, linfoma primario del SNC no inmunodeprimido y tumores de la columna metastásicos; cáncer cervicouterino; leucemia mielógena crónica (CML); cáncer de colon, cáncer rectal, carcinoma anal; cáncer de esófago; cáncer gástrico (estómago); cánceres de cabeza y cuello, incluyendo tumores del seno etmoidal, tumores del seno maxilar, tumores de las glándulas salivales, cáncer de labio, cáncer de boca, cáncer de orofaringe, cáncer de hipofaringe, cáncer primario oculto, cáncer de laringe glótica, cáncer de laringe supraglótica, cáncer de nasofaringe y cáncer avanzado de cabeza y cuello; cánceres hepatobiliares, incluido el carcinoma hepatocelular, cáncer de vesícula biliar, colangiocarcinoma intrahepático y colangiocarcinoma extrahepático; enfermedad/linfoma de Hodgkin; cáncer de riñón; melanoma; mieloma múltiple, amiloidosis sistémica de cadenas ligeras, macroglobulinemia de Waldenstrom; síndromes mielodisplásicos; tumores neuroendocrinos, incluida la neoplasia endocrina múltiple, tipo 1, neoplasia endocrina múltiple, tipo 2, tumores carcinoides, tumores de células de los islotes, feocromocitoma, carcinoides pulmonares poco diferenciados/de células pequeñas/atípicos; linfomas no Hodgkin, incluida la leucemia linfocítica crónica de linfocitos B/linfoma microlinfocítico, linfoma folicular, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma linfoblástico, linfoma de células B relacionado con el SIDA, linfoma periférico de células T y micosis fungoide/síndrome de Sezary; cánceres de piel no melanoma, incluidos los cánceres de piel de células basales y escamosas, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel; cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), incluyendo neoplasias tímicas; cáncer primario oculto; cáncer de ovario, incluido el cáncer epitelial de ovario, cáncer de ovario epitelial límite (bajo potencial maligno) e histologías de ovario menos comunes; adenocarcinoma pancreático; cáncer de próstata; cáncer de pulmón de células pequeñas y tumores neuroendocrinos de pulmón; sarcoma de tejidos blandos, incluyendo extremidades de tejidos blandos, retroperitoneal, sarcoma intraabdominal y desmoide; cáncer testicular; neoplasias tímicas, incluido el carcinoma de tiroides, evaluación de nódulos, carcinoma papilar, carcinoma folicular, neoplasia de células de Hiirthle, carcinoma medular y carcinoma anaplásico; neoplasias uterinas, incluido el cáncer de endometrio o sarcoma uterino. In some cases, the subject given stem cells has one or more of the following cancers: acute myeloid leukemia; bladder cancer, including upper tract tumors and urothelial carcinoma of the prostate; bone cancer, including chondrosarcoma, Ewing's sarcoma, and osteosarcoma; breast cancer, including non-invasive, invasive, phyllodes tumors, Paget's disease, and breast cancer during pregnancy; central nervous system cancers, low-grade infiltrative supratentorial astrocytoma / oligodendroglioma in adults, adult intracranial ependymoma, anaplastic astrocytoma / anaplastic oligodendroglioma / glioblastoma multiforme, limited metastatic lesions (1-3), multiple metastatic carcinoma lesions (> 3) , nonimmunosuppressed primary CNS lymphoma and metastatic spinal tumors; cervical cancer; chronic myelogenous leukemia (CML); colon cancer, rectal cancer, anal carcinoma; esophagus cancer; gastric (stomach) cancer; head and neck cancers, including ethmoid sinus tumors, maxillary sinus tumors, salivary gland tumors, lip cancer, mouth cancer, oropharyngeal cancer, hypopharyngeal cancer, occult primary cancer, glottic laryngeal cancer, cancer of the supraglottic larynx, nasopharyngeal cancer, and advanced head and neck cancer; hepatobiliary cancers, including hepatocellular carcinoma, gallbladder cancer, intrahepatic cholangiocarcinoma, and extrahepatic cholangiocarcinoma; Hodgkin's disease / lymphoma; kidney cancer; melanoma; multiple myeloma, systemic light chain amyloidosis, Waldenstrom's macroglobulinemia; myelodysplastic syndromes; neuroendocrine tumors, including multiple endocrine neoplasia, type 1, multiple endocrine neoplasia, type 2, carcinoid tumors, islet cell tumors, pheochromocytoma, poorly differentiated / small cell / atypical lung carcinoids; Non-Hodgkin's lymphomas, including B-cell chronic lymphocytic leukemia / micro-lymphocytic lymphoma, follicular lymphoma, marginal zone lymphoma, mantle cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, lymphoblastic lymphoma, related B-cell lymphoma with AIDS, peripheral T-cell lymphoma and mycosis fungoides / Sezary syndrome; non-melanoma skin cancers, including basal and squamous cell skin cancers, dermatofibrosarcoma protuberans, Merkel cell carcinoma; non-small cell lung cancer (NSCLC), including thymic neoplasms; occult primary cancer; ovarian cancer, including epithelial ovarian cancer, borderline epithelial ovarian cancer (low malignant potential), and less common ovarian histologies; pancreatic adenocarcinoma; prostate cancer; small cell lung cancer and neuroendocrine lung tumors; soft tissue sarcoma, including soft tissue extremities, retroperitoneal, intra-abdominal and desmoid sarcoma; Testicular cancer; thymic neoplasms, including thyroid carcinoma, nodule evaluation, papillary carcinoma, follicular carcinoma, Hiirthle cell neoplasia, medullary carcinoma, and anaplastic carcinoma; uterine neoplasms, including endometrial cancer or uterine sarcoma.

En algunos casos, las células madre, por ejemplo, HSC se procesan, purifican, aíslan y/o concentran, por ejemplo, de un sujeto HLA compatible, y las HSC se trasplantan a otra persona, por ejemplo, un hermano del sujeto, en donde el hermano tiene cáncer. En algunos casos, las células madre hematopoyéticas trasplantadas muestran actividad antitumoral (tratamiento del cáncer de injerto contra tumor).In some cases, stem cells, for example, HSCs are processed, purified, isolated and / or concentrated, for example, from an HLA-matched subject, and the HSCs are transplanted to another person, for example, a sibling of the subject, in where the brother has cancer. In some cases, the transplanted hematopoietic stem cells show antitumor activity (graft versus tumor cancer treatment).

En algunos casos, Se usan células asesinas naturales (NK) en inmunoterapia, por ejemplo, para el cáncer, por ejemplo, leucemia. Se describen usos de las células NK, por ejemplo, en Grywacz et al. (2008) Use of natural killer cells as immunotherapy for leukaemia. Best Pract Res Clin Haematol. 3: 467-483 y Miller (2013) Therapeutic applications: natural killer cells in the clinic. Hematology 2013:247-253.In some cases, Natural Killer (NK) cells are used in immunotherapy, for example, for cancer, for example, leukemia. Uses of NK cells are described, for example, in Grywacz et al. (2008) Use of natural killer cells as immunotherapy for leukemia. Best Pract Res Clin Haematol. 3: 467-483 and Miller (2013) Therapeutic applications: natural killer cells in the clinic. Hematology 2013: 247-253.

C. Diagnóstico de cáncerC. Cancer diagnosis

En algunos casos, las células aisladas utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y kits descritos en el presente documento se utilizan para diagnosticar un cáncer descrito en el presente documento, por ejemplo, un cáncer de sangre, por ejemplo, leucemia, linfoma o mieloma. En algunos casos, la leucemia es leucemia linfoblástica aguda de adultos, leucemia linfoblástica aguda infantil, leucemia mieloide aguda de adultos, leucemia mieloide aguda infantil, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica o leucemia de células pilosas. En algunos casos, el linfoma es un linfoma relacionado con el SIDA, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin de adultos, linfoma de Hodgkin infantil, micosis fungoide, linfoma no Hodgkin de adultos, linfoma no Hodgkin infantil, linfoma primario del sistema nervioso central, síndrome de Sezary, linfoma cutáneo de células T o macroglobulinemia de Waldenstrom. En algunos casos, el cáncer de sangre es un trastorno mieloproliferativo crónico, histiocitosis de células de Langerhans, mieloma múltiple, neoplasia de células plasmáticas, un síndrome mielodisplásico, una neoplasia mielodisplásica/mieloproliferativa.In some instances, cells isolated using the methods, compositions, devices, systems, and kits described herein are used to diagnose a cancer described herein, eg, a blood cancer, eg, leukemia, lymphoma, or myeloma In some cases, the leukemia is adult acute lymphoblastic leukemia, childhood acute lymphoblastic leukemia, adult acute myeloid leukemia, childhood acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, or hairy cell leukemia. In some cases, the lymphoma is an AIDS-related lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, adult Hodgkin lymphoma, childhood Hodgkin lymphoma, mycosis fungoides, adult non-Hodgkin lymphoma, childhood non-Hodgkin lymphoma, primary nervous system lymphoma central syndrome, Sezary syndrome, cutaneous T-cell lymphoma, or Waldenstrom's macroglobulinemia. In some cases, blood cancer is a chronic myeloproliferative disorder, Langerhans cell histiocytosis, multiple myeloma, plasma cell neoplasia, a myelodysplastic syndrome, a myelodysplastic / myeloproliferative neoplasia.

En algunos casos, los leucocitos se evalúan con un panel de investigación de leucemia y linfoma. En algunos casos, se utiliza un panel de investigación para buscar conjuntos de proteínas, por ejemplo, proteínas de la superficie celular y/o intracelulares que sirven como señalizadores para subtipos de leucocitos normales y neoplasias malignas hematológicas. En algunos casos, el panel se evalúa con citometría de flujo. El panel puede ser, por ejemplo, un panel de anticuerpos multicolor BD Euroflow (véase http://www.bdbiosciences.com/eu/documents/EuroFlow_datasheet_new.pdf). El señalizador en el panel de anticuerpos multicolor BD Euroflow puede ser, por ejemplo, CD-11c CD22, Cd 24, CD45, CD49d, CD 123, Igk, CD10, CD27, CD38, CD43, CD81, TCRyS, microglobulina (3-2, CD9, CD71, CD79b, 1gA, IREM-2 (CD300e), CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD16, CD16, CD20, CD23, CD36, CD38, CD41a, CD42a, CD45, CD56, CD64, CD105, CD138, CD200, IgA, IgK y HLA-DR. El marcador (por ejemplo, fluorocromo) asociado con el señalizador en el panel de anticuerpos multicolor BD Euroflow puede ser FITC, PE, V450, PE-Cy™7, PerCP-Cy5.5, APC-H7, V500-C, APC, PacB o PacO. In some cases, the white blood cells are evaluated with a leukemia and lymphoma research panel. In some cases, a research panel is used to search for protein assemblages, eg, cell surface and / or intracellular proteins that serve as markers for normal leukocyte subtypes and hematologic malignancies. In some cases, the panel is evaluated with flow cytometry. The panel can be, for example, a BD Euroflow multi-color antibody panel (see http://www.bdbiosciences.com/eu/documents/EuroFlow_datasheet_new.pdf). The marker on the BD Euroflow Multicolor Antibody Panel can be, for example, CD-11c CD22, Cd 24, CD45, CD49d, CD 123, Igk, CD10, CD27, CD38, CD43, CD81, TCRyS, microglobulin (3-2 , CD9, CD71, CD79b, 1gA, IREM-2 (CD300e), CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD16, CD16, CD20, CD23, CD36, CD38, CD41a, CD42a, CD45, CD56, CD64, CD105, CD138, CD200, IgA, IgK and HLA-DR The marker (eg, fluorochrome) associated with the marker on the BD Euroflow Multicolor Antibody Panel can be FITC, PE, V450, PE-Cy ™ 7, PerCP-Cy5. 5, APC-H7, V500-C, APC, PacB or PacO.

En algunos casos, los leucocitos recuperados usando dispositivos y/o métodos descritos en el presente documento se evalúan en análisis de células B (relación kappa y lambda). La comparación de la relación de kappa a lambda se puede utilizar para determinar si un sujeto podría tener un tumor de células plasmáticas, por ejemplo, mieloma múltiple, gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS), mieloma latente, plasmocitoma solitario del hueso o amiloidosis AL.In some cases, leukocytes recovered using devices and / or methods described herein are evaluated in B-cell analysis (kappa and lambda ratio). Comparison of the kappa to lambda ratio can be used to determine whether a subject might have a plasma cell tumor, for example multiple myeloma, monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS), smoldering myeloma, solitary plasmacytoma of bone, or AL amyloidosis. .

En algunos casos, se evalúa la producción de cadenas ligeras libres, que puede ser un pronóstico de un peor resultado en el mieloma múltiple o la leucemia linfocítica crónica.In some cases, free light chain production is evaluated, which may be a prognosis for a worse outcome in multiple myeloma or chronic lymphocytic leukemia.

D. Trastornos de la sangreD. Blood disorders

En algunos casos, las HSC procesadas (por ejemplo, procesadas o tratadas química y/o enzimáticamente), aisladas o concentradas se administran a un sujeto con un trastorno sanguíneo hereditario. El trastorno sanguíneo hereditario puede ser, por ejemplo, anemia aplásica, beta-talasemia, síndrome de Blackfan-Diamond, leucodistrofia de células globoides, anemia falciforme, inmunodeficiencia combinada grave, síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X o síndrome de Wiskott-Aldrich. Los errores innatos del metabolismo que pueden tratarse con trasplantes de médula ósea incluyen: síndrome de Hunter, síndrome de Hurler, síndrome de Lesch Nyhan y osteopetrosis. En algunos casos, el trastorno hereditario de la sangre es la anemia de Fanconi.In some cases, the processed (eg, chemically and / or enzymatically processed or treated), isolated or concentrated HSCs are administered to a subject with an inherited blood disorder. The inherited blood disorder can be, for example, aplastic anemia, beta-thalassemia, Blackfan-Diamond syndrome, Globoid cell leukodystrophy, sickle cell anemia, severe combined immunodeficiency, X-linked lymphoproliferative syndrome, or Wiskott-Aldrich syndrome. Inborn errors of metabolism that can be treated with bone marrow transplants include: Hunter syndrome, Hurler syndrome, Lesch Nyhan syndrome, and osteopetrosis. In some cases, the inherited blood disorder is Fanconi anemia.

En algunos casos, Las HSC procesadas (por ejemplo, procesadas o tratadas químicamente), purificadas, aisladas o concentradas se administran a un sujeto para tratar un trastorno sanguíneo, por ejemplo, amiloidosis, anemia, trombocitopenia esencial, anemia de Fanconi, enfermedad de Gaucher, hemocromatosis, anemia hemolítica, hemofilia, hipereosinofilia, púrpura trombocitopénica idiopática, un síndrome hereditario de insuficiencia de la médula ósea, anemia con deficiencia de hierro, histiocitosis de células de Langerhans, leucopenia, mastocitosis, mielofibrosis, un trastorno mieloprofilerativo, anemia perniciosa, policitemia vera, porfiria, anemia de células falciformes, una talasemia, trombocitopenia, trombocitosis, púrpura trombocitopénica trombótica o enfermedad de von Willebrand. In some cases, processed (eg, processed or chemically treated), purified, isolated, or concentrated HSCs are administered to a subject to treat a blood disorder, eg, amyloidosis, anemia, essential thrombocytopenia, Fanconi anemia, Gaucher disease , hemochromatosis, hemolytic anemia, hemophilia, hypereosinophilia, idiopathic thrombocytopenic purpura, an inherited syndrome of bone marrow failure, iron deficiency anemia, Langerhans cell histiocytosis, leukopenia, mastocytosis, myelofibrosis, a myeloprofilerative disorder, pernicious anemia vera, porphyria, sickle cell anemia, a thalassemia, thrombocytopenia, thrombocytosis, thrombotic thrombocytopenic purpura, or von Willebrand disease.

En algunos casos, las partículas (por ejemplo, células) procesadas (por ejemplo, procesadas o tratadas química y/o enzimáticamente), purificadas, aisladas y/o concentradas usando métodos descritos en el presente documento se usan para diagnosticar un trastorno sanguíneo, por ejemplo, un trastorno sanguíneo descrito en el presente documento.In some cases, particles (eg, cells) processed (eg, chemically and / or enzymatically processed or treated), purified, isolated, and / or concentrated using methods described herein are used to diagnose a blood disorder, eg example, a blood disorder described herein document.

E. Enfermedad autoinmunitariaE. Autoimmune disease

Las células madre, por ejemplo, HSC procesadas (por ejemplo, procesadas o tratadas química y/o enzimáticamente), purificadas, aisladas y/o concentradas utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se pueden administrar a un sujeto para tratar una enfermedad autoinmunitaria. En algunos casos, las células madre, por ejemplo, HSC purificadas, aisladas y/o concentradas utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits se pueden administrar a un sujeto con un trastorno autoinmunitario que afecta al corazón, cerebro, nervios, músculo, piel, ojo, articulaciones, pulmón, riñón, glándulas, el tracto digestivo o los vasos sanguíneos. En algunos casos, un trastorno autoinmunitario puede ser artritis reumatoide, enfermedad de Grave, tiroiditis, esclerodermia, esclerosis sistémica, vitíligo, lupus eritematoso sistémico (LES), alopecia areata, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmunitaria, dermatomiositis, diabetes (tipo 1), artritis idiopática juvenil, glomerulonefritis, síndrome de Guillain-Barre, púrpura trombocitopénica idiopática, miastenia grave, miocarditis, esclerosis múltiple, pénfigo/penfigoide, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, psoriasis, esclerodermia/esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, uveítis o granulomatosis con poliangitis (de Wegener).Stem cells, eg, HSCs processed (eg, chemically and / or enzymatically processed or treated), purified, isolated, and / or concentrated using the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein can be administered to a subject to treat an autoimmune disease. In some cases, stem cells, for example, purified, isolated and / or concentrated HSCs using the methods, compositions, devices, systems and / or kits can be administered to a subject with an autoimmune disorder affecting the heart, brain, nerves. , muscle, skin, eye, joints, lung, kidney, glands, digestive tract or blood vessels. In some cases, an autoimmune disorder can be rheumatoid arthritis, Grave's disease, thyroiditis, scleroderma, systemic sclerosis, vitiligo, systemic lupus erythematosus (SLE), alopecia areata, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune hepatitis, dermatomyositis, diabetes (type 1), Juvenile idiopathic arthritis, glomerulonephritis, Guillain-Barre syndrome, idiopathic thrombocytopenic purpura, myasthenia gravis, myocarditis, multiple sclerosis, pemphigus / pemphigoid, pernicious anemia, polyarteritis nodosa, polymyositis, primary biliary cirrhosis, psoriasis, Scleroderma / Sclerosis syndrome , uveitis or granulomatosis with polyangiitis (Wegener's).

F. Otros usos de las células madreF. Other uses of stem cells

En algunos casos, las células madre procesadas (por ejemplo, procesadas o tratadas química y/o enzimáticamente), purificadas, aisladas y/o concentradas utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento pueden usarse para tratar enfermedades de Alzheimer, lesión de la médula espinal, ictus, quemaduras, enfermedad cardíaca u osteoartritis. En algunos casos, las células madre se pueden utilizar para tratar enfermedades cardiovasculares.In some cases, stem cells processed (eg, chemically and / or enzymatically processed or treated), purified, isolated, and / or concentrated using the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein may be used to treat Alzheimer's disease, spinal cord injury, stroke, burns, heart disease, or osteoarthritis. In some cases, stem cells can be used to treat cardiovascular disease.

En algunos casos, las células madre se usan para tratar a un sujeto con una afección neurológica o neurocognitiva. La afección neurológica o neurocognitiva puede ser un trastorno neurológico que figura en la página web del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (www.ninds.nih.gov/disorders/disorder_index.htm). En algunas realizaciones, el sujeto puede tener un signo o síntoma. La afección o síntoma neurológico o neurocognitivo, puede ser, por ejemplo, abarognosis (por ejemplo, pérdida de la capacidad de detectar el peso de un objeto sostenido en la mano o de discernir la diferencia de peso entre dos objetos), enfermedad de la lipasa ácida, deficiencia de maltasa ácida, afasia epileptiforme adquirida, ausencia del septum pellucidum, encefalomielitis diseminada aguda, pupila de Adie, síndrome de Adie, adrenoleucodistrofia, agenesia del cuerpo calloso, agnosia, síndrome de Aicardi, trastorno del síndrome de Aicardi-Goutieres, SIDA - complicaciones neurológicas, acatisia, trastornos relacionados con el alcohol, enfermedad de Alexander, síndrome de la mano ajena (mano anárquica), aloquiria, enfermedad de Alper, mal de altura, hemiplejia alternante, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, anencefalia, aneurisma, síndrome de Angelman, angiomatosis, anoxia, síndrome antifosfolípido, afasia, apraxia, quistes aracnoideos, aracnoiditis, malformación de Arnold-Chiari, síndrome de Asperger, malformación arteriovenosa, ataxia, ataxias y degeneración cerebelar o espinocerebelar, ataxia telangiectasia, fibrilación auricular, ictus, trastorno por déficit de atención con hiperactividad, trastorno del procesamiento auditivo, autismo, disfunción autonómica, dolor de espalda, síndrome de Barth, enfermedad de Batten, miotonía de Becker, enfermedad de Behcet, parálisis de Bell, blefaroespasmo esencial benigno, amiotrofia focal benigna, hipertensión intracraneal benigna, síndrome de Bernhardt-Roth, polimicrogiria frontoparietal bilateral, enfermedad de Binswanger, blefaroespasmo, síndrome de Bloch-Sulzberger, lesiones de nacimiento del plexo braquial, lesión del plexo braquial, síndrome de Bradbury-Eggleston, tumor cerebral o espinal, abscesos cerebrales, aneurisma cerebral, daño cerebral, lesión cerebral, tumor cerebral, síndrome de Brown-Sequard, atrofia muscular bulboespinal, CADASIL (infartos subcorticales de arteriopatía cerebral autosómica dominante y leucoencefalopatía), enfermedad de Canavan, síndrome del túnel carpiano, causalgia, cavernomas, angioma cavernoso, malformación cavernosa, síndrome del cordón cervical central, síndrome del cordón central, síndrome de dolor central, mielinólisis pontina central, miopatía centronuclear, trastorno cefálico, deficiencia de ceramidasa, degeneración cerebelar, hipoplasia cerebelar, aneurisma cerebral, arteriosclerosis cerebral, atrofia cerebral, beriberi cerebral, malformación cavernosa cerebral, gigantismo cerebral, hipoxia cerebral, parálisis cerebral, vasculitis cerebral, síndrome cerebro-óculo-facio-esquelético (COFS), estenosis espinal cervical, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, malformación de Chiari, enfermedad por almacenamiento de ésteres de colesterol, corea, coreoacantocitosis, síndrome de fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), intolerancia ortostática crónica, dolor crónico, síndrome de Cockayne tipo II, síndrome de Coffin-Lowry, colpocefalia, coma, síndrome de dolor regional complejo, neuropatía por compresión, conmoción cerebral, diplejía facial congénita, miastenia congénita, miopatía congénita, malformaciones vasculares cavernosas congénitas, degeneración corticobasal, arteritis craneal, craneosinostosis, síndrome de Aicardi-Goutieres, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, trastornos de trauma acumulativo, síndrome de Cushing, enfermedad por cuerpos de inclusión citomegálica (CIBD), infección por citomegalovirus, síndrome de ojos y pies danzantes (síndrome opsoclonus myoclonus), síndrome de Dandy-Walker (DWS), enfermedad de Dawson, malestar de descompresión, síndrome de De Morsier, parálisis de Dejerine-Klumpke, enfermedad de Dejerine-Sottas, síndrome de fase de sueño retardada, demencia, demencia - infarto múltiple, demencia - semántica, demencia - subcortical, demencia con cuerpos de Lewy, ataxia cerebelar dentada, atrofia dentatorubral, depresión, dermatomiositis, dispraxia del desarrollo, síndrome de Devic, diabetes, neuropatía diabética, esclerosis difusa, síndrome de Dravet, disautonomía, discalculia, disgrafía, dislexia, disfagia, dispraxia, disinergia cerebelar mioclónica, disinergia cerebelar progresiva, distoma, distomas, epilepsia infantil temprana, síndrome de la silla turca vacía, encefalitis, encefalitis letárgica, encefalocele, encefalopatía, encefalopatía (familiar infantil), angiomatosis encefalotrigeminal, encopresis, epilepsia, hemiplejia epiléptica, parálisis de Erb, parálisis de Erb-Duchenne y Dejerine-Klumpke, eritromelalgia, temblor hereditario, mielinólisis extrapontina, enfermedad de Fabry, síndrome de Fahr, desmayos, disautonomia familiar, hemangioma familiar, calcificación familiar idiopática de los ganglios basales, parálisis periódicas familiares, parálisis espástica familiar, enfermedad de Farber, convulsiones febriles, displasia fibromuscular, fibromialgia, síndrome de Fisher, síndrome del bebé flácido, caída del pie, síndrome de Foville, ataxia de Friedreich, demencia frontotemporal, enfermedad de Gaucher, gangliosidosis generalizadas, síndrome de Gerstmann, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, neuropatía axonal gigante, arteritis de células gigantes, enfermedad de inclusión de células gigantes, leucodistrofia de células globoides, neuralgia glosofaríngea, enfermedad del almacenamiento de glucógeno, heterotopía de la materia gris, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hallervorden-Spatz, lesión craneal, dolor de cabeza, hemicránea continua, espasmo hemifacial, hemiplejia alterna, neuropatías hereditarias, paraplejia espástica hereditaria, heredopatía atáctica polineuritiformis, herpes zóster, herpes zoster ótico, síndrome de Hirayama, síndrome de Holmes-Adie, holoprosencefalia, mielopatía asociada a HTLV-1, infección por VIH, síndrome de Hughes, enfermedad de Huntington, hidranencefalia, hidrocefalia, hidrocefalia - presión normal, hidromielia, hipercortisolismo, hipersomnia, hipertensión, hipertonía, hipotonía, hipoxia, encefalomielitis inmunomediada, miositis por cuerpos de inclusión, incontinencia pigmentaria, hipotonía infantil, distrofia neuroaxonal infantil, enfermedad infantil por almacenamiento de ácido fitánico, enfermedad de Refsum infantil, espasmos infantiles, miopatía inflamatoria, miopatías inflamatorias, iniencefalia, lipodistrofia intestinal, quiste intracraneal, hipertensión intracraneal, síndrome de Isaac, síndrome de Joubert, síndrome de Karak, síndrome de Kearns-Sayre, enfermedad de Kennedy, síndrome de Kinsbourne, síndrome de Kleine-Levin, síndrome de Klippel Feil, síndrome de Klippel-Trenaunay (KTS), síndrome de Kluver-Bucy, síndrome amnésico de Korsakoff, enfermedad de Krabbe, enfermedad de Kugelberg-Welander, kuru, enfermedad de Lafora, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Landau-Kleffner, atrapamiento del nervio cutáneo femoral lateral, síndrome medular lateral (Wallenberg), dificultades de aprendizaje, enfermedad de Leigh, síndrome de Lennox-Gastaut, síndrome de Lesch-Nyhan, leucodistrofia, síndrome de Levine-Critchley, demencia con cuerpos de Lewy, enfermedades por almacenamiento de lípidos, proteinosis lipoide, lisencefalia, síndrome de enclaustramiento, enfermedad de Lou Gehrig, enfermedad del disco lumbar, estenosis espinal lumbar, lupus - secuelas neurológicas, enfermedad de Lyme - secuelas neurológicas, enfermedad de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelar tipo 3), macrencefalia, macropsia, megalencefalia, síndrome de Melkersson-Rosenthal, enfermedad de Meniere, meningitis, meningitis y encefalitis, enfermedad de Menkes, meralgia parestésica, leucodistrofia metacromática, trastornos metabólicos, microcefalia, micropsia, migraña, síndrome de Miller Fisher, mini-accidente cerebrovascular (ataque isquémico transitorio), misofonia, miopatía mitocondrial, síndrome de Mobius, síndrome de Moebius, amiotrofia monomélica, trastorno del estado de ánimo, enfermedad de las neuronas motoras, trastornos de las habilidades motoras, enfermedad de Moyamoya, mucolipidosis, mucopolisacaridosis, demencia por infarto múltiple, neuropatía motora multifocal, esclerosis múltiple, atrofia multisistémica, atrofia multisistémica con hipotensión ortostática, distrofia muscular, encefalomielitis miálgica, miastenia - congénita, miastenia grave, esclerosis difusa mielinoclástica, encefalopatía mioclónica de bebés, mioclonos, miopatía, miopatía - congénita, miopatía -tirotóxica, miotonía, miotonía congénita, miopatía miotubular, narcolepsia, neuroacantocitosis, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, neurofibromatosis, síndrome neuroléptico maligno, complicaciones neurológicas del SIDA, complicaciones neurológicas de la enfermedad de Lyme, consecuencias neurológicas de la infección por citomegalovirus, manifestaciones neurológicas del SIDA, Manifestaciones neurológicas de la enfermedad de Pompe, secuelas neurológicas de lupus, neuromielitis óptica, neuromiotonía, lipofuscinosis ceroide neuronal, trastornos de migración neuronal, neuropatía hereditaria, neurosarcoidosis, neurosífilis, neurotoxicidad, insulto neurotóxico, nevo cavernoso, enfermedad de Niemann-Pick, síndrome de sueño-vigilia no de 24 horas, trastorno del aprendizaje no verbal, hidrocefalia de presión normal, síndrome de O'Sullivan-McLeod, neuralgia occipital, secuencia oculta de disrafismo espinal, síndrome de Otahara, atrofia olivopontocerebelosa, opsoclono mioclono, síndrome de opsoclonomioclono, neuritis óptica, hipotensión ortostática, síndrome por sobreuso, dolor crónico, palinopsia, trastorno de pánico, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, paramiotonía congénita, enfermedades paraneoplásicas, parestesia, enfermedad de Parkinson, ataques paroxísticos, coreoatetosis paroxística, hemicránea paroxística, síndrome de Parry-Romberg, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, síndrome de Pena shokeir II, quistes perineurales, parálisis periódica, neuropatía periférica, leucomalacia periventricular, estado vegetativo persistente, trastornos profundos del desarrollo, reflejo de estornudo fótico, enfermedad por almacenamiento de ácido fitánico, enfermedad de Pick, pinzamiento de nervio, síndrome piriforme, tumores de la pituitaria, PMG, polio, polimicrogiria, polimiositis, enfermedad de Pompe, porencefalia, Síndrome pospoliomielítico, neuralgia posherpética (PHN), encefalomielitis posinfecciosa, hipotensión postural, síndrome de taquicardia ortostática postural, síndrome de taquicardia postural, síndrome de Prader-Willi, atrofia primaria del dentatum, esclerosis lateral primaria, afasia primaria progresiva, enfermedades priónicas, atrofia hemifacial progresiva, ataxia locomotora progresiva, leucoencefalopatía multifocal progresiva, Poliodistrofia esclerosante progresiva, parálisis supranuclear progresiva, prosopagnosia, síndrome pseudo-Torch, síndrome de pseudotoxoplasmosis, pseudotumor cerebral, rabia, síndrome de Ramsay Hunt tipo I, síndrome de Ramsay Hunt tipo II, síndrome de Ramsay Hunt tipo III, encefalitis de Rasmussen, distrofia neurovascular refleja, síndrome de distrofia simpática refleja, enfermedad de Refsum, enfermedad de Refsum - infantil, trastornos de movimientos repetitivos, lesión por estrés repetitivo, síndrome de piernas inquietas, mielopatía asociada a retrovirus, síndrome de Rett, síndrome de Reye, encefalitis reumática, trastorno del movimiento rítmico, síndrome de Riley-Day, síndrome de Romberg, quistes de la raíz del nervio sacro, baile de san vito, enfermedad de las glándulas salivales, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, esquizencefalia, esquizofrenia, enfermedad de Seitelberger, trastorno convulsivo, demencia semántica, disfunción de integración sensorial, displasia septoóptica, epilepsia mioclónica grave de la infancia (SMEI), síndrome del bebé sacudido, culebrilla, síndrome de Shy-Drager, síndrome de Sjogren, apnea del sueño, enfermedad del sueño, snatiation, síndrome de Sotos, espasticidad, espina bífida, infarto de la médula espinal, lesión de la médula espinal, tumor de la médula espinal, atrofia muscular espinal, ataxia espinocerebelar, atrofia espinocerebelosa, degeneración espinocerebelosa, síndrome de Steele-Richardson-Olszewski, síndrome de la persona rígida, degeneración estriatonigral, ictus, síndrome de Sturge-Weber, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalopatía arterioesclerótica subcortical, dolor de cabeza SUNCT, siderosis superficial, trastornos de la deglución, corea de Sydenham, síncope, sinestesia, esclerosis espinal sifilítica, siringohidromielia, siringomielia, lupus eritematoso sistémico, tabes dorsal, discinesia tardía, disfrenia tardía, quiste de Tarlov, síndrome del túnel tarsal, enfermedad de Tay-Sachs, arteritis temporal, tétanos, síndrome de médula espinal anclada, enfermedad de Thomsen, miotonía de Thomsen, síndrome de la salida torácica, miopatía tirotóxica, tic doloroso, parálisis de Todd, síndrome de Tourette, encefalopatía tóxica, ataque isquémico transitorio, encefalopatía espongiforme transmisible, mielitis transversa, lesión cerebral traumática, temblor, neuralgia del trigémino, paraparesis espástica tropical, síndrome de Troyer, tripanosomiasis, esclerosis tuberosa, ubisiosis, uremia, tumor eréctil vascular, síndromes de vasculitis del sistema nervioso central y periférico, encefalomielitis de Viliuisk (VE), enfermedad de von Economo, enfermedad de von Hippel-Lindau (VHL), enfermedad de von Recklinghausen, síndrome de Wallenberg, enfermedad de Werdnig-Hoffman, síndrome de Wernicke-Korsakoff, síndrome de West, latigazo, enfermedad de Whipple, síndrome de Williams, enfermedad de Wilson, enfermedad de Wolman, Atrofia muscular espinal y bulbar ligada al cromosoma X, o síndrome de Zellweger.In some cases, stem cells are used to treat a subject with a neurological or neurocognitive condition. The neurological or neurocognitive condition may be a neurological disorder listed on the National Institute of Neurological Disorders and Stroke website (www.ninds.nih.gov/disorders/disorder_index.htm). In some embodiments, the subject may have a sign or symptom. The neurological or neurocognitive condition or symptom may be, for example, embraognosis (for example, loss of the ability to detect the weight of an object held in the hand or to discern the difference in weight between two objects), lipase disease acid, acid maltase deficiency, acquired epileptiform aphasia, absence of septum pellucidum, acute disseminated encephalomyelitis, Adie's pupil, Adie's syndrome, adrenoleukodystrophy, agenesis of the corpus callosum, agnosia, Aicardi syndrome, Aicardi-Goutieres syndrome disorder, AIDS - neurological complications, akathisia, alcohol-related disorders, Alexander disease, alien hand syndrome (anarchic hand), allokyrie, Alper's disease, altitude sickness, alternating hemiplegia, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, anencephaly, aneurysm , Angelman syndrome, angiomatosis, anoxia, antiphospholipid syndrome, aphasia, apraxia, arachnoid cysts, arachnoiditis, malformation of Arnold-Chiari, Asperger syndrome, arteriovenous malformation, ataxia, ataxias and cerebellar or spinocerebellar degeneration, ataxia, telangiectasia, atrial fibrillation, stroke, attention deficit hyperactivity disorder, auditory processing disorder, autism, autonomic dysfunction, back pain, Barth's syndrome, Batten's disease, Becker's myotonia, Behcet's disease, Bell's palsy, benign essential blepharospasm, benign focal amyotrophy, benign intracranial hypertension, Bernhardt-Roth syndrome, bilateral frontoparietal polymicrogyria, Binswanger's disease, blepharospasm, Bloch-Sulzberger, brachial plexus birth injury, brachial plexus injury, Bradbury-Eggleston syndrome, brain or spinal tumor, brain abscess, brain aneurysm, brain damage, brain injury, brain tumor, Brown-Sequard syndrome, muscle atrophy bulbospinal, CADASIL (subcortical infarcts of autosomal cerebral arteriopathy dominant and leukoencephalopathy), Canavan disease, carpal tunnel syndrome, causalgia, cavernomas, cavernous angioma, cavernous malformation, central cervical cord syndrome, central cord syndrome, central pain syndrome, central pontine myelinolysis, centronuclear myopathy, head disorder, Ceramidase deficiency, cerebellar degeneration, cerebellar hypoplasia, cerebral aneurysm, cerebral arteriosclerosis, cerebral atrophy, cerebral beriberi, cerebral cavernous malformation, cerebral gigantism, cerebral hypoxia, cerebral palsy, cerebral vasculitis, cerebro-oculus-facio-skeletal syndrome (COFS), Cervical spinal stenosis, Charcot-Marie-Tooth disease, Chiari malformation, cholesterol ester storage disease, chorea, choreoacanthocytosis, chronic fatigue syndrome, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP), chronic orthostatic intolerance, chronic pain, syndrome of Cockayne type II, Coffin-Lowry syndrome , colpocephaly, coma, complex regional pain syndrome, compression neuropathy, concussion, congenital facial diplegia, congenital myasthenia, congenital myopathy, congenital cavernous vascular malformations, corticobasal degeneration, cranial arteritis, craniosynostosis, Aicardi-Goutieres syndrome, Creutzfeldt syndrome -Jakob, cumulative trauma disorders, Cushing syndrome, cytomegalic inclusion body disease (CIBD), cytomegalovirus infection, dancing eyes and feet syndrome (opsoclonus myoclonus syndrome), Dandy-Walker syndrome (DWS), Dawson's disease , decompression sickness, De Morsier syndrome, Dejerine-Klumpke palsy, Dejerine-Sottas disease, delayed sleep phase syndrome, dementia, dementia - multiple infarction, dementia - semantics, dementia - subcortical, dementia with Lewy bodies, Dentate cerebellar ataxia, dentatorubral atrophy, depression, dermatomyositis, developmental dyspraxia, Devic syndrome , diabetes, diabetic neuropathy, diffuse sclerosis, Dravet syndrome, dysautonomia, dyscalculia, dysgraphia, dyslexia, dysphagia, dyspraxia, myoclonic cerebellar dyssynergia, progressive cerebellar dyssynergia, dystoma, dystomas, early childhood epilepsy, empty sella syndrome, encephalitis, encephalitis lethargic, encephalocele, encephalopathy, encephalopathy ( familial infantile), encephalotrigeminal angiomatosis, encopresis, epilepsy, epileptic hemiplegia, Erb's palsy, Erb-Duchenne and Dejerine-Klumpke palsy, erythromelalgia, hereditary tremor, extrapontine myelinolysis, Fabry disease, Fahr syndrome, familial fainting, dysfunctions familial, idiopathic familial basal ganglia calcification, familial periodic paralysis, familial spastic paralysis, Farber's disease, febrile seizures, fibromuscular dysplasia, fibromyalgia, Fisher's syndrome, floppy baby syndrome, foot drop, Foville's syndrome, Friedreich's ataxia , frontotemporal dementia, Gaucher disease, gang Generalized liosidosis, Gerstmann syndrome, Gerstmann-Straussler-Scheinker disease, giant axonal neuropathy, giant cell arteritis, giant cell inclusion disease, globoid cell leukodystrophy, glossopharyngeal neuralgia, glycogen storage disease, gray matter heterotopia , Guillain-Barre syndrome, Hallervorden-Spatz disease, head injury, headache, hemicrania continuum, hemifacial spasm, alternating hemiplegia, hereditary neuropathies, hereditary spastic paraplegia, atactic polyneuritiformis inheritance, herpes zoster, herpes zoster oticum, Hirayama syndrome , Holmes-Adie syndrome, holoprosencephaly, HTLV-1 associated myelopathy, HIV infection, Hughes syndrome, Huntington's disease, hydranencephaly, hydrocephalus, hydrocephalus - normal pressure, hydromyelia, hypercortisolism, hypersomnia, hypertension, hypertonia, hypotonia, hypoxia , immune-mediated encephalomyelitis, infection body myositis clusion, pigmentary incontinence, infantile hypotonia, infantile neuroaxonal dystrophy, infantile phytanic acid storage disease, infantile Refsum disease, infantile spasms, inflammatory myopathy, inflammatory myopathies, iniencephaly, intestinal lipodystrophy, intracranial cyst, intracranial hypertension, Isaac syndrome, syndrome Joubert syndrome, Karak syndrome, Kearns-Sayre syndrome, Kennedy disease, Kinsbourne syndrome, Kleine-Levin syndrome, Klippel Feil syndrome, Klippel-Trenaunay syndrome (KTS), Kluver-Bucy syndrome, amnestic syndrome of Korsakoff, Krabbe disease, Kugelberg-Welander disease, kuru, Lafora disease, Lambert-Eaton myasthenic syndrome, Landau-Kleffner syndrome, lateral femoral cutaneous nerve entrapment, lateral medullary syndrome (Wallenberg), learning difficulties, disease Leigh syndrome, Lennox-Gastaut syndrome, Lesch-Nyhan syndrome, leukodystrophy, Levine-Critchley syndrome, Lewy body dementia, lipid storage diseases, lipoid proteinosis, lissencephaly, cloistered syndrome, Lou Gehrig's disease, lumbar disc disease, lumbar spinal stenosis, lupus - neurological sequelae, Lyme disease - neurological sequelae, Machado disease -Joseph (spinocerebellar ataxia type 3), macrencephaly, macropsia, megalencephaly, Melkersson-Rosenthal syndrome, Meniere's disease, meningitis, meningitis and encephalitis, Menkes disease, meralgia paresthetica, metachromatic leukodystrophy, metabolic disorders, microcephaly, micropsy, migraine Miller Fisher syndrome, mini-stroke (transient ischemic attack), misophonia, mitochondrial myopathy, Mobius syndrome, Moebius syndrome, monomelic amyotrophy, mood disorder, motor neuron disease, motor skill disorders, disease Moyamoya, mucolipidosis, mucopolysaccharidosis, heart attack dementia Multiple, multifocal motor neuropathy, multiple sclerosis, multisystemic atrophy, multisystemic atrophy with orthostatic hypotension, muscular dystrophy, myalgic encephalomyelitis, myasthenia - congenital, myasthenia gravis, diffuse myelinoclastic sclerosis, myopathy myopathy - myoclonus, myopathy - myoclonus, myopathy - myoclonus thyrotoxic, myotonia, myotonia congenita, myotubular myopathy, narcolepsy, neuroacantocytosis, neurodegeneration with iron accumulation in the brain, neurofibromatosis, neuroleptic malignant syndrome, neurological complications of AIDS, neurological complications of Lyme disease, neurological consequences of cytomegalovirus infection, Neurological manifestations of AIDS, Neurological manifestations of Pompe disease, neurological sequelae of lupus, neuromyelitis optica, neuromyotonia, neuronal ceroid lipofuscinosis, neuronal migration disorders, hereditary neuropathy, neurosarcoidosis, neurosyphilis, neur otoxicity, neurotoxic insult, cavernous nevus, Niemann-Pick disease, non-24-hour sleep-wake syndrome, non-verbal learning disorder, normal pressure hydrocephalus, O'Sullivan-McLeod syndrome, occipital neuralgia, occult dysraphism sequence spinal cord, Otahara syndrome, olivopontocerebellar atrophy, opsoclonus myoclonus, opsoclonomyclonus syndrome, optic neuritis, orthostatic hypotension, overuse syndrome, chronic pain, palinopsia, panic disorder, pantothenate kinase-associated neurodegeneration, congenital paramyotonia, paramyotonia, paraneoplastic disease Parkinson's disease, paroxysmal seizures, paroxysmal choreoathetosis, paroxysmal hemicrania, Parry-Romberg syndrome, Pelizaeus-Merzbacher disease, Pena shokeir II syndrome, perineural cysts, periodic paralysis, peripheral neuropathy, periventricular leukomalacia, persistent vegetative state, profound developmental disorders , photic sneeze reflex, ill Phytanic acid storage age, Pick's disease, nerve impingement, piriformis syndrome, pituitary tumors, PMG, polio, polymicrogyria, polymyositis, Pompe disease, porencephaly, Post-polio syndrome, post-herpetic neuralgia (PHN), post-infectious encephalomyelitis, hypotension postural, postural orthostatic tachycardia syndrome, postural tachycardia syndrome, Prader-Willi syndrome, primary dentatum atrophy, primary lateral sclerosis, primary progressive aphasia, prion diseases, progressive hemifacial atrophy, progressive locomotor ataxia, progressive multifocal leukoencephalopathy , progressive supranuclear palsy, prosopagnosia, pseudo-Torch syndrome, pseudotoxoplasmosis syndrome, pseudotumor cerebri, rabies, Ramsay Hunt syndrome type I, Ramsay Hunt syndrome type II, Ramsay Hunt syndrome type III, Rasmussen encephalitis, reflex neurovascular dystrophy, sim dystrophy syndrome Reflex disease, Refsum's disease, Refsum's disease - infantile, repetitive movement disorders, repetitive stress injury, restless legs syndrome, retrovirus-associated myelopathy, Rett syndrome, Reye's syndrome, rheumatic encephalitis, rhythmic movement disorder, syndrome Riley-Day syndrome, Romberg syndrome, sacral nerve root cysts, St. Vitus dance, salivary gland disease, Sandhoff disease, Schilder's disease, schizoencephaly, schizophrenia, Seitelberger, seizure disorder, semantic dementia, sensory integration dysfunction, septo-optic dysplasia, severe myoclonic epilepsy of infancy (SMEI), shaken baby syndrome, shingles, Shy-Drager syndrome, Sjogren's syndrome, sleep apnea, sleeping sickness , snatiation, Sotos syndrome, spasticity, spina bifida, spinal cord infarction, spinal cord injury, spinal cord tumor, spinal muscular atrophy, spinocerebellar ataxia, spinocerebellar atrophy, spinocerebellar degeneration, Steele-Richardson-Olszewski syndrome , stiff person syndrome, striatonigral degeneration, stroke, Sturge-Weber syndrome, subacute sclerosing panencephalitis, subcortical arteriosclerotic encephalopathy, SUNCT headache, superficial siderosis, swallowing disorders, Sydenham chorea, syncope, synaesthesia, syphilitic spinal sclerosis , syringomyelia, syringomyelia, systemic lupus erythematosus, tabes dorsalis, tardive dyskinesia ia, late dysprenia, Tarlov cyst, tarsal tunnel syndrome, Tay-Sachs disease, temporal arteritis, tetanus, tetanus spinal cord syndrome, Thomsen disease, Thomsen myotonia, thoracic outlet syndrome, thyrotoxic myopathy, tic pain , Todd's palsy, Tourette syndrome, toxic encephalopathy, transient ischemic attack, transmissible spongiform encephalopathy, transverse myelitis, traumatic brain injury, tremor, trigeminal neuralgia, tropical spastic paraparesis, Troyer syndrome, trypanosomiasis, tuberous sclerosis, ubisiosis, uremia, Vascular erectile tumor, central and peripheral nervous system vasculitis syndromes, Viliuisk encephalomyelitis (VE), von Economo disease, von Hippel-Lindau disease (VHL), von Recklinghausen disease, Wallenberg syndrome, Werdnig-Hoffman disease , Wernicke-Korsakoff syndrome, West syndrome, whiplash, Whipple's disease, Williams syndrome, Wilson's disease , Wolman's disease, X-linked spinal and bulbar muscular atrophy, or Zellweger syndrome.

G. MicroscopíaG. Microscopy

En algunos casos, las partículas que se procesan (por ejemplo, se procesan o se tratan química y/o enzimáticamente), purifican, aíslan y/o concentran utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento (por ejemplo, células) se pueden analizar mediante microscopía. En algunos casos, la microscopía puede ser microscopía óptica, electrónica o de sonda de barrido. En algún caso, la microscopía óptica comprende el uso de campo brillante, iluminación oblicua, luz contrapolarizada, tinción de dispersión, campo oscuro, contraste de fase, contraste de interferencia diferencial, microscopía de reflexión de interferencia, fluorescencia (por ejemplo, cuando las partículas, por ejemplo, células, están inmunoteñidas), confocal, microscopía de iluminación de un solo plano, microscopía de fluorescencia de haz de luz, deconvolución o microscopía amplificada codificada en tiempo en serie.In some cases, particles that are processed (for example, chemically and / or enzymatically processed or treated), purified, isolated, and / or concentrated using the methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein. (eg cells) can be analyzed by microscopy. In some cases, the microscopy can be light, electron, or scanning probe microscopy. In some cases, light microscopy comprises the use of bright field, oblique illumination, cross-polarized light, scatter staining, dark field, phase contrast, differential interference contrast, interference reflection microscopy, fluorescence (for example, when the particles , for example, cells, are immunostained), confocal, single plane illumination microscopy, light beam fluorescence microscopy, deconvolution, or serial time-coded amplified microscopy.

En algunos casos, la microscopía electrónica comprende la microscopía electrónica de transmisión (TEM) o la microscopía electrónica de barrido (SEM).In some cases, electron microscopy includes transmission electron microscopy (TEM) or scanning electron microscopy (SEM).

En algunos casos, un microscopio de sonda de barrido comprende un microscopio de fuerza atómica, un microscopio de barrido de efecto túnel o un microscopio de fuerza fotónica.In some cases, a scanning probe microscope comprises an atomic force microscope, a scanning tunneling microscope, or a photon force microscope.

En algunos casos, un microscopio es un microscopio de fuerza ultrasónico (UFM).In some cases, a microscope is an Ultrasonic Force Microscope (UFM).

En algunos casos, la microscopía comprende microscopía ultravioleta. En algunos casos, la microscopía comprende microscopía infrarroja. En algunos casos, la microscopía comprende microscopía holográfica digital, patología digital (microscopía virtual) o microscopía láser.In some cases, microscopy includes ultraviolet microscopy. In some cases, microscopy includes infrared microscopy. In some cases, microscopy includes digital holographic microscopy, digital pathology (virtual microscopy), or laser microscopy.

En algunos casos, un microscopio está en comunicación fluida con un dispositivo para tratamiento y/o purificación descrito en el presente documento. En algunos casos, un microscopio está en comunicación fluida con un dispositivo para tratamiento y/o purificación, en donde el microscopio está aguas abajo de un dispositivo para tratamiento y/o purificación. En algunos casos, un microscopio está en comunicación fluida con un dispositivo para tratamiento y/o purificación aguas arriba del dispositivo para purificación. En algunos casos, el microscopio está en comunicación fluida con un dispositivo para tratamiento y/o purificación aguas arriba y aguas abajo del dispositivo para tratamiento y/o purificación. En algunos casos, el microscopio está configurado para permitir la visualización de un dispositivo para el tratamiento y/o purificación descritos en el presente documento.In some cases, a microscope is in fluid communication with a device for treatment and / or purification described herein. In some cases, a microscope is in fluid communication with a device for treatment and / or purification, wherein the microscope is downstream of a device for treatment and / or purification. In some cases, a microscope is in fluid communication with a device for treatment and / or purification upstream of the device for purification. In some cases, the microscope is in fluid communication with a device for treatment and / or purification upstream and downstream of the device for treatment and / or purification. In some cases, the microscope is configured to allow viewing of a device for the treatment and / or purification described herein.

H. Citometría de flujoH. Flow cytometry

En algunos casos, las partículas (por ejemplo, células) que se procesan (por ejemplo, se procesan o tratan química y/o enzimáticamente), purifican, aíslan y/o concentran utilizando los métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento pueden analizarse mediante citometría de flujo. La manipulación de células en dispositivos en un citómetro de flujo se puede lograr usando fuerzas hidrodinámicas. Se puede inyectar una suspensión de partículas (por ejemplo, células) en el centro de un fluido envolvente que fluye. En algunos casos, las fuerzas del fluido envolvente circundante confinan la corriente de muestra a un núcleo estrecho que puede transportar células a través de la trayectoria de un láser que puede excitar los fluoróforos asociados y crear un patrón de dispersión.In some cases, particles (eg cells) that are processed (eg chemically and / or enzymatically processed or treated), purified, isolated and / or concentrated using the methods, compositions, devices, systems and / or kits described herein can be analyzed by flow cytometry. Manipulation of cells in devices on a flow cytometer can be accomplished using hydrodynamic forces. A suspension of particles (eg cells) can be injected into the center of a flowing envelope fluid. In some cases, forces from the surrounding sheath fluid confine the sample stream to a narrow core that can transport cells through the path of a laser that can excite associated fluorophores and create a scattering pattern.

La citometría de flujo puede comprender la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En algunos casos, una muestra se somete a citometría de flujo, por ejemplo, FACS, antes de que la muestra se aplique al dispositivo para el tratamiento y/o purificación descritos en el presente documento. En algunos casos, el citómetro de flujo está en comunicación fluida con un dispositivo para tratamiento y/o purificación descrito en el presente documento; en algunos casos, el citómetro de flujo está conectado de forma fluida aguas arriba de un dispositivo para tratamiento y/o purificación; en algunos casos, el citómetro de flujo está conectado de forma fluida aguas abajo de un dispositivo para el tratamiento y/o purificación descritos en el presente documento. En algunos casos, el citómetro de flujo está conectado de forma fluida aguas arriba y aguas abajo de un dispositivo para el tratamiento y/o purificación descritos en el presente documento.Flow cytometry may comprise fluorescence activated cell sorting (FACS). In some cases, a sample is subjected to flow cytometry, for example, FACS, before the sample is applied to the device for the treatment and / or purification described herein. In some cases, the flow cytometer is in fluid communication with a device for treatment and / or purification described herein; in some cases, the flow cytometer is fluidly connected upstream of a device for treatment and / or purification; in some cases, the flow cytometer is fluidly connected downstream of a device for the treatment and / or purification described herein. In some cases, the flow cytometer is fluidly connected upstream and downstream of a device for the treatment and / or purification described herein.

En algunos casos, las partículas (por ejemplo, células) que se analizan mediante citometría de flujo están marcadas. En algunos casos, las partículas (por ejemplo, células) que se analizan mediante citometría de flujo se marcan usando un dispositivo de "lavado de coches" tal como se proporciona en el presente documento. Las partículas pueden ser células. El marcaje de las células puede ser un marcaje de superficie y/o un marcaje intracelular. En algunos casos, las partículas se marcan con un fluoróforo. En algunos casos, un fluoróforo se une a un anticuerpo y el anticuerpo se une a una partícula (por ejemplo, una célula). En algunos casos, un anticuerpo puede unirse a una membrana celular. En algunos casos, una partícula se marca con un punto cuántico.In some cases, particles (eg cells) that are analyzed by flow cytometry are labeled. In some cases, particles (eg, cells) that are analyzed by flow cytometry are marked using a "car wash" device as provided herein. The particles can be cells. The labeling of the cells can be a surface labeling and / or an intracellular labeling. In some cases, the particles are labeled with a fluorophore. In some cases, a fluorophore binds to an antibody and the antibody binds to a particle (eg, a cell). In some cases, an antibody can bind to a cell membrane. In some cases, a particle is marked with a quantum dot.

Se puede utilizar FACS para clasificar una mezcla heterogénea de partículas, por ejemplo, células, en dos o más recipientes. La FACS puede basarse en las características de dispersión de luz y fluorescentes de cada tipo de célula. Una suspensión de partículas (por ejemplo, células) se puede arrastrar en una corriente de flujo de líquido. Puede haber separación entre partículas en el líquido. La corriente de partículas (por ejemplo, células) se puede romper en gotículas (por ejemplo, mediante un mecanismo de vibración). En algunos casos, solo hay una partícula (por ejemplo, una célula) en cada gotícula. En algunos casos, antes de que la corriente se rompa en gotículas, el líquido pasa a través de una estación de medición de fluorescencia. Se pueden medir las características de fluorescencia. Se puede dar una carga a cada gotícula en función de la medición de fluorescencia, y las gotículas cargadas pueden pasar a través de un sistema de deflexión electrostática que puede desviar las gotas a contenedores según la carga.FACS can be used to classify a heterogeneous mixture of particles, eg cells, into two or more containers. FACS can be based on the fluorescent and light scattering characteristics of each cell type. A suspension of particles (eg cells) can be entrained in a flowing stream of liquid. There may be separation between particles in the liquid. The stream of particles (eg cells) can be broken into droplets (eg by a vibration mechanism). In some cases, there is only one particle (for example, a cell) in each droplet. In some cases, before the stream breaks down into droplets, the liquid passes through a fluorescence measurement station. Fluorescence characteristics can be measured. Each droplet can be charged based on the fluorescence measurement, and the charged droplets can pass through an electrostatic deflection system that can deflect the droplets into containers depending on the charge.

En algunos casos, los leucocitos recuperados usando los métodos y/o dispositivos descritos en el presente documento se tiñen con antiappa-FITC (isotiocianato de fluoresceína), anti-Lamda-PE (ficoeritrina), 7AAD-PerCP y/o CD-19-APC (aloficocianina), CD-45-APC-Cy7. Se puede utilizar un citómetro de flujo para procesar y/o analizar partículas, por ejemplo, células.In some cases, leukocytes recovered using the methods and / or devices described herein are stained with antiappa-FITC (fluorescein isothiocyanate), anti-Lamda-PE (phycoerythrin), 7AAD-PerCP, and / or CD-19- APC (allophycocyanin), CD-45-APC-Cy7. You can use a flow cytometer for processing and / or analyzing particles, for example, cells.

I. Enfoque acústicoI. Acoustic approach

En algunos casos, las partículas procesadas, por ejemplo, procesadas o tratadas química y/o enzimáticamente), purificadas, aisladas y/o concentradas utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se someten a un citómetro de flujo de enfoque acústico (por ejemplo, citómetro de flujo de enfoque acústico Attune®; Life Technologies™). En algunos casos, se utiliza un enfoque acústico en una muestra antes de que la muestra se aplique a un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos ordenados. Pueden usarse múltiples nodos de partículas enfocadas acústicamente. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 8830451. En algunos casos, se utiliza un nodo focal.In some cases, particles processed (e.g. chemically and / or enzymatically processed or treated), purified, isolated, and / or concentrated using methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein are subjected to a cytometer. Acoustic Focusing Flow Cytometer (eg, Attune® Acoustic Focusing Flow Cytometer; Life Technologies ™). In some cases, an acoustic focus is used on a sample before the sample is applied to a device comprising an array of ordered obstacles. Multiple acoustically focused particle nodes can be used. See, for example, US Patent No. 8830451. In some cases, a focal node is used.

La citometría de enfoque acústico puede usar ondas ultrasónicas (por ejemplo, de más de 2 MHz) en lugar de fuerzas hidrodinámicas para colocar las células en una línea enfocada a lo largo de un eje central de un capilar. (véase, por ejemplo, www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometers/attuneacoustic-focusing-flow-cytometer/acoustic-focusing-technology-overview.htm). El enfoque acústico puede ser independiente de la tasa de entrada de muestra. El enfoque acústico puede permitir que las células estén bien enfocadas en un punto de interrogación láser. El enfoque acústico puede realizarse sin fluido envolvente de alta velocidad o gran volumen. En algunos casos, unas bombas de jeringa volumétricas pueden permitir el recuento celular absoluto sin perlas.Acoustic focus cytometry can use ultrasonic waves (for example, greater than 2 MHz) instead of hydrodynamic forces to position cells in a focused line along a central axis of a capillary. (See, for example, www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometers/attuneacoustic-focusing-flow-cytometer/acoustic-focusing-technology-overview. htm). Acoustic focus can be independent of sample input rate. Acoustic focusing can allow cells to be well focused on a laser interrogation point. Acoustic focusing can be performed without high volume or high velocity envelope fluid. In some cases, volumetric syringe pumps can allow absolute cell count without beads.

En algunos casos, la resonancia acústica se impulsa por un dispositivo piezoeléctrico.In some cases, the acoustic resonance is driven by a piezoelectric device.

El enfoque acústico puede hacer uso de una celda óptica para la interrogación de muestras, uno o más láseres y electrónica para recoger información de fluorescencia y/o dispersión. En algunos casos, el enfoque acústico hace uso de una bomba, por ejemplo, una bomba de jeringa. En algunos casos, la frecuencia utilizada en el enfoque acústico es de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,09, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5 o 6 MHz.Acoustic approach can make use of an optical cell for sample interrogation, one or more lasers, and electronics to collect fluorescence and / or scattering information. In some cases, the acoustic approach makes use of a pump, for example a syringe pump. In some cases, the frequency used in acoustic focusing is approximately 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.09, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5 or 6 MHz.

En algunos casos, el caudal en un citómetro de enfoque acústico es de al menos 10, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 pl/min.In some cases, the flow rate in an acoustic focusing cytometer is at least 10, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, or 5000 l / min.

J. Análisis de ácidos nucleicos o proteínasJ. Nucleic acid or protein analysis

En algunos casos, una partícula (por ejemplo, ácido nucleico y/o proteína) procesada (por ejemplo, procesada o tratada química y/o enzimáticamente), purificada, aislada y/o concentrada utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se puede analizar usando una o más de las siguientes técnicas: pruebas genéticas utilizando determinación de cariotipo con bandeo G, prueba de X frágil, micromatriz cromosómica (CMA, también conocida como hibridación genómica comparativa (CGH)) (por ejemplo, para analizar deleciones y/o duplicaciones genómicas submicroscópicas), hibridación genómica comparativa basada en matrices, detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) con matrices, hibridación subtelomérica fluorescente in situ (ST-FISH) (por ejemplo, para detectar variantes submicroscópicas de número de copias (CNV)), determinación del perfil de expresión, micromatriz de ADN, micromatriz de oligonucleótidos de alta densidad, matriz de expresión de ARN de genoma completo, micromatriz de péptidos, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), secuenciación del genoma, secuenciación de novo, secuenciación 454 (Roche), pirosecuenciación, secuenciación de una sola molécula verdadera de Helicos, secuenciación SOLiD ™ (Applied Biosystems, Life Technologies), secuenciación SOLEXA (secuenciación Illumina), nanosecuenciación, secuenciación de matriz de transistores de efecto de campo sensibles a productos químicos (chemFET) (Ion Torrent), secuenciación de semiconductores de iones (Ion Torrent), secuenciación de nanoesferas de ADN, secuenciación de nanoporos, secuenciación SMRT de Pacific Biosciences, secuenciación de ADN de una sola molécula de nanoporos de Genia Technologies, secuenciación de ADN de una sola molécula de Oxford Nanopore, secuenciación con polonio, secuenciación del análisis de variación del número de copias (CNV), análisis de polimorfismo de nucleótidos pequeños (SNP), inmunohistoquímica (IHC), inmunocitoquímica (ICC), espectrometría de masas, espectrometría de masas en tándem, espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS), hibridación in situ, hibridación in situ fluorescente (FISH), hibridación cromogénica in situ (CISH), hibridación in situ con plata (SISH), reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR digital (dPCR), PCR con transcripción inversa, Pc R cuantitativa (Q-PCR), qPCR de señalizador único, PCR en tiempo real, Análisis nCounter (Nanostring Technology), transferencia de Western, transferencia de Southern, SDS-PAGE, electroforesis en gel o transferencia de Northern. En algunos casos, el análisis comprende la secuenciación del exoma.In some cases, a particle (eg nucleic acid and / or protein) processed (eg chemically and / or enzymatically processed or treated), purified, isolated and / or concentrated using methods, compositions, devices, systems and / or Kits described herein can be tested using one or more of the following techniques: genetic testing using G-band karyotyping, fragile X test, chromosomal microarray (CMA, also known as comparative genomic hybridization (CGH)) (for example, to analyze submicroscopic genomic deletions and / or duplications), matrix-based comparative genomic hybridization, detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs) with arrays, subtelomeric hybridization fluorescent in situ (ST-FISH) (e.g. for detection of submicroscopic copy number variants (CNV)), expression profiling, DNA microarray, high density oligonucleotide microarray, whole genome RNA expression matrix , peptide microarray, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), genome sequencing, de novo sequencing, 454 sequencing (Roche), pyrosequencing, Helicos true single molecule sequencing, SOLiD ™ sequencing (Applied Biosystems, Life Technologies) , SOLEXA sequencing (Illumina sequencing), nano-sequencing, array sequencing of field-effect transistors sensitive to Chemicals (chemFET) (Ion Torrent), Ion Semiconductor Sequencing (Ion Torrent), DNA Nanosphere Sequencing, Nanopore Sequencing, Pacific Biosciences SMRT Sequencing, Genia Technologies Nanopore Single-molecule DNA Sequencing, Sequencing Oxford Nanopore single molecule DNA, polonium sequencing, copy number variation analysis (CNV) sequencing, small nucleotide polymorphism (SNP) analysis, immunohistochemistry (IHC), immunocytochemistry (ICC), mass spectrometry , tandem mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), in situ hybridization, fluorescent in situ hybridization (FISH), chromogenic in situ hybridization (CISH), hybridization silver in situ (SISH), polymerase chain reaction (PCR), digital PCR (dPCR), reverse transcription PCR, quantitative Pc R (Q-PCR), signal qPCR single lifter, real-time PCR, nCounter analysis (Nanostring Technology), Western blot, Southern blot, SDS-PAGE, gel electrophoresis, or Northern blot. In some cases, the analysis involves exome sequencing.

En algunos casos, el ácido nucleico se analiza utilizando tecnología de Sage Sciences, Inc. En algunos casos, el análisis comprende el dimensionamiento del ADN. En algunos casos, el dimensionamiento del ADN se realiza con casetes de gel desechables con agarosa prefabricada (Pippin, Sage Sciences).In some cases, the nucleic acid is analyzed using technology from Sage Sciences, Inc. In some cases, the analysis involves DNA sizing. In some cases, DNA sizing is done with pre-made agarose disposable gel cassettes (Pippin, Sage Sciences).

En algunos casos, el ácido nucleico se analiza usando secuenciación del genoma de representación reducida. En algún caso, el ácido nucleico se analiza usando RADseq (secuenciación de ADN asociada al sitio de restricción). El ADN se separa a lo largo de una columna de gel hasta que un fragmento programado alcanza un punto de ramificación. A continuación, se cambia un electrodo activo para desviar el ADN a una cámara de tampón unida a la membrana. Cuando se ha recogido un intervalo de tamaños, un electrodo activo se cambia de nuevo a un canal de separación. La muestra deseada se puede extraer con una pipeta. El tamaño del ADN puede ser de 90 pb a 1,5 kb (Pippen Prep) y de 50 pb a 50 kb (BluePippen). Pippen Pulse puede ser una fuente de alimentación de electroforesis de campo pulsado que se puede utilizar con geles analíticos que pueden permitir a los usuarios resolver el ADN hasta 100 kb y más.In some cases, the nucleic acid is analyzed using downstream genome sequencing. In some cases, the nucleic acid is analyzed using RADseq (restriction site associated DNA sequencing). The DNA is separated along a gel column until a programmed fragment reaches a branch point. An active electrode is then changed to divert the DNA into a membrane-bound buffer chamber. When a range of sizes has been collected, an active electrode is switched back to a separation channel. The desired sample can be extracted with a pipette. The DNA size can be 90 bp to 1.5 kb (Pippen Prep) and 50 bp to 50 kb (BluePippen). Pippen Pulse can be a pulsed field electrophoresis power supply that can be used with analytical gels that can allow users to resolve DNA up to 100 kb and more.

En algunos casos, se puede utilizar un SageELF (fraccionadores laterales electroforéticos) para el fraccionamiento de muestras completas para ADN y/o proteínas. Una muestra de ADN o proteína completa se puede fraccionar simultáneamente en al menos 12 fracciones de tamaño continuo. El ADN y/o las proteínas se separan por tamaño en una columna de separación de agarosa. Después de la separación, se puede activar un segundo conjunto de electrodos colocados lateralmente para electroeluir muestras en cámaras.In some cases, a SageELF (Electrophoretic Side Fractioners) can be used for fractionation of whole samples for DNA and / or proteins. A complete DNA or protein sample can be simultaneously fractionated into at least 12 continuous size fractions. DNA and / or proteins are separated by size on an agarose separation column. After separation, a second set of laterally placed electrodes can be activated to electroelute samples in chambers.

K. Secuenciación de última generaciónK. Next-generation sequencing

En algunos casos, un ácido nucleico (polinucleótido) procesado (por ejemplo, procesado o tratado química y/o enzimáticamente), purificado, aislado y/o concentrado utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se analiza usando secuenciación de última generación. En algunos casos, la secuenciación de última generación comprende Helicos T rue Single Molecule Sequencing (tSMS) (véase, por ejemplo, Harris T.D. et al. (2008) Science 320:106-109); 454 sequencing (Roche) (véase, por ejemplo, Margulies, M. et al. 2005, Nature, 437, 376-380); tecnología SOLiD (Applied Biosystems); secuenciación SOLEXA (Illumina); tecnología de molécula única en tiempo real (SMRT™) de Pacific Biosciences; o secuenciación de nanoporos (Soni GV y Meller A. (2007) Clin Chem 53: 1996-2001; Oxford Nanopore, Genia Technologies y Nabsys); secuenciación de semiconductores (Ion Torrent (Life Technologies); Personal Genome Machine); secuenciación de nanoesferas de ADN (por ejemplo, Complete Genomics); secuenciación utilizando tecnología de Dover Systems (Polonator). Se describen métodos de secuenciación de última generación, por ejemplo, en la Publicación PCT N.° WO2012149472.In some cases, a nucleic acid (polynucleotide) processed (eg, chemically and / or enzymatically processed or treated), purified, isolated, and / or concentrated using methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein is analyzes using state-of-the-art sequencing. In some cases, next-generation sequencing comprises Helicos T rue Single Molecule Sequencing (tSMS) (see, for example, Harris TD et al. (2008) Science 320: 106-109); 454 sequencing (Roche) (see, for example, Margulies, M. et al. 2005, Nature, 437, 376-380); SOLiD technology (Applied Biosystems); SOLEXA sequencing (Illumina); Single Molecule Real Time Technology (SMRT ™) from Pacific Biosciences; or nanopore sequencing (Soni GV and Meller A. (2007) Clin Chem 53: 1996-2001; Oxford Nanopore, Genia Technologies and Nabsys); Semiconductor Sequencing (Ion Torrent (Life Technologies); Personal Genome Machine); DNA nanosphere sequencing (eg Complete Genomics); sequencing using Dover Systems technology (Polonator). State-of-the-art sequencing methods are described, for example, in PCT Publication No. WO2012149472.

L. Construcción de bibliotecas de ácidos nucleicos L. Construction of nucleic acid libraries

En algunos casos, los ácidos nucleicos procesados, por ejemplo, procesados o tratados química y/o enzimáticamente), purificados, aislados y/o concentrados utilizando métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y/o kits descritos en el presente documento se utilizan para construir una biblioteca, por ejemplo, una biblioteca de secuenciación de última generación. Un líquido que contiene ácido nucleico (por ejemplo, células, núcleos) puede hacerse fluir a través de un canal en un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. La matriz de obstáculos se puede configurar para desviar partículas de un tamaño predeterminado (tamaño crítico) en una trayectoria de flujo que es diagonal a la dirección del flujo general de fluido. Las partículas más pequeñas se pueden dirigir con el flujo general de fluido. Se pueden añadir adaptadores a los ácidos nucleicos antes de que los ácidos nucleicos fluyan a través de un dispositivo, mientras los ácidos nucleicos fluyen a través de un dispositivo o después de que los ácidos nucleicos hayan fluido a través de un dispositivo. En algunos casos, los adaptadores son compatibles con la secuenciación mediante secuenciación Ilumina o secuenciación 454. Los adaptadores pueden comprender secuencias complementarias a uno o más cebadores de secuenciación. Los ácidos nucleicos más grandes y/o más pequeños que un tamaño crítico se pueden usar para la formación de bibliotecas, por ejemplo, formación de bibliotecas de secuenciación de última generación.In some cases, nucleic acids processed (e.g., chemically and / or enzymatically processed or treated), purified, isolated, and / or concentrated using methods, compositions, devices, systems, and / or kits described herein are used to construct a library, eg, a next-generation sequencing library. A nucleic acid-containing liquid (eg, cells, nuclei) can be flowed through a channel in a device comprising a matrix of obstacles. The obstacle matrix can be configured to deflect particles of a predetermined size (critical size) in a flow path that is diagonal to the direction of general fluid flow. Smaller particles can be directed with the general flow of fluid. Adapters can be added to nucleic acids before the nucleic acids flow through a device, while nucleic acids flow through a device or after nucleic acids have flowed through a device. In some cases, the adapters are compatible with sequencing by Ilumina sequencing or 454 sequencing. The adapters can comprise sequences complementary to one or more sequencing primers. Nucleic acids larger and / or smaller than a critical size can be used for library building, eg, next generation sequencing library building.

En algunos casos, los ácidos nucleicos se amplifican antes de fluir a través de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, los ácidos nucleicos se amplifican después de fluir a través de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, se amplifican partículas de al menos un tamaño crítico después de fluir a través de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, las partículas de menos de un tamaño crítico se amplifican después de fluir a través de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos.In some cases, nucleic acids are amplified before flowing through a device that comprises an array of obstacles. In some cases, nucleic acids are amplified after flowing through a device that comprises an array of obstacles. In some cases, particles of at least a critical size are amplified after flowing through a device comprising a matrix of obstacles. In some cases, particles less than a critical size are amplified after flowing through a device comprising an obstacle matrix.

En algunos casos, los adaptadores comprenden códigos de barras. Los códigos de barras se pueden utilizar para identificar una muestra, organismo o célula de la que procede un ácido nucleico.In some cases, the adapters include barcodes. Barcodes can be used to identify a sample, organism, or cell from which a nucleic acid is derived.

Se describen métodos para la formación de bibliotecas de secuenciación de última generación en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20130079251.Methods for the formation of state-of-the-art sequencing libraries are described in US Patent Application Publication No. 20130079251.

M. cultivo celularM. cell culture

En algunos casos, las células procesadas (procesadas o tratadas química y/o enzimáticamente), purificadas, aisladas y/o los kits descritos en el presente documento se utilizan para cultivo celular. En algunos casos, las células aisladas, por ejemplo, las células madre, se pueden diferenciar en cultivo. En algunos casos, las células madre aisladas, purificadas y/o concentradas se utilizan para expansión ex vivo. En algunos casos, la célula madre se somete a expansión ex vivo purificada.In some cases, processed (chemically and / or enzymatically processed or treated), purified, isolated cells and / or the kits described herein are used for cell culture. In some cases, isolated cells, for example stem cells, can differentiate in culture. In some cases, isolated, purified and / or concentrated stem cells are used for ex vivo expansion. In some cases, the stem cell undergoes purified ex vivo expansion.

En algunos casos, se usa una HSC para dar lugar a células sanguíneas, por ejemplo, glóbulos rojos, linfocitos B, linfocitos T, células asesinas naturales, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos y macrófagos. Una célula madre mesenquimatosa puede dar lugar a, por ejemplo, células óseas (osteocitos), células de cartílago (condrocitos), células grasas (adipocitos) y otros tipos de células del tejido conectivo, tales como las de los tendones. Una célula madre neural puede dar lugar a, por ejemplo, células nerviosas (neuronas) y dos categorías de células no neuronales, por ejemplo, astrocitos y oligodendrocitos. En algunos casos, la célula madre es una célula madre epitelial. Una célula madre epitelial puede revestir el tracto digestivo y puede aparecer en criptas profundas. Una célula madre epitelial puede dar lugar a células absorbentes, células caliciformes, células de Paneth y/o células enteroendocrinas. En algunos casos, la célula madre es una célula madre de la piel. Una célula madre de la piel puede aparecer en la capa basal de la epidermis y en la base de los folículos pilosos. Una célula madre epidérmica puede dar lugar a queratinocitos, que pueden migrar a la superficie de la piel y formar una capa protectora. Las células madre foliculares pueden dar lugar tanto al folículo piloso como a la epidermis.In some cases, an HSC is used to give rise to blood cells, for example, red blood cells, B lymphocytes, T lymphocytes, natural killer cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, and macrophages. A mesenchymal stem cell can give rise to, for example, bone cells (osteocytes), cartilage cells (chondrocytes), fat cells (adipocytes), and other types of connective tissue cells, such as tendon cells. A neural stem cell can give rise to, for example, nerve cells (neurons) and two categories of non-neuronal cells, for example, astrocytes and oligodendrocytes. In some cases, the stem cell is an epithelial stem cell. An epithelial stem cell can line the digestive tract and can appear in deep crypts. An epithelial stem cell can give rise to absorbent cells, goblet cells, Paneth cells, and / or enteroendocrine cells. In some cases, the stem cell is a skin stem cell. A skin stem cell can appear in the basal layer of the epidermis and at the base of the hair follicles. An epidermal stem cell can give rise to keratinocytes, which can migrate to the surface of the skin and form a protective layer. Follicular stem cells can give rise to both the hair follicle and the epidermis.

En algunos casos, las células se cultivan en medio sin suero. En algunos casos, el cultivo celular comprende uno o más factores de crecimiento. En algunos casos, el medio de cultivo comprende el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), azida de sodio, ácido ascórbico, medio basal alfa-MEM, medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), L-glutamina, aminoácidos no esenciales MEM, 2-mercaptoetanol, bicarbonato de sodio, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (p-HEMA), NaOH, Percoll, PBS, PBS (sin calcio ni magnesio), gelatina de piel porcina, tipo A, EDTA, EDTA 0,5 M, pH 8,0, MTG, monotioglicerol, suero bovino fetal definido, tripsina 0,05 %/EDTa 0,5 mM, colagenasa tipo IV, Neupogen, Leukina, M-CSF humano, FGF-basi humano, ligando de Flt3 humano, Il-1beta humano, IL-3 humano, IL-4 humano, IL-5 humano, sRANKL humano, TGF-beta1 humano, TNF-alfa humano, 1 alfa, 25-dihidroxivitamina D3, solución de azul tripán, 0,4 %, aceite de inmersión, 7-aad, 7-aminoactinomicina D, fracción V de albúmina de suero bovino y/o etanol.In some cases, cells are grown in serum-free medium. In some cases, the cell culture comprises one or more growth factors. In some cases, the culture medium comprises Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Sodium Azide, Ascorbic Acid, Alpha-MEM Basal Medium, Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), L-Glutamine, Nonessential Amino Acids MEM, 2-mercaptoethanol, sodium bicarbonate, poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (p-HEMA), NaOH, Percoll, PBS, PBS (without calcium and magnesium), porcine skin gelatin, type A, EDTA, EDTA 0 , 5 M, pH 8.0, MTG, monothioglycerol, defined fetal calf serum, 0.05% trypsin / 0.5 mM EDTa, type IV collagenase, Neupogen, Leukin, human M-CSF, human FGF-basi, ligand of Human Flt3, human Il-1beta, human IL-3, human IL-4, human IL-5, human sRANKL, human TGF-beta1, human TNF-alpha, 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3, trypan blue solution, 0 , 4%, immersion oil, 7-aad, 7-aminoactinomycin D, fraction V of bovine serum albumin and / or ethanol.

En algunos casos, se utilizan anticuerpos para analizar la diferenciación de progenitores hematopoyéticos y los linajes mieloides a partir de células madre pluripotentes humanas. Los anticuerpos pueden incluir anti-CD1a humano, anti-CD2 humano, anti-CD3 humano, anti-CD3 humano, anti-CD7 humano, anti-CD10 humano, anti-CD11b humano, anti-CD13 humano, anti-CD14 humano, anti-CD15 humano, anti-CD16 humano, anti-CD16 humano, anti-CD19 humano, anti-CD34 humano, anti-CD41a humano, anti-CD45 humano, anti-CD64 humano, anti-CD66b humano, anti-CD90 humano (Thy-1) anti-CD115 humano, anti-CD117 humano, anti-CD123 humano, anti-CD163 humano o anti-CD235a humano. Se describe la diferenciación hematopoyética de células madre, por ejemplo, en crm.nih.gov/stemcell_types/HSC/UWisc_HSC.asp.In some cases, antibodies are used to analyze the differentiation of hematopoietic progenitors and myeloid lineages from human pluripotent stem cells. Antibodies may include anti-human CD1a, anti-human CD2, anti-human CD3, anti-human CD3, anti-human CD7, anti-human CD10, anti-human CD11b, anti-human CD13, anti-human CD14, anti -Human CD15, anti-human CD16, anti-human CD16, anti-human CD19, anti-human CD34, anti-human CD41a, anti-human CD45, anti-human CD64, anti-human CD66b, anti-human CD90 (Thy -1) anti-human CD115, anti-human CD117, anti-human CD123, anti-human CD163 or anti-human CD235a. Hematopoietic stem cell differentiation is described, for example, at crm.nih.gov/stemcell_types/HSC/UWisc_HSC.asp.

En algunos casos, se comparan leucocitos totales y tres poblaciones principales (linfocitos, monocitos y granulocitos) con el recuento del analizador hematológico ABX.In some cases, total leukocytes and three major populations (lymphocytes, monocytes, and granulocytes) are compared with the ABX hematology analyzer count.

VIII. Sistemas VIII. Systems

En algunos casos, los dispositivos que comprenden una matriz de obstáculos como se describe en el presenteIn some cases, devices that comprise an obstacle matrix as described herein

documento son parte de un sistema. En algunos casos, el sistema comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,document are part of a system. In some cases, the system comprises at least 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,

12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 dispositivos que están acoplados, por ejemplo, acoplados de forma fluida. En12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 devices that are coupled, eg fluidly coupled. In

algunos casos, una cámara o depósito está aguas arriba de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos.some cases, a chamber or reservoir is upstream of a device that comprises an obstacle matrix.

La cámara o depósito puede comprender una muestra. Una primera cámara o depósito se puede acoplar de formaThe chamber or reservoir may comprise a sample. A first chamber or reservoir can be coupled so

fluida a una segunda cámara. La segunda cámara o depósito se puede utilizar para manipular partículas, por ejemplo,fluid to a second chamber. The second chamber or reservoir can be used to handle particles, for example,

partículas marcadoras.marker particles.

En algunos casos, un sistema comprende una cámara de reacción. En una cámara de reacción, las partículas puedenIn some cases, a system comprises a reaction chamber. In a reaction chamber, the particles can

hacerse reaccionar, por ejemplo, las células se pueden marcar, por ejemplo, con un anticuerpo fluorescente. Enreacted, for example, cells can be labeled, for example, with a fluorescent antibody. In

algunos casos, las células se lisan en una cámara de reacción. En algunos casos, un reactivo de lisis celularsome cases, the cells are lysed in a reaction chamber. In some cases, a cell lysis reagent

comprende un detergente. En algunos casos, el detergente comprende Triton X-100, SDS, CHAPS o Tween-20.It comprises a detergent. In some cases, the detergent comprises Triton X-100, SDS, CHAPS, or Tween-20.

En algunos casos, el sistema comprende una bomba. En algunos casos, una bomba está conectada de forma fluidaIn some cases, the system comprises a pump. In some cases, a pump is fluidly connected

a una entrada o salida de un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. La bomba se puede conectar a unto an input or output of a device comprising an obstacle matrix. The pump can be connected to a

dispositivo que comprende una matriz de obstáculos directa o indirectamente. En algunos casos, la bomba estádevice comprising a matrix of obstacles directly or indirectly. In some cases, the pump is

conectada a una cámara, por ejemplo, una cámara de reacción.connected to a chamber, for example a reaction chamber.

En algunos casos, el sistema comprende un medio para propulsar partículas a través de un dispositivo o cámara. EnIn some cases, the system comprises a means for propelling particles through a device or chamber. In

algunos casos, se usan fuerzas eléctricas, electroforéticas, electro-osmóticas, centrífugas, gravitacionales,some cases, electric, electrophoretic, electro-osmotic, centrifugal, gravitational forces are used,

hidrodinámicas, de gradiente de presión o capilares para impulsar partículas o fluidos.hydrodynamic, pressure gradient or capillary to drive particles or fluids.

En algunos casos, un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos está conectado de forma fluida a un aparatoIn some cases, a device comprising an obstacle matrix is fluidly connected to an apparatus

aguas abajo. En algunos casos, el aparato de aguas abajo permite el análisis de partículas desde una salida deldownstream. In some cases, the downstream apparatus allows particle analysis from an outlet of the

dispositivo. En algunos casos, el aparato aguas abajo es un microscopio, citómetro de flujo, máquina de secuenciación,device. In some cases, the downstream apparatus is a microscope, flow cytometer, sequencing machine,

máquina de secuenciación de última generación, espectrómetro de masas, HPLc , cromatógrafo de gases,state-of-the-art sequencing machine, mass spectrometer, HPLc, gas chromatograph,

espectrómetro de absorción atómica, detector de fluorescencia, contador de radiactividad, contador de centelleo oatomic absorption spectrometer, fluorescence detector, radioactivity counter, scintillation counter or

espectrofotómetro, contador de células o coagulómetro.spectrophotometer, cell counter or coagulometer.

En algunos casos, el sistema comprende un ordenador. Un ordenador puede estar en comunicación eléctrica con unIn some cases, the system comprises a computer. A computer may be in electrical communication with a

dispositivo que comprende una matriz de obstáculos.device comprising a matrix of obstacles.

En algunos casos, una muestra se filtra antes de aplicarse a un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos.In some cases, a sample is filtered before being applied to a device that comprises an obstacle matrix.

En algunos casos, una muestra pasa a través de un filtro después de que la muestra ha pasado a través de unIn some cases, a sample passes through a filter after the sample has passed through a

dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, un sistema de filtración está en comunicacióndevice comprising a matrix of obstacles. In some cases, a filtration system is in communication

fluida con un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, un sistema de filtración no estáfluid with a device comprising an obstacle matrix. In some cases, a filtration system is not

en comunicación fluida con un dispositivo que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, el filtro es unin fluid communication with a device comprising a matrix of obstacles. In some cases, the filter is a

filtro de jeringa. En algunos casos, el filtro comprende un tamaño de poro de 0,2 micrómetros o 0,45 micrómetros. Ensyringe filter. In some cases, the filter comprises a pore size of 0.2 microns or 0.45 microns. In

algunos casos, el filtro comprende un filtro de 20 micrómetros. En algunos casos, el filtro comprende un tamaño desome cases, the filter comprises a 20 micron filter. In some cases, the filter comprises a size of

poro de al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9,pore of at least 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2, 5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9,

9.5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24,9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24,

25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 5 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 8 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o 200 micrómetros.25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 5 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82, 83, 8 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 or 200 microns.

En algunos casos, el filtro comprende un tamaño de poro de menos de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5,In some cases, the filter comprises a pore size of less than 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5,

16.5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,

73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o 20073, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 or 200

micrómetros.micrometers.

En algunos casos, el filtro comprende un tamaño de poro de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9,In some cases, the filter comprises a pore size of approximately 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9,

1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5,1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5,

16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 6 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 1 micrómetros.41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 6 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 , 94, 95, 96, 97, 98, 99, 1 microns.

Se describen sistemas, por ejemplo, en la Publicación PCT N.° WO2012024194.Systems are described, for example, in PCT Publication No. WO2012024194.

En algunos casos, una pluralidad de dispositivos, por ejemplo, chips microfluídicos, se pueden hacer funcionarIn some cases, a plurality of devices, for example, microfluidic chips, can be operated

simultáneamente con un módulo. En algunos casos, la pluralidad de dispositivos (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6,simultaneously with a module. In some cases, the plurality of devices (for example, at least 2, 3, 4, 5, 6,

7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 100 o 200) se pueden hacer funcionar simultáneamente con un módulo. En7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 100 or 200) can be operated simultaneously with one module. In

algunos casos, se puede colocar una pluralidad de dispositivos dentro de un módulo, en donde cada dispositivoIn some cases, a plurality of devices can be placed within a module, where each device

comprende al menos un canal que comprende una matriz de obstáculos. En algunos casos, la aplicación de muestra, it comprises at least one channel comprising a matrix of obstacles. In some cases, the sample app,

la aplicación de tampón, el flujo de muestra, el flujo de tampón y/o la recolección de salida en cada uno de los dispositivos se pueden controlar por el módulo.buffer application, sample flow, buffer flow, and / or output collection in each of the devices can be controlled by the module.

En algunos casos, el módulo es un instrumento de sobremesa como se muestra en la FIG. 30. En algunos casos, el módulo está acoplado electrónicamente a un ordenador. En algunos casos, el módulo está acoplado con uno o más componentes, por ejemplo, microscopio, citómetro de flujo, máquina de secuenciación de última generación, etc. In some cases, the module is a benchtop instrument as shown in FIG. 30. In some cases, the module is electronically coupled to a computer. In some cases, the module is coupled with one or more components, for example, microscope, flow cytometer, state-of-the-art sequencing machine, etc.

En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento puede ser parte de un sistema. En algunos casos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento es parte de un sistema para procesar y analizar partículas. El sistema puede comprender: una pluralidad de depósitos, un dispositivo tal como se proporciona en el presente documento y un dispositivo analítico. El depósito puede comprender una muestra que comprende partículas, un tampón de lavado o un reactivo. El dispositivo puede ser cualquier dispositivo tal como se proporciona en el presente documento. El dispositivo puede estar en comunicación fluida con cada uno de la pluralidad de depósitos. El dispositivo se puede adaptar para procesar partículas de la muestra que comprende partículas. En algunos casos, el procesamiento comprende hacer fluir la muestra que comprende partículas desde un depósito que comprende la muestra a una entrada de un dispositivo y hacer pasar las partículas a través del dispositivo. El paso puede comprender hacer fluir las partículas desde la entrada a través de una pluralidad de corrientes de flujo paralelas dentro del dispositivo, en donde al menos una de las corrientes de flujo paralelas comprende un reactivo que fluye desde al menos uno de la pluralidad de depósitos, y en donde el dispositivo comprende una matriz de obstáculos, con lo que el paso de las partículas a través del dispositivo sirve para procesar las partículas así como para separar las partículas por tamaño. El dispositivo analítico puede estar en comunicación fluida con al menos uno de una pluralidad de puertos de salida del dispositivo. El dispositivo analítico se puede configurar para realizar un análisis de partículas procesadas por el dispositivo. En algunos casos, el dispositivo analítico puede ser cualquier aparato aguas abajo descrito en el presente documento. En algunos casos, el dispositivo analítico puede ser un dispositivo que realice cualquiera de los análisis descritos en el presente documento. En un caso, el dispositivo analítico puede ser un clasificador de células, por ejemplo, un citómetro de flujo.In some cases, a device as provided herein may be part of a system. In some cases, a device as provided herein is part of a system for processing and analyzing particles. The system may comprise: a plurality of reservoirs, a device as provided herein, and an analytical device. The reservoir may comprise a sample comprising particles, a wash buffer, or a reagent. The device can be any device as provided herein. The device may be in fluid communication with each of the plurality of reservoirs. The device can be adapted to process particles of the sample comprising particles. In some cases, the processing comprises flowing the sample comprising particles from a reservoir comprising the sample to an inlet of a device and passing the particles through the device. The passage may comprise flowing the particles from the inlet through a plurality of parallel flow streams within the device, wherein at least one of the parallel flow streams comprises a reagent flowing from at least one of the plurality of reservoirs. , and wherein the device comprises a matrix of obstacles, whereby the passage of the particles through the device serves to process the particles as well as to separate the particles by size. The analytical device may be in fluid communication with at least one of a plurality of output ports of the device. The analytical device can be configured to perform an analysis of particles processed by the device. In some cases, the analytical device can be any downstream apparatus described herein. In some cases, the analytical device may be a device that performs any of the analyzes described herein. In one case, the analytical device can be a cell sorter, for example a flow cytometer.

Algunos procesos manuales pueden ser propensos a errores. Por ejemplo, un proceso manual puede introducir reactivos citotóxicos, puede ofrecer rendimientos celulares bajos, puede perder células selectivamente, puede necesitar mucho tiempo y puede requerir una considerable habilidad y experiencia humana para generar una muestra uniforme que tenga un alto rendimiento, pureza y viabilidad. En sangre humana no fraccionada, los glóbulos rojos (RBC) pueden superar en gran medida el número de plaquetas y glóbulos blancos (WBC) en aproximadamente 650:40:1, respectivamente. En algunos casos, una fracción de glóbulos blancos se enriquece mediante (1) destrucción de la fracción de RBC (lisis hipotónica de RBC), 2) separación de células usando un gradiente de densidad (por ejemplo, Ficoll-Hypaque), o 3) usando partículas inmunomagnéticas.Some manual processes can be error prone. For example, a manual process may introduce cytotoxic reagents, it may offer low cell yields, it may selectively lose cells, it may be time consuming, and it may require considerable human skill and experience to generate a uniform sample that has high throughput, purity, and viability. In unfractionated human blood, red blood cells (RBC) can greatly exceed the number of platelets and white blood cells (WBC) by approximately 650: 40: 1, respectively. In some cases, a white blood cell fraction is enriched by (1) destruction of the RBC fraction (hypotonic RBC lysis), 2) cell separation using a density gradient (e.g. Ficoll-Hypaque), or 3) using immunomagnetic particles.

IX. Dispositivos y sistemasIX. Devices and systems

Se puede desarrollar un conjunto de productos para procesar muestras de sangre utilizando microchips de varios diseños que se describen en el presente documento. Estos microchips pueden diseñarse para manejar diferentes tipos de muestras y aplicaciones y tener diferentes formas.A suite of products can be developed to process blood samples using microchips of various designs that are described herein. These microchips can be designed to handle different types of samples and applications and have different shapes.

Se puede utilizar un "sistema de preparación de muestras" (SPS). El SPS puede integrarse y optimizarse, y comprende un instrumento que impulsa corrientes fluídicas desde una serie de consumibles de chip DLD microfluídico junto con protocolos operativos de instrumentos que pueden proporcionar diferentes funcionalidades, dependiendo de los requisitos de la aplicación.A "sample preparation system" (SPS) can be used. The SPS can be integrated and optimized, and comprises an instrument that drives fluidic streams from a series of microfluidic DLD chip consumables along with instrument operating protocols that can provide different functionality, depending on application requirements.

El instrumento puede ser el "controlador" de los microchips y puede proporcionar fluidos de entrada/salida, depósitos de tampón/reactivo y software de automatización para hacer funcionar los chips. El número de entradas y salidas de fluidos se puede determinar según los requisitos de cada ensayo. El software puede automatizar la configuración, operación y apagado del sistema.The instrument can be the "controller" of the microchips and can provide input / output fluids, buffer / reagent reservoirs and automation software to operate the chips. The number of fluid inlets and outlets can be determined according to the requirements of each test. The software can automate system setup, operation, and shutdown.

Se puede ofrecer una serie de chips microfluídicos con niveles específicos de capacidad para maximizar la flexibilidad en el cumplimiento de los requisitos del cliente. El diseño del chip y los protocolos asociados pueden producir un producto discreto. El chip se puede integrar en un cartucho que se ajusta al instrumento. La geometría del chip se puede determinar según los requisitos de rendimiento funcional, es decir, el número de muestras por chip, volumen de muestra y tiempo de procesamiento. Los diseños de chips pueden acomodar múltiples muestras independientes según los requisitos del usuario y el coste por muestra.A series of microfluidic chips can be offered with specific levels of capacity to maximize flexibility in meeting customer requirements. The chip design and associated protocols can produce a discrete product. The chip can be integrated into a cartridge that fits the instrument. The geometry of the chip can be determined based on functional performance requirements, that is, the number of samples per chip, sample volume, and processing time. Chip designs can accommodate multiple independent samples based on user requirements and cost per sample.

En los ejemplos 13, 14 y 15 se describen ejemplos del sistema de preparación de muestras 1.0 (SPS 1.0). En los ejemplos 16, 17, 18 y 19 se describen ejemplos del sistema de preparación de muestras (SPS 2.0/Car Wash). Pueden comprender un instrumento, un conjunto de chips y protocolos de procesamiento. SPS 2.0 puede realizar múltiples etapas de procesamiento celular, análogas a un "lavado de coches" de múltiples etapas. Conceptualmente similar a un coche que se mueve a través de un lavado de coches que puede someterse a múltiples tratamientos secuenciales (por ejemplo, lavado, aclarado, encerado, secado), las células que fluyen a través del chip pueden ser guiadas suavemente por la geometría de los postes a través de una secuencia programable de tampones y reactivos para marcarlas, fijarlas, permeabilizarlas y lavarlas mientras se retiran los glóbulos rojos (RBC), las plaquetas y las partículas más pequeñas. Este proceso puede producir una preparación "limpia" de células diana que pueden proporcionar resultados de citometría de flujo de alta calidad. La FIG.47 y el Ejemplo 24 proporcionan una descripción general de los productos.Examples 13, 14 and 15 describe Sample Preparation System 1.0 (SPS 1.0) examples. Examples 16, 17, 18 and 19 describe examples of the sample preparation system (SPS 2.0 / Car Wash). They can comprise an instrument, a set of chips, and processing protocols. SPS 2.0 can perform multiple stages of cell processing, analogous to a multi-stage "car wash." Conceptually similar to a car moving through a car wash that can undergo multiple sequential treatments (e.g. washing, rinsing, waxing, drying), the cells flowing through the chip can be gently guided by geometry of posts through a programmable sequence of buffers and reagents to mark, fix, permeate, and wash them while removing red blood cells (RBC), platelets, and smaller particles. This process can produce a "clean" preparation of target cells that can provide high-quality flow cytometry results. FIG. 47 and Example 24 provide an overview of the products.

Existe la necesidad de nuevos métodos para mejorar la eficiencia de la preparación de muestras para el método analítico de citometría de flujo ampliamente utilizado. La citometría de flujo multiparamétrica puede ser una tecnología poderosa y ampliamente utilizada en investigación y en pruebas de diagnóstico clínico para el cáncer y muchas otras enfermedades (12-14). Por ejemplo, la citometría de flujo puede ser una herramienta de apoyo analítica vital para el análisis de subconjuntos de células y la cuantificación de citocinas basada en microesferas en el campo emergente de la inmunoterapia para el cáncer (15). Otras aplicaciones clínicas emergentes y de investigación importantes pueden incluir la clasificación celular para la genómica unicelular, proteómica y metabolómica (17), análisis de subpoblaciones para cáncer y enfermedades inmunológicas (18) y evaluación del riesgo cardiovascular (19).There is a need for new methods to improve the efficiency of sample preparation for the widely used flow cytometry analytical method. Multiparametric flow cytometry can be a powerful and widely used technology in research and clinical diagnostic testing for cancer and many other diseases (12-14). For example, flow cytometry can be a vital analytical support tool for cell subsets analysis and microsphere-based cytokine quantification in the emerging field of cancer immunotherapy (15). Other important emerging clinical and research applications may include cell sorting for single-cell genomics, proteomics, and metabolomics (17), subpopulation analysis for cancer and immunological diseases (18), and cardiovascular risk assessment (19).

La tecnología de procesamiento microfluídico de células descrita en el presente documento puede proporcionar alternativas a los métodos actuales de procesamiento de células (20). Los procesos de chips DLD microfluídicos pueden recoger células de un flujo de fluido en función del tamaño (21). Las partículas por encima de un cierto tamaño crítico (por ejemplo, los glóbulos blancos (WBC)) pueden "impactar" con los postes para fluir en una dirección a lo largo del eje de la matriz inclinada (por lo tanto, el dispositivo puede denominarse "matriz de impacto"; FIG. 17). Las partículas más pequeñas y moléculas disueltas, tales como glóbulos rojos (RBC), plaquetas, constituyentes del suero solubles y en forma de partículas, Mab y reactivos químicos pueden fluir en línea recta, en promedio, con la corriente de fluido. Por tanto, después de desplazarse a través del chip microfluídico, las células más grandes pueden haber salido y pueden haberse alejado de la corriente de fluido de la mezcla de entrada original y pueden recogerse por separado. El proceso se puede utilizar para retirar una gama de objetos de un fluido de entrada, que varían desde grandes oligómeros de ADN (-100 kpb) hasta E. coli y otras bacterias, plaquetas, glóbulos rojos (RBC) y glóbulos blancos (WBC) (21-23). El tamaño crítico que determina qué trayectoria siguen las celdas u otros objetos se puede controlar mediante el diseño de la matriz de micropostes (por ejemplo, el tamaño y la forma de los postes, espacios entre postes, el ángulo de inclinación del eje) (24).The microfluidic cell processing technology described herein may provide alternatives to current cell processing methods (20). Microfluidic DLD chip processes can collect cells from a fluid stream as a function of size (21). Particles above a certain critical size (for example, white blood cells (WBC)) can "hit" the posts to flow in one direction along the axis of the inclined matrix (hence the device can be called "impact matrix"; FIG. 17 ). Smaller particles and dissolved molecules, such as red blood cells (RBC), platelets, soluble and particulate serum constituents, Mabs, and chemical reagents can flow in straight lines, on average, with the fluid stream. Thus, after moving through the microfluidic chip, the larger cells may have exited and may have drifted away from the original input mix fluid stream and may be collected separately. The process can be used to remove a range of objects from an input fluid, ranging from large DNA oligomers (-100 kbp) to E. coli and other bacteria, platelets, red blood cells (RBC), and white blood cells (WBC). (21-23). The critical size that determines which path cells or other objects follow can be controlled by the design of the micropost array (e.g., size and shape of posts, spacing between posts, angle of axis tilt) (24 ).

Los métodos, dispositivos y sistemas proporcionados en el presente documento pueden realizar el marcaje y lavado en el chip de glóbulos blancos (WBC), después de recogerlos de una corriente de entrada de sangre completa en el mismo chip, pasándolos a través de una corriente de rodamina 6G, aunque los resultados no se cuantificaron (28). También se describe en el presente documento un concepto de "pared separadora" que puede tanto confinar las células a la corriente de proceso central durante más tiempo como ralentizar la difusión de los reactivos (28).The methods, devices and systems provided herein can perform on-chip labeling and washing of white blood cells (WBCs), after collecting them from a whole blood input stream on the same chip, passing them through a stream of Rhodamine 6G, although the results were not quantified (28). Also described herein is a "partition wall" concept that can both confine cells to the central process stream for a longer time and slow reagent diffusion (28).

EjemplosExamples

Ejemplo 1: FabricaciónExample 1: Manufacturing

Se fabrican chips utilizando grabado profundo con iones reactivos (DRIE) altamente anisotrópico en sustratos pulidos de silicio cristalino utilizando un proceso "Bosch" que alterna entre las etapas de grabado y pasivación de la pared lateral, de modo que la pared lateral del poste difiere de la vertical solo en ~ 1 °. La litografía óptica define los patrones. Se micromecanizan orificios pasantes a través del sustrato que permiten la carga/descarga de fluido desde la parte trasera, que están acoplados a una plantilla de plástico con conectores a las fuentes de entrada y la recolección de salida. El chip se pretrata con copolímero Triblock F108 (2 g/l) para reducir la adhesión celular. Los parámetros de diseño del chip (por ejemplo, tamaño crítico para el comportamiento de impacto) se ajustan para obtener un alto rendimiento.Chips are fabricated using highly anisotropic Reactive Ion Deep Etching (DRIE) on polished crystalline silicon substrates using a "Bosch" process that alternates between the etching and passivation steps of the side wall so that the side wall of the post differs from vertical only by ~ 1 °. Optical lithography defines the patterns. Through holes are micromachined through the substrate allowing fluid loading / unloading from the rear, which are attached to a plastic jig with connectors to the input sources and the output collection. The chip is pretreated with Triblock F108 copolymer (2 g / l) to reduce cell adhesion. Chip design parameters (eg critical size for impact behavior) are tuned for high performance.

Ejemplo 2: OperaciónExample 2: Operation

Se incuban leucocitos de 0,1-1 ml de sangre completa lisada con eritrocitos (opcionalmente diluida con tampón (PBS sin calcio y magnesio, que contiene BSA 1 % y EDTA 4 mM) y opcionalmente enriquecidos con células leucémicas) con Mab fluorescentes ("inmunotinción") contra múltiples antígenos de superficie celular de diferenciación de leucocitos (es decir, CD45/CD14/15 (para enumerar los tipos de células monogranulocíticas), CD3/4/8 (para enumerar los subconjuntos de linfocitos T comunes), CD19/56/14 (para identificar linfocitos B y células NK), CD45/CD235a/CD71 (para identificar cualquier célula eritroide contaminante) y con un colorante de viabilidad. Esto se hace de forma convencional, es decir, fuera de chip. Después, las células se lavan y se concentran a ~ 1-10 millones de células/ml utilizando chips DLD diseñados para mover leucocitos y células leucémicas desde la corriente inicial de la suspensión de células de entrada que contiene Mab fluorescentes a la corriente de salida de tampón limpio contra la pared del chip (Figura 17B). 0.1-1 ml leukocytes of erythrocyte-lysed whole blood (optionally diluted with buffer (PBS without calcium and magnesium, containing 1% BSA and 4 mM EDTA) and optionally enriched with leukemic cells) are incubated with fluorescent Mabs (" immunostaining ") against multiple leukocyte differentiation cell surface antigens (i.e. CD45 / CD14 / 15 (to list monogranulocytic cell types), CD3 / 4/8 (to list common T lymphocyte subsets), CD19 / 56/14 (to identify B lymphocytes and NK cells), CD45 / CD235a / CD71 (to identify any contaminating erythroid cells), and with a viability dye. This is done conventionally, ie off-chip. Thereafter, the Cells are washed and concentrated to ~ 1-10 million cells / ml using DLD chips designed to move leukocytes and leukemic cells from the initial stream of the input cell suspension containing fluorescent Mabs to the output stream of ta Clean plug against the wall of the chip ( Figure 17B ) .

El método puede recuperar > 90 % de los leucocitos de entrada, concentrados de nuevo a su concentración original en sangre completa (~ 1-10 millones de células/ml), a un caudal de -200 pl/min. La viabilidad de los leucocitos se evalúa mediante un colorante de viabilidad (objetivo: > 90 % de viabilidad) y el inmunomarcaje se evalúa mediante citometría de flujo (FACS) para determinar el contenido de cada tipo de célula leucocitaria principal (es decir, rendimiento de cada uno de los tipos de leucocitos anteriores y células leucémicas añadidas opcionalmente marcadas; en algunos casos, > 90 % de rendimiento de cada tipo de célula) frente a las células idénticas procesadas mediante métodos convencionales de lavado/concentración por centrifugación. Posteriormente se compara la calidad de la inmunotinción de cada tipo de célula con el lavado/concentración microfluídica frente al convencional. Se cuantifica la cantidad de Mab fluorescentes residuales que contaminan los leucocitos obtenidos por ambas técnicas midiendo la fluorescencia de alícuotas libres de células de la muestra de partida y de los productos leucocitarios (objetivo: queda < 1 % del Mab inicial). Estas mediciones de fluorescencia se realizan en pocillos por triplicado de una placa de 96 pocillos utilizando un lector de placas de fluorescencia.The method can recover> 90% of the input leukocytes, concentrated back to their original concentration in whole blood (~ 1-10 million cells / ml), at a flow rate of -200 pl / min. Leukocyte viability is assessed using a viability dye (target:> 90% viability) and immunostaining is assessed by flow cytometry (FACS) to determine the content of each major leukocyte cell type (i.e., yield of each of the above leukocyte types and optionally labeled added leukemic cells; in some cases,> 90 % yield of each cell type) versus identical cells processed by conventional centrifugal wash / concentration methods. Subsequently, the quality of the immunostaining of each cell type is compared with the wash / microfluidic concentration versus the conventional one. The amount of residual fluorescent Mabs contaminating the leukocytes obtained by both techniques is quantified by measuring the fluorescence of cell-free aliquots of the starting sample and the leukocyte products (target: <1% of the starting Mab remains). These fluorescence measurements are performed in triplicate wells of a 96-well plate using a fluorescence plate reader.

Se realizan experimentos análogos después de una reacción de fijación/permeabilización fuera del chip en leucocitos de 0,1-1 ml de sangre completa con eritrocitos lisados (opcionalmente diluida con tampón y opcionalmente enriquecida con células de leucemia). La presencia de cantidades significativas de reactivos de fijación/permeabilización residuales se determina indirectamente por el nivel de unión no selectiva posterior de Mab fluorescentes irrelevantes (Mab de control de isotipo fluorescentes). Finalmente, se realizan experimentos similares después del marcaje intracelular y se miden los anticuerpos fluorescentes libres residuales en el producto leucocitario.Analogous experiments are performed after an off-chip fixation / permeabilization reaction on 0.1-1 ml leukocytes of whole blood with lysed erythrocytes (optionally diluted with buffer and optionally enriched with leukemia cells). The presence of significant amounts of residual binding / permeabilization reagents is indirectly determined by the level of subsequent non-selective binding of irrelevant fluorescent Mabs (fluorescent isotype control Mabs). Finally, similar experiments are performed after intracellular labeling and residual free fluorescent antibodies in the leukocyte product are measured.

Cuando el dispositivo y los protocolos se optimizan para producir de forma rutinaria leucocitos de salida que cumplen los criterios deseados, se realiza una serie de varios experimentos sucesivos (número de experimentos sujeto al significado estadístico y cálculos de potencia) en los que los leucocitos de una muestra de sangre determinada se lavan/concentran simultáneamente en el dispositivo microfluídico frente a procedimientos convencionales de centrifugación realizados por un individuo experimentado. Se realizan comparaciones estadísticas de viabilidad celular, rendimiento, pureza y subconjuntos de leucocitos.When the device and protocols are optimized to routinely produce output leukocytes that meet the desired criteria, a series of several successive experiments (number of experiments subject to statistical significance and power calculations) is performed in which the leukocytes from one Determined blood samples are simultaneously washed / concentrated in the microfluidic device versus conventional centrifugation procedures performed by an experienced individual. Statistical comparisons of cell viability, yield, purity, and leukocyte subsets are made.

Ejemplo 3: Leucocitos de sangre de cordón umbilical (UCB)Example 3: Umbilical Cord Blood Leukocytes (UCB)

Se pueden recoger leucocitos de una diversidad de tejidos. La Tabla 5 muestra experimentos de enriquecimiento de leucocitos de sangre de cordón umbilical (UCB). La muestra de partida son 3 ml de UCB, diluida 1:1 con tampón de proceso. El producto de salida enriquecido con leucocitos contenía niveles de eritrocitos por debajo de la detección (contador de células Hemavet), por lo que la pureza del producto se determina mediante análisis FACS multicolor utilizando marcadores contra CD45, CD14, CD235a y un colorante de ácido nucleico viable. Para las fracciones combinadas, la reducción de eritrocitos es del 99 %, la recuperación de leucocitos es del 87 % y la pureza de los leucocitos (es decir, 100 % -% de eritrocitos) es del 81-88 %. Hay algún volumen muerto en la configuración del instrumento, por lo que una pequeña parte de la muestra permanece en el sistema y no se procesa. Con algunos cambios de ingeniería minoritarios, se puede clasificar la muestra completa y la recuperación de leucocitos puede aumentar hasta > 90 %. La viabilidad por exclusión del colorante azul tripán es > 90 % en todas las fracciones. Los granulocitos, linfocitos y monocitos están cerca de las proporciones iniciales de "leucocitos diferenciales".Leukocytes can be collected from a variety of tissues. Table 5 shows enrichment experiments for umbilical cord blood leukocytes (UCB). The starting sample is 3 ml of UCB, diluted 1: 1 with process buffer. The leukocyte-enriched output product contained levels of erythrocytes below detection (Hemavet cell counter), therefore the purity of the product is determined by multi-color FACS analysis using markers against CD45, CD14, CD235a and a nucleic acid stain. viable. For pooled fractions, RBC reduction is 99%, WBC recovery is 87%, and WBC purity (i.e., 100% - RBC%) is 81-88%. There is some dead volume in the instrument setup, so a small part of the sample remains in the system and is not processed. With a few minor engineering changes, the entire sample can be sorted and leukocyte recovery can increase to> 90%. The viability by exclusion of the trypan blue dye is> 90% in all fractions. Granulocytes, lymphocytes and monocytes are close to the initial proportions of "differential leukocytes".

en algunos casos, la separación y lavado de leucocitos de sangre completa lisada ha confirmado la eliminación de > 99 % de los eritrocitos, plaquetas, proteínas plasmáticas y Mab no unidos, y una recuperación de leucocitos cercana al 90 % sin introducir sesgos entre las subpoblaciones de leucocitos (3).In some cases, separation and washing of leukocytes from lysed whole blood has confirmed the removal of> 99% of unbound RBCs, platelets, plasma proteins, and Mabs, and a recovery of leukocytes close to 90% without introducing bias between subpopulations. leukocytes (3).

Ejemplo 4: Prueba de perlas en un dispositivo microfluídico de múltiples corrientesExample 4: Bead test in a multi-stream microfluidic device

En este ejemplo, una muestra que comprende perlas de prueba de 10 pm y 2 pm marcadas con fluorescencia se hace fluir a través de un dispositivo microfluídico que comprende una matriz DLD como se muestra en la FIG. 19. Como se muestra en la FIG. 19, el dispositivo se configuró para hacer fluir 3 corrientes de flujo en paralelo desde la porción de entrada del dispositivo a través de una matriz de impacto DLD hasta la porción de salida del dispositivo. Como se muestra en la FIG. 19, la porción de entrada del dispositivo comprende 2 pocillos de entrada cada uno para la corriente de flujo, la corriente de flujo de reactivo y la corriente de flujo de tampón de lavado, y 2 pocillos de salida en la parte de salida del dispositivo, en donde cada uno de los pocillos de entrada y salida está delimitado por paredes opuestas. Cada una de las entradas de muestra, reactivo y tampón tenían una anchura de 126 micrómetros, con una longitud total del chip de ~ 3 cm. En este ejemplo, una corriente de perlas que comprende las perlas de prueba de 10 pm y 2 pm marcadas y dos corrientes de tampón se hacen fluir a través del dispositivo que comprende la matriz DLD de múltiples corrientes. La matriz de impacto DLD comprendía obstáculos circulares o micropostes con un diámetro de 18 |jm, un espacio entre micropostes de 18 |jm, un desplazamiento de fila de 1/42 y un tamaño crítico de aproximadamente 5 jm . Las perlas de 10 jm se diseñaron para imitar los tipos de células en una solución como la sangre con un diámetro mayor que el tamaño crítico (por ejemplo, leucocitos, diámetro de aproximadamente 7 jm), mientras que las perlas marcadas de 2 jm se diseñaron para imitar tipos de células más pequeñas en una solución como sangre (por ejemplo, glóbulos rojos, diámetro de aproximadamente 2 jm ). La FIG. 20A muestra que las perlas marcadas de 1o jm impactaban principalmente desde la parte superior de la matriz DLD hasta el último pocillo de salida del dispositivo. La FIG. 20B muestra que las perlas marcadas de 2 jm fluían generalmente desde los pocillos de entrada de muestra a los cuatro pocillos de salida superiores del dispositivo.In this example, a sample comprising fluorescently labeled 10 pm and 2 pm test beads is flowed through a microfluidic device comprising a DLD matrix as shown in FIG. 19. As shown in FIG. 19 , the device was configured to flow 3 streams of flow in parallel from the inlet portion of the device through a DLD impact die to the outlet portion of the device. As shown in FIG. 19 , the inlet portion of the device comprises 2 inlet wells each for the flow stream, the reagent flow stream and the wash buffer flow stream, and 2 outlet wells in the outlet part of the device, wherein each of the inlet and outlet wells is delimited by opposite walls. Each of the sample, reagent, and buffer inlets were 126 microns wide, with a total chip length of ~ 3 cm. In this example, a bead stream comprising the labeled 10 pm and 2 pm test beads and two buffer streams are flowed through the device comprising the multi-stream DLD array. The DLD impact matrix comprised circular obstacles or microposts with a diameter of 18 | jm, a micropost spacing of 18 | jm, a row offset of 1/42, and a critical size of approximately 5 jm. The 10 µm beads were designed to mimic cell types in a solution such as blood with a diameter greater than the critical size (for example, leukocytes, approximately 7 µm diameter), while the 2 µm labeled beads were designed to mimic smaller cell types in a solution such as blood (for example, red blood cells, diameter about 2 µm). FIG. 20A shows that the 10 µm labeled beads primarily impacted from the top of the DLD array to the last exit well of the device. FIG. 20B shows that the 2 µm labeled beads generally flowed from the sample inlet wells to the top four outlet wells of the device.

Ejemplo 5: Prueba de perlas en un dispositivo microfluídico de múltiples corrientes que comprende paredes separadorasExample 5: Bead test in a multi-stream microfluidic device comprising partition walls

En este ejemplo, se probó la mezcla difusional entre corrientes de flujo paralelas haciendo fluir perlas de prueba marcadas de 1o y 0,2 jm a través de un dispositivo microfluídico de múltiples corrientes modificado (lavado de coches) que comprende un par de paredes opuestas dentro de la matriz DLD y orientadas en paralelo a la dirección del flujo como se muestra en las FIG. 24A y B. El modelo de difusión de fuente limitada modificado representado en la FIG. 22 fue desarrollado para describir la propagación de la corriente química central en el dispositivo representado en las FIG 24A y B frente al dispositivo representado en la FIG. 19. En este ejemplo, el dispositivo utilizado para probar las perlas de prueba marcadas de 10 y 0,2 jm se diseñó para contener un tamaño crítico de 7 micrómetros, de modo que las partículas por encima de este tamaño atraviesen la corriente química y las partículas más pequeñas fluyan a lo largo de la dirección del flujo del fluido. Como puede verse en la FIG. 25, el 90 % de las partículas (perlas de prueba de 10 micrómetros) en la corriente fuente se movieron con éxito a través de la corriente química y se concentraron y recogieron en la salida. La contaminación se midió utilizando perlas fluorescentes de 0,2 micrómetros como señalizador para la localización del producto químico de la corriente central. Tal como se observa en la Tabla 1, la constante de difusión (1 x 10-8 cm2 s-1) de las perlas de 0,2 micrómetros era comparable a la de la mayoría de los marcadores de anticuerpos monoclonales, como los que se usarían en diseños convencionales y modificados. La fluorescencia en las corrientes central y de salida tanto para el dispositivo convencional (FIG. 19) como para el modificado (FIG. 24A y B) se mostró en la FIG. 26. De forma general, se observó una reducción de la contaminación de 20 veces en la salida a un caudal bajo (> 0,1 mm/s) y una reducción de 10 veces a un caudal alto (> 1 mm/s) utilizando el dispositivo que se muestra en las FIG. 24A y B, lo cual estaba de acuerdo con la simulación. Además, el tiempo empleado en la corriente de procesamiento central se incrementó en un factor de 3. En resumen, el diseño del dispositivo en la FIG. 24A y 24B permitió mejorar la limitación práctica para el procesamiento químico en el chip de corriente continua y el lavado de células en más de un orden de magnitud.In this example, diffusional mixing between parallel flow streams was tested by flowing 1 ° and 0.2 µm labeled test beads through a modified multi-stream microfluidic device (car wash) comprising a pair of opposing walls within of the DLD array and oriented parallel to the flow direction as shown in FIGS. 24A and B. The modified source-limited diffusion model depicted in FIG. 22 was developed to describe the central chemical stream propagation in the device depicted in FIGS. 24A and B versus the device depicted in FIG. 19. In this example, the device used to test the 10 and 0.2 µm labeled test beads was designed to contain a critical size of 7 microns so that particles above this size pass through the chemical stream and the Smaller particles flow along the direction of fluid flow. As can be seen in FIG. 25 , 90% of the particles (10 micron test beads) in the source stream successfully moved through the chemical stream and were concentrated and collected at the outlet. Contamination was measured using 0.2 micron fluorescent beads as a marker for the central stream chemical location. As seen in Table 1 , the diffusion constant (1 x 10-8 cm2 s-1) of the 0.2 micrometer beads was comparable to that of most monoclonal antibody markers, such as those described above. they would use in conventional and modified designs. Fluorescence in the central and outlet streams for both the conventional ( FIG. 19 ) and the modified ( FIG. 24A and B ) device was shown in FIG. 26. In general, a 20-fold reduction in contamination was observed at the outlet at low flow (> 0.1 mm / s) and a 10-fold reduction at high flow (> 1 mm / s) using the device shown in FIGS. 24A and B, which was in agreement with the simulation. In addition, the time spent in the central processing stream was increased by a factor of 3. In summary, the design of the device in FIG. 24A and 24B allowed to improve the practical limitation for chemical processing on the DC chip and cell washing by more than an order of magnitude.

Ejemplo 6: Prueba de mezcla difusional entre corrientes de flujo adyacentes en dos dispositivos de "lavado de coches"Example 6: Diffusional mixing test between adjacent flow streams in two "car wash" devices

En este ejemplo, la mezcla por difusión de una corriente de reactivo de metanol con una corriente de tampón que fluye paralelamente adyacente se probó en el dispositivo mostrado en la FIG. 19 o la FIG.24B. La FIG.23 mostró la relación entre la concentración de un reactivo (es decir, metanol; coeficiente de difusión en agua de 10-5 cm2/s) y el tiempo de incubación con velocidad de flujo para un dispositivo como se representa en la FIG. 19, en donde el dispositivo tenía una longitud total de 3 cm, anchuras de entrada de muestra, reactivo y tampón de 126 jm , micropostes circulares de 18 jm de diámetro, un espacio de 18 jm , un desplazamiento de fila de 1/42 y un tamaño crítico de ~ 5 jm . Tal como se puede observar, un tiempo de incubación de 10 segundos condujo a una salida con metanol al 33% del de la corriente de reactivo. En comparación, La FIG. 31 mostró la relación entre la concentración de un reactivo (es decir, metanol; coeficiente de difusión en agua de 10-5 cm2/s) y el tiempo de incubación con velocidad de flujo para un dispositivo como se representa en la FIG. 24B, en donde el dispositivo tenía una longitud total de 3 cm, una pared separadora de entrada con una longitud de 6 mm, una pared separadora de salida con una longitud de 12 mm, anchuras de entrada de muestra, reactivo y tampón de 126 jm , micropostes circulares de 18 jm de diámetro, un espacio de 18 jm , un desplazamiento de fila de 1/42 y un tamaño crítico de ~ 5 jm . En resumen, el diseño del dispositivo modificado en la FIG. 24B mostró una reducción de 2 a 200 veces en la concentración de metanol y una mejora de 2,14 veces en el tiempo de incubación a velocidades de flujo bajas. Por tanto, con el diseño modificado, a velocidades de flujo más altas se puede ejecutar el mismo tiempo de incubación, mientras que a la misma velocidad de flujo, el diseño modificado puede conseguir una mayor eficiencia de lavado.In this example, diffusion mixing of a methanol reagent stream with an adjacent parallel flowing buffer stream was tested in the device shown in FIG. 19 or FIG. 24B. FIG. 23 showed the relationship between the concentration of a reagent (i.e. methanol; diffusion coefficient in water of 10-5 cm2 / s) and the incubation time with flow rate for a device as depicted in FIG . 19 , where the device had a total length of 3 cm, sample, reagent and buffer inlet widths of 126 µm, circular microposts of 18 µm in diameter, a gap of 18 µm, a row offset of 1/42 and a critical size of ~ 5 jm. As can be seen, an incubation time of 10 seconds led to a methanol leakage 33% of that of the reagent stream. In comparison, FIG. 31 showed the relationship between the concentration of a reagent (i.e., methanol; diffusion coefficient in water of 10-5 cm2 / s) and the incubation time with flow rate for a device as depicted in FIG. 24B , wherein the device had a total length of 3 cm, an inlet partition wall with a length of 6 mm, an outlet partition wall with a length of 12 mm, sample, reagent and buffer inlet widths of 126 µm , circular microposts of 18 µm in diameter, a gap of 18 µm, a row offset of 1/42, and a critical size of ~ 5 µm. In summary, the modified device design in FIG. 24B showed a 2- to 200-fold reduction in methanol concentration and a 2.14-fold improvement in incubation time at low flow rates. Therefore, with the modified design, at higher flow rates the same incubation time can be run, while at the same flow rate, the modified design can achieve higher washing efficiency.

Ejemplo 7: Prueba de sangre en un dispositivo microfluídico de múltiples corrientes que comprende paredes separadorasExample 7: Blood test on a multi-stream microfluidic device comprising partition walls

En este ejemplo, se probó la mezcla difusional entre corrientes de flujo paralelas con sangre que fluía a través de un dispositivo microfluídico de múltiples corrientes modificado (lavado de coches) que comprende un par de paredes opuestas dentro de la matriz DLD y orientadas en paralelo a la dirección del flujo como se muestra en las FIG. 27A y 27B. En este ejemplo, la sangre se diluyó 4 veces, se lisaron los glóbulos rojos y se centrifugó la muestra de sangre resultante para retirar las plaquetas. Posteriormente, se pasaron 5 ml de la muestra de sangre procesada marcada con fluorescencia a través de un dispositivo como se muestra en las FIG. 27A y 27B a una velocidad de flujo de 0,1 ml/min durante 50 minutos. Como se puede ver en la FIG. 28, una parte significativa de las células sanguíneas marcadas en la corriente fuente se movió con éxito a través de la corriente de producto químico, a través del espacio entre las paredes separadora de entrada y separadora de salida, y se concentra y recoge en la salida. La FIG. 30 mostró la diferencia entre la entrada de sangre y las salidas del dispositivo, que mostró una eliminación exitosa de los glóbulos rojos (RBC). Se observaron algunas obstrucciones en las diversas regiones del dispositivo como se observa en las FIG. 29A y 29B. In this example, diffusional mixing between parallel flow streams was tested with blood flowing through a modified multi-stream microfluidic device (car wash) comprising a pair of opposing walls within the DLD array and oriented parallel to the direction of flow as shown in FIGS. 27A and 27B. In this example, blood was diluted 4 times, red blood cells were lysed, and the resulting blood sample was centrifuged to remove platelets. Subsequently, 5 ml of the fluorescently labeled processed blood sample was passed through a device as shown in FIGS. 27A and 27B at a flow rate of 0.1 ml / min for 50 minutes. As can be seen in FIG. 28 , a significant portion of the labeled blood cells in the source stream successfully moved through the chemical stream, through space between the inlet separator and outlet separator walls, and is concentrated and collected at the outlet. FIG. 30 showed the difference between the blood input and the device outputs, which showed successful removal of red blood cells (RBC). Some obstructions were observed in the various regions of the device as seen in FIGS. 29A and 29B.

Ejemplo 8: Prueba de perlas en dispositivo microfluídico con sistema de limpieza en el chip:Example 8: Bead test in microfluidic device with on-chip cleaning system:

En este ejemplo, se hizo fluir una muestra que comprendía perlas de prueba de 10 pm marcadas con fluorescencia a través de un dispositivo microfluídico que comprendía una matriz DLD y un sistema de limpieza en el chip como se muestra en las FIG. 34A y C. El dispositivo utilizado en este ejemplo comprende micropostes con un diámetro de 18 pm, un espacio entre micropostes de 18 pm, un desplazamiento de fila de 1/42 y un tamaño crítico de aproximadamente 7 pm. Se hicieron fluir 6 ml de una muestra que comprendía perlas de 10 pm marcadas con fluorescencia de color verde (1 x 105 perlas/ml) a través del dispositivo a 0,1 ml/min durante 60 minutos en el modo de impacto, seguido de un flujo de 5 ml de tampón F108 a 0,5 ml/min para retirar las perlas no obstruidas restantes. Finalmente, se hicieron fluir 5 ml de una corriente de limpieza (también tampón F108) a 0,5 ml/min en el modo de limpieza para limpiar el dispositivo. Como se muestra en la FIG. 34A y en la parte superior de la 34B, se observaron perlas obstruidas en el dispositivo después del modo de impacto, que se eliminaron sustancialmente después del modo de limpieza (parte inferior de la f Ig .34B).In this example, a sample comprising fluorescently labeled 10 pm test beads was flowed through a microfluidic device comprising a DLD matrix and an on-chip cleaning system as shown in FIGS. 34A and C. The device used in this example comprises microposts with a diameter of 18 pm, a spacing between microposts of 18 pm, a row offset of 1/42 and a critical size of approximately 7 pm. 6 ml of a sample comprising green fluorescently labeled 10 pm beads (1 x 105 beads / ml) was flowed through the device at 0.1 ml / min for 60 minutes in the impact mode, followed by a flow of 5 ml of Buffer F108 at 0.5 ml / min to remove the remaining unclogged beads. Finally, 5 ml of a cleaning stream (also buffer F108) was flowed at 0.5 ml / min in the cleaning mode to clean the device. As shown in FIG. 34A and on top of 34B , clogged beads were observed in the device after impact mode, which were substantially removed after cleaning mode (bottom of f Ig .34B ).

Ejemplo 9: Reducción de la obstrucción:Example 9: Obstruction reduction:

La FIG. 36 muestra los resultados de experimentos que identifican integrinas dependientes de calcio y activación plaquetaria inducida por trombina como contribuyentes dominantes a la obstrucción inducida por plaquetas de matrices DLD. La conclusión es que la FIG. 36 muestra cómo se puede usar un aumento de aproximadamente 3 veces en el caudal para conseguir una reducción adicional de la obstrucción además de la conseguida con EDTA 5 mM y PPACK 40 uM. [NOTA: estos gráficos muestran en el eje x (horizontal) el volumen de sangre que se ha procesado a través de una matriz, y en el eje y (vertical) la fluorescencia de los leucocitos atascados en la matriz. La sangre diluida se procesó realmente, pero este eje x representa la cantidad de sangre sin diluir que se utilizó antes de la dilución y que fluyó a través del chip. Los leucocitos se etiquetaron con un colorante fluorescente antes de poner la sangre en la matriz, por lo que la fluorescencia mide el número de células atascadas. Esta matriz era una matriz con postes triangulares de 40 micrómetros y la anchura del espacio es de 27 micrómetros. FIG. 36 shows the results of experiments identifying calcium-dependent integrins and thrombin-induced platelet activation as dominant contributors to platelet-induced blockage of DLD matrices. The bottom line is that FIG. 36 shows how an approximately 3-fold increase in flow rate can be used to achieve a further reduction in clogging in addition to that achieved with 5mM EDTA and 40uM PPACK. [NOTE: These graphs show on the x-axis (horizontal) the volume of blood that has been run through a matrix, and on the y-axis (vertical) the fluorescence of leukocytes stuck in the matrix. The diluted blood was actually processed, but this x-axis represents the amount of undiluted blood that was used prior to dilution and that flowed through the chip. The leukocytes were labeled with a fluorescent dye before putting the blood on the matrix, so the fluorescence measures the number of stuck cells. This die was a die with 40 micron triangular posts and the width of the gap is 27 microns.

La matriz tenía parámetros comúnmente utilizados para el aislamiento de leucocitos o células tumorales circulantes. La sangre humana fue suministrada por un proveedor y tratada con un nivel de 1 ml/ACD por 8 ml de sangre. (Antes de la dilución 3:1). La ACD típica se compone de 22,0 g/l de C3434 (ácido cítrico, sal trisódica, dihidrato); 7,3 g/l de C0759 (ácido cítrico, anhidro); y 24,5 g/l de G7528 (D-(+)-Glucosa).The matrix had parameters commonly used for the isolation of circulating leukocytes or tumor cells. Human blood was supplied by a supplier and treated at a level of 1 ml / ACD per 8 ml of blood. (Before dilution 3: 1). The typical ACD is composed of 22.0 g / l of C3434 (citric acid, trisodium salt, dihydrate); 7.3 g / l C0759 (citric acid, anhydrous); and 24.5 g / l of G7528 (D - (+) - Glucose).

Las condiciones de prueba convencionales implican diluir la muestra de sangre 3:1 con un tampón antes del procesamiento. El caudal promedio es de ~ 4 cm/s. La profundidad de la matriz grabada en silicio fue de ~ 0,15 mm. El tiempo de ejecución convencional fue de 30 minutos. En este tiempo se procesaron ~ 3 ml de la mezcla de sangre diluida, correspondientes a 0,75 ml de sangre total. Se añadieron aditivos a la mezcla diluida antes del procesamiento. Los leucocitos se etiquetaron con un colorante fluorescente antes de poner la sangre en la matriz, por lo que la fluorescencia mide el número de células atascadas.Conventional test conditions involve diluting the blood sample 3: 1 with a buffer prior to processing. Average flow is ~ 4 cm / s. The depth of the silicon etched matrix was ~ 0.15mm. The conventional run time was 30 minutes. During this time ~ 3 ml of the diluted blood mixture were processed, corresponding to 0.75 ml of whole blood. Additives were added to the diluted mixture before processing. The leukocytes were labeled with a fluorescent dye before putting the blood on the matrix, so the fluorescence measures the number of stuck cells.

Obsérvese en la FIG. 36 que deben tenerse en cuenta las siguientes observaciones experimentales para diferentes aditivos a la entrada: EDTA 1 mM (1 mM en la entrada de sangre diluida) proporciona un aumento rápido en la señal de fluorescencia (de leucocitos atascados) que indica una obstrucción rápida; EDTA 5 mM (en la entrada de sangre diluida) reduce la obstrucción a aproximadamente 1/8 del nivel de EDTA 1 mM; ACD (1 ml por 9 ml de la entrada de sangre diluida) reduce la obstrucción de manera similar al EDTA 5 mM. La heparina (40 unidades por ml de la entrada de sangre diluida (sin EDTA) muestra cierta reducción de la obstrucción. La adición de PPACK 40 uM al EDTA 5 mM reduce la obstrucción a un nivel casi indetectable. El aumento de la velocidad de flujo en un factor de ~ 3X (con EDTA 5 mM y PPACK 40 uM) proporciona -2,3 ml de producción de sangre completa en el chip en una matriz en 30 minutos para una matriz, y una obstrucción aún insignificante.Note in FIG. 36 that the following experimental observations should be taken into account for different input additives: 1 mM EDTA (1 mM in diluted blood input) provides a rapid increase in fluorescence signal (from stuck leukocytes) indicating rapid clogging; 5 mM EDTA (in the diluted blood inlet) reduces the blockage to approximately 1/8 the level of 1 mM EDTA; ACD (1 ml per 9 ml of the diluted blood input) reduces the blockage similar to 5 mM EDTA. Heparin (40 units per ml of the diluted blood input (without EDTA) shows some reduction in blockage. The addition of 40 uM PPACK to 5 mM EDTA reduces the blockage to an almost undetectable level. Increasing the flow rate at a factor of ~ 3X (with 5mM EDTA and 40uM PPACK) provides -2.3ml of on-chip whole blood throughput on a matrix in 30 minutes for a matrix, and still negligible clogging.

Estos resultados se han demostrado para postes circulares y triangulares con parámetros de matriz que se utilizan comúnmente para el aislamiento de leucocitos y células tumorales circulantes de la sangre. La FIG. 37 muestra imágenes de la obstrucción con EDTA 1 mM y con EDTA 5 mM PPACK 40 uM para cada uno de los tres parámetros de matriz diferentes. Las dos matrices superiores (P18/G18/C [[diámetro del poste 18 um; espacio 18 um; postes circulares]] y P40/G27/T [[postes 40 um; espacio 27 um; postes triangulares]]) tienen parámetros comúnmente utilizados para el aislamiento de leucocitos, mientras que la matriz inferior (P60/G40/T [[postes 60 um; espacios 40 um; poste triangular]]) se puede utilizar comúnmente para el aislamiento de células tumorales circulantes. La conclusión es que la combinación de un agente para reducir las vías dependientes de calcio (tales como el agente quelante de calcio (EDTA 5 mM) y un inhibidor de trombina (PPACK 40 uM) funciona mejor en todos los diseños de chips.These results have been demonstrated for circular and triangular posts with matrix parameters that are commonly used for the isolation of leukocytes and circulating tumor cells from the blood. FIG. 37 shows images of the obstruction with 1 mM EDTA and with EDTA 5 mM PPACK 40 uM for each of the three different matrix parameters. The two upper dies (P18 / G18 / C [[post diameter 18 um; gap 18 um; circular posts]] and P40 / G27 / T [[posts 40 um; gap 27 um; triangular posts]]) have parameters commonly used for the isolation of leukocytes, while the lower matrix (P60 / G40 / T [[posts 60 um; gaps 40 um; triangular post]]) can be commonly used for the isolation of circulating tumor cells. The bottom line is that the combination of an agent to reduce calcium-dependent pathways (such as calcium chelating agent (5mM EDTA) and a thrombin inhibitor (40uM PPACK) works best in all chip designs.

Ejemplo 10: Experimentos que identifican los efectos de mayores caudales y mayores diluciones de sangre Example 10: Experiments that identify the effects of higher flow rates and higher blood dilutions sobre la obstrucción en matrices DLD:About clogging in DLD arrays:

En un experimento de apoyo (FIG. 38) al Ejemplo 9, se muestra que se pueden usar caudales más altos y mayores diluciones de sangre para reducir aún más la obstrucción en la matriz de micropostes. Todos los datos corresponden a la misma condición de EDTA 1 mM en la entrada de sangre diluida al chip. Los tiempos de cada experimento son diferentes, pero la clave es la cantidad de fluorescencia (que representa leucocitos atascados) para una sangre completa equivalente dada de entrada. Debe ser lo más pequeña posible para la misma cantidad de sangre. La hipótesis dice que un caudal más alto permite menos tiempo para que se formen los agregados de plaquetas en la matriz y proporciona una fuerza mayor para evitar la adhesión plaqueta-poste, y que la dilución más alta previene la formación de agregados plaquetarios al minimizar la interacción plaqueta-plaqueta. La FIG. 38 muestra que una combinación de un aumento de 3 veces en la dilución de la sangre y un aumento de 10 veces en el caudal reduce la obstrucción, consiguiendo la combinación una reducción de la obstrucción en un factor de 10 veces.In an experiment supporting ( FIG. 38 ) to Example 9, it is shown that higher flow rates and higher dilutions of blood can be used to further reduce clogging in the micropost array. All data correspond to the same 1 mM EDTA condition in the diluted blood input to the chip. The times of each experiment are different, but the key is the amount of fluorescence (representing stuck leukocytes) for a given equivalent whole blood input. It should be as small as possible for the same amount of blood. The hypothesis is that a higher flow rate allows less time for platelet aggregates to form in the matrix and provides greater force to prevent platelet-post adhesion, and that higher dilution prevents platelet aggregate formation by minimizing platelet-post adhesion. Platelet-platelet interaction. FIG. 38 shows that a combination of a 3-fold increase in blood dilution and a 10-fold increase in flow rate reduces obstruction, the combination achieving a reduction in obstruction by a factor of 10.

En resumen, los ejemplos 9 y 10 demostraron que se pueden procesar > 2,25 ml de sangre por matriz DLD a un nivel de obstrucción muy por debajo de aquel en el que el rendimiento del chip comienza a degradarse. Esto corresponde a > 30 ml de sangre por chip convencional con 15 matrices DLD. Adicionalmente, dado que la obstrucción no parece aumentar en comparación con el tiempo en el mejor de los casos (alto rendimiento, PPACK y EDTA en la FIG. 36), a partir de nuestros resultados se pueden procesar > 250 ml de sangre utilizando un chip convencional con 15 matrices DLD antes de que la obstrucción comience a degradar significativamente el rendimiento del dispositivo. Este logro se puede atribuir a cuatro medidas que redujeron la obstrucción: 1. Incapacitación de la actividad de las integrinas dependientes de calcio en las plaquetas y/o disminución de la formación de trombina dependiente de calcio al aumentar la concentración de EDTA de 1 mM a 5 mM. Otros métodos que reducen o bloquean el calcio pueden actuar de manera similar. 2. Prevención de la activación plaquetaria inducida por trombina y la producción de fibrina mediante el uso del inhibidor directo de trombina PPACK a una concentración de 40 uM. Otros métodos que inhiben o reducen la trombina pueden actuar de manera similar. Las siguientes 2 condiciones experimentales también reducen la obstrucción: 3. Mayor caudal (que puede deberse a menos tiempo para que se produzcan las reacciones que conducen a la obstrucción). 4. Mayor dilución (que puede deberse a una interacción plaqueta-plaqueta minimizada que conduce a la formación de agregados plaquetarios).In summary, Examples 9 and 10 demonstrated that> 2.25 ml of blood can be processed per DLD matrix at a clogging level well below that at which chip performance begins to degrade. This corresponds to> 30 ml of blood per conventional chip with 15 DLD matrices. Additionally, since obstruction does not appear to increase over time in the best case (high throughput, PPACK and EDTA in FIG. 36 ),> 250 ml of blood can be processed from our results using a chip. conventional with 15 DLD arrays before clogging begins to significantly degrade device performance. This achievement can be attributed to four measures that reduced obstruction: 1. Incapacitation of calcium-dependent integrin activity in platelets and / or decreased calcium-dependent thrombin formation by increasing EDTA concentration from 1 mM to 5 mM. Other methods that reduce or block calcium can work in a similar way. 2. Prevention of thrombin-induced platelet activation and fibrin production by using the direct thrombin inhibitor PPACK at a concentration of 40 uM. Other methods that inhibit or reduce thrombin can act in a similar way. The following 2 experimental conditions also reduce clogging: 3. Higher flow rate (which may be due to less time for the reactions leading to clogging to occur). 4. Higher dilution (which may be due to a minimized platelet-platelet interaction leading to the formation of platelet aggregates).

Ejemplo 11: Tecnología microfluídica de DLD para lavar y concentrar leucocitos de la sangreExample 11: DLD Microfluidic Technology to Wash and Concentrate Leukocytes from Blood

Los glóbulos blancos (WBC), que son más grandes que otros tipos de células y desechos en la sangre normal, se mueven formando un ángulo en comparación con la dirección del flujo del fluido (FIG. 17B, 17C). Los glóbulos blancos (WBC) salieron de la corriente de entrada y pasaron a una corriente de tampón limpio y, por lo tanto, se lavaron eficazmente para liberarse de otras células y Mab no unidos sin necesidad de lisis o centrifugación convencionales de glóbulos rojos (RBC).White blood cells (WBCs), which are larger than other types of cells and wastes in normal blood, move at an angle compared to the direction of fluid flow ( FIG. 17B, 17C ) . White blood cells (WBCs) exited the input stream into a clean buffer stream and were therefore effectively washed free of other cells and unbound Mabs without the need for conventional red blood cell (RBC) lysis or centrifugation. ).

Las fracciones de glóbulos blancos (WBC) recogidas por lisis y centrifugación convencionales de glóbulos rojos (RBC) se marcaron con Mab fluorescentes contra CD19 (señalizador de linfocitos pan-B) y CD3 (señalizador de linfocitos pan-T) fuera del chip, y después se lavaron en el chip muestras pequeñas (aproximadamente 100 j l diluidos con 100 |jl de tampón). El producto y las fracciones residuales se analizaron mediante recuento celular y citometría de flujo. En un proceso representativo (Tabla 6 y FIG. 43), el 97 % de los glóbulos blancos se recuperaron en la fracción de producto, en un volumen más pequeño y más concentrado que la muestra de entrada. La viabilidad celular fue consistentemente superior al 90 %. Se lograron recuperaciones de más del 90 % para los 3 principales subconjuntos de glóbulos blancos (WBC) (granulocitos, monocitos, linfocitos), y cada subpoblación era distinta y tenía una excelente intensidad de señal de citometría de flujo, similar a la muestra de entrada. Los linfocitos son los glóbulos blancos (WBC) más pequeños, de modo que puede sospecharse que se pierden durante el procesamiento de DLD basado en el tamaño; no obstante, se encontró que las cantidades de células T CD3+ y de células B CD19+ se conservaban en el producto, al igual que su calidad de marcaje. Este resultado indicó que la recolección de chips DLD preservaba la calidad de estos análisis citométricos de flujo posteriores.White blood cell (WBC) fractions collected by conventional red blood cell (RBC) lysis and centrifugation were labeled with fluorescent Mabs against CD19 (pan-B lymphocyte marker) and CD3 (pan-T lymphocyte marker) off-chip, and then small samples (approximately 100 µl diluted with 100 µl buffer) were washed onto the chip. The product and residual fractions were analyzed by cell count and flow cytometry. In a representative process ( Table 6 and FIG. 43 ), 97% of the white blood cells were recovered in the product fraction, in a smaller and more concentrated volume than the input sample. Cell viability was consistently greater than 90%. Recoveries of more than 90% were achieved for the 3 main white blood cell (WBC) subsets (granulocytes, monocytes, lymphocytes), and each subpopulation was distinct and had excellent flow cytometric signal intensity, similar to the input sample . Lymphocytes are the smallest white blood cells (WBCs), so it can be suspected that they are lost during DLD processing based on size; however, the amounts of CD3 + T cells and CD19 + B cells were found to be conserved in the product, as was their label quality. This result indicated that the collection of DLD chips preserved the quality of these subsequent flow cytometric analyzes.

La eliminación del marcador no unido puede ser útil en citometría de flujo para reducir el efecto de fondo, aumentar la precisión de la señal y prevenir la unión inespecífica del reactivo a las células durante los posibles pasos posteriores de fijación/permeabilización. Por lo tanto, se midió la fluorescencia de las muestras de entrada y salida centrifugadas se midió con un fluorímetro (conjunto de lectores de placas de microtitulación para detectar la fluorescencia de Mab conjugados con fluorocromo no unidos). Una serie de experimentos mostró que el lavado de chips eliminaba la fluorescencia inicial que variaba de aproximadamente el 99 % de eliminación hasta el límite de detección o por debajo del mismo. Esto último se equiparó con una eliminación superior al 91 % de Mab libre. La sensibilidad del instrumento se puede modificar para detectar niveles ultrabajos de fluorescencia con el fin de medir un mayor grado de eliminación de Mab.Removal of unbound marker may be useful in flow cytometry to reduce background effect, increase signal precision, and prevent nonspecific binding of reagent to cells during possible subsequent fixation / permeabilization steps. Therefore, the fluorescence of the centrifuged inlet and outlet samples was measured with a fluorimeter (set of microtiter plate readers to detect fluorescence of unbound fluorochrome-conjugated Mabs). A series of experiments showed that chip washing removed initial fluorescence ranging from approximately 99% removal to or below the limit of detection. The latter was equated with a greater than 91% removal of free Mab. The sensitivity of the instrument can be modified to detect ultra-low levels of fluorescence in order to measure a higher degree of Mab removal.

continuacióncontinuation

Ejemplo 12: Combinación de la recolección microfluídica de leucocitos con el sistema de lavado/concentrado de DLD en una sola etapaExample 12: Combination of Microfluidic Leukocyte Harvesting with DLD Concentrate / Wash System in One Step

Los glóbulos rojos (RBC) pueden estar presentes en la sangre en un exceso 1000 veces mayor que los glóbulos blancos (WBC). Por tanto, la eliminación de los glóbulos rojos (RBC) antes del análisis puede resultar útil para evitar tiempos de análisis citométricos de flujo prolongados. El uso de un umbral de fluorescencia durante la citometría de flujo puede solucionar este problema hasta cierto punto, pero esto puede causar la pérdida de información de dispersión de luz que ayuda a distinguir los tipos de células. Por lo tanto, los glóbulos rojos (RBC) residuales se midieron mediante microscopía, Contadores Hemavet y Coulter y citometría de flujo. La sangre entera se marcó fuera del chip con CD19 y CD3. La entrada del chip DLD fue de ~ 100 ul de sangre completa diluida en 100 ul de tampón.Red blood cells (RBC) can be present in the blood in 1000 times greater excess than white blood cells (WBC). Therefore, removing red blood cells (RBCs) prior to analysis may be helpful to avoid long flow cytometric analysis times. Using a fluorescence threshold during flow cytometry can solve this problem to some extent, but this can cause the loss of light scattering information that helps distinguish cell types. Therefore, residual red blood cells (RBC) were measured by microscopy, Hemavet and Coulter Counters, and flow cytometry. Whole blood was labeled off the chip with CD19 and CD3. The input from the DLD chip was ~ 100 ul whole blood diluted in 100 ul buffer.

Recuperación de glóbulos blancos (WBC) y retirada de glóbulos rojos RBC. La Tabla 7 muestra los resultados de un experimento representativo. La recuperación de glóbulos blancos (WBC) fue del 97 % y los porcentajes de las subpoblaciones de glóbulos blancos (WBC) son esencialmente idénticos en producto frente a entrada. En una serie de 9 experimentos repetidos durante varias semanas, se recuperó un promedio de 99 ± 4 % de los glóbulos blancos (WBC) de entrada en la fracción de producto, y 2,1 ± 0,6 % de glóbulos blancos (WBC) en la fracción de desechos. En promedio, más del 99,5% de los glóbulos rojos (RBC) de partida se eliminaron de la fracción de producto. El análisis de subconjuntos en la fracción de producto indicó que la distribución de las 3 principales subpoblaciones de glóbulos blancos (WBC) se mantenía en el producto dentro del 1 % de su distribución en la entrada. El promedio de 6 experimentos con sangre completa teñida mostró que la variación era de solo 0,8 0,4 % para los granulocitos, de 0,4 0,2 % para los monocitos y de 1,0 0,4 % para los linfocitos, lo que demuestra resultados consistentes en todas las muestras y a lo largo del tiempo. White blood cell (WBC) recovery and RBC red blood cell removal. Table 7 shows the results of a representative experiment. The recovery of white blood cells (WBC) was 97% and the percentages of the subpopulations of white blood cells (WBC) are essentially identical in product versus input. In a series of 9 experiments repeated over several weeks, an average of 99 ± 4% of the input white blood cells (WBC) were recovered in the product fraction, and 2.1 ± 0.6% of the white blood cells (WBC) in the waste fraction. On average, more than 99.5% of the starting red blood cells (RBC) were removed from the product fraction. Subset analysis in the product fraction indicated that the distribution of the 3 main subpopulations of white blood cells (WBC) was maintained in the product within 1% of its distribution at the input. The average of 6 experiments with stained whole blood showed that the variation was only 0.8 0.4% for granulocytes, 0.4 0.2% for monocytes and 1.0 0.4% for lymphocytes. , demonstrating consistent results across all samples and over time.

Obstrucción. Se abordó el problema de que las células de la sangre completa podrían agregarse o coagularse y obstruir los canales en los chips DLD. La obstrucción puede ser un problema cuando los tamaños de muestra de entrada son mucho mayores de 100 pl de sangre completa. La adición de anticoagulantes, tales como un quelante de calcio (EDTA 5 mM) y un inhibidor de trombina (D-fenilalanil-L-prolil-L-arginina clorometilcetona 40 pM); PPACK) puede permitir más de 2000 pl de sangre a través de un solo canal en un chip DLD sin obstrucciones (datos no mostrados). Obstruction. Addressed issue that whole blood cells could aggregate or clot and clog channels in DLD chips. Clogging can be a problem when input sample sizes are much greater than 100 µl of whole blood. The addition of anticoagulants, such as a calcium chelator (5 mM EDTA) and a thrombin inhibitor (D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginine chloromethylketone 40 pM); PPACK) can allow more than 2000 µl of blood through a single channel on a DLD chip with no obstructions (data not shown).

Conclusión. Los resultados que se muestran en el presente documento demuestran que los chips DLD como se describen en el presente documento pueden recoger glóbulos blancos (WBC) marcados con Mab a partir de una mezcla de incubación de entrada de Mab fluorescentes en sangre completa humana con alta recuperación y viabilidad de los glóbulos blancos (WBC), mientras se reducen los glóbulos rojos (RBC) y los Mab no unidos, y sin sesgar la distribución de los subconjuntos de glóbulos blancos (WBC) (Tabla 8). Los Mab libres se eliminaron hasta el límite de detección, aumentando considerablemente las relaciones S/N de los citogramas de flujo. Estos resultados fueron consistentes entre los 3 laboratorios colaboradores que utilizaron dispositivos fabricados tanto de silicona/vidrio como de plástico. Finalmente, Los resultados del análisis de citometría de flujo de las células procesadas en los chips fueron de alta calidad. Conclution. The results shown herein demonstrate that DLD chips as described herein can collect Mab-labeled white blood cells (WBCs) from an input incubation mix of fluorescent Mabs in human whole blood with high recovery. and white blood cell (WBC) viability, while reducing red blood cells (RBC) and unbound Mabs, and without skewing the distribution of white blood cell (WBC) subsets ( Table 8 ). Free Mabs were removed up to the detection limit, greatly increasing the S / N ratios of the flow cytograms. These results were consistent among the 3 collaborating laboratories that used devices made of both silicone / glass and of plastic. Finally, the results of the flow cytometry analysis of the cells processed on the chips were of high quality.

Ejemplo 13: Sistema microfluídico basado en chip DLD para el lavado de glóbulos blancos humanos después del marcaje convencional de la superficie de sangre completaExample 13: DLD chip-based microfluidic system for washing human white blood cells after conventional labeling of the surface of whole blood

La FIG. 43 de resultados y las Tablas 6-8 describen el enfoque básico y los resultados para lavar glóbulos blancos que se han inmunoteñido de manera convencional (por ejemplo, fuera del chip) en sangre completa. Debido a que los glóbulos blancos (WBC) son más grandes que los glóbulos rojos (RBC), plaquetas, componentes del plasma y Mab, el chip DLD puede recoger los glóbulos blancos (WBC) de un flujo sanguíneo de entrada. Debido a que los glóbulos rojos (RBC) se reducen de manera eficiente, puede que no sea necesario lisar los glóbulos rojos (RBC) como en el procesamiento convencional. El enfoque del chip DLD puede lavar eficazmente los glóbulos blancos (WBC) y reducir el recuento de glóbulos rojos (RBC) en más del 99 %. El rendimiento puede ser superior al 90 % de los glóbulos blancos (WBC) recolectados en la salida, con una viabilidad superior al 90 %. FIG. Results 43 and Tables 6-8 describe the basic approach and results for washing white blood cells that have been immunostained in a conventional manner (eg, off-chip) in whole blood. Because white blood cells (WBC) are larger than red blood cells (RBC), platelets, plasma components, and Mab, the DLD chip can collect white blood cells (WBC) from an incoming blood stream. Because red blood cells (RBCs) are efficiently depleted, it may not be necessary to lyse red blood cells (RBCs) as in conventional processing. The DLD chip approach can effectively wash the white blood cells (WBC) and reduce the red blood cell count (RBC) by more than 99%. The yield can be greater than 90% of the collected white blood cells (WBC) at the outlet, with a viability greater than 90%.

Métodos. Se pueden utilizar muestras de múltiples donantes de sangre sanos. El procesamiento de glóbulos blancos (WBC) en el chip se puede realizar en menos de 10 minutos para muestras de 100 pl. La evaluación citométrica de flujo de las células de entrada y salida se puede expandir para enumerar varios subconjuntos críticos de glóbulos blancos (WBC), utilizando cócteles comerciales de Mab multicolores que se utilizan ampliamente en la investigación y el diagnóstico del cáncer. Methods. Samples from multiple healthy blood donors can be used. On-chip white blood cell (WBC) processing can be performed in less than 10 minutes for 100 µl samples. Flow cytometric evaluation of incoming and outgoing cells can be expanded to enumerate various critical subsets of white blood cells (WBCs), using commercial multi-color Mab cocktails that are widely used in cancer research and diagnosis.

Medidas de resultado. Se caracterizan alícuotas de la entrada y salida del chip DLD como en los Resultados anteriores. La evaluación de citometría de flujo se puede ampliar utilizando los siguientes cócteles de Mab para el marcaje de superficies (25-26) (estos kits contienen números específicos de perlas para permitir el recuento total de células de citometría de flujo): T rucount CD4/CD8/CD3 (BD T ritest N.° de catálogo 340401); CD3/CD19/CD45 T rucount (BD Tritest N.° de catálogo 340405); CD3/CD16 56/CD45 Trucount (BD Tritest N.° de catálogo 340403); CD45/14 (BD Simultest N.° de catálogo 340040); CD34/CD45/Kit de enumeración de células progenitoras Procount de colorante de ácido nucleico (BD N.° de catálogo 340498; determina el recuento total de células madre progenitoras, recuento total de células nucleadas y recuento total de glóbulos blancos (WBC)); CD34/CD45/7-AAD ISHAGE Kit de enumeración de células madre (BD N.° de catálogo 344563; determina el recuento total de células madre progenitoras mediante el algoritmo ISHAGE); Control de isotipo IgG1/IgG1/CD45 (BD Tritest N.° de catálogo 340385). Outcome measures. Aliquots of the input and output of the DLD chip are characterized as in the previous Results. The flow cytometry evaluation can be expanded using the following Mab cocktails for surface marking (25-26) (these kits contain specific numbers of beads to allow total cell count by flow cytometry): T rucount CD4 / CD8 / CD3 (BD T ritest Catalog No. 340401); CD3 / CD19 / CD45 T rucount (BD Tritest Catalog No. 340405); CD3 / CD16 56 / CD45 Trucount (BD Tritest Catalog No. 340403); CD45 / 14 (BD Simultest Catalog No. 340040); CD34 / CD45 / Procount Nucleic Acid Dye Progenitor Cell Enumeration Kit (BD Catalog # 340498; determines total progenitor stem cell count, total nucleated cell count, and total white blood cell (WBC) count); CD34 / CD45 / 7-AAD ISHAGE Stem Cell Enumeration Kit (BD Catalog # 344563; determines total progenitor stem cell count using ISHAGE algorithm); IgG1 / IgG1 / CD45 Isotype Control (BD Tritest Catalog # 340385).

Se pueden utilizar muestras de voluntarios adultos sanos con un panel de marcadores intracelulares y de superficie de uso común. Pueden utilizarse muestras de pacientes con una diversidad de diagnósticos tales como cáncer, enfermedad infecciosa, etc., y que representan adultos, niños y minorías raciales/étnicas.Samples from healthy adult volunteers with a panel of commonly used intracellular and surface markers can be used. Patient samples with a variety of diagnoses such as cancer, infectious disease, etc., and representing adults, children, and racial / ethnic minorities can be used.

Ejemplo 14: Sistema microfluídico de DLD basado en chip para lavar glóbulos blancos (WBC) humanos después de la fijación y permeabilización convencionalesExample 14: Chip-based DLD Microfluidic System for Washing Human White Blood Cells (WBCs) After Conventional Fixation and Permeabilization

Antes del marcaje intracelular, puede ser necesario estabilizar ("fijar") las células usando un reactivo de entrecruzamiento químico y luego permeabilizar la célula y las membranas intracelulares (por ejemplo, nucleares) para permitir que los marcadores intracelulares entren en la célula. Por ejemplo, los protocolos actuales pueden utilizar formaldehído para la fijación y metanol para la permeabilización (29). Después de estas etapas, las células se pueden lavar para eliminar estos productos químicos desnaturalizantes, antes de la incubación con los reactivos de marcaje intracelular (por ejemplo, Mab). La etapa de fijación/permeabilización se puede realizar en glóbulos blancos (WBC) aislados fuera del chip, utilizando un protocolo convencional, por ejemplo, el descrito en Chow et al., (Chow S, Hedley D, Grom P, Magari R, Jacobberger JW, Shankey TV. Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations. Cytometry A.Prior to intracellular labeling, it may be necessary to stabilize ("fix") cells using a chemical crosslinking reagent and then permeabilize the cell and intracellular (eg, nuclear) membranes to allow intracellular markers to enter the cell. For example, current protocols can use formaldehyde for fixation and methanol for permeabilization (29). After these steps, cells can be washed to remove these denaturing chemicals, prior to incubation with intracellular labeling reagents (eg, Mab). The fixation / permeabilization step can be performed on isolated white blood cells (WBCs) off the chip, using a conventional protocol, for example, that described in Chow et al., (Chow S, Hedley D, Grom P, Magari R, Jacobberger JW, Shankey TV. Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations. Cytometry A.

2005;67(1):4-17). Después, la etapa de lavado por centrifugación convencional se reemplaza por un lavado basado en chips DLD. El lavado basado en chips DLD se realiza como en la FIG. 17B, con la excepción de que la entrada es la mezcla de los glóbulos blancos (WBC) aislados y los reactivos de fijación/permeabilización. Los glóbulos blancos (WBC) fijos/permeabilizados grandes impactan y se desvían hacia la salida, y el formaldehído, metanol, etc. se mueven directamente hasta el residuo. El rendimiento de glóbulos blancos (WBC) se evalúa como en los resultados preliminares. En lugar de medir los niveles residuales de formaldehído, metanol, etc. , los glóbulos blancos (WBC) fijados/permeabilizados lavados en el chip DLD se inmunotiñen y luego se evalúa la calidad de la inmunotinción intracelular, en comparación con una alícuota separada de la misma muestra de glóbulos blancos (WBC) de partida marcada por un protocolo manual convencional (por ejemplo, todas las etapas de marcaje y lavado completadas fuera del chip) (27), como el descrito en Chow et al., (Chow S, Hedley D, Grom P, Magari R, Jacobberger JW, Shankey TV. Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations. Cytometry A. 2005;67(1):4-17).2005; 67 (1): 4-17). The conventional spin wash step is then replaced by a DLD chip based wash. DLD chip-based washing is performed as in FIG. 17B, except that the input is the mixture of the isolated white blood cells (WBC) and the fixation / permeabilization reagents. Large fixed / permeabilized white blood cells (WBCs) impact and deflect to the outlet, and formaldehyde, methanol, etc. they move directly to the residue. The white blood cell (WBC) yield is evaluated as in the preliminary results. Instead of measuring residual levels of formaldehyde, methanol, etc. , the fixed / permeabilized white blood cells (WBC) washed on the DLD chip are immunostained and then the quality of the immunostaining is evaluated intracellular, compared to a separate aliquot of the same starting white blood cell (WBC) sample labeled by a standard manual protocol (e.g., all labeling and washing steps completed off-chip) (27), as described in Chow et al., (Chow S, Hedley D, Grom P, Magari R, Jacobberger JW, Shankey TV. Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations. Cytometry A. 2005 ; 67 (1): 4-17).

Medidas de resultado. Para el marcaje intracelular se utilizan los siguientes Mab y cócteles comerciales: Anti-pStatl-PE (BD Biosciences N.° de catálogo 612564; detecta el factor de transcripción Statl fosforilado); Anti-IFN-gamma (BD Biosciences N.° de catálogo 554552); FITC BRDU Flow Kit (BD Pharmingen N.° de catálogo 557891) Solución de tinción 7-AAD (BD Pharmingen N.° de catálogo 559925); Phosflow Kit (BD N.° de catálogo 560750; detecta p38 MAPK, ERK, Statl, Stat3, Stat6, Cóctel de células T humanas; contiene reactivos para analizar simultáneamente múltiples señalizadores de células T con una de varias fosfoproteínas intracelulares para estudiar la señalización específica del subconjunto de células T); Kit de tinción FoxP3: FoxP3/CD4/CD25 (BD Pharmingen, N.° de catálogo 560l33; El factor de transcripción FoxP3 es un señalizador para las células T reguladoras (T reg), y la mayoría de las células T CD4+ CD25++ en sangre lo expresan selectivamente de forma intracelular, mientras que menos de la mitad de las células CD4+ CD25+ son FoxP3+; El kit también contiene Mab CD4 y CD25); FastImmune IFN-gamma/CD69/CD8/CD3 (BD N.° de catálogo 346048; El IFN-g se expresa intracelularmente en la mayoría de las células T CD8+, por los subconjuntos TH1 y TH0 de células T CD4+ y por las células NK tras la activación; CD69 está presente en linfocitos T, B y Nk activados). Outcome measures. The following commercial Mabs and cocktails are used for intracellular labeling: Anti-pStatl-PE (BD Biosciences Cat. # 612564; detects phosphorylated Statl transcription factor); Anti-IFN-gamma (BD Biosciences Cat # 554552); FITC BRDU Flow Kit (BD Pharmingen Cat # 557891) 7-AAD Staining Solution (BD Pharmingen Cat # 559925); Phosflow Kit (BD Catalog # 560750; detects p38 MAPK, ERK, Statl, Stat3, Stat6, Human T Cell Cocktail; contains reagents to simultaneously analyze multiple T cell markers with one of several intracellular phosphoproteins to study specific signaling T cell subset); FoxP3 staining kit: FoxP3 / CD4 / CD25 (BD Pharmingen, Cat # 560133; FoxP3 transcription factor is a marker for regulatory T cells (T reg), and most CD4 + CD25 ++ T cells in blood they selectively express it intracellularly, while less than half of the CD4 + CD25 + cells are FoxP3 +; The kit also contains CD4 and CD25 Mabs); FastImmune IFN-gamma / CD69 / CD8 / CD3 (BD Catalog # 346048; IFN-g is expressed intracellularly in most CD8 + T cells, by the TH1 and TH0 subsets of CD4 + T cells, and by NK cells upon activation; CD69 is present on activated T, B, and Nk lymphocytes).

Ejemplo 15: Sistema basado en chip DLD microfluídico para lavar glóbulos blancos (WBC) humanos después del mareaje intracelular convencionalExample 15: Microfluidic DLD chip-based system for washing human white blood cells (WBC) after conventional intracellular labeling

Después del marcaje intracelular, se puede realizar un lavado para eliminar los marcadores intracelulares no unidos. Existen protocolos de procesamiento de células para análisis de citometría de flujo que no requieren lavado. Estos métodos pueden tener el inconveniente de una alta fluorescencia de fondo. Los chips DLD descritos en el presente documento se pueden usar para reemplazar las etapas de centrifugación y resuspensión, y se puede usar citometría de flujo para evaluar la recuperación y la inmunotinción del chip DLD procesado. / s. células procesadas convencionalmente (fuera del chip), usando los cócteles de Mab.After intracellular labeling, a wash can be performed to remove unbound intracellular markers. There are cell processing protocols for flow cytometric analysis that do not require washing. These methods can have the disadvantage of high background fluorescence. The DLD chips described herein can be used to replace the centrifugation and resuspension steps, and flow cytometry can be used to assess the recovery and immunostaining of the processed DLD chip. / s. cells processed conventionally (off-chip), using Mab's cocktails.

Otra posible ventaja del procesamiento del chip DLD puede ser que la salida de residuos de esta etapa (FIG. 17C) debe contener solo el tampón y los marcadores no unidos, siendo la cantidad de tampón aproximadamente igual a la de la entrada. Por tanto, estos "residuos" pueden contener los marcadores no utilizados que luego pueden "reciclarse" para utilizarse de nuevo en etapas futuras. Esto puede ser significativo debido al alto coste de algunos marcadores Mab, especialmente cócteles multi-Mab. Este posible reciclaje de reactivos se evalúa más a fondo en el presente documento.Another possible advantage of DLD chip processing may be that the waste outlet of this step ( FIG. 17C ) should contain only the buffer and unbound labels, with the amount of buffer being approximately equal to that of the inlet. Therefore, these "wastes" can contain the unused markers that can then be "recycled" to be used again in future stages. This can be significant due to the high cost of some Mab markers, especially multi-Mab cocktails. This possible reagent recycling is further evaluated in this document.

Análisis de datos y medidas de resultado: Para asegurarse de que los resultados sean representativos de un producto futuro, se examina cada uno de los procesos del chip DLD (secuencialmente, a medida que se perfeccionan) para obtener una reproducibilidad robusta en múltiples muestras de sangre de donantes (por ejemplo, más de 10) utilizando los chips DLD y el sistema de plataforma microfluídica automatizado. Los resultados experimentales se comparan con los resultados de la preparación manual de muestras por un citometrista experto. Los resultados de los chips pueden mostrar un mejor rendimiento celular y una reproducibilidad mejor o comparable, medida por el coeficiente de variación de los números de subconjuntos y relaciones S/N equivalentes o más altas. Estos resultados pueden ser representativos del rendimiento de los productos que se ofrecerán para licencia y venta. Data analysis and outcome measures: To ensure that results are representative of a future product, each of the DLD chip's processes are examined (sequentially, as they are refined) for robust reproducibility across multiple blood samples of donors (for example, more than 10) using the DLD chips and the automated microfluidic platform system. The experimental results are compared with the results of manual sample preparation by an expert cytometrist. Chip results can show better cell performance and better or comparable reproducibility, as measured by the coefficient of variation of the numbers of subsets and equivalent or higher S / N ratios. These results may be representative of the performance of the products that will be offered for license and sale.

Para el lavado posterior a las etapas de fijación/permeabilización y marcaje intracelular, respectivamente, los glóbulos blancos (WBC) fijados/permeabilizados pueden ser ligeramente más pequeños y más rígidos que los glóbulos blancos (WBC) viables. Esta característica puede ser importante porque los impactos y la separación celular resultante basada en el chip DLD pueden depender del tamaño de las células y, en menor grado, de la rigidez de las células. Por lo tanto, para optimizar el impacto de los glóbulos blancos (WBC) fijados/permeabilizados, los parámetros de la matriz de postes se pueden ajustar ligeramente en comparación con los utilizados hasta la fecha para los glóbulos blancos (WBC) viables. Además, el coeficiente de difusión del metanol en tampón (~ 10-5 cm2/s) es mayor que el de los Mab (~ 10 6 cm2/s). Por tanto, es más probable que el producto lavado se contamine con los reactivos de fijación/permeabilización (por ejemplo, metanol) que con los marcadores Mab no unidos. Esta característica se puede abordar aumentando ligeramente la velocidad de flujo o realizando cambios minoritarios en el diseño del chip DLD, tal como un aumento de la anchura de la entrada del tampón, de modo que los reactivos puedan difundirse más lejos (de manera perpendicular al flujo de fluido) para alcanzar el canal de salida.For washing after the fixation / permeabilization and intracellular labeling steps, respectively, the fixed / permeabilized white blood cells (WBC) may be slightly smaller and stiffer than the viable white blood cells (WBC). This feature can be important because the impacts and the resulting cell separation based on the DLD chip can depend on the size of the cells and, to a lesser extent, the stiffness of the cells. Therefore, to optimize the impact of fixed / permeabilized white blood cells (WBC), the post array parameters can be adjusted slightly compared to those used to date for viable white blood cells (WBC). Furthermore, the diffusion coefficient of methanol in buffer (~ 10-5 cm2 / s) is higher than that of Mabs (~ 10 6 cm2 / s). Thus, the washed product is more likely to be contaminated with binding / permeabilization reagents (eg, methanol) than unbound Mab labels. This feature can be addressed by slightly increasing the flow rate or by making minor changes to the DLD chip design, such as increasing the width of the buffer inlet, so that the reagents can diffuse further (perpendicular to the flow). fluid) to reach the outlet channel.

Ejemplo 16: Sistema de DLD microfluídico basado en chip para recoger glóbulos blancos (WBC) de sangre total y después marcarlos en la superficie y lavarlos, Todo en el mismo chip (FIG. 42)Example 16: Chip-based microfluidic DLD system for collecting white blood cells (WBCs) from whole blood and then surface marking and washing, All on the same chip (FIG. 42)

Primero se recogen glóbulos blancos en el chip a partir de sangre completa, seguido de las etapas de marcaje de la superficie y lavado en el chip. Los métodos pueden aumentar la automatización del proceso y permitir la recuperación potencial de marcadores no utilizados. White blood cells are first collected on the chip from whole blood, followed by the steps of surface marking and washing on the chip. The methods can increase the automation of the process and allow the potential recovery of unused markers.

Métodos. Se puede usar un chip como el de la FIG. 18A y un marcador de superficie tal como Mab de CD45. La eficacia de marcaje de glóbulos blancos (WBC) se ajusta mediante la concentración de marcador y el tiempo de permanencia en la corriente de marcaje central. El tiempo de permanencia, que es el tiempo de incubación, puede controlarse por la velocidad de flujo del fluido (típicamente aproximadamente 1 mm/s), la anchura de la corriente de marcaje (típicamente de aproximadamente 0,5 mm) y el ángulo de inclinación de la matriz (de 2 ° a 6 °), para dar un tiempo de permanencia de aproximadamente 10-20 segundos. El tiempo total de flujo a través del chip puede ser del orden de unos pocos minutos. El rendimiento de glóbulos blancos (WBC) marcados (y la intensidad de fluorescencia de cada subconjunto de glóbulos blancos (WBC) definido por Mab, determinado por citometría de flujo) se compara con el obtenido usando métodos convencionales de lavado y marcaje fuera de chip. La recuperación del marcador no utilizado (creando una salida de chip separada para el) se prueba y mide por fluorescencia en comparación con la corriente de entrada del marcador. Los caudales de fluido y los parámetros de diseño del chip se pueden ajustar en respuesta a esto. Methods. A chip like the one in FIG. 18A and a surface marker such as CD45 Mab. The white blood cell (WBC) labeling efficiency is adjusted by the concentration of the label and the residence time in the central labeling stream. The residence time, which is the incubation time, can be controlled by the flow rate of the fluid (typically about 1 mm / s), the width of the marking stream (typically about 0.5 mm), and the angle of inclination of the matrix (from 2 ° to 6 °), to give a residence time of approximately 10-20 seconds. The total flow time through the chip can be on the order of a few minutes. The yield of labeled white blood cells (WBC) (and the fluorescence intensity of each Mab-defined white blood cell (WBC) subset, determined by flow cytometry) is compared to that obtained using conventional off-chip washing and labeling methods. The recovery of the unused marker (creating a separate chip output for it) is tested and measured by fluorescence compared to the marker input current. Fluid flow rates and chip design parameters can be adjusted in response to this.

Análisis de datos. Los experimentos pueden lograr: un rendimiento de marcaje (o fijación/permeabilización) tan alto como el de los métodos convencionales, recuperación de glóbulos blancos (WBC) superior al 90 %, eliminación de más del 99 % de glóbulos rojos (RBC), más del 90 % de viabilidad, eliminación superior al 90 % de Mab no unidos y una calidad de análisis de citometría de flujo comparable a la de las células procesadas convencionalmente. Analysis of data. Experiments can achieve: labeling (or fixation / permeabilization) performance as high as conventional methods, white blood cell (WBC) recovery greater than 90%, removal of more than 99% red blood cell (RBC), plus 90% viability, greater than 90% removal of unbound Mabs, and flow cytometric analysis quality comparable to conventionally processed cells.

Ejemplo 17: Sistema de DLD microfluídico basado en chip para fijar, permeabilizar y lavar glóbulos blancos marcados en la superficieExample 17: Chip-based microfluidic DLD system to fix, permeabilize, and wash surface-labeled white blood cells

Se realiza una fijación/permeabilización en el chip seguido de un lavado en el chip (FIG. 42). A fixation / permeabilization is performed on the chip followed by a wash on the chip ( FIG. 42 ) .

Métodos. Para el marcaje en el chip de células permeabilizadas, las células de fijación/permeabilizadas se introducen en el puerto de entrada de células del chip y se hacen reaccionar con los reactivos conjugados con fluorocromo enumerados en los Ejemplos 13 y 14. La citometría de flujo se realiza en paralelo con las células procesadas manualmente. El análisis de datos es como se describe en el Ejemplo 16. Methods. For on-chip labeling of permeabilized cells, the binding / permeabilized cells are introduced into the cell inlet port of the chip and reacted with the fluorochrome-conjugated reagents listed in Examples 13 and 14. Flow cytometry is performed. performed in parallel with manually processed cells. Data analysis is as described in Example 16.

Ejemplo 18: Sistema de DLD microfluídico basado en chip para marcar y lavar intracelularmente glóbulos blancos (WBC) marcados en la superficieExample 18: Chip-based microfluidic DLD system to label and wash surface-labeled white blood cells (WBC) intracellularly

El marcaje y lavado intracelular se realizan en el mismo chip (FIG. 42). Se utiliza un diseño como el de la FIG. 18A, con células de fijación/permeabilizadas como entrada y un marcador de superficie como corriente central del proceso.Intracellular labeling and washing are performed on the same chip ( FIG. 42 ). A design like that of FIG. 18A , with fixing / permeabilized cells as input and a surface marker as central stream of the process.

Métodos. Las etapas previas de marcaje de superficie y de fijación/permeabilización se realizan mediante métodos convencionales fuera del chip. Los marcadores intracelulares que se utilizarán incluyen pStat1, la forma fosforilada del factor de transcripción Stat1 y la citocina IFN-gamma. Para las pruebas se utilizan anticuerpos conjugados con ficoeritrina (por ejemplo, BD Biosciences N.° de catálogo 612564 y 554552). Las células permeabilizadas se introducen en el puerto de entrada de células del chip y se hacen reaccionar con los reactivos conjugados con fluorocromo. La citometría de flujo se realiza en paralelo con las células procesadas manualmente. Los Ejemplos 16, 17 y 18 se realizan en múltiples muestras utilizando una plataforma de sistema proporcionada en la divulgación (por ejemplo, Ejemplos 20 y 21). Se utiliza un chip con una o más paredes separadoras. Methods. The preliminary steps of surface marking and fixation / permeabilization are carried out by conventional off-chip methods. Intracellular markers to be used include pStat1, the phosphorylated form of the transcription factor Stat1, and the cytokine IFN-gamma. Phycoerythrin-conjugated antibodies (eg, BD Biosciences Cat # 612564 and 554552) are used for testing. The permeabilized cells are introduced into the cell inlet port of the chip and reacted with the fluorochrome-conjugated reagents. Flow cytometry is performed in parallel with manually processed cells. Examples 16, 17 and 18 are performed on multiple samples using a system platform provided in the disclosure (eg, Examples 20 and 21). A chip with one or more partition walls is used.

Ejemplo 19: Sistema de DLD microfluídico basado en chip para fijar, permeabilizar, marcar intracelularmente, lavar y concentrar glóbulos blancos (WBC) en un solo chip:Example 19: Chip-based microfluidic DLD system to fix, permeabilize, intracellularly label, wash and concentrate white blood cells (WBC) on a single chip:

Todas las etapas involucradas en la preparación de glóbulos blancos (WBC) para citometría de flujo se combinan en un solo chip DLD (FIG. 42). All the steps involved in preparing white blood cells (WBC) for flow cytometry are combined on a single DLD chip ( FIG. 42 ) .

Métodos. Se utiliza un diseño de chip similar al de la FIG. 18A, con el diseño detallado de cada región basado en el resultado de los Ejemplos 16, 17 y 18. El chip tiene una única entrada (sangre completa, que ya puede estar marcada). El chip tiene al menos 2 corrientes de proceso (para permitir la fijación/permeabilización y el marcaje intracelular). El chip puede tener corrientes separadas para fijación y para permeabilización. El chip tiene otra corriente para el marcaje de superficie después de que las células se hayan recogido de la sangre completa. El chip tiene al menos 3 entradas de tampón, un canal de salida final para las células preparadas y al menos una salida de residuos. Se pueden usar canales de salida adicionales para recoger marcadores no utilizados. Methods. A chip design similar to that of FIG. 18A , with the detailed design of each region based on the result of Examples 16, 17 and 18. The chip has a single entry (whole blood, which may already be labeled). The chip has at least 2 process streams (to allow for fixation / permeabilization and intracellular labeling). The chip can have separate currents for fixation and for permeabilization. The chip has another current for surface marking after the cells have been collected from whole blood. The chip has at least 3 buffer inlets, a final outlet channel for the primed cells, and at least one waste outlet. Additional output channels can be used to collect unused markers.

Medidas de resultado: Véase el Ejemplo 15. Outcome measures: See Example 15.

Análisis de datos. El enfoque automatizado se compara con los métodos convencionales en cuanto al rendimiento, relaciones de subconjuntos y mediciones de citometría de flujo con al menos 5 preparaciones de la misma muestra de sangre y para al menos 10 donantes. Una muestra puede pasar por dos o tres chips, uno después del otro. Analysis of data. The automated approach is compared to conventional methods for performance, subsets ratios, and flow cytometric measurements with at least 5 preparations from the same blood sample and for at least 10 donors. A sample can go through two or three chips, one after the other.

Ejemplo 20: Materiales de chip y chips DLD microfluídicos específicos de aplicación prototipos de fabricación para procesamiento de glóbulos blancos (WBC) Example 20: Application Specific Microfluidic DLD Chips and Chip Materials Manufacturing Prototypes for White Blood Cell (WBC) Processing

Como se muestra en la FIG. 42 y se ha descrito anteriormente, se puede diseñar un chip y un protocolo separados dependiendo del protocolo deseado. Cada uno de estos sistemas puede convertirse en un producto independiente. La geometría del chip se puede determinar basándose en los requisitos de rendimiento del producto, número de muestras por chip y consideraciones de coste. Por ejemplo, para aumentar el rendimiento, se puede aumentar la profundidad del canal, se pueden añadir más calles en paralelo o se puede aumentar la caída de presión a través del chip. Además, se pueden elegir el caudal y el diseño, por ejemplo, utilizando el concepto de pared separadora para aumentar el tiempo de interacción del tinte y las células, si se requiere, sin aumentar la contaminación de salida. As shown in FIG. 42 and described above, a separate chip and protocol can be designed depending on the desired protocol. Each of these systems can become a separate product. Chip geometry can be determined based on product performance requirements, number of samples per chip, and cost considerations. For example, to increase performance, the depth of the channel can be increased, more lanes can be added in parallel, or the pressure drop across the chip can be increased. In addition, the flow rate and design can be chosen, for example using the separating wall concept to increase the interaction time of the dye and cells, if required, without increasing the outlet contamination.

Métodos. Para cada diseño de chip, se realiza un dibujo de diseño asistido por ordenador (CAD) con múltiples réplicas del diseño del chip ajustadas en el tamaño de una oblea de 4" o 6". Usando fotomáscaras generadas a partir de los dibujos CAD, se graba un patrón con paredes laterales lisas de casi 90 ° en una oblea de Si utilizando el proceso de grabado profundo con iones reactivos (DRIE). Los chips de Si se pueden utilizar como maestros para crear chips de plástico mediante un estampado suave. En primer lugar, se vierte un material de caucho de silicona sobre los chips de Si para formar una réplica negativa del chip maestro de Si. La silicona endurecida se usa luego como herramienta de estampado para estampar en caliente las microestructuras en un material termoplástico. Los chips están hechos con diferentes polímeros tales como COP (polímero de olefina cíclica), PMMA (polimetacrilato de metilo) y PP (polipropileno), con profundidades de hasta 120 pm y espacios entre pilares de solo 9 pm. Las piezas finales de plástico de -1,5 pm se tienen en cuenta ajustando los diseños CAD para este sesgo. Después del estampado suave, los chips se limpian y sellan con cinta adhesiva. Se utilizan cintas adhesivas tanto PSA como activadas por calor. Los materiales de elección incluyen PMMA para el chip estampado y una cinta adhesiva hidrófila activada por calor para la tapa. Todos los diseños y materiales se eligen para que el sistema se pueda esterilizar fácilmente para su uso futuro en el cultivo de células después de la clasificación celular, por ejemplo, mediante haz de electrones o etanol. Methods. For each chip design, a computer aided design (CAD) drawing is made with multiple replicas of the chip design adjusted to the size of a 4 "or 6" wafer. Using photomasks generated from the CAD drawings, a pattern with nearly 90 ° smooth sidewalls is etched onto a Si wafer using the deep reactive ion etching (DRIE) process. Si chips can be used as masters to create plastic chips by soft stamping. First, a silicone rubber material is poured over the Si chips to form a negative replica of the Si master chip. The cured silicone is then used as a stamping tool to hot stamp the microstructures into a thermoplastic material. The chips are made with different polymers such as COP (cyclic olefin polymer), PMMA (polymethylmethacrylate) and PP (polypropylene), with depths up to 120 pm and pillar gaps as low as 9 pm. The final -1.5 pm plastic parts are accounted for by adjusting the CAD designs for this bias. After soft stamping, the chips are cleaned and sealed with adhesive tape. Both PSA and heat activated adhesive tapes are used. Materials of choice include PMMA for the embossed chip and a hydrophilic heat activated adhesive tape for the lid. All designs and materials are chosen so that the system can be easily sterilized for future use in cell culture after cell sorting, for example by electron beam or ethanol.

Para cada diseño de chip, se diseña un colector con las entradas y salidas de fluido necesarias, con bajo volumen muerto. Se pueden procesar múltiples muestras en paralelo en el mismo chip, para reducir el coste por muestra utilizando la tecnología de chip. Esto se puede hacer fabricando múltiples calles independientes en el mismo chip, donde cada calle se puede cargar de forma independiente y extraer el producto. Por ejemplo, La FIG. 44 muestra un chip en un colector que tiene 2 canales independientes por chip y cada canal tiene 2 entradas y 2 salidas. Se puede desarrollar un chip y un sistema para 8 muestras independientes (cada una con entrada y salidas) en el mismo chip. Los colectores están hechos de polímero acrílico y utilizan tubos de acero inoxidable como puertos de entrada y salida y, por lo tanto, el colector se puede esterilizar fácilmente.For each chip design, a manifold is designed with the necessary fluid inlets and outlets, with low dead volume. Multiple samples can be processed in parallel on the same chip, to reduce cost per sample using chip technology. This can be done by manufacturing multiple independent lanes on the same chip, where each lane can be independently loaded and product extracted. For example, FIG. 44 shows a chip on a collector that has 2 independent channels per chip and each channel has 2 inputs and 2 outputs. A chip and a system for 8 independent samples (each with input and outputs) can be developed on the same chip. The collectors are made of acrylic polymer and use stainless steel tubes as inlet and outlet ports and therefore the collector can be easily sterilized.

Para cada diseño de chip, se caracterizan las dimensiones críticas de los maestros de Si y los chips de plástico. Los SEM de las secciones transversales se calculan para medir la profundidad de grabado del maestro de Si y la profundidad de estampado de los chips de plástico. Los diámetros y espacios de los pilares se miden mediante microscopía óptica. En todos los chips se inspeccionan los defectos tales como pilares faltantes, pilares doblados y desechos. Se establecen criterios de control de calidad para la inspección de los chips. Dado que hay mucha redundancia en el número de pilares, los pequeños defectos tales como la falta de algunos pilares son aceptables y los chips son completamente funcionales incluso con estos pequeños defectos. Para cada diseño de chip, se obtiene un colector correspondiente y un conjunto de condiciones de ejecución (guiones de tiempo de presión) para realizar las diversas operaciones de marcaje, lavado, fijación/permeabilización, etc. en el chip. El rendimiento del chip se mide primero haciendo ensayos ficticios con soluciones tampón antes de procesar las muestras de células. Se realizan análisis de los datos.For each chip design, critical dimensions of Si masters and plastic chips are characterized. The SEMs of the cross sections are calculated to measure the engraving depth of the Si master and the embossing depth of the plastic chips. The diameters and spaces of the abutments are measured by light microscopy. All chips are inspected for defects such as missing abutments, bent abutments and debris. Quality control criteria are established for the inspection of chips. Since there is a lot of redundancy in the number of pillars, small defects such as missing some pillars are acceptable and the chips are fully functional even with these small defects. For each chip design, a corresponding manifold and a set of running conditions (pressure time scripts) are obtained to perform the various operations of marking, washing, fixing / permeating, etc. on the chip. Chip performance is first measured by dummy testing with buffers before processing cell samples. Data analysis is performed.

Opcionalmente, se pueden diseñar chips separados y la salida de un chip se puede recogerse e introducirse manualmente en la entrada del siguiente chip.Optionally, separate chips can be designed and the output of one chip can be collected and manually fed into the input of the next chip.

Ejemplo 21: Fabricación de un producto de plataforma automatizada para controlar el procesamiento de glóbulos blancos (WBC) a través de una interfaz de usuarioExample 21: Manufacture of an automated platform product to control white blood cell (WBC) processing through a user interface

Una plataforma automatizada puede realizar 3 funciones: 1) Puede proporcionar los flujos adecuados a cada una de las corrientes de entrada al chip. Esto se puede hacer conectando el depósito apropiado a cada entrada de chip y aplicando las presiones adecuadas a cada una (normalmente unas pocas psi (libra por pulgada al cuadrado). 2) Puede recoger las células apropiadas en las salidas para la citometría de flujo (u otra caracterización) posterior, o para su procesamiento posterior (fuera del chip o en otro chip). Esto se puede hacer conectando cada salida de chip a un depósito de recolección vacío, o posiblemente directamente a otro chip. 3) Puede proporcionar una interfaz de usuario sencilla, con automatización para especificar el proceso fluídico para lograr el resultado deseado.An automated platform can perform 3 functions: 1) It can provide the appropriate flows to each of the input streams to the chip. This can be done by connecting the appropriate reservoir to each chip inlet and applying the proper pressures to each (typically a few psi (pound per square inch). 2) You can collect the appropriate cells at the outlets for flow cytometry ( or other characterization) later, or for further processing (off-chip or on another chip). This can be done by connecting each chip outlet to an empty collection bin, or possibly directly to another chip. 3) It can provide a simple user interface, with automation to specify the fluidic process to achieve the desired result.

Se diseña un instrumento que contiene hardware y software para controlar el flujo de varias corrientes fluídicas a través del chip microfluídico. Como se describe en el Ejemplo 20, se puede diseñar y fabricar un colector para ajustarse a cada chip DLD optimizado. Se prueban múltiples diseños de chip y, por lo tanto, se pueden usar múltiples colectores diseñados y fabricados para ajustarse a los diferentes chips. El instrumento puede tener la capacidad de ejecutar todos los diversos diseños de chips y, por lo tanto, es posible que no se necesiten cambios importantes en el instrumento a medida que se generan nuevos diseños de chips DLD/colector.An instrument containing hardware and software is designed to control the flow of various fluidic streams through the microfluidic chip. As described in Example 20, a collector can be designed and manufactured to fit each optimized DLD chip. Multiple chip designs are tested and therefore multiple collectors designed and manufactured to fit different chips can be used. The instrument may have the ability to run all of the various chip designs and therefore major changes to the instrument may not be required as new DLD / collector chip designs are generated.

Métodos. Un instrumento ilustrativo mostrado en la FIG.45 controla un chip en un colector, con 2 corrientes de entrada y 2 corrientes de salida. El instrumento tiene 2 fuentes de control de presión independientes para que la presión de las 2 corrientes de entrada se pueda controlar de forma independiente. Una función de esta plataforma es mantener la presión estable sin fluctuaciones durante las ejecuciones. Las fuentes de presión que se pueden incorporar a esta plataforma se pueden adquirir fácilmente en el mercado (por ejemplo, Fluigent). Se pueden usar hasta 7 presiones independientes, una presión máxima de 20 psi (138 kPa) y hasta 6 corrientes de recolección de salida. Para ejecutar múltiples muestras independientes en un chip, el colector puede distribuir cada fuente de presión independiente para impulsar cada muestra de forma individual. Estas capacidades se pueden diseñar en el instrumento. Las presiones en corrientes de fluido específicas se pueden cambiar durante el curso de una ejecución. Las presiones se pueden controlar mediante software y se puede escribir un guión para cambiar las presiones en los momentos deseados. Methods. An illustrative instrument shown in FIG. 45 controls a chip in a collector, with 2 input currents and 2 output streams. The instrument has 2 independent pressure control sources so that the pressure of the 2 inlet streams can be controlled independently. One function of this platform is to keep pressure stable without fluctuations during runs. Pressure sources that can be incorporated into this platform are readily available on the market (eg Fluigent). Up to 7 independent pressures, a maximum pressure of 20 psi (138 kPa), and up to 6 outlet collection streams can be used. To run multiple independent samples on one chip, the manifold can distribute each independent pressure source to drive each sample individually. These capabilities can be designed into the instrument. Pressures in specific fluid streams can be changed during the course of a run. Pressures can be controlled by software and a script can be written to change pressures at desired times.

Cada generación de chips se prueba con múltiples réplicas y los datos se analizan como se describe. La funcionalidad del instrumento se prueba procesando soluciones tampón a través del dispositivo DLD microfluídico utilizando guiones de perfil de presión. Se realizan múltiples análisis en cada muestra de sangre y se recogen y caracterizan las fracciones de salida deseadas. Los resultados se comparan con el rendimiento anticipado para cada diseño de chip, y se comparan con células procesadas convencionalmente (fuera del chip) en paralelo. La fiabilidad del sistema se evalúa evaluando la variación en múltiples ejecuciones con la misma configuración.Each generation of chips is tested with multiple replicates and the data is analyzed as described. The functionality of the instrument is tested by running buffers through the DLD microfluidic device using pressure profile scripts. Multiple tests are performed on each blood sample and the desired output fractions are collected and characterized. The results are compared to the anticipated performance for each chip design, and compared to cells processed conventionally (off-chip) in parallel. The reliability of the system is evaluated by evaluating the variation in multiple runs with the same configuration.

El instrumento puede conectarse a todos los diversos diseños de colectores generados para cada configuración de chip. El instrumento puede almacenar las condiciones de ejecución (guiones de tiempos de presión) para cada diseño de chip, y un usuario puede seleccionar y ejecutar el guión adecuado para cada diseño. Una vez que se han recogido las fracciones de fluido de salida, se analizan. La obstrucción se puede prevenir utilizando volúmenes del orden de 100 |jl o añadiendo los aditivos anticoagulantes descritos en esta divulgación.The instrument can be connected to all the various collector designs generated for each chip configuration. The instrument can store the running conditions (pressure time scripts) for each chip design, and a user can select and run the appropriate script for each design. Once the outlet fluid fractions have been collected, they are analyzed. Clogging can be prevented by using volumes on the order of 100 µl or by adding the anticoagulant additives described in this disclosure.

Ejemplo 22: Procesamiento químico microfluídico con lavado en el chip mediante matrices de desplazamiento lateral determinista con paredes separadorasExample 22: On-Chip Wash Microfluidic Chemical Processing Using Deterministic Side Shift Arrays with Separating Walls

Este ejemplo describe un dispositivo microfluídico para procesamiento químico en el chip, tal como la tinción y el posterior lavado de las células. Se introducen "paredes separadoras" para aumentar el tiempo de incubación en el chip y mejorar la calidad del lavado. Las células de interés se concentran en una corriente de tratamiento de reactivos químicos en la primera pared separadora para una incubación prolongada en el chip sin causar un exceso de contaminación en la salida debido a la difusión de los productos químicos de tratamiento sin reaccionar, y después se dirigen a la corriente de lavado antes de las recolecciones finales. La segunda pared separadora reduce aún más la contaminación de salida de la difusión a la corriente de lavado. Con este enfoque, se demuestra la tinción de leucocitos en el chip con rodamina 6G y lavado. El dispositivo puede reemplazar otros procesos biológicos y analíticos convencionales.This example describes a microfluidic device for on-chip chemical processing, such as staining and subsequent washing of cells. "Parting walls" are introduced to increase the incubation time on the chip and improve the quality of the wash. The cells of interest are concentrated in a chemical reagent treatment stream on the first separating wall for a prolonged incubation on the chip without causing excess contamination at the outlet due to diffusion of unreacted treatment chemicals, and then they are directed to the wash stream before the final harvests. The second partition wall further reduces contamination exiting the diffusion to the wash stream. With this approach, leukocyte staining on the chip with rhodamine 6G and washing is demonstrated. The device can replace other conventional biological and analytical processes.

INTRODUCCIÓNINTRODUCTION

Las etapas de preparación para el análisis de células biológicas pueden implicar el tratamiento químico de las células (tal como la tinción con anticuerpos monoclonales, una etapa de fijación/permeabilización, etc.). Estas etapas pueden ir seguidas de una etapa de "lavado" para retirar los marcadores no unidos o el exceso de productos químicos de tratamiento de las células tratadas, para producir células tratadas y lavadas. Tanto el tratamiento como el lavado pueden incluir múltiples etapas manuales, tales como pipeteo, centrifugación y resuspensión de un sedimento después de la centrifugación. Estas etapas pueden requerir mucha mano de obra y pueden provocar variaciones en la calidad de las células preparadas y en los resultados de análisis o diagnósticos posteriores. (30)Preparation steps for biological cell analysis may involve chemical treatment of cells (such as monoclonal antibody staining, a fixation / permeabilization step, etc.). These steps can be followed by a "wash" step to remove unbound markers or excess treatment chemicals from the treated cells, to produce treated and washed cells. Both treatment and washing can include multiple manual steps, such as pipetting, centrifugation, and resuspending a pellet after centrifugation. These steps can be labor intensive and can cause variations in the quality of the prepared cells and in the results of subsequent analysis or diagnostics. (30)

Se pueden realizar un procesamiento y preparación de células automatizados e integrados para obtener muestras preparadas de manera más uniforme. Algunos dispositivos microfluídicos pueden realizar una de las etapas de preparación celular. M. A. McClain, et al. han mostrado un microcanal para la lisis celular en el chip utilizando campo eléctrico. (31) La centrifugación (y el lavado) convencional se puede realizar antes (y después) de la lisis celular en el chip. Asimismo, las estructuras distintivas de estos dispositivos pueden dar lugar a dificultades en la integración de nivel superior. J. Nguyen, et al. han presentado un sistema PDMS microfluídico para la preparación y análisis de células sanguíneas en el chip, (32) que tiene un diseño de múltiples secciones funcionales y puede necesitar controles de fluidos precisos para funcionar correctamente.Integrated, automated cell preparation and processing can be performed for more uniformly prepared samples. Some microfluidic devices can perform one of the cell preparation steps. MA McClain, et al. have shown a microchannel for cell lysis on the chip using electric field. (31) Conventional centrifugation (and washing) can be performed before (and after) cell lysis on the chip. Also, the distinctive structures of these devices can lead to difficulties in higher-level integration. J. Nguyen, et al. have presented a microfluidic PDMS system for on-chip blood cell preparation and analysis, (32) that has a multi-functional section design and may require precise fluid controls to function properly.

Otros dispositivos de preparación y procesamiento de células incluyen un dispositivo de "centrifugado en el chip" para la preparación de células utilizando canales simples de forma rectangular. (33) El mecanismo de separación subyacente de los vórtices en el chip puede limitar la eficiencia de captura de células al 20 % y la pureza al 40 %. Los dispositivos microfluídicos integrados para el tratamiento químico con alta eficiencia de captura de células pueden verse limitados por la difusión del producto químico de tratamiento. La difusión del producto químico de tratamiento puede causar una contaminación en la salida por el producto químico de tratamiento y una disminución de la concentración efectiva del producto químico de tratamiento. Se puede utilizar una alta velocidad de fluido para evitar esta difusión. En un dispositivo, se utiliza la fuerza de elevación inercial como mecanismo de separación para proporcionar una eficiencia de captura de células muy alta. (34) Las células se dirigen a una corriente de carbonato de sodio desde un tampón de suspensión de hematoxilina con una corriente de ácido acético como barrera de difusión para evitar la mezcla de carbonato de sodio y tampón de suspensión de hematoxilina. La velocidad del fluido puede ser de -0,6 m/s para una constante de difusión de producto químico de tratamiento de 10-9 m2/s, que se puede conseguir mediante una incubación separada en el chip o fuera del chip.Other cell preparation and processing devices include an "on-chip spin" device for cell preparation using simple rectangular-shaped channels. (33) The underlying on-chip vortex separation mechanism can limit cell capture efficiency to 20% and purity to 40%. Integrated microfluidic devices for chemical treatment with high cell capture efficiency can be limited by diffusion of the treatment chemical. Diffusion of the treatment chemical can cause contamination at the outlet by the treatment chemical and a decrease in the effective concentration of the treatment chemical. A high fluid velocity can be used to prevent this diffusion. In one device, inertial lifting force is used as a separation mechanism to provide very high cell capture efficiency. (34) Cells are directed into a sodium carbonate stream from a hematoxylin suspension buffer with an acetic acid stream as a diffusion barrier to avoid mixing of sodium carbonate and hematoxylin suspension buffer. The velocity of the fluid can be -0.6 m / s for a treatment chemical diffusion constant of 10-9 m2 / s, which can be achieved by separate on-chip or off-chip incubation.

K. Morton et al. han presentado un método para el procesamiento de células en chip en un chip microfluídico de flujo continuo, en el que se utilizan matrices de desplazamiento lateral determinista (d Ld ) para mover las células diana hacia el interior y después hacia el exterior de una corriente de procesamiento químico de tratamiento. (35) Se pueden usar altas velocidades de fluido para evitar la difusión del producto químico de tratamiento. El diseño del dispositivo y la alta eficiencia de captura de células y pureza (36, 37) hacen que el dispositivo sea atractivo. En este ejemplo, se ha demostrado que un enfoque de preparación y procesamiento de células en el chip logra tanto un tiempo de incubación prolongado como una contaminación baja del exceso de producto químico de tratamiento utilizando matrices de DLD "separadas por paredes". El dispositivo es un dispositivo microfluídico de tres entradas (corriente de muestra, corriente de tratamiento y corriente de lavado) para tinción y lavado de leucocitos en el chip utilizando rodamina 6G (R6G) con poca contaminación de salida. Las moléculas de R6G se pueden utilizar como colorante de tinción en análisis biológicos (38) y pueden tener una constante de difusión de 4x10-10m2/s en agua, próxima a la del etanol, metanol y 1-2 órdenes de magnitud mayor que la de los anticuerpos monoclonales, (39) todos los cuales pueden utilizarse en tratamientos químicos y biológicos.K. Morton et al. have presented a method for chip cell processing on a continuous flow microfluidic chip, in which deterministic lateral displacement (d Ld) matrices are used to move target cells into and then out of a stream of treatment chemical processing. (35) High fluid velocities can be used to prevent diffusion of the treatment chemical. The design of the device and the high efficiency of cell capture and purity (36, 37) make the device attractive. In this example, an on-chip cell preparation and processing approach has been shown to achieve both long incubation time and low contamination of excess treatment chemical using "wall-separated" DLD matrices. The device is a three-inlet microfluidic device (sample stream, treatment stream, and wash stream) for staining and washing leukocytes on the chip using rhodamine 6G (R6G) with little outlet contamination. R6G molecules can be used as a staining dye in biological analyzes (38) and can have a diffusion constant of 4x10-10m2 / s in water, close to that of ethanol, methanol and 1-2 orders of magnitude greater than that of of monoclonal antibodies, (39) all of which can be used in chemical and biological treatments.

MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALS AND METHODS

Diseño de dispositivo microfluídicoMicrofluidic device design

La FIG. 48A demuestra el diseño de matriz de desplazamiento lateral determinista (DLD) "separada por paredes". La entrada incluye tres corrientes: una corriente de muestra (sangre diluida en los presentes experimentos), una corriente de tratamiento (tal como productos químicos de tinción) y una corriente de lavado (tal como tampón de albúmina de suero bovino (BSA)). La salida incluye dos corrientes: el producto de las células tratadas y lavadas, y los desechos. En la región central hay una matriz DLD que consiste en una matriz de postes ligeramente inclinados en un ángulo pequeño e de la dirección de flujo en promedio impuesta por las paredes. Las células más pequeñas que un tamaño crítico D^c (celda pequeña en la FIG. 48B) pueden seguir la corriente que ondea alrededor de los postes en una dirección horizontal promedio, como se indica por la flecha negra. Las células más grandes que este tamaño crítico (célula diana en la FIG. 48B) puede seguir el eje de la matriz de postes, "impactando" y desviándose del poste en cada columna como se indica por la flecha roja. (40) Las células grandes se mueven hacia el interior de la corriente de tratamiento para ser tratadas y luego salen de la corriente de tratamiento para lavarse y recogerse como producción de producto (FIG. 48A). (34) El tamaño crítico puede determinarse mediante la geometría de la matriz d Ld . (40) En este trabajo, como se muestra en la FIG. 48B, con postes esféricos de d = 18 pm de diámetro y espacios g = 18 m entre los postes, y e = 1,36 °, el tamaño crítico (Dc) es de aproximadamente 6 pm. Los bordes de la pared de la matriz DLD están diseñados de acuerdo con las directrices de D. W. Inglis. (41) FIG. 48A demonstrates the "wall separated" deterministic side shift matrix (DLD) design. The input includes three streams: a sample stream (diluted blood in the present experiments), a treatment stream (such as staining chemicals), and a wash stream (such as bovine serum albumin (BSA) buffer). The output includes two streams: the product of the treated and washed cells, and the waste. In the central region there is a DLD matrix consisting of a matrix of posts slightly inclined at a small angle e from the direction of flow on average imposed by the walls. Cells smaller than a critical size D ^c (small cell in FIG. 48B ) can follow the current that ripples around the posts in an average horizontal direction, as indicated by the black arrow. Cells larger than this critical size (target cell in FIG. 48B ) can follow the axis of the pole array, "impacting" and deviating from the pole in each column as indicated by the red arrow. (40) Large cells move into the treatment stream to be treated and then exit the treatment stream to be washed and harvested as product production ( FIG. 48A ). (34) The critical size can be determined by the geometry of the d Ld matrix. (40) In this work, as shown in FIG. 48B , with spherical posts d = 18 pm in diameter and gaps g = 18 m between the posts, and e = 1.36 °, the critical size (Dc) is approximately 6 pm. The wall edges of the DLD die are designed in accordance with DW Inglis guidelines. (41)

Una primera pared puede prevenir cualquier difusión de producto químico (indicado por el sombreado de la FIG. 48A) hacia la salida mientras se incuban las células. Las células o partículas diana se concentran en la primera pared separadora de longitud l ⁱ = 2 cm, y luego se dirigen al interior de la corriente de lavado. Después de la primera pared separadora, las células diana pueden impactar por la matriz de DLD e impulsarse hacia el interior y a través de la corriente de lavado para ser recogidas. La corriente de tratamiento ahora puede difundirse libremente a la salida del producto y la difusión a la salida del chip se limita solo a esta región, mientras que la matriz DLD convencional tiene difusión a la salida de producto que tiene lugar en toda la matriz. El producto químico de tratamiento puede tener un tiempo de difusión más corto en la matriz DLD "separada por paredes" que en la matriz DLD convencional. La difusión en esta última región se puede volver a suprimir añadiendo una segunda pared separadora, de longitud I² = 1 cm en el diseño actual. La segunda pared separadora puede reducir la posibilidad de que una porción de los reactivos químicos se difunda hacia el canal de salida. El espacio (W^{1& 2}) entre la primera y la segunda pared separadora es de 90 pm, y puede ser lo más pequeño posible para evitar que el producto químico de tratamiento llegue a la corriente de lavado, pero puede ser lo suficientemente grande como para evitar la obstrucción de las células diana.A first wall can prevent any diffusion of chemical (indicated by the shading in FIG. 48A ) towards the outlet while the cells are incubated. The target cells or particles are concentrated on the first separating wall of length l ⁱ = 2 cm, and then directed into the wash stream. After the first separating wall, the target cells can impact the DLD matrix and be propelled into and through the wash stream to be collected. The treatment stream can now freely diffuse at the product outlet and the chip outlet diffusion is limited to this region only, whereas the conventional DLD matrix has product outlet diffusion that occurs throughout the matrix. The treatment chemical may have a shorter diffusion time in the "wall separated" DLD matrix than in the conventional DLD matrix. Diffusion in this latter region can be suppressed again by adding a second partition wall, of length I ² = 1 cm in the current design. The second partition wall can reduce the possibility of a portion of the chemical reagents diffusing into the outlet channel. The gap ( W ^{1 & 2} ) between the first and second partition walls is 90 pm, and it can be as small as possible to prevent the treatment chemical from reaching the wash stream, but it can be large enough to avoid blockage of target cells.

Fabricación y funcionamiento del dispositivoManufacture and operation of the device

Se fabricaron dispositivos con y sin paredes separadoras en obleas de silicio utilizando técnicas estándar de microfabricación. Se formaron máscaras de grabado sobre las obleas de silicio usando fotolitografía de una sola capa (Karl Suss, MA6) con fotorresistente AZ 4330 (AZ Electronic Materials, Estados Unidos) y revelador AZ 300 MIF. Después, las muestras se grabaron anisotrópicamente a 120 pm de profundidad usando un Samco RIE800iPB para grabado profundo con iones reactivos (DRIE). Las entradas y salidas son orificios pasantes a través de la oblea creados mediante chorro de arena usando partículas de óxido de aluminio de 50 pm de diámetro (PrepStart, Danville Engineering, Estados Unidos). Los dispositivos se sellaron con cinta selladora de poliolefina 3M 9795R con un cubreobjetos de vidrio en la parte inferior ("Tapa" en la FIG. 48C). Los dispositivos se montaron en una plantilla de policarbonato (FIG. 48C) conectada a una bomba de jeringa externa (Fusion 400, Chemyx, Estados Unidos). A continuación, se aplicaron filtros de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,2 pm a la plantilla para permitir que el aire saliera del colector. Finalmente, se utilizó una placa de metal de acero inoxidable con una ventana para observación microscópica para sujetar los dispositivos y la plantilla de policarbonato. Devices with and without partition walls were fabricated on silicon wafers using standard microfabrication techniques. Etch masks were formed on the silicon wafers using single layer photolithography (Karl Suss, MA6) with AZ 4330 photoresist (AZ Electronic Materials, USA) and AZ 300 MIF developer. The samples were then anisotropically etched at 120 µm depth using a Samco RIE800iPB for deep reactive ion etching (DRIE). The inlets and outlets are through holes through the wafer created by sandblasting using 50 µm diameter aluminum oxide particles (PrepStart, Danville Engineering, USA). The devices were sealed with 3M 9795R polyolefin tape with a glass coverslip on the bottom ("Cap" in FIG. 48C ) . The devices were mounted on a polycarbonate jig ( FIG. 48C ) connected to an external syringe pump (Fusion 400, Chemyx, USA). 0.2 pm polytetrafluoroethylene (PTFE) filters were then applied to the template to allow air to escape from the manifold. Finally, a stainless steel metal plate with a microscope viewing window was used to hold the devices and the polycarbonate template.

Se utilizó un microscopio invertido (Nikon Eclipse Ti) para obtener imágenes de la distribución de R6G fluorescente y células marcadas en los dispositivos, con lámpara de mercurio de alta presión como fuente de excitación con un conjunto de filtros de fluorescencia correspondiente (TRITC, excitación de 532-556 nm y emisión de 570-613 nm). Las imágenes y películas se grabaron utilizando una cámara CCD CoolSNAP ES2 y el software NIS-Elements.An inverted microscope (Nikon Eclipse Ti) was used to image the distribution of fluorescent R6G and labeled cells in the devices, with a high pressure mercury lamp as the excitation source with a set of corresponding fluorescence filters (TRITC, excitation of 532-556 nm and emission 570-613 nm). Images and movies were recorded using a CoolSNAP ES2 CCD camera and NIS-Elements software.

La FIG. 48D muestra la bomba de jeringa y el sistema microfluídicos en su totalidad. El sistema y los tubos primero se aclararon y humedecieron con tensioactivo Pluronic F108 desgasificado al 0,2% en agua desionizada y después con el tampón de ejecución (véase más adelante). A continuación, la solución de muestra como corriente de entrada de muestra, la solución de tinción como corriente de entrada del tratamiento y el tampón de ejecución como corriente de entrada de lavado se cargaron en la bomba de jeringa como entradas del dispositivo y se impulsaron a través del sistema microfluídico para realizar experimentos. La bomba de jeringa se hizo funcionar en el intervalo de 0,1 pl/min a 100 pl/min (tasa de volumen total de 0,3 pl/min a 300 pl/min para las tres entradas) para formar una velocidad de fluido promedio en los espacios de los postes que varía de aproximadamente 140 pm/s a 14 cm/s. FIG. 48D shows the syringe pump and microfluidic system in its entirety. The system and tubes were first rinsed and moistened with 0.2% degassed Pluronic F108 surfactant in deionized water and then with Run Buffer (see below). Next, the sample solution as the sample inlet stream, the staining solution as the treatment inlet stream, and the run buffer as the wash inlet stream were loaded into the syringe pump as device inlets and driven to through the microfluidic system to perform experiments. The syringe pump was operated in the range of 0.1 l / min to 100 l / min (total volume rate of 0.3 l / min to 300 l / min for all three inlets) to form a fluid velocity average in post spacings ranging from approximately 140 pm / s to 14 cm / s.

Preparación de muestras experimentalesPreparation of experimental samples

El tampón de ejecución contenía NaCl 150 mM a pH 7,2 que contenía NaN3 al 0,09%, BSA al 1% y EDTA 7 mM. Se podría añadir D-fenilalanil-prolil-arginil clorometilcetona (PPACK) 40 pM al tampón de ejecución para reducir aún más la obstrucción en el chip durante un uso prolongado del dispositivo (> 30 minutos). (42) Se diluyó sangre venosa anticoagulada con EDTA (comprada en Interstate Blood Bank, Inc., Memphis, TN, Estados Unidos) 1:3 con el tampón de ejecución como solución de muestra. Después, la sangre diluida se utilizó directamente como entrada de corriente de muestra, sin etapas de centrifugación o lisis. La solución de tinción (la entrada de la corriente de tratamiento) fue de 20 pg/l de R6G en el tampón de ejecución.The running buffer contained 150 mM NaCl at pH 7.2 containing 0.09% NaN3, 1% BSA, and 7 mM EDTA. 40 pM D-phenylalanyl-prolyl-arginyl chloromethyl ketone (PPACK) could be added to the run buffer to further reduce clogging on the chip during prolonged use of the device (> 30 minutes). (42) EDTA anticoagulated venous blood (purchased from Interstate Blood Bank, Inc., Memphis, TN, USA) was diluted 1: 3 with the running buffer as sample solution. The diluted blood was then used directly as the sample stream input, without centrifugation or lysis steps. The staining solution (the treatment stream input) was 20 pg / L R6G in the running buffer.

RESULTADOS Y DISCUSIÓNRESULTS AND DISCUSSION

Difusión de productos químicos de tratamientoDiffusion of treatment chemicals

En las FIG. 50A y B se muestran los resultados de la simulación de la concentración relativa del producto químico de tratamiento (la relación entre la concentración del producto químico de tratamiento y la de la corriente química de entrada) para dispositivos sin pared separadora, con una pared separadora y con dos paredes separadoras usando COMSOL. La constante de difusión del producto químico de tratamiento se estableció en 4*10'10 m2/s (la constante de difusión de R6G) y los postes se omitieron de la estructura de simulación por simplicidad de cálculo. La concentración relativa del producto químico de tratamiento se mostró en la entrada del chip, la parte intermedia del chip y la salida del chip. La reducción de la contaminación por el producto químico de tratamiento en la salida del producto provocada por la primera y segunda paredes separadoras puede verse por estos resultados de simulación. A una velocidad de fluido promedio de 100 pm/s para el diseño con solo la primera pared separadora (FIG. 49A), el producto químico de tratamiento fue bloqueado por la primera pared separadora, pero todavía quedaba tiempo suficiente en la última sección del chip para difundirse sin límites a través de toda la trayectoria de flujo, de modo que el diseño de 1 pared es un poco mejor que el diseño convencional sin pared. La contaminación en la salida del producto se calculó como la concentración relativa promedio del producto químico de tratamiento sobre el canal de salida del producto de 60 pm de anchura. Mediante la implementación de la segunda pared separadora, esta contaminación relativa se puede reducir a 0,14. Con la velocidad promedio del fluido de 1 cm/s (FIG. 49B), se redujo el tiempo de difusión, pero el diseño convencional todavía tenía una contaminación de salida de concentración relativa de aproximadamente 0,1. La contaminación de salida se redujo aproximadamente 4,6 veces con el primer diseño de pared separadora y se puede reducir aún más utilizando dos paredes separadoras hasta 0,017.In FIGS. 50A and B show the simulation results of the relative concentration of the treatment chemical (the relationship between the concentration of the treatment chemical and that of the inlet chemical stream) for devices without a separating wall, with a separating wall and with two partition walls using COMSOL. The diffusion constant of the treatment chemical was set at 4 * 10'10 m2 / s (the diffusion constant of R6G) and the posts were omitted from the simulation structure for simplicity of calculation. The relative concentration of the treatment chemical was shown at the inlet of the chip, the middle of the chip, and the outlet of the chip. The reduction in treatment chemical contamination at the product outlet caused by the first and second partition walls can be seen from these simulation results. At an average fluid velocity of 100 pm / s for the design with only the first partition wall ( FIG. 49A ) , the treatment chemical was blocked by the first partition wall, but there was still enough time left in the last section of the chip. to diffuse without limits throughout the entire flow path, so the 1-wall design is slightly better than the conventional no-wall design. Contamination at the product outlet was calculated as the average relative concentration of the treatment chemical over the 60 pm wide product outlet channel. By implementing the second partition wall, this relative contamination can be reduced to 0.14. With the average fluid velocity of 1 cm / s ( FIG. 49B ), the diffusion time was reduced, but the conventional design still had a relative concentration outlet contamination of about 0.1. Outlet contamination was reduced approximately 4.6 times with the first partition wall design and can be further reduced by using two partition walls down to 0.017.

La difusión de R6G en las matrices fabricadas sin y con paredes separadoras se midió experimentalmente mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa. De manera similar a los resultados de la simulación, la contaminación de salida debida a la difusión de R6G se evaluó mediante la concentración relativa promedio de R6G que entra en la salida del producto. La concentración relativa de R6G se definió como la relación entre la intensidad de fluorescencia de R6G y la de la entrada de la corriente de tratamiento, ya que la intensidad de fluorescencia de R6G tiene una relación lineal con su concentración a baja concentración. (43) Las FIG. 50A y B muestran las imágenes de fluorescencia de las regiones de entrada, intermedia y de salida de matrices DLD sin y con paredes separadoras de la misma longitud, pero con dimensiones por lo demás idénticas. A una velocidad promedio del fluido de 1,4 mm/s en espacios de postes, la contaminación en la salida del producto casi alcanzó un nivel saturado de aproximadamente 0,3 en la matriz DLD convencional (FIG. 50A). En la matriz separada por paredes, la presencia de las paredes separadoras condujo a una reducción de la contaminación de salida de 3 veces hasta aproximadamente 0,1 (FIG. The diffusion of R6G in the matrices made without and with separating walls was measured experimentally by quantitative fluorescence microscopy. Similar to the simulation results, the outlet contamination due to R6G diffusion was evaluated by the average relative concentration of R6G entering the product outlet. The relative concentration of R6G was defined as the ratio between the fluorescence intensity of R6G and that of the input of the treatment current, since the fluorescence intensity of R6G has a linear relationship with its concentration at low concentration. (43) FIG. 50A and B show the fluorescence images of the entry, middle, and exit regions of DLD arrays without and with spacer walls of the same length, but with otherwise identical dimensions. At an average fluid velocity of 1.4 mm / s in post spaces, contamination at the product outlet nearly reached a saturated level of approximately 0.3 in the conventional DLD matrix ( FIG. 50A ). In the wall-separated matrix, the presence of the separating walls led to a 3-fold reduction in outlet contamination to about 0.1 ( FIG.

50B). 50B ).

Los resultados del experimento a diferentes velocidades de fluido coincidieron bien con la simulación numérica, como se muestra en la FIG. 50C. (La velocidad promedio del fluido se usó para la simulación COMSOL y la velocidad promedio del fluido en los espacios de los postes se usó para los experimentos). La contaminación de salida dependía de la rapidez con la que se produce la difusión del producto químico de tratamiento en comparación con la velocidad a la que el fluido se mueve a través del dispositivo, caracterizada clásicamente por el número de Peclet. Para un dispositivo sin paredes separadoras, una velocidad crítica (v^c) puede ser una a la que la longitud de difusión L^{d = ^}D ^~t es igual a la distancia desde la corriente de tratamiento hasta la situación de la salida del producto, que es ww, la anchura de la corriente de lavado, donde ^t~ L^tot/v ^c es el tiempo que el fluido está en el dispositivo, y L^tot es la longitud total del dispositivo. Por lo tanto, una velocidad de fluido crítica se puede escribir como:The results of the experiment at different fluid velocities matched well with the numerical simulation, as shown in FIG. 50C . (Average fluid velocity was used for the COMSOL simulation and average fluid velocity in the post spaces was used for the experiments). The outlet contamination depended on the speed with which the diffusion of the treatment chemical occurs compared to the speed at which the fluid moves through the device, classically characterized by the Peclet number. For a device without dividing walls, a critical velocity ( v ^c ) can be one at which the diffusion length L ^{d = ^} D ^{~ t} is equal to the distance from the treatment stream to the product outlet location, which is ww, the width of the wash stream, where ^t ~ L ^tot / v ^c is the time the fluid is in the device, and L ^tot is the total length of the device. Therefore, a critical fluid velocity can be written as:

Para una matriz DLD convencional, la línea vertical negra punteada en la FIG. 50C puede indicar esta velocidad crítica del fluido de 300 pm/s. A una velocidad de fluido inferior a vc, w^w<L^d y la contaminación alcanza una meseta. A una velocidad de fluido superior a Vc, w^w>L^d y la contaminación se reduce.For a conventional DLD matrix, the dotted black vertical line in FIG. 50C can indicate this critical fluid velocity of 300 pm / s. At a fluid velocity less than vc, w ^w <L ^d and the contamination reaches a plateau. At a fluid velocity greater than Vc, w ^w > L ^d and contamination is reduced.

Para la matriz DLD "separada por paredes", el tiempo de difusión en el dispositivo se puede reducir de (iⁱ+Í²)/v a I²/V, donde v es la velocidad promedio del fluido, y la 2a pared separadora en la última región del dispositivo puede evitar además que algún producto químico de tratamiento pueda moverse a la salida. La mejora en la reducción de la contaminación de salida fue de 3 a 10 veces, dependiendo de la velocidad de fluido (FIG. 50C). Por ejemplo, a partir de los resultados experimentales, a una velocidad media de fluido de 14 mm/s en los espacios de los postes, la concentración de R6G en el canal de salida del producto se redujo de 0,07 sin paredes separadoras a solo 0,01 con la implementación de paredes separadoras.For the DLD matrix "separated by walls", the diffusion time in the device can be reduced from ( i ⁱ + Í ² ) / v to I ² / V, where v is the average velocity of the fluid, and the 2nd separating wall in the last region of the device it can also prevent any treatment chemical from moving to the outlet. The improvement in outlet contamination reduction was 3 to 10 times, depending on the fluid velocity ( FIG. 50C ) . For example, from the experimental results, at an average fluid velocity of 14 mm / s in the post spaces, the concentration of R6G in the product outlet channel was reduced from 0.07 without partition walls to only 0.01 with the implementation of partition walls.

Tiempo de incubación vs. contaminación de salida Incubation time vs. outlet contamination

El tiempo mínimo de incubación puede ser un factor clave en las aplicaciones de preparación y procesamiento de células en el chip. El tiempo mínimo de incubación se estimó en la matriz DLD "separada por paredes". Las células que fluyen dentro del dispositivo en el límite más alto experimentaron el tiempo de incubación mínimo (P1 en FIG. Minimum incubation time can be a key factor in on-chip cell preparation and processing applications. The minimum incubation time was estimated in the "wall separated" DLD matrix. Cells flowing into the device at the highest limit experienced the minimum incubation time (P1 in FIG.

48A). Este tiempo mínimo de incubación t^{m in} en la matriz DLD separada por paredes se estimó como: 48A ). This minimum incubation time t ^{min in} the DLD matrix separated by walls was estimated as:

^{í , í,} ^{e l - w T - w se l - w T - w s} _{tm n intm n in} _{----------------- -----------------} _{I----- I -----} 11 _{------------- -------------} ₍₂₎₍₂₎

e v célu la ,D L D e v m áxe v célu la, D L D e v max

dónde w^t y ws son las anchuras de la corriente de tratamiento y la corriente de muestra respectivamente, V^{c é iu}i^{a, d l d} es la velocidad de la célula en la matriz DLD, y v^{m á x} es la velocidad máxima del fluido en los espacios. Cuando las células diana fluyen en la matriz DLD, su velocidad puede cambiar periódicamente de rápida en los espacios a lenta en las regiones abiertas. Para estimar el tiempo mínimo de incubación, la velocidad del fluido en los espacios de los postes se utilizó de forma conservadora. Las células diana que estaban por encima del tamaño crítico y, por lo tanto, "impactaron" con los postes en cada columna de obstáculos, se movieron a lo largo de los postes a medida que seguían el ángulo de inclinación (célula diana en la FIG. 48B). Suponiendo que la célula diana grande se movía a la velocidad del fluido de la línea de corriente donde estaba el centro de la célula y un perfil de flujo parabólico, la velocidad de la célula fue v^{cé iu la , d l d}~ 4v^{m á x} (r^{cé iu la}/g-r¡:élula/g2), donde r^{c é u a} era el radio de las células diana (se supone r^{c é lu la} de 3,5 p para los leucocitos), y v^{m á x} era la velocidad máxima del fluido en los espacios de los postes y era 1,5 veces la velocidad promedio del fluido. (30)where w ^t and ws are the widths of the process stream and the sample stream respectively, V ^{c and Iu} i ^{a, dld} is the speed of the cell in DLD matrix, and v ^{m a x} is the maximum velocity of the fluid in the spaces. As target cells flow into the DLD matrix, their velocity can periodically change from fast in gaps to slow in open regions. To estimate the minimum incubation time, the fluid velocity in the post spaces was used conservatively. Target cells that were above the critical size and therefore "hit" the posts in each column of obstacles, moved along the posts as they followed the tilt angle (target cell in FIG 48B ). Assuming the large target cell was moving at the fluid velocity of the streamline where the center of the cell was and a parabolic flow profile, the velocity of the cell was v ^{cé iu la, dld} ~ 4v ^{max x} ( r ^{cé iu la} / gr¡: elula / g2), where r ^{c é ua} was the radius of the target cells (it is assumed r ^{c é lu the} 3.5 p for leukocytes), and v ^max was the maximum fluid velocity in the post spaces and was 1.5 times the average fluid velocity. (30)

El primer término de la ecuación (2) es la aproximación del tiempo de incubación en la matriz DLD convencional. El segundo término de la ecuación (2) es el tiempo de incubación adicional ganado al implementar la primera pared separadora. A medida que la célula diana se mueve más a través de la matriz DLD, se puede recoger contra la primera pared separadora y se puede conducir gradualmente a una posición de equilibrio donde la fuerza de elevación del efecto de la pared y la fuerza de elevación del gradiente de cizallamiento se equilibran. (44) A partir de observaciones experimentales, la posición de equilibrio de los leucocitos estaba cerca de la mitad del espacio donde la velocidad del fluido alcanza un máximo (vmáx) (FIG. 48B). El tiempo de incubación se puede aumentar aumentando la longitud total de la primera pared separadora sin penalización por la contaminación del producto químico de tratamiento en la salida del producto.The first term in equation (2) is the approximation of the incubation time in the conventional DLD matrix. The second term in equation (2) is the additional incubation time gained by implementing the first partition wall. As the target cell moves further through the DLD array, it can be collected against the first separating wall and gradually driven to an equilibrium position where the lifting force of the wall effect and the lifting force of the shear gradient is balanced. (44) From experimental observations, the equilibrium position of the leukocytes was near the middle of the space where the fluid velocity reaches a maximum (vmax) ( FIG. 48B ). The incubation time can be increased by increasing the total length of the first partition wall without penalty for contamination of the treatment chemical at the product outlet.

En la FIG.51 se muestran los resultados de simulación experimental y COMSOL de la contaminación de salida relativa frente al tiempo mínimo de incubación calculado de acuerdo con la ecuación (2) para las matrices DLD convencionales (negro) y "separadas por pared" (rojo). En caso de alta velocidad de fluido, tanto el tiempo de incubación como la contaminación de salida fueron bajos. Ambos parámetros aumentaron a medida que disminuía la velocidad del fluido. Para una prueba de tinción de leucocitos, se seleccionó la velocidad promedio del fluido en los espacios de los postes de 2,8 mm/s (indicada por las líneas de trazos rojos) como una condición experimental de tinción de leucocitos en el chip, con un tiempo de incubación mínimo de ~ 4 s y una contaminación de salida de producto de 0,067. Como se muestra en los experimentos posteriores, los leucocitos se tiñeron con una intensidad de fluorescencia reconocible en comparación con una intensidad de fondo de contaminación muy baja en esta situación. FIG. 51 shows the COMSOL and experimental simulation results of relative outlet contamination versus minimum incubation time calculated according to equation (2) for conventional (black) and "wall separated" DLD matrices ( Red). In case of high fluid velocity, both the incubation time and the exit contamination were low. Both parameters increased as the fluid velocity decreased. For a leukocyte staining test, the average fluid velocity in the post spaces of 2.8 mm / s (indicated by the dashed red lines) was selected as an experimental condition for on-chip leukocyte staining, with a minimum incubation time of ~ 4 s and a product leakage contamination of 0.067. As shown in subsequent experiments, the leukocytes were stained with a recognizable fluorescence intensity compared to a very low background intensity of contamination in this situation.

El dispositivo con pared separadora se usó después para demostrar la tinción y el lavado en el chip de leucocitos con R6G, utilizando sangre completa diluida como entrada de corriente de muestra. R6G puede difundirse al interior de las células y adherirse a sus mitocondrias. (39) La matriz separó los leucocitos de la corriente de muestra y luego los dirigió al tratamiento y las corrientes de lavado posteriores. El tamaño crítico (Dc) era de aproximadamente 6 pm en la matriz DLD medida por perlas fluorescentes de diferentes tamaños, que estaba por debajo del tamaño de la mayoría de los leucocitos. El diámetro de los eritrocitos fue de aproximadamente 6 a 8 |jm. Sin embargo, debido a su forma bicóncava distintiva, se alinearon con el flujo de fluido para comportarse como partículas pequeñas y no se desplazaron en la matriz, siguiendo así la dirección promedio del fluido. (45) Además, el tamaño del otro contenido (plaquetas, proteínas, etc.) de la sangre era mayoritariamente menor de 6 jm , de modo que solo se recogieron leucocitos de la corriente de muestra. Se utilizó microscopía fluorescente para rastrear las trayectorias y la tinción de las células (FIG. The separating wall device was then used to demonstrate staining and washing on the R6G leukocyte chip, using diluted whole blood as the sample stream input. R6G can diffuse into cells and adhere to their mitochondria. (39) The matrix separated the leukocytes from the sample stream and then directed them to treatment and subsequent wash streams. The critical size (Dc) was approximately 6 pm in the DLD matrix measured by fluorescent beads of different sizes, which was below the size of most of leukocytes. The diameter of the erythrocytes was approximately 6 to 8 µm. However, due to their distinctive biconcave shape, they aligned with the fluid flow to behave like small particles and did not move in the matrix, thus following the average direction of the fluid. (45) Furthermore, the size of the other content (platelets, proteins, etc.) in the blood was mostly less than 6 µm, so that only leukocytes were collected from the sample stream. Fluorescent microscopy was used to trace cell trajectories and staining ( FIG.

52). En la región de entrada, no se pudieron ver leucocitos fluorescentes u otras células, ya que las células aún no estaban marcadas (FIG. 50B). A continuación, los leucocitos se concentraron e incubaron a lo largo de la primera pared separadora en la región intermedia de la matriz DLD separada por paredes B (FIG. 51A FIG. 50B). Finalmente, los leucocitos marcados se recogieron en la salida del producto (FIG. 50B) y eran visibles (FIG. 51B). El recuadro de FIG. 51B muestra la salida de producto y la salida de desechos obtenidos de un experimento de 200 j l de sangre diluida. Puede indicarse una buena separación de leucocitos de eritrocitos por la notable diferencia de color. En la imagen de fluorescencia de la corriente de salida del producto, se encontraron pocos antecedentes de fluorescencia, lo que indica una buena tinción por R6G y baja contaminación de R6G sin reaccionar en la salida del producto. 52 ). In the entry region, no fluorescent leukocytes or other cells could be seen as the cells were not yet labeled ( FIG. 50B ) . The leukocytes were then concentrated and incubated along the first separating wall in the intermediate region of the DLD matrix separated by walls B ( FIG. 51A FIG. 50B ) . Finally, the labeled leukocytes were collected at the product outlet ( FIG. 50B ) and were visible ( FIG. 51B ). The inset of FIG. 51B shows the product output and waste output obtained from a 200 µl diluted blood run. Good separation of leukocytes from erythrocytes can be indicated by the marked difference in color. In the fluorescence image of the product outlet stream, little background fluorescence was found, indicating good R6G staining and low contamination of unreacted R6G at the product outlet.

CONCLUSIÓNCONCLUSION

Este ejemplo presenta una matriz DLD separada por paredes para la recolección de células, procesamiento químico y lavado integrados en un chip. El diseño "separado por paredes" puede mejorar la compensación entre tiempos prolongados de tratamiento químico y baja contaminación de salida a baja velocidad del fluido, permitiendo tanto (i) un mayor tiempo de incubación, como (ii) una menor contaminación del producto químico de tratamiento en la salida del producto. Los leucocitos se pueden separar de la sangre completa, teñirse con R6G y lavarse en un solo dispositivo de matriz DLD sin ningún procesamiento previo de la sangre o manipulación manual entre las etapas. El dispositivo también se puede aplicar a otras etapas de procesamiento y lavado en el chip, tales como el marcaje con anticuerpos monoclonales, fijación/permeabilización y otras aplicaciones novedosas.This example features a wall-separated DLD array for cell harvesting, chemical processing, and washing integrated on one chip. The "wall-separated" design can improve the trade-off between long chemical treatment times and low output contamination at low fluid velocity, allowing both (i) longer incubation time, and (ii) less contamination of the chemical from treatment at the product outlet. Leukocytes can be separated from whole blood, stained with R6G, and washed in a single DLD array device without any prior blood processing or manual handling between stages. The device can also be applied to other on-chip washing and processing steps, such as monoclonal antibody labeling, fixation / permeabilization, and other novel applications.

Ejemplo 23: Purificación de glóbulos blancos (WBC) de sangre completa utilizando DLD con diferentes formas de sección transversal de obstáculosExample 23: Purification of white blood cells (WBC) from whole blood using DLD with different cross-sectional shapes of obstacles

Se utilizaron chips microfluídicos con obstáculos para purificar glóbulos blancos (WBC) a partir de sangre completa. El diseño de las formas de las secciones transversales de los obstáculos puede permitir obtener un alto rendimiento de glóbulos blancos (WBC) y una baja contaminación debida a los glóbulos rojos (RBC).Blocked microfluidic chips were used to purify white blood cells (WBC) from whole blood. The design of the cross-sectional shapes of the obstacles can allow high yield of white blood cells (WBC) and low contamination due to red blood cells (RBC).

Se usaron chips microfluídicos con obstáculos que tenían una sección transversal en forma de diamante, (o un cuadrado girado, donde un vértice del cuadrado girado apunta en la dirección del flujo de la muestra), una sección transversal en forma de triángulo, una sección transversal de forma redonda, una sección transversal de forma cuadrada y una sección transversal de forma de cuarto de círculo para purificar los glóbulos blancos (WBC) de muestras de sangre completa. Los caudales de las muestras fueron de aproximadamente 40 ml/hora.Microfluidic chips were used with obstacles that had a diamond-shaped cross section, (or a rotated square, where one vertex of the rotated square points in the direction of sample flow), a triangle-shaped cross section, a round shape, square shape cross section and quarter circle shape cross section to purify white blood cells (WBC) from whole blood samples. The flow rates of the samples were approximately 40 ml / hour.

Cada uno de los chips microfluídicos era de silicio con una única matriz DLD grabada a una profundidad de 150 jm . La velocidad promedio en los espacios fue de aproximadamente 10 cm/segundo. Cada matriz DLD tenía una inclinación de 1/42. Los espacios en cada matriz tenían 17 jm de anchura y los obstáculos tenían un tamaño de 19 jm . La muestra de sangre utilizada en los experimentos se diluyó 1:4 en un tampón de ejecución (tampón PBS) con una concentración final de EDTA 5 mM, PPACK 40 jM y BSA al 1 %. Se pasaron volúmenes iguales de la muestra de sangre y el tampón de ejecución a través del chip simultáneamente de modo que se recogieron los glóbulos blancos (WBC) de la muestra de sangre en el tampón de ejecución libre de glóbulos rojos (RBC). La velocidad se midió por el caudal promedio dividido por el área de la sección transversal del canal a través del cual fluía el fluido. La velocidad de cizallamiento se calculó como la velocidad promedio dividida por la mitad de la anchura del espacio.Each of the microfluidic chips was silicon with a single DLD matrix etched at a depth of 150 µm. The average speed in the spaces was approximately 10 cm / second. Each DLD matrix had a slope of 1/42. The spaces in each matrix were 17 µm wide and the obstacles were 19 µm in size. The blood sample used in the experiments was diluted 1: 4 in a running buffer (PBS buffer) with a final concentration of 5 mM EDTA, 40 jM PPACK and 1% BSA. Equal volumes of the blood sample and the run buffer were passed through the chip simultaneously so that the white blood cells (WBC) were collected from the blood sample in the red cell free run buffer (RBC). Velocity was measured by the average flow rate divided by the cross-sectional area of the channel through which the fluid was flowing. Shear rate was calculated as the average rate divided by half the width of the gap.

Los rendimientos de glóbulos blancos (WBC) y las tasas de contaminación de glóbulos rojos (RBC) se muestran en FIG. 53A para matrices con obstáculos con diferentes formas de sección transversal. Entre los obstáculos con diferentes formas de sección transversal utilizados en los experimentos, una matriz con obstáculos con una sección transversal de diamante purificó glóbulos blancos (WBC) con el máximo rendimiento (más del 80 %) y con la menor contaminación por glóbulos rojos (RBC) (menos del 0,01 %).White blood cell (WBC) yields and red blood cell (RBC) contamination rates are shown in FIG. 53A for obstacle matrices with different cross-sectional shapes. Among the obstacles with different cross-sectional shapes used in the experiments, a matrix with obstacles with a diamond cross section purified white blood cells (WBC) with the highest throughput (more than 80%) and with the least contamination by red blood cells (RBC). ) (less than 0.01%).

La separación de glóbulos blancos (WBC) y glóbulos rojos (RBC) y la contaminación por glóbulos rojos (RBC) pueden verse afectadas por los efectos de inercia creados por obstáculos con diferentes formas de sección transversal. La FIG.53B muestra los efectos de inercia creados por obstáculos con secciones transversales de diamante, triangulares y circulares. Los efectos de inercia dan como resultado un desplazamiento lateral extra (dirección x) con postes triangulares asimétricos, pero no con postes circulares o de diamante. Los obstáculos con diferentes formas de sección transversal pueden causar diferentes niveles de deformación de los glóbulos blancos (WBC). Los obstáculos con secciones transversales de diamante crearon menos fuerza de cizallamiento en comparación con los obstáculos con secciones transversales circulares como se muestra en la FIG.53C. La alta velocidad de cizallamiento en una longitud de arco larga, que se puede observar con postes de sección circular, no se observa con postes con una sección transversal en forma de diamante. Una alta velocidad de cizallamiento en una longitud de arco larga puede provocar una deformación de glóbulos blancos (WBC) que puede dar como resultado bajos rendimientos. White blood cell (WBC) and red blood cell (RBC) separation and red blood cell (RBC) contamination can be affected by inertial effects created by obstacles with different cross-sectional shapes. FIG. 53B shows the inertial effects created by obstacles with diamond, triangular and circular cross sections. Inertia effects result in extra lateral displacement (x direction) with asymmetric triangular posts, but not with circle or diamond posts. Obstacles with different cross-sectional shapes can cause different levels of white blood cell (WBC) deformation. Obstacles with diamond cross sections created less shear force compared to obstacles with circular cross sections as shown in FIG. 53C. The high shear rate over a long arc length, which can be observed with posts with a circular section, is not observed with posts with a diamond-shaped cross section. High shear rate over a long arc length can cause white blood cell (WBC) deformation which can result in low yields.

Ejemplo 24: Resumen de microchips DLDExample 24: Summary of DLD microchips

Producto de Microchip del Ejemplo 13 n. ° 1-Lava glóbulos blancos (WBC) humanos de sangre humana después del mareaje de superficie convencional. Microchip Product of Example 13 n. 1 -Wash human white blood cells (WBC) from human blood after conventional surface labeling.

Producto de Microchip del Ejemplo 14 n. ° 2-Lava glóbulos blancos (WBC) fijados/permanentes después de la fijación/permeabilización convencional. Microchip Product of Example 14 n. 2 -Wash fixed / permanent white blood cells (WBC) after conventional fixation / permeabilization.

Producto de Microchip del Ejemplo 15 n. ° 3-Lava glóbulos blancos (WBC) con marcaje intracelular después del marcaje intracelular convencional. Microchip Product of Example 15 n. 3 -Wash white blood cells (WBC) with intracellular labeling after conventional intracellular labeling.

Producto de Microchip del Ejemplo 16 n. ° 4-Recoge glóbulos blancos (WBC) humanos de sangre humana que se somete a marcaje de superficie y se lava en el chip. Microchip Product of Example 16 n. 4- Collect human white blood cells (WBC) from human blood that undergo surface marking and wash on the chip.

Producto de Microchip del Ejemplo 17 n. ° 5-Recoge glóbulos blancos (WBC) humanos marcados en la superficie que se fijan/permeabilizan, se lavan en el chip, y se tiñen con un tinte intracelular fuera del chip. Microchip Product of Example 17 n. 5 - Collects surface-labeled human white blood cells (WBCs) that are fixed / permeabilized, washed on the chip, and stained with an intracellular dye off the chip.

Producto de Microchip del Ejemplo 18 n. ° 6-Los glóbulos blancos (WBC) de sangre humana se tiñen en la superficie y se fijan/permeabilizan fuera del chip, después se tiñen intracelularmente y se lavan en el chip. Microchip Product of Example 18 n. 6 -Human blood white blood cells (WBCs) are surface stained and fixed / permeabilized off the chip, then intracellularly stained and washed on the chip.

Producto de Microchip del Ejemplo 19 n. ° 7-Un sistema de chip DLD microfluídico para fijación/permeabilización en el chip, marcaje intracelular de glóbulos blancos (WBC), con lavado y concentración en el chip. Microchip Product of Example 19 n. 7 -A microfluidic DLD chip system for on-chip fixation / permeabilization, intracellular white blood cell (WBC) labeling, with on-chip washing and concentration.

Ejemplo 25: Aislamiento de glóbulos blancos (WBC) usando diferentes configuraciones de chipExample 25: Isolation of white blood cells (WBC) using different chip configurations

A: Se diluyó sangre de un día (Interstate Blood Bank) 1:5 (1 parte de sangre, 4 partes de tampón (BSA 1%/PBS)), Se añadió EDTA a 7 mM y PPACK a 40 j M), la muestra se procesó en un chip de silicio a una velocidad de entrada de muestra de 15 jl/m in y a una velocidad de entrada de tampón de 45 jl/min. El chip de silicio comprendía una matriz DLD de 3 zonas. La matriz DLD de 3 zonas tenía 3 zonas de postes circulares de desplazamiento de fila 1/10 y una profundidad de 100 jm . Las 3 zonas tenían postes de 27 jm , 18 jm y 11 jm respectivamente. Las 3 zonas tenían espacios de 18 jm , 12 jm u 11 jm , respectivamente. La longitud de cada matriz era de 1 cm, 1 cm y 1,2 cm, respectivamente. La longitud total, incluidas las regiones de entrada y salida, fue de 7 cm. La FIG. 56 muestra la matriz 3 con 11 postes jm y espacios de 11 jm . Se añadió un volumen de entrada de 900 j l de muestra durante 60 min y se utilizaron 2,7 ml de tampón. Se recogieron aproximadamente 1,8 ml de producto a través de la salida de la FIG. 56. A: One-day blood (Interstate Blood Bank) was diluted 1: 5 (1 part blood, 4 parts buffer (1% BSA / PBS)), EDTA was added at 7 mM and PPACK at 40 µM), the sample was run on a silicon chip at a sample inlet rate of 15 µl / min in and a buffer inlet rate of 45 µl / min. The silicon chip comprised a 3-zone DLD matrix. The 3-zone DLD array had 3 zones of 1/10 row offset circular posts and a depth of 100 µm. The 3 zones had posts of 27 jm, 18 jm and 11 jm respectively. The 3 zones had gaps of 18 µm, 12 µm, or 11 µm, respectively. The length of each matrix was 1 cm, 1 cm, and 1.2 cm, respectively. The total length, including the entry and exit regions, was 7 cm. FIG. 56 shows matrix 3 with 11 jm posts and 11 jm spaces. An inlet volume of 900 µl of sample was added over 60 min and 2.7 ml of buffer was used. Approximately 1.8 ml of product was collected through the outlet of FIG. 56.

El rendimiento de glóbulos blancos (WBC) fue del 71 %.The white blood cell (WBC) yield was 71%.

B: Se diluyó sangre de un día (Interstate Blood Bank) 1:5 (1 parte de sangre, 4 partes de tampón (BSA 1%/PBS)), Se añadió EDTA a 7 mM y PPACK a 40 j M), la muestra se procesó en un chip de silicio a una velocidad de entrada de muestra de 15 jl/m in y a una velocidad de entrada de tampón de 45 jl/min. El chip de silicio comprendía una matriz DLD de 3 zonas. La matriz DLD de 3 zonas tenía 3 zonas de postes circulares de desplazamiento de fila 1/10 y una profundidad de 100 jm . Las 3 zonas tenían postes de 27 jm , 18 jm y 11 jm respectivamente. Las 3 zonas tenían espacios de 18 jm , 12 jm u 11 jm , respectivamente. La longitud de cada matriz era de 1 cm, 1 cm y 1,2 cm, respectivamente. La longitud total, incluidas las regiones de entrada y salida, fue de 7 cm. La FIG. 57 muestra la matriz 3 con 11 postes jm y espacios de 11 jm . Se añadió un volumen de entrada de 900 j l de muestra durante 60 min y se utilizaron 2,7 ml de tampón. Se recogieron aproximadamente 1,5 ml de producto a través de la salida de la FIG. 57. B: One-day blood (Interstate Blood Bank) was diluted 1: 5 (1 part blood, 4 parts buffer (1% BSA / PBS)), EDTA was added at 7 mM and PPACK at 40 µM), the sample was run on a silicon chip at a sample inlet rate of 15 µl / min in and a buffer inlet rate of 45 µl / min. The silicon chip comprised a 3-zone DLD matrix. The 3-zone DLD array had 3 zones of 1/10 row offset circular posts and a depth of 100 µm. The 3 zones had posts of 27 jm, 18 jm and 11 jm respectively. The 3 zones had gaps of 18 µm, 12 µm, or 11 µm, respectively. The length of each matrix was 1 cm, 1 cm, and 1.2 cm, respectively. The total length, including the entry and exit regions, was 7 cm. FIG. 57 shows matrix 3 with 11 jm posts and 11 jm spaces. An inlet volume of 900 µl of sample was added over 60 min and 2.7 ml of buffer was used. Approximately 1.5 ml of product was collected through the outlet of FIG. 57.

El rendimiento de glóbulos blancos (WBC) fue del 83 %.The white blood cell (WBC) yield was 83%.

C: Se diluyó sangre de un día (Interstate Blood Bank) 1:5 (1 parte de sangre, 4 partes de tampón (BSA 1%/PBS)), Se añadió EDTA a 7 mM y PPACK a 40 j M), la muestra se procesó en un chip de silicio a una velocidad de entrada de muestra de 15 jl/m in y a una velocidad de entrada de tampón de 45 jl/min. El chip de silicio comprendía una matriz DLD de 3 zonas. La matriz DLD de 3 zonas tenía 3 zonas de postes circulares de desplazamiento de fila 1/10 y una profundidad de 100 jm . Las 3 zonas tenían postes de 27 jm , 18 jm y 11 jm respectivamente. Las 3 zonas tenían espacios de 18 jm , 12 jm u 11 jm , respectivamente. La longitud de cada matriz era de 1 cm, 1 cm y 1,2 cm, respectivamente. La longitud total, incluidas las regiones de entrada y salida, fue de 7 cm. La FIG. 58 muestra la matriz 3 con 11 postes jm y espacios de 11 jm . Se añadió un volumen de entrada de 900 j l de muestra durante 60 min y se utilizaron 2,7 ml de tampón. Se recogieron aproximadamente 1,0 ml de producto a través de la salida de la FIG. 58. C: One-day blood (Interstate Blood Bank) was diluted 1: 5 (1 part blood, 4 parts buffer (1% BSA / PBS)), EDTA was added at 7 mM and PPACK at 40 µM), the sample was run on a silicon chip at a sample inlet rate of 15 µl / min in and a buffer inlet rate of 45 µl / min. The silicon chip comprised a 3-zone DLD matrix. The 3-zone DLD array had 3 zones of 1/10 row offset circular posts and a depth of 100 µm. The 3 zones had posts of 27 jm, 18 jm and 11 jm respectively. The 3 zones had gaps of 18 µm, 12 µm, or 11 µm, respectively. The length of each matrix was 1 cm, 1 cm, and 1.2 cm, respectively. The total length, including the entry and exit regions, was 7 cm. FIG. 58 shows matrix 3 with 11 jm posts and 11 jm spaces. An inlet volume of 900 µl of sample was added over 60 min and 2.7 ml of buffer was used. Approximately 1.0 ml of product was collected through the outlet of FIG. 58.

El rendimiento de glóbulos blancos (WBC) fue del 75 %.The white blood cell (WBC) yield was 75%.

Los resultados del análisis se resumen en la Tabla 9 :The results of the analysis are summarized in Table 9 :

continuacióncontinuation

Referencias:References:

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43. F. M. Zehentbauer, C. Moretto, R. Stephen, T. Thevar, J. R. Gilchrist, D. Pokrajac, K. L. Richard, J. Kiefer, Spectrochim. Acta A, 121, 147-151 (2014).43. F. M. Zehentbauer, C. Moretto, R. Stephen, T. Thevar, J. R. Gilchrist, D. Pokrajac, K. L. Richard, J. Kiefer, Spectrochim. Act A, 121, 147-151 (2014).

44. L. Zeng, S. Balachandar y P. Fischer, J. Fluid Mech., 536, 1-25 (2005).44. L. Zeng, S. Balachandar and P. Fischer, J. Fluid Mech., 536, 1-25 (2005).

45. K. K. Zeming, S. Ranjan y Y. Zhang, Nat. Commun., 4, 1625 (2013).45. K. K. Zeming, S. Ranjan and Y. Zhang, Nat. Commun., 4, 1625 (2013).

Si bien se han mostrado y descrito en el presente documento realizaciones preferidas, será obvio para los expertos en la materia que tales realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. A los expertos en la materia se les ocurrirán ahora numerosas variaciones, cambios y sustituciones sin apartarse de las descripciones proporcionadas en el presente documento. Debe entenderse que se pueden emplear diversas alternativas a las realizaciones descritas en el presente documento al poner en práctica los métodos y dispositivos descritos en el presente documento. While preferred embodiments have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, changes, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the descriptions provided herein. It should be understood that various alternatives to the embodiments described herein may be employed in practicing the methods and devices described herein.

Claims

1. A microfluidic device for purifying first particles of a predetermined size from a sample, the device comprising:

a) a channel extending from a plurality of inputs to a plurality of outputs;

b) a first deterministic lateral displacement (DLD) obstacle matrix arranged in rows in the channel, where each subsequent row of obstacles is laterally displaced with respect to a previous row, wherein the obstacle matrix is configured to differentially deflect the obstacles. first particles of at least a predetermined size to a first outlet and the second particles of less than the predetermined size in the sample to a second outlet, and wherein:

i) the surfaces of two adjacent obstacles in a row of the obstacle matrix define a space; ii) the two obstacles defining a space each have a polygonal cross section; and iii) the vertices of each of the two obstacles with the polygonal cross section point towards each other in a direction substantially perpendicular to a direction of flow of the sample through the obstacle matrix;

c) an incubator comprising a first portal fluidly connected to the first outlet of the microfluidic device and a second portal fluidly connected to a second source of liquid.

The device of claim 1, wherein the space defined by the surfaces of said two adjacent obstacles comprises a shape that is symmetrically oriented with respect to a plane parallel to the direction of flow of a sample through the obstacle matrix. and equidistant from the center of the cross section of each of the two obstacles in the row.

The device of claim 2, wherein the polygonal cross section is a cross section of a cyclic quadrilateral, kite, parallelogram, rhombus, oblong, rhomboid, rectangle, tangential quadrilateral, trapezoid, trapezoid, or isosceles trapezoid.

The device of claim 2, wherein the first particles of a predetermined size are leukocytes.

The device of claim 1, wherein said incubator is a continuous flow incubator.

The device of claim 5, wherein the incubator comprises a meandering channel and wherein a balancer is fluidly connected to a second outlet of the device.

The device of claim 5, wherein the space defined by the surfaces of said two adjacent obstacles comprises a shape that is asymmetrically oriented in a plane extending through the center of the space and that is parallel to a direction of flow. of the sample through the obstacle matrix.

The device of claim 7, wherein the polygonal cross section is a cross section of a cyclic quadrilateral, comet, parallelogram, rhombus, oblong, rhomboid, rectangle, tangential quadrilateral, trapezoid, trapezoid, or isosceles trapezoid.

The device of claim 7, wherein the first particles of a predetermined size are leukocytes.

The device of claim 5, wherein the flow through the incubator is fluidically connected to a second channel, which is delimited by a first wall and a second wall opposite the first wall, and wherein the second channel comprises a second obstacle matrix DLD.

The device of claim 10, wherein the incubator comprises a meandering channel and wherein a balancer is fluidly connected to a second outlet of the device.

The device according to claim 5, wherein the incubator is configured to mix a liquid in the incubator.

13. A method for purifying first particles of at least a predetermined size in a sample, wherein the first particles comprise leukocytes or stem cells, the method comprising:

a) providing a sample comprising first particles of at least a predetermined size and, optionally, second particles of less than the predetermined size; Y

b) passing the sample through at least one device of claim 1, wherein:

i) the first purified particles enter the incubator from the first outlet of the device;

ii) the second liquid also enters the incubator and comprises a reagent selected from the group that It consists of a binding agent that binds to a cell surface marker; a DNA probe; an enzyme; a drug; a permeation agent and a fixative; Y

c) wherein said incubator is a continuous flow incubator.

The method of claim 13, wherein the flow through the incubator is fluidically connected to a second channel wherein the second channel is bounded by a first wall and a second wall opposite the first wall, and the second channel it comprises a second obstacle matrix DLD.

The method of claim 14, wherein the incubator comprises a meandering channel and wherein a balancer is fluidly connected to a second outlet of the device.